JP2024522194A - ダウン症候群に伴う加速された老化の治療 - Google Patents

Abstract

Ｈ2Ｓの過剰生成による老化加速に伴う臓器系の機能低下を有する、又はその危険性のあるダウン症候群（ＤＳ）対象の治療方法を開示する。方法は、Ｈ2Ｓ還元有効量の親水性ポリマー置換酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）と、生理学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散した任意の増強量のリポ酸又はジヒドロリポ酸とを含有する医薬組成物を対象に投与することを企図する。医薬組成物は、液体として非経口で、又は固体若しくは液体として経口で投与できる。【選択図】なし

Description

政府のライセンス権に関する記述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所から授与された助成金番号Ｒ０１ＮＳ０９４５３５及びアメリカ国立科学財団から授与された助成金番号ＩＯＳ２０１２１０６による政府支援を受けて行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。本発明は助成金番号ＢＥ－００４８のウェルチ財団の支援も受けて行われた。
本発明は、カーボンナノ材料の分野、及びダウン症候群に伴う老化加速の治療におけるこれらの治療用途に関する。

ダウン症候群（ＤＳ）は生涯にわたる慢性疾患で、発生率が増加し、寿命が延長しているが、ＤＳで早期に生じる多臓器系の機能低下に対する治療法はない。ＤＳは、活発に転写される２１番染色体の３コピー（トリソミー）に起因する遺伝病である。この染色体上には、中でも、シスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、及びＡＤに関連するタンパク質が存在する（１）。ＤＳ患者には、精神的機能障害、先天性心疾患、頭蓋顔面奇形、筋緊張低下、及び骨折リスクの上昇につながる低骨量など、多くの共通した異常がみられる（２、３）。ＤＳは米国で最も多い遺伝性疾患であり、平均余命が徐々に延びているため、この疾患を有する患者の生活の質を向上させる新薬の開発が不可欠である。
米国における２００８年時点のＤＳの推定発生率は、生児出生７００件に１件、年間約６，０００人である（４）。新たなＤＳ症例の発生率は１９７９年から２００３年の間に３０％増加しており、米国で年々高齢化している母親の平均出産年齢と正の相関がある（５）。更に、ＤＳの有病率は人種間で均等分布しておらず、黒人とヒスパニック系の乳児でＤＳが発生する可能性が最も高い（４）。
ＤＳ患者の平均余命はますます延長すると予想される。１９６０年にはダウン症児の平均死亡年齢は約１０歳だったが、２０１０年時点で約５０歳である。寿命の延長に伴って、ＤＳに伴う老化加速の影響が現れ（６、７）、免疫系の低下、骨粗しょう症や骨折の増加、筋量低下、及びアルツハイマー病（ＤＳ－ＡＤ）などの認知低下など多くの臓器系に影響が及ぶ。

２１番染色体上にあるアミロイド前駆体タンパク質の３本目の転写コピーがＡＤの一因とみられている（８）。４０歳超のほぼ全てのＤＳ患者で、ＡＤと診断するのに十分なアミロイド斑と神経原線維変化が認められる（９）。ＣＢＳが脳内で過剰発現しており（１０）、またＤＳにおけるミトコンドリア機能障害が、ＡＤで見られる病態の１つであるアミロイド斑を徐々に蓄積させている（１１）という証拠があることから、過剰なＨ₂ＳがＤＳの疾患過程に関与し、また潜在的にＡＤにも関与しているという仮説が立てられている。
ダウン症は、酸化ストレスの一因となる硫化水素の調節異常を伴う代謝障害という特徴を持つ。ＤＳにおけるＣＢＳの過剰発現は広く報告されており（１２、１３）、Ｉｃｈｉｎｏｈｅらは３倍の過剰発現を報告している（２）。ＣＢＳは、葉酸とメチオニンのサイクルから直接派生したトランススルフレーション経路に属し、特にホモシステインからシステインの生成を開始する役割を持つ（図１）。Ｈ₂Ｓの調節異常は、機能低下、ゲノム不安定性など老化に伴う特徴の多くと関連している。
ＤＳにおけるＣＢＳの過剰発現により、Ｈ₂Ｓの体内生成が増加する（１４）。更に、ＣＢＳはそれ自体の生成物であるＨ₂Ｓによって活性化され、Ｈ₂Ｓ生成の悪循環（１５）を引き起こすことが示されている。従って、Ｈ₂Ｓをポリスルフィド及びチオ硫酸に変換することで、ＣＢＳの過剰活性を抑制し、有益なポリスルフィド生成物をもたらすことができる。Ｈ₂Ｓはミトコンドリア複合体ＩＶ（フェロシトクロムＣ：二酸素オキシドレダクターゼ）の酸素還元銅錯体と強固に結合し、二酸素の水への還元とＡＴＰの生成を妨げる（１６）。複合体ＩＶの阻害により電子伝達系（ＥＴＣ）がブロックされ、複合体ＩとＩＩＩの電子が二酸素（Ｏ₂）に捕獲され、ＲＯＳ及び有害な過酸化脂質（ＬＯＯＨ）を形成する（１７）（図１）。
硫化水素（Ｈ₂Ｓ）は、いくつかの重要な生物学的機能を果たすガス状伝達物質であるが、過剰になると毒性を示す。高レベルのＨ₂Ｓはダウン症候群（ＤＳ；トリソミー２１）を含む多くの疾患過程と関連している（１６）。Ｈ₂Ｓを主に生成するシスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）の遺伝子は２１番染色体上に存在し、重複２１番染色体からも転写される（１０）。ＤＳは有効な、即ち承認された治療法がない疾患である（１８）。

特徴的な顔貌と認知機能の変化はよく知られているが、多くのＤＳ患者で多くの臓器系に機能低下が見られることはあまり知られていない。つまり、老化の特徴の多くが、しかも早期に現れ、「鈍化」といわれるように機能全般に影響が及び、免疫系、筋骨格系、消化器系の機能、心機能、更に神経機能も徐々に低下し、多くの患者がアルツハイマー病（ＡＤ）に特徴的な変化を含む早期老化の特徴を示すようになる（９、１７、１９）。こうした機能低下の原因の１つと考えられるのが、過剰なＨ₂Ｓが酸化的リン酸化や脳を含むシグナル伝達経路を妨げることであり（１６）、筋肉、骨、及びその他の臓器系における代謝異常が、この老化加速現象の影響を受ける。
本発明は、スーパーオキシドを触媒的に不均化し（dismutate)、ミトコンドリア成分間で電子をシャトルする、医薬品グレードの活性炭である、ポリ（エチレングリコール）官能化酸化(oxidized)活性炭（ＰＥＧ－ＯＡＣ）から誘導される酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）を使用することにより、この機能低下を治療する新たな手法を企図する（２０、国際公開第２０２１／２５２３８２号）。

我々は最近、ＰＥＧ－ＯＡＣもＨ₂Ｓを触媒的に酸化して有益なポリスルフィドにすることを発見した。ポリスルフィドは活性酸素種（ＲＯＳ）をクエンチし（２３）、重要な過硫酸化反応を促進して（１９）、ジスルフィドをチオールに還元する（２４）ため、Ｈ₂Ｓをポリスルフィドに変換することには有益な効果がある。ＲＯＳをクエンチした後、ポリスルフィドは無害のチオ硫酸（Ｓ₂Ｏ₃ ^2-）に変換されて排出される（２５）。
過剰なＨ₂Ｓをポリスルフィドとチオ硫酸に変えることは、過剰なＨ₂Ｓが関与するＤＳなどの病態において、ミトコンドリアを保護し機能を維持する魅力的な治療法である。提案されている手法は殆どがＨ₂Ｓ生成を排除又は阻害するものだが、これには困難を伴う。Ｈ₂Ｓ自体は殆ど作用を持たないものの、これらの活性代謝物の生成にはある程度のレベルが必要であり、Ｈ₂Ｓの場合、これらの酵素は主要な内因性抗酸化物質であるグルタチオンの生成と関連しているからである。ＯＣＮＰはＲＯＳの負荷を軽減し、過剰なＣＢＳとＨ₂Ｓによって引き起こされる代謝の不均衡を回復させることができる。
重要なこととして、ＤＳには非常に多様な表現型があり、この多様性の生化学的基盤は完全には解明されていない。ＤＳ患者は、出生時だけでなく臨床状態の悪化においても多様である。この悪化には、筋緊張低下、早期骨粗しょう症、骨折などの筋骨格系の事象、認知機能やその他の特徴があり、これらは「老化加速」に区分される（２６）。

脂質過酸化はもう１つの重要な評価項目であり、酸化ストレスによるフリーラジカル形成の結果である。脂質過酸化は、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）又はチオバルビツール酸反応性誘導体（ＴＢＡＲＳ）アッセイ、質量分析、Ｃ１１－ＢＯＤＩＰＹなどの標識を用いた蛍光顕微鏡イメージングを用いて測定できる。尿中チオ硫酸レベルは、銀－タンニン酸ナノ粒子コンジュゲートを用いて測定できる（３０）。システイン、シスチン、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、メチル葉酸、及びホモシステインも、トランススルフレーションに出入りしているため、これらのレベルは追加的な評価項目となる。好ましい定量方法は、高速液体クロマトグラフィーとエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）の組み合わせである。
内因性Ｈ₂Ｓは、主にシスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）とシスタチオニンγリアーゼ（ＣＳＥ）によるトランススルフレーション経路を通じて生成される（１３）。体内におけるＨ₂Ｓの役割は様々だが、調節不全による過剰は例外なく有害である（１４）。ミトコンドリアでは、過剰なＨ₂Ｓが複合体ＩＶを阻害することにより酸素が上流の複合体から電子を捕獲できなくなり、電子漏れが生じる（１５）。電子伝達系（ＥＴＣ）の阻害により解糖系への依存が高まり（１）、ＡＴＰ産生が減少する。

２１番染色体の三倍体化も、抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）依存性酵素（３４）、ＮＡＤＰＨ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ１）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）、グルタミン酸－システインリガーゼ調節及び触媒サブユニット（ＧＣＬＣ，ＧＣＬＭ）（３４）、スルフィレドキシン１（ＳＲＸＮ１）、チオレドキシン還元酵素（ＴＸＮＲＤ１）（３４）、グルタチオンＳ－転移酵素（ＧＳＴ）、ＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）（３５）、及び潜在的な多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）（３６）の転写をダウンレギュレートする。これらの酵素群は、主に求電子剤の第ＩＩ相代謝に関与している（３７）。
ＨＯ－１は、活性酸素種を生成し得る反応性ヘム分子を分解する過程を開始する。グルタチオン及びＵＧＴによるグルクロン酸抱合は、水溶性生成物を生成することで循環時間を短縮し、この生成物は、クエンチされたこれらの新たな生成物の排出を促進するＭＲＰによって細胞から除去される（３６）。ＮＱＯ１は求電子剤を還元して、分子上の求電子性部位を除去する。最後のグループであるＳＲＸＮ１とＴＸＮＲＤ１は、Ｈ₂Ｏ₂及びペルオキシナイトライトを除去する非常に強力な触媒である（３８、３９）。これらの酵素が失われると、細胞の抗酸化能が低下し、細胞が生体異物や過酸化物による毒性損傷を受けやすくなる。
ＡＲＥ依存性酵素は、核ＤＮＡのＡＲＥ配列に核因子赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）が結合することで発現する。細胞はＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質（Ｋｅａｐ１）を通じてＮｒｆ２の活性を制御している。Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１は複合体を形成し、Ｎｒｆ２のプロテオソーム分解を促進することでＮｒｆ２の活性を負に調節する。
Ｋｅａｐ１は、複数のシステイン残基の酸化状態によって構造的に制御される酸化還元感受性タンパク質である。Ｃｙｓ２２６、６１３、６２２、及び６２４はＨ₂Ｏ₂に対して感受性があり、酸化されると、これらのシステイン基はジスルフィド結合を形成し（図２）、これによりＮｒｆ２が核内に放出され、ＡＲＥ依存性転写が活性化する（４０、４１）。
前述したＣｙｓ残基は、酸化機構によってジスルフィド結合を形成する。しかし、それ以外の経路も可能であり得る。

チオールがポリスルフィド（ＨＳ_xＨ）と共に存在する場合、通常、長さが２～３、ただし８原子未満の短い硫黄鎖からなるアニオン性化合物である。チオレートは求核性であるため、鎖中で最も求電子性の高い硫黄を攻撃する可能性がある（４２）。この反応によりポリスルフィドとのコンジュゲート種が生成され、ＨＳ－が置換され、過硫化物（Ｒ－ＳＳＨ）が形成される。この過硫化物は、隣接するシステイン残基による求核攻撃を受けやすく、それによりジスルフィド結合を形成し、第２のＨＳ－を置換する（４２）（図２）。
今回我々は、ＯＣＮＰがＨ₂Ｓを酸化してポリスルフィドにすること、及びＯＣＮＰには培養ｂＥｎｄ．３細胞において遊離Ｎｒｆ２を単独で増加させる能力があり、細胞媒介性Ｈ₂Ｓドナーであるリポ酸と共処理することでこれが増強されることを実証する（４３）。ｂＥｎｄ．３細胞をＯＣＮＰと共処理すると、１．５～３時間の培養後、遊離Ｎｒｆ２が明らかに増加する。この作用は、ＯＣＮＰの触媒によるポリスルフィド（ＨＳ_xＨ）の形成がリポ酸の存在下で増強され、これによりＮｒｆ２の安定化が促進されることで、Ｎｒｆ２レベルが上昇するという我々が提唱する作用機序と一致している。

ＤＳにおいて更に考えられる機序は、２１番染色体の３本目のコピーが転写制御因子ＢＴＢ Ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ＣＮＣ Ｈｏｍｏｌｏｇ１（ＢＡＣＨ１）の３つめのコピーを導入し、ＡＲＥ結合ドメインを巡ってＮｒｆ２と競合するというものである（図２）（４４）。ＢＡＣＨ１はＡＲＥ依存性酵素の発現を促進しないため、酸化ストレス事象に対する抗酸化剤応答がダウンレギュレートされる（図２）。通常、ＢＡＣＨ１はＡＲＥの負の制御因子として働き、核内でヘムがＢＡＣＨ１に結合すると、ＢＡＣＨ１はＡＲＥから解離し、代わりにＮｒｆ２が結合できるようになる（４４）。しかし、ＢＡＣＨ１の濃度が高くなると、この作用は顕著でなくなり、ＢＡＣＨ１－ＡＲＥ結合事象に対してＮｒｆ２－ＡＲＥ結合事象が少なくなる（図３）。
ＢＡＣＨ１－Ｎｒｆ２軸の調節異常は、ＤＳ患者におけるアルツハイマー病発症への関与が示唆されている（４５）。遊離Ｎｒｆ２の細胞質レベルの増加は、過剰なＢＡＣＨ１とより効果的に競合し、経路の機能障害をある程度防ぐというのが我々の見解である。従って、ＯＣＮＰには、リポ酸によって増強された場合など、ＤＳにおけるこれらの障害を治療するＮｒｆ２機序において複数の有益な効果がある可能性がある。

本発明者らは、様々な炭素源から生物学的に強力な酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）を製造する合成法を開発した（米国特許第９，５７２，８３４号明細書）（２０、４６～４８）。当初、これらのナノ粒子はスーパーオキシドジスムターゼの模倣物にすぎないと考えられていたが、現在では、粒子の安定した電子ラジカルと構造が、ミトコンドリア成分間の電子の移動を含む他の反応を（４８）、またごく最近では、ポリスルフィドの生成を触媒することも発見された（図４Ａ～４Ｅ）。
従って、ＯＣＮＰは、生物反応において酸化還元メディエーターとして機能する、新たに概念化された「ナノザイム」又はナノ粒子とみなされた（４８）。ごく最近では、医薬品グレードの活性炭に由来するこれらの粒子（７）は直径が３～８ｎｍで、ｉｎ ｖｉｖｏ分布、培養細胞による取り込み、及びミトコンドリア局在を高めるためにＰＥＧ（化）されている。
本発明者らは最近、ＯＣＮＰが、溶液中（図４Ａ）及び内在的にＨＥＫ２９３細胞内（図４Ｂ）において、Ｈ₂Ｓ（Ｎａ₂Ｓの形態）由来のポリスルフィドの形成も促進することを見出した。
蛍光顕微鏡では、ＯＣＮＰで処理しＳＳＰ４で標識したｂＥｎｄ．３細胞は、未処理又はＡＰ３９で処理した細胞よりも平均積分蛍光（細胞内の全ての蛍光の合計）が高いことが示された（図４Ｃ）。予備データでも、ＯＣＮＰが１０～１０００ｎＭの範囲にわたってＡＰ３９の増殖作用と毒性作用の両方を減少させたことから、この作用が機能的結果を有することが示されている（図４Ｄ）。
ＯＣＮＰはチオ硫酸の生成速度も増加させ、結果として生じる酸化生成物が腎臓から***されやすくなるであろうことを示している（図４Ｅ）。Ｈ₂Ｓ自体は殆ど生物学的作用を持たないが、そのポリスルフィド生成物は優れた抗酸化剤であり、過硫化反応において重要な生物学的役割を担っている（２３）ことから、この新たな作用は非常に重要である。これらの結果は、ＯＣＮＰが、ポリスルフィドとチオ硫酸を生成物とするＣＢＳの内因性過剰発現からＤＳドナー細胞を保護できることを示唆している。

ＯＣＮＰの組成は、ＯＣＮＰ上のカルボン酸官能基と共役分子種上のアミン官能基との間でのアミド結合を容易にするものである。我々は以前（５０、５１、米国特許出願公開第２０２０／０２２２４５３号明細書）、デフェロキサミンを親水性炭素クラスター（ＨＣＣ）にコンジュゲートし、ＨＣＣに鉄（ＩＩＩ）をキレートする能力を付与することで、この手法の実現可能性を実証した。アミン末端分子をＯＣＮＰにコンジュゲートすることが可能であると示されたことから、他の分子も直接又はリンカー分子を介して同じように本質的にコンジュゲートさせることができる。更に、カルボン酸官能基とアルコールとの、又は共役分子上の塩化アシルと粒子のヒドロキシルとの、直接若しくはリンカーを介したエステル化も考えられる。この側面についても以下で更に論じる。
リポ酸をＯＣＮＰに結合することで、粒子近傍で硫化水素を発生させる能力が粒子に付与され、その結果、より効率的にポリスルフィドが生成される可能性がある。次いで、これらの反応性硫黄種生成物を使用して、制御タンパク質Ｋｅａｐ１上のジスルフィドなど他のジスルフィドを過硫化することができる。
遊離Ｎｒｆ２の細胞質レベルの増加は、過剰なＢＡＣＨ１とより効果的に競合し、経路機能障害をある程度防ぐというのが我々の見解である。従って、ＯＣＮＰは、特にリポ酸によって増強された場合、ＤＳにおけるこれらの障害を治療するＮｒｆ２機序に対して複数の有益な効果がある可能性がある。

本発明は、Ｈ₂Ｓの過剰生成による老化加速に伴う臓器系の機能低下を呈する、又はその危険性のあるダウン症対象を治療する新たな手法を企図する。この治療法は、ポリ（エチレングリコール）官能化酸化活性炭（ＰＥＧ－ＯＡＣ）などの親水性ポリマー置換酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）と、任意の増強量のリポ酸又はジヒドロリポ酸とを含有する医薬組成物をダウン症対象に投与することを企図している。粒子はスーパーオキシドを触媒的に不均化し、Ｈ₂Ｓを酸化してポリスルフィドを形成し、ミトコンドリア成分間で電子をシャトルする（２０）。特別に合成したこれらの親水性ポリマー置換ＯＣＮＰは、様々な急性脳損傷動物モデルにおいて、顕著な毒性を示すことなく保護作用を示す（２１、２２）。
生理学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散させたポリ（エチレングリコール）官能化酸化活性炭（ＰＥＧ－ＯＣＮＰ又はＰＥＧ－ＯＡＣ）などの親水性ポリマー置換酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）のＨ₂Ｓ還元有効量を含有する医薬組成物が企図されている。
治療は、リポ酸又はその誘導体など、ＯＣＮＰの有益な効果を増強する分子を含む任意の量の分子を同時投与することを含んでよい。これらの同時投与分子は、別々に投与しても、化学的手段によってＯＣＮＰに直接結合させてもよい。
治療法は通常、反復される。

本発明は更に、血中及び／又は尿中のＨ₂Ｓ及び／又はその代謝物のレベル、脂質過酸化、ＤＮＡ酸化損傷を含む確立されたマーカーの測定による酸化傷害の証拠、及びその他の方法の１つ以上によるＤＳ患者の層別化を含む。ＤＳにおける機能低下は複数の臓器系に及ぶため、治療効果は、臨床評価項目、並びに細胞呼吸、ホモシステイン、システイン、メチルテトラヒドロ葉酸、アミロイド前駆体タンパク質、脂質過酸化、並びにグルタチオンの組織及び循環濃度を含む臨床検査及び生化学的評価項目によって監視する。
臨床評価項目には、確立された試験手順による筋力、心機能、認知機能などがあるがこれらに限定されない。臨床検査項目には、骨密度、脳画像診断などがあるがこれらに限定されない。生化学的検査には、血液中及び／又は尿中のＨ₂Ｓ及びその代謝物のレベル、ｅｘ ｖｉｖｏで試験した個々の細胞の増殖、ミトコンドリアエネルギー、過酸化水素などの外因性毒素に対するｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の抵抗性、ＡＰ３９などの高濃度のＨ₂Ｓドナーなどによる過剰なＨ₂Ｓなどがある。長期的な臨床マーカーには、骨折歴、投与試験による認知機能の変化、脳萎縮又はアルツハイマー病の徴候、試験手順による全体的な機能レベルや健康状態などがあるがこれらに限定されない。
本開示の一部を形成する図面を以下に説明する。

シスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）の過剰発現がミトコンドリアに及ぼす影響の模式図である。ＣＢＳの過剰発現によりＨ₂Ｓが過剰となり、その結果、複合体ＩＶ阻害によるミトコンドリアの機能障害も一部介在して、毒性作用のカスケードが引き起こされる。これによりＡＴＰ産生が減少し、活性酸素種（ＲＯＳ）と過酸化脂質（ＬＯＯＨ）が増加し、トリカルボン酸サイクル（ＴＣＡ）が阻害される。 トリソミー２１（ダウン症候群；ＤＳ）に見られるＢＡＣＨ１の過剰発現によるＮｒｆ２活性の減少を、染色体数が正常な細胞（正倍数体）における同様の活性と比較した模式図である。Ｎｒｆ２とＢＡＣＨ１は、複数の抗酸化酵素の転写を促進する抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）に対して平衡状態にある。ＤＳでは、過剰なＢＡＣＨ１（太い矢印）がＮｒｆ２に置き換わり、ＡＲＥ関連酵素の転写を妨げている。 過酸化水素に反応するＫｅａｐ１のシステインアミノ酸が、どのようにポリスルフィドとも反応できるかを示した反応模式図である。機序は類似しているが、硫黄による経路が介在している。 図４Ａから図４Ｆは、Ｎａ₂Ｓ及びＡＰ３９からのポリスルフィド形成に対するＯＣＮＰの効果を示す。図４Ａは、親水性ポリマー置換酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）が、溶液中のＮａ₂Ｓからのポリスルフィド形成速度（ｙ軸）を、基礎速度と比べて３０倍増加させることを示している（国際公開第２０２１／２５２，３８２号、図１０Ａ）。 図４Ａから図４Ｆは、Ｎａ₂Ｓ及びＡＰ３９からのポリスルフィド形成に対するＯＣＮＰの効果を示す。図４Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞におけるポリスルフィド生成（ｙ軸）が、用量依存的にＯＣＮＰによって触媒されることを示している。 図４Ａから図４Ｆは、Ｎａ₂Ｓ及びＡＰ３９からのポリスルフィド形成に対するＯＣＮＰの効果を示す。図４Ｃは、８μｇ／ｍＬのＯＣＮＰ又は５μＭのＡＰ３９で処理したｂＥｎｄ．３細胞の平均積分蛍光を示す棒グラフであり、粒子単独でポリスルフィド生成を増強することを示している。 図４Ａから図４Ｆは、Ｎａ₂Ｓ及びＡＰ３９からのポリスルフィド形成に対するＯＣＮＰの効果を示す。図４Ｄは、ミトコンドリアを標的とするＨ₂ＳドナーであるＡＰ３９の１０ｎＭと１０００ｎＭの正反対の影響から、ＯＣＮＰがｂＥｎｄ．３細胞の増殖を正常化することを示している。 図４Ａから図４Ｆは、Ｎａ₂Ｓ及びＡＰ３９からのポリスルフィド形成に対するＯＣＮＰの効果を示す。図４Ｅは、チオ硫酸（Ｓ₂Ｏ₃ ^2-）生成（ｙ軸）の増加が、ＰＥＧ－ＯＡＣ濃度（ｘ軸）に対して用量依存的であることを示している（国際公開第２０２１／２５２，３８２号、図１４）。 ＣＢＳ調節におけるＯＣＮＰによる作用機序を示す模式図である。ＯＣＮＰはＨ₂Ｓをポリスルフィド（ＨＳＳＨ）に変換し、ＣＢＳの活性化を抑制する可能性がある。ＨＳＳＨはＲＯＳを還元し、チオ硫酸生成物は腎臓から除去される。つまり、Ｈ₂Ｓの過剰生成による影響は、その酸化速度を上げることで緩和される。 ＰＥＧ－ＯＡＣの合成を示す模式図である。ここでは、米国食品医薬品局の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）のＡＣを、発煙硝酸を用いて１００℃の温度で６時間（ｈ）、又は最初の酸化の前に粒子をふるいにかけた場合には４時間酸化し、続いてＰＥＧ化している。この時、「ＤＩＣ」はＮ，Ｎ′－ジイソプロピルカルボジイミドであり、「ｎ」は、平均値が約６０～約２５０の数である。 ｂＥｎｄ．３細胞における過酸化水素に対するＰＥＧ－ＯＡＣの防御能を示す棒グラフである。Ｙ軸：対照の正規化細胞数（１００％）。ＰＥＧ－ＯＡＣ（８ｍｇ／Ｌ）は、１００μＭのＨ₂Ｏ₂による２４時間後の死からｂＥｎｄ．３細胞を保護した（Ｐ＜．００１）。 ４ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣで処理した又は処理していない、ダウン症候群（ＤＳ）及び外見上健常な個人ドナー（ＡＨＩ）のリンパ球の細胞増殖プロットである。このプロットは、ＡＨＩドナー細胞では増殖の差が＋９％であるのに対し、ＤＳリンパ球では＋２８％速く増殖したことを示している。 図９Ａ及び図９Ｂの２つの図面において、リポ酸とＰＥＧ－ＯＡＣの相乗効果を示している。図９Ａは、ＰＥＧ－ＯＡＣ（ＥＭＥ２８）４μｇ／ｍＬ及び／又はリポ酸１ｍＭを投与したｂＥｎｄ．３細胞におけるＮｒｆ２の発現を示す抗Ｎｒｆ２標識ウェスタンブロットの画像である。３時間後ではＰＥＧ－ＯＡＣとリポ酸の組み合わせでＮｒｆ２レベルの強い増強が見られ（矢印）、１．５時間後ではリポ酸単独及び組み合わせによるシグナルがわずかに増加していた。 図９Ａ及び図９Ｂの２つの図面において、リポ酸とＰＥＧ－ＯＡＣの相乗効果を示している。図１０Ｂは、β－アクチン対照に対するバンド強度の定量を示しており、併用療法による強いシグナルを示している。この相乗効果は、より早い時点又は類似の時点ではあるが、３／３の実験で見られた。 ミトコンドリアを標的とするＨ₂ＳドナーであるＡＰ３９で処理した場合のＡＨＩ及びＤＳリンパ球に対するＰＥＧ－ＯＡＣの効果を示すグラフである。ＡＨＩ及びＤＳの細胞増殖は５μＭのＡＰ３９で減少した（ｐ＜０．０５）。ＡＨＩ細胞［ＧＭ０１９５４（Ｆ、４４）；ＧＭ１４５９２（Ｍ、４１）；及びＧＭ２５５２２（Ｆ、３７）］では、ＰＥＧ－ＯＡＣによって増殖が部分的に回復した。ＤＳ細胞［ＡＧ１０３１７（Ｆ、３７）；ＡＧ０９８０２（Ｍ、４１）；ＡＧ０９３９４（Ｍ、２）；及びＧＭ０１９２１（Ｍ、２３）］では、未処理の対照とＡＰ３９で処理した細胞との間で生存率の有意な低下が認められ（ｐ＜０．０５）、これはＰＥＧ－ＯＡＣの存在下で有意に改善した（ｐ＜０．０５）。 図１１Ａ～１１Ｅの５つの図面で、ＰＢＳ又は４ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣで処理した特定のＤＳ細胞株の４つのプロットを示す。４つ全てが、ＰＥＧ－ＯＡＣで処理した場合の増殖率増加を示しているが、４つとも異なる増殖動態を示し、個々の細胞株又は層別化を比較する必要性を例証している。いずれにしても、図１１Ｅに示されるように、ＰＥＧ－ＯＡＣでは平均して細胞増殖率が増加している。 図１１Ａ～１１Ｅの５つの図面で、ＰＢＳ又は４ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣで処理した特定のＤＳ細胞株の４つのプロットを示す。４つ全てが、ＰＥＧ－ＯＡＣで処理した場合の増殖率増加を示しているが、４つとも異なる増殖動態を示し、個々の細胞株又は層別化を比較する必要性を例証している。いずれにしても、図１１Ｅに示されるように、ＰＥＧ－ＯＡＣでは平均して細胞増殖率が増加している。 図１１Ａ～１１Ｅの５つの図面で、ＰＢＳ又は４ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣで処理した特定のＤＳ細胞株の４つのプロットを示す。４つ全てが、ＰＥＧ－ＯＡＣで処理した場合の増殖率増加を示しているが、４つとも異なる増殖動態を示し、個々の細胞株又は層別化を比較する必要性を例証している。いずれにしても、図１１Ｅに示されるように、ＰＥＧ－ＯＡＣでは平均して細胞増殖率が増加している。 図１１Ａ～１１Ｅの５つの図面で、ＰＢＳ又は４ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣで処理した特定のＤＳ細胞株の４つのプロットを示す。４つ全てが、ＰＥＧ－ＯＡＣで処理した場合の増殖率増加を示しているが、４つとも異なる増殖動態を示し、個々の細胞株又は層別化を比較する必要性を例証している。いずれにしても、図１１Ｅに示されるように、ＰＥＧ－ＯＡＣでは平均して細胞増殖率が増加している。 図１１Ａ～１１Ｅの５つの図面で、ＰＢＳ又は４ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣで処理した特定のＤＳ細胞株の４つのプロットを示す。４つ全てが、ＰＥＧ－ＯＡＣで処理した場合の増殖率増加を示しているが、４つとも異なる増殖動態を示し、個々の細胞株又は層別化を比較する必要性を例証している。いずれにしても、図１１Ｅに示されるように、ＰＥＧ－ＯＡＣでは平均して細胞増殖率が増加している。 図１２Ａ～１２Ｈの８つの図面で、ＡＨＩ及びＤＳリンパ球を用いたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６試験の計算出力を示す。図１２Ａは、阻害剤であるオリゴマイシン、ＦＣＣＰ、ロテノン、及びアンチマイシンＡを添加した場合の、ＤＳ及びＡＨＩリンパ球による酸素消費速度（ＯＣＲ）の時系列プロットである。これらの阻害処理から、複数の代謝パラメーターが得られる。 図１２Ａ～１２Ｈの８つの図面で、ＡＨＩ及びＤＳリンパ球を用いたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６試験の計算出力を示す。図１２Ｂは、ＤＳドナーリンパ球の基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）がＡＨＩドナーリンパ球のそれよりも高く、ＡＨＩとＤＳドナーリンパ球の両方で、ＰＥＧ－ＯＡＣとの接触によりＯＣＲが増大し（図１２Ｂ）、その程度がＤＳ細胞で若干大きかったことを示している。ＡＨＩ及びＤＳドナーリンパ球の計算上のプロトンリーク（図１２Ｃ）、即ち複合体Ｖを駆動せずにマトリックスに戻るプロトンに関連したＯＣＲの量は、ＰＥＧ－ＯＡＣによって減少し、プロトンリークの顕著な減少を示した。同様に、ＡＴＰ産生もＰＥＧ－ＯＡＣ処理細胞で増加した（図１２Ｄ）。最大呼吸（図１２Ｅ）と予備呼吸容量（図１２Ｆ）は、ＡＨＩ細胞では影響が見られなかったが、ＰＥＧ－ＯＡＣ処理したＤＳ細胞では劇的に増加した。非ミトコンドリア呼吸は、処理にかかわらず有意な影響を受けなかった（図１２Ｇ）。最後に、結合効率はＡＨＩとＤＳの両方の細胞株で向上した（図１２Ｈ）。全体として、これらの結果から、ＰＥＧ－ＯＡＣは複合体ＩＶへの電子の流れを改善することができ、ＤＳ細胞はＡＨＩ細胞株よりもこの効果に対する感受性が高いことが示唆される。ＰＥＧ－ＯＡＣ処理によるＤＳ細胞の最大呼吸の劇的な増加は、ＤＳ患者のミトコンドリアで起こると報告されている、複合体ＩＶの代償性増加による累積能力を反映している可能性がある。 図１２Ａ～１２Ｈの８つの図面で、ＡＨＩ及びＤＳリンパ球を用いたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６試験の計算出力を示す。図１２Ｂは、ＤＳドナーリンパ球の基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）がＡＨＩドナーリンパ球のそれよりも高く、ＡＨＩとＤＳドナーリンパ球の両方で、ＰＥＧ－ＯＡＣとの接触によりＯＣＲが増大し（図１２Ｂ）、その程度がＤＳ細胞で若干大きかったことを示している。ＡＨＩ及びＤＳドナーリンパ球の計算上のプロトンリーク（図１２Ｃ）、即ち複合体Ｖを駆動せずにマトリックスに戻るプロトンに関連したＯＣＲの量は、ＰＥＧ－ＯＡＣによって減少し、プロトンリークの顕著な減少を示した。同様に、ＡＴＰ産生もＰＥＧ－ＯＡＣ処理細胞で増加した（図１２Ｄ）。最大呼吸（図１２Ｅ）と予備呼吸容量（図１２Ｆ）は、ＡＨＩ細胞では影響が見られなかったが、ＰＥＧ－ＯＡＣ処理したＤＳ細胞では劇的に増加した。非ミトコンドリア呼吸は、処理にかかわらず有意な影響を受けなかった（図１２Ｇ）。最後に、結合効率はＡＨＩとＤＳの両方の細胞株で向上した（図１２Ｈ）。全体として、これらの結果から、ＰＥＧ－ＯＡＣは複合体ＩＶへの電子の流れを改善することができ、ＤＳ細胞はＡＨＩ細胞株よりもこの効果に対する感受性が高いことが示唆される。ＰＥＧ－ＯＡＣ処理によるＤＳ細胞の最大呼吸の劇的な増加は、ＤＳ患者のミトコンドリアで起こると報告されている、複合体ＩＶの代償性増加による累積能力を反映している可能性がある。 図１２Ａ～１２Ｈの８つの図面で、ＡＨＩ及びＤＳリンパ球を用いたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６試験の計算出力を示す。図１２Ｂは、ＤＳドナーリンパ球の基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）がＡＨＩドナーリンパ球のそれよりも高く、ＡＨＩとＤＳドナーリンパ球の両方で、ＰＥＧ－ＯＡＣとの接触によりＯＣＲが増大し（図１２Ｂ）、その程度がＤＳ細胞で若干大きかったことを示している。ＡＨＩ及びＤＳドナーリンパ球の計算上のプロトンリーク（図１２Ｃ）、即ち複合体Ｖを駆動せずにマトリックスに戻るプロトンに関連したＯＣＲの量は、ＰＥＧ－ＯＡＣによって減少し、プロトンリークの顕著な減少を示した。同様に、ＡＴＰ産生もＰＥＧ－ＯＡＣ処理細胞で増加した（図１２Ｄ）。最大呼吸（図１２Ｅ）と予備呼吸容量（図１２Ｆ）は、ＡＨＩ細胞では影響が見られなかったが、ＰＥＧ－ＯＡＣ処理したＤＳ細胞では劇的に増加した。非ミトコンドリア呼吸は、処理にかかわらず有意な影響を受けなかった（図１２Ｇ）。最後に、結合効率はＡＨＩとＤＳの両方の細胞株で向上した（図１２Ｈ）。全体として、これらの結果から、ＰＥＧ－ＯＡＣは複合体ＩＶへの電子の流れを改善することができ、ＤＳ細胞はＡＨＩ細胞株よりもこの効果に対する感受性が高いことが示唆される。ＰＥＧ－ＯＡＣ処理によるＤＳ細胞の最大呼吸の劇的な増加は、ＤＳ患者のミトコンドリアで起こると報告されている、複合体ＩＶの代償性増加による累積能力を反映している可能性がある。 図１２Ａ～１２Ｈの８つの図面で、ＡＨＩ及びＤＳリンパ球を用いたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６試験の計算出力を示す。図１２Ｂは、ＤＳドナーリンパ球の基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）がＡＨＩドナーリンパ球のそれよりも高く、ＡＨＩとＤＳドナーリンパ球の両方で、ＰＥＧ－ＯＡＣとの接触によりＯＣＲが増大し（図１２Ｂ）、その程度がＤＳ細胞で若干大きかったことを示している。ＡＨＩ及びＤＳドナーリンパ球の計算上のプロトンリーク（図１２Ｃ）、即ち複合体Ｖを駆動せずにマトリックスに戻るプロトンに関連したＯＣＲの量は、ＰＥＧ－ＯＡＣによって減少し、プロトンリークの顕著な減少を示した。同様に、ＡＴＰ産生もＰＥＧ－ＯＡＣ処理細胞で増加した（図１２Ｄ）。最大呼吸（図１２Ｅ）と予備呼吸容量（図１２Ｆ）は、ＡＨＩ細胞では影響が見られなかったが、ＰＥＧ－ＯＡＣ処理したＤＳ細胞では劇的に増加した。非ミトコンドリア呼吸は、処理にかかわらず有意な影響を受けなかった（図１２Ｇ）。最後に、結合効率はＡＨＩとＤＳの両方の細胞株で向上した（図１２Ｈ）。全体として、これらの結果から、ＰＥＧ－ＯＡＣは複合体ＩＶへの電子の流れを改善することができ、ＤＳ細胞はＡＨＩ細胞株よりもこの効果に対する感受性が高いことが示唆される。ＰＥＧ－ＯＡＣ処理によるＤＳ細胞の最大呼吸の劇的な増加は、ＤＳ患者のミトコンドリアで起こると報告されている、複合体ＩＶの代償性増加による累積能力を反映している可能性がある。 図１２Ａ～１２Ｈの８つの図面で、ＡＨＩ及びＤＳリンパ球を用いたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６試験の計算出力を示す。図１２Ｂは、ＤＳドナーリンパ球の基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）がＡＨＩドナーリンパ球のそれよりも高く、ＡＨＩとＤＳドナーリンパ球の両方で、ＰＥＧ－ＯＡＣとの接触によりＯＣＲが増大し（図１２Ｂ）、その程度がＤＳ細胞で若干大きかったことを示している。ＡＨＩ及びＤＳドナーリンパ球の計算上のプロトンリーク（図１２Ｃ）、即ち複合体Ｖを駆動せずにマトリックスに戻るプロトンに関連したＯＣＲの量は、ＰＥＧ－ＯＡＣによって減少し、プロトンリークの顕著な減少を示した。同様に、ＡＴＰ産生もＰＥＧ－ＯＡＣ処理細胞で増加した（図１２Ｄ）。最大呼吸（図１２Ｅ）と予備呼吸容量（図１２Ｆ）は、ＡＨＩ細胞では影響が見られなかったが、ＰＥＧ－ＯＡＣ処理したＤＳ細胞では劇的に増加した。非ミトコンドリア呼吸は、処理にかかわらず有意な影響を受けなかった（図１２Ｇ）。最後に、結合効率はＡＨＩとＤＳの両方の細胞株で向上した（図１２Ｈ）。全体として、これらの結果から、ＰＥＧ－ＯＡＣは複合体ＩＶへの電子の流れを改善することができ、ＤＳ細胞はＡＨＩ細胞株よりもこの効果に対する感受性が高いことが示唆される。ＰＥＧ－ＯＡＣ処理によるＤＳ細胞の最大呼吸の劇的な増加は、ＤＳ患者のミトコンドリアで起こると報告されている、複合体ＩＶの代償性増加による累積能力を反映している可能性がある。 図１２Ａ～１２Ｈの８つの図面で、ＡＨＩ及びＤＳリンパ球を用いたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６試験の計算出力を示す。図１２Ｂは、ＤＳドナーリンパ球の基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）がＡＨＩドナーリンパ球のそれよりも高く、ＡＨＩとＤＳドナーリンパ球の両方で、ＰＥＧ－ＯＡＣとの接触によりＯＣＲが増大し（図１２Ｂ）、その程度がＤＳ細胞で若干大きかったことを示している。ＡＨＩ及びＤＳドナーリンパ球の計算上のプロトンリーク（図１２Ｃ）、即ち複合体Ｖを駆動せずにマトリックスに戻るプロトンに関連したＯＣＲの量は、ＰＥＧ－ＯＡＣによって減少し、プロトンリークの顕著な減少を示した。同様に、ＡＴＰ産生もＰＥＧ－ＯＡＣ処理細胞で増加した（図１２Ｄ）。最大呼吸（図１２Ｅ）と予備呼吸容量（図１２Ｆ）は、ＡＨＩ細胞では影響が見られなかったが、ＰＥＧ－ＯＡＣ処理したＤＳ細胞では劇的に増加した。非ミトコンドリア呼吸は、処理にかかわらず有意な影響を受けなかった（図１２Ｇ）。最後に、結合効率はＡＨＩとＤＳの両方の細胞株で向上した（図１２Ｈ）。全体として、これらの結果から、ＰＥＧ－ＯＡＣは複合体ＩＶへの電子の流れを改善することができ、ＤＳ細胞はＡＨＩ細胞株よりもこの効果に対する感受性が高いことが示唆される。ＰＥＧ－ＯＡＣ処理によるＤＳ細胞の最大呼吸の劇的な増加は、ＤＳ患者のミトコンドリアで起こると報告されている、複合体ＩＶの代償性増加による累積能力を反映している可能性がある。 図１２Ａ～１２Ｈの８つの図面で、ＡＨＩ及びＤＳリンパ球を用いたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６試験の計算出力を示す。図１２Ｂは、ＤＳドナーリンパ球の基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）がＡＨＩドナーリンパ球のそれよりも高く、ＡＨＩとＤＳドナーリンパ球の両方で、ＰＥＧ－ＯＡＣとの接触によりＯＣＲが増大し（図１２Ｂ）、その程度がＤＳ細胞で若干大きかったことを示している。ＡＨＩ及びＤＳドナーリンパ球の計算上のプロトンリーク（図１２Ｃ）、即ち複合体Ｖを駆動せずにマトリックスに戻るプロトンに関連したＯＣＲの量は、ＰＥＧ－ＯＡＣによって減少し、プロトンリークの顕著な減少を示した。同様に、ＡＴＰ産生もＰＥＧ－ＯＡＣ処理細胞で増加した（図１２Ｄ）。最大呼吸（図１２Ｅ）と予備呼吸容量（図１２Ｆ）は、ＡＨＩ細胞では影響が見られなかったが、ＰＥＧ－ＯＡＣ処理したＤＳ細胞では劇的に増加した。非ミトコンドリア呼吸は、処理にかかわらず有意な影響を受けなかった（図１２Ｇ）。最後に、結合効率はＡＨＩとＤＳの両方の細胞株で向上した（図１２Ｈ）。全体として、これらの結果から、ＰＥＧ－ＯＡＣは複合体ＩＶへの電子の流れを改善することができ、ＤＳ細胞はＡＨＩ細胞株よりもこの効果に対する感受性が高いことが示唆される。ＰＥＧ－ＯＡＣ処理によるＤＳ細胞の最大呼吸の劇的な増加は、ＤＳ患者のミトコンドリアで起こると報告されている、複合体ＩＶの代償性増加による累積能力を反映している可能性がある。 アミド結合を用いてカルボン酸若しくはフェノール官能基上のいずれかでＯＣＮＰにリガンドを付与する結合法、又はＯＣＮＰに追加のリガンドを付加する「クリック」ケミストリー結合の２つの反応スキームを示す図である。 ２ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ－ＯＡＣを非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与して２４時間後に安楽死させたＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットから得た脳の切片の顕微鏡写真である。４％ホルムアルデヒドで固定した後、組織を抗ポリ（エチレングリコール）抗体とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＩｇＧ抗体で標識した。明るさは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＩｇＧ二次抗体によって示される位置のポリ（エチレングリコール）量を示す。

本発明は、Ｈ₂Ｓの過剰生成による老化加速に伴う臓器系の機能低下を呈する、又はその危険性のあるダウン症候群（ＤＳ）対象を治療する方法を企図する。この方法は、Ｈ₂Ｓ還元有効量の親水性ポリマー置換酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）と、生理学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散した任意の増強量のリポ酸又はジヒドロリポ酸とを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む。投与は通常、反復（ｒｅｐｏｒｔ）される。
Ｈ₂ＳレベルはＣＢＳの発現における不均一性を反映している可能性があるため、Ｈ₂ＳレベルによるＤＳ患者の層別化は、Ｈ₂Ｓによる悪化のリスクが最も高い人を同定するのに使用できる。我々は、Ｈ₂Ｓレベル及び酸化ストレスの測定値に基づく個別化手法に我々の治療法を臨床応用することを企図しており、Ｈ₂Ｓレベル及び酸化ストレスは、ガスクロマトグラフィー（２７）、Ｈ₂Ｓのメチレンブルー検出、Ｈ₂Ｓのジビマン（ｄｉｂｉｍａｎｅ）検出（２９）を含むがこれらに限定されない確立された方法を用いて血液中で測定でき、また同様に本明細書の別の箇所に記載するＨ₂Ｓの過剰生成及び酸化ストレスの更なるマーカーでも測定が可能である。
従って、このようなマーカーは、臓器系の機能低下が確認される前に、ＤＳ対象に予防的治療を行うための基礎として用いることができる。このような予防的治療では、上述のものと同じ医薬組成物を利用する。

本発明者らは、様々な炭素源から生物学的に強力な酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）を製造する合成法を開発した（米国特許第９，５７２，８３４号明細書；国際公開第２０２１／２５２，３８２号）（２０、４６～４８）。当初、これらのナノ粒子はスーパーオキシドジスムターゼの模倣物にすぎないと考えられていたが、現在では、粒子の安定した電子ラジカルと構造が、ミトコンドリア成分間の電子の移動を含む他の反応を（４８）、またごく最近では、ポリスルフィドの生成を触媒することも発見された（図２Ａ～２Ｅ）。
従って、ＯＣＮＰは、生物反応において酸化還元メディエーターとして機能する、新たに概念化された「ナノザイム」又はナノ粒子とみなされた（２９）。ごく最近では、医薬品グレードのココナッツ活性炭に由来するこれらの粒子（２０）は直径が通常約２～約５ｎｍで、ｉｎ ｖｉｖｏ分布、培養細胞による取り込み、ミトコンドリア局在、及び消失までのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を高めるためにＰＥＧ（化）されている。
本発明者らは最近、ＰＥＧ－ＯＣＮＰ（ＰＥＧ－ＯＡＣ）が、溶液中（図４Ａ）及び内在的にＨＥＫ２９３内（ヒト胎児腎細胞；ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３（商標）；図４Ｂ）において、Ｈ₂Ｓ（Ｎａ₂Ｓの形態）由来のポリスルフィドの形成も促進することを見出した。ＯＣＮＰで処理したｂＥｎｄ．３細胞の平均蛍光（図４Ｃ）から、ＯＣＮＰが、ミトコンドリアのＨ₂ＳドナーＡＰ３９によって生成されたＨ₂Ｓに由来する内因性のポリスルフィドの形成を、Ｈ₂Ｓの追加なしに増強することが示された（図４Ｃ）。予備データでは、ＯＣＮＰが１０～１０００ｎＭの範囲にわたってＡＰ３９の増殖作用と毒性作用の両方を減少させたことから、この作用が機能的結果を有することが示されている（図４Ｄ）。
ポリスルフィドは活性酸素種（ＲＯＳ）をクエンチし（２３）、重要な過硫酸化反応を促進して（１９）、ジスルフィドをチオールに還元する（２４）ため、Ｈ₂Ｓをポリスルフィドに変換することには有益な効果がある。ＲＯＳをクエンチした後、ポリスルフィドは無害のチオ硫酸（Ｓ₂Ｏ₃ ^2-）に変換されて排出される（２５）。
ＯＣＮＰはチオ硫酸の生成速度も増加させ、結果として生じる酸化生成物が腎臓から***されやすくなるであろうことを示している（図４Ｅ）。Ｈ₂Ｓ自体は殆ど生物学的作用を持たないが、そのポリスルフィド生成物は優れた抗酸化剤であり、過硫化反応において重要な生物学的役割を担っている（２３）ことから、この新たな作用は非常に重要である。これらの結果は、ＯＣＮＰが、ポリスルフィドとチオ硫酸を生成物とするＣＢＳの内因性過剰発現からＤＳドナー細胞を保護できることを示唆している。

過剰なＨ₂Ｓをポリスルフィドに変えることは、ＤＳなどの病態において、ミトコンドリアを保護し神経や他の臓器系の機能を維持する魅力的な治療法である。提案されている手法は殆どがＨ₂Ｓ生成を排除又は阻害するものだが、Ｈ₂Ｓ自体は殆ど作用を持たないものの、これらの活性代謝物の生成にはある程度のレベルが必要であるため、これには困難を伴う。ＯＣＮＰはＲＯＳの負荷を軽減し、過剰なＣＢＳとＨ₂Ｓによって引き起こされる代謝の不均衡を回復させると考えられる。
内因性Ｈ₂Ｓは、主にシスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）とシスタチオニンγリアーゼ（ＣＳＥ）によるトランススルフレーション経路を通じて生成される（３１）（図１）。体内におけるＨ₂Ｓの役割は様々だが、調節不全による過剰は例外なく有害である（３２）。ミトコンドリアでは、過剰なＨ₂Ｓが複合体ＩＶを阻害することにより酸素が上流の複合体から電子を捕獲できなくなり、電子漏れが生じる（３３）。電子伝達系（ＥＴＣ）の阻害により解糖系への依存が高まり（１６）、ＡＴＰ産生が減少する。

ＤＳは、３本目の２１番染色体（トリソミー）が存在するために、少なくとも部分的にはＣＢＳの過剰発現によって引き起こされるＨ₂Ｓの上昇が認められることから、新たな疾患標的として特定された。複合体ＩＶの障害によるこれらの影響は、解糖シフトやＡＴＰの減少など、ヒトでも観察されている（５２）。トリソミーは、おそらく配偶子を除く対象の細胞全てに存在する。従って、実質的にどの細胞でもトリソミーの影響の実例として使用できる。リンパ球と線維芽細胞は比較的豊富にあり、提供者であるヒト対象に殆ど苦痛や不快を与えずに容易に入手できるため、我々はリンパ球と線維芽細胞を実例として使用することにした。
ＯＣＮＰの投与により、抗酸化剤であるポリスルフィド及びチオ硫酸の生成が促進されることで、酸化的リン酸化が促進され、解糖系への依存が減少し、ＤＳ変異を持つ細胞の酸化ストレスが軽減されると考えられている。
Ｈ₂Ｓの抗酸化剤ポリスルフィドへの変換は、ＤＳなどにおいて過剰なＨ₂Ｓを減少させる治療法候補として提示されていない。Ｈ₂Ｓの生合成を減少させる手段となり得るものとして、ＣＢＳの直接阻害が提案されており、多くのＣＢＳ阻害剤が開発されているが、薬理学的な有益性が示されたものはない（５３）。ＣＢＳはグルタチオンの生成に使用できる必須量のシステインを生成するため、酵素の直接阻害は望ましくない可能性がある。

我々は、ＯＣＮＰが酸化ストレスを軽減し、ＤＳ患者由来のリンパ球の健康を増進することを説明する。我々は、ＤＳ由来の細胞株における内因性Ｈ₂Ｓ過剰、及び年齢をマッチさせた、外見上健常な（ＡＨＩ）細胞における薬剤誘発性Ｈ₂Ｓ過剰のモデルを使用した。
ポリサルファイド及びＨ₂Ｓレベルは、それぞれ指示薬のＳｕｌｆｕｒ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｐｒｏｂｅ４（ＳＳＰ４）と７－アジド－４－メチルクマリン（ＡｚＭＣ）で追跡した。ＲＯＳレベルは、ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）ミトコンドリアスーパーオキシド指示薬（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）指示薬を用いて測定した。ＤＳ及びＡＨＩ細胞株による酸素消費量並びにＯＣＮＰの影響は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅミトコンドリア機能試験を用いて実施した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＤＳ細胞は本質的にストレスを受けている可能性があり、ＯＣＮＰの有益な効果を実証するために、ＯＣＮＰが過酸化水素による多重のミトコンドリア酸化ストレスからＤＳ由来細胞を直接保護できるかを調べた。これについては、ＤＳ由来細胞と外見上健常者（ＡＨＩ）の細胞とを比較し（図１５Ａ）、細胞の健康の指標として、ミトコンドリア機能、スーパーオキシド生成、酸化ストレス、及び細胞生存率のマーカーとしての酸素消費量の違いを調べた。
ここで我々は、ＯＣＮＰがＨ₂Ｓを酸化してポリスルフィドにし、ＣＢＳとＨ₂Ｓの間の活性化の正のフィードバックループを減少させることを見出した（図５）。この疾患の治療のために触媒を導入することは、従来のリガンド標的阻害から、所望の生成物を増強する作用がある化学的に活性なナノ触媒の使用への構想的な転換となる。

本試験で使用した例示的なＯＣＮＰは、図６に示し、後述するようにＰＥＧ化したものである。使用するω－メトキシポリ（エチレングリコール）アミンは、約２０００～約１０，０００Ｄａの分子量を有し得る。異なる分子量を有するこれらのＰＥＧ誘導体の混合物も使用できる。現在のところ、ＰＥＧ－ＯＡＣ調製物の合成において、平均分子量が約５０００Ｄａのω－メトキシポリ（エチレングリコール）アミンを使用することが好ましい。
市販のＰＥＧ製品は、存在するエチレングリコール繰り返し単位の数が異なるため、分子量が異なる混合物であることが当該技術分野では理解されており、よく知られている。従って、分子量が約２０００ＤａのＰＥＧ製品では、平均約６０個の繰り返し単位（図６の「ｎ」）が存在する。分子量が約５０００ＤａのＰＥＧ製品では平均約１２５個の繰り返し単位が存在し、分子量が約１０，０００ＤａのＰＥＧ製品では平均約２５０個の繰り返し単位が存在する。
各粒子上のＰＥＧ置換基の数も、所与の調製物の粒子間で異なる。粒子あたり平均約３～約１２個、好ましくは平均約５～約１０個のＰＥＧ置換基が存在する。これらの数は熱重量分析によって決定できる。

ＰＥＧ－ＯＡＣは、以前に記載されており（２０）、以下に説明する手順を用いて合成する。簡単に説明すると、粒子は好ましくはココナッツ由来の活性炭（ｃＡＣ）から合成し、発煙硝酸（９０％ＨＮＯ₃）で酸化し、次いでアミノポリ（エチレングリコール）とコンジュゲートすることにより、直径が平均約３ｎｍのカーボンコア粒子を生成する。ココナッツＡＣは、平均最長寸法が異なる粉末として製造業者から入手する。一実施形態では、入手した粉末を、目開きが２０μｍのふるい（米国規格Ｎｏ．６３５目開き）にかけた後に酸化工程を実施し、粒径がより均一な酸化生成物を用意する。
粒子は円板状で、水中で約１～約５ｍｇ／ｍＬの濃度で非分離性の分散を示す。分散は室温で少なくとも７日間は分離に対して安定である。この酸化カーボンナノ粒子分散液は、約２２０ｎｍで最大ＵＶ吸光度を示す。粒子は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）により約９～約１５％のカルボニル基を含有しており、孔径０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター膜を通過する（国際公開第２０２１／２５２３８２号）。
ＰＥＧ置換ＯＣＮＰに加えて、その他の置換基も、それらの酸化合成によりＯＣＮＰの一部として存在するカルボン酸、ヒドロキシル、及びケトン官能基に結合して存在し得る。従って、プロピレンオキシドポリマー［ポリ（プロピレングリコール）；ＰＰＧ］も使用でき、親水性はやや低いながらも水溶性／水分散性の置換基を使用したい場合には、同じくプロピレンオキシド・エチレンオキシドコポリマーも使用できる。

図１３に２種類の置換基結合反応を模式的に示す。上の模式図は、ω－メトキシポリ（エチレングリコール）アミンなどの第一級アミン含有置換基Ｒとアミド結合を形成する粒子のカルボン酸官能基の使用を示す。下の２つの模式図は、粒子上に存在するヒドロキシル基を利用して、置換基Ｒが末端アルキン基を含む「クリック結合」で用いられる反応を開始させるものである。
生理的ｐＨ値でイオン電荷を持つ親水性置換基は、イオン荷電種が細胞壁を貫通しないことが多いため、通常は利用しないが、ＰＥＧなどの非荷電性置換基に結合したＯＣＮＰは貫通が可能であり、血液脳関門も通過できる（図１４参照）。
粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）、熱重量分析（ＴＧＡ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）、及びフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ－ＩＲ）により特性付けし、生成物の一貫性を確保する。ＯＣＮＰ粒子は、トランスレーショナルリサーチの重要な考慮事項として、細胞培養培地であるＰＢＳ中で安定である。
我々は、ポリ（エチレングリコール）特異的抗体標識を用いて、ＰＥＧ－ＯＡＣがラットの脳に存在できることを事前に見出していた（図１４）。
また、ＰＥＧ－ＯＡＣがミトコンドリアＨ₂ＳドナーＡＰ３９の増殖作用と毒性作用の両方を消失させたことも確認した（図４Ｄ）。この時、ＰＥＧ－ＯＡＣは過剰なＨ₂ＳからｂＥｎｄ．３細胞を保護し、ｂＥｎｄ．３細胞の生存率向上と正規化増殖の両方を示した。

ＤＳのヒトモデルとして、年齢と性別をマッチさせたＤＳドナー及び外見上健常者（ＡＨＩ）リンパ球（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ニュージャージー州カムデン）を使用する。正常細胞において過剰なＨ₂Ｓを誘導するミトコンドリア標的薬ＡＰ３９の効果を調べ、ＯＣＮＰあり及びなしのＤＳ細胞と比較した。増殖の変化を測定するために、ＤＳ及びＡＨＩドナー細胞をＰＥＧ－ＯＡＣ（４ｍｇ／Ｌ）あり又はなしで１～５日間処理した後、血球計数器で測定する。
我々は、ＡＰ３９処理のみと比べてＯＣＮＰが細胞を保護することを確認した（図１０）。Ｈ₂Ｓ生成の変化を測定するには、細胞を７－アジド－３－メチルクマリン（ＡｚＭＣ）と同時にＰＥＧ－ＯＡＣで処理し、ＡｚＭＣ蛍光の出現を、以前の研究に基づいて２４時間にわたって測定する。
同様に、ポリスルフィド合成は、細胞をＰＥＧ－ＯＡＣとＳＳＰ４で共処理し、蛍光シグナルの出現により測定する（図２Ｂ、２Ｃ、及び４Ａ）。Ｓ₂Ｏ₃ ^2-の生成は、５日間にわたって培養液のアリコートを毎日採取し、Ｄｏｎｇら（３０）によるＳ₂Ｏ₃ ^2-特異的タンニン酸官能化銀ナノ粒子を添加して測定する。

ミトコンドリア呼吸は、ＭｉｔｏＳｔｒｅｓｓ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６（ＩＢＴ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ；Ｆｅｎｇ Ｗａｎｇ（ＰｈＤ）所長）を用いて評価し、ＡＨＩ及びＤＳリンパ球の酸素消費速度（ＯＣＲ）（図１２Ａ）を用いて、最大及び予備の変化とミトコンドリアＡＴＰ産生を測定する。解糖速度試験を用いて、乳酸生成の指標である細胞外酸性化を測定することにより、これに関連したミトコンドリア阻害の尺度となる解糖の変化を測定する（５２、５４、５５）。
この試験の結果から、ＰＥＧ－ＯＡＣで処理したＤＳ細胞では、ＰＥＧ－ＯＡＣが基礎呼吸速度を上昇させ（図１２Ｂ）、プロトンリークを減少させ（図１２Ｃ）、ミトコンドリアのＡＴＰ合成を増加させた（図１２Ｄ）ことが示された。ＤＳ細胞をＰＥＧ－ＯＡＣで処理すると、平均して最大呼吸が増加し（図１２Ｅ）、それに伴って予備呼吸容量も増加した（図１２Ｆ）。非ミトコンドリアの呼吸は、処理にかかわらず有意な影響を受けなかった（図１２Ｇ）。結合効率はＡＨＩとＤＳの両方のドナー細胞で増加した（図１２Ｈ）。
酸化ストレスは、ＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）及びＭｉｔｏＳＯＸ（商標）蛍光アッセイを用いて評価する。これらの試験から、我々が過去に成功したように、血管容量に基づくｉｎ ｖｉｖｏ投与量に変換するのに必要なｉｎ ｖｉｔｒｏデータが得られる（２１、２２、４８）。
この試験の結果は、触媒ナノ粒子がＨ₂Ｓの変換を促進し、ＤＳ変異を持つ細胞の健康の複数のパラメーターを改善し、故にｉｎ ｖｉｖｏで有益な全身作用をもたらすことができるという証拠を提供する。
この試験では、ＤＳ細胞とＡＨＩ細胞の両方に対するＯＣＮＰの効果を、それぞれの細胞種について未処理の細胞を対照として比較した。２群を比較するために、事後のＦｒｅｅｍａｎ－Ｔｕｋｅｙ分析を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ分析を行う。有意性を決定するのに十分な検出力を得るため、各試験を少なくとも６回行った。細胞計数により、増殖が有意に減少し、毒性を示唆しているかを評価する。

Ｈ₂Ｓ過剰の有害作用は、培養ＤＳドナー細胞では明らかでない可能性があるが、これらの細胞が致死量以下のミトコンドリア毒素によってストレスを受けた場合には明らかになる可能性がある。この可能性を検証するため、電子伝達系阻害剤であるアンチマイシンＡ（ＡＭＡ）及び一般的な酸化ストレス誘導剤である過酸化水素に対するＰＥＧ－ＯＡＣによるＤＳドナー細胞の保護を調べる。
別の試験では、ＤＳ患者のリンパ球と外見上健常者（ＡＨＩ）のリンパ球とを用いており、図８にその結果をグラフで示す。この試験では、細胞の倍加時間を測定し、ＡＨＩリンパ球はＤＳ患者リンパ球のほぼ２倍の速さで数が倍増することがわかった。ＰＥＧ－ＯＡＣの濃度を上げて投与したところ、４ｍｇ／Ｌの濃度で測定した場合、ＤＳリンパ球の倍加時間は用量依存的に約２０％減少したのに対し、ＡＨＩリンパ球では約８％減少した。
両細胞種の増殖率を、４ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣの存在下と非存在下で比較した。図８に示した結果からわかるように、５日間の試験期間中、ＡＨＩリンパ球の増殖率はＰＥＧ－ＯＡＣの存在下で約９％増加したのに対し、ＤＳリンパ球の増殖率は４ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣの存在下で、ＰＥＧ－ＯＡＣの非存在下での増殖よりも約２８％増加した（図８）。

これらの試験で示されたように、ＤＳ患者のリンパ球はベースライン時には、マッチさせた対照リンパ球よりも増殖率が低い。これは過剰なＨ₂Ｓによる二次的なエネルギー代謝機能障害を表している可能性がある。ＰＥＧ－ＯＡＣは対照のリンパ球増殖にはあまり影響を及ぼさなかった。ＰＥＧ－ＯＡＣは、脳損傷の動物モデルにおいて有効性が示されたのと同様の濃度で、用量依存的にリンパ球増殖を促進した。
ＤＳ及びＡＨＩリンパ球を、完全培地の１．５ｍＬアリコート中１０，０００細胞／ｍＬの初期濃度で１２ウェル細胞培養処理プレートに移した。細胞を０、０．５、１、４、及び８ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣで処理した。プレートに播種した２４時間後、リンパ球を再懸濁し、８象限の血球計数器で計数するために１００μＬを取り出し、顕微鏡で計数した。計数は４８、７２、及び１２０時間後に繰り返した。増殖率はＧｒａｐｈｐａｄ９．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて計算した。
ドナーのＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス不死化ＤＳ及びＡＨＩリンパ球（それぞれＧＭ０１９２１（２３，Ｍ）及びＧＭ０７４９１（１７，Ｍ））は、テキサスＡ＆Ｍ大学との物質移動合意書に基づきＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ニュージャージー州カムデン）から購入したもので、薬剤又は市販品の開発が認められている。
Ｈ₂Ｏ₂生成ＲＯＳに対するＯＣＮＰの重要性を調べるため、ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）標識を用いて、ミトコンドリアのスーパーオキシドに対する抗酸化効果を推定し、ＲＯＳ生成の最終生成物の指標であるＢＯＤＩＰＹを用いて脂質過酸化スクリーニングを行った。これらの所見をＡＨＩ細胞のものと比較し、ＤＳドナー細胞に更なる効果があるかを判定した。試作品の抗酸化剤Ｔｒｏｌｏｘは、Ｔｒｏｌｏｘ［（±）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸］がポリスルフィドの生成に対する触媒作用を持たないことから、ＯＣＮＰの抗酸化作用とＨ₂Ｓ変換に対する作用とを区別するために、単独及び併用で試験した。

狭い分布のデータを得る上で大きな困難となるのが、ＤＳ及びＡＨＩ細胞の複製特性のばらつきが大きいことである（図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ）。このようなばらつきの大きさにもかかわらず、ＰＥＧ－ＯＡＣで処理すると、増殖にプラスの変化が観察された（図１１Ｅ）。
遊離Ｎｒｆ２の量を測定するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に続いて、Ｎｒｆ２特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った（図９Ａ、９Ｂ）。細胞をＰＥＧ－ＯＡＣ（４ｍｇ／Ｌ）及びリポ酸（１ｍＭ）又はＰＢＳと組み合わせて処理し、１．５及び３時間後に試料を採取して分析した（図１０Ｂ）。
我々は、ＰＥＧ－ＯＡＣをリポ酸と組み合わせると、この実施例では処理後３時間でＰＥＧ－ＯＡＣがＮｒｆ２発現を約１００％増加させることを見出した。従って、リポ酸は約０．１～約５ｍＭ、好ましくは約０．５～約３ｍＭなどの増強量で存在する。

ＰＥＧ－ＯＡＣに官能基を追加するには、ジヒドロリポ酸、リポ酸、又はそれらの類似体をＰＥＧ－ＯＡＣに直接、又はリンカー分子を介してコンジュゲートできる。リポ酸とジヒドロリポ酸はキラルであり、Ｒエナンチオマーの使用が好ましい。従って、リポ酸又はジヒドロリポ酸カルボキシル基は、標準的なエステル化技術を用いて、企図する粒子のヒドロキシル基にエステル化できる。リポ酸カルボキシル基は、α，ω－Ｃ₂－Ｃ₆－アルキルジアミンとの反応によってアミノアルキルアミドに形成でき、そのアミン基は次に粒子のカルボキシ官能基のケトと反応させることができる。
ジヒドロリポ酸は直ちに活性化し、遊離ジヒドロリポ酸で以前に示されたように、細胞内グルタチオンレベルを改善できる（５６）。リポ酸は、ＨＳ－がジチオラン環を求核攻撃して過硫化物とチオールを生成することにより、Ｈ₂Ｓのスカベンジャーとして機能できる。
しかし、ＨＳＳ－による攻撃により、グルタチオンによる求核攻撃及び高反応性グルタチオン分子の生成のための良好な求電子剤として機能する過硫化物Ｒ－ＳＳＳＨを生成できる。Ｈ₂ＳはＰＥＧ－ＯＡＣによって酸化され、ポリスルフィドになることがこの応用で示されている。ポリスルフィドによるリポ酸部分の活性化は、グルタチオン過硫化物の濃度を高めることによって、内因性グルタチオンの反応性を高めるのに役立つ。

鉄キレート化に加えて、他の金属も含硫チオラン及びチオール分子を用いてキレート化でき、アミド結合又は「クリック」（アジド－アルキン結合）ケミストリーを介してＯＣＮＰに容易にコンジュゲートできる（図１４）。このようなリガンドには、３－アミノ－１，２－プロパンジチオール、４－アミノ－１，２－ブタンジチオール、５－アミノ－１，２－ペンタンジチオール、６－アミノ－１，２－ヘキサンジチオール、１－アミノ－２，３－ブタンジチオール、２－（アミノメチル）－１，３－プロパンジチオール、α－リポ酸、１，２－ジチオラン－３－ペンタミン、及びこれらの各塩がある。３－（５－ヘキシン－１－イル）－１，２－ジチオラン、３－（７－１－オクチン－１－イル）－１，２－ジチオラン、３－（６－ヘプチン－１－イル）－１，２－ジチオラン、３－（１－メチル－４－ペンチン－１－イル）－１，２－ジチオラン、３－（５－メチル－６－ヘプチン－１－イル）－１，２－ジチオラン、及び様々な長さのアルキンで終端するポリ（エチレングリコール）テールを持つ他の例が、アジド－アルキン（「クリックケミストリー」）結合誘導体の例である。
我々は、分子量２，０００＋５，０００のＰＥＧ－ＮＨ₂ブレンド、及び個別に分子量１，０００、２，０００、５，０００及び１０，０００のＰＥＧの物理的な実証を用いて、ω－メトキシポリ（エチレングリコール）アミンの異なるブレンドを用いたＯＣＮＰのポリマー修飾を実施した。現在のところ、５，０００ＤａのＰＥＧの使用が好ましい。
ＤＩＣ結合を用いたＰＥＧ－ＮＨ₂のＯＣＮＰへの結合は容易であるため（図６）、他のアミン末端ポリマーも結合に好適である可能性があり、酸性度による条件付き溶解性、蛍光部分又は細胞シグナル分子の付着などの新たな特性を付与することができる。
リガンドをＯＣＮＰに結合することにより、我々は２つの目的の達成を目指す：１）チオールが更なる抗酸化剤として機能できる、２）チオール又はチオランがＯＣＮＰの分子軌道と相互作用し、ＯＣＮＰに更なる触媒活性を付加する。

治療方法と医薬組成物
ダウン症候群（ＤＳ）を有する対象（患者）の加速された老化を治療する方法が企図される。方法は、本明細書で使用する例示的なポリ（エチレングリコール）官能化酸化活性炭（ＰＥＧ－ＯＡＣ）などの本明細書に記載する親水性ポリマー官能化酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）の老化加速緩和有効量と対象の細胞とを接触させることを企図する。
企図される方法の使用に従って、且つ図１２の結果から示されるように、企図されるＯＣＮＰの投与後、細胞状態における以下の１つ以上の改善が生じ、且つ観察できる：ＤＳドナーリンパ球の基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）がＡＨＩドナーリンパ球のそれよりも高く、ＡＨＩとＤＳドナーリンパ球の両方で、ＰＥＧ－ＯＡＣとの接触によりＯＣＲが増大し、その程度がＤＳ細胞で若干大きかった；ＡＨＩ及びＤＳドナーリンパ球の、複合体Ｖを駆動せずにマトリックスに戻るプロトンに関連したＯＣＲの量は、ＰＥＧ－ＯＡＣによって減少し、プロトンリークの顕著な減少を示した；ＰＥＧ－ＯＡＣで処理したＤＳ細胞では、最大呼吸及び予備呼吸容量が劇的に増加した。

酸化カーボンナノ材料は、治療対象への毒性も最小限に抑える。
企図されるＯＣＮＰは、企図される治療方法において有用な医薬品（医薬組成物）の製造に使用できる。そのように使用する場合、薬学的に許容可能な塩や緩衝剤などが通常存在し、それらは、医薬用途が意図されていない組成物中に存在し得るものと対比して、薬学的に許容可能な希釈剤と総称される。
更なる合成を行うことなく、企図される酸化カーボンナノ粒子材料は、カルボン酸及び／又はカルボン酸アニオンとして存在する。カルボン酸塩基の電荷のバランスをとるために、一価のリチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、及びアンモニウムイオンなどのカチオン、又はマグネシウム若しくはカルシウムなどの二価イオンが存在し得る。
アミン含有化合物も、共有結合若しくは非共有結合で、又は単に疎水性力又は親水性力などの力による結合で、企図される粒子との会合が可能である。ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などの可溶化剤が粒子と会合している場合、そのポリマーのプロトン化アミン基の正電荷の数は、殆どの体液［生理的ｐＨ値（約７．２～７．４）］又は企図される細胞培養培地の通常中性付近のｐＨ値において、粒子のカルボン酸塩の負電荷の数を上回る可能性が高い。従って、正電荷のバランスをとるためにアニオン性基が存在し得る。
例示的な有用なアニオンには以下があるがこれらに限定されない：硫酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩（ｈｙｄｒｏ ｂｒｏｍｉｄｅｓ）、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩（ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３－フェニル－プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩、及びウンデカン酸塩。

医薬化合物と共に薬学的に許容可能な塩を形成する、一般的に使用される薬学的に許容可能な酸及び塩基のリストは、Ｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９７７ ６８（１）：１－１９を参照のこと。
企図される医薬組成物は、生理学的に（薬学的に）許容可能な担体中に溶解又は分散された、企図される酸化カーボンナノ粒子材料又はこれらの薬学的に許容可能な塩の老化加速緩和有効量を含有する。このような組成物は、細胞培養液中などｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞に投与してこれらの細胞と接触させること、又はダウン症患者など必要とする生きている哺乳動物宿主などにｉｎ ｖｉｖｏで細胞を接触させることができる。
図のデータは、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇレシピエント（宿主哺乳動物）体重の濃度を示す。好ましくは、約０．５～約６ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約２ｍｇ／ｋｇの濃度が、本試験における有効量となる。熟練者は、これらの量を容易に利用して、特定の治療対象又は治療すべき細胞に対する有効量を見出すことができる。

企図される組成物は通常、これらを必要とする対象に、１ヵ月以内に複数回、例えば毎週ｉｎ ｖｉｖｏで投与され、数ヵ月から数年にわたって生涯投与できる。ダウン症は遺伝性疾患であるため、生涯にわたる治療が予想される。
企図される医薬組成物は、液体又は固体製剤として口から（経口で）投与できる。非経口投与が好ましく、液体医薬組成物を用いて行われる。いずれの状況においても、製剤は、所望により、従来の非毒性の薬学的に許容可能な担体、補助剤、及び溶剤を含有する。
本明細書で使用する非経口という用語は、皮下注射、静脈内（これが最も好ましい）、筋肉内、腹腔内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射又は注入技術を含む。経口及び非経口投与用の薬物の処方については、例えばＨｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；１９７５及びＬｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０で論じられている。
親水性炭素クラスター（ＨＣＣ）は、引用文献（５０、５１）及び米国特許出願公開第２０２０／０２２２４５３号明細書で論じられているように、本明細書で使用するものと同様の化学的応用により、粉末木炭ではなくカーボンナノチューブから調製する。ＨＣＣはヌードマウスで約２～約３時間の半減期を持つことがわかっている。この場合も同様の半減期が予想される。

経口投与用の固形剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、及び顆粒があり得る。固形剤形中の企図される化合物の量は、前述した有効量であり、従って、血流濃度が約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．５～約６ｍｇ／ｋｇ、及びより好ましくは約２ｍｇ／ｋｇとなる。固形剤形は、１週間の間に複数回投与することができ、また通常はそうされる。
このような固形剤形では、本発明の化合物は通常、指示された投与経路に適した１つ以上の希釈剤と組み合わされる。経口投与の場合、化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、カルボキシセルロース、カルボキシセルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、ゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、並びに／又はポリビニルアルコールと混合でき、次いで、投与しやすいよう錠剤化又はカプセル化する。
カプセル又は錠剤などの固形剤形は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中に企図される酸化カーボンナノ粒子材料を分散させて提供できる放出制御製剤を含み得る。カプセル、錠剤、及び丸薬の場合、剤形は、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、又は炭酸水素塩などの緩衝剤も含み得る。錠剤及び丸薬は、更に、企図される酸化カーボンナノ粒子材料を放出せずに胃を通過するための腸溶性コーティングを用いて調製できる。

企図される医薬組成物は、好ましくは非経口投与に適している。従って、医薬組成物は、好ましくは投与時に液体形態であり、最も好ましくは、液体は水性液であるが、後述するように他の液体も企図され、現在最も好ましい組成物は注射可能な調合剤である。
従って、注射可能な調合剤、例えば滅菌注射可能な水性又は油性の溶液又は懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて既知の技術に従って処方できる。滅菌注射可能な調合剤は、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液のように、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の注射可能な溶液又は懸濁液であってもよい。
使用できる許容可能な溶剤及び溶媒には、水、リンゲル液、等張食塩水、リン酸緩衝食塩水がある。滅菌溶液は、活性成分を所望の溶媒系に溶解し、次いで、得られた溶液をメンブレンフィルターに通して滅菌すること、又は滅菌条件下で事前に滅菌した溶媒に滅菌化合物を溶解することによって調製できる。
他の液体医薬組成物には、例えば非経口投与に好適な溶液がある。酸化カーボンナノ粒子活性成分の滅菌水溶液、又は水、エタノール、若しくはプロピレングリコールを含む溶媒中の活性成分の滅菌溶液は、非経口投与に好適な液体組成物の例である。いくつかの態様では、企図される酸化カーボンナノ粒子材料は、使用前に注射用に塩化ナトリウムなどの適切な液体媒体に溶解（分散）させる乾燥粉末として提供される。

治療製剤において、活性酸化カーボンナノ粒子材料は、分散、溶解、乳化、懸濁、凍結乾燥、カプセル化、微粉化、ナノ粒子化などが可能であることも理解されたい。更に、製剤は、アルコール、ポリオール、エステル、水などの溶媒；ガラクトマンナンガム、デンプンなどの炭水化物ポリマー、セルロース誘導体、アルギン酸及び誘導体、アクリル酸アルキルポリマー及びコポリマー、ポリビニルアルコール及び誘導体などの増粘剤及び粘度調整剤；セルロースエーテル、カルボマーなどの被膜剤；キレート剤、長鎖脂肪酸、通常アルコール若しくは脂肪アルコール、及び／又はエステルなどの乳化剤；アミノ酸、及び緩衝剤などを含有できる。
本明細書で企図される安定した凍結乾燥医薬組成物は、酸化カーボンナノ粒子材料を単独で、又は充填剤、例えばマンニトール、トレハロース、ラフィノース、及びスクロース、若しくはこれらの混合物と混合して含む溶液を凍結乾燥することにより製造できる。他にも多くの従来の凍結乾燥剤がある。糖類の中ではラクトースが最も一般的である。また、クエン酸、炭酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ベンジルアルコール、グリシン、塩化ナトリウムなども用いられる［例えば、Ｂａｈｅｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｅｘｃｉｐ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ １（１）：４１－５４参照］。
更に、滅菌固定油は、溶媒又は懸濁媒として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む、任意のブランドの滅菌固定油を使用できる。更に、オレイン酸などの脂肪酸が、注射可能な組成物の調製に使用される。ジメチルアセトアミド、イオン性及び非イオン性洗浄剤を含む界面活性剤、ポリエチレングリコールが使用できる。上述したような溶媒と湿潤剤の混合物も有用である。

治療を必要とし、企図される化合物を含有する医薬組成物が投与される哺乳動物（対象）は、通常はヒトである。チンパンジーやゴリラなどの類人猿、カニクイザルやマカクなどのサルといったその他の霊長類、ラット、マウス、又はウサギなどの実験動物、イヌ、ネコ、ウマなどの伴侶動物、雌牛又は雄牛、ヒツジ、ラム、ブタ、ヤギ、ラマなどの食用動物なども、毒性試験などの被験体として使用できるが、ダウン症候群にはならないため、通常は治療対象とはみなされない。Ｈｓａ２１遺伝子の異なるセットについてトリソミーであるげっ歯類モデルがいくつか開発されており、被験体とすることができる（Ｎ．Ｒｕｅｄａ，Ｊ．Ｆｌｏｒｅｚ ａｎｄ Ｃ． Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｃｕｅ，Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏＦ Ｄｏｗｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｓ ａ Ｔｏｏｌ ｔｏ Ｕｎｒａｖｅｌ ｔｈｅ Ｃａｕｓｅｓ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｎｅｕｒａｌ Ｐｌａｓｔ，（２０１２）Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ５８４０７１，２６ ｐａｇｅｓ ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／５８４０７１；Ｙ．Ｈｅｒａｕｌｔ，Ｊ．Ｍ．Ｄｅｌａｂａｒ，Ｅ．Ｍ．Ｃ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｖ．Ｌ．Ｊ．Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚ，Ｅ．Ｙｕ ａｎｄ Ｖ．Ｂｒａｕｌｔ，Ｒｏｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｉｍｐａｃｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，（２０１７）Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌｓ Ｍｅｃｈ １０：１１６５－１１８６ ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．０２９７２８参照）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが企図される場合、細胞及び組織などのアッセイ対象試料が使用できる。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ組成物は、通常、水、塩化ナトリウム、又は塩化カリウム、及び酢酸塩、リン酸塩、ヘペスなどの１つ以上の緩衝塩、またよく知られているように、実施するアッセイに応じて、ｐＨ４．０～８．５、好ましくは約ｐＨ７．２～７．４などの所望のｐＨ値に緩衝するＥＤＴＡなどの金属イオンキレート剤を含有する。
好ましくは、医薬組成物は単位剤形である。このような形態では、組成物は、適切な量の酸化カーボンナノ粒子材料活性化合物を含有する単位用量に分割される。単位剤形は包装調合剤であってよく、包装は、例えば、バイアル又はアンプルに入った離散量の調合剤を含む。

一般的な方法
活性炭の酸化：粉末の医療グレードのココナッツ活性炭（ｃＡＣ）（２．５００ｇ、２０８．３ミリモル炭素）を２５０ｍＬ丸底フラスコに入れ、続いて発煙（９０％）ＨＮＯ₃（２５ｍＬ、０．６モル）を添加した。反応混合物を１４０℃に予熱した油浴に入れ、還流下で４時間（ｈ）撹拌した。加熱後、反応混合物を熱源から取り出し、室温まで冷却した。
次いで、反応混合物が入った丸底フラスコを氷浴に入れて冷やした後、２Ｍグリシン水溶液（２５ｍＬ、５０ミリモル）に注ぎ入れた。得られた急***液を１枚のＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）７透析膜（再生セルロース、１ｋＤａ ＭＷＣＯ、寸法５ｃｍ×４５ｍｍ）に移し、脱イオン水（ＤＩ）水による動的槽透析（ｄｙｎａｍｉｃ ｂａｔｈ ｄｉａｌｙｓｉｓ）で精製した。得られたｃＯＡＣ溶液は、２４時間槽透析で精製した。
精製後、反応混合物を透析槽から取り出し、０．２２μｍのＰＥＳ膜でろ過した。ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を用いて、水性ｃＯＡＣ生成物の濃度を測定した。
ふるいにかけたｃＡＣ由来ｃＯＡＣについては、酸化前に、Ｎｏ．６３５（２０μｍ）目開きの米国標準試験ふるいを通してバルクのｃＡＣ（３．０ｇ、０．２５モル炭素）をふるい、２０μｍ未満の粉末状の医療グレードのｃＡＣを収集した。ふるい工程の補助に、Ｇｉｌｓｏｎ振動ふるい振とう機を使用した（パラメーター：モード＝手動、時間＝２時間、振幅＝１００％）。収集した２０μｍ未満のｃＡＣは、続に上記の方法で酸化させた。

改良ｃＯＡＣのＰＥＧによる官能基化：水性ｃＯＡＣを凍結乾燥（Ｌａｂｃｏｎｃｏ（商標）Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ／Ｆｒｅｅｚｏｎｅ４．５）により乾燥させた。凍結乾燥したバルク又はふるいにかけたｃＯＡＣ（１６．６ｍｇ、１．３８ミリモル）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に懸濁し、振幅５０％で６０分間カップホーンで超音波処理した（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ（登録商標）Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＣＰ７５０）。
次いで、５ｋＤａメトキシ－ＰＥＧ－アミン（０．３３２７ｇ、０．０６６５４ミリモル）を反応容器に添加した。混合物を２０分間（ｍｉｎ）槽超音波処理（ｂａｔｈ－ｓｏｎｉｃａｔｅ）した（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ（登録商標）０８８４９－００超音波洗浄器）。次に、反応容器を超音波処理器から取り出し、Ｎ，Ｎ′－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（０．１７ｍＬ、１．１ミリモル）を添加した。溶液を室温（ｒｔ）で４８時間撹拌した。槽透析による精製の前に、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルター（再生セルロース、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）を用いた遠心分離（ＮｕＡｉｒｅ（登録商標）ＮＵ－Ｃ２００Ｒ、パラメーター：４５００ｘｇ、３０分、室温）で過剰なＤＭＦを除去した。得られた保持液をＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水で希釈し、次いで１つのＦｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｇ２透析装置（再生セルロース、ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ、１０ｍＬ容量）に移した。
材料を透析するために、充填した装置をＭｉｌｌｉ－Ｑ水（登録商標）の入った２Ｌビーカーに入れた。４８時間、水浴を磁気撹拌バー／撹拌プレートでゆっくりと連続的に撹拌した。この間に水を６～８回交換した。
透析後、ＰＥＧ－ｃＯＡＣ粒子を０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜に通して滅菌ろ過した。ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を用いて、得られたＰＥＧ－ｃＯＡＣ水性生成物のｃＯＡＣカーボンコア濃度を測定した。

ＳＳＰ４蛍光アッセイ：ＰＢＳ中の１２００μＭ Ｎａ₂Ｓ溶液を新たに調製し、使用した。１２０μＭのＳＳＰ４溶液をＰＢＳ中に調製し、ホイルに包んで保存した。９６ウェルプレートで、１６μｇ／ｍＬのＰＥＧ－ＯＡＣ又はＰＢＳ ５０μＬ、次いでＳＳＰ４溶液５０μＬ、ＰＢＳ ５０μＬ、最後に１２００μＭ Ｎａ₂Ｓ溶液５０μＬをプレートの２つのウェルに置いた。蛍光モードで作動するＢＭＧ Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ用いて、２つのウェルを１０秒に１回、６００秒間スキャンした。

増殖アッセイ：ＤＳ及びＡＨＩ線維芽細胞を、我々の経験に基づいて０．１～１０ｍｇ／ＬのＰＥＧ－ＯＡＣで処理する。処理時間は１～５日まで変化させる。二元配置ＡＮＯＶＡにより、ＰＥＧ－ＯＡＣが増殖を促進するかを、粒子濃度Ｘ細胞遺伝子型を用いて決定し、最大の保護効果をもたらすものを決定する。

細胞内ポリスルフィドアッセイ：ＨＥＫ２９３細胞を１、３、又は９μｇ／ｍＬのＰＥＧ－ＯＡＣで４日間処理し、３０μＭのＳＳＰ４と共にインキュベートした。プレートを定期的に読み取り、プログレス曲線を取得した。

チオ硫酸生成アッセイ：ＤＳ及びＡＨＩ線維芽細胞を培養で調製し、ＰＥＧ－ＯＡＣ（０～９μｇ／ｍＬ）あり及びなしでインキュベートする。チオ硫酸の濃度は、前述のようにＡｇナノ粒子（ＡｇＮＰ）を用いて測定する（３０）。ＡｇＮＰを用いたチオ硫酸較正曲線は、ＨＰ８４５３ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使って、４１９ｎｍの吸光度を集光点として用いて収集する。培地のアリコートを毎日採取し、ナノ粒子の溶液に添加して、４１９ｎｍにおける吸光度の減少を測定する。

ミトコンドリア呼吸測定：ＤＳ及びＡＨＩドナー細胞を培養し、ＯＣＮＰ（０．１～１０ｍｇ／Ｌ）及び／又はＴｒｏｌｏｘ（１～１００μＭ）で処理した後、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ミトコンドリア呼吸及び解糖分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、イリノイ州ウッド・デール）に入れ、その後、オリゴマイシン、カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、ロテノン／アンチマイシンＡによる処理を順次行い、全投与量のミトコンドリアストレス試験を行った。処理群と未処理群について、各薬剤投与後のＯＣＲの差を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが記載する手順を用いて比較した（５４）。
第２の試験では、ＯＣＮＰ及びＴｒｏｌｏｘあり及びなしの細胞を、アンチマイシンＡ又は過酸化水素のいずれかで処理し、処理細胞と未処理細胞のＯＣＲの差（％）を分析する。解糖速度試験を実施し、代償性解糖の変化、即ち細胞が電子伝達系の損失に反応する能力を測定する。この因子の減少は、ミトコンドリアの阻害が低下していることを示す（５２、５５）。

Ｎｒｆ２試験のためのｂＥｎｄ．３細胞の培養：マウス脳内皮（ｂ．Ｅｎｄ３）細胞は、１０％ウシ胎児血清と１％ペニシリン・ストリプトマイシンを補充したＤＭＥＭで培養及び維持する。細胞が９０％コンフルエントに達したら、細胞を１対５の割合で分割する。
Ｎｒｆ２試験のためのｂＥｎｄ．３細胞の処理：ｂ．Ｅｎｄ３細胞を１０ｃｍペトリ皿に播種する。４日目に古い培地の半分を捨て、新しい培地と交換する。５日目に、ｂ．Ｅｎｄ３細胞にＰＥＧ－ＯＡＣ（ＥＭＥ２８）４μｇ／ｍＬ又はリポ酸１ｍＭ又は溶剤（ＰＢＳ）のいずれかを投与する。
Ｎｒｆ２ウェスタンブロッティング：細胞抽出は、細胞溶解バッファーと付属の手順書（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃ＦＮＮ００１１）を用いて行う。タンパク質はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１８６３０２８）を用いて定量する。各ライセートの同量のタンパク質（２０μｇ）を（別段の記載がない限り）還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードする。膜転写は低温室で一晩（約１８時間）行い、翌日、５％粉乳／ＴＢＳＴでブロッキングする。続いて、膜を一次抗体と共に一晩（約１８時間）、更に二次抗体と共にブロッキング溶液中で１時間インキュベートする。シグナルはＥＣＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ａ４３８４０）で現像し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭイメージングシステムで撮影する。

Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの脳の抗ＰＥＧ標識：２ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ－ＯＡＣを非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）投与したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの脳を、４％ホルムアルデヒドで２４時間、氷上で固定し、Ｈ₂Ｏ中で１０～３０％のスクロース濃度勾配を用いて４８時間かけて凍結保護した。その後、Ｌｅｉｃａ Ｃｒｙｏｔｏｍｅで脳の２０μｍ切片を作製した。切片を抗ＰＥＧ Ｒｂポリクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＰＡ５－３２２４７）、次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ａ－２１２４５）で標識し、Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８倒立蛍光顕微鏡を用いて２０倍で撮像した。

本明細書に引用した特許、特許出願、及び論文はそれぞれ参照により援用される。冠詞「ａ」又は「ａｎ」の使用は、１つ以上を含むことを意図している。
前述の説明及び実施例は例示を意図したものであり、限定と捉えるべきではない。本発明の精神及び範囲内で更に他の変形が可能であり、当業者に容易に提示されるであろう。

〔参考文献〕

Claims (22)

1. Ｈ₂Ｓの過剰生成による加速された老化に伴う臓器系の機能低下を呈するダウン症候群（ＤＳ）対象を治療する方法であって、生理学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散された、Ｈ₂Ｓ還元有効量の親水性ポリマー置換酸化カーボンナノ粒子（ＯＣＮＰ）と、任意の増強量のリポ酸又はジヒドロリポ酸とを含有する医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
2. 前記親水性ポリマー置換基が、生理的ｐＨ値でイオン電荷を持たない、請求項１に記載の方法。
3. 前記親水性ポリマー置換基が、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、又はポリ（エチレングリコール－ｃｏ－プロピレングリコール）の１つ以上である、請求項２に記載の方法。
4. 前記親水性ポリマー置換基が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である、請求項３に記載の方法。
5. 前記置換基ＰＥＧの平均分子量が、約２０００～約１０，０００Ｄａである、請求項４に記載の方法。
6. 前記ＯＣＮＰが、粒子あたり平均約３～約１２個のＰＥＧ置換基を含む、請求項４に記載の方法。
7. 前記生理学的に許容可能な希釈剤が、非経口投与に適した水性液である、請求項１に記載の方法。
8. 前記水性液が、リンゲル液、等張食塩水、又はリン酸緩衝食塩水である、請求項７に記載の方法。
9. 前記親水性ポリマー置換酸化カーボンナノ粒子が、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇの濃度で存在する、請求項７に記載の方法。
10. 前記生理学的に許容可能な希釈剤が、経口投与に適している、請求項１に記載の方法。
11. 前記生理学的に許容可能な希釈剤が、水性液である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記生理学的に許容可能な希釈剤が、固体である、請求項１０に記載の方法。
13. 前記投与が、反復される、請求項１に記載の方法。
14. 前記投与が、最高レベルのＨ₂Ｓを有する患者に供される、請求項１に記載の方法。
15. 前記リポ酸が、約０．１～約５ｍＭで存在する、請求項１に記載の方法。
16. Ｈ₂Ｓの過剰生成による加速された老化に伴う臓器系の機能低下を呈するダウン症候群（ＤＳ）対象を治療する方法であって、生理学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散された、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇの濃度のポリ（エチレングリコール）置換酸化カーボンナノ粒子（ＰＥＧ－ＯＣＮＰ）と、任意の増強量のリポ酸又はジヒドロリポ酸とを含有する医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法において、前記ＰＥＧ置換基の平均分子量が約２０００～約１０，０００Ｄａであり、且つ前記ＰＥＧ－ＯＣＮＰが、粒子あたり平均約３～約１２個のＰＥＧ置換基を含む方法。
17. 前記ＰＥＧ－ＯＣＮＰが、約０．５～約６ｍｇ／ｋｇの濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＰＥＧ置換基の平均分子量が、約５０００Ｄａである、請求項１６に記載の方法。
19. 前記ＰＥＧ－ＯＣＮＰが、粒子あたり平均約５～約１０個のＰＥＧ置換基を含む、請求項１６に記載の方法。
20. 前記投与が、最高レベルのＨ₂Ｓを有する患者に供される、請求項１６に記載の方法。
21. 前記投与が、反復される、請求項１６に記載の方法。
22. 前記リポ酸が、約０．５～約３ｍＭで存在する、請求項１６に記載の方法。

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