JP2024500035A - 心血管疾患の治療 - Google Patents

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Abstract

本開示は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子を含む、かつ当該分子のセンスＲＮＡ部分またはアンチセンスＲＮＡ部分のいずれかの３’末端に共有結合した一本鎖ＤＮＡ分子をさらに含む核酸であって、二本鎖阻害性ＲＮＡが高コレステロール血症、および心血管疾患など高コレステロール血症に関連した疾患の治療において、心血管疾患に関連した遺伝子を標的にする、核酸に関する。【選択図】図１（ａ）

Description

本開示は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子を含む、かつ当該分子のセンスＲＮＡ部分またはアンチセンスＲＮＡ部分のいずれかの３’末端に共有結合した一本鎖ＤＮＡ分子をさらに含む核酸であって、二本鎖阻害性ＲＮＡが心血管疾患遺伝子を標的にする、核酸と、前記核酸分子を含む医薬組成物と、心血管疾患遺伝子の発現レベルの増加に関連する疾患（例えば、高コレステロール血症）を治療するための方法とに関する。
高コレステロール血症に関連する心血管疾患（例えば、虚血性心血管疾患）は、よく見られる疾患であり、心疾患および高い死亡率および罹患率をもたらし、質の悪い食生活、肥満、または遺伝性機能不全遺伝子の結果である可能性がある。例えば、高レベルのリポタンパク質（ａ）および他のリポタンパク質は、アテローム性動脈硬化症と関連している。コレステロールは、動物細胞における膜生合成に不可欠である。水溶性の欠如は、コレステロールがリポタンパク質と関連して身体のあちこちに運ばれることを意味する。アポリポタンパク質は、リン脂質、コレステロール、脂質と一緒に形成され、これは血流を介した身体の異なる部分への脂質（コレステロールなど）の輸送を促進する。リポタンパク質は、サイズに応じて分類され、ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）、ＩＤＬ（中間密度リポタンパク質）、ＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）、ＵＬＤＬ（極低密度リポタンパク質）リポタンパク質を形成することができる。
リポタンパク質は、それらの循環の全体を通して、アポリポタンパク質Ａ（ＡｐｏＡ）、Ｂ（ＡｐｏＢ）、Ｃ（ＡｐｏＣ）、Ｄ（ＡｐｏＤ）またはＥ（ＡｐｏＥ）、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質の異なる比を含む組成物を変化させる。例えば、ＡｐｏＢは、ＵＬＤＬおよびＬＤＬの主なアポリポタンパク質であり、２つのアイソフォームａｐｏＢ－４８およびａｐｏＢ－１００を有する。両方のＡｐｏＢアイソフォームは、一つの遺伝子によってコードされ、短い方のＡｐｏＢ－４８遺伝子は、残基２１８０でＡｐｏＢ－１００転写物のＲＮＡ編集後に産生され、それによって終止コドンが生成される。ＡｐｏＢ－１００はＬＤＬの主な構造タンパク質であり、例えばコレステロールを細胞に輸送することを可能にする細胞受容体のリガンドとして機能する。
家族性高コレステロール血症は希少疾病であり、血中のＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）値の上昇に起因する。この疾患は、ヘテロ接合性（３５０～５５０ｍｇ／ｄＬ ＬＤＬ－Ｃ）とホモ接合性（６５０～１０００ｍｇ／ｄＬ ＬＤＬ－Ｃ）の両方の状態を有する常染色体優性遺伝疾患であり、結果としてＬＤＬ－Ｃの上昇をもたらす。家族性高コレステロール血症のヘテロ接合性の形態は、人口の約１：５００である。ホモ接合性の状態は、はるかに希少であり、およそ１：１，０００，０００である。ＬＤＬ－Ｃの正常レベルは、１３０ｍｇ／ｄＬの領域にある。
高コレステロール血症は、小児科患者において特に急性であり、早期に診断されなければ、加速性冠動脈性心疾患および早期死亡をもたらす可能性がある。診断され、早期に治療された場合、小児は正常な余命を有することができる。成人において、突然変異または他の要因のいずれかにより、高いＬＤＬ－Ｃは、冠動脈疾患、脳卒中、または腎臓疾患につながる可能性のあるアテローム性動脈硬化症のリスクの増大と直接関連している。ＬＤＬ－Ｃ値の低下は、アテローム性動脈硬化症および関連疾患のリスクを低減させることが知られている。ＬＤＬ－Ｃ値は、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを阻害することによってコレステロールの新規の合成を阻害するスタチンの投与によって初期に低下させることができる。一部の対象は、スタチンをエゼチミブ、コレスチポール、またはニコチン酸などの他の治療剤と組み合わせた併用療法から利益を得ることができる。しかしながら、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現および合成は、スタチン阻害に応答して適応し、経時的に増大し、それ故に有益な効果はスタチン抵抗性が確立された後、単に一時的であるか、または限定的である。
従って、ＬＤＬ－Ｃ値上昇のため、単独または既存の治療方法と組み合わせて心血管疾患を制御できる代替療法を特定するという願望がある。
遺伝子機能を特異的にアブレーションする技術は、低分子阻害性または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる二本鎖阻害性ＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ分子に含まれる配列に相補的なｍＲＮＡの破壊をもたらす細胞内に導入することによる。ｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように互いにアニーリングされたＲＮＡの二つの相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。ｓｉＲＮＡ分子は典型的に（しかし唯一的ではない）、アブレーションされる遺伝子のエクソンに由来する。多くの生物体は、ｓｉＲＮＡの形成につながるカスケードを活性化することによって、二本鎖ＲＮＡの存在に応答する。二本鎖ＲＮＡの存在は、リボ核タンパク質複合体の一部になる、より小さい断片（ｓｉＲＮＡ、長さおよそ２１～２９ヌクレオチド）に二本鎖ＲＮＡを処理するＲＮａｓｅ ＩＩＩを含むタンパク質複合体を活性化する。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡを切断するためのＲＮａｓｅ複合体のガイドとして働き、それによってｍＲＮＡの破壊をもたらす。
リポタンパク質（ａ）の発現の阻害が既知であり、リポタンパク質（ａ）の発現をサイレンシングするための阻害性ＲＮＡの使用も既知である。例えば、ＷＯ２０１９／０９２２８３号は、リポタンパク質（ａ）をコードするｍＲＮＡのノックダウンを標的にする特定のｓｉＲＮＡ配列の特定、および冠動脈性心疾患、大動脈弁狭窄症、または脳卒中などのリポタンパク質（ａ）発現の上昇に関連する心血管疾患の治療におけるそれらの使用を開示している。同様に、ＵＳ９，９３２，５８６号は、リポタンパク質（ａ）の発現を標的にする特定のｓｉＲＮＡ配列と、バージャー病、冠動脈性心疾患、腎動脈狭窄症、高アポβリポタンパク血症、脳血管アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、静脈血栓症などのリポタンパク質（ａ）発現の上昇に関連する心血管疾患の治療におけるその特定のｓｉＲＮＡ配列の使用とを開示している。
ＡＰＯＣＩＩＩの過剰発現は、アテローム性動脈硬化症および２型糖尿病と関連している。例えば、ＷＯ２００３／０２０７６５号は、ＡｐｏＣＩＩＩポリペプチドに由来する免疫原を使用するアテローム性動脈硬化症の制御に対するワクチン接種アプローチと、冠動脈疾患および脳血管疾患におけるアテローム性動脈硬化プラークの制御におけるその使用とを開示している。同様のワクチン接種アプローチは、ＷＯ２００４／０８０３７５号およびＷＯ２００１／０６４００８号において５つが開示されている。ＷＯ２０１４／２０５４４９号およびＷＯ２０１４／１７９６２６号において、インスリン感受性を改善し、ＡＰＯＣＩＩＩ発現を標的にすることによって２型糖尿病を治療するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が開示されている。
さらに、ＷＯ２００７／１３６９８９号およびＷＯ２００５／０１９４１８号はそれぞれ、ＤＧＡＴ２の発現を制御し、高コレステロール血症、心血管疾患、２型糖尿病、代謝症候群などの血清トリグリセリドレベルの減少から利益を得るであろう疾患に関連して、ＤＧＡＴ２発現の減少から利益を得るであろう疾患を治療するためのＤＧＡＴを対象としたアンチセンス化合物の使用を開示している。ＷＯ２０１８／０９３９６６号は、肥満と、高コレステロール血症、心血管疾患、２型糖尿病、代謝症候群などの肥満関連疾患とを治療するために、ＤＧＡＴ２およびジグリセリドアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）を対象とするＲＮＡサイレンシング１０の使用を開示している。同様に、ＷＯ２００５／０４４９８１号は、他の多くの遺伝子標的の中でもＤＧＡＴ２を標的にするｓｉＲＮＡの使用、およびトリグリセリド調節から利益を得るであろう疾患の治療におけるそれらの使用を開示している。
本開示は、センスまたはアンチセンス阻害性ＲＮＡのいずれかの３’末端に結合され、かつヘアピン構造を形成する短いＤＮＡ部分の包含によって改変されている、またリポタンパク質（ａ）をコードするヌクレオチド配列を参照して設計されている、二本鎖阻害性ＲＮＡを含む核酸分子に関する。ＵＳ８，０６７，５７２号は、参照によりその全体が組み込まれていて、前記核酸分子の例を開示している。二本鎖阻害性ＲＮＡは、単にまたは主に天然ヌクレオチドを使用し、従来技術の二本鎖ＲＮＡ分子で典型的に、薬力学および薬物動態を改善するために利用される、修飾されたヌクレオチドまたは糖を必要としない。開示された二本鎖阻害性ＲＮＡは、心血管遺伝子標的をサイレンシングする活性を有し、潜在的に少なめの副作用を有する。
本発明の一態様によると、核酸分子であって、
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第一の部分と、
一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第二の部分とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子の前記５’末端が、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記センス鎖の前記３’末端に共有結合されているか、または前記一本鎖ＤＮＡ分子の前記５’末端が、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の３’に共有結合されていて、二本鎖阻害性ＲＮＡが、心血管疾患に関連した心血管遺伝子標的の一部をコードするセンスヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、前記遺伝子標的が、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ Ｂ）およびプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）ではなく、前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記一本鎖ＤＮＡの一部と相補的塩基対合することによってアニールして二本鎖ＤＮＡ構造を形成するようにその長さの少なくとも一部にわたって適合されたヌクレオチド配列を含み、前記二本鎖阻害性ＲＮＡが天然ヌクレオチドから成る、核酸分子が提供される。
本発明の一態様によると、核酸分子であって、
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第一の部分と、
一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第二の部分とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子の前記５’末端が、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記センス鎖の前記３’末端に共有結合されているか、または前記一本鎖ＤＮＡ分子の前記５’末端が、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の３’に共有結合されていて、二本鎖阻害性ＲＮＡが、心血管疾患に関連した心血管遺伝子標的の一部をコードするセンスヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、前記遺伝子標的が、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ Ｂ）およびプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、またはその多型配列バリアントではなく、前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記一本鎖ＤＮＡの一部と相補的塩基対合することによってアニールして、ステムドメインおよびループドメインを含む二本鎖ＤＮＡ構造を形成するようにその長さの少なくとも一部にわたって適合されたヌクレオチド配列を含み、前記核酸分子がＮ－アセチルガラクトサミンを含むことと、前記二本鎖阻害性ＲＮＡが天然ヌクレオチドから成ることとを特徴とする、核酸分子が提供されている。
「多型配列バリアント」は、１個、２個、３個、またはそれ以上のヌクレオチドによって変化する配列である。当方は現在の出願の主張された主題から、優先出願ＧＢ１９０９５００．９、ＧＢ１９１０５２６．１、ＧＢ２０００９０６．４、ＧＢ２０１０００４．６、ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５１５７３の内容を放棄する。当方は出願中の各出願において、参照アポリポタンパク質Ｂを用いて設計された本発明による核酸分子を開示し主張する。また、本発明によるプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）核酸分子を開示する英国特許出願ＧＢ２００３７５６．０、ＧＢ２０１０２７６．０、およびＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０５６５４０およびＧＢ２１０３５９４．４の内容も放棄する。
本発明の好ましい一実施形態において、前記一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に共有結合されている。
本発明の好ましい一実施形態において、前記一本鎖ＤＮＡ分子の５’末端は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に共有結合されている。
本発明の好ましい一実施形態において、前記ループ部分は、ヌクレオチド配列ＧＮＡまたはＧＮＮＡを含む領域を含み、各Ｎは独立してグアニン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、またはシトシン（Ｃ）を表す。
本発明の好ましい一実施形態において、前記ループドメインは、ＧおよびＣヌクレオチド塩基を含む。
本発明の代替的な一実施形態において、前記ループドメインは、ヌクレオチド配列ＧＣＧＡＡＧＣを含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列ＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＧＣ（配列番号２５１）を含む。
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列５’ ＣＧＡＡＧＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣＣＡＣＴ ３’（配列番号１３０）を含む。
阻害性ＲＮＡ分子は、化学修飾を必要としない天然ヌクレオチド塩基を含むか、またはそれらから成る。さらに、本発明の一部の実施形態において、湾曲（crook）ＤＮＡ分子は、前記二本鎖阻害性ＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合されていて、アンチセンス鎖には、少なくとも２ヌクレオチド塩基オーバーハング配列が任意選択的に提供されている。２ヌクレオチドオーバーハング配列は、標的によってコードされたヌクレオチドに対応することができるか、または非コードである。２ヌクレオチドオーバーハングは、任意の配列の２つのヌクレオチド、例えばＵＵ、ＡＡ、ＵＡ、ＡＵ、ＧＧ、ＣＣ、ＧＣ、ＣＧ、ＵＧ、ＧＵ、ＵＣ、ＣＵ、ｄＴｄＴなど、任意の順番とすることができる。
本発明の好ましい一実施形態において、前記阻害性ＲＮＡ分子は、デオキシチミジンジヌクレオチド（ｄＴｄＴ）を含むか、またはそれから成る２ヌクレオチドオーバーハングを含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記ｄＴｄＴオーバーハングは、前記アンチセンス鎖の５’末端に位置付けられている。
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記ｄＴｄＴオーバーハングは、前記アンチセンス鎖の３’末端に位置付けられている。
本発明の好ましい一実施形態において、前記ｄＴｄＴオーバーハングは、前記センス鎖の５’末端に位置付けられている。
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記ｄＴｄＴオーバーハングは、前記センス鎖の３’末端に位置付けられている。
本発明の好ましい一実施形態において、前記センス鎖および／または前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む。
好ましくは、前記センス鎖の５’および／または３’末端の２つのヌクレオチドは、２つのヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む。
好ましくは、前記アンチセンス鎖の５’および／または３’末端の２つのヌクレオチドは、２つのヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む。
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、一つ以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記核酸分子は、ビニルホスホネート修飾を含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記ビニルホスホネート修飾は、前記センスＲＮＡ鎖の５’末端リン酸塩に対するものである。
本発明の好ましい一実施形態において、前記ビニルホスホネート修飾は、前記アンチセンスＲＮＡ鎖の５’末端リン酸塩に対するものである。
本発明の好ましい一実施形態において、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、長さが１０～４０個のヌクレオチドである。
本発明の好ましい一実施形態において、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、長さが１７～２９個のヌクレオチドである。
本発明の好ましい一実施形態において、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、長さが１９～２１個のヌクレオチドである。好ましくは、長さが１９個のヌクレオチドである。
本発明の好ましい一実施形態において、前記心血管遺伝子標的は、ヒトリポタンパク質（ａ）である。
本発明の代替的な一実施形態において、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４から成る群から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号４１を含むアンチセンスヌクレオチド配列と、配列番号４９を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に共有結合されている。
本発明の好ましい一実施形態において、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号４を含むアンチセンスヌクレオチド配列と、配列番号４４を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に共有結合されている。
本発明の好ましい一実施形態において、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号５を含むアンチセンスヌクレオチド配列と、配列番号４６を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子は、二本鎖阻害性ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端に共有結合されている。
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記心血管遺伝子標的は、ヒトアポリポタンパク質Ｃ ＩＩＩ（Ａｐｏ Ｃ ＩＩＩ）である。
好ましくは、前記核酸分子は、配列番号６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８および７９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記核酸分子は、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９および２５０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。
好ましくは、前記核酸分子は、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８および８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記心血管遺伝子標的は、ヒトジグリセリドアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）である。
好ましくは、前記核酸は、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８および１１９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。
好ましくは、前記核酸は、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９および１７０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。
好ましくは、前記核酸は、配列番号９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８および１２９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記核酸分子は、Ｎ－アセチルガラクトサミンに共有結合されている。
本発明のさらなる一実施形態において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは、前記阻害性ＲＮＡのアンチセンス部分または前記阻害性ＲＮＡのセンス部分のいずれかに結合されている。
好ましくは、Ｎ－アセチルガラクトサミンは、前記センスＲＮＡの５’末端に結合されている。
本発明の代替的な一実施形態において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは、前記センスＲＮＡの３’末端に結合されている。
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記Ｎ－アセチルガラクトサミンは、前記アンチセンスＲＮＡの３’末端に結合されている。
本発明の好ましい一実施形態において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは、一価である。
本発明の好ましい一実施形態において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは、二価である。
本発明の代替的な一実施形態において、Ｎ－アセチルガラクトサミンは三価である。
本発明の好ましい一実施形態において、前記核酸分子は、以下の構造を含む分子に共有結合されている：
本発明の代替的な一実施形態において、前記核酸分子は、以下の構造を含む分子に共有結合されている：
本発明の代替的な一実施形態において、前記核酸分子は、以下の構造を含む分子に共有結合されている：
本発明の代替的な一実施形態において、前記核酸分子は、以下の構造を含む分子に共有結合されている：
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記核酸分子は、Ｎ－アセチルガラクトサミン４－硫酸塩を含む分子に共有結合されている。
本発明のさらなる一態様によると、本発明による少なくとも一つの核酸分子を含む医薬組成物が提供されている。
本発明の好ましい一実施形態において、前記組成物は、薬学的担体および／または賦形剤をさらに含む。
投与される時に、本発明の組成物は、薬学的に許容可能な調製物で投与される。こうした調製物は、薬学的に許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、および任意選択でコレステロール降下剤などの他の治療剤を日常的に含有してもよく、これは本発明による核酸分子とは別個に投与されてもよく、または組み合わせが適合する場合、組み合わせた調製物で投与されてもよい。
本発明による核酸と、他の異なる治療剤との組み合わせは、同時、連続、または時間的に別個の用量として投与される。
本発明の治療薬は、注射を含む任意の従来的経路によって、または経時的な段階的注入によって投与されることができる。投与は、例えば経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、腔内投与、皮下投与、経皮投与または経上皮投与であってもよい。
本発明の組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独で、またはさらなる用量とともに、所望の応答を生成する発現ベクターの量である。疾患（心臓血管系の疾患など）を治療する場合、所望の応答は、疾患の進行を阻害するか、または反転させることである。これは、疾患の進行を一時的に遅らせることのみを含みうるが、より好ましくは、疾患の進行を永久的に停止することを含む。これはルーチンの方法によって監視されることができる。
そのような量は、当然ながら、治療される特定の疾患、疾患の重症度、年齢、身体状態、サイズ・体重、治療期間、併用療法の性質（存在する場合）、特定の投与経路を含む個々の患者パラメータ、ならびに医療従事者の知識および専門技能内の類似の因子に依存する。これらの因子は当業者に周知であり、ルーチンの実験のみで対処されることができる。個々の成分またはその組み合わせの最大用量、すなわち健全な医学的判断による最大安全用量を使用することが概して好ましい。しかしながら、当業者であれば、医学的理由、心理的理由、または事実上あらゆる他の理由により、患者がより低い用量または耐用量を主張しうることを理解するであろう。
前述の方法で使用される医薬組成物は好ましくは、滅菌されていて、患者への投与に適切な重量または体積の単位で所望の応答を生成するための本発明による有効量の核酸分子を含有する。応答は、例えば心血管疾患の退縮および疾患症状の減少などを決定することによって測定されることができる。
対象に投与される本発明による核酸分子の用量は、異なるパラメータに従って、特に、使用される投与モードおよび対象の状態に従って選択されることができる。他の因子には、望ましい治療期間が含まれる。対象における応答が、適用される初回用量では不十分である場合、より高い用量（または異なるより局所的な送達経路による効果的により高い用量）が、患者の耐性が許容する範囲で採用されうる。本発明による核酸の検出方法は、治療を必要とする対象に対する適切な用量の決定を容易にすることが明らかであろう。
一般に、本明細書に開示の核酸分子の１ｎＭ～１μＭの用量は概して、標準的な手順に従って製剤化され、投与される。好ましくは、用量は１ｎＭ～５００ｎＭ、５ｎＭ～２００ｎＭ、１０ｎＭ～１００ｎＭの範囲とすることができる。投与量、注射のスケジュール、注射部位、投与モード、同等物が前述とは異なる、組成物の投与のための他のプロトコルは当業者に周知であろう。ヒト以外の哺乳動物への組成物の投与（例えば、試験目的または獣医学治療目的のための）は、上記と実質的に同じ条件下で実施される。本明細書で使用される対象は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり、非ヒト霊長類、またはヒトリポタンパク質（ａ）の発現に適合された遺伝子導入哺乳動物を含む。
投与される時に、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容可能な量で、かつ薬学的に許容可能な組成物で適用される。「薬学的に許容可能な」という用語は、活性成分の生物活性の有効性に干渉しない非毒性物質を意味する。こうした調製物は、塩、緩衝剤、防腐剤、適合担体、および任意選択的に他の治療剤（例えば、スタチン）を定常的に含有してもよい。医薬で使用される時に、塩は薬学的に許容可能であるべきであるが、薬学的に許容されない塩は好都合なことに、その薬学的に許容可能な塩を調製するために使用されてもよく、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的および薬学的に許容可能な塩には、限定されないが、以下の酸から調製されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、同等物。また、薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製されることができる。
組成物は、所望により、薬学的に許容可能な担体と組み合わせられてもよい。本明細書で使用される「医薬的に許容可能な担体」という用語は、ヒトへの投与に適している、一つ以上の適合する固体もしくは液体のフィラー、希釈剤、またはカプセル剤を意味する。この文脈における用語「医薬的に許容可能な担体」とは、天然または合成の有機または無機の成分を指し、それと活性成分とを組み合わせて、例えば溶解性および／または安定性を促進する。本医薬組成物の構成要素はまた、所望の医薬的有効性を実質的に損なうものになる相互作用がないような様式で、本発明の分子と、および互いに混ざり合うことができる。
医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、塩中のリン酸を含む、適切な緩衝剤を含有しうる。医薬組成物はまた任意選択的に、適切な防腐剤を含有してもよい。
医薬組成物は好都合なことに、単位剤形で供されてもよく、薬学の分野で周知のいずれかの方法によって調製されてもよい。すべての方法は、活性薬剤を一つ以上の副成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、本組成物は、活性化合物を液体担体、または微細に分割された固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、その後、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、トローチなどの個別の単位として供され、それぞれが所定量の活性化合物を含有する。
非経口投与に適した組成物は、核酸の無菌の水性または非水性調製物を含み、これはレシピエントの血液と等張であることが好ましい。この調製物は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、周知の方法に従って製剤化されうる。滅菌注射用調製物はまた、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液でありうる。採用されうる許容可能な溶媒としては、水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、滅菌固定油は従来的に、溶媒または懸濁媒体として採用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油が採用されうる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製に使用されうる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適切な担体製剤は、『Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ』（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルベニア州イーストン）において見つけることができる。
本発明のさらに好ましい一実施形態において、前記医薬組成物は、少なくとも一つのさらに異なる治療剤を含む。
本発明の好ましい一実施形態において、前記さらなる治療薬はスタチンである。
スタチンは、ＬＤＬ－Ｃ値が上昇した対象におけるコレステロール値を制御するために一般的に使用される。スタチンは、影響を受けやすい対象および心血管疾患を有する対象を予防および治療するのに有効である。スタチンの典型的な用量は５～８０ｍｇの領域であるが、これはスタチンと、高いＬＤＬ－Ｃに罹患している対象に必要とされるＬＤＬ－Ｃの低減の望ましいレベルとに依存する。しかしながら、スタチンの標的であるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの発現および合成は、スタチン投与に応答して適応し、それ故にスタチン療法の有益な効果はスタチン抵抗性が確立された後、単に一時的であるか、または限定的である。
好ましくは、前記スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチンから成る群から選択される。
本発明の好ましい一実施形態において、前記さらなる治療薬はエゼチミブである。任意選択的に、エゼチミブは、少なくとも一つのスタチン、例えばシンバスタチンと組み合わせられる。
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記さらなる治療剤は、フィブラート、ニコチン酸、コレスチラミンから成る群から選択される。
本発明のさらなる代替的な好ましい一実施形態において、さらなる治療薬は、治療抗体、例えばエボロクマブ、ボコシズマブ、またはアリロクマブである。
本発明のさらなる一態様によると、高コレステロール血症もしくは高コレステロール血症に関連する疾患を有するか、または高コレステロール血症もしくは高コレステロール血症に関連する疾患にかかりやすい対象の治療または予防に使用する、本発明による核酸分子または医薬組成物が提供されている。
本発明の好ましい一実施形態において、前記対象は小児の対象である。
小児の対象には、新生児（０～２８日）、乳児（１～２４か月）、幼児（２～６歳）、思春期前［７～１４歳］の小児が含まれる。
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、前記対象は成人の対象である。
本発明の好ましい一実施形態において、高コレステロール血症は家族性高コレステロール血症である。
本発明の好ましい一実施形態において、家族性高コレステロール血症は、リポタンパク質（ａ）発現のレベルの上昇と関連する。
本発明の好ましい一実施形態において、前記対象は、スタチン療法に耐性がある。
本発明の好ましい一実施形態において、高コレステロール血症に関連する前記疾患は、脳卒中予防、高脂血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈性心疾患、大動脈弁狭窄症、脳血管疾患、末梢動脈疾患、高血圧、代謝症候群、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、バージャー病、腎動脈狭窄症、高アポβリポタンパク血症、脳血管アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、静脈血栓症から成る群から選択される。
本発明のさらなる一態様によると、高コレステロール血症を有するか、または高コレステロール血症にかかりやすい対象を治療する方法であって、本発明による核酸または医薬組成物の有効用量を投与し、それによって高コレステロール血症を治療または予防することを含む、方法が提供されている。
本発明の好ましい一方法において、前記対象は小児の対象である。
本発明の代替的な好ましい一方法において、前記対象は成人の対象である。
本発明の好ましい一方法において、高コレステロール血症は、家族性高コレステロール血症である。
本発明の好ましい一方法において、家族性高コレステロール血症は、リポタンパク質（ａ）発現のレベル上昇と関連する。
本発明の好ましい一方法において、前記対象は、スタチン療法に耐性がある。
本発明の好ましい一方法において、高コレステロール血症に関連する前記疾患は、脳卒中予防、高脂血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈性心疾患、大動脈弁狭窄症、脳血管疾患、末梢動脈疾患、高血圧、代謝症候群、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、バージャー病、腎動脈狭窄症、高アポβリポタンパク血症、脳血管アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、静脈血栓症から成る群から選択される。
本発明のさらなる一態様によると、リポタンパク質（ａ）上昇に関連する高コレステロール血症の診断および治療のための治療処方計画であって、
ｉ） 高コレステロール血症を有することが疑われる、または高コレステロール血症を有する疑いがある対象から生体試料を取得することと、
ｉｉ） リポタンパク質（ａ）ポリペプチドに特異的な抗体（または抗体断片）と前記試料を接触させることと、
ｉｉｉ） 前記生体試料中のリポタンパク質（ａ）ポリペプチドおよびＬＤＬ－Ｃの濃度を決定することと、
ｉｖ） 前記ＬＤＬ－Ｃ濃度が３５０ｍｇ／ｄＬよりも大きい場合、本発明による核酸分子または医薬組成物を投与することと、を含む、治療処方計画が提供されている。
典型的に、家族性高コレステロール血症において、ＬＤＬ－Ｃのレベルは、選択された変異に対してヘテロ接合性である対象において３５０～５５０ｍｇ／ｄＬであり、ホモ接合性変異を有する対象において６５０～１０００ｍｇ／ｄＬである。ＬＤＬ－Ｃの正常レベルは、１３０ｍｇ／ｄＬの領域にある。
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という単語、ならびに当該単語の変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、それらに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加剤、成分、整数、または工程を除外することを意図していない（かつ除外しない）。
本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通して、文脈によって別段の解釈が要求されない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、明細書は、文脈によって別段の解釈を必要としない限り、複数性だけでなく単一性も企図するものとして理解されるべきである。
本発明の態様、実施形態、または実施例に関連して説明される特徴、完全体、特性、化合物、化学的部分、または基は、それらと不適合でない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であると理解されるべきである。
ここで、本発明の一実施形態を、以下の図を参照して、単に例として説明する。
対照のｓｉＲＮＡ構築物と比較したＧａｌＮＡｃ抱合型（GalNAc-conjugated）湾曲抗マウスＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡのインビボ活性を示すグラフ。 （ａ）５匹の成体オス野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍｌ）を、ＧａｌＮＡｃ抱合型ＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡ（一つの処置群）の投与後９６時間測定し、生理食塩水を投与した対照処置群と比較した。対応のある両側Ｔ検定アルゴリズムを使用して統計解析を適用した。結果は、ＧａｌＮＡｃ抱合型湾曲ｓｉＲＮＡで処置されたマウスの平均血漿ＡｐｏＢレベルが、対照と比較して実質的に減少したことを示す。ただし、有意性が不足し（ｐ＝０．１１）、最も可能性の高い理由は、サンプルサイズが小さいことと、対照動物間でのＡｐｏＢレベルのばらつきが小さいことである。 （ｂ）５匹の成体オス野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍｌ）を、ＧａｌＮＡｃ抱合型ＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡ（一つの処置群）の投与後９６時間測定し、ｓｉＲＮＡ構築物非抱合型（ＧａｌＮＡｃを含まない）ＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡを投与した対照処置群と比較した。対応のある両側Ｔ検定アルゴリズムを使用して統計解析を適用した。結果は、このＧａｌＮＡｃ抱合型湾曲ｓｉＲＮＡ処置群では、湾曲のある対照の非抱合型ｓｉＲＮＡと比較して、血漿ＡｐｏＢレベルの著しい減少を示す（Ｐ＝０．００４３５８３２）； 致死性ｓｉＲＮＡ試薬を使用するＲＴ４細胞におけるトランスフェクションの評価。示されたｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの７２時間後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ２．０試薬を使用してＲＴ４細胞生存率を定量化した（Ｐｒｏｍｅｇａ － 発光値は生細胞数に比例する）。この棒グラフは、平均発光量（＋ＳＤ、Ｎ＝４）を示す。 ＬＰ（ａ）およびＰＣＳＫ９を標的にするｓｉＲＮＡを使用する、ＲＴ４細胞におけるトランスフェクションの評価。示されたＯＴ＋ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの７２時間後、ＬＰ（ａ）（緑色の棒）およびＰＣＳＫ９（金色の棒）ｍＲＮＡを二重ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化した。表示されたデータは、ＮＴ ＯＴ＋に正規化された平均（＋ＳＥＭ）ｍＲＮＡ倍率変化（Ｎ＝４）である。 ＯＴ＋ ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ処置後のＲＴ４細胞死を示す顕微鏡画像。２５ｎＭでの示されたｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの７２時間後、ＲＴ４細胞をＳ３ ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して撮像した。 ２５ｎＭでのＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ非標的化およびＬＰ（ａ）ｓｉＲＮＡで処置された細胞における平均ＬＰ（ａ）ｍＲＮＡレベル。トランスフェクションの７２時間後、ＬＰ（ａ）ｍＲＮＡレベルを二重ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化した。表示されたデータは、ＮＴ ＯＴ＋（Ｎ＝４）に対するＬＰ（ａ）ｍＲＮＡの倍率変化の平均＋ＳＥＭである。 ｓｉＲＮＡ処置後のＧＡＰＤＨ ＣＴ値。０．３９ｎＭ（紫色の棒）または２５ｎＭ（金色の棒）での示されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＲＴ４細胞を、トランスフェクションの７２時間後の相対的なＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルについて評価した。表示されたデータは、ＧＡＰＤＨ ＣＴ値の平均＋ＳＥＭ（Ｎ＝４）である。 ＲＴ４は、５つの濃度（０．３９、１．５６、６．２５、２５、５０ｎＭ）の示されたカスタム湾曲ｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトされた。ＯＴ＋ ＮＴ対照に対するＬＰ（ａ）ｍＲＮＡレベルを、各データ点に対して計算した。表示されているのは、平均±ＳＥＭ（Ｎ＝４）である。 インビボでのマウス試験を実施し、ＧａｌＮＡｃ抱合型湾曲抗マウスＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡのノックダウン活性（化合物Ｈ、図９に図示）を、その「非湾曲」ｓｉＲＮＡ対照（化合物Ａ、図９に図示）と比較して評価した。化合物Ｈ（２ｍｇ／ｋｇ）は、化合物Ａおよび媒体対照と比較して、ＳＣ注射の４８時間後に肝臓ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの有意なノックダウンを示す。対応のある両側Ｔ検定アルゴリズム（ｐ＜０．００１）を使用して統計解析を適用した。 インビボでのＰＣＳＫ９試験で投与されたｓｉＲＮＡ構築物（図８）：（Ａ）化合物Ａは、湾曲部分を含まないＧａｌＮＡｃ抱合型抗マウスＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡであり、（Ｂ）化合物Ｈは、センス鎖の３’に湾曲が付加されたＧａｌＮＡｃ抱合型ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡである。（Ｃ）ＧａｌＮＡｃ構造。ｃ、ｇ、ａ、ｔ：ＤＮＡ塩基；Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ：ＲＮＡ塩基、＊ヌクレオチド間結合ホスホロチオエート（ＰＳ）。
材料および方法
リポタンパク質（ａ）
リポタンパク質（ａ）は、ヒトおよび非ヒト霊長類種の肝臓でのみ発現され、齧歯類種などの他の種は、リポタンパク質（ａ）と同等の遺伝子を有しない。しかしながら、カニクイザルなどの非ヒト霊長類における試験とは別に、リポタンパク質（ａ）を調節するのに有効な薬剤の試験に適合した幾つかの遺伝子導入動物モデルもある。例えば、ＵＳ９，０１８，４３７号は、リポタンパク質（ａ）を含むヒトリポタンパク質の発現のための遺伝子導入マウスモデルを開示している。ＵＳ６，５１２，１６１号は、ヒトリポタンパク質（ａ）の発現のための遺伝子導入ウサギモデルを開示している。各開示の内容は、参照によりその全体が組み込まれ、本発明による核酸分子を試験するためのインビボでのモデルを提供する。さらに、治療薬を試験するための非ヒト霊長類モデルは周知である。ＵＳ９，９３２，５８６号は、ヒトリポタンパク質（ａ）をサイレンシングするｓｉＲＮＡ配列を含むその内容全体が参照により組み込まれ、リポタンパク質（ａ）の発現についてカニクイザルおよび遺伝子導入マウスモデルにおけるｓｉＲＮＡ薬剤の試験を開示している。ＷＯ２０１９／０９２２８３号は、ヒトリポタンパク質（ａ）をサイレンシングするｓｉＲＮＡ配列を含むその内容全体が参照により組み込まれ、初代ヒト細胞株および非ヒト霊長類細胞株を使用するインビトロでの試験の使用を開示している。上述の通りの非ヒト、非ヒト霊長類遺伝子導入モデルに投与する場合、アポリポタンパク質（ａ）湾曲核酸を送達するための用量および投与経路は、認識できるほど違わない。
ＲＴ４逆トランスフェクション（ＬＰ（ａ）ｓｉＲＮＡ）
・ 本試験で評価したカスタムライブラリーの説明を表１に示す。Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによって合成されたカスタム二本鎖ｓｉＲＮＡを、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ遊離水に再懸濁し、１０μＭの原液を得た。
・ 原液のｓｉＲＮＡを、４×３８４ウェルアッセイプレートに分注した：
プレート１：ＬＰ１－８複製１
プレート２：ＬＰ１－８複製２
プレート３：ＬＰ９－１６複製１
プレート４：ＬＰ９－１６複製２
・ 各アッセイプレート上に、８個のカスタムｓｉＲＮＡおよび対応する対照（ＮＥＧセンスまたはＮＥＧアンチセンス）を、アッセイプレート中の５つの濃度（５０ｎＭ、２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１．５６ｎＭ、０．３９ｎＭ）で分注した。ｓｉＲＮＡ非標的化（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＃Ｄ－００１８１０－１０－０５）、標的化ＰＬＫ１（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＃Ｌ－００３２９０－００－０００５）、標的化ＬＰ（ａ）（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＃Ｌ－０２００１１－００－０００５）から成るＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ対照を分注し、最終濃度２５ｎＭを得た。
・ リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃１３７７８０７５）をＯｐｔｉＭＥＭ培地中で希釈し、その後、１ウェル当たり１０μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ：ＯｐｔｉＭＥＭ溶液をアッセイプレートに添加した。１ウェル当たりのＲＮＡｉＭＡＸの最終体積は０．０８μＬであった。
・ 脂質－ｓｉＲＮＡミックスを、室温で３０分間インキュベートしてから、細胞を加えた。
・ ＲＴ４細胞をアッセイ培地（ＭｃＣｏｙの５Ａ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）１０％ ＦＢＳ １％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で希釈し、その後、４，０００個のＲＴ４細胞をアッセイプレートの各ウェルに４０μＬ体積で播種した。アッセイ条件ごとに、四重の技術的複製物を播種した。
・ 細胞の評価前に、プレートを加湿雰囲気中で、３７℃、５％のＣＯ２で７２時間インキュベートした。
・ プレート１および３を、二重ＲＴ－ｑＰＣＲ用に処理した。プレート２および４は、培地除去後、－８０℃で保存された。
ＨｅｐＧ２細胞およびＲＴ４細胞（Ｌｐ（ａ））における湾曲ｓｉＲＮＡ活性のＡｐｏＣ３、ＤＧＡＴ２、およびＬｐ（ａ）インビトロスクリーニング
本試験で評価したＡｐｏＣ３およびＤＧＡＴ２のカスタムライブラリーｓｉＲＮＡの説明を表４に示す。
ＨｅｐＧ２およびＲＴ４逆トランスフェクション
・ ＡｐｏＣ３およびＤＧＡＴ２についてＨｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｌｐ（ａ））、およびＢｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（テキサス州ルイスビル）によって合成されたカスタム二本鎖ｓｉＲＮＡを、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ遊離水に再懸濁し、１０μＭの原液を得た。
・ 原液のｓｉＲＮＡを、４×３８４ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃７８１０９２またはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）１６４６８８）に分注した。各アッセイプレート上で、各標的および３つの対照（ＰＯＳリポタンパク質（ａ）、ＡｐｏＢ、ＮＥＧセンスとＮＥＧアンチセンス）に対して１０個のカスタムｓｉＲＮＡを分注し、１００ｎＭのアッセイプレートにおける最高最終濃度から５点４倍希釈系列を生成した。ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ非標的化およびリポタンパク質（ａ）ｓｉＲＮＡ対照を分注し、最終濃度２５ｎＭを得た。ＡｐｏＣ３およびＤＧＡＴ２について、ｓｉＲＮＡ処置を受けていない細胞は、陰性対照として使用した。
・ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＯｐｔｉｍｅｍ培地中で希釈し、その後、１ウェル当たり１０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ：ＯｐｔｉＭＥＭ溶液をアッセイプレートに添加した。１ウェル当たりのＲＮＡｉＭＡＸの最終体積は０．０８μＬであった。
・ 脂質－ｓｉＲＮＡミックスを、室温で３０分間インキュベートした。
・ ＨｅｐＧ２細胞をアッセイ培地（ＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）１０％ ＦＢＳ １％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で希釈し、その後、４，０００個のＨｅｐＧ２細胞をアッセイプレートの各ウェルに４０μＬ体積で播種した。アッセイ条件ごとに、四重の技術的複製物を播種した。
・ 細胞の評価前に、プレートを加湿雰囲気中で、３７℃、５％のＣＯ２で７２時間インキュベートした。
二重ＲＴ－ｑＰＣＲ
・ トランスフェクションの７２時間後、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ １－ｓｔｅｐ ＴａｑＭａｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ４３９１８５１ＣまたはＡ２５６０３）を使用して細胞を処理し、ＲＴ－ｑＰＣＲ測定をした。簡潔に述べると、細胞を５０μｌの氷冷ＰＢＳで洗浄し、次いで、ＤＮａｓｅ Ｉを含有する２０μｌの溶解溶液中で溶解した。５分後、２μｌのＳＴＯＰ溶液を２分間添加することによって溶解を停止させた。
・ Ｌｐ（ａ） ＲＴ－ｑＰＣＲ分析のために、１ウェル当たり３ｕｌの可溶化物を、１１μｌのＲＴ－ｑＰＣＲ反応体積のテンプレートとして３８４ウェルＰＣＲプレートに分注した。ＡｐｏＣ３およびＤＧＡＴ２のために、１ウェル当たり１ｕｌの可溶化物を、２０μｌのＲＴ－ｑＰＣＲ反応体積のテンプレートとして９６ウェルＰＣＲプレートに分注した。
・ ＧＡＰＤＨ（ＶＩＣ ＃４４４８４８６）およびリポタンパク質（ａ）用のＴａｑＭａｎプローブを用いたＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ１－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（＃４４４４４３４）を使用して、Ｌｐ（ａ）のＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨ（ＶＩＣ＿ＰＬ、アッセイＩＤ Ｈｓ００２６６７０５＿ｇ１）、ＡｐｏＣ３（ＦＡＭ、アッセイＩＤ Ｈｓ００１６３６４４＿ｍ１）、ＤＧＡＴ２（ＦＡＭ、Ｈｓ０１０４５９１３＿ｍ１）用のＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）１－Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ ＭｉｘおよびＣｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ １－ｓｔｅｐ ＴａｑＭａｎ Ｋｉｔを使用して、ＡｐｏＣ３およびＤＧＡＴ２のＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。
・ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５または６サーモサイクリング機器（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。
・ 相対定量は、ΔΔＣＴ法を使用して決定し、ここでＧＡＰＤＨを内部対照として使用し、発現変化を参照試料（ＮＥＧセンスまたはＮＥＧアンチセンスのうちいずれかのｓｉＲＮＡ処置細胞、または「無処置」細胞）に対して正規化した。
統計
・ 本プロジェクトにおけるすべてのアッセイについて、各データ点について４つの技術的複製が得られた。
・ 平均、および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を、ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して計算した。
すべてのグラフはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して生成された。
湾曲リポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢ構築物
非抱合型および抱合型のリポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡを、それぞれ静脈内（ＩＶ）経路および皮下（ＳＣ）経路により投与し、相対的な血漿および組織の曝露を調べた。用量選択の根拠は、科学文献に発表された以下の情報に基づく：
ＧａｌＮＡｃ抱合型ｓｉＲＮＡは、５ｍｇ／ｋｇで皮下投与され、これによって必要なレベルの遺伝子サイレンシングが産生されるものと予想され、ここで構造的に関連するｓｉＲＮＡのＥＤ８０が２．５ｍｇ／ｋｇとして報告されている（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。これらの構造的に関連するｓｉＲＮＡは、マウスにおいて最大２５ｍｇ／ｋｇの単回投与まで耐容性を示した（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
ｓｉＲＮＡの非抱合型は、５０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与される。ＳＣ用量と比較して１０倍であるＩＶでの増加は、非抱合型ｓｉＲＮＡが肝臓を標的にする際に有効性が低いためである。さらに、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ （２００４）は、ＳＣ投与と比較して、ＩＶ後の肝臓においてより低いレベルのＲＮＡが測定されることを報告している。皮下沈着物からのｓｉＲＮＡの放出が遅いと、長期間の曝露が生じ、受容体とリガンドの相互作用の可能性が増大し、組織への取り込みが増加すると記載されている。類似の関連ｓｉＲＮＡは、３日間連続で最大５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与を行ったマウスで良好な耐容性が示された（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。念のため、最初の動物ＩＶの投与との間に１５分間の観察期間を設けて、残りの動物に投与する前に、被験物質が何らかの有害作用を引き起こすかどうかを決定する。
マウスまたは遺伝子導入同等物は、被験物質の安全性試験において毒性学種の一つとして使用されているため、最適な種である。かなりの量の利用可能な公表済みデータがあり、それらは、この種で生成されたデータのヒトへの有意性を評価するために規制当局にとって許容可能なデータである。
二本鎖ｓｉＲＮＡのライブラリー（１６標的化ＬＰ（ａ））を、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによって合成した。表１は、各ｓｉＲＮＡに対するＲＮＡの両方の鎖の配列を示す。以下のＤＮＡ配列（ＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＧＣ）を、センス鎖（ｓｉＲＮＡ ＰＣ１～ＰＣ１０およびＬＰ１～ＬＰ８、その後センスｓｉＲＮＡと呼ばれる）またはアンチセンス鎖（ｓｉＲＮＡ ＰＣ１１～ＰＣ２０およびＬＰ９～ＬＰ１６、その後アンチセンスｓｉＲＮＡと呼ばれる）のいずれかの３’末端に付加した。
表１ 湾曲が抱合されるＬｐ（ａ）候補ｓｉＲＮＡ配列の選択
表２ 湾曲が抱合されるＡＰＯＣ ＩＩＩおよびＤＧＡＴ ２ ｓｉＲＮＡ配列の選択
表３ ＤＧＡＴ２ ｓｉＲＮＡ配列（配列番号１３１～１７０）、ＰＣＳＫ９（配列番号１７１～２１０およびＡｐｏＣＩＩＩ（配列番号２１１～２５０）の選択
表４ インビトロでのＨＥＰ２Ｇ細胞におけるＡＰＯＣ３およびＤＧＡＴ ２遺伝子発現のサイレンシングに使用されたｓｉＲＮＡ対
動物
２０匹の健康なオスの動物を提供するのに十分なＣ５７ＢＬ／６マウスまたは遺伝子導入同等物を、承認された供給源から取得した（ＡｐｏＢパイロット試験）。動物は、投与時に２０～３０ｇの目標体重範囲内である。マウスは、テールマーキングによって一意に番号付けされる。番号はランダムに割り振られる。ケージは、試験番号および動物番号を含む情報を提供するカードによってコード化される。試験室は、部屋番号および試験番号を含む情報を提供するカードによって識別される。すべての動物は受領時に、不健康の外的兆候がないか調べた。不健康な動物は試験から除外された。動物を最低５日間、環境に順応させた。実施可能な場合、研究の科学的完全性を損ねることなく、可能な限り動物に手を触れた。試験への適合性を確実にするために、投与開始前に保健検査を実施した。
マウスは、室温２０～２４℃のサーモスタット制御された部屋で維持され、相対湿度を４５～６５％とし、毎日（公称１２時間）蛍光灯に当てた。温度および相対湿度は、毎日記録される。施設は、１時間に最低１５回の空気交換を行うように設計されている。代謝ケージ内または外科手術からの回復時を除き、１ケージ当たり最大５匹のマウスを性別に応じて、適切な寝具を含む適切な固形床ケージ内に収容した。
ケージは、「Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｏｕｓｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ Ｂｒｅｄ， Ｓｕｐｐｌｉｅｄ ｏｒ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ」（Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， ２０１４）に適合する。動物の環境と保健の両方を充実させるために、木製（アスペン）のチューブロックとポリカーボネートのトンネルが提供された。サプライヤーは、使用したブロックのバッチごとに分析証明書を提出した。すべての動物は、５ＬＦ２ ＥＵ齧歯類用飼料１４％への自由なアクセスが許可される。飼料サプライヤーは、使用した各バッチについて、特定の汚染物の濃度と一部の栄養素の分析を行った。すべての動物は、ケージに取り付けられたボトルからの水道水に自由にアクセスすることが可能であった。水道水給水の定期的な分析が実施される。
本試験の一環として、生きた動物に対して実施されるすべての手順は、英国の国内法、１９８６年動物（科学的手順）法の規定の対象になる。
作業日の始めと終わりに、動物が健康であることを確認するために、すべての動物を検査した。不健康の顕著な徴候を示す動物はすべて隔離した。瀕死の動物、または関連する英国内務省のライセンスによって課せられた重症度の限度を超える危険にさらされている動物は殺処分した。
製剤の調製
被験物質を０．９％生理食塩水で希釈し、リポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ非抱合型および抱合型の静脈内投与および皮下投与用にそれぞれ２５ｍｇ／ｍＬおよび０．６ｍｇ／ｍＬの濃度にした。被験物質が完全に溶解するまで、製剤を必要に応じて穏やかにボルテックスした。
ＰＣＳＫ９については、凍結乾燥ｓｉＲＮＡ化合物を溶解し、その後、ヌクレアーゼを含まないＰＢＳ（中性ｐＨ）中で希釈した。
得られた製剤を、目視検査のみによって評価し、それに応じて以下の通り分類した：
（１） 透明な溶液
（２） 濁った懸濁液、粒子は見えない
（３） 可視粒子
使用後、製剤を公称で２～８℃で冷蔵保存した。長期保存のために、製剤を－２０℃または－８０℃で保存した。
投薬の詳細
各動物は、リポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ非抱合体の単回静脈内投与、またはリポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ抱合体の単回皮下投与のいずれかを受けた。静脈内用量は、２ｍＬ／ｋｇの体積で外側尾静脈にボーラスとして投与された。皮下用量は、５ｍＬ／ｋｇの体積で皮下腔に投与された。
ＰＣＳＫ９の被験物質については、各動物は５ｍｌ／ｋｇの投与量で単回皮下注射を受けた。
体重
少なくとも、体重は到着翌日および用量投与前に記録された。必要に応じて、追加の決定を行った。
試料の保存
試料は、必要に応じて試験番号、試料タイプ、用量群、動物番号／Ｄｅｂｒａコード、（公称）サンプリング時間、保存条件を含む情報で一意にラベル付けされた。試料は、－５０℃未満の温度で保存された。
薬物動態試験
用量群の指定
動物は以下の通りの用量群に割り当てられた。
ＰＣＳＫ９
ヌクレアーゼを含まないＰＢＳ（中性ｐＨ）に被験物質を溶解し、０．４ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬの濃度にして、それぞれ２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量を得て、それらを５ｍＬ／ｋｇの投与量で皮下投与した。
ＰＣＳＫ９について、各動物は、ＧａｌＮＡｃ抱合型ＰＣＳＫ９湾曲ｓｉＲＮＡ、または非湾曲ＧａｌＮＡｃ抱合型ＰＣＳＫ９のいずれかを単回皮下投与され、２日目（４８時間）または７日目（１６８時間）のいずれかで犠牲にして、肝臓ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡサイレンシングを決定した。試料は、終結時に尾出血または心臓穿刺のいずれかを介して得られる。
ＰＣＳＫ９湾曲ｓｉＲＮＡのそれぞれについて
１０匹のマウス ＳＣ ＧａｌＮＡｃ抱合型ＰＣＳＫ９湾曲ｓｉＲＮＡ、２ｍｇ／ｋｇ
１０匹のマウス ＳＣ ＧａｌＮＡｃ抱合型ＰＣＳＫ９湾曲ｓｉＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇ
１０匹のマウス ＳＣ ＧａｌＮＡｃ抱合型ＰＣＳＫ９「非湾曲」ｓｉＲＮＡ、２ｍｇ／ｋｇ
１０匹のマウス ＳＣ ＧａｌＮＡｃ抱合型ＰＣＳＫ９「非湾曲」ｓｉＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇ
１０匹のマウス ＳＣ ＰＢＳ対照
採血
連続血液サンプル（名目上１００μＬ、体重に依存）を、投与後０、４８、および９６＊時間で尾の切り込みにより収集した。動物にはイソフルランを使用して死なせるように麻酔をかけ、心臓穿刺によって最終試料（名目上０．５ｍＬ）を採取した。
血液試料をＫ２ＥＤＴＡマイクロキャピラリーチューブ（尾の切り込み）またはＫ２ＥＤＴＡ血液チューブ（心臓穿刺）に採取し、処理されるまで氷上に置かれた。血液を遠心分離（１５００ｇ、１０分、４℃）して、分析用の血漿を生成した。等しい体積の二つのアリコートにバルク血漿を分割した。残留血液細胞は廃棄した。血液試料収集の許容可能な時間範囲を、以下の表に要約する。実際のサンプリング時間を、すべての基質について記録した。
予定された採取時間が許容範囲外である場合、実際の採血時間が報告され、その後のＰＫ解析に含められた。
血清採取については、血液（＞３００ｕｌ）を周囲温度で血清チューブに入れ、凝固させ、次いで１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
動物の運命
動物は最終的な採血の前にペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射を介して麻酔をかけ、イソフルラン投与によって死なせた。
組織採取
肝臓を全動物（Ａ群～Ｄ群）から除去し、予め秤量された管に入れた。組織試料を、ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘホモジナイゼーションプローブを使用して、５部のＲＮＡｌａｔｅｒを１部の組織にホモジナイズした。以下の組織を、リポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢ処置群（Ａ群およびＣ群）の動物から切除し、予め秤量されたポットに入れた：
・ 脾臓
・ 脳
・ 心臓
・ 肺葉
・ 皮膚（鼠径部、約２５ｍｍ２）
組織は、ＲＮａｓｅ活性を避けるために、液体窒素中で瞬間凍結させた。組織は、－５０℃未満の温度（公称－８０℃）で保存される。
ＰＣＳＫ９インビボ試験：ＲＴ－ｑＰＣＲのための肝臓の処理
動物を犠牲にし、肝臓を採取し、液体窒素中で瞬間凍結させた。以下に記載の通り、全肝臓をすりつぶし、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現の評価のために組織可溶化物を調製した。
・ ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＲＮＢ１００－１００ＲＸＮ）を使用して、すりつぶした１０ｍｇの肝組織から全ＲＮＡを抽出した。
・ マウスＧＡＰＤＨ（ＶＩＣ＿ＰＬ）およびＰＣＳＫ９（ＦＡＭ）用のＴａｑＭａｎプローブを用いたＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、二重ＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。
・ ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの相対定量（ＲＱ）は、ΔΔＣＴ法を使用して決定され、ここでＧＡＰＤＨは内部対照として使用され、標的遺伝子の発現変化は媒体対照（ＰＢＳ）に対して正規化された。
イムノアッセイ
血漿リポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢレベルを、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．の市販マウスリポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢ検出キットを使用して、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して測定した。血漿試料を分析前に－８０℃で保存し、氷上で解凍し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、アッセイ緩衝液中でアリコートを希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに適用した。リポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢアッセイキットは、ＯＤ４５０で測定された比色測定値を得るサンドイッチＥＬＩＳＡを使用する。特定の時点（０時間および９６時間）での各動物からの試料は、複製してアッセイされ、測定はキットとともに供給された標準曲線試薬に基づいて、血漿１ｍｌ当たりのリポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢのマイクログラム量として記録された。すべてのデータポイントは、２０％未満の変動係数で測定された。各動物のリポタンパク質（ａ）またはＡｐｏＢレベルの変化は、９６時間値から０時間値を差し引くことによって計算され、パーセンテージとして表された。％変化値の範囲を、各試験群について照合し、対応のある両側Ｔ検定アルゴリズムを使用して統計解析を適用した。
パイロットのインビボマウス実験を実施して、ＧａｌＮＡｃ抱合型湾曲抗マウスＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡの活性を、対照ｓｉＲＮＡ構築物と比較して評価した。ＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡの抱合型（ＧａｌＮＡｃ）および非抱合型（ＧａｌＮＡｃを含まない）を、「材料および方法」の項にそれぞれ前述した、皮下（ＳＣ）および静脈内（ＩＶ）の経路によって、成体オス野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した。
血漿ＡｐｏＢを、「投与詳細」で上述の通りの４つの処置群（１群当たり５匹のマウス）で示される通り、０時間（ｓｉＲＮＡ構築物の投与前）およびｓｉＲＮＡ構築物の投与後９６時間でＥＬＩＳＡ（前述）によって測定した。
各治療群の５匹のマウスからの血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍｌ）を使用して、平均ＡｐｏＢ値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。ＧａｌＮＡｃ抱合型湾曲ｓｉＲＮＡのＳＣ投与後の９６時間後の血漿ＡｐｏＢレベルの変化を、対照（ｉ）媒体生理食塩水、または（ｉｉ）湾曲のある非抱合型ｓｉＲＮＡのいずれかを投与したマウスのレベルと比較した。対応のある両側Ｔ検定アルゴリズムを使用して統計解析を適用した。
図１（ａ）を参照すると、ＧａｌＮＡｃ抱合型ＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡを用いた処置の９６時間後のマウスの血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍＬ）は、生理食塩水を投与した対照処置群と比較された。対応のある両側Ｔ検定アルゴリズムを使用して統計解析を適用した。結果は、ＧａｌＮＡｃ抱合型湾曲ｓｉＲＮＡで処置されたマウスの平均血漿ＡｐｏＢレベルが、対照と比較して実質的に減少したことを示す。ただし、有意性が不足し（ｐ＝０．１１）、最も可能性の高い理由は、サンプルサイズが小さいことと、対照動物間でのＡｐｏＢレベルのばらつきが小さいことである。
図１（ｂ）を参照すると、ＧａｌＮＡｃ抱合型ＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡの投与後９６時間で測定した血漿ＡｐｏＢレベル（マイクログラム／ｍｌ）は、非抱合型（ＧａｌＮＡｃを含まない）ＡｐｏＢ湾曲ｓｉＲＮＡのｓｉＲＮＡ構築物で処置した対照群と比較された。対応のある両側Ｔ検定アルゴリズムを使用して統計解析を適用した。
結果は、このＧａｌＮＡｃ抱合型湾曲ｓｉＲＮＡ処置群の血漿ＡｐｏＢレベルが、湾曲のある対照の非抱合型ｓｉＲＮＡと比較して著しく減少したことを示す（Ｐ＝０．００４３５８３２）。
当方の最適化アッセイは、特定のＴａｑＭａｎプローブを使用するＲＴ－ｑＰＣＲによって、ＨｅｐＧ２細胞においてＬＰ（ａ）ｍＲＮＡを検出できないことを実証した。最も可能性の高い説明は、ＬＰ（ａ）がＨｅｐＧ２で表現されていないことであり、これは公開されている発現データと一致している（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１９８６７０－ＬＰ（Ａ）／ｃｅｌｌ）。ＲＴ４細胞株は、高レベルのＬＰ（ａ）を発現することが報告されていて、従って、この細胞株は、ＬＰ（ａ）発現レベルの研究にとってのその適合性について評価された。
毒性ｓｉＴＯＸおよびＯＮ ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｓｉＲＮＡ非標的化または標的化ＰＬＫ１、ＬＰ（ａ）またはＰＣＳＫ９でＲＴ４細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞生存率（図２）またはＬＰ（ａ）およびＰＣＳＫ９発現（図３）を評価するために、細胞を処理した。必須遺伝子ＰＬＫ１を標的にするｓｉＴＯＸおよびｓｉＲＮＡによって誘発されたロバストな細胞死（図２）は、高いトランスフェクション効率を示す。これは、対応するＯＴ＋ ｓｉＲＮＡを用いた処置後のＰＣＳＫ９およびＬＰ（ａ）発現の減少によってさらに確認されている（図３）。ＬＰ（ａ）ｍＲＮＡはＴａｑＭａｎプローブによって容易に検出されることができ、遺伝子がＲＴ４で発現されることが確認された。これらの結果は、ＲＴ４がＬＰ（ａ）湾曲ｓｉＲＮＡライブラリーを評価するのに適切なモデルであることを示唆する。
各アッセイプレートにおいて、ＨｅｐＧ２をＯＴ＋ ｓｉＲＮＡ非標的化でトランスフェクトし、必須遺伝子ＰＬＫ１または標的化ＬＰ（ａ）を標的にした。ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡを用いた処置後の高レベルの細胞死は、トランスフェクション効率を示す（図４）。有意であるが、ＬＰ（ａ） ＯＴ＋ ｓｉＲＮＡを用いた処置後のＬＰ（ａ）発現の減少は、ほんのわずかであった（図５）。
ＲＴ４中のＬＰ（ａ）およびＮＥＧ対照を標的にする湾曲ｓｉＲＮＡによって誘発された毒性は、ＨｅｐＧ２で観察されたものよりも実質的に高かった。これは、ＧＡＰＤＨ ＣＴ値によって説明されることができる（図６）。この毒性は、データ品質と、従ってｓｉＲＮＡ処置後のＬＰ（ａ）発現の変化を計算するために使用されるデータの能力とを大きく損なう。これに対処し、データを明確に提示できるようにするために、ＧＡＰＤＨ ＣＴ値が０．３９ｎＭでの処置と２５ｎＭでの処置（９０％を超える細胞数の減少に対応する）との間で３．５以上増加する時に、対応するｓｉＲＮＡのｍＲＮＡレベルを分析しないことが決定された。このプロセスは、２つのＮＥＧ対照と、１６個の湾曲ｓｉＲＮＡのうち６つからデータを排除することにつながった。比較すると、ＰＣＳＫ９を標的にする湾曲ｓｉＲＮＡは、ＨｅｐＧ２細胞において３を超えるＧＡＰＤＨ ＣＴの増加をもたらさなかった。
無毒性であるか、または限定的な毒性を示す１０個のＬＰ（ａ）湾曲ｓｉＲＮＡについて測定されたノックダウン活性を図７に示す。全体的に、ＬＰ（ａ）を標的にするｓｉＲＮＡのノックダウン効率は、ＨｅｐＧ２細胞株で試験されたＰＣＳＫ９を標的にするｓｉＲＮＡに比べて、同じ用量では有効ではなかった。
ＬＰ７、ＬＰ１１、およびＬＰ１２は、２５ｎＭで５０％を超えるノックダウン効率を示した。このレベルのノックダウンは、ＬＰ（ａ）を標的にするＯｎＴＡＲＧＥＴ Ｐｌｕｓ ｓｉＲＮＡについて観察されたものよりも実質的に良好であるようである。
インビボでのＰＣＳＫ９のサイレンシング
図８を参照すると、インビボでのマウス試験が実施され、ＧａｌＮＡｃ抱合型湾曲抗マウスＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ（化合物Ｈ）のノックダウン活性が、その「非湾曲」ｓｉＲＮＡ対照（化合物Ａ）と比較されて評価された（図９を参照）。成体オス野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、試験ｓｉＲＮＡ化合物を２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかで、皮下（ＳＣ）注射により投与した（１処置群当たり５つの複製）。５つの複製物の媒体（ＰＢＳ）群は、陰性対照の役目を果たした。
４８時間後、マウスを犠牲にし、「材料および方法」の項に記載の通りに、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの定量のために肝臓全体を採取した。
化合物Ｈ（２ｍｇ／ｋｇ）は、化合物Ａおよび媒体対照と比較して、ＳＣ注射の４８時間後の肝臓ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのおよそ５０％ノックダウンを示す。対応のある両側Ｔ検定アルゴリズムを使用して統計解析を適用した。
結果は、ＧａｌＮＡｃ抱合型ＰＣＳＫ９湾曲ｓｉＲＮＡ処置群（Ｈ）での肝臓ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ血漿が、ＧａｌＮＡｃ抱合型ＰＣＳＫ９「非湾曲」ｓｉＲＮＡ処置群（Ａ）および媒体（ＰＢＳ）対照と比較して、非常に有意に減少したことを示す（ｐ＜０．００１ 対 対照）。
表５を参照すると、ＡｐｏＣ３を標的にする１０個の「湾曲」ｓｉＲＮＡ（表４に列挙）のカスタムライブラリーを評価するために、ＨｅｐＧ２細胞におけるＲＮＡｉスクリーニングが実施された。ＨｅｐＧ２細胞は、１０個のｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトされた。トランスフェクションの７２時間後に、ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルを二重ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化し、ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルをハウスキーピング参照遺伝子ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。全体的に、すべてのｓｉＲＮＡ配列（ＡｐｏＣ３－０１～ＡｐｏＣ３－１０）は、無処置の場合と比べて、２５および６．２５ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で８０％以上のノックダウンを示した。５つの配列（ＡｐｏＣ３－０１、ＡｐｏＣ３－０５、ＡｐｏＣ３－０７、ＡＰＯＣ３－０９、ＡＰＯＣ３－１０）は、無処置の対照と比較して、２５ｎＭで９５％ＫＤ超を示した。
表５ 湾曲ｓｉＲＮＡの４点４倍希釈系列での７２時間のトランスフェクション後の、ＨｅｐＧ２細胞における無処置対照と比較したインビトロでのＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡのノックダウン％。
表６を参照すると、ＤＧＡＴ２を標的にする１０個の「湾曲」ｓｉＲＮＡ（表４に列挙）のカスタムライブラリーを評価するために、ＨｅｐＧ２細胞におけるＲＮＡｉスクリーニングが実施された。ＨｅｐＧ２細胞は、１０個のｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトされた。トランスフェクションの７２時間後に、ＤＧＡＴ２ ｍＲＮＡレベルを二重ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化し、ＤＧＡＴ２ ｍＲＮＡレベルをハウスキーピング参照遺伝子ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。４つのｓｉＲＮＡ配列（ＤＧＡＴ２－０１、ＤＧＡＴ２－０４、ＤＧＡＴ２－０９、ＤＧＡＴ２－１０）は、最高用量（２５ｎＭ）でＤＧＡＴ２ ｍＲＮＡの８０％超のノックダウンを示した。
表６ 湾曲ｓｉＲＮＡの４点４倍希釈系列での７２時間のトランスフェクション後の、ＨｅｐＧ２細胞における無処置対照と比較したＤＧＡＴ２ ｍＲＮＡのノックダウン％
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Claims (33)

  1. 核酸分子であって、
    センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第一の部分と、
    一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第二の部分とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子の前記５’末端が前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記センス鎖の前記３’末端に共有結合されているか、または前記一本鎖ＤＮＡ分子の前記５’末端が前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の３’に共有結合されていて、二本鎖阻害性ＲＮＡが心血管疾患に関連した心血管遺伝子標的の一部をコードするセンスヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、前記遺伝子標的がアポリポタンパク質Ｂおよびプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型またはその多型配列バリアントではなく、前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記一本鎖ＤＮＡの一部と相補的塩基対合することによってアニールしてステムドメインおよびループドメインを含む二本鎖ＤＮＡ構造を形成するようにその長さの少なくとも一部にわたって適合されたヌクレオチド配列を含み、前記核酸分子がＮ－アセチルガラクトサミンを含み、かつ、前記二本鎖阻害性ＲＮＡが天然ヌクレオチドから成ることを特徴とする、核酸分子。
  2. 前記ループドメインが、ヌクレオチド配列ＧＣＧＡＡＧＣを含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記一本鎖ＤＮＡ分子が、ヌクレオチド配列ＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＧＣ（配列番号２５１）を含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 前記阻害性ＲＮＡ分子が、２ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 前記センス鎖および／または前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 前記一本鎖ＤＮＡ分子が、一つ以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 前記核酸分子がビニルホスホネート修飾を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  8. 前記ビニルホスホネート修飾が、前記センスＲＮＡ鎖の５’末端リン酸塩に対するものである、請求項７に記載の核酸分子。
  9. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、長さ１９～２３個のヌクレオチドである、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 前記心血管遺伝子標的がヒトリポタンパク質（ａ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  11. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４から成る群から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
  12. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号４１を含むアンチセンスヌクレオチド配列と、配列番号４９を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記センス鎖の前記３’末端に共有結合されている、請求項１０に記載の核酸分子。
  13. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号４を含むアンチセンスヌクレオチド配列と、配列番号４４を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の前記３’末端に共有結合されている、請求項１０に記載の核酸分子。
  14. 前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号５を含むアンチセンスヌクレオチド配列と、配列番号４６を含むセンスヌクレオチド配列とを含み、前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記二本鎖阻害性ＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の前記３’末端に共有結合されている、請求項１０に記載の核酸分子。
  15. 前記心血管遺伝子標的が、ヒトアポリポタンパク質Ｃ ＩＩＩ（Ａｐｏ Ｃ ＩＩＩ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  16. 核酸分子が、配列番号６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１５に記載の核酸分子。
  17. 前記核酸分子が、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１５に記載の核酸分子。
  18. 前記核酸分子が、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１５に記載の核酸分子。
  19. 前記心血管遺伝子標的が、ヒトジグリセリドアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  20. 前記核酸が、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１９に記載の核酸分子。
  21. 前記核酸が、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１９に記載の核酸分子。
  22. 前記核酸が、配列番号９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ鎖を含む、請求項１９に記載の核酸分子。
  23. Ｎ－アセチルガラクトサミンが、前記阻害性ＲＮＡのアンチセンス部分または前記阻害性ＲＮＡのセンス部分のいずれかに結合されている、請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  24. Ｎ－アセチルガラクトサミンが、一価、二価、または三価である、請求項２３に記載の核酸分子。
  25. 前記核酸分子が、以下の構造を含むＮ－アセチルガラクトサミン分子に共有結合されている、請求項２３または請求項２４に記載の核酸分子。
  26. 前記核酸分子が、以下の構造を含むＮ－アセチルガラクトサミン分子に共有結合されている、請求項２３または請求項２４に記載の核酸分子。
  27. 前記核酸分子が、以下の構造を含むＮ－アセチルガラクトサミン分子に共有結合されている、請求項２３または請求項２４に記載の核酸分子。
  28. 前記核酸分子が、以下の構造を含むＮ－アセチルガラクトサミン分子に共有結合されている、請求項２３または請求項２４に記載の核酸分子。
  29. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の少なくとも一つの核酸分子を含む、医薬組成物。
  30. 高コレステロール血症もしくは高コレステロール血症に関連する疾患を有するか、または高コレステロール血症もしくは高コレステロール血症に関連する疾患にかかりやすい対象の治療または予防に使用する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の核酸分子または医薬組成物。
  31. 高コレステロール血症が、家族性高コレステロール血症である、請求項３０に記載の使用のための核酸分子または医薬組成物。
  32. 高コレステロール血症に関連する前記疾患が、脳卒中予防、高脂血症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈性心疾患、大動脈弁狭窄症、脳血管疾患、末梢動脈疾患、高血圧、代謝症候群、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、バージャー病、腎動脈狭窄症、高アポβリポタンパク血症、脳血管アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、静脈血栓症から成る群から選択される、請求項３０または請求項３１に記載の使用のための核酸分子または医薬組成物。
  33. 高コレステロール血症を有するか、または高コレステロール血症にかかりやすい対象を治療する方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸または医薬組成物の有効用量を投与し、それによって高コレステロール血症を治療または予防することを含む、方法。
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