JP6212039B2 - 真核細胞の形質導入に有用なウイルスベースのベクター組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2011年7月27日に出願された米国仮特許出願第61/512、289号の優先権を主張し、その全体を参照することにより本明細書に援用する。
(i)ウイルスベクターの基となるRNAウイルスゲノムの欠損を補完するように産生細胞を形質転換して改変し、該産生細胞をRNAベースのウイルスベクター粒子が産生できるような適切な条件下で培養し、ここで、該形質転換後の上記培養を無血清培地中で行い;及び
(ii)上記RNAベースのウイルスベクター粒子を含む上清を回収することを含む。
好ましくは、本発明にかかる製造方法は酪酸ナトリウムによる誘導工程を含まない。
(i)ベクターの基となるRNAベースのウイルスゲノムの欠損を補完するように産生細胞を形質転換して改変し、RNAベースのウイルスベクター粒子が産生できるような適切な条件下で培養し、ここで、該形質転換後の上記培養を無血清培地中で行い;及び
(ii)上記RNAベースのウイルスベクター粒子を含む上清を回収することを含む。
粗バッチAについては900:1から200:1、好ましくは600未満;
バッチCについては600:1から200:1、好ましくは300:1以下;
バッチDについては400:1から100:1、好ましくは300:1未満;
の間に含まれる場合に最適であると考えられている。
プラスミドの構築
組換えビリオン又は組換えレトロウイルスを生産するために3つのベクターを使用した。第一のベクターはウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードする核酸を提供する(図2A)。これらの配列は、上述したように、それぞれ、基特異的抗原および逆転写酵素(加えて、成熟および逆転写に必要なインテグラーゼおよびプロテアーゼ酵素)をコードする。第二のベクターはウイルスエンベロープ(env)をコードする核酸を提供する(図2B)。第三のベクターは、ウイルスのライフサイクルに必要なcis作用ウイルス配列を提供する(図2C)。また、この第三のベクターは、標的細胞へ移入する非相同の核酸配列のためのクローニング部位も含む。適切なベクターの概略図をGFPとともに導入遺伝子として図2Cに示すが、任意の遺伝子、またはshRNA若しくはmiRNAといった対象配列に置換することもできる。
ウイルスベクターを、ヒト胎児腎臓(HEK293T)細胞株を用いて製造した。ヒト結腸癌(HCT116;ATCC番号CCL−247)接着細胞株が感染性粒子の定量用に使用される。全ての細胞は、ATTC(アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関)により提供され、10%FCS(ウシ胎仔血清またはウシ胎児血清FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%ウルトラグルタミン(PAA)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco社、英国ペイズリー)中で、37℃、空気中5%CO2を含む加湿雰囲気中で培養した。ウイルスベクター上清の生産用には、DMEMに対し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1%ウルトラグルタミン(PAA)のみを添加した。
ウイルスベクターの生産を10層のCell STACK(6320cm2、Corning社)を用いて行った。HEK293T細胞を、9.5×103生細胞/cm2で、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%ウルトラグルタミン(PAA)を添加したDMEM中に播種し、37℃、空気中5%CO2を含む加湿雰囲気中に置いた。播種から4日後、細胞の形質移入前に、上清を捨て、FCSを添加せず1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1%ウルトラグルタミン(PAA)を添加した新鮮なDMEMに交換した。
また、LDH細胞毒性アッセイキットII(PromoKine社)も使用し、レンチベクター粒子をコードするプラスミドによる形質移入後に293T産生細胞から放出されたLDH酵素(乳酸脱水素酵素)を測定した。293T細胞の上清を「低対照」として用い、一方、293T細胞を細胞溶解液で溶解し、「高レベル対照」として表した。その後、LDHアッセイを、製造業者のプロトコルに従って、各粗上清の回収物について実施し、異なるレンチベクターの生産プロセス間における293T細胞の死亡率を評価するための試料として使用した。LDH細胞毒性アッセイキットIIは、WST試薬(水溶性テトラゾリウム)を利用して、損傷を受けた細胞から放出されるLDHを検出する。このアッセイは、LDHが乳酸を酸化してNADHを生成し、これが次にWSTと反応して黄色を呈する酵素カップリング反応を利用する。その後、LDH活性は、分光光度計(Glomax MultiDetection System、Promega 基準)を用いて450nmの光学密度で定量した。アッセイは、各検査済ウイルスベクターについて三重に繰り返した。
粗採取物の濃縮および精製は、まず、ポリスルホン製中空糸のカートリッジを用いた接線流限外ろ過により行った。その後、上清を、DMEMまたはTSSM緩衝液に対する連続的透析ろ過で、20ダイア容積(diavolume)となるように透析ろ過した。透析ろ過を一度行った後、残余分を回収し、さらに使い捨ての限外ろ過ユニットで濃縮した。
形質導入単位の滴定アッセイを以下のように行った。HCT116細胞を、10%FCS、1%ペニシリンストレプトマイシン、および1%ウルトラグルタミンを添加した250μlのDMEM(完全培地)で96ウェルプレートにウェル当たり12500細胞で播種する。24時間後に、各ベクターのサンプル用およびrLV−EFL−GFP内部標準について完全培地を用いて5段階希釈を実施する。細胞は、8μg/mL ポリブレン(Polybrene)(登録商標)(Sigma社)の存在下でこれらの連続希釈液により形質導入される。各サンプル系列に対し、1ウェルの非形質導入細胞を対照として加える。形質導入から3日後、細胞をトリプシン処理し、各細胞のペレットを250μlのPBSと一緒に取り出す。その後、100μlの細胞懸濁液をキュベットに入れ、その蛍光強度を、Versafluor(Biorad社)を用いてRFU(相対蛍光単位)で測定する。力価は、前もってFACSにより力価を決定した内部標準を用いて、形質導入単位/ml(TU/mL)で決定する。
P24コア抗原は、Perkin Elmer社が提供する、HIV−1 p24 ELISAキットでウイルス上清に直接検出される。このキットは、供給元の指定通りに使用する。捕捉された抗原は、HIV−1 p24に対するビオチン化ポリクローナル抗体と複合体を形成し、その後、ストレプトアビジン−HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)と結合する。結果得られた複合体は、捕捉されたp24の量に直接比例して黄色を呈するオルト−フェニレンジアミン−塩酸(OPD)とインキュベーションすることによって検出される。各マイクロプレートウェルの吸光度はマイクロプレートリーダーを用いて決定し、HIV−1 p24抗原の標準曲線の吸光度に対しキャリブレーションを行う。1pgのp24が104の物理的粒子に相当することがわかっているので、1ml当たりの物理的粒子中に発現したウイルス力価をp24の量から算出する。
各サンプル中のDNAの残存量は、Quant−iTキットPicoGreenのdsDNA試薬及びキット(Life Technologies社)を供給元の指定通りに用いることで決定した。検量線は、サンプル希釈緩衝液(DMEMまたはTSSM)で希釈したプラスミドを用いて作成される。反応自体は、25μlのサンプルを、25μlのTE緩衝液および50μlのピコグリーン(PicoGreen)(登録商標)染料の希釈標準溶液を96ウェルプレート中で混合することからなる。その後、反応物を暗所で5分間インキュベートし、染料を二本鎖DNAに結合させる。その後、サンプルの蛍光をプレートリーダー上で435/535nmの励起/発光において測定する。
各サンプル中のタンパク質の総量は、Lowry法から派生したDCTMタンパク質キット(Biorad社)を用いて決定した。このキットは供給元の指定通りに用いる。検量線は、サンプル希釈緩衝液(DMEMまたはTSSM)で希釈したBSAを用いて作成される。このアッセイは、タンパク質とアルカリ性酒石酸銅溶液及びフォリン試薬との反応に基づく。Lowryのアッセイと同様に、発色をもたらす2つの工程:アルカリ性培地中のタンパク質と銅との反応、およびそれに続く銅処理タンパク質によるフォリン試薬の還元、がある。
サンプルは、「Sample Buffer 4X」(Biorad社)および「Reducing Agent 20X」(Biorad社)で5分間95℃で変性させる。変性後、サンプルを、「Criterion XT Bis−Tris 4−12% gel」(Biorad社)のウェルに載せる。分子量マーカー「Precision Plus Protein Dual Color Standard」を、サンプルの横に配置する。泳動は「XT MOPS buffer」(Biorad社)中で行われる。泳動後、ゲルを「Biosafe Coomassie Stain」(Biorad社)で染色する前に、水で数回洗浄する。所望のコントラストを得るために、最終的に数回の水洗浄を行う。
ヒト胎児肺線維芽細胞株(IMR90)を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関より入手し(番号CCL−186)、10%ウシ胎仔血清(FCS;Gibco社)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Gibco社、米国カリフォルニア州カールスバッド)中で、37℃、5%CO2を含む加湿雰囲気のインキュベーター内で培養した。
IMR90細胞を、形質導入の24時間前に、6ウェルのプレートに50000細胞/ウェルで播種する。その後、細胞を、5から200までの様々なM.O.I.を有する、TUで正規化したeGFP保有レンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入した上清は5時間後に除去する。形質導入後6日目に、細胞を採取し、eGFP発現をフローサイトメトリーによって分析した。
細胞増殖を3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT;Sigma社)比色色素還元法を用いて測定した。IMRR90細胞を、96ウェルプレートに、ウェル当たり10%FCSを含有するDMEM中1.5×103の細胞数の密度で播種した。これらの細胞を24時間培養してから、各ウイルスベクターにつきM.O.I.40および150の異なる精製レベルのウイルスベクターを用いて形質導入した。形質導入から5または14日後に、20μ1の3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT;5mg/ml;Sigma社)含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を各ウェルに添加し、さらに2.5時間37℃で培養した。その後、培養培地を廃棄し、暗青色の結晶を各ウェル中で100μlのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。その後、ウェルを均質化してから、分光光度プレートリーダー(Glomax MultiDetection System、Promega社)を用いて560nmの光学密度(OD)を測定した。増殖アッセイは、各検査済ウイルスベクターについて三重に繰り返した。
LDH細胞毒性アッセイキットII(PromoKine社)を使用して、形質導入後の細胞から放出されたLDH酵素(乳酸脱水素酵素)を測定した。ヒト線維芽細胞を、96ウェルプレートに、ウェル当たり10%FCSを含有するDMEM中1.5×103の細胞数の密度で播種し、その後24時間で血清を2%FCSまで減少させた。その後、これらの細胞を、各ウイルスベクターにつきM.O.I.40および150の異なる精製レベルのウイルスベクターで形質導入した。形質導入から6日後に、LDHアッセイを製造業者のプロトコル通りに実施した。LDH細胞毒性アッセイキットIIは、損傷を受けた細胞から放出されるLDHを検出するためWST試薬(水溶性テトラゾリウム)を利用する。このアッセイは、LDHが乳酸を酸化してNADHを生成し、これが次にWSTと反応して黄色を呈する酵素カップリング反応を利用する。その後、LDH活性は、分光光度計(Glomax MultiDetection System、Promega基準)を用いて450nmの光学密度で定量した。アッセイは、各検査済ウイルスベクターについて三重に繰り返した。
cDNAを有さないレンチウイルスベクターを保有する空のカセット(rLV−EFl)をマイクロアレイ試験のために様々な純度で製造した。rLV−EF1ベクターのバッチBおよびCは、同一の粗採取物から精製した。10%ウシ胎児血清(BIO WEST社)の存在下でBバッチを製造するような追加的な製造を行い、これを本明細書ではB−Sバッチと呼ぶ。
ヒト***繊維芽細胞を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関より入手し(番号CRL−2097)、10%ウシ胎児血清(BIO WEST社)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(PAA)、および2mMグルタミン(PAA)を添加したEMEM(イーグル最小必須培地;Gibco社)中で培養した。細胞は、37℃、5%CO2の存在下で保持し、週に二回、5000細胞/cm2で継代した。本発明は、初代細胞、例えばヒト***線維芽細胞、に限定されない。
ヒト***線維芽細胞をT25−フラスコ中に5000細胞/cm2で形質導入の24時間前に播種した。細胞は、最終容積が5mLのrLV−EFLベクターのバッチB、CおよびBSを用い、4μg/mLのポリブレン(Polybrene)(登録商標)(Sigma社)の存在下、M.O.I.40および150として、形質導入を四重に行った。形質導入を行わない対照には、4μg/mLのポリブレン(Polybrene)(登録商標)しか与えなかった。形質導入上清を約16時間後に除去する。細胞を形質導入から54時間後にトリプシン処理、1×PBSで洗浄、及び遠心分離し、ペレットを−80℃で保存した。写真は、形質導入から48時間後に撮ったものである。
全RNAサンプルは、TRIZol(登録商標)Plus RNA Purification System(Life Technologies社)を用い、製造業者の説明書通りに細胞ペレットから抽出した。全RNA濃度および純度は、Nanodrop1000分光光度計(Nanodrop Technologies社)を用いて決定した。RNAの品質と完全性を、Agilent 2100 Bioanalyzer(米国Agilent Technologies社)で確認したところ、Agilentマイクロアレイの要件に沿ったものであった。
マイクロアレイ実験は、Genopole、トゥールーズ大学、INSA、UPS、IΝΡ、CNRS&INRAのBiochips Platform(フランス、トゥールーズ)で、製造業者のプロトコル通りに実施した。簡潔にいうと、品質管理チェック用に、one color RNA Spikeキット(Agilent Technologies社)の外因性RNAの希釈物を添加した後、100ngの全RNAをcRNAに変換し、Agilent Low Input Quick Ampキットを用いて増幅し、シアニン3で標識した。1650ngのシアニン3標識cRNAは、27,958遺伝子を標的とした44,000プローブを含むAgilent Whole Human Genome Oligo Microarrays 4×44K version2に対し、65℃、17時間、10rpmでハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたアレイを洗浄し、Agilent高解像スキャナG2505Cでスキャンし、その画像をFeature Extraction 10.10(Agilent Technologies社)を用いて解析した。Feature Extraction QC reportsに基づいた品質管理後に、3または4の複製物を条件に従って保持した。
Feature Extractionからの生データセットをGeneSpring(登録商標)GX12ソフトウエア(Agilent Technologies社)にインポートし、第3四分位数法(75th percentile method)を用いて正規化した。プローブはその後、Feature Extractionデータ(各プローブに対し、次のフラグのうちの一つが付される:「検出」、「非検出」、または「欠損(compromised)」)をインポートする際に、GeneSpring(登録商標)に帰属するフラグ値によってフィルタリングされた。少なくとも一の条件下において、複製物の60%超が検出され又は欠損を生じていないプローブを確保した(非検出又は欠損を生じたスポットは除かれた)。全てサンプルの中央値に対する強度値のベースライン変換を、プロファイルプロットの表現に適用した。これは、各プローブについて、すべての試料からのログの集計値の中央値が計算され、サンプルの各々から減算されることを意味する。各条件と対照条件間で差分を持って発現したプローブを同定するために、独立したt検定を、Benjamini−Hochbergの多重検定による補正及び補正p値<0.05を用いて実施した。倍率変化(FC)の絶対値が≧1.5のプローブを、上方及び下方制御プローブの両者について差分を持って発現したものとして確保した。倍率変化の絶対値が<1.3のプローブは、差分なしとした。
様々な細胞種に対する細胞形質導入効率
発現またはサイレンシングにわたり安定した遺伝子が必要な場合に実施する第一のアッセイは、最適な遺伝子調節を達成するのに必要な感染多重度(M.O.I.)を選択することである。すべての細胞が、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターに対し同一の許容度を示すわけではない。標的細胞を、GFP発現レンチウイルスベクターの量を増加しながら形質導入して、細胞が完全に形質導入するような条件を決定し、対応する遺伝子発現のレベルを同定する。図3A及び図3Bにおいて、M.O.I.の増加に伴い、第一に、形質導入細胞の数が標的細胞の95〜100%まで上昇し、第二に、GFP発現のレベルが増大したことが観察された。この現象は、不死化細胞株、初代細胞、および幹細胞において観察される。この結果は、検査した全細胞についてレンチウイルスベクターを用いた遺伝子移入の用量の効果を示すのみでなく、ある細胞種について使用したM.O.I.を、他の細胞種に転用することができないことを示している。細胞種ごとに特有のM.O.I.を必要とする。
一般的にウイルス、特にレンチウイルスベースのベクターの力価は、滴定に使用した方法および細胞に依存する。細胞侵入から遺伝子組み込みおよび遺伝子発現までの形質導入経路の段階を達成することができるベクター粒子の定量は、ベクター自体及び細胞の特性に依存する。
本発明にかかるレトロウイルス及びレンチウイルスベースのベクターは、標準的なリン酸カルシウム法を用いた293T細胞への三種形質移入(tritransfection)によって生産される。形質移入から24時間後(Sena−estevesら、2004年)、細胞を、無血清培地で洗浄し、ウイルス上清を24時間後に回収しろ過する。先行技術のベクターは通常、血清含有培地で生産され、超遠心または様々な供給先から提供される中央ユニットを用いた遠心分離によって濃縮される。本発明において、図5AのバッチAと呼ばれる粗バッチは、発現プラスミド構築物によるが約106TU/mlの平均力価を示す。本明細書に記載の濃縮工程後、この力価は例えば107〜108TU/mlまで達する。これらの標準的な方法により生産されたこれらの小規模バッチはいくつかの欠点を示す。第一に、これらの簡単な方法だと容量の制限があるので、規模の拡大が難しい。第二に、これらの方法は濃縮に限定されており、培地含有物の大幅な除去を可能にするわけではない。タンパク質及び血清成分の存在を避けるために、本発明にかかるプロセスでは、無血清培地中の上清を採取してからバッチAを限外ろ過及び/又はクロマトグラフィーに供し、ベクターバッチを濃縮および精製する。これは、例えば、ベクターがインビトロおよびインビボにおいて高いM.O.I.で使用されることが必要な場合、特に非組み込み型レンチウイルスベクターの場合に重要である(図10A及び10B)。
本発明は、無血清培地における高力価ウイルス上清の生産のために最適化された着実なプロセスを提供する。レンチウイルスベクターrLV−EFl−GFPを、標準的なリン酸カルシウム法を用いて0、5、および10%FCS(ウシ胎仔血清)中で、293T細胞における一過性の三種形質移入によって生産した。EF1 alpha(ヒト伸長因子1 alpha)プロモーターは、遍在性の強力なプロモーターである。ウイルス上清を採取し、全タンパク質の15μgをSDS−Pageゲルに載せ、全タンパク質含有物を解析した。その結果、無血清で生産された粗上清は、血清の不存在に直接結びつくタンパク質をより低量含有するということが示された。並行して、PPおよびTUとの間の比率を血清の有無において決定した。力価(TU/mL)およびPP/TU比は全ての条件において安定したままであったことが示された。結論としては、無血清でレトロウイルスベクターを生産すると、ベクター生産効率は低下しないが(図4C)、サンプルの全タンパク質含量は減少する(図4B及び表1)。
本発明は、形質移入産生細胞に対する誘導毒性について、酪酸ナトリウム誘導(形質移入後18時間)の有無、及び形質転換後72時間の間の採取回数の違いによる比較を説明する。これらの実験は、どの粗上清採取物についても機能的力価が106TU/mlより高いことを示し、上清の採取回数および酪酸ナトリウム誘導が結果として得られる産生細胞の毒性に対し強い影響を及ぼすことを強調する。一方で、出願人らは回収の回数および酪酸ナトリウムの誘導の有無は、粗上清の力価に対しての影響は小さいことに気付いており、酪酸ナトリウム誘導なしでウイルスベクターを生産し、採取工程が5回の場合は形質導入単位での生産増大は2倍であった(表3のTU/生産を参照)。他方、酪酸ナトリウム誘導および血清の不存在下で製造し、ベクター粒子の半減期に応じて調整した回数の複数の工程により採取した粗上清から放出された全DNAの濃度は最も低く、酪酸ナトリウム誘導をして生産し、採取時間を形質移入後64時間および88時間に固定した場合と比較して7倍であった。これらの結果は、粗上清について直接LDH細胞毒性アッセイをすることにより確認され、粗上清が、酪酸ナトリウム誘導および血清の不存在下で製造され、ベクター粒子の半減期に応じて調整した回数の複数の工程により採取されたときには、形質移入細胞の溶解が制限されることを示している。同時に、粗上清中の全DNAの濃度および細胞毒性のレベルは、酪酸ナトリウム誘導を行い、採取時間を形質移入後64時間および88時間に固定することによって増加しており、このことは細胞の溶解がこれらの生産条件によって増強されることを示している。粗上清を、酪酸ナトリウム誘導なしで細胞洗浄後40時間および64時間の2回の採取工程のみにより採取する場合、誘導毒性は82%及び48%に達するが、中間採取物については形質移入した細胞に対する毒性は、最初の3つの採取物については平均して13.3%、最後の採取物については16.4%と、30%を超えない(表3)。したがって、一定の間隔で3回から6回の間を含む複数の工程によってなされる粗上清の回収物は、請求される精製されたRNAベースのウイルスベクター組成物を得るための出発点となる。様々な採取が、産生細胞の種類や培養培地により約8時間である37℃でのベクター粒子の半減期(Le Douxら、1999年)に関連させながら、形質転換後特定の時期に実施された。酪酸ナトリウム誘導および血清なしで、ベクター半減期に関連させた複数の工程により採取することが、粗上清、すなわち本発明にかかるバッチAを製造するのにもっとも良い条件である。これらの結果は、初期の粗上清組成物は生産プロセス自体により大きく影響され、この出発組成物は形質導入した標的細胞に対し毒性の点において劇的な効果を有することを強調している。
本発明にかかる方法は、無血清生産プロセス(バッチAの取得に相当)に関連する2種類の濃縮及び/又は精製バッチ(CおよびD)を含む。これらの方法を、超遠心又は中央ユニットを用いた遠心分離に基づいた標準的で通常用いられる濃縮プロセス(バッチBの取得に相当)と比較した。異なるバッチは、精製無しから限外ろ過およびクロマトグラフィーに基づくいくつかの精製工程にわたる異なる精製方略に相当する。これら4つの精製プロセスが、混入物の除去の点で品質を向上させる(図6及び7)。
この種類のバッチは、いかなる精製工程も含まない清澄化後の採取物に相当する。この種類のバッチは通常、次の特性の一つ以上を示す:(i)発現プラスミド構築物による平均最終力価が、約106TU/ml(表1);平均最終DNA混入物濃度が650ng/mlまで;(iii)平均最終タンパク質混入物濃度が20(μg/ml)まで;及び(iv)平均最終PP/TU比が500から900の間又はそれ以下で構成される(表1及び2)。
このプロセスは、即使用可の遠心分離ユニットを用いた限外ろ過による濃縮工程を経た清澄化後の採取物(無血清培養培地)に相当する。この濃縮バッチは、図4Aに記載のものと同じプロセスだが血清を用いないことによる結果生ずるものである。この種類のバッチは通常次の特性の一つ以上を示す:(i)最終ベクター力価が1×l07〜1×l08TU/mlの間;(ii)本発明にかかる有効ベクターのプロセス回収率がバッチAと比較して約47%;(iii)濃度がバッチAと比較して95倍(表2);(iv)DNA除去率がバッチAと比較して初期の混入物の約71%;(v)タンパク質除去率がバッチAと比較して初期の混入物の約56%(図6);及び(vi)平均最終PP/TU比が約500以上(図8)。この比率は、粗バッチについて得られたものと比較すると上昇しており、これらの濃縮方法が、血清がなくともプロセスそれ自体の間においてウイルス粒子に対しダメージを与えることを示している。この現象は血清の存在下で増大する。
このプロセスは、中空糸を用いた限外ろ過による濃縮および透析ろ過工程を経た清澄化後の採取物(無血清培養培地)に相当する。この種類のバッチは通常次の特性の一つ以上を示す:(i)最終力価が1×l07〜1×l08TU/mlの間;(ii)本発明にかかる有効ベクターのプロセス回収率がバッチAと比較して約69%;(iii)濃度が約25倍であるが、通常は20から40の間(表2及び3);(iv)DNA除去率がバッチAと比較して初期の混入物の約82%(70%から90%);(v)タンパク質除去率がバッチAと比較して初期の混入物の約98%(図9);及び(vi)平均最終PP/TU比が200から600の間(図8)。
バッチDを取得するためのこのプロセスは、バッチCを取得するために使用されるプロセスの工程を濃縮工程により増強し、その後任意で遠心分離即使用可の遠心分離ユニットを用いた限外ろ過により濃縮し、加えてベンゾナーゼ処理及びクロマトグラフィーベースの精製をすることを含む。この種類のバッチは通常次の特性の一つ以上を示す:(i)最終力価が1×l07〜1×l08TU/mlの間;(ii)(本発明にかかる精製されたウイルスDNAベクターの)プロセス回収率がバッチAと比較して約12%;(iii)濃度が約7倍(5から10の間)(表2);(iv)DNA除去率がバッチAと比較して初期の混入物の約98.8%(80から99%);(v)タンパク質除去率がバッチAと比較して初期の混入物の約99.9%(図6);及び(vi)平均最終PP/TU比が100から400の間(図8)。
例えレンチウイルスベクターが、動物または哺乳動物細胞への遺伝子またはshRNAを導入する最も効率的な手段であったとしても、このようなベクターの使用に対する障壁としていくつかの問題が残っており、そのような障壁としては例えば、遺伝子導入の再現性、細胞の生存または毒性、用量効果の監視、または不死化、初代、及び幹細胞で得られた結果間での同種性(homogeneity)等が挙げられる。事実、図3に記載の通り、効率的な遺伝子導入には、実験の目的及び標的細胞に適したM.O.I.を決定するための特別な開発が必要である。いくつかの細胞(U937、初代リンパ球、造血幹細胞、THPl)では、他の細胞(293T、DAOY、HCT116)より高いM.O.I.が必要である。非常に多くの場合、初代細胞は不死化細胞よりも許容性が小さいが、THPl、Jurkat、またはU937のようないくつかの確立された細胞では50より高いM.O.I.が必要である。レンチウイルスベクターによる誘導毒性のため、これらのM.O.I.では、適用することが困難と考えられている(山田ら、2003)。図10に示すように標的細胞を効率的に形質導入するためには高いM.O.I.が必要であるという事実のために、非組込み型レンチウイルスベクター(NILV)を用いた形質導入では、この問題が浮き彫りになる。事実、ILVはM.O.I.が10のとき100%の標的細胞を形質導入するが、NILVベクターは63%の標的細胞を形質導入するのに40のM.O.I.を必要とする。また、ILVがM.O.I.5で発現するレベルと同等に達するために、NILVでは150のM.O.I.を用いなくてはならない。ヒトまたは動物の造血幹細胞を効率的に形質導入するには、高いM.O.I.が必要であり、これは遺伝子治療または動物モデル開発用に、ヒトまたは動物へその後再移植するためである。初代細胞を形質導入するのにもまた高いM.O.I.が必要であり、これは、簡便に表現型または疾患を転換するよう標的遺伝子を発現するためである。本発明の目的は、標的細胞における発現レベル、及びその結果である細胞生存との間の最適なバランスを見出すことである。ここに示したように、濃縮されたベクター上清中のタンパク質およびDNAの含有量を減らすことは細胞の停止及び死亡から細胞を保護するための方法である。これもまた、ILVおよびNILVを用いてiPS細胞へ細胞の再プログラミングを行い、再プログラミングプロセスにおける混入物の干渉を避けるための重要な検討事項である。
293T細胞を血清の不存在下で組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを産生するために三種形質移入する場合、これらの細胞が増殖を停止して上清中にストレスタンパク質および毒性元素を分泌することがある。図11Aは、ウイルス産生細胞が、三種形質移入後に高いLDH生成率を示すことを示す。この結果により、ベクター生産の間に産生細胞株により分泌された毒性タンパク質が培養培地中に存在することが強調される。粗調製物のみならず、濃縮されたバッチ中にも含有されるこの望ましくない物質は、標的細胞、特に繊細な初代細胞を形質導入するのに使用する場合、細胞摂動を誘発し、インビボでの投与後の実験動物モデルにおいて免疫原性反応を引き起こすことがある。表3に示すように、明らかにこの粗ベクター組成物は、形質移入後のベクター採取の回数及び時期の両方により影響を受ける。ベクター上清を、ベクター半減期を考慮せずに24時間間隔で採取すると、ベクター採取物のLDH効が上昇する。LDH効は、例えば表3に記載されるように4回の採取を12から16時間の間隔で繰り返すと、30%未満であるが、ベクターの採取を24時間間隔で繰り返したときは、それぞれ80%および48%に達する。よって、3から6回の回収を含む複数の回収工程を特定の時間間隔をあけて行うことにより粗上清を回収すると、精製されたRNAベースのウイルスベクター組成物、すわわち、回収された粗上清を得るための方法が得られる。複数の回収工程が、産生細胞の種類や培養培地によるが約8時間である37℃でのベクター粒子の半減期(Le Douxら、1999年)に応じて、形質転換後特定の時間に選択される。よって、ベクター生産中における血清の不存在に加え、ベクター生産中の採取時期及び回数に基づくこの第二のパラメーターにより、高品質の粗出発物質を生成することが可能になり、これはタンパク質の濃度のみならず、細胞毒性をも最小限に抑えるものである。ここで、図5Aにまとめた工程を組み合わせると、標的細胞に望ましくない効果が低減できることが実証される。このプロセスは、無血清培地、順次的な採取、および限外ろ過を含む。
初代細胞および***細胞(ATCC−CRL−2097)に対するベクター形質導入の影響を、形質導入から数日後に検討した。バッチA、B、CおよびDと称する、上述の4つのバッチを製造し、標的細胞を形質導入するのに使用して中程度及び高度のM.O.I.、それぞれ40および150における、ベクター自体及びベクター環境による段階的な効果を評価した。まず、細胞がレポーター遺伝子GFPを発現可能かどうか判断するためにチェックを行い、様々なバッチでのGFP発現の結果を図12A及び12Bにそれぞれ形質導入から5および11日後について示す。これらのデータは、全バッチにおいて、すべての形質導入細胞がGFPレポーター遺伝子を高レベルに発現することを示す。そして、GFP発現レベルは、精製グレードとは無関係であると思われる。一旦ベクターが標的生細胞に侵入すると、形質導入の経路は制限を受けないので、導入遺伝子の発現は効率が良い。並行して、これらの写真は、形質導入の2日前に同数の細胞を播種した場合であっても、すべてのウェルにおける細胞数は非常に異なることを示している。
形質導入から6日および11日後、すべてのベクター種で形質導入した細胞を観察した。各条件で得られる細胞の量を評価するために、同一の実験をM.O.I.40および150で***細胞について実施した。図13に示すように、Bバッチで形質導入した細胞の数は同じ条件でCバッチで形質導入した細胞の数の6%のみであり、細胞の生存に対するベクター純度の効果が見られた。この結果は、形質導入後の標的細胞の生存および増殖速度を評価するために、比色MTTアッセイを用いて確認した。図14Aは、Bバッチを用いた細胞の形質導入により、使用したM.O.I.に比例して成長遅延が誘導されることを示す。40%および70%の成長停止がそれぞれM.O.I.40及び150で観察される。この成長停止が、先に観察されたBバッチによる形質導入後の細胞量の低さを説明するのかもしれない。事実、一の継代を含む形質導入後に細胞培養してから11日後の結果は、Bバッチを使用すると、M.O.I.40及び150の両者において細胞数の多くの割合が影響を受けるが、細胞をCまたはDのバッチで形質導入すると、M.O.I.40での細胞量が安定していることを示す。Bバッチほどではないが、M.O.I.が高くなると、細胞量が影響を受ける。CおよびDバッチ間で有意差は観察されず、限外ろ過後に得られる精製レベルは、インビトロ実験用に細胞が成長停止しないよう細胞を保護するには十分であることを示唆している。図14Bおよび図14Cにおいて、A、B、C、及びDバッチで形質導入した細胞の増殖速度を決定したところ、Cバッチは、先に観察された成長停止から細胞を保護することが確認された。バッチB−Sを用いた細胞の形質導入は、細胞がBバッチで形質導入したときのものと比較して、細胞停止が増幅されていることを示しており、血清の不存在および限外ろ過の組み合わせが不可欠であることが強調される。
いかなる導入遺伝子からも独立して純度レベルによるベクター形質導入の効果を評価するために、***線維芽細胞を、M.O.I.40および150において、同じ粗採取物由来のrLV−EFl(cDNAを含まない)バッチBおよびCで形質導入し、それらの特性を図15Bにまとめる。図15Aに示すように、形質導入から48時間後の細胞を観察した。非形質導入細胞に比べバッチBで形質導入した細胞では、わずかな成長遅延がM.O.I.40にてみられたが、同じM.O.I.のバッチCで形質導入した後では顕著な成長差はみられなかった。M.O.I.150では、非形質導入細胞に比べバッチBで強い成長停止が見られたものの、バッチCでは緩やかな成長遅延が観察されたのみであった。転写レベルでの根本的な変化を調べるために、これらの細胞を形質導入から54時間後に回収した。RNAを抽出し、ほぼすべてのヒト転写物の定量を可能にするAgilentヒト全ゲノムマイクロアレイを実施するために使用した。M.O.I.40をおよび150としたrLV−EF1バッチBおよびCで形質導入した細胞からのRNAレベルを、非形質導入細胞からのRNAと比較した。統計的解析後、1.5倍以上に上方制御又は下方制御したプローブを、各比較のために保持した。これらのデータを交差させることにより、バッチCでは非形質導入とは異なる影響がなかったが、バッチBでは非形質導入に対し差分を持って発現した遺伝子のセットを各M.O.I.について同定できた。これらの2セットの遺伝子を、M.O.I.150については図16A及びB、およびM.O.I.40については図16C及びDにおいて散布プロットおよびプロフィールプロット上に表す。実証されたように、非形質導入細胞対バッチBでの形質導入細胞において、選択された遺伝子の転写レベルの変動は、M.O.I.40に比べM.O.I.150でより顕著であり、M.O.I.40では変動がわずかである。これらのデータは、異なる純度レベルのベクターを使用すると、形質導入細胞のトランスクリプトームに対し異なる影響があることを示している。
血清を用いて製造したベクター培地組成物の効果を評価するために、rLV−EF1ベクター(cDNAを含まない)をプロセスBを用いて10%血清の存在下で製造して濃縮すると、その結果としてバッチB−Sを得たが、この特性を図17Bにまとめる。このバッチは、M.O.I.40及びM.O.I.150において***細胞を形質導入するのに使用した。図17Aに示すように、形質導入から48時間後の細胞を観察した。バッチB−Sでの形質導入後、非形質導入細胞と比較して成長停止がみられる。この成長停止は、M.O.I.40よりも高いM.O.I.ではより強力である。注目すべきことに、バッチB−Sでの形質導入後、凝集体が観察されることがあり、それらの容量はM.O.I.に伴い上昇する。これらの細胞を形質導入から54時間後に回収し、RNA抽出およびマイクロアレイハイブリダイゼーションを行った。驚くべきことに、トリプシン処理中に、バッチB−Sで形質導入した細胞は、バッチB若しくはCで形質導入した細胞、又は非形質導入細胞よりも分離困難であった。Agilentヒト全ゲノムマイクロアレイを使用して、中程度又は高度のM.O.I.においてバッチB−Sで形質導入した細胞からのRNAレベルを、非形質導入細胞からのRNAと比較した。統計的解析後、1.5倍以上に上方制御又は下方制御したプローブを、各比較のために保持した。血清を用いて製造されたベクターに関するプローブを同定するために、我々は非形質導入条件に対しバッチB−S(M.O.I.40および150)では差分を持って発現するが、バッチBおよびC(M.O.I.40および150)では影響がなかったプローブを選択した。対応する遺伝子のセットを、図18に示すプロフィールプロットに表す。これらのデータは、血清を用いて製造したバッチによる形質導入が存在すると、形質導入細胞のトランスクリプトームは、明らかに影響されるということの裏付となる。
いかなる導入遺伝子からも独立して純度レベルによるベクター形質導入の効果を評価するために、***線維芽細胞を、M.O.I.40および150において、同じ粗採取物由来のcDNAを含まないウイルスベクター(rLV−EFl)バッチBおよびCで形質導入した。図15Aに示すように、形質導入から48時間後の細胞を観察した。バッチBでは、わずかな成長遅延がM.O.I.40にてみられたが、同じM.O.I.のバッチCでは顕著な成長差はみられなかった。M.O.I.150では、バッチBで強い成長停止が見られたものの、バッチCでは緩やかな成長遅延を観察したのみであった。転写レベルでの根本的な変化を調べるために、これらの細胞を形質導入から54時間後に回収した。RNAを抽出し、ほぼすべてのヒト転写物の定量を可能にするAgilentヒト全ゲノムマイクロアレイを実施するために使用した。M.O.I.150としたcDNAを含まないウイルスベクター(rLV−EF1)バッチBおよびCで形質導入した細胞からのRNAレベルを、非形質導入細胞からのRNAと比較した。統計的解析後、1.5倍以上に上方制御又は下方制御したプローブを、各比較のために保持した。これらのデータを交差させることにより、図16A〜16D(散布図M.O.I.40及び散布図M.O.I.150)において示されるように、バッチCでは影響なかったが、バッチBでは差分を持って発現した遺伝子のセットを各M.O.I.について同定できた。
(i)粗バッチの平均PP/TU比が、300から900の間;
この比率が濃縮工程の間に上昇するとベクターがダメージを受けているという指標となり、形質導入および標的細胞の生存を害するおそれのあるベクター堆積物の存在が予測される;
(ii)濃縮後のDNA除去率が、バッチAと比較して初期の混入物の約82%であり常に70%から99%の間;および
(iii)濃縮後のタンパク質除去率が、無血清培地中で生産したバッチAと比較して初期混入物の90%まで;
が含まれる。
Claims (5)
- (i)ウイルスベクターの基となるRNAウイルスゲノムの欠損を補完するように産生細胞を形質転換して改変し、該産生細胞をウイルスベクター粒子が産生できるような適切な条件下で培養すること、ここで、該形質転換後の前記培養を無血清培地中で行う;
(ii)形質転換から24時間後に、上清を捨て交換すること;
(iii)その後、前記産生細胞の形質転換後72時間以内に、3回〜6回である複数回の上清回収工程を、ベクター粒子の半減期に応じた特定の時間間隔をあけて行うことにより、前記RNAベースのウイルスベクター粒子を含む上清を回収すること;を含み、
(iv)接線限外ろ過及び透析ろ過を行う工程を更に含む、
RNAベースのレトロウイルス粒子の製造方法。 - 酪酸ナトリウムによる誘導工程を含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記上清の回収に続いて遠心分離による清澄化を行う、請求項1又は2に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィーを行う工程を更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記限外ろ過はポリスルホン製中空糸カートリッジを使用して操作される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
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