JP2024521881A - 非アルコール性脂肪性肝疾患のための線維症バイオマーカー - Google Patents
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Abstract
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象における肝線維症の正確な非侵襲的な診断または予後のためのバイオマーカーおよび方法が開示されている。バイオマーカーにはトロンボスポンジン２（ＴＳＰ２）の循環レベルが含まれており、疾患の経過中いつでも測定できる。本方法には、ＴＳＰ２の循環レベルを単独での非侵襲的評価、または他の分子バイオマーカー、生理学的バイオマーカーまたは放射線撮影バイオマーカーと組み合わせた非侵襲的評価のいずれか一つが含まれる。本方法は、感度が高く、進行肝線維症を約８０％以上の感度で検出する。本方法は、ＴＳＰ２の循環レベルを単独で、または他の分子バイオマーカー、生理学的バイオマーカーまたは放射線撮影バイオマーカーと併用して、対象における進行肝線維症の発症リスクを正確に予測できる。
Description
本発明は、一般に、肝臓の線維性疾患の非侵襲的診断または予後のためのバイオマーカーおよび方法に関する。
トロンボスポンジン（Thrombospondin：ＴＳＰ）は、細胞外マトリックス（extracellular matrix：ＥＣＭ）構造タンパク質、細胞受容体、成長因子、およびサイトカインを含む多数のリガンドと相互作用するマトリクス細胞タンパク質の一種である。ＴＳＰは細胞とマトリックスの相互作用を調節し、抗血管新生特性を持っている。五つのトロンボスポンジン（ＴＳＰ１～５）のうち、ＴＳＰ１とＴＳＰ２は構造が似ている。それにもかかわらず、以前の研究は、ＴＳＰ１およびＴＳＰ２が異なるリガンドに結合し、それらの発現には空間的および時間的な差異があり、それらの役割が交換可能ではないことを報告した（Ａｇａｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ；１６１：８３１－８３９（２００２）；Ｈｅｌｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ；４６４：１０２２－１０２７（２０１５）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ；４５：１２７５－１２９３（２０２０））。
高血糖はＴＳＰ１とＴＳＰ２の両方の発現を誘導する可能性があり、２型糖尿病患者においてＴＳＰ１とＴＳＰ２の組織発現の増加が見られた。非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease：ＮＡＦＬＤ）に関しては、ＴＳＰ１の遺伝的阻害がマウスの非アルコール性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis：ＮＡＳＨ）の発症を防ぐことが示され、ＴＳＰ１の血清レベルがＮＡＦＬＤ患者の肝臓脂肪変性の程度と正の相関があることが判明した（Ｍｉｎ－ＤｅＢａｒｔｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；１４：ｅ０２２６８５４（２０１９）；Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ；５７：１０２８４９（２０２０））。ある研究では、進行線維症患者では、そうでない患者と比較して、ＴＳＰ２をコードするＴＨＢＳ２遺伝子の肝臓発現が有意に上方制御されていることが明らかになったが（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：４７４８（２０１７））、循環しているＴＳＰ２の臨床的な関連性はまだ不明である。
２型糖尿病は、ＮＡＦＬＤの進行の重要な危険因子である（Ｙｏｕｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ；２：２６２－２６５（２００４）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ；１７：５４３－５５０ ｅ５４２（２０１９）；および、Ｚｏｐｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ；１０９：１０２０―１０２５（２０１４））。ＮＡＦＬＤの範囲におけるさまざまな病期の中で、肝線維症は、全死亡率および肝臓関連の有害転帰の主な決定要因である（Ａｎｇｕｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ；１４９：３８９－３９７ ｅ３１０（２０１５）；Ｅｋｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；６１：１５４７－１５５４（２０１５））。驚くべきことに、７０％以上の２型糖尿病患者がＮＡＦＬＤを併発しており、より具体的には、最近提案された定義を使用すると、代謝機能不全関連脂肪肝疾患（metabolic dysfunction-associated fatty liver disease：ＭＡＦＬＤ）を患っている（Ｅｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．，７３：２０２－２０９（２０２０））。ＮＡＦＬＤは米国で最も蔓延している慢性肝疾患である。ＮＡＦＬＤは、二つの主要な組織学的サブタイプ、すなわち非アルコール性脂肪性肝（nonalcoholic fatty liver：ＮＡＦＬ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）として存在する（Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．；４１（６）：１３１３―１３２１（２００５））。ＮＡＦＬは比較的良性の臨床経過と関連しているが、ＮＡＳＨは進行性線維症および肝硬変のリスク増加と関連している。ＮＡＳＨは、線維症の有無にかかわらず、肝臓脂肪変性および、肝細胞傷害（バルーニング）を伴う炎症の存在によって定義され得る（Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；５５：２００５－２３（２０１２））。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、孤立性肝臓脂肪変性から、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、進行線維症、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）発症に至る一連の肝臓疾患からなる（Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＮＡＦＬＤ：Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｒｏｍ ＡＡＳＬＤ；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１８）。ＮＡＦＬＤは、肝の脂肪蓄積の二次的原因を除外した後、画像診断または組織診断で肝臓脂肪変性の存在によって診断できる。しかしながら、ＮＡＳＨは、肝生検でのみ診断できる組織学的診断であり、線維症を伴うまたは伴わない、肝細胞損傷（バルーニング）を伴う炎症の存在が含まれる。肝線維症は、臨床的な決定支援手段（例えば、ＮＡＦＬＤ線維症スコア）や、画像検査（例えば、ＶＴＣＥ、ＭＲエラストグラフィー）を使用して、非侵襲的に評価できる。
ＮＡＦＬＤでは、肝生検が依然として組織学的診断、活動性の評価、線維症の病期の分類ためのゴールドスタンダードである。しかし、肝生検の日常的な使用は、その侵襲性、合併症のリスク、コスト、サンプリングエラー、および患者の受け入れの悪さによって制限されている。これは、病気の検出と病期分類のための非侵襲的で正確な方法が緊急に必要であることを強調している。現在、ＮＡＦＬをＮＡＳＨから区別する信頼できる非侵襲的手段はない（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．；１７（１）：１５６―１６３（２０１９））。また、進行した線維症を患っている一部の個人では、ＮＡＳＨが比較的少ない（Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，８，３４６－３５２（２００９））。
したがって、病気の進行、特に進行線維症の発症のリスクが高い患者は長期にわたる肝臓に関する罹患および死亡率を示すリスクが高いため、これらの患者を特定するための予後バイオマーカーが緊急に必要とされている。（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ；８：１３１－１３３（２０１７））。
したがって、本発明の目的は、ＮＡＦＬＤにおける線維症の非侵襲的検出および線維症進行の予後予測のためのバイオマーカーを提供することである。
本発明のもう一つの目的は、ＮＡＦＬＤにおける線維症の非侵襲的検出および線維症進行の予後予測のための方法を提供することである。
Ａｇａｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ；１６１：８３１－８３９（２００２）
Ｈｅｌｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ；４６４：１０２２－１０２７（２０１５）
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ；４５：１２７５－１２９３（２０２０）
Ｍｉｎ－ＤｅＢａｒｔｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；１４：ｅ０２２６８５４（２０１９）
Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ；５７：１０２８４９（２０２０））
Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：４７４８（２０１７）
Ｙｏｕｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ；２：２６２－２６５（２００４）
Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ；１７：５４３－５５０ ｅ５４２（２０１９）
Ｚｏｐｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ；１０９：１０２０―１０２５（２０１４）
Ａｎｇｕｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ；１４９：３８９－３９７ ｅ３１０（２０１５）
Ｅｋｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；６１：１５４７－１５５４（２０１５）
Ｅｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．，７３：２０２－２０９（２０２０）
Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．；４１（６）：１３１３―１３２１（２００５）
Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；５５：２００５－２３（２０１２）
Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＮＡＦＬＤ：Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｒｏｍ ＡＡＳＬＤ；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１８
Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．；１７（１）：１５６―１６３（２０１９）
Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，８，３４６－３５２（２００９）
Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ；８：１３１－１３３（２０１７）
Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ；６５：１３５９－１３６８（２０１６）
Ｃｈｉｓｔｉａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１８，１５４０：１－２９（２０１７）
Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＵＯＮ；２３（５）：１３３１－１３３６（２０１８）
Ｋａｒｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；６６：１０２２－１０３０）（２０１７）
Ｆｕｌｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３（９）：１７４９－１７５６（１９９７）
Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；６７：３２８－３５７（２０１８）
Ｖｉｌａｒ－Ｇｏｍｅｚ ａｎｄ Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；６８：３０５－３１５（２０１８）
Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；６７：５７７－５８４（２０１７）
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ；３１６：Ｇ７４４－Ｇ７５４（２０１９）
Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ；１８：７８８－７９８（２００７）
Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ；１７９：８６０－８６８（２０１１）
Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ；１６５：２０８７－２０９８（２００４）
Ａｂｕ Ｅｌ－Ａｓｒａｒ．Ａｃｔａ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ；９１：ｅ１６９－１７７（２０１３）
Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ；３３：１９２０－１９２７（２０１３）
Ｃａｓｔｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ；１５６：１２６４－１２８１ｅ１２６４（２０１９）
対象における進行肝線維症を非侵襲的に検出する方法が記載される。対象において進行肝線維症を発症するリスクを検出するための方法も記載される。これらの方法には、典型的には、対象からのサンプル中のバイオマーカーであるトロンボスポンジン２（ＴＳＰ２）の循環レベルを測定することが含まれる。ＴＳＰ２の循環レベルの測定は、ＴＳＰ２、好ましくはヒトＴＳＰ２、に対する結合特異性を有する一つ以上の抗体結合断片を含む捕捉試薬のセットを用いて行われ得る。捕捉試薬のセットは、ＴＳＰ２に対して結合特異性を有し、ＴＳＰ１、ＴＳＰ３、ＴＳＰ４およびＴＳＰ５に対しては結合特異性を有さない結合断片を含み得る。一般に、この方法は、対象からのサンプル中のＴＳＰ２の循環レベルをナノグラム／ｍｌ範囲、例えば０．２ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの間で検出する。測定方法は、約０．１５６ｎｇ／ｍｌ～約１ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．２ｎｇ／ｍｌ～約０．５ｎｇ／ｍｌ、または約０．５ｎｇ／ｍｌのＴＳＰ２の最低検出限界を有するイムノアッセイであり得る。
一般的に、この方法は、対象からのサンプル中のＴＳＰ２の循環レベルが約３．６ｎｇ／ｍｌを超える場合に、進行肝線維症を検出する。典型的には、対象は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患っている。対象はまた、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、心血管疾患（cardiovascular disease：ＣＶＤ）、および慢性腎臓病（chronic kidney disease：ＣＫＤ）などの一つ以上の他の疾患または症状を患っている可能性がある。対象はＮＡＦＬＤおよび２型糖尿病を患っている可能性がある。対象は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を患っている場合もあれば、患っていない場合もある。
この方法は典型的には、対象からの血液または血清サンプルを利用して、ＴＳＰ２の循環レベルを測定する。
典型的には、この方法は、進行肝線維症の非侵襲的検出、またはグレードＦ３以上の肝線維症への進行のリスクの非侵襲的検出を提供する。典型的には、グレードＦ３以上の進行肝線維症は、振動制御一過性エラストグラフィー（vibration controlled transient elastography：ＶＣＴＥ）によって測定される。グレードＦ３以上の進行肝線維症は、Ｍプローブで約９．６キロパスカル（ｋＰａ）またはＸＬプローブで９．３ｋＰａ、およびそれ以上のカットオフ値を有するＶＣＴＥでの肝硬度（liver stiffness：ＬＳ）測定によって等級付けされる線維症である。
この方法は、典型的には、対象からのサンプル中のＴＳＰ２の循環レベルが約３．６ｎｇ／ｍｌを超える場合に、約８０％以上の感度および約６０％以上の特異性で進行肝線維症を検出する。この方法は、典型的には、進行肝線維症を約９０％以上の陰性的中率で検出する。
また、対象において経時的に進行肝線維症が発症するリスクを検出する方法も記載される。典型的には、この方法は、対象からのサンプル中のバイオマーカーＴＳＰ２の循環レベルを測定することを含む。この方法は、経時的に進行肝線維症を発症するリスクが、ｎｇ／ｍｌで測定される対数変換された血清ＴＳＰ２レベルにおける単位増加当たり２．８２倍大きいことを検出する。典型的には、この期間は、サンプルの入手から、ＴＳＰ２の循環レベルの測定から、またはその両方から、約０．１年から約３年の間である。
また、ＴＳＰ２、好ましくはヒトＴＳＰ２、に対する結合特異性を有する一つ以上の抗体結合断片を含む捕捉試薬のセットを用いたキットおよびイムノアッセイも記載される。
ＮＡＦＬＤにおけるグレードＦ３以上の線維症の新規線維症バイオマーカーとして循環ＴＳＰ２レベルを使用すると、付随２型糖尿病の有無にかかわらず、多数のＮＡＦＬＤ患者の早期肝リスク層別化が可能になる。進行した線維症および線維症の進行を抱えるリスクが高いことを示す高い循環ＴＳＰ２レベルの患者は、さらなる評価のために肝臓専門医に紹介されて、肝臓への有害転帰（肝硬変、静脈瘤、肝がんなど）の発現についてより注意深く監視するように、特定されることができる。さらに、これらの患者には、肝線維症、肝機能障害および／または脂肪含有量を改善する可能性のある抗糖尿病薬を、および、特に医療資源が限られている場所では、臨床的に利用可能な場合には新しいＮＡＦＬＤ処置薬を優先的に投与できる。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「進行線維症」という用語は、ＬＳカットオフ：Ｆ３が９．６～１１．４ｋＰａおよびＦ４が≧１１．５ｋＰａ（Ｍプローブ）；Ｆ３が９．３～１０．９ｋＰａおよびＦ４が≧１１．０ｋＰａ（ＸＬプローブ）によって等級付けされるグレードＦ３以上の線維症を有するとして、振動制御一過性エラストグラフィーを使用する非侵襲的検出によって特徴付けられる肝臓の線維症を指す（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ；６５：１３５９－１３６８（２０１６））。
本明細書で使用される場合、「進行線維症」という用語は、ＬＳカットオフ：Ｆ３が９．６～１１．４ｋＰａおよびＦ４が≧１１．５ｋＰａ（Ｍプローブ）；Ｆ３が９．３～１０．９ｋＰａおよびＦ４が≧１１．０ｋＰａ（ＸＬプローブ）によって等級付けされるグレードＦ３以上の線維症を有するとして、振動制御一過性エラストグラフィーを使用する非侵襲的検出によって特徴付けられる肝臓の線維症を指す（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ；６５：１３５９－１３６８（２０１６））。
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または処置的な介入を含む介入もしくは曝露に対する反応についての指標として測定される、分子的、組織学的、放射線写真的、および／または生理学的特徴を指す。バイオマーカーは、組織状態または疾患の検出、組織状態または疾患のモニタリング、および／または組織状態または疾患の予測に使用される診断バイオマーカーおよび／または予後バイオマーカーであり得る。例えば、バイオマーカーである生体分子の測定値は、診断バイオマーカーとして組織状態に関する情報を提供するだけでなく、予後バイオマーカーとして組織状態の将来の変化についての情報を提供しても良い。バイオマーカーの他の例には、生理学的なバイオマーカーとしての肥満指数（ＢＭＩ）、または放射線撮影のバイオマーカーとしての組織弾性が含まれ、どちらも診断用バイオマーカーおよび予後バイオマーカーとなり得る。
本明細書で使用される場合、検出の場合における「非侵襲的」または「非侵襲的に」という用語は、注目の器官からサンプルを物理的に採取することなく、例えば注目の器官の生検を行わずに、注目の器官に関する情報を取得する形態を指す。例えば、進行肝線維症を非侵襲的に検出するとは、肝臓の生検を行わずに進行肝線維症を検出することを指す。
本明細書で使用され場合、「抗体」という用語は、ポリクローナルまたはモノクローナル免疫グロブリン分子などの抗体を指す。無傷の免疫グロブリン分子に加えて、分子がＴＳＰ２エピトープなどのエピトープと結合する能力を維持している限り、これらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマー、および免疫グロブリン分子またはその断片のヒトまたはヒト化のバージョンも含まれる。抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたは類似の方法を使用して所望の活性について試験することができ、その後、それらのｉｎ ｖｉｖｏ処置活性および／または診断活性を既知の臨床試験方法に従って確認および定量することができる。
いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体またはその結合断片である。モノクローナル抗体とは、集団内の個々の抗体が同一である抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＴＳＰ２に特異的に結合する単離された抗体は、ＴＳＰ２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。単離された抗体は、ＴＳＰ２のエピトープ、アイソフォーム、または変異体に特異的に結合する。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくても良い。
本明細書で使用される場合、「結合断片」、「抗原結合断片」、「抗体結合断片」などの用語は、抗体のＣＤＲ、および随意に、抗体の「可変領域」の抗原認識部位を構成するフレームワーク残基を含み、抗原に免疫特異的に結合する能力を示す、抗体の一つまたは複数の部分を指す。このような断片には、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）など、ならびにそれらの突然変異体および変異体、天然に存在する変異体が含まれる。
本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基、のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。
可変領域は、可変領域またはＣＤＲの結合および結合特異性を排除しない方法で置換および改変することもできる。可変領域以外（またはＣＤＲ以外）の抗体の部分の置換、改変、除去などを有する開示された抗体およびポリペプチドについては、可変領域の配列およびＣＤＲ配列が、開示されたモノクローナル抗体の可変領域またはＣＤＲであるか、またはそれらをモデルとすることが好ましい。
本明細書で使用される場合、「結合特異性」、「特異性」、「特異的に反応する」、「特異的に相互作用する」、または「に特異的な」という用語は、ＴＳＰ２のエピトープなどの抗原上に提示されるエピトープに検出可能に結合するが、他の構造との検出可能な反応性は比較的わずかである、抗体または他の薬剤の能力を指す。特異性は、例えばＢｉａｃｏｒｅ機器を使用した結合アッセイまたは競合アッセイによって相対的に決定することができる。特異性は、例えば、約５：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、または約１００００：１、またはそれ以上の、特定の抗原への結合と他の無関係な分子への非特異的結合における親和性／親和力の比によって示される。開示された抗体およびポリペプチドの場合、「二重特異性」および類似の用語は、それぞれが異なるエピトープまたはリガンドに特異的に結合する少なくとも二つの異なる特異的結合要素を含む抗体またはポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「検出する」、「検出」、「決定する」、または「決定」という用語は、通常、情報を取得することを指す。検出または決定には、例えば本明細書で明示的に言及される特定の技術を含む、当業者が利用可能な様々な技術のいずれかを利用することができる。検出または決定には、物理サンプルの操作、データまたは情報の考慮および／または操作、例えば関連する分析を実行するように適合されたコンピュータまたは他の処理装置の利用、および／または、情報源からの関連する情報および／または資料の受信が含まれる場合がある。検出または決定は、得られた値を、既知の試験値、既知の対照値、または閾値などの既知の値と比較することも意味し得る。検出または決定は、取得された値と既知の値との差に基づいて結論を形成することを意味する場合もある。
本明細書で使用される場合、「感度」という用語は、真の陽性者、すなわち肝線維症を有する対象を正確に識別する検査の能力を指す。例えば、感度はパーセンテージ、つまり正しく識別される実際の陽性者の割合として表すことができる（例えば、肝線維症を患っている対象のうち、肝線維症を患っていると検査によって正確に特定された対象の割合）。感度の高い検査では、偽陰性率、つまり肝線維症が肝線維症であると特定されない症例の率が低くなる。一般に、開示されたアッセイおよび方法は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の感度を有する。
本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、真の陰性者、すなわち肝線維症の有さない対象を正確に識別する検査の能力を指す。例えば、特異性は、正しく識別される実際の陰性の割合であるパーセンテージとして表すことができる（例えば、肝線維化を有さない対象の試験によって肝線維化を有さないと正しく識別される割合）。特異性の高い検査では、偽陽性、つまり、肝線維症を持っていないのに、検査によって肝線維症があることが示唆される患者の割合が低くなる。一般に、開示された方法は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の特異性を有する。
本明細書で使用される場合、「正確な」という用語は、約８０％を超える感度および約６０％を超える特異性、約８５％を超える感度および約６５％を超える特異性、または約９０％を超える感度および約８０％を超える特異性などの、高感度および高特異性の結果をもたらす検査の能力を指す。
本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、対象から単離された体液、身体塗抹標本、細胞、組織、器官、またはそれらの一部を指す。サンプルは単一の細胞であっても複数の細胞であってもよい。サンプルは、生検（例えば、外科的生検）によって得られた標本であってもよい。サンプルは、組織培養に配置されている、または組織培養に適応されている対象からの細胞であり得る。サンプルは、細胞、組織、血清、血漿、尿、唾液、痰、および便のうちの一つまたは複数であり得る。サンプルは、唾液、痰、涙、汗、尿、滲出液、血液、血清、血漿、または膣分泌物の一つまたは複数であり得る。
本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」または「患者」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を指す。対象は、ヒト以外の霊長類、家畜、飼育場動物または実験動物であり得る。例えば、対象は、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ウサギなどであり得る。対象は人間であってもよい。対象は、健康であっても、病気、障害、または状態に苦しんでいる、またはそれらにかかりやすい場合もある。患者とは、病気または障害に苦しむ対象を指す。「患者」という用語には、人間および獣医学の対象が含まれる。
「対照」サンプルまたは値は、試験サンプルとの比較のための参照、通常は既知の参照として機能するサンプルを指す。例えば、試験サンプルは試験対象から採取することができ、対照サンプルは既知の正常な（非疾患の）個体などの対照対象から採取することができる。対照は、同様の個人、例えば、同様の医学的背景、同じ年齢、体重などを有する疾患患者または健康な個人、の集団から収集された平均値を表すこともできる。当業者は、任意の数のパラメータを評価するために対照を設計できることを認識するであろう。
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」という用語は、疾患の一つまたは複数の症状を処置するために、組成物を対象またはシステムに投与することを指す。対象への組成物の投与の効果は、状態の特定の症状の停止、状態の症状の軽減または予防、状態の重症度の軽減、状態の完全な除去、特定の事象または特性の発現または進行の安定化または遅延、または、特定のイベントまたは特性が発生する可能性を最小限に抑えること、であり得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「有効量」および「処置上有効量」という用語は、本明細書に記載のナノ粒子、処置薬、および医薬組成物に適用される場合、互換的に使用され、所望の処置結果をもたらすのに必要な量を指す。例えば、有効量は、組成物および／または処置薬、または医薬組成物が投与されている疾患の症状を処置、治癒、または軽減するのに有効なレベルである。求められる特定の処置目標によって、有効な量は、処置される疾患およびその重症度および／または発症／進行の段階、使用される特定の化合物および/または抗悪性腫瘍剤、または医薬組成物の生物学的利用能および活性、投与経路または投与方法および対象における導入部位、を含む様々な要因に依存する。
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段の記載がない限り、その範囲内にあるそれぞれの個別の値を個別に参照する簡略的な方法として機能することを単に意図しており、個別の各値は、あたかも本明細書に個別に記載されているかのように明細書に組み込まれる。
「約」という用語の使用は、約＋／－１０％の範囲で記載された値を上回るか下回る値を表すことを意図しており、他の実施形態において、値は、約＋／－５％の範囲で記載された値を上回るか下回る場合があり、他の実施形態において、値は、約＋／－２％の範囲で記載された値を上回るか下回る場合があり、他の実施形態において、値は、約＋／－１％の範囲で記載された値を上回るか下回る場合がある。
ＩＩ．進行肝線維症のバイオマーカー
対象において進行肝線維症を非侵襲的に検出するため、または進行肝線維症を発症するリスクを判定するためのバイオマーカーには、分子バイオマーカー、放射線撮影のバイオマーカー、および／または生理学的なバイオマーカーが含まれる。バイオマーカーは、単独で使用しても、任意の組み合わせで使用してもよい。例えば、任意の一つまたは複数の分子バイオマーカーを、任意の一つまたは複数の放射線撮影のバイオマーカー、および／または任意の一つまたは複数の生理学的なバイオマーカーとともに使用することができる。いくつかの実施形態において、一つまたは複数の分子バイオマーカーは、進行肝線維症を発症するリスクを検出または予測するために、一つまたは複数の生理学的なバイオマーカーおよび／または一つまたは複数の放射線撮影のバイオマーカーとともに使用される。
対象において進行肝線維症を非侵襲的に検出するため、または進行肝線維症を発症するリスクを判定するためのバイオマーカーには、分子バイオマーカー、放射線撮影のバイオマーカー、および／または生理学的なバイオマーカーが含まれる。バイオマーカーは、単独で使用しても、任意の組み合わせで使用してもよい。例えば、任意の一つまたは複数の分子バイオマーカーを、任意の一つまたは複数の放射線撮影のバイオマーカー、および／または任意の一つまたは複数の生理学的なバイオマーカーとともに使用することができる。いくつかの実施形態において、一つまたは複数の分子バイオマーカーは、進行肝線維症を発症するリスクを検出または予測するために、一つまたは複数の生理学的なバイオマーカーおよび／または一つまたは複数の放射線撮影のバイオマーカーとともに使用される。
典型的には、分子バイオマーカーには、ＴＳＰ２およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）が含まれる。典型的には、生理学的なバイオマーカーは肥満指数（ＢＭＩ、ｋｇ／ｍ２）である。典型的には、放射線撮影のバイオマーカーには、肝硬度（ＬＳ、ｋＰａ）および、振動制御一過性エラストグラフィーでの制御された減衰パラメータ（ＣＡＰ、ｄＢ／ｍ）の読み取り値が含まれる。
Ａ．肝線維症におけるトロンボスポンジン－２
ＴＳＰファミリーには、Ｃａ２＋に結合し、他のＥＣＭタンパク質と相互作用し、細胞間および細胞とＥＣＭ間の結合に寄与する多量体糖タンパク質を表す五つのメンバー（ＴＳＰ１～５）が含まれている。ＴＳＰファミリーは、三量体サブグループＡ（ＴＳＰ１およびＴＳＰ２）と五量体サブグループＢ（ＴＳＰ３、ＴＳＰ４、およびＴＳＰ５）の二つのサブグループに分けられる。ＴＳＰは複雑なマルチドメイン構造を有する。Ｃ末端ドメイン、ＩＩＩ型リピート、および上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピートはすべてのＴＳＰにおいて存在し、ＴＳＰファミリーを強調している。オリゴマー化ドメインはすべてのファミリーメンバーにも見られるが、他の共有構造と比較してより多様である。サブグループＡには、三つのＥＧＦ様リピートとＩ型リピート（トロンボスポンジンリピート、ＴＳＲとも呼ばれる）、フォンヴィレブランド因子Ｃ型（ｖＷＣ）ドメイン、およびＮ末端ドメインがある。サブグループＢには四つのＥＧＦ様リピートが含まれているが、ｖＷＣドメインとＴＳＲが欠落している（Ｃｈｉｓｔｉａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１８，１５４０：１－２９（２０１７））。
ＴＳＰファミリーには、Ｃａ２＋に結合し、他のＥＣＭタンパク質と相互作用し、細胞間および細胞とＥＣＭ間の結合に寄与する多量体糖タンパク質を表す五つのメンバー（ＴＳＰ１～５）が含まれている。ＴＳＰファミリーは、三量体サブグループＡ（ＴＳＰ１およびＴＳＰ２）と五量体サブグループＢ（ＴＳＰ３、ＴＳＰ４、およびＴＳＰ５）の二つのサブグループに分けられる。ＴＳＰは複雑なマルチドメイン構造を有する。Ｃ末端ドメイン、ＩＩＩ型リピート、および上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピートはすべてのＴＳＰにおいて存在し、ＴＳＰファミリーを強調している。オリゴマー化ドメインはすべてのファミリーメンバーにも見られるが、他の共有構造と比較してより多様である。サブグループＡには、三つのＥＧＦ様リピートとＩ型リピート（トロンボスポンジンリピート、ＴＳＲとも呼ばれる）、フォンヴィレブランド因子Ｃ型（ｖＷＣ）ドメイン、およびＮ末端ドメインがある。サブグループＢには四つのＥＧＦ様リピートが含まれているが、ｖＷＣドメインとＴＳＲが欠落している（Ｃｈｉｓｔｉａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１８，１５４０：１－２９（２０１７））。
ＴＳＰ２タンパク質は、細胞結合型でも循環型でも存在する。ＴＳＰ２は、機能的に関連する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）糖タンパク質のグループのメンバーであり、細胞外マトリックスの構築、細胞-マトリックスの相互作用、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）－２およびＭＭＰ－９の分解、および血管新生の阻害を媒介することができる。血管新生の他に、ＴＳＰ２は複数の細胞受容体、成長因子、およびＥＣＭタンパク質と相互作用し、アポトーシス、細胞増殖、および細胞接着を調節することが報告されている。ＴＳＰ２の発現およびその予後値は、いくつかの癌において研究されている（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＵＯＮ；２３（５）：１３３１－１３３６（２０１８））。
ＴＳＰ２は、さまざまな種類の細胞から分泌される１５０ｋＤａのカルシウム結合タンパク質である。ヒトＴＳＰ２のアミノ酸配列は以下のとおりである。
ヒトＴＳＰ２のｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１３８１９３９．１下にある。
ヒトにおいて、ＴＳＰ２は遺伝子ＴＨＢＳ２（遺伝子ＩＤ：７０５８）によってコードされる。
Ｂ．進行肝線維症
一般に、進行肝線維症とは、振動制御一過性エラストグラフィーを使用した非侵襲的検出によって判定される、Ｆ３グレード以上の線維症として特徴付けられる肝臓の線維症を指す。グレードＦ３以上の線維症は、ＬＳカットオフ：Ｆ３が９．６～１１．４ｋＰａおよびＦ４が≧１１．５ｋＰａ（Ｍプローブ）；Ｆ３が９．３－１０．９ｋＰａおよびＦ４が≧１１．０ｋＰａ（ＸＬプローブ）、によって等級付けされる（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ；６５：１３５９－１３６８（２０１６））。
一般に、進行肝線維症とは、振動制御一過性エラストグラフィーを使用した非侵襲的検出によって判定される、Ｆ３グレード以上の線維症として特徴付けられる肝臓の線維症を指す。グレードＦ３以上の線維症は、ＬＳカットオフ：Ｆ３が９．６～１１．４ｋＰａおよびＦ４が≧１１．５ｋＰａ（Ｍプローブ）；Ｆ３が９．３－１０．９ｋＰａおよびＦ４が≧１１．０ｋＰａ（ＸＬプローブ）、によって等級付けされる（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ；６５：１３５９－１３６８（２０１６））。
進行肝線維症は、ＮＡＦＬＤ中の病理学的な状態として発生する可能性がある。ＮＡＦＬＤは代謝異常やその他の全身性疾患と関連している。ＮＡＦＬＤは、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、心血管疾患（ＣＶＤ）、および慢性腎臓病（ＣＫＤ）の独立した危険因子として認識されている。ＮＡＦＬＤの重症度は疾患の発現と関連している。
ＮＡＦＬＤには、単純な脂肪変性から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および進行肝線維症に至るまで、幅広い肝臓症状が含まれる。したがって、ＮＡＳＨには進行肝線維症が存在する場合と存在しない場合がある。
脂肪変性は脂肪化とも呼ばれ、細胞または器官内に脂肪（脂質）が異常に蓄積することである。脂肪変性は、脂質代謝の主要な器官である肝臓に存在する可能性があり、この状態は、一般に脂肪肝疾患と呼ばれる。
Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（登録商標）（Ｅｃｈｏｓｅｎｓ、パリ、フランス）が提供する振動制御一過性エラストグラフィー（ＶＣＴＥ（商標））は、それぞれ、制御された減衰パラメータ（ＣＡＰ（商標））と肝硬度（ＬＳ）を使用して肝臓の脂肪変性と肝線維化を検出するための非侵襲的検査の一つである。
Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（登録商標）測定には、通常、測定精度と一貫性を実現するためのさまざまなプローブが含まれている。プローブモデルの範囲は、通常、ほとんどの患者の形態の測定領域に一致する。皮膚表面から肝臓までの距離に応じて測定領域を調整することにより、一貫した３立方ｃｍの探査体積を維持することができる。これは、次の三つのプローブによって実現される。
Ｓ＋プローブ、小児用：胸郭周囲が７５ｃｍ未満の小児患者向けに設計されている；
Ｍ＋プローブ、中型：皮膚から肝被膜までの距離が２５ｍｍ以下の成人向けに設計されている；および
ＸＬ＋プローブ、特大：皮膚から肝被膜までの距離が３５ｍｍを超える体重の重い成人向けに設計されている。
Ｍ＋プローブ、中型：皮膚から肝被膜までの距離が２５ｍｍ以下の成人向けに設計されている；および
ＸＬ＋プローブ、特大：皮膚から肝被膜までの距離が３５ｍｍを超える体重の重い成人向けに設計されている。
通常、非侵襲性肝線維症（硬度）はＶＣＴＥ（商標）によって測定することができ、非侵襲性肝臓脂肪変性はＣＡＰ（商標）によって測定することができる。ＦｉｂｒｏＳｃａｎ（登録商標）を使用すると、硬度（ｋＰａ）とＣＡＰ（ｄＢ／ｍ）測定を同時に測定することができる。スキャンのＳ、Ｍ、およびＸＬプローブは、患者のあらゆる形態に適合する。ＣＡＰは、脂肪変性を非侵襲的に評価および定量化するためのツールである。ＣＡＰは、超音波減衰の尺度であり、超音波が肝臓を伝播する際の超音波の振幅の減少に対応する。ＣＡＰは： ＣＡＰと肝硬度が、同じ肝臓容積で同時に測定されること；ＣＡＰが、１メートルあたりのデシベル（ｄＢ／ｍ）で表されること；
を確保するＶＣＴＥに基づく高度なガイダンスプロセスにより強化される。
を確保するＶＣＴＥに基づく高度なガイダンスプロセスにより強化される。
肝臓脂肪変性は、公表されているＣＡＰカットオフ：軽度脂肪変性２４８～２６７ｄＢ／ｍ、中等度脂肪変性２６８～２７９ｄＢ／ｍ、および重度脂肪変性≧２８０ｄＢ／ｍ、によって等級付けされる（Ｋａｒｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；６６：１０２２－１０３０）（２０１７年））。
進行肝線維症は、軽度、中等度、または重度の肝臓脂肪変性の有無にかかわらず検出される場合がある。表１は、軽度、中等度、または重度の肝臓脂肪変性を有する対象において進行肝線維症が検出されたことを示している。
Ｃ．進行肝線維症のバイオマーカーとしての循環ＴＳＰ２
対象におけるＴＳＰ２の循環レベルは、対象における進行肝線維症の存在を検出するため、または対象における進行肝線維症を発症するリスクを検出するために使用され得る。
対象におけるＴＳＰ２の循環レベルは、対象における進行肝線維症の存在を検出するため、または対象における進行肝線維症を発症するリスクを検出するために使用され得る。
１．進行肝線維症を検出するためのＴＳＰ２
ＴＳＰ２の循環レベルは、最初の評価で進行肝線維症（Ｆ３線維症以上）の存在と有意な関連性を示す。
ＴＳＰ２の循環レベルは、最初の評価で進行肝線維症（Ｆ３線維症以上）の存在と有意な関連性を示す。
ＴＳＰ２の循環レベルが約２ｎｇ／ｍｌ以上である場合、ＴＳＰ２の循環レベルは通常、進行肝線維症の存在または発症リスクについての情報となる。典型的には、ＴＳＰ２の循環レベルは、ナノグラム／ｍｌスケールでＴＳＰ２を検出するアッセイで測定される。対象から採取されたサンプル中のＴＳＰ２の循環レベルは、約０．２ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌの間の範囲であり得る。
ＴＳＰ２の循環レベルは、通常、既存の進行肝線維症のバイオマーカーであり、対象からのサンプル中のＴＳＰ２の循環レベルが、約３．６ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌとの間など、約３．６ｎｇ／ｍｌを超える場合に、進行肝線維症を検出する。典型的には、対象からのサンプル中のＴＳＰ２の循環レベルが約３．６ｎｇ／ｍｌを超えている場合、ＴＳＰ２の循環レベルは、約８０％以上の感度、約６０％以上の特異性、および約９０％以上の陰性的中率で進行肝線維症を検出することができる。
他の生理学的および／または放射線撮影のバイオマーカーと組み合わせると、検出の感度は約８０％以上となり、特異性は約８０％以上となり得る。ＴＳＰ２の循環レベルを肥満指数（ＢＭＩ）および血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）と組み合わせた場合、ＴＳＰ２の循環レベルは、約８０％以上の感度および約８０％以上の特異性で進行肝線維症を検出することができる。
２型糖尿病の対象において、約３．６ｎｇ／ｍｌのＴＳＰ２の循環レベルは、進行肝線維症を検出するためのカットオフ値である可能性がある。２型糖尿病の対象において、ＴＳＰ２の循環レベルが約３．６ｎｇ／ｍｌ以上である場合、進行肝線維症を患っている可能性がある。
２．進行肝線維症の発症リスクに対するＴＳＰ２
最初の評価でのＴＳＰ２の循環レベルは、肝線維化の進行と有意な関連性も示しており、経時的に進行肝線維症（Ｆ３線維症以上）を発症するリスクを検出するために使用することができる。
最初の評価でのＴＳＰ２の循環レベルは、肝線維化の進行と有意な関連性も示しており、経時的に進行肝線維症（Ｆ３線維症以上）を発症するリスクを検出するために使用することができる。
ＴＳＰ２の循環レベルは、典型的に、進行肝線維症の発症リスクを予測するのに有利である。典型的には、ＴＳＰ２の循環レベルは、ナノグラム／ｍｌスケールでＴＳＰ２を検出する方法で測定される。
典型的には、経時的に進行肝線維症を発症するリスクを検出することには、ＴＳＰ２バイオマーカーの循環レベルを測定し、進行肝線維症を発症するリスクを検出することが含まれる。典型的には、対象は、ｎｇ／ｍｌで測定される対数変換された血清ＴＳＰ２レベルにおける単位増加あたり、経時的に進行肝線維症を発症するリスクが２．８２倍高くなる。典型的には、この期間は、対象からサンプルを入手してから、サンプル中のＴＳＰ２の循環レベルを測定してから、またはその両方から約０．１年から約３年の間である。
他の生理学的なおよび／または放射線撮影のバイオマーカーと組み合わせると、進行肝線維症の発症リスクの検出がより正確になる。例えば、ＴＳＰ２の循環レベルを肥満指数（ＢＭＩ）、血小板数、ＣＡＰ値と組み合わせると、ＴＳＰ２の循環レベルによってより高いＮＲＩおよびＩＤＩで進行肝線維症を発症するリスクを検出することができる。
メタボリックシンドローム、２型糖尿病、心血管疾患（ＣＶＤ）、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の疾患のうちの一つ以上を有する可能性のある対象において、本願方法は、患者において経時的に進行肝線維症を発症するリスクを検出することができる。
３．対象
開示された方法から恩恵を受ける対象はヒトである。対象は、健康であるか、または病気、障害、または状態に苦しんでいる、またはそれらにかかりやすいである場合もある。
開示された方法から恩恵を受ける対象はヒトである。対象は、健康であるか、または病気、障害、または状態に苦しんでいる、またはそれらにかかりやすいである場合もある。
対象は病気に罹っていない場合もある。対象は、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、ＣＶＤ、およびＣＫＤのうちの一つまたは複数の疾患を患っている場合もある。対象は、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、脂質異常症、および高血圧のうちの一つ以上を伴うメタボリックシンドロームを有する場合もある。対象は、糖尿病、肝疾患、または糖尿病と肝疾患の組み合わせを患っている場合もある。対象は２型糖尿病を患っている場合もある。対象はＮＡＦＬＤを患っている場合もある。対象は２型糖尿病およびＮＡＦＬＤを患っている場合もある。対象はＮＡＳＨを患っている場合もあれば、持っていない場合もある。
ＩＩＩ．ＴＳＰ２の測定方法
Ａ．測定用アッセイ
１．アフィニティークロマトグラフィー
ＴＳＰ２の循環レベルは、ＴＳＰ２リガンドまたは対ＴＳＰ２抗体が固定化された樹脂またはカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって検出され得る。標的タンパク質ＴＳＰ２は通常、サンプルまたは希釈サンプルがカラムを通過する際に吸着され、他の物質は洗い流される。その後、標的物質が溶出され、従来の実験条件を逆転させることで分析に利用可能になる。
Ａ．測定用アッセイ
１．アフィニティークロマトグラフィー
ＴＳＰ２の循環レベルは、ＴＳＰ２リガンドまたは対ＴＳＰ２抗体が固定化された樹脂またはカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって検出され得る。標的タンパク質ＴＳＰ２は通常、サンプルまたは希釈サンプルがカラムを通過する際に吸着され、他の物質は洗い流される。その後、標的物質が溶出され、従来の実験条件を逆転させることで分析に利用可能になる。
ＴＳＰ２は、ＴＧＦ－β－１、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＴＳＧ６、ヘパリン、ＭＭＰ－２、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンなどの細胞外マトリックスリガンドに結合する。ＴＳＰ２は、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＬＤＬ受容体関連タンパク質－１（カルレティキュリン経由）、インテグリンα－Ｖ／β－３、α－４／β－１、およびα－６／β－１を含む細胞表面受容体に結合する。クロマトグラフィーカラムには、ＴＳＰ２を捕捉するための抗体または抗体結合断片も含まれる場合がある。これらのリガンドのいずれか１つ以上は、ＴＳＰ２の捕捉および精製のためのアフィニティークロマトグラフィーで使用される捕捉試薬または捕捉試薬のセットであり得る。
カラムから分離され溶出されると、ＴＳＰ２の濃度は、標準的なタンパク質定量アッセイを使用して検出することができる。
２．イムノアッセイ
ＴＳＰ２の循環レベルを測定するための本方法にはイムノアッセイを含み、バイオマーカーのポリペプチドが、バイオマーカー特異的抗体、抗体結合断片、異なる抗体の組み合わせ、または異なる抗体結合断片の組み合わせとの相互作用によって評価または検出される。バイオマーカーは、定性的または定量的な方法で検出することができる。バイオマーカーのポリペプチドおよびタンパク質の検出に使用できる例示的なイムノアッセイには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降アッセイ、ウェスタンブロット、蛍光イムノアッセイ、および免疫組織化学、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気捕捉、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、および光退色後の蛍光回復／局在化（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）が含まれるが、これらに限定されない。
ＴＳＰ２の循環レベルを測定するための本方法にはイムノアッセイを含み、バイオマーカーのポリペプチドが、バイオマーカー特異的抗体、抗体結合断片、異なる抗体の組み合わせ、または異なる抗体結合断片の組み合わせとの相互作用によって評価または検出される。バイオマーカーは、定性的または定量的な方法で検出することができる。バイオマーカーのポリペプチドおよびタンパク質の検出に使用できる例示的なイムノアッセイには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降アッセイ、ウェスタンブロット、蛍光イムノアッセイ、および免疫組織化学、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気捕捉、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、および光退色後の蛍光回復／局在化（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）が含まれるが、これらに限定されない。
一部のイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡでは、二つの異なるバイオマーカーに特異的な抗体または二つの異なるリガンド（例えば、捕捉リガンドまたは抗体、および検出リガンドまたは抗体）が必要となる場合がある。特定の実施形態において、タンパク質バイオマーカーは表面上のリガンドまたは抗体で捕捉され、タンパク質バイオマーカーは酵素で標識される。一つの例では、ビオチンまたはストレプトアビジンに結合した検出抗体を使用して、ビオチンまたはストレプトアビジンを含む酵素へのビオチン－ストレプトアビジン結合を作製することができる。酵素基質が着色分子に変換されることによってシグナルが生成され、光センサーで吸光度を測定することで溶液の色の強度が定量化される。アッセイでは、タンパク質バイオマーカーの存在を示すために観察可能な色の変化を生成する発色レポーターおよび基質を利用する場合がある。蛍光発生、電気化学発光、およびリアルタイムＰＣＲレポーターも、定量可能なシグナルを生成するために検討されている。
いくつかのアッセイは、抗体をサンプルと接触させる前に、洗浄およびその後の複合体の単離を容易にするために、１つ以上の抗体を固体支持体に固定することを随意に含む。固体支持体の例としては、例えば、マイクロタイタープレート、スティック、ビーズ、またはマイクロビーズの形態のガラスまたはプラスチックが挙げられる。抗体は、プローブ、基板、またはＰＲＯＴＥＩＮＣＨＩＰ（登録商標）アレイに結合させることもできる。
フローサイトメトリーはレーザーベースの技術であって、液体の流れの中に粒子を懸濁し、電子検出装置を通過させることによって、タンパク質バイオマーカーの計数、分類、および検出に使用できる。フローサイトメーターには、色に基づいてさまざまな粒子を識別する機能がある。二つ以上の異なる波長で発光する、異なる染料による粒子の示差的染色により、粒子を区別することができる。ＦＬＯＷＭＥＴＲＩＸ（商標）などの多重分析は、Ｆｕｌｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３（９）：１７４９－１７５６（１９９７）で説明されており、同じサンプルを使用して単一のチューブ内で複数の個別のアッセイを同時に実行することができる。
いくつかの特定の実施形態において、バイオマーカーレベルは、ＬＵＭＩＮＥＸ ＸＭＡＰ（登録商標）テクノロジーを使用して測定される。ＬＵＭＩＮＥＸ ＸＭＡＰ（登録商標）は、従来のＥＬＩＳＡ技術とよく比較され、従来のＥＬＩＳＡ技術は単一の分析物のみを測定できるという限界がある。ＥＬＩＳＡとＬＵＭＩＮＥＸ ＸＭＡＰ（登録商標）テクノロジーの違いは、主に捕捉抗体の支持体にある。従来のＥＬＩＳＡとは異なり、ＬＵＭＩＮＥＸ ＸＭＡＰ（登録商標）の捕捉抗体は、ビーズ表面に共有結合しているため、より大きな表面積、ならびにマトリックスまたは自由溶液／液体環境が分析対象物と反応することが効果的に可能になる。懸濁ビーズにより、シングルプレックスまたはマルチプレックス形式でのアッセイのフレキシビリティが可能になる。
ＬＵＭＩＮＥＸ ＸＭＡＰ（登録商標）テクノロジーを含む市販のフォーマットには、例えば、単一サンプル内で最大１００の異なるアッセイを多重化できるＢＩＯ－ＰＬＥＸ（登録商標）マルチプレックスイムノアッセイシステムが含まれる。この技術には、二つの蛍光染料を異なる比率で使用して作成された明確に色分けされた１００個のビーズセットが含まれる。これらのビーズは、特定のバイオアッセイに特異的な試薬とさらに結合させることができる。試薬には、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素基質、または受容体が含まれる。この技術により、特定の分析物に対する一つの抗体を同じ色のビーズのセットに結合させ、分析物に対する第２の抗体を蛍光レポーター色素ラベルに結合させるマルチプレックスイムノアッセイが可能になる。異なる色のビーズを使用することによって、同じサンプル内の他の多くの分析物の同時マルチプレックス検出が可能になる。二重検出のフローサイトメーターは、一つのチャネルでビーズの色によって異なるアッセイを分類し、もう一つのチャネルでレポーター色素の蛍光を測定することで分析対象物の濃度を判定するために使用できる。
いくつかの特定の実施形態において、バイオマーカーレベルは、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ’ｓ ＳＩＭＯＡ（商標）テクノロジーを使用して測定される。ＳＩＭＯＡ（商標）テクノロジー（単一分子アレイ：single molecule arrayにちなんで命名）は、標準的なＥＬＩＳＡ試薬を使用した常磁性ビーズ上の個々の免疫複合体の単離に基づく。Ｓｉｍｏａと従来のイムノアッセイの主な違いは、フェムトリットルサイズのウェルに単一分子を捕捉する能力にあり、個々のビーズの「デジタル」読み取りを可能にし、標的分析物に結合しているか否かを判定できる。この技術のデジタル的な性質により、ＣＶが１０％未満である従来のアッセイと比較して平均１０００倍の感度向上が可能である。市販のＳＩＭＯＡ（商標）のテクノロジープラットフォームは、さまざまな分析物パネル（analyte panels）で最大１０プレックスの多重化のオプションを提供し、アッセイを自動化することできる。
実験を多重化は、大量のデータが生成し得る。したがって、いくつかの実施形態において、データ収集設定、編成、および解釈を自動化および制御するためにコンピュータシステムが利用される。
典型的には、ＴＳＰ２を検出するためのアッセイには、約０．０１ｎｇ／ｍｌ～約０．１８ｎｇ／ｍｌの間、例えば約０．０１ｎｇ／ｍｌ～約０．１６ｎｇ／ｍｌの間、または約０．１５６ｎｇ／ｍｌなどの最低検出限界でのイムノアッセイが含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＳＰ２を検出するためのアッセイは、それぞれ４．６％未満および７．２％未満のアッセイ内およびアッセイ間の精度を有する。
３．対照
一つ以上のバイオマーカーを分析することを含む方法は、通常、対照と比較することを含む。例えば、対象から収集したサンプル中で検出されたバイオマーカーのレベルを対照と比較することができる。適切な対照は当業者に知られているであろう。対照には、例えば、疾患または障害のない対象などの健康な対象、または同じ対象からの非罹患組織から得られた標準が含まれ得る。対照は、同じアッセイを使用した同様の個人の単一値、プール値、または平均値とすることができる。参照指数は、既知の疾患の重症度または予後が異なる疾患または障害と診断された対象を使用することによって確立できる。
一つ以上のバイオマーカーを分析することを含む方法は、通常、対照と比較することを含む。例えば、対象から収集したサンプル中で検出されたバイオマーカーのレベルを対照と比較することができる。適切な対照は当業者に知られているであろう。対照には、例えば、疾患または障害のない対象などの健康な対象、または同じ対象からの非罹患組織から得られた標準が含まれ得る。対照は、同じアッセイを使用した同様の個人の単一値、プール値、または平均値とすることができる。参照指数は、既知の疾患の重症度または予後が異なる疾患または障害と診断された対象を使用することによって確立できる。
Ｂ．肝線維症検出の感度と特異性
感度は、正しく識別される実際の陽性者の割合であるパーセンテージとして表すことができる（例えば、進行肝線維症であると検査によって正確に識別される、進行肝線維症を有する対象の割合）。感度の高い検査では、偽陰性、つまり、進行肝線維症を有しているにもかかわらず、検査によって進行肝線維症であると識別されないケースの割合が低い。一般に、開示されたアッセイおよび方法は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の感度を有する。
感度は、正しく識別される実際の陽性者の割合であるパーセンテージとして表すことができる（例えば、進行肝線維症であると検査によって正確に識別される、進行肝線維症を有する対象の割合）。感度の高い検査では、偽陰性、つまり、進行肝線維症を有しているにもかかわらず、検査によって進行肝線維症であると識別されないケースの割合が低い。一般に、開示されたアッセイおよび方法は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の感度を有する。
特異性は、正しく識別される実際の陰性の割合であるパーセンテージとして表すことができる（例えば、進行性肝線維症を有さないと検査によって正確に識別される、進行性肝線維症を有さない対象の割合）。特異性の高い検査では、偽陽性、つまり、進行肝線維症を有していないにもかかわらず、検査によって進行肝線維症が示唆される患者の割合が低い。一般に、開示された方法は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の特異性を有する。
陽性的中率と陰性的中率は、検査の対象集団における病気の有病率に影響される。有病率が高い環境では、有病率が低い集団で検査を実施した場合よりも、検査で陽性となった人が本当に病気を患っている可能性が高くなる。
典型的には、対象からのサンプル中のＴＳＰ２の循環レベルが約３．６ｎｇ／ｍｌより大きい場合に、本方法は、約８０％以上の感度、約６０％以上の特異性、および約９０％以上の陰性的中率で進行肝線維症を検出する。
ＩＶ．ＴＳＰ２測定用のキット
ＴＳＰ２に対する結合特異性を有する捕捉試薬のセットは、開示された方法を実行するか、またはその実行を補助するのに有用なキットとして、任意の適切な組み合わせで一緒にパッケージ化され得る。所与のキット内のキット構成要素が、開示された方法で一緒に使用するように設計および適合されば有用である。
ＴＳＰ２に対する結合特異性を有する捕捉試薬のセットは、開示された方法を実行するか、またはその実行を補助するのに有用なキットとして、任意の適切な組み合わせで一緒にパッケージ化され得る。所与のキット内のキット構成要素が、開示された方法で一緒に使用するように設計および適合されば有用である。
例えば、１セット以上の捕捉試薬を備えたキットが開示される。キットには、希釈バッファー、サンプルバッファー、対照試薬、溶出試薬、および検出試薬が含まれる場合がある。キットには、ＴＳＰ２の捕捉、溶出、および検出のための基質が含まれていてもよい。キットには、ＴＳＰ２の捕捉および検出のための基質が含まれていてもよい。キットには、使用説明書が含まれる場合がある。
実施例１．２型糖尿病を伴う非アルコール性脂肪性肝疾患における進行線維症の診断および予後マーカーとしての血清ＴＳＰ２レベル
研究デザインと方法
研究参加者
すべての参加者は、香港のクイーン・メアリー病院の糖尿病クリニックで定期的に追跡調査を受けている患者で構成される香港西糖尿病ＮＡＦＬＤコホートから募集された。２０１７年１月以来糖尿病合併症スクリーニングに参加していた２１歳から８０歳の中国人である処置継続患者は、２型糖尿病におけるＮＡＦＬＤ線維症進行の危険因子を特定することを目的とした前向き研究に招待された。定期的な間隔で肝臓脂肪変性と線維症を評価するためにＶＣＴＥが使用された。活動性悪性腫瘍、付随の慢性Ｂ型またはＣ型肝炎、または、α－１抗トリプシン欠乏症、ウィルソン病、自己免疫性肝炎、薬物性肝障害、および原発性胆汁性胆管炎を含む他の肝疾患の記録がある病歴を有する患者、または、アミオダロン、メトトレキサート、またはタモキシフェンなどの脂肪生成薬を連用している患者を、除外した。さらに、毎日のアルコール消費量が男性の場合３０ｇ、女性の場合２０ｇを超える患者も除外した（Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；６７：３２８－３５７（２０１８））。本研究プロトコールは、香港大学／病院当局香港西クラスター（Hospital Authority Hong Kong West Cluster）の施設内審査委員会によって承認された。研究に関する手術の前に、募集された参加者全員から書面によるインフォームドコンセントが得られた。
研究デザインと方法
研究参加者
すべての参加者は、香港のクイーン・メアリー病院の糖尿病クリニックで定期的に追跡調査を受けている患者で構成される香港西糖尿病ＮＡＦＬＤコホートから募集された。２０１７年１月以来糖尿病合併症スクリーニングに参加していた２１歳から８０歳の中国人である処置継続患者は、２型糖尿病におけるＮＡＦＬＤ線維症進行の危険因子を特定することを目的とした前向き研究に招待された。定期的な間隔で肝臓脂肪変性と線維症を評価するためにＶＣＴＥが使用された。活動性悪性腫瘍、付随の慢性Ｂ型またはＣ型肝炎、または、α－１抗トリプシン欠乏症、ウィルソン病、自己免疫性肝炎、薬物性肝障害、および原発性胆汁性胆管炎を含む他の肝疾患の記録がある病歴を有する患者、または、アミオダロン、メトトレキサート、またはタモキシフェンなどの脂肪生成薬を連用している患者を、除外した。さらに、毎日のアルコール消費量が男性の場合３０ｇ、女性の場合２０ｇを超える患者も除外した（Ｃｈａｌａｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；６７：３２８－３５７（２０１８））。本研究プロトコールは、香港大学／病院当局香港西クラスター（Hospital Authority Hong Kong West Cluster）の施設内審査委員会によって承認された。研究に関する手術の前に、募集された参加者全員から書面によるインフォームドコンセントが得られた。
２型糖尿病における循環ＴＳＰ２レベルとＮＡＦＬＤの関係を評価した本研究には、ベースラインに肝臓脂肪変性を有し、２０１７年１月から２０２０年６月までに募集された参加者のみ含まれた。さらに、循環ＴＳＰ２レベルと肝線維症の進行との予想される関連性を調べる解析には、ベースラインに進行した線維症または肝硬変を有していなかった参加者のみが含まれた。肝臓脂肪変性と線維症のレベルは、それぞれ、振動制御一過性エラストグラフィー（ＶＣＴＥ）での制御減衰パラメーター（ＣＡＰ）と肝硬度（ＬＳ）の測定によって定義された。
臨床的および生化学的評価
糖尿病クリニックのすべての患者は、通常の臨床管理の一環として定期的に合併症の評価を受けた。これは、血糖コントロール、心血管の危険因子、および糖尿病合併症の存在を確認するためである。体重（ＢＷ）、身長（ＢＨ）、肥満指数（ＢＭＩ）、腹囲（ＷＣ）、血圧（ＢＰ）などの人体測定のパラメータが測定された。血漿グルコース、脂質、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、全血球計算、肝機能および腎機能の検査のために空腹時血液が採取された。アルブミン尿の状態はランダムな尿サンプルで評価され、尿中のアルブミンとクレアチニンの比（＜３０ｍｇ／ｇ［Ａ１］、≧３０～＜３００ｍｇ／ｇ［Ａ２］、および≧３００ｍｇ／ｇ［Ａ３］）によって分類された。さらに、すべての患者は眼科医による定期的な網膜写真および／または評価を受けた。ＮＡＦＬＤコホート研究への参加に同意した人については、喫煙状況、アルコール消費量、詳細な病歴、薬物歴、および家族歴が標準化されたアンケートを使用して取得され、プロトロンビン時間も確認された。さらに、新たなＮＡＦＬＤバイオマーカーのアッセイのために、空腹時の血液をアリコートに分けて－７０℃で保存した。
糖尿病クリニックのすべての患者は、通常の臨床管理の一環として定期的に合併症の評価を受けた。これは、血糖コントロール、心血管の危険因子、および糖尿病合併症の存在を確認するためである。体重（ＢＷ）、身長（ＢＨ）、肥満指数（ＢＭＩ）、腹囲（ＷＣ）、血圧（ＢＰ）などの人体測定のパラメータが測定された。血漿グルコース、脂質、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、全血球計算、肝機能および腎機能の検査のために空腹時血液が採取された。アルブミン尿の状態はランダムな尿サンプルで評価され、尿中のアルブミンとクレアチニンの比（＜３０ｍｇ／ｇ［Ａ１］、≧３０～＜３００ｍｇ／ｇ［Ａ２］、および≧３００ｍｇ／ｇ［Ａ３］）によって分類された。さらに、すべての患者は眼科医による定期的な網膜写真および／または評価を受けた。ＮＡＦＬＤコホート研究への参加に同意した人については、喫煙状況、アルコール消費量、詳細な病歴、薬物歴、および家族歴が標準化されたアンケートを使用して取得され、プロトロンビン時間も確認された。さらに、新たなＮＡＦＬＤバイオマーカーのアッセイのために、空腹時の血液をアリコートに分けて－７０℃で保存した。
ＮＡＦＬＤ線維症スコア（ＮＦＳ）および線維症４指数（Fibrosis-4 index:ＦＩＢ－４）を含む従来の線維症スコアは、公表されている式を使用して決定され、推奨されるカットオフに基づいて分類された（Ｖｉｌａｒ－Ｇｏｍｅｚ ａｎｄ Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；６８：３０５－３１５（２０１８））。
ＴＳＰ２レベルの測定
血清ＴＳＰ２レベルは、ヒトＴＳＰ２の特異的な部位を認識する一対のモノクローナル抗体を使用して、ヒトＴＳＰ－２の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キットで測定した（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，香港大学）。使用した抗体はＩｇＧであった。このアッセイでは、血清サンプルを２倍希釈した。二次抗体はビオチン標識されている。
血清ＴＳＰ２レベルは、ヒトＴＳＰ２の特異的な部位を認識する一対のモノクローナル抗体を使用して、ヒトＴＳＰ－２の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キットで測定した（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，香港大学）。使用した抗体はＩｇＧであった。このアッセイでは、血清サンプルを２倍希釈した。二次抗体はビオチン標識されている。
アッセイはヒトＴＳＰ２に対して高度に特異的であり、ヒトＴＳＰ１、ＴＳＰ３、ＴＳＰ４およびＴＳＰ５に対して交差反応性を示さなかった。最も低い検出限界は０．１５６ｎｇ／ｍｌで、アッセイ内およびアッセイ間の精度はそれぞれ＜４．６％および＜７．２％であった。
振動制御一過性エラストグラフィー
すべての参加者はベースラインにＶＣＴＥを受け、その後は再評価のために１２～１８か月ごとにＶＣＴＥを受けた。ＶＣＴＥは少なくとも８時間の絶食後に実施された。ＣＡＰとＬＳは、５００件を超える測定の経験を持つ２人のオペレーターによって、Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（登録商標）（Ｅｃｈｏｓｅｎｓ、パリ、フランス）を使用して測定された。評価者間信頼性は、ＣＡＰの０．９８、ＬＳの０．９７であるクラス内相関に反映されるように、満足のいくものであった。ＣＡＰとＬＳは両方とも、四分位数範囲が３０％未満で成功率が６０％を超える場合として定義される、１０件の信頼できる測定値の中央値で表された。結果の妥当性を保証するために、四分位数範囲が４０ｄＢ／ｍ以上のＣＡＰ値のみが使用された（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；６７：５７７－５８４（２０１７））。最初の試行ではすべての検査がＭプローブを使用して行われ、ＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２を超える場合はＸＬプローブが使用された。
すべての参加者はベースラインにＶＣＴＥを受け、その後は再評価のために１２～１８か月ごとにＶＣＴＥを受けた。ＶＣＴＥは少なくとも８時間の絶食後に実施された。ＣＡＰとＬＳは、５００件を超える測定の経験を持つ２人のオペレーターによって、Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（登録商標）（Ｅｃｈｏｓｅｎｓ、パリ、フランス）を使用して測定された。評価者間信頼性は、ＣＡＰの０．９８、ＬＳの０．９７であるクラス内相関に反映されるように、満足のいくものであった。ＣＡＰとＬＳは両方とも、四分位数範囲が３０％未満で成功率が６０％を超える場合として定義される、１０件の信頼できる測定値の中央値で表された。結果の妥当性を保証するために、四分位数範囲が４０ｄＢ／ｍ以上のＣＡＰ値のみが使用された（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；６７：５７７－５８４（２０１７））。最初の試行ではすべての検査がＭプローブを使用して行われ、ＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２を超える場合はＸＬプローブが使用された。
肝臓脂肪変性は、公表されているＣＡＰカットオフ：軽度の脂肪変性２４８～２６７ｄＢ／ｍ、中等度の脂肪変性２６８～２７９ｄＢ／ｍ、および重度の脂肪変性≧２８０ｄＢ／ｍ、によって等級付けされた（Ｋａｒｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；６６：１０２２－１０３０（２０１７））。進行線維症（Ｆ３）および肝硬変（Ｆ４）はＬＳカットオフ：Ｆ３が９．６～１１．４ｋＰａおよびＦ４≧１１．５ｋＰａ（Ｍプローブ）；Ｆ３が９．３－１０．９ｋＰａおよびＦ４≧１１．０ｋＰａ（ＸＬプローブ）、によって等級付けされた（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ；６５：１３５９－１３６８（２０１６））。線維症の進行は、２０２０年１２月３１日の時点でＶＣＴＥの再評価によるＦ３以上の線維症（つまり、進行した線維症または肝硬変）の発症として定義された。
臨床変数の定義
中心性肥満は、女性ではＷＣ≧８０ｃｍ、男性では≧９０ｃｍと定義された。高血圧は、血圧１４０／９０ｍｍＨｇ以上、または降圧薬を服用している場合と定義された。脂質異常症は、空腹時トリグリセリド（ＴＧ）≧１５０ｍｇ／ｄＬ、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）が男性の場合４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性の場合＜５０ｍｇ／ｄＬ未満、および低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）≧１００ｍｇ／ｄＬ、または脂質低下剤を服用している場合と定義された。冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）および脳卒中の診断は、国際疾病分類（ＩＣＤ－９）第９版の診断コード（ＣＨＤは４１０、３６．０１－１０、脳卒中は４３０－４３８）に基づいていた。
中心性肥満は、女性ではＷＣ≧８０ｃｍ、男性では≧９０ｃｍと定義された。高血圧は、血圧１４０／９０ｍｍＨｇ以上、または降圧薬を服用している場合と定義された。脂質異常症は、空腹時トリグリセリド（ＴＧ）≧１５０ｍｇ／ｄＬ、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）が男性の場合４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性の場合＜５０ｍｇ／ｄＬ未満、および低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）≧１００ｍｇ／ｄＬ、または脂質低下剤を服用している場合と定義された。冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）および脳卒中の診断は、国際疾病分類（ＩＣＤ－９）第９版の診断コード（ＣＨＤは４１０、３６．０１－１０、脳卒中は４３０－４３８）に基づいていた。
統計分析
すべてのデータは、Ｒのバージョン３．６．０（ＭａｔｃｈＩｔ Ｐａｃｋａｇｅ、二つの相関受信者動作特性曲線のＤｅＬｏｎｇのテスト）およびＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓのバージョン２６．０（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州、アーモンク）で分析された。血漿ＴＧ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＦＩＢ４およびＴＳＰ２レベルなど、コルモゴロフ・スミルノフ検定によって正規分布していないと判定されたデータは、分析前にほぼ正規性を得るために対数変換された。値は、必要に応じて、平均値±標準偏差（ＳＤ）、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの中央値（データが歪んでいる変数の場合）、またはパーセンテージとして報告された。カイ二乗検定とＡＮＯＶＡをそれぞれカテゴリ変数と連続変数の比較に使用した。最も低い赤池情報量基準（ＡＩＣ）のモデルに基づいて、Ｆ３以上の線維症の存在と発症の独立した決定要因を評価するために、多変量ロジスティック回帰分析が実行された。単変量解析で統計的に有意だった変数は、多変量ロジスティック回帰分析に含まれた。臨床危険因子を含む場合と含まない場合の、血清ＴＳＰ２の受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を決定し、ＤｅＬｏｎｇ法を使用してさまざまな臨床モデルのＡＵＲＯＣを比較した。Ｆ３以上の線維症の存在を特定するための血清ＴＳＰ２レベルの最適なカットオフは、ｙ＝［感度－（１－特異性）］のＲＯＣ曲線上の、Ｙｏｕｄｅｎｊインデックス（ｙ）が最大となる点に基づいて導出された。さまざまなモデルの予測パフォーマンスは、カテゴリーフリーのネット再分類改善（ＮＲＩ）と統合識別改善（ＩＤＩ）を使用してさらに評価された。すべての統計検定において、両側ｐ値＜０．０５が有意であるとみなされた。
すべてのデータは、Ｒのバージョン３．６．０（ＭａｔｃｈＩｔ Ｐａｃｋａｇｅ、二つの相関受信者動作特性曲線のＤｅＬｏｎｇのテスト）およびＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓのバージョン２６．０（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州、アーモンク）で分析された。血漿ＴＧ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＦＩＢ４およびＴＳＰ２レベルなど、コルモゴロフ・スミルノフ検定によって正規分布していないと判定されたデータは、分析前にほぼ正規性を得るために対数変換された。値は、必要に応じて、平均値±標準偏差（ＳＤ）、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの中央値（データが歪んでいる変数の場合）、またはパーセンテージとして報告された。カイ二乗検定とＡＮＯＶＡをそれぞれカテゴリ変数と連続変数の比較に使用した。最も低い赤池情報量基準（ＡＩＣ）のモデルに基づいて、Ｆ３以上の線維症の存在と発症の独立した決定要因を評価するために、多変量ロジスティック回帰分析が実行された。単変量解析で統計的に有意だった変数は、多変量ロジスティック回帰分析に含まれた。臨床危険因子を含む場合と含まない場合の、血清ＴＳＰ２の受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を決定し、ＤｅＬｏｎｇ法を使用してさまざまな臨床モデルのＡＵＲＯＣを比較した。Ｆ３以上の線維症の存在を特定するための血清ＴＳＰ２レベルの最適なカットオフは、ｙ＝［感度－（１－特異性）］のＲＯＣ曲線上の、Ｙｏｕｄｅｎｊインデックス（ｙ）が最大となる点に基づいて導出された。さまざまなモデルの予測パフォーマンスは、カテゴリーフリーのネット再分類改善（ＮＲＩ）と統合識別改善（ＩＤＩ）を使用してさらに評価された。すべての統計検定において、両側ｐ値＜０．０５が有意であるとみなされた。
結果
血清ＴＳＰ２レベルは、２型糖尿病におけるＦ３以上の線維症の存在と有意に関連していた
この研究に含まれた２型糖尿病とＮＡＦＬＤを患う８２０人の参加者のうち、１３８人（１６．８％）がベースラインでＦ３以上の線維症を患っていた。表１は、研究参加者のベースライン特性をまとめたものである。Ｆ３以上の線維症を有する参加者は、そうでない参加者に比べて有意に若く、ＢＭＩ、ＷＣ、血清ＴＧ、ＡＬＴ、ＡＳＴが高く、ＨＤＬ－Ｃレベルと血小板数が低かった。さらに、糖尿病の罹患期間は、Ｆ３以上の線維症を有さない患者に比べて、有意に短く、アルブミン尿の有病率が高かった。さらに、Ｆ３以上の線維症の参加者は、そうでない参加者よりもＣＡＰ、ＮＦＳ、ＦＩＢ４の値が有意に高かった（ＣＡＰ：３３９ｄＢ／ｍ対２９９ｄＢ／ｍ、ｐ＜０．００１；ＮＦＳ：－０．７５対－１．１３、ｐ＝０．００１；ＦＩＢ４：１．２６対１．０５、それぞれｐ＜０．００１）。注目すべきことに、血清ＴＳＰ２レベルの中央値は、Ｆ３以上の線維症を有する参加者では、そうでない参加者よりも有意に高かった（それぞれ４．１７ｎｇ／ｍｌ対２．３３ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．００１）。
血清ＴＳＰ２レベルは、２型糖尿病におけるＦ３以上の線維症の存在と有意に関連していた
この研究に含まれた２型糖尿病とＮＡＦＬＤを患う８２０人の参加者のうち、１３８人（１６．８％）がベースラインでＦ３以上の線維症を患っていた。表１は、研究参加者のベースライン特性をまとめたものである。Ｆ３以上の線維症を有する参加者は、そうでない参加者に比べて有意に若く、ＢＭＩ、ＷＣ、血清ＴＧ、ＡＬＴ、ＡＳＴが高く、ＨＤＬ－Ｃレベルと血小板数が低かった。さらに、糖尿病の罹患期間は、Ｆ３以上の線維症を有さない患者に比べて、有意に短く、アルブミン尿の有病率が高かった。さらに、Ｆ３以上の線維症の参加者は、そうでない参加者よりもＣＡＰ、ＮＦＳ、ＦＩＢ４の値が有意に高かった（ＣＡＰ：３３９ｄＢ／ｍ対２９９ｄＢ／ｍ、ｐ＜０．００１；ＮＦＳ：－０．７５対－１．１３、ｐ＝０．００１；ＦＩＢ４：１．２６対１．０５、それぞれｐ＜０．００１）。注目すべきことに、血清ＴＳＰ２レベルの中央値は、Ｆ３以上の線維症を有する参加者では、そうでない参加者よりも有意に高かった（それぞれ４．１７ｎｇ／ｍｌ対２．３３ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．００１）。
データは平均値±標準偏差または中央値（２５～７５パーセンタイル）として表された。
ＴＳＰ２はトロンボスポンジン２；ＢＭＩは肥満指数；ＷＣは胴囲；ＢＰは血圧；ＮＡＦＬＤは非アルコール性脂肪性肝疾患；ＧＬＰ１ｒＡはグルカゴン様ペプチド１受容体アゴニスト；ＳＧＬＴ２ｉはナトリウム－グルコース共輸送体２阻害剤；ＨｂＡ１ｃは糖化ヘモグロビン；ＨＤＬ－Ｃは高密度リポタンパク質コレステロール；ＬＤＬ－Ｃは低密度リポタンパク質コレステロール；ＴＧはトリグリセリド；ＡＬＴはアラニンアミノトランスフェラーゼ；ＡＳＴはアスパラギン酸トランスアミナーゼ；ｅＧＦＲは推定糸球体濾過率；ＣＡＰは制御された減衰パラメータ；ＮＦＳは非アルコール性脂肪性肝疾患の線維症スコア；ＦＩＢ４は線維症－４インデックス。
アルブミン尿は、尿中アルブミン対クレアチニン比≧３０ｍｇ／ｇとして定義され；ＨＤＬ／ＬＤＬ－Ｃのｍｍｏｌ／ｌからｍｇ／ｄＬへの換算係数は×３８．９；ＴＧのｍｍｏｌ／ｌからｍｇ／ｄＬへの菅さん係数は×８８．２である。
ベースライン臨床変数と研究参加者の血清ＴＳＰ２レベルの四分位数の増加との関連性を表２にまとめる。ベースラインＴＳＰ２レベルのより高い四分位数は、ベースラインでのより高いＢＭＩ（ｐ＜０．００１）、ＷＣ（ｐ＜０．００１）、収縮期血圧（ｐ＝０．０１）、血清ＨｂＡ１ｃ（ｐ＝０．００５）、ＴＧ（ｐ＝０．００１）、ＡＬＴ（ｐ＜０．００１）、ＡＳＴレベル（ｐ＜０．００１）、およびアルブミン尿の有病率（ｐ＜０．００１）と有意に関連するが、ベースラインでのより低いＨＤＬ－Ｃ（ｐ＝０．０２）、ｅＧＦＲ（ｐ＝０．００１）、アルブミン値（ｐ＜０．００１）、および血小板数（ｐ＝０．０２３）と有意に関連していた。さらに、ベースラインＴＳＰ２レベルのより高い四分位数は、肝臓脂肪変性（ＣＡＰについてｐ＜０．００１）および線維症（ＮＦＳ、ＦＩＢ４、およびＬＳ；すべてｐ＜０．００１）のより高い段階とも有意に関連していた。
ＴＳＰ２はトロンボスポンジン２；ＢＭＩは肥満指数；ＷＣは胴囲；ＢＰは血圧；ＨｂＡ１ｃは糖化ヘモグロビン；ＨＤＬ－Ｃは高密度リポタンパク質コレステロール；ＬＤＬ－Ｃは低密度リポタンパク質コレステロール；ＴＧはトリグリセリド；ＡＬＴはアラニンアミノトランスフェラーゼ；ＡＳＴはアスパラギン酸トランスアミナーゼ；ｅＧＦＲは推定糸球体濾過率；ＣＡＰは制御された減衰パラメータ；ＬＳは肝臓の硬直；ＮＦＳは非アルコール性脂肪性肝疾患の線維症スコア；ＦＩＢ４は線維症－４インデックス。アルブミン尿は、尿中アルブミン対クレアチニン比≧３０ｍｇ／ｇとして定義され；ＨＤＬ／ＬＤＬ－Ｃのｍｍｏｌ／ｌからｍｇ／ｄＬへの換算係数は×３８．９；ＴＧのｍｍｏｌ／ｌからｍｇ／ｄＬへの換算係数は×８８．２。年齢、ＢＭＩ、糖尿病の期間、血小板数、血清ＨＤＬ－Ｃ、ＴＧ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＡＰ、ＴＳＰ２レベルおよびアルブミン尿を含む多変量ロジスティック回帰分析が実行された。血清ＴＳＰ２レベルは、ＢＭＩ（ＯＲ １．１４、９５％ＣＩ １．０８－１．２０、ｐ＜０．００１）、並びに血清ＡＳＴ（ＯＲ ８．０１、９５％ＣＩ ４．１０－１５．６０、ｐ＜０．００１）およびＣＡＰ値（ＯＲ １．００８、９５％ＣＩ １．００２－１．０１４、ｐ＝０．０１）とともに、ベースラインでのＦ３以上の線維症の存在と独立して関連した（オッズ比 ＯＲ ５．１３、９５％ＣＩ ３．１６－８．３２、ｐ＜０．００１）（表３）。
分析に含まれる変数は、年齢、ＢＭＩ、糖尿病の期間、アルブミン尿、ＨＤＬ－Ｃ、ＴＧ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、血小板数、ＣＡＰおよびＴＳＰ２レベルであった。モデルの選択は赤池情報量規準に基づいて行われた。ＴＳＰ２はトロンボスポンジン２；ＢＭＩは肥満指数；ＨＤＬ－Ｃは高密度リポタンパク質コレステロール；ＴＧはトリグリセリド；ＡＬＴはアラニンアミノトランスフェラーゼ；ＡＳＴはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＣＡＰは制御された減衰パラメータ；ＯＲはオッズ比；９５％ＣＩは９５％信頼区間。アルブミン尿は、尿中アルブミン対クレアチニン比≧３０ｍｇ／ｇとして定義された。
ＢＭＩをＷＣに置き換えた場合でも結果は同様であった（ＴＳＰ２のＯＲ５．６７、９５％ＣＩ３．４９－９．２２、ｐ＜０．００１、ＷＣのＯＲ１．０６、９５％ＣＩ１．０４－１．０８、ｐ＜０．００１）。さらに、サブグループ分析では、血清ＴＳＰ２レベルとＦ３以上の線維症との関連は、ＮＦＳまたはＦＩＢ４のレベルに関係なく有意なままであったが、その関連は明らかに従来の非侵襲性線維症スコアが高い人でより強かった（表４）。
モデルにはＢＭＩ、ＡＳＴ、ＣＡＰが含まれる。
ＴＳＰ２はトロンボスポンジン－２；ＯＲはオッズ比；９５％ＣＩは９５％信頼区間；ＦＩＢ４は線維症－４指数；ＮＦＳは非アルコール性脂肪性肝疾患の線維症スコア；ＢＭＩは肥満指数；ＡＳＴはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＣＡＰは制御された減衰パラメータ。
ＶＣＴＥにおけるＦ３以上の線維症の存在を特定するための血清ＴＳＰ２の性能
次に、血清ＴＳＰ２レベルが、さらなる評価のために肝臓専門医への紹介が必要と思われる個人をＶＣＴＥにおいてＦ３以上の線維症を有する個人として特定するのに臨床的に有用か否かを検討した。ＶＣＴＥにおけるＦ３以上の線維症を示す血清ＴＳＰ２単独のＡＵＲＯＣは０．８０（９５％ＣＩ０．７６－０．８４）であった。注目すべきことに、Ｆ３以上の線維症の他の二つの独立した決定因子であるＢＭＩと血清ＡＳＴからなる臨床モデルに血清ＴＳＰ２レベルを加えると、ＡＵＲＯＣは０．８６（９５％ＣＩ、０．８３－０．８９）から０．８９（９５％ＣＩ０．８６－０．９２、ｐ＝０．０１）に有意に増加した（図１）。これには、ＮＲＩ（６０．７、９５％ＣＩ５３．１－７８．３、ｐ＜０．００１）とＩＤＩ（８．１、９５％ＣＩ５．０－１１．０、ｐ＜０．００１）の両方の大幅な改善が伴った。Ｆ３以上の線維症の存在を特定するために最適な血清ＴＳＰ２のカットオフ３．６ｎｇ／ｍｌを使用すると、感度８３．６％、特異性６４．５％、陽性的中率（ＰＰＶ）４４．３％、および陰性的中率（ＮＰＶ）９２．１％が得られた。
次に、血清ＴＳＰ２レベルが、さらなる評価のために肝臓専門医への紹介が必要と思われる個人をＶＣＴＥにおいてＦ３以上の線維症を有する個人として特定するのに臨床的に有用か否かを検討した。ＶＣＴＥにおけるＦ３以上の線維症を示す血清ＴＳＰ２単独のＡＵＲＯＣは０．８０（９５％ＣＩ０．７６－０．８４）であった。注目すべきことに、Ｆ３以上の線維症の他の二つの独立した決定因子であるＢＭＩと血清ＡＳＴからなる臨床モデルに血清ＴＳＰ２レベルを加えると、ＡＵＲＯＣは０．８６（９５％ＣＩ、０．８３－０．８９）から０．８９（９５％ＣＩ０．８６－０．９２、ｐ＝０．０１）に有意に増加した（図１）。これには、ＮＲＩ（６０．７、９５％ＣＩ５３．１－７８．３、ｐ＜０．００１）とＩＤＩ（８．１、９５％ＣＩ５．０－１１．０、ｐ＜０．００１）の両方の大幅な改善が伴った。Ｆ３以上の線維症の存在を特定するために最適な血清ＴＳＰ２のカットオフ３．６ｎｇ／ｍｌを使用すると、感度８３．６％、特異性６４．５％、陽性的中率（ＰＰＶ）４４．３％、および陰性的中率（ＮＰＶ）９２．１％が得られた。
ベースラインの血清ＴＳＰ２レベルは、２型糖尿病患者におけるＦ３以上の線維症の発症と独立して関連していた
ベースラインにＦ３以上の線維症がなかった６８２人の参加者のうち、２０１９年コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）のため復帰を拒否した９０人の参加者、さらなるＴＥを拒否した１７人、追跡調査ができなくなった１９人、死亡した６人、および再評価ＴＥの予定がなかった５９人を除くと、４９１人が研究期間中に再評価ＶＣＴＥを受けた。追跡調査中央値１．５年で、参加者４９１人中４３人（８．８％）がＦ３以上の線維症を発症した。
ベースラインにＦ３以上の線維症がなかった６８２人の参加者のうち、２０１９年コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）のため復帰を拒否した９０人の参加者、さらなるＴＥを拒否した１７人、追跡調査ができなくなった１９人、死亡した６人、および再評価ＴＥの予定がなかった５９人を除くと、４９１人が研究期間中に再評価ＶＣＴＥを受けた。追跡調査中央値１．５年で、参加者４９１人中４３人（８．８％）がＦ３以上の線維症を発症した。
Ｆ３以上の線維症を患った参加者は、そうでない参加者よりも有意に若く、ベースラインＢＭＩ、ＷＣ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＡＰ、およびＮＦＳレベルが高く、血清ＨＤＬ－Ｃおよび血小板数が低かった。重要なことに、Ｆ３以上の線維症を発症した参加者は、そうでない参加者よりもベースライン血清ＴＳＰ２レベルが有意に高かった（３．２１ｎｇ／ｍｌ対２．２９ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）（表５）。
データは平均値±標準偏差または中央値（２５～７５パーセンタイル）として表された。ＴＳＰ２はトロンボスポンジン２；ＢＭＩは肥満指数；ＷＣは胴囲；ＢＰは血圧；ＮＡＦＬＤは非アルコール性脂肪性肝疾患；ＧＬＰ１ｒＡはグルカゴン様ペプチド１受容体アゴニスト；ＳＧＬＴ２ｉはナトリウム－グルコース共輸送体２阻害剤；ＨｂＡ１ｃは糖化ヘモグロビン；ＨＤＬ－Ｃは高密度リポタンパク質コレステロール；ＬＤＬ－Ｃは低密度リポタンパク質コレステロール；ＴＧ、トリグリセリド；ＡＬＴはアラニンアミノトランスフェラーゼ；ＡＳＴはアスパラギン酸トランスアミナーゼ；ｅＧＦＲは推定糸球体濾過率；ＣＡＰは制御された減衰パラメータ；ＮＦＳは非アルコール性脂肪性肝疾患の線維症スコア；ＦＩＢ４は線維症－４インデックス。アルブミン尿は、尿中アルブミン対クレアチニン比≧３０ｍｇ／ｇとして定義され；ＨＤＬ／ＬＤＬ－Ｃのｍｍｏｌ／ｌからｍｇ／ｄＬへの換算係数は×３８．９；ＴＧのｍｍｏｌ／ｌからｍｇ／ｄＬへの換算係数は×８８．２。
ベースラインの年齢、ＢＭＩ、血清ＨＤＬ－Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、血小板、ＣＡＰおよびＴＳＰ２レベルからなる多変量ロジスティック回帰分析では、ベースラインの血清ＴＳＰ２レベルが、ベースラインＢＭＩ（ＯＲ１．１２、９５％ＣＩ１．０３－１．２１、ｐ＝０．００７）、血小板数（ＯＲ０．９９２、９５％ＣＩ０．９８７－０．９９８、ｐ＝０．０１）およびＣＡＰ値（ＯＲ１．０２、９５％ＣＩ１．０１－１．０３、ｐ＜０．００１）とともに、Ｆ３以上の線維症の発症と独立して関連（ＯＲ２．８２、９５％ＣＩ１．３７－５．７８、ｐ＝０．００５）していることが判明した（表６）。
分析に含まれる変数は、年齢、ＢＭＩ、ＨＤＬ－Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、血小板数、ＣＡＰ、およびＴＳＰ２レベルであった。モデルの選択は赤池情報量規準に基づいて行われた。
ＴＳＰ２はトロンボスポンジン２；ＢＭＩは肥満指数；ＨＤＬ－Ｃは高密度リポタンパク質コレステロール；ＡＬＴはアラニンアミノトランスフェラーゼ；ＡＳＴはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＣＡＰは制御された減衰パラメータ；ＯＲはオッズ比；９５％ＣＩは９５％信頼区間。
Ｆ３以上の線維症の発症を予測するＡＵＲＯＣは、ベースラインの循環ＴＳＰ２レベルを含めても著しく変化しなかったが（ＴＳＰ２有りのモデルと無しのモデルでそれぞれ０．８３７対０．８１６、ｐ＝０．１９）、ベースラインのＢＭＩ、血小板数、およびＣＡＰ値からなる臨床モデルにベースライン循環ＴＳＰ２レベルを加えた後のＮＲＩ（３７．３、９５％ＣＩ６．４－６８．１、ｐ＝０．０２）およびＩＤＩ（２．２、９５％ＣＩ０．１－４．４、ｐ＝０．０４５）の両方のモデルで有意な改善が見られた。
この研究は、横断的アプローチと前向きアプローチの両方に基づいて、ＮＡＦＬＤにおける線維症バイオマーカーとしての循環ＴＳＰ２レベルの臨床的関連性を実証した。血清ＴＳＰ２レベルはＦ３以上の線維症の存在と関連しており、ＮＡＦＬＤと２型糖尿病を併発する患者における進行した線維症の発症の独立した予測因子でもあることが観察された。
ＴＳＰ２の遺伝子であるＴＨＢＳ２は、病因とは無関係に肝線維症に特に関連する五つの優先遺伝子の中で同定され、その発現は肝線維症の段階と正の相関を示した。げっ歯類の肝線維症モデルである四塩化炭素（ＣＣｌ４）で処置したマウスと胆管結紮を行ったラット）では、肝ＴＳＰ２タンパク質の発現が増加していることがわかった（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ；３１６：Ｇ７４４－Ｇ７５４（２０１９））。同様に、高脂肪、高コレステロール食を与えたアポリポタンパク質Ｅノックアウト（ＡｐｏＥＫＯ）マウスを用いた別の研究でも、肝臓のＴＨＢＳ２遺伝子発現は、軽度の線維症のマウスよりも重度の線維症のマウスで高かった。肝生検組織が利用可能な８人のＮＡＦＬＤ患者を評価した研究では、Ｆ０／１線維症患者と比較して、Ｆ３以上の線維症患者では肝臓におけるＴＨＢＳ２遺伝子の発現の有意な上方制御が観察された（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ；７：４７４８（２０１７））。
しかし、進行線維症患者における循環ＴＳＰ２レベルの上昇を説明するメカニズムは単純ではないようである。ＴＳＰ１とＴＳＰ２は両方とも創傷治癒とリモデリングのプロセスに関与するマトリクス細胞タンパク質であるが、それらの組織発現には場所的および時間的な差異がある。例えば、創傷治癒においては、ＴＳＰ１は急性期の反応物質として機能する一方、主に線維芽細胞によって産生されるＴＳＰ２はその後のリモデリングプロセスにより多く関与している可能性が示唆されている。肝線維症は、ＮＡＦＬＤなどの慢性肝損傷に続発する創傷治癒およびリモデリングプロセスでもある。しかし、古典的な線維形成性サイトカインである潜在的トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）を活性化するＴＳＰ１とは異なり、ＴＳＰ２はＴＧＦ－β活性に最小限の影響を与える（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ；１８：７８８－７９８（２００７））。糸球体腎炎の実験モデルでは、マウスのＴＳＰ２を遺伝的に除去すると、腎損傷後の内皮細胞の増殖と毛細血管の修復が促進されたが、野生型マウスと比較して炎症の亢進、マトリックスの蓄積、および糸球体硬化症の増加も引き起こした。同様に、実験的な脳損傷に関するもう一つのげっ歯類の研究において、ＴＳＰ２の欠如が、マウスへの異物移植の後において血液脳関門の回復を鈍らせ、神経炎症を長引かせて、マトリックスメタロプロテイナーゼ（matrix metalloproteinase:ＭＭＰ）－２およびＭＭＰ－９レベルの局所の産生が上昇することも示され（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ；１７９：８６０－８６８（２０１１））、これらは両方とも肝線維症の病因にも関与していた。さらに、関節リウマチでは、びまん性関節炎の患者では、滑膜線維芽細胞、内皮細胞およびマクロファージによって高いＴＳＰ２発現が生成されることが判明した。しかし、ヒト関節リウマチのｉｎ ｖｉｖｏモデルでは、ＴＳＰ２の過剰発現が実際に病変の血管新生、組織浸潤Ｔ細胞密度の顕著な減少、さらに腫瘍壊死因子アルファ（tumour necrosis factor alpha:ＴＮＦα）およびインターフェロン－ガンマ（interferon-gamma:ＩＦＮ－γ）を含む炎症誘発性メディエーターの産生を引き起こすことが実証された（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ；１６５：２０８７－２０９８（２００４））。一方、最近のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、ＴＨＢＳ２ｍＲＮＡが肝星細胞で高発現しており、ＴＨＢＳ２の過剰発現により肝星細胞の活性化が有意に促進されることが判明した。糖尿病では、以前の研究で、増殖性糖尿病性網膜症(proliferative diabetic retinopathy:ＰＤＲ）の患者および活動性血管新生の患者において硝子体液中のＴＳＰ２レベルが著しく上方制御されていたことから、ＴＳＰ２が増殖性糖尿病性網膜症のバイオマーカーであることも示唆されていた（Ａｂｕ Ｅｌ－Ａｓｒａｒ．Ａｃｔａ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ；９１：ｅ１６９－１７７（２０１３））。本著者らは、筋線維芽細胞がＴＳＰ２分泌を増強して、ＰＤＲにおける過剰な血管新生から組織を保護する可能性があると提案した。最近、２型糖尿病患者では皮膚におけるＴＳＰ２発現が著しく増加し、糖尿病でない人のほぼ３倍に達していることが判明した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析により、高血糖がヘキソサミン経路と核因子カッパＢ（nuclear factor kappa B:ＮＦκＢ）シグナル伝達を活性化し、それによって線維芽細胞におけるＴＳＰ２発現が増加する可能性があることが明らかになったが、高血糖は酸化ストレスの増加を通じてＴＳＰ２発現を上方制御する可能性があることも以前に示されている（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ；３３：１９２０－１９２７（２０１３））。まとめると、線維形成に対するＴＳＰ２の効果が組織特異的であるのか、それとも進行線維症の患者における肝臓および循環ＴＳＰ２レベルの上方制御がＮＡＳＨの根底にある炎症および酸化ストレスに対する代償反応を表しているのかは、さらなる機構研究での評価が必要である。
この研究にはいくつかの制限があった。まず、観察研究のデザインでは、２型糖尿病患者における高い循環ＴＳＰ２レベルとＦ３以上の線維症の発症との間の因果関係を推測することはできなかった。第二に、肝生検は行われなかった。しかし、ＶＣＴＥはＮＡＦＬＤにおける肝線維症を評価するための正確な代替ツールとしてますます利用されており、生検で証明された線維症の検出にはＡＵＲＯＣが最大０．９３である（Ｃａｓｔｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ；１５６：１２６４－１２８１ｅ１２６４（２０１９））。これは、２型糖尿病およびＮＡＦＬＤまたはＭＡＦＬＤを併発する多数の安定かつ無症候性の患者の評価に特に関連する（Ｅｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；７３：２０２－２０９（２０２０））。最後に、観察期間の中央値はわずか１．５年であり、これが以前の研究と比較して線維症進行の発生率が比較的低かったことに寄与している可能性がある。
本研究は、進行線維症のバイオマーカーとして循環ＴＳＰ２レベルを採用する証拠を示しており、これは２型糖尿病とＮＡＦＬＤを併発する多数の患者の肝リスクの層別化に有用となるであろう。特に、９０％を超える高いＮＰＶと、ＶＴＣＥでＦ３以上の線維症を特定するためのＡＵＲＯＣの大幅な改善により、バイオマーカーとしての循環ＴＳＰ２レベルはＶＣＴＥが容易に利用できない糖尿病クリニックで特に役立つ。循環ＴＳＰ２レベルが高い患者は、Ｆ３以上の線維症およびＶＣＴＥでの線維症進行のリスクが高いことを示しており、さらなる評価のために肝臓専門医に紹介するために特定することができる。さらに、これらの患者には、肝線維症、肝機能障害および／または脂肪変性を改善する可能性のある抗糖尿病薬、および臨床的に利用可能な場合には新しいＮＡＦＬＤ処置法を優先的に投与することができる。
重要なことに、ＮＡＦＬＤの現在の検出と診断には、通常、生検と組織学的分析が必要である。例えば、組織学的変化やＮＡＦＬＤ活性スコアは肝生検を使用してのみ決定できる。生検と組織学的分析の発明は、横断的研究と前向き研究に基づいていた。本研究は２型糖尿病患者を対象とし、断面組織学と前向きアプローチの両方を使用し、血清ＴＳＰ２レベルが振動制御一過性エラストグラフィー（ＶＣＴＥ）におけるＦ３以上の線維症のマーカーとして有効であることを実証した。本明細書に記載されるように、これにより、肝生検または組織学的分析を必要とせずに、ＮＡＦＬＤにおけるＦ３以上の線維症の検出および診断が可能になる。
Claims (28)
- 非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象における進行肝線維症を非侵襲的に検出する方法であって、
（ａ）前記対象からのサンプル中のバイオマーカートロンボスポンジン２（ＴＳＰ２）の循環レベルを測定する工程、および
（ｂ）前記対象からの前記サンプル中のＴＳＰ２の循環レベルが約３．６ｎｇ／ｍｌを超える場合に、前記進行肝線維症を検出する工程、
を含む方法。 - 前記測定する工程が、前記対象からの前記サンプルを捕捉試薬のセットと接触させる工程を含み、前記捕捉試薬のセットが、ＴＳＰ２に対する結合特異性を有する一つ以上の抗体結合断片を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記測定することが、前記対象からの前記サンプルを捕捉試薬のセットと接触させる工程を含み、前記捕捉試薬のセットが、ＴＳＰ２に対する結合特異性を有するがＴＳＰ１、ＴＳＰ３、ＴＳＰ４およびＴＳＰ５に対する結合特異性は有さない一つ以上の抗体結合断片を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記測定する工程が、前記対象からの前記サンプルを、ＴＳＰ２の異なる部位に対する結合特異性を各々が有する二つの抗体結合断片を含む捕捉試薬のセットと接触させる工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＳＰ２がヒトＴＳＰ２である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、希釈または未希釈の血液または血清である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、サンプル対サンプル希釈緩衝液の約１：５～１：５００（ｖ／ｖ）の比で希釈された希釈サンプルである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記進行肝線維症が、振動制御一過性エラストグラフィー（ＶＣＴＥ）によって測定される約Ｆ３以上の線維症を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記進行肝線維症が、Ｍプローブにおいて約９．６キロパスカル（ｋＰａ）またはＸＬプローブにおいて９．３ｋＰａ以上の肝硬度（ＬＳ）の測定カットオフ値によって等級付けされる約Ｆ３以上の線維症を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記進行肝線維症が、前記対象からの前記サンプル中のＴＳＰ２の循環レベルが約３．６ｎｇ／ｍｌより大きい場合、約８０％以上の感度および約６０％以上の特異性で検出される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記進行肝線維症が、約９０％以上の陰性的中率で検出される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定する工程が、約０．０１ｎｇ／ｍｌ～約０．１８ｎｇ／ｍｌのＴＳＰ２の最低検出限界を有するイムノアッセイによるものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、ＮＡＦＬＤと、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、心血管疾患（ＣＶＤ）、および慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群より選ばれる一つ以上の疾患とを有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象における進行肝線維症の発症リスクを検出する方法であって、
（ａ）前記対象からのサンプル中のバイオマーカートロンボスポンジン２（ＴＳＰ２）の循環レベルを測定する工程、および
（ｂ）ｎｇ／ｍｌで測定される、前記対象からの前記サンプル中のＴＳＰ２の対数変換された循環レベルにおける単位増加あたりの前記進行肝線維症の発症リスクを検出する工程、
を含む方法。 - 前記対象からの前記サンプル中のＴＳＰ２の対数変換された循環レベルにおける単位増加当たり、２．８２倍以上の進行肝線維症発症リスクを検出する、請求項１４に記載の方法。
- 前記進行肝線維症の発症リスクの検出が、前記工程（ａ）から約０．１年～約３年の期間内のリスクについてである、請求項１４または１５に記載の方法。
- 前記測定する工程が、前記対象からの前記サンプルを、捕捉試薬のセットと接触させることを含み、前記捕捉試薬のセットが、ＴＳＰ２に対する結合特異性を有する一つ以上の抗体結合断片を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定する工程が、前記対象からの前記サンプルを、捕捉試薬のセットと接触させることを含み、前記捕捉試薬のセットが、ＴＳＰ２に対する結合特異性を有するがＴＳＰ１、ＴＳＰ３、ＴＳＰ４、およびＴＳＰ５に対する結合特異性は有さない一つ以上の抗体結合断片を含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定する工程が、前記対象からの前記サンプルを、ＴＳＰ２の異なる部位に対する結合特異性を各々が有する二つの抗体結合断片を含む捕捉試薬のセットと接触させる工程を含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＳＰ２がヒトＴＳＰ２である、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、希釈または未希釈の血液または血清である、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、サンプル対サンプル希釈緩衝液の約１：５～１：５００（ｖ／ｖ）の比率で希釈された希釈サンプルである、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、ＮＡＦＬＤと、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、心血管疾患（ＣＶＤ）、および慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群より選ばれる一つ以上の疾患とを有する、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象を肝線維症の処置が必要であると確認することを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象を、肝線維症を軽減するように処置することを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１および請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法で使用するための、請求項２～５のいずれか一項に記載の捕捉試薬のセットを含むキット。
- 請求項２～５のいずれか一項に記載の捕捉試薬のセットを含むイムノアッセイ。
- 請求項１および請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法において使用するための、請求項２７に記載のイムノアッセイ。
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