JP2503334B2 - 抗体結合体の製造方法 - Google Patents

抗体結合体の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】１．発明の属する技術分野 本発明は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗
体 (従来の抗血清) を含む抗体を可溶性または不溶性の
結合相手 (化合物、リンカー、または担体) に共有結合
させて、アフィニティー精製、分離、診断、治療などに
有用な抗体結合体を形成させることに関する。更に詳細
には、本発明は、抗体分子の抗原結合領域外にある抗体
分子の炭水化物成分との、抗体分子のスルフヒドリル基
との、または抗体のFc領域のアミノ基またはカルボキシ
基との結合方法に関するものである。生成した結合体
は、もとになる抗体の完全な免疫特異性と免疫反応性を
実質的に保有しており、その他に補体を活性化する能力
をも有する。本発明は更に、 in vivoまたはiv vitroで
標的部位へ化合物を運搬するキャリヤーシステム全般に
も係わるものである。かかるシステムはin vivo で標的
部位へ薬剤または他の化合物を運搬するシステム、iv v
itroとin vivo での造影システム (例：腫瘍造影システ
ム) 、細胞選別システム、更に抗原−抗体相互作用に基
づく分離機構等の分野にも係わるものである。本発明は
更に、基質−リンカーと抗体との結合をも含み、これに
より生じた抗体結合体は抗原と結合し、補体を活性化す
る能力を保持するものである。所定の応用例では、これ
は活性形態の化合物の標的部位での放出を促進する。
【０００２】2. 発明の背景 2.1. 共有結合 化合物と抗体との共有結合を行うには、各種の反応を利
用することができる。これは、リシンのアミノ基、グル
タミン酸とアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システ
インのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸の様々な
部位を含む、抗体分子のアミノ酸残基の反応により達成
されてきた。これらの抗体分子のポリペプチド主鎖への
共有結合方法には重大な欠点がある。免疫グロブリンの
Ｌ鎖およびＨ鎖のアミノ酸配列は、抗原結合領域を含む
抗体分子中に比較的規則的にかつランダムに分散してい
るアミノ酸のすべてを含むものである。この抗原結合領
域内に化学的修飾が起こると、抗体の認識要素内に変化
を導入したことになる。かかる変化は、抗体の抗原に対
する親和性と特異性とを変化させると思われ、実際に変
化させている。様々な抗体の集団では、かかる抗原結合
領域内の変化は一部の抗体を完全に不活性化し、また抗
原結合部位への該変化の接近状態に応じてその他の抗体
をより少ない程度に不活性化することになる。この不活
性化は、抗原結合部位を非反応性にするような該結合部
位のコンフォメーションの変化によるものであるかも知
れず、また抗原が抗原結合領域へ接近するのを制限する
ような抗原結合領域外の変化によるものであるかも知れ
ない。
【０００３】最も普通に用いられている非特異的共有結
合法は、化合物のカルボキシル基を抗体のアミノ基へ結
合させるカルボジイミド反応であろう。これ以外に、ジ
アルデヒドまたはイミドエステル等の二官能性試薬を用
いて化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基へ結合させ
ることも行れている。研究者の中には化合物と抗体分子
とを結合させるためにシッフ塩基反応を用いたものもい
る。この方法では、グリコールまたはヒドロキシ基を含
有する薬剤または細胞毒剤の過ヨウ素酸塩による酸化を
伴い、従ってアルデヒドが形成され、これが抗体分子と
反応することになる。結合は、抗体分子のアミノ基との
シッフ塩基の形成を介して起こる。その他に、反応性の
スルフヒドリル基を有する化合物を抗体分子にカップリ
ングさせることも行われた。イソチオシアネートをカッ
プリング剤として用いて、化合物を抗体に共有結合させ
ることもできる。この方法により、蛍光顕微鏡法 (Bran
dtzaeg, 1973, Scand. J. Immunol. ２:273-290) や細
胞選別システム (Loken andHerzenberg, 1975, Annals
N. Y. Acad. Sci. 254:163-171) に用いるために蛍光化
合物を抗体分子へ結合させることが行われた。鎖間のジ
スルフィド結合を共有結合の部位として利用することも
できる。たとえ鎖間ジスルフィド結合のみを選択的に還
元することができたとしても、機能的親和性、凝集能、
補体固定能等の抗体の機能的特性のいくつかが悪影響を
受けるであろう。
【０００４】2.2. 非共有結合 抗原結合領域外 (可変領域外) での抗体分子の別の結合
方法は、抗体分子の不変領域に対して向けられた抗体の
使用、または不変領域内の部位に特異的に結合すること
が知られるスタフィロコッカスのプロテインＡを用いる
ものである。これらの結合の仕方は非共有結合であるの
で、どちらのやり方も限定れており、分離・精製法には
効率がよくないと思われる。抗原の解離は、非共有的に
結合している担体から抗体が放出される結果になりかね
ないので、抗原の選択的溶出が行れなくなる。更にキャ
リヤーシステムについては (第2.3 節を参照のこと) 、
抗体複合体が標的部位に達する前に非共有結合がこわれ
る可能性が大きいので、共有結合の方が好ましい。
【０００５】2.3. キャリヤーシステム 薬物運搬システムではいくつかの物質をキャリヤー分子
として利用しているが、上手くいった例は限られてい
る。実際に、キャリヤーは無毒性で、しかも標的部位に
対して特異性をもつべきである。理想的には、標的部位
においてキャリヤーから化合物が活性形態で放出される
ための機構があるべきである。ＤＮＡ、リポソーム、蛋
白、ステロイドホルモン、抗体 (抗体分子全部または F
abフラグメント) 等のキャリヤー分子が、放射性化合物
(例. Ｉ125 , Ｉ131 ) ；ＤＮＡと結合する物質である
アルキル化剤や種々の抗生物質 (例. ダウノマイシン,
アドリアマイシン, クロラムブシル) ；メトトレキセー
ト等の代謝拮抗物質；細胞表面で作用する物質 (例．毒
物ホスホリパーゼ, 微生物の毒物) ；蛋白質合成抑制剤
(例．ジフテリア毒素, 有毒植物蛋白) 等の広範囲にわ
たる薬剤または細胞毒剤と共に従来用いられてきた。こ
の点については以下の文献を参照されたい：Bale et a
l., 1980, Cancer Research 40:2965-2972；Gohs and B
lair, 1978, J.Natl. Cancer Inst. 61(3):657-676 ；G
regoriadis, 1977, Nature 265:407-411；Gregoriadis,
1980, Pharmac. Ther. 10:103-118；Trouet et al., 1
980, Recent Results Cancer Res. 75:229-235。本発明
に関連のあるデリバリーシステムについて以下に述べ
る。
【０００６】リポソームによる薬剤の運搬は標的特異性
に欠けるという重大な欠陥がある。最近、この問題を解
決しようとして、薬剤を含むリポソームへ全抗体または
Fabフラグメントを共有結合させた研究が行われた〔He
ath at el., 1981, Biochim.Biophys. Acta 640;66-8
1；Huang et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(17):8015
-8018；Jansons and Mallet, 1981, Anal. Biochem. 11
1:54-59；Martin et al., 1981, Biochem. 20:4229-423
8〕。更に、抗体と前もって結合させた複数の特定標的
へ製剤を向けるためにプロテインＡ (Staph Ａプロテイ
ン) をリポソームに結合させた研究も行われた。かかる
標的は用いる抗体によって限定される〔Leserman et a
l., 1980, Nature 288:602-604 〕。しかしながら、リ
ポソームキャリヤーシステムの特に重要な本質的問題
は、殆んどの場合標的化されたリポソームがin vivo で
標的部位に選択的に到達しないことである。リポソーム
が抗体分子で被覆されているか否かは問わず、リポソー
ムはマクロファージにより直ちに取り込まれ、他の標的
部位に到達する前に循環系から除去されてしまう。
【０００７】リポソーム標的化システムには他にも重大
な本質的問題があることを大多数の研究者が認めてい
る。即ち、標的化されたリポソームが標的細胞に結合す
ることは必ずしもリポソーム内容物、つまり薬剤が標的
細胞内に取り込まれることを意味しないということであ
る〔Weinstein et al., 1978, Biochem. Biopyhs. Acta
509:272-288〕。一部の研究者は、標的細胞内に取り込
まれるレセプターに対して特異性を有する化合物を用い
てリポソームを標的化することでこの問題を解決しよう
とした〔Leserman et al., 1980, Proc. Natl. Acad. S
ci., U.S.A. 77(7):4089-4093 ；Mauk et al., 1980,
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 77(8):4430-4434
〕。しかしながら、リポソーム内容物を取り込ませる
問題は、腫瘍細胞の全てが食細胞として活動していると
は限らないので解決されないままである。例えば、線維
肉腫細胞はリンパ腫や白血病の細胞よりもずっと食作用
が弱い。従って、これらのリポソームを用いたデリバリ
ーシステムは、究極的には細胞を死に至らしめる物質を
内部へ取り込む標的細胞自体の能力に依存する。
【０００８】最後に、たとえリポソームが標的細胞内に
取り込まれた場合でも、薬剤が活性形態で放出されると
いう保証はない。食作用の後で、リポソーム内容物は標
的細胞のリソソーム内に取り込まれる。リソソーム内の
蛋白質分解酵素は、薬剤の構造を変えたり活性部位を開
裂することにより、薬剤を分解したり不活性化したりす
る。リソソーム内に含まれている多種多様な蛋白質分解
酵素のため、薬剤が活性形態で放出されるような結合の
仕方を考案することは、不可能ではないにしても、非常
に難しくなる。かくして、標的細胞リソソームの酵素内
容物への依存は、活性形態の薬剤を放出させるためのせ
いぜい偶発的システムであると言える。
【０００９】化合物または薬剤を従来の抗体、モノクロ
ーナル抗体または腫瘍抗原に対する抗体の Fab部分へ直
接結合させることを伴う標的システムについての報告が
多くの研究者によってなされた。これについては上記の
論文、Blythman et al., 1981, Nature 290:145-146 ;
Davis and Preston, 1981, Science 213:1385-1388；Hu
rwitz et al., 1979, Int. J. Cancer 24:461-470 ；米
国特許第4,093,607号；英国特許第1,446,536号を参照さ
れたい。Urdal and Hakomori (1980, J. BiolChem. 255
(21):10509-10579) は、抗体で標的化し、アビジンによ
り媒介される薬剤による腫瘍細胞の撲滅について述べて
いる。標的システムのキャリヤーとして、抗体以外の蛋
白について調べた研究者も多数ある。例えば、脱シアリ
ル化糖蛋白質は優先的に肝細胞によって取り込まれる。
上記の論文、ならびにBernstein et al., 1978 J. Nat
l. Cancer Inst. 60(2):379-384 を参照されたい。抗体
キャリヤーシステムはリポソームキャリヤーシステムよ
りも標的に対して高い特異性を有しているが、標的部位
での薬剤の放出には重大な問題が生じる。リポソーム媒
介システムと同じように、抗体−薬剤化合物が腫瘍細胞
によって取り込まれて、薬物がリソソーム酵素による開
裂を経て放出されるようにしなければならい (上記論文
を参照のこと) 。更に、薬剤が抗体分子の部位へ非特異
的にランダムに結合すると、抗原結合能を妨げることが
あり、それ故該システムの有効性を減ずることがある。
【００１０】非侵入的in vivo 造影方法において最近用
いられている放射性薬剤技法は、標的となる臓器が循環
系から放射性薬剤ラベルを取り込む能力に基づいてい
る。この技法は種々の物質を利用して放射性化合物を所
望の標的へ運搬するものであり、かかる物質には基質、
基質類似体、リガンド、ホルモン、放射性核種、二官能
性キレート剤 (重金属または放射性核種と結合可能なキ
レート剤を一端に有し、標的細胞へ共有結合できる反応
基を他端に含有するリンカー基) およびリポソームがあ
る［Spencer, R. P.編集, 1980, Radiopharmaceutical
s Structure-Activity Relationship(放射線薬物の構造
−活性の関係), Grune & Stratton, New York ；Eckelm
an and Levanson, 1977, Intl. J. Appl. Radiation an
d Isotoper28:67-82 ］。現在利用可能な他の非侵入的
技法は発光断層撮影法、核磁気共鳴イメージング、in v
ivo 分光法等である。Brownell et al., 1982, Science
215:619-626を参照されたい。その中で、著者らは放射
性薬剤分野での標識抗体の使用を示唆している。
【００１１】3. 発明の概要 本発明は抗体分子と化合物を共有結合させることに関
し、その結果生じる抗体結合体は抗原へ結合しかつ補体
を活性化する能力を保持する点に特徴がある。更に具体
的には、本発明によるかかる結合の方法は、抗体の炭水
化物成分、抗体のスルフヒドリル基ならびに抗体のFc領
域のアミノまたはカルボキシル基への結合を含むもので
ある。本発明の好ましい態様では、かかる結合の方法は
抗体Ｈ鎖の炭水化物成分、一般にはＣＨ2 領域への共有
結合に係わるものである。炭水化物は抗体の不変領域内
（可変領域外）にあるので、炭水化物自体の修飾により
反応性の基または干渉性の基が可変領域内に直接導入さ
れることはない。従って、かかるアプローチは免疫反応
や免疫特異性に悪影響を与えることなしに抗体を共有結
合で修飾するための手段として有利である。
【００１２】本発明の好ましい態様によれば、抗体の修
飾は公知の試薬および反応を用いる炭水化物成分への共
有結合により行う。蛋白質化学の代わりに、本発明者ら
は糖蛋白質の炭水化物を修飾するという炭水化物に固有
の炭水化物化学反応を利用した。基本的には、排他的で
はないが、主として炭水化物成分に係わる数多くの異な
る酵素的、非酵素的反応が存在している。本発明の抗体
結合体は、完全ではないにしても、実質的な免疫反応性
と免疫特異性を保持することが見出された。モノクロー
ナル抗体を用いてかかる結合体を生成する時、会合定数
と抗体異性度指数 (index of heterogeneity) とは共有
結合修飾の本発明方法によって左右されるものではない
が、従来法の修飾では平均結合定数が減少し、機能的異
質性を導入することになる。更に本発明の新規な手法と
共に使用可能な試薬は非常に選択的であり、従って抗体
分子のポリペプチド部分の検出可能な反応がまったく存
在しない。これは抗体の完全な分子または機能的な１価
フラグメントを用いて行うことができる。更に、修飾は
IgA, IgD, IgE, IgG, IgM を含む種々の抗体クラスと、
モノクローナル抗体を含む任意の供給源から得た抗体に
ついても行うことができる。
【００１３】本発明は更に、in vivo またはin vitroで
特定の細胞、組織、臓器または他の部位へ１以上の化合
物を運搬し、続いて標的部位で該化合物を補体の媒介に
より放出させるために、該化合物を標的へ向かわせるキ
ャリヤー分子として抗体を使用することをも包含するも
のである。また、この放出は血清プロテアーゼにより媒
介されることもある。所望の標的（例．腫瘍細胞、ウイ
ルス、真菌、細胞、寄生体の抗原決定基）に対する抗体
をキャリヤー分子として使用することができる。従来の
抗体をキャリヤー分子として使用してもよいが、モノク
ローナル抗体は、抗原特異性が増し、運搬システムの効
率が向上し、製造が容易であるという利点を有する。in
vivo で投与されると、キャリヤー抗体分子は標的部位
の抗原決定基に結合する。引続いて起こる結合された化
合物の放出は、補体の活性化または血清プロテアーゼに
依存する。補体（complement) とは、ある種の免疫複合
体の生成により連続的に活性化される（補体カスケード
反応）血清蛋白のグループに与えられた集合的な名称で
ある。カスケード反応の補体成分のうちいくつかは、特
定の基質または化学結合に特異的な蛋白質加水分解活性
を有する。
【００１４】本発明の方法によれば、化合物を補体活性
化が可能である免疫グロブリンクラスの抗体キャリヤー
分子に結合させる。この結合は１種またはそれ以上の活
性化された補体酵素による開裂をうけやすいリンカーを
介して行れ、１以上の異なる化合物を各抗体分子へ結合
させることができる。その結果生じた抗体結合体が個体
に投与される。修飾をうけた抗体と抗原との in vivoで
の結合に引続き、個体の血清補体が活性化され、化合物
は選択的に開裂され、標的部位で放出される。かかる結
合体は補体結合アッセイシステムでの標的抗原のin vit
ro検出と識別にも使用することができる。本発明の実施
にあたっては、抗体の抗原結合能または補体活性化能
（補体結合とも言う）を妨げることなく、化合物を抗体
分子に結合させることが好ましい。本発明は、補体活性
化能を有する抗体のいずれにでも化合物を結合させるた
め用いることができる。新規なリンカーおよび結合方法
を開示する。また、腫瘍造影または抗原−抗体相互作用
に基づく分離法のごとき、ある種の技法においては、抗
体が不溶性マトリックスに結合されるが、これには化合
物が標的部位に結合したままでいることが必要となる。
標的部位での開裂が好ましくない別の態様では、活性化
補体蛋白に対して感受性のないリンカーグループを用い
るか、または抗体分子として補体を活性化しないクラス
または型のものを用いる。最後に、他の化合物、例えば
ホルモンまたは神経伝達物質の運搬において、補体カス
ケードを活性化せずに化合物の開裂を行うことが好まし
い場合には、補体と結合しない抗体に結合させた血清プ
ロテアーゼ感受性リンカーを用いてもよい。
【００１５】4. 発明の開示 糖蛋白質は、ある種の治療用および／または診断用手段
として用いられる生物学的に重要な巨大分子のいくつか
の種類のうちの一つである。現在認識されている糖蛋白
質のクラスは決して完全なものではないが、かかる物質
を列挙してみれば、免疫グロブリン、血清補体成分、種
々の酵素、細胞表面組織適合性抗原および細胞表面レセ
プター等が含まれる。これらの化合物はポリペプチド主
鎖へ共有結合された炭水化物残基を有している。抗体と
は、炭水化物成分が通常免疫グロブリン分子のＨ鎖上に
位置する糖蛋白質の一つのクラスである（数種の免疫グ
ロブリンの模式図を示す図１を参照のこと）。炭水化物
成分を含む免疫グロブリンの FabまたはFab'フラグメン
トもここに説明する反応式に用いることができる。IgG
免疫グロブリンのFab'フラグメントは、ペプシンまたは
パパインで抗体分子を開裂することにより得られる〔前
者は２価フラグメント(Fab')2 をもたらし、後者は二つ
の１価フラグメント２Fabをもたらす〕。
【００１６】4.1. 抗体の選択 本発明によれば、どのような抗原またはハプテンに対し
て誘導された抗体も用いることができる。従来の抗体
（抗血清）を用いてもよいが、モノクローナル抗体には
いくつかの利点がある。各モノクローナル抗体は一つの
抗原決定基に対して特異性を有する。これに加えて、各
モノクローナル抗体は無限に産生が可能である。本発明
で用いる抗体はいずれかの抗原決定基、例えば、腫瘍、
細菌、真菌、ウイルス、寄生体、マイコプラズマ、組織
適合性抗原、分化抗原、その他の細胞膜抗原、病原体表
面抗原、毒素、酵素、アレルゲン、薬剤ならびに生物学
的活性を有する分子に対して誘導されたものである。特
に興味のある薬剤としては、オピオイド類、アンフェタ
ミン類、バルビツール酸塩、ステロイド類、カテコール
アミン類、ジランチン (dilantin) 、テオフィリン、ヒ
スタミン、カンナビノイド類等である。抗原の一覧表
は、米国特許第4,193,983号、特に第７〜11欄に記載さ
れており、該特許明細書を参照によりここに組み入れる
ものとする。
【００１７】抗体と結合した化合物の運搬および放出を
希望する場合は、IgM クラスまたはIgGのサブクラスの
内いずれかの免疫グロブリンを用いるべきである。なん
となれば、これらの免疫グロブリンは補体を活性化する
ことが知られているからである。他の用途では補体活性
化能力のないキャリヤー免疫グロブリンを用いてもよ
い。かかる免疫グロブリンのキャリヤーには以下のもの
が含まれる：IgA, IgD,IgE の如きあるクラスの抗体、I
gG のある種のサブクラス、免疫グロブリンのある種の
フラグメント、例えば半抗体分子（単一のＨ：Ｌ鎖の
対）、またはFab, Fab' または(Fab')2 フラグメント。
in vivo 標的の造影を行いたい場合には、抗体フラグメ
ントは比較的速い速度で標的部位に浸透するのでキャリ
ヤーとして有利である。さらに、相異なる抗原決定基に
対して反応する抗体の組合せを用いてもよい。
【００１８】
【表１】
【００１９】4.2. 化合物を抗体分子へ結合する方法 従来法の利用に加えて、本発明は化合物を抗体分子へ結
合させる新規な方法を含んでいる。即ち、(1) 抗体分子
の炭水化物成分へ結合させること、(2) 抗体分子のスル
フヒドリル基へ結合させること、および(3) 抗体分子の
Fc領域のアミノ基またはカルボキシル基へ結合させるこ
とである。どの方法を利用した場合も、結合によって抗
体の主な特徴である免疫特異性や免疫反応性等を有意に
変えてはならない。その他には製造された抗体結合体の
安定性と反応の単純さが考慮される。
【００２０】4.2.1. 抗体の炭水化物成分への結合 以下に詳述するように、抗体の炭水化物側鎖を選択的に
酸化してアルデヒドを生成する。生成したアルデヒドを
アミン基（例．ヒドロキシルアミン, ヒドラジン, フェ
ニルヒドラジンまたはセミカルバジド等のアンモニア誘
導体）と反応させてシッフ塩基（例．オキシム, ヒドラ
ゾン, フェニルヒドラゾンまたはセミカルバゾン）を生
成させる。または、抗体の炭水化物成分を酵素的技法で
修飾して他の化学基との結合または反応を可能にするこ
とができる。かかる酵素の一例は酸素の存在下でガラク
トースを酸化するガラクトースオキシダーゼである。
【００２１】４.2.1.1. 酸化の化学的方法 抗体分子の炭水化物成分の酸化はアルデヒド基の生成へ
導く。過ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸ナ
トリウム、メタ過ヨウ素酸カリウム等の酸化剤を用いる
ことができる。これらの中では酸素酸とその塩は二次的
な反応つまり好ましくない副反応の度合が低いので好ま
しい。一般的な議論については、Jackson 著、1944「有
機反応 (Organic Reactions)２」第341頁；Bunton著、1
965「有機化学における酸化（Oxidation in Organic Ch
emistry）」第１巻、（ワイバーグ編)(アカデミックプ
レス社、ニューヨーク）第367頁を参照されたい。抗体
とこれらの酸化剤との酸化反応は公知の方法で行うこと
ができる。酸化反応では、抗体は通常水溶液の形で用い
られ、その濃度は通常100mg/ml以下、好ましくは１〜20
mg/ml である。酸化剤として酸素酸またはその塩を用い
るときは、これは通常水溶液の形で用いられ、その濃度
は通常0.001 〜50mM、好ましくは1.0 〜10mMである。酸
素酸およびその塩の量は抗体の種類に左右されるが、一
般に過剰量、例えば被酸化性炭水化物の２〜10倍量が用
いられる。しかし最適量は日常的な実験により決定でき
る。抗体を酸素酸またはその塩で酸化する工程におい
て、最適ｐＨ範囲は約４〜８、温度は０〜37℃、そして
反応時間は約15分から12時間である。糖蛋白を酸素酸ま
たはその塩で酸化する間、光を遮断して糖蛋白の過剰酸
化を防止することが好ましい。
【００２２】4.2.1.2. 酸化の酵素的方法 抗体分子の炭水化物部分の酸化は酵素、ガラクトースオ
キシダーゼで行うこともできる〔Cooper, et al., 195
9, J. Biol.Chem. 234:445-448〕抗体は水溶液の形で用
い、濃度は通常0.5 〜20mg／mlである。酵素は通常溶液
ml当り約５〜１00単位、pH約5.５〜約8.０で用いられ
る。pH、基質濃度、バッファーおよびバッファー濃度の
酵素反応に対する影響はクーパー等（前掲）が述べてい
る。
【００２３】４.2.1.3. 抗体結合体の製造 本発明による抗体結合体は、酸化抗体を利用可能なアミ
ン基を有する適当な結合相手と反応させて製造する。こ
の直後に得られる生成物（抗体結合体）は、初期の付加
生成物から水分子の除去により生じた炭素−窒素二重結
合を含む。
【００２４】
【化２】 アルデヒドとヒドラジドの反応についてはマーチ (Marc
h)著「上級有機化学：反応、メカニズムおよび構造（Ac
vanced Organic Chemistry：Reactions, Mechanisms an
d Strusture)」1978年（マグロウヒル社、ニューヨー
ク）第674頁を参照されたい。濃度が約0.５〜20mg／ml
の酸化抗体の溶液を結合相手と混ぜ合わせ（結合相手の
反応性基と抗体アルデヒドのモル比は約１〜約10,00
0）、この溶液を約１〜18時間加温した。適温は０℃〜3
7℃で、pHは約６〜８でありうる。
【００２５】４.2.1.4. 抗体結合体の安定化 抗体結合体が抗体とその結合相手との間で第4.2.1.3.節
に記載の方法で生成された後、抗体結合体は適当な還元
剤、例えばナトリウムシアノボロハイドライドまたはナ
トリウムボロハイドライドで安定化を計ることも可能で
ある。 還元剤 抗体-CH＝N-R → 抗体-CH2-NH-R 還元剤は通常、有効なアルデヒド基に対して約10〜１00
倍モル過剰に加える。これについての一般的情報は Jen
toft and Dearborn, 1979, J. Biol. Chem. 254:4359を
参照されたい。
【００２６】４.2.2. 抗体分子のスルフヒドリル基への
結合 遊離スルフヒドリル基は免疫グロブリン分子のジスルフ
ィド結合から生成しうる。これは抗体分子の温和な還元
により達成できる。 IgGのジスルフィド結合の中で通常
最も還元しやすいものは二つのＨ鎖を結合するものであ
る。抗体分子の抗原結合領域の近くにあるジスルフィド
結合は比較的影響をうけないで残存する（図１を参照の
こと）。かかる還元の結果として、補体結合能が失われ
るが、抗体−抗原結合能は影響をうけない（Karush et
al., 1979, Biochem, 18:2226-2232) 。Ｈ鎖領域内で生
成される遊離スルフヒドリル基は、次にカルボキシまた
はアミノ基を含む化合物のヨードアルキル誘導体（例．
化合物に結合されるリンカーグループのヨードアルキル
誘導体）と反応し、共有結合を形成する。かかる結合は
免疫グロブリンの抗原結合部位を妨害しない。
【００２７】化合物を還元免疫グロブリンまたは還元抗
体フラグメントの遊離スルフヒドリル基へ結合すること
により製造される抗体結合体は補体を活性化しない。従
って、これらの結合体は、化合物の開裂や放出が望まし
くないin vitro分離や in vivo造影システムに用いるこ
とができる。このような結合体は、補体により媒介され
ない放出を所望する時にも用いることができる。かかる
態様では、還元免疫グロブリンまたは還元抗体フラグメ
ントのスルフヒドリル基へ血清プロテアーゼによる開裂
をうけやすいリンカーを介して化合物を結合させること
もできる。
【００２８】IgG免疫グロブリンのFab'フラグメントは
抗体分子をペプシン（２価フラグメント(Fab')2 をもた
らす）またはパパイン（二つの１価フラグメント２Fab
をもたらす）で開裂すると得られる。図１を参照された
い。 Fabと(Fab')2 フラグメントは抗体分子全体よりも
小さく、従って、標的部位または組織への浸透が容易で
ある。これにより in vivo造影は明らかに有利となる。
その理由は結合体が in vivo部位（腫瘍塊、感染部位
等）へ浸透しやすくなるからである。抗体フラグメント
を使って生成した結合体を用いる場合は、これらのフラ
グメントが胎盤関門を越えないというその他の利点もあ
る。その結果、この態様を用いる時、妊娠中の婦人にお
いて造影化合物に胎児を曝露することなく in vivo部位
（例えば、腫瘍）を撮影することができる。
【００２９】抗体分子のスルフヒドリル基へ化合物を結
合させると補体結合能を破壊することになるが、かかる
結合の方法を用いて補体媒介放出システムに用いる抗体
結合体を作ることができる。このような態様では、補体
感受性を有する基質リンカーに結合させた化合物を、還
元したIg分子または抗体フラグメントのスルフヒドリル
に結合させ、補体を活性化することのできる完全な抗体
分子との混合物として標的へ運搬する。後者が補体を活
性化し、この補体が前者から化合物を開裂するだろう。
抗体フラグメントを、補体媒介放出システムにおいてキ
ャリヤー分子として使用すれば、妊娠中の女性の治療が
可能となり、結合体が標的部位へより迅速に浸透すると
いう利点が得られる。
【００３０】本発明によれば、還元抗体分子のスルフヒ
ドリル基への結合を行うため、基質リンカーはヨードア
ルキル基をリンカーの一端に結合させることにより修飾
される。リンカーの修飾されていない部位は化合物へ共
有結合させてもよく、させなくともよい。例えば、第5.
５節で製造した化合物にエステルまたはアミド結合され
る基質リンカー（表２および表３を参照）は、ヨードア
ルキル基を付加して修飾し、以下に示すヨードアルキル
誘導体を形成させる（注：＊印はアミドまたはエステル
結合を意味する）。
【００３１】
【化３】 前述した様に、リンカーは活性化補体または血清プロテ
アーゼによる開裂をうけやすいものであっても、これに
抵抗を示すものであってもよい。リンカーグループのヨ
ードアルキル誘導体を還元抗体分子または還元抗体フラ
グメントと反応させると、リンカーグループは抗体分子
またはフラグメントに共有結合される。これは以下の通
りである（注：＊印はアミドまたはエステル結合を意味
する）。
【００３２】
【化４】
【００３３】４.2.3. 抗体分子のFc領域のアミノまたは
カルボキシ基への結合 化合物を抗体分子へ結合させる従来法を変更して、本発
明のために使用することもできる。これらの従来法では
化合物を抗体分子のアミノまたはカルボキシル基へ結合
させる。従来法の欠点は抗体分子の抗原への結合親和力
が低下する（つまり免疫特異性が低下する）ことにあ
り、これはリンカーまたは化合物が抗体分子の Fab領域
（抗原結合アーム）へ非特異的に結合するためである。
従って、従来の結合法を利用するには、基質リンカーを
抗体分子のより適切な位置へ向けるようにして、免疫複
合体形成と補体による開裂を可能にすべきである。この
ためには、Fc領域のアミノまたはカルボキシル基が基質
リンカーと、例えば可溶性カルボジイミド反応を介し
て、反応している間、免疫グロブリンまたは半分子の抗
原結合アーム(Fab領域）を保護する。リンカーが化合物
へ共有結合されている場合は、抗体分子との結合を干渉
するような化合物の反応性基はどれも、抗体分子をリン
カーと反応させる前にブロックすべきである。抗体結合
体が形成されたら、化合物の反応性基を脱ブロックす
る。リンカーは活性化補体または血清プロテアーゼによ
る開裂をうけやすいものであっても、これに抵抗するも
のであってもよい。カップリングの程度は試薬を限定す
ることによりコントロールできる。例えば（注：＊印は
アミドまたはエステル結合を意味する）：
【００３４】
【化５】 Fabアームの保護には幾通りかの方法がある。キャリヤ
ー抗体分子の Fab部分は、キャリヤー Fab抗原結合アー
ムに対する抗体（抗Fab抗体）に結合させることができ
る。その後の結合反応は、キャリヤー抗体分子の未結合
のFc部分への化合物の結合をもたらすだろう。抗Fab抗
体をカラムに固定させると、反応済の成分と未反応の成
分の分離が容易になる。
【００３５】このような結合体は以下の通りに製造する
ことができる（各工程後にバッファーで十分に洗浄す
る）。抗 Fab抗体を臭化シアンで活性化したセファロー
スカラム等の適当な支持マトリックスに結合させる。カ
ラムにキャリヤー抗体を注入し、カラムのすべての抗原
結合部位を飽和させる。これによりキャリヤー抗体の F
ab領域が結合され、抗 Fab抗体の抗原結合部位を保護す
ることになる。カラムをアミノ基遮断剤（例．無水酢
酸, カルボベンゾキシクロライド等）で処理し、抗Fab
抗体および結合したキャリヤー抗体の両方の露出した部
分の全ての遊離アミノ基をブロックする。それからカラ
ムをカオトロピック剤 (chaotropic agent)(例．チオシ
アネート、過塩素酸塩、ヨウ化物等）または変性剤
（例．尿素、ホルモル−尿素、塩酸グアニジン等）で処
理するが、これにより抗 Fab抗体の免疫特異性を破壊せ
ずにキャリヤー抗体を抗 Fab抗体から分離することがで
きる〔Dandliker et al., 1967, Biochemistry ６(5):1
460-1467〕。この処理によって不要なキャリヤー抗体分
子が放出され、固定化抗 Fab抗体を遊離させて、その後
免疫複合体を形成させることができる。その結果、カラ
ムは非抗原結合部位にブロックされたアミノ基を含む固
定化抗 Fab抗体を含むことになり、キャリヤー抗体の負
荷を受ける。キャリヤー抗体が抗 Fab抗体に結合した後
で、化合物に結合された基質リンカーを用いて従来の結
合反応を行う。利用可能なアミノ基はキャリヤー抗体の
Fc部分にだけあるので、この反応は化合物がキャリヤー
抗体のこの部分へ基質リンカーを介して結合するという
結果をもたらす。最後に、得られた結合体は適当なバッ
ファー（例．カオトロピック剤または変性剤）を用いて
溶出によりカラムから放出される。
【００３６】４.3. 結合相手 本発明の方法によれば、抗体は適当な結合相手ならば何
にでも結合することができる。主たる限定要素は、結合
反応が (1)競合する好ましくない反応を制限するに足る
だけ選択的であること、(2) 抗体の反応性や選択性と干
渉しないように穏やかなものであること、という２点で
ある。わかりやすく言うと、結合相手は（a)抗体に直接
結合する対象の化合物と、(b) 可溶性リンカーと、(c)
不溶性担体とに分けられる。
【００３７】４.3.1. 対象の化合物 抗体が結合する相手は、抗体との反応後もその主要特性
を保有している化合物であって、抗体が免疫特異性と免
疫反応性を実質的に保持できるものであればいかなる化
合物であってもよい。例えば、糖蛋白の酸化炭水化物部
分のアルデヒドを化合物へ結合したい場合、化合物は好
ましくはアミノ基またはヒドラジド基の如き反応性基を
含有しているべきである。かかる化合物はホルモン、酵
素、輸送蛋白、触媒、キレート化合物、受容体蛋白、免
疫グロブリンの如き各種蛋白、蛍光または化学ルミネッ
センス化合物または潜在的な蛍光または化学ルミネッセ
ンス化合物を含む。「潜在的」蛍光または化学ルミネッ
センス化合物とは他の物質と反応、修飾または組み合わ
せた後にだけ蛍光または化学ルミネッセンスを発する化
合物を指す。対象化合物にアミノ基が含まれない時に
は、化合物を修飾してカップリングのためのアミノまた
はヒドラジド基をつくることができる。
【００３８】運搬システムに用いる抗体と結合される化
合物は意図する用途（例．細胞の死滅、細胞増殖の予
防、ホルモン療法、標的造影、遺伝子治療、細胞選別ま
たは分離法）にあわせて選択する。かかる化合物は、例
えば薬剤、毒素、毒素フラグメント、アルキル化剤、酵
素、抗生物質、代謝拮抗物質、抗増殖剤、ホルモン、神
経伝達物質、ＤＮＡ、放射線不透過染料、放射性アイソ
トープ、蛍光性化合物、マーカー化合物、レクチン、細
胞膜の透過性に変更を加える化合物ならびに不溶性マト
リックス等である。表１には本発明に用いることのでき
るいくつかの薬剤を記載したが、これは排他的な表でな
いことは当然である。また、化合物を組合せて用いるこ
ともできる。
【００３９】４.3.2. 可溶性リンカー 本発明によれば、一方で抗体と反応し、他方で対象化合
物と反応するいくつかの反応性基を有する中間可溶性リ
ンキング剤つまりリンカーを介して、どの化合物または
不溶性担体にでも抗体を共有結合させることができる。
リンカーは、抗体（または対象化合物もしくは不溶性担
体）との反応や最終生成物が抗体の反応性と選択性に好
ましくない影響を与えないようなものを選ばなければな
らない。一般的にはこれらのリンカーとしてはメルカプ
トエタノールアミンの如く酸化抗体にそのアミノ基を介
して結合するようなヘテロ二官能性リンカーを含む。硫
黄原子を脱ブロックすると、遊離スルフヒドリル基を次
の反応に利用できる。リンカーは抗体と対象の化合物ま
たは不溶性担体との間の距離を任意に選べるような大き
さであればよい。
【００４０】４.3.3. 不溶性担体 適当な不溶性担体は直接抗体に結合させても、または間
接的に可溶性リンカーを介して結合させてもよい。アミ
ンを含有する不溶性担体、例えばアミンまたはヒドラジ
ド担体等、即ち、誘導体化したデキストラン、アガロー
ス、ポリスチレン、ポリビニル、ポリビニルアルコー
ル、ポリアクリルアミド、ガラス、ラテックス等の適当
なポリマーを含む担体へ直接結合させるために酸化抗体
を用いる。これらの担体は通常ビーズとして用いられる
が、特定の用途によっては管や板の両面であってもよ
い。
【００４１】４.4. キャリヤーシステム 本発明の一態様によれば、化合物は標的抗原に対する抗
体に結合させることもできる。標的部位での活性化形態
での化合物の放出が望ましい時は、補体カスケードを活
性化する能力を有するクラスに属する抗体分子（免疫グ
ロブリン）の特定部位へ化合物を結合させる。この結合
は化学結合（例．エステルまたはアミド結合）および血
清補体成分の一つまたはそれ以上による開裂をうけやす
いリンカーグループ（例．ペプチドまたはアミノ酸）を
介して行われる。ここに説明した化学的結合方法により
得られた抗体結合体は、抗原と結合し、補体カスケード
を活性化する能力を保持することができる。その結果、
結合体を個体に投与すると、引続いてin vivo で標的抗
原との免疫複合体の形成が行われ、これにより個体の血
清補体が活性化される。リンカーが補体による開裂をう
けるようにデザインされているのであれば、化合物は補
体カスケードの一つまたはそれ以上の酵素によって標的
部位で開裂される。化合物の放出は標的部位への運搬後
に行われるので、標的運搬システムの効率は大巾に改善
される。
【００４２】本発明方法は他の標的運搬システムと比べ
て更に有利である。腫瘍細胞の全てが標的抗原決定基を
もつわけではないことが知られているので、標的細胞内
への取り込みを必要とするような運搬システムでは、抗
原決定基を有しかつ複合体を取り込むことのできる腫瘍
細胞についてのみ運搬が成功する。抗原決定基をもたな
かったり取り込みができない腫瘍細胞については治療不
能である。本発明方法によれば、抗体キャリヤー分子は
化合物を標的細胞へと運搬する。しかしながら、重要な
ことは、一度標的細胞との結合が行われた後では、本発
明方法では個体の活性化された補体酵素により活性化合
物の放出が可能となることである。放出が行われた後で
は、化合物は自由に標的部位、例えば腫瘍塊等へ浸透す
ることができる。その結果、化合物は抗原決定基をもた
ない腫瘍細胞にも、決定基をもつ腫瘍細胞と同様に効果
を及ぼすことになる。更に、プロセス全体が結合体の取
り込みに左右されない。ここに述べた標的への運搬方法
はいくつかの目的のために用いることができる。結合体
をつくるために用いる抗体、リンカー、化合物は運搬の
目的によって選択する。特定の標的部位への薬剤化合物
の運搬および放出の結果、腫瘍細胞、がん細胞、真菌、
細菌、寄生体またはウイルスを選択的に殺したり、それ
らの増殖を防ぐことができる。ホルモン、酵素または神
経伝達物質を所定の部位へ運搬することも可能である。
最終的には、本発明方法はＤＮＡまたは特定遺伝子をin
vivo またはin vitroでこの特定遺伝子欠損標的細胞へ
運搬するような遺伝子治療にも応用可能となろう。
【００４３】更に別の態様においては、化合物を標的ま
で運搬するが放出しないようにデザインすることもでき
る。従って、本発明は、in vivo およびin vitroで腫
瘍、臓器または感染部位等の特定部位を見い出し、検出
し、定量するために用いることもできる。本発明のこの
態様は、特に造影システム、細胞選別法、分離法等に有
用である。更に詳細に述べれば、造影に関しては放射性
薬物または重金属が、 (a)リンカーと共有結合している
か、または (b)キレート剤を介してリンカーと非共有結
合している。従って、標的の性質と運搬の目的に応じ
て、広い範囲の抗体、リンカー、対象の化合物を種々の
組合せで用いることができる。
【００４４】４.5. 血清補体とリンカーの選択 本発明の方法によれば、化合物の放出を希望する時は、
この化合物を IgMクラスまたはIgG のある種のサブクラ
スの抗体の特定部位へ結合させる（図１）。その結果得
られた結合体は、抗原と結合し、補体カスケード反応を
活性化する能力を保有する。補体とは、古典的な経路と
プロパージン経路の二つの方法の内いずれか一つにより
活性化される血清蛋白グループに与えられた集合的名称
である（Muller-Eberhard, Hospital Practice, 1977年
８月: 33-43)。古典的経路は、まず IgMクラスまたは I
gGのある種のサブクラスの抗体をその対応する抗原へ結
合させることから始まるのに対して、プロパージン経路
は血清蛋白のプロパージンならびに他の非免疫グロブリ
ン血清因子に依存する〔Reid and Porter, 1981, Ann.
Rev. Biochem. 50: 433-464〕。
【００４５】古典的経路は、本発明の実施には特に重要
なものである。古典的経路の特徴は、補体系の蛋白質分
解酵素を活性化するある種の抗体−抗原複合体（または
免疫複合体）の形成にある〔Borsos and Rapp, 1965,
J.Immunol. 95: 559-566 ；Cohen, 1968, J. Immunol.1
00: 407-413 ；Cohen and Becker, 1968, J. Immunol.1
00; 403-406 ；Ishizaka et al., 1968, J. Immunol.10
0: 1145-1153 〕。これらの活性化された補体酵素は、
補体カスケードの他の成分を開裂し、活性化する（図
２）。最終的には、「攻撃複合体 (attack complex) 」
（または溶解複合体）の形成が起こり、標的細胞膜の一
体性がくずれる結果となる。古典的経路で最初に活性化
される成分はＣ１であって、これはＣ２とＣ４に作用す
るプロテアーゼとなる。活性化Ｃ１( Ｃ１) は特異的な
エステラーゼ活性を有する。活性化Ｃ４,2 (Ｃ４b,２a)
は時にＣ３転換酵素と称されることがあるが、Ｃ３を加
水分解により開裂する複合体であり、活性化Ｃ３ (Ｃ３
b)と共にＣ５を開裂する。Ｃ３の開裂は補体活性化にお
ける古典的経路とプロパージン経路で共通した最初のス
テップである。
【００４６】Ｃ１とＣ４b,２a との酵素活性について
は、カルボキシ末端エステルまたはアミド結合でin vit
roで開裂されるモデル合成基質を用いた（表２）研究が
最近行われた。これらの合成基質を本発明で述べたよう
に抗体分子と化合物の間のリンカーとして用いてもよ
い。かかるリンカーにより、特定の補体が媒介する開
裂、これに続く活性型化合物の標的部位での放出が可能
となる。しかしながら、補体成分のいずれかによる開裂
をうけやすい基質をリンカーとして用いてもよい。かく
して、本発明によれば、化合物は基質リンカーグループ
の一端に結合され、リンカーグループの他端は抗体分子
の特定部位に結合される。例えば、化合物がヒドロキシ
基またはアミノ基をもっている時は、ペプチド、アミノ
酸または他の適当に選んだリンカーのカルボキシ末端基
へエステルまたはアミド結合を介して結合させる。例え
ば、かかる化合物はカルボジイミド反応を介してリンカ
ーペプチドへ結合させることもできる。化合物がリンカ
ーとの結合を干渉するような官能基を含む時は、これら
の干渉性官能基を化合物の結合前にブロックし、結合体
の製造後に脱ブロックすることもできる。例えば、図３
は抗新生物薬剤であるアルケラン (Alkeran)（Burrough
s-Wellcome社製）とペプチドＣＢＺ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−
ａｒｇの結合のための一般反応式を示す。その後、リン
カーグループの反対側、つまりアミノ末端基は補体活性
化能を有する抗体分子へ結合させるための修飾をうけ
る。
【００４７】化合物とリンカーの結合は、リンカーを抗
体分子へ結合する前でも後でもよい。寿命の短い放射性
アイソトープの抗体への結合などの場合は、まず中間体
として安定した修飾抗体を製造することが好ましく、そ
の場合リンカーは結合した化合物を含まない。用途によ
っては、化合物を修飾抗体のリンカーへ共有結合させて
もよい。これらのペプチドリンカーは長さが可変であっ
てよく、これは抗体分子から基質までの距離がリンカー
と化合物の間のアミドまたはエステル結合で生じる開裂
の効率を左右するからである。これらのリンカーは有機
化合物を含み、例えば一端を抗体分子の特定部位へ共有
結合させることができる所望の長さの有機ポリマーを含
みうる。有機ポリマーの他端はアミノ酸またはペプチド
リンカーに結合していてもよい。表３には、本発明の抗
体結合体を形成するためのリンカーグループとして用い
ることのできる他の基質を示してある（表中ｎはゼロを
含む整数である）。これらの配列は補体基質配列のアミ
ノ酸を類似の酸−塩基特性を有するアミノ酸と置き換え
ることにより得られた。この表は排他的なものではな
い。このようにして、結合体が補体の存在下で抗原に結
合すると、化合物をリンカーへ結合するアミドまたはエ
ステル結合が開裂され、その結果として化合物がその活
性型で放出される。これらの結合体を個体へ投与する
と、化合物の標的部位への運搬およびそこでの放出が起
こり、かかる結合体は特に薬剤、抗生物質、代謝拮抗物
質、抗増殖剤、細胞毒のin vivo運搬に有効である。別
の態様においては、本発明の結合体を用いて標的抗原を
in vitroで検出することもできる。例えば、結合体を標
的抗原と血清補体を含む試験用混合物に添加すると、そ
の結果生じる化合物（例えば、蛍光化合物）の補体媒介
放出が、該混合物内の標的抗原の存在を知らせる指標お
よび尺度となる。
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】用途によっては、化合物の放出が好ましく
ないものもある。従って、本発明の別の態様では、補体
酵素による開裂をうけにくいリンカーを介して化合物が
抗体分子へ結合される。これらのリンカーにはアミノ
酸、ペプチドまたはここに述べた方法により後で抗体分
子または抗体フラグメントへの結合に用いることのでき
る官能基を含むよう修飾しうる他の有機化合物が含まれ
る。かかる有機リンカーの一般式は次の通りである：
【００５１】
【化６】
【００５２】更には、化合物を補体活性化能のない抗体
分子または抗体フラグメントに結合させることも可能で
ある。補体活性化能をもたないキャリヤー抗体を用いる
時は、活性化補体による開裂をうけにくいリンカーまた
は活性化補体による開裂をうけやすいリンカーを用いて
結合を行う。非開裂のアプローチはアガロース、ポリア
クリルアミド等の固定化または不溶性マトリックスへ抗
体分子またはフラグメントを結合させるのに用いてもよ
い。その後、これらの生成物は複合混合物から特定の抗
原成分を同定したり、これを分離するのに用いられる。
この技術は、抗原を含むと考えれらる混合物を固定化抗
体結合体と接触させることにより達成される。反応しな
かった成分をすべて洗い流してから、抗原−抗体複合体
を解離できる変性剤またはカオトロピック剤で処理し
て、不溶性マトリックスから標的抗原を分離することが
できる。
【００５３】この非開裂アプローチは、細胞選別法〔Lo
ken and Herzenberg, 1975, AnnalsN. Y. Acad. Sci. 2
54:163-171〕や化合物の放出が好ましくない場合の腫
瘍、臓器、感染部位等の位置を決める造影システムに用
いるための抗体結合体をつくるのにも特に有用である。
かかる造影システムでは、抗体フラグメントの使用が明
らかに有利である。その理由は、このようなフラグメン
トが抗体分子全体よりもはるかに容易に組織内に拡散
し、浸透するからである。これに加えて、抗体フラグメ
ントは胎盤関門を越えない〔Bellanti, 1978, Immunolo
gy II, W. B. Saunders, Philadelphia 〕。従って、妊
娠中の婦人でも腫瘍造影を実施することができる。
【００５４】本発明の更に別の態様によれば、化合物と
抗体との間の間隔を最適にするような方法でリンカーを
構築することが必要となろう。これは一般構造式 Ｗ-(CH2)n-Ｑ を有するリンカーを用いて可能となるが、式中Ｑはアミ
ノ酸またはペプチドであり、Ｗとｎは上記した通りであ
る。更に別の標的運搬応用例においては、補体の活性化
なしで化合物が放出されることが望ましい。これは補体
カスケードの活性化が最終的に標的細胞を溶解するから
である。それ故に、標的細胞を殺さずに化合物の運搬と
放出を行わねばならない時にはこのアプローチが有用で
ある。ホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達
物質、遺伝子または酵素等の細胞メディエーターを標的
細胞へ運搬したい時は、これが目標となる。これらの結
合体は、補体活性化能のない抗体分子またはフラグメン
トに、血清プロテアーゼによる開裂を中程度に受けやす
いリンカーを介して、化合物を結合させて形成すること
ができる。この結合体を個体に投与すると、抗原−抗体
複合体が直ちに形成されるが、化合物の開裂速度は遅
く、その結果として化合物が標的部位で放出される。
【００５５】古典的な補体経路での活性化の第一ステッ
プはＣ１と抗体−抗原複合体との間の相互作用を必要と
する。この相互作用は、抗体分子のFc領域の部位が存在
することを必要とする（図１）。炭水化物成分のいくつ
かは免疫グロブリンのFc領域内に位置しているが、これ
らはＣ１結合がおこるために必要である。炭水化物成分
の除去は、免疫複合体が補体の成分Ｃ１と結合する能力
を喪失させる〔Winkelhake et al., 1980, J. Biol. Ch
em. 255:2822-2828〕。炭水化物成分を含む免疫グロブ
リンの FabまたはFab'フラグメントはここに記載した反
応式に用いることができる。かかる免疫グロブリンの例
はパットナム等によって配列決定されたヒト IgMである
〔Putnam et al., 1973, Science 132:287〕。
【００５６】本発明の一態様によれば、基質リンカーは
ヒドラジンまたはヒドラジド誘導体をリンカーの一端に
結合させることにより修飾される。リンカーの修飾をう
けない部位は化合物へ共有結合しても、しなくてもよ
い。例えば、エステルまたはアミド結合を介して化合物
へ結合された基質リンカーは、第４. ５節に記載した通
り（表２および３を参照のこと）、ペプチド鎖の反対側
のアミノ末端基にヒドラジド（例．フェニルヒドラジ
ン）を結合させることにより修飾される。この結果、次
の構造が得られる（注：＊印はアミドまたはエステル結
合を意味する）。
【００５７】
【化７】 上記構造式ではヒドラジンがパラ位にあるが、ヒドラジ
ン成分がオルトまたはメタ位にある化合物を用いること
もできる。その後、エステルまたはアミド結合を介して
化合物へ結合されたペプチドリンカーのヒドラジド誘導
体を、酸化免疫グロブリンつまり酸化炭水化物を含む免
疫グロブリンと反応させる。その結果ヒドラゾンが形成
され、補体による開裂をうけやすいリンカーグループを
介して免疫グロブリンの炭水化物側鎖と化合物とが共有
結合される。所望により、用いるリンカーは活性化補体
または血清プロテアーゼによる開裂に抵抗するものでも
よい（例．造影システムで用いるキレート剤またはキレ
ート剤誘導体を含むリンカー）。別の応用例では、リン
カーは血清プロテアーゼによる開裂をうけやすいように
デザインされる。本明細書に記載したリンカーとキャリ
ヤー抗体の共有結合は抗体分子の抗原結合部位も補体結
合も妨害しない。その結果得られた構造は以下の通りで
ある（注：＊印はアミドまたはエステル結合を意味す
る）。
【００５８】
【化８】 ここでは主として抗体の炭水化物成分との反応について
述べたが、かかる技術は他の種類の糖蛋白にも用いられ
る。
【００５９】４.6. 抗体結合体の他の用途 本発明の抗体結合体は、医学、産業用に種々の用途を有
しており、分離、アフィニティー精製、診断薬、治療
薬、免疫アッセイ、細胞選別、電気泳動分析、組織学、
細胞学等に用いられる。これらの用途はすべて、構造が
わずかに異なる化合物を特異的に識別できる抗体の能力
を利用している。本発明の新規な抗体結合体は、抗体と
抗原との相互作用が検出可能な信号または検出可能な信
号の変調手段を提供する免疫アッセイにも用いることが
できる。信号は化学的、電磁放射線、特に紫外線または
可視光線の吸収もしくは発光でもよく、熱的、容積測定
的、電気化学的であってもよい。信号の変調は、例えば
蛍光または化学ルミネッセンスの消光または変化の結果
であってもよく、この場合結合相手は蛍光または化学ル
ミネッセンス物質（または潜在的な蛍光または化学ルミ
ネッセンス物質）である。免疫アッセイでは、抗原は通
常何らかの方法でラベルまたはタグを付してあり、アッ
セイでは抗体に結合したラベルまたはタグを付した抗原
の量と結合していないラベルまたはタグを付した抗原の
量との差を識別する。ホモジーニアスアッセイでは、ラ
ベルまたタグの出す信号の変調の結果として、識別が行
われる。ヘテロジーニアスアッセイにおいては、識別は
結合抗原と非結合抗原の物理的な分離の結果である。
【００６０】５．実施例：シリーズＩ 以下の実施例において抗体分子を中間体可溶性リンカー
を介して対象の化合物へ特定的に結合する方法を示す。５.1. 抗体分子の炭水化物成分の酸化 本実施例で用いた抗体分子はモノクローナルIgM (No.17
1 と称する）であって、ヒツジ赤血球細胞の抗原決定基
に対して特異性を有する。モノクローナル抗体をつくる
には次の方法をとった。ルイスラットにヒツジ赤血球細
胞を１回注射して免疫を与え、３日後に免疫ラットの脾
臓細胞を取り出し、マックカーン等の方法によって骨髄
腫系 SP2/OAg14と融合させた（McKearn et al., 1979,
Immunol.Rev. 47:91-115)。ついで、クローン化細胞を
増殖させ、その結果得られたモノクローナル抗体をクリ
ンマン＆マックカーンの方法で精製した（Klinman & Mc
Kearn, 1981, J. Immunol. Meth. 42:1-9)。
【００６１】抗体の炭水化物成分の酸化は、上述のクー
パー等の方法の変法により、抗体とガラクトースオキシ
ダーゼとを反応させて行った（Cooper et al. 前掲）。
このため、No.171モノクローナル抗体3.８mgを0.135M N
aCl, 0.015M Tris-HCl (pH7.0), 0.5mM MgCl2 , 0.15mM
CaCl2から成るバッファー１mlへ添加した。続いて、ガ
ラクトースオキシダーゼ溶液〔ニュージャージー州フリ
ーホールドの Worthington Biochemical社製〕の0.1ml
アリコートを該バッファー１ml当り酵素52単位の濃度で
抗体溶液へ添加した。最後に、該バッファー 0.1mlに溶
解したカタラーゼ（Worthington Biochemical 社製）43
μg を反応混合物に添加した（酸化反応中に生成した過
酸化水素を分解するためにカタラーゼを添加した）。反
応混合物を室温で48時間インキュベートし、４℃で貯蔵
した。図４は未酸化(a)と酸化(b)抗体の励起スペクトル
を示す。
【００６２】５.2. 抗体分子への結合のためのトリペプ
チド−ＡＭＣの製造 本実施例のためには、合成蛍光原化合物を結合相手とし
て用いた。この合成化合物の特性は、蛍光原化合物の結
合状態と遊離状態が分光蛍光計により判別可能であると
いうことである。ここで用いた合成蛍光原化合物はニュ
ーヨーク州ロングアイランド、ガーデンシティパークの
Serva Fine Biochemicals 社製（カタログ♯51474)であ
る。本化合物はアミド結合を介して蛍光化合物７−アミ
ノ−４−メチルクマリン (ＡＭＣ）に結合したトリペプ
チド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ)から成る。グリシンの
アミノ基はカルボベンゾキシクロライド(Cbz) でブロッ
クされる。本化合物（ここではトリペプチド−ＡＭＣと
記す）の構造式を下に示す。
【００６３】
【化９】 遊離ＡＭＣの最大励起および発光（それぞれ345nm, 445
nm) はトリペプチドに結合したＡＭＣのそれとは違って
いる（それぞれ325nm, 395nm) 。これにより蛍光測定ア
ッセイを用いてＡＭＣ分子の結合型と遊離型とを区別す
ることができる。383nm と 455nmの励起および発光波長
はアッセイのための最適差異を得るために利用すること
ができる。これらの波長では、遊離ＡＭＣはその最大蛍
光の20％を保有するが、結合ＡＭＣの等モル量より 500
倍多い相対蛍光を有している〔Zimmerman, et al., 197
8, Proc. Natl. Acad, Sci., U.S.A. 75(2):750-753
〕。
【００６４】トリペプチド−ＡＭＣを第5.１節で製造し
た抗体の酸化炭水化物成分へ特異的に結合させるため、
ヒドラジン誘導体をトリペプチド−ＡＭＣ化合物の末端
グリシンヘ結合させた。ヒドラジン基の存在は、非常に
穏やかな条件下での抗体分子の酸化炭水化物成分の反応
性をもたらす一方で、抗原結合部位に影響を与えないと
ころから有利である。その結果、抗体分子の酸化炭水化
物側鎖のアルデヒド基がヒドラジン誘導体と反応してヒ
ドラゾンを形成する。ヒドラジン誘導体（例．４−フル
オロフェニルヒドラジン）を結合するには、トリペプチ
ド−ＡＭＣをまず Cbz基を取り去ってグリシンアミノ末
端基で脱ブロックした。これはトリペプチド−ＡＭＣを
トリフルオロ酢酸（ミズーリ州セントルイス、シグマ社
製）に溶解し、溶液内に HBrガス〔ニュージャージー州
イーストラザフォード、マチソン社（Matheson）製〕を
45分間通して行った。生成物Ｈ2Ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−ＮＨ−ＡＭＣは低温のジエチルエーテル〔ニュ
ージャージー州フィリップスバーグ、ベーカー・ケミカ
ル社（Baker Chemical Co.）製〕を添加して沈殿させ、
無水エタノール〔ペンシルバニア州リンフィールド、パ
ブリッカー・インダストリーズ社（Publicker Industri
es Co.）製〕に溶解した。無水エタノール中の４−フル
オロフェニルヒドラジン〔ウィスコンシン州ミルウォー
キー、アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical C
o.）製〕を等モル量攪拌しながら加えた。室温で２時間
遮光した状態でインキュベートした後、反応混合物を４
℃で遮光状態で貯蔵した。その結果得られた生成物（フ
ェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ）は以下の構
造式を有する。
【００６５】
【化１０】 本化合物は、紫外線で励起すると蛍光について（＋）で
あり、ヒドラジン基の存在についても（＋）であった。
トリペプチドに結合したヒドラジンは、ヒドラジンの比
色定量測定のため0.１％トリニトロベンゼンスルフォン
酸水溶液をスプレーして薄層クロマトグラフィー (ＴＬ
Ｃ）により検出した（ピンクがかった、またはオレンジ
がかった茶色がヒドラジンの存在を示す）。ＴＬＣの結
果は、トリペプチド−ＡＭＣの移動バンドにヒドラジン
基の存在を示した。
【００６６】図５に示したフェニヒドラジン−トリペプ
チド−ＡＭＣ化合物の吸収および発光スペクトルはトリ
ペプチド−ＡＭＣスペクトルとの類似性を示すが、トリ
ペプチド−ＡＭＣの共有結合修飾と一致した最大励起お
よび発光のシフトを示す。フェニルヒドラジン−トリペ
プチド−ＡＭＣ化合物の最大励起および発光は各々 345
nmと385nm である。生成物は冷却したジエチルエーテル
を用いて溶液から沈殿させ、洗浄して、ジメチルスルホ
キシド（ニージャージー州フィリップスバーグ、Baker
Chemical社製）に溶解した。
【００６７】５.3. フェニルヒドラジン−トリペプチド
−ＡＭＣと抗体分子の酸化炭水化物成分との共有結合 上記第5.１節に記載した酸化モノクローナル抗体調製物
を0.1Mアセテートバッファー（pH5.0)少量を添加してpH
5.１に調整した。抗体溶液へフェニルヒドラジン−トリ
ペプチド−ＡＭＣ（第5.２節で製造）を約10倍量加え
て、これを遮光状態で37℃で一晩インキュベートした
（約14時間）。その後、反応混合物をセファデックスG-
25カラム（ニュージャージー州ピスカタウェイ、Pharma
cia Fine Chemicals製）でクロマトグラフィーにかけ、
未反応のフェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣを
取り除いた。蛋白分画の分光蛍光測定分析によって、抗
体に共有結合したフェニルヒドラジン−トリペプチド−
ＡＭＣ( 抗体−フェニルヒドラジン−トリペプチド−Ａ
ＭＣまたは抗体結合体と以下称する）の存在を確認し
た。結合体の最大励起および発光は各々 325nmと 385nm
である（図６）。結合体の励起スペクトルにおいて285n
m で大きいピークが見られたが、これは 385nmでの残留
蛍光によるトリプトファン吸収によって説明ができ、ま
た抗体分子のアミノ酸トリプトファンからＡＭＣへの共
鳴エネルギー移動の結果かも知れない。
【００６８】６. 実施例：シリーズII 本シリーズの実施例の目的は、本発明による抗体結合体
の製造法はカルボジイミド反応が抗体の抗原結合特性に
影響を与えるようには抗原結合特性に悪影響を与えない
ことを示すことにある。このため、ホスホリルコリン基
に特異性を有するマウスのモノクローナル IgMの炭水化
物を酸化し、1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAを形成する
エチレンジアミン ジ−（Ｏ−ヒドロキシフェニル酢
酸)〔EDDHA〕の1,６−ジアミノヘキシル誘導体へ共有結
合させた。比較のために、1,６−ジアミノヘキシル-EDD
HAと未修飾 EDDHAとをカルボジイミド反応を利用して I
gMモノクローナル抗体の同一サンプルへ結合した。これ
らの条件下では、1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAがアス
パラギン酸とグルタミン酸残基に結合し、未修飾 EDDHA
がリジンに結合するだろう。これらのサンプルの結合特
性を天然抗体と比較して親和性と均質性を評価した。
【００６９】６.1. マウスモノクローナルIgMの酸化 リガンドのホスホリルコリンに対する特異性を有するマ
ウスモノクローナル IgM抗体を食塩加燐酸バッファー
（PBS, 0.01M燐酸, 0.15M 塩化ナトリウム）pH7.０中で
２mg／mlの濃度で酸化した。抗体含有溶液を氷水浴で冷
却し、メタ過ヨウ素酸ナトリウム56.8μg （1.42mg／ml
溶液を40μl ：最終過ヨウ素塩濃度＝0.26mM）を添加し
た。。この反応混合物を１時間インキュベートした後、
エチレングリコール２μl を加えた。これを更に30分間
インキュベートした。それからサンプルをＰＢＳで平衡
化したセファデックスG-25カラムを通し、蛋白分画をプ
ールした。
【００７０】６.2. リンカーとEDDHAの結合 EDDHA (1.5g, 4.2mmole)およびトリエチルアミン（1.2m
l, 8.4mmole)を水40mlと混合した。この不均質な溶液を
60℃に加熱し、0.５時間激しく攪拌した。溶液を真空乾
燥し、無水 N,N−ジメチルホルムアミド 400ml中に溶解
した。それから溶液を氷浴の中で冷却し、イソブチルク
ロロホルメート（0.56ml, 4.2mmole）を加えた。反応混
合物を冷却しながら0.５時間攪拌した。その結果生じた
トリエチルアミン塩酸塩析出物を濾過して取り除いた。
EDDHAの混合カルボキシ炭酸無水物を含む濾液は赤色を
していた。１−アミノ−６−トリフルオロアセトアミド
ヘキサン（0.8g, 4.１ミリモル）を上記 EDDHAのカルボ
キシ炭酸無水物に加えた。均質溶液を0.５時間４℃で攪
拌し、凍結乾燥して油状生成物を得た。油状物をアセト
ン／エーテル（４：１）混合物で洗って、黄色の粗生成
物を得た。固体の１−アミノ−６−トリフルオロアセト
アミドヘキシル-EDDHAを採取して、７％ K2CO3 で加水
分解し、pH４で HClで再析出させて、純粋な1,６−ジア
ミノヘキシル-EDDHA（1.4g）を得た。この化合物は、ニ
ンヒドリンテストでは陽性で、薄膜クロマトグラフィー
では１スポットのみを示す。等モル量のTbCl3 塩基性溶
液の存在下では 295nmでの励起は 545nmでの発光をもた
らしたが、これは EDDHAとテルビウムイオンとの特徴的
なエネルギー転移キレート複合体の形成による。
【００７１】６.3. IgM-リンカー-EDDHA結合体の製造 第6.１節の方法で酸化した抗体に第6.２節の方法で製造
した1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAを約 270倍過剰モル
加え、室温で１時間インキュベートした。これに引続い
て、固体のナトリウムシアノボロハイドライドを加えて
最終濃度を10mMとし、それから更に室温で４時間インキ
ュベートした。混合物を４℃でＰＢＳを何度か変えて透
析し、限外濾過して濃縮した。
【００７２】６.4. リンカー-EDDHAのIgMへのカルボジ
イミド結合 IgM抗体(1.9mg／ml)263μl に１−エチル−３−(3−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド10mg（10mg／ml
溶液の１ml、pH5.０) とＰＢＳ(pH5.0) を添加して2.５
mlとした。混合物を室温で２時間インキュベートした。
水2.５ml（pH5.５) 中に0.1M 1, ６−ジアミノヘキシル
-EDDHAを 275μl 加えて、溶液を室温で２時間インキュ
ベートした。ここへ１M エタノールアミン10μl を加え
て、室温で１時間インキュベートした。これをＰＢＳ
(pH7.０）で一晩透析した。
【００７３】６.5. EDDHAのIgMへのカルボジイミド結
合 IgM抗体(1.9mg／ml)263μl へ１−エチル−３−(3−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド10mg（10mg／ml
溶液を１ml、pH5.０) とＰＢＳ（pH5.０) を添加して2.
５mlとした。混合物を室温で２時間インキュベートし
た。これに 0.01MEDDHA (pH5.5)を2.75ml添加し、溶液
を室温で２時間インキュベートした。１Mエタノールア
ミン10μl を添加し、混合物を室温で１時間インキュベ
ートした。これをＰＢＳ（pH7.０) で一晩透析した。
【００７４】６.6. 抗体の炭水化物により媒介される結
合の効果 未修飾のマウスモノクローナル抗体と第6.３節, 第6.４
節, 第6.５節により製造した抗体結合体（全てホスホリ
ルコリン基に特異性を有する）の親和性をパーキン・エ
ルマー型 512ダブルビーム蛍光分光計（コネチカット州
ノーウォーク、Perkin-Elmer社製）を用いて蛍光消光に
より測定した。励起および発光波長は各々295nm と 345
nmであり、温度はラウダ（Lauda) K-2/R循環水浴（Brin
kmann Instruments 社製）で25℃とした。抗体濃度の計
算はε280 1%＝13.5を用いて行い、7.5×10-8から9.7×
10-8M であった。結合部位はすべて活性を有すると見な
した。サンプル量は3.０mlであった。リガンドであるＮ
−( 2,４−ジニトロフェニル）−ｐ−アミノフェニルホ
スホリルコリン(DPPC)の原液濃度は1.17×10-4M であっ
た。滴定は食塩加リン酸バッファー中 pH7.4で行った。
リガンドを攪拌しながら連続的に、モーター駆動シリン
ジを使って9.01μl ／分の速度で加え、蛍光度を2040デ
ュアルドライブフロッピーディスクと2023プリンターを
備えた CBM2001シリーズコンピューター（Commodore Bu
isiness Machines）にアナログ／デジタル変換用プレセ
ットＩ(Connecticut Microcomputers)をインターフェー
スしてモニターした。減衰およびサンプルの希釈を修正
するため、非特異的なヒトワルデンシュトレーム・マク
ログロブリンまたは抗ラクトースネズミハイブリドーマ
抗体〔Mandal and Karush, 1981, J. Jmmunol. 127:124
0 〕を滴定した。合計 180μl のリガンド溶液を滴定ご
とに添加した。結合パラメータの計算には、シップスの
分布関数〔Sips, 1948,J. Chem. Phys. 16：490〕を反
復して用い、抗体異性度指数 (heterogeneity index)が
１の0.002以内となるまで最大消光（maximum quench)
を変化させた。Qmax値の計算はかなり不確実であって、
多分10％以下ではないと思われるが、これはこの値を得
るために用いた反復法のためである。この不確実性は、
活性部位の実際の濃度と光学密度から計算した濃度との
間の違いが、抗体異性度指数１という規準を用いた場合
に、Qmaxの誘導値において補償される事実から生じる。
この補償は結合リガンドの濃度が抗体濃度とQmaxの値の
比に依存しているところから生じるものである。こうし
た依存という事実の故に、会合定数の得られた値の精度
は活性部位の濃度によって限定されない。
【００７５】図７に未修飾抗体とカルボジイミド結合体
と本発明の抗体結合体のデータを示すシップスグラフを
示す。結合測定は明らかに、未修飾抗体（・−・）と比
較した時の、本発明の炭水化物結合方法を介して修飾し
たサンプル（Δ−Δ）の特異性、親和性、均質性の保持
を示している。ホスホリルコリン誘導体の結合について
会合定数を測定したところ未修飾抗体は 8.1×105M-1で
あり、炭水化物結合抗体結合体は 1.1×106M-1であっ
た。これと対照的に、カルボジイミド反応による修飾を
うけた抗体調製物（□─□）は大幅に結合が減少してお
り、計算値である１−２×105 よりもずっと低い。シッ
プス解析における抗体異性度指数１の仮定は、サンプル
が均質（モノクローナル）である場合にのみデータ換算
に有効である。サンプルの実際の均質性（モノクローナ
ル性）についてのチェックは相関係数であるか、または
実験データがシップスプロットの計算線と一致する場合
に適合する。図７のグラフを見ると、未修飾抗体と炭水
化物結合抗体については良く一致しており、カルボジイ
ミド結合のものについてはあまり一致していないことが
わかる。これは多分カルボジイミド結合方法の選択性の
欠如のためであろう。リジン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸は抗原結合領域を含む抗体分子全ての部分に存在
する。その結果、抗体の少なくともいくつかは結合部位
でまたはその近くで修飾され、その結果抗原との相互作
用に影響を与える。しかしながら、炭水化物への結合部
位は特定的であり、結合部位から離れているので、これ
らの実験でみられる結合能力には変化が殆んどみられな
い。溶液中の共有修飾抗体について得られたものではあ
るが、本研究の結論は固定化抗体にも応用できると考え
られる（固定化抗体を使った同一実験は技術上の理由か
ら実施不能である）。通常用いられる結合化学（臭化シ
アン活性化ゲル、グルタルアルデヒドビーズ、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルゲル等）の不規則性で
は、本発明の部位特異的結合とくらべて結合能力の劣っ
たマトリックスを生成するはずである。
【００７６】７. 実施例：シリーズIII 本実施例シリーズの目的は、抗体がその炭水化物成分を
介して効率良く不溶性の担体に結合され、かつ結合抗体
が特異的抗原結合能を保有する証拠を提供することにあ
る。７.1. アミノヘキシル−セファロースへの抗体結合 第６.1項に記載の過ヨウ素酸塩を用いて IgMと IgG抗体
を酸化したが、但し反応を停止するためエチレングリコ
ールの代わりにセファロース CL-4B（ニュージャージー
州ニューマーケット、Pharmacia Fine Chemicals社製）
を用いた。セファロース CL-4Bを除去してのち、抗体を
アミノヘキシル−セファロースCL-4B (Pharmacia Fine
Chemicals 社製）へ添加し、温室で30分間攪拌した。ナ
トリウムシアノボロハイドライドを最終濃度５mMとなる
ように添加し、混合物を16時間攪拌した。その結果得た
抗体結合樹脂（Ab-CHO-SEPH)をＰＢＳでよく洗った。ア
ミノヘキシル−セファロースへ結合した抗体の量は 125
Ｉ-IgGと 125Ｉ-IgM抗体を用いて測定した。表４は抗体
の炭水化物成分を介した抗体の固定化が非常に高能率で
おこることを示す。
【００７７】
【表４】
【００７８】７.2. 分離 ２,4−ジニトロフェニル（DNP)ハプテン基に対するマウ
スのモノクローナル IgG抗体を酸化して第７.1項にその
概略を記した方法によりアミノヘキシル−セファロース
へ結合させた（Ab-CHO-SEPH)。抗体はクアトレカサス
（Cuatrecasas ）らの方法〔1968, Proc. Natl. Acad.
Sci., U.S.A. 61：636〕により臭化シアンで活性化した
セファロースへも結合させた。ＤＮＰ基と結合したリボ
ヌクレアーゼ（DNP-RNase)は2,４−ジニトロフルオロベ
ンゼン（ウィスコンシン州ミルウォーキー州のアルドリ
ッチケミカル社製）とリボヌクレアーゼ（ミズーリ州セ
ント・ルイスのシグマ社製）を等モル量ずつ、0.１M 炭
酸塩バッファーpH9.０中で、４時間室温で混合して製造
した。ＰＳＢに対して十分に透析した後、 DNP-RNaseを
測定し、その結果、リボヌクレアーゼ１モル当りＤＮＰ
基は平均0.８モルであることが明らかとなった。 DNP-R
Naseはクロラミン−Ｔ (Aldrich Chemical社製）を用い
て 125Ｉで標識をつけた。
【００７９】二つの固定化された抗ＤＮＰ抗体樹脂、 A
b-CHO-SEPHとAb-CNBr-SEPHについて、 125Ｉ-DNP-RNase
の結合能をテストした。３Ｍチオシアン酸ナトリウムが
どちらの抗体調製物からも結合 DNP-RNaseを放出できな
いという事実からも明らかなように、二つの抗体調製物
は DNP-RNaseに対して非常に高度の結合親和性を有して
いた。従って、抗原結合を可逆的にできるようこのシス
テムを改良するため、実験を４M 尿素の存在化で行なっ
た。表５のデータは、炭水化物結合により固定化された
抗体（Ab-CHO-SEPH)がリジン残基で固定化された同じ抗
体（Ab-CNBr-SEPH）よりも効率よく DNP-RNaseと結合す
ることを示している。
【００８０】
【表５】
【００８１】８．実施例：シリーズIV 以下の実施例は、アミドまたはエステル結合を介して対
象の化合物（化合物と称する）ヘ結合させたペプチドの
抗体分子への特異的結合の方法を示すものである。生成
した抗体結合体は溶血補体結合アッセイから明らかなよ
うに補体結合能を保有している。更に、補体系による酵
素開裂を介して抗原細胞表面で化合物が特異的に放出さ
れることが非溶血アッセイにより実証される。以下の実
施例では、化合物は蛍光原物質である。従って、蛍光化
合物の補体を媒体とする放出は、蛍光分子の結合した形
と遊離した形を区別することのできるアッセイによって
検出できる。第5.１節の材料と方法を用いてモノクロー
ナル抗体（No.171）の炭水化物成分を酸化した。ヒツジ
の赤血球細胞と血清補体の存在下では、これらのモノク
ローナル抗体（No. 171)は補体酵素カスケード反応を活
性化する（抗原−抗体結合の結果）。補体の結合はヒツ
ジ赤血球細胞の溶解を生じせしめ、その結果ヘモグロビ
ンが放出される。放出されたヘモグロビンは分光光度計
で検出でき、補体結合アッセイを可能とする。トリペプ
チド−ＡＭＣは第5.２節で記載したように製造した。蛍
光原化合物（ＡＭＣ）の特性により、その化合物の結合
した形と遊離した形が分光光度計で識別可能となる。こ
れにより抗体結合体の補体結合能を測定するための明確
なアッセイを提供する。更に重要なことは、その後の化
合物の補体媒介放出の定量手段を提供することである。
抗体の酸化炭水化物成分へのフェニルヒドラジン−トリ
ペプチド−ＡＭＣの特異的共有結合は第5.３節に記載の
方法により行った。
【００８２】８.1. 補体結合アッセイ 補体結合アッセイの二つのタイプ、溶血タイプと蛍光分
析タイプを利用した。これらのアッセイにより、抗体−
フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ結合体が補
体結合能を保持しているか否か、ＡＭＣが補体により開
裂されたか否かを判定する。８.1.1. ヒト補体の調製 ヒトの新鮮な全血10mlを17時間氷冷し、凝固させた。凝
固物は遠心分離により取り除き、その結果得られたヒト
の血清を0.５mlアリコートとして凍結させた。第８.1.2
節に記載した溶血アッセイにより、これらのサンプル中
のヒト補体は活性を有していることが明らかとなった。
【００８３】８.1.2. 補体結合のための溶血アッセイ 濃度が約２×108 細胞／mlであるヒツジ赤血球細胞懸濁
液（ウィスコンシン州マディソン、Gibco Diagnostics
製）の 200μl アリコートを第５.3節で製造した抗体結
合体混合物（タンパク質約２μg ）20μl と混合した。
攪拌しながら37℃で15分間インキュベーションを行なっ
て後、ヒトの血清補体（第８.1.1節で製造）100 μl を
混合物へ添加した。37℃で30分から１時間インキュベー
トした後、混合物を遠心分離にかけ、細胞をペレット状
にした。補体により媒介される細胞溶解の程度は、上澄
み液中へ放出されたヘモグロビンを分光光度計 (412nm)
で測定して調べた。本アッセイの結果により、完全な溶
血と抗体の細胞表面へのほぼ 100％の結合が明らかとな
った。例えば、ヒツジ赤血球細胞懸濁液 200μl を遠心
分離にかけて得たペレットに蒸留水を添加すると細胞は
完全に溶解し、ヘモグロビンを放出する。蒸留水で完全
に溶解したヒツジ赤血球細胞の上澄み液を 1：20で希釈
したものは、O.D.412 が 0.646であった。結合体と補体
を添加して溶解したヒツジ赤血球細胞の同じ希釈物のO.
D.412 は 0.672であった。すなわち、結合体は抗原結合
能と補体結合能を保持していた。
【００８４】８.1.3. ＡＭＣの補体媒介放出の非溶血ア
ッセイ 非溶血アッセイの条件は上記と同じであるが、通常のヒ
ツジ赤血球細胞の代わりにグルタルアルデヒドで固定し
たヒツジ赤血球細胞（ミズーリ州セントルイス、Sigma
社製）を用いた。グルタルアルデヒドで固定した細胞は
抗体と補体の存在下では溶解せず、したがって、ヘモグ
ロビンは放出されない。その代わりに蛍光分析アッセイ
を用いてＡＭＣの放出を検出する。蛍光分析アッセイで
は非溶血システムが必要であり、これはヘモグロビンの
存在が本システム中の蛍光測定を干渉するからである。
アッセイに用いる前に、これらの固定赤血球細胞は未修
飾抗体と、第５.3節で製造した抗体−フェニルヒドラジ
ン−トリペプチド−ＡＭＣの両方に結合することがわか
った。非溶血アッセイを用いて、抗体結合体からのＡＭ
Ｃの特異的補体媒介放出を明らかにした。溶血アッセイ
の場合と同じく、濃度が約２×108 細胞／mlのグルタル
アルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞 200μl を抗体
−フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ結合体と
共に37℃で15分間インキュベートした。
【００８５】遠心分離してバッファーに再懸濁した後、
ヒト補体調製物（第８.1.1節）を50μl 添加し、 460nm
での蛍光をモニターし、 380nmでの励起を時間の関数と
した〔Caporale et al., 1981, J. Immunol, 128. 1963
-65 〕。コントロールとして、結合体をヒツジ赤血球細
胞とのみ；ラット赤血球細胞とヒト補体の存在下で（用
いたモノクローナル抗体はラット赤血球細胞と結合しな
い）；およびヒツジ赤血球細胞と補体の両方の不在下で
（用いたモノクローナル抗体はラット赤血球細胞と結合
しない）各々インキュベートした。図８にこれらの実験
の結果を示す。グルタルアルデヒドで固定したヒツジ赤
血球細胞とヒト補体と共にインキュベートした結合体を
表わす曲線(a) をコントロールを表わす曲線(b),(c),
(d)と比較すると、特異的抗体標的とヒト補体を含むサ
ンプルにおける遊離ＡＭＣの放出が明瞭である。従っ
て、グルタルアルデヒドで固定したラット赤血球細胞と
ヒト補体とインキュベートした結合体を表わす曲線(b)
と、グルタルアルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞と
インキュベートした結合体を表わす曲線(c) と、結合体
のみを表わす曲線(d) はＡＭＣの放出がないことを示し
ている。本出願に記載し、クレームした本発明は、上記
に開示した特定の実施例によりその範囲を限定されるも
のではない。これらの実施例は本発明のいくつかの面を
例示するためのものであり、これらと均等の他の実施例
もすべて本発明の範囲内にあるものである。ここに示
し、説明したもの以外の本発明の様々な変更は、当該分
野の技術者にとって自明であろう。かかる変更は同時に
添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１(a), (b)は抗体分子、即ち IgGクラス(a)
と IgMクラス(b) の免疫グロブリンを示す概略図であ
る。
【図２】図２は古典的経路により活性化された補体カス
ケードの一部を表す。Ｃ１からＣ９は補体タンパク質を
示す。数字の上の横線は活性酵素を示す。Ｓ'は細胞膜
上の部位を示す。
【図３】図３は抗新生物剤アルケラン（Alkeran ；バロ
ーズ−ウェルカム社製）のペプチドＣＢｚ−ｇｌｙ−ｇ
ｌｙ−ａｒｇへの結合のための一般反応式を示す。
【図４】図４(a) は非酸化抗体の励起スペクトル図を示
し、図４(b) は第５.1節に従って酸化した抗体の励起ス
ペクトル図を示す。
【図５】図５は第５.2節により製造したフェニルヒドラ
ジン−トリペプチド−ＡＭＣ化合物の励起および発光ス
ペクトルを示す。
【図６】図６は第５.3節により製造した抗体−フェニル
ヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ（APTA）結合体の励
起および発光スペクトルを示す。
【図７】図７は、修飾を加えない抗体（・─・）、本発
明方法により修飾を加えた抗体（Δ−Δ）、アスパラギ
ン酸および／またはグルタミン酸への結合（カルボジイ
ミド）により修飾した抗体（□−□）を用いた蛍光消光
データのシップスプロット(Sips plot) を示す。
【図８】図８は、いくつかのコントロールと共にＡＭＣ
の特異的補体媒介放出を示す実験結果を表す。蛍光を 4
60nmでモニターし、 380nmで励起している。蛍光の増加
は、抗体−フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ
（APTA）結合体からのＡＭＣの放出を示す。(a) はグル
タルアルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞とヒト補体
と共にインキュベートしたAPTA結合体を示す。(b) はグ
ルタルアルデヒドで固定したラット赤血球細胞とヒト補
体と共にインキュベートしたAPTA結合体を示す。(c) は
グルタルアルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞と共に
インキュベートしたAPTA結合体を示し、(d) はAPTA結合
体のみを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ａ 33/543 ５２５ 33/543 ５２５Ｇ 33/569 33/569 Ｚ (72)発明者 ジョン，ウォルター，フランク，ゴアー ズ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08540， プリンストン，セイヤ ドラ イブ 38 (72)発明者 チャイー，リー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08820 イースト ウィンザー，アビン トン ドライブ， ツイン リバース アパート ビー−22（番地なし) (56)参考文献 米国特許4256833（ＵＳ，Ａ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の工程： (a) 細菌抗原、ウイルス抗原、腫瘍抗原、真菌抗原、寄
    生体抗原、マイコプラズマ抗原、分化抗原および組織適
    合性抗原より成る群から選ばれた抗原部位に対する抗体
    または抗体フラグメントを酸化剤にさらし、抗体または
    抗体フラグメントの炭水化物成分中にアルデヒド基を生
    成して、抗体または抗体フラグメントの抗原結合領域外
    に酸化炭水化物成分を有する抗体または抗体フラグメン
    トを形成すること；および (b) 抗体または抗体フラグメントの酸化炭水化物成分の
    アルデヒド基を、化合物のアミン基と、または化合物に
    共有結合もしくは非共有結合により結合したリンカーの
    アミン基と反応させて、抗体または抗体フラグメントと
    本質的に同じ免疫反応性および免疫特異性を有するin v
    ivo 使用に適した抗体結合体を形成すること；を含む抗
    体結合体の製造方法。
  2. 【請求項２】 アルデヒド基を化合物のアミン基と反応
    させ、その際の該アミン基が二級アミン、ヒドラジン、
    ヒドラジド、フェニルヒドラジン、ヒドロキシルアミン
    またはセミカルバジドであることを特徴とする、請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】 アルデヒド基を化合物に結合したリンカ
    ーのアミン基と反応させ、その際の該アミン基が一級ア
    ミン、二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニル
    ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはセミカルバジド
    であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 酸化剤がガラクトースオキシダーゼまた
    は酸素酸もしくはその塩であることを特徴とする、請求
    項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 酸化剤が過ヨウ素酸塩であることを特徴
    とする、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 抗体フラグメントがＩｇＭ抗体のＦａｂ
    フラグメントまたは半抗体分子であることを特徴とす
    る、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 抗体がモノクローナル抗体であることを
    特徴とする、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 リンカーがペプチドリンカーの、アミノ
    酸リンカーの、または一般式： 【化１】 を有するリンカーのアミン基含有誘導体であり、該リン
    カーが治療用または診断用化合物に結合されていること
    を特徴とする、請求項１に記載の方法。
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