JP2003530309A

JP2003530309A - 増殖性皮膚疾患又は増殖性眼疾患を治療するリボザイム療法

Info

Publication number: JP2003530309A
Application number: JP2001532780A
Authority: JP
Inventors: ジョアンエムロビンス; リチャードトリッツ
Original assignee: イミューソルインコーポレイテッド
Priority date: 1999-10-26
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2003-10-14
Also published as: WO2001030362A3; WO2001030362A2; EP1223950A2; EP1223950B1; ATE314856T1; AU1345601A; DE60025391D1; AU781151B2; CA2388924A1

Abstract

(57)【要約】乾癬や増殖性糖尿病網膜症のような増殖性皮膚疾患又は増殖性眼疾患の効果的な治療として、本発明は、炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコードしているRNAを切断するリボザイム又はリボザイム送達系を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、一般的には、治療剤、更に詳細には、乾癬や増殖性網膜症のような
増殖性皮膚疾患又は増殖性眼疾患の治療及び/又は予防に用いることができる組
成物及び方法に関する。

【０００２】発明の背景乾癬のような増殖性皮膚疾患は、米国の全人口の2〜3％程度が罹患し、毎年25
0,000を超える症例が新たに診断されている。米国のみの乾癬の治療費は、毎年3
0〜50億ドルの範囲にあると推定されるので、ヘルス・ケア・システムに対する健
康のための主な費用を表している。乾癬の原因は現在未知であるが、多遺伝子自
己免疫疾患であることを示す傾向が証明されている。乾癬のような増殖性皮膚疾患は、容易に出血する炎症を起こした痒い鱗屑性病
変を特徴とする。様々な局所治療（例えば、炭脂製剤、ステロイド系クリーム剤
又は軟膏）と全身治療（例えば、紫外線照射、PUVA、ステロイド剤、又はメトト
レキセートのような化学療法剤）があるが、現在乾癬は治癒していない。更に、
現在利用できる治療は、たいてい不十分である。即ち、緩解率が高く、ある治療
法は潜在的に重大な副作用がある。増殖性糖尿病網膜症（PDR）のような増殖性眼疾患は、米国においては700,000
人程度が罹患し、毎年65,000を超える症例が新たに診断されている。毎年、25,0
00人程度がその疾患から失明し、それが労働年齢のアメリカ人の中で失明の主因
である。成功した処置からの費用節約は、毎年1億ドルになる。この疾患は、単
一の網膜変化に由来しない。むしろ、生化学的、代謝的、及び血液学的異常の組
み合わせが引き金になることがある。

【０００３】初期症状はない。痛みがなく、視力障害がなく、眼の炎症がない。実際に、多
くの人々は、その疾患が増殖期に十分に進行するまで視覚障害を生じない。この
時点で失われた視力を回復させることはできない。光凝固術とも呼ばれるレーザ
手術は、PDRを治療する現在唯一の治療法である。現在、この疾患は治癒してい
ない。瘢痕は、外観が損なわれること、疼痛、及び罹患患者の医療コストの増大のか
なりの原因である。線維芽細胞の過剰増殖とマトリックスの過度の沈着を特徴と
する組織発育過度を引き起こし得ることは創傷治癒での異常事象の結果である。
手術における瘢痕組織形成と攣縮が主要な臨床課題である。同様に、事故の熱傷
又は他の損傷又は外傷後の瘢痕もしばしば重大な結果をもたらし、機能不全や審
美効果が醜いことの原因となる。現在、瘢痕を予防するための満足な治療はない
。従って、増殖性疾患（例えば、乾癬、PDR又は瘢痕）を治療する効果的な治療
法が求められている。本発明は、この要求を満足させ、更に他の関連した利点も
提供する。

【０００４】発明の要約概要としては、本発明は、乾癬、PDR又は瘢痕のような増殖性皮膚疾患又は増
殖性眼疾患と関連がある細胞の増殖に関係するメカニズムを阻害することができ
るリボザイム又はリボザイム送達系を提供する。従って、本発明は、炎症に関係
するサイトカイン、細胞外マトリックス生成に関係するマトリックスメタロプロ
テイナーゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、細胞周期調節に関係する増
殖因子、又はレダクターゼを阻害することにより瘢痕や増殖性疾患を治療するの
に適するリボザイムを提供する。本発明の態様においては、かかる方法は、一般的には、前記増殖性皮膚疾患を
治療するような炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナー
ゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコー
ドしているRNAを切断するリボザイムの治療的に有効な量を患者に投与する段階
を含んでいる。関連した態様においては、前記増殖性皮膚疾患を治療するような
炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、サイクリン
、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコードしているRNA
を切断するリボザイムをコードしている核酸セグメントに作用可能に結合したプ
ロモーターを含んでいる核酸分子の治療的に有効な量を患者に投与する段階を含
んでいる増殖性皮膚疾患の治療方法が提供される。増殖性皮膚疾患の代表例とし
ては、乾癬、アトピー性皮膚炎、光線性角化症、扁平上皮がん又は基底細胞がん
、ウイルス性ゆうぜい又は脂漏性ゆうぜいが挙げられる。

【０００５】他の態様においては、かかる方法は、一般的には、前記増殖性眼疾患を治療す
るような炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、サ
イクリン、細胞周期依存性キナーゼ、又は増殖因子をコードしているRNAを切断
するリボザイムの治療的に有効な量を患者に投与する段階を含んでいる。関連し
た態様においては、前記増殖性眼疾患を治療するような炎症に関係するサイトカ
イン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナー
ゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコードしているRNAを切断するリボザイムを
コードしている核酸セグメントに作用可能に結合したプロモーターを含んでいる
核酸分子の治療的に有効な量を患者に投与する段階を含んでいる増殖性眼疾患の
治療方法が提供される。増殖性皮膚疾患の代表例としては、増殖性糖尿病網膜症
、増殖性硝子体網膜症、増殖性鎌状赤血球網膜症、未熟児網膜症、又は網膜剥離
が挙げられる。

【０００６】他の態様においては、瘢痕を治療又は予防する方法であって、前記瘢痕を治療
するような炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、
サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコードし
ているRNAを切断するリボザイムの治療的に有効な量を患者に投与する段階を含
んでいる、前記方法が提供される。関連した他の態様においては、瘢痕を治療又
は予防する方法であって、前記瘢痕を治療するような炎症に関係するサイトカイ
ン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ
、増殖因子、又はレダクターゼをコードしているRNAを切断するリボザイムをコ
ードしている核酸セグメントに作用可能に結合したプロモーターを含んでいる核
酸分子の有効量を患者に投与する段階を含んでいる、前記方法が提供される。瘢
痕を引き起こす疾患又は損傷の代表例としては、ケロイド、癒着（例えば、外科
的癒着）、肥厚性熱傷瘢痕、又は外傷（例えば、鈍的外傷又は外科的外傷）が挙
げられる。

【０００７】サイクリン及び細胞周期依存性キナーゼは、増殖をまねく細胞***のチェック
ポイント制御に直接関係する。特に好ましいサイクリン又は細胞周期依存性キナ
ーゼとしては、CDK1、CDK2、CDK4、サイクリンB1、サイクリンD又はPCNAが含ま
れる。感染又は損傷には、凝血経路の活性化、内皮への免疫細胞の接着、増殖の誘導
、又は傷害を急速に修復するために損傷部位への細胞の遊走を含む事象の複雑な
カスケードが含まれる。これらの応答は、損傷した組織から遊離したサイトカイ
ンや増殖因子によって、また、造血細胞によって仲介される。サイトカインや増
殖因子が産生され続けられる場合に慢性炎症が生じ、結果として、悪化した治癒
応答が引き起こされる。特に好ましいサイトカインとしては、炎症サイトカイン
インターロイキン1α又はβ、インターロイキン2、インターロイキン6、インタ
ーロイキン8、インターフェロンγ、又は腫瘍壊死因子が含まれる。特に好まし
い増殖因子としては、血管内皮増殖因子（VEGF）、又は血小板由来増殖因子（PD
GF）が含まれる。

【０００８】マトリックスメタロプロテイナーゼは、対応する阻害剤、メタロプロテイナー
ゼの組織阻害剤又はTIMPと共に、損傷した組織の修復に関係する。プロテイナー
ゼと阻害剤との釣り合いが創傷治癒のパターンと程度を調節する。MMPの過剰生
産又はTIMPの生産不足が、結果として異常な創傷治癒を生じる。特に好ましいマ
トリックスメタロプロテイナーゼとしては、MMP1、MMP2、MMP3又はMMP9が含まれ
る。好ましくは、リボザイムは、ハンマーヘッドリボザイム又はヘアピンリボザイ
ムであり、標的部位配列を認識する代表例は、下記にも実施例にも示されている
。好適実施態様においては、本発明は、そのようなリボザイムをコードしている
核酸分子を提供する。更に、核酸は、好ましくはDNA又はcDNAである。核酸分子
は、更に好ましくは核酸を転写するプロモーターの制御下にある。本発明の実施態様においては、核酸分子は、本明細書に示されたリボザイムを
コードしている。好ましくは、ベクターは、プラスミド、ウイルス、レトロトラ
ンスポゾン、コスミド又はレトロウイルスである。ベクターがレトロウイルスで
ある実施態様においては、プロモーターの制御下のリボザイムをコードしている
核酸分子、好ましくはpol IIIプロモーター、更に好ましくはヒトtRNAvalプロモ
ーター又はアデノウイルスVAlプロモーターは、レトロウイルスの5' と3' 間の
長末端反復配列に挿入されている。本発明のこれらの及び他の態様は、次の詳細な説明及び添付図面によって明ら
かになる。更に、ある種の手順又は組成（例えば、プラスミド等）を詳述してい
る様々な文献を示す。従って、それらの文献の記載は、それぞれが個々に含まれ
ているかのように全体で本願明細書に含まれるものとする。

【０００９】発明の詳細な説明定義発明を示す前に、以下で用いられるある種の用語の定義をまず示すことは理解
を援助するものである。『リボザイム』は、特定の核酸配列を切断することができる核酸分子を意味す
る。リボザイムは、RNA、DNA、核酸類縁体（例えば、ホスホロチオエート）、又
はこれらの組合わせ（例えば、DNA/RNAキメラ体）から構成されるものである。
特に好ましい実施態様においては、リボザイムは、特定の認識、及びRNA切断酵
素活性のためにアンチセンス配列を含むRNA分子を意味すると理解されなければ
ならない。『リボザイム遺伝子』は、RNAに転写される場合にリボザイムを生じるリボザ
イム配列からなる核酸分子（例えば、DNA）を意味する。『ベクター』は、問題のリボザイムを発現させることができる構築物である。
ベクターは、デオキシリボ核酸（『DNA』）又はリボ核酸（『RNA』）から構成さ
れていてもよい。任意により、ベクターは、ポリアデニル化配列、1つ以上の制
限部位、及び1つ以上の選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ又はピューロマイシ
ン-N-アセチルトランスフェラーゼを含んでいてもよい。更に、選択したホスト
細胞や用いられるベクターによっては、複製開始点、他の核酸制限部位、エンハ
ンサー、転写誘発性を与える配列、又は選択可能なマーカーのような他の遺伝要
素も本明細書に記載されるベクターに組込むことができる。

【００１０】『核酸』又は『核酸分子』は、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、
オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により作成された断片、又
は結合、切断、エンドヌクレアーゼ作用、又はエキソヌクレアーゼ作用で作成さ
れた断片を意味する。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシ
リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、天然に存在するヌクレオチドの類縁
体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのαエナンチオマー形）、又はその両
者の組合わせであるモノマーから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及
び/又はピリミジン又はプリン塩基部分で修飾し得る。糖修飾は、例えば、1つ以
上のヒドロキシル基をハロゲン、アルキル基、アミン、又はアジド基に置換する
ことを含み、糖はエーテル又はエステルとしても機能し得る。更に、糖部分全体
を立体化学的に及び電子的に類似の構造、例えば、アザ糖又は炭素環状糖類縁体
に置換し得る。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン
、アシル化プリン又はピリミジン、又は他の周知の複素環置換体が挙げられる。
核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はその結合の類縁体によって結合し得
る。ホスホジエステル結合の類縁体としては、ホスホロチオエート、ホスホロジ
チオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロ
チオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート等が挙げられる。『核
酸』という用語は、ポリアミドバックボーンに結合した天然に存在する核酸又は
修飾核酸を含む、いわゆる『ぺプチド核酸』も含まれる。核酸は、一本鎖か又は
二本鎖であり得る。

【００１１】『分離した核酸分子』は、生物体のゲノムDNAに組込まれていない核酸分子で
ある。例えば、真核細胞のゲノムDNAから分離した遺伝子をコードしているDNA分
子は、分離したDNA分子である。分離した核酸分子の他の例は、生物体のゲノム
に組込まれていない化学的に合成した核酸分子である。『プロモーター』は、構造遺伝子の転写を進めるヌクレオチド配列である。典
型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近接した遺伝子の5'
領域にある。プロモーターが誘導プロモーターである場合には、転写率は誘導物
質に応答して増大する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場
合には転写率は誘導物質では調節されない。上記のように、乾癬、PDR、又は瘢痕のような増殖性疾患は、多くの個体に罹
患し、ヘルスケアシステムに対して主なコストを表すものである。下で詳述され
るように、増殖することができる細胞の細胞周期制御を妨害することにより、乾
癬又はPDRのような増殖性疾患を効果的に治療し得る。本発明は、すべて直接又
は間接に増殖に与るものである、炎症に関係するサイカイン、マトリックスメタ
ロプロテイナーゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、レダクタ
ーゼの活性を阻害するリボザイム及びリボザイムを用いる方法を与えることによ
り達成される。

【００１２】サイクリンと細胞周期依存性キナーゼは、シグナリングと複製するために細胞
周期により進行する細胞をもたらす合成に直接関係する。適切なリボザイム標的
の代表例としては、cdk1リボザイム結合部位（配列番号1〜149); cdk2リボザイ
ム結合部位（配列番号150〜3010); cdk3リボザイム結合部位（配列番号302〜405
); cdk4リボザイム結合部位（配列番号406〜526); cdk6リボザイム結合部位（配
列番号527〜665); cdk7リボザイム結合部位（配列番号666〜866); cdk8リボザイ
ム結合部位（配列番号867〜1112); cdk-we-huリボザイム結合部位（配列番号111
3〜1408); サイクリンA2リボザイム結合部位（配列番号1409〜1614); サイクリ
ンCリボザイム結合部位（配列番号1615〜1819); サイクリンD1リボザイム結合部
位（配列番号1820〜1889); サイクリンD2リボザイム結合部位（配列番号1890〜1
975); サイクリンD3リボザイム結合部位（配列番号1976〜2053); サイクリンEリ
ボザイム結合部位（配列番号2054〜2318); サイクリンFリボザイム結合部位（配
列番号2319〜2561); サイクリンG1リボザイム結合部位（配列番号2562〜2787);
サイクリンHリボザイム結合部位（配列番号2788〜2964); サイクリンA1リボザイ
ム結合部位（配列番号2965〜3257); サイクリンB1リボザイム結合部位（配列番
号3258〜3478); cdc25hsリボザイム結合部位（配列番号3479〜3854); PCNA HHリ
ボザイム結合部位（配列番号3855〜4115); 又はキメラヘアピンリボザイム（配
列番号4116-4119）が挙げられる。

【００１３】上述したように、感染又は損傷は、凝血経路の活性化、内皮への免疫細胞の接
着、増殖の誘導、又は傷害を急速に修復するために損傷部位への細胞の遊走を含
む事象の複雑なカスケードを誘導する。これらの応答は、損傷した組織から遊離
するある種のサイトカインや増殖因子によって、また、造血細胞によっても仲介
される。サイトカインや増殖因子が産生し続けられる場合に慢性炎症が生じ、結
果として、悪化した治癒応答が引き起こされる。特に好ましいサイトカインとし
ては、炎症サイトカインインターロイキン1α又はβ、インターロイキン2、イン
ターロイキン6、インターロイキン8、インターフェロンγ、又は腫瘍壊死因子が
含まれる。特に好ましい増殖因子としては、血管内皮増殖因子（VEGF）、又は血
小板由来増殖因子（PDGF）が含まれる。マトリックスメタロプロテイナーゼは、対応する阻害剤、メタロプロテイナー
ゼの組織阻害剤又はTIMPと共に、損傷した組織の修復に関係する。プロテイナー
ゼと阻害剤との釣り合いが創傷治癒のパターンと程度を調節する。MMPの過剰生
産又はTIMPの生産不足が、結果として異常な創傷治癒を生じる。特に好ましいマ
トリックスメタロプロテイナーゼとしては、MMP1、MMP2、MMP3又はMMP9が含まれ
る。

【００１４】リボザイム上述したように、本発明は、細胞周期制御に直接又は間接（例えば、タンパク
質をコードしている）に関係している核酸分子を切断あるいは阻害する能力をも
つリボザイムを提供する。本発明に用いるために、数種類の異なるリボザイム、
例えば、ハンマーヘッドリボザイム(Rossi, J.J.ら, Pharmac. Ther. 50:245-25
4, 1991)(Forster & Symons, Cell 48:211-220, 1987; Haseloff & Gerlach, Na
ture 328:596-600, 1988; Walbot & Bruening, Nature 334:196, 1988; Haselof
f & Gerlach, Nature 334:585, 1988; Haseloffら, 米国特許第5,254,678号)、
ヘアピンリボザイム(Hampelら, Nucl. Acids Res. 18:299-304, 1990; 米国特許
第5,254,678号)、ヘアピンδウイルスリボザイム(Perrotta & Been, Biochem. 3
1:16, 1992)、グループIイントロンリボザイム(Cechら, 米国特許第4,987,071号
)、又はRNase Pリボザイム(Takadaら, Cell 35:849, 1983); (『鎖置換による産
物放出を伴うリボザイム』と称する国際出願第95/29241号; 『新規な酵素RNA分
子』と称する国際出願第95/31551号も参照されたい)を構築することができる。

【００１５】 Cechら（1991年1月22日発行の米国特許第4,987,071号）には、テトラキメナリ
ボソームRNA自己スプライシング反応の特性に基づくリボザイムの調製及び使用
が開示されている。これらのリボザイムには、8塩基対の標的部位と遊離グアノ
シン（又はグアノシン誘導体）が必要である。50℃の至適温度は、エンドリボヌ
クレアーゼ活性が報告されている。切断から生じる断片は、5' リン酸基と3' ヒ
ドロキシル基及び切断したRNAの5' 端に付加した遊離グアノシンヌクレオチドを
有する。 Cechらのリボザイムと対照的に、本発明の特に好ましいリボザイムは、生理的
温度で標的配列に対して効率よくハイブリダイズし、生体内で用いるのに単に研
究手段としてでなく適している（Cechら, 米国特許第4,987,071号の15欄、15行
を参照されたい）。従って、本発明に用いられる特に好ましいリボザイムとして
は、ヘアピンリボザイム（例えば、Hampelら, 1990年3月26日公開の欧州特許公
開第0 360 257号）やハンマーヘッドリボザイムが含まれる。概要としては、ヘ
アピンリボザイムに要求される配列は、NNNBN^*GUC(N)x（配列番号4120〜4124）
（ここで、xは6〜10の数であり、N^*Gは切断部位であり、BはG、C、又はUのいず
れかであり、NはG、U、C、又はAのいずれかである。）からなるRNA配列である。
ヘアピンリボザイムの認識配列又は標的配列の代表例は、下記の実施例に示され
ている。更に、ヘアピンリボザイムのバックボーン又はヘアピンは、未変性ヘア
ピンリボザイムのヌクレオチド配列を用いて設計することができ（Hampelら, Nu
cl. Acids Res. 18:299-304, 1990）、安定性と触媒活性を高める『テトラルー
プ』構造を含むように修飾することもできる（実施例2; Yuら, Virology 206:38
1-386, 1995; Cheongら, Nature 346:680-682, 1990; Andersonら, Nucl. Acids
Res. 22:1096-1100, 1994）。

【００１６】ハンマーヘッドリボザイムの切断部位に要求される配列は、標的にされ得るNU
H（ここで、NはG、U、C、又はAのいずれかであり、HはC、U、又はAである。）か
らなるRNA配列である。従って、ヘアピンリーダー配列と同じ標的、GUCがハンマ
ーヘッドリボザイムに用いられる。ハンマーヘッドリボザイム又はヘアピンリボ
ザイムのヌクレオチドは、更に、標的フランキングヌクレオチドやハンマーヘッ
ド共通配列によって決定される（Ruffnerら, Biochemistry 29:10695-10702, 19
90）。本明細書に示される配列と開示と共にこの情報は、本発明のヘアピンリボ
ザイムの生産を可能にする。下で詳述される本発明のリボザイム、及びそのリボザイムや他の適切な核酸分
子をコードしているDNAは、核酸分子の合成について当該技術において周知の方
法を用いて化学的に合成しうる（例えば、Heidenreichら, J. FASEB 70(1):90-6
, 1993; Sproat, Curr. Opin. Biotechnol. 4(1):20-28, 1993）。また、プロメ
ガ、米国ウィスコンシン州マディソンのような会社がリボザイムのような核酸分
子の生産に適した一連のプロトコールを示している。

【００１７】本発明の態様においては、RNAポリメラーゼプロモーター、例えば、T7 RNAポ
リメラーゼ又はSP6 RNAポリメラーゼに作用可能に結合したDNA分子又は他の核酸
分子（転写時にRNA分子を生じる）から調製される。従って、本発明のリボザイ
ムをコードしている核酸分子、例えば、DNA又はcDNAが本発明によって提供され
る。ベクターがDNA分子に作用可能に結合したRNAポリメラーゼプロモーターを含
んでいる場合、RNAポリメラーゼと適切なヌクレオチドと共にインキュベートし
たときに試験管内でリボザイムが生産し得る。別の実施態様においては、DNAは
、Cotten & Birnstiel, EMBO J. 8(12):3861-3866, 1989; Hempelら, Biochemis
try 28:4929-4933, 1989に記載されているような発現カセットに挿入することが
できる。分子生物学方法論の詳細は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989に開示されている。合成中のリボザイムは、リボザイムを安定化するとともにRNaseに対して耐性
にする能力をもつDNA分子に結合することにより修飾することができる（Rossiら
, Pharmac. Ther. 50:245-254, 1991）。他の実施態様においては、リボザイム
は、リポソーム送達系に用いられるホスホチオ類縁体に修飾し得る。この修飾に
よりリボザイムはエンドヌクレアーゼ活性に対して耐性になる。他の実施態様に
おいては、更に、プロパンジオール結合を含むように又は2'-O-メチル化ヌクレ
オチドを組込むようにリボザイムを修飾し得る。

【００１８】ベクター乾癬又は湿疹のような増殖性皮膚疾患を治療するためのリボザイムの使用は、
問題の感染した細胞に機能リボザイムを導入することを必要とする。これは、機
能リボザイムを試験管内で合成した後に送達するか又は生体内でリボザイム合成
を進めることができるDNAを送達することにより達成され得る。更に詳細には、本発明の他の態様においては、ホスト細胞（例えば、培養内又
は生物体の細胞内原核細胞又は真核細胞）に導入するのに適したベクターにおい
てリボザイム遺伝子を構築することができる。適切な原核細胞や真核細胞は、本
発明のリボザイムをコードしている核酸分子を含んでいる適切な伝達ベクターで
トランスフェクトし得る。生体内ベクターによりリボザイムを生産するために、pol III（例えば、アデ
ノウイルス由来のtRNA又はVA-1）、CMV、SV40後期プロモーター、又はSV40初期
プロモーターのような原核プロモーターの制御下にリボザイムをコードしている
ヌクレオチド配列を置くことが好ましい。ある実施態様においては、プロモータ
ーは、組織又は細胞特異的プロモーターであってもよい。従って、リボザイムは
、生体内で伝達ベンズアルデヒドから直接生産することができる。

【００１９】本発明の関係においては、様々なベクター、例えば、プラスミド、ウイルス、
レトロトランスポゾン又はコスミドを用いることができる。代表例としては、ア
デノウイルスベクター（例えば、国際出願第94/26914号、同第93/9191号; Yeiら
, Gene Therapy 1:192-200, 1994; Kollsら, PNAS 91(1):215-219, 1994; Kass-
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48, 1993; Guzmanら, Cir. Res. 73(6):1202-1207, 1993; Zabnerら, Cell 75(2
):207-216, 1993; Liら, Hum Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaudら, Eu
r. J. Neurosci. 5(10):1287-1291, 1993）、アデノ随伴1型（『AAV-1』）又は
アデノ随伴2型（『AAV-2』）ベクター（国際出願第95/13365号; Flotteら, PNAS
90(22):10613-10617, 1993）、肝炎δベクター、生存力のある弱毒化δウイル
ス又はヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第5,288,641号）、又は米
国特許第5,166,320号に開示されているベクターが挙げられる。他の代表的なベ
クターとしては、レトロウイルスベクター（例えば、欧州特許第0 415 731号;
国際出願第90/07936号; 同第91/02805号; 同第94/03622号; 同第93/25698号; 同
第93/25234号; 米国特許第5,219,740号; 国際出願第93/11230号; 同第93/10218
号）が挙げられる。遺伝子治療においてそのようなベクターを用いる一般法は、
当該技術において周知である（例えば、Larrick, J.W. & Burck, K.L., 遺伝子
治療: 分子生物学の応用, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y., N.Y
., 1991; Kreigler, M., 遺伝子移入と発現: 実験マニュアル, W.H. Freeman &
Company, N.Y., 1990）。

【００２０】更に、それぞれの分子が別個の原核プロモーター（又は内部リボソームエント
リー部位又は『IRES』）の制御下に、又は単一原核プロモーターの制御下に、本
発明のリボザイムをコードしている1以上の核酸分子を有するベクターが本発明
によって提供される。本発明のベクターによって送達することができる他の核酸
分子の代表例としては、インターフェロン（例えば、α、β又はγ）、又はリボ
ザイムを阻害することができる巻き戻し又は制限した二次折りたたみによって標
的配列を切断するのにリボザイムを援助又は促進する様々な他のサイトカイン又
は増殖因子、又は促進物質のような治療分子が挙げられる。これらのベクターは
、乾癬に対して多機能治療を与えることが利点であり、好ましくは、種々の治療
が手術中に共に適用される。上記ベクターを安定に含んでいるホスト原核細胞と真核細胞も本発明によって
提供される。適切なホスト細胞としては、細菌細胞、ラット細胞、マウス細胞、
ヒト細胞が含まれる。

【００２１】送達本発明のある態様においては、リボザイム分子、リボザイムをコードしている
核酸分子を、賦形剤を用いて、又は種々の物理的方法によってホスト細胞に導入
又は患者に投与することができる。そのような方法の代表例としては、リン酸カ
ルシウム沈降を用いた形質転換（Dubenskyら, PNAS 81:7529-7533, 1984）、そ
の核酸分子の無傷標的細胞への直接マイクロインジェクション（Acsadiら, Natu
re 352:815-818, 1991）、又は伝導性溶液に懸濁した細胞を強磁場に供して膜を
一時的に分極し、核酸分子の侵入を可能にするエレクトロポレーションが挙げら
れる。他の方法としては、不活性アデノウイルス（Cottonら, PNAS 89:6094, 19
90）、リポフェクション（Felgnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-74
17, 1989）、微粒子銃（Williamsら, PNAS 88:2726-2730, 1991）、ポリリシン
、レセプター特異的リガンド、核酸分子にからみついているリポソーム、核酸分
子を含有する大腸菌を細胞外壁からストリッピングしかつポリエチレングリコー
ルを用いて動物細胞に融合させるスフェロプラスト融合、ウイルス導入（Cline
ら, Pharmac. Ther. 29:69, 1985; Freidmannら, Science 244:1275, 1989）、
又はDNAリガンド（Wuら, J. of Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989）に結合し
た核酸分子の使用が挙げられる。実施態様においては、リボザイムはリポソーム
を用いてホスト細胞に導入される。本発明の実施態様においては、更に、本明細書に記載される方法を用いて追加
の治療分子（例えば、インターフェロン）又は促進物質を送達させることができ
る。そのような送達は、リボザイム又はリボザイムを発現するベクターの送達と
同時、前又は後であってもよい。

【００２２】医薬組成物上記のように、医薬組成物（又は『薬剤』）が本発明によって提供される。こ
れらの組成物は、上記リボザイム、DNA分子、ベクター又はホスト細胞のいずれ
かを薬学的に許容しうる又は生理学的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共
に含有する。一般的に、かかる担体は、用いられる用量と濃度において受容個体
に非毒性でなければならない。通常、かかる組成物の調製は、治療剤と緩衝剤、
アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（約10残基未満）ポリぺプチド、タ
ンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロース又はデキストリンのような炭水化
物、EDTAのようなキレート化剤、グルタチオン又は他の安定剤又は賦形剤とを組
合わせることが必要である。中性緩衝化食塩水又は非特異的血清アルブミンと混
合した食塩水は適切な具体的希釈剤である。特に好ましい担体としては、DOTAP:
コレステロールのようなコレステロールが含まれる。内在リボヌクレアーゼを阻害するという発現目的のために組成物に添加される
追加成分としては、還元剤、例えば、ジチオトレイトール、デタージェント、例
えば、ドデシル硫酸ナトリウム、又は他の物質、例えば、バニジルヌクレオチド
、アウリントリカルボン酸、過酸化水素又はtRNAのようなRNAデコイが含まれる
。

【００２３】本発明の医薬組成物は、また、1種以上の追加治療分子（例えば、インターフ
ェロン）又は促進物質を含有、又は発現（例えば、ベクターの場合）するように
調製することができる。本発明の医薬組成物は、種々の異なる経路によって、例えば、局所的、内皮的
又は眼内的に投与するために調製することができる。更に、本発明の医薬組成物
は、その医薬組成物の使用についての説明書を与える包装材料と共に容器に入れ
ることができる。一般的には、その説明書は、試薬濃度、及びある実施態様にお
いては、医薬組成物を再構成するのに必要であってもよい賦形剤成分又は希釈剤
（例えば、水、食塩水又はPBS）の相対量を記載している具体的な表現を含んで
いる。本発明の医薬組成物は、診断用と治療用双方に用いられる。

【００２４】治療法乾癬又はPDRのような増殖性疾患の治療方法が本発明によって提供される。更
に詳細には、本発明の態様においては、乾癬又はPDRのような増殖性疾患は、リ
ボザイム、及び/又はリボザイムをコードしている核酸分子又はベクターの治療
的に有効な量を温血動物（例えば、ヒト）に投与することにより治療することが
できる。概要としては、損傷又は他の傷害に応答した細胞は、典型的には、2つの可能
な経路: 正常な創傷治癒又は悪化した増殖の少なくとも1つを行う。正常創傷治
癒については、創傷の治癒をできるだけ早くすることができるように細胞の増殖
促進と成熟が起こる。乾癬、瘢痕又はPDRのような増殖性疾患は、創傷治癒の過程の多くの点で似て
いる。即ち、細胞を生成し、比較的短時間で遊走する。しかしながら、増殖が速
すぎる場合又は増殖するシグナルの時間が長すぎる場合、細胞は肥厚した病巣を
つくるまで増強する。この増殖は、新しい血管、及び様々な増殖因子（細胞の増
殖を更に高める）を生産する種々のリンパ球の浸潤によって援助される。これら
の細胞は、周囲組織の破壊を引き起こす酵素を分解する組織を与え得る。ある場
合には、肥厚した病巣が収縮し、皮膚又は網膜の表面をゆがめる。悪化した増殖
の結果は、増殖性疾患と関連がある臨床症状である。

【００２５】本発明は、所望の細胞と本発明のリボザイムの有効量とを接触させることによ
り、又は該細胞にリボザイムをコードしている核酸分子を有するベクターの有効
量を導入することによる増殖性皮膚疾患又は増殖性眼疾患の治療を提供する。適
切な『治療的に有効な量』は、治療する、又は異常増殖が予想され得る医療処置
が企図される場合には予防する患部組織の種類と程度に左右される。その『治療
的に有効な量』は、周知の方法、及び適切な動物モデル（例えば、ラット、ウサ
ギ、又はブタモデル）を用いて、又は臨床試験に基づいて当業者が容易に決定し
得る。本明細書に用いられるように、増殖性皮膚疾患又は増殖性眼疾患が患者に
おいて定量化方法で逆転又は阻止される場合には患者が『治療』されていると判
断される。更に、治療の治療的に有効な量又は用法は、(1)臨床症状（例えば、
炎症、組織の肥厚化、収縮、落屑、『熱傷』、又はそう痒）の頻度、重症度、又
は持続期間の低下; (2)寛解時間の増加; (3)病理学的症状の変化（例えば、ケラ
チン細胞、線維芽細胞、グリア、又は網膜色素上皮増殖の阻止）; (4)網膜剥離
の予防; 及び/又は(5)視力障害の予防をもたらさなければならない。リボザイムを外因的に送達する場合、RNA分子は、安定なRNA分子に又はリポソ
ームのような保護環境の別の形で組込み得る。また、RNAは、RNase耐性DNA対応
物に組込み得る。外因的リボザイムの細胞吸収は、コレステリル部分のようなDN
A末端に化学基を結合することにより増大させ得る（Letsingerら, P.N.A.S., U.
S.A., 1989）。

【００２６】本発明の他の態様においては、標的細胞にベクターを挿入すること及びリボザ
イムをコードしている核酸の安定な発現を助ける条件下で標的細胞が導入される
。標的細胞は、皮膚基底レベル、真皮、又は表皮に見られる細胞; 眼の硝子体、
又は眼の網膜層や色素上皮層を含み得るがこれらに限定されない。更に、リボザイム、リボザイム遺伝子又はベクターは、細胞への取込みを援助
する生分解性ポリマー、球、プルロニックゲル等に容易に組込むことができる。リボザイム（又はリボザイムをコードしている核酸分子又はベクター）は、上
記の治療結果を得るのに十分な方法で投与し得るが、好ましい方法としては局所
投与や全身系投与が含まれる。局部的な疾患をもつ患者は、リボザイム（又は核
酸分子又はベクター）を皮膚病巣に直接適用される局所クリーム、軟膏又はエモ
リエントで投与され得る。例えば、重量で100 mgのリボザイムを含有する局所ク
リームが投与され得るが、疾患の重さや治療に対する患者の応答に左右される。
好適実施態様においては、重量で100 mgのリボザイムを含有する局所製剤は、乾
癬病巣に投与される。また、適切な医薬賦形剤中のリボザイムの皮内又は眼内注
射は、個体病巣の管理のために使用し得る。リボザイムは、液体（例えば、DOTAP:コレステロール）と共に処方することが
できる。更に、リボザイムは、還元剤（例えば、ジチオトレイトール）、デター
ジェント（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、バニジルヌクレオチド、アウリ
ントリカルボン酸、過酸化水素、又はRNAデコイ（例えば、tRNA）を含むがこれ
らのに限定されないリボヌクレアーゼ阻害剤と共に処方することができる。次の実施例は、例示であり、限定されない。

【００２７】実施例実施例1 リボザイム部位選択の基準 A. ヘアピンリボザイムの部位選択本発明に用いるのに適したヘアピンリボザイムは、好ましくは次のRNA配列: N NNB NGUCNNNNNNNN（配列番号4122）を認識し、該リボザイムは下線配列に相補的
であるように構築され、BはC、G又はUである。配列GUCは、下記のすべてのヘア
ピンリボザイムに保存されなければならない。他のヌクレオチド（上記下線の『
N』）は、好ましくは高度の配列保存を有し、同じ標的部位に対して多重リボザ
イムの要求を制限している。

【００２８】 B. ハンマーヘッドリボザイムの切断部位の選択本発明に用いるのに適したハンマーヘッドリボザイムは、好ましくは配列NUH
を認識し、NはG、U、C、又はAのいずれかであり、HはC、U、又はAである。ヘア
ピン認識部位GUCはハンマーヘッド認識部位NUHのサブセットである。従って、す
べてのヘアピン部位は当然ハンマー部位であるが、逆はあてはまらない。種々の
遺伝子の代表的なGUCヘアピン/ハンマーヘッドリボザイム認識部位を表1〜16に
示す。ハンマーヘッドのみの部位を表18に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【表２】

【００３１】

【表３】

【００３２】

【表４】

【００３３】

【表５】

【００３４】

【表６】

【００３５】

【表７】

【００３６】

【表８】

【００３７】

【表９】

【００３８】

【表１０】

【００３９】

【表１１】

【００４０】

【表１２】

【００４１】

【表１３】

【００４２】

【表１４】

【００４３】

【表１５】

【００４４】

【表１６】

【００４５】

【表１７】

【００４６】

【表１８】

【００４７】実施例2 ヘアピンリボザイムの構築 2つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを化学合成し、一緒にして二本鎖DNAに変
換した場合に標的部位に相補的なヌクレオチドを含む全ヘアピンリボザイムを含
有している。更に、続いてのクローニングを容易にするために両端に制限酵素認
識部位を入れることができる。更に詳細には、オリゴヌクレオチドは共にハイブ
リダイズされ、クレノウDNAポリメラーゼか又はTaq DNAポリメラーゼを用いて二
本鎖DNAに変換される。得られたDNAを制限部位BamHIとMluIで切断し、精製し、
試験管内転写（pGEM、プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）のために又はレ
トロウイルス生産と哺乳動物発現（pLNL/MJTバックボーン）のためにベクターの
中へクローン化する。代表的なヘアピンリボザイムを下に示す（下線はリボザイ
ムが標的配列と結合する部位を示していることに留意されたい。） cdc-2 530（配列番号4378） 5'AACGAGCT AGAACCAGACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTA 3' サイクリンB1 281（配列番号4379） 5'CTGGCTCA AGAACTGGACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTA 3' PCNA 158（配列番号4381） 5'AGCCCTCA AGAAGCAGACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTA 3' 対照として用いられる欠損リボザイムは、上記のように構築することができ、
配列AAAが図1に示されるUGCに変化することを除く。

【００４８】実施例3 ハンマーヘッドリボザイムの構築キメラハンマーリボザイム（即ち、RNA/DNAハイブリッド）を、リボザイム切
断に適切なNUH配列を有するように設計する。図1に示される一般構造をもつリボ
ザイムを化学合成する。結合アーム塩基とステムループはDNAを含み、触媒ドメ
インはRNA及び/又は2' OメチルRNA塩基を含んでいる。PCNAを標的にする合成ヒ
トハンマーヘッドリボザイムの個々の例を次に示す（DNA塩基は上に示され、RNA
塩基は下に示され、2' OメチルRNAは下に下線を引いて示され、プロパンジオー
ルはpr pr pr prとして示されている。）。配列番号4382: PN30003 PCNI-HH 長さ: 40 5' GAGCCCTG cugaugag CAATTTTTTG cgaaa ACCAGGCGC 3' 配列番号4383: PN30004 OptPCN1-ome HH 長さ: 38 5' AGCCC ug cuga u g agg CCGTAAGG cc ga a a cc AGGCGC 3' 配列番号4384: PN30005 StabPCN1-ome HH 長さ: 38 5' AGCCC ugcu ga u g agg CCGTAAGG cc ga a a cc AGGCGC 3' 配列番号4385 : PN30006 PCN1-ome HH p4 長さ: 38 5' AGCCC ug cuga u g ag pr pr pr pr c ga a a cc AGGCGC 3'

【００４９】ステムループと触媒ドメインにおける塩基組成の変化は、試験管内切断により
分析したようにキメラリボザイムの触媒活性を高める（実施例5）。RNA塩基を2'
Oメチル塩基に置き換えるとキメラリボザイムの安定性が高められる。分析は、
10μgのリボザイムを100μlの細胞溶解物と37℃で30秒から240分までの範囲にあ
る時間インキュベートし、次に無傷リボザイムを分解産物から15％ PAGAにより
分離し、SYBRグリーン（モレキュラープロブス、ユージーン、OR）で染色し、ホ
スホルイメージ分析（モレキュラーダイナミクス）により定量することからなる
。リボザイムの構造に対して特定の塩基修飾を行うことにより、細胞溶解物の半
減期はPN30003については約2.5時間から、PN30004については3.5時間まで、PN30
005については10時間より長く連続して延びた（図2）。血清においては、PN3000
3の半減期は30秒以内である。リボザイムPN30005に対する特定の塩基修飾は、血
清における半減期が4時間より長く延びた（図3）。内部ステムループ構造はプロ
パンジオール結合で置換して分子を短くすることができ、送達を容易にし、触媒
活性を高める（図4）。リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの同じ組成を含むスクランブル
配列を、触媒活性のない対照として働く各リボザイムとして合成する。リボザイ
ムの細胞への吸収を高めるためにリポフェクチンを用いることができる。

【００５０】実施例4 リボザイム哺乳動物発現ベクターの構築 tRNA^val RNA pol IIIプロモーターによって進められる抗U5 HIVリボザイムを
含有するプラスミドpMJT（Yuら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:6340-6344, 1
993）をBamHIとMluIで消化し、リボザイム断片からベクターを精製する。pGemベ
クターからBamHIとMluIで上記ヘアピンリボザイムを切除し、精製し、中空pMJT
ベクターに結合する。得られたベクターはpLNT-Rzと呼ばれ（図5を参照されたい
。）と呼ばれ、ネオマイシン耐性遺伝子を推進するモロニーLTRとリボザイムの
発現を推進するtRNA^val RNA pol IIIプロモーターを含有する。

【００５１】実施例5 試験管内切断部位ヘアピン又はハンマーヘッドリボザイムについて試験管内分析における切断活
性を試験する。プラスミド非依存性試験管内転写の新しい方法（Welchら1997）
によってリボザイムと基質合成が行われる。概要としては、リボザイム又は基質
配列と相接するT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列によりオリゴヌクレオチド
を合成し（レトロゲン、カリフォルニア州サンディエゴ）、プラスミドクローニ
ングを必要とせずにアニーリングしたオリゴヌクレオチドの試験管内転写を可能
にする。40 mMトリスpＨ 7.5、10 mM MgCl2、2 mMスペルミジン中37℃で2時間の
経過反応において試験管内切断を試験する（Welchら1997）。反応産物をポリア
クリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で分析し、ホスホルイメージ分析（モレキュ
ラーダイナミクス）で定量する。上記分析と共に2〜4 nMの濃度と2〜200 nMの範
囲にある基質濃度を用いて単一代謝回転速度論的実験を行うことにより各リボザ
イムのミカエリス定数（K_m ^app）とk₂を求める。リボザイムのK_m ^appとk₂について
R2＞0.90であるハーンズプロットを測る。触媒効率をk₂/K_m ^appとして計算する。
CDK4、CDK2、CDC2、サイクリンB1、及びMMP-1遺伝子内の特定部位を標的にする
いくつかの代表的リボザイムの試験管内切断データを表19に示す。

【００５２】

【表１９】

【００５３】実施例6 リボザイムの生体内使用 A. 実験プロトコール動物実験に関する米国公衆衛生局のガイドラインに従ってすべての動物を処理
する。 1. ブタ瘢痕モデル約35 kgの家畜ブタを14日間実験環境に慣らす。各ブタの側腹部の5ヶ所に外科
的に皮膚病巣をつくる。各病巣は、長さ3 cm×深さ5 mmであり、各病巣部位から
2 mmの切片を取り除く。創縁を電気焼灼器で封じることができる。また、6 mm穿
刺生検法を用いて病巣をつくることもできる。所望の試験物質を各病巣の皮膚に適用することにより創傷を毎日処理する（1
匹のブタにつき少なくとも2ヶ所の未処理対照部位を有する）。主治医の指示で
部位に包帯をしてもよい。すべての部位を等しく処理する。病巣部位の機械的刺
激を防止するためにブタに保護「ジャケット」を着用させる。毎日を基準として治癒過程を主観的に評価（1＝新たな病巣、5＝完全に治癒）
し、対照（未処理）部位が完全に治癒したように評価したときに実験が終わる。

【００５４】 2. ウサギ疾患モデル約2 kgのダッチベルテッドウサギを約14日間実験環境に慣らす。疾患を誘導す
るために0.06単位のディスパーゼを硝子体内に注射する。次に、1、7、14、28及
び48日目に増殖性硝子体網膜症（PVR）を評価する（1＝0、5＝網膜剥離）。眼底
検査法により過程の典型的なディジタル写真をとる。 21日目にウサギにリボザイムか対照を注射することにより処理する。対照（賦
形剤）部位が完全に剥離したように評価したときに実験が終わる。剥離が明らか
でない場合には処理グループを続けることができる。

【００５５】 B. 生体内結果ブタ瘢痕モデルにおけるPCNA標的リボザイムの使用の例を図7に示す。パネルA
は、14日後の2ヶ所の6 mm穿刺生検法に対する賦形剤対照の作用を示す写真であ
る。パネルBは、14日後の2ヶ所の6 mm穿刺生検法に対するリボザイム処理の作用
を示す写真である。処理試料において創傷が治癒し、その例においては瘢痕が消
えている。ウサギディスパーゼモデルにおいてDOTAP:コレステロール中で処方したPCNA標
的リボザイムの使用の例を図8に示す。パネルAは、正常眼を示す写真である。パ
ネルBは、ディスパーゼに続いて賦形剤で処理した31日後の作用を示す写真であ
る。パネルCは、ディスパーゼに続いてリボザイムで処理した31日後の作用を示
す写真である。賦形剤処理眼においては網膜が完全に剥離する。リボザイム処理
眼においては、増殖性硝子体網膜症は消え、網膜剥離は明らかでない。上記から、哺乳動物の個々の実施態様が例示のために記載されたものであるが
、本発明の真意と範囲からそれることなく様々な変更を行うことができる。従っ
て、本発明は、前述の特許請求の範囲を除いては制限されない。

【００５６】実施例７ヒト遺体皮膚における[³²P]リボザイムの試験管内経皮吸収本実施例は、テープで角質層を取り除いた又は無傷のヒト遺体皮膚において³² P標識リボザイム（PN30006）の8種類の試験製剤の試験管内経皮吸収を評価する
ことであった。放射能標識した薬剤の累積経皮吸収を1時間と24時間に測定した
。24時間には、組織区画（角質層、表皮、真皮）回収を測定した。

【００５７】実験計画

【００５８】物質リボザイム製剤 360-34A 10 mM DTT、1.5％HEC中5 mg/mlリボザイム 360-34B 0.1% SDS、1.5％HEC中5 mg/mlリボザイム 360-34C 5% DMSO、1.5％HEC中5 mg/mlリボザイム 360-34D 15% PG、1.5％HEC中5 mg/mlリボザイム 360-34E 10 mM DTT、0.1% SDS、1.5％HEC中5 mg/mlリボザイム 360-34F 5% DMSO、15% PG、1.5％HEC中5 mg/mlリボザイム 360-34G 10 mM DTT、0.1% SDS、5% DMSO、1.5％HEC中5 mg/mlリボザイム 360-34H 10 mM DTT、5% DMSO、15% PG、1.5％HEC中5 mg/mlリボザイム略語解 DTT ジチオトレイトール(還元剤) HEC ヒドロキシエチルセルロース（ゲル剤） SDS ドデシル硫酸ナトリウム（浸透促進剤） DMSO ジメチルスルホキシド（浸透促進剤） PG プロピレングリコール（浸透促進剤）

【００５９】ヒト皮膚: 一人のドナーからヒト遺体皮膚を入手した。皮膚を約200μm（200μ）の厚さ
に切り取った。皮膚が損傷していたり、変形があったり（瘢痕組織、あな、母斑
等）、感染疾患をもつドナー由来である場合には除外した。皮膚試料を使用する
まで凍結した。皮膚標品を実験前にプラスチックのシールバッグで冷蔵庫内に一
晩解凍した。スパイク試験製剤: 実験前に試験製剤を[³²P]リボザイムでスパイクした。15リットルの放射能標
識溶液を1.0 g（ml）の製剤に添加し、へらで伸ばした。スパイクした試験製剤の最終比活性を分析するために、約10〜30 mgの製剤の
重量を量り（n＝3）、100μlの試料を10 mlのEcoscint(登録商標)シンチレーシ
ョンフルオル（ナショナルダイアグノスチックス #LS275）に入れ、³²Pの前調整
した消光曲線とともにベックマンモデルLS 3801液体シンチレーションカウンタ
で計数した。30 mgのスパイク製剤を各チャンバに適用した。30 mg用量で適用し
た全DPMを求め、DPMの適用先端を引くことにより、全DPMの適用量を計算した。

【００６０】装置アクリルブロック、磁気スターラー、及びステンレススチールマニホールドを
備えた9配置フランツ拡散セルドライブコンソール（クラウン #FDCD-9-LV）上に
取り付けた磁気スターラーを備えた54フランツ静止拡散ガラス拡散チャンバ（ク
ラウンガラスCat # FDC-100）の全部を実験に用いた。各セルのレザバー容量（6
〜11 ml）を前調製した。装置セットアップ: 拡散セルに、緩衝化（pＨ 7.04）等張食塩水（PBSフィッシャCat # C5551-20
セリンII等張食塩水中の4％ウシ血清アルブミン（BSA、画分V）(シグマCat.#A21
53）を皮膚の境界面の泡を避けるように注意して充填した。皮膚標品を適用する
前に、拡散セルを37℃の温度に1〜2時間循環水ポンプ（ハーケ）により平衡化し
た。薬剤の皮膚への適用無傷の又は予めテープで角質層を取り除いて切り取ったヒト遺体皮膚をチャン
バ上に置き、Oリングで密閉した。試験製剤に暴露した皮膚表面積は、1.77 cm²
であった。試験製剤を適用する前に拡散セル上に皮膚を37℃で30分間平衡化した
。30 mgのスパイク製剤の全部をギルソンMicroman(登録商標)容積ピペットを用
いて皮膚表面に適用し、ピペットの先端を用いて皮膚に弱くこすった。分配先端
を保持し、計数した。分配先端によって保持した平均DPMを計算し、理論値DPMか
ら引いて各チャンバに適用した全DPMの平均を求めた。

【００６１】試料収集: レザバー: 1時間と24時間に10 mlの試料を調整したギルソンP1000 Pipetteman(登録商標)
マイクロピペットを用いてレザバーから取り出し、その容積を1.0 mlのBSA食塩
水に置き換えた。Ecoscint(登録商標)シンチレーションフルオル（ナショナルダ
イアグノスティック # LS-275）を含有するシンチレーションバイアルに入れ、
計数前に暗所で一晩平衡化した。洗浄とガーゼワイプ: 24時間で皮膚表面を水中1.0 mlの2％オレス-20（クロダ社 # 9004-98-2）で3
回洗浄し、次にイソプロパノール中1.0 mlの5％スパン80で2回洗浄した。洗浄液
について回収カウントを集めた。洗浄手順に用いられる分配先端を計数し、『洗
浄』区画に含めた。洗浄後、皮膚表面を3回連続して綿ガーゼクロスで拭き、『
ガーゼ』区画中の回収計数を援助した。テープストリッピング（角質層）皮膚標品を薬剤適用の前かガーゼで拭いた後にテープで角質層を取り除いた。
皮膚を平らな面に下側に真皮を置いた。皮膚をセロファンテープで『輝く』（約
22片）まで又は表皮分離が起こり始めるまでテープで取り除くことにより角質層
を除去した。角質層の外面に付着した過剰の薬剤を除去する最初の2片は別に計
数した。これらの計数は、全回収（SC表面）に含めたが、角質層の区画回収から
は除いた。それぞれが5連続テープ片からなる4グループをScintilene(登録商標)
(フィッシャ# SX2-4)を含有するシンチレーションバイアルに入れた。

【００６２】表皮及び真皮: 無傷皮膚のテープで角質層を取り除いた後に又はテープで角質層を取り除いた
皮膚をチャンバから取り出した後に、真皮と表皮をマイクロ波法（2〜5秒間）で
分離した。分離した表皮を1 mlのソルエン350（パッカード社 # 6003038）を含
有するバイアルに入れ、真皮を2 mlのソルエン350を含有するバイアルに入れた
。次に、組織を60℃オーブンに4時間消化した。消化した組織にヒオニック・フル
オル（パッカード社 # 6013319）を添加し、ベックマンLSCで計数し、消光を修
正した。回収: それぞれの区画に回収した適用DPM全体の％を計算することにより、レザバー
、洗浄液、ガーゼワイプ、及び皮膚区画（角質層、表皮、真皮）に回収した³²P
リボザイムの％を求めた。回収％を各チャンバに適用した薬剤の全量（μg）で乗ずることにより、各区
画に回収した薬剤の全μgを得た。データエントリー/計算: LSCテープからのDPMデータ、細胞容積の測定、及び薬剤の適用量を規格化クァ
トロプロスプレッドシートに入れた。各区画の異常値を捨てた後にデータを計算
した。疑わしい値が残りの値の平均偏差の4倍を超えるだけ再計算平均と異なる
場合には値は異常であるとみなした（Skoog & West, Analytical Chemistry）。

【００６３】結果各細胞に適用した全DPMは、12〜15×10⁶の範囲にあった。³²Pリボザイムの累
積経皮吸収は、各時点でレザバーに回収された適用量の％として示される（図9
）。³²Pリボザイムの経皮吸収は、また、レザバーに回収された全μgとして示さ
れる。テープで角質層を取り除いた全24時間フラックスは無傷皮膚の0.2％に比
べて5〜12％の範囲にあった。種々の皮膚区画中の³²Pリボザイムの局在は、各区画に回収された適用量（DPM
）の％（図11）と各区画中の全マイクログラム（図12）双方として示される。皮
膚組織中の製剤の回収は、テープで角質層を取り除いた皮膚と同じであり、無傷
皮膚の0.1％に比べて適用量の0.5〜1.0％の範囲にあった。全製剤の回収は、テ
ープで角質層を取り除いた皮膚の表皮で多く、無傷皮膚の0.2％に比べて3〜10％
の範囲にあった。表20及び表21は、レザバー、表皮及び真皮の回収の合計の試験製剤の吸収（％
、g）である。

【００６４】

【表２０】

【００６５】

【表２１】

【００６６】実施例8 リボザイム標的ウサギPCNAによる実験PVRの阻止 A. リボザイム:脂質複合体で処理した実験PVR 実験計画ウサギモデルは、網膜裂傷を加えることを必要とせずに硝子体隙にディスパー
ゼを注入することを必要とする。以前のモデルは、疾患を誘導するために線維芽
細胞のような外因性細胞に依存している。ディスパーゼモデルにおいては、疾患
の形成に関係する内在細胞のタイプに関して前提としていない。PVRの重症度は
、注射されるディスパーゼの用量と相関した。ディスパーゼの最適量は、白内障
や出血のような合併症を妨害することをできるだけ少なくするように決定した。
このモデルは、網膜下よりむしろ硝子体内を用いる。細胞応答のタイミングと複
雑性は、ヒト疾患に対応する。これらの利点は、このモデルを特に魅力的にして
いる。比較的長いタイムフレームの単一の欠点は、観察時間を延長することによ
り容易に克服される。このモデルは、キメラPCNA標的リボザイムの効力を試験す
るために用いた。

【００６７】選択されたロットのディスパースをウサギ眼に試験して疾患発症の用量とタイ
ムフレームを力価測定し、アリコートを残りのすべての実験のために凍結した（
Frenzel EM, Neely KA, Walsh AW, Cameron JD, Gregerson DS. 1998. 増殖性硝
子体網膜症の新規なモデル. IOVS 39:2157-2164）。12匹の1〜2 kgのダッチベル
テッドウサギに0日目に0.06、0.07、又は0.08 Uディスパーゼを硝子体内に1回注
射した（各用量を4匹のウサギに）。ウサギをケタミン/キシラジンで麻酔し、眼
を2.5％フェニルエフリンと1％トロピカミドで散大し、局所麻酔剤、プロパラカ
インHClを適用した。0.1 ccのディスパーゼを各ウサギの右眼に30ゲージ針で注
射し、移動性シャールレンズを備えた解剖顕微鏡で直視下で外傷を負わせずに網
膜のすぐ前の硝子体腔にディスパーゼを送達した。左眼は対照とする。1、7、14
、21、28、及び48日目に眼底検査で疾患の進行を追跡した。ディスパーゼ処理グ
ループの疾患の発症の確率を最大にするために十分なタイムフレームを割り当て
た。眼底検査評価は、この実験と次の実験に対する2人の別々の熟練した観察者
によった。この実験においては、0.07 Uディスパーゼの用量により21日までに一
様にPVRが発症した。同じプロトコールに従って、0日目に右眼に0.07 Uディスパーゼを投与した8匹
のウサギを用いて第2の実験を行った。注射の7〜14日後にすべての眼には硝子体
と網膜前の出血があった。21日目に8匹のウサギのうち7匹が線維性神経膠増殖を
特徴とする初期PVRであった。いずれかの眼に網膜剥離が認められる前に、ウサ
ギの対照グループ（n＝4）を0.1 ccのDOTAP:コレステロール賦形剤の硝子体内注
射で処理した。実験グループ（n＝4）に0.1 ccキメラPCNA標的リボザイム（PN30
006）の硝子体内注射を投与した。

【００６８】眼底検査分析キメラPCNA標的リボザイムと対照処理ウサギ眼の眼底検査評価は、図8に示さ
れるように同じである。35日までに、対照グループのウサギ全部がかなりの網膜
剥離を生じた。キメラPCNA標的リボザイム処理グループの4匹のうち3匹は網膜剥
離を生じたが、1匹は小さな網膜剥離であり、60日の追究期間で進行しなかった
。これらのデータは、PVRの原因となる細胞の増殖をPCNAに対するキメラリボザ
イムで阻止することは治療又は予防的役割があるものであることを示している。表22のように1〜6の段階で2人の独立した熟練した観察者によってすべての眼
を評価した（Fastenbergら, 1982. 充実性網膜周囲増殖の実験モデルにおける異
なる細胞接種物の比較. Am J Ophthalmol. 93:559-56; Sakamotoら, 1995. 自殺
遺伝子のレトロウイルスベクター仲介移入による実験増殖性硝子体網膜症の阻止
. Ophthalmology 102: 1417-1424）。段階は、炎症、出血、歪み、硝子体内の曇
り又は膜、又は網膜破裂、牽引、又は剥離の形成に基づくものである。結果（図
１３）は、キメラリボザイムがPVRの発症を阻止又は遅らせるのに有効であるこ
とを意味している。

【００６９】

【表２２】

【００７０】組織病理学的分析処理及び対照眼を摘出し、4％パラホルムアルデヒドに固定し、パラフィンに
包埋し、組織病理学的評価のために切片にした。切片にする前に選択した肉眼的
試料を写真にとった。ヘマトキシリンとエオジン染色後に組織学的試験を行った
。組織病理学的分析は、肉眼的病理学的知見と相関し、PVRと網膜剥離の臨床的
診断を確認した。眼における細胞の異常増殖による損傷の程度を妨げ又は小さくする本キメラリ
ボザイム複合体の能力は、PVRの治療に著しい進歩であり得る。このタイプの治
療は、従来の外科的治療の失敗による視力喪失に直面する患者用いるのに特に十
分適しているものである（McCormack P, Simcock PR, Charteris D, Lavin MJ.
1994. 増殖性硝子体網膜症の手術が正当と認められますか？ Eye 8:75-76）。 B. リボザイムのみで治療した実験PVR PVRにおいて3つの追加実験を行った。実験2は、脂質と複合体を形成したスク
ランブル配列（ランダム特異性）リボザイムによる対照グループとともに上記第
1実験を繰り返した。他の2つの実験は、DOTAP:コレステロール脂質を加えずに10
mg/mlのリボザイムのみを用いて行った。これらは沈殿観察に基づいて行い透明
になるまで2週間以上かかった。脂質が存在しない場合は沈殿が見られなかった
。実験3は、最初の2つの実験のタイミングを繰り返し、20日目に処理した。実験
4は、予防的方法を表すために7日目に処理した。PVRの重症度全体は、ディスパ
ーゼの活性喪失と一致する対照グループでさえ時間の経過につれて低下した。結
果を表23に示す。2つの独立した評価は、Fastenbergら（1982）評価システム（
即ち、表22）を変更して熟練した観察者によって行った。

【００７１】

【表２３】

【００７２】結果から、未処理又はスクランブルリボザイム対照に比べて活性キメラPCNA標
的リボザイムによる処理後にPVR重症度の低下が一貫していることがわかる。

【００７３】実施例9 ブタにおける瘢痕形成に対するPCNA標的リボザイムの影響外科的切除によるブタモデルにおいてキメラPCNA標的リボザイム（PN30006）
を試験した。概要としては、2匹の市販の雌ブタに外科的創傷をつくった後、3日
間引き続き選択した創傷に試験剤又は賦形剤を投与した。各々が長さ約3 cm×深
さ5 mm×幅6 mmある半月形創傷部位（それぞれの側に5ヶ所）を各ブタの背部に
つくった（図14A）。それぞれの傷を1回縫合した（図14B）。このタイプの創は
、切除創を繰り返すようにつくった。1、2及び3日目に試験剤を点滴した直後に
創傷にOp部位包帯をした。ブタに包帯をし、抑制ジャケットを着用させて手術部
位の機械的刺激を防止した（必要に応じ）。生存期に行われる目視観察を次のように評価した。1 完治/瘢痕、2 痂皮落屑
、3痂皮、4開放創。組織病理学的評価を36日目に行い、上皮形成、炎症、瘢痕組
織、及び結合組織の評価が含まれた。 3日間引き続いて選択した創傷部位に試験剤又は賦形剤を点滴した後に治療に
関連した臨床徴候はなかった。観察されたすべての臨床徴候（赤い皮膚、滲出液
、痂皮）を本実験でつくったタイプの外科的創傷の正常な治癒過程の一部である
とみなした。

【００７４】組織病理学的試験のために創傷部位すべてをパラフィンワックスに包埋し、切
片にし、ヘマトキシリンとエオジン/フロキシンで染色することにより調製した
。両方のブタ由来のすべての創傷部位について組織病理学的試験を行い、次のパ
ラメーターを評価した。 a. 再上皮化表面上皮が存在する、部分的、又は存在しない。 b. 炎症重症の程度、細胞の種類及び分布 c. 瘢痕組織形成瘢痕組織の存在又は不在、程度、サイズ、深さ、及び瘢痕
の重症度 d. 結合組織形成正常な治癒に伴うコラーゲンや結合組織の存在又は不在、
程度、サイズ及び深さ（瘢痕組織形成と対照的に）。治癒に対する瘢痕は、結合組織の量、血管新生量、炎症、及び正常皮下コラー
ゲンの存在量によって区別された。瘢痕病巣においては、結合組織が多く、栓塞
面積が隣接の正常組織と明らかに区別され、治癒病巣又は薬剤処理病巣において
は、栓塞面積は隣接組織とほとんど相接し、隣接組織と区別しにくい。組織病理学的試験によって、完全な治癒がすべての創傷部位に生じたので薬剤
治療による上皮化に対する負の長期結果は検出されなかった。更に、治療と炎症
間に相関はなかった。創傷36日後の創傷部位の組織病理学的試験から、キメラPC
NA標的リボザイム処理創は完全に治癒し、未処理創又は賦形剤で処理した創より
瘢痕がすくないことがわかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】キメラDNA/RNAリボザイム（配列番号4385と4386）の一般構造を示す略図であ
る。

【図２】ヒト血管平滑筋細胞溶解物におけるキメラリボザイムPN30003、30004、及び30
005の安定性を示すゲルの写真である。

【図３】血清におけるキメラリボザイムPN30003及び30005の安定性を示すゲルの写真で
ある。

【図４】プロパンジオールリンカーの図式である。

【図５】ベクターpLNT-Rzの概略図である。

【図６】代表的なヘアピンリボザイム（配列番号4387と4388）の略図である。

【図７】瘢痕形成のブタモデルから治療した皮膚と対照皮膚の写真である。

【図８】増殖性硝子体網膜症のウサギディスパーゼモデルから対照の眼及びキメラPCNA
標的リボザイムで処理した眼の写真である。

【図９】拡散チャンバのレザバーに回収した適用量の％として示した³²Pリボザイムの
累積経皮吸収の図表である。

【図１０】拡散チャンバのレザバーに回収された全μgとして示した³²Pリボザイムの累積
経皮吸収の図表である。

【図１１】各区画に回収された適用量の％として示した各種皮膚区画における³²Pリボザ
イム局在の図表である。

【図１２】各区画内の全μgとして示した各種皮膚区画における³²Pリボザイム局在の図表
である。

【図１３】キメラPCNA標的リボザイムと対照処理ウサギ眼の組織病理学的評価の図表であ
る。評価は、変更したファステンバーグ評価に基づき（表22）、2人の熟練した
観察者が盲検的に行った。PはT検定により0.0008未満である。

【図１４】ブタ皮膚における外科的創傷モデルの2枚の写真である。図14Aは、創の寸法（
長さ約3 cm、深さ5 mm及び幅6 mm）を示す写真である。図14Bは、皮膚の切除と1
回の縫合を示す写真である。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１４年５月３０日（２００２．５．３０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/255 Ａ６１Ｋ 31/255 ４Ｃ２０６ 31/7105 31/7105 31/7125 31/7125 33/40 33/40 35/76 35/76 45/00 45/00 47/28 47/28 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 17/00 17/00 17/06 17/06 35/00 35/00 37/08 37/08 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 CA11 EA02 GA11 HA08 HA17 4C076 AA06 AA11 AA16 BB16 BB24 BB31 CC03 CC10 CC18 CC27 CC35 DD38N DD61N DD70 EE32P FF34 FF35 4C084 AA13 AA19 MA02 MA05 MA17 MA28 MA58 MA63 MA65 NA14 ZA331 ZA332 ZA891 ZA892 ZB131 ZB132 ZB261 ZB262 ZB331 ZB332 ZC351 ZC352 4C086 AA02 EA16 HA22 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA17 MA28 MA58 MA63 MA65 NA14 ZA89 ZB13 ZB26 ZB33 ZC35 4C087 AA02 BC83 MA02 MA05 MA17 MA28 MA58 MA63 MA65 NA14 ZA33 ZA89 ZB13 ZB26 ZB33 ZC35 4C206 AA02 JA02 JA52 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA21 MA28 MA30 MA37 MA48 MA78 MA83 MA85 NA14 ZA33 ZA89 ZB13 ZB26 ZB33 ZC35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】増殖性皮膚疾患の治療方法であって、前記増殖性皮膚疾患を
治療するような炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナー
ゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコー
ドしているRNAを切断するリボザイムの治療的に有効な量を患者に投与する段階
を含む、前記方法。
【請求項２】増殖性皮膚疾患の治療方法であって、前記増殖性皮膚疾患を
治療するような炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナー
ゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコー
ドしているRNAを切断するリボザイムをコードしている核酸セグメントに作用可
能に結合したプロモーターを含んでいる核酸分子の治療的に有効な量を患者に投
与する段階を含む、前記方法。
【請求項３】前記増殖性皮膚疾患が乾癬である、請求項1又は2記載の方法
。
【請求項４】前記増殖性皮膚疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項1又
は2記載の方法。
【請求項５】前記増殖性皮膚疾患が光線性角化症である、請求項1又は2記
載の方法。
【請求項６】前記増殖性皮膚疾患が扁平上皮がん又は基底細胞がんである
、請求項1又は2記載の方法。
【請求項７】前記増殖性皮膚疾患がウイルス性ゆうぜい又は脂漏性ゆうぜ
いである、請求項1又は2記載の方法。
【請求項８】前記リボザイムがハンマーヘッドリボザイム又はヘアピンリ
ボザイムである、請求項1又は2記載の方法。
【請求項９】前記細胞周期依存性キナーゼがCDK1、CDK2、又はCDK4である
、請求項1又は2記載の方法。
【請求項１０】前記サイクリンがPCNAである、請求項1又は2記載の方法。
【請求項１１】前記サイクリンがサイクリンB1又はサイクリンDである、
請求項1又は2記載の方法。
【請求項１２】前記サイトカインがインターロイキン1α又はβ、インタ
ーロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン8、インターフェロンγ、
又は腫瘍壊死因子である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項１３】前記マトリックスメタロプロテイナーゼがMMP1、MMP2、MM
P3又はMMP9である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項１４】前記増殖因子が血管内皮増殖因子、又は血小板由来増殖因
子である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項１５】前記リボザイムが局所的に又は内皮的に投与される、請求
項1記載の方法。
【請求項１６】前記核酸分子が内皮的に投与される、請求項2記載の方法
。
【請求項１７】前記リボザイムがクリーム、軟膏又はローションに処方さ
れる、請求項1記載の方法。
【請求項１８】前記リボザイムが脂質と共に処方される、請求項18記載の
方法。
【請求項１９】前記脂質がDOTAP:コレステロールである、請求項1記載の
方法。
【請求項２０】前記リボザイムがリボヌクレアーゼ阻害剤と処方される、
請求項1記載の方法。
【請求項２１】前記リボヌクレアーゼ阻害剤が還元剤である、請求項20記
載の方法。
【請求項２２】前記還元剤がジチオトレイトールである、請求項20記載の
方法。
【請求項２３】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がデタージェントである、請
求項20記載の方法。
【請求項２４】該デタージェントがドデシル硫酸ナトリウムである、請求
項23記載の方法。
【請求項２５】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がバニジルヌクレオチドであ
る、請求項20記載の方法。
【請求項２６】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がアウリントリカルボン酸で
ある、請求項20記載の方法。
【請求項２７】前記リボヌクレアーゼ阻害剤が過酸化水素である、請求項
20記載の方法。
【請求項２８】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がRNAデコイである、請求項2
0記載の方法。
【請求項２９】前記RNAデコイがtRNAである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】前記リボザイムがリボ核酸から構成されている、請求項1
記載の方法。
【請求項３１】 1種以上の前記リボ核酸が2'-O-メチルリボ核酸である、請
求項30記載の方法。
【請求項３２】前記リボザイムがデオキシリボ核酸とリボ核酸の混合物か
ら構成されている、請求項1記載の方法。
【請求項３３】前記リボザイムがホスホチオエート結合を有する核酸から
構成されている、請求項1記載の方法。
【請求項３４】前記リボザイムがプロパンジオール結合を有する核酸から
構成されている、請求項1記載の方法。
【請求項３５】前記核酸分子がウイルスベクターに含まれている、請求項
2記載の方法。
【請求項３６】前記ウイルスベクターがレトロウイルス、アデノウイルス
、又はアデノ随伴ウイルスからなる群より選ばれたウイルスから作成されている
、請求項2記載の方法。
【請求項３７】瘢痕を治療又は予防する方法であって、前記瘢痕を治療又
は予防するような炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナ
ーゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコ
ードしているRNAを切断するリボザイムの治療的に有効な量を患者に投与する段
階を含んでいる、前記方法。
【請求項３８】瘢痕を治療又は予防する方法であって、前記瘢痕を治療又
は予防するような炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナ
ーゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコ
ードしているRNAを切断するリボザイムをコードしている核酸セグメントに作用
可能に結合したプロモーターを含んでいる核酸分子の治療的に有効な量を患者に
投与する段階を含んでいる、前記方法。
【請求項３９】前記瘢痕がケロイドである、請求項37又は38記載の方法。
【請求項４０】前記瘢痕が癒着である、請求項37又は38記載の方法。
【請求項４１】前記瘢痕が肥厚性瘢痕又は肥厚性熱傷瘢痕である、請求項
37又は38記載の方法。
【請求項４２】前記リボザイムがハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム
である、請求項37又は38記載の方法。
【請求項４３】前記細胞周期依存性キナーゼがCDK1、CDK2、又はCDK4であ
る、請求項37又は38記載の方法。
【請求項４４】前記サイクリンがPCNAである、請求項37又は38記載の方法
。
【請求項４５】前記サイクリンがサイクリンB1又はサイクリンDである、
請求項37又は38記載の方法。
【請求項４６】前記サイトカインがインターロイキン1α又はβ、インタ
ーロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン8、インターフェロンγ、
又は腫瘍壊死因子である、請求項37又は38記載の方法。
【請求項４７】前記マトリックスメタロプロテイナーゼがMMP1、MMP2、MM
P3、又はMMP9である、請求項37又は38記載の方法。
【請求項４８】前記増殖因子がVEGF又はPDGFである、請求項37又は38記載
の方法。
【請求項４９】前記リボザイムが局所的に又は内皮的に投与される、請求
項37記載の方法。
【請求項５０】前記核酸分子が内皮的に投与される、請求項38記載の方法
。
【請求項５１】前記リボザイムがクリーム、軟膏又はローションに処方さ
れる、請求項37記載の方法。
【請求項５２】前記リボザイムが脂質と共に処方される、請求項37記載の
方法。
【請求項５３】前記脂質がDOTAP:コレステロールである、請求項52記載の
方法。
【請求項５４】前記リボザイムがリボヌクレアーゼ阻害剤と処方される、
請求項37記載の方法。
【請求項５５】前記リボヌクレアーゼ阻害剤が還元剤である、請求項54記
載の方法。
【請求項５６】前記還元剤がジチオトレイトールである、請求項55記載の
方法。
【請求項５７】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がデタージェントである、請
求項54記載の方法。
【請求項５８】前記デタージェントがドデシル硫酸ナトリウムである、請
求項57記載の方法。
【請求項５９】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がバニジルヌクレオチドであ
る、請求項54記載の方法。
【請求項６０】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がアウリントリカルボン酸で
ある、請求項54記載の方法。
【請求項６１】前記リボヌクレアーゼ阻害剤が過酸化水素である、請求項
54記載の方法。
【請求項６２】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がRNAデコイである、請求項5
4記載の方法。
【請求項６３】前記RNAデコイがtRNAである、請求項62記載の方法。
【請求項６４】前記リボザイムがリボ核酸から構成されている、請求項37
記載の方法。
【請求項６５】前記リボ核酸の1種以上が2'-O-メチルリボ核酸である、請
求項64記載の方法。
【請求項６６】前記リボザイムがデオキシリボ核酸とリボ核酸の混合物か
ら構成されている、請求項37記載の方法。
【請求項６７】前記リボザイムがホスホチオエート結合を有する核酸から
構成されている、請求項37記載の方法。
【請求項６８】前記リボザイムがプロパンジオール結合を有する核酸から
構成されている、請求項37記載の方法。
【請求項６９】前記核酸分子がウイルスベクターに含まれている、請求項
38記載の方法。
【請求項７０】前記ウイルスベクターがレトロウイルス、アデノウイルス
、又はアデノ随伴ウイルスからなる群より選ばれたウイルスから作成されている
、請求項38記載の方法。
【請求項７１】増殖性眼疾患の治療方法であって、前記増殖性眼疾患を治
療するような炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ
、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコード
しているRNAを切断するリボザイムの治療的に有効な量を患者に投与する段階を
含んでいる、前記方法。
【請求項７２】増殖性眼疾患を治療する方法であって、前記増殖性眼疾患
を治療するような炎症に関係するサイトカイン、マトリックスメタロプロテイナ
ーゼ、サイクリン、細胞周期依存性キナーゼ、増殖因子、又はレダクターゼをコ
ードしているRNAを切断するリボザイムをコードしている核酸セグメントに作用
可能に結合したプロモーターを含んでいる核酸分子の治療的に有効な量を患者に
投与する段階を含んでいる、前記方法。
【請求項７３】前記増殖性眼疾患が増殖性糖尿病網膜症である、請求項71
又は72記載の方法。
【請求項７４】前記増殖性眼疾患が増殖性硝子体網膜症である、請求項71
又は72記載の方法。
【請求項７５】前記増殖性眼疾患が増殖性鎌状赤血球網膜症である、請求
項71又は72記載の方法。
【請求項７６】前記増殖性眼疾患が未熟児網膜症である、請求項71又は72
記載の方法。
【請求項７７】前記増殖性眼疾患が網膜剥離である、請求項71又は72記載
の方法。
【請求項７８】前記リボザイムがハンマーヘッド又はヘアピンリボザイム
である、請求項71又は72記載の方法。
【請求項７９】前記細胞周期依存性キナーゼがCDK1、CDK2、又はCDK4であ
る、請求項71又は72記載の方法。
【請求項８０】前記サイクリンがPCNAである、請求項71又は72記載の方法
。
【請求項８１】前記サイクリンがサイクリンB1又はサイクリンDである、
請求項71又は72記載の方法。
【請求項８２】前記サイクリンがインターロイキン1α又はβ、インター
ロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン8、インターロイキン10、イ
ンターフェロンγ、腫瘍壊死因子である、請求項71又は72記載の方法。
【請求項８３】前記マトリックスメタロプロテイナーゼがMMP1、MMP2、MM
P3、又はMMP9である、請求項71又は72記載の方法。
【請求項８４】前記増殖因子がVEGF又はPDGFである、請求項71又は72記載
の方法。
【請求項８５】前記核酸分子が眼内に投与される、請求項71又は72記載の
方法。
【請求項８６】前記リボザイムが溶液に処方される、請求項71又は72記載
の方法。
【請求項８７】前記リボザイムが脂質と共に処方される、請求項71記載の
方法。
【請求項８８】前記脂質がDOTAP:コレステロールである、請求項87記載の
方法。
【請求項８９】前記リボザイムがリボヌクレアーゼ阻害剤と処方される、
請求項71記載の方法。
【請求項９０】前記リボヌクレアーゼ阻害剤が還元剤である、請求項89記
載の方法。
【請求項９１】該還元剤がジチオトレイトールである、請求項90記載の方
法。
【請求項９２】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がデタージェントである、請
求項89記載の方法。
【請求項９３】該デタージェントがドデシル硫酸ナトリウムである、請求
項92記載の方法。
【請求項９４】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がバニジルヌクレオチドであ
る、請求項89記載の方法。
【請求項９５】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がアウリントリカルボン酸で
ある、請求項89記載の方法。
【請求項９６】前記リボヌクレアーゼ阻害剤が過酸化水素である、請求項
89記載の方法。
【請求項９７】前記リボヌクレアーゼ阻害剤がRNAデコイである、請求項8
9記載の方法。
【請求項９８】前記RNAデコイがtRNAである、請求項97記載の方法。
【請求項９９】前記リボザイムがリボ核酸から構成されている、請求項71
記載の方法。
【請求項１００】前記リボ核酸の1種以上が2'-O-メチルリボ核酸である、
請求項99記載の方法。
【請求項１０１】前記リボザイムがデオキシリボ核酸とリボ核酸の混合物
から構成されている、請求項71記載の方法。
【請求項１０２】前記リボザイムがホスホチオエート結合を有する核酸か
ら構成されている、請求項71記載の方法。
【請求項１０３】前記リボザイムがプロパンジオール結合を有する核酸か
ら構成されている、請求項71記載の方法。
【請求項１０４】前記核酸分子がウイルスベクターに含まれている、請求
項72記載の方法。
【請求項１０５】前記ウイルスベクターがレトロウイルス、アデノウイル
ス、又はアデノ随伴ウイルスからなる群より選ばれたウイルスから作成されてい
る、請求項72記載の方法。