JP2024501888A - Ｂｃｍａに特異的に結合する抗体およびその使用 - Google Patents

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Abstract

ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体が開示される。抗体は、その配列を含有する重鎖可変ドメインＶＨ、軽鎖可変ドメインＶＬ、およびキメラ抗原受容体を含む。さらに、本発明の抗体またはキメラ抗原受容体のアミノ酸配列、ベクター、ホスト細胞、および組成物が開示される。また、疾患の防止または治療のための薬物の調製における抗体またはキメラ抗原受容体の使用が開示される。【選択図】なし

Description

本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体、および抗体に基づいて構築されたキメラ抗原受容体に関し、抗体のアミノ酸シーケンサー、クローニングまたは発現ベクター、ホスト細胞、抗体を産生するための方法、および抗体またはキメラ抗原受容体の使用を開示する。
多発性骨髄腫（ＭＭ）はクローン性の形質細胞の大規模な増殖を特徴とする悪性の腫瘍である。近年、多発性骨髄腫の治療選択肢は有意に進歩したが、多発性骨髄腫は高い罹患率および死亡率を有する疾患のままである。よって、多発性骨髄腫の治療のための新たな治療方法が喫緊に必要とされる。
近年、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）免疫療法は悪性の血液腫瘍の治療の急速な発展を達成しており、それは悪性腫瘍の最も有効な治療方法の１つである。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、細胞内シグナルドメイン（共刺激ドメインおよびＴ細胞活性化ドメイン）から組成される融合蛋白質である。ＣＡＲ－Ｔ細胞のｓｃＦｖは一般的にモノクローナル抗体に由来し、これは、無傷細胞表面蛋白質を認識するための主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の制約を回避し得る。
多発性骨髄腫免疫療法における標的候補はＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である。ＢＣＭＡは形質細胞および一部の成熟Ｂ細胞によって主に発現され、ほとんどのＢ細胞および他の組織では発現されない（Ｂ細胞成熟抗原は多発性骨髄腫の養子Ｔ細胞療法の有望な標的である（B－cell Maturation Antigen Is a Promising Target for Adoptive T－cell Therapy of Multiple Myeloma），クリニカル・キャンサー・リサーチ（clinical cancer research），２０１３年４月１５日）。よって、ＢＣＭＡはＭＭのためのＣＡＲ－Ｔ細胞療法の標的抗原として用いられ得る。現在では、国内および国外における治験が、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法が多発性骨髄腫の治療において良好な治療上の効果を達成したということを確認している。しかしながら、現行で治験に用いられるＣＡＲ－Ｔ細胞のほとんどはマウス由来の一本鎖抗体ｓｃＦｖであり、これはＣＡＲ－Ｔ細胞にインビボでの抗ＣＡＲ免疫応答を生成させ、インビボでのＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力の減少、インビボでの持続不可能なＣＡＲ－Ｔ、および残念な臨床有効性などに至り得る（ヒト化ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）を有する新規の抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体は、白血病細胞死滅の引き金となる（The novel anti－CD19 chimeric antigen receptors with humanized scFv (single－chain variable fragment) trigger leukemia cell killing），セルラー・イミュノロジー（Cellular Immunology），２０１６年３月１４日；多発性骨髄腫のためのキメラ抗原受容体Ｔ細胞療法（Chimeric Antigen Receptor T－cell Therapies for Multiple Myeloma），ブラッド（blood），２０１７年１２月１４日）。加えて、標的抗原に対するｓｃＦｖの親和性もまたＣＡＲ－Ｔが標的細胞を有効に死滅させ得るかどうかを決定するための重要な因子である。よって、特異的かつ有効にＢＣＭＡを認識し得るｓｃＦｖを選別・除去することは、ＭＭの治療のための安全かつ有効なＣＡＲ－Ｔの構築にとって極めて重要である。
本発明は、重鎖可変ドメイン（以下、ＶＨと略される）および軽鎖可変ドメイン（以下、ＶＬと略される）を含む、ＢＣＭＡに特異的に結合する単離された抗体を開示し、
ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列（ＧＹＴＦＸ１Ｘ２ＹＳＭＮ）を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列（ＲＩＮＴＸ３ＳＧＸ４ＰＸ５ＹＡＤＤＦＫＧ）を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列（ＳＮＤＹＸ６ＹＳＬＤＸ７）を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、式中、Ｘ１はＳ、Ｔ、Ｒから選択され、Ｘ２はＲ、Ｓ、Ｈから選択され、Ｘ３はＧ、Ｅ、Ｒから選択され、Ｘ４はＡ、Ｔ、Ｖから選択され、Ｘ５はＩ、Ｎから選択され、Ｘ６はＮ、Ｌから選択され、Ｘ７はＨ、Ｙ、Ｆから選択され、
ＶＬは、配列番号４のアミノ酸配列（ＲＡＳＸ８ＳＶＸ９Ｘ１０Ｘ１１ＧＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｙ）を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列（ＬＡＳＮＶＱＴ）を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列（Ｘ１６ＱＳＲＸ１７ＩＰＲＴ）を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含み、式中、Ｘ８はＲ、Ｅから選択され、Ｘ９はＴ、Ｓから選択され、Ｘ１０はＩ、Ｖから選択され、Ｘ１１はＡ、Ｌから選択され、Ｘ１２はＳ、Ｎから選択され、Ｘ１３はＰ、Ｈから選択され、Ｘ１４はＩ、Ｌから選択され、Ｘ１５はＩ、Ｖから選択され、Ｘ１６はＬ、Ｆから選択され、Ｘ１７はＴ、Ｓから選択される。
具体的な実施形態において、抗体のＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列で提示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で提示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３で提示されるアミノ酸配列のＶＨ－ＣＤＲ３を含み、
抗体のＶＬは、配列番号４のアミノ酸配列で提示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で提示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列で提示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含む。
本発明は、ＶＨおよびＶＬを含む、ＢＣＭＡに特異的に結合する単離された抗体を開示し、ＶＨはＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を含み、ＶＬはＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ３を含み、ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号７、８、および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１０、１１、１２、および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１４、１５、および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号１７、１８、および１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ－ＣＤＲ２は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ－ＣＤＲ３は配列番号２１または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態において、ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号７、８、および９からなる群のアミノ酸配列から選択され、ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１０、１１、１２、および１３からなる群のアミノ酸配列から選択され、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１４、１５、および１６からなる群のアミノ酸配列から選択され、ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号１７、１８、および１９からなる群のアミノ酸配列から選択され、ＶＬ－ＣＤＲ２は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ－ＣＤＲ３は配列番号２１または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態において、抗体は、
１）配列番号７で提示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１０で提示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１４で提示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１７で提示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０で提示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２１で提示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含むＶＬ、
２）配列番号８で提示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１１で提示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１５で提示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１８で提示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０で提示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２１で提示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含むＶＬ、
３）配列番号８で提示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１２で提示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１４で提示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１７で提示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０で提示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２１で提示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含むＶＬ、
４）配列番号７で提示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１０で提示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１４で提示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１７で提示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０で提示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２２で提示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含むＶＬ、または
５）配列番号９で提示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１３で提示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１６で提示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１９で提示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０で提示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２１で提示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。
具体的な実施形態において、上記の抗体上のＶＨは、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態において、上記の抗体上のＶＬは、配列番号３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態において、抗体は、
１）配列番号２３で提示されるＶＨおよび配列番号３３で提示されるＶＬ、
２）配列番号２４で提示されるＶＨおよび配列番号３３で提示されるＶＬ、
３）配列番号２５で提示されるＶＨおよび配列番号３５で提示されるＶＬ、
４）配列番号２６で提示されるＶＨおよび配列番号３６で提示されるＶＬ、
５）配列番号２７で提示されるＶＨおよび配列番号３７で提示されるＶＬ、
６）配列番号２８で提示されるＶＨおよび配列番号３８で提示されるＶＬ、
７）配列番号２９で提示されるＶＨおよび配列番号３３で提示されるＶＬ、
８）配列番号３０で提示されるＶＨおよび配列番号３９で提示されるＶＬ、
９）配列番号３１で提示されるＶＨおよび配列番号４０で提示されるＶＬ、
１０）配列番号３２で提示されるＶＨおよび配列番号４１で提示されるＶＬ、
１１）配列番号２８で提示されるＶＨおよび配列番号４２で提示されるＶＬ、または
１２）配列番号２９で提示されるＶＨおよび配列番号４３で提示されるＶＬ、を含む。
具体的な実施形態において、上記の抗体は、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、および５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むか、あるいは
抗体は、上記の配列で構成されるか、または本質的に構成される。
具体的な実施形態において、本発明の抗体は一本鎖抗体ｓｃＦｖであり、そのＶＨおよびＶＬはグリシンおよびセリンに富むリンカーペプチド鎖によって連結され、ＶＨおよびＶＬの順番は交換可能である。
具体的な実施形態において、本発明の抗体はキメラまたはヒト化抗体である。
別の態様において、本発明はさらにＢＣＭＡを標的化するキメラ抗原受容体を開示し、１）本発明のｓｃＦｖ、２）ヒンジ領域、３）膜貫通領域、４）共刺激ドメイン、および５）ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ここで、共刺激ドメインはＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ－２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択され、好ましくは、共刺激ドメインは４－１ＢＢから選択され、４－１ＢＢは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態において、ヒンジ領域および膜貫通ドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１１受容体、ＰＤ－１、またはＣＤ３４のヒンジ領域および膜貫通ドメインから選択される。
例示的な抗体の配列は表１および配列表において提示される通りである。
Figure 2024501888000001
例示的な抗体のＣＤＲ配列は表２および配列表において提示される通りである。
Figure 2024501888000002
Figure 2024501888000003
Figure 2024501888000004
Figure 2024501888000005
Figure 2024501888000006
Figure 2024501888000007
Figure 2024501888000008
本発明は、前述の抗体またはキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子を開示する。
本発明は、前述の核酸分子を含むクローニングまたは発現ベクターをもまた開示する。ここで、ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターの１つ以上から選択される、
本発明は、前述の核酸分子または前述のベクターを含むホスト細胞をもまた開示する。ここで、ホスト細胞はＴリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、またはＴｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）である。
本発明は組成物またはキットをもまた開示し、前述の抗体、前述のキメラ抗原受容体、前述の核酸分子、前述のベクター、前述のホスト細胞の少なくとも１つ、および薬学的に許容される賦形剤（単数もしくは複数）、希釈剤（単数もしくは複数）、または担体を含む。
本発明は、Ｂ細胞関連新生物疾患、自己免疫疾患、ウイルスまたは細菌によって引き起こされる感染性疾患の防止または治療のための医薬の調製における、前述の抗体、前述のキメラ抗原受容体、前述の核酸分子、前述のベクター、前述のホスト細胞、または前述の組成物の使用をもまた開示する。
本発明は疾患を治療する方法を開示し、有効量の前述の抗体、前述のキメラ抗原受容体、前述の核酸分子、前述のベクター、前述のホスト細胞、または前述の組成物が、治療の必要がある対象に投与され、対象は、Ｂ細胞関連新生物疾患、自己免疫疾患、ウイルスまたは細菌によって引き起こされる感染性疾患の少なくとも１つを患っている。
１つの実施形態において、Ｂ細胞関連新生物疾患は、例えば急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、および骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病などの急性白血病、例えば慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病などの慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、ならびに骨髄異形成から選択される少なくとも１つである。
図１はＣＡＲ分子の模式図を示す。 図２はプラスミドベクターの模式図を示す。レンチウイルスの調製に用いられるプラスミドはｐＬｅｎｔｉプラスミドであり、標的遺伝子の上流プロモーターはＥＦ－１αであり、プロモーターの下流は順番にシグナルペプチド、リンカー領域、およびＣＡＲ構造配列である。 図３は、ＢＣＭＡを特異的に認識するｓｃＦｖを持つＣＡＲを有するレンチウイルスのＴ細胞における形質導入効率を示す。 図４は、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞およびＫ５６２細胞の表面上のＢＣＭＡ発現のフローアッセイプロットを示す。 図５は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－０１を含有するＣＡＲ－Ｔ（０１－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示し、０１－ＣＡＲ－ＴはｓｃＦｖ－０１を含有するＣＡＲ－Ｔ細胞を指示し、Ｃ－ＣＡＲ－Ｔは正の対照であり、Ｔ細胞治療群は負の対照である。 図６は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－０４を含有するＣＡＲ－Ｔ（０４－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図７は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－０５を含有するＣＡＲ－Ｔ（０５－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図８は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－０６を含有するＣＡＲ－Ｔ（０６－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図９は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－０７を含有するＣＡＲ－Ｔ（０７－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図１０は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－０８を含有するＣＡＲ－Ｔ（０８－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図１１は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－０９を含有するＣＡＲ－Ｔ（０９－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図１２は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－１０を含有するＣＡＲ－Ｔ（１０－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図１３は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－１１を含有するＣＡＲ－Ｔ（１１－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図１４は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－１２を含有するＣＡＲ－Ｔ（１２－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図１５は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－１３を含有するＣＡＲ－Ｔ（１３－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図１６は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－１４を含有するＣＡＲ－Ｔ（１４－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図１７は、標的細胞に対するｓｃＦｖ－１５を含有するＣＡＲ－Ｔ（１５－ＣＡＲ－Ｔ）の死滅効果のグラフを示す。 図１８は、標的細胞に対する本発明のＣＡＲ－Ｔの死滅効果の正規化されたグラフを示す。 図１９は、標的細胞刺激によるｓｃＦｖ－０１を含有するＣＡＲ－Ｔ（０１－ＣＡＲ－Ｔ）のサイトカイン発現のグラフを示す。
本発明は、具体的な実施形態によってさらに下記に記載される。別様に定められない限り、本明細書において用いられる用語は、当業者に普通に理解される同じ意味を有する。
本明細書において用いられる用語「抗原」は、抗体産生または特異的な免疫担当細胞の活性化が関わり得る免疫応答を引き出す分子を言う。当業者は、全ての蛋白質またはペプチドを包含するいずれかの高分子が抗原として用いられ得るということを理解するであろう。抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を引き出す蛋白質をコードし、本明細書において用いられる用語「抗原」をコードするヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の一部を包含するいずれかのＤＮＡを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原は遺伝子の全長ヌクレオチド配列によって専らコードされる必要はないということを理解するであろう。本開示は遺伝子の１つよりも多くの部分的なヌクレオチド配列の使用を包含するが、これに限定されないということと、これらのヌクレオチド配列は所望の免疫応答を引き出すために異なる組み合わせで配置されるということとは直ちに明らかである。さらに、当業者は、抗原は「遺伝子」によってコードされる必要は少しもなく、抗原は生成され得るか、合成され得るか、または生物サンプルに由来し得るということを理解するであろう。かかる生物サンプルは組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、または生体液を包含し得るが、これらに限定されない。
本明細書において用いられる用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を言う。抗体は、天然の起源にまたは組み換えの起源に由来する無傷免疫グロブリンであり得、無傷免疫グロブリンの免疫反応性の部分であり得る。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は種々の形態で存在し得、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多重特異性、非特異的、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、変異、およびグラフト抗体を包含する；本発明の抗体の形態は、全長抗体、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｔｒｉ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、および抗原結合機能を保持する他の抗体断片をもまた包含する；それらは二量体構造（ダイアボディ）または三量体構造（トライアボディ）でもまたあり得る。典型的には、断片は抗原結合断片を包含すべきであり、これは典型的にはＶＬおよびＶＨを含むが、必ずしも両方を含まなくてよい。例えば、いわゆるＦｄ抗体断片はＶＨおよびＣＨ１ドメインのみからなるが、依然として、無傷抗体の抗原結合機能の一部を保持する。免疫グロブリンまたはその断片もしくは誘導体としての用語「抗体」は、インビトロで産生されるかまたはインビボで産生されるかにかかわらず、抗原結合部位を含むいずれかのポリペプチドを包含する。ＶＨまたはＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、散財しているフレームワーク領域（ＦＷＲ）と呼ばれるより保存された領域とにさらに細分され得る。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。重鎖上のＣＤＲはＶＨ－ＣＤＲ、例えばＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３と略され、軽鎖上のＣＤＲはＶＬ－ＣＤＲ、例えばＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ＶＬ－ＣＤＲ３と略される。本発明において開示される抗体および抗原結合断片のＣＤＲはカバット付番によって定められるかまたは同定される。
本明細書において用いられる用語「一本鎖可変領域断片」、「一本鎖抗体」、または「ｓｃｆｖ」は、免疫グロブリンの重（heavey）鎖可変領域および軽鎖可変領域がアミノ酸ペプチドのセグメント（リンカー）によって連結される組み換えＤＮＡ技術によって形成された抗体を言う。一本鎖抗体を生成するための種々の方法が公知であり、米国特許第４，６９４，７７８号；バード（Bird）（１９８８年）サイエンス（Science）第２４２巻：ｐ．４２３－４４２；ハストン（Huston）ら（１９８８年）米国科学アカデミー紀要第８５巻：ｐ．５８７９－５８８３；ウォード（Ward）ら（１９８９年）ネイチャー（Nature）第３３４巻：ｐ．５４４５４；スケラ（Skerra）ら（１９８８年）サイエンス（Science）第２４２巻：ｐ．１０３８－１０４１に記載されているものを包含する。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。重鎖上のＣＤＲはＶＨ－ＣＤＲ、例えば、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３と略され、軽鎖上のＣＤＲはＶＬ－ＣＤＲ、例えば、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ＶＬ－ＣＤＲ３と略される。本発明において開示される抗体および抗原結合断片のＣＤＲはカバット付番によって定められるかまたは同定される。
本開示において用いられる用語「キメラ」は、重鎖のある部分が１つの種に由来し、重鎖の別の部分が他の種に由来する抗体または抗体ポリペプチドを言う。例示的な例において、キメラ抗体は、ヒトに由来する定常領域およびラクダ科動物などの非ヒト動物に由来する可変領域を含み得る。ある種の実施形態において、非ヒト動物は哺乳動物、例えばラクダ科動物、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、羊、モルモット、またはハムスターである。
本開示において用いられる用語「ヒト化」は、非ヒト動物に由来するＣＤＲ、ヒトに由来するＦＷＲ領域、および適用可能なときにはヒトに由来する定常領域を含む抗体または抗体ポリペプチドを言う。
本開示において用いられる「ＢＣＭＡ」はヒトに由来し得、ヒトＢＣＭＡの例示的な配列はヒトＢＣＭＡ蛋白質（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．：ＢＡＢ６０８９５．１）を包含する。
本発明において用いられる用語「ＢＣＭＡ」は、ＢＣＭＡのいずれかの形態を包摂することを意図される。例えば、１）天然の未加工ＢＣＭＡ分子、「全長」ＢＣＭＡ鎖、または天然に生成されるＢＣＭＡ変異体であって、例えばスプライス変異体もしくは対立変異体を包含する；２）細胞内処理後に産生されるＢＣＭＡのいずれかの形態；あるいは３）ＢＣＭＡサブユニットの全長、断片（例えば、短縮形態、細胞外／膜貫通ドメイン）、またはそれらの改変形態（例えば、突然変異体形態、グリコシル化／ＰＥＧ化、Ｈｉｓタグ／免疫蛍光融合形態）であって、組み換え法によって産生される。
本発明において用いられる用語「ＢＣＭＡを標的化する」は、ＢＣＭＡ（例えばヒトＢＣＭＡ）に特異的に結合する能力を言う。例えば、ＢＣＭＡを標的化するキメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡに特異的に結合し得るキメラ抗原受容体を言う；例えば、ＢＣＭＡを標的化するｓｃＦｖはＢＣＭＡ（例えばヒトＢＣＭＡ）に特異的に結合し得る一本鎖抗体を言う。
本開示において用いられる用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、２つの分子間のランダムでない結合反応、例えば、抗体および抗原の間の結合反応を言う。ある種の実施形態において、本開示によって提供される抗体ポリペプチドは、ヒトＢＣＭＡに、結合親和性（ＫＤ）≦１０－６Ｍ（例えば、≦５×１０－７Ｍ、≦２×１０－７Ｍ、≦１０－７Ｍ、≦５×１０－８Ｍ、≦２×１０－８Ｍ、≦１０－８Ｍ、≦５×１０－９Ｍ、≦４×１０－９Ｍ、≦３×１０－９Ｍ、≦２×１０－９Ｍ、または≦１０－９Ｍ）で特異的に結合する。本開示において用いられるＫＤは結合速度に対する解離速度の比（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を言い、これは当分野において公知のいずれかの従来の方法によって決定され得、表面プラズモン共鳴法、マイクロスケール熱泳動、高速液体クロマトグラフィー質量分析、およびフローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）法を包含するが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、ＫＤは好適にはフローサイトメーターによって決定され得る。
本明細書において用いられる用語「ベクター」は、目当ての含有される外来性の遺伝子（例えば本発明のポリヌクレオチド）の標的細胞における輸送、形質導入、および発現のための分子ツールを言い、これは、標的細胞における転写を開始するための好適なヌクレオチド配列、すなわちプロモーターを提供する。ベクターは、単離された核酸を包含し、単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いられ得る。数々のベクターが当分野において公知であり、直鎖ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを包含するが、これらに限定されない。それゆえに、用語「ベクター」は自律複製するプラスミドまたはウイルスを包含する。用語は、細胞内への核酸の移入を容易化する非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物、リポソーム、および同類をもまた包含すると解釈すべきである。ウイルスベクターの例はセンダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、および同類を包含するが、これらに限定されない。
本明細書において用いられる「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現コントロール配列を包含する組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを言う。発現ベクターは発現のための十分なシス作用エレメントを包含する；発現のための他のエレメントはホスト細胞によってまたはインビトロ発現系で供給され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを組み込む当分野において公知の全てのもの、例えばプラスミド（例えば裸の、またはリポソーム中に含有された）およびウイルス（例えば、センダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を包含する。
本明細書において用いられる「クローニングベクター」は、ホスト細胞内で自律複製ができるＤＮＡ分子、例えばプラスミド、コスミド、またはファージを言う。クローニングベクターは典型的には１つのまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびマーカー遺伝子を含有し、外来性のＤＮＡ配列が、ベクターの必須の生物学的機能を失うことなしに制限エンドヌクレアーゼ認識部位において定められた様式で挿入され、マーカー遺伝子は、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択に好適である。マーカー遺伝子は、典型的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を包含する。
ホスト細胞は、クローニングベクターまたは発現ベクターを含有するいずれかの原核または真核細胞であり得、クローニングされた遺伝子をホスト細胞の染色体またはゲノム上に含有するように遺伝子操作された原核または真核細胞を包含する。好適な哺乳類ホスト細胞は、ミエローマ細胞、例えばＳＰ２／０細胞およびＮＳＯ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハイブリドーマ細胞株、および抗体を発現するために用いられ得る他の哺乳類ホスト細胞を包含する。改変された免疫系を有する特別なトランスジェニック動物もまた抗体を作るために用いられ得る。
本明細書において用いられる「同一性」は、２つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性を言う。同一性は、比較目的でアラインメントされた各配列上の位置を比較することによって決定され得る。比較される配列同士のある位置が同じ塩基によって占有されるときには、分子同士はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の度合いは、核酸配列同士によって共有される位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。２つの配列間の同一性は種々のアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムによって計算され得る。ＧＣＧ配列解析パッケージ（ウィスコンシン大学、マディソン、ウィスコンシン州）の一部として利用可能なもの、およびＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを包含し、これらは例えばデフォルトの設定で用いられ得る。例えば、当業者は、少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を本明細書に記載される特定のポリペプチドに対して有するポリペプチド、および好ましくは実質的に同じ機能を見せるポリペプチド、ならびに上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを予想し得る。
本明細書において用いられる「単離された」は、天然の状態から変更されたか、または取り出されたかを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、その天然状態において共存する材料から部分的にまたは完全に分離されている同じ核酸またはペプチドは「単離」されている。単離された核酸または蛋白質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または非天然環境に、例えばホスト細胞内に存在し得る。
別様に規定されない限り、本明細書において用いられる蛋白質の核酸分子または蛋白質のアミノ酸配列を「コード」するヌクレオチド配列は、互いの縮重、および同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を包含する。ヌクレオチド配列は１つ以上のイントロンをもまた包含し得る。
本明細書において用いられる用語「変異体」は、少なくとも１つの残基を置換すること、または少なくとも１つのアミノ酸残基を親分子のアミノ酸配列のＮもしくはＣ末端に追加することによって得られるポリペプチドの変異体を意味する。
本明細書において用いられる用語「対象」はいずれかのヒトまたは非ヒト動物を包含する。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、羊、犬、猫、馬、牛、鶏、ラット、マウス、両生類、爬虫類、および同類を包含する。別様に指示されない限り、用語「患者」または「対象」は交換可能に用いられる。本発明において、好ましい対象はヒトである。
本明細書において用いられる用語「治療する」は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の縮減または疾患の改善、例えば有益なまたは所望の臨床結果を有するようにして、本明細書に記載される方法に従ってエクスビボで変更した標的遺伝子のポリヌクレオチド配列を有する有効量の細胞を対象に投与することを言う。本開示の目的では、有益なまたは所望の臨床結果は、１つ以上の症状の縮減、疾患の重症度の縮減、疾患状態の安定化（すなわち悪化なし）、疾患進行の遅延または低速化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分的な寛解かまたは完全な寛解かにかかわらず）を、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず包含するが、これらに限定されない。治療は、治療を受けない場合の予想される生残と比較して生残を引き延ばすことを言い得る。それゆえに、当業者により、治療は疾患の状態を改善し得るが、疾患の完全な治癒とはなり得ないことが理解される。本明細書において用いられる用語「治療」は防止を包含する。代替的には、疾患の進行が縮減または停止させられる場合に、治療は「有効」である。「治療」は、治療を受けない場合の予想される生残と比較して生残を引き延ばすことをもまた意味し得る。治療の必要がある患者は、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害と診断された患者、および遺伝的素因または他の因子を原因としてかかる障害を発生し得る患者を包含する。
本明細書において用いられる用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答からもたらされる障害として定められる。自己免疫疾患は自己抗原に対する不適当なかつ過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例は、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性ムンプス、クローン病、糖尿（１型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、および同類を包含するが、これらに限定されない。
数的な限度または範囲が本明細書において申し立てられるケースでは、端点は包含される。加えて、数的な限度または範囲内の全ての値および部分範囲は具体的に包含される。
例１．ｓｃＦｖ遺伝子の合成
本発明の具体的な実施形態においては、表２に提示されるｓｃＦｖをコードする核酸が遺伝子操作法によって合成され得る。本発明のｓｃＦｖをコードする核酸断片は北京バイオメッド・ジーン・テクノロジー（Beijing Biomed Gene Technology）社において合成された。ｓｃＦｖ断片は、ＶＨと、ＶＬと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを一緒に連結してＢＣＭＡを特異的に認識する抗原結合部位を形成するリンカー領域とを含有する。一本鎖抗体は一般的には１つのヌクレオチド鎖によってコードされる連続的な１つのアミノ酸鎖であり、ｓｃＦｖはアミノ酸欠失、挿入、置換、追加、および当分野において公知の他の改変によってさらに改変され得る。加えて、ｓｃＦｖの改変が好ましくは核酸レベルで行われるようにして、何らかのアミノ酸配列に従ってそれらの核酸配列上に上記の改変を導入する方法もまた当業者には公知である。
例２．ＣＡＲ分子の構築およびレンチウイルスパッケージング
図１に示される通り、一本鎖抗体ｓｃＦｖおよびヒンジ領域、膜貫通構造ドメイン、ＣＤ２８または４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζドメインは、一緒になって、例１のＣＡＲ構造を形成する。ヒンジ領域および膜貫通領域はＣＤ８αから選択される。
１）ＢＣＭＡを標的化するｓｃＦｖ遺伝子を遺伝子合成法（北京バイオメッド・ジーン・テクノロジー（Beijing Biomed Gene Technology）社）によって合成した。２）既存のＣＡＲプラスミドを鋳型として用いて、ＣＡＲ分子上のＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通領域、４－１ＢＢの細胞内領域（ＮＰ＿００１５５２．２に対応）、およびＣＤ３ζの細胞内領域（ＮＰ＿０００７２５．１に対応）を含有する核酸断片を、ＰＣＲによってクローニングした。３）ステップ１）で得られた遺伝子およびステップ２）で得られた核酸断片を鋳型として用いて、ＢＣＭＡを標的化するＣＡＲの完全な核酸断片をＰＣＲによってクローニングした。４）ステップ３）で得られた完全な核酸断片を、レンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５（サーモフィッシャー、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）上に制限消化およびライゲーションによって挿入して、ＢＣＭＡを標的化するＣＡＲの遺伝子を持つレンチウイルス移入プラスミドを得た（図２）。５）レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＬＰ／ＶＳＶＧ、ｐＬＰ１／ＭＤＫ、ｐＬＰ２／ＲＳＫ（サーモフィッシャー、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）およびステップ４）で得られた移入プラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（サーモフィッシャー、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、培地を４８時間後に収集した。３００ｇでの遠心分離によって細胞デブリを取り除いた後に、細胞を３時間に渡って２５，０００ｒｐｍで超遠心分離機を用いて遠心分離した。沈殿を１ｍＬの生理食塩水に溶解した。これが所望のレンチウイルスベクターであった。
例３．ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
Ｔ細胞を健康なボランティアの末梢血単核細胞（妙通（上海）生物科技有限公司（Miaotong (Shanghai) Biological Technology Co., Ltd.）、中国）からＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（サーモフィッシャー）を用いて単離した。単離および精製されたＴ細胞（この時点のＴ細胞はＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズに取り付けられている）を、１．０×１０６細胞／ｍＬで、ＩＬ－２（山東金泰バイオロジカルエンジニアリング（Shandong Jintai Biological Engineering）社、中国）（５００ＩＵ／ｍＬ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ１５培地（ロンザ、スイス）によって培養した。４８時間の培養後に、Ｔ細胞を上記のレンチウイルスベクターに感染させた。ウイルス感染の２４時間後に、細胞を遠心分離し、培地を交換し、ＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）を含有する新鮮なＸ－ＶＩＶＯ１５を追加して培養を継続した。８日の細胞培養後に、培養系の全ての細胞を収集し、ダイナビーズを培養系から磁石ラックを用いて取り除き、Ｔ細胞を遠心分離およびカウントした。
例４．レンチウイルス形質導入効率分析
１．０×１０６の細胞を調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞から取り、細胞を２００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、上清を１０００ｇでの遠心分離後に取り除いた。細胞沈殿を１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、３μＬの抗体を追加し、室温で２０分に渡ってインキュベーションし、細胞を２００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、上清を１０００ｇでの遠心分離後に取り除いた。細胞を１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、細胞の各群におけるＣＡＲ含量をフローサイトメーター（ＮｏｖｏＣｙｔｅ２０６０Ｒ、ＡＣＥＡバイオサイエンシズ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出した。図３に示される通り、各ＣＡＲ遺伝子の形質導入効率はレンチウイルス感染ＭＯＩ＝０．５において３５～６５％の範囲であった。
例５．標的細胞の表面上のＢＣＭＡ発現の検出
この例では、ヒトミエローマ細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９およびヒト白血病細胞株Ｋ５６２の表面上のＢＣＭＡの発現を例として上げた。
ＮＣＩ－Ｈ９２９およびＫ５６２細胞両方はＡＴＣＣから購入した。ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞およびＫ５６２細胞を活発な増殖段階まで培養し、１．０×１０６細胞をそれぞれから取った。細胞を２００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、１０００ｇで遠心分離し、上清を取り除いた。細胞沈殿を１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、５μＬの蛍光標識ＢＣＭＡ抗体（ミルテニーバイオテク、ＵＳＡ）を追加し、室温で２０分に渡ってインキュベーションし、細胞を２００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、上清を１０００ｇでの遠心分離後に取り除いた。細胞を１００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、２つの細胞におけるＢＣＭＡ発現の比をフローサイトメーター（ＮｏｖｏＣｙｔｅ２０６０Ｒ、ＡＣＥＡバイオサイエンシズ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出した。図４に示される通り、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞の表面上のＢＣＭＡの発現レベルは高かったが、Ｋ５６２細胞はＢＣＭＡをほとんど発現しなかった。
例６．標的細胞の死滅時のＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔの効率
この例では、ＢＣＭＡ陽性の標的細胞に対する、ＢＣＭＡを特異的に認識するｓｃＦｖと、ＣＤ８αヒンジ領域と、ＣＤ８α膜貫通ドメインと、４－１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ζドメインとを含有するＣＡＲ－Ｔの死滅効率の検出を例として上げた。
２×１０６のＮＣＩ－Ｈ９２９標的細胞（ＡＴＣＣ）またはＢＣＭＡ発現陰性のＫ５６２細胞を１ｍＬの生食に再懸濁し、５μＬのカルセインＡＭ（濃度１μｇ／μＬ、サーモフィッシャー、ＵＳＡ）を追加し、穏やかに混合し、それから３７℃水浴によって５分に渡ってインキュベーションして、標的細胞を標識し、１０ｍＬの生食によって２回洗浄して余分な色素を取り除き、細胞をカウントのために１ｍＬの生食に再懸濁した。各１×１０５の上で標識されたＮＣＩ－Ｈ９２９またはＫ５６２細胞を４８ウェル細胞培養プレート（コーニング社、コーニング、ＮＹ、ＵＳＡ）の各ウェルに追加し、種々のＣＡＲ－Ｔ細胞をＥ：Ｔ＝５：１に従って追加し、プレートを３７℃の５％ＣＯ２細胞インキュベータに６時間に渡って置き、培養上清を検出のために取った。細胞上清の蛍光値を蛍光マイクロプレートリーダー（バリオスキャンＬｕｘ、サーモフィッシャー）によって検出した（励起波長：４９５ｎｍ、発光波長：５１５ｎｍ）。
図５から１７は、ＢＣＭＡを標的化するｓｃＦｖと共刺激シグナルドメインとＣＤ３ζシグナルドメインとを有するＣＡＲ－Ｔが、全て、ＢＣＭＡ標的蛋白質を認識することによってＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を有効に死滅し得、ブルーバード・バイオのＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ（Ｃ－ＣＡＲ－Ｔ、国際公開第２０１６／０１４７８９号の配列参照ＳｅｑＮｏ．１５）よりもＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に対して有効であるが、ＢＣＭＡ発現陰性のＫ５６２細胞を有効には死滅し得ないということを示し、これらのＣＡＲ－ＴがｓｃＦｖによってＢＣＭＡを特異的に認識し、ＣＡＲ－Ｔを活性化し、ＣＡＲ－Ｔに腫瘍細胞を死滅させ得ることを指示している。
図１８は、Ｃ－ＣＡＲ－Ｔと比較して、ほとんどのＣＡＲ－Ｔ細胞（０５－ＣＡＲ－Ｔを例外とする）がより高い死滅効率をＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に対して有するということを示し、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞に対してより反応性であるということを指示している。
例７．標的細胞によって刺激されたＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔのサイトカイン発現
本例では、ＢＣＭＡを特異的に認識するｓｃＦｖ－０１と、ＣＤ８αヒンジ領域と、ＣＤ８α膜貫通ドメインと、４－１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ζドメインとを含有するＣＡＲ－Ｔの刺激後の、ＢＣＭＡ陽性の標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９）およびＢＣＭＡ陰性の細胞（Ｋ５６２）におけるサイトカインインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の発現の検出を、例として上げた。
Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞をＮＣＩ－Ｈ９２９細胞またはＫ５６２細胞と６時間に渡って３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにおいて共インキュベーションし（標的細胞に対するエフェクター細胞の比はそれぞれ１０：１、５：１、１：１であった）、上清を収集し、ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキット（ＢＤバイオサイエンス）を用いてサイトカイン発現を検出した。
図１９は、Ｔ細胞と比較して、ＢＣＭＡ陽性の標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９）と共インキュベーションされたＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞の、ＩＦＮ－γ誘導効果が有意に増強されたということを示している。同時に、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に対するエフェクター細胞の比の増大によって、サイトカイン放出効果は増強される。しかしながら、ＢＣＭＡ陰性の細胞Ｋ５６２とのＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞の共インキュベーション後には、ＩＦＮ－γ誘導効果はＴ細胞群のものと有意には異ならなかった。上記の実験結果は、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞がＢＣＭＡ標的抗原を特異的に認識し、それによって細胞傷害性に関係するサイトカインを産生し得るということを示している。

Claims (15)

  1. 重鎖可変ドメインＶＨおよび軽鎖可変ドメインＶＬを含む、ＢＣＭＡに特異的に結合する単離された抗体であって、
    前記ＶＨは、配列番号１を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、
    前記ＶＬは、配列番号４を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２１を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む、抗体。
  2. 前記ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号７、８、および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１０、１１、１２、および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１４、１５、および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号１７、１８、および１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体は、
    １）配列番号７を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１４を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１７を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２１を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含むＶＬと、
    ２）配列番号８を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１１を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１５を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１８を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２１を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含むＶＨと、
    ３）配列番号８を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１２を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１４を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１７を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２１を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含むＶＬと、
    ４）配列番号９を含むＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１３を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１６を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１９を含むＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２０を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２１を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含むＶＬと、を含む、請求項１に記載の抗体。
  4. 前記ＶＨは、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  5. １）配列番号２３、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３３、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    ２）配列番号２４、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３３、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    ３）配列番号２５、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３５、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    ４）配列番号２６、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３６、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    ５）配列番号２７、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３７、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    ６）配列番号２８、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３８、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    ７）配列番号２９、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３３、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    ８）配列番号３０、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３９、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    ９）配列番号３１、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４０、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    １０）配列番号３２、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４１、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
    １１）配列番号２８、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４２、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、あるいは
    １２）配列番号２９、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４３、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む請求項１に記載の抗体。
  6. 配列番号４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、もしくは５６で提示されるアミノ酸配列、または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をそれに対して有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  7. 前記抗体は、ｓｃＦｖである、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
  8. 請求項７に記載のｓｃＦｖを含み、ヒンジ領域、膜貫通領域、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインの少なくとも１つを任意にさらに含む、ＢＣＭＡを標的化するキメラ抗原受容体。
  9. 前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択され、好ましくは、前記共刺激ドメインは４－１ＢＢから選択され、前記４－１ＢＢは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤ３ζから選択される、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。
  10. 請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体または請求項８～９のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体をコードする、単離された核酸分子。
  11. 請求項１０に記載の核酸分子を含むベクター。
  12. 請求項１０に記載の核酸分子または請求項１１に記載のベクターを含む、ホスト細胞。
  13. 請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体、請求項８または９に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載のホスト細胞の少なくとも１つ、および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む、組成物またはキット。
  14. Ｂ細胞関連新生物疾患、自己免疫疾患、ウイルスまたは細菌によって引き起こされる感染性疾患の防止または治療のための医薬の調製における、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体、請求項７もしくは８に記載のキメラ抗原受容体、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載のホスト細胞、または請求項１２に記載の組成物の使用。
  15. 前記Ｂ細胞関連新生物疾患は、例えば急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、および骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病などの急性白血病、例えば慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病などの慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、ならびに骨髄異形成から選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載の使用。
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