JP2024515793A - ウイルスベクター生産システム - Google Patents

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Abstract

本開示は、少なくとも部分的に、満足のいく安全性条件下において、高力価レンチウイルスベクターを生産する方法及び目的の導入遺伝子を担持するレンチウイルス粒子を生産する方法を提供する。本開示は、少なくとも部分的に、例えば細胞培養物からのそのようなレンチウイルス粒子の精製方法も提供する。本開示は、精製、保存及び遺伝子移入事象中にウイルスベクターの構造的完全性を維持するレンチウイルス調製物への製剤化も提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／１８０，４２３号明細書に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスは、多くの場合、感染した宿主の免疫系による検出を回避するが、特定の細胞型への核酸送達に極めて効率的である。こうした特徴により、特定のウイルスは、遺伝子治療に使用される遺伝子送達ビヒクルとして魅力的な候補となっている。
遺伝子治療用途に利用可能なウイルスベクターとして、レンチウイルスベクターがある。このようなベクターは、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）に由来する再構築ウイルスベクター系を含み、動物及びヒト初代細胞又は細胞株に目的の遺伝子を導入することができる。レンチウイルスベクター媒介性遺伝子発現は、目的の遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれており、細胞の***時に複製されるため、これを用いて継続的且つ安定したタンパク質生産を達成することができる。レンチウイルスベクターは、非***細胞及び活発に細胞周期を経て進行する細胞を効果的に形質導入することができる。レンチウイルスベクター媒介による、目的の遺伝子の長期にわたる発現が起こり得る組織及び細胞としては、とりわけ、脳、肝臓、筋細胞、網膜、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞及びマクロファージが挙げられる。
レンチウイルスベクターの大規模生産は、低力価のウイルス産生量及びベクターの安定性の低さなど、いくつかの課題によって妨げられてきた。さらに、レンチウイルスベクターは、精製プロセス中に不活性化の影響を受けやすく、これは、ベクター調製物の最終品質及び有効性の低下に寄与する可能性があり、精製されたレンチウイルスベクターの大規模生産にさらに別の障害をもたらしている。このように、より高力価のレンチウイルスベクターの大規模生産プロセス及び大規模精製プロセス並びにベクターの安定性を保持する製剤化バッファーが依然として必要とされている。
本開示は、少なくとも部分的に、満足のいく安全性条件下において、目的の導入遺伝子を担持する高力価レンチウイルスベクターを生産する方法を提供する。本開示は、少なくとも部分的に、例えば細胞培養物からのそのようなレンチウイルス粒子の精製方法も提供する。本開示は、精製、保存及び遺伝子移入事象（例えば、エクスビボ遺伝子移入）中にウイルスベクターの構造的完全性を維持するレンチウイルス調製物のための製剤化も提供する。
いくつかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、
ａ）複数の哺乳動物（例えば、ヒト）細胞を提供するステップと、
ｂ）複数の哺乳動物細胞を、
ｉ）ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬、及び
ｉｉ）治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）及びウイルス粒子にパッケージングするための十分なＬＴＲ配列をコードする核酸並びに任意選択でレンチウイルスパッケージングタンパク質、レンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸
と、少なくとも細胞のサブセットに核酸が導入されることを可能にする条件下で接触させるステップと、
ｃ）レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で細胞を培養するステップと
を含む。
特定の実施形態では、複数の哺乳動物細胞が５０Ｌの培養物中にある場合、他には同様の１００ｍｌの培養物中における培養物１ｍｌ当たりの形質導入単位数の５０％、６０％、７０％又は８０％以上である、培養物１ｍｌ当たりの形質導入単位数をもたらす。
特定の実施形態では、本方法は、実施例５に記載の条件下で使用された場合、少なくとも１×１０７若しくは３×１０７又は少なくとも１×１０８の形質導入単位をもたらす。
特定の実施形態では、本方法は、１１８８：１、９５３：１及び１８００：１以下のＰＰ（物理的粒子）：ＩＰ（感染性粒子）の比をもたらす。
特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞である。
特定の実施形態では、ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶは、０．３～０．６μｌのＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶ／百万細胞、例えば約０．４μｌ／百万細胞の濃度で使用される。
特定の実施形態では、核酸は、０．３～０．６μｇの核酸／百万細胞、例えば約０．４μｇ／百万細胞の濃度で使用される。
特定の実施形態では、ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶ：トランスフェクションのためのＤＮＡの比は、１：０．５～１：２、例えば約１：１である（ここで、任意選択で、トランスフェクションのためのＤＮＡは、治療用エフェクターをコードするＤＮＡ、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質をコードするＤＮＡ及びレトロウイルスエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡを含む）。
特定の実施形態では、ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬は、核酸と複合体化される。
いくつかの実施形態において、本方法は、ステップｂ）前にＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬を核酸と混合するステップをさらに含む。
特定の実施形態では、トランスフェクション試薬と核酸との複合体形成量は、約１％～約１５％、例えば約１％～約１０％（例えば、約５～７．５％又は７．５～１０％）である。
いくつかの実施形態では、複合体形成量は、３～７％、４～６％又は約５％である。
特定の実施形態では、ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬と核酸とは、複合体形成が起こることを可能にするのに十分な時間、例えば約１０～９０分、例えば１５～６０、例えば１５～３０、３０～４５又は４５～６０分にわたってインキュベートされる。
いくつかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、
ａ）複数の哺乳動物（例えば、ヒト）細胞を約６．９超又は約６．９～７．３、例えば約７．０～７．１のｐＨで培養するステップ、
ｂ）ステップａ）に続いて、培養物のｐＨを約６．０～６．８、例えば６．６～６．８、例えば約６．７に調節するステップ、
ｃ）ステップｂ）に続いて、培養物をトランスフェクション試薬及びＤＮＡと接触させるステップ
を含む。
特定の実施形態では、トランスフェクション試薬は、ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする。
いくつかの実施形態において、ａ）は、約２～４日間、例えば約３日間にわたって細胞を培養するステップを含む。
特定の実施形態では、本方法は、ステップｂ）とステップｃ）との間において、細胞を培養する追加のステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ステップｃ）後に細胞を培養する追加のステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ｐＨを約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１だけ低下させるステップを含む。
特定の実施形態では、ステップａ）前に、複数の哺乳動物細胞は、０．１×１０６細胞／ｍＬ～０．３×１０６細胞／ｍＬ（例えば、約０．１５×１０６細胞／ｍＬ又は約０．２×１０６細胞／ｍＬ）で最終体積の培養培地（例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地）に接種される。
いくつかの実施形態において、複数の哺乳動物細胞は、ステップａ）の５０～８０時間（例えば、約５５時間、約６０時間、約６５時間、約７０時間、約７２時間、約７５時間又は約８０時間）前に接種される。
特定の実施形態では、複数の哺乳動物細胞は、トランスフェクションでの好適な細胞密度（例えば、約１．０×１０６細胞／ｍＬ～約３．０×１０６細胞／ｍＬ（例えば、１．５×１０６細胞／ｍＬ～２．５×１０６細胞／ｍＬ）への細胞増殖及び増幅を可能にするのに好適な条件下で培養される。
いくつかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、
ａ）レンチウイルスベクター及び少なくとも１つの不純物を含む組成物を提供するステップ（例えば、ここで、組成物は、清澄化された細胞採取物又は濾液を含む）と、
ｂ）組成物をアルギニン又はその塩と接触させるステップと
を含む。
特定の実施形態では、以下の１つ又は複数である：
ｉ）アルギニンは、約２５～５０ｍＭ（約５０ｍＭ）、５０～１００ｍＭ（例えば、約７５ｍＭ）、１００～２００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ）又は２００～４００（例えば、約３００）ｍＭのアルギニン）の濃度であること、又は
ｉｉ）アルギニンは、例えば、実施例７によるアッセイにおいて、他には同様の組成物と比較して、レンチウイルスベクターの形質導入単位のレベルを約１０％～３００％、２０％～１８０％、３０％～１６０％、５０％～１５０％、７５％～１２５％又は約１００％だけ増加させるのに十分な濃度であること、
ｉｉｉ）ステップｂ）後、組成物は、例えば、実施例１０に記載のアッセイにおいて、マイクロフローイメージングによって測定された場合、１ｍｌ当たり４００，０００、３００，０００、２００，０００又は１００，０００未満の総粒子濃度を示し、任意選択で、粒子は、凝集されたレンチウイルスを含むこと、
ｉｖ）ステップｂ）後、組成物は、例えば、実施例１０に記載のアッセイにおいて、マイクロフローイメージングによって測定された場合、１ｍｌ当たり約５，０００、４，５００、４，０００、３，５００、３，０００又は２，５００未満の、≧１０μｍの粒子の濃度を示し、任意選択で、粒子は、凝集されたレンチウイルスを含むこと、
ｖ）ステップｂ）後、組成物は、例えば、実施例１０に記載のアッセイにおいて、マイクロフローイメージングによって測定された場合、１ｍｌ当たり約５００、４００、３００又は２００未満の、≧２５μｍの粒子の濃度を示し、任意選択で、粒子は、凝集されたレンチウイルスを含むこと、
ｖｉ）ステップｂ）後、組成物は、アルギニン又はその塩を添加しないこと以外には同様の濾液と比較して、レンチウイルスベクターの低減された凝集を示すこと、
ｖｉｉ）レンチウイルスベクターの形質導入単位の回収率は、例えば、実施例７によるアッセイで測定された場合、アルギニンを添加しないこと以外には同様の対照よりも例えば少なくとも約１０％、２０％、５０％、１００％又は２００％だけ高いこと。
いくつかの実施形態において、ｂ）は、組成物を、アルギニン及び緩衝液を含む溶液と接触させるステップを含み、任意選択で、緩衝液は、ＰＩＰＥＳであり、任意選択で、ＰＩＰＥＳは、溶液中において約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、例えば約２０ｍＭの濃度である。特定の実施形態では、溶液は、約６．０～約７．０、例えば約６．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、溶液は、塩をさらに含み、任意選択で、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選択され、例えば塩化ナトリウムである。
いくつかの実施形態において、塩は、約２５～１５０ｍＭ、例えば５０～１００ｍＭ、例えば約７５ｍＭの濃度で溶液中に存在する。
特定の実施形態では、溶液中のその濃度の塩は、約６．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、溶液は、炭水化物、例えば非還元炭水化物、例えばスクロース又はトレハロースをさらに含む。
特定の実施形態では、炭水化物は、溶液の約１～約１０重量／体積％、例えば溶液の約２～約５重量／体積％、溶液の約２．５重量／体積％の濃度で溶液中に存在する。
特定の実施形態では、炭水化物は、約３０～１５０ｍＭ（約７３ｍＭ）又は１５０～３００（例えば、約２２０）ｍＭの濃度で溶液中に存在する。
いくつかの実施形態において、溶液は、ＮａＣｌ（例えば、約２５～１５０ｍＭ、例えば５０～１００ｍＭ、例えば約７５ｍＭ）と、スクロース（例えば、約３０～１５０ｍＭ、例えば約７３ｍＭ若しくは例えば約１５０～３００ｍＭ、例えば約２２０ｍＭ又は溶液の約２．５重量／体積％）との一方又は両方をさらに含む。
いくつかの実施形態において、溶液は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び溶液の２．５重量／体積％のスクロースを含み、溶液は、約６．５のｐＨを有する。特定の実施形態では、溶液は、約２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、約７５ｍＭの塩化ナトリウム及び溶液の２．５重量／体積％のスクロースを含み、溶液は、約６．５のｐＨを有する。
特定の実施形態では、溶液は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び７３ｍＭのスクロースを含み、溶液は、約６．５のｐＨを有する。特定の実施形態では、溶液は、約２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、約７５ｍＭの塩化ナトリウム及び約７３ｍＭのスクロースを含み、溶液は、約６．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、溶液は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び２２０ｍＭのスクロースを含み、溶液は、約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶液は、約２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、約７５ｍＭの塩化ナトリウム及び約２２０ｍＭのスクロースを含み、溶液は、約６．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、溶液は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭのアルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌをさらに含み、溶液は、約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶液は、約２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、約７５ｍＭのアルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌをさらに含み、溶液は、約６．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、前記溶液の浸透圧は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３００ｍＯｓｍ／ｋ、例えば約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇである。
特定の実施形態では、本方法は、ｃ）ｂ）の組成物に対して精精製ステップ、例えば濾過ステップを実施し、それによりレンチウイルスベクターを含む半精製組成物を生成するステップをさらに含む。
特定の実施形態では、本方法は、ステップｃ）後、半精製組成物をアルギニン又はその塩と接触させるステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、アルギニンは、レンチウイルスベクターを被包する。
特定の実施形態では、アルギニンは、レンチウイルスベクターを安定化する。
いくつかの実施形態において、不純物は、タンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質）、核酸（例えば、宿主細胞核酸）、炭水化物（例えば、宿主細胞炭水化物）、脂質、酵素、塩、緩衝液又はそれらの任意の組合せを含む。
特定の実施形態では、トランスフェクションでの細胞密度は、約１．０×１０６細胞／ｍＬ～約３．０×１０６細胞／ｍＬ（例えば、１．５×１０６細胞／ｍＬ～２．５×１０６細胞／ｍＬ）である。
特定の実施形態では、細胞の生存率は、トランスフェクション時に少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）であるか又はそのように評価される。
特定の実施形態では、細胞の生存率は、トランスフェクション時又はその前後（例えば、トランスフェクション前の３０分以内）に測定される。
いくつかの実施形態において、本方法は、２つ以上の核酸（例えば、２つ以上のプラスミド、例えば２つのプラスミド、３つのプラスミド、４つのプラスミド又は５つのプラスミド）を用いたプロセスに使用される。
いくつかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、
ａ）ヒト細胞（例えば、２９３細胞）の集団を提供するステップと、
ｂ）レトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸を細胞に導入するステップと、
ｃ）ステップｂ）の約６～４０～１０～４０～１０～３０又は約２０時間後の時点で細胞をベンゾナーゼと接触させるステップと、
ｄ）レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で細胞を培養するステップと
を含む。
いくつかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、
ａ）ヒト細胞（例えば、２９３細胞）の集団を提供するステップ、
ｂ）レトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸を細胞に導入するステップ、
ｃ）細胞をベンゾナーゼと接触させるステップ、
ｄ）レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で細胞を培養するステップ、
ｅ）ステップｃ）の６～１０時間、１０～２０時間、２０～３０時間、３０～４０時間又は４０～５０時間後、細胞からレンチウイルスベクターを採取するステップ
を含む。
いくつかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、
ａ）複数の哺乳動物（例えば、ヒト）細胞を提供するステップであって、複数の細胞（例えば、ここで、細胞は、線維芽細胞、例えば胎児性腎線維芽細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞である）であり、細胞は、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む、ステップ、
ｂ）レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で細胞を培養するステップ
を含む。
いくつかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクター、アルギニン、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）緩衝液及び塩を含む水性組成物を提供する。
特定の実施形態では、水性組成物中のアルギニンは、約２５～５０ｍＭ（約５０ｍＭ）、５０～１００ｍＭ（例えば、約７５ｍＭ）、１００～２００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ）又は２００～４００（例えば、約３００）ｍＭのアルギニン）の濃度であり、任意選択で、ＰＩＰＥＳ水性組成物は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、例えば約、例えば２０ｍＭの濃度である。
いくつかの実施形態において、水性組成物は、約６．０～約７．０、例えば約６．５のｐＨを有する。
特定の実施形態では、水性組成物は、塩をさらに含み、任意選択で、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。
特定の実施形態では、水性組成物中の塩は、約２５ｍＭ～約１５０ｍＭ、例えば約５０ｍＭ～約７５ｍＭである。
いくつかの態様において、水性組成物は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ及び７５ｍＭの塩化ナトリウムを含み、水性組成物は、約６．５のｐＨを有する。
特定の実施形態では、水性組成物は、炭水化物、例えば非還元炭水化物、例えばスクロース又はトレハロースをさらに含む。
いくつかの実施形態において、炭水化物は、前記溶液の約１～約１０重量／体積％、例えば水性組成物の約２～約５重量／体積％、水性組成物の約２．５重量／体積％の濃度で水性組成物中に存在する。
一実施形態では、炭水化物は、約３０～１５０ｍＭ（約７３ｍＭ）又は１５０～３００（例えば、約２２０）ｍＭの濃度で水性組成物中に存在する。
いくつかの実施形態において、水性組成物は、ＮａＣｌ（例えば、約２５～１５０ｍＭ、例えば５０～１００ｍＭ、例えば約７５ｍＭ）と、スクロース（例えば、約３０～１５０ｍＭ、例えば約７３ｍＭ若しくは例えば約１５０～３００ｍＭ、例えば約２２０ｍＭ又は水性組成物の約２．５重量／体積％）との一方又は両方を含む。
一実施形態では、水性組成物は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び水性組成物の２．５重量／体積％のスクロースを含み、水性組成物は、約６．５のｐＨを有する。
特定の実施形態では、水性組成物は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び７３ｍＭのスクロースを含み、水性組成物は、約６．５のｐＨを有する。
一実施形態では、水性組成物は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び２２０ｍＭのスクロースを含み、水性組成物は、約６．５のｐＨを有する。
特定の実施形態では、前記水性組成物の浸透圧は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３００ｍＯｓｍ／ｋ、例えば約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇである。
一実施形態において、先行するいずれかの請求項に記載のレンチウイルスベクターは、約３×１０８ＴＵ／ｍＬ～約５×１０８ＴＵ／ｍＬの濃度で存在する。
特定の実施形態では、水性組成物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びリポタンパク質からなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質を含まない。
一実施形態において、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子、例えばタンパク質、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。
特定の実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び１つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、１つ若しくは複数の一次シグナル伝達ドメイン及び／又は１つ若しくは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、前記１つ又は複数の一次シグナル伝達ドメインの１つは、ＣＤ３－ζ刺激ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、前記共刺激シグナル伝達ドメインの１つ又は複数は、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される共刺激タンパク質から選択される細胞内ドメイン、例えば４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン又はＣＤ２８共刺激ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、前記共刺激シグナル伝達ドメインの１つ又は複数は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又はＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される共刺激タンパク質から選択される細胞内ドメインを含む。
特定の実施形態では、前記抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合ドメインは、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３；上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖｌｌｌ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１ １７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２；メソテリン；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）；ステージ特異的胎児性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体α；受容体チロシン－プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）（ｂｃｒ－ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１ Ｅ２（ＯＲ５１ Ｅ２）；ＴＣＲγオルタネートリーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；***タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫アポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス性癌遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；後期糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックプロテイン７０－２変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；及び免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群から選択される抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、メソテリン又はＣＤ１２３に結合する。
特定の実施形態では、前記ＣＡＲは、抗ＣＤ１９抗体又はそのフラグメント、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜貫通ドメイン及びＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、第２の導入遺伝子、例えば第２のタンパク質、例えば第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のタンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含む。
一態様において、本開示は、レンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、
ａ）ヒト細胞（例えば、２９３細胞）の集団を提供するステップと、
ｂ）レトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸を細胞に導入するステップと、
ｃ）ステップｂ）の約２～６（例えば、約３）、４～１０（例えば、６）、６～４０、１０～４０、１０～３０（例えば、約２４）又は約２０時間後の時点で細胞をベンゾナーゼと接触させるステップと、
ｄ）レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で細胞を培養するステップと
を含む。
特定の実施形態では、ベンゾナーゼは、細胞からレンチウイルスベクターを採取する６～１０時間、１０～２０時間、２０～３０時間、３０～４０時間又は４０～５０時間前に添加される。
一態様において、本開示は、レンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、
ａ）ヒト細胞（例えば、２９３細胞）の集団を提供するステップ、
ｂ）レトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸を細胞に導入するステップ、
ｃ）（例えば、ステップｂの３～２４時間後に）細胞をベンゾナーゼと接触させるステップ、
ｄ）レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で細胞を培養するステップ、
ｅ）ステップｃ）の６～１０時間、１０～２０時間、２０～３０時間、３０～４０時間又は４０～５０時間後、細胞からレンチウイルスベクターを採取するステップ
を含む。
いくつかの実施形態において、ベンゾナーゼは、約１０～４０Ｕ／ｍＬ、例えば２０～３０Ｕ／ｍＬ、例えば約２５Ｕ／ｍＬの濃度である。
いくつかの実施形態において、ベンゾナーゼは、約３～６０Ｕ／ｍＬ、３～１０Ｕ／ｍＬ、３～７Ｕ／ｍＬ、４～６Ｕ／ｍＬ又は約５Ｕ／ｍＬの濃度である。
一実施形態において、ベンゾナーゼは、５～５０、５～１５、１５～２５又は２５～５０Ｕ／ｍＬの濃度である。
特定の実施形態では、本方法は、ステップｃ）前にベンゾナーゼを例えば約１～５ｍＭ、１～３ｍＭ又は約２ｍＭのＭｇＣｌ２と接触させるステップをさらに含む。
一態様において、本開示は、レンチウイルスベクターを製造する方法を提供し、この方法は、
ａ）複数の哺乳動物（例えば、ヒト）細胞を提供するステップであって、複数の哺乳動物細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を含まず（例えば、ここで、細胞は、線維芽細胞、例えば胎児性腎線維芽細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞である）、複数の哺乳動物細胞は、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む、ステップ、
ｂ）レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で細胞を培養するステップ
を含む。
特定の実施形態では、ａ）は、核酸を複数の哺乳動物細胞に導入するステップを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、複数の哺乳動物細胞からレンチウイルスベクターを少なくとも部分的に分離するステップをさらに含む。
一実施形態において、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質は、レンチウイルスｇａｇ、レンチウイルスｐｏｌ若しくはレンチウイルスｒｅｖ又はそれらの任意の組み合わせを含む。
特定の実施形態では、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇを含む。
いくつかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクターの調製物を提供し、この調製物は、
ａ）治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスゲノムと、
ｂ）レンチウイルスゲノムを被包するエンベロープ（ここで、任意選択で、エンベロープは、ＶＳＶ－Ｇを含む）と
を含む複数のレンチウイルスベクターを含み、
調製物は、少なくとも５×１０７、１×１０８、１×１０９又は１×１０１０の形質導入単位を含み、
調製物は、９０％未満のＳＶ４０ラージＴ抗原又はＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ未満の核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、複数のレンチウイルスベクターは、少なくとも１×１０９、２×１０９、５×１０９又は１×１０１０、２×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、５×１０１又は１×１０１２の細胞を含む。
特定の実施形態では、複数の哺乳動物細胞は、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００又は５００Ｌの培養液量中にある。
一実施形態において、複数の哺乳動物細胞を無血清培地で培養するステップを含む。
特定の実施形態では、複数の哺乳動物細胞は、懸濁液中で増殖される。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、国際公開第２０１４１５３２７０Ａ１号パンフレットに記載されるように、例えばヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ）を含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、デュアルＣＡＲ（例えば、国際公開第２０１６１６４７３１Ａ２号パンフレットに記載されるように、例えばヒト化ＣＤ１９－ＣＤ２２ ＣＡＲ）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、国際公開第２０１７０４９１６６Ａ号パンフレットに記載されるように、ｓｈＲＮＡをさらにコードする。
一実施形態において、レンチウイルスベクターは、血清の非存在下で培養された細胞中で生産される。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された場合、１００±２５ｎｍの流体力学的半径によって特徴付けられる。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、２５℃～５５℃の温度範囲内（例えば、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃又は５５℃）で１００±２５ｎｍの前記流体力学的半径を維持する。
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、１０％～２５％（例えば、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％又は２５％）の多分散性によって特徴付けられる。
一実施形態において、レンチウイルスベクターは、２５℃～５５℃の温度範囲内（例えば、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃又は５５℃）で１０％～２５％（例えば、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％又は２５％）の前記多分散性を維持する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、３回の凍結／融解サイクル後、前記凍結／融解サイクル前の前記水性組成物中の前記レンチウイルスベクターの濃度と比較して、約７０％～約１００％（例えば、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％又は約１００％）の濃度を維持し、前記凍結／融解サイクルの各々は、前記水性組成物を凍結し、且つ続いて前記水性組成物を室温で融解させることを含む。
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、６～１０回の前記凍結／融解サイクル後、例えば６～９回の前記凍結／融解サイクル後、約７０％～約１００％（例えば、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％又は約１００％）の前記濃度を維持する。
いくつかの態様において、本開示は、レンチウイルスベクターと、リン酸緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液からなる群から選択される緩衝液と、塩とを含む水性組成物を提供する。
いくつかの態様において、前記塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選択される。
一実施形態において、前記水性組成物は、スクロース及びトレハロースからなる群から選択される非還元炭水化物をさらに含む。
いくつかの態様において、本開示は、例えば、予防、診断、免疫療法又は治療用途のための大量のウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を生産するスケーラブルなプロセスを提供する。このプロセスは、浮遊細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞）を用いて実施することができる。いくつかの実施形態では、実質的に全ての浮遊細胞がラージＴ抗原、例えばＳＶ４０ Ｔ抗原を発現しない。いくつかの実施形態では、本製法は、バイオリアクターを用いて実施され得る。
いくつかの態様において、本開示は、高ウイルス力価又は高ウイルス収率の一方又は両方を有する大量のウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を生産するための、高度に再現性であり、効率的であり、且つスケーラブルなプロセスを提供する。
いくつかの態様において、本開示は、高ウイルス力価又は高ウイルス収率の一方又は両方を有する大量のウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターを精製するための、高度に再現性であり、効率的であり、且つスケーラブルなプロセスを提供する。
別の態様において、本開示は、精製プロセス中にウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを安定化するための組成物及び方法を提供する。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞による約１．５Ｅ７ＴＵ／ｍＬのＬＶ生産性及びＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞による約３．９Ｅ７ＴＵ／ｍＬのＬＶ生産性を示し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を用いて得られたＰＰ／ＩＰ比は、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を用いて達成された約１０００のＰＰ／ＩＰ比と比較して約１９００である。 各継代で観察された細胞密度が両方の細胞株間で同等（約３×１０６細胞／ｍＬ）であることを示す。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ及びＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞の両方が培養中に高い生存率（＞９０％）を示す。 トランスフェクション試薬ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶが、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞のＬＶ生産性を目的の遺伝子に応じて１．９倍から２．８倍に有意に増加させることを示す。 異なる培養量中でＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶをトランスフェクション試薬として使用した場合のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞のＬＶ生産性の一貫した堅固な増加を示す。 トランスフェクションのために異なる量のＤＮＡを用いて得られたレンチウイルスの量を示す。この実験では、０．４μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を用いて、最も高いウイルス生産及び最も低いＰＰ／ＩＰが得られた。 ２つの異なるレンチウイルスベクターを用いて得られたレンチウイルスの量を示し、トランスフェクション前にｐＨを６．７に変更することにより、生産性の約３倍の増加が誘導された。２．５Ｌスケールのバイオリアクターを使用した。 以下の２つの生産システム：（ｉ）トランスフェクション試薬としてＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶを用いたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞、及び（ｉｉ）トランスフェクション試薬としてＰＥＩｐｒｏ（登録商標）を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、異なるＣＡＲ構築物を用いたレンチウイルス生産性の比較を示す。 サンプルを限外濾過に供した場合の対照ランと比較して、濾過処理時間がアルギニンの存在下で２４４分から１４５分に短縮されたことを示す。 ＴＦＦの前にアルギニンを添加すると、後続のプロセスのベクター回収率が約４０％から８０％以上に向上したことを示す。 両濾過ステップ前にアルギニン添加を実施すると、ベクター回収率がさらに増加したことを示す。 アルギニンの添加によって濃度依存的に粒子数及びサイズが減少することを示す。 異なる濃度のベンゾナーゼ及び異なる添加時間で採取した際の感染性ＬＶＶ（ＴＵ／ｍＬ－ＴＵアッセイ）及び比ＰＰ／ＩＰ（物理的粒子／感染性粒子）の生産性を示す棒グラフである。 異なる濃度のベンゾナーゼ及び異なる添加時間で回収した際のＤＮＡの量（ｎｇ／１Ｅ＋７ ＴＵ）を示す棒グラフである。 異なる濃度のベンゾナーゼ及び異なる添加時間で回収した際のＤＮＡの量（ｎｇ／ｍＬ）を示す棒グラフである。 異なるインキュベーション時間及び複合体形成量で回収した際の感染性ＬＶＶ（ＴＵ／ｍＬ－ＴＵアッセイ）及び比ＰＰ／ＩＰ（物理的粒子／感染性粒子）の生産性を示す棒グラフである。 異なるインキュベーション時間で回収した際の感染性ＬＶＶ（ＴＵ／ｍＬ－ＴＵアッセイ）及び比ＰＰ／ＩＰ（物理的粒子／感染性粒子）の生産性を示す棒グラフである。 ＬＶＶ処理中の５０Ｌスケール（ｎ＝４）での細胞密度及び生存率を示す棒グラフである。 ２つの異なる生成物（Ｃ１及びＩ１）を用いた異なるスケールでの感染性ＬＶＶ（ＴＵ／ｍＬ－ＴＵアッセイ）の生産性を示す棒グラフである。
本開示は、少なくとも部分的に、満足のいく安全性条件下において、目的の導入遺伝子を担持する高力価レンチウイルスベクターを生産する方法に基づく。本開示は、少なくとも部分的に、例えば細胞培養物からのそのようなレンチウイルス粒子の精製方法も提供する。本開示は、精製、保存及びエクスビボでの遺伝子移入事象中にウイルスベクターの構造的完全性を維持するレンチウイルス調製物への製剤化も提供する。
定義
別段の記載がない限り、本明細書で使用される以下の用語及び語句は、下記の意味を有することが意図される。
本明細書で用される場合、単数形「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、別に記載されない限り複数の指示対象を含む。
「又は」という用語は、文脈が明確に別の解釈を指示していない限り、本明細書では「及び／又は」という用語を意味し、それと互換的に使用される。
「約」及び「およそ」とは、一般に、測定の性質又は精度を考慮して、測定された量について許容可能な誤差の程度を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
用語「アミノ酸」は、天然に存在する、合成及び非天然のアミノ酸並びに天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸並びに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、Ｏ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、即ち水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合したα－炭素、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホンニウムを指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「緩衝液」という用語は、弱酸とその共役塩基又は弱塩基とその共役酸との混合物を指す。例えば、本明細書で使用される場合、「１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸緩衝液」とは、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸と１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸アニオン（例えば、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸ナトリウム）を含む混合物を指す。同様に、本明細書で使用される「クエン酸ナトリウム緩衝液」は、クエン酸ナトリウム並びにその共役酸、クエン酸を含む混合物を指す。弱酸とその共役塩基の間には化学平衡が確立されているため、緩衝液を含む溶液は、溶液に少量の酸又は塩基を添加した際のｐＨの急激な変化に抵抗する。
本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」又は「抗体分子」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖又はそのフラグメントを指す。「結合ドメイン」又は「抗体分子」という用語は、抗体及び抗体フラグメントを包含する。いくつかの実施形態において、抗体分子は、多重特異的抗体分子であり、例えば複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、複数の配列の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１エピトープに対する結合特異性を有し、複数の配列の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２エピトープに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態において、多重特異的抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ抗原のみに対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１エピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２エピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。
「抗体重鎖」という用語は、天然に存在する立体配座の抗体分子中に存在する２種類のポリペプチド鎖の大きい方を指し、これは、通常、抗体が属するクラスを決定する。
「抗体軽鎖」という用語は、天然に存在する立体配座の抗体分子中に存在する２種類のポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパ（κ）軽鎖とラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原のエピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持する抗体の１つ又は複数の部分を指す。結合フラグメントの例を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない：一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ラクダ抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、即ち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）；並びに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又は抗体の他のエピトープ結合フラグメント。
抗体又はその抗体フラグメントを含む記載のＣＡＲの部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体又は二重特異性抗体を含む連続したポリペプチド鎖の一部として発現される様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。いくつかの態様において、ＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。別の態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（“Ｋａｂａｔ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ），Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（“Ｃｈｏｔｈｉａ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）を含め、いくつかの公知のスキームのいずれか又はそれらの組合せを使用して決定することができる。
さらに、Ｆｖのフラグメントの２つのドメイン、即ちＶＬ及びＶＨは、個別の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖にすることを可能にする合成リンカーによりそれらを結合することができ、この単一タンパク質鎖中で、ＶＬ及びＶＨの領域が対合して、一価分子を形成する（「一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９－５８８３，１９８８を参照されたい）。このような一本鎖抗体は、「抗原結合フラグメント」という用語に包含されることも意図される。これらの抗原結合フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、これらのフラグメントは、インタクトな抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
用語「キメラ抗原受容体」又は代わりに「ＣＡＲ」は、少なくとも、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義するとおりの刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）とを含む組換えポリペプチドコンストラクトを指す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲポリペプチドコンストラクトのドメインは、同じポリペプチド鎖にあり、例えばキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲポリペプチドコンストラクトのドメインは、互いに連続しておらず、例えばＲＣＡＲに提供されるように、例えば異なるポリペプチド鎖にある。
いくつかの態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ζの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義するとおりの少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能性シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、共刺激分子は、４１ＢＢ（即ちＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ及び／又はＣＤ２８から選択される。いくつかの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意選択のリーダー配列を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、リーダー配列は、任意選択で、細胞プロセシング及びＣＡＲの細胞膜局在化中に抗原認識ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断される。
特定の腫瘍マーカーＸ（ここで、Ｘは、本明細書に記載されるような腫瘍マーカーであり得る）を標的とする、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体又はＴＣＲ（例えば、ＴＣＲアルファ結合ドメイン又はＴＣＲベータ結合ドメイン））を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも称される。例えば、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＢＣＭＡ ＣＡＲと称される。ＣＡＲは、任意の細胞、例えば本明細書に記載の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）で発現させることができる。
用語「シグナル伝達ドメイン」は、二次メッセンジャーを生成するか又はかかるメッセンジャーに応答してエフェクターとして機能することにより定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するように細胞内で情報を伝えることにより機能するタンパク質の機能性の一部分を指す。「刺激性分子」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現され、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について、免疫細胞の活性化を刺激的に調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する分子を指す。いくつかの態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが負荷されたＭＨＣ分子との結合によって惹起される一次シグナルであり、これは、限定されないが、増殖、活性化、分化などを含めたＴ細胞応答の媒介につながる。刺激的方法で機能する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例には、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１６）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。特定のＣＡＲにおいて、本発明の任意の１つ以上のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばＣＤ３ζの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ζの一次シグナル伝達配列は、ヒト配列又は非ヒト種、例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿などからの均等な残基である。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。免疫エフェクター機能（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞におけるもの）の例には、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性及びヘルパー活性が含まれる。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激又は抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。例えば、ＣＡＲ Ｔの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインがＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、及び共刺激細胞内シグナル伝達ドメインが共受容体又は共刺激分子からの細胞質配列を含むことができる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例には、限定されないが、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ベータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれる。
「ζ」又は代替的に「ζ鎖」、「ＣＤ３ζ」若しくは「ＴＣＲζ」という用語は、ＣＤ２４７を指す。Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０９６３は、例示的なヒトＣＤ３ζアミノ酸配列を提供する。「ζ刺激ドメイン」又は代替的に「ＣＤ３ζ刺激ドメイン」若しくは「ＴＣＲζ刺激ドメイン」は、ＣＤ３ζの刺激ドメイン又はその変異体（例えば、変異、例えば点変異、フラグメント、挿入又は欠失を有する分子）を指す。いくつかの実施形態において、ζの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４又はその変異体（例えば、変異、例えば点変異、フラグメント、挿入又は欠失を有する分子）を含む。代わりに又はさらに、「ζ」若しくは代替的に「ζ鎖」、「ＣＤ３－ζ」（又は「ＣＤ３ζ、ＣＤ３ ζ若しくはＣＤ３ｚ）又は「ＴＣＲ－ζ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基として定義され、「ζ刺激ドメイン」若しくは代替的に「ＣＤ３－ζ刺激ドメイン」又は「ＴＣＲ－ζ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なζ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基又はその機能的誘導体として定義される。いくつかの態様において、ζの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４又はその機能性オルソログである非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基を含む。
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによりＴ細胞による共刺激応答、例えば、限定されないが、増殖を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子であり、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２は、効率的な免疫応答に寄与する。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体並びにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような共刺激性分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激性分子は、以下のタンパク質ファミリーに代表され得る：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）及び活性化ＮＫ細胞受容体。そのような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。
細胞内シグナル伝達ドメインは、その由来である分子の細胞内部分全体、又は天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はその機能性フラグメント若しくは誘導体を含み得る。
「相補性決定ドメイン」又は「相補決定領域（「ＣＤＲ」）は、ＶＬ及びＶＨの超可変領域を互換的に指す。ＣＤＲは、抗体鎖の標的タンパク質結合部位であり、これは、そうした標的タンパク質に対して特異性を有する。各ヒトＶＬ又はＶＨには３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～３、Ｎ末端から順に番号が付けられている）があり、可変ドメインの約１５～２０％を構成している。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープと構造的に相補的であるため、結合特異性を直接担う。ＶＬ又はＶＨの残りの区間、いわゆるフレームワーク領域は、より低いアミノ酸配列の変動を呈示する（Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）。
ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置は、当技術分野における様々な公知の定義、例えばＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブ：ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）及びＡｂＭ（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０５～２０６（２００１）を参照されたい）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８８３（１９８９）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７９９－８１７（１９９２）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－７４８（１９９７））を用いて決定することができる。抗原結合部位の定義は、以下の文献にも記載されている：Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１９－２２１（２０００）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２０７－２０９（２００１）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２－７４５（１９９６）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２６８－９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０３：１２１－１５３（１９９１）；Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１－１７２（１９９６）。
本明細書で使用される場合、「混入ポリヌクレオチド」という用語は、レンチウイルスベクターに由来しないポリヌクレオチドを指す。混入ポリヌクレオチドは、例えば、レンチウイルスベクターが産生された細胞に由来する非レンチウイルスポリヌクレオチド、例えばレンチウイルスベクターの導入遺伝子又は他の成分に含まれない染色体哺乳動物ＤＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡ）を含み得る。
「由来する」は、この用語が本明細書で使用されるとき、第１の分子と第２の分子との間の関係を指す。これは、概して、第１の分子と第２の分子との間の構造的類似性を指すものであり、第２の分子に由来する第１の分子に関する方法又は供給源を限定することを含意又は包含しない。例えば、ＣＤ３ζ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、それが、求められる機能、即ち適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するような十分なＣＤ３ζ構造を保持している。これは、細胞内シグナル伝達ドメインの特定の作製方法に限定することを含意又は包含せず、例えば細胞内シグナル伝達ドメインを提供するためにＣＤ３ζ配列で開始して不要な配列を欠失させるか、又は突然変異を付与して細胞内シグナル伝達ドメインに至らせなければならないことを意味しない。
本明細書で使用される場合、「凍結／融解サイクル」という用語は、水溶液又は懸濁液などの液体混合物を、混合物が凍結するまでその凝固点以下の温度に曝露し、その後、その凝固点よりも高い温度で混合物を融解させることを指す。凍結ステップは、例えば、温度が約－８０℃～約－２０℃である環境に混合物を置くことによって実施することができる。混合物は、例えば、融解前の１若しくは数日、数週間、数ヶ月又は数年の期間、凍結したままにしておくことができる。融解ステップは、混合物を、温度が約２℃～約８℃である条件に曝露するか、又は混合物を室温（例えば、実験室の周囲温度又は約２５℃）で保存することによって実施することができる。代わりに、ウォーターバス（例：３７℃）を用いて融解させることもできる。
本明細書で使用される場合、「流体力学的半径」という用語は、粒子の拡散特性から推測される溶液中の粒子の見掛けの半径（ｎｍ単位のＲｈ）を指す。ウイルス粒子の流体力学的半径は、水溶液中でのウイルス粒子の拡散速度並びに粒子が高分子のゲル中を移動する能力を決定する１要因である。ウイルス粒子の流体力学的半径は、粒子の成分各々の質量及び分子構造並びにその水和状態によって部分的に決定される。ウイルス粒子の流体力学的半径を決定する方法は、当技術分野で公知であり、そうしたものとして、動的光散乱及びサイズ排除クロマトグラフィーの使用がある。
本明細書において、「非還元炭水化物」という用語は、アルデヒドとの化学平衡状態では存在せず、従って、銀（Ａｇ＋）及び銅（Ｃｕ２＋）などの遷移金属カチオンによってカルボン酸に酸化される能力が欠如した炭水化物を指す。例示的な非還元炭水化物として、限定はしないが、スクロース、トレハロース及びパラチニトールなどの二糖類、ラフィノース及びメレジトースなどの三糖類並びにスタキオースなどの四糖類が挙げられる。非還元炭水化物としては、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール及びキシリトールなどの単糖誘導体、ラシトール及びマルチトールなどの二糖類誘導体、アルドン酸並びにグルコン酸、グルコン酸γラクトンなどのそれらのラクトン、アルダリン酸及並びにリバラ酸、アラビナリン酸及びガラクタリン酸などのそれらのラクトン、グルクロン酸、ガラクロン酸及びイチアンウロン酸などのウロン酸、トレハロースオクタアセテート、スクロースオクタアセテート及びセロビオースオクタアセテートなどのエステル誘導体並びにヒドロキシル基がＯ－アルキル化されたエーテル誘導体がさらに挙げられる。非還元炭水化物には、Ｄ又はＬ立体化学的配向を有するものが含まれる。
本明細書で使用される場合、「浸透圧」という用語は、水溶液中の溶質粒子の浸透圧の尺度を指す。溶質粒子は、イオン分子及び非イオン化分子の両方を含む。浸透圧は、１ｋｇの溶媒（即ち水）に溶解した浸透圧活性粒子の濃度（即ち、オスモル）として表される。浸透圧は、本明細書では、水１ｋｇ当たりのミリオスモル数（ｍＯｓｍ／ｋｇ）の単位で表される。
本明細書で使用される場合、「重量／体積パーセント」又は「ｗ／ｖ％」という用語は、その成分を含有する混合物の総体積に対する単一成分の重量（グラム単位）百分率を示す。例えば、８ｍｌの総体積中５００ｍｇの成分は、６．２５ｗ／ｖ％であり、５ｍｌの総体積中５００ｍｇの成分は１０ｗ／ｖ％である。
本明細書で使用される場合、「多分散性」という用語は、サンプル内のレンチウイルス粒子などの粒子のサイズの均質性の程度を指す。多分散度が高いほど均質性が低いことを示し、多分散性が低いほど均質性が高いことを示す。例えば、均質性のレベルが高い場合、レンチウイルス粒子は同一サイズと同様であると見なすことができるため、単分散である。当業者により理解されるように、多分散性が低下するにつれて、均質性のレベルが増加する。そのため、多分散性が低いほど、均質性のレベルが高いことを示す。例えば、多分散度が１５％の製剤は、多分散度が１０％の製剤よりも均質性が低い。均質性のレベルが低いと、粒子集団は、有意に異なるサイズを含むため、多分散であるとみなすことができる。
本明細書中で使用される場合、任意の疾患又は障害を「予防する」、「予防する（こと）」若しくはその「予防」という用語は、疾患若しくは障害の予防的処置；又は疾患若しくは障害の発症又は進行を遅らせることを指す。
本明細書で使用される用語「認識する」は、そのエピトープが直鎖状又は立体配座であるかにかかわらず、そのエピトープを見出し、相互作用する（例えば、結合する）抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。「エピトープ」という用語は、本開示の抗体又は抗原結合フラグメントが特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、タンパク質の三次折りたたみによって並置された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒への曝露時に保持されるが、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、典型的に、変性溶媒による処理で消失する。エピトープは、典型的には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸を固有の空間的コンフォメーションで含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法としては、当技術分野の技術、例えばＸ線結晶構造解析及び２次元核磁気共鳴法が挙げられる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルスパッケージングタンパク質」という用語は、レトロウイルス又はその変異体に由来するタンパク質を指し、これは、核酸（例えば、ウイルスゲノム）のエンベロープへのパッケージングを補助する。例示的なレトロウイルスパッケージングタンパク質としては、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｒｅｖ、例えばレンチウイルスｇａｇ、ｐｏｌ及びｒｅｖ、例えば野生型タンパク質又はその変異体、例えばそれらに対して少なくとも８０％、９０％又は９５％の配列同一性を有する配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質は、ポリタンパク質として提供される。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルスエンベロープタンパク質」という用語は、レトロウイルスに由来するタンパク質又はその変異体を指し、これは、アセンブリングされて、核酸（例えば、ウイルスゲノム）の周囲にエンベロープを形成することができる。例示的なレトロウイルスエンベロープタンパク質は、ｅｎｖ、例えば野生型又はその変異体である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、レンチウイルスエンベロープタンパク質、例えば野生型又はその変異体である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇ、例えば野生型又はその変異体である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、偽型である。いくつかの実施形態において、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、レトロウイルスパッケージングタンパク質又はパッケージ仕様とする核酸のＬＴＲの１つ若しくは複数とは異なるウイルスに由来する。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」及び「結合する」という語句は、タンパク質及び他の生体分子の不均一な集団において、例えば特異性を有するリガンドによって認識される特定のタンパク質の存在を決定する、結合反応を指す。タンパク質に特異的に結合するリガンド（例えば、タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなど）は、ＫＤが５００ｎＭ未満のタンパク質に結合する。例えば、タンパク質に特異的に結合するリガンドは、最大５００ｎＭ（例えば、１ｐＭ～５００ｎＭ）のＫＤでタンパク質に結合する。タンパク質又はそのドメインに対して特異的結合を示さないリガンドは、その特定のタンパク質又はそのドメインに対して、５００ｎＭ超（例えば、６００ｎｍ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μΜ、１００μΜ、５００μΜ又は１ｍＭ超）のＫＤを示す。特定のタンパク質に対するリガンドの親和性を決定するために、様々なアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡアッセイは、標的タンパク質に特異的に結合するリガンドを同定するために、常用的に使用されている。特異的タンパク質結合を決定するのに用いることができるアッセイのフォーマット及び条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）及びＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照されたい。
「対象」という用語には、ヒト及びヒト以外の動物が含まれる。ヒト以外の動物には、全ての脊椎動物、例えば哺乳類及び非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類などが含まれる。注記される場合を除いて、「患者」又は「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「治療用エフェクター」という用語は、本明細書中で使用されるように、有効なレベルで、対象に対して治療効果を及ぼし得る分子（例えば、ＲＮＡ又はポリペプチド）を指す。
「治療上許容可能な量」又は「治療有効用量」という用語は、互換的に、所望の結果（即ち、腫瘍サイズの縮小、腫瘍増殖の阻害、転移の防止、ウイルス、細菌、真菌若しくは寄生虫感染の阻害又は予防）をもたらすのに十分な量を指す。いくつかの態様において、治療上許容可能な量は、望ましくない副作用を誘導又は誘発しない。いくつかの態様において、治療上許容可能な量は、副作用を誘導又は誘発するが、患者の状態を考慮して医療提供者によって許容されるものに限る。治療上許容可能な量は、最初に低用量を投与し、次に、所望の効果が達成されるまで、その用量を漸増することによって決定することができる。「予防的に有効な投与量」及び「治療的に有効な投与量」は、いくつかの実施形態では、それぞれ、癌に関連する症状などの疾患の症状の発症を予防するか、又はその重症度の低下をもたらすことができる。
本明細書で用いる「トランスフェクション」という用語は、真核細胞へのＤＮＡの導入を指す。トランスフェクションは、限定はされないが、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及びバイオリスティックスを含む多様な手段によって達成され得る。
本明細書で使用される場合、任意の疾患又は障害を「治療する」、「治療すること」若しくはその「治療」という用語は、一実施形態において、疾患又は障害を改善すること（即ち、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発症を遅らせるか、阻止するか又は低減すること）を指す。別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」又は「治療」は、患者によって認識できないものを含め、少なくとも１つの物理的パラメータを緩和又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」又は「治療」は、疾患又は障害を、物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメータの安定化）又は両方に調節することを指す。
本明細書で使用される場合、「ウイルス力価」という用語は、粒子から標的細胞への所与の核酸配列の転写をもたらす感染性ベクター粒子の数又は「形質導入単位」を指す。ウイルス力価は、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １４４：１ １３－１２４，１９９７又はＦｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０－５３２，１９９６に記載のアッセイなどの機能性アッセイによって測定することができ、これらの文献のいずれの開示内容も、その全体が参照により組み込まれる。代わりに、ウイルス力価は、例えば、当技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、宿主細胞ゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡの量を決定することによって測定することもできる。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、核酸分子を宿主に導入する能力を有するウイルス粒子を指す。外因性遺伝子を担持するウイルスベクターは、通常、特定の細胞株を用いてプラスミドをパッケージングすることにより、ウイルスパッケージを介して感染性ウイルス粒子にパッケージングされる。感染性ウイルス粒子は細胞に感染して、外因性遺伝子の発現を達成する。「組換え」ウイルスベクターとは、遺伝子組換え技術によって構築されたウイルスベクターを指す。組換えウイルスベクターは、任意の適切な方法を用いて、例えばウイルスゲノムをコードする核酸をパッケージング細胞株に形質導入又はトランスフェクトした後、新たにパッケージングされたウイルス粒子を単離することにより、構築することができる。組換え技術は、ウイルスベクター自体の生産の上流の段階で実施され得ることが理解される。例えば、組換え技術を用いてプラスミドを生産し、次に、プラスミドを大規模に生産し、最後にプラスミドをパッケージングのために細胞株に導入して、ウイルスベクターを生産することができる。
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、こうしたものとして、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターがある。医療施設で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例としては、限定するものではないが、例えばＯｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ製のＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ製のＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが挙げられる。非臨床型のレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に公知であろう。
レンチウイルスの生産方法
本開示は、とりわけ、レンチウイルスベクターを製造するための改善された方法を提供する。以下の一般的な手順を使用することができる。まず、宿主細胞を培養することができる。例示的なタイプの宿主細胞、例えばラージＴ抗原を欠いたヒト細胞については、本明細書で「宿主細胞」と題されるセクションでより詳細に説明される。本明細書の実施例１に記載されるように、ラージＴ抗原を欠いた宿主細胞は、ラージＴ抗原を含む宿主細胞と比較して、製造上の利点をもたらすことができる。
いくつかの実施形態では、大量の細胞を生産するために、宿主細胞は、十分に多数の細胞が産生されるまで、順次、より大きい容器（例えば、バイオリアクター）で培養される。
十分な数の宿主細胞が得られたら、所望の核酸を宿主細胞に導入することができる。核酸は、トランスフェクションにより、例えば本明細書で「トランスフェクション」と題されるセクションに記載されるように、例えばＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬を用いて導入され得る。ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬の利点は、本明細書の実施例２及び３に記載されている。トランスフェクトされた核酸は、パッケージングしようとするウイルスゲノムを含み得、ウイルスゲノムは、目的の治療用遺伝子と、ウイルス粒子にパッケージングするための十分なＬＴＲ配列とを含む。宿主細胞に導入され得る追加の核酸には、パッケージングを促進するプラスミド、例えばウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ及びｒｅｖをコードするプラスミドが含まれる。いくつかの実施形態では、培養培地のｐＨは、トランスフェクション前に例えば約７．１から約６．７に、例えば本明細書で「培養条件及びトランスフェクション条件」と題されるセクション及び本明細書の実施例４に記載されているように下方に変更され得る。その後、細胞は、レンチウイルスを産生し始める。
トランスフェクション後、ベンゾナーゼなどのヌクレアーゼは、例えば、本明細書の「培地」と題されるセクション及び実施例５に記載されているように培養培地に添加され得る。理論に縛られることを望まないが、いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、最終的なレンチウイルス調製物に対する混入核酸の供給源であり、例えば、培養培地は、溶解した宿主細胞由来の宿主細胞ＤＮＡを含有し得る。従って、細胞培養培地にベンゾナーゼを添加すると、混入核酸を分解し得るため、レンチウイルスの精製の改善を可能にする。
次に、レンチウイルスの精製を開始するために、宿主細胞培養物からレンチウイルスを採取することができる。いくつかの実施形態では、レンチウイルスの採取は、上清又は細胞培養培地を細胞から分離することを含む。いくつかの実施形態では、清澄化前に細胞を溶解しない。いくつかの実施形態では、細胞を溶解し得、溶解物を清澄化し得る。
細胞培養培地又は細胞溶解物からのレンチウイルスの精製は通常、いくつかの連続した精製ステップを含む。精製ステップは、濾過（例えば、限外濾過）及びクロマトグラフィーステップを含み得る。いくつかの態様において、アルギニンは、精製プロセス中、例えば濾過ステップ又はクロマトグラフィーステップ前又は後に添加することができる。アルギニンの添加は、例えば、本明細書の「精製」と題されるセクション及び実施例８～１２に記載されている。理論に縛られることを望まないが、いくつかの態様において、アルギニンは、レンチウイルスベクターを安定化し、且つ／又はそれらの凝集を低減する。
精製されたレンチウイルスは、様々な用途に用いることができる。例えば、レンチウイルスは、例えば、アフェレーシスサンプル由来の免疫エフェクター細胞からＣＡＲＴ細胞を生成する目的で、エクスビボで細胞に遺伝子を送達するために使用され得る。別の例として、対象の細胞にインサイチュで遺伝子を送達するために、レンチウイルスを対象に投与し得る。例えば、レンチウイルスは、インビボＣＡＲＴに使用され得る。いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、ヒト対象における投与に適しており、例えばＣＡＲをコードするレンチウイルスを対象に投与して、対象の体内の免疫エフェクター細胞へのＣＡＲコード核酸の導入を可能にすることができる。
天然に存在するレンチウイルスは、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの属であり、長い潜伏期間を特徴とする。レンチウイルスは、一般的に、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送達することができる。レンチウイルスの例としては、以下のものが挙げられる：ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因であるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）；ヒツジに脳炎（ｖｉｓｎａ）又は肺炎（ｍａｅｄｉ）を引き起こすビスナ・マエディ（ｖｉｓｎａ－ｍａｅｄｉ）、ヤギに免疫不全、関節炎及び脳症を引き起こすヤギ関節炎－脳炎ウイルス；ウマに自己免疫性溶血性貧血及び脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス；ネコに免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；畜牛にリンパ節腫脹、リンパ球増加症及びおそらく中枢神経系感染症を引き起こすウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；並びに類人猿に免疫不全及び脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長い潜伏期間と長引く経過を特徴とする。通常、ウイルスは単球及びマクロファージに潜在的に感染し、そこから他の細胞に拡散する。ＨＩＶ、ＦＩＶ及びＳＩＶもＴリンパ球（即ちＴ細胞）に容易に感染する。
導入遺伝子
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるレンチウイルス又はレンチウイルスベクターは、核酸、例えば導入遺伝子、例えばタンパク質をコードする導入遺伝子を含み得る。核酸は、例えば、本明細書で「導入遺伝子」と題するセクションに記載されるような導入遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、プロモーター配列に機能的に連結され得る。核酸は、１つ又は複数（例えば、２つ）のＬＴＲ配列も含み得る。理論に縛られることを望まないが、ＬＴＲは、宿主細胞ゲノムへの導入遺伝子とプロモーターの挿入を促進し得る。ＬＴＲ配列は、野生型レンチウイルスＬＴＲ配列又はその変異体を含み得る。例えば、３’ＬＴＲは、組込み後にウイルスを自己不活性化する欠失を含み得る。さらに、５’ＬＴＲは、キメラＬＴＲであり得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、標的細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。
例示的導入遺伝子としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするものが挙げられる。ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び１つ又は複数のシグナル伝達ドメインなど、いくつかのドメインを含み得る。こうした場合、シグナル伝達ドメインは、１つ若しくは複数の一次シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３－ζ刺激ドメインなど）及び／又は１つ若しくは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３又はＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含み得る。
いくつかの実施形態において、導入遺伝子、例えばＣＡＲを含む導入遺伝子は、特定の標的タンパク質又は炭水化物に結合する抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）をコードし得る。例示的な抗原としては、以下のものが挙げられる：ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖｌｌｌ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ ７２）、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＴ（ＣＤ１ １７）、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２、メソテリン、インターロイキン１受容体α（ＩＬ－１１Ｒａ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロテアーゼセリン２１、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイス（Ｙ）抗原、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ステージ特異的胎児性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、ＣＤ２０、葉酸受容体α、受容体チロシン－プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、プロスターゼ、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、伸長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、β型、９（ＬＭＰ２）、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）（ｂｃｒ－ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質、チロシナーゼ、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、ガングリオシドＧＭ３、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、葉酸受容体β、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ポリシアル酸、胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分、乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）、パネキシン３（ＰＡＮＸ３）、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、嗅覚受容体５１ Ｅ２（ＯＲ５１ Ｅ２）、ＴＣＲγオルタネートリーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）、黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）、***タンパク質１７（ＳＰＡ１７）、Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）、アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）、黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）、黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）、Ｆｏｓ関連抗原１、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１、ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転座切断点、アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）、ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス性癌遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）、滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）、後期糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ－１）、腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）、腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）、レグマイン、ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）、ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、腸カルボキシルエステラーゼ、熱ショックプロテイン７０－２変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ＩｇＡ受容体（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）のＦｃフラグメント、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）及び免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のレンチウイルスベクターは、２つ以上の導入遺伝子、例えば第１ＣＡＲ、例えばＣＤ１９ ＣＡＲをコードする第１の導入遺伝子と、第２ＣＡＲ、例えばＣＤ２２ ＣＡＲをコードする第２の導入遺伝子とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデュアルＣＡＲレンチウイルスベクターは、２つの異なるＣＡＲ、例えばＣＤ１９ ＣＡＲ及びＣＤ２２ ＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態において、２つのＣＡＲは、単一のオープンリーディングフレームの一部であり、プロテアーゼ切断部位、例えば自己切断部位、例えばＰ２Ａ部位により隔てられている。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレームは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のリーダー配列、第１のｓｃＦｖ（例えば、ＣＤ２２に結合する）、任意選択で、第１のヒンジドメイン、第１の膜貫通ドメイン、第１の共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）、第１の一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ζ）、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ）、第２のリーダー配列、第２のｓｃＦｖ（例えば、これは、ＣＤ１９に結合する）、任意選択で、第２のヒンジドメイン、第２の膜貫通ドメイン、第２の共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）及び第２の一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ζ）をコードする。いくつかの実施形態では、第１及び第２のリーダー配列は、同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヒンジドメインは、同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の膜貫通ドメインは、同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の共刺激ドメインは、同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、同じ配列を有する。
本明細書に記載の導入遺伝子によってコードされ得る追加のＣＡＲは、例えば、本明細書で「ＣＡＲ標的」と題するセクションに提供されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のレンチウイルスベクターは、免疫エフェクター細胞内の核酸を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードする。例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、Ｔ細胞において、ＴＣＲ及び／若しくはＨＬＡ並びに／又は阻害性分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／若しくはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４若しくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ）をコードする核酸を標的とし得る。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの発現系並びに例示的なｓｈＲＮＡは、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットのパラグラフ６４９及び６５０に記載されており、その全体が参照により援用される。これらの核酸は、例えば、ＣＲＩＳＰＥＲシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮを用いてターゲティングすることもできる。免疫エフェクター細胞は、治療しようとする対象に対して自己由来又は同種異系であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のレンチウイルスベクターは、メチルシトシンジオキシゲナーゼ遺伝子（例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２又はＴｅｔ３）の１つ若しくは複数の阻害剤を含むか又はコードする。操作された細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞などの遺伝子改変抗原特異的Ｔ細胞）の機能活性を増大させるためのそうした組成物及び方法の使用も企図される。理論に縛られるものではないが、Ｔｅｔ遺伝子の単一の対立遺伝子（Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２若しくはＴｅｔ３）の破壊は、増殖の増強、エフェクターサイトカイン産生の調節及び脱顆粒に伴って５－ヒドロキシメチルシトシンの総レベルを低下させ、それにより、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖及び／又は機能を高める。いくつかの実施形態において、前記細胞におけるＴｅｔ２の発現及び／又は機能は、低減又は排除されている。
いくつかの実施形態において、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２及び／又はＴｅｔ３の阻害剤は、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、Ｔｅｔ３又は前記ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡをコードする核酸に特異的なｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、Ｔｅｔ２ ｍＲＮＡの配列と相補的な配列を含み、例えば国際公開第２０１７／０４９１６６号パンフレットの表４に列挙されるｓｈＲＮＡの標的配列を含み、この出願は、表４を含むその全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２及び／又はＴｅｔ３の阻害剤は、（１）Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２及び／又はＴｅｔ３又はその調節エレメント、例えばＴｅｔ２又はその調節エレメントをコードする遺伝子内の１つ若しくは複数の部位を標的とする遺伝子編集システム；（２）前記遺伝子編集システムの１つ若しくは複数の成分をコードする核酸；又は（３）それらの組合せである。いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステム及びメガヌクレアーゼシステムからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターは、導入遺伝子、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子を含み、さらに、免疫エフェクター細胞中の核酸を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含む。
レンチウイルスベクターの特徴
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される１００±２５ｎｍの流体力学的半径によって特徴付けられる。例えば、レンチウイルスベクターは、２５℃～５５℃の温度範囲内で１００±２５ｎｍの流体力学的半径を維持し得る。
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、１０％～２５％の多分散性によって特徴付けられる。例えば、レンチウイルスベクターは、２５℃～５５℃の温度範囲内で１０％～２５％の多分散性を維持し得る。
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、３、６又は９回の凍結／融解サイクル後、凍結／融解サイクル前の水性組成物中のレンチウイルスベクターの濃度に対して約７０％～約１００％の濃度を維持し、凍結／融解サイクルの各々は、水性組成物を凍結し、次に水性組成物を室温で解凍させることを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法又は製剤のいずれかを用いて調製、精製若しくは保存されたレンチウイルスは、例えば、１のＭＯＩで試験した場合、本明細書に記載の方法によって又は本明細書に記載の製剤中に生産、精製若しくは保存されていないレンチウイルスと比較して低いベクターコピー数（ＶＣＮ）、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％低いＶＣＮを有し得る。
レンチウイルスベクターパッケージングシステム
パッケージングシステムを使用して、核酸、例えば導入遺伝子をコードするＲＮＡをレンチウイルスベクターにパッケージングすることができる。従って、本明細書に記載のシステム及び方法は、例えば、レンチウイルスベクター、例えば任意選択で導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターの生産に適した少なくとも１つのプラスミドを含むレンチウイルスパッケージングシステムを含み得る。レンチウイルスベクターの生産に有用な種々のレンチウイルス成分は、当技術分野で公知である。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１－８７５及びＤｕｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３－８４７１を参照されたい。レンチウイルスベクターの生産に適した様々な機能を、１つ又は複数の核酸（例えば、プラスミド）、例えば少なくとも１つ、２つ、３つ又は４つのプラスミドを含むレンチウイルスパッケージングシステム内の宿主細胞に付与することができ、１つのプラスミドは、レトロウイルスエンベロープタンパク質（Ｅｎｖプラスミド）をコードし、１つのプラスミドは、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質、例えばＧａｇ及びＰｏｌタンパク質（パッケージングプラスミド又はＧａｇ－Ｐｏｌプラスミド）をコードし、１つのプラスミドは、レンチウイルスＲｅｖタンパク質（Ｒｅｖプラスミド）及び少なくとも１つの目的の導入遺伝子（ＴＯＩ）発現カセットを含む１つ又は複数のプラスミドをコードする。いくつかの実施形態において、レンチウイルスパッケージングシステムは、少なくとも１つ、２つ、３つ若しくは４つのプラスミドをさらに含むか、又は本明細書に記載の方法は、それらの使用を含む。いくつかの実施形態において、レンチウイルスパッケージングシステムは、第５のプラスミドをさらに含むか、又は本明細書に記載の方法は、その使用を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、５つのプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトすることを含み、第５のプラスミドは、レンチウイルスベクターパッケージングシステムのタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態において、レンチウイルスパッケージングシステムは、１つ又は複数の核酸（例えば、プラスミド）、例えば５つのプラスミドを含み、例えばＲｏｕｔ－Ｐｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５（２）：１－９，２０１８）に記載されるように、１つのプラスミドは、発現ベクターをコードし、１つのプラスミドは、Ｔａｔ（例えば、ｐｃＤＮＡＴａｔ）をコードし、１つのプラスミドは、Ｒｅｖタンパク質（例えば、ｐＨＣＭＶ－Ｒｅｖ）をコードし、１つのプラスミドは、ｇａｇｐｏｌ（例えば、ｐＨＣＭＶ－ｇａｇｐｏｌ）をコードし、１つのプラスミドは、ＶＳＶ－Ｇ（例えば、ｐＶＳＶＧ）もコードする。いくつかの実施形態において、プラスミドは、二重遺伝子発現カセット、例えばバイシストロンカセット、例えば２つの目的導入遺伝子をコードするバイシストロン構築物を含み得る。いくつかの実施形態において、第１の目的導入遺伝子は、第１ＣＡＲ、例えばＣＤ１９ ＣＡＲをコードし、第２の目的導入遺伝子は、第２ＣＡＲ、例えばＣＤ２２ ＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態において、レトロウイルスパッケージングタンパク質は、レンチウイルス、例えばレンチウイルスパッケージングタンパク質、例えばレンチウイルスｇａｇ及びｐｏｌタンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスｇａｇタンパク質は、野生型レンチウイルスｇａｇタンパク質であり、他の実施形態では、これは、野生型配列に対して１つ又は複数の配列修飾を有する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスｐｏｌタンパク質は、野生型レンチウイルスｐｏｌタンパク質であり、他の実施形態では、野生型配列に対して１つ又は複数の配列修飾を有する。いくつかの実施形態において、ｒｅｖタンパク質は、野生型ｒｅｖタンパク質であり、他の実施形態では、これは、野生型配列に対して１つ又は複数の配列修飾を有する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、修飾エンベロープタンパク質、例えば異なるウイルスに由来するエンベロープタンパク質又はキメラエンベロープタンパク質を含む偽型ベクターであり得、例えば、Ｅｎｖプラスミドは、ＶＳＶ－Ｇ Ｅｎｖタンパク質、例えば野生型ＶＳＶ－Ｇタンパク質又は修飾変異体をコードし得る。
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｐＭＤＬｇｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ及びｐＭＤ．Ｇプラスミド（Ｄｕｌｌ ａｌ．，前掲）を含むパッケージングシステムを用いて作製されるが、例えばアンピシリン遺伝子の代わりに、カナマイシン耐性マーカー、例えばカナマイシン及びネオマイシンの両方に対する耐性を付与するマーカー、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩを使用する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムは、例えば、アンピシリン遺伝子の代わりに、カナマイシン耐性マーカー、例えばカナマイシン及びネオマイシンの両方に対する耐性を付与するマーカー、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩを含むトランスファーベクターを含む。いくつかの実施形態において、転写ベクターは、例えば、国際公開第２０１７０８７８６１Ａ号パンフレット又はＭｉｌｏｎｅ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４，２００９（各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているようなｐＥＬＰＳ構築物由来の配列を含む。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、レンチウイルス５’ＬＴＲ（例えば、切断型レンチウイルス５’ＬＴＲ）、レンチウイルス３’ＬＴＲ、ｃＰＰＴ及びＷＰＲＥの１つ又は複数、例えば全部を含む自己不活性化トランスファーベクターにコードされる。いくつかの実施形態において、転写ベクターは、細菌内で活性なプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター及びｌａｃプロモーターの全てを欠く）、Ｍ１３プライマー結合部位（例えば、Ｍ１３フォワードプライマー結合部位及びＭ１３リバースプライマー結合部位の両方を欠く）、ファージ起源（例えば、ｆ１ ｏｒｉ）並びに蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、例えばＥＧＦＰ）をコードする遺伝子の１つ又は複数、例えば全部が欠失している。いくつかの実施形態において、トランスファーベクターは、ＣＡＰ結合部位及びｌａｃオペレーターの両方が欠失している。いくつかの実施形態において、トランスファーベクターが、Ｔ７プロモーター、Ｍ１３フォワードプライマー結合部位、ｆ１ ｏｒｉ、ＣＡＰ結合部位、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、ｌａｃオペレーター、Ｍ１３リバースプライマー結合部位、Ｔ３プロモーター及びＥＧＦＰを欠失している以外には、トランスファーベクターは、国際公開第２０１７０８７８６１号パンフレットに開示されるようなｐＥＬＰＳ構築物を含み、トランスファーベクターは、治療用タンパク質、例えばＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態において、トランスファーベクターは、以下の特性の１つ又は複数を有する：（ａ）他の点では類似の対照トランスファーベクターよりも安定しているか、（ｂ）他の方法では類似の対照トランスファーベクターよりも生じる細胞毒性が低いか、又は（ｃ）例えば、本明細書に記載されるように、標的細胞に組み込まれた場合、より低いベクターコピー数（ＶＣＮ）をもたらす。いくつかの実施形態において、対照トランスファーベクターは、Ｔ７プロモーター、Ｍ１３フォワードプライマー結合部位、ｆ１ ｏｒｉ、ＣＡＰ結合部位、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、ｌａｃオペレーター、Ｍ１３リバースプライマー結合部位及びＴ３プロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子発現カセットは、タンパク質、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子発現カセットは、２つのタンパク質、例えば第１ＣＡＲ及び第２ＣＡＲをコードする。遺伝子発現カセットに適した例示的な導入遺伝子は、本開示に記載されている。
トランスフェクション
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターの生産に適したレンチウイルスパッケージングシステムのトランスフェクション、例えば一過性又は安定トランスフェクションにより、レンチウイルスベクター生産のための様々な機能が複数の宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（例えば、無血清条件下、懸濁液中で増殖する複数のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞）に付与される。いくつかの実施形態では、宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％がトランスフェクトされる。トランスフェクション又は感染の方法は、当業者に周知である。いくつかの実施形態において、トランスフェクションのために、１００万細胞当たり少なくとも０．３μｇ、少なくとも０．４μｇ、少なくとも０．５μｇ、少なくとも０．６μｇ、少なくとも０．７μｇ、少なくとも０．８μｇの細胞、少なくとも０．９μｇ又は少なくとも１．０μｇのレンチウイルスパッケージングシステムが提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞をトランスフェクトするために、トランスフェクション試薬を使用する。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬が使用される。トランスフェクション試薬は、当技術分野で公知であり、供給業者から入手可能である。トランスフェクション試薬の例として、限定するものではないが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｏｌｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＬｅｎｔｉＴｒａｎ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）、ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）及びＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬、例えばＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶは、１００万細胞当たり０．１μｌ、０２．μｌ、０．３μｌ、０．４μｌ、０．５μｌ、０．６μｌ、０．７μｌ、０．８μｌ、０．９μｌ又は１．０μｌのレベルで使用される。いくつかの実施形態では、パッケージングシステム及びトランスフェクション試薬、例えばＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶは、トランスフェクションのために、約１：０．５、１：０．７５、１：１、１：１．５若しくは１：２又はそれらの間の任意の範囲の比で使用される。
いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬は、ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬を含む。ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶは、例えば、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ（８５０ ｂｄ Ｓｅｂａｓｔｉｅｎ Ｂｒａｎｔ，６７４００ Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，ＦＲＡＮＣＥ；１２５１ Ａｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｓ；３ｒｄ Ｆｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＮＹ １００２０ ＵＳＡ）から取得することができる。ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶは、化学物質ベースの動物由来フリートランスフェクション試薬である。
いくつかの実施形態では、トランスフェクション時に、細胞（例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞）は、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０７細胞／ｍＬ、１×１０６細胞／ｍＬ～６×１０６細胞／ｍＬ、１×１０６細胞／ｍＬ～５×１０６細胞／ｍＬ、１．５０×１０６細胞／ｍＬ～２．５０×１０６細胞／ｍＬ、２．０×１０６細胞／ｍＬ～３．０×１０６細胞／ｍＬ、２．０×１０６細胞／ｍＬ～２．５×１０６細胞／ｍＬの密度である。いくつかの実施形態において、トランスフェクションの時点で、細胞集団は、少なくとも約８０％、９０％又は９５％の生存率を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＰ／ＩＰ（物理的粒子／感染性粒子）比は、トランスフェクション後、５００、７００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００未満である。
宿主細胞
ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、例えば本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの発現に好適な任意の宿主細胞を使用して、本明細書に開示される方法を実施することができる。いくつかの実施形態では、好適な宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ウイルス、例えばレンチウイルス、例えばレンチウイルスベクター又は目的のレンチウイルスを発現するための遺伝子改変哺乳動物細胞であり得る。いくつかの哺乳動物細胞株は、ウイルスの組換え発現に適した宿主細胞である。哺乳動物宿主細胞株として、例えば、ＣＯＳ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ－３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＭＭＴ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、ＣＨＯ、２９３Ｔ、Ａ４３１、３Ｔ３、ＣＶ－１、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、Ｌ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ－６０、ＦＲｈＬ－２、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｔ２、ＢａＦ３、３２Ｄ、ＦＤＣＰ－１、ＰＣ１２、Ｍ１ｘ、マウス骨髄腫（例えば、ＳＰ２／０及びＮＳ０）並びにＣ２Ｃ１２細胞、さらには形質転換霊長類細胞株、ハイブリドーマ、正常二倍体細胞並びに初代組織及び初代外植片のインビトロ培養物由来の細胞株が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞、例えば２９３Ｆ細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を含め、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態では、培養物中の宿主細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、ラージＴ抗原、例えばポリオーマウイルスのラージＴ抗原、例えばＳＶ４０のラージＴ抗原、例えば変異体ＳＶ４０のラージＴ抗原を発現する。いくつかの実施形態では、培養物中の宿主細胞の少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％は、ラージＴ細胞抗原を発現しない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、懸濁液中での増殖に適している。
培養プロセス
本明細書に記載の細胞株は、高力価のレンチウイルスベクター粒子の生産を可能にする条件下で培養することができる。真核細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、培養の大部分を通して懸濁液中で自由に増殖する非足場依存性細胞として；又はその増殖のために固体基質への付着を必要とする足場依存性細胞として（例えば、単層として）培養され得る。
いくつかの実施形態では、細胞増殖に適応させるために、マイクロキャリアシステムを使用し得る。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアシステムは、懸濁培養、例えば大規模懸濁培養を含み得る。懸濁培養は、開放系又は閉鎖系、例えばバッチ式又はフェドバッチ式の閉鎖系で操作され得る。いくつかの実施形態において、栄養素は、添加されず、廃棄物は、培養期間を通して除去されない。いくつかの実施形態では、細胞、生成物、副産物及び有毒代謝物を含む廃棄物は、除去されないが、増殖サイクルを延長するために栄養素が継続的にシステムに供給される。いくつかの実施形態では、培養システムは、開放、例えば連続システム、例えば灌流システム又はケモスタットシステムであり得る。いくつかの実施形態では、システムは、１つ又は複数の細胞保持装置を備え得る。細胞保持装置は、例えば、マイクロキャリア、微細メッシュスピンフィルター、中空糸、平板膜フィルター、沈降管、超音波細胞保持装置などを含み得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクター内の細胞の濃度は、バイオリアクターから採取された上清中に存在する細胞の濃度よりも高い。いくつかの実施形態では、バイオリアクター内の細胞の濃度は、バイオリアクターから採取された上清と実質的に同一である。
連続発酵プロセスでは、多くの場合、規定培地をバイオリアクターに連続的に添加しながら、生成物の回収のために等量の培養液を同時に除去する。連続培養は、一般に、増殖の対数期において細胞を一定の細胞密度に維持する。連続又は半連続培養法では、細胞増殖又は最終生成物濃度に影響を与える１つの因子又は任意の数の因子を調節することが可能である。例えば、或るアプローチは、炭素源を制限し、他の全てのパラメータが代謝を和らげることを可能にし得る。いくつかのシステムでは、増殖に影響を与える多くの因子が連続的に変化し得るが、培地の濁度によって測定される細胞濃度は一定に保持される。連続システムは、多くの場合、定常状態の増殖を維持するため、細胞増殖速度は、培地が培養物から取り出されることによる細胞喪失に対して均衡が保たれることが多い。連続的な培養プロセスのための栄養素及び成長因子を調節する方法は、公知であり、種々の方法が当技術分野で公知である。
いくつかの実施形態において、浮遊細胞の培養物は、懸濁液中にある細胞のみを含む。いくつかの実施形態において、浮遊細胞の培養物は、例えば、一過性に表面に接着する少数（例えば、１％未満）の細胞を含み得る。
「細胞培養」は、細胞のあらゆるインビトロ培養を指し得る。この用語には、連続細胞株（例えば、不死性表現型を有する）、初代細胞培養、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）及びインビトロで維持されるその他の細胞集団が含まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステム又は方法は、ウイルスベクターの生産のためにパッケージング細胞又はパッケージング細胞株を使用する。細胞株は、レンチウイルスベクター生産のためのエレメント、例えばレトロウイルスパッケージングタンパク質及びレトロウイルスエンベロープタンパク質で安定的にトランスフェクトすることができる。典型的には、このようなパッケージング細胞は、ウイルスタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖなど）を発現することができる１つ又は複数の発現カセットを含むが、発現カセットは、パッケージングシグナルを含まない。パッケージング細胞は、インビトロで培養された細胞であり得る。パッケージング細胞株を使用して、例えば少なくとも１つの目的導入遺伝子（ＴＯＩ）発現カセットを含む少なくとも１つのプラスミドを提供することにより、レンチウイルス粒子生産のためのプロデューサー細胞株を作製することができる。いくつかの実施形態において、プロデューサー細胞は、治療用エフェクターをコードすると共に、ＬＴＲを含むＲＮＡをウイルスベクターにパッケージングすることを可能にするのに十分なＬＴＲ配列を含むプラスミド（例えば、トランスファープラスミド）を一過性に発現する。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞株は、治療用エフェクターをコードすると共に、ＬＴＲを含むＲＮＡをウイルスベクターにパッケージングすることを可能にするのに十分なＬＴＲ配列を含む発現カセットを安定して発現する。
培地
本開示の方法は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を培養するのに適した（例えば、本開示の条件下での細胞増殖及び維持を支持する）任意の培地を用いて実施され得る。「細胞培養培地」及び「培養培地」（又は単に「培地」）という用語は、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞を指し、これは、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の増殖に使用される栄養溶液を指し、典型的には、下記カテゴリーの１つ又は複数から少なくとも１つの成分を提供する：（１）培地の浸透圧に寄与する塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）；（２）通常、グルコースなどの炭水化物の形態のエネルギー源；（３）全ての必須アミノ酸及び通常２０のアミノ酸の基本セット；（４）低濃度で必要なビタミン及び／又はその他の有機化合物；並びに（５）微量元素（微量元素は、通常、マイクロモル範囲の非常に低濃度で通常必要とされる無機化合物として定義される）。このような培地の組成物は、当技術分野で公知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ，ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２：７７７－７８５を参照されたい）。栄養溶液は、任意選択で、以下のカテゴリーのいずれかからの成分の１つ又は複数を補充され得る：（ａ）動物血清；（ｂ）ホルモン及び他の成長因子、例えばインスリン、トランスフェリン及び上皮成長因子；並びに（ｃ）植物、酵母及び／又は組織の加水分解物（それらのタンパク質加水分解物を含む）。
いくつかの実施形態において、培養培地は、血清、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含み得る。いくつかの実施形態では、培養培地は無血清である。いくつかの実施形態では、培地は、既知組成で、例えば動物由来成分を含まない培地である。本明細書で使用される場合、「動物由来」成分は、インタクトな動物において産生される任意の成分（例えば、血清から単離及び精製されたタンパク質）又はインタクトな動物において産生される成分を用いて生成される任意の成分（例えば、植物源材料を加水分解するために動物から単離及び精製された酵素を用いて製造されたアミノ酸など）である。対照的に、動物性タンパク質の配列を有する（即ち、動物にゲノム起源を有する）が、インタクトな動物において産生される成分を含まない培地又はインタクトな動物から単離及び精製された培地を用いて、細胞培養物中で（例えば、組換え酵母若しくは細菌細胞中において又は組換え体若しくは非組換え体にかかわらず、樹立された連続真核生物細胞株において）インビトロで産生されるタンパク質は、「動物由来」の成分ではない。
既知組成培地は、全ての成分が既知の化学構造を有する培地である。既知組成培地は、例えば、Ｓｉｇｍａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｉｂｃｏなどの供給業者から入手可能である。いくつかの実施形態では、培地は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍである。いくつかの態様では、濃縮血清、例えば通常必要とされ、且つ増殖培養物に通常に提供される栄養素の濃度より高濃度の栄養素を含有する培地を使用し得る。いくつかの実施形態では、培地は、当技術分野で公知の任意の供給源又は方法から得られるアミノ酸を含有し得る。
いくつかの実施形態では、酵素、例えばヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼ、例えば組換えエンドヌクレアーゼ、例えばベンゾナーゼ（登録商標）を培養培地に添加し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２Ｕ／ｍｌ、少なくとも５Ｕ／ｍｌ、少なくとも７Ｕ／ｍｌ、少なくとも１０Ｕ／ｍｌ、少なくとも１５Ｕ／ｍｌ、少なくとも２０Ｕ／ｍｌ、少なくとも２５Ｕ／ｍｌ、少なくとも２５Ｕ／ｍｌ、少なくとも３０Ｕ／ｍｌ、少なくとも３５Ｕ／ｍｌ、少なくとも４０Ｕ／ｍｌ、少なくとも４５Ｕ／ｍｌ、少なくとも５０Ｕ／ｍｌ、少なくとも５５Ｕ／ｍｌ又は少なくとも６０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（登録商標）を添加する。いくつかの実施形態では、２Ｕ／ｍＬ～１０Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ～２０Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ～３０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ～４０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ～５０Ｕ／ｍＬ又は５０Ｕ／ｍＬ～６０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（登録商標）を添加する。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼ（登録商標）は、宿主細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞をトランスフェクトしてから約５～４０、１０～４０、１０～３０、２０～３０又は約２０時間若しくは約２４時間後の時点で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから２０～３０時間（例えば、約２４時間）後、３～７Ｕ／ｍＬ（例えば、約５Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから１～５時間（例えば、約３時間）後、３～７Ｕ／ｍＬ（例えば、約５Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから４～８時間（例えば、約６時間）後、３～７Ｕ／ｍＬ（例えば、約５Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから１～５時間（例えば、約３時間）後、１２～１８Ｕ／ｍＬ（例えば、約１５Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから、４～８時間（例えば、約６時間）後、１２～１８Ｕ／ｍＬ（例えば、約１５Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから２０～３０時間（例えば、約２４時間）後、１２～１８Ｕ／ｍＬ（例えば、約１５Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから１～５時間（例えば、約３時間）後、２０～３０Ｕ／ｍＬ（例えば、約２５Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから４～８時間（例えば、約６時間）後、２０～３０Ｕ／ｍＬ（例えば、約２５Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから２０～３０時間（例えば、約２４時間）後、２０～３０Ｕ／ｍＬ（例えば、約２５Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから１～５時間（例えば、約３時間）後、４０～６０Ｕ／ｍＬ（例えば、約５０Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから４～８時間（例えば、約６時間）後、４０～６０Ｕ／ｍＬ（例えば、約５０Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから２０～３０時間（例えば、約２４時間）後、４０～６０Ｕ／ｍＬ（例えば、約５０Ｕ／ｍＬ）の濃度で添加される。いくつかの実施形態において、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約３時間後に５Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約３時間後に１５Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約３時間後に２５Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約３時間後に５０Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約６時間後に５Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約６時間後に１５Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約６時間後に２５Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約６時間後に５０Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約２４時間後に５Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約２４時間後に１５Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの態様において、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約２４時間後に２５Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼは、宿主細胞をトランスフェクトしてから約２４時間後に５０Ｕ／ｍＬの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、塩、例えばＭｇＣｌ２が、例えば、約１～５ｍＭ、１～３ｍＭ又は約２ｍＭの濃度でベンゾナーゼ（登録商標）に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、生産及び／又は精製プロセス中にベンゾナーゼ（登録商標）の添加を含み得る。
いくつかの実施形態において、化合物を培地に添加して、培養物増殖、例えば増殖の阻害、分化の誘導及び遺伝子発現の誘導又は抑制に影響を与えることができる。いくつかの実施形態では、化合物は酪酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞培養培地は、酪酸ナトリウムを含む。
培養条件及びトランスフェクション条件
培養条件は、細胞を維持するのに適した任意の培養条件（例えば、静止又は増殖状態）を含み得る。例えば、培養条件は、限定しないが、温度、酸素含量、栄養含量（例えば、グルコース含量）、ｐＨ（例えば、ｐＨの上昇又は減少）、攪拌レベル（例えば、毎分回転数）、ガス流量（例えば、空気、酸素、窒素ガス）、酸化還元電位、細胞密度（例えば、光学密度）、細胞生存率などを含め、いくつかのパラメータを含み得る。培養条件の変化は、１つ若しくは複数の培養パラメータの改変、修正又は変更を含み得る。例えば、培養条件は、温度の増減、ｐＨの増減（例えば、酸、塩基若しくは二酸化炭素を添加又は除去）、酸素含量の増減（例えば、空気、酸素、二酸化炭素、窒素を導入）、空気圧の増減（例えば、空気、酸素、二酸化炭素、窒素を導入することにより）、撹拌の増減及び／又は栄養素（例えば、１つ若しくは複数の糖又は糖の供給源、バイオマス、ビタミンなど）の追加若しくは除去、培養物とフラスコ容量との比の増減或いはこれらの組合せによって変化させることができる。いくつかの実施形態では、培養条件の変化、例えばｐＨの上昇又は低下が培養中の特定の時点、例えばトランスフェクション前に導入される。いくつかの実施形態では、レンチウイルスパッケージングシステムによるトランスフェクション前にｐＨを修正し、例えば約６．０～６．８、例えば６．２～６．８、例えば６．４～６．８、例えば６．７～６．７５に調節する。
培養量及び培養単位
開示の方法は、小型細胞培養、例えば実験室規模又は大規模培養、例えば工業規模で実施することができる。これらの方法は、適切な培養ユニット、例えば培養フラスコ又はバイオリアクターで実施することができる。バイオリアクターは、細胞、例えば哺乳動物細胞の培養に有用である限り、任意のサイズのものであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、高度にスケーラブルであり、例えば、複数の哺乳動物細胞は、スケーリングされた培養物中に存在する（例えば、少なくとも１Ｌ、少なくとも２Ｌ、少なくとも５Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも１５Ｌ、少なくとも２０Ｌは、他には同様の小規模培養、例えば１００ｍｌ、２００ｍｌ、例えば３００ｍｌ、４００ｍｌ、５００ｍｌにおける培養物１ｍｌ当たりの形質導入単位数の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は８０％以上である、培養物１ｍｌ当たりの形質導入単位数をもたらす）。いくつかの実施形態では、スケール培養（即ち、５０Ｌを超える培養容量を有する）は、最小限の培養条件の変更で、小さい、実験室規模の培養物（例えば、１０Ｌ）から生産規模の培養物（例えば、５０Ｌ以上）へのスケールアップに特に適していると考えられる。ｐＨ、ｐＯ２及び温度を含むが、これらに限定されない培養ユニットの内部条件は、典型的には培養期間中に制御される。生産培養単位とは、ポリペプチド、ウイルス及び／又は目的とする他の生成物の生産に使用される最終培養単位を指す。大規模生産培養ユニットの容量は、一般に約５０リットルより大きく、約１００、約２００、約３００、約５００、約８００、約１０００、約２５００、約５０００、約８０００、約１０，０００、約１２，００００Ｌ以上又は任意の中間容量であり得る。好適な培養ユニット又は生産培養ユニットは、本明細書で企図される培養条件下で培地に懸濁させた細胞培養物を保持するのに適した任意の材料及び哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞増殖及び生存率を促進する材料からなる（即ち構成される）ものであり得る。好適な材料の例として、限定はしないが、ガラス、プラスチック及び／又は金属が挙げられる。いくつかの実施形態では、材料は、所望の産物、例えばレンチウイルスベクターの発現及び／又は安定性を妨害しないか又は有意に若しくは実質的に妨害しない。
いくつかの実施形態において、細胞培養プロセスは、１つ又は複数の種子培養ユニットを使用し、続いて生産培養ユニットを使用するなど、２つ以上の異なる培養ユニットで作動される。いくつかの実施形態では、このプロセスは、増殖した種子培養物を１つ又は複数の種子培養ユニットから大きい生産ユニットに移すことを含む。いくつかの実施形態では、細胞の増殖から生産培養ユニット及び生産段階まで１つの物理的培養ユニットで達成し得、例えば最終生産規模まで細胞を増殖させた後、プロセスを生産条件に切り替え得る。レンチウイルス又はレンチウイルスベクターを下流で処理するために、使用済みの培地を培養期間の終了時に回収する。いくつかの実施形態では、採取物は、トランスフェクション後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間又は１２０時間時点で収集され得る。
いくつかの実施形態において、下流処理は、レンチウイルスの精製、製剤化及び／又は長期保存を含む。いくつかの実施形態では、培養期間の終了時に収集されるウイルス採取物は、例えば、約５×１０６形質導入単位／ミリリットル（ＴＵ／ｍＬ）～約７×１０７ＴＵ／ｍＬ（例えば、５×１０６ＴＵ／ｍＬ、５．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、６×１０６ＴＵ／ｍＬ、６．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、７×１０６ＴＵ／ｍＬ、７．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、８×１０６ＴＵ／ｍＬ、８．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、９×１０６ＴＵ／ｍＬ、９．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、１×１０７ＴＵ／ｍＬ、１．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、２×１０７ＴＵ／ｍＬ、２．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、３×１０７ＴＵ／ｍＬ、３．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、４×１０７ＴＵ／ｍＬ、４．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、５×１０７ＴＵ／ｍＬ、５．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、６×１０７ＴＵ／ｍＬ、６．５×１０７ＴＵ／ｍＬ又は７×１０７ＴＵ／ｍＬ）である。いくつかの実施形態では、培養期間の終了時に収集されるウイルス採取物は、少なくとも５×１０６ＴＵ／ｍＬ、５．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、６×１０６ＴＵ／ｍＬ、６．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、７×１０６ＴＵ／ｍＬ、７．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、８×１０６ＴＵ／ｍＬ、８．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、９×１０６ＴＵ／ｍＬ、９．５×１０６ＴＵ／ｍＬ、１×１０７ＴＵ／ｍＬ、１．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、２×１０７ＴＵ／ｍＬ、２．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、３×１０７ＴＵ／ｍＬ、３．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、４×１０７ＴＵ／ｍＬ、４．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、５×１０７ＴＵ／ｍＬ、５．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、６×１０７ＴＵ／ｍＬ、６．５×１０７ＴＵ／ｍＬ又は７×１０７ＴＵ／ｍＬの濃度で、レンチウイルスを含む。いくつかの実施形態では、培養期間の終了時に収集されるウイルス採取物は、５×１０６ＴＵ／ｍＬ～６×１０６ＴＵ／ｍＬ、６×１０６ＴＵ／ｍＬ～７×１０６ＴＵ／ｍＬ、７×１０６ＴＵ／ｍＬ～８×１０６ＴＵ／ｍＬ、８×１０６ＴＵ／ｍＬ～９×１０６ＴＵ／ｍ、９×１０６ＴＵ／ｍＬ～１×１０７ＴＵ／ｍＬ、１×１０７ＴＵ／ｍＬ～２×１０７ＴＵ／ｍＬ、２×１０７ＴＵ／ｍＬ～３×１０７ＴＵ／ｍＬ、３×１０７ＴＵ／ｍＬ～４×１０７ＴＵ／ｍＬ、４×１０７ＴＵ／ｍＬ～５×１０７ＴＵ／ｍＬ、５×１０７ＴＵ／ｍＬ～６×１０７ＴＵ／ｍＬ、６×１０７ＴＵ／ｍＬ～７×１０７ＴＵ／ｍＬの濃度で、レンチウイルスを含む。
濾過及びクロマトグラフィーを含む精製方法
いくつかの態様において、本開示は、例えば、より大量のレンチウイルスベクターが回収されるような、改善された効率でレンチウイルスベクターを精製するためのプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、精製プロセスにおける少なくとも１つのステップは、さらなる精製、例えば遠心分離、濾過又はクロマトグラフィー前に精製中間組成物（精製完了前の緩衝液を含む中間組成物）に薬剤、例えばアミノ酸又はその塩、例えばアルギニン又はその塩、例えばアルギニン－ＨＣｌを添加して精製プロセスを改善することを含む。いくつかの実施形態では、濾過は、フロー濾過、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過を指し得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを含み得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って生産されたレンチウイルスベクターは、以下の特性の１つ又は複数を有する：ＧＭＰガイドラインに準拠している、無菌である、実質的に汚染物質がない、医薬用途に適している、ヒト対象への投与に適しているか又はヒト細胞のエクスビボ処理に適している。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、溶液又は懸濁液を半透膜（濾過）に付すが、これは、溶媒及び小さい溶質分子を通過させるが、より大きい粒子、例えばウイルス粒子を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、フィルターを使用して、塩、糖及び非水溶媒を除去及び交換し、結合種から遊離したものを分離し、低分子量物質を除去し、且つ／又はイオン性及び／若しくはｐＨ環境の急速な変化を引き起こす。濾過ステップを用いて、溶液又は懸濁液中のベクターの濃度を高めることができる。いくつかの実施形態では、濾過ステップを使用して、採取物中のレンチウイルス粒子の濃度を高める。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、濾過ステップ（例えば、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過及び透析濾過の１つ若しくは複数）を順次又は同時に含むプロセス、技術若しくは技術の組合せを利用する。いくつかの実施形態では、濾過は、フラットシート膜又は中空糸を用いて行われる。いくつかの実施形態では、濾過は、約０．１～０．５バール（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４又は０．５バール）の平均膜間差圧を用いて実施される。いくつかの実施形態では、濾過は、４～１００Ｌ／ｍ２、例えば約４～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０又は８０～９０の負荷を用いて実施される。本開示の特定の実施形態では、濾過ステップを使用して、任意選択でクロマトグラフィー又は他の精製ステップと組み合わせて、本開示に関連して使用される様々な緩衝液を交換し、また任意選択でウイルス採取物から不純物を除去する。
上に記載され、当技術分野で知られているものなどの濾過技術を使用して、レンチウイルスベクターが調製される微生物及び細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞）を実質的に含まないレンチウイルス調製物を生産することができる。さらに又は代替的に、混入ポリヌクレオチド（例えば、レンチウイルスベクターが産生された細胞に由来する非レンチウイルスポリヌクレオチド、例えば染色体哺乳動物ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ、ＲＮＡ又はレンチウイルス導入遺伝子に含まれない他のポリヌクレオチドなど）を実質的に含まない調製物を生産するように、本開示のレンチウイルスベクター調製物をヌクレアーゼで処理し得る。
例えば、精製に使用するための緩衝液（バッファー）
種々の緩衝液、例えばウイルスベクター精製に使用される緩衝剤を含む緩衝剤を含む水性組成物は、当技術分野で公知であり、そうしたものとして、限定はされないが、スルホン酸系緩衝液、例えば１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）系緩衝液（ＰＩＰＥＳ緩衝液）、ポリオール系緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液が挙げられむ。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される精製プロセスに関連して使用される緩衝液は、スルホン酸系緩衝液、例えばＰＩＰＥＳ緩衝液である。いくつかの実施形態において、ＰＩＰＥＳ緩衝液は、緩衝剤、例えば約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１５ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、例えば約２０ｍＭの濃度のＰＩＰＥＳを含み得る。
いくつかの実施形態において、緩衝液は、塩、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）若しくは塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）又はそれらの任意の組合せをさらに含み得る。塩は、例えば、水性レンチウイルス調製物中に約１ｍＭ～約１Ｍ（例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、４７５ｍＭ、５００ｍＭ、５２５ｍＭ、５７５ｍＭ、６００ｍＭ、６２５ｍＭ、６５０ｍＭ、６７５ｍＭ、７００ｍＭ、７２５ｍＭ、７５０ｍＭ、７７５ｍＭ、８００ｍＭ、８２５ｍＭ、８５０ｍＭ、８７５ｍＭ、９００ｍＭ、９２５ｍＭ、９５０ｍＭ、９５７ｍＭ又は１Ｍ）の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ又は約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ又は１５０ｍＭ）である。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、必要に応じて、５０ｍＭ又は７５ｍＭであり得る。
いくつかの実施形態において、緩衝液は、炭水化物、例えば非還元炭水化物、例えばスクロース又はトレハロースをさらに含有し得る。いくつかの実施形態では、炭水化物、例えばスクロースは、約３０ｍＭ～約３００ｍＭ、約４０ｍＭ～約２７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約６０ｍＭ～約２４０ｍＭ、約７０ｍＭ～約２２０ｍＭ、約３０ｍＭ～１５０ｍＭ又は約１５０～３００ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、緩衝液、例えばＰＩＰＥＳ緩衝液、例えば濾過用緩衝液、交換用緩衝液は、約５０ｍＭ～約８０ｍＭ、例えば約７３ｍＭの濃度のスクロースを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液、例えばＰＩＰＥＳ緩衝液、例えば製剤化用バッファー、保存用バッファーは、約２００ｍＭ～２５０ｍＭ、例えば約２２０ｍＭの濃度のスクロースを含む。
いくつかの実施形態において、炭水化物は、例えば、約１％～約１０％、約２．５％～約１０％又は約２．５％～約５重量／体積（ｗ／ｖ）％の濃度で存在し得る。例えば、本明細書に記載の非還元炭水化物などの炭水化物は、水性レンチウイルス調製物の１ｗ／ｖ％、１．５ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％、２．５ｗ／ｖ％、３ｗ／ｖ％、３．５ｗ／ｖ％、４ｗ／ｖ％、４．５ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、５．５ｗ／ｖ％、６ｗ／ｖ％、６．５ｗ／ｖ、７ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％、８ｗ／ｖ％、８．５ｗ／ｖ％、９ｗ／ｖ％、９．５ｗ／ｖ％又は１０ｗ／ｖ％の濃度で水性レンチウイルス調製物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非還元炭水化物などの炭水化物は、少なくとも１ｗ／ｖ％、１．５ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％、２．５ｗ／ｖ％、３ｗ／ｖ％、３．５ｗ／ｖ％、４ｗ／ｖ％、４．５ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、５．５ｗ／ｖ％、６ｗ／ｖ％、６．５ｗ／ｖ％、７ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％、８ｗ／ｖ％、８．５ｗ／ｖ％、９ｗ／ｖ％、９．５ｗ／ｖ％又は１０ｗ／ｖ％の濃度でレンチウイルス水性調製物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非還元炭水化物などの炭水化物は、１ｗ／ｖ％～２ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％～３ｗ／ｖ％、３ｗ／ｖ％～４ｗ／ｖ％、４ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％、６ｗ／ｖ％～７ｗ／ｖ％、７ｗ／ｖ％～８ｗ／ｖ％、８ｗ／ｖ％～９ｗ／ｖ％、９ｗ／ｖ％～１０ｗ／ｖ％の濃度で、レンチウイルス水性調製物中に存在し得る。
いくつかの実施形態において、緩衝液は、例えば、アルギニン又はその塩、例えばアルギニン－ＨＣｌをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤、例えばアルギニン又はその塩、例えばアルギニン一塩酸塩（アルギニン－ＨＣｌ）は、約２５～５０ｍＭ（例えば、約５０ｍＭ）、５０～１００ｍＭ（例えば、約７５ｍＭ）、１００～２００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ）又は２００～４００（例えば、約３００）ｍＭの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、緩衝液の少なくとも１つ、例えばウイルス精製（例えば、本明細書に開示されるプロセスを用いたレンチウイルス精製）に使用されるＰＩＰＥＳ緩衝液は、アルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌを含有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される精製プロセスで使用される緩衝液のｐＨは、約５．０～約８．０、例えば６．０～約７．０（例えば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９又は７．０）、例えば約６．５である。
いくつかの実施形態において、ＰＩＰＥＳ緩衝液は、交換用緩衝液、濾過用緩衝液、製剤化用緩衝液及び／又は保存用緩衝液の１つ又は複数として使用され得る。いくつかの実施形態において、ＰＩＰＥＳ、ＮａＣｌ及びスクロースの濃度の比は、ＰＩＰＥＳ濾過用緩衝液、ＰＩＰＥＳ交換用緩衝液、ＰＩＰＥＳ製剤化用緩衝液及びＰＩＰＥＳ保存用緩衝液で異なる。いくつかの実施形態では、ＰＩＰＥＳ、ＮａＣｌ及びスクロースの濃度の比は、ＰＩＰＥＳ濾過用緩衝液、ＰＩＰＥＳ交換用緩衝液、ＰＩＰＥＳ製剤化用緩衝液及びＰＩＰＥＳ保存用緩衝液において同一である。いくつかの実施形態では、ＰＩＰＥＳ、ＮａＣｌ及びスクロースの濃度の比は、ＰＩＰＥＳ交換用緩衝液及びＰＩＰＥＳ濾過用緩衝液において同一である。いくつかの実施形態では、ＰＩＰＥＳ、ＮａＣｌ、スクロース及び任意選択でアルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌの濃度の比は、ＰＩＰＥＳ製剤化用緩衝液及びＰＩＰＥＳ保存用緩衝液において同一である。
アルギニン添加
いくつかの実施形態において、アルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌは、精製中に細胞培養採取物に添加される。いくつかの実施形態では、アルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌは、精製中に緩衝液、例えばＰＩＰＥＳ緩衝液又はＰＩＰＥＳ緩衝液を含む精製中間組成物に添加される。いくつかの実施形態では、アルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌは、アルギニンを含まないＰＩＰＥＳ緩衝液に添加される。いくつかの実施形態では、アルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌは、アルギニンを含むＰＩＰＥＳ緩衝液に添加される。いくつかの実施形態では、薬剤、例えばアルギニン又はその塩、例えば一塩アルギニン（アルギニン－ＨＣｌ）は、約２５～５０ｍＭ（例えば、約５０ｍＭ）、５０～１００ｍＭ（例えば、約７５ｍＭ）、１００～２００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ）又は２００～４００（例えば、約３００）ｍＭの濃度で添加される。
いくつかの実施形態において、ベクター回収率、レンチウイルスの形質導入単位の量は、例えば、アルギニンを精製中間組成物に添加することを含む精製ステップを含む精製プロセスでは、精製中間組成物にアルギニンを添加することを含む精製ステップを含まない精製プロセスと比較して約１０％～３００％、２０％～１８０％、３０％～１６０％、５０％～１５０％、７５％～１２５％又は約１００％だけ高い。いくつかの実施形態では、アルギニンの添加は、精製の処理時間を短縮する。いくつかの実施形態では、精製が、例えば、アルギニン又はその塩、例えばアルギニン－ＨＣｌを精製中間組成物に添加することを含む場合、精製の処理時間は、精製中間体組成物にアルギニンを添加することを含まない以外には類似する精製方法と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％改善される。いくつかの実施形態では、アルギニン又はその塩、例えばアルギニン－ＨＣｌの添加と、それに続く精製ステップ後の精製中間組成物は、マイクロフローイメージングによって測定された場合、１ｍｌ当たり４００，０００、３００，０００、２００，０００又は１００，０００未満の総粒子濃度を示す。理論に縛られることを望まないが、いくつかの実施形態において、マイクロフローイメージングでは、個々のレンチウイルス粒子（例えば、感染性ウイルス粒子）は、実質的に検出されないが、凝集体、例えば非機能性ウイルスの凝集体を含むより大きい粒子は、検出される。いくつかの実施形態では、アルギニン又はその塩、例えばアルギニン－ＨＣｌの添加、それに続く精製ステップ後の精製中間組成物は、マイクロフローイメージングによって測定された場合、１ｍｌ当たり約５，０００、４，５００、４，０００、３，５００、３，０００又は２，５００未満の≧１０μｍの粒子の濃度を示す。いくつかの実施形態では、アルギニン又はその塩、例えばアルギニン－ＨＣｌを添加した後の精製中間組成物、例えばアルギニン－ＨＣｌの添加と、それに続く精製ステップ後の精製中間組成物は、マイクロフローイメージングによって測定された場合、１ｍｌ当たり約５００、４００、３００又は２００未満の≧２５μｍの濃度を示す。いくつかの実施形態では、凝集体が減少すると、所与の時点での濾過膜の閉塞が低減する。いくつかの実施形態では、アルギニンは、レンチウイルス粒子を安定化させる。
いくつかの実施形態において、精製レンチウイルス組成物は、例えば、１ミリリットル当たり約１×１０７形質導入単位（ＴＵ／ｍＬ）～約７×１０７ＴＵ／ｍＬ（例えば、１×１０７ＴＵ／ｍＬ、１．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、２×１０７ＴＵ／ｍＬ、２．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、３×１０７ＴＵ／ｍＬ、３．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、４×１０７ＴＵ／ｍＬ、４．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、５×１０７ＴＵ／ｍＬ、５．５×１０７ＴＵ／ｍＬ、６×１０７ＴＵ／ｍＬ、６．５×１０７ＴＵ／ｍＬ又は７×１０７ＴＵ／ｍＬ）の濃度でレンチウイルスベクターを含む。
レンチウイルス保存のための水性組成物
いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、本明細書に開示されるレンチウイルスベクター及び緩衝液、例えば製剤化用緩衝液又は保存用緩衝液、例えばＰＩＰＥＳ緩衝液、例えばアルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌを含むＰＩＰＥＳ緩衝液を含む調製物、例えば水性混合物、例えば水溶液又は懸濁液、例えば水性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、製剤化用緩衝液又は保存用緩衝液、例えばＰＩＰＥＳ緩衝液、例えばアルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌを含むＰＩＰＥＳ緩衝液を含むレンチウイルス製剤は、ＨＥＰＥＳなどの従来のレンチウイルス製剤化用緩衝液を含有するレンチウイルス製剤と比較して、改善された生物学的特性を示す。これらの改善された生物学的特性には、国際公開第２０１７０８７８６１Ａ１号パンフレットに開示されているように、広範な温度及び塩濃度での凝集に対する耐性の増加が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＩＰＥＳ緩衝液は、生理学的及び高温（４２℃及び５０℃など）での形質導入能力の改善と共に、複数回の凍結／融解サイクル中の感染性の喪失に対する耐性の増加を示す。本開示のレンチウイルス調製物と併せて有用な他の緩衝液としては、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、ＭＥＳ緩衝液及びＭＯＰＳ緩衝液が挙げられる。本開示のレンチウイルス調製物は、任意選択で、塩化ナトリウムなどの塩を含み得、また任意選択で非還元炭水化物などの炭水化物を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＰＩＰＥＳ製剤化用緩衝液及び／又は保存用緩衝液は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１５ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、例えば約２０ｍＭの濃度の緩衝剤、例えばＰＩＰＥＳを含み得る。レンチウイルスベクター調製物は、任意選択で、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム又は塩化カルシウムなどの塩を含むことができる。塩は、例えば、水性レンチウイルス調製物中に約１ｍＭ～約１Ｍ（例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、４７５ｍＭ、５００ｍＭ、５２５ｍＭ、５７５ｍＭ、６００ｍＭ、６２５ｍＭ、６５０ｍＭ、６７５ｍＭ、７００ｍＭ、７２５ｍＭ、７５０ｍＭ、７７５ｍＭ、８００ｍＭ、８２５ｍＭ、８５０ｍＭ、８７５ｍＭ、９００ｍＭ、９２５ｍＭ、９５０ｍＭ、９５７ｍＭ又は１Ｍ）の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、少なくとも約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、４７５ｍＭ、５００ｍＭ、５２５ｍＭ、５７５ｍＭ、６００ｍＭ、６２５ｍＭ、６５０ｍＭ、６７５ｍＭ、７００ｍＭ、７２５ｍＭ、７５０ｍＭ、７７５ｍＭ、８００ｍＭ、８２５ｍＭ、８５０ｍＭ、８７５ｍＭ、９００ｍＭ、９２５ｍＭ、９５０ｍＭ、９５７ｍＭ又は１Ｍである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、１～２ｍＭ、２～３ｍＭ、３～４ｍＭ、４～５ｍＭ、５～６ｍＭ、６～７ｍＭ、７～８ｍＭ、８～９ｍＭ、９～１０ｍＭ、１０～１５ｍＭ、１５～２０ｍＭ、２０～２５ｍＭ、２５～３０ｍＭ、３０～３５ｍＭ、３５～４０ｍＭ、４０～４５ｍＭ、４５～５０ｍＭ、５０～５５ｍＭ、５５～６０ｍＭ、６０～６５ｍＭ、６５～７０ｍＭ、７０～７５ｍＭ、７５～８０ｍＭ、８０～８５ｍＭ、８５～９０ｍＭ、９０～１００ｍＭ、１００～１２５ｍＭ、１２５～１５０ｍＭ、１５０～１７５ｍＭ、１７５～２００ｍＭ、２００～２２５ｍＭ、２２５～２５０ｍＭ、２５０～２７５ｍＭ、２７５～３００ｍＭ、３００～３２５ｍＭ、３２５～３５０ｍＭ、３５０～３７５ｍＭ、３７５～４００ｍＭ、４００～４５０ｍＭ、４５０～４７５ｍＭ、４７５～５００ｍＭ、５００～５２５ｍＭ、５２５～５７５ｍＭ、５７５～６００ｍＭ、６００～６２５ｍＭ、６２５～６５０ｍＭ、６５０～６７５ｍＭ、６７５～７００ｍＭ、７００～７２５ｍＭ、７２５～７５０ｍＭ、７５０～７７５ｍＭ、７７５～８００ｍＭ、８００～８２５ｍＭ、８２５～８５０ｍＭ、８５０～８７５ｍＭ、８７５～９００ｍＭ、９００～９２５ｍＭ、９２５～９５０ｍＭ、９５０～９７５ｍＭ又は９５７ｍＭ～１Ｍである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ又は約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ又は１５０ｍＭ）である。いくつかの態様において、塩の濃度は、必要に応じて、５０ｍＭ又は７５ｍＭであり得る。
本開示のレンチウイルスベクター調製物は、任意選択で、本明細書に記載の非還元炭水化物などの炭水化物を含有し得る。例示的な非還元炭水化物としては、とりわけスクロース及びトレハロースが挙げられる。レンチウイルスベクター調製物に含まれる場合、炭水化物は、例えば、水性レンチウイルス調製物の例えば、約１％～約１０％、約２．５％～約１０％又は約２．５％～約５％重量／体積（ｗ／ｖ）の濃度で存在し得る。例えば、本明細書に記載の非還元炭水化物などの炭水化物は、１ｗ／ｖ％、１．５ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％、２．５ｗ／ｖ％、３ｗ／ｖ％、３．５ｗ／ｖ％、４ｗ／ｖ％、４．５ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、５．５ｗ／ｖ％、６ｗ／ｖ％、６．５ｗ／ｖ％、７ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％、８ｗ／ｖ％、８．５ｗ／ｖ％、９ｗ／ｖ％、９．５ｗ／ｖ％又は１０ｗ／ｖ％の濃度で水性レンチウイルス調製物中に存在し得る。
本開示のレンチウイルスベクター調製物は、アミノ酸又はその塩；例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン又はこれらの塩を含み得る。レンチウイルスベクター調製物に含まれる場合、アミノ酸、例えばアルギニン－ＨＣｌは、約２５～５０ｍＭ（例えば、約５０ｍＭ）、５０～１００ｍＭ（例えば、約７５ｍＭ）、１００～２００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ）又は２００～４００（例えば、約３００）ｍＭの濃度で存在し得る。いくつかの態様において、本明細書に開示されるレンチウイルスベクター調製物は、２つ以上のアミノ酸又はその塩、例えばアルギニン又はその塩及びヒスチジン又はその塩を含み得る。
本明細書に記載のレンチウイルスベクター調製物は、例えば、約５．０～約８．０、例えば６．０～約７．０（例えば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９又は７．０）のｐＨを呈示し得る。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクター調製物のｐＨは、６．５である。
いくつかの実施形態において、ＰＩＰＥＳ製剤化用緩衝液及びＰＩＰＥＳ保存用緩衝液は、同一の組成、例えば同一濃度のＰＩＰＥＳ、ＮａＣｌ、スクロース及び任意選択でアルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、ＰＩＰＥＳ製剤化用緩衝液及びＰＩＰＥＳ保存用緩衝液は、異なる組成、例えば異なる濃度のＰＩＰＥＳ、ＮａＣｌ、スクロース及び任意選択でアルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌを含む。
レンチウイルスベクターは、本開示のレンチウイルス調製物中に様々な濃度で存在し得る。例えば、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス調製物中において、例えば約１×１０７形質導入単位／ミリリットル（ＴＵ／ｍＬ）～約１×１０９ＴＵ／ｍＬ（例えば、１×１０７ＴＵ／ｍＬ、２×１０７ＴＵ／ｍＬ、３×１０７ＴＵ／ｍＬ、４×１０７ＴＵ／ｍＬ、５×１０７ＴＵ／ｍＬ、６×１０７ＴＵ／ｍＬ、７×１０７ＴＵ／ｍＬ、８×１０７ＴＵ／ｍＬ、９×１０７ＴＵ／ｍＬ、１×１０８ＴＵ／ｍＬ、１．５×１０８ＴＵ／ｍＬ、２×１０８ＴＵ／ｍＬ、２．５×１０８ＴＵ／ｍＬ、３×１０８ＴＵ／ｍＬ、３．５×１０８ＴＵ／ｍＬ、４×１０８ＴＵ／ｍＬ、４．５×１０８ＴＵ／ｍＬ、５×１０８ＴＵ／ｍＬ、５．５×１０８ＴＵ／ｍＬ、６×１０８ＴＵ／ｍＬ、６．５×１０８ＴＵ／ｍＬ、７×１０８ＴＵ／ｍＬ、７．５×１０８ＴＵ／ｍＬ、８×１０８ＴＵ／ｍＬ、８．５×１０８ＴＵ／ｍＬ、９×１０８ＴＵ／ｍＬ、９．５×１０８ＴＵ／ｍＬ又は１×１０９ＴＵ／ｍＬ）の濃度で存在し得る。必要に応じて、レンチウイルス調製物は、約３×１０８ＴＵ／ｍＬ～約５×１０８ＴＵ／ｍＬ（例えば、３×１０８ＴＵ／ｍＬ、３．５×１０８ＴＵ／ｍＬ、４×１０８ＴＵ／ｍＬ、４．５×１０８ＴＵ／ｍＬ又は５×１０８ＴＵ／ｍＬ）の濃度のレンチウイルスベクターを含有し得る。
本開示は、それぞれレンチウイルスベクターと、リン酸緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液からなる群から選択される緩衝液と、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム又は塩化カルシウム）とを含有する水性組成物も提供する。これらの組成物は、炭水化物、例えば非還元炭水化物（例えば、スクロース又はトレハロース）をさらに含有し得る。
いくつかの実施形態において、水性組成物、例えば本明細書に記載のレンチウイルスベクターを含む水性組成物は、低温、例えば１０℃、６℃、４℃、０℃、－１０℃、－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃又は９０℃で一定時間、例えば約２０分、４０分、６０分、１．５時間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、２０日、２１日又は２５日にわたって保存することができる。いくつかの実施形態では、水性組成物は、１０℃、６℃、４℃、０℃、－１０℃、－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃又は９０℃未満で保存される。いくつかの実施形態では、ＰＩＰＥＳ保存用緩衝液で保存される精製レンチウイルスサンプルは、精製された直後、－８０℃にて凍結状態で保存される。いくつかの実施形態では、このように保存されたレンチウイルス調製物は、使用前に解凍し、再凍結することができる（例えば、凍結融解サイクル）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように調製及び保存されるレンチウイルス調製物は、安定性及び／又は感染性の有意な喪失なしに、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回の凍結融解サイクルを受け得る。いくつかの実施形態では、調製物は、凍結融解サイクルを一度も経ていないレンチウイルス調製物と比較して安定性及び／又は感染性の０．５％以下、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下又は８０％以下の安定性及び／又は感染性の喪失を示す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるレンチウイルス調製物は、４℃で一定期間、例えば約２０分、４０分、６０分、１．５時間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、２０日、２１日又は２５日にわたって保存することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルス調製物は、－８０℃で一定期間、例えば約２０分、４０分、６０分、１．５時間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、２０日、２１日又は２５日にわたって保存することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のように保存された（例えば、凍結状態で保存された）レンチウイルス調製物は、一度も凍結されなかったレンチウイルスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の感染力を示す。いくつかの実施形態では、レンチウイルス調製物は、２回以上（例：２、３、４、５、６、７、８又は９回）の凍結融解サイクルを受けた後、．５％以上、１％以上、２％以上、５％以上、７％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上感染力を喪失しない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のように保存された（例えば、凍結状態で保存される）レンチウイルス調製物は、一度も凍結されなかったレンチウイルスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％安定である。いくつかの実施形態では、レンチウイルス調製物は、ベクター完全性の改善のために、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも５日、少なくとも７日間凍結した後に使用される。
本開示は、本明細書に記載の水性組成物を乾燥又は凍結乾燥することによって調製される乾燥又は凍結乾燥組成物並びに本明細書に記載の緩衝液（又は投与のための別の標準的なビヒクル）中でそのような乾燥又は凍結乾燥組成物を再構成することによって調製される水性組成物をさらに含む。
ＣＡＲ標的
免疫エフェクター細胞を、望ましくない細胞（例えば、癌細胞）に指向させる、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を形質導入するウイルスベクターが本明細書に記載される。これは、癌関連抗原に対して特異的であるＣＡＲ上の抗原結合ドメインを通して達成される。ＣＡＲにより標的化され得る２つのクラスの癌関連抗原（腫瘍抗原）は、（１）癌細胞の表面に発現される癌関連抗原；及び（２）それ自体細胞内であるが、そのような抗原（ペプチド）のフラグメントがＭＨＣ（主要組織適合複合体）により癌細胞の表面に提示される癌関連抗原である。
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９及び１９Ａ２４とも称される）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１又はＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（ＴｎＡｇ）又は（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスチシン又はＰＲＳＳ２１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）；ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体α；受容体チロシン－プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びエーベルソンマウス白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレノセプターβ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６、染色体１２ｐに位置する（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；***タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンギオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１又はガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（メランＡ又はＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；サルコーマ転座切断点；黒色腫アポトーシス阻害因子（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス性癌遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ又は刷り込み部位の調節因子のブラザー）、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；後期糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓遍在性１（ＲＵ１）；腎臓遍在性２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；又は免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）の１つ以上から選択される。
本明細書に記載のＣＡＲは、腫瘍支持抗原（例えば、本明細書に記載の腫瘍支持抗原）に結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体フラグメント、ＴＣＲ又はＴＣＲフラグメント）を含むことができる。いくつかの実施形態では、腫瘍支持抗原は、間質細胞又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上に存在する抗原である。間質細胞は、微小環境での細胞***を促進するために、成長因子を分泌することができる。ＭＤＳＣ細胞は、Ｔ細胞の増殖及び活性化を阻害することができる。理論に縛られることを望まないが、いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、腫瘍支持細胞を破壊し、それにより間接的に腫瘍の増殖又は生存を阻害する。
複数の実施形態において、間質細胞抗原は、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びテネイシンの１つ又は複数から選択される。一実施形態において、ＦＡＰ特異的抗体は、シブロツズマブであるか、シブロツズマブと結合について競合するか、又はシブロツズマブと同じＣＤＲを有する。複数の実施形態では、ＭＤＳＣ抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５及びＣＤ６６ｂの１つ又は複数から選択される。従って、いくつかの実施形態では、腫瘍支持抗原は、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はテネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５及びＣＤ６６ｂの１つ又は複数から選択される。
ＣＤ１９
非限定的な例示的腫瘍抗原は、ＣＤ１９である。ＣＤ１９に結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット及び同第２０１４／１５３２７０号パンフレットに開示されているものを本開示に従って用い得る。当技術分野では、任意の公知のＣＤ１９ ＣＡＲ、例えば任意の公知のＣＤ１９ ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。例えば、ＬＧ－７４０；米国特許第８，３９９，６４５号明細書に記載のＣＤ１９ ＣＡＲ；米国特許第７，４４６，１９０号明細書；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２０１３ ５４（２）：２５５－２６０（２０１２）；Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２２（１７）：２９６５－２９７３（２０１３）；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８（１８）：４８１７－４８２８（２０１１）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６（２０）：４０９９－１０２（２０１０）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２２（２５）：４１２９－３９（２０１３）；及び１６ｔｈ Ａｎｎｕ Ｍｅｅｔ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ（ＡＳＧＣＴ）（Ｍａｙ １５－１８，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ）２０１３，Ａｂｓｔ １０。
非限定的な例示的なＣＤ１９ ＣＡＲは、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ又はＸｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １２３．２４（２０１４）：３７５０－９；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １２２．２５（２０１３）：４１２９－３９，Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １２２．１７（２０１３）：２９６５－７３、ＮＣＴ００５８６３９１、ＮＣＴ０１０８７２９４、ＮＣＴ０２４５６３５０、ＮＣＴ００８４０８５３、ＮＣＴ０２６５９９４３、ＮＣＴ０２６５０９９９、ＮＣＴ０２６４０２０９、ＮＣＴ０１７４７４８６、ＮＣＴ０２５４６７３９、ＮＣＴ０２６５６１４７、ＮＣＴ０２７７２１９８、ＮＣＴ００７０９０３３、ＮＣＴ０２０８１９３７、ＮＣＴ００９２４３２６、ＮＣＴ０２７３５０８３、ＮＣＴ０２７９４２４６、ＮＣＴ０２７４６９５２、ＮＣＴ０１５９３６９６、ＮＣＴ０２１３４２６２、ＮＣＴ０１８５３６３１、ＮＣＴ０２４４３８３１、ＮＣＴ０２２７７５２２、ＮＣＴ０２３４８２１６、ＮＣＴ０２６１４０６６、ＮＣＴ０２０３０８３４、ＮＣＴ０２６２４２５８、ＮＣＴ０２６２５４８０、ＮＣＴ０２０３０８４７、ＮＣＴ０２６４４６５５、ＮＣＴ０２３４９６９８、ＮＣＴ０２８１３８３７、ＮＣＴ０２０５０３４７、ＮＣＴ０１６８３２７９、ＮＣＴ０２５２９８１３、ＮＣＴ０２５３７９７７、ＮＣＴ０２７９９５５０、ＮＣＴ０２６７２５０１、ＮＣＴ０２８１９５８３、ＮＣＴ０２０２８４５５、ＮＣＴ０１８４０５６６、ＮＣＴ０１３１８３１７、ＮＣＴ０１８６４８８９、ＮＣＴ０２７０６４０５、ＮＣＴ０１４７５０５８、ＮＣＴ０１４３０３９０、ＮＣＴ０２１４６９２４、ＮＣＴ０２０５１２５７、ＮＣＴ０２４３１９８８、ＮＣＴ０１８１５７４９、ＮＣＴ０２１５３５８０、ＮＣＴ０１８６５６１７、ＮＣＴ０２２０８３６２、ＮＣＴ０２６８５６７０、ＮＣＴ０２５３５３６４、ＮＣＴ０２６３１０４４、ＮＣＴ０２７２８８８２、ＮＣＴ０２７３５２９１、ＮＣＴ０１８６０９３７、ＮＣＴ０２８２２３２６、ＮＣＴ０２７３７０８５、ＮＣＴ０２４６５９８３、ＮＣＴ０２１３２６２４、ＮＣＴ０２７８２３５１、ＮＣＴ０１４９３４５３、ＮＣＴ０２６５２９１０、ＮＣＴ０２２４７６０９、ＮＣＴ０１０２９３６６、ＮＣＴ０１６２６４９５、ＮＣＴ０２７２１４０７、ＮＣＴ０１０４４０６９、ＮＣＴ００４２２３８３、ＮＣＴ０１６８０９９１、ＮＣＴ０２７９４９６１又はＮＣＴ０２４５６２０７に記載される抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含み、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）に記載されるＦＭＣ６３ ｓｃＦｖフラグメントと同じ又は類似の結合特異性を有する。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインはＣＤ１９に結合し、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）に記載されるｓｃＦｖフラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）は、ＣＤ１９に結合し、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（参照により本明細書に援用される）の表３からの配列を含む。国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットには、多様なＣＡＲ構築物の結合及び有効性をアッセイする方法も記載されている。
マウスＣＤ１９抗体のヒト化は、ＣＡＲＴ１９治療、即ち、ＣＡＲ１９構築物で形質導入されたＴ細胞による治療を受けている患者において、マウス特異的残基がヒト抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘発し得る臨床現場で要望されている。ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ配列の産生、特性評価及び有効性は、実施例１～５（ｐ．１１５～１５９）を含め、その全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットに記載されている。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に提供されるＣＡＲ１９構築物の親マウスｓｃＦｖ配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットに記載のｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットにおいて配列番号１２として提供される融合ポリペプチド配列を含み、これは、ヒトＣＤ１９に特異的に結合するマウス起源のｓｃＦｖフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットで配列番号１２として提供されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、
のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同な配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、
のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、アミノ酸配列：
を含むヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列、例えば以下の表１に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくは全長ＣＡＲ配列又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
例示的なＣＤ１９ ＣＡＲ Ａ
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＦＭＣ６３モノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ活性化ドメインの結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２５のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２５のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２５のポリペプチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。 いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２５の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２５の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２５の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。
例示的なＣＤ１９ ＣＡＲ Ｂ
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ３－ζ共刺激ドメインに連結されたマウス抗ＣＤ１９一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ１９一本鎖可変フラグメントは、ＦＭＣ６３抗体（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３４（１６－１７）：１１５７－１１６５，１９９７に記載の抗体；その内容全体が参照により本明細書に援用される）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２６のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２６のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２６のポリペプチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２６の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２６の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２６の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２６の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２６の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２６の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２６の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２６の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２６の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。
例示的なＣＤ１９ ＣＡＲ Ｃ
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ３－ζ共刺激ドメインに連結されたマウス抗ＣＤ１９一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２７のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２７のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２７のポリペプチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２７の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２７の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２７の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２７の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２７の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２７の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２７の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２７の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２７の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。
例示的なＣＤ１９ ＣＡＲ Ｆ
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２７のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表３４のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表３４のポリペプチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つ以下の変異を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表３４の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表３４の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表３４の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表３４の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表３４の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表３４の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表３４の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表３４の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表３４の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。
例示的なＣＤ１９－ＣＤ２０ ＣＡＲ Ｇ
いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。特定の実施形態では、ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲは、ＣＤ１９を標的とする軽鎖可変ドメインと、異なる標的（例えば、ＣＤ２０）を標的とする重鎖可変ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ｃａｒは、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２０ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、二重特異的ＣＡＲは、表３５のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つの変異を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、表３５のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つの変異を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、表３５のポリペプチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１つの変異を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、表３５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表３５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表３５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、表３５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表３５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表３５の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、表３５の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表３５の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表３５の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。
ＢＣＭＡ
非限定的な例示的腫瘍抗原は、ＢＣＭＡである。ＢＣＭＡに結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレット又は同第２０１９／２４１４２６号パンフレットに開示されるものを本開示に従って使用することができる。当技術分野では、任意の公知のＢＣＭＡ ＣＡＲ、例えば任意の公知のＢＣＭＡ ＣＡＲのＢＣＭＡ抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。例えば、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットに開示されるＢＣＭＡ－１、ＢＣＭＡ－２、ＢＣＭＡ－３、ＢＣＭＡ－４、ＢＣＭＡ－５、ＢＣＭＡ－６、ＢＣＭＡ－７、ＢＣＭＡ－８、ＢＣＭＡ－９、ＢＣＭＡ－１０、ＢＣＭＡ－１１、ＢＣＭＡ－１２、ＢＣＭＡ－１３、ＢＣＭＡ－１４、ＢＣＭＡ－１５、１４９３６２、１４９３６３、１４９３６４、１４９３６５、１４９３６６、１４９３６７、１４９３６８、１４９３６９、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ａ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｇ１、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７９－Ｃ１、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｃ７、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｄ１０、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７９－Ｃ１２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８０－Ｇ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８０－Ｄ２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ａ１０、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｄ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８０－Ａ２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８１－Ｃ３、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｇ４、Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２又はＣ１３Ｆ１２．１である。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットに開示されるＢＣＭＡ－１、ＢＣＭＡ－２、ＢＣＭＡ－３、ＢＣＭＡ－４、ＢＣＭＡ－５、ＢＣＭＡ－６、ＢＣＭＡ－７、ＢＣＭＡ－８、ＢＣＭＡ－９、ＢＣＭＡ－１０、ＢＣＭＡ－１１、ＢＣＭＡ－１２、ＢＣＭＡ－１３、ＢＣＭＡ－１４、ＢＣＭＡ－１５、１４９３６２、１４９３６３、１４９３６４、１４９３６５、１４９３６６、１４９３６７、１４９３６８、１４９３６９、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ａ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｇ１、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７９－Ｃ１、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｃ７、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｄ１０、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７９－Ｃ１２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８０－Ｇ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８０－Ｄ２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ａ１０、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｄ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８０－Ａ２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８１－Ｃ３、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｇ４、Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２又はＣ１３Ｆ１２．１の、１つ以上のＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦＶ若しくは全長配列又はそれと実質的に（例えば、９５～９９％）同一の配列を含む。
ＢＣＭＡに結合する例示的な抗原結合ドメインは、国際公開第２０１２／０１６３８０５号パンフレット、同第２０１７／０２１４５０号パンフレット、同第２０１７／０１１８０４号パンフレット、同第２０１７／０２５０３８号パンフレット、同第２０１６／０９０３２７号パンフレット、同第２０１６／１３０５９８号パンフレット、同第２０１６／２１０２９３号パンフレット、同第２０１６／０９０３２０号パンフレット、同第２０１６／０１４７８９号パンフレット、同第２０１６／０９４３０４号パンフレット、同第２０１６／１５４０５５号パンフレット、同第２０１５／１６６０７３号パンフレット、同第２０１５／１８８１１９号パンフレット、同第２０１５／１５８６７１号パンフレット、米国特許第９，２４３，０５８号明細書、同第８，９２０，７７６号明細書、同第９，２７３，１４１号明細書、同第７，０８３，７８５号明細書、同第９，０３４，３２４号明細書、米国特許出願公開第２００７／００４９７３５号明細書、同第２０１５／０２８４４６７号明細書、同第２０１５／００５１２６６号明細書、同第２０１５／０３４４８４４号明細書、同第２０１６／０１３１６５５号明細書、同第２０１６／０２９７８８４号明細書、同第２０１６／０２９７８８５号明細書、同第２０１７／００５１３０８号明細書、同第２０１７／００５１２５２号明細書、同第２０１６／０２０３３２号明細書、国際公開第２０１６／０８７５３１号パンフレット、同第２０１６／０７９１７７号パンフレット、同第２０１５／１７２８００号パンフレット、同第２０１７／００８１６９号パンフレット、米国特許第９，３４０，６２１号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０２７３０５５号明細書、同第２０１６／０１７６９７３号明細書、同第２０１５／０３６８３５１号明細書、同第２０１７／００５１０６８号明細書、同第２０１６／０３６８９８８号明細書及び同第２０１５／０２３２５５７号明細書に開示されており、これらは、その全体が参照により本明細書に全面的に組み込まれる。いくつかの実施形態では、そこに開示されるＢＣＭＡ抗原結合ドメインの１つ又は複数の１つ又は複数の抗原結合ドメインである。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡに結合するヒト抗体又はヒト抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に（例えば、表２～１４に）記載されるヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの１つ若しくは複数（例えば、３つ全て）のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３並びに／又は本明細書に（例えば、表２～１４に）記載されるヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの１つ若しくは複数（例えば、３つ全て）のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に（例えば、表２、６及び１０に）記載のヒトＶＬ及び／又は本明細書に（例えば、表２、６及び１０に）記載のヒトＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、表２、６及び１０のアミノ酸配列のＶＬ及びＶＨを含むｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、以下を含む：表２、６及び１０に提供されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ若しくは３つの修飾（例えば、置換、例えば保存的置換）、但し、３０、２０若しくは１０以下の修飾（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列又は表２、６及び１０のアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含むＶＬ；及び／又は表２、６及び１０に提供されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ若しくは３つの修飾（例えば、置換、例えば保存的置換）、但し、３０、２０若しくは１０以下の修飾（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列又は表２、６及び１０のアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性を有する配列を含むＶＨ。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合ドメインは、以下を含む：
（１）下記から選択される１つ、２つ若しくは３つの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号５４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号５５のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号５６のＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は
（２）下記のいずれか１つに由来する１つ、２つ若しくは３つの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号４４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号８４のＨＣ ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号４４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣ ＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号４４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号６８のＨＣ ＣＤＲ３；又は（ｉｖ）配列番号４４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号７６のＨＣ ＣＤＲ３。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合ドメインは、以下を含む：
（１）下記のいずれか１つに由来する１つ、２つ若しくは３つの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号９５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１３１のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号１３２のＬＣ ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号９５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号９６のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣ ＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号９５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１１４のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号１１５のＬＣ ＣＤＲ３；又は（ｉｖ）配列番号９５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１１４のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は
（２）下記のいずれか１つに由来する１つ、２つ若しくは３つの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号８６のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１３０のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号８８のＨＣ ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号８６のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号８７のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号８８のＨＣ ＣＤＲ３；又は（ｉｉｉ）配列番号８６のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１０９のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号８８のＨＣ ＣＤＲ３。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合ドメインは、以下を含む：
（１）下記のいずれか１つに由来する１つ、２つ若しくは３つの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号１４７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１８２のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号１８３のＬＣ ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号１４７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１４８のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号１４９のＬＣ ＣＤＲ３；又は（ｉｉｉ）配列番号１４７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１７０のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号１７１のＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は
（２）下記のいずれか１つに由来する１つ、２つ若しくは３つの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号１７９のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１８０のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号１８１のＨＣ ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号１３７のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１３８のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号１３９のＨＣ ＣＤＲ３；又は（ｉｉｉ）配列番号１６０のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１６１のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号１６２のＨＣ ＣＤＲ３。
いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４４、４５、８４、５４、５５及び５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４４、４５、４６、５４、５５及び５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４４、４５、６８、５４、５５及び５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４４、４５、７６、５４、５５及び５６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４７、４８、８４、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４７、４８、４６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４７、４８、６８、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４７、４８、７６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９、５０、８５、６０、５８及び５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９、５０、５１、６０、５８及び５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９、５０、６９、６０、５８及び５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９、５０、７７、６０、５８及び５６のアミノ酸配列をそれぞれ含む。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列、例えば表２～１４に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくは全長ＣＡＲ配列又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、国際公開第２０１２／０１６３８０５号パンフレットからのＶＨ及びＶＬ配列を使用して生成され得る（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、国際公開第２０１９／２４１４２６号パンフレットからのＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ又は全長ＣＡＲ配列を使用して生成され得る（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｄ
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）の認識に特異的なマウス細胞外一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、それに続くヒトＣＤ８αヒンジ及びＣＤ１３７（４－１ＢＢ）及びＣＤ３ζ鎖のＴ細胞細胞質シグナル伝達ドメインに融合した膜貫通ドメインをタンデムで含む。ＢＣＭＡ ＣＡＲ ＤがＢＣＭＡ発現標的細胞に結合すると、ＣＤ３ζ及び４－１ＢＢドメインにより開始されるシグナル伝達、これに続いて、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の活性化が起こる。ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｄの抗原特異的活性化は、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の増殖、サイトカイン分泌及びそれに続くＢＣＭＡ発現細胞の細胞溶解死を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表２８のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表２８のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表２８のポリペプチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１の変異を有するヌクレオチド配列を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表２８の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２８の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２８の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表２８の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２８の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２８の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表２８の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２８の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２８の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。
例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｅ
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインに連結された２つの単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ抗原受容体は、（ａ）第１の抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む細胞外抗原結合ドメインと、第２の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗ＢＣＭＡ抗体の各々は、独立してＶｈＨドメインである。特定の実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂは、配列番号３７７のアミノ酸配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１以下の変異を有するペプチド配列を含むＶｈＨドメインに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂは、配列番号３８１のアミノ酸配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１以下の変異を有するペプチド配列を含むＶｈＨドメインに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、米国特許第１１，１８６，６４７号明細書に記載の任意のＢＣＭＡ ＣＡＲであり、その内容全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２９のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２９のヌクレオチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１以下の変異を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表２９のポリペプチド配列或いはその少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％若しくは１００％又はそれに対する２０、１５、１０、８、５、４、３、２若しくは１以下の変異を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表２９の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２９の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２９の配列の重鎖ＣＤＲ１－３及び軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表２９の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２９の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２９の配列の重鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、表２９の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｋａｂａｔによる表２９の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、Ｃｈｏｔｈｉａによる表２９の配列の軽鎖ＣＤＲ１－３を含む。
他の例示的な標的
さらなる非限定的な例示的な腫瘍抗原には、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３及びＣＬＬ－１が含まれる。
ＣＤ２０に結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０６７９９２号パンフレット又は国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレットに開示されているものは、本開示に従って使用され得る。当技術分野では、任意の公知のＣＤ２０ ＣＡＲ、例えば任意の公知のＣＤ２０ ＣＡＲのＣＤ２０抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。例示的なＣＤ２０結合配列又はＣＤ２０ ＣＡＲ配列は、例えば、参照により組み込まれる国際公開第２０１８／０６７９９２号パンフレットの表１～５に開示されている。いくつかの実施形態において、ＣＤ２０ ＣＡＲは、国際公開第２０１８／０６７９９２号パンフレット又は国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレット（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているＣＤ２０ ＣＡＲのＣＤＲ、可変領域、ｓｃＦｖ又は全長配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲは、以下の表２３に開示される配列、例えばＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくは全ＣＡＲ配列又はそれらに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
ＣＤ２０に結合する例示的な抗原結合ドメインは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレット及び同第２０１８／０６７９９２号パンフレットに記載されている。いくつかの実施形態では、そこに開示されるＣＤ２０抗原結合ドメインの１つ又は複数の抗原結合ドメインである。
ＣＤ２２に結合する例示的な抗原結合ドメインは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレット及び同第２０１８／０６７９９２号パンフレットに記載されている。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、表１５に列挙される任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。複数の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３をさらに含む。複数の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１６に列挙されるＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、表１６に列挙された任意の軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３の１つ、２つ又は全て並びに表１５に列挙された任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３の１つ、２つ又は全てを含む。
ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する例示的な抗原結合ドメインは、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットに記載されている。
ＣＤ１２３に結合する例示的な抗原結合ドメインは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレット及び同第２０１６／０２８８９６号パンフレットに記載されている。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレットの表１～２からの配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレットの表２、６及び９からの配列を含む。
ＣＬＬ－１に結合する例示的な抗原結合ドメインは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレットに開示されている。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗体（例えば、参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５－０２８３１７８－Ａ１号明細書、同第２０１６－００４６７２４－Ａ１号明細書、同第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、同第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書、同第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書、同第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書、同第２０１４／０３２２２７５Ａ１号明細書若しくは国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載の抗体）に由来する１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３並びに／又は本明細書に記載の抗体（例えば、参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５－０２８３１７８－Ａ１号明細書、同第２０１６－００４６７２４－Ａ１号明細書、同第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、同第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書、同第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書、同第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書、同第２０１４／０３２２２７５Ａ１号明細書若しくは国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載の抗体）に由来する１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、上に挙げた抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。
複数の実施形態において、抗原結合ドメインは、参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５－０２８３１７８－Ａ１号明細書、同第２０１６－００４６７２４－Ａ１号明細書、同第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、同第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書、同第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書、同第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書、同第２０１４／０３２２２７５Ａ１号明細書若しくは国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載される抗原結合ドメインである。
ＣＡＲ発現細胞を用いてターゲティングすることができる例示的な標的抗原として、限定はされないが、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、メソテリン、ＢＣＭＡ及びＧＦＲ ＡＬＰＨＡ－４、とりわけ例えば国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット、同第２０１４／１３０６３５号パンフレット、同第２０１６／０２８８９６号パンフレット、同第２０１４／１３０６５７号パンフレット、同第２０１６／０１４５７６号パンフレット、同第２０１５／０９０２３０号パンフレット、同第２０１６／０１４５６５号パンフレット、同第２０１６／０１４５３５号パンフレット及び同第２０１６／０２５８８０号パンフレットに記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかの抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、メソテリン、ＢＣＭＡ及びＧＦＲ ＡＬＰＨＡ－４）は、上に列挙された抗体由来の１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３並びに／又は上に列挙された抗原結合ドメイン由来の１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙又は記載された抗体の重鎖可変領域及び／又は可変軽鎖領域を含む。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙された抗体の１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３並びに／又は上に列挙された抗体由来の１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、上記に列挙又は記載された抗体の重鎖可変領域及び／又は可変軽鎖領域を含む。
ＣＤ２２に結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、国際公開第２０１８／０６７９９２号パンフレット又は国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレットに開示されているものは、本開示に従って使用され得る。当技術分野では、任意の公知のＣＤ２２ ＣＡＲ、例えば任意の公知のＣＤ２２ ＣＡＲのＣＤ２２抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。
例示的なＣＤ２２結合配列又はＣＤ２２ ＣＡＲ配列は、例えば、国際公開第２０１６１６４７３１号パンフレットの表６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０Ａ及び１０Ｂ並びに国際公開第２０１８０６７９９２号パンフレットの表６～１０に開示されている。いくつかの実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲ配列は、国際公開第２０１８０６７９９２号パンフレット又は国際公開第２０１６１６４７３１号パンフレットに開示されているＣＤ２２ ＣＡＲのＣＤＲ、可変領域、ｓｃＦｖ又は全長配列を含む。
実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する抗原結合ドメイン（ＣＤ２２ ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ２２を標的とする。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるような単鎖Ｆｖ配列を含む。
ヒトＣＤ２２ ＣＡＲの配列を以下に提供する。いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＡＲ２２－６５である。
ヒトＣＤ２２ ＣＡＲ ｓｃＦｖ配列
ヒトＣＤ２２ ＣＡＲ重鎖可変領域
ヒトＣＤ２２ ＣＡＲ軽鎖可変領域
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＡＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＳＮＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＴＳＳＳＴＬＹＶＦＧＴＧＴＱＬＴＶＬ（配列番号７５５）
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲは、以下の表１５～１６及び表２４に開示される配列、例えばＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくは全ＣＡＲ配列又はそれらに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
ＥＧＦＲに結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットに開示されているものは、本開示に従って使用され得る。当技術分野では、任意の公知のＥＧＦＲ ＣＡＲ、例えば任意の公知のＥＧＦＲ ＣＡＲのＥＧＦＲ抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。例示的なＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレット、例えば国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットの表２に開示される、ＣＤＲ、可変領域、ｓｃＦｖ又は全長ＣＡＲ配列を含み得る。
ＣＤ１２３に結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレット又は国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレットに開示されているものは、本開示に従って使用され得る。当技術分野では、任意の公知のＣＤ１２３ ＣＡＲ、例えば任意の公知のＣＤ１２３ ＣＡＲのＣＤ１２３抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。例えば、国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレットに開示されているＣＡＲ１～ＣＡＲ８；又は国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレットに開示されているＣＡＲ１２３－１～ＣＡＲ１２３－４及びｈｚＣＡＲ１２３－１～ｈｚＣＡＲ１２３－３２である。ＣＤ１２３ ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＨ ＣＤＲ及び１つ、２つ、３つのＶＬ ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレット及び国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレットに指定される。
ＣＬＬ－１に結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書に開示されているものである。当技術分野では、任意の公知のＣＬＬ－１ ＣＡＲ、例えば任意の公知のＣＬＬ－１ ＣＡＲのＣＬＬ－１抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレットの表２によるＣＬＬ－１ ＣＡＲ又は抗原結合ドメインを含む。ＣＬＬ－１ ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＨ ＣＤＲ及び１つ、２つ、３つのＶＬ ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレットに指定される。
ＣＤ３３に結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書及び国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットに開示されているものは、本開示に従って使用され得る。当技術分野では、任意の公知のＣＤ３３ ＣＡＲ、例えば任意の公知のＣＤ３３ ＣＡＲのＣＤ３３抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。例えば、国際公開２０１６／０１４５７６号パンフレットに開示されているＣＡＲ３３－１～ＣＡＲ３３－９は、本開示に従って使用され得る。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットの表２又は９によるＣＤ３３ ＣＡＲ又は抗原結合ドメインを含む。ＣＤ３３ ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＨ ＣＤＲ及び１つ、２つ、３つのＶＬ ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットに指定される。
一実施形態において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｂｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７（６）：１４９０－１４９６（２００１）（ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ Ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ｈＰ６７．６）、Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２（２４）：６７６１－６７６７（１９９２）（リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、ＨｕＭ１９５）、Ｌａｐｕｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ３０（３）：１１２１－１１３１（２０１２）（ＡＶＥ９６３３）、Ａｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２７（５）：１１０７－１１１５（２０１３）（ＡＭＧ３３０，ＣＤ３３ ＢｉＴＥ）、Ｄｕｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ ｈｅｍａｔｏｌ ２０１２：６８３０６５（２０１２）及びＰｉｚｚｉｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｌｕｅ．２０１４．６２（２０１４）に記載される抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。一実施形態において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットに記載の抗体、抗原結合フラグメント又はＣＡＲの抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍｕｊｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７（４）：１０９８－１１０４（１９８７）；Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４５（６）：２６４２－２６４９（１９８５），Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５（９）：１４３０－１４４０（１９８７），Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １６（９）：３０５３－３０６０（１９９８），Ｈａｎｄｇｒｅｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３５（３）：１９９－２０４（１９９２）に記載される抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。いくつかの実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、ｍＡｂ１４．１８、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６．１及び８Ｈ９から選択される抗体の抗原結合部分であり、例えば国際公開第２０１２０３３８８５号パンフレット、同第２０１３０４０３７１号パンフレット、同第２０１３１９２２９４号パンフレット、同第２０１３０６１２７３号パンフレット、同第２０１３１２３０６１号パンフレット、同第２０１３０７４９１６号パンフレット及び同第２０１３８５５５２号パンフレットを参照されたい。いくつかの実施形態では、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１００１５０９１０号明細書又は国際公開第２０１１１６０１１９号パンフレットに記載の抗体の抗原結合部分である。
一実施形態において、Ｔｎ抗原に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第８，４４０，７９８号明細書、Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０７（２２）：１００５６－１００６１（２０１０）及びＳｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（６）：８６３－８７３（２０１２）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＳＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ８９（２）：１３６－１４５（２０１３）、米国特許第２０１１０２６８６５６号明細書（Ｊ５９１ ＳｃＦｖ）；Ｆｒｉｇｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４９（９）：２２２３－２２３２（２０１３）（ｓｃＦｖＤ２Ｂ）；国際公開第２００６１２５４８１号パンフレット（ｍＡｂ ３／Ａ１２、３／Ｅ７及び３／Ｆ１１）に記載の抗体並びに一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ Ａ５及びＤ７）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＲＯＲ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９（１２）：３１５３－３１６４（２０１３）；国際公開第２０１１１５９８４７号パンフレット；及び米国特許第２０１３０１０１６０７号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＬＴ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２０１１０７６９２２号パンフレット、米国特許第５７７７０８４号明細書、欧州特許第０７５４２３０号明細書、米国特許第２００９０２９７５２９明細書に記載の抗体及びいくつかの市販用カタログ抗体（Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＴＡＧ７２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１３（４）：１１６３－１１７０（１９９７）に記載の抗体；及びアブカム（Ａｂｃａｍ）ａｂ６９１の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＡＰに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｏｓｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：４５８４－４５９２（２００８）（ＦＡＰ５）、米国特許出願公開第２００９／０３０４７１８号明細書；シブロツズマブ（例えば、Ｈｏｆｈｅｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ２６（１），２００３を参照されたい）；並びにＴｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１０（６）：１１２５－１１３５（２０１３）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３８に対する抗原結合ドメインは、ダラツムマブ（例えば、Ｇｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ １１６（２１）：１２６１－１２６２（２０１０）を参照されたい）；ＭＯＲ２０２（例えば、米国特許第８，２６３，７４６号明細書を参照されたい）；又は米国特許第８，３６２，２１１号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｃａｓｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ １２２（２０）：３４６１－３４７２（２０１３）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＥＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４３（４）：１０９５－１１０７（２０１２）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、ＭＴ１１０、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ａｂ（例えば、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００６３５５９６を参照されたい）から選択される抗体；エドレコロマブ；３６２２Ｗ９４；ＩＮＧ－１；並びにアデカツムマブ（ＭＴ２０１）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＲＳＳ２１に対する抗原結合ドメインは、米国特許第８，０８０，６５０号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、Ｂ７Ｈ３に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＫＩＴに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７９１５３９１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２８８５０６号明細書に記載の抗体並びにいくつかの市販カタログ抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＬ－１３Ｒａ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２００８／１４６９１１号パンフレット、同第２００４０８７７５８号パンフレット、いくつかの市販用カタログ抗体並びに国際公開第２００４０８７７５８号パンフレットに記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３０に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７０９０８４３Ｂ１号明細書及び欧州特許第０８０５８７１号明細書に記載される抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７２５３２６３号明細書；同第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；欧州特許第１０１３７６１号明細書；国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット；及び米国特許第６４３７０９８号明細書に記載される抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ１７１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３７（２）：９３－１０４（２０１４）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＬ－１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、Ａｂｃａｍ（ｃａｔ＃ａｂ５５２６２）又はＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ｃａｔ＃ＥＰＲ５４４６）から入手可能な抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。別の実施形態では、ＩＬ－１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、ペプチドであり、例えばＨｕａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２（１）：２７１－２８１（２０１２）を参照されたい。
一実施形態において、ＰＳＣＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍｏｒｇｅｎｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７（１０）：１１２１－１１３１（２００７）（ｓｃＦｖ ７Ｆ５）；Ｎｅｊａｔｏｌｌａｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１３（２０１３），論文ＩＤ ８３９８３１（ｓｃＦｖ Ｃ５－ＩＩ）；及び米国特許出願公開第２００９０３１１１８１号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＶＥＧＦＲ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０（１１）：３９５３－３９６８（２０１０）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ルイスＹに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２３（４）：４１１－４２３（２００８）（ｈｕ３Ｓ１９３ Ａｂ（ｓｃＦｖｓ））；Ｄｏｌｅｚａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（１）：４７－５６（２００３）（ＮＣ１０ ｓｃＦｖ）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ２４に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍａｌｉａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４３（５）：１３７５－１３８４（２０１２）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＤＧＦＲ－βに対する抗原結合ドメインは、抗体Ａｂｃａｍ ａｂ３２５７０の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＳＳＥＡ－４に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＣ８１３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は他の市販の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ２０に対する抗原結合ドメインは、抗体リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ若しくはＧＡ１０１の抗体；又は国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレットに記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、葉酸受容体αに対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＧＮ８５３又は米国特許出願公開第２０１２０００９１８１号明細書；米国特許第４８５１３３２号明細書、ＬＫ２６：米国特許第５９５２４８４号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＲＢＢ２に対する抗原結合ドメイン（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）は、抗体：トラスツズマブ又はペルツズマブの抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＭＵＣ１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＳＡＲ５６６６５８の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合ドメインは、抗体：セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ又はマツズマブの抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＮＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン２－２Ｂ：ＭＡＢ５３２４（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、エフリンＢ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ａｂｅｎｇｏｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９（１９）：４５６５－４５７６（２０１２）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＧＦ－Ｉ受容体に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第８３４４１１２Ｂ２号明細書；欧州特許出願公開第２３２２５５０Ａ１号明細書；国際公開第２００６／１３８３１５号パンフレット又はＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２９９５号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＡＩＸに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン３０３１２３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＭＰ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７，４１０，６４０号明細書又は米国特許出願公開第２００５０１２９７０１号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ｇｐ１００に対する抗原結合ドメインは、抗体ＨＭＢ４５、ＮＫＩβＢ又は国際公開第２０１３１６５９４０号パンフレット若しくは米国特許出願公開第２０１３０２９５００７号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、チロシナーゼに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第５８４３６７４号明細書；又は米国特許第１９９５０５０４０４８号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥｐｈＡ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２（１）：１０２－１１１（２０１４）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７２５３２６３号明細書；米国特許第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；欧州特許出願公開第１０１３７６１ Ａ３号明細書；２０１２０２７６０４６；国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット；又は米国特許第６４３７０９８号明細書に記載される抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、フコシルＧＭ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許出願公開第２０１００２９７１３８号明細書；又は国際公開第２００７／０６７９９２号パンフレットに記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ｓＬｅに対する抗原結合ドメインは、抗体Ｇ１９３（ルイスＹの場合）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである（Ｓｃｏｔｔ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：３２５４－６１（２０００）を参照されたく、またＮｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍａｙ ２０１３ １９０（Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１７７．１０に記載されている通りである）。
一実施形態において、ＧＭ３に対する抗原結合ドメインは、抗体ＣＡ ２５２３４４９（ｍＡｂ １４Ｆ７）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＨＭＷＭＡＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｋｍｉｅｃｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３（１）：ｅ２７１８５（２０１４）（ＰＭＩＤ：２４５７５３８２）（ｍＡｂ９．２．２７）；米国特許第６５２８４８１号明細書；国際公開第２０１００３３８６６号パンフレット；又は米国特許出願公開第２０１４０００４１２４号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ｏ－アセチル－ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、抗体８Ｂ６の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２３５（２）：２９８－３０８（２００６）；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６３（２）：２２１－２３２（２０１１）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＡＢ０２７（Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである（例えば、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２０５４３５１を参照されたい）。
一実施形態において、ＴＳＨＲに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第号８，６０３，４６６号；同第８，５０１，４１５号；又は同第８，３０９，６９３号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合ドメインは、抗体：ＦＡＢ６３００Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；又はＬＳ－Ａ４１８０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ９７に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第号６，８４６，９１１号明細書；ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３（６）：４１２７－４１３４（２００９）に記載の抗体；又はＲ＆Ｄ：ＭＡＢ３７３４からの抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＡＬＫに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍｉｎｏ－Ｋｅｎｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６（５）：１５６１－１５７１（２０１０）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ポリシアル酸に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｎａｇａｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８（４７）：３３７８４－３３７９６（２０１３）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｇｈｏｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１３ ｄｏｉ：１０．１００２／ｂａｂ．１１７７に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合ドメインは、抗体ＶＫ９；又は例えばＫｕｄｒｙａｓｈｏｖ Ｖ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．１５（３）：２４３－９（１９９８）、Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（７）：２４８２－２４８７（２０１４）；ＭＢｒ１：Ｂｒｅｍｅｒ Ｅ－Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５９：１４７７３－１４７７７（１９８４）に記載の抗体の抗原結合部分である。
一実施形態において、ＮＹ－ＢＲ－１に対する抗原結合ドメインは、抗原結合部分、例えばＪａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｍｏｒｐｈｏｌ １５（１）：７７－８３（２００７）に記載の抗体のＣＤＲである。
一実施形態において、ＷＴ－１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｄａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５（１７６）：１７６ｒａ３３（２０１３）；又は国際公開第２０１２／１３５８５４号パンフレットに記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４（１２）：７８５３－７８５８（２００５）（ＴＣＲ様ｓｃＦｖ）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、***タンパク質１７に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔ Ｏｎｃｏｌ ２０１３ Ａｕｇ １４（ＰＭＩＤ：２３９４３３１３）；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ ２９（４）：２９２３－２９３１（２０１２）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、Ｔｉｅ２に対する抗原結合ドメインは、抗体ＡＢ３３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＭＡＤ－ＣＴ－２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＭＩＤ：２４５０９５２；米国特許第７６３５７５３号明細書に記載される抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合ドメインは、抗体１２Ｆ９（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１に対する抗原結合ドメインは、欧州特許出願公開第２５１４７６６Ａ２号明細書；又は米国特許第７，７４９，７１９号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、肉腫転座切断点に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４（６）：４５３－４６１（２０１２）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＴＲＰ－２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８４（６）：２２０７－１６（１９９６）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍａｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０２（９）：３２８７－３２９４（２００３）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＲＡＧＥ－１に対する抗原結合ドメインは、抗体：ＭＡＢ５３２８（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合ドメインは、抗体：ｃａｔ ｎｏ：ＬＳ－Ｂ９５－１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、腸内カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合ドメインは、抗体：４Ｆ１２：ｃａｔ ｎｏ：ＬＳ－Ｂ６１９０－５０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２に対する抗原結合ドメインは、抗体：Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：モノクローナル：ｃａｔ ｎｏ：ＬＳ－Ｃ１３３２６１－１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ７９ａに対する抗原結合ドメインは、以下の抗体：Ａｂｃａｍから入手可能な抗体、抗ＣＤ７９ａ抗体［ＨＭ４７／Ａ９］（ａｂ３１２１）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な抗体、ＣＤ７９Ａ抗体＃３３５１；又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な抗体ＨＰＡ０１７７４８（ウサギに産生される抗ＣＤ７９Ａ抗体）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ７９ｂに対する抗原結合ドメインは、以下の抗体：Ｄｏｒｎａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ７９ｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ａｎｔｉ－ＣＤ７９ｂ－ｖｃ－ＭＭＡＥ，ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ”Ｂｌｏｏｄ．２００９ Ｓｅｐ ２４；１１４（１３）：２７２１－９．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００９－０２－２０５５００．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｌ ２４のポラツズマブベドチン、抗ＣＤ７９ｂ又は“４５０７ Ｐｒｅ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｎｔｉ－ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３ Ａｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ”Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ５６ｔｈ ＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ６－９ ２０１４に記載されている二重特異性抗体Ａｎｔｉ－ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ７２に対する抗原結合ドメインは、以下の抗体：Ｍｙｅｒｓ，ａｎｄ Ｕｃｋｕｎ，“Ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ７２ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－ｌｉｎｅａｇｅ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．”Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１９９５ Ｊｕｎ；１８（１－２）：１１９－２２に記載のＪ３－１０９又はＰｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ：Ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ Ｌｉｎｋｅｒ－Ｄｒｕｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｍａｒｃｈ １５，２００９ ６９；２３５８に記載の抗ＣＤ７２（１０Ｄ６．８．１、ｍＩｇＧ１）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＡＩＲ１に対する抗原結合ドメインは、以下の抗体：ＰｒｏＳｐｅｃから入手可能なＡＮＴ－３０１ ＬＡＩＲ１抗体；又はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能な抗ヒトＣＤ３０５（ＬＡＩＲ１）抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＣＡＲに対する抗原結合ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から入手可能な抗体：ＣＤ８９／ＦＣＡＲＡｎｔｉｂｏｄｙ（カタログ＃１０４１４－Ｈ０８Ｈ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＩＬＲＡ２に対する抗原結合ドメインは、以下の抗体：Ａｂｎｏｖａから入手可能なＬＩＬＲＡ２モノクローナル抗体（Ｍ１７）、クローン３Ｃ７又はＬｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なマウス抗ＬＩＬＲＡ２抗体、モノクローナル（２Ｄ７）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３００ＬＦに対する抗原結合ドメインは、以下の抗体：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能なマウス抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル［ＵＰ－Ｄ２］又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なラット抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル［２３４９０３］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａに対する抗原結合ドメインは、以下の抗体：二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）ｓｃＦｖ－抗体及びＮｏｏｒｄｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＣＬＥＣ１２Ａ Ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｂｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＬＬ－１ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ Ａｎｔｉｂｏｄｙ”５３ｒｄ ＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １０－１３，２０１１に記載のＡＤＣ並びにＭＣＬＡ－１１７（Ｍｅｒｕｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＢＳＴ２に対する抗原結合ドメイン（ＣＤ３１７とも呼ばれる）は、以下の抗体：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｏｎｌｉｎｅから入手可能なマウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル［３Ｈ４］又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なマウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル［６９６７３９］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＭＲ２に対する抗原結合ドメイン（ＣＤ３１２とも呼ばれる）は、以下の抗体：Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なマウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル［ＬＳ－Ｂ８０３３］又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なマウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル［４９４０２５］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＹ７５に対する抗原結合ドメインは、以下の抗体：ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能なマウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル［ＨＤ３０］又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なマウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル［Ａ１５７９７］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＰＣ３に対する抗原結合ドメインは、以下の抗体：Ｎａｋａｎｏ Ｋ，Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ，Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ｇｌｙｐｉｃａｎ ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ；２１（１０）：９０７－９１６に記載されるｈＧＣ３３又はＭＤＸ－１４１４、ＨＮ３若しくはＹＰ７（これら３つの全ては、Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ．”ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１４ Ｊａｎ ２１；５８８（２）：３７７－８２に記載されている）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合ドメインは、Ｅｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“ＦｃＲＬ５ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ”Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｏｃｔ；１１（１０）：２２２２－３２に記載の抗ＦｃＲＬ５抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。一実施形態において、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２００１／０３８４９０号パンフレット、同第２００５／１１７９８６号パンフレット、同第２００６／０３９２３８号パンフレット、同第２００６／０７６６９１号パンフレット、同第２０１０／１１４９４０号パンフレット、同第２０１０／１２０５６１号パンフレット又は同第２０１４／２１００６４号パンフレットに記載される抗ＦｃＲＬ５抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＧＬＬ１に対する抗原結合ドメインは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なマウス抗免疫グロブリンλ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル［ＡＴ１Ｇ４］、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能なマウス抗免疫グロブリンλ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル［ＨＳＬ１１］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙された抗体由来の１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３及び／又は上に列挙された抗体由来の１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に挙げた抗体の重鎖可変領域及び／又は可変軽鎖領域を含む。
別の態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体又は抗体フラグメントを含む。いくつかの態様では、非ヒト抗体はヒト化され、抗体の特定の配列又は領域は、ヒトおいて自然に産生される抗体又はそのフラグメントとの類似性を高めるように修飾される。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化される。
メソテリンに結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、ヒトメソテリンに結合する、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５０９０２３０号パンフレット及び国際公開第２０１７１１２７４１号パンフレット、例えば国際公開第２０１７１１２７４１号パンフレットの表２、３、４及び５に開示されているものである。当技術分野では、任意の公知のメソテリンＣＡＲ、例えば任意の公知のメソテリンＣＡＲのメソテリン抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。
ＧＦＲ ＡＬＰＨＡ－４に結合するＣＡＲは、当技術分野で公知である。例えば、国際公開第２０１６／０２５８８０号パンフレットに開示されているものは、本開示に従って使用され得る。当技術分野では、任意の公知のＧＦＲ ＡＬＰＨＡ－４ ＣＡＲ、例えば任意の公知のＧＦＲ ＡＬＰＨＡ－４ ＣＡＲのＧＦＲ ＡＬＰＨＡ－４抗原結合ドメインは、本開示に従って使用され得る。ＧＦＲ ＡＬＰＨＡ－４ ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＨ ＣＤＲ及び１つ、２つ、３つのＶＬ ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第２０１６／０２５８８０号パンフレットに指定される。
抗原結合ドメイン構造
いくつかの実施形態において、コードされたＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨ又はＶＬドメイン、ラクダ科動物のＶＨＨドメイン又は二機能性（例えば二特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））を含む。
ある例において、ｓｃＦｖは、当技術分野で知られる方法により製造できる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域とを一緒に連結することにより産生できる。ｓｃＦｖ分子は、最適長及び／又はアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際に、短ポリペプチドリンカーを用いる場合、（例えば、５～１０アミノ酸）、鎖内折りたたみは、阻止される。鎖内折りたたみは、２つの可変領域が一体となって機能的エピトープ結合部位を形成させるためにも必要である。リンカー方向及びサイズの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７５６０６号明細書、米国特許出願公開第２００７／００１４７９４号明細書並びに国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレット及び国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照されたい。
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域との間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎは、１つ以上の正の整数である）などの一連のグリシン及びセリン反復を含む（配列番号２２）。いくつかの実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２９）又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３０）であり得る。リンカー長の変動は、活性を維持又は増強し、活性試験において優れた有効性を生じ得る。
別の態様において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）又はそのフラグメント、例えば単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。そのようなＴＣＲを作製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ ＲＡ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１３６９－１３７７（２０００）；Ｚｈａｎｇ Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１：４８７－４９６（２００４）；Ａｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９（４）：３６５－７４（２０１２）（参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。例えば、リンカー（例えば、柔軟なペプチド）によって連結されたＴ細胞クローン由来のＶα及びＶβ遺伝子を含むｓｃＴＣＲを操作することができる。このアプローチは、それ自体が細胞内にある癌関連標的にとって非常に有用であるが、そのような抗原（ペプチド）のフラグメントは、ＭＨＣによって癌細胞の表面に提示される。
特定の実施形態において、コードされた抗原結合ドメインは、１０－４Ｍ～１０－８Ｍの結合親和性ＫＤを有する。
いくつかの実施形態において、コードされたＣＡＲ分子は、標的抗原について、１０－４Ｍ～１０－８Ｍ、例えば１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、例えば１０－６Ｍ又は１０－７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、参照抗体、例えば本明細書に記載の抗体より少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍又は１０００倍小さい結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、コードされた抗原結合ドメインは、参照抗体（例えば、抗原結合ドメインが由来する抗体）より少なくとも５倍小さい結合親和性を有する。いくつかの態様において、このような抗体フラグメントは、当業者に理解されるように、免疫応答活性化、その標的抗原からのシグナル伝達開始阻害を含むが、これらに限定されない生物学的応答を提供する点で機能的である。
いくつかの態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、それが由来するｓｃＦｖのマウス配列と比較してヒト化されたｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、その配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、ＣＡＲ構築物全体は、その配列全体が哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。コドン最適化とは、コードＤＮＡにおける同義コドン（即ち同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が異なる種で偏っているという発見を指す。そのようなコドン縮重は、同一のポリペプチドが様々なヌクレオチド配列によってコードされることを可能にする。様々なコドン最適化方法が当技術分野で知られており、例えば少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号明細書及び第６，１１４，１４８号明細書に開示される方法が含まれる。
特定の抗原抗体対は、当技術分野で公知である。抗原抗体対及びその成分の非限定的な例示的な実施形態は、本明細書の上記の「標的」という名称のセクション及び以下に提供される。
二特異性ＣＡＲ
特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、二又は多特異的分子（例えば、多特異的抗体分子）である。いくつかの実施形態において、多特異性抗体分子は、二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２つ以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第１エピトープに対する結合特異性を有する第１免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第２エピトープに対する結合特異性を有する第２免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。いくつかの実施形態において、第１及び第２エピトープは、同じ抗原、例えば同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）である。いくつかの実施形態において、第１及び第２エピトープは、オーバーラップする。いくつかの実施形態において、第１及び第２エピトープは、オーバーラップしない。いくつかの実施形態において、第１及び第２エピトープは、異なる抗原、例えば異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）にある。いくつかの実施形態において、二特異性抗体分子は、第１エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列並びに第２エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態において、二特異性抗体分子は、第１エピトープに結合特異性を有する半抗体及び第２エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。いくつかの実施形態において、二特異性抗体分子は、第１エピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメント及び第２エピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、二特異性抗体分子は、第１エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメント及び第２エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、抗体分子は、多特異性（例えば、二特異性又は三特異性）抗体分子である。このような分子は、例えば、二特異性融合タンパク質、例えば２つのｓｃＦｖとその間の親水性へリックスペプチドリンカー及び完全定常領域とを含む発現構築物、例えば米国特許第５６３７４８１号明細書に記載のもの；二量体化して二特異性／多価分子を形成することができる、抗体ヒンジ領域及びＣＨ３領域にペプチドスペーサーでさらに結合した、連結したＶＬ及びＶＨ鎖を有するミニボディ構築物、例えば米国特許第５８３７８２１号明細書に記載のもの；ペプチド結合により架橋性基とＣ末端で結合し、さらにＶＬドメインと会合して一連のＦＶ（又はｓｃＦｖ）を形成するＶＨドメイン（又はファミリーメンバーのＶＬドメイン）のストリング、例えば米国特許第５８６４０１９号明細書に記載のもの；及び両方のｓｃＦＶ又は二特異性抗体型フォーマットを使用して、例えばホモ二価、ヘテロ二価、三価及び四価構造を形成する、非共有結合又は化学架橋により多価構造に組み合わされたペプチドリンカーにより連結したＶＨ及びＶＬドメインの両方を有する単鎖結合ポリペプチド、例えば米国特許第５８６９６２０号明細書に記載のものを含む。上に参照した出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
二特異性抗体分子の各抗体又は抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）内において、ＶＨは、ＶＬの上流又は下流であり得る。いくつかの実施形態において、上流抗体又は抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）の上流のそのＶＨ（ＶＨ１）と共に配置され、下流抗体又は抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）の上流のそのＶＨ（ＶＨ２）と共に配置され、その結果、全体的二特異性抗体分子は、配置ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２を有する。他の実施形態において、上流抗体又は抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）の上流のそのＶＬ（ＶＬ１）と共に配置され、下流抗体又は抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）の上流のそのＶＬ（ＶＬ２）と共に配置され、その結果、全体的二特異性抗体分子は、配置ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２を有する。任意選択で、リンカーは、２つの抗体又は抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）間、例えば構築物がＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２として配列される場合にＶＬ１とＶＬ２との間又は構築物がＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２として配置される場合にＶＨ１とＶＨ２との間に配置される。リンカーは、本明細書に記載のリンカー、例えば（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカー（ここで、ｎは、１、２、３、４、５又は６、好ましくは４である）であり得る（配列番号６９１）。一般に、２つのｓｃＦｖ間のリンカーは、２つのｓｃＦｖのドメイン間の誤対合を避けるのに十分長くなければならない。任意選択で、リンカーは、第１のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に配置される。任意選択で、リンカーは、第２のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に配置される。複数リンカーを有する構築物において、リンカーの任意の２つ以上は、同一であるか又は異なり得る。従って、いくつかの実施形態において、二特異性ＣＡＲは、本明細書に記載のような配置でＶＬ、ＶＨ及び任意選択で１つ以上のリンカーを含む。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の実施形態において、本明細書に記載のキメラ分子（例えば、ＣＡＲ）は、キメラ分子の細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１つ以上のさらなるアミノ酸、例えば膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と関連する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸）及び／又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関連する１つ以上のさらなるアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸）を含み得る。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、キメラタンパク質（例えば、ＣＡＲ）の他のドメインの１つと関連するものであり、例えばいくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はヒンジドメインが由来するのと同じタンパク質由来であり得る。別の態様において、膜貫通ドメインは、キメラタンパク質（例えば、ＣＡＲ）の任意の別のドメインが由来するものと同じタンパク質に由来しない。いくつかの例において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが、同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合することを避けるように、例えば受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択又はアミノ酸置換による修飾ができる。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の別のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞に存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように修飾又は置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然由来又は組み換え源由来であり得る。源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合又は膜貫通タンパク質由来であり得る。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときには常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ又はＮＫＧ２Ｃの少なくとも膜貫通領域を含み得る。
いくつかの例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質からのヒンジを介してＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに結合できる。例えば、いくつかの実施形態において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ又はＩｇＤヒンジ）、ＧＳリンカー（例えば、本明細書に記載のＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ又はＣＤ８ａヒンジであり得る。いくつかの実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列を含む（例えば、これからなる）。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の膜貫通ドメインを含む（例えば、これからなる）。
いくつかの実施形態において、コードされた膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも１、２又は３つの修飾を有するが、修飾が２０、１０又は５を超えないＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列又は配列番号１２のアミノ酸配列と９５～９９％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、コードされた膜貫通ドメインは、配列番号１２の配列を含む。
他の実施形態において、ＣＡＲ分子をコードする核酸は、例えば、配列番号１３の配列又はそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含むＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、コードされた抗原結合ドメインは、膜貫通ドメインにヒンジ領域によって結合されている。いくつかの実施形態において、コードされたヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジのアミノ酸配列、例えば配列番号４；又はＩｇＧ４ヒンジのアミノ酸配列、例えば配列番号６又は配列番号４又は６と９５～９９％の同一性を有する配列を含む。他の実施形態において、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、それぞれＣＤ８ヒンジ又はＩｇＧ４ヒンジに対応する、配列番号５又は配列番号７の配列又は配列番号５又は７と９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの態様において、ヒンジ又はスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、いくつかの実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、アミノ酸配列
のヒンジを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、
のヌクレオチド配列によりコードされたヒンジを含む。
いくつかの態様において、ヒンジ又はスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、いくつかの実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、アミノ酸配列
のヒンジを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、
のヌクレオチド配列によりコードされたヒンジを含む。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、組み換えであり得、その場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。いくつかの態様において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットを組み換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
任意選択で、２～１０アミノ酸長の短オリゴ又はポリペプチドリンカーがＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に結合を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適当なリンカーを提供する。例えば、いくつかの態様において、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号１１）のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号８７７）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号８７６）のヌクレオチド配列によりコードされる。
いくつかの態様において、ヒンジ又はスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインを有する本発明の実施形態において、このようなドメインは、例えば、一次シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、互いに無作為に又は特定の順序で連結し得る。任意選択で、例えば２～１０アミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸）長の短オリゴ又はポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間に結合を形成し得る。いくつかの実施形態において、グリシン－セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。いくつかの実施形態において、単一アミノ酸、例えばアラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば２、３、４、５つ又はそれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインを含むように設計される。いくつかの実施形態において、２つ以上、例えば２、３、４、５つ又はそれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば本明細書に記載のリンカー分子により分けられる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リンカー分子は、グリシン残基である。いくつかの実施形態において、リンカーは、アラニン残基である。
一次シグナル伝達ドメイン
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性方向又は阻害性方向のいずれかで制御する。刺激性方向で作用する初代細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＣＡＲにおいて、このようなドメインは同じ目的で使用される。
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２のものを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、コードされた一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメインを含む。コードされたＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインは、配列番号１８若しくは配列番号２０に少なくとも１、２若しくは３つの修飾を有するが、修飾が２０、１０又は５を超えないアミノ酸配列又は配列番号１８若しくは配列番号２０と９５～９９％同一性を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、コードされた一次シグナル伝達ドメインは、配列番号１８又は配列番号２０の配列を含む。他の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１９若しくは配列番号２１の配列又はそれと９５～９９％同一性を有する配列を含む。
共刺激シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、コードされた共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６及びＮＫＧ２Ｄの１つ以上から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、コードされた共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４若しくは配列番号１６に少なくとも１、２若しくは３つの修飾を有するが、修飾が２０、１０又は５を超えないアミノ酸配列又は配列番号１４若しくは配列番号１６と９５～９９％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、コードされた共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４又は配列番号１６の配列を含む。他の実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１５若しくは配列番号１７の配列又はそれと９５～９９％同一性を有する配列を含む。
他の実施形態において、コードされる細胞内ドメインは、配列番号１４又は配列番号１６の配列及び配列番号１８又は配列番号２０の配列を含み、これらの細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームに且つ単一ポリペプチド鎖として発現される。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１５若しくは配列番号１７の配列又はそれと９５～９９％同一性を有する配列及び配列番号１９若しくは配列番号２１の配列又はそれと９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、核酸分子は、リーダー配列をさらにコードする。いくつかの実施形態において、リーダー配列は、配列番号２の配列を含む。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。いくつかの態様において、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１４のシグナル伝達ドメインである。いくつかの態様において、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のシグナル伝達ドメインである。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。いくつかの態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＲＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、
の核酸配列によりコードされる。
阻害性ドメイン
いくつかの実施形態において、ベクターは、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸配列及びｉｎｈＫＩＲ細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えばＫＩＲ膜貫通ドメイン；及び阻害剤細胞質ドメイン、例えばＩＴＩＭドメイン、例えばｉｎｈＫＩＲ ＩＴＩＭドメインを含む阻害分子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、阻害分子は、天然に存在するｉｎｈＫＩＲであるか、又は天然に存在するｉｎｈＫＩＲと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の相同性を共有するか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０残基を超えて異ならない配列である。
いくつかの実施形態において、阻害分子をコードする核酸配列は、ＳＬＡＭファミリー細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えばＳＬＡＭファミリー膜貫通ドメイン；及び阻害剤細胞質ドメイン、例えばＳＬＡＭファミリードメイン、例えばＳＬＡＭファミリーＩＴＩＭドメインを含む。いくつかの実施形態において、阻害分子は、天然に存在するＳＬＡＭファミリーメンバーであるか、又は天然に存在するＳＬＡＭファミリーメンバーと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の相同性を共有するか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０残基を超えて異ならない配列である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば本明細書に記載の核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターの核酸配列は、ポリ（Ａ）テール、例えばポリＡテールをさらに含む。いくつかの実施形態において、ベクターの核酸配列は、３’ＵＴＲ、例えば本明細書に記載される、例えばヒトβ－グロブリンに由来する３’ＵＴＲの少なくとも１つのリピートを含む３’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、ベクターの核酸配列は、プロモーター、例えばＴ２Ａプロモーターをさらに含む。
プロモーター
いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＥＦ－１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター又はホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターから選択される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＥＦ－１プロモーターである。いくつかの実施形態において、ＥＦ－１プロモーターは、配列番号１の配列を含む。
本発明のいくつかの態様において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離など、当業者に知られるあらゆる技術を使用して、対象から採取した血液の単位から得ることができる。いくつかの態様において、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、典型的にはＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球及び血小板を含む。いくつかの態様において、アフェレーシスにより採取した細胞は、血漿画分を除去するために洗浄し、任意選択で細胞を続くプロセシング過程のために緩衝液又は媒体に懸濁させることができる。いくつかの実施形態において、細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを欠き得る。
製造方法
本明細書に記載のレンチウイルスベクター（例えば、本明細書に記載の方法を用いて作製したもの）は、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ製造に使用することができる。
本明細書に開示されるＣＡＲＴは、当技術分野で公知の任意の方法によりエクスビボで製造することができる。例えば、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット又は国際公開第２０２０／０４７４５２号パンフレット（いずれも参照により本明細書に援用される）に記載の方法を用い得る。本明細書に開示のＣＡＲＴは、当技術分野で公知の任意の方法によりインビボで製造することもできる。例えば、国際公開第２０２０／１７６３９７号パンフレットに記載の方法（参照により本明細書に援用される）である。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、１つのＣＡＲ又は２つ以上のＣＡＲを発現し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、２４時間未満で１つ又は複数のＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞を製造することができる。理論に縛られること望まないが、本明細書に提供される方法は、製造プロセス中、ナイーブＴ細胞などのＴ細胞の未分化表現型を保存する。未分化表現型を有するこれらのＣＡＲ発現細胞は、注入後、インビボでより長く持続し、且つ／又はより良好に増殖し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて測定した場合、従来の製造プロセスにより生産されるＣＡＲＴ細胞と比較して、高いパーセンテージの幹細胞メモリーＴ細胞を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて測定した場合、従来の製造プロセスにより生産されたＣＡＲＴ細胞と比較して、高いパーセンテージのエフェクターＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて測定した場合、従来の製造プロセスにより生産されるＣＡＲＴ細胞と比較して、Ｔ細胞の幹細胞性を良好に保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて測定した場合、従来の製造プロセスにより生産されるＣＡＲＴ細胞と比較して、低レベルの低酸素状態を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて測定した場合、従来の製造プロセスにより生産されるＣＡＲＴ細胞と比較して、低レベルのオートファジーを示す。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、本明細書に開示される１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を含むように操作される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））などのビーズの使用を含まないため、脱ビーズステップを含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって製造されたＣＡＲＴ細胞は、最小限のエクスビボ増殖、例えば１日未満、１２時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満又はエクスビボ増殖なしで対象に投与され得る。従って、本明細書に記載の方法は、対象における疾患の治療に使用するための改良されたＣＡＲ発現細胞産物を製造する高速製造プロセスを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法を提供し、この方法は、以下のステップを含む：（ｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば凍結又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたＴ細胞）の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップと、（ｉｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供するステップと、（ｉｉｉ）保存（例えば、凍結保存培地中での細胞集団の再構築）又は投与のために、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を採取するステップとを含み、（ａ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に又はステップ（ｉ）の開始後２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１８時間以内に実施され、またステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後２６時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後２２、２３若しくは２４時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後２４時間以内に実施され；（ｂ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に又はステップ（ｉ）の開始後２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１８時間以内に実施され、またステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の開始後３０時間以内、例えばステップ（ｉｉ）の開始後２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施されるか、或いは（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、増殖してないか、又は例えば生存細胞の数により評価した場合、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団と比較して５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％程度のみ増殖している。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の核酸分子は、ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の核酸分子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の核酸分子は、どのベクター上にも存在しない。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団は、対象からのアフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）から収集される。
いくつかの実施形態では、アフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）は、対象から収集され、凍結サンプル（例えば、凍結保存サンプル）として細胞製造施設に輸送される。その後、凍結アフェレーシスサンプルは解凍され、例えば細胞選別機（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を用いて、アフェレーシスサンプルからＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）が選択される。次に、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を、本明細書に記載の活性化プロセスを用いたＣＡＲＴ製造のために播種する。いくつかの実施形態では、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のために播種する前に、１回又は複数のラウンドの凍結融解に供する。
いくつかの実施形態において、アフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）は、対象から収集され、新鮮な製品（例えば、凍結されていない製品）として細胞製造施設に輸送される。例えば、細胞選別機（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を用いて、アフェレーシスサンプルからＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）が選択される。次に、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を、本明細書に記載の活性化プロセスを用いたＣＡＲＴ製造のために播種する。いくつかの実施形態では、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のために播種する前に、１回又は複数のラウンドの凍結融解に供する。
いくつかの実施形態において、アフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）は、対象から収集される。例えば、細胞選別機（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を用いて、アフェレーシスサンプルからＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）が選択される。次に、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）は、凍結サンプル（例えば、凍結保存サンプル）として細胞製造施設に輸送される。その後、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を解凍し、本明細書に記載の活性化プロセスを用いたＣＡＲＴ製造のために播種する。
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体と例えば１２時間にわたって接触させた後、ＣＡＲをコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）（例えば、１つ又は複数のベクター）を用いた形質導入（例えば、１つ又は複数のＣＡＲ）を行う。培養開始から２４時間後、細胞を洗浄し、保存又は投与のために製剤化する。
理論に縛られることを望まないが、短時間のＣＤ３及びＣＤ２８刺激は、自己複製Ｔ細胞の効率的な形質導入を促進し得る。従来のＣＡＲＴ製造アプローチと比較して、本明細書で提供される活性化プロセスは、長期にわたるエクスビボ増殖を含まない。サイトカインプロセスと同様に、本明細書で提供される活性化プロセスもＣＡＲＴ製造中に未分化Ｔ細胞を保存する。
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触する。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、ＣＤ３を刺激する薬剤である。いくつかの実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、０Ｘ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＣＤ２、ＣＤ２２６又はそれらの任意の組合せを刺激する薬剤である。いくつかの実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８を刺激する薬剤である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗体（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然のリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド）から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は抗体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗ＣＤ３抗体である。いくつかの実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗体（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然のリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド）から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤又は共刺激分子を刺激する薬剤は、ビーズを含まない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、コロイドポリマーナノマトリックスに共有結合した抗ＣＤ３抗体を含む。いくつかの実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、コロイドポリマーナノマトリックスに共有結合した抗ＣＤ２８抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び共刺激分子を刺激する薬剤は、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を含む。
いくつかの実施形態において、マトリックスは、例えば、生分解性若しくは生体適合性の不活性材料であるポリマーを含むか、又はそれらから構成され、例えば、これらの材料は、細胞に対して非毒性である。いくつかの実施形態では、マトリックスは、親水性ポリマー鎖から構成され、これは、鎖の水和によって水溶液中で最大の移動度を取得する。いくつかの実施形態では、移動性マトリックスは、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン又は細胞外マトリックス組成物からなるものであり得る。多糖類としては、例えば、セルロースエーテル、デンプン、アラビアゴム、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアーガム又はアルギン酸塩を挙げることができる。他のポリマーとしては、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリクオタニウムポリマー、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ブロック共重合体又はポリウレタンが挙げられる。いくつかの実施形態では、移動性マトリックスは、デキストランのポリマーである。
いくつかの実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲ（例えば、１つ又は複数のＣＡＲ）をコードする核酸分子（例えば、１つ又は複数の核酸分子）と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲ（例えば、１つ又は複数のＣＡＲ）をコードするＤＮＡ分子（例えば、１つ又は複数のＤＮＡ分子）で形質導入する。
いくつかの実施形態において、各々が本明細書に開示のＣＡＲをコードする２つの核酸分子（例えば、レンチウイルスベクター）の共形質導入の場合、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターの各々を、異なる感染多重度（ＭＯＩ）で反応混合物（例えば、細胞集団を含む）に添加することができる。
理論に縛られることを望まないが、いくつかの実施形態において、異なるＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含むベクターに対して異なるＭＯＩを使用すると、細胞集団の最終的な組成に影響を及ぼし得ると考えられる。例えば、１つのＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターと、異なる標的をターゲティングする別のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターの共形質導入の場合、異なるＭＯＩを使用して、好ましいモノＣＡＲＴ細胞及びデュアルＣＡＲＴ細胞のパーセントを最大化することができると同時に、望ましくないモノＣＡＲＴ細胞及び非形質導入細胞を減少させることができる。
各ベクターに使用される正確なＭＯＩは、限定されないが、ウイルスベクターのバッチの特性、形質導入される細胞の特性及び形質導入効率をはじめとする多くの要因に基づいて調節又は決定することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団と接触させるステップは、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団を接触させるステップと同時に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触開始後３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０．５時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞集団との接触開始後２０時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１９時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１８時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１７時間以内に実施する。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１６時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１５時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１４時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１４時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１３時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１２時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１１時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１０時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後９時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後８時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後７時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後６時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後５時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後４時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後３時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後２時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後１時間以内に実施する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子と細胞の集団との接触は、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後３０分以内に実施する。
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、保存又は投与のために採取される。
いくつかの実施形態において、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後７２、６０、４８、３６、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９又は１８時間以内に保存又は投与のために細胞の集団を採取する。いくつかの実施形態では、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後２６時間以内に、保存又は投与のために細胞の集団を採取する。いくつかの実施形態では、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後２５時間以内に、保存又は投与のために細胞の集団を採取する。いくつかの実施形態では、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後２４時間以内に、保存又は投与のために細胞の集団を採取する。いくつかの実施形態では、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後２３時間以内に、保存又は投与のために細胞の集団を採取する。いくつかの実施形態では、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と細胞の集団との接触の開始後２２時間以内に、保存又は投与のために細胞の集団を採取する。
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、エクスビボで増殖されない。
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比較して５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、４５、５０、５５又は６０％以下のみ増殖される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比較して５％以下のみ増殖される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比較して１０％以下のみ増殖される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比較して１５％以下のみ増殖される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比較して２０％以下のみ増殖される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比較して２５％以下のみ増殖される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比較して３０％以下のみ増殖される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比較して３５％以下のみ増殖される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述したＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比較して４０％以下のみ増殖される。
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、例えば、生存細胞の数により評価した場合、既述した１つ又は複数のサイトカインと接触させる前の細胞集団と比較して１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４、３６又は４８時間以下のみ増殖される。
いくつかの実施形態において、活性化プロセスは、無血清細胞培地中で行われる。いくつかの実施形態では、活性化プロセスは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ））又はＩＬ－６（例えば、ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒａ）から選択される１つ若しくは複数のサイトカインを含む細胞培地中で実施される。いくつかの実施形態では、ｈｅｔＩＬ－１５は、
のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈｅｔＩＬ－１５は、配列番号３０９に対して少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、活性化プロセスは、ＬＳＤ１阻害剤を含む細胞培地中で行われる。
いくつかの実施形態において、活性化プロセスは、ＭＡＬＴ１阻害剤を含む細胞培地中で行われる。いくつかの実施形態では、無血清細胞培地は、血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、血清代替物は、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＩＣＳＲ）である。いくつかの実施形態では、ＩＣＳＲのレベルは、例えば、最大５％、例えば約１％、２％、３％、４％又は５％であり得る。理論に縛られることを望まないが、ＩＣＳＲ、例えば２％のＩＣＳＲを含む細胞培地、例えば表２１又は表２５に示すラピッドメディアを使用すると、本明細書に記載の製造プロセス中の細胞生存率を向上させ得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法を提供し、これは、（ａ）対象から採取されたアフェレーシスサンプル（例えば、新鮮な又は凍結保存された白血球アフェレーシスサンプル）を提供するステップ、（ｂ）アフェレーシスサンプルからＴ細胞を選択する（例えば、負の選択、正の選択若しくはビーズなしの選択を使用して）、（ｃ）単離したＴ細胞を例えば、１×１０６～１×１０７細胞／ｍＬで播種するステップ、（ｄ）Ｔ細胞を刺激する薬剤、例えばＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞表面上の共刺激分子を刺激する薬剤とＴ細胞を接触させる（例えば、Ｔ細胞を抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体と接触させる、例えばＴ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔと接触させる）ステップ、（ｅ）ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）とＴ細胞を例えば、６～４８時間、例えば２０～２８時間にわたって接触させる（例えば、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスとＴ細胞を接触させる）ステップ、（ｆ）保存（例えば、凍結保存培地中でのＴ細胞の再構築）又は投与のためにＴ細胞を洗浄及び採取するステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｄ）又は（ｅ）の開始後３０時間以内、例えばステップ（ｄ）又は（ｅ）の開始後２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の製造プロセスのいずれかによって作製された細胞（例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）の集団である。
いくつかの実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、製造プロセスの開始時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時）の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージと比較して、（１）同じであるか、（２）例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５％以下のみ異なるか、又は（３）例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５％増加する。いくつかの実施形態では、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団は、例えば、２６時間超持続する（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日超持続する）か、又は細胞の集団をインビトロで例えば、３日以上増殖させる（例えば、細胞の集団をインビトロで３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５日間増殖させる）ことを含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比較して高い（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％だけ高い）パーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋Ｔ細胞を示す。
いくつかの実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０％以上である。
いくつかの実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、製造プロセスの開始時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時）の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと比較して、（１）同じであるか、（２）例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５％以下のみ異なるか、又は（３）例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５％減少する。いくつかの実施形態では、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団は、例えば、２６時間以上持続する（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日以上持続する）か、又は細胞の集団をインビトロで例えば３日以上増殖させる（例えば、細胞の集団をインビトロで３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５日間増殖させる）ことを含み、他には同様の方法により作製された細胞と比較して低い（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％低い）パーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞を示す。
いくつかの実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％以下である。
いくつかの実施形態において、インビボで投与された後、製造プロセスの終了時（例えば、サイトカインプロセス又は本明細書に記載の活性化プロセスの終了時）の細胞の集団は、例えば、２６時間超（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日超持続する）か、又は例えば３日超にわたって増殖させる（例えば、細胞集団をインビトロで３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５日間増殖させる）ことを含み、他には同様の方法により作製された細胞と比較して長く持続するか又は高い（例えば、少なくとも、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５若しくは９０％だけ高い）レベルで増殖する。
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、製造プロセスの開始前（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始前）に、ＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒａ及び／又はＩＬ６Ｋｂに対して陽性である細胞）について濃縮されている。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、例えば、製造プロセスの開始時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時）に、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５若しくは８０％以上のＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒａ及び／又はＩＬ６Ｋｂに対して陽性である細胞）を含む。
インビトロ ＣＡＲ－Ｔ製造
本明細書に記載のレンチウイルスベクター（例えば、本明細書に記載の方法を用いて作製されたもの）は、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ製造に使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のウイルスベクターで形質導入された細胞は、例えば、本明細書に記載の方法によって増殖される。いくつかの実施形態において、細胞を数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）～約１４日（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日）の期間の培養により増殖する。いくつかの実施形態において、細胞は、４～９日の期間増殖される。いくつかの実施形態において、細胞は、８日以下、例えば７日、６日又は５日の期間増殖される。いくつかの実施形態において、細胞は、培養物中で５日間増殖させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日間培養して増殖させた同じ細胞より強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死滅、サイトカイン産生、活性化、遊走又はそれらの組み合わせにより規定され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、５日間増殖させ、同じ培養条件下において培養物中で９日間増殖させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍又は４倍増加を示す。いくつかの実施形態において、細胞は、培養物中で５日間増殖させ、得られた細胞は、同じ培養条件下において培養物中で９日間増殖させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ－γ及び／又はＧＭ－ＣＳＦレベルを示す。いくつかの実施形態において、５日間増殖させた細胞は、同じ培養条件下において培養物中で９日間増殖させた同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ－γ及び／又はＧＭ－ＣＳＦレベルのｐｇ／ｍｌでの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれを超える増加を示す。
カルシウム非存在下の初期活性化過程は、活性化の増強に至り得る。当業者に容易に認識されるように、洗浄ステップは、製造業者の指示に従う半自動化「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ又は他の緩衝剤を含む又は含まない食塩水溶液など、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。代わりに、アフェレーシスサンプルの望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
本出願のインビトロ方法は、５％以下、例えば２％の、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、既知培養培地条件及び組成物、例えばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１５）４，ｅ３１；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１に記載のものを用い得ることが認識される。
いくつかの態様において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離又は向流遠心溶出法により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。単離されたＴ細胞は、本明細書に記載の方法でさらに使用され得る。
本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の例えば陰性選択技術を使用する、例えばＴ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えばＴ細胞の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御性枯渇細胞集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
いくつかの実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ－２を使用して集団から除去する。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドを基質、例えばビーズにコンジュゲートするか又は他に基質、例えばビーズ上に被覆させる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメントを本明細書に記載の基質にコンジュゲートさせる。
いくつかの実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。いくつかの実施形態において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比は、１×１０７細胞対２０μＬ、又は１×１０７細胞対１５μＬ、又は１×１０７細胞対１０μＬ、又は１×１０７細胞対５μＬ、又は１×１０７細胞対２．５μＬ、又は１×１０７細胞対１．２５μＬである。いくつかの実施形態において、例えばＴ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋枯渇のために５億細胞／ｍｌを使用する。さらなる態様において、６億、７億、８億又は９億細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。
いくつかの実施形態において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞集団は、約６×１０９ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。他の態様において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞集団は、約１×１０９～１×１０１０（及びその間の任意の整数値）ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、得られたＴ制御性枯渇細胞集団は、２×１０９Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞又はそれ未満（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７又はそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞を、例えばチュービング１６２－０１など、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。いくつかの実施形態において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を例えばＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定において動かす。
特定の理論に拘束されることを望まないが、アフェレーシス前又はＣＡＲ発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少（例えば、望まない免疫細胞、例えばＴＲＥＧ細胞の数の減少）は、対象の再発リスクを減らし得る。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇する方法は、当技術分野で知られている。例えば、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（抗ＧＩＴＲ本明細書に記載の抗体）、ＣＤ２５枯渇及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、製造法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の数の減少（例えば、枯渇）を含む。例えば、製造法は、例えば、サンプル、例えばアフェレーシスサンプルを抗ＧＩＴＲ抗体及び／又は抗ＣＤ２５抗体（又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド）と接触させ、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
いくつかの実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞採取前にＴＲＥＧ細胞を減らす１つ以上の治療で前処置されており、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再び必要とするリスクを軽減する。いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はそれらの組み合わせの１つ以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はそれらの組み合わせの１つ以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、注入中又は注入後に行われ得る。
いくつかの実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。いくつかの実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。
いくつかの実施形態において、除去すべき細胞集団は、制御性Ｔ細胞又は腫瘍細胞ではなく、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖及び／又は機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５又は潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。いくつかの実施形態において、このような細胞は、制御性Ｔ細胞及び／又は腫瘍細胞と同時に、又は前記枯渇後又は別の順番で除去することが意図される。
本明細書に記載の方法は、２つ以上の選択ステップ、例えば２つ以上の枯渇ステップを含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。１つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫粘着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含み得る。
本明細書に記載の方法は、腫瘍抗原、例えばＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４又はＣＤ１１ｂを発現する細胞集団からの除去をさらに含み、それによりＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇及び腫瘍抗原枯渇細胞集団を提供する。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗腫瘍抗原抗体又はそのフラグメントを同じ基質、例えばビーズに結合でき、これを細胞の除去に使用できるか、又は抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗腫瘍抗原抗体又はそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去及び腫瘍抗原発現細胞の除去は、逐次的であり、例えばいずれの順番でも生じ得る。
チェックポイント阻害剤、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞及びＴＩＭ３＋細胞の１つ以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞及びチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋及び／又はＴＩＭ３＋枯渇細胞集団を提供する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤は、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ及びＬＡＩＲ１を含む。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はそのフラグメントを同じビーズに結合でき、それを細胞の除去に使用できるか、又は抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去及びチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は、逐次的であり、例えばいずれ順序でも生じ得る。
本明細書に記載の方法は、陽性選択ステップを含み得る。例えば、Ｔ細胞を所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間にわたり、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）コンジュゲートビーズとインキュベーションすることにより単離することができる。いくつかの実施形態において、時間は、約３０分である。さらなる実施形態において、時間は、３０分～３６時間又はそれより長い範囲及びその間の任意の整数値である。さらなる実施形態において、時間は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間又は６時間である。さらに別の実施形態において、時間は、１０～２４時間、例えば２４時間である。腫瘍組織又は免疫不全状態個体から腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を単離するような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲効率を高め得る。従って、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を短くする又は長くし、且つ／又はビーズ対Ｔ細胞比を増加又は減少させる（さらに本明細書に記載のとおり）ことにより、Ｔ細胞の亜集団が培養開始時又はプロセス中の他の時点で優先的に選択される。さらに、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体比を増加又は減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団が培養開始時又は他の所望の時点で優先的に選択される。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ及びパーフォリン又は他の適切な分子、例えば他のサイトカインの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットに記載する方法により決定できる。
陽性又は陰性選択により所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は、変わり得る。いくつかの態様において、細胞とビーズとの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞とを一緒に混合する体積を有意に低下させる（例えば、細胞濃度を増加させる）ことが望まれ得る。例えば、いくつかの態様において、１００億細胞／ｍｌ、９０億細胞／ｍｌ、８０億細胞／ｍｌ、７０億細胞／ｍｌ、６０億細胞／ｍｌ又は５０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。いくつかの態様において、１０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなるいくつかの態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。
高濃度を使用して細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞の又は多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（例えば、白血病性血液、腫瘍組織など）からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有し得、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
いくつかの実施形態において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞で選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕獲される。いくつかの態様において、使用する細胞の濃度は５×１０６／ｍｌである。他の態様において、使用する濃度は約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ及びその間の任意の整数値であり得る。
他の態様において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で２～１０℃又は室温においてローテータでインキュベートし得る。
刺激のためのＴ細胞は、洗浄ステップ後にも凍結され得る。理論に拘束されることを望まないが、凍結及び続く解凍ステップは、細胞集団から顆粒球及びある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップ後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で知られ、これに関連して有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ又は１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ又は３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯを含む培養培地又は例えばＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１°／分の速度で－８０℃に凍結し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存する。制御凍結の他の方法並びに直接－２０℃又は液体窒素の非制御凍結も使用できる。
いくつかの態様において、凍結保存細胞を本明細書に記載のように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前に室温で１時間休息させる。
本発明に関連して、本明細書に記載の増殖細胞が必要となり得る時点前の期間における対象からの血液サンプル又はアフェレーシス産物の収集も企図されている。従って、増殖する細胞の供給源を必要な任意の時点で採取でき、Ｔ細胞などの所望の細胞を、本明細書に記載のものなどの免疫エフェクター細胞療法からの利益があるであろう任意の数の疾患及び状態について、免疫エフェクター細胞療法におけるその後の使用のために単離及び凍結できる。いくつかの態様において、血液サンプル又はアフェレーシスを一般に健常対象から採取する。いくつかの態様において、血液サンプル又はアフェレーシスを、一般に、疾患を発症するリスクにあるが、依然として疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離及び凍結する。いくつかの態様において、Ｔ細胞をその後の時点で増殖、凍結及び使用し得る。いくつかの態様において、サンプルを、本明細書に記載の特定の疾患の診断の直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。さらなる態様において、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８及び照射などの抗体又は他の免疫除去剤による処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連する処置モダリティ前に対象からの血液サンプル又はアフェレーシスから細胞を単離する。
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接得る。ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直後、患者が、通常、その処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であり得るか又は改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖増強について好ましい状態であり得る。そのため、本発明に関連して、Ｔ細胞、樹状細胞又は造血細胞系統の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。さらに、いくつかの態様において、可動化（例えば、ＧＭ－ＣＳＦでの可動化）及びコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び／又は増殖に好都合である条件を、特に治療後の定められた時間枠中に対象に形成できる。細胞型の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞を含む。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ ＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はＤＧＫ活性が低下した又は阻害された細胞である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。代わりに、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書に記載のＤＧＫ阻害剤での処理により産生できる。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はイカロス活性が低下した又は阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。代わりに、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドマイドでの処理により産生できる。
実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損及びイカロス欠損であり、例えばＤＧＫ及びイカロスを発現しないか、又はＤＧＫ及びイカロス活性が低下又は阻害されている。このようなＤＧＫ及びイカロス欠損細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかにより産生できる。
いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞を対象から得る。別の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＮＫ－９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
特定の例示的態様において、対象を白血球除去に付し、ここで、白血球を採取し、エクスビボで富化又は枯渇して、目的の細胞、例えばＴ細胞を選択及び／又は単離する。
これらのＴ細胞単離物は、本明細書に記載の方法によって増殖され得る。処置を必要とする対象を、その後、高用量の化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付し得る。いくつかの態様において、移植後又は同時に、対象は、本発明の方法により調整された、増殖させたＣＡＲ Ｔ細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖細胞を手術前又は後に投与する。
さらに発現される薬剤
ＣＡＲ活性を増強する薬剤の共発現
本明細書で企図される実施形態において、追加の薬剤は、上記で本明細書に記載されたベクター中にコードされ得ることが理解される。従って、これらの薬剤は、ＣＡＲ発現細胞に関連して以下に記載される。
別の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、別の薬剤、例えばＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現できる。例えば、いくつかの実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４並びにＴＧＦＲベータ、例えば本明細書に記載のものを含む。いくつかの実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第２のポリペプチド、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに結合した第１のポリペプチド、例えば阻害分子を含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４若しくはＴＧＦＲベータ又はこれらのいずれかのフラグメントなどの阻害分子の第１のポリペプチド及び本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインである第２のポリペプチド（例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載の例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む）である第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＰＤ－１又はそのフラグメントの第１のポリペプチド並びに本明細書に記載する細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載するＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０又は４－ＩＢＢシグナル伝達ドメイン及び／又は本明細書に記載するＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドを含む。
第２のＣＡＲの共発現
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、例えば、同じ標的（例えば、ＣＤ１９）又は異なる標的（例えば、ＣＤ１９以外の標的、例えば本明細書に記載される標的）に対する、第２のＣＡＲ、例えば異なる抗原結合ドメインを含む第２のＣＡＲをさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載の方法を用いて製造されたＣＡＲ発現細胞は、（ｉ）ＢＣＭＡに結合する第１のＣＡＲをコードする第１の核酸分子、及び（ｉｉ）ＣＤ１９に結合する第２のＣＡＲをコードする第２の核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、第１のＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン及び第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、上記抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、上記ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号８６、８７、８８、９５、９６及び９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＣＡＲは、抗ＣＤ１９結合ドメイン、第２の膜貫通ドメイン及び第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、上記ＣＤ１９結合ドメインは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、上記ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号７６０、６８７、７６２、７６３、７６４及び７６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）抗ＢＣＭＡ結合ドメインのＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号９３及び１０２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインのＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号２５０Ａ及び２５１Ａのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号７５８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のＣＡＲは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のＣＡＲは、配列番号２２５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載の方法を用いて製造されたＣＡＲ発現細胞は、（ｉ）ＣＤ２２に結合する第１のＣＡＲをコードする第１の核酸分子と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合する第２のＣＡＲをコードする第２の核酸分子とを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２２抗原結合ドメイン及び第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；並びに／又は第１の一次シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ１９抗原結合ドメイン及び第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；並びに／又は第２の一次シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、例えば、表１５、１６、３０、３１若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ２２結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；並びに／又は例えば、表１５、１６、３０、３１若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ２２結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む。実施形態では、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、例えば、表１５、１６、３０、３１若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ２２結合ドメインのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３；並びに／又は表１５、１６、３０、３１若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ２２結合ドメインのＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、例えば、表１、３０、３１若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ１９結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３；並びに／又は例えば、表１、３０、３１若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ１９結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、例えば、表１、３０、３１及び３２で、本明細書に記載されるＣＤ１９結合ドメインのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３；並びに／又は例えば、表１、３０、３１及び３２で、本明細書に記載されるＣＤ１９結合ドメインのＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、例えば、表３０若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ２２結合ドメインの軽鎖可変（ＶＬ）領域；及び／又は表３０若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ２２結合ドメインの重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表３０又は３２に提供されるＣＤ２２ ＶＬ領域配列の少なくとも１つ、２つ又は３つの修飾（例えば、置換）、但し３０、２０又は１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表３０若しくは３２に提供されるアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表３０又は３２に提供されるＣＤ２２ ＶＨ領域配列の少なくとも１つ、２つ又は３つの修飾（例えば、置換）、但し３０、２０又は１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表３０若しくは３２に提供されるＣＤ２２ ＶＨ領域配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、例えば、表１、３０若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ１９結合ドメインのＶＬ領域；及び／又は例えば、表１、３０若しくは３２で、本明細書に記載されるＣＤ１９結合ドメインのＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１、３０又は３２に提供されるＣＤ１９ ＶＬ領域配列の少なくとも１つ、２つ若しくは３つの修飾（例えば、置換）、但し３０、２０若しくは１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１、３０若しくは３２に提供されるＣＤ１９ ＶＬ領域配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１、３０又は３２に提供されるＣＤ１９ ＶＨ領域配列の少なくとも１つ、２つ若しくは３つの修飾（例えば、置換）、但し３０、２０若しくは１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１、３０若しくは３２に提供されるＣＤ１９ ＶＨ領域配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２２抗原結合は、表３０又は３２に提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列の少なくとも１つ、２つ若しくは３つの修飾（例えば、置換）、但し３０、２０若しくは１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２２抗原結合は、表３０若しくは３２に提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１、３０又は３２に提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列の少なくとも１つ、２つ若しくは３つの修飾（例えば、置換）、但し３０、２０若しくは１０以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１、３０又は３２に提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列含むｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲ分子及び／又はＣＤ１９ ＣＡＲ分子は、表３３に提供されるアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する、追加の構成要素、例えばシグナルペプチド、ヒンジ、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメイン、Ｐ２Ａ部位及び／又はリンカーを含むか、又は表３３に提供されるヌクレオチド配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
ＣＡＲ分子の例示的なヌクレオチド及びアミノ酸配列、例えば（ｉ）ＣＤ２２に結合する第１のＣＡＲ、及び（ｉｉ）本明細書に開示されるＣＤ１９に結合する第２のＣＡＲを含む二重ＣＡＲ分子を表３０に提供する。
開示のデュアルＣＡＲ（例えば、（ｉ）ＣＤ２２に結合する第１ＣＡＲと、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合する第２ＣＡＲを含むデュアルＣＡＲ）のＣＤ２２及びＣＤ１９ ＣＤＲを表３１に記載する。
表３２は、本明細書に開示されるデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ、例えば（ｉ）ＣＤ２２に結合する第１ＣＡＲと、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合する第２ＣＡＲを含むデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲのＣＤ１９及びＣＤ２２結合ドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を記載する。
表３３は、ＣＡＲ分子、例えば本明細書に記載のデュアルＣＡＲ分子（例えば、（ｉ）ＣＤ２２に結合する第１ＣＡＲと（ｉｉ）ＣＤ１９に結合する第２ＣＡＲを含むデュアルＣＡＲ）に使用することができる、追加のＣＡＲ成分、例えばシグナルペプチド、リンカー及びＰ２Ａ部位のヌクレオチド及びアミノ酸配列を記載する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、第２のＣＡＲ、例えば同じ標的（例えば、上記した標的）又は異なる標的に対する例えば第２のＣＡＲの異なる抗原結合ドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲの標的と同じ癌細胞型で発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、第１の抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ及び第２の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。理論に拘束されることを望まないが、第１のＣＡＲへの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７又はＯＸ－４０及び一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの第２のＣＡＲへの配置は、両方の標的が発現される細胞に対してＣＡＲ活性を制限する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、例えば、上記の標的を標的とする抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含む第１のＣＡＲ及び第１のＣＡＲが標的とする抗原以外の抗原（例えば、第１の標的と同一の癌細胞型に発現される抗原）を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、例えば、上記の標的を標的とする抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ及び第１のＣＡＲが標的とする抗原以外の抗原（例えば、第１の標的と同一の癌細胞型に発現される抗原）を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載のＣＡＲ、例えば上記の標的に対するＣＡＲ及び阻害性ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えばまた標的を発現する正常細胞で見られるが、癌細胞で見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４又はＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、本明細書に記載の腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＣＡＲ及びＰＤ１細胞外ドメイン又はそのフラグメントを含む第２のＣＡＲを含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、上記の阻害分子をさらに含む。
いくつかの実施形態において、細胞内の第２のＣＡＲは、阻害性ＣＡＲであり、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び阻害分子の細胞内ドメインを含む。阻害分子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及びＣＥＡＣＡＭ－５の１つ以上から選択され得る。いくつかの実施形態において、第２のＣＡＲ分子は、ＰＤ１の細胞外ドメイン又はそのフラグメントを含む。
実施形態において、細胞内の第２のＣＡＲ分子は、一次シグナル伝達ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
他の実施形態において、細胞における細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能的ドメインを含む一次シグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢの機能的ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第１のＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含まない。例えば、第１のＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、ラクダ科動物のＶＨＨドメインを含む。
ＣＡＲの立体構造
本明細書で企図される実施形態において、１つ以上のＣＡＲの立体構造は、本明細書で上記に記載されたベクターによって調節され得ることが理解される。従って、これらの立体構造は、ＣＡＲ発現細胞に関連して以下に記載されている。
スプリットＣＡＲ
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、国際公開第２０１４／０５５４４２号パンフレット及び国際公開第２０１４／０５５６５７号パンフレットにより詳細に記載されている。簡潔には、スプリットＣＡＲ系は、第１の抗原結合ドメイン及び共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ）を有する第１のＣＡＲを発現する細胞を含み、細胞は、第２の抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を有する第２のＣＡＲも発現する。細胞が第１の抗原に遭遇したとき、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第２の抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、細胞死滅活性が開始される。従って、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原存在下でのみ完全活性化される。
複数のＣＡＲ
いくつかの態様において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ、例えば同じ標的又は異なる標的（例えば、本明細書に記載の癌関連抗原以外の標的又は本明細書に記載の異なる癌関連抗原）に対する、例えば第２のＣＡＲの異なる抗原結合ドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、第２のＣＡＲは、癌関連抗原と同じ癌細胞型を発現する標的に対する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原を標的とし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ及び第２の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。理論に拘束されることを望まないが、第１のＣＡＲへの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７又はＯＸ－４０及び一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの第２のＣＡＲへの配置は、両方の標的が発現される細胞に対してＣＡＲ活性を制限し得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載の標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含む第１の癌関連抗原ＣＡＲと、異なる標的抗原をターゲティングし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ（例えば、第１の標的抗原と同じ癌細胞型に発現する抗原）とを含む。別の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載の標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲと、第１の標的抗原以外の抗原（例えば、第１の標的抗原と同じ癌細胞型に発現する抗原）をターゲティングし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、第１及び第２のＣＡＲを提供し、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、他方は、ｓｃＦｖではない。いくつかの実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。いくつかの実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
本明細書に記載の方法が実施されると、例えば適切なインビトロ及び動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続及び抗癌活性についての活性を評価するために様々なアッセイが使用され得る。本発明のＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、当業者に知られており、以下に一般的に記載される。
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を、単量体及び二量体の存在を検出するために使用できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。極めて簡潔には、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）をインビトロで１０日超増殖させ、続いて溶解及び還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥを行う。全長ＴＣＲ－ζ細胞質ドメイン及び内因性ＴＣＲ－ζ鎖を含むＣＡＲを、ＴＣＲ－ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合性二量体形成の評価を可能とするために非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に使用する。
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロ増殖をフローサイトメトリーによって測定することができる。
再刺激非存在下の持続するＣＡＲ＋Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。簡潔には、平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激及び１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にＣｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩＩ粒子カウンター、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｃｅｐｔｅｒを使用して測定する。
動物モデルも、ＣＡＲ Ｔ活性の測定に使用できる。例えば、免疫不全マウスにおける初代ヒトプレＢ ＡＬＬを処置するための、本明細書に記載のヒト癌関連抗原に特異的なＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用する異種移植モデルを使用できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。
用量依存的ＣＡＲ処置応答を評価できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。例えば、２１日目にＣＡＲ Ｔ細胞、等しい数の偽形質導入Ｔ細胞で処置した又はＴ細胞処置なしのマウスにおいて白血病が確立した後、３５～７０日後に末梢血を得る。各群からのマウスを本明細書に記載の末梢血癌関連抗原ＡＬＬ芽細胞数の決定のために無作為に採血し、３５日目及び４９日目に屠殺する。残りの動物を５７日目及び７０日目に評価する。
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に以前に記載されている。
細胞毒性は、標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。
造影技術を使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送及び増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１５７５－１５８６（２０１１）に記載されている。
本明細書に記載のもの並びに当技術分野で公知のものを含む他のアッセイも本発明に記載のＣＡＲの評価に使用できる。
以下の実施例は、本開示のいくつかの実施形態をさらに説明するために提供されるが、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく；それらの例示的な性質により、周知の他の手順、方法又は技術が代替的に使用され得ることが当業者に理解されるであろう。
以下の実施例は、当業者に、本明細書に記載の組成物及び方法がどのように使用、製造及び評価され得るかの説明を提供するために提示され、あくまで本開示の例示であることを意図し、本開示の範囲の限定を意図するものではない。
実施例１：支持ＬＶ生産システムとしてのＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞
最新のＬＶベクター作製法は、ＳＶ４０ Ｔ－抗原を含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞を伴う。現場では、プロデューサー細胞中のＳＶ４０ Ｔ－抗原の存在は、一般的にベクター生産に有益であると考えられている。加えて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＳＶ４０ Ｔ抗原を欠いたＨＥＫ２９３細胞と比較して、細胞増殖及びトランスフェクション効率の向上を示す。この実験では、安全性の懸念を最小限に抑えるための支持ＬＶ生産システムとして、ＳＶ４０ Ｔ抗原を欠いた細胞株であるＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を評価する。この実施例に示されるように、ラージＴ抗原を欠いた細胞は、レンチウイルスベクターの満足のいく収率及び純度を付与することが示されている。本明細書で試験した細胞は、複製可能レンチウイルス（ＲＣＬ）を生成し得る組換え事象の可能性を低減し、それによりウイルス複製及び望ましくない遺伝子座における宿主ＤＮＡへの挿入のリスクを低減するために有益である。市販のＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－カタログ＃Ａ１４５２７－ロット＃１９９４６３５）を入手した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ 細胞株のレンチウイルス生産性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株のレンチウイルスベクターの生産性と比較した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞とＨＥＫ２９３Ｔ浮遊細胞の両方を、ＳＦ２５０ｍＬフラスコ内のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地に０．１５Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で播種し、１５０ｒｐｍで３日間培養した。３日間の細胞増殖及び増幅後、細胞を、ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ（Ｃ１）をコードするモデルＧＯＩプラスミドでトランスフェクトした。０．４μｇのＤＮＡ／Ｅ６細胞をＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（０．４μＬ／１Ｅ６細胞）と混合し、トランスフェクション複合体を形成した。トランスフェクション複合体を細胞培養物に直接添加した。トランスフェクションの２４時間後、酪酸ナトリウム及びＭｇＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）を含む２５Ｕ／ｍＬベンゾナーゼを培地に添加した。細胞は、感染から４８時間後に分析のために採取した。ＴＵアッセイ及びＥＬＩＳＡを用いて、各細胞株のレンチウイルス生産性を測定及び比較した。
分析方法：機能力価（細胞に取り込むことができるビリオンの総量の測定値）を得るため且つ細胞毒性の低減及び細胞形質導入の効率の向上に関する重要なパラメータであるＰＰ／ＩＰ（物理粒子／感染性粒子）の比によって生産の品質を評価するために、２つの異なる方法、即ちＴＵアッセイ及びｐ２４ ＥＬＩＳＡによってサンプルを分析した。この比は、ウイルス粒子全体（物理力価）と比較して、感染性であったウイルス粒子のパーセンテージを示すものであった。
機能力価：ＴＵアッセイ：形質導入単位アッセイは、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞の形質導入、それに続くゲノムＤＮＡの抽出並びにベクター特異的配列（レンチウイルスＷＰＲＥエレメント）とハウスキーピング遺伝子（ヒト細胞当たり２コピーに存在することが知られているアルブミン配列）をデュプレックスｑＰＣＲで増幅することによる、ウイルスコピーの定量に基づく。播種された細胞数に対する正規化及び相関後、形質導入単位、即ち自身のゲノムを標的細胞に送達した後、宿主細胞ゲノムに組み込むことができる感染性ウイルス粒子の濃度を計算した。
ｐ２４ 酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｌｉｓａ）：この分析法は、機能的又は非機能的（即ち、未熟な形態、空の粒子）であるかどうかにかかわらず、全ての物理的粒子及び上清中の遊離ｐ２４タンパク質を検出することにより、有効ＬＶＶ濃度の近似値を付与した。物理力価（レンチウイルス粒子（ＬＰ）／ｍＬ）は、レンチウイルスカプシドタンパク質ｐ２４を測定するｐ２４ Ｅｌｉｓａによって定量した。ｐ２４コア抗原は、ＨＩＶ－１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットを用いてレンチウイルス上清中で直接検出した。このＥｌｉｓａでは、レンチウイルス粒子の量（ＬＰ／ｍＬ）に比例するｐ２４（ｐｇ／ｍＬ）の濃度を測定した。
この実験では、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞が約３．９Ｅ７ＴＵ／ｍＬのＬＶ生産性を示すことが明らかになった。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、満足のいくＬＶ生産性（約１．５Ｅ７ＴＵ／ｍＬ）をもたらす（図１Ａ）。より高いＰＰ／ＩＰ比（約１８８２）が観察され、これは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆセルのアセンブリー効率の低下を表している可能性がある。各継代で観察された細胞密度は、両方の細胞株間で同等であった（約３×１０６細胞／ｍＬ）（図１Ｂ）。２つの細胞株の集団倍加時間はわずかに異なり、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞の場合、約１９時間、Ｅｘｐｉ２９３Ｆでは約２１時間であることが判明した（図１Ｂ）。いずれの細胞株も、培養中、＞９０％の生存率を示した（図１Ｃ）。Ｅｘｐｉ２９３Ｆの性能を最適化するためにさらなる開発に着手した。
実施例２：レンチウイルスの生産性向上における各種トランスフェクション試薬の効果評価
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を、０．１５Ｅ６細胞／ｍＬを超える最終密度に達するように、１つのＳＦ ２５０ｍＬフラスコに播種した。細胞をＳＦ２５０ｍＬフラスコ中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地に０．１５Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で播種し、１５０ｒｐｍで３日間培養した。３日間の細胞増殖及び増幅後、細胞を３つの異なるモデルＣＡＲ構築物（ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ（Ｃ１）、ＣＤ１９－ＣＤ２２ ＣＡＲデュアルＣＡＲ（Ｉ１）を含むか、又はヒト化ＣＡＲとＴｅｔ２ ｓｈＲＮＡを含む（Ｍ１））でトランスフェクトした。トランスフェクション試薬としてＰＥＩｐｒｏ（登録商標）又はＦｅｃｔｏＶＩＲ－ＡＡＶ（登録商標）を使用した。各構築物／Ｅ６細胞の０．４μｇのＤＮＡをＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（０．４μＬ／１Ｅ６細胞）又はＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶ（０．４μＬ／１Ｅ６細胞）のいずれかと混合し、トランスフェクション複合体を形成させた。トランスフェクション複合体を細胞培養物に直接添加した。トランスフェクションから２４時間後、ＭｇＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）を含む２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを各培地に添加した。感染から４８時間後、分析のために細胞を採取した。各細胞株のレンチウイルス生産性を、ＴＵアッセイ及びＥｌｉｓａを用いて、測定及び比較した。
トランスフェクション試薬ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶは、ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）試薬と比較して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞のＬＶ生産性を目的遺伝子に応じて１．９倍から２．８倍に有意に高めた（図２Ａ）。生産性の増加は、大規模生産でも維持された（図２Ｂ及び表１）。
表１：バルクハーベスト中のレンチウイルス生産性の生データ
さらに、構築物にＦｅｃｔｏＶＩＲ－ＡＡＶ（登録商標）をトランスフェクトすると、ＰＰ／ＩＰ比の低下が観察され、これはトランスフェクション効率の向上を表している。
実施例３：より高度のウイルス生産に好適なＤＮＡ量の決定
この実施例では、ウイルス収率を高めるためにトランスフェクションに使用されるＤＮＡの量を決定する方法について説明する。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を解凍し、０．１５Ｅ６細胞／ｍＬを超える最終密度に達するように、１つのＳＦ２５０ｍＬフラスコに播種した。細胞をＳＦ２５０ｍＬフラスコ中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地に０．１５Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で播種し、１５０ｒｐｍで３日間培養した。細胞を、５０Ｌ培養の播種に好適な量に達するように、常用的に培養した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地の使い捨ての撹拌タンクバイオリアクター中に接種して、好適な細胞密度（１．５０×１０６細胞／ｍＬ～２．５０×１０６細胞／ｍＬ）に到達させた。細胞の生存率は≧９０％と評価された。トランスフェクションは播種後７２時間実施した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（５ｗ／ｖ％）中で、０．３μｇのＤＮＡ／Ｅ６細胞、０．４μｇのＤＮＡ／Ｅ６細胞、０．５μｇのＤＮＡ／Ｅ６又は０．６μｇのＤＮＡ／Ｅ６細胞をＦｅｃｔｏＶＩＲ－ＡＡＶ（登録商標）と１：１の比で混合し、トランスフェクション複合体の形成を可能にするために３０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体を細胞培養物に直接添加した。トランスフェクションから２０時間後、ＭｇＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）を含む２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを培地に添加した。レンチウイルスベクター粒子を含む馴化培地をトランスフェクションの４８時間後に回収した。
データから、０．４μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞で最も高いウイルス生産が達成されることがわかった（図３）。さらに、０．４μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞で得られたウイルス生産は、供給者が推奨する１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞で得られたウイルス生産よりも高かった（データは示していない）。
実施例４：レンチウイルス生産性に対するトランスフェクション前の培地ｐＨの修正の決定
この実施例では、培地のｐＨを７．１から６．７±０．０５に下げると、レンチウイルスの生産性が向上することを実証する。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を解凍し、０．１５Ｅ６細胞／ｍＬを超える最終密度に達するように、１つのＳＦ２５０ｍＬフラスコに播種した。細胞を標準培養条件下で４日間培養し、２．５Ｌ培養の播種のために好適な量に達するように、スケールアップした。培地として、既知組成の、無血清及び無タンパク質培地である、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地を使用した。
３日間の細胞増殖及び増幅後、開発中に決定されたトランスフェクションでの好適な細胞密度（１．５０×１０６細胞／ｍＬ～２．５０×１０６細胞／ｍＬ）に到達した。細胞の生存率は≧９０％と評価された。トランスフェクションは、播種から７２時間後に実施した。３日間の細胞増殖及び増幅後、細胞に３つのモデル構築物（Ｃ１、Ｉ１及びＭ１）をトランスフェクトした。トランスフェクション前にｐＨ設定値を７．１から６．７±０．０５に修正した。トランスフェクションは、この新しい設定値に達した後に実施した。各構築物／Ｅ６細胞の０．４μｇのＤＮＡをＦｅｃｔｏＶＩＲ－ＡＡＶ（登録商標）試薬（０．４μＬ／１Ｅ６細胞）と混合し、一緒にインキュベートすることにより得られたトランスフェクション複合体で、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、ＭｇＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）を含む２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを各培地に添加した。感染から４８時間後、分析のために細胞を採取した。ＴＵアッセイ及びＥｌｉｓａを用いて、各細胞株のレンチウイルス生産性を測定及び比較した。
このデータから、トランスフェクション前にｐＨを６．７に変更すると、レンチウイルスの生産性が両構築物で約３倍に増加することがわかった（図４）。対照的に、別の研究では、プロセスのより早期（接種時）にｐＨを６．７に低下させると、細胞増殖に悪影響を及ぼし、生産プロセスが遅くなることが明らかにされた（データは示していない）。従って、この実験から、慎重に時間を計ってｐＨを低下させると、高度な細胞増殖とＬＶ生産性の向上の両方をもたらすことがわかる。
実施例５：レンチウイルス生産
全てのベクター作製及び細胞培養は、２９３Ｆ細胞株に由来するＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞を使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞も使用して実施した。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞の１バイアルを解凍し、０．１５Ｅ６細胞／ｍＬ を超える最終密度に達するまで１つのＳＦ２５０ｍＬフラスコに播種した。細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地を用いて標準培養条件下で４日間培養し、撹拌タンクバイオリアクター５０Ｌの播種に必要な細胞量に達するまでスケールアップした。
使い捨ての撹拌タンクバイオリアクターにおいて、最終体積４７ＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地中にＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を０．２×１０６細胞／ｍＬ±０．０２５で接種した。３日間の細胞増殖及び増幅後、開発中に決定されたトランスフェクションでの好適な細胞密度（１．５０×１０６細胞／ｍＬ～２．５０×１０６細胞／ｍＬ）に到達した。細胞の生存率は≧９０％と評価された。トランスフェクションは、播種から７２時間後に実施した。トランスフェクション前にｐＨ設定値を７．１から６．７±０．０５に修正した。トランスフェクションは、この新しい設定値に達した後に実施した。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションは、３つのヘルパープラスミドと１つのトランスファー（ＧＯＩ）プラスミドから構成される４つの異なるプラスミドを用いて、達成された：
（ｉ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－ｇ）エンベロープの糖タンパク質をコードするプラスミド、
（ｉｉ）構造タンパク質及びウイルス酵素をコードするプラスミド、
（ｉｉｉ）転写後調節因子（Ｒｅｖ）をコードするプラスミド、及び
（ｉｖ）導入遺伝子と、ウイルスＲＮＡ産生、プロセシング及びパッケージングに必要な最小限のシス作用配列とを含むトランスファープラスミド。
ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶ（Ｒｅｆ １２０－１００、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）をトランスフェクション試薬として使用した。０．４μｇのＤＮＡ／Ｅ６細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（５ｗ／ｖ％）中でＦｅｃｔｏｒＶＩＲ－ＡＡＶ（登録商標）（０．４μＬ／１Ｅ６細胞）と混合し、３０分間インキュベートして、トランスフェクション複合体を形成させた。トランスフェクション複合体を細胞培養に直接添加した。トランスフェクションから２０時間後、ＭｇＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）を含む２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを培地に添加した。レンチウイルスベクター粒子を含む馴化培地をトランスフェクションの４８時間後に回収した。ＴＵアッセイ及びｐ２４ ＥＬＩＳＡは、実施例１に記載の通りに実施した。
データから、実施例２～４に記載した条件を適用すると、実施例１に記載の対照条件で得られた約１．５Ｅ７ ＴＵ／ｍＬと比較して、Ｃ１の場合、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞でのレンチウイルス生産性が３Ｅ７ ＴＵ／ｍＬまで増加したことがわかった。レンチウイルスの生産性は、Ｉ１の場合、バルクハーベスト中に１．５Ｅ７ ＴＵ／ｍＬであることが判明した。図５は、（ｉ）トランスフェクション試薬としてＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶを使用したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞と、（ｉｉ）トランスフェクション試薬としてＰＥＩｐｒｏ（登録商標）を使用したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の２つの生産システムでＣ１及びＩ１構築物を使用したレンチウイルスの生産性の比較を示す。
実施例６：アルギニンの添加により、様々な実験セットアップにおける濾過プロセス時間が改善される
Ｃ１をモデルベクターとして用いて濾過を行い、清澄化した採取物を得た。安定化剤としてのアルギニンの効果を調べるために、レンチウイルスベクターを含む出発物質に１Ｍアルギニン－ＨＣｌを添加して、５０ｍＭの最終アルギニン濃度を達成した。清澄化した採取物を未処理の対照として使用した。
清澄化採取物サンプルをＰＩＰＥＳ製剤化用緩衝液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、７５ｍ ＭＮａＣｌ、７３ｍＭスクロース、ｐＨ ６．５）を用いて濾過し、レンチウイルスベクター溶液を濃縮し、緩衝剤で再度処理した。濃縮し、緩衝剤で再処理したレンチウイルスベクター溶液を濾過スキッドから回収し、ホールドアップ体積のＰＩＰＥＳ濾過バッファーでシステムをフラッシングした。
第１濾液中のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の形質導入単位（ＴＵ）力価の測定は、実施例１に記載のバイオ分析試験方法に従って行った。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるｐ２４の測定は、実施例１に記載の通りに実施した。データから、アルギニンの存在下では、サンプルを限外濾過に付した対照ランと比較して、処理時間が２４４分から１４５分に短縮されることがわかった（図６）。結論として、アルギニン（最終濃度５０ｍＭ）を添加すると、プロセス時間が約４０％改善された。
実施例７：アルギニンの存在により、濾過中のベクター回収率が向上した
この実験では、アルギニンの添加がその後の濾過ステップのベクター回収率に及ぼす影響について説明する。
清澄化採取物を調製し、５０ｍＭのアルギニンを添加した。未処理の清澄化採取物を対照として使用した。いずれのサンプルについても、２００ｍＬの清澄化採取物を使用した。アルギニンを含む清澄化採取物中のベクター濃度は、４．８Ｅ＋０６ＴＵ／ｍＬであったのに対し、対照清澄化採取物サンプル中の出発濃度は、９．５Ｅ＋０６ＴＵ／ｍＬであった。清澄化採取物は、当業者に周知のウイルス精製手順に従って濾過及び濃縮した。
アルギニンを含むサンプルは、２２．３ｍＬの最終体積と、３．７Ｅ＋０７ＴＵ／ｍＬのベクター濃度を有し、８５％のベクター回収率が得られたのに対し、アルギニンを含まない対照サンプルは、最終体積が２０．５ｍＬ、ベクター濃度が３．７Ｅ＋０７ＴＵ／ｍＬで、４０％のベクター回収率のみをもたらした（図７）。
実施例８：サンプルを濾過試験に供した後の清澄化採取物のさらなる精製
この実験では、清澄化採取物のさらなる精製手順について説明する。
清澄化採取物に１Ｍアルギニン－ＨＣｌを添加し、５０ｍＭの最終アルギニン濃度を達成した。このサンプルを実施例６に記載のように使用される濾過に付して、第１の精製中間体を得た。サンプルに対して５０Ｕ／ｍＬを用いるベンゾナーゼ処理を実施した。カラムの平衡化及び洗浄のためにＰＩＰＥＳ交換バッファーを用いて、クロマトグラフィーを実施した。
クロマトグラフィー後に得られた精製中間体（第１の濾液）に、７５ｍＭのアルギニンの最終濃度まで１Ｍアルギニン－ＨＣｌを添加し、ＰＩＰＥＳ製剤バッファーを用いる濾過に付した。さらなる分析のために第２の濾液を収集した。
実施例９：アルギニンの存在下において、レンチウイルス下流プロセスのいずれの濾過ステップでも頑健な高ベクター回収率を達成することができる
この実験では、濾過ステップ前にアルギニン添加を実施すると、ベクターの回収率がさらに向上することを説明する。
この下流プロセスは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞株を用いて生産されたＭ１構築物及びＲＣＶ構築物の精製に使用した。生成物Ｍ１の様々なベクター構築物を用い、濾液１及び濾液２の前の７５ｍＭのアルギニン添加を、様々なベクター濃度について、また複数の構築物に対して試験した。
濾液１の場合、３１６８ｍＬの平均出発体積（範囲：３０３１～３２２４ｍＬ）及び７．５Ｅ＋０６ＴＵ／ｍＬの平均ＴＵ力価（範囲：４．３Ｅ＋０６～１．２Ｅ＋０７ＴＵ／ｍＬ）を使用した。濃縮及び濾過後、回収された濾液１濃縮物は、５６４ｍＬの平均体積（範囲：５２６～６１１ｍＬ）及び３．６Ｅ０７ＴＵ／ｍＬのＴＵ力価（範囲：１．９Ｅ＋０７～５．７Ｅ＋０７ＴＵ／ｍＬ）を有した。従って、全体の濃度係数は約５．６であり、形質導入単位換算のベクター回収率は平均８５％であった（図８）。
濾液２の場合、５５９ｍＬの平均出発体積（範囲：５２２～５９２ｍＬ）及び２．６Ｅ＋０７ＴＵ／ｍＬの平均ＴＵ力価（範囲：１．５Ｅ＋０７～４．１Ｅ＋０７ＴＵ／ｍＬ）を使用した。濃縮及び濾過後、回収された濾液２濃縮物は、４６．３ｍＬの平均体積（範囲：２４．３～７４．４ｍＬ）及び３．４Ｅ＋０８ＴＵ／ｍＬのＴＵ力価（範囲：１．３Ｅ＋０８～１．０Ｅ＋０９ＴＵ／ｍＬ）を有した。従って、全体の濃度係数は約１３．５（範囲：７．５～２２．６）であり、形質導入単位換算のベクター回収率は平均８７％であった（図８）。
実施例１０：アルギニンは、凝集体の存在を濃度依存的に減少させる
この例では、凝集体の存在に対するアルギニンの影響について説明する。
実施例８による精製の終了後に濾液２サンプルを採取し、以下のように処理した：（１）１サンプルを０．８２５Ｍアルギニンと混合して、１５０ｍＭの最終アルギニン濃度を達成した。（２）別のサンプルを等量の２．４７５ｍＭのアルギニンと混合して、３００ｍＭの最終アルギニン濃度を達成した。（３）最終アルギニン濃度を７５ｍＭ（実施例９で得られた濾液２濾液と同様）に保持すると共に、他の２つのサンプルへのアルギニンの添加による希釈を考慮するために、対照サンプルを等量のＰＩＰＥＳ製剤化用緩衝液で処理した。マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）によりサブビジブル粒子についてサンプルを分析した。
アルギニンの存在は、濃度依存的に粒子数及び粒子サイズを低減することがわかった（図９）。アルギニンの添加は、レンチウイルス粒子に凝集に対する耐性を付与すると思われた。結論として、アルギニンは、精製プロセスにおけるレンチウイルスベクターの収率を向上させるためのレンチウイルスベクターの精製に好適な安定化剤であることが判明した。
実施例１１：ベンゾナーゼの存在は、ＤＮＡ不純物を減少させた
この実施例では、ＤＮＡ不純物に対するベンゾナーゼの影響について説明する。
レンチウイルス生産は、ａ）ベンゾナーゼ添加時間の変更；及び／又はｂ）ベンゾナーゼの量の変更を除いて、実施例５に記載の通り、２５０ｍＬＳＦで実施した。実施例５では、２４ＨＰＴでベンゾナーゼを２４Ｕ／ｍＬの濃度で添加した。表１２ａ）からわかるように、ＬＶＶ（Ｃ１）の第１バッチの場合、実験は、３ＨＰＴと２４ＨＰＴの両方で、５Ｕ／ｍＬ、１５Ｕ／ｍＬ、２５Ｕ／ｍＬ及び５０Ｕ／ｍＬと、ベンゾナーゼの添加を変動させることを含んだ。
図１０からわかるように、ベンゾナーゼ濃度及び添加時点を変動させた場合、採取物で２．９Ｅ＋７～４．３Ｅ＋７ＴＵ／ｍＬを示す感染ＬＶＶの生産性（ＴＵ／ｍＬ－ＴＵアッセイ）又は採取物でのＰＰ／ＩＰ（物理粒子／感染性粒子）の比に対するベンゾナーゼの影響は一切なかった。しかし、トランスフェクション後にベンゾナーゼを添加した後、総ＤＮＡ量が有意に減少した（図１１）。これらの結果は、６ＨＰＴでベンゾナーゼをさらに添加したＬＶＶ生産の２回目のバッチ（Ｃ１）でさらに確認された（表１２ｂ；図１２）。
これらのデータは、様々な濃度及び時間でのベンゾナーゼの添加は、感染性ＬＶＶの生産性に影響を与えないが、生産に影響を与える可能性のあるＤＮＡ不純物の濃度を有意に低下させることを示す。
実施例１２：インキュベーション時間及び複合体形成量
この実施例では、インキュベーション時間及び複合体形成量の影響について説明する。
レンチウイルス生産は、ａ）インキュベーション時間の変更；及び／又はｂ）複合体形成量の変更を除いて、実施例５に記載の通り、２５０ｍＬのＳＦで実施した。実施例５では、ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶ（Ｒｅｆ １２０－１００、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）をトランスフェクション試薬として使用した。０．４μｇのＤＮＡ／Ｅ６細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（５ｗ／ｖ％）中でＦｅｃｔｏｒＶＩＲ－ＡＡＶ（登録商標）（０．４μＬ／１Ｅ６細胞）と混合し、３０分間インキュベートして、トランスフェクション複合体（Ｃ１）を形成させた。この例では、１５分、３０分、４５分及び６０分のインキュベーションで、複合体形成量を５ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％及び１０ｗ／ｖ％から変動させた（表１３ａ）。
図１３からわかるように、複合体形成量の増加によるトランスフェクション効率へのプラスの影響は観察されなかった。さらに、１５～６０分のインキュベーションの場合、５％の複合体形成量で同様のＬＬＶ生産性（採取物で約２Ｅ＋７ＴＵ／ｍＬ）が観察された。５％の複合体形成量についてのこれらの結果は、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分及び６０分でＬＶＶ（Ｉ１）を含むデュアルＣＡＲを使用する２回目のバッチＬＶＶ製造でさらに確認された（図１４）。
これらのデータは、インキュベーション時間と複合体形成量の変動が、感染性ＬＶＶの生産性に影響を与えないことを示し、且つインキュベーション期間にわたるトランスフェクション複合体の安定性を示している。
実施例１３：プロセスの頑健性
この実施例は、２つの異なる構築物（Ｃ１とＩ１）を使用した様々なスケールでの生産プロセスの頑健性を実証する。
レンチウイルス生産は、生産規模の変更を除いて、実施例５に記載の通りに実施した。まず、図１５は、構築物Ｉ１の５０Ｌスケールでの攪拌タンクバイオリアクターでの細胞増殖を示す。様々な構築物での頑健性をさらに調べるために、図１６は、４つの異なるスケール（５０Ｌ、２．６Ｌ、２．５Ｌの振盪フラスコ（ＳＦ）及び１００ｍＬ ＳＦ）で２つの異なる構築物（Ｃ１及びＩ１）を使用したプロセスの頑健性を示している。
これらのデータは、例えば、このプロセスが、様々な構築物を用いた複数のスケールで、再現性且つ頑健性を有し、多くの異なるＬＶＶの生産に使用できることを示している。
参照による組込み
本明細書に記載されるあらゆる刊行物、特許及びアクセッション番号は、各々の刊行物又は特許が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているのと同様に、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
均等物
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様及び変形形態は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様及び均等な変形形態の全てを含むと解釈されることが意図される。

Claims (104)

  1. レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
    ａ）複数の哺乳動物（例えば、ヒト）細胞を提供するステップと、
    ｂ）前記複数の哺乳動物細胞を、
    ｉ）ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬、及び
    ｉｉ）治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）及びウイルス粒子にパッケージングするための十分なＬＴＲ配列をコードする核酸並びに任意選択でレンチウイルスパッケージングタンパク質、レンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸
    と、少なくとも前記細胞のサブセットに前記核酸が導入されることを可能にする条件下で接触させるステップと、
    ｃ）前記レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で前記細胞を培養するステップと
    を含む方法。
  2. 前記複数の哺乳動物細胞が５０Ｌの培養物中にある場合、他には同様の１００ｍｌの培養物中における培養物１ｍｌ当たりの形質導入単位数の５０％、６０％、７０％又は８０％以上である、培養物１ｍｌ当たりの前記形質導入単位数をもたらす、請求項１に記載の方法。
  3. 実施例５に記載の条件下で使用された場合、少なくとも１×１０７若しくは３×１０７又は少なくとも１×１０８の形質導入単位をもたらす、請求項１又は２に記載の方法。
  4. １１８８：１、９５３：１及び１８００：１以下のＰＰ（物理的粒子）：ＩＰ（感染性粒子）の比をもたらす、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記哺乳動物細胞は、２９３細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶは、０．３～０．６μｌのＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶ／百万細胞、例えば約０．４μｌ／百万細胞の濃度で使用される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記核酸は、０．３～０．６μｇの核酸／百万細胞、例えば約０．４μｇ／百万細胞の濃度で使用される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶ：トランスフェクションのためのＤＮＡの比は、１：０．５～１：２、例えば約１：１である（ここで、任意選択で、前記トランスフェクションのためのＤＮＡは、前記治療用エフェクターをコードするＤＮＡ、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質をコードするＤＮＡ及びレトロウイルスエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡを含む）、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬は、前記核酸と複合体化される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. ステップｂ）前に前記ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬を前記核酸と混合するステップをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記トランスフェクション試薬と前記核酸との複合体形成量は、約１％～約１５％、例えば約１％～約１０％（例えば、約５～７．５％又は７．５～１０％）である、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 前記複合体形成量は、３～７％、４～６％又は約５％である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬と前記核酸とは、複合体形成が起こることを可能にするのに十分な時間、例えば約１０～９０分、例えば１５～６０、例えば１５～３０、３０～４５又は４５～６０分にわたってインキュベートされる、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
    ａ）複数の哺乳動物（例えば、ヒト）細胞を約６．９超又は約６．９～７．３、例えば約７．０～７．１のｐＨで培養するステップ、
    ｂ）ステップａ）に続いて、培養物の前記ｐＨを約６．０～６．８、例えば６．６～６．８、例えば約６．７に調節するステップ、
    ｃ）ステップｂ）に続いて、前記培養物をトランスフェクション試薬及びＤＮＡと接触させるステップ
    を含む方法。
  15. 前記トランスフェクション試薬は、ＦｅｃｔｏＶＩＲ（登録商標）－ＡＡＶトランスフェクション試薬を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ＤＮＡは、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. ａ）は、約２～４日間、例えば約３日間にわたって前記細胞を培養するステップを含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ステップｂ）とステップｃ）との間において、前記細胞を培養する追加のステップをさらに含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ステップｃ）後に前記細胞を培養する追加のステップをさらに含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ステップｂ）は、前記ｐＨを約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１だけ低下させるステップを含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ステップａ）前に、前記複数の哺乳動物細胞は、０．１×１０６細胞／ｍＬ～０．３×１０６細胞／ｍＬ（例えば、約０．１５×１０６細胞／ｍＬ又は約０．２×１０６細胞／ｍＬ）で最終体積の培養培地（例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地）に接種される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記複数の哺乳動物細胞は、ステップａ）の５０～８０時間（例えば、約５５時間、約６０時間、約６５時間、約７０時間、約７２時間、約７５時間又は約８０時間）前に接種される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記複数の哺乳動物細胞は、トランスフェクションでの好適な細胞密度（例えば、約１．０×１０６細胞／ｍＬ～約３．０×１０６細胞／ｍＬ（例えば、１．５×１０６細胞／ｍＬ～２．５×１０６細胞／ｍＬ）への細胞増殖及び増幅を可能にするのに好適な条件下で培養される、ステップ２１又は２２に記載の方法。
  24. レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
    ａ）前記レンチウイルスベクター及び少なくとも１つの不純物を含む組成物を提供するステップ（例えば、ここで、前記組成物は、清澄化された細胞採取物又は濾液を含む）と、
    ｂ）前記組成物をアルギニン又はその塩と接触させるステップと
    を含む方法。
  25. ｉ）前記アルギニンは、約２５～５０ｍＭ（約５０ｍＭ）、５０～１００ｍＭ（例えば、約７５ｍＭ）、１００～２００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ）又は２００～４００（例えば、約３００）ｍＭのアルギニン）の濃度であること、又は
    ｉｉ）前記アルギニンは、例えば、実施例７によるアッセイにおいて、他には同様の組成物と比較して、前記レンチウイルスベクターの形質導入単位のレベルを約１０％～３００％、２０％～１８０％、３０％～１６０％、５０％～１５０％、７５％～１２５％又は約１００％だけ増加させるのに十分な濃度であること、
    ｉｉｉ）ステップｂ）後、前記組成物は、例えば、実施例１０に記載のアッセイにおいて、マイクロフローイメージングによって測定された場合、１ｍｌ当たり４００，０００、３００，０００、２００，０００又は１００，０００未満の総粒子濃度を示し、任意選択で、前記粒子は、凝集されたレンチウイルスを含むこと、
    ｉｖ）ステップｂ）後、前記組成物は、例えば、実施例１０に記載のアッセイにおいて、マイクロフローイメージングによって測定された場合、１ｍｌ当たり約５，０００、４，５００、４，０００、３，５００、３，０００又は２，５００未満の、≧１０μｍの粒子の濃度を示し、任意選択で、前記粒子は、凝集されたレンチウイルスを含むこと、
    ｖ）ステップｂ）後、前記組成物は、例えば、実施例１０に記載のアッセイにおいて、マイクロフローイメージングによって測定された場合、１ｍｌ当たり約５００、４００、３００又は２００未満の、≧２５μｍの粒子の濃度を示し、任意選択で、前記粒子は、凝集されたレンチウイルスを含むこと、
    ｖｉ）ステップｂ）後、前記組成物は、前記アルギニン又はその塩を添加しないこと以外には同様の濾液と比較して、前記レンチウイルスベクターの低減された凝集を示すこと、
    ｖｉｉ）前記レンチウイルスベクターの形質導入単位の回収率は、例えば、実施例７によるアッセイで測定された場合、アルギニンを添加しないこと以外には同様の対照よりも例えば少なくとも約１０％、２０％、５０％、１００％又は２００％だけ高いこと
    の１つ又は複数である、請求項２４に記載の方法。
  26. ｂ）は、前記組成物を、前記アルギニン及び緩衝液を含む溶液と接触させるステップを含み、任意選択で、前記緩衝液は、ＰＩＰＥＳであり、任意選択で、前記ＰＩＰＥＳは、前記溶液中において約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、例えば約２０ｍＭの濃度である、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 前記溶液は、約６．０～約７．０、例えば約６．５のｐＨを有する、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記溶液は、塩をさらに含み、任意選択で、前記塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選択され、例えば塩化ナトリウムである、請求項２６又は２７に記載の方法。
  29. 前記塩は、約２５～１５０ｍＭ、例えば５０～１００ｍＭ、例えば約７５ｍＭの濃度で前記溶液中に存在する、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記溶液中の前記濃度の前記塩は、約６．５のｐＨを有する、請求項２８又は２９に記載の方法。
  31. 前記溶液は、炭水化物、例えば非還元炭水化物、例えばスクロース又はトレハロースをさらに含む、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記炭水化物は、前記溶液の約１～約１０重量／体積％、例えば前記溶液の約２～約５重量／体積％、前記溶液の約２．５重量／体積％の濃度で溶液中に存在する、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記炭水化物は、約３０～１５０ｍＭ（約７３ｍＭ）又は１５０～３００（例えば、約２２０）ｍＭの濃度で前記溶液中に存在する、請求項３１又は３２に記載の方法。
  34. 前記溶液は、ＮａＣｌ（例えば、約２５～１５０ｍＭ、例えば５０～１００ｍＭ、例えば約７５ｍＭ）と、スクロース（例えば、約３０～１５０ｍＭ、例えば約７３ｍＭ若しくは例えば約１５０～３００ｍＭ、例えば約２２０ｍＭ又は前記溶液の約２．５重量／体積％）との一方又は両方をさらに含む、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記溶液は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び前記溶液の２．５重量／体積％のスクロースを含み、前記溶液は、約６．５のｐＨを有する、請求項２６に記載の方法。
  36. 前記溶液は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び７３ｍＭのスクロースを含み、前記溶液は、約６．５のｐＨを有する、請求項２６に記載の方法。
  37. 前記溶液は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び２２０ｍＭのスクロースを含み、前記溶液は、約６．５のｐＨを有する、請求項２６に記載の方法。
  38. 前記溶液は、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭのアルギニン、例えばアルギニン－ＨＣｌをさらに含み、前記溶液は、約６．５のｐＨを有する、請求項２６に記載の方法。
  39. 前記溶液の浸透圧は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３００ｍＯｓｍ／ｋ、例えば約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. ｃ）ｂ）の前記組成物に対して精製ステップ、例えば濾過ステップを実施し、それにより前記レンチウイルスベクターを含む半精製組成物を生成するステップをさらに含む、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. ステップｃ）後、前記半精製組成物をアルギニン又はその塩と接触させるステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記アルギニンは、前記レンチウイルスベクターを被包する、請求項２４～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記アルギニンは、前記レンチウイルスベクターを安定化する、請求項２４～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記不純物は、タンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質）、核酸（例えば、宿主細胞核酸）、炭水化物（例えば、宿主細胞炭水化物）、脂質、酵素、塩、緩衝液又はそれらの任意の組合せを含む、請求項２４～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. トランスフェクションでの前記細胞密度は、約１．０×１０６細胞／ｍＬ～約３．０×１０６細胞／ｍＬ（例えば、１．５×１０６細胞／ｍＬ～２．５×１０６細胞／ｍＬ）である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記細胞の生存率は、トランスフェクション時に少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）であるか又はそのように評価される、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記細胞の前記生存率は、トランスフェクション時又はその前後（例えば、トランスフェクション前の３０分以内）に測定される、請求項４６に記載の方法。
  48. ２つ以上の核酸（例えば、２つ以上のプラスミド、例えば２つのプラスミド、３つのプラスミド、４つのプラスミド又は５つのプラスミド）を用いたプロセスに使用される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. レンチウイルスベクター、アルギニン、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）緩衝液及び塩を含む水性組成物。
  50. 前記水性組成物中の前記アルギニンは、約２５～５０ｍＭ（約５０ｍＭ）、５０～１００ｍＭ（例えば、約７５ｍＭ）、１００～２００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ）又は２００～４００（例えば、約３００）ｍＭのアルギニン）の濃度であり、任意選択で、前記ＰＩＰＥＳ水性組成物は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、例えば約、例えば２０ｍＭの濃度である、請求項４９に記載の水性組成物。
  51. 約６．０～約７．０、例えば約６．５のｐＨを有する、請求項４９又は５０に記載の水性組成物。
  52. 塩をさらに含み、任意選択で、前記塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選択される、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の水性組成物。
  53. 前記塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の水性組成物。
  54. 前記水性組成物中の前記塩は、約２５ｍＭ～約１５０ｍＭ、例えば約５０ｍＭ～約７５ｍＭである、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の水性組成物。
  55. ２０ｍＭのＰＩＰＥＳ及び７５ｍＭの塩化ナトリウムを含み、約６．５のｐＨを有する、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の水性組成物。
  56. 炭水化物、例えば非還元炭水化物、例えばスクロース又はトレハロースをさらに含む、請求項４９～５５のいずれか一項に記載の水性組成物。
  57. 前記炭水化物は、前記溶液の約１～約１０重量／体積％、例えば前記水性組成物の約２～約５重量／体積％、前記水性組成物の約２．５重量／体積％の濃度で前記水性組成物中に存在する、請求項４９～５６のいずれか一項に記載の水性組成物。
  58. 前記炭水化物は、約３０～１５０ｍＭ（約７３ｍＭ）又は１５０～３００（例えば、約２２０）ｍＭの濃度で前記水性組成物中に存在する、請求項４９～５７のいずれか一項に記載の水性組成物。
  59. ＮａＣｌ（例えば、約２５～１５０ｍＭ、例えば５０～１００ｍＭ、例えば約７５ｍＭ）と、スクロース（例えば、約３０～１５０ｍＭ、例えば約７３ｍＭ若しくは例えば約１５０～３００ｍＭ、例えば約２２０ｍＭ又は前記水性組成物の約２．５重量／体積％）との一方又は両方を含む、請求項４９～５８のいずれか一項に記載の水性組成物。
  60. ２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び前記水性組成物の２．５重量／体積％のスクロースを含み、約６．５のｐＨを有する、請求項４９～５９のいずれか一項に記載の水性組成物。
  61. ２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び７３ｍＭのスクロースを含み、約６．５のｐＨを有する、請求項４９～６０のいずれか一項に記載の水性組成物。
  62. ２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、７５ｍＭの塩化ナトリウム及び２２０ｍＭのスクロースを含み、約６．５のｐＨを有する、請求項４９～６１のいずれか一項に記載の水性組成物。
  63. 前記水性組成物の浸透圧は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３００ｍＯｓｍ／ｋ、例えば約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項４９～６２のいずれか一項に記載の水性組成物。
  64. 請求項４９～６３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターは、約３×１０８ＴＵ／ｍＬ～約５×１０８ＴＵ／ｍＬの濃度で存在する、請求項４９～６３のいずれか一項に記載の水性組成物。
  65. ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びリポタンパク質からなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質を含まない、請求項４９～６４のいずれか一項に記載の水性組成物。
  66. レンチウイルスベクターは、導入遺伝子、例えばタンパク質、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項１～６５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
  67. 前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び１つ又は複数のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
  68. 前記シグナル伝達ドメインは、１つ若しくは複数の一次シグナル伝達ドメイン及び／又は１つ若しくは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～６７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
  69. 前記１つ又は複数の一次シグナル伝達ドメインの１つは、ＣＤ３－ζ刺激ドメインを含む、請求項１～６８のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
  70. 前記共刺激シグナル伝達ドメインの１つ又は複数は、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される共刺激タンパク質から選択される細胞内ドメイン、例えば４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン又はＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
  71. 前記抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである、請求項１～７０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
  72. 前記抗原結合ドメインは、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３；上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖｌｌｌ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１ １７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２；メソテリン；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）；ステージ特異的胎児性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体α；受容体チロシン－プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）（ｂｃｒ－ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１ Ｅ２（ＯＲ５１ Ｅ２）；ＴＣＲγオルタネートリーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；***タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫アポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス性癌遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；後期糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックプロテイン７０－２変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；及び免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群から選択される抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、メソテリン又はＣＤ１２３に結合する、請求項１～７１のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
  73. 前記ＣＡＲは、抗ＣＤ１９抗体又はそのフラグメント、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜貫通ドメイン及びＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１～７２のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
  74. 第２の導入遺伝子、例えば第２のタンパク質、例えば第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のタンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含む、請求項１～７３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
  75. レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
    ａ）ヒト細胞（例えば、２９３細胞）の集団を提供するステップと、
    ｂ）レトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸を前記細胞に導入するステップと、
    ｃ）ステップｂ）の約２～６（例えば、約３）、４～１０（例えば、６）、６～４０、１０～４０、１０～３０（例えば、約２４）又は約２０時間後の時点で前記細胞をベンゾナーゼと接触させるステップと、
    ｄ）前記レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で前記細胞を培養するステップと
    を含む方法。
  76. ベンゾナーゼは、前記細胞からレンチウイルスベクターを採取する６～１０時間、１０～２０時間、２０～３０時間、３０～４０時間又は４０～５０時間前に添加される、請求項７５に記載の方法。
  77. レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
    ａ）ヒト細胞（例えば、２９３細胞）の集団を提供するステップ、
    ｂ）レトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸を前記細胞に導入するステップ、
    ｃ）（例えば、ステップｂの３～２４時間後に）前記細胞をベンゾナーゼと接触させるステップ、
    ｄ）前記レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で前記細胞を培養するステップ、
    ｅ）ステップｃ）の６～１０時間、１０～２０時間、２０～３０時間、３０～４０時間又は４０～５０時間後、細胞から前記レンチウイルスベクターを採取するステップ
    を含む方法。
  78. ベンゾナーゼは、約１０～４０Ｕ／ｍＬ、例えば２０～３０Ｕ／ｍＬ、例えば約２５Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. ベンゾナーゼは、約３～６０Ｕ／ｍＬ、３～１０Ｕ／ｍＬ、３～７Ｕ／ｍＬ、４～６Ｕ／ｍＬ又は約５Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項７５～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記ベンゾナーゼは、５～５０、５～１５、１５～２５又は２５～５０Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項７５～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. ステップｃ）前に前記ベンゾナーゼを例えば約１～５ｍＭ、１～３ｍＭ又は約２ｍＭのＭｇＣｌ２と接触させるステップをさらに含む、請求項７５～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. レンチウイルスベクターを製造する方法であって、
    ａ）複数の哺乳動物（例えば、ヒト）細胞を提供するステップであって、前記複数の哺乳動物細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を含まず（例えば、ここで、前記細胞は、線維芽細胞、例えば胎児性腎線維芽細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞である）、前記複数の哺乳動物細胞は、１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む、ステップ、
    ｂ）前記レンチウイルスベクターの生産に好適な条件下で前記細胞を培養するステップ
    を含む方法。
  83. ａ）は、前記核酸を前記複数の哺乳動物細胞に導入するステップを含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記複数の哺乳動物細胞から前記レンチウイルスベクターを少なくとも部分的に分離するステップをさらに含む、請求項７５～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記１つ又は複数のレトロウイルスパッケージングタンパク質は、レンチウイルスｇａｇ、レンチウイルスｐｏｌ若しくはレンチウイルスｒｅｖ又はそれらの任意の組合せを含む、請求項８３又は８４に記載の方法。
  86. 前記レトロウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇを含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. レンチウイルスベクターの調製物であって、
    ａ）治療用エフェクター、例えば治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスゲノムと、
    ｂ）前記レンチウイルスゲノムを被包するエンベロープ（ここで、任意選択で、前記エンベロープは、ＶＳＶ－Ｇを含む）と
    を含む複数のレンチウイルスベクターを含み、
    少なくとも５×１０７、１×１０８、１×１０９又は１×１０１０の形質導入単位を含み、
    ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする、１０μｇ／ｍｌ未満又は１μｇ／ｍｌ未満の核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む調製物。
  88. 前記複数のレンチウイルスベクターは、少なくとも１×１０９、２×１０９、５×１０９又は１×１０１０、２×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、５×１０１又は１×１０１２の前記細胞を含む、請求項８３～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記複数の哺乳動物細胞は、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００又は５００Ｌの培養液量中にある、請求項８３～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記複数の哺乳動物細胞を無血清培地で培養するステップを含む、請求項８３～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記複数の哺乳動物細胞は、懸濁液中で増殖される、請求項８３～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、国際公開第２０１４１５３２７０Ａ１号パンフレットに記載されるように、例えばヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ）を含む、請求項８３～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記ＣＡＲは、デュアルＣＡＲ（例えば、国際公開第２０１６１６４７３１Ａ２号パンフレットに記載されるように、例えばヒト化ＣＤ１９－ＣＤ２２ ＣＡＲ）を含む、請求項８３～９１のいずれか一項に記載の方法。
  94. ＣＡＲをコードする前記核酸は、例えば、国際公開第２０１７０４９１６６Ａ号パンフレットに記載されるように、ｓｈＲＮＡをさらにコードする、請求項８３～９１のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記レンチウイルスベクターは、血清の非存在下で培養された細胞中で生産される、請求項８３～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記レンチウイルスベクターは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された場合、１００±２５ｎｍの流体力学的半径によって特徴付けられる、請求項１～９５のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  97. 前記レンチウイルスベクターは、２５℃～５５℃の温度範囲内で１００±２５ｎｍの前記流体力学的半径を維持する、請求項１～９６のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  98. 前記レンチウイルスベクターは、１０％～２５％の多分散性によって特徴付けられる、請求項１～９７のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  99. 前記レンチウイルスベクターは、２５℃～５５℃の温度範囲内で１０％～２５％の前記多分散性を維持する、請求項１～９８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  100. 前記レンチウイルスベクターは、３回の凍結／融解サイクル後、前記凍結／融解サイクル前の前記水性組成物中の前記レンチウイルスベクターの濃度と比較して、約７０％～約１００％の前記濃度を維持し、前記凍結／融解サイクルの各々は、前記水性組成物を凍結し、且つ続いて前記水性組成物を室温で融解させることを含む、請求項１～９９のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  101. 前記レンチウイルスベクターは、６～１０回の前記凍結／融解サイクル後、例えば６～９回の前記凍結／融解サイクル後、約７０％～約１００％の前記濃度を維持する、請求項１～１００のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
  102. レンチウイルスベクターと、リン酸緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液からなる群から選択される緩衝液と、塩とを含む水性組成物。
  103. 前記塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムからなる群から選択される、請求項１０２に記載の水性組成物。
  104. スクロース及びトレハロースからなる群から選択される非還元炭水化物をさらに含む、請求項１０１又は１０３に記載の水性組成物。
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