KR102316091B1 - Bcma를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

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엄현석
박은정
최범규
노소연
홍성원
한충용
조제열
성혜진
최시영
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Abstract

본 발명은 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 BCMA를 표적으로 하는 항체, 상기 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체, 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR-T 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 제조된 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포는 BCMA와 효과적으로 결합할 뿐만 아니라, BCMA와 결합한 CAR-T 세포의 활성화가 이루어진 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 CAR-T 세포는 BCMA를 발현하는 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포는 B 세포 또는 BCMA 발현과 관련된 질환 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도{Chimeric antigen receptor targeting BCMA and use thereof}
본 발명은 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 BCMA를 표적으로 하는 항체, 상기 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체, 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR-T 세포에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(CAR) T-세포는 특정 항암 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하기 위해 목적으로 하는 항원에 대한 항체-기반 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하는 분자이다. 일반적으로, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포외 항원 결합 도메인은 확인된 종양 항원을 표적으로 하는 단일 사슬 가변 단편(single-chain variable fragment; scFv)을 포함할 수 있다.
CAR는 유전자 형질감염 기술을 이용하여 면역 이펙터 세포(immune effector cell)인 T 세포의 표면상에서 발현될 수 있다. T 세포 표면에 발현된 CAR와 표적 종양 항원이 결합하게 되면, CAR는 특정한 항종양 반응을 항원-의존성 방식으로 착수하도록 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
한편, CD269 또는 TNFRSF17로도 알려진 B-세포 성숙 항원(B-cell maturation antigen: BCMA)은 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 수용체 패밀리의 구성원이다. BCMA가 B-세포 활성화 인자 수용체(B-cell activating factor receptor: BAFF) 및 B-세포 증식 유도 리간드(B-cell proliferation-inducing ligand: APRIL)와 결합하여 상이한 발달 단계에서 B 세포의 생존을 촉진할 수 있음이 보고된 바 있다. 비정상적인 신호전달은 B 세포의 비정상적인 증식을 초래하여 다발성 골수종 등과 같은 자가 면역 질환(autoimmune diseases) 및 종양형성(tumorigenesis)을 초래할 수 있다 (Rickert, et al., Immunological Reviews, 2011, Vol. 244:115-133)
다발성 골수종은 형질세포가 비정상적으로 분화 및 증식하여 나타나는 혈액암의 일종으로, 이는 종양을 생성하고 뼈를 녹여 통증을 유발한다. 이뿐만 아니라, 다발성 골수종은 골수를 침범하여 백혈구, 적혈구, 혈소판 수치를 감소시킴으로써 빈혈, 감염, 출혈의 위험성도 증가시킨다. 나아가, 골수종 세포는 비정상 면역단백인 M 단백(M protein)을 생성하기도 하며, 이는 혈액의 농도를 증가시켜 혈액과점도증후군을 초래하거나 신장에 손상을 주기도 한다.
다발성 골수종에 대한 일부 치료법은 다른 암에 대한 치료법, 예를 들면, 화학요법 또는 방사선 요법, 줄기세포 이식 또는 골수 이식, 표적화된 요법 또는 생물학적 요법과 유사하다. 항체-기초된 세포 면역요법은 혈액학적 악성, 특히 B 세포 비호지킨 림프종을 앓는 환자에 대한 실제적인 임상적 유익성이 확인되었으나, 대부분의 환자가 재발하거나 2차 저항이 발생하는 문제점이 있으므로, 다발성 골수종을 치료하기 위한 효과적인 면역치료적 작용제가 요구되고 있으며, 이를 위해 CAR-T 세포를 이용한 치료방법이 연구되고 있다 (Ellebrecht et al., Science 353:179-184, 2016; Carpenter et al., Clin Cancer Res,19(8):2048-2060, 2013; WO2016-014789; WO 2016/014565; WO 2013/154760).
이에, 본 발명에서는 다발성 골수종 등과 같은 B 세포와 관련된 질환의 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, BCMA를 표적으로 하는 항체를 선별하였으며, 상기 선별된 항-BCMA 항체를 인간화시켜(humanized antibody) 최종적으로 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포를 제조하였다. 상기 제조된 BCMA 표적 CAR-T 세포는 BCMA와 결합하는 것을 확인하였으며, BCMA 발현 종양세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 BCMA를 표적하는 항체 및 상기 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 BCMA를 표적하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 키메라 항원 수용체 발현하는 면역 이펙터 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 BCMA를 표적하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포를 포함하는 BCMA 발현과 관련된 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 BCMA(B-cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되는 항체; 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 BCMA-결합 도메인; 막관통 도메인(transmembrane domain); 공동자극 도메인(costimulatory domain); 및 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로,
상기 BCMA-결합 도메인은 BCMA와 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 포함하며,
상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택되는 단백질로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX-40 및 ICOS로 구성된 군에서 선택되는 단백질 유래일 수 있고, 상기 신호전달 도메인은 CD3ζ 유래일 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 BCMA-결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 부위(hinge region)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 힌지 부위는 CD8α 유래일 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드(plasmid), 레트로바이러스(retroviral) 벡터 또는 렌티바이러스(lentiviral) 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하고, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 이펙터 세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 T 세포일 수 있다.
또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 BCMA를 표적하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포 또는 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 BCMA 발현과 관련된 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 BCMA 발현과 관련된 질환은 다발성골수종(multiple myeloma), 혈액암, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 자가항체-의존성 자가면역 질환(autoantibody-dependent autoimmune disease), 전신홍반루프스(systemic lupus erythematosus, SLE) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)일 수 있다.
본 발명에서 제조된 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포는 BCMA와 효과적으로 결합할 뿐만 아니라, BCMA와 결합한 CAR-T 세포의 활성화가 이루어진 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 CAR-T 세포는 BCMA를 발현하는 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포는 B 세포 또는 BCMA 발현과 관련된 질환 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 인간화된 항-BCMA 단클론 항체(3G4V2)의 BCMA 결합능을 확인한 데이터이다.
도 2는 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(hBCMA-CAR)를 발현하는 렌티바이러스 벡터 및 T 세포에서 발현된 키메라 항원 수용체를 나타낸 모식도이다.
도 3은 hBCMA-CAR를 발현하는 렌티바이러스를 이용한 hBCMA-CAR-T 세포 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 hBCMA-CAR-T 세포의 BCMA 결합능을 확인한 데이터이다.
도 5는 hBCMA-CAR-T 세포의 활성화를 확인하기 위해, 표적 세포의 존재하에 3G4V2-CAR T 세포에 의한 IFNγ 및 CD107a 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 6은 hBCMA-CAR-T 세포에 의한 표적 세포의 사멸효과를 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
BCMA를 표적으로 하는 항체
본 발명은 일관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 BCMA(B-cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody)일 수 있다. 본 발명에서, 용어 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 모노클로날 항체 또는 단일클론항체라고도 불리며, 단일 항체 형성세포가 생성하는 항체로, 1차 구조(아미노산 배열)가 균일한 특징이 있다. 오직 하나의 항원 결정기만을 인식하며, 일반적으로 암세포와 항체생산세포를 융합한 하이브리도마(hybridoma cell)을 배양하여 생산되지만, 확보된 항체 유전자 서열을 이용하여 다른 재조합 단백질 발현 숙주세포를 이용하여 생산할 수도 있다.
본 발명에서, 용어 "항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이란 적어도 펩타이드 태그(에피토프) 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 scFv, Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일 도메인(single domain) 등을 포함한다.
항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 부위(hinge region)를 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 부위의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다). 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명의 BCMA에 특이적으로 결합하는 단클론 항체는 상기 BCMA 단백질 전체 또는 일부 펩타이드를 면역원(또는 항원)으로 이용하여 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 우선 면역원으로서 상기 BCMA, 상기 BCMA 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 상기 BCMA 단백질을 포함하는 캐리어(carrier)를 필요에 따라서 면역증강제인 아주반트(adjuvant)(예, Freund adjuvant)와 함께 인간을 제외한 포유동물의 피하, 근육, 정맥, 발볼록살 또는 복강 내에 1회 내지 그 이상 주사하는 것으로써 면역감작(immunization)을 시킨다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 말 또는 소(인간 항체를 생산하는 형질 전환(transgenic) 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 조작된 형질 전환(transgenic) 동물을 포함한다.)이며, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭 또는 토끼이다. 첫 번째 면역으로부터 약 1~21일 마다 1~4회 면역을 실시하여, 최종 면역으로부터 약 1~10일 후에 면역 감작 된 포유동물로부터 항체 생산하는 세포를 수득할 수 있다. 면역을 시키는 회수 및 시간적 간격은 사용하는 면역원의 특징 등에 의하여 적당히 변경할 수 있다.
단클론 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma)의 제조는 케이라 및 미르슈타인 등의 방법(Nature, 1975, Vol. 256, p. 495-497) 및 이에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기와 같이 면역 감작된 인간을 제외한 동물로부터 채취한 비장, 림프절, 골수 또는 편도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체 생산하는 세포와 자가 항체 생산 능력이 없는 포유동물 유래의 골수종 세포(myeloma cells)를 세포 융합시키는 것에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 제조할 수 있다. 상기 포유동물은 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 닭, 토끼 또는 인간일 수 있고, 바람직하게는 마우스, 래트, 닭 또는 인간일 수 있다.
세포 융합은, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜이나 센다이 바이러스를 비롯한 융합 촉진제나 전기 펄스에 의한 방법이 이용되고, 일례를 들면, 융합 촉진제를 함유하는 융합 배지에 항체 생산 세포와 무한 증식 가능한 포유류 유래의 세포를 약 1:1 내지 1:10의 비율로 부유시켜, 이 상태로, 약 30 내지 40℃로 약 1 내지 5분간 배양한다. 융합 배지에는, 예를 들면, MEM 배지, RPMI1640 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 비롯한 통상의 일반적인 것을 이용하면 좋고, 소 혈청 등의 혈청류는 제외해 두는 것이 바람직하다.
상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 스크리닝하는 방법은 우선, 상기한 바와 같이 획득한 융합 세포를 HAT 배지 등의 선택용 배지에 옮기고, 약 30 내지 40℃로 약 3일 내지 3주일 배양해서 하이브리도마 이외의 세포를 사멸시킨다. 이어서, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등에서 하이브리도마를 배양한 후, 위에서 기술한 인간을 제외한 동물의 면역반응에 사용한 면역원과 배양 상청액과의 반응성이 증가된 부분을 RIA(radioactive substance-marked immuno antibody) 또는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)같은 면역분석방법을 통하여 찾는 방법을 통해 수행할 수 있다. 그리고 상기에서 찾은 단클론 항체를 생산하는 클론은 상기 면역원에 대하여 특이적인 결합력을 보여준다.
본 발명의 단클론 항체는, 이와 같은 하이브리도마를 생체 내외에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 배양에는, 포유동물 유래의 세포를 배양하기 위한 통상의 방법이 이용되며, 배양물 등으로부터 단클론 항체를 채취하기 위해서는, 항체 일반을 정제하기 위한 이 분야에서의 통상의 방법이 이용된다. 각각의 방법으로서는, 예를들면, 염석(鹽析), 투석, 여과, 농축, 원심분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등을 들 수 있고, 이들은 필요에 따라서 조합해서 적용된다. 정제한 단클론 항체는, 그 후, 농축, 건조하여, 용도에 따라서 액상 또는 고상으로 한다.
또한, 본 발명의 단클론 항체는, 중쇄(重鎖) 및 경쇄(輕鎖) 가변영역을 코딩하는 DNA를 각각, 중쇄 및 경쇄의 정상영역을 코딩하는 기지의 DNA(예를 들면, 일본 2007-252372호 공보 참조)와 각각 연결한 유전자를, PCR법, 또는, 화학 합성에 의해 합성하고, 그 유전자의 발현을 가능하게 하는 공지의 발현 벡터(pcDNA 3.1(Invitrogen 사 판매) 등에 이식하여 형질 전환체를 제조하고, CHO 세포나 대장균 등의 숙주 중에서 발현시킴으로써 항체를 생산하고, 이러한 배양액으로부터, 프로테인 A 또는 G(Protein A 또는 G) 컬럼 등을 이용해서 항체를 정제함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는, BCMA와 특이적으로 결합하는 마우스 항체를 제작하고 스크리닝하여 신규한 항체를 확립하였으며, 이를 3G4로 명명하였다.
상기 3G4 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열(GYTFTSYV) 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열(IIPYNDGT)로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열(ARWNWDGYFDV)로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위; 및 서열번호 4의 아미노산 서열(KSLLHSNGITY)로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열(QMS)로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열(TQNLELPFT)로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변부위로 구성되는 것을 확인하였다.
바람직하게 상기 3G4 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 또한, 3G4 항체의 중쇄 가변부위는 서열번호 9의 염기서열로, 3G4 항체의 경쇄 가변부위는 서열번호 10의 염기서열로 코딩될 수 있다. 상기 3G4 항체가 scFv 형태로 존재하는 경우 경쇄 가변부위-링커-중쇄 가변부위로 연결될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 11의 아미노산 서열로 또는 서열번호 12의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서, 항-BCMA 항체인 3G4를 인간에 대응하는 구조로 변경한 인간화된 항체(humanized antibody)를 제조하였으며, 이를 3G4V2로 명명하였다.
상기 3G4V2의 중쇄 가변부위 CDR과 경쇄 가변부위 CDR은 3G4와 동일한 것으로 CDR 부분을 제외한 나머지 부분을 인간화하였다. 바람직하게 3G4V2는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 또한, 3G4V2 항체의 중쇄 가변부위는 서열번호 15의 염기서열로, 3G4V2 항체의 경쇄 가변부위는 서열번호 16의 염기서열로 코딩될 수 있다. 상기 3G4 항체가 scFv 형태로 존재하는 경우 경쇄 가변부위-링커-중쇄 가변부위로 연결될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 17의 아미노산 서열로 또는 서열번호 18의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에서, 인간화된 항-BCMA 항체인 3G4V2와 BCMA가 특이적으로 결합하는지 확인한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 hBCMA가 발현되지 않는 A549 세포에서는 3G4V2와의 결합이 확인되지 않았으나, hBCMA를 발현하는 A549 세포와 3G4V2의 결합능이 증가한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 인간화된 항-BCMA 항체인 3G4V2를 이용하여 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR, chimeric antigen receptor)를 제조하였다.
본 발명에서, 용어 "인간화 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 소유하고 및/또는 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 만들기 위한 기술 중에서 한 가지를 이용하여 만들어진 항체이다. 인간화 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다.
또한, 본 발명에 포함된 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 아미노산 서열은 적어도 단백질 또는 폴리펩타이드와 동일하거나 유사한 기능을 갖는 기능성 변이체(functional variants) 또는 상동체를 포함하는 것으로 이해되어야한다.
본 발명에서, 기능적 변이체(functional variants)는 상기 단백질 및/또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 첨가함으로써 수득되는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 기능적 변이체(functional variants)는 1에서 30, 1에서 20 또는 1에서 10 또는 1, 2, 3, 4 또는 5와 같은 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입으로 인해 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 기능적 변이체(functional variants)는 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩타이드 (치환, 결실 또는 첨가)의 생물학적 특성을 실질적으로 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 기능적 변이체(functional variants)는 원래 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성 (항원 결합 능력과 같은)의 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 100 %로 유지될 수 있다.
본 발명에서, 상동체는 상기 단백질 및/또는 폴리펩타이드와 아미노산 서열 상동성이 약 85 % 이상(예컨대, 약 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상)인 단백질 또는 폴리펩타이드(예를 들어 BCMA 또는 이의 단편과 특이적으로 결합할 수 있는 항체)일 수 있다.
본 발명에서, 상동성은 일반적으로 둘 이상의 서열 사이의 유사성, 유사성 또는 상관성을 지칭한다.
BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)
본 발명은 다른 관점에서,
BCMA-결합 도메인;
막관통 도메인(transmembrane domain);
공동자극 도메인(costimulatory domain); 및
세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로,
상기 BCMA-결합 도메인은 BCMA와 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 포함하며,
상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "키메릭 항원 수용체 (CAR)"는 일반적으로 항원 및 하나 이상의 세포 내 도메인과 결합하는 능력을 갖는 세포 외 도메인을 함유하는 융합 단백질을 지칭한다. CAR는 키메릭 항원 수용체 T 세포(CAR-T)의 핵심 부분이며, 항원(예를 들어, 종양 관련 항원(BCMA)) 결합 도메인, 막 관통 도메인, 공동 자극 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. CAR는 항체의 항원(예를 들어 BCMA) 특이성에 기초하여 T 세포 수용체-활성화 세포 내 도메인과 조합될 수 있다. 유전자가 변형된 CAR-발현 T 세포는 표적 항원-발현 악성 세포를 특이적으로 식별하고 제거할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "BCMA(B-cell maturation antigen)"는 B-세포 성숙 항원을 지칭한다. BCMA(TNFRSF17, BCM 또는 CD269로도 공지됨)는 종양 괴사 수용체 (TNFR) 패밀리의 구성원이고, 최종 분화 B 세포, 예를 들어 기억 B 세포 및 형질 세포 상에서 우세하게 발현된다. BCMA는 종양 세포(예를 들어, 다발성 골수종 세포)에서 발현되거나 또는 종양 세포 표면에 위치된다. 본 발명의 "BCMA"는 전장 야생형 BCMA의 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 결실 및 스플라이스 변이체를 포함하는 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "BCMA-결합 도메인(BCMA-binding domain)"은 일반적으로 BCMA 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 지칭한다. 예를 들어, BCMA-결합 도메인은 B 세포에서 발현된 인간 BCMA 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항-BCMA 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "결합 도메인(binding domain)"은 "세포 외 도메인(extracellular domain)", "세포 외 결합 도메인(extracellular binding domain)", "항원-특이적 결합 도메인(antigenspecific binding domain)" 및 "세포 외 항원-특이적 결합 도메인(extracellular antigen-specific biding domain)"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 표적 항원(예를 들어 BCMA)에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 CAR 도메인 또는 단편을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 상기 항-BCMA 항체 또는 이의 단편은 상술한 항-BCMA 항체로, 단클론 항체(monoclonal antibody), 바람직하게는 scFv(single chain variable fragment)이며, 본 발명에서는 인간화된 항-BCMA 항체인 3G4V2를 사용하였다.
본 발명에서, 용어 "막관통 도메인(transmembrane domain)"은 일반적으로 세포막을 통과하고 세포 내 신호전달 도메인에 연결되어 신호전달의 역할을 하는 CAR의 도메인을 지칭한다. 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택되는 단백질로부터 유래될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "공동 자극 도메인(costimulatory domain)"은 일반적으로 림프구의 항원에 대한 효과적인 반응에 필요한 세포 표면 분자인 면역 자극 분자를 제공할 수 있는 세포 내 도메인을 지칭한다. 상기 기재된 공동자극 도메인(costimulatory domain)은 CD28의 공동 자극 도메인을 포함할 수 있고, OX40 및 4-1BB의 공동 자극 도메인과 같은 TNF 수용체 패밀리의 공동 자극 도메인을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 30의 아미노산 서열로 표시되는 4-1BB일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)"은 일반적으로 세포 내부에 위치하고 신호를 전달할 수 있는 도메인을 지칭한다. 본 발명에서, 세포 내 신호전달 도메인은 키메라 항원 수용체의 세포 내 신호전달 도메인이다. 예를 들어, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포 내 도메인, CD28 세포 내 도메인, CD28 세포 내 도메인, 4-1BB 세포 내 도메인 및 OX40 세포 내 도메인으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CD3ζ일 수 있다.
본 발명에 있어서, BCMA-결합 도메인의 C 말단 및 막관통 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 부위(hinge region)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 힌지 부위는 CD8α 유래로, 바람직하게는 서열번호 28의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 상기 "힌지 부위(hinge region)"는 일반적으로 항원-결합 영역과 면역 세포 Fc 수용체 (FcR)-결합영역 사이의 연결 영역을 지칭한다.
본 발명에 있어서, BCMA-결합 도메인의 N 말단에 신호 펩타이드(signal peptide)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 "신호 펩타이드(signal peptide)"는 일반적으로 단백질 전달을 안내하기 위한 펩타이드 사슬을 지칭한다. 신호 펩타이드는 5 내지 30 개의 아미노산 길이를 갖는 짧은 펩타이드일 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 27의 아미노산 서열을 이용하였다.
키메릭 항원 수용체 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 키메릭 항원 수용체 발현 벡터
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 BCMA-결합 도메인를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 공동 자극 도메인을 코팅하는 폴리뉴클레오타이드; 및 세포 내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 BCMA-결합 도메인를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 3G4 항체 또는 3G4V2 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 구체적인 염기서열은 상술한 바와 같다.
본 발명의 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게, 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 신호 펩타이드; 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 항-BCMA 항체인 3G4V2; 서열번호 23의 염기서열로 표시되는 막관통 도메인; 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 4-1BB(공동자극 도메인); 및 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 CD3ζ(세포 내 신호전달 도메인)로 구성될 수 있다.
또한, BCMA-결합 도메인를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 막관통 도메인 사이에, 힌지 부위(hinge region)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 포함될 수 있으며, 바람직하게 서열번호 22의 염기서열로 표시되는 CD8 힌지 부위일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 임의의 길이로 분리된 핵산 분자(nucleic acid molecule), 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 (1) 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭과 같은 in-vitro 증폭; (2) 클로닝 및 재조합; (3) 절단(digestion) 및 겔 전기영동 분리와 같은 정제; (4) 화학 합성과 같은 합성을 통해 제조될 수 있으며, 바람직하게 분리된 폴리뉴클레오타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 본 발명에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하기 위한 핵산은 합성 올리고뉴클레오티드의 제한 단편 조작(restriction fragment operation) 또는 SOE PCR의 적용을 포함하지만 이에 제한하지 않고, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "벡터(expression vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제조물이다. 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
또한, 벡터는 코딩 영역이 적합한 숙주에서 정확하게 발현될 수 있게 하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome-binding site), 인핸서(enhancer) 및 유전자 전사(transcription) 또는 mRNA 번역(translation)을 조절하기 위한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스(box), 캡핑된(capped) 서열, CAAT 서열 등과 같은 전사 개시 및 번역 개시에 각각 참여하는 5' 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열을 함유한다. 예를 들어, 5' 비-전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산을 전사 및 조절하기 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 벡터는 재조합 바이러스 벡터로, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이며, 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터; 시그널 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; BCMA-결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 세포 내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질 발현을 증가시키기 위해 WPRE(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element)를 추가로 포함할 수 있다 (도 2).
상기 EF1α 프로모터는 서열번호 19의 염기서열로 표시될 수 있으며, 필요에 따라 상기 서열번호 19의 염기서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로모터는 BCMA-결합 도메인인 항-hBCMA 항체(scFv)의 발현을 유도하도록 작동 가능하게 연결되어 있으며 여기서, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
유전자를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 관련 기술분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 옮겨질 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY]을 참조한다. 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 및 리포솜을 비롯한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관 내 및 생체 내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 최신 기술의 표적화된 전달, 예컨대 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 마이크로미터-미만 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 다른 방법이 이용 가능하다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제제의 사용은 숙주세포 내로의 핵산의 도입(시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)을 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 점재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유 또는 복합체화되거나, 또는 지질과 달리 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다.
키메릭 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하고, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 이펙터 세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 포유동물 유래 세포 일 수 있으며, 바람직하게는 T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 이펙터 세포는 본 발명의 CAR 벡터를 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 도입시켜 제조할 수 있다.
구체적으로, CAR 벡터는 전기천공법, 리포펙타민(lipofectamine 2000, Invitrogen) 등과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 렌티바이러스 벡터에 의해 형질 감염되어 CAR 분자를 운반하는 바이러스 게놈을 숙주 게놈에 통합시켜 표적 유전자의 장기적이고 안정적인 발현을 보장할 수 있다. 다른 예를 들어, 전이인자(transposon)는 CAR 운반 플라스미드(transposon) 및 전이효소 운반 플라스미드를 표적 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 다른 예를 들어, CAR 분자는 유전자 편집방법 (예컨대 CRISPR / Cas9)에 의해 게놈에 첨가될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 도 2에 나타난 바와 같이 hBCMA-CAR를 코팅하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 렌티바이러스 벡터를 제조하였으며, 제조된 벡터를 T 세포에 형질전환 시켜 hBCMA-CAR-T 세포를 제조하였다. 제조된 hBCMA-CAR-T 세포에서는 본 발명의 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체를 발현하게 된다.
키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 이펙터 세포 제조를 위한 면역 이펙터 세포는 대상체로 부터 수득할 수 있으며, 상기 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물)를 포함한다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다.
상기 T 세포는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 많은 기술, 예를 들면, 피콜(Ficoll)™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 혈액으로부터 세포는 분리반출술에 의해 수득되며, 분리반출술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포를 비롯한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다.
분리반출술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 프로세싱 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 두기 위해 세척될 수 있다. T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 분리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 도 3에 나타난 바와 같이, 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)로 부터 활성화된 T 세포를 분리한 다음, hBCMA-CAR 렌티바이러스를 T 세포에 형질도입시켜 hBCMA-CAR-T 세포를 제조하였다. 제조된 hBCMA-CAR-T 세포의 hBCMA 펩타이드 결합능을 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, hBCMA 펩타이드 증가에 따라, hBCMA와 결합하는 CD4 또는 CD8를 발현하는 hBCMA-CAR-T 세포가 증가하는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에서 제조한 hBCMA-CAR-T 세포가 효과적으로 BCMA와 결합하는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서, hBCMA-CAR-T 세포의 활성화를 확인하기 위해, 표적 세포의 존재하에 3G4V2-CAR-T 세포에 의한 IFNγ 및 CD107a 발현 정도를 확인하였다. 그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, BCMA를 발현하지 않는 K562 세포에서는 T 세포가 활성화되지 않은 반면, BCMA를 발현하는 H929 세포의 존재하에 T 세포가 활성화되어 IFNγ 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, hBCMA-CAR-T 세포에 의한 표적 세포의 사멸효과를 확인한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, hBCMA-CAR-T 세포는 BCMA를 발현하는 RPMI8226 세포 및 H929 세포 특이적으로 사멸 효과를 보이는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포는 B 세포 또는 BCMA 발현과 관련된 질환 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
BCMA 발현과 관련된 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 또 다른 관점에서, BCMA를 표적하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포를 포함하는 B 세포와 관련된 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, BCMA를 표적으로 하는 항체를 포함하는 B 세포와 관련된 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
B 세포와 관련된 질환 또는 BCMA(야생형 또는 돌연변이체 BCMA) 발현과 관련된 질환은 암, 악성종양 또는 자가면역 질환 일 수 있다. 바람직하게 다발성골수종(multiple myeloma), 혈액암, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 자가항체-의존성 자가면역 질환(autoantibody-dependent autoimmune disease), 전신홍반루프스(systemic lupus erythematosus, SLE) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우 에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제형은 상술한 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조될 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 막 투과성을 향상시킬 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 상기 hBCMA-CAR-T 세포 또는 항-hBCMA 항체를 포함하는 약학적 조성물은 B 세포와 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위해 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 질환 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분과 함께 투여되거나 순차적으로 투여될 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개체"는 상기 약학적 조성물을 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 '투여'는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 1~10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
BCMA를 표적으로 하는 항체 제조 및 선별
BCMA 펩타이드 특이적인 항체를 선별하기 위해, BCMA와 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하여 항체를 선별하였다.
먼저, 당업계에 공지된 방법으로 BCMA 펩타이드(서열번호 19; Acrobiosystems Inc. cat# BCA-H522y)를 이용하여 마우스를 면역시킨 다음, 비장세포를 적출하고 마우스 골수증세포와 세포융합을 통하여 하이브리도마 세포를 제작하였다.
세포융합에 이용하는 마우스 골수종 세포는 HGPRT (HypoxanthineGuanidine-Phosphoribosyl-Transferase)를 가지고 있지 않기 때문에 HAT 배지에서는 생존할 수 없으나, 하이브리도마는 비장세포와 융합함으로써 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 이를 이용하면 하이브리도마만을 증식시킬 수 있으므로, 하이브리도마가 확립될 때까지 HAT 배지에서 증식시켰다.
하이브리도마 중에는 BCMA와 결합하는 항체를 생산하기 위해 한계희석법을 사용하였다. 우선 96웰당 1개 세포 이하가 되도록한다음, 1개의 세포로부터 증식된 클론을 선별하였다. 상기과정을 3회 반복하여 BCMA와 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다.
선별된 하이브리도마에서 선별된 항체는 3G4 항체(anti-hBCMA monoclonal antibody)로 명명하였으며, 아미노산 서열을 분석하였다. 서열분석 결과에 따른 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 1에 나타내었으며, 하기 표 1에서 밑줄친 부분은 상보적 결정 부위(complementarity determining region; CDR)를 의미한다.
3G4항체의 서열정보
3G4 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYTFTSYV 서열번호 1
중쇄가변부위 CDR2 IIPYNDGT 서열번호 2
중쇄가변부위 CDR3 ARWNWDGYFDV 서열번호 3
경쇄가변부위 CDR1 KSLLHSNGITY 서열번호 4
경쇄가변부위 CDR2 QMS 서열번호 5
경쇄가변부위 CDR3 TQNLELPFT 서열번호 6
중쇄가변부위
아미노산서열		 QVQLKESGPELVKPGASVKMSCKAS GYTFTSYV MHWVKQKPGQGLEWIGY IIPYNDGT KYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSALYYC ARWNWDGYFDV WGAGTTVTVSS 서열번호 7
경쇄가변부위
아미노산서열		 DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSS KSLLHSNGITY LYWYLQKPGQSPQLLIY QMS NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVFYC TQNLELPFTF GSGTKLEIK 서열번호 8
중쇄가변부위
염기서열		 CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTATTCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGCTCTATTACTGTGCAAGATGGAACTGGGACGGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 서열번호 9
경쇄가변부위
염기서열		 GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTTTTACTGTACTCAAAATCTAGAACTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA 서열번호 10
표 1에 나타난 바와 같이, 3G4 항체는 서열번호 1의 아미노산서열(GYTFTSYV) 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열(IIPYNDGT)로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산서열(ARWNWDGYFDV)로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄가변부위; 및 서열번호 4의 아미노산서열(KSLLHSNGITY)로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열(QMS)로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산서열(TQNLELPFT)로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄가변부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 상기 3G4 항체는 서열번호 7의아미노산 서열로 표시되는 중쇄가변부위 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄가변부위로 구성되며, 또한, 3G4 항체의 중쇄가변부위는 서열번호 9의 염기서열로, 3G4 항체의 경쇄가변부위는 서열번호 10의 염기서열로 코딩는 것을 확인하였다.
3G4 항체 기반 인간화 항체 제조
상기 실시예 1에서 선별한 3G4 항체를 인간에 대응하는 구조로 변경한 인간화된 항체(humanized antibody)를 제조하였다.
구체적으로, 인간 항체의 생식계열 염기서열(germline sequence)를 프레임(frame)으로하여 BCMA와 결합하는 마우스 항체의 CDR를 인간 항체의 CDR를 교체하는 CDR-그라프팅(CDR grafting) 방법으로 마우스 3G4 항체를 인간화한 항체를 제작하였다. 인간화한 항체는 3G4V2로 명명하였으며, 아미노산 서열을 분석하였다. 서열분석 결과에 따른 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 2에 나타내었으며, 하기 표 2에서 밑줄친 부분은 상보적 결정 부위(complementarity determining region; CDR)를 의미한다.
3G4V2 항체의 서열정보
3G4V2 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYTFTSYV 서열번호 1
중쇄가변부위 CDR2 IIPYNDGT 서열번호 2
중쇄가변부위 CDR3 ARWNWDGYFDV 서열번호 3
경쇄가변부위 CDR1 KSLLHSNGITY 서열번호 4
경쇄가변부위 CDR2 QMS 서열번호 5
경쇄가변부위 CDR3 TQNLELPFT 서열번호 6
중쇄가변부위
아미노산서열		 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYV MHWVRQAPGQRLEWIGY IIPYNDGT KYNEKFQGRVTLTSDKSSSTAYMELSSLRSEDTAV YYC ARWNWDGYFDV WGQGTTVTVSS 서열번호 13
경쇄가변부위
아미노산서열		 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSS KSLLHSNGITY LYWYLQKPGQSPQLLIY QMS NRASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC TQNLELPFT FGQGTKLEIK 서열번호 14
중쇄가변부위
염기서열		 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCGGGTGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACGTGATGCATTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGACAGCGCCTGGAGTGGATCGGTTACATCATCCCGTACAACGACGGCACTAAGTACAACGAGAAATTTCAGGGCCGAGTGACCCTGACCTCCGACAAATCCAGCTCGACCGCCTACATGGAGCTGTCTTCTCTGCGCTCGGAGGACACCGCGGTTTATTACTGTGCTCGTTGGAACTGGGATGGCTATTTCGACGTGTGGGGCCAGGGAACGACCGTCACCGTGTCGTCC 서열번호 15
경쇄가변부위
염기서열		 GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTTTGTCTCTTCCTGTCACTCCGGGGGAGCCAGCTTCTATCTCATGCCGATCTTCCAAGAGCCTGCTGCACTCAAATGGCATCACCTACCTCTATTGGTACCTGCAGAAGCCCGGGCAATCCCCTCAGTTGCTCATCTATCAGATGTCTAACCGCGCCTCCGGTGTCCCCGACCGCTTCAGCTCCTCTGGCTCCGGCACCGACTTTACTCTGAAGATATCCCGCGTGGAGGCCGAAGATGTGGGCGTGTACTACTGCACTCAGAACCTGGAACTGCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 서열번호 16
표 2에 나타난 바와 같이, 3G4V2 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 또한, 3G4V2 항체의 중쇄 가변부위는 서열번호 15의 염기서열로, 3G4V2 항체의 경쇄 가변부위는 서열번호 16의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
항- BCMA 항체의 BCMA 결합능 확인
본 발명에서는 상기 실시예 2에서 제조한 인간화된 항-BCMA 항체인 3G4V2가 BCMA를 특이적으로 표적화할 수 있는지 확인하였다.
먼저, 3G4V2 항체를 생산하기 위해, 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 중쇄 가변부위를 인간항체 IgG1의 중쇄항체 발현벡터에 클로닝하고, 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 경쇄 가변부위를 인간항체 카파(Kappa) 경쇄항체 발현벡터에 클로닝하여, 각각의 발현 백터를 CHO 세포로 공동 감염(co-transfection) 시켜서 항체를 생산하였다. 생산한 항체는 Protein A 컬럼(Thermo Fisher, cat#　20356)을 이용해서 정제하였다.
그 다음, 상기에서 정제된 항체를 A549 세포와 hBCMA를 발현하는 A549세포에 1 mg씩 처리하여 반응시킨 후 인간 IgG Fc 부분에 특이적인 2차 항체(Biolegend, cat# 409304)를 처리하였다. 항체와 반응시킨 후 2차 항체의 PE 형광을 유세포 분석(Flow cytometry) 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 hBCMA가 발현되지 않는 A549 세포에서는 3G4V2와의 결합이 확인되지 않았으나, hBCMA를 발현하는 A549 세포와 3G4V2의 결합능이 60.1%로 증가한 것을 확인하였다.
BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 벡터 제작
본 발명에서는 상기 실시예 2에서 제조한 인간화된 항-BCMA 항체인 3G4V2가 포함된 BCMA를 표적으로 하는 키메라 항원수용체(CAR)를 발현하는 렌티바이러스 벡터(hBCMA-CAR 렌티바이러스)를 제조하였다.
도 3의 모식도에 나타난 바와 같이, EF1α 프로모터(서열번호 20); 시그널 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 21); BCMA-결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 18); CD8 힌지 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 22); 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 23); 4-1BB(공동자극도메인)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 24); CD3ζ세포내신호전달도메인)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 25); 및 WPRE를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 26)로 구성된 CAR DNA(서열번호 32)를 생체외(in vitro)에서 합성하여 3세대 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다.
렌티바이러스벡터는 pMDLg/pRRE(Addgene, cat# #12251) pMD2.G(Addgene, cat##12259), pRSV-Rev(Addgene, cat##12253)의 세 가지 벡터 함께 Lenti-X 293T 세포로 공동 감염(co-transfection)시킨 다음, hBCMA-CAR 렌티바이러스를 생산하였다. co-transfection을 위해 Lipofectamine 3000 transfection kit(Invitrogen, cat# L3000-015)와 Opti-MEM+GlutaMAX(gibco, cat# 51985-034)media를 사용해 세 가지 벡터와 Lenti-X 293T 세포를 6시간 배양하였다.
hBCMA-CAR-T 세포 제조
본 발명에서는 상기 실시예 4에서 제조한 hBCMA-CAR 렌티바이러스 벡터를 T 세포에 형질전환시켜 hBCMA-CAR-T 세포(또는 3G4V2-CAR-T 세포)를 제조하였다.
구체적으로, 도 3에 나타난 바와 같이, 혈액에서 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리한 다음, T 세포활성화비드(T cell activation bead; Miltenyl Biotec, cat# 130-091-441)를사용해 T 세포를 활성화시켰다. 활성화된 T 세포에 상기 실시예 4에서 제조한 hBCMA-CAR 렌티바이러스를 T 세포에 형질 도입시켜 hBCMA-CAR-T 세포를 제조하였으며, Lenti-boost-p를 사용하여 형질 도입 효율을 증가시켰다.
hBCMA-CAR-T 세포의 hBCMA 펩타이드 결합능은 유세포분석(Flow Cytometry) 방법을 통해 확인하였다. 상기에서 제조한 hBCMA-CAR-T세포를 FITC-hBCMA 단백질과 anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 항체와 반응시킨 후 FACS 기계를 이용해 형광 세기를 측정하였다. 분석과정에서 CD3를 발현하는 세포를 T 세포로하여 T 세포안에서 FITC 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, hBCMA 펩타이드 증가에 따라, hBCMA와 결합하는 CD4 또는 CD8를 발현하는 hBCMA-CAR-T 세포가 증가하는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에서 제조한 hBCMA-CAR-T 세포가 효과적으로 BCMA와 결합하는 것을 의미한다.
hBCMA 펩타이드에 의한 hBCMA-CAR-T 세포 활성화 확인
본 발명에서는 상기 실시예 5에서 제조한 hBCMA-CAR-T 세포가 BCMA 펩타이드에 의해 활성화되는지 확인하기 위해, 표적세포의 존재하에 hBCMA-CAR-T 세포에 의한 IFNγ및 CD107a 발현 정도를 확인하였다.
표적세포는 BCMA를 발현하지 않는 K562 세포(ATCC, 　cat#CCL-243) 및 BCMA를 발현하는 H929 세포(ATCC, cat#CRL-9068)를 이용하였으며, hBCMA-CAR-T 세포와 표적세포를 2:1, 1:1. 0.5:1, 0:1 비율로 일정시간 반응시킨 후 surface & intra antibody로 염색하여 FACS 측정하였다 (BCMA protein, INF-r, CD107a, CD3, CD4, CD8 염색). 0:1(CAR-T only)를 기준으로 표적세포와 반응시킨 hBCMA-CAR-T의 IFNγ및 CD107a 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, BCMA를 발현하지 않는 K562 세포에서는 T 세포가 활성화되지 않은 반면, BCMA를발현하는 H929세포의 존재 하에 T 세포가 활성화되어 IFNγ발현이 증가하는 것을 확인하였다.
BCMA 발현 세포에 대한 hBCMA-CAR-T 세포의 사멸 효과 확인
본발명에서는 hBCMA-CAR-T 세포에 의한 표적세포의 사멸효과를 확인하였다.
표적세포로 BCMA를 발현하지 않는 K562 세포와 BCMA를 발현하는 RPMI8226 세포 및 H929 세포를 이용하였으며, hBCMA-CAR-T 세포와 1:4, 1:2, 1:1, 1:0.5 및 1:0.25 비율이 되도록 혼합한 다음, 루미네센스(CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay, Promega, cat# G9291)를 측정하였다. 측정한 값으로 하기 수학식 1을 이용하여 세포 사멸정도를 계산하였다.
[수학식 1]
Figure 112021075461651-pat00001
그 결과, 도 6에나타난 바와 같이, hBCMA-CAR-T 세포는 BCMA를 발현하는 RPMI8226 세포 및 H929세포 특이적으로 사멸효과를 보이는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 BCMA를 표적으로 하는 키메라항원수용체 및 CAR-T 세포는 B 세포 또는 BCMA 발현과 관련된 질환예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
<110> NATIONAL CANCER CENTER PROTANBIO INC. <120> Chimeric antigen receptor targeting BCMA and use thereof <130> 1067521 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G4_VH_CDR1 <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G4_VH_CDR2 <400> 2 Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Gly Thr 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G4_VH_CDR3 <400> 3 Ala Arg Trp Asn Trp Asp Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G4_VL_CDR1 <400> 4 Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G4_VL_CDR2 <400> 5 Gln Met Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G4_VL_CDR3 <400> 6 Thr Gln Asn Leu Glu Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3G4_VH chain <400> 7 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser 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Sequence <220> <223> transmembrane domain <400> 23 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 accctttact gc 72 <210> 24 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB <400> 24 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 25 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3_zeta <400> 25 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 26 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE <400> 26 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg 420 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct g 591 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 27 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 28 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 Hinge <400> 28 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transmembrane domain <400> 29 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 30 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB <400> 30 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 31 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3_zeta <400> 31 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 32 <211> 2594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR for lentivirus insertion <400> 32 gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60 gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120 atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180 tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240 tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300 cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360 agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420 ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480 tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540 aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600 cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660 cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720 gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780 ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840 cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900 cctcagccgt cgcttcatgt gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960 agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020 agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080 tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140 tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgatc tagaggatcc gacatcgtga 1200 tgacccagag ccctttgtct cttcctgtca ctccggggga gccagcttct atctcatgcc 1260 gatcttccaa gagcctgctg cactcaaatg gcatcaccta cctctattgg tacctgcaga 1320 agcccgggca atcccctcag ttgctcatct atcagatgtc taaccgcgcc tccggtgtcc 1380 ccgaccgctt cagctcctct ggctccggca ccgactttac tctgaagata tcccgcgtgg 1440 aggccgaaga tgtgggcgtg tactactgca ctcagaacct ggaactgccc ttcaccttcg 1500 gccagggcac caagctggag atcaagggcg gtggtggctc cggcggaggg ggttctggag 1560 gcggcggctc ccaggtgcag ctggtgcaga gcggcgccga ggtgaagaag ccgggtgctt 1620 ccgtgaaggt gtcctgtaag gcctctggct acaccttcac cagctacgtg atgcattggg 1680 tccgccaggc ccccggacag cgcctggagt ggatcggtta catcatcccg tacaacgacg 1740 gcactaagta caacgagaaa tttcagggcc gagtgaccct gacctccgac aaatccagct 1800 cgaccgccta catggagctg tcttctctgc gctcggagga caccgcggtt tattactgtg 1860 ctcgttggaa ctgggatggc tatttcgacg tgtggggcca gggaacgacc gtcaccgtgt 1920 cgtccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc 1980 ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg 2040 ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc 2100 ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata 2160 tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct 2220 gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg 2280 cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac 2340 gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa 2400 agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg 2460 cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg 2520 gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg 2580 ccctgccccc tcgc 2594

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위; 및
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변부위;를 포함하는 BCMA(B-cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되는 항체 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되는 항체인 것을 특징으로 하는 BCMA(B-cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  3. BCMA-결합 도메인;
    막관통 도메인(transmembrane domain);
    공동자극 도메인(costimulatory domain); 및
    세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로,
    상기 BCMA-결합 도메인은 BCMA와 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 포함하며,
    상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX-40 및 ICOS로 구성된 군에서 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  6. 제3항에 있어서, 상기 신호전달 도메인은 CD3ζ인 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  7. 제3항에 있어서, 상기 BCMA-결합 도메인의 C 말단 및 막관통 도메인의 N 말단 사이에 힌지 부위(hinge region)가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드(plasmid), 레트로바이러스(retroviral) 벡터 또는 렌티바이러스(lentiviral)인 것을 특징으로 하는 벡터.
  11. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 면역 이펙터 세포로,
    상기 면역 이펙터 세포는 단리된 세포인 것을 특징으로 하는, 면역 이펙터 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 T 세포 또는 자연살해(Natural Killer) 세포인 것을 특징으로 하는 면역 이펙터 세포.
  13. 제11항의 면역 이펙터 세포를 포함하는 BCMA 발현과 관련된 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
    상기 BCMA 발현과 관련된 질환은 다발성골수종(multiple myeloma), 혈액암, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 자가항체-의존성 자가면역 질환(autoantibody-dependent autoimmune disease), 전신홍반루프스(systemic lupus erythematosus, SLE) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)인 것을 특징으로 하는 BCMA 발현과 관련된 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 삭제
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