JP2024513520A - 心筋細胞及び組成物ならびにそれらの生産方法 - Google Patents

心筋細胞及び組成物ならびにそれらの生産方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2024513520A
JP2024513520A JP2023562560A JP2023562560A JP2024513520A JP 2024513520 A JP2024513520 A JP 2024513520A JP 2023562560 A JP2023562560 A JP 2023562560A JP 2023562560 A JP2023562560 A JP 2023562560A JP 2024513520 A JP2024513520 A JP 2024513520A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cardiomyocytes
cardiomyocyte
cells
immature
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023562560A
Other languages
English (en)
Inventor
リチャード ティー． リー，
ジェシカ ガーバーン，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harvard College
Childrens Medical Center Corp
Original Assignee
Harvard College
Childrens Medical Center Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College, Childrens Medical Center Corp filed Critical Harvard College
Publication of JP2024513520A publication Critical patent/JP2024513520A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Abstract

本書では、成熟した心筋細胞を生成する方法、及び成熟した心筋細胞を含む組成物が開示される。また、本書では、休止心筋細胞の成熟を増進する方法、及び成熟した休止心筋細胞を含む組成物も開示される。本書では、未熟心筋細胞から成熟した心筋細胞を生産する方法が開示される。当該方法は、例えば、パルス培養または定常状態培養のような二次元培養または三次元培養などの培養下で、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と未熟心筋細胞を接触させることを含む。【選択図】図１

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年４月１１日に出願された米国仮出願第６３／１７３，４８９号の利益を主張する。上記の出願の全教示は、参照により本書に組み込まれる。
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から心筋細胞を生産する現行の分化プロトコルは、心筋トロポニンＴの発現によって判定して高純度の心筋細胞集団を生成することが可能である。しかし、これらの心筋細胞は未熟なままであり、胎児の状態によりよく類似し、成体心筋細胞と比較して最大収縮力が低く、アップストローク速度が遅く、ミトコンドリア機能が未熟である。未熟心筋細胞は、サルコメア構造がさほど組織化されておらず、十分な収縮力が得られないだけでなく、成体動物モデルに供給すると生命を脅かす可能性のある心室性不整脈をもたらす自動性またはペースメーカー様の活動を示すため、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の未熟さは、心疾患のための心筋細胞細胞療法の臨床応用に対する大きな障壁となり得る。発達中、心筋細胞は、胎児の増殖状態から、出生後により成熟しているが休止している状態への移行を起こす。心筋細胞を休止状態に導くことにより、分化中の心筋細胞の成熟を増進するための改良された方法が必要とされている。
数ある用途の中でもとりわけ細胞療法及びスクリーニングに使用するための、成熟した心筋細胞を生成するための方法またはプロトコルが必要とされている。いくつかの実施形態では、心筋細胞を休止状態に導くことにより、心筋細胞の成熟が増進され得る。
本書では、未熟心筋細胞から成熟した心筋細胞を生産する方法が開示される。当該方法は、例えば、パルス培養または定常状態培養のような二次元培養または三次元培養などの培養下で、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と未熟心筋細胞を接触させることを含む。
また、本書では、心筋細胞の休止を誘導する方法も開示される。当該方法は、例えば、パルス培養または定常状態培養のような二次元培養または三次元培養などの培養下で、心筋細胞成熟因子と老化心筋細胞を接触させ、それにより、休止心筋細胞に移行するように老化心筋細胞を誘導することを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、ｐ５３上方制御因子を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、ｍＴＯＲインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、ｐ５３上方制御因子及び／またはｍＴＯＲインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、セノリティック、ＭＤＭ２インヒビター、及び／またはｍＴＯＲインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、セノリティック、ＭＤＭ２インヒビター、ｍＴＯＲインヒビター、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、Ｔｏｒｉｎ１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ及び／またはケルセチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、及び／またはＴｏｒｉｎ１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子をパルス処置または連続処置によって未熟心筋細胞と接触させる。
いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、Ｔ細胞、または線維芽細胞に由来する。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞は胎児心筋細胞に類似する。
いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞が拍動を開始した後に、未熟心筋細胞を少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させる。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞が拍動を開始した１～３日後に、未熟心筋細胞を少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させる。
いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上の成熟遺伝子の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、１つ以上の成熟遺伝子は、ＴＮＮＩ３、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＮＰＰＢ、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮＡ１ｃ、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＰＡＲＧＣ１、ＫＣＮＪ２、ＲＥＳＴ、ＲｙＲ、及びＳＣＮ５ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上のサルコメアタンパク質の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、１つ以上のサルコメアタンパク質は、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＭＹＨ６、及びＭＹＨ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上のイオンチャネル遺伝子の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、１つ以上のイオンチャネル遺伝子は、ＫＣＮＪ２、ＨＣＮ４、ＳＣＮ５ａ、ＲＹＲ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、及びＳＥＲＣＡ２ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、ＲＥＳＴ及び／またはＧＡＴＡ４の発現増加を呈する。
いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、減少した拍動速度を呈する。いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞は、－７０ｍＶ以下の静止膜電位、毎分４０拍未満の自発拍動速度、及び／または２００Ｖ／秒を超えるアップストローク速度を呈する。いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞は、電気的、収縮性、及び／または代謝的に成熟した心筋細胞である。
また、本書では、本書で開示される方法のいずれかによって生産された非自然発生の心筋細胞も開示される。
いくつかの実施形態では、非自然発生の心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上の成熟遺伝子の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、１つ以上の成熟遺伝子は、ＴＮＮＩ３、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＮＰＰＢ、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮＡ１ｃ、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＰＡＲＧＣ１、ＫＣＮＪ２、ＲＥＳＴ、ＲｙＲ、及びＳＣＮ５ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非自然発生の心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上のサルコメアタンパク質の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、１つ以上のサルコメアタンパク質は、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＭＹＨ６、及びＭＹＨ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非自然発生の心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上のイオンチャネル遺伝子の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、１つ以上のイオンチャネル遺伝子は、ＫＣＮＪ２、ＨＣＮ４、ＳＣＮ５ａ、ＲＹＲ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、及びＳＥＲＣＡ２ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非自然発生の心筋細胞は、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＫＣＮＪ２、及びｐ５３のうちの１つ以上の発現増加を呈する。
いくつかの実施形態では、非自然発生の心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、減少した拍動速度を呈する。いくつかの実施形態では、非自然発生の心筋細胞は、－７０ｍＶ以下の静止膜電位、毎分４０拍未満の自発拍動速度、及び／または２００Ｖ／秒を超えるアップストローク速度を呈する。いくつかの実施形態では、非自然発生の心筋細胞は、電気的、収縮性、及び／または代謝的に成熟した心筋細胞である。
本書では、処置の方法であって、それを必要とする対象に、本書に記載される非自然発生の心筋細胞を含む組成物を投与することを含む、方法が開示される。また、本書では、処置の方法であって、それを必要とする対象に、本書に記載される１つ以上の非自然発生の心筋細胞の単離集団を使用して生産された医薬組成物を投与することを含む、方法も開示される。また、本書では、心臓の病態を処置するための薬品の製造における組成物の使用であって、処置が、それを必要とする対象への薬品の投与を含み、組成物が、本書に記載される非自然発生の心筋細胞を少なくとも１つ含む、使用も開示される。
いくつかの実施形態では、対象は、心室性不整脈、減少した収縮期心機能、慢性心不全、先天性心疾患、もしくは他の心疾患を有するか、またはその発症リスクを持つ。
また、本書では、未熟心筋細胞から成熟した心筋細胞を生産する方法も開示される。当該方法は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、Ｔｏｒｉｎ１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と未熟心筋細胞を接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞は三次元培養で生産される。いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞は二次元培養で生産される。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞をパルス処置によって少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させる。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞を連続処置によって少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させる。
本発明の実施には、特に断りのない限り、当業者が備えている技能の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えばＤＮＡ）技術、免疫学、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の従来技法が典型的に用いられる。これらの技法のうち特定のものの非限定的な説明は、次の公表文献に見出される：Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、すべてＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．、２００８年１２月版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｒｕｓｓｅｌｌ， ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ２００１、Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８８、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．， “Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ， ２００５。治療用薬剤及びヒト疾患に関する非限定的な情報は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １１ｔｈ Ｅｄ．， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， ２００５， Ｋａｔｚｕｎｇ， Ｂ． （ｅｄ．） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、第１０版（２００６年）または第１１版（２００９年７月）に見出される。遺伝子及び遺伝性障害に関する非限定的な情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｖ．Ａ．： Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ． Ａ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ： Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９８（第１２版）またはより最近のオンラインデータベース：Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ、ＯＭＩＭ（商標）、ＭｃＫｕｓｉｃｋ－Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、２０１０年５月１日付け、ワールドワイドウェブＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／、ならびに動物種（ヒト及びマウス以外）の遺伝子、遺伝性疾患、及び形質のデータベースであるＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ａｎｉｍａｌｓ（ＯＭＩＡ）（ｏｍｉａ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕ／ｃｏｎｔａｃｔ．ｓｈｔｍｌ）に見出される。本書で言及されるすべての特許、特許出願、及び他の公表文献（例えば科学論文、書籍、ウェブサイト、及びデータベース）は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書と組み込まれた参考文献のいずれかとの間に矛盾がある場合には、本明細書（組み込まれた参考文献に基づき得るその補正を含む）が優先するものとする。特に断りのない限り、本書では、当技術分野で受け入れられている標準的な用語の意味が使用される。本書では、様々な用語の標準的な略語が使用される。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の写しは、要請及び必要手数料の支払いに応じて当局によって提供される。
懸濁培養下で電気的に成熟したｉＰＳＣ－ＣＭを作出するための提唱の概略図を提供する。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、ＴＮＮＴ２＋ｉＰＳＣ－ＣＭのパーセンテージを増加させることを示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、ＴＮＮＴ２の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を増加させることを示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、ＴＮＮＩ３＋の割合（％）を増加させることを示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、ＴＮＮＩ３の平均蛍光強度を増加させることを示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、Ｋｉｒ２．１を発現するＴＮＮＴ２＋ｉＰＳＣ－ＣＭのパーセンテージを増加させることを示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、Ｋｉｒ２．１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を増加させることを示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、ｐ５３＋ＴＮＮＴ２＋ｉＰＳＣ－ＣＭの割合（％）を増加させることを示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、フローサイトメトリーによるＴＮＮＩ３及びｐ５３の平均蛍光強度を増加させることを示す。 ケルセチンが、Ｋｉｒ２．１を発現するＴＮＮＴ２＋ｉＰＳＣ－ＣＭの割合（％）を増加させることを示す。 ケルセチンが、Ｋｉｒ２．１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を増加させることを示す。 ケルセチンが、ｐ５３＋ＴＮＮＴ２＋ｉＰＳＣ－ＣＭの割合（％）を増加させることを示す。 ケルセチンが、フローサイトメトリーによるｐ５３のＭＦＩを増加させることを示す。 ケルセチンが、生細胞のパーセンテージを減少させるが、心筋細胞のパーセンテージを増加させることを示す。Ａは、生細胞のパーセンテージを示す。Ｂは、生細胞中のＴＮＮＴ２＋細胞のパーセンテージを示す。定量化はフローサイトメトリーによる。一元配置ＡＮＯＶＡにより＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ケルセチンが、ＰＰＡＲＧＣ１ａの発現を増加させることを示す。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａによるｐ５３の上方制御がＴＮＮＩ３発現を増進し、Ｔｏｒｉｎ１との相乗効果を有することを示す。心筋細胞成熟の提唱される機構を示す概略図を提供する。Ｔ３、トリヨードサイロニン。ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを示し、ｍＴＯＲは、ラパマイシン機構的標的を示し、ＴＮＮＴ２＋ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭは、心筋型トロポニンＴ２陽性のＢＪ線維芽細胞由来ＲＮＡ誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞を示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａによるｐ５３の上方制御がＴＮＮＩ３発現を増進し、Ｔｏｒｉｎ１との相乗効果を有することを示す。拍動発生から約２日後に開始して、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処置、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ（１０μｍｏｌ／Ｌ）での２４時間の処置、Ｔｏｒｉｎ１（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）での７日間の処置、またはＴｏｒｉｎ１（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）とｎｕｔｌｉｎ－３ａ（Ｔｏｒｉｎ１処置の最初の２４時間に１０μｍｏｌ／Ｌ）による７日間の同時処置を行った後の、Ｇ０期、Ｇ１期、またはＳ／Ｇ２／Ｍ期におけるＴＮＮＴ２＋ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭのパーセンテージを示す細胞周期分析を示す。各群ｎ＝３。２元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ多重比較検定により＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを示し、ｍＴＯＲは、ラパマイシン機構的標的を示し、ＴＮＮＴ２＋ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭは、心筋型トロポニンＴ２陽性のＢＪ線維芽細胞由来ＲＮＡ誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞を示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａによるｐ５３の上方制御がＴＮＮＩ３発現を増進し、Ｔｏｒｉｎ１との相乗効果を有することを示す。拍動発生から約２日後に開始して、コントロール（ＤＭＳＯ）、ｎｕｔｌｉｎ－３ａÅ約２４時間（１０μｍｏｌ／Ｌ）、Ｔｏｒｉｎ１Å約７日間（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）、またはＴｏｒｉｎ１Å約７日間（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）＋ｎｕｔｌｉｎ－３ａ（１０μｍｏｌ／Ｌ）で２４時間の処置を行ったＢＪＲｉＰＳ由来心筋細胞ライセートからの、ＭＤＭ２、ｐ５３、ＴＮＮＩ３、及びβ－チューブリンの代表的なウエスタンブロットを提供する（ｎｕｔｌｉｎ－３ａは、Ｔｏｒｉｎ１処置の最初の２４時間のみ投与した）。処置の最終日に採取された細胞、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを示し、ｍＴＯＲは、ラパマイシン機構的標的を示し、ＴＮＮＴ２＋ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭは、心筋型トロポニンＴ２陽性のＢＪ線維芽細胞由来ＲＮＡ誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞を示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａによるｐ５３の上方制御がＴＮＮＩ３発現を増進し、Ｔｏｒｉｎ１との相乗効果を有することを示す。ウエスタン分析によるｐ５３バンドのデンシトメトリーを示す。２元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ多重比較検定により＊＊Ｐ＜０．０１、条件ごとにｎ＝３。ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを示し、ｍＴＯＲは、ラパマイシン機構的標的を示し、ＴＮＮＴ２＋ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭは、心筋型トロポニンＴ２陽性のＢＪ線維芽細胞由来ＲＮＡ誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞を示す。 ｎｕｔｌｉｎ－３ａによるｐ５３の上方制御がＴＮＮＩ３発現を増進し、Ｔｏｒｉｎ１との相乗効果を有することを示す。ウエスタン分析によるＴＮＮＩ３バンドのデンシトメトリーを示す。２元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ多重比較検定により＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、条件ごとにｎ＝３、ＢＪＲＩＰＳ－ＣＭ。ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを示し、ｍＴＯＲは、ラパマイシン機構的標的を示し、ＴＮＮＴ２＋ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭは、心筋型トロポニンＴ２陽性のＢＪ線維芽細胞由来ＲＮＡ誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞を示す。 Ｔｏｒｉｎ１＋／－Ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、２Ｄ培養においてＴＮＮＴ２発現を増加させることを示す。これは、心筋細胞のミトコンドリアがより成熟していることを示唆する。ＦＡＣＳ Ｎ＝３／群、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓフローサイトメトリー、１元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定。 Ｔｏｒｉｎ１＋／－Ｎｕｔｌｉｎ－３ａが、２Ｄ培養においてミトコンドリア膜分極を増加させることを示す。これは、心筋細胞のミトコンドリアがより成熟していることを示唆する。ＦＡＣＳ Ｎ＝３／群、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓフローサイトメトリー、１元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定。 ２Ｄ培養におけるＮｕｔｌｉｎ－３ａ処置がスーパーオキシドシグナルの平均蛍光強度を増加させることを示す。活性酸素種は心筋細胞の成熟を制御し得る。ＦＡＣＳ、ｎ＝３／群。 Ｔｏｒｉｎ１＋Ｎｕｔｌｉｎ－３ａ処置が、３Ｄ懸濁培養で分化したｉＰＳＣ心筋細胞におけるＴＮＮＴ２純度（Ａ）及びＴＮＮＴ２発現（Ｂ）を増加させることを示す。心筋細胞分化の１０日目から開始して、３Ｄ懸濁培養下の細胞に、２４時間おきに１時間のパルス処置を２日間行った。フローサイトメトリーからのデータ、各群ｎ＝３。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来心筋細胞（ＣＭ）の細胞休止を増加させることを示す。特記なき限り、拍動発生から約２日後に開始して７日間のＴｏｒｉｎ１処置を行う、分化プロトコルの概略図を提供する。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＩＷＰ－４、Ｗｎｔ産生インヒビター４；ＲＩ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）インヒビター（Ｙ－２７６３２）；ＲＰＭＩ、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来心筋細胞（ＣＭ）の細胞休止を増加させることを示す。ベースライン、ならびにＴｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）によるｉＰＳＣ由来ＣＭ、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭの単回処置の３０分後、及び２、４、１０、２４、及び４８時間後の、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓ６及びｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔのウエスタン分析を提供する。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＩＷＰ－４、Ｗｎｔ産生インヒビター４；ＲＩ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）インヒビター（Ｙ－２７６３２）；ＲＰＭＩ、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来心筋細胞（ＣＭ）の細胞休止を増加させることを示す。分化中の１２ウェルプレートのウェル当たりの細胞数を示す。Ｔｏｒｉｎ１処置は、ＣＭ拍動発生のおよそ２日後である９日目に開始した。ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ、時点ごとに各群ｎ＝３。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＩＷＰ－４、Ｗｎｔ産生インヒビター４；ＲＩ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）インヒビター（Ｙ－２７６３２）；ＲＰＭＩ、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来心筋細胞（ＣＭ）の細胞休止を増加させることを示す。フローサイトメトリーによる生細胞集団中のＴＮＮＴ２＋ＣＭのパーセンテージを示す（Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭ、条件ごとにｎ＝３、一元配置ＡＮＯＶＡによるｎ．ｓ．）。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＩＷＰ－４、Ｗｎｔ産生インヒビター４；ＲＩ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）インヒビター（Ｙ－２７６３２）；ＲＰＭＩ、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来心筋細胞（ＣＭ）の細胞休止を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間、Ｔｏｒｉｎ１（１０ｎＭ、５０ｎＭ、もしくは２００ｎＭ）またはビヒクルコントロール（０．０２％ＤＭＳＯ）で処置した後のｉＰＳＣ由来心筋細胞における、選択された休止マーカー（ＴＰ５３、ＲＢ１、ＲＢＬ２（ｐ１３０）、ＣＤＫＮ１ａ（ｐ２１）、ＣＤＫＮ１ｂ（ｐ２７）、ＣＤＫＮ２ａ（ｐ１６）及びＨＥＳ１）ならびに増殖マーカー（ＭＫＩ６７、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＣ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ３、及びＥ２Ｆ１）のｑＰＣＲを示す。条件ごとにｎ＝３、各遺伝子についてコントロールと比較するためのＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ法を用いた多重ｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＩＷＰ－４、Ｗｎｔ産生インヒビター４；ＲＩ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）インヒビター（Ｙ－２７６３２）；ＲＰＭＩ、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来心筋細胞（ＣＭ）の細胞休止を増加させることを示す。コントロール、１０ｎＭ Ｔｏｒｉｎ１処置細胞、または２００ｎＭ Ｔｏｒｉｎ１処置細胞、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭにおけるＧ０期、Ｇ１期、及びＳ／Ｇ２／Ｍ期を区別するためにＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２及びＰｙｒｏｎｉｎ Ｙで染色されたｉＰＳＣ由来ＣＭの代表的なフローサイトメトリープロットを提供する。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＩＷＰ－４、Ｗｎｔ産生インヒビター４；ＲＩ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）インヒビター（Ｙ－２７６３２）；ＲＰＭＩ、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来心筋細胞（ＣＭ）の細胞休止を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して１週間にわたるＴｏｒｉｎ１処置（２００ｎＭ）後のＧ０期、Ｇ１期またはＳ／Ｇ２／Ｍ期におけるＴＮＮＴ２＋心筋細胞のパーセンテージを示す。条件ごとにｎ＝３、二元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定により＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＩＷＰ－４、Ｗｎｔ産生インヒビター４；ＲＩ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）インヒビター（Ｙ－２７６３２）；ＲＰＭＩ、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来心筋細胞（ＣＭ）の細胞休止を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して１週間にわたる０．０２％ＤＭＳＯ処置に続いて１０％ＦＢＳまたは無血清コントロールを与えた後のコントロールＣＭにおける、Ｇ０期、Ｇ１期またはＳ／Ｇ２／Ｍ期におけるＴＮＮＴ２＋ＣＭのパーセンテージを示す。各群ｎ＝３、二元配置ＡＮＯＶＡとＳｉｄａｋの多重比較検定により＊＊ｐ＜０．０１、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳＣ－ＣＭ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＩＷＰ－４、Ｗｎｔ産生インヒビター４；ＲＩ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）インヒビター（Ｙ－２７６３２）；ＲＰＭＩ、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来心筋細胞（ＣＭ）の細胞休止を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して１週間にわたるＴｏｒｉｎ１処置（２００ｎＭ）に続いて１０％ＦＢＳまたは無血清コントロールを与えた後の、Ｇ０期、Ｇ１期またはＳ／Ｇ２／Ｍ期におけるＴＮＮＴ２＋ＣＭのパーセンテージを示す。各群ｎ＝３、二元配置ＡＮＯＶＡとＳｉｄａｋの多重比較検定により＊＊ｐ＜０．０１、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳＣ－ＣＭ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＩＷＰ－４、Ｗｎｔ産生インヒビター４；ＲＩ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）インヒビター（Ｙ－２７６３２）；ＲＰＭＩ、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、サルコメア遺伝子の発現を増加させ、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮性を増進することを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間、Ｔｏｒｉｎ１（１０ｎＭ、５０ｎＭ、もしくは２００ｎＭ）またはビヒクルコントロール（０．０２％ＤＭＳＯ）で処置した後のｉＰＳＣ由来心筋細胞における、選択されたサルコメア遺伝子（ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３）のｑＰＣＲを提供する。条件ごとにｎ＝３、二元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、サルコメア遺伝子の発現を増加させ、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮性を増進することを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間のＴｏｒｉｎ１処置後のＴＮＮＴ２及びＴＮＮＩ３の代表的なウエスタンブロット分析を提供する。β－チューブリンはローディングコントロールとして示されている。Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、サルコメア遺伝子の発現を増加させ、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮性を増進することを示す。ＴＮＮＴ２＋細胞のＴＮＮＴ２－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の平均蛍光強度を示す。条件ごとにｎ＝３、一元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定により＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、サルコメア遺伝子の発現を増加させ、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮性を増進することを示す。拡張期及び収縮期のＭＴＦの概略的な側面図と共に、拡張期及び収縮期のＭＴＦの代表的な画像を提供する。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、サルコメア遺伝子の発現を増加させ、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮性を増進することを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間Ｔｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）またはビヒクルで処置したｉＰＳＣ由来心筋細胞、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭを播種した筋薄膜（ＭＴＦ）の代表的な力対時間プロットを提供する。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、サルコメア遺伝子の発現を増加させ、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮性を増進することを示す。筋薄膜を使用して定量化された相対最大収縮力を示す（コントロールに対して正規化されている）。各群ｎ＝８～９、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ（２バッチ）及びＧｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭ（１バッチ）の３バッチを組み合わせたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊＊ｐ＜０．０１。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、サルコメア遺伝子の発現を増加させ、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮性を増進することを示す。Ｔｏｒｉｎ１（２００ｎＭ×７日）での処置ありまたはなしの心筋細胞を示す代表的な免疫染色画像を提供する。青＝ＤＡＰＩ、緑＝α－アクチニン、黄＝Ｆ－アクチン、マゼンタ＝ＴＮＮＴ２、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ、スケールバー＝１０μｍ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、サルコメア遺伝子の発現を増加させ、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮性を増進することを示す。コントロール（ｎ＝１３細胞）及びＴｏｒｉｎ１処置ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ（ｎ＝１７細胞）のサルコメア長を示し、ｎ．ｓは対応のないｔ検定による。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、サルコメア遺伝子の発現を増加させ、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮性を増進することを示す。ＤＭＳＯ×７日間（コントロール）、ＤＭＳＯ×７日間に続いて１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）×２日間、Ｔｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）×７日間、またはＴｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）×７日間に続いて１０％ＦＢＳ×２日間の処置後のＴＮＮＴ２＋細胞のＴＮＮＴ２－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の平均蛍光強度を示す。条件ごとにｎ＝３、一元配置ＡＮＯＶＡとＳｉｄａｋの多重比較検定により＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０００１、ＵＣＳＤ－ＣＭ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 Ｔｏｒｉｎ１が、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の酸素消費速度及びミトコンドリア分極を増加させることを示す。Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔによって評価された、ベースラインに対して正規化された平均酸素消費速度の時間に応じたプロファイルを提供する。白丸＝コントロール（ｎ＝７０ウェル）、黒四角＝Ｔｏｒｉｎ１（６９ウェル、２００ｎＭ×７日；アッセイ前に２４～４８時間にわたってＳｅａｈｏｒｓｅプレートに再プレーティングされたＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ）、２つの独立した実験からのデータを組み合わせたもの。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＦＣＣＰ、２－［２－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ヒドラジニリデン］－プロパンジニトリル。 Ｔｏｒｉｎ１が、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の酸素消費速度及びミトコンドリア分極を増加させることを示す。最大ＯＣＲ、呼吸予備力、及び非ミトコンドリアＯＣＲに対する、コントロール（白バー、ｎ＝７０ウェル）対黒バー（白バー、ｎ＝６９ウェル）のベースラインに対して正規化された酸素消費速度を示す。二元配置ＡＮＯＶＡとＳｉｄａｋの多重比較検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＦＣＣＰ、２－［２－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ヒドラジニリデン］－プロパンジニトリル。 Ｔｏｒｉｎ１が、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の酸素消費速度及びミトコンドリア分極を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間、Ｔｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）またはビヒクルコントロール（０．０２％ＤＭＳＯ）で処置した後のＢＪＲｉＰＳ－ＣＭの、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭの平均蛍光強度を示す。対応のないｔ検定により＊ｐ＜０．０５、各群ｎ＝３、ＢＪＲｉＰＳ細胞株。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＦＣＣＰ、２－［２－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ヒドラジニリデン］－プロパンジニトリル。 Ｔｏｒｉｎ１が、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の酸素消費速度及びミトコンドリア分極を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間、Ｔｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）またはビヒクルコントロール（０．０２％ＤＭＳＯ）で処置した後のＢＪＲｉＰＳ－ＣＭの、ミトコンドリア（ＮＤ１）対核（Ｂ２Ｍ）ＤＮＡ比を示す。対応のないｔ検定により＊ｐ＜０．０５、各群ｎ＝３、ＢＪＲｉＰＳ細胞株。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＦＣＣＰ、２－［２－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ヒドラジニリデン］－プロパンジニトリル。 Ｔｏｒｉｎ１が、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の酸素消費速度及びミトコンドリア分極を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間、Ｔｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）またはビヒクルコントロール（０．０２％ＤＭＳＯ）で処置した後のＢＪＲｉＰＳ－ＣＭにおける、赤色蛍光と緑色蛍光のＭｉｔｏＰｒｏｂｅ ＪＣ－１相対比を示しており、アッセイはＴｏｒｉｎ１処置の最終日に実行した。各群ｎ＝６、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊＊ｐ＜０．０１。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＦＣＣＰ、２－［２－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ヒドラジニリデン］－プロパンジニトリル。 Ｔｏｒｉｎ１が、ｉＰＳＣ由来心筋細胞の酸素消費速度及びミトコンドリア分極を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間、Ｔｏｒｉｎ１（１０ｎＭ、５０ｎＭ、もしくは２００ｎＭ）またはビヒクルコントロール（０．０２％ＤＭＳＯ）で処置した後のＢＪＲｉＰＳ－ＣＭの、選択された脂肪酸代謝関連遺伝子（ＰＰＡＲＧＣ１ａ（ＰＧＣ１α）、ＣＤ３６、ＳＬＣ２７Ａ１（ＦＡＴＰ１）、ＳＬＣ２７Ａ６（ＦＡＴＰ６）、及びＬＰＩＮ１）またはグルコース代謝関連遺伝子（ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＰＦＫ、及びＰＹＧＭ）のｑＰＣＲを提供する。二元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、各群ｎ＝３。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＦＣＣＰ、２－［２－［４－（トリフルオロメトキシ）フェニル］ヒドラジニリデン］－プロパンジニトリル。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間、Ｔｏｒｉｎ１（１０ｎＭもしくは２００ｎＭ）またはビヒクルコントロール（０．０２％ＤＭＳＯ）で処置した後のｉＰＳＣ由来心筋細胞の、選択されたイオンチャネル（ＫＣＮＪ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、ＲＹ２、ＡＴＰ２ａ２、ＳＣＮ５ａ、ＨＣＮ４）のｑＰＣＲを提供する。各群ｎ＝３、二元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ＢＪＲｉＰＳ株。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間のＴｏｒｉｎ１処置後のＫｉｒ２．１（ＫＣＮＪ２によってコードされる）の平均蛍光強度のフローサイトメトリー分析を提供する。各群ｎ＝３、対応のないｔ検定により＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ株。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。Ｔｏｒｉｎ１処置ありまたはなしの心筋細胞の自発拍動速度を示す。条件ごとにｎ＝６～１０ウェル、一元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。ＣｙｔｅＳｅｅｒソフトウェアによって自動的に行われた細胞セグメンテーションを示す代表的画像を提供する。青＝Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、緑＝ＦｌｕｏＶｏｌｔ。Ｆｌｕｏｖｏｌｔデータについては、コントロールｎ＝５３１細胞、Ｔｏｒｉｎ１ ｎ＝３１５細胞、対応のないｔ検定による分析。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。Ｔｏｒｉｎ１処置心筋細胞がコントロールと比較してより延長されたプラトー期を有することを表す代表的な活動電位プロファイルを示す。ＣＴＤ２５（カルシウム過渡の２５％の期間、または最大振幅から２５％低下する期間）、ＣＴＤ７５（カルシウム過渡の７５％の期間、または最大振幅から７５％低下する期間）、Ｔ７５－２５（電圧が最大の７５％から２５％まで減衰するのにかかる時間）。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。ピーク立ち上がり時間（ミリ秒）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＵＣＳＤ－ＣＭを示す。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。ダウンストローク速度（ミリ秒）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＵＣＳＤ－ＣＭを示す。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。ＣＴＤ２５時間（ミリ秒）、ｎ．ｓ．、ＵＣＳＤ－ＣＭを示す。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。ＣＴＤ７５時間（ミリ秒）、＊ｐ＜０．０５、ＵＣＳＤ－ＣＭを示す。 Ｔｏｒｉｎ１処置が、選択されたイオンチャネルの発現を増加させ、活動電位プロファイルのピーク立ち上がり時間及びダウンストローク速度を増加させることを示す。Ｔ７５－２５時間（ミリ秒）、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＵＣＳＤ－ＣＭを示す。 Ｔｏｒｉｎ１がｐ５３発現を増加させ、効果がピフィスリン－αによって阻害されることを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間、０（ＤＭＳＯ）、１０、５０、または２００ｎＭのＴｏｒｉｎ１で処置された、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭライセートからのｐ５３、ｐｈｏｓｐｈｏ－５３、ｐ２１（ＣＤＫＮ１ａ）、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２．５、及びβ－チューブリンの代表的なウエスタンブロットを提供する。細胞は処置の最終日に採取した。 Ｔｏｒｉｎ１がｐ５３発現を増加させ、効果がピフィスリン－αによって阻害されることを示す。拍動発生から約２日後に開始して、ビヒクル（ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド）処置、ピフィスリン－α（１０μＭ）での１週間の処置、Ｔｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）での７日間の処置、またはピフィスリン－α（１０μＭ）及びＴｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）による７日間の同時処置を行った後の、Ｇ０、Ｇ１期またはＳ／Ｇ２／Ｍ期におけるＴＮＮＴ２＋ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭのパーセンテージを示す細胞周期分析を提供する。各群ｎ＝３、二元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 Ｔｏｒｉｎ１がｐ５３発現を増加させ、効果がピフィスリン－αによって阻害されることを示す。拍動発生から約２日後に開始して７日間、コントロール（ＤＭＳＯ）、Ｔｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）、ピフィスリン－α（１０μＭ）、またはＴｏｒｉｎ１（２００ｎＭ）＋ピフィスリン－α（１０μＭ）で処置された、ＢＪＲｉＰＳ由来心筋細胞ライセートからのｐ５３、ＴＮＮＩ３、ｐ２１、及びβ－チューブリンの代表的なウエスタンブロットを提供する。細胞は処置の最終日に採取した。 Ｔｏｒｉｎ１がｐ５３発現を増加させ、効果がピフィスリン－αによって阻害されることを示す。ウエスタン分析によるＴＮＮＩ３バンドのデンシトメトリーを示す。各群ｎ＝３、二元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定により＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。 Ｔｏｒｉｎ１ありまたはなしで処置された後に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ありまたはなしで処置された細胞、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭを比較する、ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ ＰａｎｅｌからのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析を示す。細胞周期経路遺伝子の教師なし階層的クラスタリングを示す。ＱＣ、クオリティコントロール。 Ｔｏｒｉｎ１ありまたはなしで処置された後に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ありまたはなしで処置された細胞、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭを比較する、ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ ＰａｎｅｌからのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析を示す。タンパク質代謝経路遺伝子の教師なし階層的クラスタリングを示す。ＱＣ、クオリティコントロール。 Ｔｏｒｉｎ１ありまたはなしで処置された後に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ありまたはなしで処置された細胞、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭを比較する、ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ ＰａｎｅｌからのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析を示す。細胞周期経路遺伝子の差次的遺伝子発現分析（コントロール＋ＦＢＳ対コントロール）を示すボルケーノプロットを提供する。 Ｔｏｒｉｎ１ありまたはなしで処置された後に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ありまたはなしで処置された細胞、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭを比較する、ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ ＰａｎｅｌからのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析を示す。細胞周期経路遺伝子の差次的遺伝子発現分析（コントロール対Ｔｏｒｉｎ１）を示すボルケーノプロットを提供する。 Ｔｏｒｉｎ１ありまたはなしで処置された後に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ありまたはなしで処置された細胞、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭを比較する、ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ ＰａｎｅｌからのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析を示す。細胞周期経路遺伝子の差次的遺伝子発現分析（Ｔｏｒｉｎ１＋ＦＢＳ対Ｔｏｒｉｎ１）を示すボルケーノプロットを提供する。 Ｔｏｒｉｎ１ありまたはなしで処置された後に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ありまたはなしで処置された細胞、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭを比較する、ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ ＰａｎｅｌからのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析を示す。タンパク質代謝経路遺伝子の差次的遺伝子発現分析（コントロール＋ＦＢＳ対コントロール）を示すボルケーノプロットを提供する。 Ｔｏｒｉｎ１ありまたはなしで処置された後に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ありまたはなしで処置された細胞、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭを比較する、ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ ＰａｎｅｌからのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析を示す。タンパク質代謝経路遺伝子の差次的遺伝子発現分析（コントロール対Ｔｏｒｉｎ１）を示すボルケーノプロットを提供する。 Ｔｏｒｉｎ１ありまたはなしで処置された後に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ありまたはなしで処置された細胞、Ｇｉｂｃｏ ｉＰＳ－ＣＭを比較する、ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｗａｙｓ ＰａｎｅｌからのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析を示す。タンパク質代謝経路遺伝子の差次的遺伝子発現分析（Ｔｏｒｉｎ１＋ＦＢＳ対Ｔｏｒｉｎ１）を示すボルケーノプロットを提供する。 非解離細胞における増殖の評価を提供する。心筋細胞を１２ウェルプレートで分化させた後、元のプレートで固定及び染色して、解離しても生存する細胞の選択の可能性を最小限に抑えた。Ｋｉ６７／ＴＮＮＴ２／ＤＡＰＩまたはｐｈｏｓｐｈｏ－Ｈ３／ＴＮＮＴ２／ＤＡＰＩで染色された細胞の代表的な画像を提供する。スケールバー＝１００μｍ。青＝ＤＡＰＩ、黄＝Ｋｉ６７、緑＝ｐＨ３、マゼンタ＝ＴＮＮＴ２。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド。 非解離細胞における増殖の評価を提供する。心筋細胞を１２ウェルプレートで分化させた後、元のプレートで固定及び染色して、解離しても生存する細胞の選択の可能性を最小限に抑えた。コントロール（ｎ＝１０８８細胞）対Ｔｏｒｉｎ１処置細胞（ｎ＝８３７細胞）におけるＫｉ６７＋またはＫｉ６７－である総ＤＡＰＩ／ＴＮＮＴ＋心筋細胞のパーセンテージを表す円グラフを提供する。カイ二乗分析により＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド。 非解離細胞における増殖の評価を提供する。心筋細胞を１２ウェルプレートで分化させた後、元のプレートで固定及び染色して、解離しても生存する細胞の選択の可能性を最小限に抑えた。コントロール（ｎ＝９６２細胞）対Ｔｏｒｉｎ１処置細胞（ｎ＝７７９細胞）におけるｐＨ３＋またはｐＨ３－である総ＤＡＰＩ／ＴＮＮＴ＋心筋細胞のパーセンテージを表す円グラフを提供する。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド。 市販のヒト胎児及び成人の心臓ＲＮＡのベンチマークサンプルと比較した、選択された遺伝子（ＴＮＮＴ２）のｑＰＣＲ分析を提供する。各群Ｎ＝６～１２で、２～４つの独立した実験からのデータを組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。垂直線は、生物学的複製物の欠如により、胎児及び成人の心臓ＲＮＡが統計分析に含まれなかったことを示す（両方とも、商業的ベンダーから購入した単一チューブからのものであった）。生物学的複製物の欠如のため、胎児及び成人の心臓ＲＮＡについてエラーバーは示されていない。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 市販のヒト胎児及び成人の心臓ＲＮＡのベンチマークサンプルと比較した、選択された遺伝子（ＴＮＮＩ３）のｑＰＣＲ分析を提供する。各群Ｎ＝６～１２で、２～４つの独立した実験からのデータを組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。垂直線は、生物学的複製物の欠如により、胎児及び成人の心臓ＲＮＡが統計分析に含まれなかったことを示す（両方とも、商業的ベンダーから購入した単一チューブからのものであった）。生物学的複製物の欠如のため、胎児及び成人の心臓ＲＮＡについてエラーバーは示されていない。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 市販のヒト胎児及び成人の心臓ＲＮＡのベンチマークサンプルと比較した、選択された遺伝子（ＰＰＡＲＧＣ１ａ）のｑＰＣＲ分析を提供する。各群Ｎ＝６～１２で、２～４つの独立した実験からのデータを組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。垂直線は、生物学的複製物の欠如により、胎児及び成人の心臓ＲＮＡが統計分析に含まれなかったことを示す（両方とも、商業的ベンダーから購入した単一チューブからのものであった）。生物学的複製物の欠如のため、胎児及び成人の心臓ＲＮＡについてエラーバーは示されていない。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 市販のヒト胎児及び成人の心臓ＲＮＡのベンチマークサンプルと比較した、選択された遺伝子（ＲＹＲ２）のｑＰＣＲ分析を提供する。各群Ｎ＝６～１２で、２～４つの独立した実験からのデータを組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。垂直線は、生物学的複製物の欠如により、胎児及び成人の心臓ＲＮＡが統計分析に含まれなかったことを示す（両方とも、商業的ベンダーから購入した単一チューブからのものであった）。生物学的複製物の欠如のため、胎児及び成人の心臓ＲＮＡについてエラーバーは示されていない。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 市販のヒト胎児及び成人の心臓ＲＮＡのベンチマークサンプルと比較した、選択された遺伝子（ＫＣＮＪ２）のｑＰＣＲ分析を提供する。各群Ｎ＝６～１２で、２～４つの独立した実験からのデータを組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。垂直線は、生物学的複製物の欠如により、胎児及び成人の心臓ＲＮＡが統計分析に含まれなかったことを示す（両方とも、商業的ベンダーから購入した単一チューブからのものであった）。生物学的複製物の欠如のため、胎児及び成人の心臓ＲＮＡについてエラーバーは示されていない。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 市販のヒト胎児及び成人の心臓ＲＮＡのベンチマークサンプルと比較した、選択された遺伝子（ＣＡＣＮＡ１ｃ）のｑＰＣＲ分析を提供する。各群Ｎ＝６～１２で、２～４つの独立した実験からのデータを組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。垂直線は、生物学的複製物の欠如により、胎児及び成人の心臓ＲＮＡが統計分析に含まれなかったことを示す（両方とも、商業的ベンダーから購入した単一チューブからのものであった）。生物学的複製物の欠如のため、胎児及び成人の心臓ＲＮＡについてエラーバーは示されていない。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 市販のヒト胎児及び成人の心臓ＲＮＡのベンチマークサンプルと比較した、選択された遺伝子（ＴＰ５３）のｑＰＣＲ分析を提供する。各群Ｎ＝６～１２で、２～４つの独立した実験からのデータを組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。垂直線は、生物学的複製物の欠如により、胎児及び成人の心臓ＲＮＡが統計分析に含まれなかったことを示す（両方とも、商業的ベンダーから購入した単一チューブからのものであった）。生物学的複製物の欠如のため、胎児及び成人の心臓ＲＮＡについてエラーバーは示されていない。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 市販のヒト胎児及び成人の心臓ＲＮＡのベンチマークサンプルと比較した、選択された遺伝子（ＣＤＫＮ１ａ（ｐ２１））のｑＰＣＲ分析を提供する。各群Ｎ＝６～１２で、２～４つの独立した実験からのデータを組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。垂直線は、生物学的複製物の欠如により、胎児及び成人の心臓ＲＮＡが統計分析に含まれなかったことを示す（両方とも、商業的ベンダーから購入した単一チューブからのものであった）。生物学的複製物の欠如のため、胎児及び成人の心臓ＲＮＡについてエラーバーは示されていない。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 市販のヒト胎児及び成人の心臓ＲＮＡのベンチマークサンプルと比較した、選択された遺伝子（ＧＡＴＡ４）のｑＰＣＲ分析を提供する。各群Ｎ＝６～１２で、２～４つの独立した実験からのデータを組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＢＪＲｉＰＳ－ＣＭ。垂直線は、生物学的複製物の欠如により、胎児及び成人の心臓ＲＮＡが統計分析に含まれなかったことを示す（両方とも、商業的ベンダーから購入した単一チューブからのものであった）。生物学的複製物の欠如のため、胎児及び成人の心臓ＲＮＡについてエラーバーは示されていない。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質。 異なる期間のＴｏｒｉｎ１処置の評価を提供する。分化８～１１日目、８～１５日目、９～１１日目、９～１６日目、１１～１４日目、または１１～１８日目の、コントロール（ＤＭＳＯビヒクル）または２００ｎＭのＴｏｒｉｎ１で処置した後のＴＮＮＴ２－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の平均蛍光強度を示す。各群ｎ＝３、コントロールと比較するための一元配置ＡＮＯＶＡとＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定により＊ｐ＜０．０５。 異なる期間のＴｏｒｉｎ１処置の評価を提供する。分化８～１１日目、８～１５日目、９～１１日目、９～１６日目、１１～１４日目、または１１～１８日目の、コントロール（ＤＭＳＯビヒクル）または２００ｎＭのＴｏｒｉｎ１で処置した後のＫｉｒ２．１（細胞外）の平均蛍光強度を示す。各群ｎ＝３、コントロールと比較するための一元配置ＡＮＯＶＡとＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から心筋細胞を生産する現行の分化プロトコルは、心筋トロポニンＴの発現によって判定して高純度の心筋細胞集団を生成することが可能である。しかし、これらの心筋細胞は未熟なままであり、胎児の状態によりよく類似し、成体心筋細胞と比較して最大収縮力が低く、アップストローク速度が遅く、ミトコンドリア機能が未熟である。ｉＰＳＣ由来心筋細胞の未熟さは、心疾患のための心筋細胞細胞療法の臨床応用に対する大きな障壁となり得る。発達中、心筋細胞は、胎児の増殖状態から、出生後により成熟しているが休止している状態への移行を起こす。ラパマイシン機構的標的（ｍＴＯＲ）シグナル伝達経路は、栄養素の感知及び成長において重要な役割を果たす。
Ｗｎｔ経路を調節する小分子を使用して、ｉＰＳＣ株から心筋細胞を分化させた。いくつかの実施形態では、ｐ５３の上方制御因子を様々な時点で使用し、成熟したｉＰＳＣ由来心筋細胞の収縮的特性、代謝的特性、及び電気生理学的特性を定量化した。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ経路のインヒビターを様々な時点で使用した。いくつかの実施形態では、ｐ５３シグナル伝達を阻害するために、小分子インヒビターを使用した。いくつかの実施形態では、二次元または三次元の培養培地で心筋細胞を分化及び／または成熟させる。
本開示の諸態様は、少なくとも１つの幹細胞から心筋細胞（本書では、非自然発生の心筋細胞、非天然心筋細胞、休止心筋細胞、または成熟した心筋細胞という）を生成するための組成物、方法、キット、及び薬剤、ならびに、細胞療法、アッセイ、及び様々な処置方法で使用するための、これらの組成物、方法、キット、及び薬剤によって生産された成熟心筋細胞または休止心筋細胞に関する。
本書に記載される方法に従って生成される、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生産された心筋細胞は、多くの利点を示す。例えば、それらは電気的に成熟しており（例えば、減少した自動性を呈する）、収縮性が成熟しており、代謝的に成熟している。さらに、生成される心筋細胞は、細胞療法（例えば、追加の及び／または機能的な心筋細胞を必要とする対象への移植）及び研究のための新しいプラットフォームを提供し得る。
定義
便宜上、本書の明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語をここに収載する。別途定義されない限り、本書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本書で使用される場合、「体細胞」という用語は、生殖系列細胞とは異なり、生物の体を形成するあらゆる細胞を指す。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても知られている）は、受精中に融合して接合体と呼ばれる細胞を作る***及び卵子であり、そこから哺乳動物の胚全体が発生する。***及び卵子、それらを作る細胞（生殖母体）、ならびに未分化幹細胞を除く、哺乳動物の体内の他のすべての細胞型は体細胞型であり、内臓、皮膚、骨、血液、及び結合組織はすべて、体細胞で構成されている。いくつかの実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは、胚に存在しないか、または胚から得られず、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。いくつかの実施形態では、体細胞は「成体体細胞」であり、これは、胚もしくは胎児以外の生物に存在するか、もしくは当該生物から得られる細胞、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する。
本書で使用される場合、「成体細胞」という用語は、胚発生後に全身に見られる細胞を指す。
「始原細胞」または「前駆細胞」という用語は、本書では互換的に使用され、分化によって生じ得る細胞と比べてより原始的な細胞表現型を有する（すなわち、完全に分化した細胞よりも発生経路または進行に沿った初期の段階にある）細胞を指す。始原細胞は、著しい、または非常に高い増殖能も有することが多い。始原細胞は、発生経路に応じて、また細胞が発達し分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞型を生じることもあれば、単一の分化細胞型を生じることもある。
「表現型」という用語は、実際の遺伝子型に関係なく、特定のセットの環境条件及び因子の下で細胞または生物を定義する、１つまたは複数の総合的な生物学的特徴を指す。
本書で使用される「多能性」という用語は、２つ以上の分化細胞型に分化する能力、好ましくは３つすべての生殖細胞層に特徴的な細胞型に分化する能力を持つ細胞を指す。多能性細胞は主に、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して、２つ以上の細胞型、好ましくは３つすべての胚葉に分化する能力によって特性解析される。多能性は胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても証明されるが、好ましい多能性検査は、３つの胚葉の各々の細胞に分化する能力の実証試験である。このような細胞を単に培養すること自体が、それらを多能性にするわけではないことに留意されたい。また、再プログラムされた多能性細胞（例えば、本書における用語の定義のとおりのｉＰＳ細胞）は、培養下では概して限られた回数の***しかできない初代細胞の親に比べて、成長能を損失することなく継代を延長できるという特徴を有する。
本書で使用される場合、「ｉＰＳ細胞」及び「人工多能性幹細胞」という用語は互換的に使用され、例えば、１つ以上の遺伝子の強制発現を誘導することにより、非多能性細胞から、典型的には成体体細胞から、人工的に導出された（例えば、誘導された、または完全な逆転による）、多能性幹細胞を指す。
本書で使用される「幹細胞」という用語は、増殖して、多数の母細胞を生成する能力を有する始原細胞をさらに生じさせることが可能である未分化細胞を指し、母細胞は、分化した、または分化可能な娘細胞を生じさせることができる。娘細胞自体を誘導して増殖させ、後に１つ以上の成熟細胞型へと分化する後代を生産すると共に、親の発生能を持つ１つ以上の細胞を保持することもできる。「幹細胞」という用語は、特定の状況下で、より特殊化または分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、特定の状況下で、実質的に分化することなく増殖する能力を保持する、始原細胞のサブセットを指す。一実施形態では、幹細胞という用語は、自然発生の母細胞であって、その子孫（後代）が、分化によって、例えば、胚細胞及び組織の進行的多様化で生じるように、完全に個別の特徴を獲得することによって、しばしば異なる方向に特殊化する、母細胞を広く指す。細胞分化は、典型的には多くの細胞***を通じて生じる複雑なプロセスである。分化細胞は、自らが多分化能性細胞などに由来する多分化能性細胞に由来し得る。これらの多分化能性細胞の各々を幹細胞とみなすことができるが、各々が生じさせ得る細胞型の範囲は大きく異なり得る。一部の分化細胞は、より大きな発生能を持つ細胞を生じさせる能力も有する。このような能力は天然の場合もあれば、様々な因子での処置によって人工的に誘導される場合もある。多くの生物学的事例において、幹細胞は、２つ以上の異なる細胞型の後代を生産し得ることから「多分化能性」でもあるが、このことは「幹細胞性」の要件ではない。自己再生は、幹細胞の定義における他の古典的部分であり、本文書で使用されるように不可欠である。理論上、自己再生は、２つの主要な機構のいずれかによって生じ得る。幹細胞は非対称的に***して、一方の娘が幹細胞状態を保持し、他方の娘が何らかの異なる他の特異的機能及び表現型を発現することがある。あるいは、集団中の幹細胞の一部が２つの幹細胞へと対称的に***することで、集団中の一部の幹細胞が全体として維持される一方で、集団中の他の細胞は分化した後代のみを生じさせることがある。形式的には、幹細胞として始まった細胞は、分化した表現型に向かって進み得るが、その後「逆転」して幹細胞表現型を再発現する可能性があり、これは当業者がしばしば「脱分化」または「再プログラム」または「逆分化」という用語である。本書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胎盤幹細胞などを含む。
本書で使用される場合、「休止」または「細胞休止」とは、栄養素の欠乏によって引き起こされ、適切な刺激に応答して細胞周期に再び入る能力を特徴とする細胞の静止状態を指すために使用される。休止細胞は、代謝活性及び転写活性を保持する。細胞は、Ｇ０、深いＧ０、及び、細胞周期への復帰を引き起こす刺激に対する細胞の応答性が高い、より浅い休止状態であるＧａｌｅｒｔ状態への移行期間を含め、様々な深さの休止状態を有し得る。休止心筋細胞は、ｐ１６及びｐ１３０を含む１つ以上の休止マーカーの発現を呈し得る。
「内因性心筋細胞」または「内因性の成熟した心筋細胞」という用語は、本書では、成熟した心筋細胞を指すために使用される。成熟した心筋細胞は、電気的成熟、収縮性成熟、及び／または代謝的成熟を呈し得る。心筋細胞の表現型は、当業者にはよく知られており、例えば、自発的に拍動する能力、心筋トロポニン、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ミオシン重鎖、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、リアノジン受容体（ＲｙＲ）、ナトリウムチャネルタンパク質ＳＣＮ５ａ、カリウム電位依存性チャネルＫＣＮＪ２、ＡＴＰ２Ａ２、ＰＰＡＲＧＣ１ａ、Ｃｘ４３などのマーカーの発現に加え、サルコメアが組織化されていること、桿状細胞を有すること、及びＴ細管を有することなど、独特の形態学的特徴を含む。
本書で使用される場合、「心筋細胞」、「非自然発生の心筋細胞」、「非天然心筋細胞」、「休止心筋細胞」、及び「成熟した心筋細胞」はすべて、本書で開示される方法によって生産される心筋細胞を指す。心筋細胞は、心室型、心房型、及び／または結節型の心筋細胞、あるいは心筋細胞の混合集団であり得る。心筋細胞は、自発的に拍動する能力、電気的に成熟していること、代謝的に成熟していること、収縮性が成熟していること、１つ以上の遺伝子マーカー（例えばＴＮＮＩ３、ＴＮＮＴ１、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＫＣＮＪ２、ＲｙＲ、及びＲＥＳＴ）の適切な発現を呈すること、１つ以上の休止マーカー（例えばｐ１６及びｐ１３０）の適切な発現を呈すること、適切な形態学的特徴（例えば桿状細胞及び組織化されたサルコメア）を呈すること、及び培養下の増大可能性を含むがこれらに限定されない、内因性心筋細胞と共通し得る１つ以上の特徴を呈し得る。しかし、非自然発生の心筋細胞は、遺伝子発現に基づく差異を含め、本書に記載されるような内因性心筋細胞と同一ではなく、内因性心筋細胞から区別可能である。
「心筋細胞マーカー」という用語は、限定されるものではないが、内因性心筋細胞において特異的に発現または存在する、タンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質及び核酸の多型、スプライスバリアント、タンパク質または核酸の断片、エレメント、ならびに他の分析物を指す。例示的な心筋細胞マーカーは、心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）、心筋トロポニンＩ（ＴＮＮＩ３）、カリウムチャネルＫＣＮＪ２、リプレッサーエレメント１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、リアノジン受容体（ＲｙＲ）、ナトリウムチャネル（ＳＣＮ５ａ）、及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２０１４；１１４（３）：５１１－２３に記載されているものを含むが、これらに限定されない。
本書で使用される「未熟心筋細胞」という用語は、未熟である（例えば電気的、代謝的、及び／または収縮性）心筋細胞を意味する。未熟心筋細胞は、自動性またはペースメーカー様の活動を示し、高い静止膜電位及び遅いアップストローク速度を有し、さほど組織化されていないサルコメア構造、及び低い最大収縮力を有し、Ｔ細管を有せず、主に（酸化的リン酸化ではなく）解糖を通じてエネルギーを獲得し、休止状態ではなく老化状態であり得る。
本書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞の成長及び***を意味する。いくつかの実施形態では、細胞に関して本書で使用される「増殖」という用語は、ある期間にわたって数が増加し得る細胞群を指す。
細胞個体発生の文脈において、形容詞の「分化された」または「分化している」は、「分化細胞」が比較対象の細胞よりも発生経路をさらに進んだ細胞であることを意味する相対的な用語である。したがって、幹細胞は、系統が限定された前駆細胞（中胚葉幹細胞など）に分化することができ、次にこの前駆細胞は、経路をさらに進んだ他の種類の前駆細胞（心筋細胞前駆細胞など）に、そして最終段階の分化細胞に分化することができ、この最終段階の分化細胞は、特定の組織型で特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持することもあれば保持しないこともある。
本書で使用される「薬剤」という用語は、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどであるがこれらに限定されない任意の化合物または物質を意味する。「薬剤」は、限定されるものではないが、合成及び自然発生のタンパク質性実体及び非タンパク質性実体を含む、任意の化学物質、実体、または部分であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、核酸、核酸アナログ、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物であり、これは、限定されるものではないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの修飾形及び組み合わせなどを含む。特定の実施形態では、薬剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分には、非置換または置換のアルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分が含まれ、これには、マクロライド、レプトマイシン、及び関連する天然産物またはそれらのアナログが含まれる。化合物は、所望の活性及び／または特性を有することが分かっているものでもよいし、多様な化合物のライブラリから選択されてもよい。
本書で使用される場合、「接触させる」という用語（すなわち、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を成熟因子または成熟因子の組み合わせと接触させること）は、分化培地及び／または薬剤と細胞とを一緒にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすること（例えば、培養下の細胞に成熟因子を加えること）を含むことを意図する。いくつかの実施形態では、「接触させる」という用語は、対象において自然に起こり得る、本書で開示される化合物への細胞のｉｎ ｖｉｖｏ曝露（すなわち、自然の生理学的プロセスの結果として起こり得る曝露）を含むことを意図しない。本書に記載される実施形態でなされるような、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を成熟因子と接触させるステップは、任意の好適な様式で行われ得る。例えば、細胞は三次元培養で処置され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、心筋細胞の形成を促進する条件で処置される。本開示は、成熟した心筋細胞の形成を促進するあらゆる条件を企図する。成熟した心筋細胞の形成を促進する条件の例は、限定されるものではないが、低付着組織培養プレート、スピナーフラスコ、アグリウェル（ａｇｇｒｅｗｅｌｌ）プレートにおける懸濁培養を含む。いくつかの実施形態において、本発明者らは、成熟した心筋細胞が培地中で安定したままであることを観察した。いくつかの態様では、細胞の解離及び再プレーティングの前に、血清（例えば熱失活ウシ胎仔血清）が加えられる。
成熟因子（例えば心筋細胞成熟因子）と接触させる細胞は、細胞を安定化させるため、または細胞をさらに分化もしくは成熟させるために、他の分化薬剤などの別の薬剤または環境と、同時に、またはその後に接触させてもよいことが理解される。
同様に、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させた後、少なくとももう１つの心筋細胞成熟因子と接触させてもよい。いくつかの実施形態では、細胞を少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させ、その接触は時間的に分離しているが、いくつかの実施形態では、細胞を少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と実質的に同時に接触させる。いくつかの実施形態では、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、または少なくとも１０種の心筋細胞成熟因子と細胞を接触させる。
本書で言及される「細胞培養培地」という用語（本書では「培養培地」または「培地」ともいう）は、細胞の生存能を維持して増殖を支持する栄養素を含有する、細胞培養用の培地である。細胞培養培地は、塩（複数可）、バッファー（複数可）、アミノ酸、グルコースまたは他の糖（複数可）、抗生物質、血清または血清代替物、及び他の成分、例えばペプチド成長因子などのいずれかを、適切な組み合わせで含有し得る。特定の細胞型に通常使用される細胞培養培地は、当業者には公知である。
「細胞株」という用語は、単一の祖先細胞あるいは規定の祖先細胞集団及び／または実質的に同一の祖先細胞の集団から典型的に導出された、大部分が同一または実質的に同一の細胞の集団を指す。細胞株は、長期間（例えば、数か月、数年、無制限の期間）にわたって培養下に維持されているか、または維持できる可能性がある。細胞株は、細胞に無制限の培養寿命を与える自発的または誘導性の形質転換プロセスを経た可能性がある。細胞株には、そのようなものとして当技術分野で認識されているすべての細胞株が含まれる。細胞株の個々の細胞の少なくともいくつかの特性が互いと比べて異なり得るように、細胞が時間の経過と共に変異を獲得し、場合によっては後成的変化を獲得することは理解されるであろう。いくつかの実施形態では、細胞株は、本書に記載される心筋細胞を含む。
「外因性」という用語は、天然源以外の細胞または生物に存在する物質を指す。例えば、「外因性核酸」または「外因性タンパク質」という用語は、ある核酸またはタンパク質が通常見出されないか、またはより少ない量で見出される細胞または生物などの生物学的システムに、人の手が関与するプロセスによって導入された、当該核酸またはタンパク質を指す。ある物質が、細胞またはその物質を受け継ぐ細胞の祖先に導入された場合、その物質は外因性とみなされる。これに対し、「内因性」という用語は、生物学的システムにとって天然の物質を指す。
本書で使用される「遺伝子修飾」または「エンジニアリングされた」細胞という用語は、人の手が関与するプロセスによって外因性核酸が導入された細胞（またはその核酸の少なくとも一部を受け継いだそのような細胞の子孫）を指す。核酸は、例えば、細胞にとって外因性の配列を含有する場合もあり、天然配列（すなわち、細胞に天然に見出される配列）だが非自然発生の構成の配列（例えば、異なる遺伝子からのプロモーターに連結されたコード領域）、または天然配列の改変バージョンなどを含有する場合もある。核酸を細胞に移入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成され得る。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその一部分が細胞のゲノムに組み込まれる。核酸は、その後ゲノムから除去または切除されていてもよいが、ただし、そのような除去または切除により、未修飾であるがその他の点では同等の細胞と比べて細胞内に検出可能な変化が生じることを条件とする。遺伝子修飾という用語は、修飾されたＲＮＡ（例えば、合成の修飾されたＲＮＡ）を細胞に直接導入することを含むことを意図していることを理解されたい。そのような合成の修飾されたＲＮＡには、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによる急速な分解を防止し、ＲＮＡに対する細胞の自然免疫またはインターフェロン応答を回避するまたは低減させるための修飾が含まれる。修飾は、例えば、（ａ）末端修飾、例えば５’末端修飾（リン酸化、脱リン酸化、共役、逆位結合など）、３’末端修飾（共役、ＤＮＡヌクレオチド、逆位結合など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または広いレパートリーのパートナーと塩基対を形成する塩基、または共役塩基による置換、（ｃ）糖修飾（例えば２’位または４’位における糖修飾）または糖の置換、及び（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置換を含むヌクレオシド間結合修飾を含むが、これらに限定されない。そのような修飾が翻訳を妨げる（すなわち、例えばウサギ網状赤血球ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイにおいて、修飾がない場合と比べて翻訳の５０％以上の低減をもたらす）場合、その修飾は、本書に記載される方法及び組成物に好適ではない。
「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質の生産、そして場合によってはタンパク質の分泌に関与する細胞プロセスを指し、該当する場合、例えば、転写、翻訳、フォールディング、修飾、及びプロセシングを含むがこれらに限定されない。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られるポリペプチドが含まれる。
本書で使用される「単離された」または「部分的に精製された」という用語は、核酸またはポリペプチドの場合、その天然源に見出される核酸もしくはポリペプチドと共に存在する、及び／または、細胞によって発現されたとき、もしくは分泌ポリペプチドの場合には分泌されたとき、核酸もしくはポリペプチドと共に存在することになる、少なくとも１つの他の成分（例えば核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプチドを指す。化学的に合成された核酸もしくはポリペプチド、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を使用して合成されたものは、「単離された」とみなされる。
本書で使用される「単離細胞」という用語は、その細胞が最初に発見された生物から取り出された細胞、またはこのような細胞の子孫を指す。場合により、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば他の細胞の存在下で培養されたものである。場合により、細胞は、後に第２の生物に導入されるか、または細胞（またはその由来細胞）の単離源となった生物に再導入される。
本書で使用される細胞の単離集団に関する「単離集団」という用語は、混合型または不均質の細胞集団から取り出され分離された細胞集団を指す。いくつかの実施形態では、単離集団は、細胞の単離源または濃縮源となった不均質の集団と比較して実質的に純粋な細胞集団である。
特定の細胞集団に関する「実質的に純粋」という用語は、総細胞集団を構成する細胞を基準として少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。すなわち、心筋細胞の集団に関する「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、本書における用語によって定義される心筋細胞ではない細胞を、約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％未満、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％未満、または１％未満含有する細胞集団を指す。いくつかの実施形態では、本発明は、心筋細胞の集団を増大させる方法を包含し、ここで、増大した心筋細胞の集団は、心筋細胞の実質的に純粋な集団である。
「濃縮する」または「濃縮された」という用語は、本書では互換的に使用され、ある種類の細胞の収量（画分）が、出発培養物または調製物中のその種類の細胞の画分よりも少なくとも１０％増加することを意味する。
「再生」または「自己再生」または「増殖」という用語は、本書では互換的に使用され、幹細胞が、長期間、及び／または何か月から何年にもわたって、同じ非特殊化細胞型に***することにより、自らを再生する能力を指すために使用される。場合によっては、増殖は、単一細胞が２つの同一の娘細胞に繰り返し***することによる細胞の増大を指す。
「調節する」という用語は、当技術分野でのその使用と一致するように使用され、すなわち、関心対象のプロセス、経路、または現象において、質的または量的な変化、改変、または修飾を引き起こすまたは容易にすることを意味する。そのような変化は、限定されるものではないが、プロセス、経路、または現象の異なる構成要素または分岐の相対的な強度または活性の増加、減少、または変化であり得る。「モジュレーター」とは、関心対象のプロセス、経路、または現象において、質的または量的な変化、改変、または修飾を引き起こすまたは容易にする薬剤である。
本書で使用される「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸と定義される。
本書で使用される「マーカー」は、細胞の特徴及び／または表現型を記述するために使用される。マーカーは、関心対象の特性を含む細胞の選択のために使用され得る。マーカーは特定の細胞によって異なる。マーカーは、特定の細胞型の細胞またはその細胞型によって発現される分子の特徴であり、形態学的特徴か、機能的特徴か、生化学的（酵素的）特徴かを問わない。好ましくは、そのようなマーカーはタンパク質であり、より好ましくは、当技術分野で利用可能な抗体または他の結合分子のエピトープを有する。しかし、マーカーは、タンパク質（ペプチド及びポリペプチド）、脂質、多糖、核酸及びステロイドを含むがこれらに限定されない、細胞に見出される任意の分子からなり得る。形態学的特徴または形質の例は、形状、サイズ、及び核対細胞質比を含むが、これらに限定されない。機能的特徴または形質の例は、特定の基質に接着する能力、特定の色素を組み込むまたは排除する能力、特定の条件下で移動する能力、及び特定の系統に沿って分化または脱分化する能力を含むが、これらに限定されない。マーカーは、当業者にとって利用可能な任意の方法によって検出され得る。マーカーは、形態学的特徴の非存在、またはタンパク質、脂質などの非存在である場合もある。マーカーは、ポリペプチドの有無及び他の形態学的特徴の独特の特徴のパネルの組み合わせであってもよい。
「選択マーカー」という用語は、発現されると、細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制性の薬剤への耐性（例えば抗生物質耐性）、栄養素の原栄養性、またはタンパク質を発現する細胞と発現しない細胞とを区別するための基礎として使用できる特定のタンパク質の発現など、選択可能な表現型を細胞に付与する、遺伝子、ＲＮＡ、またはタンパク質を指す。蛍光タンパク質もしくは発光タンパク質、または基質に作用して有色、蛍光性もしくは発光性の物質を生成する酵素など、その発現が容易に検出できるタンパク質（「検出マーカー」）は、選択マーカーのサブセットを構成する。多能性細胞において通常選択的または排他的に発現される遺伝子に固有の発現コントロールエレメントに連結された選択マーカーの存在により、多能性状態に再プログラムされた体細胞を識別及び選択することが可能になる。ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、及びｈｉｓＤ遺伝子など、種々の選択マーカー遺伝子が使用され得る。検出マーカーには、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色、サファイア、黄色、赤色、オレンジ、及びシアン蛍光タンパク質、ならびにこれらのいずれかのバリアントが含まれる。ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼ）などの発光タンパク質も有用である。当業者には明らかなように、本書で使用される「選択マーカー」という用語は、遺伝子または遺伝子の発現産物、例えば、コードされたタンパク質を指し得る。
いくつかの実施形態では、選択マーカーは、それを発現しない細胞、または有意に低いレベルでそれを発現する細胞と比べて、それを発現する細胞に増殖及び／または生存の利点を付与する。このような増殖及び／または生存の利点は、典型的に、細胞が特定の条件すなわち「選択的条件」下で維持される場合に生じる。効果的な選択を確実にするためには、マーカーを発現しない細胞が増殖せず、及び／または生存せず、集団から排除されるか、またはその数が集団のごく一部にまで低減するような条件下で、十分な期間にわたり、細胞集団を維持することができる。増殖及び／または生存の利点を付与するマーカーを発現しない細胞の大部分または全体を排除するように選択的条件下で細胞集団を維持することによって、当該マーカーを発現する細胞を選択するプロセスを、本書では「正の選択」といい、当該マーカーは、「正の選択に有用」であると言われる。負の選択及び負の選択に有用なマーカーも、本書に記載される特定の方法の関心対象である。そのようなマーカーの発現は、マーカーを発現しない細胞または有意に低いレベルでそれを発現する細胞と比べて、マーカーを発現する細胞に増殖及び／または生存の不利点を付与する（または、別の見方をすると、マーカーを発現しない細胞は、マーカーを発現する細胞と比べて増殖及び／または生存の利点を有する）。したがって、マーカーを発現する細胞は、選択的条件下で十分な期間維持すると、細胞集団から大部分または全体が排除され得る。
「対象」及び「個体」という用語は、本書では互換的に使用され、細胞の取得源になり得る動物、及び／または本書に記載される細胞を用いた予防的処置を含む処置が提供される動物、例えばヒトを指す。ヒト対象などの特定の動物に特異的な感染、病態、または病状の処置については、対象という用語は、その特定の動物を指す。本書で互換的に使用される「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、及び非ヒト霊長動物などの哺乳動物が含まれる。「対象」という用語は、哺乳動物、爬虫類、両生類、及び魚類を含むがこれらに限定されない任意の脊椎動物も包含する。しかし、対象は、ヒト、または、飼育哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなど、もしくは畜産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどのような他の哺乳動物などの哺乳動物であることが有利である。
単離細胞に適用される「処置する」、「処置すること」、「処置」などという用語は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件にさらすこと、または細胞に任意の種類の操作もしくは作業を行うことを含む。対象に適用される場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」などという用語は、個体に内科的または外科的な配慮、ケア、または管理を提供することを指す。その個体は通常、疾病もしくは傷害を有するか、または集団の平均的メンバーと比べて疾病になるリスクが高く、そのような配慮、ケア、または管理を必要とするものである。これには、対象が、疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の向上、例えば有益なまたな所望の臨床結果を呈するように、有効量の組成物を対象に投与することが含まれ得る。本発明では、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能か検出不能にかかわらず、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患進行の遅延または緩徐化、病状の改善または緩和、及び寛解（部分的か完全かを問わない）を含むが、これらに限定されない。処置は、処置を受けない場合の予測生存期間と比較した生存期間の延長を指す場合もある。したがって、処置は病態を向上させ得るが、疾患の完全な治癒でなくてもよいことは、当業者には認識されている。「処置」という用語には予防が含まれる。処置を必要とする者には、ある病態（例えば、筋肉の障害または疾患）の診断を既に受けた者だけでなく、遺伝的感受性または他の要因により病態を発症する可能性が高い者も含まれる。
「組織」という用語は、一緒に特定の特殊機能を果たす特殊化細胞の群または層を指す。「組織特異的」という用語は、特定の組織からの細胞源を指す。
「減少」、「低減した」、「低減」、「減少」または「阻害する」という用語はすべて、本書では、統計的に有意な量の減少を広く意味するように使用される。しかし、疑義を避けるために付言すると、「低減した」、「低減」または「減少」または「阻害する」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の減少、または最大１００％で１００％を含む減少（すなわち、参照サンプルと比較して存在しないレベル）、または参照レベルと比較して１０～１００％のあらゆる減少を意味する。
「増加した」、「増加」または「増進する」または「活性化する」という用語はすべて、本書では、統計的に有意な量の増加を広く意味するように使用される；疑義を避けるために付言すると、「増加した」、「増加」または「増進する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、または最大１００％で１００％を含む増加、または参照レベルと比較して１０～１００％のあらゆる増加、または少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または参照レベルと比較して２倍から１０倍の間もしくはそれを超えるあらゆる増加を意味する。
「統計的に有意」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、概して、マーカーの濃度が正常より２標準偏差（２ＳＤ）以上低いことを意味する。この用語は、差異があることの統計的な証拠を指す。これは、帰無仮説が実際には真である場合に帰無仮説を棄却する決定を下す確率と定義される。この決定は、多くの場合、ｐ値を使用して行われる。
本書で使用される、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、本発明に必須である組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用されるが、必須か否かを問わず不特定の要素を含むことについて制限されない。
本書で使用される「から本質的になる」という用語は、所定の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、該当する本発明の実施形態の基本的及び新規または機能的な特徴（複数可）に著しく影響しない追加要素の存在を許容する。
「からなる」という用語は、実施形態の説明に挙げられていない要素を除外する、本書に記載される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素を指す。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈により別段明記されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及には、本書に記載される種類の、及び／または本開示を読むことなどにより当業者に明らかとなる、１つ以上の方法及び／またはステップが含まれる。
幹細胞
幹細胞は、有糸細胞***によって自らを再生する能力を保持し、多岐にわたる特殊化された細胞型へと分化し得る細胞である。哺乳動物幹細胞には、大別して、胚盤胞に見られる胚性幹（ＥＳ）細胞、及び成体組織に見られる成体幹細胞という２つの種類がある。発生中の胚において、幹細胞は、特殊化された胚組織のすべてに分化することができる。成体生物では、幹細胞及び始原細胞が身体の修復系として機能し、特殊化細胞を補充するが、さらに、血液、皮膚、または腸組織などの再生器官の正常な代謝回転を維持する。多能性幹細胞は、３つの胚葉のいずれに由来する細胞にも分化することができる。
特定の実施形態は、心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）またはその前駆細胞を生産するための幹細胞の使用に関して以下に記載されるが、本書に記載される例示的なプロトコルと同様のプロトコルを使用して少なくとも１つの心筋細胞をもたらすために、幹細胞の代わりに、または幹細胞と共に、生殖細胞を使用することもできる。好適な生殖細胞は、例えば、最終月経期間から約８～１１週間後に採取されたヒト胎児材料中に存在する原始生殖細胞から調製することができる。例示的な生殖細胞調製方法は、例えば、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６， １９９８及び米国特許第６，０９０，６２２号に記載されている。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）などのＥＳ細胞は、事実上無限の複製能力と、ほとんどの細胞型に分化する可能性とを備えており、原理上、臨床療法用の分化細胞を生成するための無制限の出発材料を提供する（ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｆｏ／ｓｃｉｒｅｐｏｒｔ／２００６ｒｅｐｏｒｔ．ｈｔｍ，２００６）。ＥＳ細胞の考えられる応用の１つは、まず、例えばｈＥＳＣから心臓始原細胞を生産し、次いで、心臓始原細胞を少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞へとさらに分化させ、次いで、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）へとさらに分化させることによって、心不全（例えば慢性心不全）の細胞置換療法のための新しい心筋細胞を生成することである。
ｈＥＳＣ細胞は、例えば、Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｎ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５０：１３５３， ２００４）及びＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５， １９９８）に記載されており、他の霊長動物からの胚性幹細胞、アカゲザル幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４， １９９５）、マーモセット幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５５：２５４， １９９６）、及びヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６， １９９８）も、本書で開示される方法において使用され得る。ｍＥＳＣは、例えば、Ｔｒｅｍｍｌ ｅｔ ａｌ． （Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｕｎｉｔ １Ｃ．４， ２００８）に記載されている。幹細胞は、例えば、単能性、全能性、多分化能性、または多能性であり得る。いくつかの例では、少なくとも１つの胚層、または３つすべての胚層の派生物である後代を生産することができる霊長動物起源の任意の細胞が、本書で開示される方法において使用され得る。
特定の例において、ＥＳ細胞は、例えば、Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｎ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５０：１３５３， ２００４）、及び米国特許第５，８４３，７８０号、及びＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４， １９９５に記載されているように単離され得る。例えば、ｈＥＳＣ細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，２００，８０６号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５， １９９８、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ３８：１３３ ｆｆ．， １９９８）及びＲｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １８：３９９， ２０００に記載されている技法を使用して、ヒト胚盤胞細胞から調製することができる。ｈＥＳＣと同等の細胞型には、例えばＷＯ０１／５１６１０（Ｂｒｅｓａｇｅｎ）に概説されているような、原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞などの多能性派生物が含まれる。ｈＥＳＣは、ヒトの着床前胚から取得することもできる。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）胚を使用することもできるし、１細胞のヒト胚を胚盤胞期まで増大させることもできる（Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４： ７０６， １９８９）。胚は、Ｇ１．２及びＧ２．２培地で胚盤胞期まで培養される（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｆｅｒｔｉｌ． Ｓｔｅｒｉｌ． ６９：８４， １９９８）。透明帯が、プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）に短時間曝露することにより、発生した胚盤胞から除去される。内部細胞塊は免疫手術によって単離でき、免疫手術では、胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清の１：５０希釈物に３０分間曝露し、次いでＤＭＥＭで５分間の洗浄を３回行い、モルモット補体の１：５希釈物（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する（Ｓｏｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２：５０９９， １９７５）。ＤＭＥＭでさらに２回洗浄した後、溶解した栄養外胚葉細胞を穏やかなピペッティングによって無傷の内部細胞塊（ＩＣＭ）から除去し、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー層上にプレーティングする。９～１５日後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むカルシウム不含かつマグネシウム不含のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への曝露、ディスパーゼもしくはトリプシンへの曝露、またはマイクロピペットを用いた機械的解離のいずれかによって、内部細胞塊由来の増殖物を凝集塊に解離させ、次いで、新鮮な培地中のｍＥＦに再プレーティングすることができる。未分化の形態を有する成長中のコロニーをマイクロピペットで個別に選択し、機械的に解離させて凝集塊にし、再プレーティングすることができる。ＥＳ様の形態は、明らかに高い核対細胞質比及び顕著な核小体を有する密なコロニーと特徴付けられる。得られたｈＥＳＣはその後、１～２週間ごとに、例えば、手短なトリプシン処理、ダルベッコＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ含有）への曝露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）への曝露、またはマイクロピペットによる個々のコロニーの選択により、慣例的に分割され得る。いくつかの例では、約５０～１００細胞の凝集塊サイズが最適である。ｍＥＳＣ細胞は、例えば、Ｃｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔ． ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｕｎｉｔ ２３．４， ２００３）に記載されている技法を使用することで調製することができる。
胚性幹細胞は、霊長動物種のメンバーの胚盤胞から単離することができる（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４， １９９５）。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，２００，８０６号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５， １９９８、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ３８：１３３ ｆｆ．， １９９８）及びＲｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １８：３９９， ２０００に記載されている技法を使用して、ヒト胚盤胞細胞から調製することができる。ｈＥＳ細胞と同等の細胞型には、ＷＯ０１／５１６１０（Ｂｒｅｓａｇｅｎ）に概説されているような、原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞などの多能性派生物が含まれる。
あるいは、いくつかの実施形態は、ｈＥＳ細胞は、ヒトの着床前胚から取得することもできる。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）胚を使用することもできるし、１細胞のヒト胚を胚盤胞期まで増大させることもできる（Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４： ７０６， １９８９）。胚は、Ｇ１．２及びＧ２．２培地で胚盤胞期まで培養される（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｆｅｒｔｉｌ． Ｓｔｅｒｉｌ． ６９：８４， １９９８）。透明帯が、プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）に短時間曝露することにより、発生した胚盤胞から除去される。内部細胞塊は免疫手術によって単離され、免疫手術では、胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清の１：５０希釈物に３０分間曝露し、次いでＤＭＥＭで５分間の洗浄を３回行い、モルモット補体の１：５希釈物（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する（Ｓｏｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２：５０９９， １９７５）。ＤＭＥＭでさらに２回洗浄した後、溶解した栄養外胚葉細胞を穏やかなピペッティングによって無傷の内部細胞塊（ＩＣＭ）から除去し、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー層上にプレーティングする。
９～１５日後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むカルシウム不含かつマグネシウム不含のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への曝露、ディスパーゼもしくはトリプシンへの曝露、またはマイクロピペットを用いた機械的解離のいずれかによって、内部細胞塊由来の増殖物を凝集塊に解離させ、次いで、新鮮な培地中のｍＥＦに再プレーティングする。未分化の形態を有する成長中のコロニーをマイクロピペットで個別に選択し、機械的に解離させて凝集塊にし、再プレーティングする。ＥＳ様の形態は、明らかに高い核対細胞質比及び顕著な核小体を有する密なコロニーと特徴付けられる。得られたＥＳ細胞はその後、１～２週間ごとに、手短なトリプシン処理、ダルベッコＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ含有）への曝露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）への曝露、またはマイクロピペットによる個々のコロニーの選択により、慣例的に分割される。約５０～１００細胞の凝集塊サイズが最適である。
いくつかの実施形態では、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、原始内胚葉細胞に分化させるために本書で開示される方法において使用され得る多能性幹細胞である。使用されるｈＥＧ細胞は、最終月経期間の約８～１１週間後に採取されたヒト胎児材料中に存在する原始生殖細胞から調製することができる。好適な調製方法は、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６， １９９８及び米国特許第６，０９０，６２２号に記載されており、これは、参照によりその全体が本書に組み込まれる。
手短に述べると、生殖***を処理して、脱凝集した細胞を形成する。ＥＧ成長培地は、ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／Ｌ Ｄ－グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１５％ＥＳ適格ウシ胎仔血清（ＢＲＬ）、２ｍＭグルタミン（ＢＲＬ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ）、１０００～２０００Ｕ／ｍＬヒト組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、１～２ｎｇ／ｍＬヒト組換えｂＦＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、及び１０μＭフォルスコリン（１０％ＤＭＳＯ中）である。９６ウェル組織培養プレートを、５０００ｒａｄのγ線照射で失活した、ＬＩＦ、ｂＦＧＦまたはフォルスコリンを含まない改変ＥＧ成長培地で３日間培養したフィーダー細胞（例えばＳＴＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５０３）のサブコンフルエント層で調製し、約０．２ｍＬの初代生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を各ウェルに加える。ＥＧ成長培地中で７～１０日後に最初の継代を行い、各ウェルを、照射済みＳＴＯマウス線維芽細胞を用いて事前に調製した２４ウェル培養皿の１つのウェルに移す。典型的には７～３０日または１～４継代後、ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、培地を毎日交換しながら細胞を培養する。
特定の例において、幹細胞は、本書で開示される方法に従って少なくとも１つの心筋細胞成熟因子に曝露される前に未分化（例えば、特定の系統に傾倒していない細胞）であり得るが、他の例では、本書に記載される少なくとも１つの心筋細胞成熟因子（複数可）の曝露前に、幹細胞を１つ以上の中間細胞型に分化させることが望ましい場合がある。例えば、幹細胞は、胚または成体起源の分化細胞からそれらを区別するために使用され得る未分化細胞の形態学的、生物学的、または物理的な特徴を示し得る。いくつかの例では、未分化細胞は、二次元の顕微鏡視野において、高い核／細胞質比及び顕著な核小体を有する細胞のコロニーとして現れる場合がある。幹細胞は、それ自体でもよく（例えば、未分化細胞が実質的に存在しない）、または分化細胞の存在下で使用されてもよい。特定の例において、幹細胞は、幹細胞が成長でき、場合により分化できるように、好適な栄養素、及び場合により他の細胞の存在下で培養され得る。例えば、幹細胞の成長を助けるために、胚性線維芽細胞または線維芽細胞様細胞が培養物中に存在し得る。線維芽細胞は、幹細胞の成長の一段階で存在し得るが、必ずしもすべての段階で存在するとは限らない。例えば、線維芽細胞は、第１の培養段階で幹細胞培養物に添加され、その後の１つ以上の培養段階では幹細胞培養物に添加されなくてもよい。
本発明のすべての態様で使用される幹細胞は、任意の種類の組織（例えば、胎児もしくは胎児前の組織などの胚組織、または成体組織）に由来する任意の細胞であり得、この幹細胞は、適切な条件下で異なる細胞型の後代、例えば、３つの胚層（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の少なくとも１つのすべての派生物を生産できるという特徴を有する。これらの細胞型は、確立された細胞株の形態で提供されてもよいし、または初代胚組織から直接取得され、分化のために直ちに使用されてもよい。ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリに収載されている細胞、例えばｈＥＳＢＧＮ－０１、ｈＥＳＢＧＮ－０２、ｈＥＳＢＧＮ－０３、ｈＥＳＢＧＮ－０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）；ＨＥＳ－１、ＨＥＳ－２、ＨＥＳ－３、ＨＥＳ－４、ＨＥＳ－５、ＨＥＳ－６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；Ｍｉｚ－ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ－Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ－１、ＨＳＦ－６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；及びＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））が含まれる。いくつかの実施形態では、成熟した心筋細胞への化学誘導分化に使用されたヒト幹細胞または多能性幹細胞の供給源は、ヒト胚の破壊を伴わなかった。
別の実施形態では、幹細胞は、固形組織を含む組織から単離され得る。いくつかの実施形態では、組織は、皮膚、脂肪組織（ｆａｔ ｔｉｓｓｕｅ）（例えば、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ））、筋肉組織、心臓組織または心組織である。他の実施形態では、組織は、例えば、臍帯血、胎盤、骨髄、または軟骨であるが、これらに限定されない。
関心対象の幹細胞には、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５に記載されているヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、他の霊長動物由来の胚性幹細胞、例えばアカゲザル幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４）、マーモセット幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５５：２５４）、及びヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｆｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６， １９９８）によって例示される、様々な種類の胚細胞も含まれる。中胚葉幹細胞及び他の初期心臓原性細胞など（Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｂｌｏｏｄ ９８：２６１５－２６２５、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ＆ Ｂａｄｅｒ （１９９６） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ７８（２）：２０５－１６などを参照のこと）、系統が決定された幹細胞も関心対象である。幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、齧歯動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長動物などから取得され得る。いくつかの実施形態では、本書で開示される方法及び組成物で使用された多能性細胞の供給源のために、ヒト胚は破壊されなかった。
ＥＳ細胞は、特定の分化系統に傾倒していない場合、未分化とみなされる。このような細胞は、胚または成体起源の分化細胞からそれらを区別する形態学的特徴を示す。未分化ＥＳ細胞は、当業者によって容易に認識され、典型的に、二次元の顕微鏡視野において、高い核／細胞質比及び顕著な核小体を有する細胞のコロニーとして現れる。未分化ＥＳ細胞は、未分化細胞の存在を検出するためのマーカーとして使用され得る遺伝子を発現し、そのポリペプチド産物は、負の選択のためのマーカーとして使用され得る。例えば、各々が参照により本書に組み込まれている、米国特許出願第２００３／０２２４４１１号Ａ１、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ （２００４） Ｂｌｏｏｄ １０３（８）：２９５６－６４、及び上掲のＴｈｏｍｓｏｎ（１９９８）を参照されたい。ヒトＥＳ細胞株は、段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、及びアルカリホスファターゼを含む、未分化の非ヒト霊長動物ＥＳ細胞及びヒトＥＣ細胞を特徴付ける細胞表面マーカーを発現する。ＳＳＥＡ－４エピトープを有するグロボ系糖脂質ＧＬ７は、ＳＳＥＡ－３エピトープを有するグロボ系糖脂質ＧｂＳへのシアル酸の付加によって形成される。したがって、ＧＬ７は、ＳＳＥＡ－３及びＳＳＥＡ－４の両方に対する抗体と反応する。未分化ヒトＥＳ細胞株はＳＳＥＡ－１について染色されなかったが、分化細胞はＳＳＥＡ－Ｉについて強く染色された。未分化形態のｈＥＳ細胞を増殖させる方法は、ＷＯ９９／２０７４１、ＷＯ０１／５１６１６、及びＷＯ０３／０２０９２０に記載されている。
内皮幹細胞、筋肉幹細胞、及び／または神経幹細胞の好適な供給源からの細胞の混合物は、当技術分野で公知の方法により、哺乳動物ドナーから採取され得る。好適な供給源は造血微小環境である。例えば、循環末梢血、好ましくは可動化（すなわち動員）されたものが、対象から取り出され得る。あるいは、自家移植を受けるヒト患者などの哺乳動物から骨髄が取得され得る。いくつかの実施形態では、幹細胞は、例えば、参照により全体が本書に組み込まれている米国特許第７，３９０，４８４号及び同第７，４２９，４８８号で開示されているＣｙｔｏｒｉのＣＥＬＵＴＩＯＮ（商標）ＳＹＳＴＥＭを使用して、対象の脂肪組織から取得され得る。
いくつかの実施形態では、ヒト臍帯血細胞（ＨＵＣＢＣ）が、本書で開示される方法において有用である。ヒトＵＢＣ細胞は、造血始原細胞及び間葉始原細胞の豊富な供給源として認識されている（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４１０９－４１１３）。これまで、臍帯及び胎盤血は、乳児の誕生時に通常廃棄される廃棄物と考えられていた。臍帯血細胞は、移植可能な幹細胞及び始原細胞の供給源として、また悪性疾患（すなわち、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び神経芽細胞腫）ならびにファンコーニ貧血及び再生不良性貧血などの非悪性疾患の処置のための骨髄再増殖細胞の供給源として使用されている（Ｋｏｈｌｉ－Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ８５：４１９－４２２、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｂｌｏｏｄ ７９；１８７４－１８８１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ ２２：６１－７８、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４：４９３－５０３）。ＨＵＣＢＣの明確な利点は、胎児細胞に非常によく似たこれらの細胞の未熟な免疫であり、これは、宿主による拒絶反応のリスクを有意に低減させる（Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｂｒｙｓｏｎ， １９８５ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３４：１４９３－１４９７）。ヒト臍帯血には、間葉原細胞及び造血始原細胞、ならびに組織培養で増大させることができる内皮細胞前駆細胞が含まれている（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４１０９－４１１３、Ｋｏｈｌｉ－Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ８５：４１９－４２２、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｂｌｏｏｄ ７９；１８７４－１８８１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ ２２：６１－７８、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４：４９３－５０３、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｂｒｙｓｏｎ， １９８５ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３４：１４９３－１４９７、Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ， １９９５ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３５：６９４－７０２、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１ Ｓｔｒｏｋｅ ３２：２６８２－２６８８、Ｎｉｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９８：７７５－７７７、Ｅｒｉｃｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １０９：２３５－２４２）。臍帯血中の造血始原細胞の総含有量は骨髄と同等かそれを超えており、さらに、増殖性の高い造血細胞は、ＨＵＣＢＣでは骨髄中よりも８倍高く、ＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５などの造血マーカーを発現する（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１ Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒ． １７１：１０９－１１５、Ｂｉｃｋｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １１：２６１－２６４、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １７８：２０８９－２０９６）。
別の実施形態では、多能性細胞は、循環末梢血などの造血微小環境中の、好ましくは、哺乳動物の末梢血、臍帯血、骨髄、胎児肝臓、または卵黄嚢の単球画分からの細胞である。幹細胞、特に神経幹細胞は、髄膜を含む中枢神経系に由来することもある。
別の実施形態では、多能性細胞は、胚様体中に存在し、手短なプロテアーゼ消化によりＥＳ細胞を採取し、未分化ヒトＥＳＣの小さな凝集塊を懸濁培養下で成長させることによって形成される。分化は馴化培地の除去によって誘導される。得られた胚様体は、半固体基質上にプレーティングされる。分化細胞の形成は、約７日後付近から約４週間後付近に観察され得る。胚様体または同様の構造を部分的に解離して細胞凝集体をもたらすことにより、幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物から、生存能があり分化している細胞が選択される。凝集体中の細胞間の接触を実質的に維持する方法を使用して、表現型の特徴について関心対象の細胞を含む凝集体が選択される。
代替的な実施形態では、幹細胞は、体細胞または分化細胞に由来する幹細胞などの再プログラムされた幹細胞であり得る。そのような実施形態では、脱分化幹細胞は、例えば、新生細胞、腫瘍細胞、及びがん細胞、あるいは人工多能性幹細胞またはｉＰＳ細胞などの誘導された再プログラム細胞であり得るが、これらに限定されない。
クローニング及び細胞培養
本書に記載される技術において使用され得る分子遺伝子学及び遺伝子エンジニアリングのための例示的な方法は、例えば、最新版のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に見出すことができる。細胞生物学、タンパク質化学、及び抗体の技法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ． Ｅ． Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ． Ｓ． Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ． Ｅ． Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．）に見出すことができる。遺伝子操作用の例示的な試薬、クローニングベクター、及びキットは、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎＴｅｃｈ、及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏから商業的に取得され得る。
好適な細胞培養法は、例えば、最新版のＣｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍ． Ａ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＆ Ｉ． Ｆ． Ｒａｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ）、及びＥｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ． Ｔｕｒｋｓｅｎ ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。好適な組織培養用品及び試薬は、例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｎａｌｇｅｎｅ－Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、及びＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから市販されている。
多能性幹細胞は、当業者が、分化を促進することなく増殖を促進する培養条件を使用して、継続的に培養下で繁殖させることができる。例示的な血清含有ＥＳ培地は、８０％のＤＭＥＭ（例えばＫｎｏｃｋ－Ｏｕｔ ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）、２０％の規定のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）または血清代替物（ＷＯ９８／３０６７９）のいずれか、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ－グルタミン、及び０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノールを用いて作製される。使用直前に、ヒトｂＦＧＦを４ｎｇ／ｍＬまで添加する（ＷＯ９９／２０７４１、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）。従来、ＥＳ細胞は、フィーダー細胞、典型的には胚組織または胎児組織に由来する線維芽細胞の層で培養される。
あるいは、多能性ＳＣは、フィーダー細胞がなくても未分化状態で維持することができる。フィーダーフリー培養の環境には、好適な培養基質、特にＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ゼラチン状タンパク質混合物）またはラミニンなどの細胞外マトリックスが含まれる。典型的に、酵素消化は、細胞が完全に分散する前に停止する（コラゲナーゼＩＶを用いる場合は約５分）。次いで、約１０～２，０００細胞の凝集塊をさらに分散させることなく基質上に直接プレーティングする。
心筋細胞の生成
本開示の諸態様は、心筋細胞（例えば、成熟した休止心筋細胞）の生成に関する。概して、本書で開示される方法に従って生産された心筋細胞は、電気的に成熟していること（例えば、減少した自動性を呈すること）、収縮性が成熟していること、及び代謝的に成熟していることを含むがこれらに限定されない、機能的な成熟した休止心筋細胞のいくつかの特長を示す。
心筋細胞は、幹細胞または多能性細胞を所望の分化段階まで分化させるための任意の好適な培養プロトコルまたは一連の培養プロトコルに従って生産され得る。いくつかの実施形態では、心筋細胞またはその前駆細胞は、少なくとも１つの多能性細胞を心筋細胞またはその前駆細胞に分化させるのに好適な期間及び条件で、少なくとも１つの多能性細胞を培養することによって生産される。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、未熟心筋細胞を老化状態から休止状態に移行させ、それにより、心筋細胞の成熟を増進することによって生産される。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、心筋細胞の実質的に純粋な集団である。いくつかの実施形態では、心筋細胞またはその前駆細胞の集団は、多能性細胞または分化細胞の混合物を含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞またはその前駆細胞の集団は、胚性幹細胞または多能性細胞またはｉＰＳ細胞を実質的に含まないか、または全く含まない。
いくつかの実施形態では、線維芽細胞などの体細胞を、例えば組織生検として、例えば皮膚生検などとして対象から単離し、人工多能性幹細胞へと再プログラムし、さらに分化させて、本書に記載される組成物及び方法で使用するための心筋細胞またはその前駆細胞を生産することができる。いくつかの実施形態では、線維芽細胞などの体細胞を、当業者に公知の方法によって培養下に維持し、いくつかの実施形態では繁殖させ、その後、本書で開示される方法によって心筋細胞へと変換する。
いくつかの実施形態では、心筋細胞またはその前駆細胞を、当業者に公知の方法によって培養下に維持し、いくつかの実施形態では繁殖させ、その後、本書で開示される方法によって心筋細胞へと変換する。
さらに、心筋細胞またはその前駆細胞、例えば未熟心筋細胞は、任意の哺乳動物種のものでよく、非限定的な例には、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヒトの細胞が含まれる。明確かつ簡潔にするために、本書における方法の説明は哺乳動物心筋細胞またはその前駆細胞に言及しているが、本書に記載される方法のすべてが他の細胞型の心筋細胞またはその前駆細胞に容易に適用され得ることは理解されるはずである。いくつかの実施形態では、心筋細胞またはその前駆細胞は、ヒト個体に由来する。
本開示の諸態様には、未熟な老化心筋細胞が関わる。本書で使用される未熟心筋細胞は、任意の供給源に由来することができ、または任意の好適なプロトコルに従って生成することができる。いくつかの態様では、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣは、未熟心筋細胞に分化する。いくつかの態様では、未熟心筋細胞は、さらに成熟して、成熟した心筋細胞となる。いくつかの実施形態では、参照により本書に組み込まれているＬｉａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１２；８（１）： １６２－１７５）に記載されている分化プロトコルを使用して、多能性幹細胞を未熟心筋細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、Ｌｉａｎによって説明された分化プロトコルを、本書に記載されるように修正した。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞を１つ以上の小分子と接触させてＷｎｔ経路を操作し、それにより、多能性幹細胞を未熟心筋細胞へと分化させる。いくつかの態様では、１つ以上の小分子は、ＣＨＩＲ９９０２１及びＩＷＰ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の集団を第１のＷｎｔ経路モジュレーター（例えばＣＨＩＲ９９０２１）と接触させ、次いで第２のＷｎｔ経路モジュレーター（例えばＩＷＰ４）と接触させる。
本開示の諸態様には、心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）が関わる。本書で使用される心筋細胞は、任意の供給源に由来することができ、または任意の好適なプロトコルに従って生成することができる。いくつかの態様では、老化心筋細胞（例えば、未熟心筋細胞）は、休止心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）へと誘導される。細胞休止は、心筋細胞の成熟を容易にし得る。いくつかの態様では、未熟心筋細胞を成熟するように誘導して、成熟した心筋細胞にする。
いくつかの態様では、本開示は、心筋細胞の休止を誘導する（例えば、心筋細胞を休止状態に移行させる）方法を提供する。特定の態様では、心筋細胞の休止の誘導は、心筋細胞の成熟を増進する。いくつかの実施形態では、心筋細胞における細胞周期制御因子の発現を上方制御することにより、心筋細胞を休止状態に移行させる。特定の実施形態では、心筋細胞におけるｐ５３の発現を上方制御することにより、心筋細胞を休止状態に移行させる。ｐ５３の発現は、心筋細胞において、ｐ５３のアクチベーターと心筋細胞を接触させることによって上方制御され得る。いくつかの実施形態では、ｐ５３のアクチベーターは、小分子である。特定の実施形態では、ｐ５３のアクチベーターは、Ｔｏｒｉｎ１である。特定の実施形態では、ｐ５３のアクチベーターは、Ｔｏｒｉｎ１ではない。いくつかの実施形態では、ｐ５３のアクチベーターは、ＭＤＭ２のインヒビターである。特定の実施形態では、ｐ５３のアクチベーターは、ｎｕｔｌｉｎ－３ａである。いくつかの実施形態では、ｐ５３のアクチベーターは、セノリティックである。特定の実施形態では、ｐ５３のアクチベーターは、ケルセチンである。いくつかの実施形態では、ｐ５３のアクチベーターは、２つ以上の薬剤の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害し、ｐ５３の発現を上方制御することにより、心筋細胞を休止状態に移行させる。いくつかの実施形態では、ｐ５３の発現を上方制御し、ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害しないことにより、心筋細胞を休止状態に移行させる。いくつかの態様では、ｍＴＯＲシグナル伝達は、心筋細胞において、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２のインヒビターと心筋細胞を接触させることによって阻害され得る。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２のインヒビターは、Ｔｏｒｉｎ１である。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２のインヒビターは、Ｔｏｒｉｎ１ではない。特定の実施形態では、心筋細胞を単一の薬剤と接触させることによって、ｐ５３発現が上方制御され、ｍＴＯＲシグナル伝達が阻害される。特定の実施形態では、単一の薬剤はＴｏｒｉｎ１である。他の実施形態では、単一の薬剤はＴｏｒｉｎ１ではない。
いくつかの態様では、本開示は、未熟心筋細胞から成熟した（例えば電気的に成熟した、収縮性の成熟した、及び／または代謝的に成熟した）心筋細胞を生成する方法を提供し、当該方法は、心筋細胞の休止を誘導すること（すなわち、心筋細胞を休止状態すなわち成熟状態に向かって移行させること）を含む。いくつかの実施形態では、ｐ５３発現を上方制御することにより、心筋細胞を休止状態（例えば成熟状態）に向かって移行させる。ｐ５３のアクチベーター（例えばｎｕｔｌｉｎ－３ａまたはケルセチン）と未熟心筋細胞を接触させることにより、心筋細胞を休止状態に向かって移行させてもよい。いくつかの実施形態では、ｐ５３発現を上方制御し、ｍＴＯＲシグナル伝達を下方制御することにより、心筋細胞を休止状態（例えば成熟状態）に向かって移行させる。いくつかの実施形態では、ｐ５３発現を上方制御し、ｍＴＯＲシグナル伝達を下方制御しないことにより、心筋細胞を休止状態に向かって移行させる。いくつかの実施形態では、未熟な老化心筋細胞をＴｏｒｉｎ１と接触させることにより、心筋細胞を休止状態に向かって移行させる。いくつかの実施形態では、未熟な老化心筋細胞をＴｏｒｉｎ１ではない薬剤と接触させることにより、心筋細胞を休止状態に向かって移行させる。
いくつかの態様では、本開示は、未熟心筋細胞から成熟した（例えば電気的に成熟した、収縮性の成熟した、及び／または代謝的に成熟した）心筋細胞を生成する方法を提供し、当該方法は、ｐ５３アクチベーター及び／またはｍＴＯＲのインヒビターを含む少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と、未熟心筋細胞を含む細胞集団を接触させて、集団中の少なくとも１つの未熟心筋細胞が心筋細胞に成熟すること（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟）を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞を含む細胞集団を、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子（例えばｐ５３アクチベーター及び／またはｍＴＯＲインヒビター）と接触させる。いくつかの態様では、ｍＴＯＲの阻害と組み合わせてｐ５３発現を上方制御して、幹細胞に由来する心筋細胞の成熟を増進する。いくつかの態様では、ｍＴＯＲを阻害せずにｐ５３発現を上方制御して、幹細胞に由来する心筋細胞の成熟を増進する。
本開示は、未熟心筋細胞が老化状態から休止状態に移行することを促す（例えば、心筋細胞へと分化及び／または成熟させる（例えば単独で、または別の心筋細胞成熟因子（例えばｍＴＯＲインヒビター）と組み合わせて））、あらゆるｐ５３アクチベーターの使用を企図する。いくつかの実施形態では、ｐ５３アクチベーターは、ｐ５３発現の上方制御因子である。ｐ５３の上方制御は、総ｐ５３タンパク質及びリン酸化ｐ５３タンパク質の増加を含み得る。ｐ５３アクチベーターまたは上方制御因子の例には、小分子、核酸、アミノ酸、代謝産物、ポリペプチド、抗体及び抗体様分子、アプタマー、大環状分子、ならびに他の分子が含まれる。いくつかの態様では、ｐ５３の上方制御因子は、ＭＤＭ２インヒビターである。特定の態様では、ｐ５３の上方制御因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａである。いくつかの態様では、ｐ５３の上方制御因子は、セノリティックである。特定の態様では、ｐ５３の上方制御因子は、ケルセチンである。いくつかの態様では、ｐ５３の上方制御因子は、Ｔｏｒｉｎ１である。いくつかの態様では、ｐ５３の上方制御因子は、Ｔｏｒｉｎ１ではない薬剤である。いくつかの態様では、ｐ５３の上方制御因子は、ｍＴＯＲインヒビターではない薬剤である。いくつかの態様では、ｐ５３の上方制御因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ及びＴｏｒｉｎ１の組み合わせである。いくつかの態様では、ｐ５３の上方制御因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ及びケルセチンの組み合わせである。いくつかの態様では、ｐ５３の上方制御因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、及びＴｏｒｉｎ１の組み合わせである。
いくつかの態様では、本開示は、未熟心筋細胞から成熟した（例えば電気的に成熟した、収縮性の成熟した、及び／または代謝的に成熟した）心筋細胞を生成する方法を提供し、当該方法は、ｍＴＯＲインヒビターを含む少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と、未熟心筋細胞を含む細胞集団を接触させて、集団中の少なくとも１つの未熟心筋細胞が心筋細胞に成熟すること（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟）を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞を含む細胞集団を、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子（例えばｍＴＯＲインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、またはＡｋｔインヒビター）と接触させる。いくつかの態様では、幹細胞に由来する心筋細胞の成熟を増進するために、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路を操作する（例えば阻害する）。
本開示は、未熟心筋細胞が心筋細胞に分化及び／または成熟することを促す（例えば単独で、または別の心筋細胞成熟因子（例えばｐ５３上方制御因子）と組み合わせて）、あらゆるｍＴＯＲインヒビターの使用を企図する。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲは、ｍＴＯＲＣ１及び／またはｍＴＯＲＣ２を含む。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、ｍＴＯＲＣ１及び／またはｍＴＯＲＣ２のインヒビターである。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、４Ｅ－ＢＰ１のリン酸化を阻害する。４Ｅ－ＢＰ１のリン酸化を阻害すると、酸化的リン酸化経路の制御に影響が及び得る。４Ｅ－ＢＰ１のリン酸化を阻害すると、ｐ２１が分解され、それにより、ｐ５３が上方制御され得る。酸化的リン酸化経路のモジュレーターの非限定的な例には、４ＥＧＩ－１、ＪＲ－ＡＢ２－０１１（ｍＴＯＲＣ２インヒビター）、ＡＩＣＡＲ（ＡＭＰＫアクチベーター）、メトホルミン（ＡＭＰＫアクチベーター及びｍＴＯＲＣ１／２インヒビター）、及びＨＬＭ００６４７４（Ｅ２Ｆインヒビター）が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、４Ｅ－ＢＰ１及びリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化を阻害する。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、Ｔｏｒｉｎ１、Ｔｏｒｉｎ２、ラパマイシン、エベロリムス、及び／またはテムシロリムスを含む。特定の実施形態では、未熟心筋細胞を含む細胞集団をＴｏｒｉｎ１と接触させて、集団中の少なくとも１つの未熟心筋細胞が心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）に成熟することを誘導する。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞を含む細胞集団をＴｏｒｉｎ２と接触させて、集団中の少なくとも１つの未熟心筋細胞が心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）に成熟することを誘導する。
いくつかの実施形態では、接触は、１つ以上の心筋細胞成熟因子を含む培養培地で、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を維持することによって行われ得る。いくつかの実施形態では、接触は、１つ以上の心筋細胞成熟因子を含む二次元（２Ｄ）培養培地で、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を維持することによって行われる。他の実施形態では、接触は、１つ以上の心筋細胞成熟因子を含む三次元（３Ｄ）培養培地で、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を維持することによって行われる。いくつかの態様では、１つ以上の心筋細胞成熟因子は、パルス処置により培養培地（例えば２Ｄまたは３Ｄ培養培地）に適用される。いくつかの実施形態では、パルス処置は、１～２４時間、５～１８時間、または１０～１２時間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、パルス処置は、１時間以上にわたって行われる。いくつかの実施形態では、パルス処置は、２４時間以下にわたって行われる。いくつかの実施形態では、パルス処置は、１～５日間または２～３日間にわたって行われる。一実施形態では、パルス処置は、既定の時間で既定の期間にわたって２～３日間行われ、それにより、概日周期が模倣される。いくつかの態様では、１つ以上の心筋細胞成熟因子は、連続処置によって培養培地（例えば２Ｄまたは３Ｄ培養培地）に適用される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞は、遺伝子エンジニアリングされ得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞は、本書で開示される１つ以上の心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）のマーカーを発現するように、例えば、ＴＮＮＩ３、ＫＣＮＪ２、ＲＥＳＴ／ＮＲＳＦ、Ｒｙｒ、及びＳＣＮ５ａから選択される少なくとも１つのポリペプチド、またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列、またはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントを発現するように、遺伝子エンジニアリングされ得る。
未熟心筋細胞またはその前駆細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で維持される場合、従来の組織培養条件及び方法を使用することができ、これらは当業者には公知である。様々な細胞の単離及び培養の方法は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
本開示の方法では、少なくとも１つの心筋細胞またはその前駆細胞は、概して、標準的な温度条件、ｐＨ、及び他の環境条件下で、例えば組織培養プレート中の接着細胞として、または５～１０％のＣＯ２を含む雰囲気中３７℃で三角フラスコにおける３Ｄ培養下で、培養することができる。細胞及び／または培養培地は、本書に記載されるような心筋細胞への変換を達成するために適切に改変される。
特定の例において、心筋細胞成熟因子は、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を少なくとも１つの心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）へと分化させるために、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を、本書に記載される有効量の心筋細胞成熟因子に曝露または接触させることにより、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞の分化を誘導するために使用され得る。いくつかの態様では、未熟心筋細胞を心筋細胞成熟因子に曝露または接触させることは、連続的に行われるか、または他の態様では、パルス処置によって行われる。
したがって、本書には、本書に記載される方法によって作製された細胞及び組成物が含まれる。心筋細胞成熟因子の正確な量及び種類は、未熟心筋細胞またはその前駆細胞の数、所望の分化段階、及びそれまでに行われた分化段階の数に応じて異なり得る。
特定の例において、心筋細胞成熟因子は有効量で存在する。本書で使用される場合、「有効量」とは、未熟心筋細胞またはその前駆細胞の集団中の細胞の少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％が心筋細胞に分化するために存在すべき化合物の量を指す。
さらなる例において、心筋細胞成熟因子は、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞の培養培地に存在してもよいし、あるいは、心筋細胞成熟因子は、成長のある段階において少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞に添加されてもよい。
いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞が拍動を開始した後に、未熟心筋細胞を心筋細胞成熟因子（例えばｍＴＯＲインヒビター及び／またはｐ５３上方制御因子）と接触させる。いくつかの態様では、未熟心筋細胞は、心筋細胞成熟因子と接触させる前に、１～５日間、１～４日間、１～３日間、１～２日間、１日間、２日間、３日間、４日間、または５日間にわたって拍動している。いくつかの態様では、未熟心筋細胞は、心筋細胞成熟因子と接触させる前に、１～４０日間、２～３５日間、３～３０日間、４～２５日間、５～２０日間、７～３５日間、１４～３０日間、または２１～２８日間にわたって拍動している。いくつかの態様では、未熟心筋細胞が拍動を開始していなければ、未熟心筋細胞を心筋細胞成熟因子（例えばｍＴＯＲインヒビター及び／またはｐ５３上方制御因子）と接触させない。
いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞がトロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）及びミオシン重鎖６（ＭＹＨ６）を発現し始めた後に、未熟心筋細胞を心筋細胞成熟因子（例えばｍＴＯＲインヒビター及び／またはｐ５３上方制御因子）と接触させる。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞がトロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ３）、ミオシン重鎖６（ＭＹＨ６）、及びミオシン重鎖７（ＭＹＨ７）を発現し始めた後に、未熟心筋細胞を心筋細胞成熟因子（例えばｍＴＯＲインヒビター及び／またはｐ５３上方制御因子）と接触させる。
少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で維持される場合、従来の組織培養条件及び方法を使用することができ、これらは当業者には公知である。様々な細胞の単離及び培養の方法は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
いくつかの態様では、分化プロトコルの０日目に、多能性幹細胞をＲＰＭＩ＋Ｂ２７で培養し、ＧＳＫ３インヒビター／ＷＮＴアクチベーター（例えばＣＨＩＲ９９０２１）と接触させる。プロトコルの２日目に、ＷＮＴアクチベーター（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を除去する。プロトコルの３日目にＷＮＴインヒビター（例えばＩＷＰ４）を添加し、５日目にＷＮＴインヒビター（例えばＩＷＰ４）を除去する。７日目にインスリンを培養物に添加し、２～３日ごとに培地を交換する。１１日目にｍＴＯＲインヒビター（例えばＴｏｒｉｎ１）を添加し、１８日目まで培養下に維持する。分化プロトコルの完了時に、成熟した心筋細胞が培養培地から取得される。
いくつかの態様では、分化プロトコルの０日目から２日目に、多能性幹細胞をＲＰＭＩ＋Ｂ２７で培養し、ＧＳＫ３インヒビター／ＷＮＴアクチベーター（例えばＣＨＩＲ９９０２１）と接触させる。プロトコルの２日目から４日目に、ＷＮＴインヒビター（例えばＩＷＰ４）を添加する。７日目にインスリンを培養物に添加し、２～３日ごとに培地を交換する。拍動が起こったら、拍動発生からおよそ２日後に開始して７日間、Ｔｏｒｉｎ１で心筋細胞を処置した。代替的な態様では、拍動が起こったら、拍動発生からおよそ２日後に開始して５日間、Ｔｏｒｉｎ１ではない心筋細胞成熟因子（例えばｎｕｔｌｉｎ－３ａ及び／またはケルセチン）で心筋細胞を処置した。処置が完了したら、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７／インスリンに戻し、２～３日ごとに培地を交換して維持した。分化プロトコルの完了時に、成熟した心筋細胞が培養培地から取得される。
いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞またはその前駆細胞から心筋細胞を取得するための分化プロトコルは、二次元培養系で行われる。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞またはその前駆細胞から心筋細胞を取得するための分化プロトコルは、三次元培養系で（例えば、３Ｄバイオリアクターシステムを使用して）行われる。
本開示の諸態様には、内因性の成熟した心筋細胞と形態及び機能が類似するにもかかわらず天然の心筋細胞とは異なる心筋細胞を生成することが関わる。いくつかの実施形態では、心筋細胞の形態は、内因性心筋細胞の形態に類似する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は休止している。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、休止マーカー（例えばｐ１６、ｐ５３、及びｐ１３０）の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、増殖マーカー（例えばサイクリンＣ１、Ｅ２Ｆ１、及びＫｉ６７）の発現減少を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、インヒビターＥ２Ｆ因子（例えばＥ２Ｆ３ｂ－８）の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、刺激性Ｅ２Ｆ因子（例えばＥ２Ｆ１－３ａ）の発現減少を呈する。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は成熟している。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、サルコメアタンパク質（例えばＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＭＹＨ６、及び／またはＭＹＨ７）の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、胎児心筋細胞または未熟心筋細胞と比較して、減少した拍動速度を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、イオンチャネル（例えばＫＣＮＪ２、ＨＣＮ４、ＳＣＮ５ａ、ＲＹＲ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、及び／またはＳＥＲＣＡ２ａ（ＡＴＰ２ａ２））の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、脳ナトリウム利尿ペプチドの発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、核転写因子（例えばＲＥＳＴ／ＮＲＳＦ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ２０、ＢＲＧ１、ＹＡＰ、ＥＲＢＢ２、ＰＩＴＸ２、ＭＥＩＳ１、ＡＴＡ４、Ｎｋｘ２－５、ＴＢＸ５、ＮＦＡＴ、ＴＥＡＤ、ＨＡＮＤ、ＣＨＦ１、ＦｏｘＯ３／ＦｏｘＯ４、ＣＨＦ１／Ｈｅｙ２、ＣＨＦ１／Ｈｅｙ２、ＦｏｘＯ１、Ｍｅｆ２Ｃ、ＳＲＦ、ｐ５３、ＮＦｋＢ、及びそれらの組み合わせ）の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、酸化的リン酸化経路制御因子（例えばＰＧＣ１－α）の発現増加を呈する。
本開示の方法を使用した少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞の変換または成熟による心筋細胞の生成には、複数の利点がある。まず、本開示の方法により、個体に特異的であり、個体と遺伝的に適合する細胞である自家心筋細胞を生成することができる。概して、自家細胞は、免疫拒絶反応の対象となる可能性が非自家細胞よりも低い。これらの細胞は、例えば、個体の体細胞（例えば線維芽細胞）を人工多能性状態に再プログラムし、次いで多能性細胞を培養して、多能性細胞の少なくとも一部を少なくとも１つの未熟心筋細胞または前駆細胞に分化させた後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも１つの未熟心筋細胞が心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）に成熟することを誘導することによって取得された心臓始原細胞など、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞に由来する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞の取得源となる対象は、ヒト対象などの哺乳動物対象である。いくつかの実施形態では、対象は、心臓障害を患っている。いくつかの実施形態では、対象は、慢性心不全を患っている。いくつかの実施形態では、対象は、心室性不整脈を患っている。そのような実施形態では、対象の心臓障害（例えば心不全）を処置する方法において、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を、本書に記載される方法によってｅｘ ｖｉｖｏで心筋細胞に分化させ、次いで、細胞の採取源となった対象に投与することができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞は、対象内に（ｉｎ ｖｉｖｏで）存在し、本書で開示される方法によってｉｎ ｖｉｖｏで心筋細胞になるように変換される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を心筋細胞にｉｎ ｖｉｖｏで変換することは、本書に記載される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそれ以上の心筋細胞成熟因子を含む組成物を対象に投与することによって達成され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を心筋細胞にｉｎ ｖｉｖｏで変換することは、本書に記載される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの心筋細胞成熟因子を含む組成物を対象に投与することによって達成され得る。
心筋細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、成熟した心筋細胞を提供する。本書で開示される心筋細胞は、天然の心筋細胞の多くの顕著な特徴を共有するが、特定の態様（例えば遺伝子発現プロファイル）において異なる。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、非天然または非自然発生のものである。本書で使用される場合、「非天然」または「非自然発生」とは、心筋細胞が、特定の態様において、天然に存在する心筋細胞、すなわち天然心筋細胞と著しく異なることを意味する。しかし、これらの顕著な差異は、典型的には、心筋細胞が特定の機能的差異を呈する結果となり得る構造的特徴に関連していることを理解されたい。例えば、心筋細胞の遺伝子発現パターンが天然心筋細胞とは異なっても、心筋細胞は天然心筋細胞と同様の様式で挙動するが、特定の機能は天然心筋細胞と比較して変化（例えば向上）している場合がある。
本開示の心筋細胞は、正常な心筋細胞の機能にとって重要である天然心筋細胞の独特の特徴の多くを共有する。成熟した心筋細胞の特徴は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ． ２０１４；１１４（３）：５１１－２３に記載されている。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は休止している。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、休止状態で代謝活性及び転写活性を保持する。いくつかの実施形態では、休止状態は、心筋細胞の成熟を容易にする。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ｐ１６、ｐ５３、及びｐ１３０を含む特定の休止マーカーを発現するか、または上昇したレベルで（すなわち、コントロールと比較して）発現する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、Ｋｉ６７、サイクリンＣ１、及びＥ２Ｆ１などの増殖マーカーを発現しないか、または低減したレベルで（すなわち、コントロールと比較して）発現する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、阻害性Ｅ２Ｆ因子（例えばＥ２Ｆ３ｂ、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５、Ｅ２Ｆ６、Ｅ２Ｆ７、及びＥ２Ｆ８）の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、刺激性Ｅ２Ｆ因子（例えばＥ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、及びＥ２Ｆ３）の発現減少を呈する。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、電気的に成熟した心筋細胞である。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、減少した自動性を呈する。天然の成熟した成人の心筋細胞は、自然に毎分２０～３０回拍動する。いくつかの態様では、本書に記載される心筋細胞は、より遅い固有拍動速度を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、毎分１５～３５回、毎分１５～２０回、または毎分３０～３５回拍動する。特定の実施形態では、心筋細胞は、毎分４０拍未満の自発拍動速度を呈する。より遅い固有拍動速度は、減少した自動性を示唆する可能性があり、減少した自動性を有する（すなわち、自発的に拍動する原動力が減少している）心筋細胞は、細胞療法における不整脈のリスクを減少させ得る。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、収縮性の成熟した心筋細胞である。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、収縮タンパク質（例えばサルコメア収縮タンパク質）のＲＮＡ及びタンパク質発現の増加を呈する（すなわち、未熟心筋細胞と比較した場合）。いくつかの態様では、心筋細胞は、心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）、心筋トロポニンＩ（ＴＮＮＩ３）、ミオシン重鎖タンパク質６（ＭＹＨ６）、及びミオシン重鎖タンパク質７（ＭＹＨ７）のうちの少なくとも１つのＲＮＡ及びタンパク質発現の増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、用量依存的様式で（例えば、未熟心筋細胞をｍＴＯＲインヒビターで処置した際に）タンパク質のＲＮＡ発現の増加を呈する。１つ以上のサルコメアタンパク質の発現増加は、心筋細胞の収縮性を増進し得る。いくつかの態様では、心筋細胞は、ＴＮＮＩ３の全体的な含有量または量の増加を呈し、いくつかの態様では、遅骨格型のＴＮＮＩ３に対するＴＮＮＩ３の含有量または量の増加を呈する。いくつかの態様では、心筋細胞は、ＭＹＨ６含有量またはタンパク質に対するＭＹＨ７含有量またはタンパク質の増加を呈する（例えば、ヒトにおいて）。いくつかの実施形態では、心筋細胞におけるＴＮＮＩ３発現は、未熟心筋細胞と比較して、ほぼ５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、または１５倍増加する。いくつかの態様では、心筋細胞の収縮性は、細胞の運動を測定することによって（例えば、１つ以上のイメージング法を使用して）測定され得る。収縮性を定量化するためには、心筋細胞の収縮に伴って曲がる軟質基質が、１つ以上のイメージング法と併せて使用され得る。いくつかの態様では、心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、増加した収縮性を有する。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、代謝的に成熟した心筋細胞である。いくつかの態様では、心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、増加した代謝活性を有する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、未熟心筋細胞と比較して、増加した酸素消費速度及び／または細胞外酸性化速度を有する。代謝的成熟は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ｍｉｔｏストレス代謝アッセイ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して定量化され得る。このアッセイは、ミトコンドリア機能に影響を与える１つ以上の化合物（例えば小分子化合物）に応答した酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を測定するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、内因性の成熟した心筋細胞の形態に類似する形態を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、桿状細胞を形成する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、組織化されたサルコメア構造を呈する。いくつかの態様では、平均サルコメア長は、１．０～４．０μｍ、１．５～３．５μｍ、または２．０～３．０μｍである。いくつかの態様では、平均サルコメア長は、約１．５μｍ、１．６μｍ、１．７μｍ、１．８μｍ、１．９μｍ、２．０μｍ、２．１μｍ、２．２μｍ、２．３μｍ、２．４μｍ、２．５μｍ、２．６μｍ、２．７μｍ、２．８μｍ、２．９μｍ、または３．０μｍである。
いくつかの態様では、心筋細胞は、成熟したイオンチャネル発現プロファイルを呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、増加したイオンチャネル発現を呈する（すなわち、未熟心筋細胞と比較して）。イオンチャネル発現は、ＫＣＮＪ２、ＨＣＮ４、ＳＣＮ５ａ、ＲＹＲ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、またはＳＥＲＣＡ２ａ（ＡＴＰ２ａ２）のうちの１つ以上について増加し得る。いくつかの態様では、心筋細胞におけるＫＣＮＪ２発現は、用量依存的様式で（例えば、２Ｄまたは３Ｄ培養において未熟心筋細胞を１つ以上の心筋細胞成熟因子で処置した際に）増加する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ＳＣＮ５ａ、ＫＣＮＪ２、及びＲＹＲ２の発現増加を呈する（すなわち、未熟心筋細胞と比較して）。いくつかの実施形態では、心筋細胞の静止膜電位は、－７０～－１５０ｍＶ、－７５～－１２５ｍＶ、－８０～－１００ｍＶ、または－８５～－９５ｍＶの範囲内である。いくつかの実施形態では、心筋細胞の静止膜電位は、約－８５ｍＶ、－８６ｍＶ、－８７ｍＶ、－８８ｍＶ、－８９ｍＶ、－９０ｍＶ、－９１ｍＶ、－９２ｍＶ、－９３ｍＶ、－９４ｍＶ、または－９５ｍＶである。特定の実施形態では、心筋細胞の静止膜電位は、－７０ｍＶ未満かそれと等しい。いくつかの実施形態では、心筋細胞のアップストローク速度は、１５０～３５０Ｖ／秒、１７５～３２５Ｖ／秒、２００～３００Ｖ／秒、または２２５～２７５Ｖ／秒の範囲内である。いくつかの実施形態では、心筋細胞のアップストローク速度は、約２００Ｖ／秒、２１０Ｖ／秒、２２０Ｖ／秒、２３０Ｖ／秒、２４０Ｖ／秒、２５０Ｖ／秒、２６０Ｖ／秒、２７０Ｖ／秒、２８０Ｖ／秒、２９０Ｖ／秒、または３００Ｖ／秒である。特定の実施形態では、心筋細胞のアップストローク速度は２００Ｖ／秒を超え、例えば約２５０Ｖ／秒である。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、転写因子（例えば核転写因子）の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、１つ以上の転写因子の発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ニューロン限定サイレンサー因子としても知られる核転写因子リプレッサーエレメント１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）の発現増加を呈する（すなわち、未熟心筋細胞と比較した場合）。いくつかの態様では、ＲＥＳＴの発現は、ＨＣＮ４の発現を抑制する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、用量依存的様式で（例えば、２Ｄまたは３Ｄ培養において未熟心筋細胞を１つ以上の心筋細胞成熟因子で処置した際に）ＲＥＳＴの発現増加を呈する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ＲＥＳＴ／ＮＲＳＦ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ２０、ＢＲＧ１、ＹＡＰ、ＥＲＢＢ２、ＰＩＴＸ２、ＭＥＩＳ１、ＡＴＡ４、Ｎｋｘ２－５、ＴＢＸ５、ＮＦＡＴ、ＴＥＡＤ、ＨＡＮＤ、ＣＨＦ１、ＦｏｘＯ３／ＦｏｘＯ４、ＣＨＦ１／Ｈｅｙ２、ＣＨＦ１／Ｈｅｙ２、ＦｏｘＯ１、Ｍｅｆ２Ｃ、ＳＲＦ、ｐ５３、ＮＦｋＢ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される転写因子の発現増加を呈する。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、酸化的リン酸化経路制御因子の発現増加を呈する（すなわち、未熟心筋細胞と比較した場合）。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、酸化的リン酸化経路制御因子ＰＧＣ１－α（ＰＰＡＲＧＣ１ａ）の発現増加を呈する。成熟した心筋細胞では、エネルギーの導出が解糖から酸化的リン酸化に切り替わる。ＰＧＣ１αの上方制御は、酸化的リン酸化に関連する経路を増進し得る。いくつかの実施形態では、代謝は主に、脂肪酸から、例えば脂肪酸のβ酸化から（例えば、解糖の代わりに）起こる。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の発現増加を呈する（すなわち、未熟心筋細胞と比較した場合）。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ナトリウム利尿ペプチドＢ（ＮＰＰＢ）の発現増加を呈する。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、増加したミトコンドリア含有量を呈する（すなわち、未熟心筋細胞と比較した場合）。例えば、心筋細胞では、ミトコンドリアの長さが増加し、ミトコンドリア膜電位が増加し得る。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアは、体積で心筋細胞の約５～７０％、１０～６０％、１５～５０％、または２０～４０％を占める。いくつかの態様では、ミトコンドリアは、結晶様格子パターンで心筋細胞全体に分布している。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、約０．１５～２．５メートル／秒、０．２～２．０メートル／秒、０．２５～１．５メートル／秒、または０．３～１．０メートル／秒の伝導速度を有する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０メートル／秒の伝導速度を有する。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ６、ＫＣＮＪ２、ＨＣＮ４、ＳＣＮ５ａ、ＲＹＲ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、ＳＥＲＣＡ２ａ（ＡＴＰ２ａ２）、ＮＰＰＢ（ＢＮＰ）、ＲＥＳＴ、及びＰＰＡＲＧＣ１ａ（ＰＧＣ１ａ）からなる群から選択される、内因性の成熟した心筋細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＫＣＮＪ２、ＲＥＳＴ、ＲｙＲ、及びＳＣＮ５ａからなる群から選択される、内因性の成熟した心筋細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。
本発明は、心筋細胞の由来となる出発細胞によって限定されることを意図していないため、心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで任意の出発細胞から分化する。例示的な出発細胞は、限定されるものではないが、未熟心筋細胞またはその任意の前駆細胞、例えば心臓始原細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及び人工多能性幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、再プログラムされた細胞、部分的に再プログラムされた細胞（すなわち、人工多能性細胞とその由来となった体細胞との間の中間状態で存在するように部分的に再プログラムされた線維芽細胞などの体細胞）、または分化転換細胞から分化する。いくつかの実施形態では、本書で開示される心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、未熟心筋細胞またはその前駆細胞から分化し得る。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、未熟心筋細胞、心臓始原細胞、及び多能性幹細胞からなる群から選択される前駆細胞から分化する。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、心筋細胞または心筋細胞の由来となる多能性幹細胞は、ヒトのものである。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、ヒトのものである。
いくつかの実施形態では、心筋細胞は、遺伝子修飾されていない。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、細胞の遺伝子修飾がない天然心筋細胞と共通する特徴を取得する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、遺伝子修飾されている。
いくつかの態様では、本開示は、本書に記載される心筋細胞を含む細胞株を提供する。いくつかの実施形態では、心筋細胞を凍結し、解凍し、継代することができる。心筋細胞は、有意な形態学的変化を伴わずに少なくとも５回継代することができる。
本開示の諸態様は、本書に記載される方法に従って生産された心筋細胞の単離集団に関する。いくつかの実施形態では、心筋細胞の集団は、本書に記載される少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と少なくとも１つの未熟心筋細胞を接触させることによって生産される。
本開示の諸態様には、本書に記載される細胞（例えば心筋細胞）の単離集団を含むマイクロカプセルが関わる。マイクロカプセルは当技術分野でよく知られている。マイクロカプセルの好適な例は、文献に記載されている（例えば、Ｏｒｉｖｅ ｅｔ ａｌ．， “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ （２０１３）， ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１３．０７．００９、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｅｌｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１０；６２：７１１－７３０、Ｍｕｒｕａ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｅｌｌ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｔｏｗａｒｄｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００８；１３２：７６－８３、及びＺａｎｉｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１２；１６０：３－１３）。マイクロカプセルは、種々の手段で製剤することができる。例示的なマイクロカプセルは、外側アルギン酸塩膜で覆われたポリカチオン層に包囲されたアルギン酸塩コアを含む。ポリカチオン膜は、安定性及び生体適合性を付与する半透膜を形成する。ポリカチオンの例は、限定されるものではないが、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン、キトサン、ラクトース修飾キトサン、及び光重合生体材料を含む。いくつかの実施形態では、アルギン酸塩コアは、例えば、ＲＧＤ配列（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）と共有結合したオリゴペプチドを有するアルギン酸塩コアを含む足場を生産するために修飾される。いくつかの実施形態では、アルギン酸塩コアは、例えば、増進した安定性を持つ化学酵素的にエンジニアリングされたアルギン酸塩を有する共有結合で強化されたマイクロカプセルを生産するために修飾される。いくつかの実施形態では、アルギン酸塩コアは、例えば、アクリレート官能化リン脂質のｉｎ－ｓｉｔｕ重合によって構築される膜模倣フィルムを生産するために修飾される。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、エピメラーゼを使用して酵素的に修飾されたアルギン酸塩から構成される。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、マイクロカプセル膜の隣接する層の間に共有結合を含む。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、フェノール部分と結合したアルギン酸塩を含むサブシーブサイズのカプセルを含む。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、アルギン酸塩アガロースを含む足場を含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、アルギン酸塩に封入される前にＰＥＧで修飾される。いくつかの実施形態では、心筋細胞などの細胞の単離集団は、光反応性リポソーム及びアルギン酸塩に封入される。マイクロカプセルに用いられるアルギン酸塩は、ＰＥＧ、キトサン、ＰＥＳ中空繊維、コラーゲン、ヒアルロン酸、デキストランとＲＧＤ、ＥＨＤ及びＰＥＧＤＡ、ＰＭＢＶ及びＰＶＡ、ＰＧＳＡＳ、アガロース、アガロースとゼラチン、ＰＬＧＡ、ならびにこれらの多層実施形態を含むがこれらに限定されない、他の好適な生体材料で置き換えられ得ることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、本書に記載される方法に従って生産された心筋細胞の集団を含む組成物は、機械的デバイスの機能的構成要素として使用することもできる。例えば、デバイスには、細胞集団の通過を防止し、それらをデバイス内に保持する半透膜の後ろに、心筋細胞の集団（例えば、未熟心筋細胞またはその前駆細胞の集団から生産されたもの）が含まれ得る。デバイスの他の例としては、心臓患者への埋め込み用、または体外療法用に企図されるものが挙げられる。
本開示の諸態様には、本書に記載される心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）の単離集団を含むアッセイが関わる。いくつかの実施形態では、アッセイは、成熟した心筋細胞の運命を促進または阻害する１つ以上の候補薬剤を識別するために使用され得る。いくつかの実施形態では、アッセイは、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞から心筋細胞への分化を促進する１つ以上の候補薬剤を識別するために使用され得る。いくつかの実施形態では、アッセイは、老化状態にある未熟心筋細胞から休止状態にある成熟した心筋細胞への移行を促進する１つ以上の候補薬剤を識別するために使用され得る。
本開示は、疾患（例えば、心不全、または心臓関連障害）を患っている個体から抽出または単離された細胞に由来するｉＰＳ細胞から、本書に記載される方法に従って心筋細胞が生成され、これらの心筋細胞が、疾患を有しない健康な個体の正常な心筋細胞と比較して、疾患の（例えば後成的及び／または遺伝的な）マーカーとして有用であり得る、当該心筋細胞と正常心筋細胞との間の差異が識別される方法を企図する。いくつかの実施形態では、心筋細胞が、心不全を患っている個体から取得され、正常な心筋細胞と比較され、次いで、心筋細胞がｉＰＳ細胞に再プログラムされ、ｉＰＳ細胞が、心不全を患っている個体から取得された心筋細胞には存在するが正常な心筋細胞には存在しない遺伝的及び／または後成的マーカーについて分析されて、マーカーが識別される（例えば、心不全前）。いくつかの実施形態では、患者に由来するｉＰＳ細胞及び／または心筋細胞は、薬剤（例えば、心不全表現型に寄与する遺伝子を調節することができる薬剤）をスクリーニングするために使用される。
心筋細胞の存在の確認及び識別
老化心筋細胞の存在と比較した休止心筋細胞の存在を確認するためには、当業者にとって一般的な任意の手段を使用することができる。本書に記載される少なくとも１つの心筋細胞成熟因子への曝露による少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞の分化によって生産された、成熟した心筋細胞などの心筋細胞の存在を確認するためには、当業者にとって一般的な任意の手段を使用することができる。
いくつかの実施形態では、休止マーカーの存在は、休止状態を示す１つ以上のマーカーの存在または非存在を検出することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、当該方法は、休止マーカーｐ１６、ｐ５３、及び／またはｐ１３０の陽性発現を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、増殖マーカーＫｉ６７、サイクリンＣ１、及び／またはＥ２Ｆの陰性発現を検出することを含み得る。
いくつかの実施形態では、心筋細胞マーカー、例えば化学的に誘導された心筋細胞の存在は、内因性心筋細胞を示す１つ以上のマーカーの存在または非存在を検出することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、当該方法は、心筋細胞のマーカーの陽性発現（例えば存在）を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、１つ以上のサルコメアタンパク質（例えば、心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）、心筋トロポニンＩ（ＴＮＮＩ３）、ミオシン重鎖タンパク質６（ＭＹＨ６）及びミオシン重鎖タンパク質７（ＭＹＨ７））の陽性発現を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、１つ以上のイオンチャネル（例えばＫＣＮＪ２、ＨＣＮ４、ＳＣＮ５ａ、ＲＹＲ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、及びＳＥＲＣＡ２ａ（ＡＴＰ２ａ２））の陽性発現を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の陽性発現を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、１つ以上の転写因子（例えばＲＥＳＴ）の陽性発現を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、１つ以上の酸化的リン酸化経路制御因子（例えばＰＧＣ１－α（ＰＰＡＲＧＣ１ａ））の陽性発現を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、マーカーは、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３及び／またはＫＣＮＪ２の検出用試薬などの試薬を使用して検出され得る。一態様では、本書における心筋細胞は、ＴＮＮＩ３及びＫＣＮＪ２を発現し、未熟心筋細胞を示す他のマーカーを有意なレベルで発現しない。一態様では、本書における心筋細胞は、ＴＮＮＴ２及びＫＣＮＪ２を発現し、未熟心筋細胞を示す他のマーカーを有意なレベルで発現しない。心筋細胞は、特定のマーカーの下方制御によって特徴付けられることもある。例えば、心筋細胞は、ＨＣＮ４の統計的に有意な下方制御によって特徴付けられることがある。
マーカーのための試薬は、例えば、マーカーに対する抗体、または、ＲＴ－ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応、例えば半定量的もしくは定量的なＲＴ－ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応のためのプライマーであり得る。このようなマーカーは、心筋細胞が生産されたかどうかを評価するために使用できる。抗体または他の検出試薬は、検出に使用するための標識、例えば放射線標識、蛍光標識（例えばＧＦＰ）または比色標識に結合させることができる。検出試薬がプライマーである場合、それは例えば凍結乾燥された乾燥調製物として、または溶液として供給され得る。
少なくとも１つの未熟心筋細胞の老化状態から休止状態への進行は、休止心筋細胞に特徴的なマーカーの発現を判定することによってモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、特定のマーカーの発現は、マーカーの存在または非存在を検出することによって判定される。あるいは、特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物または細胞集団の細胞に存在するレベルを測定することによって判定され得る。特定のプロセスでは、休止心筋細胞に特徴的なマーカーの発現と、それの由来となった老化心筋細胞に特徴的なマーカーの有意な発現の欠如とが判定される。
少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞から心筋細胞への進行は、成熟した心筋細胞に特徴的なマーカーの発現を判定することによってモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、特定のマーカーの発現は、マーカーの存在または非存在を検出することによって判定される。あるいは、特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物または細胞集団の細胞に存在するレベルを測定することによって判定され得る。特定のプロセスでは、成熟した心筋細胞に特徴的なマーカーの発現と、それの由来となった未熟心筋細胞またはその前駆細胞に特徴的なマーカーの有意な発現の欠如とが判定される。
未熟心筋細胞からの心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）の生産のモニタリングに関連して記載したように、当業者には一般的に知られている方法を使用してマーカー発現を測定するために、ブロット転写法及び免疫細胞化学などの定性的または半定量的な技法を使用することができる。あるいは、マーカー発現は、当技術分野でよく知られている方法による定量的ＰＣＲなどの技法を使用することにより、正確に定量することができる。さらに、細胞外マーカー含有量を測定するための技法、例えばＥＬＩＳＡを利用してもよい。
本発明は、心筋細胞マーカーとして本書に列挙されるマーカーに限定されず、本発明には、細胞表面マーカーなどのマーカー、抗原、ならびにＥＳＴ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを含む）、ＤＮＡ（遺伝子及びｃＤＮＡを含む）、及びそれらの一部分を含む他の遺伝子産物も包含されると理解される。
心筋細胞の濃縮、単離、及び精製
本発明の別の態様は、成熟した心筋細胞と、成熟した心筋細胞の由来となった未熟心筋細胞またはその前駆細胞とを含む混合細胞集団のような、不均質の細胞集団からの心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）の集団の単離に関する。いくつかの態様では、休止心筋細胞の集団は、老化心筋細胞及び休止心筋細胞を含む混合細胞集団などの不均質の細胞集団から単離される。上述のプロセスのいずれかによって生産された心筋細胞の集団は、その由来となった未熟心筋細胞またはその前駆細胞には存在しない、心筋細胞に存在する任意の細胞表面マーカーを使用することによって、濃縮、単離及び／または精製され得る。このような細胞表面マーカーは、心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）に特異的なアフィニティータグともいう。心筋細胞に特異的なアフィニティータグの例は、心筋細胞の細胞表面には存在するが、他の細胞型（例えば未熟心筋細胞）には実質的に存在しない、ポリペプチドなどのマーカー分子に特異的な抗体、リガンド、または他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、心筋細胞の細胞表面抗原に結合する抗体が、本書に記載される方法によって生産された、化学的に誘導された（例えば、本書に記載される少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させることによって化学的に誘導された）心筋細胞の濃縮、単離または精製のためのアフィニティータグとして使用される。そのような抗体は公知であり、市販されている。
当業者であれば、心筋細胞の濃縮、単離及び／または精製のために抗体を使用するプロセスを容易に理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、心筋細胞を含む細胞集団と共に抗体などの試薬をインキュベートし、この細胞集団は、細胞間接着及び基質接着を低減させるために処置されたものである。次いで、細胞集団を洗浄し、遠心分離し、再懸濁する。いくつかの実施形態では、抗体が標識で既に標識されていなければ、細胞懸濁液を、一次抗体に結合することができるＦＩＴＣ共役抗体などの二次抗体と共にインキュベートする。次いで、心筋細胞を洗浄し、遠心分離し、バッファーに再懸濁する。次に、心筋細胞懸濁液を分析し、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して選別する。抗体に結合した蛍光性の再プログラム細胞を未結合の非蛍光性細胞とは別に収集することにより、細胞懸濁液に存在する他の細胞、例えば未熟心筋細胞またはその前駆細胞から、心筋細胞が単離される。
本書に記載されるプロセスの別の実施形態では、心筋細胞を含む単離細胞組成物は、代替的な親和性ベースの方法を使用することによって、または心筋細胞に特異的な同じもしくは異なるマーカーを使用するさらなるラウンドの選別によって、さらに精製することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳ選別を使用して、ＴＮＮＴ２を単独で、もしくはＫＣＮＪ２の発現と共に発現するか、あるいは本書で開示される心筋細胞マーカーと共に発現する心筋細胞を、細胞集団におけるこれらのマーカーのうちの１つを発現しない細胞（例えば陰性細胞）から最初に単離する。いくつかの態様では、ＴＮＮＩ３及び／またはＭＹＨ７も、ＦＡＣＳ選別用のマーカーとして、単独で、あるいはＴＮＮＴ２及び／またはＫＣＮＪ２と組み合わせて使用される。第２のＦＡＣＳ選別、例えば、ＦＡＣＳを使用して陽性細胞を再度選別して、第１の選別とは異なるマーカーに対して陽性である細胞を単離することにより、細胞集団における再プログラムされた細胞が濃縮される。
代替的な実施形態では、ほとんどの未熟心筋細胞には存在するが心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）には存在しないマーカーについて陰性選別することによって細胞を分離するために、ＦＡＣＳ選別が使用される。
本書に記載されるプロセスのいくつかの実施形態では、心筋細胞は、抗体を使用せずに蛍光標識され、その後、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用することによって非標識細胞から単離される。そのような実施形態では、上述の方法を使用して再プログラムされた細胞を標識するために、ＧＦＰ、ＹＦＰをコードする核酸、またはルシフェラーゼをコードする遺伝子などの発現可能な蛍光マーカー遺伝子をコードする別の核酸が使用される。
ここで説明した手順に加えて、化学的に誘導された心筋細胞は、他の細胞単離技法によっても単離され得る。さらに、心筋細胞は、心筋細胞の選択的生存または選択的増大を促進する成長条件での連続継代培養の方法によって濃縮または単離することもできる。このような方法は、当業者にとって公知である。
本書に記載される方法を使用すると、濃縮、単離及び／または精製された心筋細胞集団を、未熟心筋細胞またはその前駆細胞（本書に記載される方法によって多能性幹細胞から分化させたもの）からｉｎ ｖｉｔｒｏで生産することができる。いくつかの実施形態では、好ましい濃縮、単離及び／または精製の方法は、ヒト多能性幹細胞またはヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から分化したヒトの未熟心筋細胞またはその前駆細胞からの、ヒト心筋細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生産に関する。そのような実施形態では、心筋細胞が、以前にｉＰＳ細胞から導出された未熟心筋細胞から分化する場合、心筋細胞は、ｉＰＳ細胞を生成するための細胞の取得源となった対象にとって自家であり得る。
本書に記載される方法を使用すると、心筋細胞の単離細胞集団は、未熟心筋細胞または前駆細胞集団の化学的誘導前の細胞集団と比較して、心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）の含有量が少なくとも約１倍から約１０００倍濃縮される。いくつかの実施形態では、心筋細胞の集団は、未熟心筋細胞または前駆細胞集団の化学的誘導前の細胞集団と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上誘導されるか、増進するか、濃縮されるか、または増加する。
心筋細胞を含む組成物
本発明のいくつかの実施形態は、心筋細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物であって、心筋細胞が少なくとも１つの未熟心筋細胞から導出されたものである、細胞組成物に関する。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、未熟心筋細胞を含む。
いくつかの実施形態では、細胞組成物は、休止心筋細胞を含み、休止心筋細胞は、少なくとも１つの老化心筋細胞から導出されたものである。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、老化心筋細胞を含む。
特定の実施形態によれば、化学的に誘導された心筋細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、そのような心筋細胞はヒト心筋細胞である。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞は、多能性幹細胞（例えばヒト多能性幹細胞）から導出されたものである。
いくつかの実施形態では、細胞組成物は、成熟した心筋細胞を含み、成熟した心筋細胞は、本書に記載される方法を使用して少なくとも１つの未熟心筋細胞から導出されたものである。例えば、細胞組成物は、未熟心筋細胞を１つ以上の心筋細胞成熟因子と接触させた、２Ｄまたは３Ｄ培養における未熟心筋細胞の培養から取得された、成熟した心筋細胞を含む。
本発明の他の実施形態は、本書で開示される方法によって生産された心筋細胞を含む単離細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。そのような実施形態では、心筋細胞は、心筋細胞集団中の総細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満を構成する。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞集団中の総細胞の約９０％超を構成する心筋細胞の集団を含み、例えば、細胞集団中の総細胞の少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％が心筋細胞である。
本発明の特定の他の実施形態は、心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）と、心筋細胞の由来となった未熟心筋細胞またはその前駆細胞との組み合わせを含む、単離細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。いくつかの実施形態では、心筋細胞の由来となる未熟心筋細胞は、単離細胞集団または培養物中の総細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満を構成する。
本発明のさらなる実施形態は、本書に記載されるプロセスによって生産され、大部分の細胞型として化学的に誘導された心筋細胞を含む、単離細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。いくつかの実施形態では、本書に記載される方法及びプロセスは、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％、または少なくとも約５０％の心筋細胞を含む、単離細胞培養物及び／または細胞集団を生産する。
別の実施形態では、単離細胞集団または細胞の組成物（または細胞培養物）は、ヒト心筋細胞を含む。他の実施形態では、本書に記載される方法及びプロセスは、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、または少なくとも約１％の心筋細胞を含む単離細胞集団を生産することができる。好ましい実施形態では、単離細胞集団はヒト心筋細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の心筋細胞のパーセンテージは、培養物中に残存するフィーダー細胞に関係なく計算される。
本発明のさらに他の実施形態は、心筋細胞と、その分化源または成熟源となった未熟心筋細胞またはその前駆細胞との混合物を含む、単離細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。例えば、約９５個の未熟心筋細胞またはその前駆細胞ごとに少なくとも約５個の心筋細胞を含む細胞培養物または細胞集団が生産され得る。他の実施形態では、約５個の未熟心筋細胞またはその前駆細胞ごとに少なくとも約９５個の心筋細胞を含む細胞培養物または細胞集団が生産され得る。さらに、未熟心筋細胞またはその前駆細胞に対する他の比率の心筋細胞を含む細胞培養物または細胞集団が企図される。例えば、約１，０００，０００個、または少なくとも１００，０００個、または少なくとも１０，０００個、または少なくとも１０００個、または５００個、または少なくとも２５０個、または少なくとも１００個、または少なくとも１０個の未熟心筋細胞またはその前駆細胞ごとに、少なくとも約１個の心筋細胞を含む組成物が生産され得る。
本発明のさらなる実施形態は、内因性心筋細胞の少なくとも１つの特徴を示すヒト心筋細胞などのヒト細胞を含む、細胞培養物または細胞集団などの組成物に関する。
本発明の好ましい実施形態では、心筋細胞の細胞培養物及び／または細胞集団は、非組換え細胞であるヒト心筋細胞を含む。そのような実施形態では、細胞培養物及び／または細胞集団は、組換えヒト心筋細胞を全く含まないか、または実質的に含まない。
心筋細胞成熟因子
本開示の諸態様には、例えば、未熟心筋細胞の成熟またはその前駆細胞から心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）への分化を誘導するために、未熟心筋細胞またはその前駆細胞を心筋細胞成熟因子と接触させることが関わる。「心筋細胞成熟因子」という用語は、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞から心筋細胞への変換を促進する、またはそれに寄与する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、例えば、本書に記載される方法に従って、多能性細胞（例えばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣ）から未熟心筋細胞への分化を誘導する。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、例えば、本書に記載される方法に従って、未熟心筋細胞から心筋細胞への成熟を誘導する。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、休止心筋細胞に移行するように老化心筋細胞を誘導する。
概して、本書に記載される少なくとも１つの心筋細胞成熟因子は、本書で開示される方法に従って心筋細胞を生成するために、単独で、または他の心筋細胞成熟因子と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、本書に記載される、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、または少なくとも１０種の心筋細胞成熟因子が、心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）を生成する方法において使用される。
いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のモジュレーター（例えばインヒビター）を含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ｍＴＯＲ経路のインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ＰＩ３Ｋ及び／またはＡｋｔのインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、小分子、核酸、アミノ酸、代謝産物、ポリペプチド、抗体及び抗体様分子、アプタマー、大環状分子、または他の分子を含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、Ｔｏｒｉｎ１、Ｔｏｒｉｎ２、ラパマイシン、エベロリムス、及びテムシロリムスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、Ｔｏｒｉｎ１である。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、Ｔｏｒｉｎ２である。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ラパマイシンである。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、エベロリムスである。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、テムシロリムスである。
いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、老化細胞のモジュレーターを含む。例えば、老化細胞のモジュレーターは、セノリティックであり得る。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、老化細胞を低減させ、特定の態様では排除する。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、フィセチン、ルテオリン、クルクミン、ゲルダナマイシン、タネスピマイシン、アルベスピマイシン、ピペルロングミン、ＦＯＸＯ４関連ペプチド、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ウアバイン、プロスシラリジンＡ、ジゴキシン、ケルセチン、ダサチニブ、ナビトクラックス、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ケルセチンである。いくつかの態様では、ケルセチンは、ｐ５３及び／またはＫｉｒ２．１の発現を増加させる。
いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、細胞周期制御因子ｐ５３のモジュレーター（例えば上方制御因子）を含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ｐ５３の上方制御因子またはアクチベーターを含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、小分子、核酸、アミノ酸、代謝産物、ポリペプチド、抗体及び抗体様分子、アプタマー、大環状分子、または他の分子を含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ＭＤＭ２インヒビターである。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ＲＧ７１１２、イダサヌトリン（ｉｄａｓａｎｕｔｌｉｎ）、ＡＭＧ－２３２、ＡＰＧ－１１５、ＢＩ－９０７８２８、ＣＧＭ０９７、シレマドリン（ｓｉｒｅｍａｄｌｉｎ）、ミラデメタン（ｍｉｌａｄｅｍｅｔａｎ）、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ＭＤＭ２インヒビター（例えばｎｕｔｌｉｎ－３ａ）である。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、セノリティック（例えばケルセチン）である。
いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、Ｔｏｒｉｎ１、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、及びケルセチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、Ｔｏｒｉｎ１である。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａである。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ケルセチンである。いくつかの実施形態では、ｐ５３は、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、及びＴｏｒｉｎ１のうちの１つ以上を投与することによって（例えば相乗的に）上方制御される。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、Ｔｏｒｉｎ１ではない。いくつかの実施形態では、心筋細胞成熟因子は、ｍＴＯＲインヒビターではない。
組成物及びキット
本書には、本書に記載される心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞及び／または休止心筋細胞）を含む組成物が記載される。いくつかの実施形態では、組成物は、本書に記載される成熟因子及び／または細胞培養培地も含む。本書には、本書に記載される化合物を含む組成物（例えば、本書に記載される化合物のうちの１つ以上を含む細胞培養培地）も記載される。
また、本書には、本書で開示される方法を実施するため、及び本書で開示される心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞及び／または休止心筋細胞）を作製するためのキットも記載される。また、本書には、慢性心不全を処置し、心室性不整脈の発生率を低減させるためのキットも記載される。一態様では、キットは、少なくとも１つの未熟及び／または老化心筋細胞またはその前駆細胞、ならびに本書に記載される少なくとも１つの成熟因子を含み、場合により、キットは、本書に記載される方法を使用して（例えば２Ｄまたは３Ｄ培養を使用して）少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を成熟した心筋細胞の集団に変換するための説明書をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも２つの成熟因子を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも３つの成熟因子を含む。いくつかの実施形態では、キットは、成熟因子の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、キット内の化合物は、水密または気密の容器で提供することができ、この容器は、いくつかの実施形態では、キットの他の構成要素を実質的に含まない。化合物は、２つ以上の容器で供給されてもよく、例えば、未熟及び／または老化心筋細胞、またはそれらの前駆細胞を誘導して、成熟した心筋細胞及び／または休止心筋細胞にするための、既定の数の反応、例えば１、２、３またはそれ以上の数の別個の反応のために十分な試薬を有する容器で供給されてもよい。成熟因子は、任意の形態、例えば液体形態、乾燥形態、または凍結乾燥形態で提供され得る。本書に記載される化合物（複数可）（例えば成熟因子）は、実質的に純粋及び／または無菌であることが好ましい。本書に記載される化合物（複数可）が液体溶液で提供される場合、液体溶液は、好ましくは水溶液であり、無菌水溶液が好ましい。本書に記載される化合物（複数可）が乾燥形態として提供される場合、再構成は概して、好適な溶媒の添加による。溶媒、例えば、滅菌水またはバッファーは、場合により、キットにおいて提供され得る。
いくつかの実施形態では、キットは、場合により、情報資料をさらに含む。情報資料は、本書に記載される方法及び／または本書に記載される方法のための本書に記載される化合物（複数可）の使用に関する、記述資料、説明資料、マーケティング資料、または他の資料であり得る。
キットの情報資料は、その説明または情報の内容において制限されない。一実施形態では、情報資料は、化合物の生産、化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチまたは生産場所情報などに関する情報を含み得る。一実施形態では、情報資料は、化合物を投与する方法に関する。さらに、キットの情報資料は、その形態において制限されない。多くの場合、情報資料、例えば説明書は、印刷物、例えば印刷されたテキスト、図面、及び／または写真、例えばラベルまたは印刷されたシートで提供される。しかし、情報資料は、ブライユ点字、コンピュータ可読資料、ビデオ録画、または音声記録など、他のフォーマットで提供されてもよい。別の実施形態では、キットの情報資料は、キットの使用者が、本書に記載される化合物及び／または本書に記載される方法におけるその使用に関する確かな情報を取得することができる、連絡先情報、例えば、実際の所在地、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号である。当然ながら、情報資料は、任意の組み合わせのフォーマットで提供することもできる。
一実施形態では、情報資料は、本書に記載される方法を行うのに好適な様式で、例えば、好適な用量、剤形、または投与形式（例えば、本書に記載される用量、剤形、または投与形式）で、本書に記載される化合物（複数可）（例えば成熟因子）を（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞またはｉｎ ｖｉｖｏの細胞に）投与するための説明書を含み得る。別の実施形態では、情報資料は、好適な対象、例えば、本書に記載される障害を有するもしくはそのリスクを持つヒトなどのヒト、またはｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に、本書に記載される化合物（複数可）を投与するための説明書を含み得る。
本書に記載される化合物（複数可）に加えて、キットの組成物は、溶媒もしくはバッファー、安定剤、保存剤、香味剤（例えば苦味拮抗剤または甘味料）、香料、もしくは他の化粧成分、及び／または本書に記載される病態もしくは障害を処置するための追加の薬剤など、他の成分を含み得る。あるいは、他の成分は、キット内に、ただし本書に記載される化合物とは異なる組成物または容器に含まれていてもよい。そのような実施形態では、キットは、本書に記載される化合物（複数可）及び他の成分を混和するための、または本書に記載される化合物（複数可）を他の成分と共に使用するための説明書、例えば、２つの薬剤を投与前に組み合わせるための説明書を含み得る。
キットは、本書に記載される少なくとも１つの成熟因子を含有する組成物のための１つ以上の容器を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、組成物（複数可）及び情報資料のための別個の容器（例えば、２つの薬剤のための２つの別個の容器）、仕切り、またはコンパートメントを含み得る。例えば、組成物は、ボトル、バイアル、またはシリンジに収容することができ、情報資料は、プラスチックスリーブまたはパケットに収容することができる。他の実施形態では、キットの別個の要素が、単一の分割されていない容器に収容される。例えば、組成物は、ラベルの形態で情報資料が添付されたボトル、バイアル、またはシリンジに収容される。いくつかの実施形態では、キットは、複数（例えばパック）の個別容器を含み、その各々が、本書に記載される化合物の１つ以上の単位剤形（例えば、本書に記載される剤形）を含む。例えば、キットは、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、またはブリスターパックを含み、その各々が、本書に記載される化合物の単一単位用量を含む。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、湿気の変化または蒸発に対して不浸透性）、及び／または遮光性であり得る。
キットは、場合により、組成物の投与に好適なデバイス、例えば、シリンジ、吸入器、ピペット、鉗子、計量スプーン、ドロッパー（例えば、点眼器）、スワブ（例えば、綿スワブまたは木製スワブ）、または任意のかかる送達デバイスを含む。好ましい実施形態では、デバイスは、例えば外科的挿入用にパッケージングされた医療用インプラントデバイスである。
キットには、本書に記載されるマーカーなどの心筋細胞のマーカーの検出のための成分、例えば、成熟した心筋細胞の検出のための試薬も含まれ得る。または、いくつかの実施形態では、キットは、成熟した心筋細胞の負の選択の目的のための心筋細胞のネガティブマーカーの検出用、またはこれらのネガティブマーカーを発現しない細胞（例えば心筋細胞）の識別用の試薬も含み得る。試薬は例えば、マーカーに対する抗体、または、ＲＴ－ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応、例えば半定量的もしくは定量的なＲＴ－ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応のためのプライマーであり得る。このようなマーカーは、ｉＰＳ細胞が生産されたかどうかを評価するために使用できる。検出試薬が抗体である場合、それは例えば凍結乾燥された乾燥調製物として、または溶液として供給され得る。抗体または他の検出試薬は、検出に使用するための標識、例えば放射線標識、蛍光標識（例えばＧＦＰ）または比色標識に結合させることができる。検出試薬がプライマーである場合、それは例えば凍結乾燥された乾燥調製物として、または溶液として供給され得る。
キットは、例えば陽性細胞型コントロールとして使用するための、同じ種類の未熟及び／または老化心筋細胞またはその前駆細胞に由来する成熟した心筋細胞及び／または休止心筋細胞などの心筋細胞を含み得る。
細胞の投与方法
一実施形態では、本書に記載される細胞、例えば、成熟した心筋細胞の集団は移植可能であり、例えば、心筋細胞の集団は、対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本書に記載される細胞、例えば、成熟した休止心筋細胞の集団は移植可能であり、例えば、心筋細胞の集団は、対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、心筋細胞の集団を投与される対象は、心筋細胞に分化させるために使用される多能性幹細胞の取得源となった対象と同じ対象である（例えば、自家細胞療法のため）。いくつかの実施形態では、対象は、異なる対象である。いくつかの実施形態では、対象は、慢性心不全を患っているか、または正常な対象である。例えば、移植用の細胞（例えば、心筋細胞の集団を含む組成物）は、移植に好適な形態であり得る。
当該方法は、細胞を、それを必要とする対象、例えば哺乳動物対象、例えばヒト対象に投与することをさらに含み得る。細胞の供給源は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。細胞の供給源またはレシピエントは、非ヒト対象、例えば動物モデルでもよい。「哺乳動物」という用語には、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、及び好ましくはヒトを含む生物が含まれる。同様に、移植可能な細胞は、非ヒトトランスジェニック生物を含め、これらの生物のいずれから取得されてもよい。一実施形態では、移植可能な細胞は遺伝子エンジニアリングされており、例えば、細胞は外因性遺伝子を含むか、または内因性遺伝子を不活性化もしくは改変するように遺伝子エンジニアリングされている。
心筋細胞の集団を含む組成物は、埋め込み型デバイスを使用して対象に投与することができる。埋め込み型デバイス及び関連技術は当技術分野で公知であり、本書に記述される化合物または組成物の連続放出または徐放送達が望まれる場合の送達系として有用である。さらに、埋め込み型デバイス送達系は、化合物または組成物の送達の特定の点（例えば、局所的な部位、器官）を標的とするのに有用である。Ｎｅｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２２（６）：５６３ （２００１）。代替的な送達方法を用いる徐放技術も本発明では使用され得る。例えば、ポリマー技術、持続放出技法及び封入技法（例えばポリマー、リポソーム）に基づく徐放製剤も、本書に記述される化合物及び組成物の送達に使用され得る。
医薬組成物
対象に投与する場合、本書で開示される方法によって生産された細胞集団、例えば、心筋細胞の集団（少なくとも１つの未熟心筋細胞を少なくとも１つの成熟因子（例えば、本書に記載される任意の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の成熟因子）と接触させることによって生産されたもの）は、例えば、薬学的に許容可能な組成物で対象に投与することができる。これらの薬学的に許容可能な組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体（添加剤）及び／または希釈剤と共に製剤された、上述のような成熟した心筋細胞の集団を治療有効量で含む。いくつかの態様では、これらの薬学的に許容可能な組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体（添加剤）及び／または希釈剤と共に製剤された、上述のような成熟した休止心筋細胞の集団を治療有効量で含む。
以下に詳細に記載するように、本発明の医薬組成物は、（１）経口投与、例えば、飲薬（水性または非水性の溶液または懸濁液）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、丸剤、錠剤（例えば、口腔内、舌下、及び全身性吸収を標的とするもの）、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト、（２）非経口投与、例えば、無菌の溶液もしくは懸濁液、または持続放出性製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射によるもの、（３）局所適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、または制御放出性パッチもしくはスプレーとしてのもの、（４）膣内または直腸内投与、例えば、ペッサリー、クリーム、または泡としてのもの、（５）舌下投与、（６）眼への投与、（７）経皮的投与、（８）経粘膜的投与、または（９）経鼻的投与のために適合されたものを含む、固体または液体の形態での投与のために特別に製剤され得る。さらに、化合物は、薬物送達系を使用して患者に埋め込んだり、注射したりすることもできる。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ２４： １９９－２３６ （１９８４）、Ｌｅｗｉｓ， ｅｄ． “Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ” （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１）、米国特許第３，７７３，９１９号、及び米国特許第３５３，２７０，９６０号を参照されたい。
ここで使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を起こさずに、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適であり、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指す。
ここで使用される「薬学的に許容可能な担体」という用語は、ある器官または身体の部分から別の器官または身体の部分に対象化合物を運搬または輸送することに関わる、薬学的に許容可能な材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造用助剤（例えば、滑沢剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、かつ患者に有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、及びスクロース、（２）澱粉、例えば、トウモロコシ澱粉及び馬鈴薯澱粉、（３）セルロース、及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、及び酢酸セルロース、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク、（８）賦形剤、例えば、カカオバター及び坐剤用ワックス、（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油、（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェンフリー水、（１７）等張食塩水、（１８）リンガー液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、及び／またはポリ無水物、（２２）増量剤、例えばポリペプチド及びアミノ酸、（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬ、（２４）Ｃ２～Ｃ１２アルコール、例えばエタノール、ならびに（２５）医薬製剤に用いられる他の非毒性で適合性の物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤、及び抗酸化剤も、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容可能な担体」などといった用語は、本書では互換的に使用される。
細胞集団に関して本書で使用される「治療有効量」という語句は、あらゆる医学的処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で、動物の細胞の少なくとも部分集団において何らかの所望の治療効果をもたらすために有効な、細胞集団中の該当する細胞、例えば成熟した心筋細胞、または本発明の成熟した心筋細胞を含む組成物の量を意味する。例えば、慢性心不全の少なくとも１つの症状、例えば収縮期心機能または心室性不整脈の発生などにおける、統計的に有意で測定可能な変化をもたらすのに十分である、対象に投与される成熟した心筋細胞の集団の量である。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内にある。概して、治療有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別、ならびに対象の医学的状態の重篤度及び種類、ならびに他の薬学的活性のある薬剤の投与によって変わり得る。
疾患または障害の「処置」、「防止」または「改善」とは、そのような疾患もしくは障害の発生を遅延させるもしくは防止すること、そのような疾患もしくは障害に関連する病態の進行もしくは重篤度を逆転すること、緩和すること、改善すること、阻害すること、緩徐化すること、または停止することを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％緩和される。
本書で使用される場合、「投与する」という用語は、所望の効果が生じるように、所望の部位で組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、組成物を対象に入れることを指す。本発明の方法に好適な投与経路には、局所投与及び全身投与の両方が含まれる。概して、局所投与では、投与された心筋細胞が対象の全身と比べて特定の位置により多く送達されることになるが、全身投与では、心筋細胞が本質的に対象の全身に送達されることになる。
化合物で処置された細胞を投与する文脈において、「投与すること」という用語には、対象におけるそのような細胞の移植も含まれる。本書で使用される場合、「移植」という用語は、少なくとも１つの細胞を対象に移植または移入するプロセスを指す。「移植」という用語には、例えば、自家移植（ある患者におけるある部位から細胞（複数可）を除去し、同じ患者における同じまたは別の部位に移すこと）、同種移植（同じ種のメンバー間の移植）、及び異種移植（異なる種のメンバー間の移植）が含まれる。
成熟した心筋細胞またはそれを含む組成物は、経口経路、または静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気道投与（エアロゾル）、肺投与、経鼻投与、直腸投与、及び局所投与（口腔内投与及び舌下投与を含む）を含む非経口経路を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され得る。
例示的な投与様式は、注射、注入、点滴注入、吸入、経口摂取、または局所適用を含むが、これらに限定されない。「注射」は、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入を含む。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。他の好ましい実施形態では、組成物は、細胞パッチを介して投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、三次元構造体（例えば、マトリックスまたは足場）を介して投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、微小組織を介して投与される。
本書において使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長動物、齧歯動物、飼育動物、またはゲーム動物などの脊椎動物である。霊長動物としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。齧歯動物としては、マウス、ラット、ヤマネズミ、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。飼育動物及びゲーム動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種（例えばイエネコ）、イヌ科の種（例えばイヌ、キツネ、オオカミ）、トリの種（例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ）、及び魚類（例えばマス、ナマズ、及びサケ）が挙げられる。患者または対象としては、前述のもののうちの任意のサブセット（例えば上記のもののすべてであるが、１つ以上の群または種（ヒト、霊長動物、または齧歯動物など）を除外する）が挙げられる。本書に記載される態様の特定の実施形態において、対象は、哺乳動物、例えば霊長動物、例えばヒトである。「患者」及び「対象」という用語は、本書では互換的に使用される。「患者」及び「対象」という用語は、本書では互換的に使用される。対象は、オスまたはメスであり得る。
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物を、減少した収縮期心機能または心室性不整脈に関連する障害の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。さらに、本書に記載される方法及び組成物は、飼育動物及び／またはペットを処置するために使用され得る。
対象は、減少した収縮期心機能もしくは心室性不整脈を特徴とする障害と以前に診断されているか、またはそれを患っているもしくは有すると識別されているものであり得る。対象は、心不全（例えば慢性心不全）と以前に診断されているか、またはそれを有すると識別されている人物であり得る。いくつかの態様では、対象は、心臓関連の疾患もしくは障害と以前に診断されているか、またはそれを有すると識別されている人物であり得る。いくつかの態様では、対象は、先天性心疾患（例えば、収縮期心疾患または組織エンジニアリングの結果としての心疾患）と以前に診断されている人物であり得る。
本書に記載される態様のいくつかの実施形態では、当該方法は、対象を処置する前に、減少した収縮期心機能または心室性不整脈について対象を診断及び／または選択することをさらに含む。いくつかの態様では、当該方法は、対象を処置する前に、心臓関連の疾患または障害について対象を診断及び／または選択することをさらに含む。いくつかの態様では、当該方法は、対象を処置する前に、先天性心疾患について対象を診断及び／または選択することをさらに含む。
本書に記載される心筋細胞組成物は、機械的補助デバイス（例えば、心室回復を補助するために使用される心室補助デバイス（ＶＡＤ）または体外膜型酸素供給（ＥＣＭＯ）システム）と組み合わせて、または心臓の血管再建を行うための心臓カテーテル手技（例えば、冠動脈のステント留置もしくはバルーン血管形成術、または外科的バイパス移植術）と組み合わせて投与され得る。本書に記載される心筋細胞組成物は、薬学的活性のある薬剤と組み合わせて対象に共投与することができる。例示的な薬学的活性のある化合物は、限定されるものではないが、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １３ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄｓ． Ｔ．Ｒ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｎ．Ｙ．， ＮＹ、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ５０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９７， Ｏｒａｄｅｌｌ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ， １９９０、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ， Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ， ＵＳＰ ＸＩＩ ＮＦ ＸＶＩＩ， １９９０、最新版のＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｏｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、及び最新版のＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘに見出されるものを含み、これらのすべての完全な内容全体が、本書に組み込まれている。
心筋細胞を含む組成物及び／または薬学的活性のある薬剤は、同じ医薬組成物または異なる医薬組成物で（同時にまたは異なる時点で）対象に投与することができる。異なる時点で投与する場合、心筋細胞を含む組成物及び／または薬学的活性のある薬剤は、他方の投与から５分以内、１０分以内、２０分以内、６０分以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、８時間以内、１２時間以内、２４時間以内に投与され得る。心筋細胞を含む組成物及び／または薬学的活性のある薬剤が、異なる医薬組成物で投与される場合、投与経路は異なり得る。いくつかの実施形態では、対象に、心筋細胞を含む組成物が投与される。他の実施形態では、対象に、薬学的活性のある薬剤を含む組成物が投与される。別の実施形態では、対象に、薬学的活性のある薬剤と混合された心筋細胞集団を含む組成物が投与される。別の実施形態では、対象に、心筋細胞集団を含む組成物と、薬学的活性のある薬剤を含む組成物とが投与され、投与は、実質的に同時か、または互いに続いて行われる。
心筋細胞集団を含む組成物の投与の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を判定するための、細胞培養物または実験動物における標準的薬学的手順により、決定することができる。大きな治療指数を呈する心筋細胞集団を含む組成物が好ましい。
心筋細胞集団を含む組成物の量は、いくつかの十分に確立された動物モデルを使用して試験され得る。
いくつかの実施形態では、細胞培養アッセイ及び動物実験から取得されたデータが、ヒトにおいて使用するための投与量範囲を策定する際に使用され得る。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に収まる。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。
心筋細胞集団を含む組成物の治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することもできる。あるいは、任意の特定の投与量の効果を好適なバイオアッセイによってモニタリングすることができる。
処置の期間及び頻度に関しては、処置が治療利益をもたらしているときを決定するために、また、投与量を増加させるべきか減少させるべきか、投与頻度を増加させるべきか減少させるべきか、処置を中止すべきか、処置を再開すべきか、または処置レジメンに他の改変を行うべきかを決定するために、対象をモニタリングするのは、当業者にとって一般的である。投薬スケジュールは、複数の臨床的要因に応じて週１回から日１回まで異なり得る。所望の用量は、一度に投与するか、または２～４の分割用量などの分割用量に分割して投与することができ、ある期間にわたって、例えば一日を通して適切な間隔で、または他の適切なスケジュールで投与することができる。このような分割用量は、単位剤形として投与することができる。いくつかの実施形態では、投与は長期にわたり、例えば、数週間または数か月にわたって日１回以上の用量である。投薬スケジュールの例は、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、もしくは６か月、またはそれ以上の期間にわたり、日１回、日２回、日３回、または日４回以上の投与である。
本発明の別の態様では、当該方法は、本書で開示される心筋細胞の単離集団の使用を提供する。本発明の一実施形態では、本書で開示される心筋細胞の単離集団は、処置を必要とする対象、例えば、心室性不整脈もしくは減少した収縮期心機能（例えば慢性心不全）を有するか、またはその発症リスクを持つ対象への移植に使用される医薬組成物の生産のために使用され得る。一実施形態では、心筋細胞の単離集団は、遺伝子修飾されていてもよい。別の態様では、対象は、心室性不整脈もしくは減少した収縮期心機能を有し得るか、またはそのリスクがあり得る。いくつかの実施形態では、本書で開示される心筋細胞の単離集団は、自家及び／または同種異系であり得る。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物であり、他の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
本発明の一実施形態は、慢性心不全を有する対象に、本書で開示される心筋細胞の集団を含む組成物の有効量を投与することを含む、対象の慢性心不全を処置する方法に関する。他の実施形態は、心室性不整脈を有する対象に、本書で開示される心筋細胞の集団を含む組成物の有効量を投与することを含む、対象の心室性不整脈を処置する方法に関する。さらなる実施形態において、本発明は、減少した収縮期心機能を有する対象に、本書で開示される心筋細胞の集団を含む組成物を投与することを含む、減少した収縮期心機能を処置する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、先天性心疾患を有する対象に、本書で開示される心筋細胞の集団を含む組成物の有効量を投与することを含む、先天性心疾患を処置する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本書で開示される心筋細胞の集団は、任意の生理学的に許容可能な賦形剤で投与することができ、ここで、心筋細胞は、複製、増殖、及び／または生着に適切な部位を見出し得る。いくつかの実施形態では、本書で開示される心筋細胞の集団は、注射、カテーテルなどによって導入され得る。いくつかの実施形態では、本書で開示される心筋細胞の集団は、液体窒素温度で凍結して長期間保管することができ、解凍して使用することができる。凍結する場合、心筋細胞の集団は通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ １６４０培地または他の凍結保護溶液中で保管される。解凍されたら、本書で開示される心筋細胞の培養に関連する成長因子及び／またはフィーダー細胞の使用により、細胞を増大させることができる。
いくつかの実施形態では、本書で開示される心筋細胞の集団は、ヒトへの投与のために十分に滅菌された条件下で調製された等張性賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給され得る。医薬製剤の一般的原理については、Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， ｂｙ Ｇ． Ｍｏｒｓｔｙｎ ＆ Ｗ． Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｄｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９６、及びＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｅ． Ｄ． Ｂａｌｌ， Ｊ． Ｌｉｓｔｅｒ ＆ Ｐ． Ｌａｗ， Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， ２０００を参照されたい。本書で開示される心筋細胞の集団を含む組成物の細胞賦形剤及び任意の付随要素の選択は、投与に使用される経路及びデバイスに従って適合されることになる。いくつかの実施形態では、心筋細胞の集団を含む組成物には、心筋細胞の生着または機能的可動化を容易にする１つ以上の他の成分が含まれたり付随したりしてもよい。好適な成分としては、心筋細胞または相補的な細胞型の接着を支持または促進するマトリックスタンパク質が挙げられる。別の実施形態では、組成物は、再吸収性または生分解性のマトリックス足場を含み得る。
遺伝子療法は、細胞を改変して遺伝子産物を置き換えるか、組織の再生を容易にするか、疾患を処置するか、または対象への移植後の細胞の生存を向上させる（すなわち、拒絶反応を防止する）ために使用され得る。
本発明の一態様では、本書で開示される心筋細胞の集団は、全身または標的の解剖学的部位に投与するのに好適である。心筋細胞の集団は、例えば、対象の心臓内もしくはその近くに移植することができ、または動脈内投与もしく静脈内投与など（ただしこれらに限定されない）、全身投与することもできる。代替的な実施形態では、本発明の心筋細胞の集団は、静脈内及び動脈内投与、髄腔内投与、心室内投与、実質内、頭蓋内、大槽内、線条体内、及び黒質内投与を含む非経口投与を含むがこれらに限定されない、心臓系に移植するのに適切となる様々な手段で投与され得る。場合により、心筋細胞の集団は、免疫抑制性薬剤と併せて投与される。
いくつかの実施形態では、心筋細胞の集団は、個々の患者の臨床状態、投与の部位及び方法、投与の予定、患者の年齢、性別、体重、ならびに医師に知られている他の要因を考慮した、適正な医療行為に従って投与及び投薬され得る。そのため、本書での薬学的「有効量」は、当技術分野で公知のそのような考慮事項によって決定される。この量は、向上した生存率もしくはより迅速な回復、または症状の向上もしくは消失、ならびに適切な尺度として当業者によって選択される他の指標を含むがこれらに限定されない向上を達成するために有効でなければならない。心筋細胞の集団は、次の場所：診療所、臨床オフィス、救急診療部、病棟、集中治療室、手術室、カテーテル法特別室、及び放射線特別室で対象に投与され得る。
他の実施形態では、心筋細胞の集団は、後の移植／注入のために保管される。心筋細胞の集団の一部が後の適用のために保持され、一部が対象に直ちに適用されるように、心筋細胞の集団を２つ以上のアリコートまたは単位に分割してもよい。米国特許公開第２００３／００５４３３１号及び特許出願第ＷＯ０３／０２４２１５号で開示され、その全体が参照により組み込まれているように、細胞バンクにおける細胞の全部または一部の中期から長期の保管も、本発明の範囲内にある。処理の終了時に、濃縮された細胞は、当業者に公知の任意の手段によってレシピエントに移入するために、シリンジなどの送達デバイスに装填され得る。
いくつかの実施形態では、心筋細胞の集団は、単独で、あるいは他の細胞、組織、組織断片、ＶＥＧＦなどの成長因子、及び他の既知の血管新生性もしくは動脈原性の成長因子、生物学的活性のある化合物もしくは不活性化合物、再吸収性プラスチック足場、または集団の送達、有効性、忍容性、もしくは機能を増進することを意図した他の添加剤と組み合わせて適用され得る。いくつかの実施形態では、心筋細胞の集団はまた、構造的または治療的な目的の誘導のために細胞の機能を変更、増進、または補助するように、ＤＮＡを挿入すること、または細胞培養下に置くことによって改変され得る。例えば、幹細胞の遺伝子移入技法は、（Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００３、Ｍｏｓｃａ ｅｔ ａｌ．， ２０００）で開示されているように当業者には公知であり、ウイルストランスフェクション技法、より具体的には（Ｗａｌｔｈｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ， ２０００）及び（Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００）で開示されているアデノ随伴ウイルス遺伝子移入技法を含み得る。非ウイルスベースの技法を（Ｍｕｒａｒｎａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）で開示されているように行うこともできる。
別の態様では、いくつかの実施形態では、心筋細胞の集団は、血管新生促進成長因子（複数可）をコードする遺伝子と組み合わされ得る。抗アポトーシス因子または薬剤をコードする遺伝子も適用され得る。遺伝子（または遺伝子の組み合わせ）の付加は、アデノウイルス形質導入、「遺伝子銃」、リポソーム媒介形質導入、及びレトロウイルスまたはレンチウイルス媒介形質導入、プラスミドアデノ随伴ウイルスを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の技術によって行われ得る。細胞は、形質導入を継続または開始できるように、経時的に細胞に遺伝子を放出及び／または提示することができる、担体材料を有する遺伝子送達ビヒクルと共に移植され得る。特に、細胞及び／または細胞を含む組織が、細胞及び／または組織の取得源となった患者以外の患者に投与される場合、移植片の拒絶反応を低減させ、好ましくは防止するために、細胞及び／または組織を受ける患者に１つ以上の免疫抑制性薬剤が投与され得る。本書で使用される場合、「免疫抑制性薬物または免疫抑制性薬剤」という用語は、正常な免疫機能を阻害または妨害する医薬品を含むことを意図する。本書で開示される方法で好適な免疫抑制性薬剤の例には、参照により本書に組み込まれている米国特許公開第２００２／０１８２２１１号で開示されているような、ＣＴＬＡ４及びＢ７経路を介したＴ細胞とＢ細胞との結合を妨害する薬剤など、Ｔ細胞／Ｂ細胞共刺激経路を阻害する薬剤が含まれる。一実施形態では、免疫抑制性薬剤はシクロスポリンＡである。他の例には、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、及び抗胸腺細胞グロブリンが含まれる。一実施形態では、免疫抑制性薬物は、少なくとも１つの他の治療用薬剤と共に投与される。免疫抑制性薬物は、投与経路と適合する製剤で投与され、所望の治療効果を達成するのに十分な投与量で対象に投与される。別の実施形態では、免疫抑制性薬物は、本発明の心筋細胞に対する耐性を誘導するのに十分な時間にわたり、一時的に投与される。
有効量の心筋細胞集団を含む医薬組成物も、本発明によって企図される。これらの組成物は、有効な数の心筋細胞を、場合により、薬学的に許容可能な担体、添加剤または賦形剤と組み合わせて含む。本発明の特定の態様では、心筋細胞の集団は、滅菌食塩水中で移植を必要とする対象に投与される。本発明の他の態様では、心筋細胞の集団は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）またはＩｓｏｌｙｔｅ Ｓ（ｐＨ７．４）中で投与される。無血清細胞培地の使用を含め、他のアプローチを使用してもよい。一実施形態では、心筋細胞の集団は、血漿またはウシ胎仔血清、及びＤＭＳＯ中で投与される。特定の適応症では、対象への心筋細胞集団の全身投与が好ましい場合があるが、他の適応症では、疾患及び／または損傷組織の部位またはその付近での直接投与が好ましい場合がある。
いくつかの実施形態では、心筋細胞の集団は、場合により、対象への投与前の心筋細胞の集団の再構成または解凍（凍結されている場合）など、所望の目的のための説明書を備えた好適な容器にパッケージングされ得る。
成熟した心筋細胞の生産を増加させる心筋細胞成熟因子を識別する方法
本書には、心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）の生産を増加させる心筋細胞成熟因子または薬剤を識別する方法が記載される。特定の例では、ハイコンテントスクリーニング及び／またはハイスループットスクリーニングの方法が提供される。当該方法は、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を少なくとも１つの化合物（例えば、ライブラリ化合物または本書に記載される化合物）に曝露することと、化合物が少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞からの成熟した心筋細胞などの心筋細胞の生産を増加させるかどうかを判定することとを含む。本書に記載されるマーカーのうちの１つ以上を使用して、細胞を心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）として識別することができる。いくつかの例では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞は、ライブラリへの曝露前に分化し得る。他の例では、２つ以上の化合物が、スクリーニングアッセイにおいて、個々にまたは一緒に使用され得る。さらなる例では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞をマルチウェルプレートに配置してもよく、ライブラリの様々なメンバーをマルチウェルプレートの異なるウェルに配置することによって、化合物のライブラリをスクリーニングしてもよい。ライブラリのこのようなスクリーニングにより、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞から成熟した心筋細胞などの心筋細胞を生成することができる化合物を迅速に識別することができる。
本書には、心筋細胞（例えば休止心筋細胞）の生産を増加させる心筋細胞成熟因子または薬剤を識別する方法も記載される。特定の例では、ハイコンテントスクリーニング及び／またはハイスループットスクリーニングの方法が提供される。当該方法は、少なくとも１つの老化心筋細胞を少なくとも１つの化合物（例えば、ライブラリ化合物または本書に記載される化合物）に曝露することと、化合物が少なくとも１つの老化心筋細胞からの休止心筋細胞などの心筋細胞の生産を増加させるかどうかを判定することとを含む。本書に記載されるマーカーのうちの１つ以上を使用して、細胞を心筋細胞（例えば休止心筋細胞）として識別することができる。他の例では、２つ以上の化合物が、スクリーニングアッセイにおいて、個々にまたは一緒に使用され得る。さらなる例では、少なくとも１つの老化心筋細胞をマルチウェルプレートに配置してもよく、ライブラリの様々なメンバーをマルチウェルプレートの異なるウェルに配置することによって、化合物のライブラリをスクリーニングしてもよい。ライブラリのこのようなスクリーニングにより、少なくとも１つの老化心筋細胞から休止心筋細胞などの心筋細胞を生成することができる化合物を迅速に識別することができる。
いくつかの実施形態では、当該方法は、成熟した心筋細胞などの心筋細胞の集団を単離することをさらに含む（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、５０％、７５％またはそれ以上が対象細胞型である）。
いくつかの実施形態では、当該方法は、本書で開示される方法によって生産された心筋細胞を対象（例えば、慢性心不全を有する対象）に移植することをさらに含む。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、対象から取得された幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、心筋細胞は、対象の親族など、対象とは異なるドナーからの幹細胞に由来する。
一態様では、本発明は、本書に記載される方法によって作製された、成熟した心筋細胞などの心筋細胞を特徴とする。別の態様では、本発明は、本書に記載される方法によって作製された心筋細胞を含む組成物を特徴とする。
別の態様では、本発明は、未熟心筋細胞またはその前駆細胞；本書に記載される少なくとも１つの心筋細胞成熟因子；ならびに心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）を生産するための未熟心筋細胞またはその前駆細胞及び少なくとも１つの心筋細胞成熟因子の使用に関する説明書を含むキットを特徴とする。いくつかの実施形態では、キットは、成熟した心筋細胞のマーカー、例えば本書に記載されるマーカーの検出用の成分、例えば心筋細胞成熟のマーカーの検出用の試薬、例えばマーカーに対する抗体；及び例えばコントロールとして使用するための成熟した心筋細胞をさらに含む。
一態様では、本発明は、未熟心筋細胞またはその前駆細胞から心筋細胞への分化を容易にする方法であって、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞を用意することと、幹細胞が少なくとも１つの成熟因子に曝露されたら、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞が心筋細胞（例えば、成熟した心筋細胞）に成熟または分化するように、少なくとも１つの心筋細胞成熟因子（例えば、本書に記載される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の心筋細胞成熟因子）を提供することとを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞は、哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞は、マウス由来またはヒト由来である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞は、胚性幹細胞（例えば、マウスまたはヒトの胚性幹細胞などの哺乳動物胚性幹細胞）の培養から導出される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの未熟心筋細胞またはその前駆細胞は、人工多能性幹細胞（例えば、マウスまたはヒトのｉＰｓ細胞などの哺乳動物ｉＰｓ細胞）の培養から導出される。
いくつかの実施形態では、例えば、複数の未熟心筋細胞またはその前駆細胞を、本書に記載される心筋細胞成熟因子のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれ以上と接触させることにより、複数の未熟心筋細胞またはその前駆細胞を複数の成熟した心筋細胞に分化または成熟させる。
いくつかの実施形態では、例えば、複数の老化心筋細胞を、本書に記載される心筋細胞成熟因子のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれ以上と接触させることにより、複数の老化心筋細胞を複数の休止心筋細胞に成熟させる。
いくつかの実施形態では、複数の未熟心筋細胞またはその前駆細胞を、約１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１２日、１４日、１６日、またはそれ以上にわたり、心筋細胞成熟因子に曝露する。いくつかの実施形態では、複数の未熟心筋細胞またはその前駆細胞を、約２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、または１０μＭの濃度の心筋細胞成熟因子に曝露する。いくつかの実施形態では、複数の未熟心筋細胞またはその前駆細胞を、約２５０ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、または８００ｎＭの濃度の心筋細胞成熟因子に曝露する。いくつかの実施形態では、未熟心筋細胞またはその前駆細胞の約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、または約９０％超が、成熟した心筋細胞に分化または成熟する。
前述の詳細な説明及び以下の実施例は、例示であるに過ぎず、本発明の範囲に対する制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。当業者には明らかとなる、開示された実施形態の様々な変更及び改変が、本開示の主旨及び範囲から逸脱することなく行われ得る。さらに、特定されたすべての特許、特許出願、及び公表文献は、例えば、本開示に関連して使用され得る、そのような公表文献に記載された方法論を説明及び開示する目的で、参照により本書に明確に組み込まれる。これらの公表文献は、本出願の出願日以前の、それらの開示内容のためにのみ提供されている。この点に関するいかなる内容も、先行発明または何らかの他の理由により、本発明者らがかかる開示に先行する権利を持たないことを認めるものと解釈されてはならない。これらの文書の日付についてのすべての記述または内容についての表現は、本出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さについての承認となるものではない。
実施例１：幹細胞由来心筋細胞の成熟のための老化抑制
背景：
慢性心不全を処置するための幹細胞アプローチには、収縮期心機能を向上させ、心室性不整脈の発生率を低減させるために、心室心筋細胞の生産が必要となる。しかし、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（それぞれＥＳＣまたはｉＰＳＣ）に由来する心筋細胞は、現行の分化プロトコルを使用した場合、機能的に未熟なままである。これらの未熟心筋細胞は、成体動物モデルに供給すると生命を脅かす可能性のある心室性不整脈をもたらす自動性またはペースメーカー様の活動を示し、また、サルコメア構造がさほど組織化されておらず、十分な収縮力が得られない（１、２）。循環器疾患の処置への幹細胞由来療法の応用に成功するには、幹細胞由来心筋細胞の成熟のための改良された方法を開発することが必要である。
哺乳動物では出生時に著しい生理学的変化が起こる。これは、新生児が、すべての酸素及び栄養素を胎盤から導出することから、自発呼吸による酸素導出、及び経腸栄養による栄養素導出に適応するためである。これらの生理学的変化が心臓表現型を制御する基礎となる分子機構は依然として不明である。マウスでは、生後数日間、心筋細胞が心筋損傷後に再生する能力を保持する（３）。しかし、この期間を過ぎると、心筋細胞は細胞周期を脱して休止状態になる（４）。最近、ラパマイシン機構的標的（ｍＴＯＲ）経路の阻害により、細胞休止の誘導及び細胞老化の抑制を介して二次元（２Ｄ）培養下のｉＰＳＣ－ＣＭの成熟が向上することが特定された（５）。
細胞休止とは、栄養素の欠乏によって引き起こされ、適切な刺激に応答して細胞周期に再び入る能力を特徴とする静止状態である（６）。これに対し、細胞老化とは、ＤＮＡ損傷、活性酸素種レベルの上昇、及び近傍細胞での炎症促進性表現型につながり得る老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の発現を特徴とする、加齢表現型または疾患表現型に関連する不可逆的な細胞周期停止の状態である（７）。老化表現型を有するｉＰＳＣ－ＣＭは成熟度が低く、より成熟した心筋細胞で見られるサルコメアまたはイオンチャネルタンパク質の発現が低いことが判明した。インターロイキン－６（ＩＬ－６）などのＳＡＳＰタンパク質はパラクリン作用によって近傍細胞に有害な影響を与える可能性があるため、セノリティック（老化細胞のアポトーシスを誘導する化合物）による老化細胞の除去が生存細胞の成熟を増進し得るかどうかを試験する。
発明の概要：
これまでに、後期分化中のＴｏｒｉｎ１によるｍＴＯＲシグナル伝達の阻害により、細胞休止が誘導されると共に、心筋細胞の成熟が増進されることが示唆されている。さらに、休止深度が成熟を容易にする可能性があり、ｐ５３上方制御による休止の誘導がｉＰＳＣ－ＣＭ成熟を容易にする可能性があることが示唆された。
予備データは、３Ｄ懸濁培養物からの老化細胞の除去によってもｉＰＳＣ－ＣＭの成熟が容易になり得ることを示唆している。セノリティックであるケルセチンは、老化腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し得る、リンゴなどの食物に見出されるフラボノールである（８）。予備データは、ｉＰＳＣ－ＣＭをケルセチンで処置するとｉＰＳＣ－ＣＭ成熟が増進し得ることを示唆している。
方法：
ＵＣＳＤ１４２ｉ－８６－１細胞株を使用して予備データを生成した。実験室での三次元培養に適合させた既報のプロトコル（９）に従って、ＵＣＳＤ１４２ｉ－８６－１細胞を心筋細胞に分化させた。拍動発生から２日後（分化９日目あたり）、心筋細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）または異なる濃度のケルセチンで様々な期間にわたって処置した。ｑＰＣＲ、ウエスタン、またはフローサイトメトリーのために、異なる時点で細胞を採取した。
予備的結果：
ケルセチンは、生細胞のパーセンテージを減少させるが、心筋細胞のパーセンテージを増加させる。
ケルセチン処置（２００μＭ）は、フローサイトメトリーによって定量化して、２日間または５日間の処置で生細胞のパーセンテージを減少させる（図４Ａ）。しかし、２０または２００μＭのケルセチンによる２日間の処置は、心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）陽性心筋細胞のパーセンテージを増加させ（図４Ｂ）、このことは、非心筋細胞の細胞死による心筋細胞の精製が生じることを示唆し得る。
ケルセチンは、３Ｄ培養下でＫｉｒ２．１及びｐ５３の発現を増加させる。
ｉＰＳＣ－ＣＭのケルセチン処置は、内向き整流電流（ＩＫ１）を介した静止膜電位の維持において大きな役割を果たすイオンチャネルであるＫｉｒ２．１の発現を増加させる（図３Ａ～３Ｄ）；低レベルでは、異常な膜脱分極により心室性不整脈のリスクが増加し得る（１０、１１）。さらに、ケルセチンはｐ５３の発現を増加させ、これは休止の誘導を支持し得る。
ケルセチンはＰＰＡＲＧＣ１ａの発現を増加させる。
２００μＭのケルセチンを３日間用いた処置により、ミトコンドリア発生の制御因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーター１Ａ（ＰＰＡＲＧＣ１ａ）のｍＲＮＡ発現が有意に増加した（図５）。ＰＰＡＲＧＣ１ａ活性化は心筋細胞成熟を刺激することができ（１０）、ケルセチン処置細胞がより成熟した代謝表現型を有し得ることを示唆している。
要旨
まとめると、セノリティックであるケルセチンを使用して３Ｄ懸濁培養物から老化細胞を除去すると、Ｋｉｒ２．１及びＰＰＡＲＧＣ１ａを含め、選択されたＰＳＣ－ＣＭ成熟マーカーの発現が増加する。これらの結果は、ケルセチンが生存ｉＰＳＣ－ＣＭの成熟を向上させ得ることを示唆している。セノリティックを使用した老化細胞の除去は、移植前の培養下のｉＰＳＣ－ＣＭの成熟を容易にし得る。
参考文献：
１． Ｃｈｏｎｇ ＪＪ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｄｏｎ ＣＷ， Ｍｉｎａｍｉ Ｅ， Ｌｉｕ ＹＷ， Ｗｅｙｅｒｓ ＪＪ， Ｍａｈｏｎｅｙ ＷＭ， Ｖａｎ Ｂｉｂｅｒ Ｂ， Ｃｏｏｋ ＳＭ， Ｐａｌｐａｎｔ ＮＪ， Ｇａｎｔｚ ＪＡ， Ｆｕｇａｔｅ ＪＡ， Ｍｕｓｋｈｅｌｉ Ｖ， Ｇｏｕｇｈ ＧＭ， Ｖｏｇｅｌ ＫＷ， Ａｓｔｌｅｙ ＣＡ， Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ＣＥ， Ｂａｌｄｅｓｓａｒｉ Ａ， Ｐａｂｏｎ Ｌ， Ｒｅｉｎｅｃｋｅ Ｈ， Ｇｉｌｌ ＥＡ， Ｎｅｌｓｏｎ Ｖ， Ｋｉｅｍ ＨＰ， Ｌａｆｌａｍｍｅ ＭＡ， Ｍｕｒｒｙ ＣＥ． Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｈｅａｒｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１４；５１０（７５０４）：２７３－７． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３２３３． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４７７６７９７；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ４１５４５９４．
２． Ｙａｎｇ Ｘ， Ｐａｂｏｎ Ｌ， Ｍｕｒｒｙ ＣＥ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ： ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０１４；１１４（３）：５１１－２３． ｄｏｉ： １０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１４．３００５５８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４４８１８４２；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ３９５５３７０．
３． Ｐｏｒｒｅｌｌｏ ＥＲ， Ｍａｈｍｏｕｄ ＡＩ， Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｅ， Ｈｉｌｌ ＪＡ， Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＪＡ， Ｏｌｓｏｎ ＥＮ， Ｓａｄｅｋ ＨＡ． Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１１；３３１（６０２０）：１０７８－８０． Ｅｐｕｂ ２０１１／０２／２６． ｄｏｉ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２００７０８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２１３５０１７９；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ３０９９４７８．
４． Ｙｕａｎ Ｘ， Ｂｒａｕｎ Ｔ． Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｄｉａｃ Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０１７；１２１（３）：２９３－３０９． Ｅｐｕｂ ２０１７／０７／２２． ｄｏｉ： １０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１７．３０８４２８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２８７２９４５４．
５． Ｇａｒｂｅｒｎ ＪＣ， Ｈｅｌｍａｎ Ａ， Ｓｅｒｅｄａ Ｒ， Ｓａｒｉｋｈａｎｉ Ｍ， Ａｈｍｅｄ Ａ， Ｅｓｃａｌａｎｔｅ ＧＯ， Ｏｇｕｒｌｕ Ｒ， Ｋｉｍ ＳＬ， Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＪＦ， Ｃｈｏ Ａ， ＭａｃＱｕｅｅｎ Ｌ， Ｂｅｚｚｅｒｉｄｅｓ ＶＪ， Ｐａｒｋｅｒ ＫＫ， Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ， Ｌｅｅ ＲＴ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｐ５３－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２０２０；１４１（４）：２８５－３００． Ｅｐｕｂ ２０１９／１１／１２． ｄｏｉ： １０．１１６１／ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮＡＨＡ．１１９．０４４２０５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３１７０７８３１；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ７００９７４０．
６． Ｙａｏ Ｇ． Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ． Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｆｏｃｕｓ． ２０１４；４（３）：２０１３００７４． Ｅｐｕｂ ２０１４／０６／０７． ｄｏｉ： １０．１０９８／ｒｓｆｓ．２０１３．００７４． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４９０４７３７；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ３９９６５８６．
７． Ｄｉ Ｍｉｃｃｏ Ｒ， Ｋｒｉｚｈａｎｏｖｓｋｙ Ｖ， Ｂａｋｅｒ Ｄ， ｄ’Ａｄｄａ ｄｉ Ｆａｇａｇｎａ Ｆ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ａｇｅｉｎｇ： ｆｒｏｍ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０２１；２２（２）：７５－９５． Ｅｐｕｂ ２０２０／１２／１８． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５８０－０２０－００３１４－ｗ． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３３３２８６１４．
８． Ｚｈｕ Ｙ， Ｔｃｈｋｏｎｉａ Ｔ， Ｐｉｒｔｓｋｈａｌａｖａ Ｔ， Ｇｏｗｅｒ ＡＣ， Ｄｉｎｇ Ｈ， Ｇｉｏｒｇａｄｚｅ Ｎ， Ｐａｌｍｅｒ ＡＫ， Ｉｋｅｎｏ Ｙ， Ｈｕｂｂａｒｄ ＧＢ， Ｌｅｎｂｕｒｇ Ｍ， Ｏ’Ｈａｒａ ＳＰ， ＬａＲｕｓｓｏ ＮＦ， Ｍｉｌｌｅｒ ＪＤ， Ｒｏｏｓ ＣＭ， Ｖｅｒｚｏｓａ ＧＣ， ＬｅＢｒａｓｓｅｕｒ ＮＫ， Ｗｒｅｎ ＪＤ， Ｆａｒｒ ＪＮ， Ｋｈｏｓｌａ Ｓ， Ｓｔｏｕｔ ＭＢ， ＭｃＧｏｗａｎ ＳＪ， Ｆｕｈｒｍａｎｎ‐Ｓｔｒｏｉｓｓｎｉｇｇ Ｈ， Ｇｕｒｋａｒ ＡＵ， Ｚｈａｏ Ｊ， Ｃｏｌａｎｇｅｌｏ Ｄ， Ｄｏｒｒｏｎｓｏｒｏ Ａ， Ｌｉｎｇ ＹＹ， Ｂａｒｇｈｏｕｔｈｙ ＡＳ， Ｎａｖａｒｒｏ ＤＣ， Ｓａｎｏ Ｔ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＤ， Ｎｉｅｄｅｒｎｈｏｆｅｒ ＬＪ， Ｋｉｒｋｌａｎｄ ＪＬ． Ｔｈｅ Ａｃｈｉｌｌｅｓ’ ｈｅｅｌ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌｓ： ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｔｏ ｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ． Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ． ２０１５；１４（４）：６４４－５８． ｄｏｉ： １０．１１１１／ａｃｅｌ．１２３４４．
９． Ｌｉａｎ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ａｚａｒｉｎ ＳＭ， Ｚｈｕ Ｋ， Ｈａｚｅｌｔｉｎｅ ＬＢ， Ｂａｏ Ｘ， Ｈｓｉａｏ Ｃ， Ｋａｍｐ ＴＪ， Ｐａｌｅｃｅｋ ＳＰ． Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｕｎｄｅｒ ｆｕｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１３；８（１）：１６２－７５． Ｅｐｕｂ ２０１２／１２／２２． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１５０． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２３２５７９８４；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ３６１２９６８．
１０． Ｌｉｕ Ｙ， Ｂａｉ Ｈ， Ｇｕｏ Ｆ， Ｔｈａｉ ＰＮ， Ｌｕｏ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｐ， Ｙａｎｇ Ｃ， Ｆｅｎｇ Ｘ， Ｚｈｕ Ｄ， Ｇｕｏ Ｊ， Ｌｉａｎｇ Ｐ， Ｘｕ Ｚ， Ｙａｎｇ Ｈ， Ｌｕ Ｘ． ＰＧＣ－１ａｌｐｈａ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＺＬＮ００５ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ａｇｉｎｇ （Ａｌｂａｎｙ ＮＹ）． ２０２０；１２（８）：７４１１－３０． Ｅｐｕｂ ２０２０／０４／２９． ｄｏｉ： １０．１８６３２／ａｇｉｎｇ．１０３０８８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３２３４３６７４；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ７２０２５４２．
実施例２：幹細胞由来心筋細胞の電気的成熟
概略
循環器疾患は、依然として世界中の主な死因である。同種異系の多能性幹細胞ＰＳＣ由来心筋細胞（ＰＳＣ－ＣＭ）は、心不全を処置するための画一的な再生アプローチを提供する。しかし、ヒトＰＳＣ－ＣＭを分化させる現行のプロトコルでは、おそらく高い静止膜電位（ＲＭＰ）が原因となって生命を脅かす心室性頻拍（ＶＴ）のリスクを増加させ得る未熟心筋細胞が生成される。さらに、スケールアップを容易にするためには、２Ｄプロトコルを三次元（３Ｄ）懸濁培養に適合させる必要があり、この移行は些末ではない。本プロジェクトの目標は、－７０ｍＶ以下のＲＭＰを有する電気的に成熟したＰＳＣ由来心筋細胞を生成することが可能な３Ｄ懸濁培養プロトコルに２Ｄプロトコルを適合させることである。３Ｄ生成された心筋細胞の完全な表現型特性解析と併せてこのベンチマークを達成することは、この再生技術の大型動物実験ならびにその後の臨床応用及び商業化を進めるために必要である。
背景
急性心筋梗塞の後、ヒトの心臓はおよそ１０億個以上の心筋細胞を失う（１）。同種異系のヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（ＰＳＣ－ＣＭ）は、心筋梗塞後の収縮期心不全患者を処置するための画一的な再生アプローチを提供し得る。しかし、未熟心筋細胞の送達は、生命を脅かす可能性のある不整脈である心室性頻拍（ＶＴ）のリスクを増加させるため、ＰＳＣ－ＣＭの不十分な成熟は、臨床応用に対する大きな障壁となり得る（２～４）。ＶＴのリスク増加は、ほとんどのプロトコルで生成されたＰＳＣ－ＣＭが未熟すぎて、ＰＳＣ－ＣＭが約－５０ｍＶから－６０ｍＶの比較的高い静止膜電位（ＲＭＰ）を有するために起こると考えられている（これに対し、成体心室心筋細胞は約－９０ｍＶのＲＭＰを有する）（５）。ＶＴのリスクを回避するための戦略をまず開発する必要があるため、ＰＳＣ－ＣＭの不十分な電気的成熟は、臨床用途に向けたＰＳＣ－ＣＭの開発における進歩を著しく妨げている。
様々な剛性の基質上での培養、長期培養（数か月）、電気的刺激または小分子とのインキュベーションなど、成熟を増進するための様々な戦略が研究されてきた（６～９）。３Ｄ懸濁培養下のＰＳＣ－ＣＭで－７０ｍＶ以下のＲＭＰを達成すれば、臨床応用に対する大きな障壁が克服されるであろう。最近、単一の小分子Ｔｏｒｉｎ１によるラパマイシン機構的標的（ｍＴＯＲ）経路の阻害を介した細胞休止の誘導によって、ほんの２週間で同等のＲＭＰを有する二次元（２Ｄ）培養下のＰＳＣ－ＣＭを生成することができ（１０）、成熟したＰＳＣ－ＣＭを生産するのに２か月かかる他のプロトコルと比較して製造プロセスが大幅に簡略化されることが特定された（９）。
有意性
実行可能な治療オプションとして同種異系ヒトＰＳＣ－ＣＭを使用する置換療法を開発するには、画一的利用のための適正製造規範を用いて多数のＰＳＣ－ＣＭを培養する方法を開発しなければならない。２Ｄ培養の維持は労働集約的であり、バッチごとに有意なばらつきがある（１１）。そのため、多くのグループが三次元（３Ｄ）バイオリアクターシステムでのＰＳＣの維持及び分化に移行しており、このシステムは、スケールアップにより適しており、労働時間を短縮し、少量のサンプリングによってクオリティコントロールの向上が可能になる（１２）。しかし、この２Ｄ培養から３Ｄ培養への移行は、異なる培養形状におけるｍＴＯＲを含む様々なシグナル伝達経路の差次的制御により、細胞の表現型を変化させる（１３）。この分野では、３Ｄで成熟したＰＳＣ－ＣＭを効率的に生産する均一なプロトコルが未だ考案されていない。このような療法の臨床応用及び商業化が可能になるには、この課題を克服する必要がある。最近の予備データは、ｍＴＯＲ阻害が３Ｄ培養における成熟にごくわずかな影響しか及ぼさないことを示唆している。さらなる予備データは、３Ｄ培養において、ｐ５３を上方制御できる及び／または老化細胞を排除できる他の小分子が、ＰＳＣ－ＣＭ成熟に対してより顕著な影響を及ぼし得ることを示唆している。
本プロジェクトの目的は以下の通りである。
１． ｎｕｔｌｉｎ－３ａによるｐ５３活性化が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの３Ｄ培養におけるｉＰＳＣ由来心筋細胞の電気的成熟を増進するかどうかを判定すること。
２． セノリティックであるケルセチンによる老化細胞の排除が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの３Ｄ培養におけるｉＰＳＣ由来心筋細胞の電気的成熟を増進するかどうかを判定すること。
予備研究
Ｎｕｔｌｉｎ－３ａは、３Ｄ培養下でＫｉｒ２．１及びｐ５３の発現を増加させるが、Ｔｏｒｉｎ１はそれらの発現を増加させない。
Ｋｉｒ２．１は、内向き整流電流（ＩＫ１）を介した静止膜電位の維持において大きな役割を果たすイオンチャネルである；低レベルでは、異常な膜脱分極により心室性不整脈のリスクが増加し得る（１０、１１）。ｉＰＳＣ－ＣＭのＮｕｔｌｉｎ－３ａ処置は、Ｋｉｒ２．１の発現を増加させるが、Ｔｏｒｉｎ１処置は、Ｋｉｒ２．１の発現を増加させない（図２Ａ～２Ｈ）。また、Ｎｕｔｌｉｎ－３ａは、休止状態の誘導を支持し得るｐ５３の発現を増加させるが、Ｔｏｒｉｎ１はｐ５３の発現を増加させない（図２Ａ～２Ｈ）。この予備データは、ｍＴＯＲ阻害が２Ｄ培養と比較して３Ｄ培養において有益な効果を有しないことを示唆しており、これはおそらく、ｍＴＯＲ活性を低減させる接触阻害によるものである（１３）。
ケルセチンは、３Ｄ培養下でＫｉｒ２．１及びｐ５３の発現を増加させる。
ｉＰＳＣ－ＣＭのケルセチン処置は、Ｋｉｒ２．１及びｐ５３の両方の発現を増加させ（図３Ａ～３Ｄ）、ケルセチンがｉＰＳＣ－ＣＭの電気的成熟及び休止を容易にし得ることの証拠を提供している。
研究計画
３Ｄ懸濁培養においてｐ５３の活性化または老化細胞の排除を通じて電気的に成熟したヒトＰＳＣ－ＣＭを生成することが可能な現行適正製造規範（ｃＧＭＰ）準拠プロトコルを開発することを提唱する。ＲＭＰ≦－７０ｍＶのベンチマークを使用することで、不整脈の可能性を評価するための大型動物実験を進めるための現行プロトコルからの十分な改良を実証する。サルコメア、イオンチャネル及び代謝遺伝子のＲＮＡ及びタンパク質発現の評価、収縮性、電気生理学的特性、及び酸素消費速度の定量化を含む、完全な表現型の特性解析を行う。シェーカープラットフォームで三角フラスコを使用して、３Ｄ懸濁培養プロトコルを最適化した。本書に記載されるプロトコルは、ＰＳＣ－ＣＭ拍動発生後に処置を開始することで、他のプロトコルを超えたさらなる成熟を促進し得る、他の分化プロトコルを補助するものとして機能し得る。
目的１の論拠
細胞休止とは、栄養素の欠乏によって引き起こされ、適切な刺激に応答して細胞周期に再び入る能力を特徴とする静止状態である（１４）。これに対し、細胞老化とは、ＤＮＡ損傷、活性酸素種レベルの上昇、及び近傍細胞での炎症促進性表現型につながり得る老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の発現を特徴とする、加齢表現型または疾患表現型に関連する不可逆的な細胞周期停止の状態である（１５）。老化表現型を有するｉＰＳＣ－ＣＭは成熟度が低く、より成熟した心筋細胞で見られるサルコメアまたはイオンチャネルタンパク質の発現が低いことが判明した。ｐ５３の上方制御は、休止状態を支持することによって発現成熟を増進し得る。３Ｄ懸濁培養においてｐ５３アクチベーターであるｎｕｔｌｉｎ－３ａを使用することにより、電気的に成熟したヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（ＰＳＣ－ＣＭ）を生成することを提唱する。
目的２の論拠
インターロイキン－６（ＩＬ－６）などのＳＡＳＰタンパク質はパラクリン作用によって近傍細胞に有害な影響を与える可能性があるため、セノリティックによる老化細胞の除去が生存細胞の成熟を増進し得るかどうかを試験する。セノリティックであるケルセチンは、老化腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し得る、リンゴなどの食物に見出されるフラボノールである（１６）。ケルセチンが３Ｄ懸濁培養下で老化表現型の抑制によってｉＰＳＣ－ＣＭの電気的成熟を向上させ得るかどうかを評価する。
目的１及び２についての実験設計及び方法
ＰＳＣ－ＣＭを３Ｄ培養下でｎｕｔｌｉｎ－３ａ（目的１）またはケルセチン（目的２）によって処置する。提唱される介入が成熟を向上させるかどうかを判定するために、ｉＰＳＣ－ＣＭの収縮的特性、代謝的特性、及び電気的特性の特性解析を行う。細胞の電気的特性の完全な特性解析が焦点となる。これは、将来の研究でこれらのｉＰＳＣ－ＣＭが大型動物ｉｎ ｖｉｖｏモデルに移植された場合に、提唱される介入が心室性不整脈のリスクを低減させ得るかどうかを理解するために重要になるであろう。
細胞株、分化及び処置。少なくとも２つの異なる起源細胞型（例えば、線維芽細胞由来または末梢血単核細胞由来のｉＰＳＣ）で、男女両方のドナーからの少なくとも３つのヒト人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）株（ＤｉＰＳ １０１６ ＳｅｖＡ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＣＳＤ１４２ｉ－８６－１）を各実験に用いる。これにより、我々の所見が複数の細胞株でロバストであるという確信が得られるであろう。細胞株は、Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｉＰＳＣコア施設から（ＤｉＰＳ １０１６ ＳｅｖＡ）、他の学術的細胞販売元から、確立された幹細胞バンク（ＵＣＳＤ１４２ｉ－８６－１株のＷｉＣｅｌｌなど）から、または商業的ベンダー（Ｇｉｂｃｏ）から取得する。Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ（１１）によって概説された分化プロトコルを使用する。この分化プロトコルは、２Ｄ培養及び３Ｄ培養の両方に首尾よく適合されている。心筋細胞の拍動発生後（分化の約７～９日目）、異なる時点及び濃度で、ｉＰＳＣ－ＣＭをＮｕｔｌｉｎ－３ａ（目的１）またはケルセチン（目的２）のいずれかで処置する。
心筋細胞の特性解析。提唱される介入がｉＰＳＣ－ＣＭ成熟に影響するかどうかを評価するために、ｉＰＳＣ－ＣＭの代謝的特性、収縮的特性、及び電気生理学的特性を定量化する。選択された代謝タンパク質（ＧＬＵＴ１－４、ＦＡＴＰ１－６、ＰＰＡＲａ、ＰＰＡＲｇ、ＰＧＣ１ａ）、収縮タンパク質（ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＭＹＨ６、及びＭＹＨ７）、及びイオンチャネルタンパク質（ＫＣＮＪ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＲＹＲ２、及びＨＣＮ４）のｍＲＮＡ発現をシングルセルＲＮＡｓｅｑによって評価し、タンパク質発現をウエスタン分析によって評価する。ミトコンドリア膜分極はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって定量化する。Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を評価する。２Ｄ培養下の収縮性は、ビデオベースの分析及び付随するＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプト（１７）を使用して定量化する。カルシウム過渡は、Ｆｌｕｏ－４（１８）を使用して分析し、活動電位持続期間は、Ｖａｌａキネティックイメージサイトメーター（ＫＩＣ）（２０）を使用したＦｌｕｏＶｏｌｔ技術（１９）を使用して分析する。パッチクランプ分析を行って、静止膜電位及びＩＫ１を定量化する。
参考文献リスト
１． Ｌａｆｌａｍｍｅ ＭＡ， Ｍｕｒｒｙ ＣＥ． Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５；２３（７）：８４５－５６． Ｅｐｕｂ ２００５／０７／０９． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｂｔ１１１７． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： １６００３３７３．
２． Ｃｈｏｎｇ ＪＪ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｄｏｎ ＣＷ， Ｍｉｎａｍｉ Ｅ， Ｌｉｕ ＹＷ， Ｗｅｙｅｒｓ ＪＪ， Ｍａｈｏｎｅｙ ＷＭ， Ｖａｎ Ｂｉｂｅｒ Ｂ， Ｃｏｏｋ ＳＭ， Ｐａｌｐａｎｔ ＮＪ， Ｇａｎｔｚ ＪＡ， Ｆｕｇａｔｅ ＪＡ， Ｍｕｓｋｈｅｌｉ Ｖ， Ｇｏｕｇｈ ＧＭ， Ｖｏｇｅｌ ＫＷ， Ａｓｔｌｅｙ ＣＡ， Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ＣＥ， Ｂａｌｄｅｓｓａｒｉ Ａ， Ｐａｂｏｎ Ｌ， Ｒｅｉｎｅｃｋｅ Ｈ， Ｇｉｌｌ ＥＡ， Ｎｅｌｓｏｎ Ｖ， Ｋｉｅｍ ＨＰ， Ｌａｆｌａｍｍｅ ＭＡ， Ｍｕｒｒｙ ＣＥ． Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｈｅａｒｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１４；５１０（７５０４）：２７３－７． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３２３３． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４７７６７９７；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ４１５４５９４．
３． Ｌｉｕ ＹＷ， Ｃｈｅｎ Ｂ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｆｕｇａｔｅ ＪＡ， Ｋａｌｕｃｋｉ ＦＡ， Ｆｕｔａｋｕｃｈｉ－Ｔｓｕｃｈｉｄａ Ａ， Ｃｏｕｔｕｒｅ Ｌ， Ｖｏｇｅｌ ＫＷ， Ａｓｔｌｅｙ ＣＡ， Ｂａｌｄｅｓｓａｒｉ Ａ， Ｏｇｌｅ Ｊ， Ｄｏｎ ＣＷ， Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＺＬ， Ｓｅｓｌａｒ ＳＰ， Ｔｕｃｋ ＳＡ， Ｔｓｕｃｈｉｄａ Ｈ， Ｎａｕｍｏｖａ ＡＶ， Ｄｕｐｒａｓ ＳＫ， Ｌｙｕ ＭＳ， Ｌｅｅ Ｊ， Ｈａｉｌｅｙ ＤＷ， Ｒｅｉｎｅｃｋｅ Ｈ， Ｐａｂｏｎ Ｌ， Ｆｒｙｅｒ ＢＨ， ＭａｃＬｅｌｌａｎ ＷＲ， Ｔｈｉｅｓ ＲＳ， Ｍｕｒｒｙ ＣＥ． Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｒｅｓｔｏｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｈｅａｒｔｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１８；３６（７）：５９７－６０５． Ｅｐｕｂ ２０１８／０７／０４． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｂｔ．４１６２． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２９９６９４４０；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ６３２９３７５．
４． Ｒｏｍａｇｎｕｏｌｏ Ｒ， Ｍａｓｏｕｄｐｏｕｒ Ｈ， Ｐｏｒｔａ－Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ， Ｑｉａｎｇ Ｂ， Ｂａｒｒｙ Ｊ， Ｌａｓｋａｒｙ Ａ， Ｑｉ Ｘ， Ｍａｓｓｅ Ｓ， Ｍａｇｔｉｂａｙ Ｋ， Ｋａｗａｊｉｒｉ Ｈ， Ｗｕ Ｊ， Ｖａｌｄｍａｎ Ｓａｄｉｋｏｖ Ｔ， Ｒｏｔｈｂｅｒｇ Ｊ， Ｐａｎｃｈａｌｉｎｇａｍ ＫＭ， Ｔｉｔｕｓ Ｅ， Ｌｉ ＲＫ， Ｚａｎｄｓｔｒａ ＰＷ， Ｗｒｉｇｈｔ ＧＡ， Ｎａｎｔｈａｋｕｍａｒ Ｋ， Ｇｈｕｇｒｅ ＮＲ， Ｋｅｌｌｅｒ Ｇ， Ｌａｆｌａｍｍｅ ＭＡ． Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｔｈｅ Ｉｎｆａｒｃｔｅｄ Ｐｉｇ Ｈｅａｒｔ ｂｕｔ Ｉｎｄｕｃｅ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｔａｃｈｙａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０１９；１２：９６７－８１． Ｅｐｕｂ ２０１９／０５／０６． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１９．０４．００５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３１０５６４７９．
５． Ｋａｒｂａｓｓｉ Ｅ， Ｆｅｎｉｘ Ａ， Ｍａｒｃｈｉａｎｏ Ｓ， Ｍｕｒａｏｋａ Ｎ， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｍｕｒｒｙ ＣＥ． Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ： ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０２０；１７（６）：３４１－５９． Ｅｐｕｂ ２０２０／０２／０６． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５６９－０１９－０３３１－ｘ． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３２０１５５２８；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ７２３９７４９．
６． Ｍｏｎｔｅｓｓｕｉｔ Ｃ， Ｐａｌｍａ Ｔ， Ｖｉｇｌｉｎｏ Ｃ， Ｐｅｌｌｉｅｕｘ Ｃ， Ｌｅｒｃｈ Ｒ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ｉ ｏｎ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ． ２００６；４５２（４）：３８０－６． ｄｏｉ： １０．１００７／ｓ００４２４－００６－００５９－４． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： １６５８６０９４．
７． Ｙａｎｇ Ｘ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｍ， Ｐａｂｏｎ Ｌ， Ｆｉｓｃｈｅｒ ＫＡ， Ｒｅｉｎｅｃｋｅ Ｈ， Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｍ， Ｓｎｉａｄｅｃｋｉ ＮＪ， Ｒｕｏｈｏｌａ－Ｂａｋｅｒ Ｈ， Ｍｕｒｒｙ ＣＥ． Ｔｒｉ－ｉｏｄｏ－ｌ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０１４；７２：２９６－３０４． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｙｊｍｃｃ．２０１４．０４．００５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４７３５８３０；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ４０４１７３２．
８． Ｙａｎｇ Ｘ， Ｐａｂｏｎ Ｌ， Ｍｕｒｒｙ ＣＥ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ： ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０１４；１１４（３）：５１１－２３． ｄｏｉ： １０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１４．３００５５８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４４８１８４２；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ３９５５３７０．
９． Ｆｅｙｅｎ ＤＡＭ， ＭｃＫｅｉｔｈａｎ ＷＬ， Ｂｒｕｙｎｅｅｌ ＡＡＮ， Ｓｐｉｅｒｉｎｇ Ｓ， Ｈｏｒｍａｎｎ Ｌ， Ｕｌｍｅｒ Ｂ， Ｚｈａｎｇ Ｈ， Ｂｒｉｇａｎｔｉ Ｆ， Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ Ｍ， Ｈｅｇｙｉ Ｂ， Ｌｉａｏ Ｚ， Ｐｏｌｏｎｅｎ ＲＰ， Ｇｉｎｓｂｕｒｇ ＫＳ， Ｌａｍ ＣＫ， Ｓｅｒｒａｎｏ Ｒ， Ｗａｈｌｑｕｉｓｔ Ｃ， Ｋｒｅｙｍｅｒｍａｎ Ａ， Ｖｕ Ｍ， Ａｍａｔｙａ ＰＬ， Ｂｅｈｒｅｎｓ ＣＳ， Ｒａｎｊｂａｒｖａｚｉｒｉ Ｓ， Ｍａａｓ ＲＧＣ， Ｇｒｅｅｎｈａｗ Ｍ， Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｄ， Ｗｕ ＪＣ， Ｂｅｒｓ ＤＭ， Ｅｓｃｈｅｎｈａｇｅｎ Ｔ， Ｍｅｔａｌｌｏ ＣＭ， Ｍｅｒｃｏｌａ Ｍ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２０２０；３２（３）：１０７９２５． Ｅｐｕｂ ２０２０／０７／２３． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０２０．１０７９２５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３２６９７９９７．
１０． Ｇａｒｂｅｒｎ ＪＣ， Ｈｅｌｍａｎ Ａ， Ｓｅｒｅｄａ Ｒ， Ｓａｒｉｋｈａｎｉ Ｍ， Ａｈｍｅｄ Ａ， Ｅｓｃａｌａｎｔｅ ＧＯ， Ｏｇｕｒｌｕ Ｒ， Ｋｉｍ ＳＬ， Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＪＦ， Ｃｈｏ Ａ， ＭａｃＱｕｅｅｎ Ｌ， Ｂｅｚｚｅｒｉｄｅｓ ＶＪ， Ｐａｒｋｅｒ ＫＫ， Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ， Ｌｅｅ ＲＴ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｐ５３－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２０２０；１４１（４）：２８５－３００． Ｅｐｕｂ ２０１９／１１／１２． ｄｏｉ： １０．１１６１／ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮＡＨＡ．１１９．０４４２０５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３１７０７８３１；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ７００９７４０．
１１． Ｌｉａｎ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ａｚａｒｉｎ ＳＭ， Ｚｈｕ Ｋ， Ｈａｚｅｌｔｉｎｅ ＬＢ， Ｂａｏ Ｘ， Ｈｓｉａｏ Ｃ， Ｋａｍｐ ＴＪ， Ｐａｌｅｃｅｋ ＳＰ． Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｕｎｄｅｒ ｆｕｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１３；８（１）：１６２－７５． Ｅｐｕｂ ２０１２／１２／２２． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１５０． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２３２５７９８４；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ３６１２９６８．
１２． Ｋｅｍｐｆ Ｈ， Ｋｒｏｐｐ Ｃ， Ｏｌｍｅｒ Ｒ， Ｍａｒｔｉｎ Ｕ， Ｚｗｅｉｇｅｒｄｔ Ｒ． Ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｃａｌａｂｌｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１５；１０（９）：１３４５－６１． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０８９． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２６２７０３９４．
１３． Ｒｉｅｄｌ Ａ， Ｓｃｈｌｅｄｅｒｅｒ Ｍ， Ｐｕｄｅｌｋｏ Ｋ， Ｓｔａｄｌｅｒ Ｍ， Ｗａｌｔｅｒ Ｓ， Ｕｎｔｅｒｌｅｕｔｈｎｅｒ Ｄ， Ｕｎｇｅｒ Ｃ， Ｋｒａｍｅｒ Ｎ， Ｈｅｎｇｓｔｓｃｈｌａｇｅｒ Ｍ， Ｋｅｎｎｅｒ Ｌ， Ｐｆｅｉｆｆｅｒ Ｄ， Ｋｒｕｐｉｔｚａ Ｇ， Ｄｏｌｚｎｉｇ Ｈ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ２Ｄ ｖｓ ３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＡＫＴ－ｍＴＯＲ－Ｓ６Ｋ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２０１７；１３０（１）：２０３－１８． Ｅｐｕｂ ２０１６／０９／２５． ｄｏｉ： １０．１２４２／ｊｃｓ．１８８１０２． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２７６６３５１１．
１４． Ｙａｏ Ｇ． Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ． Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｆｏｃｕｓ． ２０１４；４（３）：２０１３００７４． Ｅｐｕｂ ２０１４／０６／０７． ｄｏｉ： １０．１０９８／ｒｓｆｓ．２０１３．００７４． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２４９０４７３７；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ３９９６５８６．
１５． Ｄｉ Ｍｉｃｃｏ Ｒ， Ｋｒｉｚｈａｎｏｖｓｋｙ Ｖ， Ｂａｋｅｒ Ｄ， ｄ’Ａｄｄａ ｄｉ Ｆａｇａｇｎａ Ｆ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ａｇｅｉｎｇ： ｆｒｏｍ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０２１；２２（２）：７５－９５． Ｅｐｕｂ ２０２０／１２／１８． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５８０－０２０－００３１４－ｗ． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３３３２８６１４．
１６． Ｚｈｕ Ｙ， Ｔｃｈｋｏｎｉａ Ｔ， Ｐｉｒｔｓｋｈａｌａｖａ Ｔ， Ｇｏｗｅｒ ＡＣ， Ｄｉｎｇ Ｈ， Ｇｉｏｒｇａｄｚｅ Ｎ， Ｐａｌｍｅｒ ＡＫ， Ｉｋｅｎｏ Ｙ， Ｈｕｂｂａｒｄ ＧＢ， Ｌｅｎｂｕｒｇ Ｍ， Ｏ’Ｈａｒａ ＳＰ， ＬａＲｕｓｓｏ ＮＦ， Ｍｉｌｌｅｒ ＪＤ， Ｒｏｏｓ ＣＭ， Ｖｅｒｚｏｓａ ＧＣ， ＬｅＢｒａｓｓｅｕｒ ＮＫ， Ｗｒｅｎ ＪＤ， Ｆａｒｒ ＪＮ， Ｋｈｏｓｌａ Ｓ， Ｓｔｏｕｔ ＭＢ， ＭｃＧｏｗａｎ ＳＪ， Ｆｕｈｒｍａｎｎ－Ｓｔｒｏｉｓｓｎｉｇｇ Ｈ， Ｇｕｒｋａｒ ＡＵ， Ｚｈａｏ Ｊ， Ｃｏｌａｎｇｅｌｏ Ｄ， Ｄｏｒｒｏｎｓｏｒｏ Ａ， Ｌｉｎｇ ＹＹ， Ｂａｒｇｈｏｕｔｈｙ ＡＳ， Ｎａｖａｒｒｏ ＤＣ， Ｓａｎｏ Ｔ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＤ， Ｎｉｅｄｅｒｎｈｏｆｅｒ ＬＪ， Ｋｉｒｋｌａｎｄ ＪＬ． Ｔｈｅ Ａｃｈｉｌｌｅｓ’ ｈｅｅｌ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌｓ： ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｔｏ ｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ． Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ． ２０１５；１４（４）：６４４－５８． ｄｏｉ： １０．１１１１／ａｃｅｌ．１２３４４．
１７． Ｈｕｅｂｓｃｈ Ｎ， Ｌｏｓｋｉｌｌ Ｐ， Ｍａｎｄｅｇａｒ ＭＡ， Ｍａｒｋｓ ＮＣ， Ｓｈｅｅｈａｎ ＡＳ， Ｍａ Ｚ， Ｍａｔｈｕｒ Ａ， Ｎｇｕｙｅｎ ＴＮ， Ｙｏｏ ＪＣ， Ｊｕｄｇｅ ＬＭ， Ｓｐｅｎｃｅｒ ＣＩ， Ｃｈｕｋｋａ ＡＣ， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＣＲ， Ｓｏ ＰＬ， Ｃｏｎｋｌｉｎ ＢＲ， Ｈｅａｌｙ ＫＥ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｖｉｄｅｏ－Ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｆｌｕｘ ｉｎ Ｈｕｍａｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｖｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｐａｔｉａｌ Ｓｃａｌｅｓ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１５；２１（５）：４６７－７９． Ｅｐｕｂ ２０１４／１０／２２． ｄｏｉ： １０．１０８９／ｔｅｎ．ＴＥＣ．２０１４．０２８３． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２５３３３９６７；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ４４１０２８６．
１８． Ａｈｏｌａ Ａ， Ｐｏｌｏｎｅｎ ＲＰ， Ａａｌｔｏ－Ｓｅｔａｌａ Ｋ， Ｈｙｔｔｉｎｅｎ Ｊ． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ． ２０１８；４６（１）：１４８－５８． Ｅｐｕｂ ２０１７／１０／０５． ｄｏｉ： １０．１００７／ｓ１０４３９－０１７－１９３３－２． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２８９７５４６０；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ５７５４４５３．
１９． Ｂｅｄｕｔ Ｓ， Ｓｅｍｉｎａｔｏｒｅ－Ｎｏｌｅ Ｃ， Ｌａｍａｍｙ Ｖ， Ｃａｉｇｎａｒｄ Ｓ， Ｂｏｕｔｉｎ ＪＡ， Ｎｏｓｊｅａｎ Ｏ， Ｓｔｅｐｈａｎ ＪＰ， Ｃｏｇｅ Ｆ． Ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｒｕｇ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｖｏｌｔａｇｅ－ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１６；３１１（１）：Ｈ４４－５３． Ｅｐｕｂ ２０１６／０５／２１． ｄｏｉ： １０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００７９３．２０１５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２７１９９１２８．
２０． Ｌｕ ＨＲ， Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｒ， Ｐｒｉｃｅ ＪＨ， Ｖｅｇａ Ｒ， Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＥＲ， Ｃｅｒｉｇｎｏｌｉ Ｆ， Ｔｏｗａｒｔ Ｒ， Ｇａｌｌａｃｈｅｒ ＤＪ． Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａ＋＋ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｂｙ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｙ： Ａ Ｃａｒｄｉａｃ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｌａｒｇｅ Ｐａｎｅｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ． ２０１５；１４８（２）：５０３－１６． Ｅｐｕｂ ２０１５／０９／１２． ｄｏｉ： １０．１０９３／ｔｏｘｓｃｉ／ｋｆｖ２０１． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２６３５８００３．
２１． Ｔｉｓａｔｏ Ｖ， Ｖｏｌｔａｎ Ｒ， Ｇｏｎｅｌｌｉ Ａ， Ｓｅｃｃｈｉｅｒｏ Ｐ， Ｚａｕｌｉ Ｇ． ＭＤＭ２／Ｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ： ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ． ２０１７；１０（１）：１３３． Ｅｐｕｂ ２０１７／０７／０５． ｄｏｉ： １０．１１８６／ｓ１３０４５－０１７－０５００－５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２８６７３３１３；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ５４９６３６８．
２２． Ｈａｎ ＭＫ， Ｂａｒｒｅｔｏ ＴＡ， Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＦＪ， Ｃｏｍｓｔｏｃｋ ＡＴ， Ｓａｊｊａｎ ＵＳ． Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． ＢＭＪ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ． ２０２０；７（１）． Ｅｐｕｂ ２０２０／０２／２０． ｄｏｉ： １０．１１３６／ｂｍｊｒｅｓｐ－２０１８－０００３９２． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３２０７１１４９；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ７０４７４９１．
２３． Ｄｅｈｇｈａｎｉ Ｆ， Ｓｅｚａｖａｒ Ｓｅｙｅｄｉ Ｊａｎｄａｇｈｉ ＳＨ， Ｊａｎａｎｉ Ｌ， Ｓａｒｅｂａｎｈａｓｓａｎａｂａｄｉ Ｍ， Ｅｍａｍａｔ Ｈ， Ｖａｆａ Ｍ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ ｉｎ ｐｏｓｔ－ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ： Ａ ｄｏｕｂｌｅ ｂｌｉｎｄ， ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ， ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ． Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ Ｒｅｓ． ２０２０． Ｅｐｕｂ ２０２０／１１／２１． ｄｏｉ： １０．１００２／ｐｔｒ．６９５５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３３２１６４２１．
２４． Ａｕｃｏｉｎ Ｍ， Ｃｏｏｌｅｙ Ｋ， Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＰＲ， Ｃａｒｄｏｚｏ Ｖ， Ｒｅｍｙ Ｄ， Ｃｒａｍｅｒ Ｈ， Ｎｅｙｒｅ Ａｂａｄ Ｃ， Ｈａｎｎａｎ Ｎ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ： Ａ ｒａｐｉｄ ｒｅｖｉｅｗ． Ａｄｖ Ｉｎｔｅｇｒ Ｍｅｄ． ２０２０；７（４）：２４７－５１． Ｅｐｕｂ ２０２０／０８／２５． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ａｉｍｅｄ．２０２０．０７．００７． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３２８３７８９１；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ７３９２１０７．
２５． Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ＵＳＦａＤ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ２０２１． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ－ｂｌｏｏｄ－ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／ｃｅｌｌｕｌａｒ－ｇｅｎｅ－ｔｈｅｒａｐｙ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ．
２６． Ｓｈｉｂａ Ｙ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ Ｓ， Ｚｈｕ ＷＺ， Ｆｉｌｉｃｅ Ｄ， Ｍｕｓｋｈｅｌｉ Ｖ， Ｋｉｍ Ｊ， Ｐａｌｐａｎｔ ＮＪ， Ｇａｎｔｚ Ｊ， Ｍｏｙｅｓ ＫＷ， Ｒｅｉｎｅｃｋｅ Ｈ， Ｖａｎ Ｂｉｂｅｒ Ｂ， Ｄａｒｄａｓ Ｔ， Ｍｉｇｎｏｎｅ ＪＬ， Ｉｚａｗａ Ａ， Ｈａｎｎａ Ｒ， Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ Ｍ， Ｇｏｌｄ ＪＤ， Ｋｏｔｌｉｋｏｆｆ ＭＩ， Ｓａｒｖａｚｙａｎ Ｎ， Ｋａｙ ＭＷ， Ｍｕｒｒｙ ＣＥ， Ｌａｆｌａｍｍｅ ＭＡ． Ｈｕｍａｎ ＥＳ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｃｏｕｐｌｅ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ ｉｎ ｉｎｊｕｒｅｄ ｈｅａｒｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１２；４８９（７４１５）：３２２－５． Ｅｐｕｂ ２０１２／０８／０７． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１３１７． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２２８６４４１５；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ３４４３３２４．
２７． Ｍａｒｉｎ Ｖ， Ｃｒｉｂｉｏｌｉ Ｅ， Ｐｈｉｌｉｐ Ｂ， Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ Ｓ， Ｐｉｚｚｉｔｏｌａ Ｉ， Ｂｉｏｎｄｉ Ａ， Ｂｉａｇｉ Ｅ， Ｐｕｌｅ Ｍ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｉｃｉｄｅ－ｇｅｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１２；２３（６）：３７６－８６． Ｅｐｕｂ ２０１２／１１／２９． ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１２．０５０． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２３１８６１６５；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ４０１５０８０．
２８． Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ Ｍ， Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ Ｐ， Ｃｈｌｅｂａｎｏｗｓｋａ Ｐ， Ｍａｊｋａ Ｍ． Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＨＳＶ－ＴＫ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ “Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｅｘｉｔ” Ｓｗｉｔｃｈ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１８；１９（１）． Ｅｐｕｂ ２０１８／０１／１０． ｄｏｉ： １０．３３９０／ｉｊｍｓ１９０１０１９７． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２９３１５２２１；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ５７９６１４６．
２９． Ｄｉ Ｓｔａｓｉ Ａ， Ｔｅｙ ＳＫ， Ｄｏｔｔｉ Ｇ， Ｆｕｊｉｔａ Ｙ， Ｋｅｎｎｅｄｙ－Ｎａｓｓｅｒ Ａ， Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｃ， Ｓｔｒａａｔｈｏｆ Ｋ， Ｌｉｕ Ｅ， Ｄｕｒｅｔｔ ＡＧ， Ｇｒｉｌｌｅｙ Ｂ， Ｌｉｕ Ｈ， Ｃｒｕｚ ＣＲ， Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ， Ｇｅｅ ＡＰ， Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ Ｊ， Ｋｒａｎｃｅ ＲＡ， Ｈｅｓｌｏｐ ＨＥ， Ｓｐｅｎｃｅｒ ＤＭ， Ｒｏｏｎｅｙ ＣＭ， Ｂｒｅｎｎｅｒ ＭＫ． Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓ ａ ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１１；３６５（１８）：１６７３－８３． Ｅｐｕｂ ２０１１／１１／０４． ｄｏｉ： １０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１１０６１５２． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２２０４７５５８；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ３２３６３７０．
３０． Ｈａｎ Ｘ， Ｗａｎｇ Ｍ， Ｄｕａｎ Ｓ， Ｆｒａｎｃｏ ＰＪ， Ｋｅｎｔｙ ＪＨ， Ｈｅｄｒｉｃｋ Ｐ， Ｘｉａ Ｙ， Ａｌｌｅｎ Ａ， Ｆｅｒｒｅｉｒａ ＬＭＲ， Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ ＪＬ， Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ， Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ＴＢ， Ｃｏｗａｎ ＣＡ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１９；１１６（２１）：１０４４１－６． Ｅｐｕｂ ２０１９／０５／０２． ｄｏｉ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．１９０２５６６１１６． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３１０４０２０９；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ６５３５０３５．
３１． Ｄｅｕｓｅ Ｔ， Ｈｕ Ｘ， Ｇｒａｖｉｎａ Ａ， Ｗａｎｇ Ｄ， Ｔｅｄｉａｓｈｖｉｌｉ Ｇ， Ｄｅ Ｃ， Ｔｈａｙｅｒ ＷＯ， Ｗａｈｌ Ａ， Ｇａｒｃｉａ ＪＶ， Ｒｅｉｃｈｅｎｓｐｕｒｎｅｒ Ｈ， Ｄａｖｉｓ ＭＭ， Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ， Ｓｃｈｒｅｐｆｅｒ Ｓ． Ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｖａｄｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｕｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１９；３７（３）：２５２－８． Ｅｐｕｂ ２０１９／０２／２０． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５８７－０１９－００１６－３． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３０７７８２３２；ＰＭＣＩＤ： ＰＭＣ６４１９５１６．

Claims (72)

  1. 三次元培養において少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と未熟心筋細胞を接触させることを含む、前記未熟心筋細胞から成熟した心筋細胞を生産する方法。
  2. 前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子が、ｐ５３上方制御因子を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子が、セノリティック、ＭＤＭ２インヒビター、ｍＴＯＲインヒビター、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子が、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、Ｔｏｒｉｎ１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子が、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子が、ｎｕｔｌｉｎ－３ａを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子が、ケルセチンを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子をパルス処置によって前記未熟心筋細胞と接触させる、請求項１に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子を連続処置によって前記未熟心筋細胞と接触させる、請求項１に記載の方法。
  10. 前記未熟心筋細胞がｉＰＳ細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
  11. 前記未熟心筋細胞がＥＳ細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
  12. 前記未熟心筋細胞がＴ細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記未熟心筋細胞が線維芽細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記未熟心筋細胞が胎児心筋細胞に類似する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記未熟心筋細胞が拍動を開始した後に、前記未熟心筋細胞を前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させる、請求項１に記載の方法。
  16. 前記未熟心筋細胞が拍動を開始した１～３日後に、前記未熟心筋細胞を前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させる、請求項１に記載の方法。
  17. 前記成熟した心筋細胞が、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上の成熟遺伝子の発現増加を呈する、請求項１に記載の方法。
  18. 前記１つ以上の成熟遺伝子が、ＴＮＮＩ３、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＮＰＰＢ、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮＡ１ｃ、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＰＡＲＧＣ１、ＫＣＮＪ２、ＲＥＳＴ、ＲｙＲ、及びＳＣＮ５ａからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記成熟した心筋細胞が、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上のサルコメアタンパク質の発現増加を呈する、請求項１に記載の方法。
  20. 前記１つ以上のサルコメアタンパク質が、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＭＹＨ６、及びＭＹＨ７からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記成熟した心筋細胞が、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上のイオンチャネル遺伝子の発現増加を呈する、請求項１に記載の方法。
  22. 前記１つ以上のイオンチャネル遺伝子が、ＫＣＮＪ２、ＨＣＮ４、ＳＣＮ５ａ、ＲＹＲ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、及びＳＥＲＣＡ２ａからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記成熟した心筋細胞が、未熟心筋細胞と比較して、ＲＥＳＴ及び／またはＧＡＴＡ４の発現増加を呈する、請求項１に記載の方法。
  24. 前記成熟した心筋細胞が、未熟心筋細胞と比較して、減少した拍動速度を呈する、請求項１に記載の方法。
  25. 前記成熟した心筋細胞が、－７０ｍＶ以下の静止膜電位を呈する、請求項１に記載の方法。
  26. 前記成熟した心筋細胞が、毎分４０拍未満の自発拍動速度を呈する、請求項１に記載の方法。
  27. 前記成熟した心筋細胞が、２００Ｖ／秒を超えるアップストローク速度を呈する、請求項１に記載の方法。
  28. 前記成熟した心筋細胞が、電気的に成熟した心筋細胞である、請求項１に記載の方法。
  29. 前記成熟した心筋細胞が、収縮性の成熟した心筋細胞である、請求項１に記載の方法。
  30. 前記成熟した心筋細胞が、代謝的に成熟した心筋細胞である、請求項１に記載の方法。
  31. 前記成熟した心筋細胞が、電気的、収縮性、及び代謝的に成熟した心筋細胞である、請求項１に記載の方法。
  32. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法によって生産された非自然発生の心筋細胞。
  33. 前記非自然発生の心筋細胞が、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上の成熟遺伝子の発現増加を呈する、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  34. 前記１つ以上の成熟遺伝子が、ＴＮＮＩ３、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＮＰＰＢ、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮＡ１ｃ、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＰＡＲＧＣ１、ＫＣＮＪ２、ＲＥＳＴ、ＲｙＲ、及びＳＣＮ５ａからなる群から選択される、請求項３３に記載の非自然発生の心筋細胞。
  35. 前記非自然発生の心筋細胞が、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上のサルコメアタンパク質の発現増加を呈する、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  36. 前記１つ以上のサルコメアタンパク質が、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＭＹＨ６、及びＭＹＨ７からなる群から選択される、請求項３５に記載の非自然発生の心筋細胞。
  37. 前記非自然発生の心筋細胞が、未熟心筋細胞と比較して、１つ以上のイオンチャネル遺伝子の発現増加を呈する、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  38. 前記１つ以上のイオンチャネル遺伝子が、ＫＣＮＪ２、ＨＣＮ４、ＳＣＮ５ａ、ＲＹＲ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、及びＳＥＲＣＡ２ａからなる群から選択される、請求項３７に記載の非自然発生の心筋細胞。
  39. 前記非自然発生の心筋細胞が、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＫＣＮＪ２、及びｐ５３のうちの１つ以上の発現増加を呈する、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  40. 前記非自然発生の心筋細胞が、未熟心筋細胞と比較して、減少した拍動速度を呈する、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  41. 前記非自然発生の心筋細胞が、－７０ｍＶ以下の静止膜電位を呈する、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  42. 前記非自然発生の心筋細胞が、毎分４０拍未満の自発拍動速度を呈する、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  43. 前記非自然発生の心筋細胞が、２００Ｖ／秒を超えるアップストローク速度を呈する、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  44. 前記非自然発生の心筋細胞が、電気的に成熟した心筋細胞である、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  45. 前記非自然発生の心筋細胞が、収縮性の成熟した心筋細胞である、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  46. 前記非自然発生の心筋細胞が、代謝的に成熟した心筋細胞である、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  47. 前記非自然発生の心筋細胞が、電気的、収縮性、及び代謝的に成熟した心筋細胞である、請求項３２に記載の非自然発生の心筋細胞。
  48. 処置の方法であって、それを必要とする対象に、請求項３２～４７のいずれか１項に記載の非自然発生の心筋細胞を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
  49. 前記対象が、心室性不整脈、減少した収縮期心機能、慢性心不全、先天性心疾患、もしくは他の心疾患を有するか、またはその発症リスクを持つ、請求項４８に記載の方法。
  50. 処置の方法であって、それを必要とする対象に、請求項３２～４７のいずれか１項に記載の１つ以上の非自然発生の心筋細胞の単離集団を使用して生産された医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  51. 前記対象が、心室性不整脈、減少した収縮期心機能、慢性心不全、先天性心疾患、もしくは他の心疾患を有するか、またはその発症リスクを持つ、請求項５０に記載の方法。
  52. 心臓の病態を処置するための薬品の製造における組成物の使用であって、前記処置が、それを必要とする対象への前記薬品の投与を含み、前記組成物が、請求項３２～４７のいずれか１項に記載の非自然発生の心筋細胞を少なくとも１つ含む、前記使用。
  53. 前記対象が、心室性不整脈、減少した収縮期心機能、慢性心不全、先天性心疾患、もしくは他の心疾患を有するか、またはその発症リスクを持つ、請求項５２に記載の使用。
  54. 心筋細胞の休止を誘導する方法であって、三次元培養において心筋細胞成熟因子と老化心筋細胞を接触させ、それにより、休止心筋細胞に移行するように前記老化心筋細胞を誘導することを含む、前記方法。
  55. 前記心筋細胞成熟因子が、ｐ５３の上方制御因子を含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記心筋細胞成熟因子が、ｍＴＯＲシグナル伝達経路インヒビターを含む、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記心筋細胞成熟因子が、ｐ５３の上方制御因子及びｍＴＯＲインヒビターを含む、請求項５４に記載の方法。
  58. 前記心筋細胞成熟因子が、セノリティックを含む、請求項５４に記載の方法。
  59. 前記心筋細胞成熟因子が、ＭＤＭ２インヒビターを含む、請求項５４に記載の方法。
  60. 前記心筋細胞成熟因子が、Ｔｏｒｉｎ１、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  61. 前記心筋細胞成熟因子が、Ｔｏｒｉｎ１を含む、請求項５４に記載の方法。
  62. 前記心筋細胞成熟因子が、Ｔｏｒｉｎ１及びｎｕｔｌｉｎ－３ａの組み合わせを含む、請求項５４に記載の方法。
  63. 前記心筋細胞成熟因子が、ｎｕｔｌｉｎ－３ａを含む、請求項５４に記載の方法。
  64. 前記心筋細胞成熟因子が、ケルセチンを含む、請求項５４に記載の方法。
  65. 前記心筋細胞成熟因子が、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ及びケルセチンの組み合わせを含む、請求項５４に記載の方法。
  66. 前記心筋細胞成熟因子が、Ｔｏｒｉｎ１ではない、請求項５４に記載の方法。
  67. ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、Ｔｏｒｉｎ１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と未熟心筋細胞を接触させることを含む、前記未熟心筋細胞から成熟した心筋細胞を生産する方法。
  68. 前記心筋細胞成熟因子が、ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ケルセチン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記成熟した心筋細胞が三次元培養で生産される、請求項６７に記載の方法。
  70. 前記成熟した心筋細胞が二次元培養で生産される、請求項６７に記載の方法。
  71. 前記未熟心筋細胞をパルス処置によって前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させる、請求項６７に記載の方法。
  72. 前記未熟心筋細胞を連続処置によって前記少なくとも１つの心筋細胞成熟因子と接触させる、請求項６７に記載の方法。
JP2023562560A 2021-04-11 2022-03-29 心筋細胞及び組成物ならびにそれらの生産方法 Pending JP2024513520A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163173489P 2021-04-11 2021-04-11
US63/173,489 2021-04-11
PCT/US2022/022402 WO2022221051A1 (en) 2021-04-11 2022-03-29 Cardiomyocytes and compositions and methods for producing the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024513520A true JP2024513520A (ja) 2024-03-25

Family

ID=81384824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023562560A Pending JP2024513520A (ja) 2021-04-11 2022-03-29 心筋細胞及び組成物ならびにそれらの生産方法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4323497A1 (ja)
JP (1) JP2024513520A (ja)
KR (1) KR20240004504A (ja)
CN (1) CN117529550A (ja)
AU (1) AU2022258097A1 (ja)
CA (1) CA3216537A1 (ja)
WO (1) WO2022221051A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023086599A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 President And Fellows Of Harvard College Cardiomyocytes and compositions and methods for producing the same

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3270960A (en) 1964-09-11 1966-09-06 Sperry Rand Corp Fluid sensor
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
JP2001508302A (ja) 1997-01-10 2001-06-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 胚性幹細胞血清置換
US6090622A (en) 1997-03-31 2000-07-18 The Johns Hopkins School Of Medicine Human embryonic pluripotent germ cells
CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
CA2397292A1 (en) 2000-01-14 2001-07-19 Bresagen Limited Cell production
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
US20030054331A1 (en) 2001-09-14 2003-03-20 Stemsource, Inc. Preservation of non embryonic cells from non hematopoietic tissues
CN1630526B (zh) 2001-12-07 2010-05-05 马克罗珀尔生物外科公司 用加工的脂肪抽吸细胞来治疗患者的***和方法
US20030224411A1 (en) 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
JP2022535141A (ja) * 2019-06-06 2022-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 心筋細胞及び組成物ならびにそれらを生成する方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4323497A1 (en) 2024-02-21
CN117529550A (zh) 2024-02-06
WO2022221051A1 (en) 2022-10-20
CA3216537A1 (en) 2022-10-20
KR20240004504A (ko) 2024-01-11
AU2022258097A1 (en) 2023-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10722541B2 (en) Methods for treating radiation or chemical injury
JP4448333B2 (ja) 幹細胞及び前駆細胞の分化のモジュレーション、アッセイ、並びにそれらの使用
DE202014011287U1 (de) SC-ß Zellen und Zusammensetzungen zur Erzeugung der Zellen
US11850266B2 (en) Cardiomyocytes and compositions and methods for producing the same
EP1402004A2 (en) Remodeling of somatic nuclei upon addition of pluripotent cell extracts
US11859211B2 (en) Satellite cells and compositions and methods for producing the same
JP2024513520A (ja) 心筋細胞及び組成物ならびにそれらの生産方法
US20210214690A1 (en) Stem cell-derived alpha cells and methods of generating same
WO2023086599A1 (en) Cardiomyocytes and compositions and methods for producing the same
US20220177846A1 (en) Genome-edited induced pluripotent stem cells, and cells derived therefrom, and uses thereof
US20230340417A1 (en) Defined matrix for the differentiation of islets
US20230128770A1 (en) Compositions and methods for enhancing differentiation of stem cell-derived beta cells
EP3980535A1 (en) Compositions and methods for maturing stem cell-derived beta cells