JP2024075766A - Gmpレベルの無血清懸濁液細胞を用いるレンチウイルスの大規模製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】GMPレベルの無血清懸濁細胞を用いることによるレンチウイルスの大規模製造方法を提供する。【解決手段】(a)パッケージング細胞のシード溶液を提供する工程;(b)前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種する工程;(c)前記パッケージング細胞を継代培養する工程;(d)液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程;(e)工程(c)および(d)をn回繰り返す工程;(f)トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を開始する工程;(h)前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を継代培養する工程;(i)液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程;(j)工程(h)および(i)をm回繰り返す工程;(k)回収された液体を混合する工程;及び(l)精製処理を行う工程を含む。【選択図】なし
Description
本発明は、生物学の技術分野に関し、特にGMPレベルの無血清懸濁細胞を用いること
によるレンチウイルスの大規模製造方法に関する。
によるレンチウイルスの大規模製造方法に関する。
遺伝子治療とは、外因性の治療遺伝子を標的細胞に導入して、遺伝子の欠陥や異常によ
って引き起こされる疾患を是正したり、補償したりすること、あるいは外因性遺伝子によ
って発現される製品を介して疾患標的に作用して治療の目的を達成することをいう。
って引き起こされる疾患を是正したり、補償したりすること、あるいは外因性遺伝子によ
って発現される製品を介して疾患標的に作用して治療の目的を達成することをいう。
一般的な組換えレンチウイルスベクターは、HIV-1(ヒト免疫不全ウイルス-1:
human immunodeficiency virus-1)に基づいて開発された
遺伝子治療ベクターである。一般的なレトロウイルスベクターとは異なり、組換えレンチ
ウイルスベクターは、***細胞および非***細胞の両方に感染する能力を有する。組換え
レンチウイルスベクターは、インビボおよびインビトロでの高い生物学的力価、低い免疫
原性および他の利点のために、CART細胞および遺伝子治療のための好ましいトランス
ジェニックベクターとなっている。
human immunodeficiency virus-1)に基づいて開発された
遺伝子治療ベクターである。一般的なレトロウイルスベクターとは異なり、組換えレンチ
ウイルスベクターは、***細胞および非***細胞の両方に感染する能力を有する。組換え
レンチウイルスベクターは、インビボおよびインビトロでの高い生物学的力価、低い免疫
原性および他の利点のために、CART細胞および遺伝子治療のための好ましいトランス
ジェニックベクターとなっている。
成熟HIV-1ウイルスは100~120nmの直径であり、二十面体対称構造を有し
、球形である。均一な密な円錐形のコアが電子顕微鏡下で見られる。ウイルスのRNA分
子と酵素を含む。後者には、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼが含まれる
。HIV-1の最外層はリポ蛋白エンベロープである。エンベロープには、表面タンパク
質(gp120)と固有タンパク質(gp41)の2つの糖タンパク質が含まれている。
gp120はスパイクであり、gp41は膜貫通タンパク質である。エンベロープの内側
表面はP17からなるマトリックスであり、エンベロープの内側はカプシドタンパク質(
P24)によって包まれたRNAOである。
、球形である。均一な密な円錐形のコアが電子顕微鏡下で見られる。ウイルスのRNA分
子と酵素を含む。後者には、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼが含まれる
。HIV-1の最外層はリポ蛋白エンベロープである。エンベロープには、表面タンパク
質(gp120)と固有タンパク質(gp41)の2つの糖タンパク質が含まれている。
gp120はスパイクであり、gp41は膜貫通タンパク質である。エンベロープの内側
表面はP17からなるマトリックスであり、エンベロープの内側はカプシドタンパク質(
P24)によって包まれたRNAOである。
現在の組換えレンチウイルスベクターは、遺伝子改変法を用いて、レンチウイルスゲノ
ム中のパッケージングシグナルおよび標的遺伝子の転写エレメントのみを残し、逆転写酵
素、エンベロープ蛋白質VSVG、gag/pol、rev、tatおよび他の構造的ま
たは調節的遺伝子を異なるベクター上に分散させ、一方、組換えレンチウイルスベクター
の安全性を確保するために病原性遺伝子を欠失させる。
ム中のパッケージングシグナルおよび標的遺伝子の転写エレメントのみを残し、逆転写酵
素、エンベロープ蛋白質VSVG、gag/pol、rev、tatおよび他の構造的ま
たは調節的遺伝子を異なるベクター上に分散させ、一方、組換えレンチウイルスベクター
の安全性を確保するために病原性遺伝子を欠失させる。
HEK293Tはヒトの腎性エピリウムに由来する細胞株である。アデノウイルスE1
A遺伝子のトランスフェクションによりHEK 293細胞株から得られ、SV40のラ
ージT抗原、及びSV40を含む複製起点とプロモーター領域を発現することができる。
SV40ウイルスを含む複製原産地のユーカリ発表現ベクトルはHEK 293Tセルに
おける効率的な複製と転写を達成し、それにより外来遺伝子の表現レベルを増加させるこ
とができる。したがって、HEK293T細胞はレンチウイルスパッケージングに広く使
用されており、高力価のレンチウイルス供給液を得ることができる。
A遺伝子のトランスフェクションによりHEK 293細胞株から得られ、SV40のラ
ージT抗原、及びSV40を含む複製起点とプロモーター領域を発現することができる。
SV40ウイルスを含む複製原産地のユーカリ発表現ベクトルはHEK 293Tセルに
おける効率的な複製と転写を達成し、それにより外来遺伝子の表現レベルを増加させるこ
とができる。したがって、HEK293T細胞はレンチウイルスパッケージングに広く使
用されており、高力価のレンチウイルス供給液を得ることができる。
しかしながら、レンチウィルス作製のための細胞株としてのHEK293T細胞には、
以下の問題点が依然として存在する。1)大型T抗原は潜在的な発がん性リスクを有して
おり、下流工程が効果的に除去できなければ、臨床治療には一定のリスクがあり、大型T
抗原には一定の免疫性があるため、臨床治療の難易度を高めることになる;2)HEK2
93Tは接着細胞であり、細胞工場やスピナーボトル生産による工業化は困難である;3
)壁への付着力が弱く、マイクロキャリア技術を用いた場合、細胞が脱落しやすく、毒素
生産効率が著しく低下する。
以下の問題点が依然として存在する。1)大型T抗原は潜在的な発がん性リスクを有して
おり、下流工程が効果的に除去できなければ、臨床治療には一定のリスクがあり、大型T
抗原には一定の免疫性があるため、臨床治療の難易度を高めることになる;2)HEK2
93Tは接着細胞であり、細胞工場やスピナーボトル生産による工業化は困難である;3
)壁への付着力が弱く、マイクロキャリア技術を用いた場合、細胞が脱落しやすく、毒素
生産効率が著しく低下する。
さらに、懸濁細胞に基づいてレンチウイルスを生成するためのいくつかの技術が開発さ
れているが、既存の産生方法は依然としていくつかの欠点を有する。例えば、それらは大
規模生産には適しておらず、GMP生産の厳しい要件をほとんど満たすことができず、生
産されたウイルスは低い力価を有する。
れているが、既存の産生方法は依然としていくつかの欠点を有する。例えば、それらは大
規模生産には適しておらず、GMP生産の厳しい要件をほとんど満たすことができず、生
産されたウイルスは低い力価を有する。
したがって、この分野において、無血清および懸濁培養下で細胞をパッケージングする
ことによって、大規模にレンチウイルスを効率的に産生することができる方法を開発する
緊急の必要性が存在する。
ことによって、大規模にレンチウイルスを効率的に産生することができる方法を開発する
緊急の必要性が存在する。
本発明の目的は、無血清および懸濁培養下で細胞をパッケージングすることによって、
大規模にレンチウイルスを効率的に産生するための方法を提供することである。
大規模にレンチウイルスを効率的に産生するための方法を提供することである。
本発明の第1の態様において、無血清懸濁細胞からレンチウイルスを製造するための方
法が提供される。当該方法以下の工程を含む:
(a) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程で
あって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該
工程;
(b) 前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種して、第1培養物を得る工程で
あって、前記第1培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が1×106~5×106
細胞/mlであり、および前記第1培養液の体積が3~100Lである、該工程;
(c) 前記第1培養物を、温度30~38℃、溶存酸素35~55%、CO2濃度2~1
0%、pH6.9~7.4の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養し;継代培養
工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアルタイム
pH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値を6.
9~7.4に維持する工程;
(d) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、
前記液体交換トリガ条件が
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは
7.05以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リ
アルタイムpH値は依然として下降傾向を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出し、ここで、前記
上清の排出前における前記培養物の体積をVq1とし、前記上清の排出後における前記培
養物の体積をVh1とした場合に、Vq1/Vh1比が3~15であり;次いで、前記培
養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程
;
(e) 工程(c)および(d)をn回繰り返す工程であって、nが1、2または3である
、該工程;
(f) トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を
開始する工程であって、前記トランスフェクショントリガ条件が
(t1)総細胞量が0.05~2×1011細胞であること;
(t2)細胞濃度が0.5~5×106細胞/mlであること;
(t3)細胞の生存率が90%以上であること;
(t4)総培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミド
およびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、
前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成す
ることを含む、該工程;
(g) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程;
(h) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度30~37℃、溶存酸
素35~55%、CO2濃度2~10%、pH6.9~7.4の条件下で継代培養し;継
代培養工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアル
タイムpH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値
を6.9~7.4に維持する工程;
(i) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程で
あって、前記液体交換トリガー条件は以下を含む:
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リ
アルタイムpH値は依然として減少を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
ここで、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収すること
を含み、前記供給液の回収前における培養物の体積をVq2とし、上清の回収後における
培養物の体積をVh2とした場合に、Vq2/Vh2比が3~15である、該工程;
(j) 工程(h)および(i)をm回繰り返す工程であって、mが1、2または3であり
、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養
物を形成する、該工程;
(k) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程;
(l) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程。
法が提供される。当該方法以下の工程を含む:
(a) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程で
あって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該
工程;
(b) 前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種して、第1培養物を得る工程で
あって、前記第1培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が1×106~5×106
細胞/mlであり、および前記第1培養液の体積が3~100Lである、該工程;
(c) 前記第1培養物を、温度30~38℃、溶存酸素35~55%、CO2濃度2~1
0%、pH6.9~7.4の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養し;継代培養
工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアルタイム
pH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値を6.
9~7.4に維持する工程;
(d) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、
前記液体交換トリガ条件が
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは
7.05以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リ
アルタイムpH値は依然として下降傾向を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出し、ここで、前記
上清の排出前における前記培養物の体積をVq1とし、前記上清の排出後における前記培
養物の体積をVh1とした場合に、Vq1/Vh1比が3~15であり;次いで、前記培
養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程
;
(e) 工程(c)および(d)をn回繰り返す工程であって、nが1、2または3である
、該工程;
(f) トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を
開始する工程であって、前記トランスフェクショントリガ条件が
(t1)総細胞量が0.05~2×1011細胞であること;
(t2)細胞濃度が0.5~5×106細胞/mlであること;
(t3)細胞の生存率が90%以上であること;
(t4)総培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミド
およびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、
前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成す
ることを含む、該工程;
(g) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程;
(h) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度30~37℃、溶存酸
素35~55%、CO2濃度2~10%、pH6.9~7.4の条件下で継代培養し;継
代培養工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアル
タイムpH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値
を6.9~7.4に維持する工程;
(i) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程で
あって、前記液体交換トリガー条件は以下を含む:
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リ
アルタイムpH値は依然として減少を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
ここで、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収すること
を含み、前記供給液の回収前における培養物の体積をVq2とし、上清の回収後における
培養物の体積をVh2とした場合に、Vq2/Vh2比が3~15である、該工程;
(j) 工程(h)および(i)をm回繰り返す工程であって、mが1、2または3であり
、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養
物を形成する、該工程;
(k) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程;
(l) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程。
ここで、上記各工程で用いられる培養液は、無血清細胞培養液である。
別の好ましい実施形態では、工程(d)において、パッケージング細胞培養物の体積は
Vb1であり、Vb1: Vq1比は(0.8~1.2):1である。
Vb1であり、Vb1: Vq1比は(0.8~1.2):1である。
別の好ましい実施形態では、工程(j)において、トランスフェクション細胞培養物の
体積はVb2であり、Vb2: Vq2比は(0.8~1.2):1である。
体積はVb2であり、Vb2: Vq2比は(0.8~1.2):1である。
別の好ましい実施形態において、工程(c)および/または(h)において、培養は、
振盪条件下で行われる。
振盪条件下で行われる。
別の好ましい実施形態では、上記振盪条件は、毎分10~30回、前後に揺動させるこ
とである。
とである。
別の好ましい実施形態では、各揺動の振幅が1~20cm、好ましくは5~10cmで
ある。
ある。
別の好ましい実施形態において、異なる工程で添加される培養溶液は、同じであり、ま
たは異なる培養溶液である。
たは異なる培養溶液である。
別の好ましい実施形態では、工程(c)および/または(h)において、pH値は7.
0~7.35の範囲に維持される。
0~7.35の範囲に維持される。
別の好ましい実施形態では、工程(c)および/または(h)において、溶存酸素は3
0%~50%の範囲に維持される。
0%~50%の範囲に維持される。
別の好ましい実施形態では、工程(c)および/または(h)において、CO2濃度は
3%~5%に維持される。
3%~5%に維持される。
別の好ましい実施形態では、工程(d)および/または(i)において、Vq1/Vh
1比は5:10である。
1比は5:10である。
別の好ましい実施形態において、工程(c)、(d)および(e)の合計時間は、(ト
ランスフェクション前)72~216時間である。
ランスフェクション前)72~216時間である。
別の好ましい実施形態において、工程(f)、(g)、(h)、(i)および(j)の
合計時間は、(トランスフェクション後)72~120時間である。
合計時間は、(トランスフェクション後)72~120時間である。
別の好ましい実施形態において、工程(f)において、使用されるマルチプラスミドト
ランスフェクション(multi-plasmid transfection)は、3
プラスミドトランスフェクションおよび4プラスミドトランスフェクションを含む。
ランスフェクション(multi-plasmid transfection)は、3
プラスミドトランスフェクションおよび4プラスミドトランスフェクションを含む。
別の好ましい実施形態において、4プラスミドトランスフェクションは、プラスミドC
AR、gag/pol、revおよびVSVGを使用するトランスフェクションである。
AR、gag/pol、revおよびVSVGを使用するトランスフェクションである。
別の好ましい実施形態では、培養容器は、使い捨て培養容器である。
別の好ましい実施形態では、培養容器の容積が20~120L、好ましくは30~10
0L、より好ましくは50~80Lである。
0L、より好ましくは50~80Lである。
別の好ましい実施形態において、混合ウイルス含有上清に含まれるウイルスの総数は、
1×1012Tuである。
1×1012Tuである。
別の好ましい実施形態において、混合ウイルス含有上清中のウイルス力価は、8×10
7Tu/mlである。
7Tu/mlである。
別の好ましい実施形態において、パッケージング細胞は、ヒト胚性腎上皮細胞(hum
an embryonic renal epithelial cells)である。
an embryonic renal epithelial cells)である。
別の好ましい実施形態において、パッケージング細胞は、ヒト胚性腎上皮細胞HEK2
93Fまたはそれに由来する細胞である。
93Fまたはそれに由来する細胞である。
別の好ましい実施形態において、無血清培地がLV-MAX(商標)生産培地(Gib
co(商標))である。
co(商標))である。
別の好ましい実施形態では、工程(l)において、精製は限外濾過およびクロマトグラ
フィーを含む。
フィーを含む。
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下に詳細に説明する技術的特徴
(例えば、実施形態)を互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成
することができることを理解されたい。スペースの制約のため、ここでは説明しない。
(例えば、実施形態)を互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成
することができることを理解されたい。スペースの制約のため、ここでは説明しない。
詳細説明
広範かつ詳細な研究の後、製造プロセスへの探索およびプロセスパラメータのスクリー
ニングを通して、本発明者らは、大規模なGMPレベルの無血清懸濁細胞からレンチウイ
ルスを製造するための方法を開発した。本発明により提供される方法は、50リットル以
上の大規模生産に適しているだけでなく、極めて効率的な様式で高力価レンチウイルスを
調製する。さらに、全プロセスが無血清培養条件を採用するので、この方法は、血清の使
用による動物ベースのタンパク質および他の汚染物質の導入の危険性を回避する。さらに
、本発明によって提供される方法によって産生されるレンチウイルスのバッチ間の変動は
極めて小さく、これは産生品質のためのGMP産生の高い要件を満たし得る。これにより
、本発明が完成する。
広範かつ詳細な研究の後、製造プロセスへの探索およびプロセスパラメータのスクリー
ニングを通して、本発明者らは、大規模なGMPレベルの無血清懸濁細胞からレンチウイ
ルスを製造するための方法を開発した。本発明により提供される方法は、50リットル以
上の大規模生産に適しているだけでなく、極めて効率的な様式で高力価レンチウイルスを
調製する。さらに、全プロセスが無血清培養条件を採用するので、この方法は、血清の使
用による動物ベースのタンパク質および他の汚染物質の導入の危険性を回避する。さらに
、本発明によって提供される方法によって産生されるレンチウイルスのバッチ間の変動は
極めて小さく、これは産生品質のためのGMP産生の高い要件を満たし得る。これにより
、本発明が完成する。
用語
本明細書において、「本発明のパッケージング細胞」、「パッケージング細胞HEK2
93F」、および「本発明のパッケージング細胞HEK293F」という用語は、それぞ
れ交換可能に使用されることができ、本発明の第1の態様において記載され、レンチウイ
ルスをパッケージングおよび産生するために使用される細胞を意味する。
本明細書において、「本発明のパッケージング細胞」、「パッケージング細胞HEK2
93F」、および「本発明のパッケージング細胞HEK293F」という用語は、それぞ
れ交換可能に使用されることができ、本発明の第1の態様において記載され、レンチウイ
ルスをパッケージングおよび産生するために使用される細胞を意味する。
パッケージング細胞およびパッケージングシステム
本発明において、使用可能なレンチウイルスパッケージング系は特に限定されないが、
好ましくは、3プラスミドおよび4プラスミド系を使用することができる。
本発明において、使用可能なレンチウイルスパッケージング系は特に限定されないが、
好ましくは、3プラスミドおよび4プラスミド系を使用することができる。
特に好ましいパッケージング系は、HIV-1に由来するレンチウイルスベクターを使
用するものであって、ここで、4プラスミド系が3プラスミド系の代わりに使用され、t
at調節遺伝子がノックアウトされ、そしてgag/polおよびrevキャリアプラス
ミドが1つから2つに分割され、それによって、複製ウイルスを生成する可能性を減少さ
せ、そしてベクター系の安全性を大幅に増加させる。
用するものであって、ここで、4プラスミド系が3プラスミド系の代わりに使用され、t
at調節遺伝子がノックアウトされ、そしてgag/polおよびrevキャリアプラス
ミドが1つから2つに分割され、それによって、複製ウイルスを生成する可能性を減少さ
せ、そしてベクター系の安全性を大幅に増加させる。
本発明の好ましい実施形態において、レンチウイルス産生のための4プラスミド系を使
用することによって、レンチウイルス製品の安全性および信頼性がさらに保証される。
用することによって、レンチウイルス製品の安全性および信頼性がさらに保証される。
本発明は、以下の主な利点を有する:
(a)本発明の細胞は、自動制御システムを用いることでスケールアップすることができる
懸濁培養細胞であり、それにより、組換えレンチウイルスベクター供給液を大規模に生産
することができ、生産コストを制御下に置くことができる。
(a)本発明の細胞は、自動制御システムを用いることでスケールアップすることができる
懸濁培養細胞であり、それにより、組換えレンチウイルスベクター供給液を大規模に生産
することができ、生産コストを制御下に置くことができる。
(b)本発明の細胞培養プロセスは、一回培養技術を採用し、無血清および無タンパク質培
地を使用するものであり、これによって最終産物における異種タンパク質および狂牛病ウ
イルスの汚染の危険性を排除し、そして産物の臨床適用の安全性を大幅に改善することが
できる。そのため、細胞または遺伝子医薬の産生において使用される。
地を使用するものであり、これによって最終産物における異種タンパク質および狂牛病ウ
イルスの汚染の危険性を排除し、そして産物の臨床適用の安全性を大幅に改善することが
できる。そのため、細胞または遺伝子医薬の産生において使用される。
以下、本発明を特定の実施形態に関連してさらに説明する。これらの実施形態は本発明
を例示することを意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものでは
ないことを理解されたい。以下の実施形態における特定の条件を伴わない実験方法は一般
に、従来の条件、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:
Laboratory Manual(New York: Cold Spring Har
bor Laboratory Press,1989)等に記載される条件に従うか、また
は製造業者によって推奨される条件に従う。特に断らない限り、百分率および部は、重量
百分率および重量部である。
を例示することを意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものでは
ないことを理解されたい。以下の実施形態における特定の条件を伴わない実験方法は一般
に、従来の条件、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:
Laboratory Manual(New York: Cold Spring Har
bor Laboratory Press,1989)等に記載される条件に従うか、また
は製造業者によって推奨される条件に従う。特に断らない限り、百分率および部は、重量
百分率および重量部である。
<一般的な方法及び材料>
培地:明確な化学組成を有する無血清および無タンパク質培地
培養条件:CO23~5%;温度30~37℃
(1)トランスフェクション試薬の調製:
a) 1×HBS (pH7.4):8.76gのNaClを900mlの超純水に溶解し、
20mlの1M HEPESを添加し、pH値を7.4に調整し、容量を1Lに設定し、
濾過し(0.2μm濾過膜)、後の使用のために4℃で保存した;
b) PEI粉末125mgを量り、1×HBS(pH7.4)50mlに溶かし、0.2
μmのろ過膜でろ過し、4℃で保存して使用した。
培地:明確な化学組成を有する無血清および無タンパク質培地
培養条件:CO23~5%;温度30~37℃
(1)トランスフェクション試薬の調製:
a) 1×HBS (pH7.4):8.76gのNaClを900mlの超純水に溶解し、
20mlの1M HEPESを添加し、pH値を7.4に調整し、容量を1Lに設定し、
濾過し(0.2μm濾過膜)、後の使用のために4℃で保存した;
b) PEI粉末125mgを量り、1×HBS(pH7.4)50mlに溶かし、0.2
μmのろ過膜でろ過し、4℃で保存して使用した。
<実施例1>
レンチウイルスの大規模生産方法:
本発明は、GMPレベルの無血清懸濁細胞を使用することによるレンチウイルスの大規
模生産のための方法を提供するものである。
レンチウイルスの大規模生産方法:
本発明は、GMPレベルの無血清懸濁細胞を使用することによるレンチウイルスの大規
模生産のための方法を提供するものである。
本発明によって提供される方法は、以下の工程を含む:
(a) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程で
あって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該
工程;
(b) 前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種して、第1培養物を得る工程であ
って、前記第1培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が1×106~5×106細
胞/mlであり、および前記第1培養液の体積が所定の大容量(例えば、3~100L)
である、該工程;
(c) 前記第1培養物を、温度30~38℃、溶存酸素35~55%、CO2濃度2~10
%、pH6.9~7.4の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養する工程;
(d) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、前
記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出すること;次いで、前
記培養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該
工程;
(e)工程(c)および(d)をn回繰り返す工程であって、nが1、2または3である、
該工程;
(f)トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を
開始する工程であって、前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生の
ための産生プラスミドおよびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添
加し、それによって、前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケ
ージング細胞を形成することを含む、該工程;
(g) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程;
(h) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度30~37℃、溶存酸素
35~55%、CO2濃度2~10%、pH6.9~7.4の条件下で培養する工程;
(i) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程で
あって、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収すること
を含む、該工程;
(j) 工程(h)および(i)をm回繰り返す工程であって、mが1、2または3であり
、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養
物を形成する、該工程;
(k) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程;
(l) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程;
ここで、上記各工程で用いる培養液は、無血清細胞培養液である。
(a) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程で
あって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該
工程;
(b) 前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種して、第1培養物を得る工程であ
って、前記第1培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が1×106~5×106細
胞/mlであり、および前記第1培養液の体積が所定の大容量(例えば、3~100L)
である、該工程;
(c) 前記第1培養物を、温度30~38℃、溶存酸素35~55%、CO2濃度2~10
%、pH6.9~7.4の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養する工程;
(d) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、前
記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出すること;次いで、前
記培養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該
工程;
(e)工程(c)および(d)をn回繰り返す工程であって、nが1、2または3である、
該工程;
(f)トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を
開始する工程であって、前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生の
ための産生プラスミドおよびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添
加し、それによって、前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケ
ージング細胞を形成することを含む、該工程;
(g) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程;
(h) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度30~37℃、溶存酸素
35~55%、CO2濃度2~10%、pH6.9~7.4の条件下で培養する工程;
(i) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程で
あって、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収すること
を含む、該工程;
(j) 工程(h)および(i)をm回繰り返す工程であって、mが1、2または3であり
、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養
物を形成する、該工程;
(k) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程;
(l) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程;
ここで、上記各工程で用いる培養液は、無血清細胞培養液である。
本発明では、液体交換トリガー条件が最適化され、これにより、各生産バッチの品質変
動を低減させることができ、高い力価および高い収率を有する医療グレードのレンチウイ
ルスを得ることができる。典型的には、液体変更トリガ条件は、以下を含む:
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは7
.05以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リア
ルタイムpH値は依然として下降傾向を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること。
動を低減させることができ、高い力価および高い収率を有する医療グレードのレンチウイ
ルスを得ることができる。典型的には、液体変更トリガ条件は、以下を含む:
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは7
.05以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リア
ルタイムpH値は依然として下降傾向を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること。
本発明において、トランスフェクショントリガー条件は最適化され、これにより、各生
産バッチの品質変動を減少させることができ、高い力価および高い収率を有する医療グレ
ードのレンチウイルスを得ることができる。典型的には、トラ(t1)総細胞量が0.0
5~2×1011細胞であること;
(t2)細胞濃度が0.5~5×106細胞/mlであること;
(t3)細胞の生存率が90%以上であること;および
(t4)総培養時間が72時間以上であること。
産バッチの品質変動を減少させることができ、高い力価および高い収率を有する医療グレ
ードのレンチウイルスを得ることができる。典型的には、トラ(t1)総細胞量が0.0
5~2×1011細胞であること;
(t2)細胞濃度が0.5~5×106細胞/mlであること;
(t3)細胞の生存率が90%以上であること;および
(t4)総培養時間が72時間以上であること。
典型的には、本発明の特定の実施形態において、上記方法は、以下のステップを含むも
のとした:
シード溶液の調製;
接種濃度1~5×106細胞/mlの接種(25Lの培養液に接種);
パッケージング細胞の継代培養を行い(この間、pHおよび溶存酸素を用いて、溶存C
O2、窒素、大気の通気比率、さらに液交換の開始様式が自動的に調整すされる)、pH
を6.9~7.4、好ましくは7.0~7.3、より好ましくは7.1~7.2に制御す
る;
第1の液体変化(pHが6.9以下、好ましくは7.0以下である場合、液体変化を開
始することができる)、例えば、25L→2~10L(好ましくは3~7L);
無血清培養液を補充し、24~96時間、好ましくは36~72時間、より好ましくは
40~60時間培養し続け;300時間培養した後、細胞数は5×1010である;
プラスミドを添加し、パッケージング細胞に複数のプラスミドをトランスフェクトする
;
任意選択的な工程:トランスフェクション後、2~10時間、好ましくは4~6時間培
養し、再度、液体交換を行う(まず一定量の培養混合液を排出し、次に無血清培養液を添
加する);
汎用工程:トランスフェクション後、培養を続ける;pHが≦6.9、好ましくは≦7
.0の場合、トランスフェクション後に第1の液体交換を開始することができ、トランス
フェクション後の液体交換中に、排出された液体培養混合物(無細胞ウイルス含有上清)
を回収し、回収液R1として記録し、2~8℃で保存する;
液体交換の後、培養を続ける;液体交換トリガー条件が満たされた場合、トランスフェ
クション後にi番目の液体交換が行われ(ここで、iは2、3、4または5であり)、各
回の液体交換の間、排出された液体培養混合物の無細胞ウイルス含有上清が回収され、回
収液Riとして記録される;この工程を1、2または3回繰り返す;
回収した各液体を混合し、混合ウイルス含有上清を得る;
混合ウイルス含有上清を精製して、1×108~1×109 Tu/mLの力価を有する
精製レンチウイルスベクターを得る。
のとした:
シード溶液の調製;
接種濃度1~5×106細胞/mlの接種(25Lの培養液に接種);
パッケージング細胞の継代培養を行い(この間、pHおよび溶存酸素を用いて、溶存C
O2、窒素、大気の通気比率、さらに液交換の開始様式が自動的に調整すされる)、pH
を6.9~7.4、好ましくは7.0~7.3、より好ましくは7.1~7.2に制御す
る;
第1の液体変化(pHが6.9以下、好ましくは7.0以下である場合、液体変化を開
始することができる)、例えば、25L→2~10L(好ましくは3~7L);
無血清培養液を補充し、24~96時間、好ましくは36~72時間、より好ましくは
40~60時間培養し続け;300時間培養した後、細胞数は5×1010である;
プラスミドを添加し、パッケージング細胞に複数のプラスミドをトランスフェクトする
;
任意選択的な工程:トランスフェクション後、2~10時間、好ましくは4~6時間培
養し、再度、液体交換を行う(まず一定量の培養混合液を排出し、次に無血清培養液を添
加する);
汎用工程:トランスフェクション後、培養を続ける;pHが≦6.9、好ましくは≦7
.0の場合、トランスフェクション後に第1の液体交換を開始することができ、トランス
フェクション後の液体交換中に、排出された液体培養混合物(無細胞ウイルス含有上清)
を回収し、回収液R1として記録し、2~8℃で保存する;
液体交換の後、培養を続ける;液体交換トリガー条件が満たされた場合、トランスフェ
クション後にi番目の液体交換が行われ(ここで、iは2、3、4または5であり)、各
回の液体交換の間、排出された液体培養混合物の無細胞ウイルス含有上清が回収され、回
収液Riとして記録される;この工程を1、2または3回繰り返す;
回収した各液体を混合し、混合ウイルス含有上清を得る;
混合ウイルス含有上清を精製して、1×108~1×109 Tu/mLの力価を有する
精製レンチウイルスベクターを得る。
比較例1
以下の相違点を除いて、実施例1を繰り返した。初期pH値は6.9~7.4であるが
、継代培養プロセスにおいて、第1培養物のリアルタイムpH値はリアルタイムでモニタ
ーされず、代わりに、継代培養は24~96時間で行った。
以下の相違点を除いて、実施例1を繰り返した。初期pH値は6.9~7.4であるが
、継代培養プロセスにおいて、第1培養物のリアルタイムpH値はリアルタイムでモニタ
ーされず、代わりに、継代培養は24~96時間で行った。
結果:300時間培養した後、細胞の数は4×109であった(好ましい実施形態にお
ける細胞の数より少ない)。
ける細胞の数より少ない)。
比較例2
以下の相違点を除いて、実施例1を繰り返した:CO2含有量は調整しない。
以下の相違点を除いて、実施例1を繰り返した:CO2含有量は調整しない。
結果:レンチウイルスの生物学的力価は、好ましい実施形態の20%であった。
本発明において言及される全ての文献は各文献が個々に参照として引用されるかのよう
に、本出願において参照として引用される。さらに、本発明の上記教示内容に基づき、当
業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの等価な形態もまた、
本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解することがで
きる。
に、本出願において参照として引用される。さらに、本発明の上記教示内容に基づき、当
業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの等価な形態もまた、
本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解することがで
きる。
Claims (10)
- 無血清懸濁細胞からレンチウイルスを製造するための方法であって、以下の工程:
(a) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程で
あって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該
工程;
(b) 前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種して、第1培養物を得る工程で
あって、前記第1培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が1×106~5×106
細胞/mlであり、および前記第1培養液の体積が3~100Lである、該工程;
(c) 前記第1培養物を、温度30~38℃、溶存酸素35~55%、CO2濃度2~1
0%、pH6.9~7.4の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養し;継代培養
工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアルタイム
pH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値を6.
9~7.4に維持する工程;
(d) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、
前記液体交換トリガ条件が
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは
7.05以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リ
アルタイムpH値は依然として下降傾向を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出し、ここで、前記
上清の排出前における前記培養物の体積をVq1とし、前記上清の排出後における前記培
養物の体積をVh1とした場合に、Vq1/Vh1比が3~15であり;次いで、前記培
養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程
;
(e) 工程(c)および(d)をn回繰り返す工程であって、nが1、2または3である
、該工程;
(f) トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を
開始する工程であって、前記トランスフェクショントリガ条件が
(t1)総細胞量が0.05~2×1011細胞であること;
(t2)細胞濃度が0.5~5×106細胞/mlであること;
(t3)細胞の生存率が90%以上であること;
(t4)総培養時間が72時間以上であること;
を含み、
前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミド
およびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、
前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成す
ることを含む、該工程;
(g) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程;
(h) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度30~37℃、溶存酸
素35~55%、CO2濃度2~10%、pH6.9~7.4の条件下で継代培養し;継
代培養工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアル
タイムpH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値
を6.9~7.4に維持する工程;
(i) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程で
あって、前記液体交換トリガー条件は以下を含む:
(s1)リアルタイムpH値が、6.9以下であること;
(s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リ
アルタイムpH値は依然として減少を示すこと;および
(s3)継代培養時間が72時間以上であること;
を含み、
ここで、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収すること
を含み、前記供給液の回収前における培養物の体積をVq2とし、上清の回収後における
培養物の体積をVh2とした場合に、Vq2/Vh2比が3~15である、該工程;
(j) 工程(h)および(i)をm回繰り返す工程であって、mが1、2または3であり
、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養
物を形成する、該工程;
(k) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程;
(l) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程;
を含み、上記各工程で用いられる培養液は、無血清細胞培養液である、該方法。 - 工程(c)および/または(h)において、培養が振盪条件下で行われる、請求項1に
記載の方法。 - 工程(c)および/または(h)において、pH値が7.0~7.35の範囲に維持さ
れる、請求項1に記載の方法。 - 工程(d)および/または(i)において、Vq1/Vh1比が5:10である、請求
項1に記載の方法。 - 工程(c)、(d)および(e)の合計時間が72~216時間である、請求項1に記
載の方法。 - 工程(f)において、用いられるマルチプラスミドトランスフェクションが、3プラス
ミドトランスフェクションおよび4プラスミドトランスフェクションを含む、請求項1に
記載の方法。 - 前記培養容器が使い捨て培養容器である、請求項1に記載の方法。
- 前記混合ウイルス含有上清に含まれるウイルスの総数が、1×1012 Tuである、
請求項1に記載の方法。 - 前記パッケージング細胞が、ヒト胚性腎上皮細胞である、請求項1に記載の方法。
- 工程(l)において、前記精製が、限外濾過およびクロマトグラフィーを含む、請求項
1に記載の方法。
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CN107043784A (zh) * | 2016-02-05 | 2017-08-15 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | 一种慢病毒载体的制备方法 |
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