JP2532651B2 - 抗核抗体測定用器具の製法 - Google Patents
抗核抗体測定用器具の製法Info
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- JP2532651B2 JP2532651B2 JP1076620A JP7662089A JP2532651B2 JP 2532651 B2 JP2532651 B2 JP 2532651B2 JP 1076620 A JP1076620 A JP 1076620A JP 7662089 A JP7662089 A JP 7662089A JP 2532651 B2 JP2532651 B2 JP 2532651B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗核抗体測定用器具の製法およびそれによ
って製造された器具を提供する。本発明の測定用器具に
よれば血液や体液中の抗核抗体を簡便に高精度で測定で
きるので自己免疫疾患の診断に利用でき、特に、一次ス
クリーニングに広く利用できる。また、本発明は、コス
トの安い測定法を提供することができるので、その操作
の簡便さも併せて、これまで特殊なケースでなければ測
定されることのなかった、抗核抗体が、一般の健康診断
でも広く診断できることになり、自己免疫疾患を比較的
早期のうちに診断し、治療することを可能にする。
って製造された器具を提供する。本発明の測定用器具に
よれば血液や体液中の抗核抗体を簡便に高精度で測定で
きるので自己免疫疾患の診断に利用でき、特に、一次ス
クリーニングに広く利用できる。また、本発明は、コス
トの安い測定法を提供することができるので、その操作
の簡便さも併せて、これまで特殊なケースでなければ測
定されることのなかった、抗核抗体が、一般の健康診断
でも広く診断できることになり、自己免疫疾患を比較的
早期のうちに診断し、治療することを可能にする。
［従来の技術］ 自己免疫性疾患として知られる、全身性エリテマトー
デス（systemic lupus erythematosus;SLE）や全身性強
皮症（progressive systemic sclerosos;PSS）、慢性関
節リウマチ（rheumatoid arthritis;RA）、Sjoegren症
候群（SjS）、皮膚筋炎（dermatomyositis;DM）、多発
性筋炎（polymyositis;PM）、混合性結合組織病（mixed
connective tissue disease;MCTD）等の患者では、血
液中に抗核抗体がしばしば高い濃度で検出される。抗核
抗体には、抗ds−又はss−DNA抗体や抗ヒストン抗体、
抗非ヒストン核蛋白質抗体、抗セントロメア抗体、抗U1
−RNP抗体、抗Sm抗体等、細胞核に存在する種々の抗原
に対する20種類以上の抗体が知られている。例えば、血
液中の抗ds−又はss−DNA抗体の存在がSLEの診断の根拠
に用いられるごとく、それぞれの抗核抗体について、種
々の自己免疫性疾患との関連が知られており、血液中の
これらの抗体を検出することが自己免疫性疾患の診断に
役立っている。
デス（systemic lupus erythematosus;SLE）や全身性強
皮症（progressive systemic sclerosos;PSS）、慢性関
節リウマチ（rheumatoid arthritis;RA）、Sjoegren症
候群（SjS）、皮膚筋炎（dermatomyositis;DM）、多発
性筋炎（polymyositis;PM）、混合性結合組織病（mixed
connective tissue disease;MCTD）等の患者では、血
液中に抗核抗体がしばしば高い濃度で検出される。抗核
抗体には、抗ds−又はss−DNA抗体や抗ヒストン抗体、
抗非ヒストン核蛋白質抗体、抗セントロメア抗体、抗U1
−RNP抗体、抗Sm抗体等、細胞核に存在する種々の抗原
に対する20種類以上の抗体が知られている。例えば、血
液中の抗ds−又はss−DNA抗体の存在がSLEの診断の根拠
に用いられるごとく、それぞれの抗核抗体について、種
々の自己免疫性疾患との関連が知られており、血液中の
これらの抗体を検出することが自己免疫性疾患の診断に
役立っている。
これまで、抗核抗体を検出するために最も用いられて
いる標準的な測定方法は、蛍光抗体法であり（総説；
『臨床検査』,vol.30,No.7,1986,p684−728）、他に、
二重免疫拡散法やRIA,ELISA,赤血球凝集反応等がある。
蛍光抗体法は、ガラススライド上に組織切片又は、株化
細胞を固定したものを抗原材料とし、血液等の検体中の
抗核抗体の有無及び、細胞の蛍光染色パターンを蛍光顕
微鏡下で観察し、抗核抗体の種類を判定する。この測定
法は、蛍光染色パターンと抗核抗体の関連がよく調べら
れており、自己免疫性疾患の診断において、その有効性
は広く認められている。しかし、この蛍光法には、正確
な判定は熟練者の肉眼によってのみ可能であることや、
蛍光色素が比較的不安定であり扱いにくいこと、さらに
蛍光顕微鏡の感度や検鏡条件が判定に影響を与えること
などの欠点を有している。
いる標準的な測定方法は、蛍光抗体法であり（総説；
『臨床検査』,vol.30,No.7,1986,p684−728）、他に、
二重免疫拡散法やRIA,ELISA,赤血球凝集反応等がある。
蛍光抗体法は、ガラススライド上に組織切片又は、株化
細胞を固定したものを抗原材料とし、血液等の検体中の
抗核抗体の有無及び、細胞の蛍光染色パターンを蛍光顕
微鏡下で観察し、抗核抗体の種類を判定する。この測定
法は、蛍光染色パターンと抗核抗体の関連がよく調べら
れており、自己免疫性疾患の診断において、その有効性
は広く認められている。しかし、この蛍光法には、正確
な判定は熟練者の肉眼によってのみ可能であることや、
蛍光色素が比較的不安定であり扱いにくいこと、さらに
蛍光顕微鏡の感度や検鏡条件が判定に影響を与えること
などの欠点を有している。
このために、より個人差が少なく、かつ、操作が簡便
で定量性のある測定法としてELISA（enzyme linked imm
unosorbent assay）法の開発が行なわれてきた。抗核抗
体のELISA法は、大きく二種類に分けられる。ひとつ
は、細胞核より分離精製した、種々のDNAやRNA、ヒスト
ン蛋白質、非ヒストン蛋白質等の精製抗原をプラスチッ
ク支持体に担持させたELISA法で、抗核抗体の同定が可
能であるが、全ての核抗原についてそれぞれELISAを行
なうことは繁雑であるので、主に、二次的スクリーニン
グにて蛍光法と共にあるいは別々に用いる。
で定量性のある測定法としてELISA（enzyme linked imm
unosorbent assay）法の開発が行なわれてきた。抗核抗
体のELISA法は、大きく二種類に分けられる。ひとつ
は、細胞核より分離精製した、種々のDNAやRNA、ヒスト
ン蛋白質、非ヒストン蛋白質等の精製抗原をプラスチッ
ク支持体に担持させたELISA法で、抗核抗体の同定が可
能であるが、全ての核抗原についてそれぞれELISAを行
なうことは繁雑であるので、主に、二次的スクリーニン
グにて蛍光法と共にあるいは別々に用いる。
これに対して、抽出核抗原（extractable nuclear an
tigen;ENA）をプラスチック支持体に担持させたELISA法
が、多くの種類の抗核抗体の存在を迅速に検出する、主
として一次スクリーニングを目的として開発されてきた
（R.Warlowら，“Diagnostic Immunology,vol.2,p154−
160,1984）。この方法は、肝臓等の組織や株化細胞の核
抗原を可溶化又は、酸抽出して使用しているが、核抗原
のうち、不溶性の抗原や酸で抽出できない抗原に対する
抗核抗体は見落してしまう欠点があって、標準法の蛍光
法による判定と必ずしも一致しないことがあった。
tigen;ENA）をプラスチック支持体に担持させたELISA法
が、多くの種類の抗核抗体の存在を迅速に検出する、主
として一次スクリーニングを目的として開発されてきた
（R.Warlowら，“Diagnostic Immunology,vol.2,p154−
160,1984）。この方法は、肝臓等の組織や株化細胞の核
抗原を可溶化又は、酸抽出して使用しているが、核抗原
のうち、不溶性の抗原や酸で抽出できない抗原に対する
抗核抗体は見落してしまう欠点があって、標準法の蛍光
法による判定と必ずしも一致しないことがあった。
さらに、1987年,V.L.リップ等による『抗核抗体の検
出方法及び装置』が特許出願公開となった（特開昭62−
32363）。この測定法では、乾燥法により核を固体支持
体に担持させており、不溶性の核抗原をも検出可能であ
る。
出方法及び装置』が特許出願公開となった（特開昭62−
32363）。この測定法では、乾燥法により核を固体支持
体に担持させており、不溶性の核抗原をも検出可能であ
る。
しかしこの方法は核単独ではなく、界面活性剤処理の
後、超音波処理して得た核抗原（NS）や、ENAも調製し
て、三者を併せて固体支持体に担持させるという繁雑な
操作を必要としており、検体として未希釈血清を用いる
感度の低い方法である。また、未希釈血清を直接用いる
ために、検体中に夾雑する大量の非特異的抗体によるバ
ックグラウンドの反応が検出されやすい。さらに上記特
許出願公開明細書では、実際の自己免疫性疾患患者の血
液等の検体を測定した実施例を欠き、その実用化のため
には更に改良が必要と思われる。
後、超音波処理して得た核抗原（NS）や、ENAも調製し
て、三者を併せて固体支持体に担持させるという繁雑な
操作を必要としており、検体として未希釈血清を用いる
感度の低い方法である。また、未希釈血清を直接用いる
ために、検体中に夾雑する大量の非特異的抗体によるバ
ックグラウンドの反応が検出されやすい。さらに上記特
許出願公開明細書では、実際の自己免疫性疾患患者の血
液等の検体を測定した実施例を欠き、その実用化のため
には更に改良が必要と思われる。
本発明の目的は、抗核抗体を測定するELISA用の器具
を簡単な操作で製造することができる方法を提供するこ
とにある。更には、抗核抗体を精度よくスクリーニング
できる測定器具を提供することである。
を簡単な操作で製造することができる方法を提供するこ
とにある。更には、抗核抗体を精度よくスクリーニング
できる測定器具を提供することである。
本発明にそれば、細胞核の懸濁液を直接支持体と接触
させて細胞核を支持体に吸着させ、前記懸濁液と分離し
た後、50〜90％アセトン溶液で処理することにより細胞
核を支持体に固定させることによって、細胞核を支持体
に担持させる。
させて細胞核を支持体に吸着させ、前記懸濁液と分離し
た後、50〜90％アセトン溶液で処理することにより細胞
核を支持体に固定させることによって、細胞核を支持体
に担持させる。
ここにおいて細胞核とは、細胞内での正常な構造を保
持した状態（intact）の核又はその機械的破壊による断
片（tragment）を意味する。
持した状態（intact）の核又はその機械的破壊による断
片（tragment）を意味する。
本発明において、細胞核は高等動物特にヒトの細胞株
由来のものを用いる。特に好適な細胞株としては、HEp
−2,Wil−2,A−549,PC−13,ZR−751等が挙げられる。細
胞核の懸濁液は、以下のようにして作成できる。
由来のものを用いる。特に好適な細胞株としては、HEp
−2,Wil−2,A−549,PC−13,ZR−751等が挙げられる。細
胞核の懸濁液は、以下のようにして作成できる。
細胞を常法により、培養し、集めたあと等張緩衝液で
洗い、次に、塩濃度を減じた低張緩衝液に懸濁して破れ
ない程度に細胞を膨満させる。膨満した細胞は、簡単な
ホモジナイズ操作により緩和にこわされるので、細胞核
は比較的無傷で得られる。
洗い、次に、塩濃度を減じた低張緩衝液に懸濁して破れ
ない程度に細胞を膨満させる。膨満した細胞は、簡単な
ホモジナイズ操作により緩和にこわされるので、細胞核
は比較的無傷で得られる。
ここにおいて用いられる等張緩衝液としてはトリス緩
衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。また低張緩衝液と
は、塩濃度が等張液に比して1/2から1/15の範囲のもの
が適当である。ホモジナイズ操作により細胞を90％以上
破壊することが望ましい。ホモジナイズ操作のほか、超
音波処理によって細胞を破壊することも可能である。
衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。また低張緩衝液と
は、塩濃度が等張液に比して1/2から1/15の範囲のもの
が適当である。ホモジナイズ操作により細胞を90％以上
破壊することが望ましい。ホモジナイズ操作のほか、超
音波処理によって細胞を破壊することも可能である。
このようにして得られた細胞破砕液を遠心分離するこ
とによって核画分が採取される。採取された核画分は上
記低張液中に再び懸濁して核画分の懸濁液を作成する。
この際の核画分の濃度は細胞核に換算して２×105/ml以
上とするのが望ましい。
とによって核画分が採取される。採取された核画分は上
記低張液中に再び懸濁して核画分の懸濁液を作成する。
この際の核画分の濃度は細胞核に換算して２×105/ml以
上とするのが望ましい。
この核画分懸濁液を直接支持体、好ましくはプラスチ
ック支持体と接触させることにより核画分を支持体に吸
着させる。プラスチック支持体としてはポリスチレン、
表面処理をほどこしたポリスチレン、ポリビニール製の
もの等が用いられる。96穴のウェルを持つポリスチレン
製のELISA法のプレートが市販されており、これをその
まま用いるのが便利である。しかし、その形状は、試験
官状、板状等の任意の形をとることができる。核画分懸
濁液をプラスチック支持体と接触させるのは室温で30〜
120分間静置すれば良い。温度と時間は適当な範囲内で
変化させることができる。ウェルのあるELISAプレート
を用いる場合は、核画分懸濁液を分注し、そのまま必要
な時間静置すれば良い。
ック支持体と接触させることにより核画分を支持体に吸
着させる。プラスチック支持体としてはポリスチレン、
表面処理をほどこしたポリスチレン、ポリビニール製の
もの等が用いられる。96穴のウェルを持つポリスチレン
製のELISA法のプレートが市販されており、これをその
まま用いるのが便利である。しかし、その形状は、試験
官状、板状等の任意の形をとることができる。核画分懸
濁液をプラスチック支持体と接触させるのは室温で30〜
120分間静置すれば良い。温度と時間は適当な範囲内で
変化させることができる。ウェルのあるELISAプレート
を用いる場合は、核画分懸濁液を分注し、そのまま必要
な時間静置すれば良い。
ついでプラスチック支持体と核画分懸濁液を分離し、
50〜90％アセトン溶液で処理して核画分をプラスチック
支持体に固定する。ウェルのあるELISAプレートを用い
たときは、核画分懸濁液を吸引等の適宜の手段で除いた
後、核画分懸濁液と等量の50〜90％アセトン溶液を分注
する。通常室温に10分以上静置すれば細胞核はプラスチ
ック担体に固定され、洗浄によってもはがれなくなる。
ウェルから核画分懸濁液を除いた後、洗浄を行なうと細
胞核が洗い流されるので通常は洗浄しない方が望まし
い。しかし、支持体に担持する細胞核の数を調節するた
めに洗浄を行なうことは可能である。アセトン溶液とし
ては85％の水溶液を用いるのが望ましい。90％より濃い
アセトン溶液を用いるとプラスチック支持体がアセトン
によって侵されるので好ましくない。アセトンは水溶液
であることが望ましいが、水の一部を例えばエチルアル
コール等の極性溶媒でおきかえる等のこともできる。処
理温度と時間は適当な範囲内で変化させることができ
る。本発明のアセトン処理は、細胞核を支持体に固定す
る効果のほか、細胞核のリン脂質膜を溶かし、核内部の
核抗原に抗核抗体が近づき易くしており、このことが測
定の精度の向上に大きく寄与している。
50〜90％アセトン溶液で処理して核画分をプラスチック
支持体に固定する。ウェルのあるELISAプレートを用い
たときは、核画分懸濁液を吸引等の適宜の手段で除いた
後、核画分懸濁液と等量の50〜90％アセトン溶液を分注
する。通常室温に10分以上静置すれば細胞核はプラスチ
ック担体に固定され、洗浄によってもはがれなくなる。
ウェルから核画分懸濁液を除いた後、洗浄を行なうと細
胞核が洗い流されるので通常は洗浄しない方が望まし
い。しかし、支持体に担持する細胞核の数を調節するた
めに洗浄を行なうことは可能である。アセトン溶液とし
ては85％の水溶液を用いるのが望ましい。90％より濃い
アセトン溶液を用いるとプラスチック支持体がアセトン
によって侵されるので好ましくない。アセトンは水溶液
であることが望ましいが、水の一部を例えばエチルアル
コール等の極性溶媒でおきかえる等のこともできる。処
理温度と時間は適当な範囲内で変化させることができ
る。本発明のアセトン処理は、細胞核を支持体に固定す
る効果のほか、細胞核のリン脂質膜を溶かし、核内部の
核抗原に抗核抗体が近づき易くしており、このことが測
定の精度の向上に大きく寄与している。
これらの処理により、本発明で作成された細胞核担持
プラスチックELISAプレートでは、100倍希釈の血清で充
分測定可能な、感度のよい、しかも検体中に共存する非
特異的抗体によるバックグラウンドの少ない抗核抗体の
測定が可能となる。すなわち、このプレートを用いると
きは、特開昭62−32363で行っているように、核抗原（N
S）やENAを塗布しなくても、自己免疫疾患の患者の抗核
抗体の有無を精度良くスクリーニングすることができ
る。しかし、検出を更に容易にするためにENA等をこの
プレートに更に担持させることもできる。このために
は、本方法によって得られたプレートをENAと接触させ
ることによりENAをプレートに吸着させる。
プラスチックELISAプレートでは、100倍希釈の血清で充
分測定可能な、感度のよい、しかも検体中に共存する非
特異的抗体によるバックグラウンドの少ない抗核抗体の
測定が可能となる。すなわち、このプレートを用いると
きは、特開昭62−32363で行っているように、核抗原（N
S）やENAを塗布しなくても、自己免疫疾患の患者の抗核
抗体の有無を精度良くスクリーニングすることができ
る。しかし、検出を更に容易にするためにENA等をこの
プレートに更に担持させることもできる。このために
は、本方法によって得られたプレートをENAと接触させ
ることによりENAをプレートに吸着させる。
本発明で作成された細胞核担持プラスチック支持体を
用いる抗核抗体の検出は、抽出核抗原をプラスチック支
持体に担持させたELISA法と同様に行なうことができ
る。
用いる抗核抗体の検出は、抽出核抗原をプラスチック支
持体に担持させたELISA法と同様に行なうことができ
る。
すなわち、本発明によって細胞核を担持させたプラス
チックウェルに被検血清を加えて反応させ、未反応血清
を除去洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）等
では標識したウサギやヤギ等の抗ヒト免疫グロブリン抗
体あるいはプロテインＧ等を反応させて、細胞核と結合
した抗核抗体に結合させる。洗浄後HRPOをテトラメチル
ベンヂジン（TMB）発色液により発色させる。
チックウェルに被検血清を加えて反応させ、未反応血清
を除去洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）等
では標識したウサギやヤギ等の抗ヒト免疫グロブリン抗
体あるいはプロテインＧ等を反応させて、細胞核と結合
した抗核抗体に結合させる。洗浄後HRPOをテトラメチル
ベンヂジン（TMB）発色液により発色させる。
本発明によれば簡単な操作で、精度の高い抗核抗体の
検出のためのプラスチックプレートが得られる。このよ
うにして得られたプラスチックプレートは低温低湿に保
存すれば１年以上効力の低下がなく保存することができ
る。
検出のためのプラスチックプレートが得られる。このよ
うにして得られたプラスチックプレートは低温低湿に保
存すれば１年以上効力の低下がなく保存することができ
る。
以下に実施例および試験例によって本発明を具体的に
説明する。
説明する。
実 施 例 （細胞の培養） 真核細胞の核画分調製の材料として、ATCC（American
Type Culture Collection）から、ヒト喉頭上皮細胞癌
由来のHEp−２細胞株（ATCCCCL23）を購入した。購入し
たHEp−２細胞は、速やかに10％FBS−RPMI1640培地に
て、培養し、凍結保存する。細胞核の実際の調製は、こ
の凍結保存細胞を解凍し、約１週間細胞を成育させ、１
×108個の細胞を集める。培養フラスコから細胞をはが
す際に0.02％EDTA−りん酸緩衝溶液（PBS）（Na2HPO3・
12H2O;14.5g,KH2PO4;1.0g,NaCl;40.0g,KCl;1.0gを蒸留
水に溶解し、pHを7.2に調製し、全量を５リットルと
し、さらに、EDTA・2Na・2H2Oを溶解し、オートクレー
ブ滅菌をする。）を用いる。
Type Culture Collection）から、ヒト喉頭上皮細胞癌
由来のHEp−２細胞株（ATCCCCL23）を購入した。購入し
たHEp−２細胞は、速やかに10％FBS−RPMI1640培地に
て、培養し、凍結保存する。細胞核の実際の調製は、こ
の凍結保存細胞を解凍し、約１週間細胞を成育させ、１
×108個の細胞を集める。培養フラスコから細胞をはが
す際に0.02％EDTA−りん酸緩衝溶液（PBS）（Na2HPO3・
12H2O;14.5g,KH2PO4;1.0g,NaCl;40.0g,KCl;1.0gを蒸留
水に溶解し、pHを7.2に調製し、全量を５リットルと
し、さらに、EDTA・2Na・2H2Oを溶解し、オートクレー
ブ滅菌をする。）を用いる。
（低張緩衝液による細胞核の抽出および固定） １×108個のHEp−２細胞を、洗浄のためにトリス緩衝
溶液（TBS）（0.01M Tris−Hcl,0.15M NaCl,pH7.4）5
0mlに浮遊させ、500×ｇで５分間、遠心分離により細胞
を沈殿として集めた。この洗浄操作をもう１回繰り返し
た。この細胞を、20mlの低張緩衝液（0.01M Tris−HC
l,0.01M NaCl,1mM MgCl2,pH7.4）に浮遊させ、氷上に
15分間静置した。ダウンスホモジナイザーで細胞を破壊
し、細胞膜が90％以上破壊されていることを顕微鏡下で
確認した後、再び、2,000×ｇ、10分で遠心分離した。
残渣として得られる核画分を、上記低張緩衝液に、細胞
核に換算した時の濃度が２×105/mlとなるように懸濁
し、プラスチックマイクロプレート（例えば、Nunc社よ
り市販されている）の各ウェルに50μづつ添加した。
このプラスチックプレートを室温にて、30分放置した。
放置後、添加液上清を、自動洗浄機等（例えば、ベーリ
ング社のモデルBEP−II）で充分に吸引除去した。次
に、各ウェルに85％アセトン水溶液を30μづつ添加
し、室温にて10分間静置した。アセトン溶液を吸引除去
し、乾燥機中でこのプラスチックプレートを乾燥させ
た。このようにして作成された、細胞核を担持させたプ
ラスチックプレートは、サランラップ等で包んで、４℃
にて半年以上保存が可能であった。
溶液（TBS）（0.01M Tris−Hcl,0.15M NaCl,pH7.4）5
0mlに浮遊させ、500×ｇで５分間、遠心分離により細胞
を沈殿として集めた。この洗浄操作をもう１回繰り返し
た。この細胞を、20mlの低張緩衝液（0.01M Tris−HC
l,0.01M NaCl,1mM MgCl2,pH7.4）に浮遊させ、氷上に
15分間静置した。ダウンスホモジナイザーで細胞を破壊
し、細胞膜が90％以上破壊されていることを顕微鏡下で
確認した後、再び、2,000×ｇ、10分で遠心分離した。
残渣として得られる核画分を、上記低張緩衝液に、細胞
核に換算した時の濃度が２×105/mlとなるように懸濁
し、プラスチックマイクロプレート（例えば、Nunc社よ
り市販されている）の各ウェルに50μづつ添加した。
このプラスチックプレートを室温にて、30分放置した。
放置後、添加液上清を、自動洗浄機等（例えば、ベーリ
ング社のモデルBEP−II）で充分に吸引除去した。次
に、各ウェルに85％アセトン水溶液を30μづつ添加
し、室温にて10分間静置した。アセトン溶液を吸引除去
し、乾燥機中でこのプラスチックプレートを乾燥させ
た。このようにして作成された、細胞核を担持させたプ
ラスチックプレートは、サランラップ等で包んで、４℃
にて半年以上保存が可能であった。
（超音波処理による細胞核の抽出および固定） 先に記した方法により培養したHEp−２細胞を１×108
個TBSに浮遊させた。細胞は50mlのTBSで３回洗浄をし、
500×ｇで５分間遠心分離により細胞を沈殿として集め
た。この細胞を10mlのTBSに浮遊させた後、超音波処理
により細胞を破壊した。超音波処理の条件は、市販の超
音波発振器（日本精器製作所製）により、出力2.0、位
相1.2で40秒間おこなった。超音波処理後、2,000×ｇで
10分間遠心分離し、細胞核を含む沈殿を得た。この沈殿
を80mlのTBSにて再懸濁し（2.5×105細胞/ml）、プラス
チックプレートの各ウェルに50μずつ添加した。これ
を先の例と同様に固定した。すなわち、このプラスチッ
クプレートを30分間放置し、添加液上清を吸引除去し
た。次に、各ウェルに85％アセトン水溶液を50μづつ
添加し、室温にて10分間静置し、アセトン水溶液を吸引
除去した後、プラスチックプレートを乾燥させた。
個TBSに浮遊させた。細胞は50mlのTBSで３回洗浄をし、
500×ｇで５分間遠心分離により細胞を沈殿として集め
た。この細胞を10mlのTBSに浮遊させた後、超音波処理
により細胞を破壊した。超音波処理の条件は、市販の超
音波発振器（日本精器製作所製）により、出力2.0、位
相1.2で40秒間おこなった。超音波処理後、2,000×ｇで
10分間遠心分離し、細胞核を含む沈殿を得た。この沈殿
を80mlのTBSにて再懸濁し（2.5×105細胞/ml）、プラス
チックプレートの各ウェルに50μずつ添加した。これ
を先の例と同様に固定した。すなわち、このプラスチッ
クプレートを30分間放置し、添加液上清を吸引除去し
た。次に、各ウェルに85％アセトン水溶液を50μづつ
添加し、室温にて10分間静置し、アセトン水溶液を吸引
除去した後、プラスチックプレートを乾燥させた。
試 験 例 低張緩衝液により抽出した細胞核を担持させたプラス
チックプレートに、正常人（37例）又は、自己免疫性疾
患患者（71例）より得られたヒト血清を、それぞれ100
倍に希釈した検体を、各ウェル当り、40μづつ加え
た。この時、ヒト血清の希釈は、カゼインを0.01M Tri
s−HCl/0.15M NaCl緩衝液（pH7.4,防腐剤0.1％ NaN3
を含む）に飽和するまで溶かして調整した希釈液を用い
た。検体の希釈血清の添加後、室温にてプレートを約１
時間放置した。放置後、各ウェルから未反応上清を吸引
除去し、洗浄液（1.3mg/ml Na2HPO4,3.3mg/ml KH2PO4,
100mg/ml NaCl及び、20mg/mlモノラウリン酸ポリオキシ
エチレンソルビタンを含む濃縮洗浄液を用事20倍に希釈
して使用）にて３回ウェルを洗う。次に、各ウェルにHR
PO標識プロテインＧ（プロテインＧは免疫グロブリンと
特異的に反応する蛋白であり、コスモ・バイオ（株）よ
り市販されている。）をカゼイン溶液（希釈液に同じ、
ただし、防腐剤は0.2％フェノール）に5mg/mlの濃度で
溶かした標識溶液を40μづつ加え、さらに室温にて約
１時間放置する。再放置後、各ウェルから未反応標識溶
液を吸引除去し、再び、洗浄液にて各ウェルを洗う。次
に、各ウェルに50μのテトラメチルベンヂジン（TM
B）発色液（5mg/mlテトラメチルベンヂジン,0.2mg/mlフ
ェノキシメチルペニシリンカリウム,3.2μ/ml塩酸を
含むクロモゲン水溶液と0.27mg/ml尿素・過酸化水素,1
3.1mg/ml水酸化ナトリウム,1.64μ/ml酢酸を含む基質
液を用事１対10で混合し使用）を加え、室温にて30分間
放置後、各ウェルに50μの0.5N硫酸を加えて反応を停
止させ、450nmにて吸光度を測定した。
チックプレートに、正常人（37例）又は、自己免疫性疾
患患者（71例）より得られたヒト血清を、それぞれ100
倍に希釈した検体を、各ウェル当り、40μづつ加え
た。この時、ヒト血清の希釈は、カゼインを0.01M Tri
s−HCl/0.15M NaCl緩衝液（pH7.4,防腐剤0.1％ NaN3
を含む）に飽和するまで溶かして調整した希釈液を用い
た。検体の希釈血清の添加後、室温にてプレートを約１
時間放置した。放置後、各ウェルから未反応上清を吸引
除去し、洗浄液（1.3mg/ml Na2HPO4,3.3mg/ml KH2PO4,
100mg/ml NaCl及び、20mg/mlモノラウリン酸ポリオキシ
エチレンソルビタンを含む濃縮洗浄液を用事20倍に希釈
して使用）にて３回ウェルを洗う。次に、各ウェルにHR
PO標識プロテインＧ（プロテインＧは免疫グロブリンと
特異的に反応する蛋白であり、コスモ・バイオ（株）よ
り市販されている。）をカゼイン溶液（希釈液に同じ、
ただし、防腐剤は0.2％フェノール）に5mg/mlの濃度で
溶かした標識溶液を40μづつ加え、さらに室温にて約
１時間放置する。再放置後、各ウェルから未反応標識溶
液を吸引除去し、再び、洗浄液にて各ウェルを洗う。次
に、各ウェルに50μのテトラメチルベンヂジン（TM
B）発色液（5mg/mlテトラメチルベンヂジン,0.2mg/mlフ
ェノキシメチルペニシリンカリウム,3.2μ/ml塩酸を
含むクロモゲン水溶液と0.27mg/ml尿素・過酸化水素,1
3.1mg/ml水酸化ナトリウム,1.64μ/ml酢酸を含む基質
液を用事１対10で混合し使用）を加え、室温にて30分間
放置後、各ウェルに50μの0.5N硫酸を加えて反応を停
止させ、450nmにて吸光度を測定した。
結果を図に示す。図において１個の○または●印は１
つの検体を表わす。○印は対照として行った可溶化抗原
（ENA）を用いた従来のELISA法の場合、●印は本発明の
測定用器具を用いた場合の各検体の吸光度を示す。また
Ｉは現在標準法とされるHEp−２細胞を固定したスライ
ドガラスを用いた蛍光抗体法で陽性の自己免疫患者血清
を測定した場合、IIは正常人血清を測定した場合、III
は蛍光抗体法で陰性の自己免疫患者血清を測定した場合
を示す。Ｉで吸光度の低いところに○印がかたまってい
るのは、従来法の測定器具の感度が悪いことを示してい
る。
つの検体を表わす。○印は対照として行った可溶化抗原
（ENA）を用いた従来のELISA法の場合、●印は本発明の
測定用器具を用いた場合の各検体の吸光度を示す。また
Ｉは現在標準法とされるHEp−２細胞を固定したスライ
ドガラスを用いた蛍光抗体法で陽性の自己免疫患者血清
を測定した場合、IIは正常人血清を測定した場合、III
は蛍光抗体法で陰性の自己免疫患者血清を測定した場合
を示す。Ｉで吸光度の低いところに○印がかたまってい
るのは、従来法の測定器具の感度が悪いことを示してい
る。
本発明による核画分を担持させたプレートによるELIS
A法による陽性，陰性の判定と、蛍光抗体法による判定
の間には85〜95％の相関率が認められたのに対して、従
来のENAを用いた従来のELISA法と蛍光抗体法による判定
の間には60〜70％の相関率が認められたにすぎなかっ
た。また、本発明のELISAによる測定値と蛍光抗体法の
蛍光染色強度の間にも高い相関性が認められた。
A法による陽性，陰性の判定と、蛍光抗体法による判定
の間には85〜95％の相関率が認められたのに対して、従
来のENAを用いた従来のELISA法と蛍光抗体法による判定
の間には60〜70％の相関率が認められたにすぎなかっ
た。また、本発明のELISAによる測定値と蛍光抗体法の
蛍光染色強度の間にも高い相関性が認められた。
図は本発明および従来の測定用器具を用いて検体血清中
の抗核抗体を測定した結果を示す。
の抗核抗体を測定した結果を示す。
Claims (3)
- 【請求項１】細胞核の懸濁液をプラスチック支持体と接
触させて細胞核を支持体に吸着させ、該プラスチック支
持体を前記懸濁液から分離した後、その表面を50〜90％
アセトン溶液で処理して細胞核を支持体に固定すること
を特徴とする抗核抗体測定用器具の製法。 - 【請求項２】細胞核の懸濁液をプラスチック支持体のウ
ェルに添加し、室温にて30〜120分間静置して細胞核を
プラスチック支持体上に吸着させ、未吸着上清をウェル
から除去後、50〜90％アセトン溶液を、ウェルに添加
し、室温にて10分間以上静置して、細胞核をプラスチッ
ク支持体上に固定させることを特徴とする請求項１記載
の製法。 - 【請求項３】請求項１または２に記載の製法によって製
造された抗核抗体測定用器具。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1076620A JP2532651B2 (ja) | 1988-03-30 | 1989-03-30 | 抗核抗体測定用器具の製法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7446888 | 1988-03-30 | ||
| JP63-74468 | 1988-03-30 | ||
| JP1076620A JP2532651B2 (ja) | 1988-03-30 | 1989-03-30 | 抗核抗体測定用器具の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01316662A JPH01316662A (ja) | 1989-12-21 |
| JP2532651B2 true JP2532651B2 (ja) | 1996-09-11 |
Family
ID=26415625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1076620A Expired - Fee Related JP2532651B2 (ja) | 1988-03-30 | 1989-03-30 | 抗核抗体測定用器具の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2532651B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001055724A1 (fr) * | 2000-01-27 | 2001-08-02 | Shibayagi Co., Ltd | Technique de quantification applicable a un anticorps de maladie auto-immune, reactif de quantification et trousse de quantification |
| EP2697645A1 (en) * | 2011-04-15 | 2014-02-19 | VivaBioCell SpA | Immunodiagnostic method for diagnosing auto-immune systemic sclerosis (ssc) and systemic lupus erythematosus (sle) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2447025A1 (de) * | 1974-10-02 | 1976-04-08 | Behringwerke Ag | Reagens zum nachweis von antinukleaeren faktoren und ein verfahren zu dessen stabilisierung |
| JPS58168960A (ja) * | 1982-03-30 | 1983-10-05 | Green Cross Corp:The | 免疫測定用プラスチツクセル |
| EP0206779A1 (en) * | 1985-06-21 | 1986-12-30 | Modern Diagnostics, Inc. | Detecting antinuclear antibody |
| JPH0833395B2 (ja) * | 1986-04-15 | 1996-03-29 | 住友ベークライト株式会社 | 固相免疫測定用成形品の製造方法 |
-
1989
- 1989-03-30 JP JP1076620A patent/JP2532651B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01316662A (ja) | 1989-12-21 |
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