JP2024506664A - 抗ｖｅｇｆ抗体およびその使用 - Google Patents
抗ｖｅｇｆ抗体およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024506664A JP2024506664A JP2023548780A JP2023548780A JP2024506664A JP 2024506664 A JP2024506664 A JP 2024506664A JP 2023548780 A JP2023548780 A JP 2023548780A JP 2023548780 A JP2023548780 A JP 2023548780A JP 2024506664 A JP2024506664 A JP 2024506664A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- antigen binding
- acid sequence
- binding protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 claims abstract description 141
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 claims abstract description 141
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 84
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 157
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 64
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 53
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 43
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 38
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims description 26
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 claims description 26
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 15
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 claims description 14
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 7
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 claims description 7
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 claims description 7
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 7
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 7
- -1 cell Substances 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 4
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 102000055590 human KDR Human genes 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 5
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 4
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282418 Hominidae Species 0.000 description 2
- 101000851030 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102100028762 Neuropilin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000772 Neuropilin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 1-[4-[6-amino-5-[(Z)-methoxyiminomethyl]pyrimidin-4-yl]oxy-2-chlorophenyl]-3-ethylurea Chemical compound CCNC(=O)Nc1ccc(Oc2ncnc(N)c2\C=N/OC)cc1Cl BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000288951 Callithrix <genus> Species 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001037140 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-23 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100040220 Immunoglobulin heavy variable 3-23 Human genes 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 101000808007 Mus musculus Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 108010082093 Placenta Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102100040681 Platelet-derived growth factor C Human genes 0.000 description 1
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000288961 Saguinus imperator Species 0.000 description 1
- 101710105463 Snake venom vascular endothelial growth factor toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010073925 Vascular Endothelial Growth Factor B Proteins 0.000 description 1
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 description 1
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 1
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 1
- 102100038232 Vascular endothelial growth factor C Human genes 0.000 description 1
- 102100038234 Vascular endothelial growth factor D Human genes 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010017992 platelet-derived growth factor C Proteins 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
ＶＥＧＦタンパク質に結合可能である、および／またはＶＥＧＦタンパク質のＶＥＧＦＲタンパク質に対する結合を阻害可能である、単離された抗原結合タンパク質が提供される。さらに、上記単離された抗原結合タンパク質の、薬物の製造における使用が提供される。
Description
本願は、バイオ医薬の分野に関し、特に、抗ＶＥＧＦ抗体および医薬の製造におけるその使用に関する。
現在、悪性腫瘍は世界的にヒトの健康を深刻に脅かす疾患であり、ヒトを死に至らしめる主要な疾患である。国内人口の高齢化が進み、腫瘍の発生率が増加する中、有効な治療薬の開発が急務となっており、中でも抗血管新生薬の開発が近年の研究ホットスポットとなっている。腫瘍の増殖と転移には、十分な酸素と栄養を供給するための豊富な血管が必要であり、腫瘍組織は、様々な血管新生促進物質を分泌しうる。
腫瘍増殖中、上皮成長因子ＶＥＧＦは、内皮細胞の増殖を特異的に刺激し得、様々なタイプの腫瘍血管新生において重要な役割を果たしている。ＶＥＧＦは、上皮成長因子受容体ＶＥＧＦＲに結合した後、下流のシグナル伝達経路を通じて細胞内関連タンパク質遺伝子の転写と発現を仲介し、血管内皮細胞の増殖を促進する。現在、ベバシズマブ等のヒトＶＥＧＦを標的とするヒト化モノクローナル抗体が数多く開発されているが、応答率が低い、治療過程において薬剤耐性を容易に形成する等の現象が依然として存在する。そのため、安定した構造を持ち、有効性が高く、大規模な工業的生産に好適な抗腫瘍ＶＥＧＦ抗体の開発が急務となっている。
本願は、以下の特性：（１）１×１０－７Ｍ以下のＫＤ値でＶＥＧＦタンパク質に結合可能である；および（２）ＶＥＧＦタンパク質のＶＥＧＦＲタンパク質に対する結合を阻害可能である、の１つ以上を有する、単離された抗原結合タンパク質を提供する。
具体的な実施態様によれば、ＶＥＧＦタンパク質がＶＥＧＦ１６５を含む。
具体的な実施態様によれば、ＶＥＧＦＲタンパク質がＶＥＧＦＲ２を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質が抗体またはその抗原結合断片を含む。
具体的な実施態様によれば、上記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨおよび／またはｄＡｂを含む。
具体的な実施態様によれば、上記抗原結合断片がＶＨＨである。
具体的な実施態様によれば、上記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体からなる群より選択される。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質が、ＶＥＧＦタンパク質への結合に対して参照抗体と競合可能であり、前記参照抗体が重鎖可変領域ＶＨを含み、前記参照抗体の該ＶＨがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記参照抗体の該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、前記参照抗体の該ＨＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含み、前記参照抗体の該ＨＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記参照抗体のＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記参照抗体のＨＣＤＲ２が配列番号１２～１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記参照抗体のＨＣＤＲ３が配列番号１７～１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＶＨ中に少なくとも一つのＣＤＲを含み、該ＶＨが配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＶＨ中に少なくとも一つのＣＤＲを含み、該ＶＨが配列番号１～６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＨＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記ＨＣＤＲ３が配列番号１７～１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＨＣＤＲ２を含み、該ＨＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記ＨＣＤＲ２が配列番号１２～１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＨＣＤＲ１を含み、該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＤＲ２が配列番号１２～１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＤＲ３が配列番号１７～１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が以下のアミノ酸配列の群：
（１）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１２、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（２）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（３）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１４、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（４）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１８；ならびに
（５）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１９；
のいずれか一つから選択される。
（１）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１２、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（２）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（３）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１４、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（４）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１８；ならびに
（５）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１９；
のいずれか一つから選択される。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質が重鎖可変領域ＶＨを含み、該ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１を含み、該Ｈ－ＦＲ１のＣ末端が直接的にまたは間接的にＨＣＤＲ１のＮ末端に連結し、該Ｈ－ＦＲ１が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記Ｈ－ＦＲ１が配列番号７または８に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ２を含み、該Ｈ－ＦＲ２がＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ２の間に位置し、該Ｈ－ＦＲ２が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記Ｈ－ＦＲ２が配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ３を含み、該Ｈ－ＦＲ３がＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３の間に位置し、該Ｈ－ＦＲ３が配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記Ｈ－ＦＲ３が配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、Ｈ－ＦＲ４のＮ末端がＨＣＤＲ３のＣ末端に連結し、該Ｈ－ＦＲ４が配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記Ｈ－ＦＲ４が配列番号２０～２２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み、該Ｈ－ＦＲ１が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ２が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ３が配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ４が配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み、該Ｈ－ＦＲ１が配列番号７または８に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ２が配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ３が配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ４が配列番号２０～２２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質がＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み、該Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４が以下のアミノ酸配列の群：
（１）Ｆ－ＦＲ１：配列番号７、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１０、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１５、およびＨ－ＦＲ４：配列番号２０；
（２）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１６、およびＨ－ＦＲ４：配列番号２１；ならびに
（３）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１６、およびＨ－ＦＲ４：配列番号２２；
のいずれか一つから選択される。
（１）Ｆ－ＦＲ１：配列番号７、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１０、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１５、およびＨ－ＦＲ４：配列番号２０；
（２）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１６、およびＨ－ＦＲ４：配列番号２１；ならびに
（３）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１６、およびＨ－ＦＲ４：配列番号２２；
のいずれか一つから選択される。
具体的な実施態様によれば、上記単離された抗原結合タンパク質が重鎖可変領域ＶＨを含み、該ＶＨが配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様によれば、上記ＶＨが配列番号１～６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。
別の態様によれば、本願は、上記単離された抗原結合タンパク質をコードする、一つ以上の単離された核酸分子を提供する。
別の態様によれば、本願は、上記核酸分子を含む、ベクターを提供する。
別の態様によれば、本願は、上記核酸分子また上記ベクターを含む、細胞を提供する。
別の態様によれば、本願は、上記単離された抗原結合タンパク質を製造する方法であって、上記単離された抗原結合タンパク質が発現されるような条件下で上記細胞を培養することを含む、方法を提供する。
別の態様によれば、本願は、上記単離された抗原結合タンパク質、上記核酸分子、上記ベクターおよび／または上記細胞と、場合により薬学的に許容可能な坦体とを含む、医薬組成物を提供する。
別の態様によれば、本願は、上記単離された抗原結合タンパク質を含む、ポリペプチドを提供する。
別の態様によれば、本願は、上記単離された抗原結合タンパク質または上記ポリペプチドを含む、免疫コンジュゲートを提供する。
別の態様によれば、本願は、上記単離された抗原結合タンパク質、上記核酸分子、上記ベクター、上記細胞、上記医薬組成物、上記ポリペプチドおよび／または上記免疫コンジュゲートの、腫瘍の予防、緩和および／または治療のための医薬の製造における使用を提供する。
具体的な実施態様によれば、上記腫瘍がＶＥＧＦ過剰発現の腫瘍を含む。
具体的な実施態様によれば、上記腫瘍が固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含む。
具体的な実施態様によれば、上記腫瘍が、肺ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、腎臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、芽腫、頚部ガンおよび／または卵巣ガンを含む。
別の態様によれば、本願は、腫瘍を予防する、緩和するまたは治療する方法であって、それを必要とする対象に上記単離された抗原結合タンパク質、上記核酸分子、上記ベクター、上記細胞、上記医薬組成物、上記ポリペプチドおよび／または上記免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。
具体的な実施態様によれば、上記腫瘍がＶＥＧＦ過剰発現の腫瘍を含む。
具体的な実施態様によれば、上記腫瘍が固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含む。
具体的な実施態様によれば、上記腫瘍が、肺ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、腎臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、芽腫、頚部ガンおよび／または卵巣ガンを含む。
別の態様によれば、本願は、腫瘍の予防、緩和または治療における使用のための、上記単離された抗原結合タンパク質、上記核酸分子、上記ベクター、上記細胞、上記医薬組成物、上記ポリペプチドおよび／または上記免疫コンジュゲートを提供する。
具体的な実施態様によれば、上記腫瘍がＶＥＧＦ過剰発現の腫瘍を含む。
具体的な実施態様によれば、上記腫瘍が固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含む。
具体的な実施態様によれば、上記腫瘍が、肺ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、腎臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、芽腫、頚部ガンおよび／または卵巣ガンを含む。
別の態様によれば、本願は、ＶＥＧＦタンパク質のＶＥＧＦＲタンパク質に対する結合を阻害する方法であって、上記単離された抗原結合タンパク質、上記核酸分子、上記ベクター、上記細胞、上記医薬組成物、上記ポリペプチドおよび／または上記免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。
本願の他の態様および利点は、以下の詳細な説明から当業者によって容易に認識されうる。以下の詳細な説明は、本願の例示的な実施形態を図示し、説明するのみである。当業者には理解されるであろうが、本願の内容は、本願に関わる精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態を当業者が変更することを可能にする。したがって、本願に添付の図面および明細書の説明は、単に例示的なものであって限定的なものではない。
本願に関する本発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に列挙されている。本願に関する本発明の特徴および利点は、以下に詳細に記載される例示的な実施形態および添付の図面を参照することにより、よりよく理解されうる。図面の簡単な説明は以下のとおりである：
好ましい実施態様の詳細な説明
以下、本願発明の実施形態を具体的な例により説明する。当業者であれば、本明細書に開示された内容から本願の他の利点および効果を容易に理解しうる。
以下、本願発明の実施形態を具体的な例により説明する。当業者であれば、本明細書に開示された内容から本願の他の利点および効果を容易に理解しうる。
用語および定義
本願において、用語「ＶＥＧＦ」は、一般に、血管内皮細胞増殖因子を指し、天然に存在する対立遺伝子の形態およびプロセッシングされた形態を含む。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆおよび／またはＰｌＧＦを含んでもよい。本願において、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａであってもよく、これはＶＥＧＦ１６５とも呼ばれる場合がある。ＶＥＧＦ－Ａは、受容体チロシンキナーゼ、すなわちＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１）、ＶＥＧＦＲ－２（Ｆｌｋ－１／ＫＤＲ）、ＶＥＧＦＲ３およびニューロピリン－１（ＮＲＰ－１）に結合しうる。ＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦＲ２に結合した後、下流のＰＬＣ－γ－ＰＫＣ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＭＡＰＫシグナル伝達経路を通じて細胞内関連タンパク質遺伝子の転写と発現を仲介し、血管内皮細胞の増殖を促進しうる（Takahashi T et al., Oncogene, 18(13):2221- 2230. (1999)）。また、用語「ＶＥＧＦ」は、マウス、ラット、霊長類などの非ヒト種由来のＶＥＧＦを指すこともある。本願において、特定種由来のＶＥＧＦは、ｈＶＥＧＦがヒトＶＥＧＦを意味し、ｍＶＥＧＦがマウスＶＥＧＦを意味するように表されうる。一般に、ＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦを指す場合がある。用語「ＶＥＧＦ」は、インタクトなＶＥＧＦの切断型または断片を示すためにも使用され、また、ＶＥＧＦの機能的変異体、アイソフォーム、種相同体、誘導体、アナログ、およびＶＥＧＦと少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログも含む。ＶＥＧＦの配列は、当技術分野で既に知られている。例えば、例示的な全長ヒトＶＥＧＦＡタンパク質配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号 ＮＰ＿００１０２０５３７、ＮＰ＿００１０２０５３８、ＮＰ＿００１０２０５３９、ＮＰ＿００１０２０５４０またはＮＰ＿００１０２０５４１に見いだすことができる。
本願において、用語「ＶＥＧＦ」は、一般に、血管内皮細胞増殖因子を指し、天然に存在する対立遺伝子の形態およびプロセッシングされた形態を含む。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆおよび／またはＰｌＧＦを含んでもよい。本願において、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａであってもよく、これはＶＥＧＦ１６５とも呼ばれる場合がある。ＶＥＧＦ－Ａは、受容体チロシンキナーゼ、すなわちＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１）、ＶＥＧＦＲ－２（Ｆｌｋ－１／ＫＤＲ）、ＶＥＧＦＲ３およびニューロピリン－１（ＮＲＰ－１）に結合しうる。ＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦＲ２に結合した後、下流のＰＬＣ－γ－ＰＫＣ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＭＡＰＫシグナル伝達経路を通じて細胞内関連タンパク質遺伝子の転写と発現を仲介し、血管内皮細胞の増殖を促進しうる（Takahashi T et al., Oncogene, 18(13):2221- 2230. (1999)）。また、用語「ＶＥＧＦ」は、マウス、ラット、霊長類などの非ヒト種由来のＶＥＧＦを指すこともある。本願において、特定種由来のＶＥＧＦは、ｈＶＥＧＦがヒトＶＥＧＦを意味し、ｍＶＥＧＦがマウスＶＥＧＦを意味するように表されうる。一般に、ＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦを指す場合がある。用語「ＶＥＧＦ」は、インタクトなＶＥＧＦの切断型または断片を示すためにも使用され、また、ＶＥＧＦの機能的変異体、アイソフォーム、種相同体、誘導体、アナログ、およびＶＥＧＦと少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログも含む。ＶＥＧＦの配列は、当技術分野で既に知られている。例えば、例示的な全長ヒトＶＥＧＦＡタンパク質配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号 ＮＰ＿００１０２０５３７、ＮＰ＿００１０２０５３８、ＮＰ＿００１０２０５３９、ＮＰ＿００１０２０５４０またはＮＰ＿００１０２０５４１に見いだすことができる。
本願において、用語「ＶＥＧＦＲ」は、一般に、血管内皮増殖因子受容体を指し、天然に存在する対立遺伝子の形態およびプロセッシングされた形態を含む。ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１、ＣＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３、ならびに他の選択的スプライシングがなされた変異体を含みうる。ＶＥＧＦＲは、膜結合型または可溶性でありうる。また、用語「ＶＥＧＦＲ」は、マウス、ラットまたは霊長類などの非ヒト種由来のＶＥＧＦＲを指すこともある。本願において、特定の種由来のＶＥＧＦＲは、ｈＶＥＧＦＲがヒトＶＥＧＦＲを意味し、ｍＶＥＧＦＲがマウスＶＥＧＦＲを意味するように表されうる。典型的には、ＶＥＧＦＲは、ヒトＶＥＧＦＲを指す場合がある。用語「ＶＥＧＦＲ」は、インタクトなＶＥＧＦＲの切断型または断片を示すためにも使用され、ＶＥＧＦＲの機能的変異体、アイソフォーム、種の相同体、誘導体、アナログ、およびＶＥＧＦＲと少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログも含む。ＶＥＧＦＲの配列は、当該技術分野で既に知られている。例えば、例示的な全長ヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号 ＮＰ＿００２２４４で見いだすことができる。
本願において、用語「相同体」は、一般に、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。用語「相同性」は、配列の「同一性」と同一視してもよい。相同性配列には、対象配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％同一でありうるアミノ酸配列が含まれてもよい。一般に、相同体は、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は、類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮されうるか、または配列同一性の観点から表現されうる。本願において、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の配列番号のいずれか１つとパーセント同一性を有する配列への言及は、言及された配列番号の全長にわたって記載されたパーセント同一性を有する配列を指す。
本願において、用語「抗原結合タンパク質」は、一般に、抗原に結合する部分と、場合により、抗原に結合する部分が抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進するコンフォメーションをとることを可能にする足場部分または骨格部分とを含むタンパク質を指す。抗原結合タンパク質は、通常、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、またはその両方、およびそれらの機能的断片を含んでもよい。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗原結合タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、抗体、抗原結合断片、免疫コンジュゲート、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片、抗体誘導体、抗体アナログまたは融合タンパク質など（ただし、所望の抗原結合活性を示すもの）が挙げられる。
本願において、用語「抗体」は、一般に、特定のタンパク質もしくはペプチドまたはその断片と反応性を有する免疫グロブリンを指す。抗体は、任意のクラスの抗体（これらに限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）、ならびに任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）の抗体でありうる。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有しうる。抗体はまた、例えばκ（カッパ）またはλ（ラムダ）から選択される軽鎖を有してもよい。本願の抗体は、任意の生物種に由来するものでありうる。
本願において、用語「抗原結合断片」は、一般に、抗体分子の部分を指し、その部分は、抗原と相互作用し、抗原に対する特異性および親和性を抗体に付与するアミノ酸残基を含む。抗原結合断片の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂが挙げられる。本願において、用語「Ｆａｂ」は、一般に、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、さらに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる断片を指す；用語「Ｆａｂ’」は、一般に、重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシル末端への数残基（抗体のヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む）の付加によってＦａｂとは異なる断片を指す；用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、一般に、２つのＦａｂ断片がヒンジ領域上のジスルフィド橋によって連結された抗体断片を含む、Ｆａｂ’の二量体を指す。用語「Ｆｖ」は、一般に、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体断片を指す。場合によっては、この断片は、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域とが非共有結合で強固に結合した二量体からなることもある。用語「ｄｓＦｖ」は、一般に、単一の軽鎖可変領域と単一の重鎖可変領域との間の結合がジスルフィド結合である、ジスルフィド結合安定化Ｆｖ断片を指す。「ｄＡｂ断片」は、一般に、ＶＨドメインからなる抗体断片を指す。本願において、用語「ｓｃＦｖ」は、一般に、抗体の１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとを可撓性ペプチドリンカーによって共有結合で連結し、対合させることによって形成される、一価の分子を指す；このようなｓｃＦｖ分子は、一般的な構造（ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨ）を有してもよい。本願において、用語「ＶＨＨ」は、一般に、重鎖抗体の可変抗原結合ドメインを含む抗体を指す（Vanlandschoot P. et al., 2011, Antiviral Research 92, 389-407を参照）。ＶＨＨは、ナノボディ（Ｎｂ）とも呼ばれる場合がある。
本願において、用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、一般に、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖ドメインを指す。本願において、用語「可変」は、一般に、抗体の可変ドメイン配列の特定の部分が強く変化することを意味し、これは、その特定の抗原に対する様々な特異的抗体の結合性および特異性に寄与する。上記可変は、抗体の可変領域全体に均一に分布しているわけではない。相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる軽鎖および重鎖可変領域の３つのセグメントに集中しており、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と呼ばれている。可変ドメイン中のより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然型重鎖と軽鎖の各可変ドメインは、４つのＦＲ領域（Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、Ｈ－ＦＲ４、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、Ｌ－ＦＲ４）を含み、そのほとんどがβシート配置をとり、３つのＣＤＲ構造ループ領域によって連結されている。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって相互に近接し、もう一方の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する。
当技術分野において、種々の方法（例えば、配列の可変に基づくＫａｂａｔ番号付けスキームおよび定義規則（Kabat et al., Protein Sequences in Immunology, 第5版, National Institutes of Health、Bethesda, Maryland（1991）を参照）、構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームおよび定義規則（A1-Lazikani et al., JMol Biol 273：927-48、1997を参照）、生殖細胞系列のＶ遺伝子のアミノ酸配列アラインメントに基づくefrancらのＩＭＧＴ番号付けスキームおよび定義規則、ならびに、Ｈｏｎｎｅｇｅｒの番号付けスキーム（ＡＨｏ’ｓ）、Ｍａｒｔｉｎ番号付けスキーム、Ｇｅｌｆａｎｄ番号付けスキームなど（Mathieu Dondelinger et al.Understanding the Significance and Implications of Antibody Numbering and Antigen-binding Surface/Residue Definition, Front. Immunol., 2018年10月16日を参照）により、抗体の可変領域がコード化されうるか、または抗体のＣＤＲが分割されうる。
本願において、用語「モノクローナル抗体」は、一般に、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、極微量に存在するかもしれない、天然に起こりうる変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して特異性が高い。
本願において、用語「キメラ抗体」は、一般に、可変領域がある種に由来し、定常領域が他の種に由来する抗体を指す。一般に、可変領域がげっ歯類などの実験動物の抗体（「親抗体」）由来であり、定常領域がヒト抗体由来であるため、得られるキメラ抗体によってヒト個体に有害な免疫応答を引き起こす可能性は、親（例えばマウス由来）抗体と比較して低減される。
本願において、用語「ヒト化抗体」は、一般に、非ヒト抗体（マウス抗体など）のＣＤＲ外のアミノ酸の一部または全部がヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を指す。ＣＤＲにおいて、アミノ酸の付加、欠失、挿入、置換または修飾も、抗体が特異的抗原に結合する能力を保持する限り、許容されてもよい。ヒト化抗体は、場合によりヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。「ヒト化抗体」は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン配列に由来するキメラ抗体を最小限含んでもよい。場合によっては、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）のＣＤＲ領域の残基は、所望の特性、親和性および／または能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類など）のＣＤＲ領域由来の残基に置換されてもよい。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ領域の残基は、対応する非ヒト残基と置換されてもよい。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体やドナー抗体には存在しないアミノ酸修飾を含んでいてもよい。
本願において、「完全ヒト抗体」とは、一般に、ヒト抗体コード遺伝子を、抗体遺伝子欠損の遺伝子改変動物に導入することで、動物により発現される抗体を指す。抗体のすべての部分（抗体の可変領域と定常領域を含む）は、ヒト由来の遺伝子によってコードされている。当該技術分野における完全ヒト抗体を得るための方法としては、ファージディスプレイ技術、トランスジェニックマウス技術、リボソームディスプレイ技術、ＲＮＡ－ポリペプチド技術などが挙げられてもよい。
本願において、用語「結合」、「特異的結合」または「～に特異的」は、一般に、抗原と抗体の結合のような、測定可能で再現可能な相互作用を意味し、これによって、標的の存在が分子（生体分子を含む）の不均質な集団の存在下で決定されてもよい。例えば、抗体は、その抗原結合ドメインによってエピトープに結合し、この結合には、抗原結合ドメインとエピトープの間の一定の相補性が必要である。例えば、標的（エピトープであってもよい）に特異的に結合する抗体とは、他の標的に結合するよりも高い親和性、アビディティ、容易性および／または持続時間で標的に結合する抗体である。抗体がその抗原結合ドメインによってエピトープに結合し、ランダムで無関係なエピトープに結合するよりも容易に結合する場合、その抗体は、その抗原に「特異的に結合する」と呼ばれる。
本願において、用語「ＫＤ」、「ＫＤ」は、互換的に使用され、一般に、平衡解離定数を指す。「ＫＤ」は、解離速度定数（ｋｄｉｓ、「オフ速度（ｋｏｆｆ）」または「ｋｄ」とも呼ばれる）の会合速度定数（ｋｏｎ、「オン速度（ｋｏｎ）」または「ｋａ」とも呼ばれる）に対する比である。会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｄｉｓ）および平衡解離定数（ＫＤ）は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の抗原に対する結合親和性を表すために使用されうる。会合速度定数および解離速度定数を決定する方法は、当技術分野でよく知られており、これらに限定されるものではないが、バイオフィルム干渉技術（ＢＬＩ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、平衡透析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、共免疫沈降（Ｃｏ－ＩＰ）およびタンパク質チップ技術が挙げられる。異なる条件下（例えば、塩濃度やｐＨなどの観点）で測定を行った場合、特定のタンパク質－タンパク質相互作用の親和性の測定値が異なることがある。
本願において、「霊長類」は、通常、サル類および類人猿類を指し、サル類としては、マカカ属のサル（例えば、カニクイザル（カニクイザル（Macaca fascicularis））および／またはアカゲザル（アカゲザル（Macaca mulatta）））およびヒヒ（ヒヒ（Papio ursinus））ならびにマーモセット（Callithrix属の一種）、リスザル（リスザル属の一種）、タマリン（タマリン属の一種）、類人猿（例えば、チンパンジー（チンパンジー（Pan troglodytes）））、さらにはホモ・サピエンスも含まれる。
本願において、用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。これらの用語はまた、天然に存在するアミノ酸ポリマーと同様に、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸のアナログまたはミメティックであるアミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語はまた、例えば、糖タンパク質を形成するための炭水化物残基の付加やリン酸化などの修飾を受けたアミノ酸ポリマーをも包含しうる。ポリペプチドおよびタンパク質は、天然に存在する非組換え細胞によって、または遺伝子操作細胞もしくは組換え細胞によって産生され得、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然の配列の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を有する分子を含みうる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、特に、本願に記載の抗原結合タンパク質の１つ以上のアミノ酸からの欠失、付加および／または置換を有する配列を具体的に含む。
本願において、用語「単離された」は、一般に、ウイルス、核酸またはタンパク質のような生物学的材料を指し、この生物学的物質は、その天然に存在する環境において通常付随するかまたは相互作用する成分を実質的に含まない。単離された生物学的材料は、場合により、その自然環境において生物学的材料とともに見いだされない付加的な材料（例えば、核酸またはタンパク質）を含む。本願において、タンパク質が言及される場合、「単離された」とは、一般に、その分子が天然に存在することが見いだされた生物全体から単離され、分離されていること意味するか、または同じタイプの他の生物学的高分子が実質的に存在しないことを意味する。核酸分子が言及される場合、その分子が天然に関連する配列から完全にまたは部分的に分離されているか、核酸がそれに関連する異種配列を有するか、または核酸が染色体から単離されていることを意味する。
本願において、用語「免疫コンジュゲート」は、一般に、抗原結合タンパク質と、低分子活性剤であってもよい他の活性剤（例えば、化学療法剤、毒素、免疫療法剤、イメージングプローブまたは分光プローブ）とを連結することによって形成される物質を指す。
本願において、用語「核酸」分子は、一般に、それらの自然環境から単離され、ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログから任意の長さで単離された形態のもの、または人工的に合成されたものを指す。
本願において、用語「ベクター」は、一般に、好適な宿主において自己複製が可能な核酸分子を指し、挿入された核酸分子を宿主細胞内および／または宿主細胞間に移送する。ベクターには、主にＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入するためのベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡを複製するためのベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のための発現ベクターが含まれてもよい。また、ベクターには、上記の複数の機能を有するものも含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞に導入されたときにポリペプチドへの転写および翻訳が可能なポリヌクレオチドであってもよい。一般に、ベクターは、ベクターを含む好適な宿主細胞を培養することにより、所望の発現産物を産生しうる。
本願において、用語「細胞」は、一般に、本願の核酸分子からなるプラスミドまたはベクターを含んでもよいか、または既に含んでいてもよいか、または本願の抗原結合タンパク質を発現することが可能な、個々の細胞、細胞株または細胞培養物を指す。細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含んでもよい。自然変異、偶発的変異または意図的変異により、子孫細胞と元の親細胞は、本願の抗体またはその抗原結合断片を発現することが可能な限り、形態またはゲノムの点で必ずしも同一でなくてもよい。細胞は、本願のベクターを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞をトランスフェクションすることにより得てもよい。細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌）であってもよいし、真核細胞（例えば、酵母細胞、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＳＯ細胞、または骨髄腫細胞）であってもよい。場合によっては、細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。例えば、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞であってもよい。
本願において、用語「医薬組成物」は、一般に、有効成分の生物学的活性を有効にすることが可能な形態で存在し、組成物が投与される対象にとって許容できないほど有毒な追加成分を含まない、処方物を指す。
本願において、用語「治療」は、一般に、治療される個体における疾患の自然経過を変化させることを望むことを指し、予防および治療を達成するための臨床的介入であっても、臨床疾患の経過中であってもよい。望ましい治療効果としては、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理学的結果のいかなる減弱、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または寛解、および予後の緩和または改善が挙げられる。場合によっては、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）は、疾患の進行を遅延させるか、または疾患の進行を遅らせることに使用されうる。
本願において、用語「投与」は、一般に、ある用量の化合物（例えば、抗腫瘍治療剤）または医薬組成物（例えば、抗腫瘍治療剤を含む医薬組成物）を対象（例えば、患者）に投与する方法を指す。投与は、非経口投与、肺内投与、経鼻投与および（局所治療が必要な場合には）病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって実施されうる。非経口注入には、例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。
本願において、用語「腫瘍」は、一般に、すべての腫瘍性細胞の成長および増殖（悪性か良性かを問わない）、ならびにすべての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。本願において、腫瘍は、細胞および組織においてＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲが高発現している腫瘍であってもよい。腫瘍には、固形腫瘍および／または非固形腫瘍（例えば、血液腫瘍、リンパ腫）が含まれうる。
本願において、用語「間」は、一般に、アミノ酸断片のＣ末端が第一のアミノ酸断片のＮ末端に直接的または間接的に連結し、そのＮ末端が第二のアミノ酸断片のＣ末端に直接的または間接的に連結することを意味する。軽鎖では、例えば、Ｌ－ＦＲ２のＮ末端がＬＣＤＲ１のＣ末端に直接的または間接的に連結しており、Ｌ－ＦＲ２のＣ末端がＬＣＤＲ２のＮ末端に直接的または間接的に連結している。別の例では、Ｌ－ＦＲ３のＮ末端がＬＣＤＲ２のＣ末端に直接的または間接的に連結しており、Ｌ－ＦＲ３のＣ末端がＬＣＤＲ３のＮ末端に直接的または間接的に連結している。重鎖では、例えば、Ｈ－ＦＲ２のＮ末端がＨＣＤＲ１のＣ末端に直接的または間接的に連結され、Ｈ－ＦＲ２のＣ末端がＨＣＤＲ２のＮ末端に直接的または間接的に連結される。別の例では、Ｈ－ＦＲ３のＮ末端がＨＣＤＲ２のＣ末端に直接的または間接的に連結しており、Ｈ－ＦＲ３のＣ末端がＨＣＤＲ３のＮ末端に直接的または間接的に連結している。本願において、「第一のアミノ酸断片」および「第二のアミノ酸断片」は、同一であっても異なっていてもよい任意のアミノ酸断片である。
本願において、用語「含む（include/includes）」は、一般に、「含む（comprising）」、「含む（inclusive）」、「含む（containing）」、または「包含する（encompassing）」の意味を指す。場合によっては、「である（is）」、「からなる（consist of）」という意味も表す。
本願において、用語「約」は、一般に、特定の値より０．５％～１０％の上下の変動の範囲、例えば、特定の値より、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％または１０％の上下の変動の範囲を指す。
発明の詳細な説明
抗原結合タンパク質
一態様によれば、本願は、１×１０－８Ｍ以下のＫＤ値で霊長類（例えば、ヒト）由来のＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）に結合可能な、単離された抗原結合タンパク質を提供する。ＶＥＧＦ抗原結合タンパク質のＶＥＧＦに対する結合親和性は、当技術分野で知られている任意の方法で決定されてもよい。場合によっては、結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、結合抗原沈殿、平衡透析、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって決定されてもよい。場合によっては、ＶＥＧＦ抗原結合タンパク質のＶＥＧＦに対する結合親和性及びＫＤ値は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって決定されてもよい。例えば、ForteBio Octet分子間相互作用解析メータを用いて抗原抗体間の結合動態解析が実施されてもよい。
抗原結合タンパク質
一態様によれば、本願は、１×１０－８Ｍ以下のＫＤ値で霊長類（例えば、ヒト）由来のＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）に結合可能な、単離された抗原結合タンパク質を提供する。ＶＥＧＦ抗原結合タンパク質のＶＥＧＦに対する結合親和性は、当技術分野で知られている任意の方法で決定されてもよい。場合によっては、結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、結合抗原沈殿、平衡透析、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって決定されてもよい。場合によっては、ＶＥＧＦ抗原結合タンパク質のＶＥＧＦに対する結合親和性及びＫＤ値は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって決定されてもよい。例えば、ForteBio Octet分子間相互作用解析メータを用いて抗原抗体間の結合動態解析が実施されてもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、１×１０－７Ｍ以下のＫＤ値でＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）に結合しうる。例えば、ヒト由来のＶＥＧＦは、例えばForteBio Octet分子相互作用分析メータにより検出された場合、約５×１０－８Ｍ以下、約４×１０－８Ｍ以下、約３×１０－８Ｍ以下、約２×１０－８Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約９×１０－９Ｍ以下、約８×１０－９Ｍ以下、約７×１０－９Ｍ以下、約６×１０－９Ｍ以下、約５×１０－９Ｍ以下、約４×１０－９Ｍ以下、約３×１０－９Ｍ以下、約２×１０－９Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約９×１０－１０Ｍ以下、約８×１０－１０Ｍ以下、約７×１０－１０Ｍ以下のＫＤ値で結合されてもよい。
本願の抗原結合タンパク質は、ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）のＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ２）に対する結合を阻害可能である。いくつかの場合、上記抗原結合タンパク質によるＶＥＧＦのＶＥＧＦＲに対する結合の阻害は、フローサイトメトリ ＦＡＣＳ、酵素結合免疫吸着アッセイ ＥＬＩＳＡにより決定されてもよい。
例えば、ヒトＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ２）をまず漸減量の非標識抗原結合タンパク質とインキュベートし、続いて標識ＶＥＧＦタンパク質とインキュベートする。次に、ＯＤ４５０が測定され、抗原結合タンパク質がＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）のＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ２）に対する結合を阻害することを確認する。例えば、阻害活性のＩＣ５０は、約０．００１～約１０μｇ／ｍＬ、約０．００１～約５μｇ／ｍＬ、約０．０１～約１μｇ／ｍＬ、約０．０２～約０．５μｇ／ｍＬ、約０．２～約１５μｇ／ｍＬ、約０．２～約１２μｇ／ｍＬ、約０．２～約１０μｇ／ｍＬ、約０．３～約８μｇ／ｍＬ、約０．３～約６μｇ／ｍＬ、約０．５～約５μｇ／ｍＬ、約０．１～約２μｇ／ｍＬ、または約０．５～約１．５μｇ／ｍＬである。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＥＧＦタンパク質への結合に対して参照抗体と競合可能であり、上記参照抗体が重鎖可変領域ＶＨを含んでもよく、上記参照抗体の該ＶＨがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、上記参照抗体の該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、上記参照抗体の該ＨＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、上記参照抗体の該ＨＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＥＧＦタンパク質への結合に対して参照抗体と競合可能であり、上記参照抗体がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、上記参照抗体の該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、上記参照抗体の該ＨＣＤＲ２が配列番号１２～１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含んでもよく、上記参照抗体の該ＨＣＤＲ３が配列番号１７～１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＥＧＦタンパク質への結合に対して参照抗体と競合可能であり、上記参照抗体がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、上記参照抗体の該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が以下のアミノ酸配列の群：
（１）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１２、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（２）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（３）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１４、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（４）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１８；ならびに
（５）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１９；
のいずれか一つから選択されてもよい。
（１）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１２、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（２）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（３）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１４、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（４）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１８；ならびに
（５）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１９；
のいずれか一つから選択されてもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨ中に少なくとも一つのＣＤＲを含んでもよく、該ＶＨが配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨＨであってもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ３を含んでもよく、これは、アミノ酸配列が配列番号２９に記載されるＶＨのＣＤＲ３を含んでもよい。本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、アミノ酸配列が配列番号１～６のいずれか一つに記載のＶＨのＣＤＲ３を含むＨＣＤＲ３を含んでもよい。
例えば、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ３を含んでもよく、これは、配列番号２４：ＲＬＲＩＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＥＲＬＤＹ（配列番号２４）（式中、Ｘ５は、ＰまたはＴであり、Ｘ６は、ＤまたはＨであり、Ｘ７は、Ｅ、ＱまたはＷであり、Ｘ８は、Ｒ、ＷまたはＹであり、Ｘ９は、ＲまたはＳであり、Ｘ１０は、ＲまたはＴである）に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
いくつかの場合、配列番号１７に記載のアミノ酸配列と比較して、ＨＣＤＲ３は、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９および／またはＸ１０でのアミノ酸置換、から選択される位置にアミノ酸置換を少なくとも含んでもよい。
例えば、上記ＨＣＤＲ３は、配列番号１７～１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ２を含んでもよく、これは、アミノ酸配列が配列番号２９に記載されるＶＨのＣＤＲ２を含んでもよい。本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ２を含んでもよく、これは、アミノ酸配列が配列番号１～６のいずれか一つに記載のＶＨのＣＤＲ２を含んでもよい。
例えば、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ２を含んでもよく、これは、配列番号２３：ＡＶＸ３ＡＸ５Ｘ６ＷＸ８ＹＶＥＤＳＶＸ１５Ｇ（配列番号２３）（式中、Ｘ３は、ＦまたはＬであり、Ｘ５は、ＥまたはＰであり、Ｘ６は、ＤまたはＧであり、Ｘ８は、ＲまたはＳであり、Ｘ１５は、ＫまたはＲである）に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、上記配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義された規則に従って決定された配列であってもよい。
いくつかの場合、配列番号１２に記載のアミノ酸配列と比較して、ＨＣＤＲ２は、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ８および／またはＸ１５でのアミノ酸置換、から選択される位置にアミノ酸置換を少なくとも含んでもよい。
例えば、上記ＨＣＤＲ２は、配列番号１２～１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１を含んでもよく、これは、アミノ酸配列が配列番号２９に記載されるＶＨのＣＤＲ１を含んでもよい。本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１を含んでもよく、これは、アミノ酸配列が配列番号１～６のいずれか一つに記載のＶＨのＣＤＲ１を含んでもよい。
例えば、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１を含んでもよく、これは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列が配列番号２９に記載されるＶＨのＣＤＲ１を含んでもよく、該ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列が配列番号２９に記載されるＶＨのＣＤＲ２を含んでもよく、該ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列が配列番号２９に記載されるＶＨのＣＤＲ３を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列が配列番号１～６のいずれかに記載されるＶＨのＣＤＲ１を含んでもよく、該ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列が配列番号１～６のいずれかに記載されるＶＨのＣＤＲ２を含んでもよく、該ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列が配列番号１～６のいずれかに記載されるＶＨのＣＤＲ３を含んでもよい。
本願において、本願に記載の単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該ＨＣＤＲ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ２は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、本願に記載の単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該ＨＣＤＲ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ２は、配列番号１２～１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ３は、配列番号１７～１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、本願に記載の単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該ＨＣＤＲ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ２は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ３は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、本願に記載の単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該ＨＣＤＲ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ２は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ３は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、本願に記載の単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該ＨＣＤＲ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ３は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、本願に記載の単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該ＨＣＤＲ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ２は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ３は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、本願に記載の単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該ＨＣＤＲ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ２は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含んでもよく、該ＨＣＤＲ３は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ１を含んでもよく、これは、配列番号２５：Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＸ１４ＧＧＳＸ１８ＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＳＤ（配列番号２５）（式中、Ｘ１は、ＡまたはＥであり、Ｘ１４は、ＡまたはＰであり、Ｘ１８は、ＡまたはＬである）に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、上記配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより決定された規則により決定された配列であってもよい。
いくつかの場合、配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して、上記Ｈ－ＦＲ１は、Ｘ１、Ｘ１４および／またはＸ１８でのアミノ酸置換、から選択される位置にアミノ酸置換を少なくとも含んでもよい。
例えば、上記Ｈ－ＦＲ１は、配列番号７または８に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ２を含んでもよく、これは、配列番号２６：ＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＸＱＱＬＶＸ１４（配列番号２６）（式中、Ｘ１１は、ＤまたはＥであり、Ｘ１４は、ＡまたはＳである）に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、上記配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義された規則により決定された配列であってもよい。
いくつかの場合、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と比較して、上記Ｈ－ＦＲ２は、Ｘ１１および／またはＸ１４でのアミノ酸置換、から選択される位置にアミノ酸置換を少なくとも含んでもよい。
例えば、上記Ｈ－ＦＲ２は、配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ３を含んでもよく、これは、配列番号２７：ＲＦＴＩＳＲＤＮＸ９ＫＮＴＶＸ１４ＬＱＭＮＸ１９ＬＸ２１Ｘ２２ＥＤＴＡＸ２７ＹＹＣＮＶ（配列番号２７）（式中、Ｘ９は、ＳまたはＴであり、Ｘ１４は、ＤまたはＹであり、Ｘ１９は、ＮまたはＳであり、Ｘ２１は、ＫまたはＲであり、Ｘ２２は、ＡまたはＰであり、Ｘ２７は、ＩまたはＶである）に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、上記配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義された規則により決定された配列であってもよい。
いくつかの場合、配列番号１５に記載のアミノ酸配列と比較して、上記Ｈ－ＦＲ３は、Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ２２および／またはＸ２７でのアミノ酸置換、から選択される位置にアミノ酸置換を少なくとも含んでもよい。
例えば、上記Ｈ－ＦＲ３は、配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ４を含んでもよく、これは、配列番号２８：ＷＧＸ３ＧＴＸ６ＶＴＶＳＳ（配列番号２８）（式中、Ｘ３は、ＫまたはＱであり、Ｘ６は、Ｌ、ＱまたはＴである）に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、上記配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義された規則により決定された配列であってもよい。
いくつかの場合、配列番号２０に記載のアミノ酸配列と比較して、上記Ｈ－ＦＲ４は、Ｘ３および／またはＸ６でのアミノ酸置換、から選択される位置にアミノ酸置換を少なくとも含んでもよい。
例えば、上記Ｈ－ＦＲ４は、配列番号２０～２２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域ＶＨを含んでもよく、これは、配列番号２９：Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＸ１４ＧＧＳＸ１８ＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＳＤＩＶＳＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＸ４６ＬＶＸ４９ＡＶＸ５２ＡＸ５４Ｘ５５ＷＸ５７ＹＶＥＤＳＶＸ６４ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＸ７４ＫＮＴＶＸ７９ＬＱＭＮＸ８４ＬＸ８６Ｘ８７ＥＤＴＡＸ９２ＹＹＣＮＶＲＬＲＩＸ１０２Ｘ１０３Ｘ１０４Ｘ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７ＥＲＬＤＹＷＧＸ１１５ＧＴＸ１１８ＶＴＶＳＳ（配列番号２９）（式中、Ｘ１は、ＡまたはＥであり、Ｘ１４は、ＡまたはＰであり、Ｘ１８は、ＡまたはＬであり、Ｘ４６は、ＤまたはＥであり、Ｘ４９は、ＡまたはＳであり、Ｘ５２は、ＦまたはＬであり、Ｘ５４は、ＥまたはＰであり、Ｘ５５は、ＤまたはＧであり、Ｘ５７は、ＲまたはＳであり、Ｘ６４は、ＫまたはＲであり、Ｘ７４は、ＳまたはＴであり、Ｘ７９は、ＤまたはＹであり、Ｘ８４は、ＮまたはＳであり、Ｘ８６は、ＫまたはＲであり、Ｘ８７は、ＡまたはＰであり、Ｘ９２は、ＩまたはＶであり、Ｘ１０２は、ＰまたはＴであり、Ｘ１０３は、ＤまたはＨであり、Ｘ１０４は、Ｅ、ＱまたはＷであり、Ｘ１０５は、Ｒ、ＷまたはＹであり、Ｘ１０６は、ＲまたはＳであり、Ｘ１０７は、ＲまたはＴであり、Ｘ１１５は、ＫまたはＱであり、Ｘ１１８は、Ｌ、ＱまたはＴである）に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、上記配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義された規則により決定された配列であってもよい。
いくつかの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列と比較して、上記ＶＨは、Ｘ１、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ５２、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ５７、Ｘ６４、Ｘ７４、Ｘ７９、Ｘ８４、Ｘ８６、Ｘ８７、Ｘ９２、Ｘ１０２、Ｘ１０３、Ｘ１０４、Ｘ１０５、Ｘ１０６、Ｘ１０７、Ｘ１１５および／またはＸ１１８でのアミノ酸置換、から選択される位置にアミノ酸置換を少なくとも含んでもよい。
例えば、上記ＶＨは、配列番号１～６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨＨであってもよい。例えば、上記ＶＨＨは、配列番号１～６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記抗原結合タンパク質の各重鎖または軽鎖のアミノ酸配列の一部は、特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体の対応するアミノ酸配列と相同である。例えば、軽鎖および重鎖の可変領域および定常部分はいずれも、ある動物種（ヒトなど）の抗体の可変領域および定常領域に由来する。本願において、相同体は、タンパク質および／またはポリペプチド（例えば、ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片）のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上）の配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。
本願において、相同性とは、一般に、２つ以上の配列間の類似性、相似性または関連性を指す。配列相同性のパーセンテージを決定するためのアラインメントは、当該分野で知られている種々の方法（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用することによって）で達成されてもよい。当業者は、全長配列範囲内または標的配列領域内における比較中の最大アラインメントを実施するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列アラインメントのための適切なパラメータを決定してもよい。相同性はまた、以下の方法（ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）によって決定されてもよい。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの説明については、W. R. Pearson and D. J. Lipman, “Improved Tools for Biological Sequence Comparison”, Proc. Natl. Acad. Sci.), 85: 2444-2448, 1988; および D. J. Lipman and W. R. Pearson, “Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches”, Science, 227: 1435-1441, 1989が参照されてもよい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの説明については、S. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D. Lipman, “A Basic Local Alignment Search Tool”, J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990が参照されてもよい。
核酸、ベクター、宿主細胞および製造方法
別の態様において、本願はさらに、１つ以上の単離された核酸分子を提供する。上記１つ以上の核酸は、本願の抗原結合タンパク質をコードしてもよい。例えば、上記１つ以上の核酸分子の各核酸分子は、インタクトな抗原結合タンパク質をコードしてもよく、またその一部（例えば、ＨＣＤＲ１～３、ＬＣＤＲ１～３、ＶＬ、ＶＨ、軽鎖または重鎖の１つ以上）をコードしてもよい。
別の態様において、本願はさらに、１つ以上の単離された核酸分子を提供する。上記１つ以上の核酸は、本願の抗原結合タンパク質をコードしてもよい。例えば、上記１つ以上の核酸分子の各核酸分子は、インタクトな抗原結合タンパク質をコードしてもよく、またその一部（例えば、ＨＣＤＲ１～３、ＬＣＤＲ１～３、ＶＬ、ＶＨ、軽鎖または重鎖の１つ以上）をコードしてもよい。
本願の核酸分子は、単離されていてもよい。例えば、以下の方法によって産生または合成されてもよい：（ｉ）in vitroでの増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介した増幅による産生）、（ｉｉ）クローン組み換えによる産生、（ｉｉｉ）精製（例えば、酵素切断およびゲル電気泳動を介した画分分離）、または（ｉｖ）合成（例えば、化学合成によって）。いくつかの実施形態において、上記単離された核酸は、ＤＮＡ組換え技術によって製造される核酸分子である。
本願において、抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、当技術分野で知られている種々の方法（これらに限定されるものではないが、制限フラグメント操作の使用、または合成オリゴヌクレオチドによるオーバーラッピング伸長ＰＣＲの使用を含む）によって製造されてもよい。
別の態様において、本願は、本願に記載の１つ以上の核酸分子を含む、１つ以上のベクターを提供する。各ベクターは、１つ以上の核酸分子を含んでいてもよい。その上、上記ベクターは、他の遺伝子（例えば、ベクターが適切な宿主細胞で適切な条件下で選択されることを可能にするマーカー遺伝子）を含んでいてもよい。その上、上記ベクターはまた、コード領域が適切な宿主において正しく発現されることを可能にする発現制御エレメントを含んでいてもよい。例えば、上記ベクターは、発現ベクターである。
別の態様において、本願は、本願の１つ以上の核酸分子および／または本願の１つ以上のベクターを含んでもよい、宿主細胞を提供する。具体的な実施形態において、宿主細胞の各タイプまたは宿主細胞の各々は、本願の１つ以上の核酸分子またはベクターを含んでもよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞の各タイプまたは宿主細胞の各々は、本願発明の核酸分子またはベクターの複数（例えば、２つ以上）または複数タイプ（例えば、２つ以上のタイプ）を含んでもよい。
別の態様において、本願は、抗体またはその抗原結合断片を製造する方法を提供する。上記方法は、本願の宿主細胞を、抗体またはその抗原結合断片が発現される条件下で培養することを含んでもよい。例えば、適切な培地、適切な温度および培養時間等を用いることにより達成されてもよく、これらの方法は、当業者に知られている。
医薬組成物、方法および使用
別の態様において、本願は、本願の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞と、場合により薬学的に許容可能な担体とを含んでもよい、医薬組成物を提供する。薬学的に許容可能なアジュバントは、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、本願の医薬組成物はまた、互いに悪影響を及ぼすことなく相補的な活性を有する活性化合物である複数の活性化合物を含んでもよい。このような医薬の種類および有効量は、例えば、処方物中に存在するアンタゴニストの量および種類、ならびに対象の臨床パラメータに依存する。
別の態様において、本願は、本願の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞と、場合により薬学的に許容可能な担体とを含んでもよい、医薬組成物を提供する。薬学的に許容可能なアジュバントは、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、本願の医薬組成物はまた、互いに悪影響を及ぼすことなく相補的な活性を有する活性化合物である複数の活性化合物を含んでもよい。このような医薬の種類および有効量は、例えば、処方物中に存在するアンタゴニストの量および種類、ならびに対象の臨床パラメータに依存する。
上記医薬組成物は、腫瘍の成長の阻害のために使用されてもよい。例えば、本願の医薬組成物は、疾患の発症または進行を阻害または遅延させ、腫瘍サイズを縮小させ（基本的に腫瘍を消失させることさえある）、ならびに／または疾患状態を緩和させおよび／もしくは安定化させてもよい。
本願の医薬組成物は、予防上および／または治療上有効な量の抗体、その抗原結合断片を含んでもよい。予防上および／または治療上有効な量は、疾患または障害を有するか、または疾患または障害を発症する危険性のある対象において、疾患もしくは障害および／またはその任意の合併症を予防および／または治療（少なくとも部分的に治療）するのに必要な用量である。
別の態様によれば、本願は、上記単離された抗原結合タンパク質および／または上記融合タンパク質の、医薬の製造における使用を提供する。上記医薬は、ガンの治療、腫瘍の成長の阻害および／または腫瘍の増殖の阻害に使用される。具体的な実施態様によれば、上記腫瘍がＶＥＧＦ過剰発現の腫瘍を含む。具体的な実施態様によれば、上記腫瘍がＶＥＧＦ過剰発現の腫瘍を含む。具体的な実施態様によれば、上記腫瘍が固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含む。具体的な実施態様によれば、上記腫瘍が、肺ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、腎臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、芽腫、頚部ガンおよび／または卵巣ガンを含む。
別の態様によれば、本願は、ＶＥＧＦタンパク質のＶＥＧＦＲタンパク質に対する結合を阻害する方法であって、本願の単離された抗原結合タンパク質および／またはポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。例えば、上記方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ法またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法でありうる。例えば、上記方法は、非治療目的の方法であってもよい。いくつかの場合、上記方法は、抗原結合タンパク質および／またはＶＥＧＦＲとＶＥＧＦとの結合を可能にする条件下で、生物学的試料と本願の抗原結合タンパク質および／またはＶＥＧＦＲとを接触させること、上記抗原結合タンパク質とＶＥＧＦとの間に複合体が形成されるか否かを検出すること、ならびにＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの間に複合体が形成されるか否かを検出すること、を含みうる。
別の態様によれば、本願は、ＶＥＧＦタンパク質の存在および／または量を検出する方法であって、上記抗原結合タンパク質および／またはポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。例えば、上記方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ法またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法でありうる。例えば、上記方法は、非治療目的の方法であってもよい。
本願は、腫瘍またはガンに罹患している対象を診断する方法における上記抗原結合タンパク質の使用であって、上記方法は、対象から得られた試料を本願の抗原結合タンパク質と接触させ、結合した抗体の存在を検出することにより、試料中のＶＥＧＦの存在または発現レベルを決定することを含む、方法をさらに提供する。
別の態様によれば、本願は、細胞傷害性薬剤と本願の抗原結合断片とを含んでもよい、抗体－薬物コンジュゲートを提供する。抗体－薬物コンジュゲートとは、通常、特定のリンカーを用いて低分子細胞傷害性薬に連結された抗体を指し、その主成分は、抗体、リンカーおよび低分子細胞傷害性薬を含んでもよい。
別の態様によれば、本願は、本願の抗原結合タンパク質、キメラ抗原受容体、遺伝子改変細胞、抗体薬物コンジュゲートおよび／または本願の医薬組成物を含んでもよい、キットを提供する。これは、単一の従来の容器内に、本願の抗原結合タンパク質、キメラ抗原受容体、遺伝子改変細胞および／または抗体薬物コンジュゲートを含んでもよく、また、場合により１つ以上の治療剤と組み合わせてもよく、場合によりそれらを一緒に処方化して医薬組成物としてもよい。
別の態様によれば、本願は、本願に記載の抗原結合タンパク質またはその医薬組成物の投与のために使用されてもよい、薬物送達デバイスを提供する。
いかなる理論によっても限定されることを意図することなく、以下の実施例は、本願発明の様々な技術的解決策を説明するために使用されるに過ぎず、本願発明の範囲を限定するために使用されるものではない。
実施例１ 抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体の製造および検出
標的抗原で免疫されていない３頭のアルパカの血液サンプルをそれぞれ１５０ｍｌ採取した。血液サンプルからリンパ球を単離して全ＲＮＡを抽出し、３×１０９ｃｆｕのサイズのファージディスプレイ化ナノボディライブラリーを構築した。６ｍｌの形質転換抗体ライブラリーファージを選択し、特異的パンニング用ファージを調製し、ファージの総量はライブラリー容量の５０倍となった。
標的抗原で免疫されていない３頭のアルパカの血液サンプルをそれぞれ１５０ｍｌ採取した。血液サンプルからリンパ球を単離して全ＲＮＡを抽出し、３×１０９ｃｆｕのサイズのファージディスプレイ化ナノボディライブラリーを構築した。６ｍｌの形質転換抗体ライブラリーファージを選択し、特異的パンニング用ファージを調製し、ファージの総量はライブラリー容量の５０倍となった。
５０ｍｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Thermo fisher社、Cat.No.: 88817）を１ｍｌのファージに予め結合させ、室温で３０分間インキュベートして非特異的結合を除去した。バックグラウンドが除去されたナノボディライブラリーファージを選択し、これに１０ｕｇのビオチン化ヒトＶＥＧＦ１６５（ACROBiosystems社、Cat.No.: VE5-H82Q0）、１５０ｕｌストレプトアビジン磁気ビーズを加え、室温で１５分間インキュベートした後、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で１４回洗浄し、結合していないファージを洗い流した。抗原特異的に結合したファージを４５０ｕｌの１００ｍＭ塩酸で溶出し、５０ｕｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ１１）を加えて中和し、対数増殖期の大腸菌ＳＳ３２０に感染させ、次のラウンドのスクリーニングのためにファージを産生・精製した。スクリーニング方法は、抗原量を４ｕｇに減らした以外、第１ラウンドと同じであった。２ラウンドのスクリーニング後に濃縮されたファージの濃縮度を、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で同定した。結果を以下の表１に示す。この結果は、２ラウンドのパンニング後、ファージが有意に濃縮されたことを示す。
実施例２ 単一ドメイン抗体のスクリーニングおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の同定
実施例１の単一ドメイン抗体ライブラリーを２ラウンドのパンニング後のプラスミドを鋳型として、プライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりナノボディ遺伝子（ＶＨＨ）を増幅した；ＰＣＲで増幅したＶＨＨ遺伝子断片を回収し、酵母ディスプレイプラスミドと共形質転換（co-transformed）してサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＥＢＹ１００株（ＡＴＣＣより購入）に導入し、サッカロミケス・セレビシエの相同組換えによりＶＨＨ遺伝子を酵母ディスプレイプラスミドに挿入することで、酵母細胞壁表面への単一ドメイン抗体のディスプレイを実現した。構築スキームを図１に示す。
実施例１の単一ドメイン抗体ライブラリーを２ラウンドのパンニング後のプラスミドを鋳型として、プライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりナノボディ遺伝子（ＶＨＨ）を増幅した；ＰＣＲで増幅したＶＨＨ遺伝子断片を回収し、酵母ディスプレイプラスミドと共形質転換（co-transformed）してサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＥＢＹ１００株（ＡＴＣＣより購入）に導入し、サッカロミケス・セレビシエの相同組換えによりＶＨＨ遺伝子を酵母ディスプレイプラスミドに挿入することで、酵母細胞壁表面への単一ドメイン抗体のディスプレイを実現した。構築スキームを図１に示す。
酵母ディスプレイライブラリーを、フローソーターを用いて２ラウンドのソーティングを実施し、ソーティングで得られた酵母を栄養要求性のプレート培地にまき、そこから４６個の単一のクローンをシークエンシングのために選択し、最終的にユニークな配列を持つ５個の単一ドメイン重鎖抗体を得た。同定プロトコールを表２に示す。対応する酵母モノクローナルコロニーをフロー染色で解析し、表２のプロトコールに従う染色用に１×１０６個の細胞を選択した。プロトコール１では、ヒトＶＥＧＦ１６５－Ｂｉｏに結合する細胞集団の強さをＰＥ平均蛍光シグナル強度（ＭＦＩ）として反映する。同様に、プロトコール２とプロトコール３を用いてマウスＶＥＧＦ－Ｂｉｏと非特異的結合レベルを評価し得、プロトコール４では競合シグナルをＡＰＣ平均蛍光シグナル強度（ＭＦＩ）として反映する。結果を表３に示す。表３から理解されうるように、ヒトＶＥＧＦやマウスＶＥＧＦに結合しないクローンを除いた後、抗ヒトＶＥＧＦ１６５単一ドメイン重鎖抗体のモノクローンＹ２０Ａ６が得られ、Ｙ２０Ａ６の結合能、競合能ともに満足できるものであった。
実施例３ 単一ドメイン抗体のヒト化
３．１ ヒト化設計および単一ドメイン抗体の発現
モノクローナル抗体Ｙ２０Ａ６の配列をIMGT/Domain Gap Alignに供し、最も相同性の高いヒト生殖細胞系列がＩＧＨＶ３－２３＊０４であった。抗体配列をＣｈｏｔｈｉａルールにしたがって番号付けし、異なる部位の配列（Ｈ１、Ｈ１４、Ｈ１８など）を有する部位を、表４に示すように変異させた。Ａｂ１９１０ＶＥ６と番号付けされたタンパク質がヒト化前のオリジナルの抗体であった。
３．１ ヒト化設計および単一ドメイン抗体の発現
モノクローナル抗体Ｙ２０Ａ６の配列をIMGT/Domain Gap Alignに供し、最も相同性の高いヒト生殖細胞系列がＩＧＨＶ３－２３＊０４であった。抗体配列をＣｈｏｔｈｉａルールにしたがって番号付けし、異なる部位の配列（Ｈ１、Ｈ１４、Ｈ１８など）を有する部位を、表４に示すように変異させた。Ａｂ１９１０ＶＥ６と番号付けされたタンパク質がヒト化前のオリジナルの抗体であった。
表４の全長配列をＩｇＧ１ Ｆｃ Ｎ２９７Ａ（Taizhou Biointron社より購入）と融合させ、コドンを最適化し、遺伝子合成後に発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４（Life Technologies社）にロードした。発現プラスミドを増幅し、プラスミドを抽出した後、プラスミドをＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ThermoFisher Scientific社、A29133）に導入し、供給元のＥｘｐｉＣＨＯ発現システムの方法にしたがって抗体を一過性に発現させた。得られた精製抗体を表５に示す。
実施例４ ＶＥＧＦ１６５に対する本願の抗原結合タンパク質の結合活性アッセイ
（１）Octet RED96e（Fortebio社）を用いて、Ａｂ１９１０ＶＥ６、ＡＢ１９１０ＶＥ８およびＡｂ１９１０ＶＥ９のヒトＶＥＧＦ１６５（Acro社、Cat.No.:VE5-H82Q0）に対する親和性を測定した。抗原および抗体をともに１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ：Sango Biotech社、B548117-0500；０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０：sigma-alorich社、P1379）で希釈し、抗原を１００ｎＭ、抗体を５０ｎＭの濃度で使用した。
（１）Octet RED96e（Fortebio社）を用いて、Ａｂ１９１０ＶＥ６、ＡＢ１９１０ＶＥ８およびＡｂ１９１０ＶＥ９のヒトＶＥＧＦ１６５（Acro社、Cat.No.:VE5-H82Q0）に対する親和性を測定した。抗原および抗体をともに１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ：Sango Biotech社、B548117-0500；０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０：sigma-alorich社、P1379）で希釈し、抗原を１００ｎＭ、抗体を５０ｎＭの濃度で使用した。
（２）サンプルのオンボード検出（Octet Data Acquisition 11.1.0.11）：まず、サンプルを９６ウェルプレート（Greiner bio-one社、655209）に加え、２００μＬ／ウェルの系とした。次に、ソフトウェアのパラメータを設定し、プレート温度を３０℃に設定し、標準動態シグナルを収集する周波数を５．０Ｈｚとした。次に、ＡＨＣセンサー（Fortebio社、Cat.No.: 18-0015）を、１×ＰＢＳＴで予め１０分間湿らせ、装置上で検出した。各サイクルは、以下のステップからなる：１）バッファーに６０秒間浸漬；２）抗原とセンサーの非特異的結合の有無の検出；３）ｐＨ１．７の１０ｍＭグリシン溶液の再生；４）緩衝液に６０秒間浸漬；５）抗体をセンサーに２０秒間固定化；６）センサーを緩衝液に１８０秒間浸漬；７）１８０秒間、抗原と抗体の結合；８）１０分間、抗原と抗体の解離；９）センサーの再生。
（３）データ解析
Fortebio社のData Analysis 11.0ソフトウェアを用い、抗原－抗体の１：１結合モードでの会合速度（Ｋａ）と解離速度（Ｋｄ）を測定し、抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。結果を表６に示す。Ａｂ１９１０ＶＥ６、ＡＢ１９１０ＶＥ８およびＡｂ１９１０ＶＥ９はいずれも、ＶＥＧＦに対して強い親和性を示す。このことは、本願の抗原結合タンパク質がＶＥＧＦに対して高い結合親和性を有することを示す。
Fortebio社のData Analysis 11.0ソフトウェアを用い、抗原－抗体の１：１結合モードでの会合速度（Ｋａ）と解離速度（Ｋｄ）を測定し、抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。結果を表６に示す。Ａｂ１９１０ＶＥ６、ＡＢ１９１０ＶＥ８およびＡｂ１９１０ＶＥ９はいずれも、ＶＥＧＦに対して強い親和性を示す。このことは、本願の抗原結合タンパク質がＶＥＧＦに対して高い結合親和性を有することを示す。
実施例５ ヒトＶＥＧＦ１６５のヒトＶＥＧＦＲ２に対する結合阻害における本願の抗原結合タンパク質の活性アッセイ
ＶＥＧＦ１６５のヒトＶＥＧＦＲ２に対する結合阻害における単一ドメイン抗体の活性を測定するため、競合ＥＬＩＳＡ法を用いた。具体的な工程は、以下のように行った：ヒトＶＥＧＦＲ２（Acro社、Cat.No.: KDR-H5227）をＰＢＳ（Gibco社、Cat.No.: 10010-023）で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、シールフィルムを貼付し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄液 ＰＢＳＴ（０．０５％ＴＷＥＥＮ－２０：sigma-alorich社、P1379）で３回洗浄した後、上記洗浄液を用いてブロッキング液 ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡ（ＢＳＡ：VWR社、0332-1KG）を調製し、各ウェルにブロッキング液３００μＬを加え、３７℃で１時間ブロッキングした。抗ＶＥＧＦとビオチン－ｈＶＥＧＦ（Acro社、Cat.No.:VE5-H82Q0）をブロッキング液で調製し、抗ＶＥＧＦの初期調製濃度を２００μｇ／ｍＬとし、その後に５倍連続希釈（７濃度点＋１ゼロ濃度点）を行い、ビオチン－ｈＶＥＧＦの調製濃度を９０ｎｇ／ｍＬとした。その後、シーリングしたＥＬＩＳＡプレートを取り出し、洗浄液でプレートを３回洗浄した後、希釈した抗ＶＥＧＦ ５０μＬを選択して９６ウェルプレートに添加し、ビオチン－ｈＶＥＧＦ ５０μＬを選択して９６ウェルプレートに添加し、３７℃で１時間共インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、二次抗体ＳＡ－ＨＲＰ（sigma社、S2438）をブロッキング液で１：５０００に希釈し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、ＴＭＢ発色液（Biopanda社、Cat.No.: TMB-S-003）を各ウェルに１００μＬずつ加え、室温暗所で発色させた後、反応停止液（Solarbio社、Cat.No.: C1058）を各ウェルに５０μＬずつ加えて反応を停止させ、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。この結果（図２）は、Ａｂ１９１０ＶＥ８、Ａｂ１９１０ＶＥ９およびＡｂ１９１０ＶＥ６がいずれも強いブロッキング能を有することを示す。このことは、本願の抗原結合タンパク質がＶＥＧＦのＶＥＧＦＲに対する結合阻害において良好な効果を有することを示す。
ＶＥＧＦ１６５のヒトＶＥＧＦＲ２に対する結合阻害における単一ドメイン抗体の活性を測定するため、競合ＥＬＩＳＡ法を用いた。具体的な工程は、以下のように行った：ヒトＶＥＧＦＲ２（Acro社、Cat.No.: KDR-H5227）をＰＢＳ（Gibco社、Cat.No.: 10010-023）で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、シールフィルムを貼付し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄液 ＰＢＳＴ（０．０５％ＴＷＥＥＮ－２０：sigma-alorich社、P1379）で３回洗浄した後、上記洗浄液を用いてブロッキング液 ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡ（ＢＳＡ：VWR社、0332-1KG）を調製し、各ウェルにブロッキング液３００μＬを加え、３７℃で１時間ブロッキングした。抗ＶＥＧＦとビオチン－ｈＶＥＧＦ（Acro社、Cat.No.:VE5-H82Q0）をブロッキング液で調製し、抗ＶＥＧＦの初期調製濃度を２００μｇ／ｍＬとし、その後に５倍連続希釈（７濃度点＋１ゼロ濃度点）を行い、ビオチン－ｈＶＥＧＦの調製濃度を９０ｎｇ／ｍＬとした。その後、シーリングしたＥＬＩＳＡプレートを取り出し、洗浄液でプレートを３回洗浄した後、希釈した抗ＶＥＧＦ ５０μＬを選択して９６ウェルプレートに添加し、ビオチン－ｈＶＥＧＦ ５０μＬを選択して９６ウェルプレートに添加し、３７℃で１時間共インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、二次抗体ＳＡ－ＨＲＰ（sigma社、S2438）をブロッキング液で１：５０００に希釈し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、ＴＭＢ発色液（Biopanda社、Cat.No.: TMB-S-003）を各ウェルに１００μＬずつ加え、室温暗所で発色させた後、反応停止液（Solarbio社、Cat.No.: C1058）を各ウェルに５０μＬずつ加えて反応を停止させ、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。この結果（図２）は、Ａｂ１９１０ＶＥ８、Ａｂ１９１０ＶＥ９およびＡｂ１９１０ＶＥ６がいずれも強いブロッキング能を有することを示す。このことは、本願の抗原結合タンパク質がＶＥＧＦのＶＥＧＦＲに対する結合阻害において良好な効果を有することを示す。
実施例６ 本願の抗原結合タンパク質の親和性の成熟化およびin vitroでの同定
６．１ 単一ドメイン抗体の親和性成熟化ライブラリーの構築
Ａｂ１９１０ＶＥ９の配列を親和性成熟化のために選択し、Ａｂ１９１０ＶＥ９のＣＤＲ領域をＣｈｏｔｈｉａによって定義した。可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３については、ＮＮＫ変異プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用に設計し、各ＣＤＲ変異ライブラリーの遺伝子断片を増幅した。各ＣＤＲ変異ライブラリーを酵母表面に表示させるために、文献に記載された方法に従って、各ＣＤＲ変異ライブラリー遺伝子断片と酵母ディスプレイプラスミドをそれぞれサッカロミケス・セレビシエ ＥＢＹ１００株（ＡＴＣＣより購入）に形質転換させた。同時に、Ａｂ１９１０ＶＥ９の親配列を酵母表面に表示し、コントロールとして使用した。
６．１ 単一ドメイン抗体の親和性成熟化ライブラリーの構築
Ａｂ１９１０ＶＥ９の配列を親和性成熟化のために選択し、Ａｂ１９１０ＶＥ９のＣＤＲ領域をＣｈｏｔｈｉａによって定義した。可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３については、ＮＮＫ変異プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用に設計し、各ＣＤＲ変異ライブラリーの遺伝子断片を増幅した。各ＣＤＲ変異ライブラリーを酵母表面に表示させるために、文献に記載された方法に従って、各ＣＤＲ変異ライブラリー遺伝子断片と酵母ディスプレイプラスミドをそれぞれサッカロミケス・セレビシエ ＥＢＹ１００株（ＡＴＣＣより購入）に形質転換させた。同時に、Ａｂ１９１０ＶＥ９の親配列を酵母表面に表示し、コントロールとして使用した。
ライブラリーを培養・誘導した後、ビオチン－ヒトＶＥＧＦ１６５を用いて、初期濃度３ｎＭから１０倍の連続希釈を行い、３ラウンドのソーティングを行った。表示レベルが高く、抗原結合能の強い細胞集団を回収し；ソーティング後、細胞をＳＤ－Ｔｒｐ固形培地にまき、３０℃で３日間、静置培養に供した。
６．２ モノクローナルの同定
単一のクローンを採取し、シークエンスに出し、得られた単一クローンをフロー染色（１ｎＭ ビオチンヒトＶＥＧＦ１６５とインキュベートして染色）により同定し、異なるクローンにおける抗原結合平均蛍光シグナル強度に対する表示平均蛍光シグナル強度の比を比較した（単一分子の抗原結合能を反映）。結合力の値にしたがって、各ＣＤＲ領域の変異配列が異なる合計３分子を選択し、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価に供した（詳細は表７を参照）。
単一のクローンを採取し、シークエンスに出し、得られた単一クローンをフロー染色（１ｎＭ ビオチンヒトＶＥＧＦ１６５とインキュベートして染色）により同定し、異なるクローンにおける抗原結合平均蛍光シグナル強度に対する表示平均蛍光シグナル強度の比を比較した（単一分子の抗原結合能を反映）。結合力の値にしたがって、各ＣＤＲ領域の変異配列が異なる合計３分子を選択し、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価に供した（詳細は表７を参照）。
６．３ 親和性成熟化単一ドメイン抗体の発現およびＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度分析
表７の各単一ドメイン抗体を発現させ、精製した。発現した抗体をＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度分析に供し、その方法は以下のとおりである：
（１）サンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈し、よく混合した後、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を選択してサンプルボトルに移し、ＨＰＬＣサンプルトレイに入れた。クロマトグラフィ条件を以下のように設定した：
表７の各単一ドメイン抗体を発現させ、精製した。発現した抗体をＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度分析に供し、その方法は以下のとおりである：
（１）サンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈し、よく混合した後、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を選択してサンプルボトルに移し、ＨＰＬＣサンプルトレイに入れた。クロマトグラフィ条件を以下のように設定した：
（２）クロマトグラフィカラムを移動相（２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８）で平衡化し、注入、分析した後、クロマトグラフィソフトを用いてデータ解析を行い、ピーク面積正規化法により各ピークのピーク面積率を算出した。
具体的な結果を表８に示す。
実施例７ 本願の抗原結合タンパク質の動態パラメータの測定
実施例４の方法を参照して、ヒトＶＥＧＦ１６５に対する抗体の親和性を、親和性成熟化の前後で測定した。
実施例４の方法を参照して、ヒトＶＥＧＦ１６５に対する抗体の親和性を、親和性成熟化の前後で測定した。
結果を表９に示す。Ａｂ１９１０ＶＥ１８は、親和性成熟化前の分子であり、成熟化後は、抗体分子の親和性が約２～５倍に向上している。このことは、本願の抗原結合タンパク質がＶＥＧＦに対して高い結合親和性を有することを示す。
実施例８ ヒトＶＥＧＦ１６５のヒトＶＥＧＦＲ２に対する結合阻害能における本願の抗原結合タンパク質の試験
実施例５の方法を参照し、親和性成熟化ＶＥＧＦ抗体がヒトＶＥＧＦ１６５のヒトＶＥＧＦＲ２に対する結合阻害の機能を決定するための実験を行った（ここで、ビオチン－ｈＶＥＧＦ１６５の調製濃度は、７００ｎｇ／ｍＬであった）。実験結果を図３に示す。Ａｂ１９１０ＶＥ１８抗体、Ａｂ１９１０ＶＥ２１抗体およびＡｂ１９１０ＶＥ２４抗体の阻害効果は、ベバシズマブと同等であった。このことは、本願の抗原結合タンパク質がＶＥＧＦのＶＥＧＦＲに対する結合阻害において良好な効果を有することを示す。
実施例５の方法を参照し、親和性成熟化ＶＥＧＦ抗体がヒトＶＥＧＦ１６５のヒトＶＥＧＦＲ２に対する結合阻害の機能を決定するための実験を行った（ここで、ビオチン－ｈＶＥＧＦ１６５の調製濃度は、７００ｎｇ／ｍＬであった）。実験結果を図３に示す。Ａｂ１９１０ＶＥ１８抗体、Ａｂ１９１０ＶＥ２１抗体およびＡｂ１９１０ＶＥ２４抗体の阻害効果は、ベバシズマブと同等であった。このことは、本願の抗原結合タンパク質がＶＥＧＦのＶＥＧＦＲに対する結合阻害において良好な効果を有することを示す。
上記の詳細な説明は、説明および例として提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。本願に列挙された実施形態の様々な変更は、当業者にとって自明であり、添付の特許請求の範囲およびその同等な解決策の範囲内に留保される。
Claims (54)
- 以下の特性：
（１）１×１０－７Ｍ以下のＫＤ値でＶＥＧＦタンパク質に結合可能である；および
（２）ＶＥＧＦタンパク質のＶＥＧＦＲタンパク質に対する結合を阻害可能である
の１つ以上を有する、単離された抗原結合タンパク質。 - ＶＥＧＦタンパク質がＶＥＧＦ１６５を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＶＥＧＦＲタンパク質がＶＥＧＦＲ２を含む、請求項１または２に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨおよび／またはｄＡｂを含む、請求項４に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合断片がＶＨＨである、請求項４または５に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体からなる群より選択される、請求項４～６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＶＥＧＦタンパク質への結合に対して参照抗体と競合可能であり、前記参照抗体が重鎖可変領域ＶＨを含み、前記参照抗体の該ＶＨがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記参照抗体の該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、前記参照抗体の該ＨＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含み、前記参照抗体の該ＨＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記参照抗体のＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記参照抗体のＨＣＤＲ２が配列番号１２～１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項８または９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記参照抗体のＨＣＤＲ３が配列番号１７～１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＶＨ中に少なくとも一つのＣＤＲを含み、該ＶＨが配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＶＨ中に少なくとも一つのＣＤＲを含み、該ＶＨが配列番号１～６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＨＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記ＨＣＤＲ３が配列番号１７～１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＨＣＤＲ２を含み、該ＨＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記ＨＣＤＲ２が配列番号１２～１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＨＣＤＲ１を含み、該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ１が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＤＲ２が配列番号１２～１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＤＲ３が配列番号１７～１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が以下のアミノ酸配列の群：
（１）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１２、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（２）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（３）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１４、およびＨＣＤＲ３：配列番号１７；
（４）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１８；ならびに
（５）ＨＣＤＲ１：配列番号９、ＨＣＤＲ２：配列番号１３、およびＨＣＤＲ３：配列番号１９；
のいずれか一つから選択される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 重鎖可変領域ＶＨを含み、該ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１を含み、該Ｈ－ＦＲ１のＣ末端が直接的にまたは間接的にＨＣＤＲ１のＮ末端に連結し、該Ｈ－ＦＲ１が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記Ｈ－ＦＲ１が配列番号７または８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ２を含み、該Ｈ－ＦＲ２がＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ２の間に位置し、該Ｈ－ＦＲ２が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２２または２３に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記Ｈ－ＦＲ２が配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ３を含み、該Ｈ－ＦＲ３がＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３の間に位置し、該Ｈ－ＦＲ３が配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記Ｈ－ＦＲ３が配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- Ｈ－ＦＲ４のＮ末端がＨＣＤＲ３のＣ末端に連結し、該Ｈ－ＦＲ４が配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記Ｈ－ＦＲ４が配列番号２０～２２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み、該Ｈ－ＦＲ１が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ２が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ３が配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ４が配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み、該Ｈ－ＦＲ１が配列番号７または８に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ２が配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ３が配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列を含み、該Ｈ－ＦＲ４が配列番号２０～２２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み、該Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４が以下のアミノ酸配列の群：
（１）Ｆ－ＦＲ１：配列番号７、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１０、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１５、およびＨ－ＦＲ４：配列番号２０；
（２）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１６、およびＨ－ＦＲ４：配列番号２１；ならびに
（３）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１６、およびＨ－ＦＲ４：配列番号２２；
のいずれか一つから選択される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。 - 重鎖可変領域ＶＨを含み、該ＶＨが配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記ＶＨが配列番号１～６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質をコードする、一つ以上の単離された核酸分子。
- 請求項３５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項３５に記載の核酸分子または請求項３６に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質を製造する方法であって、請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質が発現されるような条件下で請求項３７に記載の細胞を培養することを含む、方法。
- 請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項３５に記載の核酸分子、請求項３６に記載のベクターおよび／または請求項３７に記載の細胞と、場合により薬学的に許容可能な坦体とを含む、医薬組成物。
- 請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質を含む、ポリペプチド。
- 請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質または請求項４０に記載のポリペプチドを含む、免疫コンジュゲート。
- 請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項３５に記載の核酸分子、請求項３６に記載のベクター、請求項３７に記載の細胞、請求項３９に記載の医薬組成物、請求項４０に記載のポリペプチドおよび／または請求項４１に記載の免疫コンジュゲートの、腫瘍の予防、緩和および／または治療のための医薬の製造における使用。
- 前記腫瘍がＶＥＧＦ過剰発現の腫瘍を含む、請求項４２に記載の使用。
- 前記腫瘍が固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含む、請求項４２または４３に記載の使用。
- 前記腫瘍が、肺ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、腎臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、芽腫、頚部ガンおよび／または卵巣ガンを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の使用。
- 腫瘍を予防する、緩和するまたは治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項３５に記載の核酸分子、請求項３６に記載のベクター、請求項３７に記載の細胞、請求項３９に記載の医薬組成物、請求項４０に記載のポリペプチドおよび／または請求項４１に記載の免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法。
- 前記腫瘍がＶＥＧＦ過剰発現の腫瘍を含む、請求項４６に記載の方法。
- 前記腫瘍が固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含む、請求項４６または４７に記載の方法。
- 前記腫瘍が、肺ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、腎臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、芽腫、頚部ガンおよび／または卵巣ガンを含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍の予防、緩和または治療における使用のための、請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項３５に記載の核酸分子、請求項３６に記載のベクター、請求項３７に記載の細胞、請求項３９に記載の医薬組成物、請求項４０に記載のポリペプチドおよび／または請求項４１に記載の免疫コンジュゲート。
- 前記腫瘍がＶＥＧＦ過剰発現の腫瘍を含む、請求項５０に記載の単離された抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞、医薬組成物、ポリペプチドおよび／または免疫コンジュゲート。
- 前記腫瘍が固形腫瘍および／または非固形腫瘍を含む、請求項５０または５１に記載の単離された抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞、医薬組成物、ポリペプチドおよび／または免疫コンジュゲート。
- 前記腫瘍が、肺ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、腎臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、芽腫、頚部ガンおよび／または卵巣ガンを含む、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞、医薬組成物、ポリペプチドおよび／または免疫コンジュゲート。
- ＶＥＧＦタンパク質のＶＥＧＦＲタンパク質に対する結合を阻害する方法であって、請求項１～３４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項３５に記載の核酸分子、請求項３６に記載のベクター、請求項３７に記載の細胞、請求項３９に記載の医薬組成物、請求項４０に記載のポリペプチドおよび／または請求項４１に記載の免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110183560.5 | 2021-02-10 | ||
| CN202110183560 | 2021-02-10 | ||
| PCT/CN2022/075600 WO2022171109A1 (zh) | 2021-02-10 | 2022-02-09 | 抗vegf抗体及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024506664A true JP2024506664A (ja) | 2024-02-14 |
Family
ID=82838272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023548780A Pending JP2024506664A (ja) | 2021-02-10 | 2022-02-09 | 抗ｖｅｇｆ抗体およびその使用 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4292661A1 (ja) |
| JP (1) | JP2024506664A (ja) |
| KR (1) | KR20230142838A (ja) |
| CN (1) | CN116897164A (ja) |
| AU (1) | AU2022220965A1 (ja) |
| BR (1) | BR112023016095A2 (ja) |
| CA (1) | CA3207763A1 (ja) |
| IL (1) | IL305092A (ja) |
| TW (1) | TW202246328A (ja) |
| WO (1) | WO2022171109A1 (ja) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101148474B (zh) * | 2006-09-21 | 2014-06-11 | 上海杰隆生物工程股份有限公司 | 人源人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备方法 |
| CN102002104A (zh) * | 2009-08-28 | 2011-04-06 | 江苏先声药物研究有限公司 | 一种抗vegf的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物 |
| US11199536B2 (en) * | 2016-06-03 | 2021-12-14 | Aimed Bio Inc. | Method for screening antibody using patient-derived tumor spheroids |
| MX2022000779A (es) * | 2019-07-19 | 2022-02-14 | Sinocelltech Ltd | Anticuerpo monoclonal anti-vegf humanizado. |
-
2022
- 2022-02-09 KR KR1020237030457A patent/KR20230142838A/ko unknown
- 2022-02-09 IL IL305092A patent/IL305092A/en unknown
- 2022-02-09 CN CN202280014211.3A patent/CN116897164A/zh active Pending
- 2022-02-09 EP EP22752269.5A patent/EP4292661A1/en active Pending
- 2022-02-09 JP JP2023548780A patent/JP2024506664A/ja active Pending
- 2022-02-09 WO PCT/CN2022/075600 patent/WO2022171109A1/zh active Application Filing
- 2022-02-09 CA CA3207763A patent/CA3207763A1/en active Pending
- 2022-02-09 TW TW111104769A patent/TW202246328A/zh unknown
- 2022-02-09 AU AU2022220965A patent/AU2022220965A1/en active Pending
- 2022-02-09 BR BR112023016095A patent/BR112023016095A2/pt unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3207763A1 (en) | 2022-08-18 |
| TW202246328A (zh) | 2022-12-01 |
| IL305092A (en) | 2023-10-01 |
| WO2022171109A1 (zh) | 2022-08-18 |
| EP4292661A1 (en) | 2023-12-20 |
| KR20230142838A (ko) | 2023-10-11 |
| BR112023016095A2 (pt) | 2023-11-14 |
| AU2022220965A1 (en) | 2023-08-31 |
| CN116897164A (zh) | 2023-10-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2022042690A1 (zh) | Ccr8抗体及其应用 | |
| CN107428838B (zh) | 结合tfpi的新型抗体以及包含所述抗体的组合物 | |
| US20160060347A1 (en) | Antibodies targeting specifically human cxcr2 | |
| JP7457822B2 (ja) | 抗ｃｄ３および抗ｃｄ１２３二重特異性抗体およびその使用 | |
| CN112243443B (zh) | 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| JP2021119788A (ja) | 多重特異的結合タンパク質 | |
| AU2021390121A1 (en) | Anti-human b7-h3 antibody and application thereof | |
| EP4279507A1 (en) | Cd73-binding protein and use thereof | |
| CN114174335A (zh) | 一种人源化vegfr2抗体及其应用 | |
| WO2022161454A1 (zh) | 抗原结合蛋白及其用途 | |
| US20220127364A1 (en) | Novel anti-pd-l1 antibody and uses thereof | |
| JP2024506664A (ja) | 抗ｖｅｇｆ抗体およびその使用 | |
| WO2024032664A1 (zh) | 一种靶向pd-l1和vegf的抗体及其应用 | |
| WO2024032662A1 (zh) | 一种靶向pd-1和vegf的抗体及其应用 | |
| WO2024078558A1 (zh) | 抗cd100抗体及其用途 | |
| CN113164601B (zh) | 一种分离的抗原结合蛋白及其用途 | |
| WO2024012434A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| CN113166264B (zh) | 一种分离的抗原结合蛋白及其用途 | |
| TW202413438A (zh) | 一種靶向ｐｄ－ｌ１和ｖｅｇｆ的抗體及其應用 | |
| TW202413427A (zh) | 一種靶向ｐｄ－１和ｖｅｇｆ的抗體及其應用 | |
| JP2024509369A (ja) | 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその使用 | |
| CN114075284A (zh) | Cd47结合分子及其用途 | |
| JP2023537958A (ja) | Ｂｃｍａと結合する単一可変ドメイン及び抗原結合分子 | |
| TW202241957A (zh) | 抗ｐｄ－１抗體及其用途 | |
| KR20240022546A (ko) | 항il-36r 항체 및 그의 사용 |