JP2548507B2 - 線維形成誘導性サイトカインに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびその用途 - Google Patents
線維形成誘導性サイトカインに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびその用途Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、線維形成誘導性(fibro
genic)サイトカインに対する新規なアンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチドに関する。特に、本発明は、創傷
部位から多量に分泌される線維形成誘導性サイトカイン
の遺伝子発現を抑制して創傷部位の瘢痕形成を防止する
ことができる新規なアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドに関するものである。
genic)サイトカインに対する新規なアンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチドに関する。特に、本発明は、創傷
部位から多量に分泌される線維形成誘導性サイトカイン
の遺伝子発現を抑制して創傷部位の瘢痕形成を防止する
ことができる新規なアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】免疫反応、炎症反応および組織再生反応
(tissue repair response)等は、宿主を、危ない周囲環
境から保護する機能を行う。しかし、このような反応が
穏やかに起こらないとか過剰に起こる場合、この様な反
応等は宿主を保護するというよりは却って宿主に被害を
与えることになる。このような反応等が関与する生体過
程中の一例として、創傷の治癒過程においては外傷、手
術および火傷等に対する組織再生反応の一つとして瘢痕
が形成されるが、形成された瘢痕は収縮して非常に組織
の成長を阻害したり、機能の障害を招来したり、宿主の
外観を損なわせることがある。
(tissue repair response)等は、宿主を、危ない周囲環
境から保護する機能を行う。しかし、このような反応が
穏やかに起こらないとか過剰に起こる場合、この様な反
応等は宿主を保護するというよりは却って宿主に被害を
与えることになる。このような反応等が関与する生体過
程中の一例として、創傷の治癒過程においては外傷、手
術および火傷等に対する組織再生反応の一つとして瘢痕
が形成されるが、形成された瘢痕は収縮して非常に組織
の成長を阻害したり、機能の障害を招来したり、宿主の
外観を損なわせることがある。
【０００３】創傷の治癒過程は急性および慢性炎症、細
胞の移動、血管新生および細胞外マトリックス(ＥＣＭ)
の蓄積等が順次に生ずる非常に精巧な組織反応である。
創傷が生ずると創傷組織の周囲の血管が損傷し、創傷部
位に局所的に出血が起こり、凝固が起こる。この血塊内
に存在するフィブリノーゲンがフィブリンゲルを形成す
れば、フィブロネクチンのような血漿蛋白質がゲルの中
に入ることになる。この外にも炎症細胞、線維芽細胞お
よび血管新生細胞等がこのようなゲル内に入ってゲルを
溶かしたり、一方では、フィブロネクチンがコラーゲ
ン、プロテオグリカン等のようなＥＣＭの成分等を創傷
の周囲組織に蓄積させる。このような過程によって、始
めに組織中に存在していたフィブリン基質は、肉芽組織
に代替され、時間の経過と共にその場所に瘢痕が形成さ
れ、ＥＣＭの蓄積とともに角化細胞が移動して上皮膜を
形成し、水分の消失と細菌の侵入を防止することにな
る。このような一連の創傷治癒に関連した過程等は、損
傷部位の組織の免疫細胞、炎症細胞および間葉細胞とト
ランスフォーミング成長因子β(ＴＧＦ−β)、血小板由
来成長因子(ＰＤＧＦ)、線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)お
よび線維芽細胞活性化因子(ＦＡＦ)等、各種のサイトカ
インとコラーゲン、フィブロネクチン、テネイシンおよ
びプロテオグリカン等のようなＥＣＭ等との相互作用に
よって行われる。
胞の移動、血管新生および細胞外マトリックス(ＥＣＭ)
の蓄積等が順次に生ずる非常に精巧な組織反応である。
創傷が生ずると創傷組織の周囲の血管が損傷し、創傷部
位に局所的に出血が起こり、凝固が起こる。この血塊内
に存在するフィブリノーゲンがフィブリンゲルを形成す
れば、フィブロネクチンのような血漿蛋白質がゲルの中
に入ることになる。この外にも炎症細胞、線維芽細胞お
よび血管新生細胞等がこのようなゲル内に入ってゲルを
溶かしたり、一方では、フィブロネクチンがコラーゲ
ン、プロテオグリカン等のようなＥＣＭの成分等を創傷
の周囲組織に蓄積させる。このような過程によって、始
めに組織中に存在していたフィブリン基質は、肉芽組織
に代替され、時間の経過と共にその場所に瘢痕が形成さ
れ、ＥＣＭの蓄積とともに角化細胞が移動して上皮膜を
形成し、水分の消失と細菌の侵入を防止することにな
る。このような一連の創傷治癒に関連した過程等は、損
傷部位の組織の免疫細胞、炎症細胞および間葉細胞とト
ランスフォーミング成長因子β(ＴＧＦ−β)、血小板由
来成長因子(ＰＤＧＦ)、線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)お
よび線維芽細胞活性化因子(ＦＡＦ)等、各種のサイトカ
インとコラーゲン、フィブロネクチン、テネイシンおよ
びプロテオグリカン等のようなＥＣＭ等との相互作用に
よって行われる。
【０００４】このように、創傷部位の線維芽細胞の増殖
を促進させ、ＥＣＭの蓄積を増加させる種々のサイトカ
インの中では特にＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦが最も大き
な役割を遂行していることが明らかになった。ＴＧＦ−
βは線維芽細胞の増殖を有意に増加させるのみならず、
コラーゲンやフィブロネクチン等のようなＥＣＭの遺伝
子発現を増加させ、ＰＤＧＦはコラーゲンの合成には影
響が少ないが、線維芽細胞の増殖を非常に促進させるも
のと知られている。
を促進させ、ＥＣＭの蓄積を増加させる種々のサイトカ
インの中では特にＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦが最も大き
な役割を遂行していることが明らかになった。ＴＧＦ−
βは線維芽細胞の増殖を有意に増加させるのみならず、
コラーゲンやフィブロネクチン等のようなＥＣＭの遺伝
子発現を増加させ、ＰＤＧＦはコラーゲンの合成には影
響が少ないが、線維芽細胞の増殖を非常に促進させるも
のと知られている。
【０００５】さらに、最近の報告によれば、胎児創傷(f
etal wounds)の場合には、創傷治癒過程中で瘢痕が形成
されず、炎症反応も少ないのみならず、サイトカインの
分泌も成体創傷(adult wounds)に比べて少ないものと明
らかになった(参照：ホワイトビィ・ディ・ジェイ(Ｗhi
tby,Ｄ.Ｊ.)およびエム・ダブリュ・ジェイ・ファーグ
ソン(Ｍ.Ｗ.Ｊ．Ｆerguson)、９９１，胎児創傷治癒に
おける成長因子の免疫組織化学的局在化(Ｉmmunohisto-
chemical localization of growth factors infetal wo
und healing)、ディベロープメンタル・バイオロジー
(Ｄev.Ｂiol.)１４７:２０７−２１５]。しかしなが
ら、上記文献には、さらに、胎児創傷の場合でも、ＴＧ
Ｆ−βを創傷周囲の組織に注射すれば瘢痕が形成され、
糸球体腎炎が誘発されることが報告されている。
etal wounds)の場合には、創傷治癒過程中で瘢痕が形成
されず、炎症反応も少ないのみならず、サイトカインの
分泌も成体創傷(adult wounds)に比べて少ないものと明
らかになった(参照：ホワイトビィ・ディ・ジェイ(Ｗhi
tby,Ｄ.Ｊ.)およびエム・ダブリュ・ジェイ・ファーグ
ソン(Ｍ.Ｗ.Ｊ．Ｆerguson)、９９１，胎児創傷治癒に
おける成長因子の免疫組織化学的局在化(Ｉmmunohisto-
chemical localization of growth factors infetal wo
und healing)、ディベロープメンタル・バイオロジー
(Ｄev.Ｂiol.)１４７:２０７−２１５]。しかしなが
ら、上記文献には、さらに、胎児創傷の場合でも、ＴＧ
Ｆ−βを創傷周囲の組織に注射すれば瘢痕が形成され、
糸球体腎炎が誘発されることが報告されている。
【０００６】このような瘢痕形成とサイトカインの存在
との間の関係が明らかになるにつれて、サイトカインを
調節することによって瘢痕組織の形成を抑制することが
できることを提案するに至った。例えば、シャー・エム
(Ｓhah Ｍ.)ら(下記文献)の創傷の治癒過程の中でＴＧ
Ｆ−βが生理的に過剰に分泌されるという事実から、ラ
ットに人為的に創傷を形成させた後、創傷の周囲にＴＧ
Ｆ−βに対する中和抗体(ＮＡ)を注射した結果、中和抗
体で処理した創傷部位において、治癒された後にも組織
の引張力(tensile strength)に変化がないばかりでな
く、中和抗体−非処理対照群の創傷に比べて、より正常
に近い皮膚組織所見を表すことを観察することができた
[シャー・エム(Ｓhah Ｍ.)、フォアマン・ディエム(Ｆo
reman ＤＭ.)、ファーグソン・エムダブリュジェイ(Ｆ
erguson ＭＷＪ.)、１９９２、トランスフォーミング
成長因子βに対する中和抗体による成体創傷の瘢痕形成
の制御(Ｃontrol of scarring in adult wounds by neu
tralizing antibody to transforming growth factor
β)、ランセット(Ｌancet) ３３９:２１３−２１４を
参照]。また、本実験においては、中和抗体で処理され
た創傷は、瘢痕を形成せずに治癒される反面、中和抗体
−非処理対照群の創傷部位では、中和抗体処理された創
傷に比べて、より多くの炎症細胞が観察されるばかりで
なく、コラーゲンやフィブロネクチンのようなＥＣＭが
より多量に蓄積されるという事実も確認された。しか
し、このような中和抗体は非常に高価であり、不安定で
あり保管上の問題があるので、実用化させるには難しか
った。
との間の関係が明らかになるにつれて、サイトカインを
調節することによって瘢痕組織の形成を抑制することが
できることを提案するに至った。例えば、シャー・エム
(Ｓhah Ｍ.)ら(下記文献)の創傷の治癒過程の中でＴＧ
Ｆ−βが生理的に過剰に分泌されるという事実から、ラ
ットに人為的に創傷を形成させた後、創傷の周囲にＴＧ
Ｆ−βに対する中和抗体(ＮＡ)を注射した結果、中和抗
体で処理した創傷部位において、治癒された後にも組織
の引張力(tensile strength)に変化がないばかりでな
く、中和抗体−非処理対照群の創傷に比べて、より正常
に近い皮膚組織所見を表すことを観察することができた
[シャー・エム(Ｓhah Ｍ.)、フォアマン・ディエム(Ｆo
reman ＤＭ.)、ファーグソン・エムダブリュジェイ(Ｆ
erguson ＭＷＪ.)、１９９２、トランスフォーミング
成長因子βに対する中和抗体による成体創傷の瘢痕形成
の制御(Ｃontrol of scarring in adult wounds by neu
tralizing antibody to transforming growth factor
β)、ランセット(Ｌancet) ３３９:２１３−２１４を
参照]。また、本実験においては、中和抗体で処理され
た創傷は、瘢痕を形成せずに治癒される反面、中和抗体
−非処理対照群の創傷部位では、中和抗体処理された創
傷に比べて、より多くの炎症細胞が観察されるばかりで
なく、コラーゲンやフィブロネクチンのようなＥＣＭが
より多量に蓄積されるという事実も確認された。しか
し、このような中和抗体は非常に高価であり、不安定で
あり保管上の問題があるので、実用化させるには難しか
った。
【０００７】さらに、ボーダー・ダブリュエイ(Ｂorder
ＷＡ)らは、プロテオグリカンＥＣＭの一種にしてＴＧ
Ｆ−βの受容体に結合することができ、したがって、Ｔ
ＧＦ−βに対する抑制剤として作用できる、デコリン(d
ecorin)を実験的糸球体腎炎動物モデルに投与した結
果、デコリンがフィブリノイド変性を抑制することによ
って糸球体腎炎を予防することができるという事実を確
認した[ボーダー・ダブリュエイ(Ｂorder ＷＡ)、ラウ
スラーティ・イー(Ｒouslahti Ｅ.)、１９９２、疾患に
おけるトランスフォーミング成長因子β：組織再生のダ
ークサイド(Ｔransforming growth factor−β in dise
ase：Ｔhe dark side of tissue repair)、ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(Ｊ.Ｃli
n.Ｉnvest.)、９０：１−７を参照]。しかし、デコリン
のような蛋白質性薬剤は巨大分子構造を持っているので
細胞内浸透が難しく、したがって、経口投与のみによっ
て使用できる。したがって、有効量の薬剤が目的とする
創傷部位に達するのは困難である。
ＷＡ)らは、プロテオグリカンＥＣＭの一種にしてＴＧ
Ｆ−βの受容体に結合することができ、したがって、Ｔ
ＧＦ−βに対する抑制剤として作用できる、デコリン(d
ecorin)を実験的糸球体腎炎動物モデルに投与した結
果、デコリンがフィブリノイド変性を抑制することによ
って糸球体腎炎を予防することができるという事実を確
認した[ボーダー・ダブリュエイ(Ｂorder ＷＡ)、ラウ
スラーティ・イー(Ｒouslahti Ｅ.)、１９９２、疾患に
おけるトランスフォーミング成長因子β：組織再生のダ
ークサイド(Ｔransforming growth factor−β in dise
ase：Ｔhe dark side of tissue repair)、ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(Ｊ.Ｃli
n.Ｉnvest.)、９０：１−７を参照]。しかし、デコリン
のような蛋白質性薬剤は巨大分子構造を持っているので
細胞内浸透が難しく、したがって、経口投与のみによっ
て使用できる。したがって、有効量の薬剤が目的とする
創傷部位に達するのは困難である。
【０００８】前記方法以外にも、最も伝統的であり、一
般的な方法としてステロイドのような合成医薬品を使用
する方法があるにはあるが、このような薬剤等は瘢痕形
成に対する直接的な抑制効果がないだけでなく、典型的
なステロイド薬剤の副作用等を示す短所があった。
般的な方法としてステロイドのような合成医薬品を使用
する方法があるにはあるが、このような薬剤等は瘢痕形
成に対する直接的な抑制効果がないだけでなく、典型的
なステロイド薬剤の副作用等を示す短所があった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】このような先行技術の
研究によって、本発明者は、創傷周囲の組織において既
に生成された線維形成誘導性サイトカイン等の作用を抑
制したり、遮断したりして瘢痕形成を防止するのではな
く、より根源的に線維形成誘導性サイトカイン自体の生
成を抑制することによって、創傷部位において瘢痕の形
成を防止することができる手段を集中的に研究し、その
結果、線維形成誘導性サイトカインのｍＲＮＡに対する
特定のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用い
ることによって、このような目的が達成できることを確
認し、本発明を完成するに至った。
研究によって、本発明者は、創傷周囲の組織において既
に生成された線維形成誘導性サイトカイン等の作用を抑
制したり、遮断したりして瘢痕形成を防止するのではな
く、より根源的に線維形成誘導性サイトカイン自体の生
成を抑制することによって、創傷部位において瘢痕の形
成を防止することができる手段を集中的に研究し、その
結果、線維形成誘導性サイトカインのｍＲＮＡに対する
特定のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用い
ることによって、このような目的が達成できることを確
認し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、創傷部位で多
量に分泌され、組織の線維素様変性を刺激する線維形成
誘導性サイトカインのｍＲＮＡに対する新規なアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドを提供するものであ
る。さらに、本発明は、線維形成誘導性サイトカインの
遺伝子発現を抑制し、その結果、創傷部位での瘢痕形成
を抑制するのに充分な量の線維形成誘導性サイトカイン
に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドから
なる瘢痕形成抑制剤組成物を提供するものである。さら
にまた、本発明は、多量の線維形成誘導性サイトカイン
に対する新規アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
の製造方法を提供するものでもある。
量に分泌され、組織の線維素様変性を刺激する線維形成
誘導性サイトカインのｍＲＮＡに対する新規なアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドを提供するものであ
る。さらに、本発明は、線維形成誘導性サイトカインの
遺伝子発現を抑制し、その結果、創傷部位での瘢痕形成
を抑制するのに充分な量の線維形成誘導性サイトカイン
に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドから
なる瘢痕形成抑制剤組成物を提供するものである。さら
にまた、本発明は、多量の線維形成誘導性サイトカイン
に対する新規アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
の製造方法を提供するものでもある。
【００１１】特に、本発明は、線維形成誘導性サイトカ
インのｍＲＮＡに対する相補的配列に結合して線維形成
誘導性サイトカインの遺伝子の発現を抑制することによ
って、動物の創傷部位で瘢痕の形成を実質的にまたは完
全に防止することができる新規なアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドに関するものである。
インのｍＲＮＡに対する相補的配列に結合して線維形成
誘導性サイトカインの遺伝子の発現を抑制することによ
って、動物の創傷部位で瘢痕の形成を実質的にまたは完
全に防止することができる新規なアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドに関するものである。
【００１２】本発明における線維形成誘導性サイトカイ
ンのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチドは、創傷周囲組織に適用すれば、ｍＲＮＡの相
補的配列に結合してハイブリドを形成することによっ
て、線維形成誘導性サイトカインの遺伝子発現を抑制す
る。このようにすることによって、創傷周囲での線維形
成誘導性サイトカインの生成が抑制され、従って、瘢痕
形成を防止することができる。
ンのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチドは、創傷周囲組織に適用すれば、ｍＲＮＡの相
補的配列に結合してハイブリドを形成することによっ
て、線維形成誘導性サイトカインの遺伝子発現を抑制す
る。このようにすることによって、創傷周囲での線維形
成誘導性サイトカインの生成が抑制され、従って、瘢痕
形成を防止することができる。
【００１３】本発明におけるアンチセンスオリゴデオキ
シヌクレオチドは、線維形成誘導性サイトカイン、例え
ば、トランスフォーミング成長因子−β(ＴＧＦ−β)、
血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)、線維芽細胞成長因子
(ＦＧＦ)、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インター
ロイキン−１(ＩＬ−１)およびインターロイキン−(Ｉ
Ｌ−６)等の活性物質のｍＲＮＡに対するものであり、
特に、これらの線維形成誘導性サイトカインの中で最も
強力に線維芽細胞増殖と結合組織の生成を誘導するＴＧ
Ｆ−βおよびＰＤＧＦのｍＲＮＡに対するものである。
シヌクレオチドは、線維形成誘導性サイトカイン、例え
ば、トランスフォーミング成長因子−β(ＴＧＦ−β)、
血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)、線維芽細胞成長因子
(ＦＧＦ)、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インター
ロイキン−１(ＩＬ−１)およびインターロイキン−(Ｉ
Ｌ−６)等の活性物質のｍＲＮＡに対するものであり、
特に、これらの線維形成誘導性サイトカインの中で最も
強力に線維芽細胞増殖と結合組織の生成を誘導するＴＧ
Ｆ−βおよびＰＤＧＦのｍＲＮＡに対するものである。
【００１４】以下に、発明における代表的なアンチセン
スオリゴデオキシヌクレオチドを例示する。
スオリゴデオキシヌクレオチドを例示する。
【００１５】ＴＧＦ−βのｍＲＮＡに対する代表的なア
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド： ５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３'； ５'−ＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧ−３'； ５'−ＧＧＣＴＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣ−３'； ５'−ＡＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣ−３'； ５'−ＣＣＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＴ−３'； ５'−ＧＧＣＡＡＡＡＧＧＴＡＧＧＡＧ−３'； ５'−ＧＡＡＡＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＣ−３'； ５'−ＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧ−３'； ５'−ＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴ−３'；または ５'−ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＡ−３'。
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド： ５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３'； ５'−ＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧ−３'； ５'−ＧＧＣＴＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣ−３'； ５'−ＡＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣ−３'； ５'−ＣＣＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＴ−３'； ５'−ＧＧＣＡＡＡＡＧＧＴＡＧＧＡＧ−３'； ５'−ＧＡＡＡＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＣ−３'； ５'−ＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧ−３'； ５'−ＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴ−３'；または ５'−ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＡ−３'。
【００１６】ＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対するアンチセン
スオリゴデオキシヌクレオチド： ５'−ＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＴ−３'； ５'−ＧＧＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧ−３'； ５'−ＴＡＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣ−３'； ５'−ＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴ−３'； ５'−ＧＧＴＧＧＣＧＣＣＴＧＣＣＡＣＧＡＴ−３'。
スオリゴデオキシヌクレオチド： ５'−ＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＴ−３'； ５'−ＧＧＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧ−３'； ５'−ＴＡＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣ−３'； ５'−ＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴ−３'； ５'−ＧＧＴＧＧＣＧＣＣＴＧＣＣＡＣＧＡＴ−３'。
【００１７】ＩＬ−６のｍＲＮＡに対するアンチセンス
オリゴデオキシヌクレオチド： ５'−ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴ−３'。
オリゴデオキシヌクレオチド： ５'−ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴ−３'。
【００１８】ＰＤＧＦのｍＲＮＡに対するアンチセンス
オリゴデオキシヌクレオチド： ５'−ＣＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＴＣＡＴ−３'； ５'−ＡＡＣＧＣＧＴＡＧＡＴＣＧＡＧ−３'； ５'−ＡＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣ−３'； ５'−ＧＡＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＴＡ−３'； ５'−ＡＣＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＧＧＣ−３'。
オリゴデオキシヌクレオチド： ５'−ＣＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＴＣＡＴ−３'； ５'−ＡＡＣＧＣＧＴＡＧＡＴＣＧＡＧ−３'； ５'−ＡＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣ−３'； ５'−ＧＡＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＴＡ−３'； ５'−ＡＣＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＧＧＣ−３'。
【００１９】本発明におけるアンチセンスオリゴデオキ
シヌクレオチドは通常的な化学的ヌクレオチド合成方法
によって製造できるが、製造の便利上、望ましくは、コ
ンピューター化されたＤＮＡ自動合成機を用いて合成す
る。このような合成過程中の全塩基は、細胞に対して毒
性のない保護基で保護して、ヌクレアーゼによる分解を
防止する。この際、保護基としてはホスホロチオエート
が最も望ましく使用される。しかし、アンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドを皮膚に適用する場合、塩基配
列を変形させても薬効に大きい差がないので、非保護状
態で塩基を合成して使用することもできる。しかし、非
修飾配列は組織中の天然エンドヌクレアーゼに対して非
常に敏感であるので、エンドヌクレアーゼに対して相対
的に高い耐性であるホスホロチオエート基によって修飾
されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、所
望の組織での治療効果期間を延長するために好ましく使
用される。かくして、本発明の線維形成誘導性サイトカ
インに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
は、非修飾形態および修飾(すなわち、保護)誘導体の両
方を含む。このようにして合成されたアンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドは、両末端に適切なリンカーを
結合させた後、このヌクレオチドを適切なベクタープラ
スミドに移入させ、組換えプラスミドを取得した後に、
この組換えプラスミドで適切な宿主細菌を形質転換させ
る。得られた形質転換体を適切な条件下で培養すること
によって、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを
多量に発現させた後、制限酵素によって消化させ、目的
とするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのみを
純粋に分離して、大量に収得することができる。
シヌクレオチドは通常的な化学的ヌクレオチド合成方法
によって製造できるが、製造の便利上、望ましくは、コ
ンピューター化されたＤＮＡ自動合成機を用いて合成す
る。このような合成過程中の全塩基は、細胞に対して毒
性のない保護基で保護して、ヌクレアーゼによる分解を
防止する。この際、保護基としてはホスホロチオエート
が最も望ましく使用される。しかし、アンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドを皮膚に適用する場合、塩基配
列を変形させても薬効に大きい差がないので、非保護状
態で塩基を合成して使用することもできる。しかし、非
修飾配列は組織中の天然エンドヌクレアーゼに対して非
常に敏感であるので、エンドヌクレアーゼに対して相対
的に高い耐性であるホスホロチオエート基によって修飾
されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、所
望の組織での治療効果期間を延長するために好ましく使
用される。かくして、本発明の線維形成誘導性サイトカ
インに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
は、非修飾形態および修飾(すなわち、保護)誘導体の両
方を含む。このようにして合成されたアンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドは、両末端に適切なリンカーを
結合させた後、このヌクレオチドを適切なベクタープラ
スミドに移入させ、組換えプラスミドを取得した後に、
この組換えプラスミドで適切な宿主細菌を形質転換させ
る。得られた形質転換体を適切な条件下で培養すること
によって、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを
多量に発現させた後、制限酵素によって消化させ、目的
とするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのみを
純粋に分離して、大量に収得することができる。
【００２０】上記方法において望ましく使用されている
プラスミドは、例えば、ｐＳＰＴ１８、ｐＳＰＴ１９、
ｐＢluescript、ｐＧＥＭ−３などであり、特に望まし
くは、プラスミドｐＢluescriptが使用される。このよ
うなプラスミドとアンチセンスオリゴデオキシヌクレオ
チドからなる組換えプラスミドで形質転換させるのに望
ましい宿主微生物は、イー・コリ(Ｅ.coli) ＨＢ１０１
である。
プラスミドは、例えば、ｐＳＰＴ１８、ｐＳＰＴ１９、
ｐＢluescript、ｐＧＥＭ−３などであり、特に望まし
くは、プラスミドｐＢluescriptが使用される。このよ
うなプラスミドとアンチセンスオリゴデオキシヌクレオ
チドからなる組換えプラスミドで形質転換させるのに望
ましい宿主微生物は、イー・コリ(Ｅ.coli) ＨＢ１０１
である。
【００２１】このようにして製造されたアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドは、上記のとおり、創傷周囲
に多量に分泌されることが知られている線維形成誘導性
サイトカインの生成を抑制することができるので、創傷
部位に対する瘢痕形成抑制剤として使用することができ
る。
リゴデオキシヌクレオチドは、上記のとおり、創傷周囲
に多量に分泌されることが知られている線維形成誘導性
サイトカインの生成を抑制することができるので、創傷
部位に対する瘢痕形成抑制剤として使用することができ
る。
【００２２】したがって、本発明は、さらに、ヒトを含
む温血哺乳動物における、上記のような新規なアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドの瘢痕形成抑制剤とし
ての用途に関するものである。
む温血哺乳動物における、上記のような新規なアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドの瘢痕形成抑制剤とし
ての用途に関するものである。
【００２３】瘢痕形成抑制剤として使用する場合、本発
明におけるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
は、１種の線維形成誘導性サイトカインに対するものを
単独に使用することができるが、所望により、２種以上
の線維形成誘導性サイトカインに対するアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドを混合して使用することもで
きる。例えば、ＴＧＦ−βに対するアンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチドをＴＮＦ−αに対するアンチセン
スオリゴデオキシヌクレオチドと混合して使用すれば、
より速い創傷治癒効果を得ることができる。
明におけるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
は、１種の線維形成誘導性サイトカインに対するものを
単独に使用することができるが、所望により、２種以上
の線維形成誘導性サイトカインに対するアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドを混合して使用することもで
きる。例えば、ＴＧＦ−βに対するアンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチドをＴＮＦ−αに対するアンチセン
スオリゴデオキシヌクレオチドと混合して使用すれば、
より速い創傷治癒効果を得ることができる。
【００２４】本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチドは、医薬的に許容される慣用の担体とともに医
薬的に許容される製剤の形態に、例えば、注射剤、噴霧
剤、軟膏剤、クリーム剤などの形態に製剤化し、全身投
与したり、創傷部位に局所適用して利用できる。このよ
うな製剤化に使用される医薬的に許容される慣用の担体
には、注射用としては注射用蒸留水、リン酸塩緩衝液、
生理食塩水などが包含され、噴霧剤用としてはエタノー
ル、プロピレングリコール、グリセリンまたは噴射剤(p
ropellant)などが包含され、軟膏剤およびクリーム剤な
どの局所投与用製剤用としてはポリエチレングリコー
ル、流動パラフィン、カルナウバワックスなどが含まれ
る。
レオチドは、医薬的に許容される慣用の担体とともに医
薬的に許容される製剤の形態に、例えば、注射剤、噴霧
剤、軟膏剤、クリーム剤などの形態に製剤化し、全身投
与したり、創傷部位に局所適用して利用できる。このよ
うな製剤化に使用される医薬的に許容される慣用の担体
には、注射用としては注射用蒸留水、リン酸塩緩衝液、
生理食塩水などが包含され、噴霧剤用としてはエタノー
ル、プロピレングリコール、グリセリンまたは噴射剤(p
ropellant)などが包含され、軟膏剤およびクリーム剤な
どの局所投与用製剤用としてはポリエチレングリコー
ル、流動パラフィン、カルナウバワックスなどが含まれ
る。
【００２５】本発明における線維形成誘導性サイトカイ
ンに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの
使用量は、創傷部位の範囲、程度など、および適用対象
の状態によって変わるが、一般に、１日に当たり３乃至
５回、毎回約１０μＭずつ、最も好ましくは、１日当た
り５０μＭを使用する。好ましくは、本発明におけるア
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、クリーム
剤、軟膏剤、ローション剤などの形態で皮膚に局所投与
されるか、または皮下注射によって投与される。
ンに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの
使用量は、創傷部位の範囲、程度など、および適用対象
の状態によって変わるが、一般に、１日に当たり３乃至
５回、毎回約１０μＭずつ、最も好ましくは、１日当た
り５０μＭを使用する。好ましくは、本発明におけるア
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、クリーム
剤、軟膏剤、ローション剤などの形態で皮膚に局所投与
されるか、または皮下注射によって投与される。
【００２６】本発明におけるアンチセンスオリゴデオキ
シヌクレオチドは、さらに、組織の線維素様変性による
瘢痕形成に関与する線維形成誘導性サイトカインの遺伝
子発現過程においてのみ作用するものであり、特別な副
作用や毒性は惹起させず、しかも治療の目的で上記で言
及したとおり、１０μＭ程度の極微量を使用するので、
本発明におけるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ
ドは、薬物アレルギー、光過敏反応などを含む副作用の
発生は実質的にない。
シヌクレオチドは、さらに、組織の線維素様変性による
瘢痕形成に関与する線維形成誘導性サイトカインの遺伝
子発現過程においてのみ作用するものであり、特別な副
作用や毒性は惹起させず、しかも治療の目的で上記で言
及したとおり、１０μＭ程度の極微量を使用するので、
本発明におけるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ
ドは、薬物アレルギー、光過敏反応などを含む副作用の
発生は実質的にない。
【００２７】以下の実施例によって、本発明を、さらに
具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例で限定
されるものではない。
具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例で限定
されるものではない。
【００２８】
実施例１ ＴＧＦ−βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドである５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧ
ＡＡＣＡＧＧＧＣ−３'の合成 カートリッジ洗浄のためのアセトニトリル、塩基の保護
基を除去するためのジクロロ酢酸および水分除去のため
の単分散プラスチックビーズを各々含む瓶が連結されて
おり、出発物質として塩基Ｃ(シトシン)を使用し、所定
量の塩基Ａ(アデニン)、Ｇ(グアニン)およびＣ(シトシ
ン)を所定の順序で導入せしめるように調節されたＤＮ
Ａ自動合成機であるジーン・アセンブラー・スペシャル
(ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ ＳＰＥＣＩＡＬ：Ｐhar
macia,ＬＫＢ)を室温にて２.５時間作動させ、目的とす
るＴＧＦ−βに対するアンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチドである５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＡ
ＧＧＧＣ−３'を合成した。
キシヌクレオチドである５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧ
ＡＡＣＡＧＧＧＣ−３'の合成 カートリッジ洗浄のためのアセトニトリル、塩基の保護
基を除去するためのジクロロ酢酸および水分除去のため
の単分散プラスチックビーズを各々含む瓶が連結されて
おり、出発物質として塩基Ｃ(シトシン)を使用し、所定
量の塩基Ａ(アデニン)、Ｇ(グアニン)およびＣ(シトシ
ン)を所定の順序で導入せしめるように調節されたＤＮ
Ａ自動合成機であるジーン・アセンブラー・スペシャル
(ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ ＳＰＥＣＩＡＬ：Ｐhar
macia,ＬＫＢ)を室温にて２.５時間作動させ、目的とす
るＴＧＦ−βに対するアンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチドである５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＡ
ＧＧＧＣ−３'を合成した。
【００２９】上記より合成されたアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドの両末端に、ＡpaＩに対する切断部
位を提供するリンカー配列ＧＧＧＣＣを結合させた後、
得られたヌクレオチド配列をプラスミドｐＢluescript
のＡpaＩ切断部位に移入して、組換え発現プラスミドを
得た。得られた組換えプラスミドを宿主菌株であるイー
・コリ ＨＢ１０１中に導入して形質転換体を得た。該
形質転換体イー・コリＨＢ１０１をＬＢ培地(ルリア−
バータニ(Ｌuria−Ｂertani)ブロス１リットル；バクロ
−トリプトン(Ｂacto−tryptone)１０ｇ、バクト−酵母
抽出物(Ｂacto−yeast extract)５ｇ、ＮaＣl ５ｇ、１
Ｎ ＮaＯＨ １ml)で３７℃で約１６時間培養して、目的
とするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発現
させた。単離されたプラスミドを制限酵素ＡpaＩで消化
させて、目的とする配列の純粋なアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドを得た。分光光度計を使用して、２
６０nmにおいて、生成物の吸光度を測定した。目的生成
物の収率は９２％であった。生成されたアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドの塩基配列分析および電気泳
動(「図１」)によって、目的とする標記アンチセンス配列
が得られたことを確認した。
オキシヌクレオチドの両末端に、ＡpaＩに対する切断部
位を提供するリンカー配列ＧＧＧＣＣを結合させた後、
得られたヌクレオチド配列をプラスミドｐＢluescript
のＡpaＩ切断部位に移入して、組換え発現プラスミドを
得た。得られた組換えプラスミドを宿主菌株であるイー
・コリ ＨＢ１０１中に導入して形質転換体を得た。該
形質転換体イー・コリＨＢ１０１をＬＢ培地(ルリア−
バータニ(Ｌuria−Ｂertani)ブロス１リットル；バクロ
−トリプトン(Ｂacto−tryptone)１０ｇ、バクト−酵母
抽出物(Ｂacto−yeast extract)５ｇ、ＮaＣl ５ｇ、１
Ｎ ＮaＯＨ １ml)で３７℃で約１６時間培養して、目的
とするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発現
させた。単離されたプラスミドを制限酵素ＡpaＩで消化
させて、目的とする配列の純粋なアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドを得た。分光光度計を使用して、２
６０nmにおいて、生成物の吸光度を測定した。目的生成
物の収率は９２％であった。生成されたアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドの塩基配列分析および電気泳
動(「図１」)によって、目的とする標記アンチセンス配列
が得られたことを確認した。
【００３０】実施例２ ＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドである５'−ＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧ
ＣＴＣＡＴ−３'の合成 カートリッジ洗浄のためのアセトニトリル、塩基の保護
基を除去するためのジクロロ酢酸および水分除去のため
の単分散プラスチックビーズを各々含む瓶が連結されて
おり、所定量の塩基Ａ(アデニン)、Ｇ(グアニン)、Ｃ
(シトシン)およびＴ(チミン)を、所定の順序で導入せし
めるように調節されたＤＮＡ自動合成機であるジーン・
アセンブラー・スペシャル(ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥ
Ｒ ＳＰＥＣＩＡＬ；Ｐharmacia,ＬＫＢ)を室温にて２.
５時間作動させて、目的とするＴＮＦ−αに対するアン
チセンスオリゴデオキシヌクレオチドである５'−ＡＧ
ＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＴ−３'を合成した。
キシヌクレオチドである５'−ＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧ
ＣＴＣＡＴ−３'の合成 カートリッジ洗浄のためのアセトニトリル、塩基の保護
基を除去するためのジクロロ酢酸および水分除去のため
の単分散プラスチックビーズを各々含む瓶が連結されて
おり、所定量の塩基Ａ(アデニン)、Ｇ(グアニン)、Ｃ
(シトシン)およびＴ(チミン)を、所定の順序で導入せし
めるように調節されたＤＮＡ自動合成機であるジーン・
アセンブラー・スペシャル(ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥ
Ｒ ＳＰＥＣＩＡＬ；Ｐharmacia,ＬＫＢ)を室温にて２.
５時間作動させて、目的とするＴＮＦ−αに対するアン
チセンスオリゴデオキシヌクレオチドである５'−ＡＧ
ＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＴ−３'を合成した。
【００３１】上記で合成されたアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドの両末端にＨindIIIに対する切断部位
を提供するリンカー配列ＡＡを結合させた後、得られた
ヌクレオチド配列をプラスミドｐＢluescriptのＨind I
II切断部位に移入させて、組換え発現プラスミドを得
た。次いで、得られた組換えプラスミドを宿主菌株であ
るイー・コリ ＨＢ１０１に導入して形質転換体を得
た。形質転換体イー・コリ ＨＢ１０１をＬＢ培地で３
７℃で約１６時間培養して、目的とするアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドを発現させた。単離されたプ
ラスミドを制限酵素Ｈind IIIで消化して、目的とする
配列の純粋なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
を得た。分光光度計を使用して、２６０nmにおいて、生
成物の吸光度を測定した。目的生成物の収率は９０％で
あった。生成されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドの塩基配列分析および電気泳動によって、目的と
する標記アンチセンス配列が得られたことを確認した。
キシヌクレオチドの両末端にＨindIIIに対する切断部位
を提供するリンカー配列ＡＡを結合させた後、得られた
ヌクレオチド配列をプラスミドｐＢluescriptのＨind I
II切断部位に移入させて、組換え発現プラスミドを得
た。次いで、得られた組換えプラスミドを宿主菌株であ
るイー・コリ ＨＢ１０１に導入して形質転換体を得
た。形質転換体イー・コリ ＨＢ１０１をＬＢ培地で３
７℃で約１６時間培養して、目的とするアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドを発現させた。単離されたプ
ラスミドを制限酵素Ｈind IIIで消化して、目的とする
配列の純粋なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
を得た。分光光度計を使用して、２６０nmにおいて、生
成物の吸光度を測定した。目的生成物の収率は９０％で
あった。生成されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドの塩基配列分析および電気泳動によって、目的と
する標記アンチセンス配列が得られたことを確認した。
【００３２】実施例３ ＰＤＧＦのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴデオキ
シヌクレオチドである５'−ＡＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＡ
ＧＧＣ−３'の合成 カートリッジ洗浄のためのアセトニトリル、塩基の保護
基を除去するためのジクロロ酢酸および水分除去のため
の単分散プラスチックビーズを各々含む瓶が連結されて
おり、所定量の塩基Ａ(アデニン)、Ｇ(グアニン)、Ｃ
(シトシン)およびＴ(チミン)を所定の順序で導入せしめ
るように調節されたＤＮＡ自動合成機であるジーン・ア
センブラー・スペシャル(ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ
ＳＰＥＣＩＡＬ；Ｐharmacia,ＬＫＢ)を室温にて２.５
時間作動させて、目的とするＰＤＧＦに対するアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドである５'−ＡＴＣＡ
ＧＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣ−３'を合成した。
シヌクレオチドである５'−ＡＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＡ
ＧＧＣ−３'の合成 カートリッジ洗浄のためのアセトニトリル、塩基の保護
基を除去するためのジクロロ酢酸および水分除去のため
の単分散プラスチックビーズを各々含む瓶が連結されて
おり、所定量の塩基Ａ(アデニン)、Ｇ(グアニン)、Ｃ
(シトシン)およびＴ(チミン)を所定の順序で導入せしめ
るように調節されたＤＮＡ自動合成機であるジーン・ア
センブラー・スペシャル(ＧＥＮＥ ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ
ＳＰＥＣＩＡＬ；Ｐharmacia,ＬＫＢ)を室温にて２.５
時間作動させて、目的とするＰＤＧＦに対するアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドである５'−ＡＴＣＡ
ＧＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣ−３'を合成した。
【００３３】上記より合成されたアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドの両末端に、ＣlaＩに対する切断部
位を提供するリンカー配列ＡＴＣＧを結合させた後、得
られたヌクレオチド配列をプラスミドｐＢluescriptの
ＣlaＩ切断部位に移入させて組換え発現プラスミドを得
た。
オキシヌクレオチドの両末端に、ＣlaＩに対する切断部
位を提供するリンカー配列ＡＴＣＧを結合させた後、得
られたヌクレオチド配列をプラスミドｐＢluescriptの
ＣlaＩ切断部位に移入させて組換え発現プラスミドを得
た。
【００３４】次いで、得られた組換えプラスミドを宿主
菌株であるイー・コリ ＨＢ１０１中に導入して形質転
換体を得た。得られた形質転換体イー・コリ ＨＢ１０
１をＬＢ培地で３７℃で約１６時間培養して、目的とす
るアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発現させ
た。単離されたプラスミドを制限酵素ＣlaＩで消化して
目的とする配列の純粋なアンチセンスオリゴデオキシヌ
クレオチドを得た。分光光度計を使用して、２６０nmに
おいて、生成物の吸光度を測定した。目的生成物の収率
は９２％であった。生成されたアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドの塩基配列分析および電気泳動(「図
１」)によって、目的とする標記アンチセンス配列が得ら
れたことを確認した。
菌株であるイー・コリ ＨＢ１０１中に導入して形質転
換体を得た。得られた形質転換体イー・コリ ＨＢ１０
１をＬＢ培地で３７℃で約１６時間培養して、目的とす
るアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発現させ
た。単離されたプラスミドを制限酵素ＣlaＩで消化して
目的とする配列の純粋なアンチセンスオリゴデオキシヌ
クレオチドを得た。分光光度計を使用して、２６０nmに
おいて、生成物の吸光度を測定した。目的生成物の収率
は９２％であった。生成されたアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドの塩基配列分析および電気泳動(「図
１」)によって、目的とする標記アンチセンス配列が得ら
れたことを確認した。
【００３５】実施例４ ＴＧＦ−βに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドが遺伝子発現に及ぼす影響 実験的に創傷を誘発させた動物に、線維形成誘導性サイ
トカイン中で代表的なＴＧＦ−βに対するアンチセンス
オリゴデオキシヌクレオチドを投与し、投与しなかった
対照群と比較して、投与されたアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドがサイトカインの発現に及ぼす影響を
評価した。
オチドが遺伝子発現に及ぼす影響 実験的に創傷を誘発させた動物に、線維形成誘導性サイ
トカイン中で代表的なＴＧＦ−βに対するアンチセンス
オリゴデオキシヌクレオチドを投与し、投与しなかった
対照群と比較して、投与されたアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドがサイトカインの発現に及ぼす影響を
評価した。
【００３６】１) Ｂalb／Ｃマウスをエーテルで麻酔し
た後、背中部位の毛髪を、毛髪切削機およびチオグリコ
ール酸を用いて完全に除去し、正中央から四肢までの間
を同一の間隔で４カ所、筋肉の真上部分まで切断し、縫
合せずに自然的に治癒を誘導した。この際、１グループ
のマウスには、実施例１で製造したＴＧＦ−βに対する
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(５'−ＣＣＧ
ＡＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３')(皮膚への局
所投与に適している賦形剤に溶解または懸濁させた)を
５０μＭの濃度で局所投与して処理し、このような処理
を行わない他の１グループのマウスを対照群にして、各
グループにおいて、外傷治癒期間の経過として、線維形
成誘導性サイトカインの発現を測定した。
た後、背中部位の毛髪を、毛髪切削機およびチオグリコ
ール酸を用いて完全に除去し、正中央から四肢までの間
を同一の間隔で４カ所、筋肉の真上部分まで切断し、縫
合せずに自然的に治癒を誘導した。この際、１グループ
のマウスには、実施例１で製造したＴＧＦ−βに対する
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(５'−ＣＣＧ
ＡＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３')(皮膚への局
所投与に適している賦形剤に溶解または懸濁させた)を
５０μＭの濃度で局所投与して処理し、このような処理
を行わない他の１グループのマウスを対照群にして、各
グループにおいて、外傷治癒期間の経過として、線維形
成誘導性サイトカインの発現を測定した。
【００３７】創傷形成の直後および創傷形成の１、２、
３、５および１０週間後に、各グループのマウスから創
傷部分の組織を分離して細胞を収集した。収集した細胞
をＣa2+、Ｍg2+およびＲＮaseを含有しないＰＢＳで洗
浄した後、ＮＰ−４０溶解緩衝液(lysis buffer)[０.５
％ＮＰ−４０、１０mＭトリス−Ｃl(pＨ８.０)、１００
mＭ ＮaＣl、３mＭ ＭgＣl2、１０００Ｕ／ml ＲＮＡsi
n(プロメガ(Ｐromega))]中に導入し、１２０００rpmで
２分間遠心して細胞核を除去した。次いで、上清は分離
して、直接ＲＮＡの原料として使用することができる。
３、５および１０週間後に、各グループのマウスから創
傷部分の組織を分離して細胞を収集した。収集した細胞
をＣa2+、Ｍg2+およびＲＮaseを含有しないＰＢＳで洗
浄した後、ＮＰ−４０溶解緩衝液(lysis buffer)[０.５
％ＮＰ−４０、１０mＭトリス−Ｃl(pＨ８.０)、１００
mＭ ＮaＣl、３mＭ ＭgＣl2、１０００Ｕ／ml ＲＮＡsi
n(プロメガ(Ｐromega))]中に導入し、１２０００rpmで
２分間遠心して細胞核を除去した。次いで、上清は分離
して、直接ＲＮＡの原料として使用することができる。
【００３８】別法としては、１×１０8個の細胞をＧＩ
Ｔ緩衝液[４Ｍ グアニジンチオシアネート、５０mＭト
リス−Ｃl(pＨ８.０)、１０mＭ ＥＤＴＡ(エチレンジア
ミン四酢酸)、０.５％ラウリルサルコシンナトリウム、
０.１Ｍメルカプトエタノール]４mlに溶解した後、５.
７Ｍ ＣsＣl緩衝液７mlに負荷させ、８００００rpm、２
５℃で約２時間遠心した。このようにして試験管下部と
壁に付着している総ＲＮＡを得た後、ポリ(Ａ)+ｍＲＮ
Ａを純粋に分離するために、溶離液としてＴＥ緩衝液を
使用して適正量のオリゴテックス(oligotex)−dＴを、
得られたＲＮＡに添加した。該混合物を６５℃で５分間
加熱した後、氷で急冷し、次いで、１／１０容積の５Ｍ
ＮaＣl溶液を加えて３７℃で５乃至１０分間培養し
た。その後、１５０００rpmで５乃至１０分間遠心し、
上清を除去した後、滅菌蒸留水を加えて混合し、再度、
６５℃で５分間加熱し、次いで、１５０００rpmで５乃
至１０分間遠心した。上清をそのままエタノールで沈殿
させた後、ジエチルピロカルボネート(ＤＥＰＣ)−ｄＨ
2Ｏに溶解して所望のｍＲＮＡを得ることができた。
Ｔ緩衝液[４Ｍ グアニジンチオシアネート、５０mＭト
リス−Ｃl(pＨ８.０)、１０mＭ ＥＤＴＡ(エチレンジア
ミン四酢酸)、０.５％ラウリルサルコシンナトリウム、
０.１Ｍメルカプトエタノール]４mlに溶解した後、５.
７Ｍ ＣsＣl緩衝液７mlに負荷させ、８００００rpm、２
５℃で約２時間遠心した。このようにして試験管下部と
壁に付着している総ＲＮＡを得た後、ポリ(Ａ)+ｍＲＮ
Ａを純粋に分離するために、溶離液としてＴＥ緩衝液を
使用して適正量のオリゴテックス(oligotex)−dＴを、
得られたＲＮＡに添加した。該混合物を６５℃で５分間
加熱した後、氷で急冷し、次いで、１／１０容積の５Ｍ
ＮaＣl溶液を加えて３７℃で５乃至１０分間培養し
た。その後、１５０００rpmで５乃至１０分間遠心し、
上清を除去した後、滅菌蒸留水を加えて混合し、再度、
６５℃で５分間加熱し、次いで、１５０００rpmで５乃
至１０分間遠心した。上清をそのままエタノールで沈殿
させた後、ジエチルピロカルボネート(ＤＥＰＣ)−ｄＨ
2Ｏに溶解して所望のｍＲＮＡを得ることができた。
【００３９】上記方法によって得られたｍＲＮＡを６５
乃至７５℃で１０分間変性させる。変性されたｍＲＮＡ
１〜２μg、オリゴ(ｄＴ)12-18(ファルマシア(Ｐharma
cia))０.５μg、１×Ｔaqポリメラーゼ緩衝液(５０mＭ
トリス−Ｃl、pＨ８.３、３mＭ ＭgＣl2、２５０μg／m
l ＢＳＡ)、ｄＮＴＰ １.２５mＭ、ＭgＣl2２.５mＭ、
ＲＮＡsin(ＢＲＬ)２０単位およびネズミ逆転写酵素(Ｂ
ＲＬ)１００単位を、ＲＮＡseを含有しない試験管に入
れて、ここに最終容積が２０μlになるようにＤＥＰＣ
−ｄＨ2Ｏを加えた。充分に攪拌した後、３７℃で１時
間反応させた[モレキュラー・クローニング(Ｍolecular
Ｃloning)、第II巻、１４、第２０〜２１頁を参照]。
次いで、９５℃で５分間加熱して反応を終結させた後、
ＮaＯＨでアルカリ処理して一本鎖ｃＤＮＡを得、次い
で、これをポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)のための鋳型
として使用する。
乃至７５℃で１０分間変性させる。変性されたｍＲＮＡ
１〜２μg、オリゴ(ｄＴ)12-18(ファルマシア(Ｐharma
cia))０.５μg、１×Ｔaqポリメラーゼ緩衝液(５０mＭ
トリス−Ｃl、pＨ８.３、３mＭ ＭgＣl2、２５０μg／m
l ＢＳＡ)、ｄＮＴＰ １.２５mＭ、ＭgＣl2２.５mＭ、
ＲＮＡsin(ＢＲＬ)２０単位およびネズミ逆転写酵素(Ｂ
ＲＬ)１００単位を、ＲＮＡseを含有しない試験管に入
れて、ここに最終容積が２０μlになるようにＤＥＰＣ
−ｄＨ2Ｏを加えた。充分に攪拌した後、３７℃で１時
間反応させた[モレキュラー・クローニング(Ｍolecular
Ｃloning)、第II巻、１４、第２０〜２１頁を参照]。
次いで、９５℃で５分間加熱して反応を終結させた後、
ＮaＯＨでアルカリ処理して一本鎖ｃＤＮＡを得、次い
で、これをポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)のための鋳型
として使用する。
【００４０】０.５mlのエッペンドルフ(eppendorf)試験
管に１×Ｔaqポリメラーゼ緩衝液(５０mＭトリス−Ｃ
l、pＨ８.３、３mＭ ＭgＣl2、２５０μg／ml ＢＳ
Ａ)、ｄＮＴＰ ２００μＭ、プライマー５'−ＧＧＧＡ
ＡＡＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＣ−３'および５'−Ｃ
ＴＧＡＡＧＣＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣ−３'各０.２
５μＭ(１０pmol)、上記で生成したｃＤＮＡ ２μgおよ
びＴaqポリメラーゼ０.１Ｕを導入し、次いで、反応液
の総容積が１０μlになるように、滅菌されたdＨ2Ｏを
加え、充分に混合した。その後、試験管を短時間遠心
し、該試験管の壁に付着している反応液を試験管の下部
に集めた。この反応液を、気泡が入らないように気をつ
けながら、ガラス製の毛細管に移し、毛細管の両末端を
加熱溶融して密封した。その後、サーマルサイクラー(t
hermal cycler、ＦＴＣ−２０００)を使用して、１つの
サイクルを９５℃で５秒、５５℃で５秒、７２℃で１５
秒間に指定して、３５〜４５サイクルを繰り返すことに
よってＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡを１％シ
ーケム(Ｓeakem)アガロースゲルを使用して電気泳動に
付した後、臭化エチジウム溶液５０μg／mlを使用して
染色し、次いで、ＵＶ透視器(ＵＶ transilluminator)
を使用して確認した。その結果、本発明のＴＧＦ−βに
対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを投与
したマウスの組織においては、臭化エチジウム染色の強
度は、非処理対照群の組織における染色強度に比べて非
常に弱かった。このような結果より、ＴＧＦ−βに対す
るアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、ＴＧＦ
−βの構造遺伝子の前の部分に結合してＴＧＦ−βの発
現を濃度依存的に特異的に抑制することが分かった。し
たがって、このような濃度依存的抑制の結果に基づい
て、創傷部位の細胞数によってＴＧＦ−βの発現を完全
に抑制することができるアンチセンスオリゴデオキシヌ
クレオチドの量が決定され、次いで、臨床的に効果的な
創傷治癒を誘導できる理想的な用量として用いられる。
管に１×Ｔaqポリメラーゼ緩衝液(５０mＭトリス−Ｃ
l、pＨ８.３、３mＭ ＭgＣl2、２５０μg／ml ＢＳ
Ａ)、ｄＮＴＰ ２００μＭ、プライマー５'−ＧＧＧＡ
ＡＡＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＣ−３'および５'−Ｃ
ＴＧＡＡＧＣＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣ−３'各０.２
５μＭ(１０pmol)、上記で生成したｃＤＮＡ ２μgおよ
びＴaqポリメラーゼ０.１Ｕを導入し、次いで、反応液
の総容積が１０μlになるように、滅菌されたdＨ2Ｏを
加え、充分に混合した。その後、試験管を短時間遠心
し、該試験管の壁に付着している反応液を試験管の下部
に集めた。この反応液を、気泡が入らないように気をつ
けながら、ガラス製の毛細管に移し、毛細管の両末端を
加熱溶融して密封した。その後、サーマルサイクラー(t
hermal cycler、ＦＴＣ−２０００)を使用して、１つの
サイクルを９５℃で５秒、５５℃で５秒、７２℃で１５
秒間に指定して、３５〜４５サイクルを繰り返すことに
よってＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡを１％シ
ーケム(Ｓeakem)アガロースゲルを使用して電気泳動に
付した後、臭化エチジウム溶液５０μg／mlを使用して
染色し、次いで、ＵＶ透視器(ＵＶ transilluminator)
を使用して確認した。その結果、本発明のＴＧＦ−βに
対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを投与
したマウスの組織においては、臭化エチジウム染色の強
度は、非処理対照群の組織における染色強度に比べて非
常に弱かった。このような結果より、ＴＧＦ−βに対す
るアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、ＴＧＦ
−βの構造遺伝子の前の部分に結合してＴＧＦ−βの発
現を濃度依存的に特異的に抑制することが分かった。し
たがって、このような濃度依存的抑制の結果に基づい
て、創傷部位の細胞数によってＴＧＦ−βの発現を完全
に抑制することができるアンチセンスオリゴデオキシヌ
クレオチドの量が決定され、次いで、臨床的に効果的な
創傷治癒を誘導できる理想的な用量として用いられる。
【００４１】２) in situハイブリダイゼーション：目
的とするＴＧＦ−β遺伝子をプラスミドベクターｐＢlu
escript(クロンテク(Ｃlontech)から購入)の相応するＥ
coＲＩ切断部位に挿入して組換えプラスミドを生成し、
次いで、この組換えプラスミドをイー・コリ ＨＢ１０
１内に移入させて形質転換体を得た。得られた形質転換
イー・コリ ＨＢ１０１を培養して目的とするプラスミ
ドを大量に得、これを塩化セシウム(ＣsＣl)勾配遠心器
(１ｇ／ml ＣsＣl、７４０μg／ml臭化エチジウム＋プ
ラスミドＤＮＡ、１００,０００rpm、１０時間)で精製
した。その後、ＲＮＡ標識化キット(ビー・エム・カン
パニー,リミテッド(Ｂ.Ｍ.Ｃo.,Ｌtd.)製)を利用して、
ＳＰ６(またはＴ３)Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるin v
itro転写を３７℃で１〜２時間行った。転写反応が終了
した後、ＤＮase Ｉによって鋳型ＤＮＡを分解し、エタ
ノール沈殿させて、転写産物であるＲＮＡプローブを回
収した。回収したＲＮＡプローブを１０mＭ ＤＴＴ、１
０mＭトリス−ＨＣl、１mＭ ＥＤＴＡ(pＨ７.６)５０μ
lに溶解し、ハイブリダイゼーションに使用した。反応
終了後、該反応混合物に同量の中和緩衝液(３００mＭ
ＣＨ3ＣＯＯＮa、pＨ６.０、１％ＣＨ3ＣＯＯＨ、１０m
ＭＤＴＴ)を添加し、次いで、エタノール沈殿させて、
目的とするプローブを回収した。
的とするＴＧＦ−β遺伝子をプラスミドベクターｐＢlu
escript(クロンテク(Ｃlontech)から購入)の相応するＥ
coＲＩ切断部位に挿入して組換えプラスミドを生成し、
次いで、この組換えプラスミドをイー・コリ ＨＢ１０
１内に移入させて形質転換体を得た。得られた形質転換
イー・コリ ＨＢ１０１を培養して目的とするプラスミ
ドを大量に得、これを塩化セシウム(ＣsＣl)勾配遠心器
(１ｇ／ml ＣsＣl、７４０μg／ml臭化エチジウム＋プ
ラスミドＤＮＡ、１００,０００rpm、１０時間)で精製
した。その後、ＲＮＡ標識化キット(ビー・エム・カン
パニー,リミテッド(Ｂ.Ｍ.Ｃo.,Ｌtd.)製)を利用して、
ＳＰ６(またはＴ３)Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるin v
itro転写を３７℃で１〜２時間行った。転写反応が終了
した後、ＤＮase Ｉによって鋳型ＤＮＡを分解し、エタ
ノール沈殿させて、転写産物であるＲＮＡプローブを回
収した。回収したＲＮＡプローブを１０mＭ ＤＴＴ、１
０mＭトリス−ＨＣl、１mＭ ＥＤＴＡ(pＨ７.６)５０μ
lに溶解し、ハイブリダイゼーションに使用した。反応
終了後、該反応混合物に同量の中和緩衝液(３００mＭ
ＣＨ3ＣＯＯＮa、pＨ６.０、１％ＣＨ3ＣＯＯＨ、１０m
ＭＤＴＴ)を添加し、次いで、エタノール沈殿させて、
目的とするプローブを回収した。
【００４２】ハイブリダイゼーション反応液(５０％脱
イオン化ホルムアミド、１０mＭトリス−ＨＣl、pＨ７.
６、ＲＮaseを含有しないｔＲＮＡ ２００μg／ml、１
×デンハルト(Ｄenhardt)溶液、１０％デキストラン硫
酸、６００mＭ ＮaＣl、０.２５％ ＳＤＳからなる)１
００μlに、上記で得たプローブ０.５μgを加えて混合
した後、上記１)から得たマウス創傷組織が付着してい
る前処理した各々のスライドグラス上に、この混合物を
５０〜１００μlずつ置いて、該スライドグラスをカバ
ーグラスで覆ったまま１６〜２２時間ハイブリダイゼー
ションに付した。
イオン化ホルムアミド、１０mＭトリス−ＨＣl、pＨ７.
６、ＲＮaseを含有しないｔＲＮＡ ２００μg／ml、１
×デンハルト(Ｄenhardt)溶液、１０％デキストラン硫
酸、６００mＭ ＮaＣl、０.２５％ ＳＤＳからなる)１
００μlに、上記で得たプローブ０.５μgを加えて混合
した後、上記１)から得たマウス創傷組織が付着してい
る前処理した各々のスライドグラス上に、この混合物を
５０〜１００μlずつ置いて、該スライドグラスをカバ
ーグラスで覆ったまま１６〜２２時間ハイブリダイゼー
ションに付した。
【００４３】ハイブリダイゼーションの終了後、５×Ｓ
ＳＣ中、５０℃で、スライドグラスからカバーグラスを
除去し、ハイブリダイズ生成物をＲＮaseで処理して不
必要なシグナルを除去した。
ＳＣ中、５０℃で、スライドグラスからカバーグラスを
除去し、ハイブリダイズ生成物をＲＮaseで処理して不
必要なシグナルを除去した。
【００４４】ハイブリダイズ生成物について、ＤＩＧ
ＥＬＩＳＡ ＤＮＡ標識化および検出キット(ビー・エム
・カンパニー,リミテッド(Ｂ.Ｍ.Ｃo.,Ｌtd.))を使用し
て発色反応を行った。すなわち、上記で得たハイブリダ
イズ生成物を１００mＭトリス−ＨＣl、pＨ７.５、１５
０mＭ ＮaＣl(ＴＳ)中で約５分間放置した後、取り出
し、再度、ＴＳ中に脂肪および糖を含有しない乾燥牛乳
粉末を濃度１.５％として溶解した遮断液に入れ、室温
で３０分間放置した。その後、ここに５００〜１０００
倍量のＴＳで希釈したアルカリホスファターゼ結合アン
チジゴキシゲニン抗体０.２単位を添加し、該混合物を
３０〜６０分間反応させた。反応が終わった後、生成物
をＴＳ中で１５分間ずつ２回洗浄し、１００mＭトリス
−ＨＣl、pＨ９.５、１００mＭ ＮaＣl、５００mＭ Ｍg
Ｃl2(ＴＳＭ)中で簡単に洗浄した。次いで、ＴＳＭで希
釈したニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)および５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸(ＢＣＩＰ)
液で１〜２日間染色した。次いで、ＴＥ緩衝液(トリス
−ＨＣl １０mmol／リットル、ＥＤＴＡ １mmol／リッ
トル、pＨ８.０)を添加して発色反応を中止させ、スラ
イドグラスを水溶性封入剤(aqueous crystal mount)で
封入した。染色された状態で結果を判読した。
ＥＬＩＳＡ ＤＮＡ標識化および検出キット(ビー・エム
・カンパニー,リミテッド(Ｂ.Ｍ.Ｃo.,Ｌtd.))を使用し
て発色反応を行った。すなわち、上記で得たハイブリダ
イズ生成物を１００mＭトリス−ＨＣl、pＨ７.５、１５
０mＭ ＮaＣl(ＴＳ)中で約５分間放置した後、取り出
し、再度、ＴＳ中に脂肪および糖を含有しない乾燥牛乳
粉末を濃度１.５％として溶解した遮断液に入れ、室温
で３０分間放置した。その後、ここに５００〜１０００
倍量のＴＳで希釈したアルカリホスファターゼ結合アン
チジゴキシゲニン抗体０.２単位を添加し、該混合物を
３０〜６０分間反応させた。反応が終わった後、生成物
をＴＳ中で１５分間ずつ２回洗浄し、１００mＭトリス
−ＨＣl、pＨ９.５、１００mＭ ＮaＣl、５００mＭ Ｍg
Ｃl2(ＴＳＭ)中で簡単に洗浄した。次いで、ＴＳＭで希
釈したニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)および５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸(ＢＣＩＰ)
液で１〜２日間染色した。次いで、ＴＥ緩衝液(トリス
−ＨＣl １０mmol／リットル、ＥＤＴＡ １mmol／リッ
トル、pＨ８.０)を添加して発色反応を中止させ、スラ
イドグラスを水溶性封入剤(aqueous crystal mount)で
封入した。染色された状態で結果を判読した。
【００４５】その結果、アンチセンスオリゴデオキシヌ
クレオチドで処理していない対照群において、サイトカ
インのｍＲＮＡは、創傷が発生した後１日目にはわずか
に検出されたが、３日目からは主に大食細胞から検出さ
れた。他方、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
処理群では、サイトカインのｍＲＮＡに対するシグナル
は検出されなかった。これによって、アンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドによってサイトカインの発現が
抑制されることを明らかに分かることができる。
クレオチドで処理していない対照群において、サイトカ
インのｍＲＮＡは、創傷が発生した後１日目にはわずか
に検出されたが、３日目からは主に大食細胞から検出さ
れた。他方、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
処理群では、サイトカインのｍＲＮＡに対するシグナル
は検出されなかった。これによって、アンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドによってサイトカインの発現が
抑制されることを明らかに分かることができる。
【００４６】実施例５ 本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドにつ
いて、瘢痕形成抑制活性を次のような方法によって測定
した。
いて、瘢痕形成抑制活性を次のような方法によって測定
した。
【００４７】４０頭のネズミの背中部位に人工的に直径
約６mmの創傷を加えた後、２０頭ずつ２つの群に分け
た。１つの群の鼠には、創傷を加えた後に実施例１によ
って製造されたＴＧＦ−βに対するアンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチド(５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＡ
ＡＣＡＧＧＧＣ−３')を５０μＭの容量で創傷部位に噴
霧した(アンチセンス処理群)。残り１つの群では、アン
チセンスオリゴデオキシヌクレオチド処理をしなかった
(非処理対照群)。その後、瘢痕形成の重要なパラメター
である創傷部位のコラーゲン含量および引張力を時間の
経過に従って測定して、本発明のアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドの瘢痕形成抑制の効果を判断した。
約６mmの創傷を加えた後、２０頭ずつ２つの群に分け
た。１つの群の鼠には、創傷を加えた後に実施例１によ
って製造されたＴＧＦ−βに対するアンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチド(５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＡ
ＡＣＡＧＧＧＣ−３')を５０μＭの容量で創傷部位に噴
霧した(アンチセンス処理群)。残り１つの群では、アン
チセンスオリゴデオキシヌクレオチド処理をしなかった
(非処理対照群)。その後、瘢痕形成の重要なパラメター
である創傷部位のコラーゲン含量および引張力を時間の
経過に従って測定して、本発明のアンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチドの瘢痕形成抑制の効果を判断した。
【００４８】その結果を下記「表１」および「表２」に
示す。
示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】上記「表１」および「表２」の結果から分
かるように、本発明のＴＧＦ−βに対するアンチセンス
オリゴデオキシヌクレオチドで創傷部位を処理したネズ
ミにおいては、非処理対照群よりコラーゲン含量が有意
に低いが、このような低いコラーゲン含量にもかかわら
ず、引張力はむしろ高かった。また、本発明のアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドの投与によって、創傷
治癒が遅くならず、対照群に比べて、より正常組織に近
い形態に治癒されて、肉眼で区別が不可能であるほどの
完璧な組織再生力を現した。
かるように、本発明のＴＧＦ−βに対するアンチセンス
オリゴデオキシヌクレオチドで創傷部位を処理したネズ
ミにおいては、非処理対照群よりコラーゲン含量が有意
に低いが、このような低いコラーゲン含量にもかかわら
ず、引張力はむしろ高かった。また、本発明のアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドの投与によって、創傷
治癒が遅くならず、対照群に比べて、より正常組織に近
い形態に治癒されて、肉眼で区別が不可能であるほどの
完璧な組織再生力を現した。
【００５２】このような結果は、ＴＧＦ−βに対するア
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで創傷部位を処
理すれば、一般に創傷部位で生ずる現象であるＴＧＦ−
βのような各種のサイトカインの発現誘発が抑制される
だけでなく、成長因子による線維細胞の***および結合
組織の過量形成が抑制されることによって得られたもの
であると推定される。また、このようなアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドは、できる限り早く、すなわ
ち、創傷が発生した直後に、投与するのが効果の増大に
望ましく、血管新生も少なくなる。
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで創傷部位を処
理すれば、一般に創傷部位で生ずる現象であるＴＧＦ−
βのような各種のサイトカインの発現誘発が抑制される
だけでなく、成長因子による線維細胞の***および結合
組織の過量形成が抑制されることによって得られたもの
であると推定される。また、このようなアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドは、できる限り早く、すなわ
ち、創傷が発生した直後に、投与するのが効果の増大に
望ましく、血管新生も少なくなる。
【００５３】実施例６ ＴＮＦ−αに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドを使用したin vitro実験 マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４.７のin vitr
o培養液にＴＮＦ−αに対するアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドを注入して、抗癌および抗腫瘍効果に
関与することが知られている一酸化窒素(ＮＯ)の形成に
対する抑制効果を観察した。この試験は、ＮＯの形成は
一酸化窒素シンセターゼ(ＮＯＳ)について遺伝子の発現
によって行われ、このＮＯＳ遺伝子は、ＴＮＦ−αの発
現と密接な関連があるという事実[参照文献：ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー(Ｊournalof Ｉmmunology) １
４６、１１４−１２０、１９９１およびジャーナル・オ
ブ・イムノロジー(Ｊournal of Ｉmmunology) １４９、
３２９０−３２９６、１９９２]に基づいている。
オチドを使用したin vitro実験 マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４.７のin vitr
o培養液にＴＮＦ−αに対するアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドを注入して、抗癌および抗腫瘍効果に
関与することが知られている一酸化窒素(ＮＯ)の形成に
対する抑制効果を観察した。この試験は、ＮＯの形成は
一酸化窒素シンセターゼ(ＮＯＳ)について遺伝子の発現
によって行われ、このＮＯＳ遺伝子は、ＴＮＦ−αの発
現と密接な関連があるという事実[参照文献：ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー(Ｊournalof Ｉmmunology) １
４６、１１４−１２０、１９９１およびジャーナル・オ
ブ・イムノロジー(Ｊournal of Ｉmmunology) １４９、
３２９０−３２９６、１９９２]に基づいている。
【００５４】マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６
４.７を２００μlずつ、９６−ウェルプレート(Ｎunc)
に入れ、γＩＦＮ １０Ｕ／mlおよびＬＰＳ(リポ多糖
類)１０ng／mlを含有するＤＭＥＭ培地(ダルベッコの修
飾されたイーグル培地(Ｄulbecco's Ｍodified Ｅagle'
s Ｍedium)＋５％ウシ胎児血清＋０.５％ペニシリン／
ストレプトマイシン)２００μlを入れた。また、ＴＮＦ
−αに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
を、各々、０.１μＭ、１μＭおよび１０μＭの濃度で
加え、対照用にはＴＮＦ−αに対するアンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドを加えないまま、全試験管を３
７℃で４８時間培養した。次いで、ディング(Ｄing)ら
の方法[参照文献：ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ
ournal of Ｉmmunology) １４１、２４０７−２４１
２、１９８８]を利用して、培養液１００μlと同量のグ
リース(Ｇriess)試薬との発色反応によって、ＴＮＦ−
αに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの
存在または不在下において、γＩＦＮおよびＬＰＳによ
って媒介されてニトライトの分泌量(ＮＯ2として計算し
てμＭ／リットルで示す)を測定して、ニトライト生成
に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの効
果を評価した。その結果を「図２」に示した。
４.７を２００μlずつ、９６−ウェルプレート(Ｎunc)
に入れ、γＩＦＮ １０Ｕ／mlおよびＬＰＳ(リポ多糖
類)１０ng／mlを含有するＤＭＥＭ培地(ダルベッコの修
飾されたイーグル培地(Ｄulbecco's Ｍodified Ｅagle'
s Ｍedium)＋５％ウシ胎児血清＋０.５％ペニシリン／
ストレプトマイシン)２００μlを入れた。また、ＴＮＦ
−αに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
を、各々、０.１μＭ、１μＭおよび１０μＭの濃度で
加え、対照用にはＴＮＦ−αに対するアンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドを加えないまま、全試験管を３
７℃で４８時間培養した。次いで、ディング(Ｄing)ら
の方法[参照文献：ジャーナル・オブ・イムノロジー(Ｊ
ournal of Ｉmmunology) １４１、２４０７−２４１
２、１９８８]を利用して、培養液１００μlと同量のグ
リース(Ｇriess)試薬との発色反応によって、ＴＮＦ−
αに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの
存在または不在下において、γＩＦＮおよびＬＰＳによ
って媒介されてニトライトの分泌量(ＮＯ2として計算し
てμＭ／リットルで示す)を測定して、ニトライト生成
に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの効
果を評価した。その結果を「図２」に示した。
【００５５】「図２」に示された結果から分かるように、
ＮＯ生産はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに
よって濃度依存的に抑制される。この結果から、ＴＮＦ
−αを含む線維形成誘導性サイトカインに対するアンチ
センスオリゴデオキシヌクレオチドは創傷の形成の際に
発現されることが知られているＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β
などの線維形成誘導性サイトカインの発現を直接抑制す
ることができると推論できる。
ＮＯ生産はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに
よって濃度依存的に抑制される。この結果から、ＴＮＦ
−αを含む線維形成誘導性サイトカインに対するアンチ
センスオリゴデオキシヌクレオチドは創傷の形成の際に
発現されることが知られているＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β
などの線維形成誘導性サイトカインの発現を直接抑制す
ることができると推論できる。
【００５６】上記のとおり、本発明の線維形成誘導性サ
イトカインに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドは、創傷部位から多量に分泌されて瘢痕の形成を
促進するＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦなどのよう
なサイトカインの遺伝子発現を抑制するので、創傷部位
で瘢痕の形成を阻害して創傷部位が正常組織と外観的に
全く差異無しに治癒されるようにするのに有用な薬剤と
して利用することができる。
イトカインに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドは、創傷部位から多量に分泌されて瘢痕の形成を
促進するＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦなどのよう
なサイトカインの遺伝子発現を抑制するので、創傷部位
で瘢痕の形成を阻害して創傷部位が正常組織と外観的に
全く差異無しに治癒されるようにするのに有用な薬剤と
して利用することができる。
【００５７】より適切な、本発明の重要な特徴は、発明
の詳細な説明がより良好に理解され、当該技術への寄与
が充分に認められるように、上記で概略記載された。当
業者は、本明細書に記載した概念および特定の具体例が
本発明の同一目的を行うために修飾するかまたは他の構
造を設計することを基礎として容易に利用できると理解
できる。さらに、当業者は、かかる等価の構造が特許請
求の範囲に記載した本発明の範囲から逸脱しないことを
明確に理解することができる。
の詳細な説明がより良好に理解され、当該技術への寄与
が充分に認められるように、上記で概略記載された。当
業者は、本明細書に記載した概念および特定の具体例が
本発明の同一目的を行うために修飾するかまたは他の構
造を設計することを基礎として容易に利用できると理解
できる。さらに、当業者は、かかる等価の構造が特許請
求の範囲に記載した本発明の範囲から逸脱しないことを
明確に理解することができる。
【００５８】
【発明の効果】本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌ
クレオチドは、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦなど
の線維形成誘導性サイトカインのｍＲＮＡに対する相補
的配列に結合して、これらの物質の遺伝子発現を抑制す
ることによって、創傷においての線維形成誘導性サイト
カインの生成および組織の線維化による瘢痕形成を防止
して、創傷部位が正常組織とほぼ同一な外観および引張
力をもつように治癒させることができる。
クレオチドは、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦなど
の線維形成誘導性サイトカインのｍＲＮＡに対する相補
的配列に結合して、これらの物質の遺伝子発現を抑制す
ることによって、創傷においての線維形成誘導性サイト
カインの生成および組織の線維化による瘢痕形成を防止
して、創傷部位が正常組織とほぼ同一な外観および引張
力をもつように治癒させることができる。
【図１】 ＴＧＦ−β １および２（レーン２および
３)、ＴＮＦ−α（レーン４)、ＰＤＧＦ １および２
（レーン５および６）およびφＸ１７４／Ｈａｅ III
（分子サイズマーカー；レーン１）に対するアンチセン
スオリゴデオキシヌクレオチドの電気泳動の結果を示す
図面代用写真。
３)、ＴＮＦ−α（レーン４)、ＰＤＧＦ １および２
（レーン５および６）およびφＸ１７４／Ｈａｅ III
（分子サイズマーカー；レーン１）に対するアンチセン
スオリゴデオキシヌクレオチドの電気泳動の結果を示す
図面代用写真。
【図２】 γＩＦＮおよびＬＰＳによって媒介されたニ
トライトの分泌に対するアンチセンスＴＮＦ−αの効果
を示すグラフ。
トライトの分泌に対するアンチセンスＴＮＦ−αの効果
を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホンテック・ジョン 大韓民国チョルラブックト、イリシ、ナ ムジュンドン１ガ、224−５番 ナムソ ン・アパートメント１−301 (56)参考文献 国際公開92／17206（ＷＯ，Ａ) ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．88，ＮＯ．４ （1991）Ｐ．1516−1520 Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．，ＶＯ Ｌ．91，ＮＯ．５（1993．５）Ｐ．1152 −1157 Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，ＶＯＬ．174, ＮＯ．４（1991）Ｐ．925−929 ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭ ＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．149，ＮＯ. ８（1992）Ｐ．2785−2794 ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．89，ＮＯ．10 （1992）Ｐ．4754−4758 ＮＥＵＲＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．42，Ｎ Ｏ．４ ＳＵＰＰＬ．３（1992）Ｐ. 415 ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．316（1985) Ｐ．701−705 ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．312（1984) Ｐ．724−729 ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．316（1985) Ｐ．748−750
Claims (8)
- 【請求項１】 形質転換成長因子−β(ＴＧＦ−β)およ
び腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)から選ばれる線維形成
誘導性サイトカインのｍＲＮＡに対する相補的配列に結
合して線維形成誘導性サイトカインに対する遺伝子の発
現を抑制することができる ５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３'；
または ５'−ＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＴ−３' の配列を有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ
ドまたはその配列がホスホロチオエートによって修飾さ
れた誘導体。 - 【請求項２】 線維形成誘導性サイトカインがＴＧＦ−
βであり、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが
ＴＧＦ−βのｍＲＮＡに対する配列： ５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３'； を有する請求項１記載のアンチセンスオリゴデオキシヌ
クレオチド。 - 【請求項３】 線維形成誘導性サイトカインがＴＮＦ−
αであり、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが
ＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対する配列： ５'−ＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＴ−３'； を有する請求項１記載のアンチセンスオリゴデオキシヌ
クレオチド。 - 【請求項４】 請求項１記載の、線維形成誘導性サイト
カインのｍＲＮＡに対する、少なくとも１つのアンチセ
ンスオリゴデオキシヌクレオチドの有効量を含有するこ
とを特徴とする創傷部位で創傷を治癒する間の瘢痕形成
抑制剤組成物。 - 【請求項５】 線維形成誘導性サイトカインがＴＧＦ−
βであり、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが
ＴＧＦ−βのｍＲＮＡに対する配列： ５'−ＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３' を含有する請求項４記載の瘢痕形成抑制剤組成物。 - 【請求項６】 線維形成誘導性サイトカインがＴＮＦ−
αであり、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが
ＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対する配列： ５'−ＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＴ−３' を含有する請求項４記載の瘢痕形成抑制剤組成物。 - 【請求項７】 さらに、医薬的に許容される担体、補助
剤または賦形剤を含有する請求項４記載の瘢痕形成抑制
剤組成物。 - 【請求項８】 注射剤、噴霧剤、軟膏剤またはクリーム
剤の形態に製剤化される請求項４記載の瘢痕形成抑制剤
組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1993-10883 | 1993-06-15 | ||
| KR1019930010883A KR970005347B1 (ko) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | 섬유생성세포활성물질에대한안티-센스올리고데옥시뉴클레오타이드및이를함유하는반흔형성억제제조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0799977A JPH0799977A (ja) | 1995-04-18 |
| JP2548507B2 true JP2548507B2 (ja) | 1996-10-30 |
Family
ID=19357432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5262304A Expired - Lifetime JP2548507B2 (ja) | 1993-06-15 | 1993-10-20 | 線維形成誘導性サイトカインに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびその用途 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2548507B2 (ja) |
| KR (1) | KR970005347B1 (ja) |
| IL (1) | IL109942A0 (ja) |
| ZA (1) | ZA944185B (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997044046A1 (fr) * | 1996-05-17 | 1997-11-27 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Agent inhibiteur de l'expression du facteur de croissance d'origine plaquettaire |
| US20090048191A1 (en) * | 2004-03-31 | 2009-02-19 | Lions Eye Institute Limited | Therapeutic molecules for modulating stability of vegf |
-
1993
- 1993-06-15 KR KR1019930010883A patent/KR970005347B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-10-20 JP JP5262304A patent/JP2548507B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-08 IL IL10994294A patent/IL109942A0/xx unknown
- 1994-06-14 ZA ZA944185A patent/ZA944185B/xx unknown
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．，ＶＯＬ．９１，ＮＯ．５（１９９３．５）Ｐ．１１５２−１１５７ |
| Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，ＶＯＬ．１７４，ＮＯ．４（１９９１）Ｐ．９２５−９２９ |
| ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．３１２（１９８４）Ｐ．７２４−７２９ |
| ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．３１６（１９８５）Ｐ．７０１−７０５ |
| ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．３１６（１９８５）Ｐ．７４８−７５０ |
| ＮＥＵＲＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．４２，ＮＯ．４ＳＵＰＰＬ．３（１９９２）Ｐ．４１５ |
| ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．８８，ＮＯ．４（１９９１）Ｐ．１５１６−１５２０ |
| ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．８９，ＮＯ．１０（１９９２）Ｐ．４７５４−４７５８ |
| ＴＨＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１４９，ＮＯ．８（１９９２）Ｐ．２７８５−２７９４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL109942A0 (en) | 1994-10-07 |
| KR970005347B1 (ko) | 1997-04-15 |
| JPH0799977A (ja) | 1995-04-18 |
| ZA944185B (en) | 1995-02-08 |
| KR950000725A (ko) | 1995-01-03 |
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