JP2024063234A - 新規な抗a2ap抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒトA2APに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。【解決手段】A2APに結合し、A2APの活性を阻害することができる単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、前記単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントが、プラスミン活性を阻害しない、前記単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントである。単離された抗体または抗原結合フラグメントは、一態様において、i)ウサギおよび/またはカニクイザルA2APと交差反応し、ii)ヒトプラスミン活性を阻害せず、およびiii)A2APの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、ヒトα2アンチプラスミン(A2AP)に結合する単離された抗体またはそ
の抗原結合フラグメントを提供する。本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントは、i)ウサギおよび/またはカニクイザル(cynomolgus)A2APと
交差反応し、ii)ヒトプラスミンに結合せず/ヒトプラスミン活性を阻害せず、iii
)A2APをセリンプロテアーゼ阻害剤からセリンプロテアーゼ基質に変換せず、iv)
解離定数(KD)≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM、また
は≦0.5nMで、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2APに結合し;
v)≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM
、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で、配列番号1のアミノ酸40~491の配
列のヒトA2APに結合し;vi)≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50
nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で、配列番号
1のアミノ酸40~491のヒトA2APの活性を阻害し;および/またはA2APの存
在下でのプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。
本発明は、ヒトα2アンチプラスミン(A2AP)に結合する単離された抗体またはそ
の抗原結合フラグメントを提供する。本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントは、i)ウサギおよび/またはカニクイザル(cynomolgus)A2APと
交差反応し、ii)ヒトプラスミンに結合せず/ヒトプラスミン活性を阻害せず、iii
)A2APをセリンプロテアーゼ阻害剤からセリンプロテアーゼ基質に変換せず、iv)
解離定数(KD)≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM、また
は≦0.5nMで、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2APに結合し;
v)≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM
、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で、配列番号1のアミノ酸40~491の配
列のヒトA2APに結合し;vi)≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50
nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で、配列番号
1のアミノ酸40~491のヒトA2APの活性を阻害し;および/またはA2APの存
在下でのプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。
本発明はさらに、前記抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配
列およびそれを含むベクター、前記抗体または抗原結合フラグメントを発現する単離され
た細胞、前記抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法、ならびに前記抗体または
抗原結合フラグメントを含む医薬組成物およびキットを提供する。
列およびそれを含むベクター、前記抗体または抗原結合フラグメントを発現する単離され
た細胞、前記抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法、ならびに前記抗体または
抗原結合フラグメントを含む医薬組成物およびキットを提供する。
本発明による抗体は、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静
脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの部分的または完全な血管
閉塞に起因する虚血性事象に関連する疾患の治療に使用することができる。
脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの部分的または完全な血管
閉塞に起因する虚血性事象に関連する疾患の治療に使用することができる。
発明の背景
血管内の血餅形成は、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静
脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの複数の重篤な疾患を引き
起こし得る。血餅の発生および持続性は、フィブリンおよび血小板によるその形成の速度
、ならびに溶解系によるその溶解によって影響を受ける。現在の標準的な治療は、血栓症
の慢性予防のための抗凝固に焦点を当てており、これは、非ビタミンKアンタゴニストの
経口抗凝固剤(NOAC)による全ての改善にもかかわらず、依然として出血のリスクを
伴い、血餅の消散に対して間接的な効果しか有さない。
血管内の血餅形成は、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静
脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの複数の重篤な疾患を引き
起こし得る。血餅の発生および持続性は、フィブリンおよび血小板によるその形成の速度
、ならびに溶解系によるその溶解によって影響を受ける。現在の標準的な治療は、血栓症
の慢性予防のための抗凝固に焦点を当てており、これは、非ビタミンKアンタゴニストの
経口抗凝固剤(NOAC)による全ての改善にもかかわらず、依然として出血のリスクを
伴い、血餅の消散に対して間接的な効果しか有さない。
虚血性または塞栓性事象に罹患している患者の主な治療目標は、血流の適時の回復であ
る。静脈内(IV)組換え組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)および機械的血栓
除去(MT)などの血管内治療を含む、血栓溶解を使用する再潅流療法は、例えば虚血性
脳卒中に罹患している患者のための唯一の承認された治療である。しかしながら、両方の
治療選択肢には限界がある。特に、短時間作用型tPAについては、出血リスクの強い増
加、神経毒性作用、および限られた有効性の時間枠のため、その使用は制限される。
る。静脈内(IV)組換え組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)および機械的血栓
除去(MT)などの血管内治療を含む、血栓溶解を使用する再潅流療法は、例えば虚血性
脳卒中に罹患している患者のための唯一の承認された治療である。しかしながら、両方の
治療選択肢には限界がある。特に、短時間作用型tPAについては、出血リスクの強い増
加、神経毒性作用、および限られた有効性の時間枠のため、その使用は制限される。
対照的に、主要な内因性プラスミン阻害剤α2-アンチプラスミン(a2Ap)の阻害
は、出血リスクを伴わずに病理学的パラメータを改善することが報告されている。したが
って、α2-アンチプラスミンの阻害は、血餅溶解の加速および(二次)血栓性事象の予
防のための革新的な治療選択肢であり得る。
は、出血リスクを伴わずに病理学的パラメータを改善することが報告されている。したが
って、α2-アンチプラスミンの阻害は、血餅溶解の加速および(二次)血栓性事象の予
防のための革新的な治療選択肢であり得る。
α2-アンチプラスミンは、セルピンスーパーファミリーのメンバーである。これは、
セリンプロテアーゼプラスミンの主要な生理学的阻害剤である。プラスミンは次に、様々
な他のタンパク質の分解および線維素溶解に関与する重要な酵素である(Tone M、
Kikuno R、Kume-Iwaki A、Hashimoto-Gotoh T、
Structure of human alpha 2-plasmin inhib
itor deduced from cDNA sequence、J Bioche
m.1987;102(5):1033-1041;Silverman GA、Bir
d PI、Carrell RWら、The serpins are an expa
nding superfamily of structurally simila
r but functionally diverse proteins.Evol
ution,mechanism of inhibition,novel func
tions,and a revised nomenclature.J Biol
Chem.2001;276(36):33293-33296)。
セリンプロテアーゼプラスミンの主要な生理学的阻害剤である。プラスミンは次に、様々
な他のタンパク質の分解および線維素溶解に関与する重要な酵素である(Tone M、
Kikuno R、Kume-Iwaki A、Hashimoto-Gotoh T、
Structure of human alpha 2-plasmin inhib
itor deduced from cDNA sequence、J Bioche
m.1987;102(5):1033-1041;Silverman GA、Bir
d PI、Carrell RWら、The serpins are an expa
nding superfamily of structurally simila
r but functionally diverse proteins.Evol
ution,mechanism of inhibition,novel func
tions,and a revised nomenclature.J Biol
Chem.2001;276(36):33293-33296)。
α2-アンチプラスミンは、27アミノ酸のシグナルペプチドを有する491アミノ酸
の前駆体として合成される。分泌型は、短いプロペプチド(残基28~39)および成熟
鎖(残基40~491)を示す。肝臓および腎臓は、a2Ap産生の主要部位であるが、
筋肉、腸、中枢神経系、および胎盤などの他の組織も、そのmRNAを中程度のレベルで
発現する。
の前駆体として合成される。分泌型は、短いプロペプチド(残基28~39)および成熟
鎖(残基40~491)を示す。肝臓および腎臓は、a2Ap産生の主要部位であるが、
筋肉、腸、中枢神経系、および胎盤などの他の組織も、そのmRNAを中程度のレベルで
発現する。
α2-アンチプラスミンの血漿中濃度は約1マイクロモル(~70マイクログラム/m
l)であり、血漿中の半減期は2.6日間で決定されている(Collen D、Wim
an B、Turnover of antiplasmin,fast-acting
plasmin inhibitor of plasma、Blood、1979;
53(2):313-324)。
l)であり、血漿中の半減期は2.6日間で決定されている(Collen D、Wim
an B、Turnover of antiplasmin,fast-acting
plasmin inhibitor of plasma、Blood、1979;
53(2):313-324)。
α2-アンチプラスミンの実験的治療的不活化は、微小血管血栓症、虚血性脳損傷、脳
腫脹、脳出血および血栓塞栓性脳卒中後の死亡を著しく減少させる(Reed GL、H
oung AK、Wang D、Microvascular thrombosis,
fibrinolysis,ischemic injury,and death a
fter cerebral thromboembolism are affect
ed by levels of circulating α2-antiplasm
in、Arterioscler Thromb Vasc Biol、2014;34
(12):2586-2593)。
腫脹、脳出血および血栓塞栓性脳卒中後の死亡を著しく減少させる(Reed GL、H
oung AK、Wang D、Microvascular thrombosis,
fibrinolysis,ischemic injury,and death a
fter cerebral thromboembolism are affect
ed by levels of circulating α2-antiplasm
in、Arterioscler Thromb Vasc Biol、2014;34
(12):2586-2593)。
Mimuroらは、A2AP抗体であるJPTI-1について記載している。予め形成
されたA2AP-プラスミン複合体に対するJPTI-1の結合活性は、遊離A2APに
対するよりも低かった。JPTI-1は、A2AP-プラスミン複合体の形成を妨害する
ことによりA2AP活性を阻害した。しかしながら、Mimuroらは、血餅溶解を増強
するためのJPTI-1の使用について沈黙している(Mimuro Jら、Blood
、1987;69:446-453)。
されたA2AP-プラスミン複合体に対するJPTI-1の結合活性は、遊離A2APに
対するよりも低かった。JPTI-1は、A2AP-プラスミン複合体の形成を妨害する
ことによりA2AP活性を阻害した。しかしながら、Mimuroらは、血餅溶解を増強
するためのJPTI-1の使用について沈黙している(Mimuro Jら、Blood
、1987;69:446-453)。
先行技術の最もよく特徴付けられた既知の抗体の1つは、Reedらによって記載され
た77A3であり(Reed GL、Functional characteriza
tion of monoclonal antibody inhibitors o
f alpha 2-antiplasmin that accelerate fi
brinolysis in different animal plasmas、H
ybridoma、1997;16(3):281-286;WO98/12334、W
O98/12329)、古典的なマウス免疫アプローチに由来する抗体である。この抗体
がマウス由来であるという事実により、少なくともヒト化キャンペーンが行われている。
た77A3であり(Reed GL、Functional characteriza
tion of monoclonal antibody inhibitors o
f alpha 2-antiplasmin that accelerate fi
brinolysis in different animal plasmas、H
ybridoma、1997;16(3):281-286;WO98/12334、W
O98/12329)、古典的なマウス免疫アプローチに由来する抗体である。この抗体
がマウス由来であるという事実により、少なくともヒト化キャンペーンが行われている。
他の機能遮断抗α2-アンチプラスミン抗体は、非ヒト抗体、例えばヤギ由来のSer
pin F2/α2-アンチプラスミン抗体(R&D、カタログ番号AF1484-SP
)としてのそれらの起源のため、それらの特異性、例えばそれぞれマウス特異的抗体クロ
ーン27C9、4H9、およびCBYY-I0956(MyBioSource、カタロ
グ番号MBS135095およびMBS135076、Creative Biolab
s、カタログ番号CBMAB-I2124-YY)のため、またはこれらの抗体がポリク
ローナルであるという事実のため(Invitrogen、カタログ番号PA5-471
42)、治療薬として適していない。
pin F2/α2-アンチプラスミン抗体(R&D、カタログ番号AF1484-SP
)としてのそれらの起源のため、それらの特異性、例えばそれぞれマウス特異的抗体クロ
ーン27C9、4H9、およびCBYY-I0956(MyBioSource、カタロ
グ番号MBS135095およびMBS135076、Creative Biolab
s、カタログ番号CBMAB-I2124-YY)のため、またはこれらの抗体がポリク
ローナルであるという事実のため(Invitrogen、カタログ番号PA5-471
42)、治療薬として適していない。
したがって、これまで満たされていない部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事
象に関連する疾患の治療に有用な新規の治療用A2AP抗体が非常に必要とされている。
象に関連する疾患の治療に有用な新規の治療用A2AP抗体が非常に必要とされている。
Tone M、Kikuno R、Kume-Iwaki A、Hashimoto-Gotoh T、J Biochem.1987;102(5):1033-1041
Silverman GA、Bird PI、Carrell RWら、J Biol Chem.2001;276(36):33293-33296
Collen D、Wiman B、Blood、1979;53(2):313-324
Reed GL、Houng AK、Wang D、Arterioscler Thromb Vasc Biol、2014;34(12):2586-2593
Mimuro Jら、Blood、1987;69:446-453
Reed GL、Hybridoma、1997;16(3):281-286
本発明の対象
先行技術に鑑みて、本発明の目的は、先行技術のA2AP抗体の欠点を克服する新規な
治療用A2AP抗体を提供することである。特に、本発明の目的は、ヒトA2APの高親
和性結合剤である新規A2AP抗体を提供することである。望ましいA2AP抗体は、ウ
サギおよび/またはカニクイザルA2APに対して交差反応性である。それらはヒト治療
において非免疫原性であり、すなわち、それらはヒトまたはヒト化抗体である。望ましい
A2AP抗体はA2APに対して選択的であり、特に、ヒトプラスミンに結合せず、それ
を阻害しない。また、それらは、A2APの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加さ
せることができる。
先行技術に鑑みて、本発明の目的は、先行技術のA2AP抗体の欠点を克服する新規な
治療用A2AP抗体を提供することである。特に、本発明の目的は、ヒトA2APの高親
和性結合剤である新規A2AP抗体を提供することである。望ましいA2AP抗体は、ウ
サギおよび/またはカニクイザルA2APに対して交差反応性である。それらはヒト治療
において非免疫原性であり、すなわち、それらはヒトまたはヒト化抗体である。望ましい
A2AP抗体はA2APに対して選択的であり、特に、ヒトプラスミンに結合せず、それ
を阻害しない。また、それらは、A2APの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加さ
せることができる。
そのような新規なA2AP抗体は、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋
梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症またはシャント血栓症などの部分的または
完全な血管閉塞に起因する虚血性事象に関連する疾患の治療において大きな進歩を提供す
る。
梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症またはシャント血栓症などの部分的または
完全な血管閉塞に起因する虚血性事象に関連する疾患の治療において大きな進歩を提供す
る。
発明の概要
上述の目的および他の目的は、本発明の教示によって達成される。本発明はα2-アン
チプラスミンに対して特異的親和性を有し、被験体に治療的利益を送達することができる
新規抗体の発見に基づく。
上述の目的および他の目的は、本発明の教示によって達成される。本発明はα2-アン
チプラスミンに対して特異的親和性を有し、被験体に治療的利益を送達することができる
新規抗体の発見に基づく。
したがって、第1の態様において、本発明は、ヒトA2APに結合する単離された抗体
またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結
合フラグメントは、
i)ウサギおよび/またはカニクイザルA2APと交差反応し、
ii)ヒトプラスミン活性を阻害せず、
iii)A2APをセリンプロテアーゼ阻害剤からセリンプロテアーゼ基質に変換せず、
iv)解離定数(KD)≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM
、または≦0.5nMで、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2APに結
合し;
v)≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM
、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で、配列番号1のアミノ酸40-491の配
列のヒトA2APに結合し;
vi)≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10n
M、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で、配列番号1のアミノ酸40~491の
ヒトA2APの活性を阻害し;および/または
A2APの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。
またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結
合フラグメントは、
i)ウサギおよび/またはカニクイザルA2APと交差反応し、
ii)ヒトプラスミン活性を阻害せず、
iii)A2APをセリンプロテアーゼ阻害剤からセリンプロテアーゼ基質に変換せず、
iv)解離定数(KD)≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM
、または≦0.5nMで、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2APに結
合し;
v)≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM
、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で、配列番号1のアミノ酸40-491の配
列のヒトA2APに結合し;
vi)≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10n
M、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で、配列番号1のアミノ酸40~491の
ヒトA2APの活性を阻害し;および/または
A2APの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。
本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、機能遮断抗α2-アンチ
プラスミン抗体または抗原結合フラグメントであり、これらは、他の血栓溶解促進化合物
に典型的であるため、出血のような望ましくない副作用を引き起こすことなく、インビト
ロ(in vitro)およびインビボ(in vivo)で加速された血餅溶解を誘導
する。したがって、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、虚血性
脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓
症またはシャント血栓症などの血管部分閉塞または完全閉塞に起因する虚血性事象に関連
する疾患の治療に使用することができる。本発明による単離された抗体または抗原結合フ
ラグメントは、A2AP関連障害の診断においてさらに使用され得る。
プラスミン抗体または抗原結合フラグメントであり、これらは、他の血栓溶解促進化合物
に典型的であるため、出血のような望ましくない副作用を引き起こすことなく、インビト
ロ(in vitro)およびインビボ(in vivo)で加速された血餅溶解を誘導
する。したがって、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、虚血性
脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓
症またはシャント血栓症などの血管部分閉塞または完全閉塞に起因する虚血性事象に関連
する疾患の治療に使用することができる。本発明による単離された抗体または抗原結合フ
ラグメントは、A2AP関連障害の診断においてさらに使用され得る。
さらなる態様において、本発明は、A2APに結合することができ、A2APの活性を
阻害することができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、プラスミン活性を阻害しない。
阻害することができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、プラスミン活性を阻害しない。
さらなる態様において、本発明は、ヒトA2APに結合し、A2APの活性を阻害する
ことができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、
ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸
402~408(SRMSLSS)を含むA2APのエピトープに結合する。
ことができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、
ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸
402~408(SRMSLSS)を含むA2APのエピトープに結合する。
さらなる態様において、本発明は、A2APへの結合について前記単離された抗体また
は抗原結合フラグメントと競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに
関する。
は抗原結合フラグメントと競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに
関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントを含む抗体コンジュゲートに関する。
メントを含む抗体コンジュゲートに関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントをコ
ードする単離された核酸配列に関する。
ードする単離された核酸配列に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による核酸配列を含むベクターに関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントを
発現する、および/または本発明による核酸もしくは本発明によるベクターを含む単離さ
れた細胞に関する。
発現する、および/または本発明による核酸もしくは本発明によるベクターを含む単離さ
れた細胞に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントを産生する方法であって、本発明による細胞を培養すること、および任意に抗体ま
たは抗原結合フラグメントを精製することを含む方法に関する。
メントを産生する方法であって、本発明による細胞を培養すること、および任意に抗体ま
たは抗原結合フラグメントを精製することを含む方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントまたは本発明による抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
メントまたは本発明による抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、疾患の治療または予防に使用するための、本発明に
よる単離された抗体または抗原結合フラグメント、または本発明によるコンジュゲート、
または本発明による医薬組成物に関する。
よる単離された抗体または抗原結合フラグメント、または本発明によるコンジュゲート、
または本発明による医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、診断薬としての使用のための、本発明による単離さ
れた抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは本発明によるコンジュゲートに関する。
れた抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは本発明によるコンジュゲートに関する。
さらなる態様において、本発明は、部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に
関連する障害または疾患、例えば虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞
、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症の治療または予防に使
用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、本発明によ
るコンジュゲートまたは本発明による医薬組成物に関する。
関連する障害または疾患、例えば虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞
、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症の治療または予防に使
用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、本発明によ
るコンジュゲートまたは本発明による医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、特に凝固カスケード阻害剤、抗凝固剤、および血小
板凝集阻害剤から選択される1種以上のさらなる治療活性化合物と同時に、別々に、また
は連続して組み合わせて使用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合
フラグメント、本発明によるコンジュゲートまたは本発明による医薬組成物に関する。
板凝集阻害剤から選択される1種以上のさらなる治療活性化合物と同時に、別々に、また
は連続して組み合わせて使用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合
フラグメント、本発明によるコンジュゲートまたは本発明による医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラ
グメントまたは本発明によるコンジュゲートと、使用説明書とを含むキットに関する。
グメントまたは本発明によるコンジュゲートと、使用説明書とを含むキットに関する。
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例を参照することによ
って、より容易に理解され得る。
本発明は、本発明の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例を参照することによ
って、より容易に理解され得る。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本
発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。しかしながら、
以下の参考文献は、本発明が関連する当業者に、本発明で使用される用語の多くの一般的
定義を提供することができ、そのような定義が当技術分野で一般的に理解される意味と一
致する限り、参考および使用することができる。そのような参考文献には、これらに限定
されないが、以下のものが含まれる:Singletonら、Dictionary o
f Microbiology and Molecular Biology (第2
版、1994);The Cambridge Dictionary of Scie
nce and Technology(Walker編、1988);Hale &
Marham、The Harper Collins Dictionary of
Biology(1991);およびLackieら、The Dictionary
of Cell&Molecular Biology(第3版、1999);およびC
ellular and Molecular Immunology、Eds.Abb
as、Lichtman and Pober、第2版、W.B.Saunders C
ompany。当業者に利用可能な、当技術分野で一般的に理解されている意味を有する
本明細書で使用される用語の定義を提供する任意の追加の技術的リソースを参考にするこ
とができる。本発明の目的のために、以下の用語をさらに定義する。さらなる用語は、本
明細書の他の箇所で定義される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合
、単数形「a」および「the」は文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の参照
を含む。したがって、例えば、「遺伝子(a gene)」への言及は1つまたは複数の
遺伝子への言及であり、当業者に公知のその等価物などを含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本
発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。しかしながら、
以下の参考文献は、本発明が関連する当業者に、本発明で使用される用語の多くの一般的
定義を提供することができ、そのような定義が当技術分野で一般的に理解される意味と一
致する限り、参考および使用することができる。そのような参考文献には、これらに限定
されないが、以下のものが含まれる:Singletonら、Dictionary o
f Microbiology and Molecular Biology (第2
版、1994);The Cambridge Dictionary of Scie
nce and Technology(Walker編、1988);Hale &
Marham、The Harper Collins Dictionary of
Biology(1991);およびLackieら、The Dictionary
of Cell&Molecular Biology(第3版、1999);およびC
ellular and Molecular Immunology、Eds.Abb
as、Lichtman and Pober、第2版、W.B.Saunders C
ompany。当業者に利用可能な、当技術分野で一般的に理解されている意味を有する
本明細書で使用される用語の定義を提供する任意の追加の技術的リソースを参考にするこ
とができる。本発明の目的のために、以下の用語をさらに定義する。さらなる用語は、本
明細書の他の箇所で定義される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合
、単数形「a」および「the」は文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の参照
を含む。したがって、例えば、「遺伝子(a gene)」への言及は1つまたは複数の
遺伝子への言及であり、当業者に公知のその等価物などを含む。
本明細書の文脈において、「含む(comprises)」または「含む(compr
ising)」という語は「含むが、これに限定されない(including, bu
t not limited to)」を意味する。この用語は、制限のないものを意図
しており、記載された特徴、要素、整数、ステップ、または構成要素の存在を特定するが
、1つまたは複数の他の特徴、要素、整数、ステップ、構成要素、またはそれらの群の存
在または追加を排除しない。したがって、「含む(comprising)」という用語
は、より限定的な用語「からなる(consisting of)」および「から本質的
になる(essentially consisting of)」を包含する。一実施
形態において、本出願を通して、特に特許請求の範囲内で使用される「含む」という用語
は、「からなる」という用語に置き換えることができる。
ising)」という語は「含むが、これに限定されない(including, bu
t not limited to)」を意味する。この用語は、制限のないものを意図
しており、記載された特徴、要素、整数、ステップ、または構成要素の存在を特定するが
、1つまたは複数の他の特徴、要素、整数、ステップ、構成要素、またはそれらの群の存
在または追加を排除しない。したがって、「含む(comprising)」という用語
は、より限定的な用語「からなる(consisting of)」および「から本質的
になる(essentially consisting of)」を包含する。一実施
形態において、本出願を通して、特に特許請求の範囲内で使用される「含む」という用語
は、「からなる」という用語に置き換えることができる。
これに関連して、「約(about)」または「およそ(approximately
)」という用語は、所与の値または範囲の80%~120%、あるいは90%~110%
を意味し、95%~105%の範囲内を含む。
)」という用語は、所与の値または範囲の80%~120%、あるいは90%~110%
を意味し、95%~105%の範囲内を含む。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために
本明細書において互換的に使用される。この用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が対
応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポ
リマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。特に明記しない限り、特定のポリペ
プチド配列は、その保存的に修飾された変異体も暗黙的に包含する。
本明細書において互換的に使用される。この用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が対
応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポ
リマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。特に明記しない限り、特定のポリペ
プチド配列は、その保存的に修飾された変異体も暗黙的に包含する。
本明細書で使用される場合、「A2AP」は、「SerpinF2」(セルピンファミ
リーFメンバー2)、AAP、API、PLI、またはALPHA-2-PIとしても知
られる「α2-アンチプラスミン」を示す。A2APは、セルピンスーパーファミリーの
メンバーである。これは、セリンプロテアーゼプラスミンの主要な生理学的阻害剤である
。A2APは、27アミノ酸のシグナルペプチドを有する491アミノ酸の前駆体として
合成される。分泌型は、短いプロペプチド(残基28~39)および成熟鎖(残基40~
491)を示す。ヒトA2APの参照配列は、UniProtKB/Swiss-Pro
tデータベースから受託番号P08697-1(配列番号1)で入手可能であり、シグナ
ルペプチド(1~27位)、プロペプチド(残基28~39)および成熟鎖(残基40~
491)を含む(番号付けは1位のメチオニンに従う)。
リーFメンバー2)、AAP、API、PLI、またはALPHA-2-PIとしても知
られる「α2-アンチプラスミン」を示す。A2APは、セルピンスーパーファミリーの
メンバーである。これは、セリンプロテアーゼプラスミンの主要な生理学的阻害剤である
。A2APは、27アミノ酸のシグナルペプチドを有する491アミノ酸の前駆体として
合成される。分泌型は、短いプロペプチド(残基28~39)および成熟鎖(残基40~
491)を示す。ヒトA2APの参照配列は、UniProtKB/Swiss-Pro
tデータベースから受託番号P08697-1(配列番号1)で入手可能であり、シグナ
ルペプチド(1~27位)、プロペプチド(残基28~39)および成熟鎖(残基40~
491)を含む(番号付けは1位のメチオニンに従う)。
ヒトA2AP(配列番号1):
MALLWGLLVLSWSCLQGPCSVFSPVSAMEPLGRQLTSGPNQEQVSPLTLLKLGNQEPGGQTALKSPPGVCSRDPTPEQTH
RLARAMMAFTADLFSLVAQTSTCPNLILSPLSVALALSHLALGAQNHTLQRLQQVLHAGSGPCLPHLLSRLCQDLGPGAF
RLAARMYLQKGFPIKEDFLEQSEQLFGAKPVSLTGKQEDDLANINQWVKEATEGKIQEFLSGLPEDTVLLLLNAIHFQGF
WRNKFDPSLTQRDSFHLDEQFTVPVEMMQARTYPLRWFLLEQPEIQVAHFPFKNNMSFVVLVPTHFEWNVSQVLANLSWD
TLHPPLVWERPTKVRLPKLYLKHQMDLVATLSQLGLQELFQAPDLRGISEQSLVVSGVQHQSTLELSEVGVEAAAATSIA
MSRMSLSSFSVNRPFLFFIFEDTTGLPLFVGSVRNPNPSAPRELKEQQDSPGNKDFLQSLKGFPRGDKLFGPDLKLVPPM
EEDYPQFGSPK
MALLWGLLVLSWSCLQGPCSVFSPVSAMEPLGRQLTSGPNQEQVSPLTLLKLGNQEPGGQTALKSPPGVCSRDPTPEQTH
RLARAMMAFTADLFSLVAQTSTCPNLILSPLSVALALSHLALGAQNHTLQRLQQVLHAGSGPCLPHLLSRLCQDLGPGAF
RLAARMYLQKGFPIKEDFLEQSEQLFGAKPVSLTGKQEDDLANINQWVKEATEGKIQEFLSGLPEDTVLLLLNAIHFQGF
WRNKFDPSLTQRDSFHLDEQFTVPVEMMQARTYPLRWFLLEQPEIQVAHFPFKNNMSFVVLVPTHFEWNVSQVLANLSWD
TLHPPLVWERPTKVRLPKLYLKHQMDLVATLSQLGLQELFQAPDLRGISEQSLVVSGVQHQSTLELSEVGVEAAAATSIA
MSRMSLSSFSVNRPFLFFIFEDTTGLPLFVGSVRNPNPSAPRELKEQQDSPGNKDFLQSLKGFPRGDKLFGPDLKLVPPM
EEDYPQFGSPK
本明細書で使用される場合、「プラスミン」は、「プラスミン」を示す。プラスミンは
、例えば血餅中のフィブリンを溶解するように作用する。プラスミンは、プラスミノーゲ
ン(PLG)と呼ばれるプロ酵素として肝臓から体循環に放出される。プラスミノーゲン
の2つの主要なグリコフォームがヒトに存在する-I型プラスミノーゲンは2つのグリコ
シル化部分(N289にN結合し、T346にO結合する)を含有するが、II型プラス
ミノーゲンは単一のO結合糖(T346にO結合する)のみを含有する。II型プラスミ
ノーゲンは、I型グリコフォームよりも細胞表面に優先的に動員される。逆に、I型プラ
スミノーゲンは、血餅により容易に動員されるようである。循環において、プラスミノー
ゲンは、閉構造、活性化抵抗性の立体構造をとる。血餅または細胞表面に結合すると、プ
ラスミノーゲンは、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)を含む様々な酵
素によって活性プラスミンに変換され得る開構造をとる。フィブリンは、組織プラスミノ
ーゲン活性化因子によるプラスミノーゲン活性化のための補因子である。プラスミノーゲ
ンのプラスミンへの変換は、Arg-561とVal-562(Wikipedia)と
の間のペプチド結合の切断を含む。
、例えば血餅中のフィブリンを溶解するように作用する。プラスミンは、プラスミノーゲ
ン(PLG)と呼ばれるプロ酵素として肝臓から体循環に放出される。プラスミノーゲン
の2つの主要なグリコフォームがヒトに存在する-I型プラスミノーゲンは2つのグリコ
シル化部分(N289にN結合し、T346にO結合する)を含有するが、II型プラス
ミノーゲンは単一のO結合糖(T346にO結合する)のみを含有する。II型プラスミ
ノーゲンは、I型グリコフォームよりも細胞表面に優先的に動員される。逆に、I型プラ
スミノーゲンは、血餅により容易に動員されるようである。循環において、プラスミノー
ゲンは、閉構造、活性化抵抗性の立体構造をとる。血餅または細胞表面に結合すると、プ
ラスミノーゲンは、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)を含む様々な酵
素によって活性プラスミンに変換され得る開構造をとる。フィブリンは、組織プラスミノ
ーゲン活性化因子によるプラスミノーゲン活性化のための補因子である。プラスミノーゲ
ンのプラスミンへの変換は、Arg-561とVal-562(Wikipedia)と
の間のペプチド結合の切断を含む。
用語「抗A2AP抗体」または「抗α2-アンチプラスミン抗体」および「α2-アン
チプラスミンに結合する抗体」または「A2APに結合する抗体」は、α2-アンチプラ
スミンを十分な親和性で結合することができる抗体を指し、その結果、抗体は、α2-ア
ンチプラスミンを標的とする際の診断および/または治療剤として有用である。一実施形
態において、非関連、非α2-アンチプラスミンタンパク質への抗α2-アンチプラスミ
ン抗体の結合の程度が例えば、標準的なELISA手順によって測定した場合、α2-ア
ンチプラスミンへの抗体の結合の約10%未満、約5%未満、または約2%未満である。
ある態様において、α2-アンチプラスミンに結合する抗体は、≦1μM、≦100nM
、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM(例
えば、10-8M以下、例えば、10-8M~10-13M、例えば、10-9M~10
-13M)の結合活性(EC50)を有する。特定の実施形態において、抗α2-アンチ
プラスミン抗体が異なる種由来のα2-アンチプラスミンの間で保存されているα2-ア
ンチプラスミンのエピトープに結合する。
チプラスミンに結合する抗体」または「A2APに結合する抗体」は、α2-アンチプラ
スミンを十分な親和性で結合することができる抗体を指し、その結果、抗体は、α2-ア
ンチプラスミンを標的とする際の診断および/または治療剤として有用である。一実施形
態において、非関連、非α2-アンチプラスミンタンパク質への抗α2-アンチプラスミ
ン抗体の結合の程度が例えば、標準的なELISA手順によって測定した場合、α2-ア
ンチプラスミンへの抗体の結合の約10%未満、約5%未満、または約2%未満である。
ある態様において、α2-アンチプラスミンに結合する抗体は、≦1μM、≦100nM
、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM(例
えば、10-8M以下、例えば、10-8M~10-13M、例えば、10-9M~10
-13M)の結合活性(EC50)を有する。特定の実施形態において、抗α2-アンチ
プラスミン抗体が異なる種由来のα2-アンチプラスミンの間で保存されているα2-ア
ンチプラスミンのエピトープに結合する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子を指すことが意図さ
れる。抗体は、4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖(約50~70kDa)および
2つの軽(L)鎖(約25kDa)を含み得、これらは典型的にはジスルフィド結合によ
って相互連結される。特定の実施形態において、抗体がポリペプチド鎖の2つの同一の対
から構成される。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約100~110ま
たはそれ以上のアミノ酸の「可変」領域を含む。重鎖可変領域は、本明細書においてVH
と略記され、軽鎖可変領域は、本明細書においてVLと略記される。各鎖のカルボキシル
末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。重鎖定常領域は例えば、
3つのドメインCH1、CH2およびCH3を含むことができる。軽鎖定常領域は、1つ
のドメイン(CL)からなる。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼
ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性
の領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、典型的にはアミノ末端から
カルボキシ末端に、例えば、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3
、CDR3、FR4で配列された、3つのCDRおよび最大4つのFRから構成される。
れる。抗体は、4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖(約50~70kDa)および
2つの軽(L)鎖(約25kDa)を含み得、これらは典型的にはジスルフィド結合によ
って相互連結される。特定の実施形態において、抗体がポリペプチド鎖の2つの同一の対
から構成される。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約100~110ま
たはそれ以上のアミノ酸の「可変」領域を含む。重鎖可変領域は、本明細書においてVH
と略記され、軽鎖可変領域は、本明細書においてVLと略記される。各鎖のカルボキシル
末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。重鎖定常領域は例えば、
3つのドメインCH1、CH2およびCH3を含むことができる。軽鎖定常領域は、1つ
のドメイン(CL)からなる。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼
ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性
の領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、典型的にはアミノ末端から
カルボキシ末端に、例えば、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3
、CDR3、FR4で配列された、3つのCDRおよび最大4つのFRから構成される。
本明細書で使用される場合、用語「相補性決定領域」(CDR;例えば、CDR1、C
DR2、およびCDR3)は、その存在が抗原結合に必要である抗体可変ドメインのアミ
ノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的にはCDR1、CDR2およびCDR3とし
て同定される3つのCDRを有する。各相補性決定領域は、Kabatにより定義されて
いるような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の約2
3~36(L1)、52~58(L2)および91~101(L3)ならびに重鎖可変ド
メイン中の31~35(H1)、50~65(H2)および98~110(H3);(K
abatら、Sequences of Proteins of Immunolog
ical Interest、第5版、Public Health Service、
National Institutes of Health、Bethesda、M
D(1991))および/または「超可変ループ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可
変ドメイン中の約26~32(L1)、50~52(L2)および91~96(L3)な
らびに重鎖可変ドメイン中の26~32(H1)、53~55(H2)および96~10
1(H3)(Chothia and Lesk;J Mol Biol 196:90
1-917(1987)))を含み得る。いくつかの例において、相補性決定領域は、K
abatに従って定義されるCDRおよび超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る
。
DR2、およびCDR3)は、その存在が抗原結合に必要である抗体可変ドメインのアミ
ノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的にはCDR1、CDR2およびCDR3とし
て同定される3つのCDRを有する。各相補性決定領域は、Kabatにより定義されて
いるような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の約2
3~36(L1)、52~58(L2)および91~101(L3)ならびに重鎖可変ド
メイン中の31~35(H1)、50~65(H2)および98~110(H3);(K
abatら、Sequences of Proteins of Immunolog
ical Interest、第5版、Public Health Service、
National Institutes of Health、Bethesda、M
D(1991))および/または「超可変ループ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可
変ドメイン中の約26~32(L1)、50~52(L2)および91~96(L3)な
らびに重鎖可変ドメイン中の26~32(H1)、53~55(H2)および96~10
1(H3)(Chothia and Lesk;J Mol Biol 196:90
1-917(1987)))を含み得る。いくつかの例において、相補性決定領域は、K
abatに従って定義されるCDRおよび超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る
。
「フレームワーク」またはFR残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である
。
。
語句「定常領域」とは、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。
本明細書において用語「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリ
ン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Fc領域および
変異体Fc領域を含む。一実施形態において、ヒトIgG重鎖Fc領域がCys226か
ら、またはPro230から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Fc領
域のC末端リシン(Lys447)は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書におい
て別段の指定がない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、
Kabatら、Sequences of Proteins of Immunolo
gical Interest、第5版、Public Health Service
、National Institutes of Health、Bethesda、
MD、1991に記載されているように、EU番号付けシステム(EUインデックスとも
呼ばれる)に従う。
ン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Fc領域および
変異体Fc領域を含む。一実施形態において、ヒトIgG重鎖Fc領域がCys226か
ら、またはPro230から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Fc領
域のC末端リシン(Lys447)は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書におい
て別段の指定がない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、
Kabatら、Sequences of Proteins of Immunolo
gical Interest、第5版、Public Health Service
、National Institutes of Health、Bethesda、
MD、1991に記載されているように、EU番号付けシステム(EUインデックスとも
呼ばれる)に従う。
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラス
に割り当てることができる。重鎖は、ミュー(μ)、デルタ(Δ)、ガンマ(γ)、α(
α)、およびエプシロン(ε)として分類され、それぞれIgM、IgD、IgG、Ig
A、およびIgEとして抗体のアイソタイプを定義する。特定の実施形態において、本発
明による抗体がIgG抗体である。これらのうちのいくつかは、サブクラスまたはアイソ
タイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に
さらに分けられ得る。特定の実施形態において、本発明による抗体がIgG1、IgG2
、IgG3またはIgG4抗体、より具体的にはIgG1またはIgG4抗体である。異
なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有し得る。ヒト軽鎖は、カッパ(Κ)お
よびラムダ(λ)軽鎖として分類される。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域
は、約12個以上のアミノ酸の「J」領域によって連結され、重鎖はまた、約10個以上
のアミノ酸の「D」領域を含む。一般的には、Fundamental Immunol
ogy、Ch.7(Paul、W.編集、第2版、Raven Press、N.Y(1
989))を参照されたい。
に割り当てることができる。重鎖は、ミュー(μ)、デルタ(Δ)、ガンマ(γ)、α(
α)、およびエプシロン(ε)として分類され、それぞれIgM、IgD、IgG、Ig
A、およびIgEとして抗体のアイソタイプを定義する。特定の実施形態において、本発
明による抗体がIgG抗体である。これらのうちのいくつかは、サブクラスまたはアイソ
タイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に
さらに分けられ得る。特定の実施形態において、本発明による抗体がIgG1、IgG2
、IgG3またはIgG4抗体、より具体的にはIgG1またはIgG4抗体である。異
なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有し得る。ヒト軽鎖は、カッパ(Κ)お
よびラムダ(λ)軽鎖として分類される。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域
は、約12個以上のアミノ酸の「J」領域によって連結され、重鎖はまた、約10個以上
のアミノ酸の「D」領域を含む。一般的には、Fundamental Immunol
ogy、Ch.7(Paul、W.編集、第2版、Raven Press、N.Y(1
989))を参照されたい。
抗体/免疫グロブリンの「機能的フラグメント」または「抗原結合抗体フラグメント」
は本明細書において、抗原結合領域を保持する抗体/免疫グロブリンのフラグメント(例
えば、IgGの可変領域)として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には抗
体の1つまたは複数の超可変領域、例えば、CDR1、-2、および/または-3領域に
見出される;しかしながら、可変「フレームワーク」領域はまた、CDRの足場を提供す
ることなどによって、抗原結合において重要な役割を果たすことができる。好ましくは「
抗原結合領域」は、少なくとも可変軽(VL)鎖の4~103および可変重(VH)鎖の
5~109アミノ酸残基、より好ましくはVLの3~107およびVHの4~111アミ
ノ酸残基を含み、特に好ましくは完全なVLおよびVH鎖(VLの1~109およびVH
の1~113アミノ酸位置;WO97/08320による番号付け)である。
は本明細書において、抗原結合領域を保持する抗体/免疫グロブリンのフラグメント(例
えば、IgGの可変領域)として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には抗
体の1つまたは複数の超可変領域、例えば、CDR1、-2、および/または-3領域に
見出される;しかしながら、可変「フレームワーク」領域はまた、CDRの足場を提供す
ることなどによって、抗原結合において重要な役割を果たすことができる。好ましくは「
抗原結合領域」は、少なくとも可変軽(VL)鎖の4~103および可変重(VH)鎖の
5~109アミノ酸残基、より好ましくはVLの3~107およびVHの4~111アミ
ノ酸残基を含み、特に好ましくは完全なVLおよびVH鎖(VLの1~109およびVH
の1~113アミノ酸位置;WO97/08320による番号付け)である。
「機能的フラグメント」または「抗原結合抗体フラグメント」の非限定的な例としては
、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、ドメイン抗体(dAb)、相
補性決定領域(CDR)フラグメント、単鎖抗体(scFv)、単鎖抗体フラグメント、
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体(Zapataら、Protei
n Eng.、8(10):1057-1062(1995));キレート化組換え抗体
、トリボディまたはバイボディ、ナノボディ、小モジュラー免疫製剤(SMIP)、抗原
結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、VHH含有抗体、またはそ
のムテインまたは誘導体、および抗体が所望の生物学的活性を保持する限り、CDR配列
などの、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくと
も一部を含有するポリペプチド;および抗体フラグメントから形成される二重特異性およ
び三重特異性抗体(C.A.K Borrebaeck、editor(1995)An
tibody Engineering(Breakthroughs in Mole
cular Biology)、Oxford University Press;R
.Kontermann&S.Duebel、editors(2001)Antibo
dy Engineering(Springer Laboratory Manua
l)、Springer Verlag)が挙げられる。「二重特異性」または「二機能
性」抗体以外の抗体は、その結合部位の各々が同一であると理解される。F(ab’)2
またはFabは、CH1領域とCL領域との間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最
小化または完全に除去するように操作され得る。抗体のパパイン消化は、2つの同じ抗原
結合フラグメント(「Fab」フラグメントと呼ばれ、これらは各々、1つの抗原結合部
位を含む)と、残りの「Fc」フラグメント(この名前は容易に結晶化する能力を反映す
る)とを生じる。ペプシン処理により、2つの「Fv」フラグメントを有するF(ab’
)2フラグメントが得られる。「Fv」フラグメントは、完全な抗原認識および結合部位
を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖
可変ドメインとが硬く非共有的に会合している二量体から構成されている。各可変ドメイ
ンの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面上の抗原結合部位を規定する
のは、この立体配置である。まとめると、6個のCDRによって、抗体に対する抗原結合
特異性が付与される。しかし、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDR
のみを含むFvの半分)でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有する。
、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、ドメイン抗体(dAb)、相
補性決定領域(CDR)フラグメント、単鎖抗体(scFv)、単鎖抗体フラグメント、
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体(Zapataら、Protei
n Eng.、8(10):1057-1062(1995));キレート化組換え抗体
、トリボディまたはバイボディ、ナノボディ、小モジュラー免疫製剤(SMIP)、抗原
結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、VHH含有抗体、またはそ
のムテインまたは誘導体、および抗体が所望の生物学的活性を保持する限り、CDR配列
などの、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくと
も一部を含有するポリペプチド;および抗体フラグメントから形成される二重特異性およ
び三重特異性抗体(C.A.K Borrebaeck、editor(1995)An
tibody Engineering(Breakthroughs in Mole
cular Biology)、Oxford University Press;R
.Kontermann&S.Duebel、editors(2001)Antibo
dy Engineering(Springer Laboratory Manua
l)、Springer Verlag)が挙げられる。「二重特異性」または「二機能
性」抗体以外の抗体は、その結合部位の各々が同一であると理解される。F(ab’)2
またはFabは、CH1領域とCL領域との間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最
小化または完全に除去するように操作され得る。抗体のパパイン消化は、2つの同じ抗原
結合フラグメント(「Fab」フラグメントと呼ばれ、これらは各々、1つの抗原結合部
位を含む)と、残りの「Fc」フラグメント(この名前は容易に結晶化する能力を反映す
る)とを生じる。ペプシン処理により、2つの「Fv」フラグメントを有するF(ab’
)2フラグメントが得られる。「Fv」フラグメントは、完全な抗原認識および結合部位
を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖
可変ドメインとが硬く非共有的に会合している二量体から構成されている。各可変ドメイ
ンの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面上の抗原結合部位を規定する
のは、この立体配置である。まとめると、6個のCDRによって、抗体に対する抗原結合
特異性が付与される。しかし、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDR
のみを含むFvの半分)でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有する。
「単鎖Fv」または「sFv」または「scFv」抗体フラグメントは、抗体のVHお
よびVLドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。
よびVLドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。
好ましくは、Fvポリペプチドは、Fvが抗原結合のための所望の構造を形成すること
を可能にする、VHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む
。Fvの総説については、Pluckthun in The Pharmacolog
y of Monoclonal Antibodies、第113巻、Rosenbu
rg and Moore編、Springer-Verlag、New York、2
69-315頁(1994)を参照されたい。
を可能にする、VHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む
。Fvの総説については、Pluckthun in The Pharmacolog
y of Monoclonal Antibodies、第113巻、Rosenbu
rg and Moore編、Springer-Verlag、New York、2
69-315頁(1994)を参照されたい。
Fabフラグメントにはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第1定常ドメイン(CH1
)とが含まれる。Fabフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1つまたは複数のシステ
イン残基を含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によっ
て、Fab’フラグメントとは異なる。Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残
基(単数または複数)が遊離のチオール基を有しているFab’についての本明細書中で
の名称である。F(ab’)2抗体フラグメントは、元々、それらの間にヒンジシステイ
ン残基を有するFab’フラグメントの対として産生された。
)とが含まれる。Fabフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1つまたは複数のシステ
イン残基を含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によっ
て、Fab’フラグメントとは異なる。Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残
基(単数または複数)が遊離のチオール基を有しているFab’についての本明細書中で
の名称である。F(ab’)2抗体フラグメントは、元々、それらの間にヒンジシステイ
ン残基を有するFab’フラグメントの対として産生された。
用語「ムテイン」または「変異体」は互換的に使用することができ、可変領域または可
変領域と等価な部分に少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む抗体また
は抗原結合フラグメントを指すが、ただし、ムテインまたは変異体は、所望の結合親和性
または生物学的活性を保持する。本発明において企図される抗体または抗原結合抗体フラ
グメントの変異体は、抗体または抗原結合抗体フラグメントの結合活性が維持される分子
である。
変領域と等価な部分に少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む抗体また
は抗原結合フラグメントを指すが、ただし、ムテインまたは変異体は、所望の結合親和性
または生物学的活性を保持する。本発明において企図される抗体または抗原結合抗体フラ
グメントの変異体は、抗体または抗原結合抗体フラグメントの結合活性が維持される分子
である。
「キメラ抗体」またはその抗原結合フラグメントは本明細書において、可変ドメインが
非ヒト起源に由来し、いくつかまたはすべての定常ドメインがヒト起源に由来するものと
して定義される。
非ヒト起源に由来し、いくつかまたはすべての定常ドメインがヒト起源に由来するものと
して定義される。
「ヒト化抗体」は例えば、任意の必要なフレームワーク復帰突然変異と共にヒト配列由
来V領域に移植された、マウスなどの非ヒト種に由来するCDR領域を含む。したがって
、ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異
性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非
ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリ
ン(レシピエント抗体)である。例えば、米国特許第5,225,539号;同第5,5
85,089号;同第5,693,761号;同第5,693,762号;同第5,85
9,205号(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。いくつ
かの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によ
って置換される(例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,5
85,089号;同第5,693,761号;同第5,693,762号を参照されたい
)。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含
むことができる。これらの修飾は抗体性能をさらに改良するために(例えば、所望の親和
性を得るために)行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変領域のすべてまたは実質的に
すべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質
的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの
可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリン定常領域(
Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。さらなる詳細に
ついては、Jonesら、Nature 331:522-25(1986);Riec
hmannら、Nature 332:323-27(1988);およびPresta
、Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-96(1992)(それ
ぞれ参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
来V領域に移植された、マウスなどの非ヒト種に由来するCDR領域を含む。したがって
、ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異
性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非
ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリ
ン(レシピエント抗体)である。例えば、米国特許第5,225,539号;同第5,5
85,089号;同第5,693,761号;同第5,693,762号;同第5,85
9,205号(それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。いくつ
かの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によ
って置換される(例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,5
85,089号;同第5,693,761号;同第5,693,762号を参照されたい
)。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含
むことができる。これらの修飾は抗体性能をさらに改良するために(例えば、所望の親和
性を得るために)行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変領域のすべてまたは実質的に
すべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質
的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの
可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリン定常領域(
Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。さらなる詳細に
ついては、Jonesら、Nature 331:522-25(1986);Riec
hmannら、Nature 332:323-27(1988);およびPresta
、Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-96(1992)(それ
ぞれ参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」は、ヒト由来CDR、すなわちヒト起源のCDR
を含む。完全ヒト抗体は、IMGTデータベース(http://www.imgt.o
rg)に基づいて決定された最も近いヒト生殖系列基準と比較して、少数の生殖系列逸脱
を含み得る。例えば、本発明による完全ヒト抗体は、最も近いヒト生殖系列基準と比較し
て、CDRにおける最大1、2、3、4、5、6、7、8、9または10の生殖系列偏差
を含み得る。完全ヒト抗体は、細胞濃縮または不死化工程と組み合わせたクローニング技
術によって、ヒト由来B細胞から開発することができる。しかしながら、完全ヒト抗体の
大部分は、ヒトIgG遺伝子座のトランスジェニック免疫マウス、またはファージディス
プレイによる洗練されたコンビナトリアルライブラリーから単離される(Bruegge
mann M.、Osborn M.J.、Ma B.、Hayre J.、Avis
S.、Lundstrom B. and Buelow R.、Human Anti
body Production in Transgenic Animals、Ar
ch Immunol Ther Exp(Warsz.)63(2015)、101-
108;Carter P.J.、Potent antibody therapeu
tics by design、Nat Rev Immunol 6(2006)、3
43-357;Frenzel A.、Schirrmann T. and Hust
M.、Phage display-derived human antibodi
es in clinical development and therapy、M
Abs 8(2016)、1177-1194;Nelson A.L.、Dhimol
ea E. and Reichert J.M.、Development tren
ds for human monoclonal antibody therape
utics、Nat Rev Drug Discov 9(2010)、767-77
4.))。
を含む。完全ヒト抗体は、IMGTデータベース(http://www.imgt.o
rg)に基づいて決定された最も近いヒト生殖系列基準と比較して、少数の生殖系列逸脱
を含み得る。例えば、本発明による完全ヒト抗体は、最も近いヒト生殖系列基準と比較し
て、CDRにおける最大1、2、3、4、5、6、7、8、9または10の生殖系列偏差
を含み得る。完全ヒト抗体は、細胞濃縮または不死化工程と組み合わせたクローニング技
術によって、ヒト由来B細胞から開発することができる。しかしながら、完全ヒト抗体の
大部分は、ヒトIgG遺伝子座のトランスジェニック免疫マウス、またはファージディス
プレイによる洗練されたコンビナトリアルライブラリーから単離される(Bruegge
mann M.、Osborn M.J.、Ma B.、Hayre J.、Avis
S.、Lundstrom B. and Buelow R.、Human Anti
body Production in Transgenic Animals、Ar
ch Immunol Ther Exp(Warsz.)63(2015)、101-
108;Carter P.J.、Potent antibody therapeu
tics by design、Nat Rev Immunol 6(2006)、3
43-357;Frenzel A.、Schirrmann T. and Hust
M.、Phage display-derived human antibodi
es in clinical development and therapy、M
Abs 8(2016)、1177-1194;Nelson A.L.、Dhimol
ea E. and Reichert J.M.、Development tren
ds for human monoclonal antibody therape
utics、Nat Rev Drug Discov 9(2010)、767-77
4.))。
完全ヒト抗体を作製するために、いくつかの技術が利用可能である(WO2008/1
12640A3参照)。Cambridge Antibody Technologi
es(CAT)およびDyaxは、免疫化されたヒトから単離された末梢B細胞から抗体
cDNA配列を得て、特定の特異性のヒト可変領域配列の同定のためのファージディスプ
レイライブラリーを考案した。簡潔に述べると、抗体可変領域配列は、M13バクテリオ
ファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIII構造のいずれかと融合される。これらの抗
体可変領域配列は、それぞれの配列を有するファージの先端でFabまたは単鎖Fv(s
cFv)構造のいずれかとして発現される。異なるレベルの抗原結合条件(ストリンジェ
ンシー)を使用するパニングプロセスのラウンドを通して、目的の抗原に特異的なFab
またはscFv構造を発現するファージを選択し、単離することができる。次いで、選択
されたファージの抗体可変領域cDNA配列を、標準的な配列決定手順を用いて解明する
ことができる。次いで、これらの配列は、確立された抗体工学技術を使用して、所望のア
イソタイプを有する完全抗体の再構築のために使用され得る。この方法に従って構築され
た抗体は、完全ヒト抗体(CDRを含む)とみなされる。選択された抗体の免疫反応性(
抗原結合親和性および特異性)を改善するために、異なる重鎖および軽鎖の組み合わせ会
合、重鎖および軽鎖のCDR3における欠失/付加/突然変異(V-JおよびV-D-J
組換えを模倣するため)、およびランダム突然変異(体細胞超突然変異を模倣するため)
を含む、インビトロ成熟プロセスを導入することができる。この方法によって生成される
「完全ヒト」抗体の例は、抗腫瘍壊死因子α抗体、Humira(アダリムマブ)である
。
12640A3参照)。Cambridge Antibody Technologi
es(CAT)およびDyaxは、免疫化されたヒトから単離された末梢B細胞から抗体
cDNA配列を得て、特定の特異性のヒト可変領域配列の同定のためのファージディスプ
レイライブラリーを考案した。簡潔に述べると、抗体可変領域配列は、M13バクテリオ
ファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIII構造のいずれかと融合される。これらの抗
体可変領域配列は、それぞれの配列を有するファージの先端でFabまたは単鎖Fv(s
cFv)構造のいずれかとして発現される。異なるレベルの抗原結合条件(ストリンジェ
ンシー)を使用するパニングプロセスのラウンドを通して、目的の抗原に特異的なFab
またはscFv構造を発現するファージを選択し、単離することができる。次いで、選択
されたファージの抗体可変領域cDNA配列を、標準的な配列決定手順を用いて解明する
ことができる。次いで、これらの配列は、確立された抗体工学技術を使用して、所望のア
イソタイプを有する完全抗体の再構築のために使用され得る。この方法に従って構築され
た抗体は、完全ヒト抗体(CDRを含む)とみなされる。選択された抗体の免疫反応性(
抗原結合親和性および特異性)を改善するために、異なる重鎖および軽鎖の組み合わせ会
合、重鎖および軽鎖のCDR3における欠失/付加/突然変異(V-JおよびV-D-J
組換えを模倣するため)、およびランダム突然変異(体細胞超突然変異を模倣するため)
を含む、インビトロ成熟プロセスを導入することができる。この方法によって生成される
「完全ヒト」抗体の例は、抗腫瘍壊死因子α抗体、Humira(アダリムマブ)である
。
「Human Engineered(商標)」抗体は、Studnickaら、米国
特許第5,766,886号に記載されている方法に従って、親配列を変更することによ
って生成される。
特許第5,766,886号に記載されている方法に従って、親配列を変更することによ
って生成される。
本発明の抗体は、組換え抗体遺伝子ライブラリーに由来し得る。組換えヒト抗体遺伝子
のレパートリーを作製するためのテクノロジーの開発、および糸状バクテリオファージの
表面上のコードされた抗体フラグメントのディスプレイは、ヒト化、キメラ、マウス、ま
たはムテイン抗体にも適用することができる、ヒト抗体を直接的に作製および選択するた
めの組換え手段を提供した。ファージ技術によって産生される抗体は、細菌において抗原
結合フラグメント(通常はFvまたはFabフラグメント)として産生され、したがって
エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、次の2つの戦略のうちの1つによって導
入することができる:フラグメントが哺乳動物細胞における発現のために完全抗体中に、
またはエフェクター機能を誘発することができる第2の結合部位を有する二重特異性抗体
フラグメント中に操作することができる。典型的には、抗体のFdフラグメント(VH-
CH1)および軽鎖(VL-CL)がPCRによって別々にクローニングされ、コンビナ
トリアルファージディスプレイライブラリー中で無作為に組み換えられ、その後、特定の
抗原への結合について選択され得る。Fabフラグメントはファージ表面上で発現される
、すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に連結される。したがって、抗原結合に
よるFabの選択は、Fabをコードする配列を共選択し、その後増幅することができる
。数ラウンドの抗原結合および再増幅によって、パンニングと呼ばれる手順によって、抗
原に特異的なFabが濃縮され、最終的に単離される。
のレパートリーを作製するためのテクノロジーの開発、および糸状バクテリオファージの
表面上のコードされた抗体フラグメントのディスプレイは、ヒト化、キメラ、マウス、ま
たはムテイン抗体にも適用することができる、ヒト抗体を直接的に作製および選択するた
めの組換え手段を提供した。ファージ技術によって産生される抗体は、細菌において抗原
結合フラグメント(通常はFvまたはFabフラグメント)として産生され、したがって
エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、次の2つの戦略のうちの1つによって導
入することができる:フラグメントが哺乳動物細胞における発現のために完全抗体中に、
またはエフェクター機能を誘発することができる第2の結合部位を有する二重特異性抗体
フラグメント中に操作することができる。典型的には、抗体のFdフラグメント(VH-
CH1)および軽鎖(VL-CL)がPCRによって別々にクローニングされ、コンビナ
トリアルファージディスプレイライブラリー中で無作為に組み換えられ、その後、特定の
抗原への結合について選択され得る。Fabフラグメントはファージ表面上で発現される
、すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に連結される。したがって、抗原結合に
よるFabの選択は、Fabをコードする配列を共選択し、その後増幅することができる
。数ラウンドの抗原結合および再増幅によって、パンニングと呼ばれる手順によって、抗
原に特異的なFabが濃縮され、最終的に単離される。
ファージディスプレイライブラリーに由来するヒト抗体について、様々な手順が記載さ
れている。そのようなライブラリーは、Carlsson and Soederlin
d Exp.Rev.Mol.Diagn.1(1)、102-108 (2001)、
Soederlinら、Nat.Biotech.18、852-856(2000)お
よび米国特許第6,989,250号によって記載されるように、多様なインビボで形成
された(すなわち、ヒト由来の)CDRを組み換えることができる単一のマスターフレー
ムワーク上に構築することができる。あるいは、そのような抗体ライブラリーは、インシ
リコで設計され、合成的に作製される核酸によってコードされるアミノ酸配列に基づき得
る。抗体配列のインシリコ設計は例えば、ヒト配列のデータベースを分析し、そこから得
られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することによって達成される。インシリ
コで作製された配列を設計および取得するための方法は例えば、Knappikら、J.
Mol.Biol.(2000)296:57;Krebsら、J.Immunol.M
ethods.(2001)254:67;および米国特許第6,300,064号に記
載されている。ファージディスプレイスクリーニングの概説(例えば、Hoet RMら
、Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8を参照のこと)に
ついては、十分に確立されたハイブリドーマテクノロジー(例えば、Koehler a
nd Milstein Nature.1975 Aug 7;256(5517):
495-7を参照のこと)、またはマウスの免疫化、とりわけhMAbマウスの免疫化(
例えば、VelocImmune mouse(登録商標))。
れている。そのようなライブラリーは、Carlsson and Soederlin
d Exp.Rev.Mol.Diagn.1(1)、102-108 (2001)、
Soederlinら、Nat.Biotech.18、852-856(2000)お
よび米国特許第6,989,250号によって記載されるように、多様なインビボで形成
された(すなわち、ヒト由来の)CDRを組み換えることができる単一のマスターフレー
ムワーク上に構築することができる。あるいは、そのような抗体ライブラリーは、インシ
リコで設計され、合成的に作製される核酸によってコードされるアミノ酸配列に基づき得
る。抗体配列のインシリコ設計は例えば、ヒト配列のデータベースを分析し、そこから得
られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することによって達成される。インシリ
コで作製された配列を設計および取得するための方法は例えば、Knappikら、J.
Mol.Biol.(2000)296:57;Krebsら、J.Immunol.M
ethods.(2001)254:67;および米国特許第6,300,064号に記
載されている。ファージディスプレイスクリーニングの概説(例えば、Hoet RMら
、Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8を参照のこと)に
ついては、十分に確立されたハイブリドーマテクノロジー(例えば、Koehler a
nd Milstein Nature.1975 Aug 7;256(5517):
495-7を参照のこと)、またはマウスの免疫化、とりわけhMAbマウスの免疫化(
例えば、VelocImmune mouse(登録商標))。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集
団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る
可能な変異、例えば、天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、用語「モノ
クローナル」は、別個の抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。異なる決定基(エピト
ープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノ
クローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するもので
ある。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロ
ブリンによって汚染されないという点で有利である。用語「モノクローナル」は、任意の
特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、使用され
るモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、256:495[1975]
によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えDN
A法によって作製され得る(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)
。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、組換え、キメラ、ヒト化、ヒト、Human
Engineered(商標)、または抗体フラグメントであってもよい。
団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る
可能な変異、例えば、天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、用語「モノ
クローナル」は、別個の抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。異なる決定基(エピト
ープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノ
クローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するもので
ある。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロ
ブリンによって汚染されないという点で有利である。用語「モノクローナル」は、任意の
特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、使用され
るモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、256:495[1975]
によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えDN
A法によって作製され得る(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)
。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、組換え、キメラ、ヒト化、ヒト、Human
Engineered(商標)、または抗体フラグメントであってもよい。
「単離された」抗体は、それを発現した細胞の成分から同定され、分離されたものであ
る。細胞の汚染成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホ
ルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
る。細胞の汚染成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホ
ルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から同定され、分離されたものである。単
離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は染色
体外またはその天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。
離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は染色
体外またはその天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。
本明細書中で使用される場合、抗体は、関心対象の抗原、例えばA2AP「に特異的に
結合し」、「に特異的であり」、または「を特異的に認識する」ものであり、十分な親和
性で抗原に結合するものであり、そのため、抗体は、抗原を発現する細胞または組織を標
的とする際に治療薬として有用であり、前述の抗原標的のオルソログおよび変異体(例え
ば、変異体形態、スプライス変異体、またはタンパク質分解的に切断された形態)以外の
タンパク質と有意に交差反応しない。本明細書で使用される特定のポリペプチドまたは特
定のポリペプチド標的上のエピトープ「を特異的に認識する」または「に特異的に結合す
る」または「に特異的である」という用語は、例えば、約10-4M未満、あるいは約1
0-5M未満、あるいは約10-6M未満、あるいは約10-7M未満、あるいは約10
-8M未満、あるいは約10-9M未満、あるいは約10-10M未満、あるいは約10
-11M未満、あるいは約10-12M未満、またはそれ未満の抗原に対する一価KDを
有する、抗体またはその抗原結合フラグメントによって示すことができる。そのような抗
体がそのような抗原と1つまたは複数の参照抗原とを区別することができる場合、抗体は
、抗原「に特異的に結合する」、「に特異的である」、または「を特異的に認識する」。
その最も一般的な形態において、「特異的結合」、「に特異的に結合する」、「に特異的
である」、または「特異的に認識する」は例えば、以下の方法の1つに従って決定される
ように、目的の抗原と無関係の抗原とを区別する抗体の能力を指す。そのような方法は限
定されるものではないが、表面プラズモン共鳴(SPR)、ウェスタンブロット、ELI
SA-、RIA-、ECL-、IRMA-試験およびペプチドスキャンを含む。例えば、
標準的なELISAアッセイを行うことができる。スコアリングは標準的な発色によって
行うことができる(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼとの二次抗体および過酸化水素
とのテトラメチルベンジジン)。特定のウェルにおける反応は光学密度、例えば、450
nmでスコアリングされる。典型的なバックグラウンド(=陰性反応)は0.1ODであ
り得;典型的な陽性反応は1ODであり得る。これは、正/負の差異が5倍超、10倍超
、50倍超、好ましくは100倍超であることを意味する。典型的には、結合特異性の決
定は、単一の参照抗原ではなく、粉乳、BSA、トランスフェリンなどの約3~5個の無
関係の抗原のセットを使用することによって行われる。
結合し」、「に特異的であり」、または「を特異的に認識する」ものであり、十分な親和
性で抗原に結合するものであり、そのため、抗体は、抗原を発現する細胞または組織を標
的とする際に治療薬として有用であり、前述の抗原標的のオルソログおよび変異体(例え
ば、変異体形態、スプライス変異体、またはタンパク質分解的に切断された形態)以外の
タンパク質と有意に交差反応しない。本明細書で使用される特定のポリペプチドまたは特
定のポリペプチド標的上のエピトープ「を特異的に認識する」または「に特異的に結合す
る」または「に特異的である」という用語は、例えば、約10-4M未満、あるいは約1
0-5M未満、あるいは約10-6M未満、あるいは約10-7M未満、あるいは約10
-8M未満、あるいは約10-9M未満、あるいは約10-10M未満、あるいは約10
-11M未満、あるいは約10-12M未満、またはそれ未満の抗原に対する一価KDを
有する、抗体またはその抗原結合フラグメントによって示すことができる。そのような抗
体がそのような抗原と1つまたは複数の参照抗原とを区別することができる場合、抗体は
、抗原「に特異的に結合する」、「に特異的である」、または「を特異的に認識する」。
その最も一般的な形態において、「特異的結合」、「に特異的に結合する」、「に特異的
である」、または「特異的に認識する」は例えば、以下の方法の1つに従って決定される
ように、目的の抗原と無関係の抗原とを区別する抗体の能力を指す。そのような方法は限
定されるものではないが、表面プラズモン共鳴(SPR)、ウェスタンブロット、ELI
SA-、RIA-、ECL-、IRMA-試験およびペプチドスキャンを含む。例えば、
標準的なELISAアッセイを行うことができる。スコアリングは標準的な発色によって
行うことができる(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼとの二次抗体および過酸化水素
とのテトラメチルベンジジン)。特定のウェルにおける反応は光学密度、例えば、450
nmでスコアリングされる。典型的なバックグラウンド(=陰性反応)は0.1ODであ
り得;典型的な陽性反応は1ODであり得る。これは、正/負の差異が5倍超、10倍超
、50倍超、好ましくは100倍超であることを意味する。典型的には、結合特異性の決
定は、単一の参照抗原ではなく、粉乳、BSA、トランスフェリンなどの約3~5個の無
関係の抗原のセットを使用することによって行われる。
「結合親和性」または「親和性」は、分子の単一の結合部位とその結合パートナーとの
間の非共有相互作用の総和の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用する場合
、「結合親和性」は結合対(例えば、抗体と抗原)のメンバー間の1:1相互作用を反映
する固有の結合親和性を指す。解離定数「KD」は一般に、分子(抗体など)とその結合
相手(抗原など)との間の親和性、すなわち、リガンドが特定の蛋白質にどの程度強く結
合するかを記述するために使用される。リガンド-タンパク質親和性は、2つの分子間の
非共有結合性分子間相互作用によって影響を受ける。親和性は、本明細書に記載のものを
含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。一実施形態にお
いて、本発明による「KD」または「KD値」は、Biacore T200機器(GE
Healthcare Biacore、Inc)を使用する表面プラズモン共鳴アッ
セイを使用して測定される。他の好適なデバイスは、BIACORE T100、BIA
CORE(R)-2000、BIACORe 4000、BIACORE(R)-300
0(BIAcore、Inc.、Piscataway、NJ)、またはProteOn
XPR36機器(Bio-Rad Laboratories、Inc.)である。
間の非共有相互作用の総和の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用する場合
、「結合親和性」は結合対(例えば、抗体と抗原)のメンバー間の1:1相互作用を反映
する固有の結合親和性を指す。解離定数「KD」は一般に、分子(抗体など)とその結合
相手(抗原など)との間の親和性、すなわち、リガンドが特定の蛋白質にどの程度強く結
合するかを記述するために使用される。リガンド-タンパク質親和性は、2つの分子間の
非共有結合性分子間相互作用によって影響を受ける。親和性は、本明細書に記載のものを
含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。一実施形態にお
いて、本発明による「KD」または「KD値」は、Biacore T200機器(GE
Healthcare Biacore、Inc)を使用する表面プラズモン共鳴アッ
セイを使用して測定される。他の好適なデバイスは、BIACORE T100、BIA
CORE(R)-2000、BIACORe 4000、BIACORE(R)-300
0(BIAcore、Inc.、Piscataway、NJ)、またはProteOn
XPR36機器(Bio-Rad Laboratories、Inc.)である。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細
胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決
定基は通常、アミノ酸もしくは糖側鎖、またはそれらの組み合わせなどの分子の化学的に
活性な表面グルーピングからなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特
性を有する。
胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決
定基は通常、アミノ酸もしくは糖側鎖、またはそれらの組み合わせなどの分子の化学的に
活性な表面グルーピングからなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特
性を有する。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」または参照抗体と「結合について競合す
る抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を10%、20%、3
0%、40%、50%またはそれ以上遮断し、逆に、参照抗体は競合アッセイにおいてそ
の抗原への抗体の結合を10%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上遮断す
る抗体を指す。
る抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を10%、20%、3
0%、40%、50%またはそれ以上遮断し、逆に、参照抗体は競合アッセイにおいてそ
の抗原への抗体の結合を10%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上遮断す
る抗体を指す。
「成熟抗体」または「成熟抗原結合フラグメント」、例えば成熟Fab変異体または「
最適化された」変異体という用語は、標的タンパク質の細胞外ドメインなどの所与の抗原
に対するより強い結合(すなわち、増加した親和性を有する結合)を示す抗体または抗体
フラグメントの誘導体を含む。成熟は、この親和性の増加をもたらす、抗体または抗体フ
ラグメントの6つのCDR内の少数の突然変異を同定するプロセスである。成熟プロセス
は、抗体への突然変異の導入および改善された結合剤を同定するためのスクリーニングの
ための分子生物学的方法の組み合わせである。
最適化された」変異体という用語は、標的タンパク質の細胞外ドメインなどの所与の抗原
に対するより強い結合(すなわち、増加した親和性を有する結合)を示す抗体または抗体
フラグメントの誘導体を含む。成熟は、この親和性の増加をもたらす、抗体または抗体フ
ラグメントの6つのCDR内の少数の突然変異を同定するプロセスである。成熟プロセス
は、抗体への突然変異の導入および改善された結合剤を同定するためのスクリーニングの
ための分子生物学的方法の組み合わせである。
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「配列同一性パーセント(%)
」はそれぞれ、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインさせ、必
要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそ
れぞれの中の、核酸またはアミノ酸残基とそれぞれ同一である候補配列中の、核酸または
アミノ酸残基それぞれのパーセンテージとして定義される。保存的置換は、配列同一性の
一部とはみなされない。ギャップなしアライメントが好ましい。アミノ酸配列同一性パー
セントを決定する目的でのアラインメントは、当業者の範囲内の様々な方法で、例えば、
BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソ
フトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することが
できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するた
めに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決
定することができる。
」はそれぞれ、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインさせ、必
要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそ
れぞれの中の、核酸またはアミノ酸残基とそれぞれ同一である候補配列中の、核酸または
アミノ酸残基それぞれのパーセンテージとして定義される。保存的置換は、配列同一性の
一部とはみなされない。ギャップなしアライメントが好ましい。アミノ酸配列同一性パー
セントを決定する目的でのアラインメントは、当業者の範囲内の様々な方法で、例えば、
BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソ
フトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することが
できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するた
めに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決
定することができる。
「配列相同性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセ
ンテージを示す。
ンテージを示す。
「アンタゴニスト」抗体または「遮断」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を
有意に(部分的にまたは完全に)阻害するものである。特定の実施形態において、本発明
による抗体または抗原結合フラグメントは、A2AP遮断抗体または抗原結合フラグメン
トである。
有意に(部分的にまたは完全に)阻害するものである。特定の実施形態において、本発明
による抗体または抗原結合フラグメントは、A2AP遮断抗体または抗原結合フラグメン
トである。
「抗体コンジュゲート」という用語は、薬物を含む1つまたは複数の分子にコンジュゲ
ートした抗体を指し、この場合、抗体コンジュゲートは、「抗体-薬物コンジュゲート」
(「ADC」)と呼ばれ、およびペプチドまたはタンパク質などの高分子量分子にコンジ
ュゲートした抗体を指す。
ートした抗体を指し、この場合、抗体コンジュゲートは、「抗体-薬物コンジュゲート」
(「ADC」)と呼ばれ、およびペプチドまたはタンパク質などの高分子量分子にコンジ
ュゲートした抗体を指す。
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている3文字記号またはIUPAC-IUB
Biochemical Nomenclature Commissionによって
推奨される1文字記号によって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的
に受け入れられている一文字コードによって言及され得る。
Biochemical Nomenclature Commissionによって
推奨される1文字記号によって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的
に受け入れられている一文字コードによって言及され得る。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが連結されている別の核
酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベ
クター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特
定のベクターは、それらが作動可能なように連結されている核酸の発現を指令することが
できる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベ
クター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特
定のベクターは、それらが作動可能なように連結されている核酸の発現を指令することが
できる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使
用され、少なくとも1つの外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を
含む。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」、「形質移入体」および「形
質移入細胞」および「形質導入細胞」を含み、継代数に関係なく、初代形質転換/形質移
入/形質導入細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は核酸含量が親細胞と完全に同
一ではない場合があるが、突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞においてスク
リーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異子孫が
、本明細書に含まれる。
用され、少なくとも1つの外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を
含む。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」、「形質移入体」および「形
質移入細胞」および「形質導入細胞」を含み、継代数に関係なく、初代形質転換/形質移
入/形質導入細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は核酸含量が親細胞と完全に同
一ではない場合があるが、突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞においてスク
リーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異子孫が
、本明細書に含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、所望の治療レジメンに従っ
て投与された場合に、疾患のそのような症状の一部またはすべてを軽減することまたは疾
患の素因を低減することを含む、所望の治療または予防効果または応答を誘発するのに適
切であろう治療または予防抗体の量を指すことを意味する。
て投与された場合に、疾患のそのような症状の一部またはすべてを軽減することまたは疾
患の素因を低減することを含む、所望の治療または予防効果または応答を誘発するのに適
切であろう治療または予防抗体の量を指すことを意味する。
「医薬製剤」/「医薬組成物」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的
活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される被験体に対して
許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない製剤を指す。
活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される被験体に対して
許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない製剤を指す。
本発明による抗体
一態様において、本発明は、ヒトA2APに結合する単離された抗体またはその抗原結
合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは
ウサギおよび/またはカニクイザルA2APと交差反応する。特定の実施形態において、
本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトA2APに対する親和
性とは100倍未満、特に30倍未満、さらにより具体的には15倍未満、最も具体的に
は5倍未満異なるウサギA2APに対する親和性を有する。特にそのような実施形態にお
いて、前記親和性は、配列番号1のアミノ酸40~491のヒトA2APおよび配列番号
2のアミノ酸28~491のウサギA2APに対するものである。特定の実施形態におい
て、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトA2APに対する
親和性とは100倍未満、特に30倍未満、さらにより具体的には15倍未満、最も具体
的には5倍未満異なるカニクイザルA2APに対する親和性を有する。特にそのような実
施形態において、前記親和性は、配列番号1のアミノ酸40~491のヒトA2APおよ
び配列番号3のアミノ酸28~491のカニクイザルA2APに対するものである。
一態様において、本発明は、ヒトA2APに結合する単離された抗体またはその抗原結
合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは
ウサギおよび/またはカニクイザルA2APと交差反応する。特定の実施形態において、
本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトA2APに対する親和
性とは100倍未満、特に30倍未満、さらにより具体的には15倍未満、最も具体的に
は5倍未満異なるウサギA2APに対する親和性を有する。特にそのような実施形態にお
いて、前記親和性は、配列番号1のアミノ酸40~491のヒトA2APおよび配列番号
2のアミノ酸28~491のウサギA2APに対するものである。特定の実施形態におい
て、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトA2APに対する
親和性とは100倍未満、特に30倍未満、さらにより具体的には15倍未満、最も具体
的には5倍未満異なるカニクイザルA2APに対する親和性を有する。特にそのような実
施形態において、前記親和性は、配列番号1のアミノ酸40~491のヒトA2APおよ
び配列番号3のアミノ酸28~491のカニクイザルA2APに対するものである。
別の態様において、本発明は、ヒトA2APに結合することができ、A2APの活性を
阻害することができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントはプラスミン活性を阻害しない。
阻害することができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントはプラスミン活性を阻害しない。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグ
メントは、A2APのプラスミンへの結合を防止することによってA2APの活性を阻害
する。
メントは、A2APのプラスミンへの結合を防止することによってA2APの活性を阻害
する。
A2APの内因性血漿濃度が比較的高い(それぞれ1μM;および70μg/ml)と
いう事実により、A2AP活性を遮断するために高濃度の中和抗体が必要とされる。した
がって、A2AP抗体が、高濃度の抗体までプラスミン活性を阻害しないのであれば有利
である。驚くべきことに、本発明による単離された抗体またはその抗原結合フラグメント
は、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて10μMの濃度までプラスミン活性を阻
害しなかったが、抗体77A3は同じアッセイにおいて1.7μMのIC50でプラスミ
ン活性を阻害した(実施例11、図16を参照されたい)。
いう事実により、A2AP活性を遮断するために高濃度の中和抗体が必要とされる。した
がって、A2AP抗体が、高濃度の抗体までプラスミン活性を阻害しないのであれば有利
である。驚くべきことに、本発明による単離された抗体またはその抗原結合フラグメント
は、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて10μMの濃度までプラスミン活性を阻
害しなかったが、抗体77A3は同じアッセイにおいて1.7μMのIC50でプラスミ
ン活性を阻害した(実施例11、図16を参照されたい)。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグ
メントは、ヒトプラスミン、特に配列番号118(プラスミン重鎖A)および配列番号1
19(プラスミン軽鎖B)を含むヒトプラスミンの活性を、高マイクロモル濃度で存在す
る場合であっても阻害しない。
メントは、ヒトプラスミン、特に配列番号118(プラスミン重鎖A)および配列番号1
19(プラスミン軽鎖B)を含むヒトプラスミンの活性を、高マイクロモル濃度で存在す
る場合であっても阻害しない。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグ
メントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、1μM、2μM、5μMまたは
10μMの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度(concert
ation)までプラスミン活性を阻害しない。
メントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、1μM、2μM、5μMまたは
10μMの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度(concert
ation)までプラスミン活性を阻害しない。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグ
メントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、1μM、2μM、5μMまたは
10μMの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度(concert
ation)までプラスミン活性を阻害せず、ここで、インビトロプラスミン阻害アッセ
イは、プラスミンのタンパク質分解活性の阻害を決定する。
メントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、1μM、2μM、5μMまたは
10μMの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度(concert
ation)までプラスミン活性を阻害せず、ここで、インビトロプラスミン阻害アッセ
イは、プラスミンのタンパク質分解活性の阻害を決定する。
そのようなインビトロプラスミン阻害アッセイは、実施例11に記載されるように、プ
ラスミンのタンパク質分解活性の阻害を決定するアッセイであり得る。そのようなアッセ
イのために、プラスミンおよび蛍光発生基質I-1275(Bachem;MeOSuc
-Ala-Phe-Lys-AMCトリフルオロアセテート塩;カタログ番号I-127
5)のようなプラスミンタンパク質分解活性のための標識基質を使用することができる。
ラスミンのタンパク質分解活性の阻害を決定するアッセイであり得る。そのようなアッセ
イのために、プラスミンおよび蛍光発生基質I-1275(Bachem;MeOSuc
-Ala-Phe-Lys-AMCトリフルオロアセテート塩;カタログ番号I-127
5)のようなプラスミンタンパク質分解活性のための標識基質を使用することができる。
別の態様において、本発明は、ヒトA2APに結合し、A2APの活性を阻害すること
ができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離され
た抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸402~408(SR
MSLSS)を含むA2APのエピトープに結合する。
ができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離され
た抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸402~408(SR
MSLSS)を含むA2APのエピトープに結合する。
A2APは、A2APの反応中心ループ(配列番号1のアミノ酸400~412)に位
置するアミノ酸配列SRMSLSS(配列番号1のアミノ酸402~408)を含む。特
定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメン
トは、ヒトA2APに結合し、A2APの活性を阻害することができ、ここで、前記単離
された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸402~408(
SRMSLSS)を含むA2APのエピトープに結合し、前記単離された抗体またはその
抗原結合フラグメントは、プラスミン活性を阻害しない。
置するアミノ酸配列SRMSLSS(配列番号1のアミノ酸402~408)を含む。特
定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメン
トは、ヒトA2APに結合し、A2APの活性を阻害することができ、ここで、前記単離
された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸402~408(
SRMSLSS)を含むA2APのエピトープに結合し、前記単離された抗体またはその
抗原結合フラグメントは、プラスミン活性を阻害しない。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグ
メントは、ヒトA2APに結合し、A2APの活性を阻害することができ、ここで、前記
単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸402~40
8(SRMSLSS)を含むA2APのエピトープに結合し、前記単離された抗体または
その抗原結合フラグメントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、1μM、2
μM、5μMまたは10μMの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃
度(concertation)まで、プラスミン活性を阻害しない。
メントは、ヒトA2APに結合し、A2APの活性を阻害することができ、ここで、前記
単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸402~40
8(SRMSLSS)を含むA2APのエピトープに結合し、前記単離された抗体または
その抗原結合フラグメントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、1μM、2
μM、5μMまたは10μMの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃
度(concertation)まで、プラスミン活性を阻害しない。
別の態様において、本発明がヒトA2APに結合する単離された抗体またはその抗原結
合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは
、A2APをセリンプロテアーゼ阻害剤からセリンプロテアーゼ基質に変換しない。
合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは
、A2APをセリンプロテアーゼ阻害剤からセリンプロテアーゼ基質に変換しない。
別の態様において、本発明は、ヒトA2APに結合する単離された抗体またはその抗原
結合フラグメントに関し、ここで、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2
APに、解離定数(KD)≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1n
M、または≦0.5nMで結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関
する。
結合フラグメントに関し、ここで、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2
APに、解離定数(KD)≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1n
M、または≦0.5nMで結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関
する。
別の態様において、本発明は、ヒトA2APに結合する単離された抗体またはその抗原
結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント
は、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2APに、≦500nM、≦25
0nM、≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM、または≦0.
5nMのEC50で結合する。
結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント
は、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2APに、≦500nM、≦25
0nM、≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM、または≦0.
5nMのEC50で結合する。
別の態様において、本発明は、ヒトA2APに結合する単離された抗体またはその抗原
結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント
は、インビトロA2AP機能遮断アッセイにおいて、配列番号1のアミノ酸40~491
のヒトA2APの活性を、≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM、≦
25nM、≦10nM、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で阻害する。
結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント
は、インビトロA2AP機能遮断アッセイにおいて、配列番号1のアミノ酸40~491
のヒトA2APの活性を、≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM、≦
25nM、≦10nM、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で阻害する。
インビトロA2AP機能遮断アッセイは、実施例4に記載されるようなアッセイであり
得る。このようなアッセイでは、試験抗体をA2APとプレインキュベートする。プラス
ミン、トリプシンまたはキモトリプシンなどのA2AP基質をアッセイに添加した後、添
加したA2AP基質の活性(A2APによって遮断されない)を、例えば、A2AP基質
のための標識基質の使用によって分析することができる。例えば、プラスミン(A2AP
基質)については、蛍光基質I-1275(Bachem;MeOSuc-Ala-Ph
e-Lys-AMCトリフルオロアセテート塩;カタログ番号I-1275)を使用する
ことができる。
得る。このようなアッセイでは、試験抗体をA2APとプレインキュベートする。プラス
ミン、トリプシンまたはキモトリプシンなどのA2AP基質をアッセイに添加した後、添
加したA2AP基質の活性(A2APによって遮断されない)を、例えば、A2AP基質
のための標識基質の使用によって分析することができる。例えば、プラスミン(A2AP
基質)については、蛍光基質I-1275(Bachem;MeOSuc-Ala-Ph
e-Lys-AMCトリフルオロアセテート塩;カタログ番号I-1275)を使用する
ことができる。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグ
メントは、
(i)解離定数(KD)≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM
、または≦0.5nMで、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2APに結
合し;および
(ii)インビトロA2AP機能遮断アッセイにおいて、配列番号1のアミノ酸40~4
91のヒトA2APの活性を、≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM
、≦25nM、≦10nM、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で阻害する。
メントは、
(i)解離定数(KD)≦100nM、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM
、または≦0.5nMで、配列番号1のアミノ酸40~491の配列のヒトA2APに結
合し;および
(ii)インビトロA2AP機能遮断アッセイにおいて、配列番号1のアミノ酸40~4
91のヒトA2APの活性を、≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM
、≦25nM、≦10nM、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で阻害する。
別の態様において、本発明は、ヒトA2APに結合する単離された抗体またはその抗原
結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント
は、A2APの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。特に、本発明による単
離された抗体または抗原結合フラグメントは、インビトロおよび/またはインビボでのプ
ラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。インビトロでプラスミン媒介性血餅溶解を増加さ
せる抗体の能力は、実施例7に記載されるように評価され得る。インビボでプラスミン媒
介性血餅溶解を増加させる抗体の能力は、実施例8に記載されるように評価され得る。
結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント
は、A2APの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。特に、本発明による単
離された抗体または抗原結合フラグメントは、インビトロおよび/またはインビボでのプ
ラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。インビトロでプラスミン媒介性血餅溶解を増加さ
せる抗体の能力は、実施例7に記載されるように評価され得る。インビボでプラスミン媒
介性血餅溶解を増加させる抗体の能力は、実施例8に記載されるように評価され得る。
本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、上記の特徴の任意の組み
合わせを示し得る。
合わせを示し得る。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
、A2APとプラスミンとの相互作用、特にヒトA2APとヒトプラスミンとの相互作用
、特に配列番号1のアミノ酸40~491のヒトA2APとヒトプラスミン、特に配列番
号118(プラスミン重鎖A)および配列番号119(プラスミン軽鎖B)を含むヒトプ
ラスミンとの相互作用を妨害する。特に、本発明による抗体または抗原結合フラグメント
は、A2AP遮断抗体または抗原結合フラグメントである。
、A2APとプラスミンとの相互作用、特にヒトA2APとヒトプラスミンとの相互作用
、特に配列番号1のアミノ酸40~491のヒトA2APとヒトプラスミン、特に配列番
号118(プラスミン重鎖A)および配列番号119(プラスミン軽鎖B)を含むヒトプ
ラスミンとの相互作用を妨害する。特に、本発明による抗体または抗原結合フラグメント
は、A2AP遮断抗体または抗原結合フラグメントである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
、配列番号32と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なく
とも99%同一である重鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態において、本発明による
単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号38と少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%同一である軽鎖可変ドメインを
含む。特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメン
トは、配列番号32と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少
なくとも99%同一である重鎖可変ドメインと、配列番号38と少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%同一である軽鎖可変ドメインと
を含む。
、配列番号32と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なく
とも99%同一である重鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態において、本発明による
単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号38と少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%同一である軽鎖可変ドメインを
含む。特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメン
トは、配列番号32と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少
なくとも99%同一である重鎖可変ドメインと、配列番号38と少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%同一である軽鎖可変ドメインと
を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
、配列EX1YDSSGYYHLX2Y(配列番号4)を含むH-CDR3を含む重鎖抗
原結合領域を含み、ここで、X1は、Y、DおよびGからなる群から選択され、X2は、
D、V、EおよびTからなる群から選択される。特定の実施形態において、X1は、Dお
よびGからなる群から選択され、X2は、V、EおよびTからなる群から選択される。
、配列EX1YDSSGYYHLX2Y(配列番号4)を含むH-CDR3を含む重鎖抗
原結合領域を含み、ここで、X1は、Y、DおよびGからなる群から選択され、X2は、
D、V、EおよびTからなる群から選択される。特定の実施形態において、X1は、Dお
よびGからなる群から選択され、X2は、V、EおよびTからなる群から選択される。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントが
配列X1AWDX2SLSGWV(配列番号5)を含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合
領域を含み、ここで、X1は、AおよびWからなる群から選択され、X2は、D、N、L
、WおよびVからなる群から選択される。特定の実施形態において、X1は、Wからなる
群から選択され、X2は、N、L、WおよびVからなる群から選択される。
配列X1AWDX2SLSGWV(配列番号5)を含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合
領域を含み、ここで、X1は、AおよびWからなる群から選択され、X2は、D、N、L
、WおよびVからなる群から選択される。特定の実施形態において、X1は、Wからなる
群から選択され、X2は、N、L、WおよびVからなる群から選択される。
特に、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、i)配列EX1Y
DSSGYYHLX2Y(配列番号4)を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域を含
み、ここで、X1は、Y、DおよびGからなる群から選択され、X2は、D、V、Eおよ
びTからなる群から選択され、およびii)配列X1AWDX2SLSGWV(配列番号
5)を含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域を含み、ここで、X1は、AおよびWか
らなる群から選択され、X2は、D、N、L、WおよびVからなる群から選択される。
DSSGYYHLX2Y(配列番号4)を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域を含
み、ここで、X1は、Y、DおよびGからなる群から選択され、X2は、D、V、Eおよ
びTからなる群から選択され、およびii)配列X1AWDX2SLSGWV(配列番号
5)を含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域を含み、ここで、X1は、AおよびWか
らなる群から選択され、X2は、D、N、L、WおよびVからなる群から選択される。
特定の実施形態において、H-CDR3領域の5’末端に直接隣接する2つのフレーム
ワーク残基X1X2(配列番号32の参照VHドメインの残基96[X1]および97[
X2]に対応する)は、以下のように選択される:X1は、AおよびDからなる群から選
択され、特にX1は、Dであり、およびX2は、RおよびSからなる群から選択され、特
にX2は、Sである。
ワーク残基X1X2(配列番号32の参照VHドメインの残基96[X1]および97[
X2]に対応する)は、以下のように選択される:X1は、AおよびDからなる群から選
択され、特にX1は、Dであり、およびX2は、RおよびSからなる群から選択され、特
にX2は、Sである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
、配列番号6または配列番号21を含むH-CDR1および配列番号7、配列番号8また
は配列番号22を含むH-CDR2を含む重鎖抗原結合領域を含む。特定の実施形態にお
いて、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号9を含むL
-CDR1および配列番号10を含むL-CDR2を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
、配列番号6または配列番号21を含むH-CDR1および配列番号7、配列番号8また
は配列番号22を含むH-CDR2を含む重鎖抗原結合領域を含む。特定の実施形態にお
いて、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号9を含むL
-CDR1および配列番号10を含むL-CDR2を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
、
i)配列番号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含む
L-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
ii)配列番号11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号17を含
むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
iii)配列番号11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を
含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
iv)配列番号12を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含
むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
v)配列番号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号19を含む
L-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
vi)配列番号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含
むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
vii)配列番号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を
含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
viii)配列番号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号20
を含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
ix)配列番号15を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含
むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
x)配列番号16を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含む
L-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域
を含む。
、
i)配列番号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含む
L-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
ii)配列番号11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号17を含
むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
iii)配列番号11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を
含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
iv)配列番号12を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含
むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
v)配列番号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号19を含む
L-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
vi)配列番号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含
むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
vii)配列番号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を
含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
viii)配列番号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号20
を含むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
ix)配列番号15を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含
むL-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域、または
x)配列番号16を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域および配列番号18を含む
L-CDR3を含む軽鎖抗原結合領域
を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
:
i)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号8を含むH-CDR2、および配列番号1
3を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR1
、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽鎖
抗原結合領域、または
ii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域、または
iii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番
号11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CD
R1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号17を含むL-CDR3を含む
軽鎖抗原結合領域、または
iv)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域、または
v)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号1
2を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR1
、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽鎖
抗原結合領域、または
vi)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号19を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域、または
vii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番
号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CD
R1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む
軽鎖抗原結合領域、または
viii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列
番号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-C
DR1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号20を含むL-CDR3を含
む軽鎖抗原結合領域、または
ix)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
15を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域、または
x)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号1
6を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR1
、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽鎖
抗原結合領域、または
xi)配列番号21を含むH-CDR1、配列番号8を含むH-CDR2、および配列番
号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CD
R1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む
軽鎖抗原結合領域、または
xii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号22を含むH-CDR2、および配列
番号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-C
DR1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含
む軽鎖抗原結合領域を含む。
:
i)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号8を含むH-CDR2、および配列番号1
3を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR1
、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽鎖
抗原結合領域、または
ii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域、または
iii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番
号11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CD
R1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号17を含むL-CDR3を含む
軽鎖抗原結合領域、または
iv)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域、または
v)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号1
2を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR1
、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽鎖
抗原結合領域、または
vi)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号19を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域、または
vii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番
号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CD
R1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む
軽鎖抗原結合領域、または
viii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列
番号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-C
DR1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号20を含むL-CDR3を含
む軽鎖抗原結合領域、または
ix)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
15を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域、または
x)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号1
6を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR1
、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽鎖
抗原結合領域、または
xi)配列番号21を含むH-CDR1、配列番号8を含むH-CDR2、および配列番
号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CD
R1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む
軽鎖抗原結合領域、または
xii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号22を含むH-CDR2、および配列
番号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-C
DR1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含
む軽鎖抗原結合領域を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
、30S、31S、53S、56S、97Kからなる群から選択されるCDR残基および
重鎖可変ドメインフレームワークの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つま
たは少なくとも4つまたは少なくとも5つを含む。これらのアミノ酸位置は、配列番号3
2の参照重鎖可変ドメインのアミノ酸位置に対応し、フレームワークならびにH-CDR
1およびH-CDR2アミノ酸残基を含む。
、30S、31S、53S、56S、97Kからなる群から選択されるCDR残基および
重鎖可変ドメインフレームワークの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つま
たは少なくとも4つまたは少なくとも5つを含む。これらのアミノ酸位置は、配列番号3
2の参照重鎖可変ドメインのアミノ酸位置に対応し、フレームワークならびにH-CDR
1およびH-CDR2アミノ酸残基を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
:
i)配列番号32を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン;
または
ii)配列番号23を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号37を含む可変軽鎖ドメイン
;または
iii)配列番号24を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
iv)配列番号25を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン
;または
v)配列番号26を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン;
または
vi)配列番号27を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号39を含む可変軽鎖ドメイン
;または
vii)配列番号27を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
viii)配列番号28を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメ
イン;または
ix)配列番号28を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号40を含む可変軽鎖ドメイン
;または
x)配列番号29を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン;
または
xi)配列番号30を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン
;または
xii)配列番号31を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
xiii)配列番号33を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメ
イン;または
xiv)配列番号34を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
xv)配列番号35を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン
;または
xvi)配列番号36を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン
を含む。
:
i)配列番号32を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン;
または
ii)配列番号23を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号37を含む可変軽鎖ドメイン
;または
iii)配列番号24を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
iv)配列番号25を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン
;または
v)配列番号26を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン;
または
vi)配列番号27を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号39を含む可変軽鎖ドメイン
;または
vii)配列番号27を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
viii)配列番号28を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメ
イン;または
ix)配列番号28を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号40を含む可変軽鎖ドメイン
;または
x)配列番号29を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン;
または
xi)配列番号30を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン
;または
xii)配列番号31を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
xiii)配列番号33を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメ
イン;または
xiv)配列番号34を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
xv)配列番号35を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン
;または
xvi)配列番号36を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン
を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体は、IgG抗体である。特にそ
のような実施形態において、本発明による単離された抗体は、IgG1、IgG2、Ig
G3またはIgG4抗体である。最も具体的には、本発明による単離された抗体は、Ig
G1またはIgG4抗体である。
のような実施形態において、本発明による単離された抗体は、IgG1、IgG2、Ig
G3またはIgG4抗体である。最も具体的には、本発明による単離された抗体は、Ig
G1またはIgG4抗体である。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体は:
i)配列番号55を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
ii)配列番号41を含む重鎖および配列番号56を含む軽鎖;または
iii)配列番号42を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
iv)配列番号43を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
v)配列番号44を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
vi)配列番号45を含む重鎖および配列番号58を含む軽鎖;または
vii)配列番号45を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
viii)配列番号46を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
ix)配列番号46を含む重鎖および配列番号59を含む軽鎖;または
x)配列番号47を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xi)配列番号48を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xii)配列番号49を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xiii)配列番号50を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xiv)配列番号51を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xv)配列番号52を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xvi)配列番号53を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xvii)配列番号54を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖
を含む。
i)配列番号55を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
ii)配列番号41を含む重鎖および配列番号56を含む軽鎖;または
iii)配列番号42を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
iv)配列番号43を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
v)配列番号44を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
vi)配列番号45を含む重鎖および配列番号58を含む軽鎖;または
vii)配列番号45を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
viii)配列番号46を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
ix)配列番号46を含む重鎖および配列番号59を含む軽鎖;または
x)配列番号47を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xi)配列番号48を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xii)配列番号49を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xiii)配列番号50を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xiv)配列番号51を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xv)配列番号52を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xvi)配列番号53を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xvii)配列番号54を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖
を含む。
特定の実施形態において、本発明による抗原結合フラグメントは、scFv、Fab、
Fab’フラグメントまたはF(ab’)2フラグメントである。
Fab’フラグメントまたはF(ab’)2フラグメントである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである。
、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体または抗原結合フラグメント、より具体的には完全ヒト
抗体または抗原結合フラグメントである。
、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体または抗原結合フラグメント、より具体的には完全ヒト
抗体または抗原結合フラグメントである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは
、単一特異性抗体である。特定の他の実施形態において、本発明による単離された抗体ま
たは抗原結合フラグメントは、A2APおよび少なくとも1つのさらなる抗原に結合する
多重特異性抗体、例えば二重特異性、三重特異性または四重特異性抗体である。
、単一特異性抗体である。特定の他の実施形態において、本発明による単離された抗体ま
たは抗原結合フラグメントは、A2APおよび少なくとも1つのさらなる抗原に結合する
多重特異性抗体、例えば二重特異性、三重特異性または四重特異性抗体である。
さらなる態様において、本発明は、A2APへの結合について、本発明による単離され
た抗体または抗原結合フラグメントと競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラ
グメントに関する。
た抗体または抗原結合フラグメントと競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラ
グメントに関する。
本発明による好ましい抗体のアミノ酸配列を表1に列挙する。
本発明による好ましい抗体の核酸配列を表2に列挙する。
ペプチド変異体
本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書に提供される特定のペプチド配
列に限定されない。むしろ、本発明は、これらのポリペプチドの変異体も具体化する。本
開示および従来利用可能な技術および参考文献を参照すると、当業者は、本明細書に開示
される抗体の機能的変異体を調製し、試験し、利用することができ、一方で、A2APに
結合する能力を有するこれらの変異体が本発明の範囲内にあることを認識するであろう。
本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書に提供される特定のペプチド配
列に限定されない。むしろ、本発明は、これらのポリペプチドの変異体も具体化する。本
開示および従来利用可能な技術および参考文献を参照すると、当業者は、本明細書に開示
される抗体の機能的変異体を調製し、試験し、利用することができ、一方で、A2APに
結合する能力を有するこれらの変異体が本発明の範囲内にあることを認識するであろう。
変異体は例えば、本明細書に開示されるペプチド配列に対して、少なくとも1つの変更
された相補性決定領域(CDR)(超可変)および/またはフレームワーク(FR)(可
変)ドメイン/位置を有する抗体を含むことができる。
された相補性決定領域(CDR)(超可変)および/またはフレームワーク(FR)(可
変)ドメイン/位置を有する抗体を含むことができる。
CDRまたはFR領域中の1つまたは複数のアミノ酸残基を変更することによって、当
業者は例えば、突然変異または多様化された抗体配列を日常的に生成することができ、そ
れらは、新規または改善された特性について、抗原に対してスクリーニングすることがで
きる。
業者は例えば、突然変異または多様化された抗体配列を日常的に生成することができ、そ
れらは、新規または改善された特性について、抗原に対してスクリーニングすることがで
きる。
本発明のさらに好ましい実施形態は、VHおよびVL配列が表1に示されるように選択
される抗体または抗原結合フラグメントである。当業者は、表1のデータを使用して、本
発明の範囲内にあるペプチド変異体を設計することができる。変異体は、1つまたは複数
のCDR領域内のアミノ酸を変化させることによって構築されることが好ましく;変異体
はまた、1つまたは複数の変更したフレームワーク領域を有し得る。フレームワーク領域
に変更を加えてもよい。例えば、ペプチドFRドメインは、生殖系列配列と比較して残基
に偏差がある場合に変更され得る。
される抗体または抗原結合フラグメントである。当業者は、表1のデータを使用して、本
発明の範囲内にあるペプチド変異体を設計することができる。変異体は、1つまたは複数
のCDR領域内のアミノ酸を変化させることによって構築されることが好ましく;変異体
はまた、1つまたは複数の変更したフレームワーク領域を有し得る。フレームワーク領域
に変更を加えてもよい。例えば、ペプチドFRドメインは、生殖系列配列と比較して残基
に偏差がある場合に変更され得る。
あるいは、当業者は例えば、Knappik A.ら、JMB 2000、296:5
7-86に記載されている手順を用いて、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、そ
のような抗体の同じクラスの既知の配列と比較することによって、同じ分析を行うことが
できる。
7-86に記載されている手順を用いて、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、そ
のような抗体の同じクラスの既知の配列と比較することによって、同じ分析を行うことが
できる。
さらに、変異体は、さらなる最適化のための出発点として1つの抗体を使用することに
よって、抗体中の1つ以上のアミノ酸残基、好ましくは1つ以上のCDR中のアミノ酸残
基を多様化することによって、および改善された特性を有する変異体について得られた抗
体変異体のコレクションをスクリーニングすることによって得ることができる。特に好ま
しいのは、VLおよび/またはVHのCDR3中の1つまたは複数のアミノ酸残基の多様
化である。多様化は例えば、トリヌクレオチド突然変異誘発(TRIM)技術を用いてD
NA分子のコレクションを合成することによって行うことができる(Virnekaes
B.ら、Nucl.Acids Res.1994、22:5600)。抗体またはそ
の抗原結合フラグメントは例えば、変更された半減期(例えば、Fc部分の修飾またはP
EGなどのさらなる分子の結合)、変更された結合親和性または変更されたADCCもし
くはCDC活性をもたらす修飾を含むが、これらに限定されない修飾/変異を有する分子
を含む。
よって、抗体中の1つ以上のアミノ酸残基、好ましくは1つ以上のCDR中のアミノ酸残
基を多様化することによって、および改善された特性を有する変異体について得られた抗
体変異体のコレクションをスクリーニングすることによって得ることができる。特に好ま
しいのは、VLおよび/またはVHのCDR3中の1つまたは複数のアミノ酸残基の多様
化である。多様化は例えば、トリヌクレオチド突然変異誘発(TRIM)技術を用いてD
NA分子のコレクションを合成することによって行うことができる(Virnekaes
B.ら、Nucl.Acids Res.1994、22:5600)。抗体またはそ
の抗原結合フラグメントは例えば、変更された半減期(例えば、Fc部分の修飾またはP
EGなどのさらなる分子の結合)、変更された結合親和性または変更されたADCCもし
くはCDC活性をもたらす修飾を含むが、これらに限定されない修飾/変異を有する分子
を含む。
保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載の抗体ペプチド配列の全体的な分子構造を保存するポリペプチド変異体
を作製することができる。個々のアミノ酸の特性を考慮すると、いくつかの合理的な置換
が当業者に認識されるのであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は例えば、関
与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の性質の類
似性に基づいて行うことができる。
本明細書に記載の抗体ペプチド配列の全体的な分子構造を保存するポリペプチド変異体
を作製することができる。個々のアミノ酸の特性を考慮すると、いくつかの合理的な置換
が当業者に認識されるのであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は例えば、関
与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の性質の類
似性に基づいて行うことができる。
例えば、(a)非極性(疎水性)アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン
、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ
;(b)極性中性アミノ酸としてはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシ
ン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ;(c)正に荷電した(塩基性)アミノ
酸としてはアルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられ;ならびに(d)負に荷電
した(酸性)アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。置換は
、典型的にはグループ(a)~(d)内でなされ得る。さらに、グリシンおよびプロリン
は、α-ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて、互いに置換され得る。同様に、
特定のアミノ酸、例えば、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸
、グルタミン、ヒスチジンおよびリシンは、α-ヘリックスにおいてより一般的に見出さ
れ、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび
トレオニンは、β-プリーツシートにおいてより一般的に見出される。グリシン、セリン
、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンは一般に、交互に見出される。いくつ
かの好ましい置換は、以下の群の中でなされ得る:(i)SおよびT;(ii)Pおよび
G;ならびに(iii)A、V、LおよびI。公知の遺伝子コード、ならびに組換えおよ
び合成DNA技術を考慮すると、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするDNAを
容易に構築することができる。
、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ
;(b)極性中性アミノ酸としてはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシ
ン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ;(c)正に荷電した(塩基性)アミノ
酸としてはアルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられ;ならびに(d)負に荷電
した(酸性)アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。置換は
、典型的にはグループ(a)~(d)内でなされ得る。さらに、グリシンおよびプロリン
は、α-ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて、互いに置換され得る。同様に、
特定のアミノ酸、例えば、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸
、グルタミン、ヒスチジンおよびリシンは、α-ヘリックスにおいてより一般的に見出さ
れ、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび
トレオニンは、β-プリーツシートにおいてより一般的に見出される。グリシン、セリン
、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンは一般に、交互に見出される。いくつ
かの好ましい置換は、以下の群の中でなされ得る:(i)SおよびT;(ii)Pおよび
G;ならびに(iii)A、V、LおよびI。公知の遺伝子コード、ならびに組換えおよ
び合成DNA技術を考慮すると、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするDNAを
容易に構築することができる。
グリコシル化変異体
抗体がFc領域を含む場合、それに結合した炭水化物を変更することができる。哺乳動
物細胞によって産生される天然抗体は典型的には、Fc領域のCH2ドメインのKaba
t EUナンバリングを使用して、Asn297にN-結合によって一般的に結合される
分岐した、二分岐オリゴ糖を含む;例えば、Wrightら、Trends Biote
chnol.15:26-32(1997)を参照。
抗体がFc領域を含む場合、それに結合した炭水化物を変更することができる。哺乳動
物細胞によって産生される天然抗体は典型的には、Fc領域のCH2ドメインのKaba
t EUナンバリングを使用して、Asn297にN-結合によって一般的に結合される
分岐した、二分岐オリゴ糖を含む;例えば、Wrightら、Trends Biote
chnol.15:26-32(1997)を参照。
ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化され
る程度を増加または減少させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加また
は欠失は、発現系(例えば、宿主細胞)を変更することによって、および/または1つ以
上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによっ
て、好都合に達成され得る。
る程度を増加または減少させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加また
は欠失は、発現系(例えば、宿主細胞)を変更することによって、および/または1つ以
上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによっ
て、好都合に達成され得る。
本発明の一実施形態において、低下したエフェクター機能を有するアグリコシル抗体ま
たは抗体誘導体は、原核生物宿主における発現によって調製される。好適な原核生物宿主
としては大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトマイ
セス属、およびブドウ球菌属内の様々な種が挙げられるが、これらに限定されない。
たは抗体誘導体は、原核生物宿主における発現によって調製される。好適な原核生物宿主
としては大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトマイ
セス属、およびブドウ球菌属内の様々な種が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、低下したエフェクター機能を有する抗体変異体が提供され、これ
は前記抗体のFc部分のCH2ドメインにおける保存されたN結合部位における修飾を特
徴とする。本発明の一実施形態において、修飾が重鎖グリコシル化部位に突然変異を含み
、その部位でのグリコシル化を防止する。したがって、本発明の1つの好ましい実施形態
において、アグリコシル抗体または抗体誘導体は、重鎖グリコシル化部位の突然変異、す
なわち、Kabat EUナンバリングを用いたN297の突然変異によって調製され、
適切な宿主細胞において発現される。
は前記抗体のFc部分のCH2ドメインにおける保存されたN結合部位における修飾を特
徴とする。本発明の一実施形態において、修飾が重鎖グリコシル化部位に突然変異を含み
、その部位でのグリコシル化を防止する。したがって、本発明の1つの好ましい実施形態
において、アグリコシル抗体または抗体誘導体は、重鎖グリコシル化部位の突然変異、す
なわち、Kabat EUナンバリングを用いたN297の突然変異によって調製され、
適切な宿主細胞において発現される。
本発明の別の実施形態において、アグリコシル抗体または抗体誘導体は低下したエフェ
クター機能を有し、ここで、前記抗体または抗体誘導体のFc部分のCH2ドメインにお
ける保存されたN結合部位における修飾は、CH2ドメイングリカンの除去、すなわち脱
グリコシル化を含む。これらのアグリコシル抗体は、従来の方法によって生成され、次い
で酵素的に脱グリコシル化され得る。抗体の酵素的脱グリコシル化のための方法は当技術
分野において周知である(例えば、Winkelhake & Nicolson(19
76)、J Biol Chem.251(4):1074-80)。
クター機能を有し、ここで、前記抗体または抗体誘導体のFc部分のCH2ドメインにお
ける保存されたN結合部位における修飾は、CH2ドメイングリカンの除去、すなわち脱
グリコシル化を含む。これらのアグリコシル抗体は、従来の方法によって生成され、次い
で酵素的に脱グリコシル化され得る。抗体の酵素的脱グリコシル化のための方法は当技術
分野において周知である(例えば、Winkelhake & Nicolson(19
76)、J Biol Chem.251(4):1074-80)。
本発明の別の実施形態において、脱グリコシル化は、グリコシル化阻害剤ツニカマイシ
ン(Nose & Wigzell(1983)、Proc Natl Acad Sc
i USA、80(21):6632-6)を用いて達成され得る。すなわち、修飾は、
前記抗体のFc部分のCH2ドメインにおける保存されたN結合部位におけるグリコシル
化の防止である。
ン(Nose & Wigzell(1983)、Proc Natl Acad Sc
i USA、80(21):6632-6)を用いて達成され得る。すなわち、修飾は、
前記抗体のFc部分のCH2ドメインにおける保存されたN結合部位におけるグリコシル
化の防止である。
一実施形態において、Fc領域に(直接的または間接的に)結合したフコースを欠く炭
水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量
は、1%~80%、1%~65%、5%~65%または20%~40%であり得る。フコ
ースの量は例えば、WO2008/077546に記載されているように、MALDI-
TOF質量分析によって測定される、Asn297に結合した全ての糖構造(例えば、複
合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造)の合計に対する、Asn297における糖
鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域
中の約297位に位置するアスパラギン残基(Fc領域残基のEuナンバリング)を指す
;しかしながら、Asn297は、抗体のわずかな配列変動のために、297位の上流ま
たは下流約±3アミノ酸、すなわち294位と300位との間にも位置し得る。そのよう
なフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。
水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量
は、1%~80%、1%~65%、5%~65%または20%~40%であり得る。フコ
ースの量は例えば、WO2008/077546に記載されているように、MALDI-
TOF質量分析によって測定される、Asn297に結合した全ての糖構造(例えば、複
合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造)の合計に対する、Asn297における糖
鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域
中の約297位に位置するアスパラギン残基(Fc領域残基のEuナンバリング)を指す
;しかしながら、Asn297は、抗体のわずかな配列変動のために、297位の上流ま
たは下流約±3アミノ酸、すなわち294位と300位との間にも位置し得る。そのよう
なフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。
「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、O
kazakiら、J Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Y
amane-Ohnukiら、Biotech.Bioeng.87:614(2004
)が挙げられる。
kazakiら、J Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Y
amane-Ohnukiら、Biotech.Bioeng.87:614(2004
)が挙げられる。
脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠
損するLec13CHO細胞(Ripkaら、Arch.Biochem.Biophy
s.249:533-545(1986);およびWO2004/056312)、なら
びにアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトC
HO細胞などのノックアウト細胞株(例えば、Yamane-Ohnukiら、Biot
ech.Bioeng.87:614(2004);Kanda、Y.ら、Biotec
hnol.Bioeng.、94(4):680-688(2006)を参照のこと)が
挙げられる。
損するLec13CHO細胞(Ripkaら、Arch.Biochem.Biophy
s.249:533-545(1986);およびWO2004/056312)、なら
びにアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトC
HO細胞などのノックアウト細胞株(例えば、Yamane-Ohnukiら、Biot
ech.Bioeng.87:614(2004);Kanda、Y.ら、Biotec
hnol.Bioeng.、94(4):680-688(2006)を参照のこと)が
挙げられる。
抗体変異体には、例えば、抗体のFc領域に結合した二分岐オリゴ糖がGlcNAcに
よって二分された二分オリゴ糖がさらに提供される。そのような抗体変異体は、フコシル
化の減少および/または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変異体の例
は例えば、WO2003/011878;米国特許第6,602,684号;およびUS
2005/0123546に記載されている。
よって二分された二分オリゴ糖がさらに提供される。そのような抗体変異体は、フコシル
化の減少および/または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変異体の例
は例えば、WO2003/011878;米国特許第6,602,684号;およびUS
2005/0123546に記載されている。
Fc領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異
体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。このよう
な抗体変異体は、例えばWO1997/30087;WO1998/58964;および
WO1999/22764に記載されている。
体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。このよう
な抗体変異体は、例えばWO1997/30087;WO1998/58964;および
WO1999/22764に記載されている。
FC領域変異体
特定の実施形態において、1つまたは複数のアミノ酸修飾(例えば、置換)を、本明細
書で提供される抗体のFc領域(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIg
G4Fc領域)に導入し、それによってFc領域変異体を生成することができる。
特定の実施形態において、1つまたは複数のアミノ酸修飾(例えば、置換)を、本明細
書で提供される抗体のFc領域(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIg
G4Fc領域)に導入し、それによってFc領域変異体を生成することができる。
特定の実施形態において、本発明は、インビボでの抗体の半減期は重要であるが、特定
のエフェクター機能(例えば、補体およびADCC)が不必要または有害である用途のた
めの望ましい候補となる、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体変
異体を企図する。CDCおよび/またはADCC活性の減少/枯渇を確認するために、イ
ンビトロおよび/またはインビボ細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、F
c受容体(FcR)結合アッセイは、抗体がFcγR結合を欠く(したがって、おそらく
ADCC活性を欠く)がFcRn結合能力を保持することを確実にするために行うことが
できる。いくつかの実施形態において、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害(
CDC)の変更(すなわち、改善または減少のいずれか)をもたらす変更がFc領域で行
われる。
のエフェクター機能(例えば、補体およびADCC)が不必要または有害である用途のた
めの望ましい候補となる、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体変
異体を企図する。CDCおよび/またはADCC活性の減少/枯渇を確認するために、イ
ンビトロおよび/またはインビボ細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、F
c受容体(FcR)結合アッセイは、抗体がFcγR結合を欠く(したがって、おそらく
ADCC活性を欠く)がFcRn結合能力を保持することを確実にするために行うことが
できる。いくつかの実施形態において、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害(
CDC)の変更(すなわち、改善または減少のいずれか)をもたらす変更がFc領域で行
われる。
特定の実施形態において、本発明は、増加または減少した半減期を有する抗体変異体を
企図する。母体IgGの胎児への転移に関与する、半減期が増加し、新生児Fc受容体(
FcRn)への結合が改善された抗体(Guyerら、J Immunol.117:5
87(1976)およびKimら、J Immunol.24:249(1994))は
、US2005/0014934(Hintonら)に記載されている。これらの抗体は
、FcRnへのFc領域の結合を改善する1つまたは複数の置換を有するFc領域を含む
。
企図する。母体IgGの胎児への転移に関与する、半減期が増加し、新生児Fc受容体(
FcRn)への結合が改善された抗体(Guyerら、J Immunol.117:5
87(1976)およびKimら、J Immunol.24:249(1994))は
、US2005/0014934(Hintonら)に記載されている。これらの抗体は
、FcRnへのFc領域の結合を改善する1つまたは複数の置換を有するFc領域を含む
。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントを含む抗体コンジュゲートに関する。
メントを含む抗体コンジュゲートに関する。
抗体産生
本発明の抗体は、多数の健常ボランティアの抗体から単離されたアミノ酸配列に基づく
組換え抗体ライブラリーに由来してもよく、例えば、n-CoDeR(登録商標)技術を
用いて、完全ヒトCDRは新しい抗体分子に組換えられる(Carlson & Soe
derlind、Expert Rev Mol Diagn.2001 May;1(
1):102-8)。あるいは、例えば、Hoet RMら、Nat Biotechn
ol 2005;23(3):344-8)に記載されている完全ヒト抗体ファージディ
スプレイライブラリーとしての抗体ライブラリーを使用して、A2AP特異的抗体を単離
することができる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは
、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなされる。
本発明の抗体は、多数の健常ボランティアの抗体から単離されたアミノ酸配列に基づく
組換え抗体ライブラリーに由来してもよく、例えば、n-CoDeR(登録商標)技術を
用いて、完全ヒトCDRは新しい抗体分子に組換えられる(Carlson & Soe
derlind、Expert Rev Mol Diagn.2001 May;1(
1):102-8)。あるいは、例えば、Hoet RMら、Nat Biotechn
ol 2005;23(3):344-8)に記載されている完全ヒト抗体ファージディ
スプレイライブラリーとしての抗体ライブラリーを使用して、A2AP特異的抗体を単離
することができる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは
、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなされる。
ヒト抗体は、抗原攻撃に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有する
インタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与す
ることによってさらに調製され得る。そのような動物は、典型的には内因性免疫グロブリ
ン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、または動物の染色体にランダ
ムに組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。例えば、
遺伝子操作されたマウスの免疫化、とりわけhMAbマウス(例えば、VelocImm
uneマウス(登録商標)またはXENOMOUSE(登録商標))の免疫化を行うこと
ができる。
インタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与す
ることによってさらに調製され得る。そのような動物は、典型的には内因性免疫グロブリ
ン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、または動物の染色体にランダ
ムに組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。例えば、
遺伝子操作されたマウスの免疫化、とりわけhMAbマウス(例えば、VelocImm
uneマウス(登録商標)またはXENOMOUSE(登録商標))の免疫化を行うこと
ができる。
さらなる抗体は、ハイブリドーマ技術(例えば、Koehler and Milst
ein Nature.1975 Aug 7;256(5517):495-7を参照
されたい)を用いて生成され得、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体に変換され得るマ
ウス、ラット、またはウサギ抗体をもたらす。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は
例えば、Almagro and Fransson、Front.Biosci.13
:1619-1633(2008)に概説されており、例えば、Riechmannら、
Nature 332:323-329(1988);Queenら、Proc.Nat
l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);米国特許
第5,821,337、7,527,791、6,982,321、および7,087,
409号;Kashmiriら、Methods 36:25-34 (2005)(特
異性決定領域(SDR)グラフティングを記載);Padlan、Mol.、Immun
ol.、28:489-498(1991)(「リサーフェシング」について記載);D
all’Acquaら、Methods 36:43-60(2005)(「FRシャッ
フリング」について記載);およびOsboumら、Methods 36:61-68
(2005)およびKlimkaら、J.Cancer、83:252-260(200
0)(FRシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記載している)にさらに記載さ
れている。
ein Nature.1975 Aug 7;256(5517):495-7を参照
されたい)を用いて生成され得、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体に変換され得るマ
ウス、ラット、またはウサギ抗体をもたらす。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は
例えば、Almagro and Fransson、Front.Biosci.13
:1619-1633(2008)に概説されており、例えば、Riechmannら、
Nature 332:323-329(1988);Queenら、Proc.Nat
l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);米国特許
第5,821,337、7,527,791、6,982,321、および7,087,
409号;Kashmiriら、Methods 36:25-34 (2005)(特
異性決定領域(SDR)グラフティングを記載);Padlan、Mol.、Immun
ol.、28:489-498(1991)(「リサーフェシング」について記載);D
all’Acquaら、Methods 36:43-60(2005)(「FRシャッ
フリング」について記載);およびOsboumら、Methods 36:61-68
(2005)およびKlimkaら、J.Cancer、83:252-260(200
0)(FRシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記載している)にさらに記載さ
れている。
組換え抗体ライブラリーを用いた抗体の作製のための例が提供される。
本発明によるDNA分子
本発明はまた、本発明による抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された
核酸配列に関する。本発明による抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離され
た核酸配列は例えば、Sambrookら、1989、およびAusubelら、198
9に記載されている技術によって、または代替的に、化学合成によって作製することがで
きる(例えば、Oligonucleotide Synthesis(1984、Ga
it編集、IRL Press、Oxford)に記載の技術)。発現された抗体に使用
されたDNA配列を表2に示す。これらの配列は、哺乳動物発現のための特定の場合にお
いて最適化される。本発明のDNA分子は、本明細書に開示される配列に限定されず、そ
の変異体も含む。本発明内のDNA変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの
物理的特性を参照することによって記載され得る。当業者は、DNAがその相補体を同定
するために使用され得ること、およびDNAは二本鎖であるので、核酸ハイブリダイゼー
ション技術を使用してその等価物または相同体であることを認識するのであろう。ハイブ
リダイゼーションは、100%未満の相補性で起こり得ることも認識されるのであろう。
しかしながら、条件の適切な選択を考慮すると、ハイブリダイゼーション技術を使用して
、特定のプローブに対するそれらの構造的関連性に基づいてDNA配列を区別することが
できる。そのような条件に関するガイダンスについては、Sambrookら、1989
上記の、およびAusubelら、1995(Ausubel、F.M.、Brent、
R.、Kingston、R.E.、Moore、D.D.、Sedman、J.G.、
Smith、J.A.、& Struhl、K.編集(1995)、分子生物学における
現在のプロトコル、New York:John Wiley and Sons)を参
照。
本発明はまた、本発明による抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された
核酸配列に関する。本発明による抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離され
た核酸配列は例えば、Sambrookら、1989、およびAusubelら、198
9に記載されている技術によって、または代替的に、化学合成によって作製することがで
きる(例えば、Oligonucleotide Synthesis(1984、Ga
it編集、IRL Press、Oxford)に記載の技術)。発現された抗体に使用
されたDNA配列を表2に示す。これらの配列は、哺乳動物発現のための特定の場合にお
いて最適化される。本発明のDNA分子は、本明細書に開示される配列に限定されず、そ
の変異体も含む。本発明内のDNA変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの
物理的特性を参照することによって記載され得る。当業者は、DNAがその相補体を同定
するために使用され得ること、およびDNAは二本鎖であるので、核酸ハイブリダイゼー
ション技術を使用してその等価物または相同体であることを認識するのであろう。ハイブ
リダイゼーションは、100%未満の相補性で起こり得ることも認識されるのであろう。
しかしながら、条件の適切な選択を考慮すると、ハイブリダイゼーション技術を使用して
、特定のプローブに対するそれらの構造的関連性に基づいてDNA配列を区別することが
できる。そのような条件に関するガイダンスについては、Sambrookら、1989
上記の、およびAusubelら、1995(Ausubel、F.M.、Brent、
R.、Kingston、R.E.、Moore、D.D.、Sedman、J.G.、
Smith、J.A.、& Struhl、K.編集(1995)、分子生物学における
現在のプロトコル、New York:John Wiley and Sons)を参
照。
2つのポリヌクレオチド配列間の構造的類似性は、2つの配列が互いにハイブリダイズ
する条件の「ストリンジェンシー」の関数として表すことができる。本明細書で使用され
る場合、用語「ストリンジェンシー」は、条件がハイブリダイゼーションに好ましくない
程度を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションに強く不利であり、最も
構造的に関連する分子のみが、このような条件下で互いにハイブリダイズする。逆に、非
ストリンジェント条件は、より低い程度の構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーシ
ョンに有利である。したがって、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、2つの
核酸配列の構造的関係と直接相関する。
する条件の「ストリンジェンシー」の関数として表すことができる。本明細書で使用され
る場合、用語「ストリンジェンシー」は、条件がハイブリダイゼーションに好ましくない
程度を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションに強く不利であり、最も
構造的に関連する分子のみが、このような条件下で互いにハイブリダイズする。逆に、非
ストリンジェント条件は、より低い程度の構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーシ
ョンに有利である。したがって、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、2つの
核酸配列の構造的関係と直接相関する。
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、全体的なDNA濃度、イオン強度、温
度、プローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の存在を含む多くの因子の関数であ
る。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いDNA濃度、高いイオン強度、低
い温度、より長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の不在が含まれる。ハ
イブリダイゼーションは、典型的には「結合」相および「洗浄」相の2つの相で実施され
る。
度、プローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の存在を含む多くの因子の関数であ
る。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いDNA濃度、高いイオン強度、低
い温度、より長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の不在が含まれる。ハ
イブリダイゼーションは、典型的には「結合」相および「洗浄」相の2つの相で実施され
る。
機能的に等価なDNA変異体
本発明の範囲内のさらに別のクラスのDNA変異体は、それらがコードする産物を参照
して記載され得る。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝子コードの縮重の
ために同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
本発明の範囲内のさらに別のクラスのDNA変異体は、それらがコードする産物を参照
して記載され得る。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝子コードの縮重の
ために同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
本明細書において提供されるDNA分子の変異体は、いくつかの異なる方法で構築され
得ることが認識される。例えば、それらは完全に合成されたDNAとして構築され得る。
オリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法は、広く利用可能である。Ausubelら
、section 2.11、Supplement 21(1993)を参照。重複オ
リゴヌクレオチドは、Khoranaら、J.Mol.Biol.、72:209-21
7(1971)により最初に報告された様式で合成および組み立てられ得る;Ausub
elら、上記の、Section 8.2も参照のこと。合成DNAは、好ましくは適切
なベクターへのクローニングを容易にするために、遺伝子の5’末端および3’末端で操
作された便利な制限部位を用いて設計される。
得ることが認識される。例えば、それらは完全に合成されたDNAとして構築され得る。
オリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法は、広く利用可能である。Ausubelら
、section 2.11、Supplement 21(1993)を参照。重複オ
リゴヌクレオチドは、Khoranaら、J.Mol.Biol.、72:209-21
7(1971)により最初に報告された様式で合成および組み立てられ得る;Ausub
elら、上記の、Section 8.2も参照のこと。合成DNAは、好ましくは適切
なベクターへのクローニングを容易にするために、遺伝子の5’末端および3’末端で操
作された便利な制限部位を用いて設計される。
示されるように、変異体を作製する方法は、本明細書に開示されるDNAのうちの1つ
から開始し、次いで部位特異的突然変異誘発を行うことである。Ausubelら、上記
の、第8章、Supplement 37(1997)を参照されたい。典型的な方法で
は、標的DNAを一本鎖DNAバクテリオファージビヒクルにクローニングする。一本鎖
DNAを単離し、所望のヌクレオチド変更を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさ
せる。相補鎖が合成され、二本鎖ファージが宿主に導入される。得られた子孫の一部は、
DNA配列決定を用いて確認することができる所望の変異体を含む。加えて、子孫ファー
ジが所望の変異体である確率を増加させる様々な方法が利用可能である。これらの方法は
当業者に周知であり、キットは、このような変異体を生成するために市販されている。
から開始し、次いで部位特異的突然変異誘発を行うことである。Ausubelら、上記
の、第8章、Supplement 37(1997)を参照されたい。典型的な方法で
は、標的DNAを一本鎖DNAバクテリオファージビヒクルにクローニングする。一本鎖
DNAを単離し、所望のヌクレオチド変更を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさ
せる。相補鎖が合成され、二本鎖ファージが宿主に導入される。得られた子孫の一部は、
DNA配列決定を用いて確認することができる所望の変異体を含む。加えて、子孫ファー
ジが所望の変異体である確率を増加させる様々な方法が利用可能である。これらの方法は
当業者に周知であり、キットは、このような変異体を生成するために市販されている。
組換えDNA構築物および発現
本発明はさらに、本発明によるヌクレオチド配列の1つまたは複数を含む組換えDNA
構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメ
ントもしくはその変異体をコードするDNA分子が挿入されているベクター、例えばプラ
スミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと関連して使用することができ
る。
本発明はさらに、本発明によるヌクレオチド配列の1つまたは複数を含む組換えDNA
構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメ
ントもしくはその変異体をコードするDNA分子が挿入されているベクター、例えばプラ
スミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと関連して使用することができ
る。
したがって、一態様において、本発明は、本発明による核酸配列を含むベクターに関す
る。
る。
本明細書において提供される抗体、抗原結合部分、またはその変異体は、宿主細胞にお
ける軽鎖および重鎖またはその部分をコードする核酸配列の組換え発現によって調製する
ことができる。抗体、抗原結合部分、またはその変異体を組換え的に発現させるために、
軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現されるように、軽鎖および/または重鎖またはその部
分をコードするDNAフラグメントを保有する1つ以上の組換え発現ベクターで宿主細胞
をトランスフェクトすることができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製および/
または取得し、これらの核酸を組換え発現ベクターに組み込み、該ベクターを宿主細胞に
導入するために、Sambrook、FritschおよびManiatis(編集)、
Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2
版、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1989)、Ausubel
、F.M.ら(編集)Current Protocols in Molecular
Biology、Greene Publishing Associates、(1
989)およびBossらによる米国特許第4,816,397号に記載されている方法
など、標準的な組換えDNA方法が使用される。
ける軽鎖および重鎖またはその部分をコードする核酸配列の組換え発現によって調製する
ことができる。抗体、抗原結合部分、またはその変異体を組換え的に発現させるために、
軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現されるように、軽鎖および/または重鎖またはその部
分をコードするDNAフラグメントを保有する1つ以上の組換え発現ベクターで宿主細胞
をトランスフェクトすることができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製および/
または取得し、これらの核酸を組換え発現ベクターに組み込み、該ベクターを宿主細胞に
導入するために、Sambrook、FritschおよびManiatis(編集)、
Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2
版、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1989)、Ausubel
、F.M.ら(編集)Current Protocols in Molecular
Biology、Greene Publishing Associates、(1
989)およびBossらによる米国特許第4,816,397号に記載されている方法
など、標準的な組換えDNA方法が使用される。
さらに、重鎖および/または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は例えば、全長抗体
鎖、Fabフラグメントをコードする核酸配列、またはscFvに変換することができる
。VLまたはVHをコードするDNAフラグメントは(2つのDNAフラグメントによっ
てコードされるアミノ酸配列がインフレームであるように)、例えば、抗体定常領域また
は柔軟なリンカーをコードする別のDNAフラグメントに作動可能なように連結され得る
。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は、当技術分野で公知であり(例えば、Kabat
、E.A.ら、(1991)Sequences of Proteins of Im
munological Interest、第5版、U.S.Department
of Health and Human Services、NIH Publica
tion No.91-3242を参照)、これらの領域を包含するDNAフラグメント
は、標準的なPCR増幅によって取得できる。
鎖、Fabフラグメントをコードする核酸配列、またはscFvに変換することができる
。VLまたはVHをコードするDNAフラグメントは(2つのDNAフラグメントによっ
てコードされるアミノ酸配列がインフレームであるように)、例えば、抗体定常領域また
は柔軟なリンカーをコードする別のDNAフラグメントに作動可能なように連結され得る
。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は、当技術分野で公知であり(例えば、Kabat
、E.A.ら、(1991)Sequences of Proteins of Im
munological Interest、第5版、U.S.Department
of Health and Human Services、NIH Publica
tion No.91-3242を参照)、これらの領域を包含するDNAフラグメント
は、標準的なPCR増幅によって取得できる。
scFvをコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、VHおよびVLをコー
ドする核酸は、VHおよびVL配列が、フレキシブルリンカーによって連結されるVLお
よびVH領域を備え、連続する一本鎖タンパク質として発現され得るように、フレキシブ
ルリンカーをコードする別のフラグメントに作動可能なように連結され得る(例えば、B
irdら(1988)Science 242:423-426;Hustonら(19
88) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;
McCaffertyら、Nature(1990)348:552-554を参照)。
ドする核酸は、VHおよびVL配列が、フレキシブルリンカーによって連結されるVLお
よびVH領域を備え、連続する一本鎖タンパク質として発現され得るように、フレキシブ
ルリンカーをコードする別のフラグメントに作動可能なように連結され得る(例えば、B
irdら(1988)Science 242:423-426;Hustonら(19
88) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;
McCaffertyら、Nature(1990)348:552-554を参照)。
抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体を発現させるために、標準的な組換
えDNA発現法を用いることができる(例えば、Goeddel;Gene Expre
ssion Technology.Methods in Enzymology 1
85、Academic Press、San Diego、Calif(1990))
。例えば、所望のポリペプチドをコードするDNAを発現ベクターに挿入し、次いで、適
切な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞は、原核細胞および
真核細胞である。原核生物宿主細胞の例は例えば細菌であり、真核生物宿主細胞の例は、
酵母、昆虫および昆虫細胞、植物および植物細胞、トランスジェニック動物、または哺乳
動物細胞である。宿主細胞への組換え構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェク
ション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形
質導入またはファージ感染などの標準的な技術を用いて行うことができる。
えDNA発現法を用いることができる(例えば、Goeddel;Gene Expre
ssion Technology.Methods in Enzymology 1
85、Academic Press、San Diego、Calif(1990))
。例えば、所望のポリペプチドをコードするDNAを発現ベクターに挿入し、次いで、適
切な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞は、原核細胞および
真核細胞である。原核生物宿主細胞の例は例えば細菌であり、真核生物宿主細胞の例は、
酵母、昆虫および昆虫細胞、植物および植物細胞、トランスジェニック動物、または哺乳
動物細胞である。宿主細胞への組換え構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェク
ション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形
質導入またはファージ感染などの標準的な技術を用いて行うことができる。
いくつかの態様において、重鎖および軽鎖をコードするDNAは、別々のベクターに挿
入される。他の実施形態において、重鎖および軽鎖をコードするDNAは、同じベクター
に挿入される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望のタ
ンパク質の発現レベル、および発現が構成的であるか誘導性であるかなどの因子によって
影響されることが理解される。
入される。他の実施形態において、重鎖および軽鎖をコードするDNAは、同じベクター
に挿入される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望のタ
ンパク質の発現レベル、および発現が構成的であるか誘導性であるかなどの因子によって
影響されることが理解される。
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明による抗体もしくは抗原結合フ
ラグメントを発現する、および/または本発明による核酸もしくは本発明によるベクター
を含む単離された細胞に関する。
ラグメントを発現する、および/または本発明による核酸もしくは本発明によるベクター
を含む単離された細胞に関する。
単離された細胞は、発現ベクターが利用可能な実質的に任意の細胞であり得る。単離さ
れた細胞は例えば、哺乳動物細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主
細胞であってもよく、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。
れた細胞は例えば、哺乳動物細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主
細胞であってもよく、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。
さらなる態様において、本発明は、本発明による細胞を培養することを含む、本発明に
よる単離された抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法に関する。特定の実施形
態において、本発明による細胞が抗体発現に適した条件下で培養され、抗体または抗原結
合フラグメントが回収される。特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメン
トが特に少なくとも95重量%の均一性まで精製される。
よる単離された抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法に関する。特定の実施形
態において、本発明による細胞が抗体発現に適した条件下で培養され、抗体または抗原結
合フラグメントが回収される。特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメン
トが特に少なくとも95重量%の均一性まで精製される。
細菌発現
細菌使用のための有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードするDNA配列を
、適切な翻訳開始および終止シグナルと共に、機能的プロモーターを有する作動可能な読
み取り相に挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、
所望であれば、宿主内で増幅を提供するために、1つまたは複数の表現型選択マーカーお
よび複製起点を含む。形質転換に適した原核生物宿主としては大腸菌、枯草菌、ネズミチ
フス菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトマイセス属、およびブドウ球菌属内の様
々な種が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌使用のための有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードするDNA配列を
、適切な翻訳開始および終止シグナルと共に、機能的プロモーターを有する作動可能な読
み取り相に挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、
所望であれば、宿主内で増幅を提供するために、1つまたは複数の表現型選択マーカーお
よび複製起点を含む。形質転換に適した原核生物宿主としては大腸菌、枯草菌、ネズミチ
フス菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトマイセス属、およびブドウ球菌属内の様
々な種が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌ベクターは例えば、バクテリオファージ、プラスミド、またはファージミドベース
であり得る。これらのベクターは、選択マーカーと、周知のクローニングベクターpBR
322(ATCC 37017)のエレメントを典型的に含有する市販のプラスミドに由
来する細菌複製起点とを含有することができる。適切な宿主株の形質転換および適切な細
胞密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段(例えば、温
度変化または化学的誘導)によって抑制解除/誘導され、細胞は、さらなる時間培養され
る。細胞は、典型的には、遠心分離により集められ、物理的または化学的手段により破壊
され、次いで、得られた粗抽出物をさらなる精製のためにとっておく。
であり得る。これらのベクターは、選択マーカーと、周知のクローニングベクターpBR
322(ATCC 37017)のエレメントを典型的に含有する市販のプラスミドに由
来する細菌複製起点とを含有することができる。適切な宿主株の形質転換および適切な細
胞密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段(例えば、温
度変化または化学的誘導)によって抑制解除/誘導され、細胞は、さらなる時間培養され
る。細胞は、典型的には、遠心分離により集められ、物理的または化学的手段により破壊
され、次いで、得られた粗抽出物をさらなる精製のためにとっておく。
細菌系では、発現されるタンパク質を意図する用途に応じて、多数の発現ベクターを有
利に選択することができる。例えば、大量のそのようなタンパク質が産生される場合、抗
体の生成のために、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、例えば、
容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場
合がある。
利に選択することができる。例えば、大量のそのようなタンパク質が産生される場合、抗
体の生成のために、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、例えば、
容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場
合がある。
したがって、本発明の一実施形態は、本発明の新規抗体をコードする核酸配列を含む発
現ベクターである。
現ベクターである。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその変異体は、天然に精製された
産物、化学合成手順の産物、および、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならび
にシュードモナス属、ストレプトミセス、およびブドウ球菌属内の様々な種、好ましくは
大腸菌細胞を含む原核生物宿主からの組換え技術によって産生された産物を含む。
産物、化学合成手順の産物、および、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならび
にシュードモナス属、ストレプトミセス、およびブドウ球菌属内の様々な種、好ましくは
大腸菌細胞を含む原核生物宿主からの組換え技術によって産生された産物を含む。
哺乳類発現
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベル
のタンパク質発現を指令するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス(CM
V)(CMVプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)(
SV40プロモーター/エンハンサーなど)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス
主要後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび
/またはエンハンサーが含まれる。抗体の発現は、構成的であってもよく、または調節的
であってもよい(例えば、Tet系と併せたテトラサイクリンなどの小分子誘導因子の付
加または除去によって誘導可能である)。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさら
なる説明については、例えば、StinskiによるU.S.5,168,062、Be
llらによるU.S.4,510,245およびSchaffnerらによるU.S.4
,968,615を参照されたい。組換え発現ベクターはまた、複製起点および選択マー
カーを含むことができる(例えば、U.S.4,399,216、4,634,665お
よびU.S.5,179,017を参照されたい)。適切な選択マーカーには、G418
、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ゼオシン/ブレオマイシンま
たはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子またはグルタミンシンテ
ターゼなどの栄養要求性を利用する選択マーカー(Bebbingtonら、Biote
chnology(N Y)1992 Feb;10(2):169-75)を、ベクタ
ーが導入された宿主細胞に含む。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子
はメトトレキサートに対する耐性を付与し、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与
し、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)由来のbs
d遺伝子はブラストサイジンに対する耐性を付与し、ピューロマイシンN-アセチルトラ
ンスフェラーゼはピューロマイシンに対する耐性を付与し、Sh ble遺伝子産物はゼ
オシンに対する耐性を付与し、ハイグロマイシンに対する耐性は、大腸菌ハイグロマイシ
ン耐性遺伝子(hygまたはhph)によって付与される。DHFRまたはグルタミンシ
ンテターゼのような選択可能なマーカーもまた、MTXおよびMSXと併せて増幅技術に
有用である。
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベル
のタンパク質発現を指令するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス(CM
V)(CMVプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)(
SV40プロモーター/エンハンサーなど)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス
主要後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび
/またはエンハンサーが含まれる。抗体の発現は、構成的であってもよく、または調節的
であってもよい(例えば、Tet系と併せたテトラサイクリンなどの小分子誘導因子の付
加または除去によって誘導可能である)。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさら
なる説明については、例えば、StinskiによるU.S.5,168,062、Be
llらによるU.S.4,510,245およびSchaffnerらによるU.S.4
,968,615を参照されたい。組換え発現ベクターはまた、複製起点および選択マー
カーを含むことができる(例えば、U.S.4,399,216、4,634,665お
よびU.S.5,179,017を参照されたい)。適切な選択マーカーには、G418
、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ゼオシン/ブレオマイシンま
たはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子またはグルタミンシンテ
ターゼなどの栄養要求性を利用する選択マーカー(Bebbingtonら、Biote
chnology(N Y)1992 Feb;10(2):169-75)を、ベクタ
ーが導入された宿主細胞に含む。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子
はメトトレキサートに対する耐性を付与し、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与
し、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)由来のbs
d遺伝子はブラストサイジンに対する耐性を付与し、ピューロマイシンN-アセチルトラ
ンスフェラーゼはピューロマイシンに対する耐性を付与し、Sh ble遺伝子産物はゼ
オシンに対する耐性を付与し、ハイグロマイシンに対する耐性は、大腸菌ハイグロマイシ
ン耐性遺伝子(hygまたはhph)によって付与される。DHFRまたはグルタミンシ
ンテターゼのような選択可能なマーカーもまた、MTXおよびMSXと併せて増幅技術に
有用である。
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、ヌク
レオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、ポリエチレンイミン(P
EI)に基づくトランスフェクションおよびDEAE-デキストラントランスフェクショ
ンなどのポリカチオンに基づくトランスフェクションなどの標準的な技術を用いて行うこ
とができる。
レオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、ポリエチレンイミン(P
EI)に基づくトランスフェクションおよびDEAE-デキストラントランスフェクショ
ンなどのポリカチオンに基づくトランスフェクションなどの標準的な技術を用いて行うこ
とができる。
本明細書で提供される抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体を発現するた
めの好適な哺乳動物宿主細胞には、CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SVなどの
チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)[UrlaubおよびChasin、(19
80)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220およ
びUrlaubら、Cell.1983 Jun;33(2):405-12に記載され
ている、例えば、R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)M
ol.Biol.159:601-621に記載されているDHFR選択可能なマーカー
と使用される、dhfr-CHO細胞;およびFanら、Biotechnol Bio
eng.2012 Apr;109(4):1007-15に例示される他のノックアウ
ト細胞を含む]、NS0骨髄腫細胞、COS細胞、HEK293細胞、HKB11細胞、
BHK21細胞、CAP細胞、EB66細胞、およびSP2細胞が挙げられる。
めの好適な哺乳動物宿主細胞には、CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SVなどの
チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)[UrlaubおよびChasin、(19
80)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220およ
びUrlaubら、Cell.1983 Jun;33(2):405-12に記載され
ている、例えば、R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)M
ol.Biol.159:601-621に記載されているDHFR選択可能なマーカー
と使用される、dhfr-CHO細胞;およびFanら、Biotechnol Bio
eng.2012 Apr;109(4):1007-15に例示される他のノックアウ
ト細胞を含む]、NS0骨髄腫細胞、COS細胞、HEK293細胞、HKB11細胞、
BHK21細胞、CAP細胞、EB66細胞、およびSP2細胞が挙げられる。
発現はまた、HEK293、HEK293T、HEK293-EBNA、HEK293
E、HEK293-6E、HEK293-Freestyle、HKB11、Expi2
93F、293EBNALT75、CHO Freestyle、CHO-S、CHO-
K1、CHO-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7ま
たはCAP-T細胞(例えば、Durocherら、Nucleic Acids Re
s.2002 Jan 15;30(2):E9)などの発現系において一過性または半
安定であり得る。
E、HEK293-6E、HEK293-Freestyle、HKB11、Expi2
93F、293EBNALT75、CHO Freestyle、CHO-S、CHO-
K1、CHO-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7ま
たはCAP-T細胞(例えば、Durocherら、Nucleic Acids Re
s.2002 Jan 15;30(2):E9)などの発現系において一過性または半
安定であり得る。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、発現されたタンパク質が宿主細胞が増
殖する培地中に分泌されるように設計される。抗体、その抗原結合フラグメントまたはそ
の変異体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。
殖する培地中に分泌されるように設計される。抗体、その抗原結合フラグメントまたはそ
の変異体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。
精製
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその変異体は、硫酸アンモニウム
またはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインAクロマトグラフィー、プロテインGクロマ
トグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含
むがこれらに限定されない周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製す
ることができる。高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)も精製に用いることがで
きる。例えば、Colligan、Current Protocols in Imm
unology、or Current Protocols in Protein
Science、John Wiley & Sons、NY、N.Y.、(1997-
2001)、例えば、Chapters1、4、6、8、9、10を参照されたい、それ
ぞれが参照により完全に本明細書に組み込まれる。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその変異体は、硫酸アンモニウム
またはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインAクロマトグラフィー、プロテインGクロマ
トグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含
むがこれらに限定されない周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製す
ることができる。高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)も精製に用いることがで
きる。例えば、Colligan、Current Protocols in Imm
unology、or Current Protocols in Protein
Science、John Wiley & Sons、NY、N.Y.、(1997-
2001)、例えば、Chapters1、4、6、8、9、10を参照されたい、それ
ぞれが参照により完全に本明細書に組み込まれる。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその変異体には、天然に精製され
た産物、化学合成手順の産物、および、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細
胞を含む、真核宿主からの組換え技術によって産生された産物が含まれる。組換え産生手
順において使用される宿主に応じて、本発明の抗体は、グリコシル化され得るか、または
非グリコシル化され得る。そのような方法は、Sambrook、上記の、Sectio
ns17.37~17.42;Ausubel、上記の、Chapters10、12、
13、16、18および20などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
た産物、化学合成手順の産物、および、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細
胞を含む、真核宿主からの組換え技術によって産生された産物が含まれる。組換え産生手
順において使用される宿主に応じて、本発明の抗体は、グリコシル化され得るか、または
非グリコシル化され得る。そのような方法は、Sambrook、上記の、Sectio
ns17.37~17.42;Ausubel、上記の、Chapters10、12、
13、16、18および20などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
好適な実施形態において、抗体は例えば、ローリー法、UV-Vis分光法、またはS
DS-キャピラリーゲル電気フォレジン(例えば、Caliper LabChip G
XII、GX 90またはBiorad Bioanalyzer装置により)によって
決定されるように、抗体の95重量%以上に、さらに好適な実施形態において99重量%
以上に、(2)N末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程
度まで、または(3)クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた還元または非還元
条件下でSDS-PAGEにより均質になるまで、精製される。抗体の天然環境の少なく
とも1つの成分が存在しないので、単離された天然に存在する抗体は、組換え細胞内のイ
ンサイチュの(in situ)抗体を含む。しかし、通常は、単離された抗体が少なく
とも1つの精製工程によって調製される。
DS-キャピラリーゲル電気フォレジン(例えば、Caliper LabChip G
XII、GX 90またはBiorad Bioanalyzer装置により)によって
決定されるように、抗体の95重量%以上に、さらに好適な実施形態において99重量%
以上に、(2)N末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程
度まで、または(3)クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた還元または非還元
条件下でSDS-PAGEにより均質になるまで、精製される。抗体の天然環境の少なく
とも1つの成分が存在しないので、単離された天然に存在する抗体は、組換え細胞内のイ
ンサイチュの(in situ)抗体を含む。しかし、通常は、単離された抗体が少なく
とも1つの精製工程によって調製される。
治療方法
治療方法は、治療を必要とする被験体に、治療上有効である量の本発明によって企図さ
れる抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその変異体を投与することを含む。「
治療上有効である」量は、本明細書において、単回用量として、または複数回投与レジメ
ンにより、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、被験体におけるプラスミン媒介性血
餅溶解を増加させるのに十分な量の抗体または抗原結合フラグメントの量として定義され
、それは有害な状態の緩和をもたらすが、毒物学的に許容される量である。被験体は、ヒ
トまたは非ヒト動物(例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の低次霊長
類)であり得る。
治療方法は、治療を必要とする被験体に、治療上有効である量の本発明によって企図さ
れる抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその変異体を投与することを含む。「
治療上有効である」量は、本明細書において、単回用量として、または複数回投与レジメ
ンにより、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、被験体におけるプラスミン媒介性血
餅溶解を増加させるのに十分な量の抗体または抗原結合フラグメントの量として定義され
、それは有害な状態の緩和をもたらすが、毒物学的に許容される量である。被験体は、ヒ
トまたは非ヒト動物(例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の低次霊長
類)であり得る。
したがって、一態様において、本発明は、疾患の治療または予防に使用するための、本
発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明による単離され
た抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離さ
れた抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物に関する。
発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明による単離され
た抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離さ
れた抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物に関する。
本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、部分的または完全な血管
閉塞に起因する虚血事象に関連する様々なA2AP関連障害および/または疾患における
治療または診断ツールとして使用することができる。
閉塞に起因する虚血事象に関連する様々なA2AP関連障害および/または疾患における
治療または診断ツールとして使用することができる。
虚血事象は1つの血管の部分的または完全な閉塞に起因し得るが、それはまた、いくつ
かの血管が部分的に閉塞され得、いくつかの血管が完全に閉塞され得る、2つ以上の血管
の部分的または完全な閉塞の結果であり得る。
かの血管が部分的に閉塞され得、いくつかの血管が完全に閉塞され得る、2つ以上の血管
の部分的または完全な閉塞の結果であり得る。
したがって、さらなる態様において、本発明は、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動
脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、もしくはシャント血栓症な
どの、部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療
または予防に使用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメン
ト、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲ
ート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成
物に関する。
脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、もしくはシャント血栓症な
どの、部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療
または予防に使用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメン
ト、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲ
ート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成
物に関する。
さらなる態様において、本発明は、疾患、特に、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動
脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症など
の部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療また
は予防のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本
発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、または
本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物に関する。
脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症など
の部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療また
は予防のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本
発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、または
本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、疾患、特に、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動
脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症など
の部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療また
は予防の方法における、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、ま
たは本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、
または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の使
用に関する。
脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症など
の部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療また
は予防の方法における、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、ま
たは本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、
または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の使
用に関する。
さらなる態様において、本発明は、疾患、特に、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動
脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症など
の部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の予防また
は治療のための医薬組成物、好ましくは医薬の調製のための、本発明による単離された抗
体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合
フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結
合フラグメントを含む医薬組成物の使用に関する。
脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症など
の部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の予防また
は治療のための医薬組成物、好ましくは医薬の調製のための、本発明による単離された抗
体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合
フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結
合フラグメントを含む医薬組成物の使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラ
グメントまたは本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジ
ュゲートまたは本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組
成物の有効量を使用する、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部
静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの部分的または完全な血
管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療または予防の方法に関する。
上述の障害は、ヒトにおいて十分に特徴付けられているが、哺乳動物を含む他の動物にお
いても同様の病因で存在し、本発明による医薬組成物を投与することによって治療するこ
とができる。
グメントまたは本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジ
ュゲートまたは本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組
成物の有効量を使用する、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部
静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの部分的または完全な血
管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療または予防の方法に関する。
上述の障害は、ヒトにおいて十分に特徴付けられているが、哺乳動物を含む他の動物にお
いても同様の病因で存在し、本発明による医薬組成物を投与することによって治療するこ
とができる。
本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその変異体は、既知の医薬と同
時投与されてもよく、場合によっては抗体またはその抗原結合フラグメント自体が修飾さ
れてもよい。例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその変異体は、効力
を潜在的にさらに増加させるために、薬物または別のペプチドもしくはタンパク質にコン
ジュゲートされ得る。
時投与されてもよく、場合によっては抗体またはその抗原結合フラグメント自体が修飾さ
れてもよい。例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその変異体は、効力
を潜在的にさらに増加させるために、薬物または別のペプチドもしくはタンパク質にコン
ジュゲートされ得る。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくはその変異体は、唯一の医薬剤と
して、または1つもしくは複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与され得、ここで、こ
の組み合わせは許容できない有害作用を引き起こさない。
して、または1つもしくは複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与され得、ここで、こ
の組み合わせは許容できない有害作用を引き起こさない。
したがって、さらなる態様において、本発明は、1つまたは複数のさらなる治療活性化
合物と同時に、別々に、または連続的に組み合わせて使用するための本発明による単離さ
れた抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明によるコンジュゲート、または本
発明による薬学的組成物に関する。
合物と同時に、別々に、または連続的に組み合わせて使用するための本発明による単離さ
れた抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明によるコンジュゲート、または本
発明による薬学的組成物に関する。
本発明による抗体または抗原結合フラグメントと組み合わせて使用される治療活性化合
物の非限定的な例は以下のとおりである:
i)プラスミノーゲン活性化因子のような凝固カスケードの阻害剤(血栓溶解剤/線維素
溶解剤)、ならびに血栓溶解および/または線維素溶解を増加させる化合物(組織プラス
ミノーゲン活性化因子(t-PA)、ストレプトキナーゼ、レテプラーゼ、およびウロキ
ナーゼのような)、またはプラスミノーゲン活性化因子阻害因子(PAI)もしくはトロ
ンビン活性化可能線維素溶解阻害因子(TAFI)の阻害剤;
ii)非分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリノイド、ヒルジン、ビバリルジンおよ
び/またはアルガトロバンのような抗凝固剤;直接経口抗凝固剤/第Xa因子阻害剤など
の非ビタミンK抗凝固剤、例えばアピキサバン、エドキサバンおよびリバーロキサバン、
ならびにトロンビン阻害剤、例えばダビガトラン。
物の非限定的な例は以下のとおりである:
i)プラスミノーゲン活性化因子のような凝固カスケードの阻害剤(血栓溶解剤/線維素
溶解剤)、ならびに血栓溶解および/または線維素溶解を増加させる化合物(組織プラス
ミノーゲン活性化因子(t-PA)、ストレプトキナーゼ、レテプラーゼ、およびウロキ
ナーゼのような)、またはプラスミノーゲン活性化因子阻害因子(PAI)もしくはトロ
ンビン活性化可能線維素溶解阻害因子(TAFI)の阻害剤;
ii)非分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリノイド、ヒルジン、ビバリルジンおよ
び/またはアルガトロバンのような抗凝固剤;直接経口抗凝固剤/第Xa因子阻害剤など
の非ビタミンK抗凝固剤、例えばアピキサバン、エドキサバンおよびリバーロキサバン、
ならびにトロンビン阻害剤、例えばダビガトラン。
iii)アスピリン、クロピドグレル、シロスタゾール、プラスグレル、チカグレロル、
カングレロールなどの血小板凝集阻害剤。
カングレロールなどの血小板凝集阻害剤。
併用療法は、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその変異体および
1つ以上の追加の治療剤を含む単一の医薬投与製剤の投与、ならびに本発明による抗体も
しくは抗原結合フラグメントおよびそれぞれの追加の治療剤の、それ自体の別々の医薬投
与製剤における投与を含む。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまた
はその変異体および治療剤は、単一の液体組成物で患者に一緒に投与されてもよく、また
は各薬剤は別々の投与製剤で投与されてもよい。
1つ以上の追加の治療剤を含む単一の医薬投与製剤の投与、ならびに本発明による抗体も
しくは抗原結合フラグメントおよびそれぞれの追加の治療剤の、それ自体の別々の医薬投
与製剤における投与を含む。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまた
はその変異体および治療剤は、単一の液体組成物で患者に一緒に投与されてもよく、また
は各薬剤は別々の投与製剤で投与されてもよい。
別々の投与製剤が使用される場合、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントま
たはその変異体および1つ以上の追加の治療剤は、本質的に同時に(例えば、同時に(c
oncurrently))または別々にずらして(例えば、連続して)投与され得る。
たはその変異体および1つ以上の追加の治療剤は、本質的に同時に(例えば、同時に(c
oncurrently))または別々にずらして(例えば、連続して)投与され得る。
本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはその変異体は、機械的塞栓摘出術
、血栓摘出術、血栓回収デバイス、脳血行再建術のようなこれらに限定されない外科的介
入と組み合わせて使用され得る。
、血栓摘出術、血栓回収デバイス、脳血行再建術のようなこれらに限定されない外科的介
入と組み合わせて使用され得る。
診断方法
さらに、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、それ自体で、または組成物
中で、研究および診断において、または分析基準などとして利用され得る。
さらに、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、それ自体で、または組成物
中で、研究および診断において、または分析基準などとして利用され得る。
抗A2AP抗体またはその抗原結合フラグメントは、A2APの存在を検出するために
使用することができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、診断薬として使
用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは本発明
による抗体コンジュゲートに関する。
使用することができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、診断薬として使
用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは本発明
による抗体コンジュゲートに関する。
医薬組成物および投与
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントまたは本発明による抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。前述の障害の
いずれかを治療するために、本発明に従って使用するための医薬組成物は、1つ以上の生
理学的に許容される担体、賦形剤、または助剤を使用して、任意の従来の様式で製剤化さ
れ得る。製剤化および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Remington’
s Pharmaceutical Sciences(編集 Maack Publi
shing Co、Easton、Pa.)の最新版に見出すことができる。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントまたは本発明による抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。前述の障害の
いずれかを治療するために、本発明に従って使用するための医薬組成物は、1つ以上の生
理学的に許容される担体、賦形剤、または助剤を使用して、任意の従来の様式で製剤化さ
れ得る。製剤化および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Remington’
s Pharmaceutical Sciences(編集 Maack Publi
shing Co、Easton、Pa.)の最新版に見出すことができる。
本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、治療される障害のタイプに応じて変
化し得る任意の適切な手段によって投与することができる。可能な投与経路としては、経
口、非経口、および局所投与が挙げられる。非経口送達の方法は、動脈内、筋肉内、皮下
、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与を含む。さらに、本発明に
よる抗体または抗原結合フラグメントは例えば、抗体の用量を減少させながら、パルス注
入によって投与され得る。好ましくは投与は,注射、最も好ましくは静脈内または皮下注
射によるものであり、部分的には投与が短時間であるかまたは長期であるかに依存する。
投与される量は、臨床症状、個体の体重、他の薬物が投与されるかどうかなどの様々な因
子に依存する。当業者は、投与経路が治療される障害または状態に応じて変化することを
認識するのであろう。
化し得る任意の適切な手段によって投与することができる。可能な投与経路としては、経
口、非経口、および局所投与が挙げられる。非経口送達の方法は、動脈内、筋肉内、皮下
、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与を含む。さらに、本発明に
よる抗体または抗原結合フラグメントは例えば、抗体の用量を減少させながら、パルス注
入によって投与され得る。好ましくは投与は,注射、最も好ましくは静脈内または皮下注
射によるものであり、部分的には投与が短時間であるかまたは長期であるかに依存する。
投与される量は、臨床症状、個体の体重、他の薬物が投与されるかどうかなどの様々な因
子に依存する。当業者は、投与経路が治療される障害または状態に応じて変化することを
認識するのであろう。
本発明による医薬組成物は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを、単独で
、または安定化化合物などの少なくとも1つの他の薬剤と組み合わせて含む。本発明によ
る抗体または抗原結合フラグメントは,生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、
および水を含むが、これらに限定されない、任意の無菌の生体適合性医薬担体中で投与さ
れ得る。特定の実施形態において、本発明による医薬組成物は、1つ以上のさらなる薬学
的に活性な化合物、特に、A2AP関連障害および/または部分的または完全な血管閉塞
による虚血事象に関連する障害を治療するのに適した1つ以上のさらなる薬学的に活性な
化合物を含み得る。これらの薬剤のいずれも、単独で、または他の薬剤もしくは薬物と組
み合わせて、賦形剤(複数可)または薬学的に許容される担体と混合される医薬組成物中
で、患者に投与することができる。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は
薬学的に不活性である。
、または安定化化合物などの少なくとも1つの他の薬剤と組み合わせて含む。本発明によ
る抗体または抗原結合フラグメントは,生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、
および水を含むが、これらに限定されない、任意の無菌の生体適合性医薬担体中で投与さ
れ得る。特定の実施形態において、本発明による医薬組成物は、1つ以上のさらなる薬学
的に活性な化合物、特に、A2AP関連障害および/または部分的または完全な血管閉塞
による虚血事象に関連する障害を治療するのに適した1つ以上のさらなる薬学的に活性な
化合物を含み得る。これらの薬剤のいずれも、単独で、または他の薬剤もしくは薬物と組
み合わせて、賦形剤(複数可)または薬学的に許容される担体と混合される医薬組成物中
で、患者に投与することができる。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は
薬学的に不活性である。
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適した用量で、当技術分野で周知の薬学的
に許容される担体を用いて製剤化することができる。このような担体は、患者による摂取
のために、医薬品組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラ
リー、懸濁液等に製剤化できる。
に許容される担体を用いて製剤化することができる。このような担体は、患者による摂取
のために、医薬品組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラ
リー、懸濁液等に製剤化できる。
経口使用のための医薬調製物は、活性化合物と固体賦形剤との組み合わせ、任意に得ら
れた混合物を粉砕すること、および所望であれば、適切な補助剤を添加した後に顆粒の混
合物を加工して錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。好適な賦形
剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、
またはソルビトールを含む糖類;トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の
植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、または
カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース;アラビアゴムおよびトラガン
トを含むゴム類;ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質類である。必要に
応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムな
どのその塩などの崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
れた混合物を粉砕すること、および所望であれば、適切な補助剤を添加した後に顆粒の混
合物を加工して錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。好適な賦形
剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、
またはソルビトールを含む糖類;トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の
植物由来のデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、または
カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース;アラビアゴムおよびトラガン
トを含むゴム類;ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質類である。必要に
応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムな
どのその塩などの崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
糖衣錠コアには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、
ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有
機溶媒または溶媒混合物を含有する可能性がある濃縮糖溶液などの適切なコーティングを
施すことができる。色素または顔料は、製品同定のために、または活性化合物の量、すな
わち投薬量を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有
機溶媒または溶媒混合物を含有する可能性がある濃縮糖溶液などの適切なコーティングを
施すことができる。色素または顔料は、製品同定のために、または活性化合物の量、すな
わち投薬量を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
経口的に使用することができる医薬調製物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセ
ル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作製
された軟質の密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースまたは
デンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑
剤、および任意に安定剤と混合された活性成分を含有することができる。柔らかいカプセ
ルでは、活性化合物が、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体
ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁される。
ル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作製
された軟質の密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースまたは
デンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑
剤、および任意に安定剤と混合された活性成分を含有することができる。柔らかいカプセ
ルでは、活性化合物が、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体
ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁される。
非経口投与のための医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射のために、本
発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス
液、リンゲル液、または生理学的に緩衝された生理食塩水中に製剤化され得る。水性注射
懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン
などの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、
適切な油性注入懸濁液として調製され得る。好適な親脂性溶媒またはビヒクルにはゴマ油
のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エス
テル、またはリポソームが包含される。任意に、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能
にするために、化合物の溶解度を増加させる適切な安定剤または薬剤を含有する可能性が
ある。
発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス
液、リンゲル液、または生理学的に緩衝された生理食塩水中に製剤化され得る。水性注射
懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン
などの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、
適切な油性注入懸濁液として調製され得る。好適な親脂性溶媒またはビヒクルにはゴマ油
のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エス
テル、またはリポソームが包含される。任意に、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能
にするために、化合物の溶解度を増加させる適切な安定剤または薬剤を含有する可能性が
ある。
局所または経鼻投与のために、浸透されるべき特定のバリアに適切な浸透剤が製剤中で
使用される。このような浸透剤は、当該技術分野において一般に知られている。
使用される。このような浸透剤は、当該技術分野において一般に知られている。
本発明の医薬組成物は例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、微粒子化(le
vigating)、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程の手段によって、当該
技術分野で公知の方法で製造することができる。
vigating)、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程の手段によって、当該
技術分野で公知の方法で製造することができる。
医薬組成物は、塩として提供することができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リン
ゴ酸、コハク酸などを含むが、これらに限定されない酸で形成することができる。塩は、
水性または対応する遊離塩基形態である他のプロトン性溶媒により可溶性である傾向があ
る。他の場合には、好ましい調製物は、1mM~50mMのヒスチジンまたはリン酸もし
くはトリス、0.1%~2%のスクロースおよび/または2%~7%のマンニトール中の
、pH4.5~7.5の範囲の凍結乾燥粉末であってもよく、任意に、使用前に緩衝液と
混合されるポリソルベートのような追加の物質を含む。
ゴ酸、コハク酸などを含むが、これらに限定されない酸で形成することができる。塩は、
水性または対応する遊離塩基形態である他のプロトン性溶媒により可溶性である傾向があ
る。他の場合には、好ましい調製物は、1mM~50mMのヒスチジンまたはリン酸もし
くはトリス、0.1%~2%のスクロースおよび/または2%~7%のマンニトール中の
、pH4.5~7.5の範囲の凍結乾燥粉末であってもよく、任意に、使用前に緩衝液と
混合されるポリソルベートのような追加の物質を含む。
許容される担体中に製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物が調製された後、そ
れらを適切な容器に入れ、指示された状態の治療のためにラベル付けすることができる。
抗A2AP抗体またはその抗原結合フラグメントの投与のために、そのようなラベリング
は、投与の量、頻度および方法を含む。
れらを適切な容器に入れ、指示された状態の治療のためにラベル付けすることができる。
抗A2AP抗体またはその抗原結合フラグメントの投与のために、そのようなラベリング
は、投与の量、頻度および方法を含む。
治療上の有効用量
本発明による使用に適した医薬組成物には、意図する目的、例えば、部分的または完全
な血管閉塞による虚血事象を特徴とする特定の疾患状態の治療を達成するのに有効な量で
活性成分が含有される組成物が含まれる。
本発明による使用に適した医薬組成物には、意図する目的、例えば、部分的または完全
な血管閉塞による虚血事象を特徴とする特定の疾患状態の治療を達成するのに有効な量で
活性成分が含有される組成物が含まれる。
有効用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。本発明の新規抗体またはその
抗原結合フラグメントもしくはその変異体の治療有効量を決定することは、主に、特定の
患者の特徴、投与経路、および治療される障害の性質に依存する。一般的なガイダンスは
例えば、国際調和会議(International Conference on H
armonization)の刊行物およびREMINGTON’S PHARMACE
UTICAL SCIENCES、第27および28章、484-528頁(第18版、
Alfonso R.Gennaro、Ed.、Easton、Pa.:Mack Pu
b.Co.、1990)に見出すことができる。より具体的には、治療有効量を決定する
ことは、薬剤の毒性および有効性などの因子に依存する。毒性は当技術分野で周知の方法
を用いて決定することができ、前述の参考文献に見出される。有効性は、実施例において
以下に記載される方法と併せて同じガイダンスを利用して決定され得る。
抗原結合フラグメントもしくはその変異体の治療有効量を決定することは、主に、特定の
患者の特徴、投与経路、および治療される障害の性質に依存する。一般的なガイダンスは
例えば、国際調和会議(International Conference on H
armonization)の刊行物およびREMINGTON’S PHARMACE
UTICAL SCIENCES、第27および28章、484-528頁(第18版、
Alfonso R.Gennaro、Ed.、Easton、Pa.:Mack Pu
b.Co.、1990)に見出すことができる。より具体的には、治療有効量を決定する
ことは、薬剤の毒性および有効性などの因子に依存する。毒性は当技術分野で周知の方法
を用いて決定することができ、前述の参考文献に見出される。有効性は、実施例において
以下に記載される方法と併せて同じガイダンスを利用して決定され得る。
任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデ
ル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルにおいて、最初に推定することができ
る。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するために使用される。
次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量および経路を
決定することができる。
ル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルにおいて、最初に推定することができ
る。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するために使用される。
次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量および経路を
決定することができる。
治療上有効な用量は、症状または状態を改善する抗体またはその抗原結合フラグメント
の量を指す。そのような化合物の治療的有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物
における通常の薬学的手法、例えば、ED50(集団の50%において治療的に効果的な
用量)およびLD50(集団の50%に対して致死的な用量)によって決定することがで
きる。治療効果と毒性効果との間の投与量比は治療係数であり、ED50/LD50の比
率として表すことができる。大きな治療係数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッ
セイおよび動物研究から得られたデータは、ヒト使用のための用量の範囲を処方する際に
使用される。このような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く有害性を有さ
ないED50を含む循環血中濃度の範囲内にある。用量は、使用される投与形態、患者の
感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変化する。
の量を指す。そのような化合物の治療的有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物
における通常の薬学的手法、例えば、ED50(集団の50%において治療的に効果的な
用量)およびLD50(集団の50%に対して致死的な用量)によって決定することがで
きる。治療効果と毒性効果との間の投与量比は治療係数であり、ED50/LD50の比
率として表すことができる。大きな治療係数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッ
セイおよび動物研究から得られたデータは、ヒト使用のための用量の範囲を処方する際に
使用される。このような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く有害性を有さ
ないED50を含む循環血中濃度の範囲内にある。用量は、使用される投与形態、患者の
感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変化する。
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して個々の担当医により選択される。用量お
よび投与は十分なレベルの活性部分を提供するように、または所望の効果を維持するよう
に調整される。考慮され得るさらなる因子は、疾患状態の重症度、患者の年齢、体重およ
び性別;食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに治療に
対する耐性/応答を含む。長時間作用型医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリア
ランス速度に応じて、例えば3~4日毎、毎週、2週間に1回、または3週間に1回投与
することができる。
よび投与は十分なレベルの活性部分を提供するように、または所望の効果を維持するよう
に調整される。考慮され得るさらなる因子は、疾患状態の重症度、患者の年齢、体重およ
び性別;食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに治療に
対する耐性/応答を含む。長時間作用型医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリア
ランス速度に応じて、例えば3~4日毎、毎週、2週間に1回、または3週間に1回投与
することができる。
通常の用量は、投与経路に応じて、0.1~100,000マイクログラム、最大約1
0gの総用量で変動してもよい。特定の用量および送達方法に関するガイダンスは、文献
に提供されている。米国特許第4,657,760号、5,206,344号、5,22
5,212号を参照。
0gの総用量で変動してもよい。特定の用量および送達方法に関するガイダンスは、文献
に提供されている。米国特許第4,657,760号、5,206,344号、5,22
5,212号を参照。
キット
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントまたは本発明によるコンジュゲートと、使用説明書とを含むキットに関する。特定
の実施形態において、キットは、本発明の前述の組成物の成分のうちの1つまたは複数が
充填された1つまたは複数の容器を含む。そのような容器に関連して、ヒトへの投与のた
めの製品の製造、使用または販売の機関による承認を反映している、医薬品または生物学
的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知がある
ことができる。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグ
メントまたは本発明によるコンジュゲートと、使用説明書とを含むキットに関する。特定
の実施形態において、キットは、本発明の前述の組成物の成分のうちの1つまたは複数が
充填された1つまたは複数の容器を含む。そのような容器に関連して、ヒトへの投与のた
めの製品の製造、使用または販売の機関による承認を反映している、医薬品または生物学
的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知がある
ことができる。
図面の簡単な説明
カラム1:対照
カラム2:0.125mg/kgのtPA、
カラム3:0.25mg/kgのtPA
カラム4:1mg/kgのtPA
カラム5:3.75mg/kgのTPP-17928
カラム6:7.5mg/kgのTPP-17928
カラム7:15mg/kgのTPP-17928
カラム8:15mg/kgのTPP-17928+0.125mg/kgのtPA
図14:プラスミンに対する77A3および本発明の抗体の効果 実施例10に記載のA2AP機能遮断アッセイの結果を示す。
カラム2:0.125mg/kgのtPA、
カラム3:0.25mg/kgのtPA
カラム4:1mg/kgのtPA
カラム5:3.75mg/kgのTPP-17928
カラム6:7.5mg/kgのTPP-17928
カラム7:15mg/kgのTPP-17928
カラム8:15mg/kgのTPP-17928+0.125mg/kgのtPA
以下の抗体および抗体濃度を使用した:
図14.1:6.1E-11~3.0E-08M 77A3(左図)および6.11E-
11~1.0E-06M 77A3(右図)
図14.2:6.11E-11~1E-06M 77A3(丸)および6.1E-11~
1.0E-06M TPP-17041(三角)
図14.3:6.1E-11~1.0E-06M 77A3(丸)及び6.1E-11~
1.0E-06M TPP-17044(四角)
図14.4:6.1E-11~1Ee-06M 77A3(丸)および6.1E-11~
1.0E-06M TPP-17045(三角)
図14.5:6.1E-11~1.0E-06M 77A3(丸)および6.1E-11
~1.0E-06M TPP-17048(菱形)
図14.6:6.1E-11~1.0E-06M 77A3(丸)および6.1E-11
~1.0E-06M TPP-17051(三角).
図14.7:6.1E-11~1.0E-06M 77A3(丸)および6.1E-11
~1.0E-06M TPP-17053(四角)。
図14.1:6.1E-11~3.0E-08M 77A3(左図)および6.11E-
11~1.0E-06M 77A3(右図)
図14.2:6.11E-11~1E-06M 77A3(丸)および6.1E-11~
1.0E-06M TPP-17041(三角)
図14.3:6.1E-11~1.0E-06M 77A3(丸)及び6.1E-11~
1.0E-06M TPP-17044(四角)
図14.4:6.1E-11~1Ee-06M 77A3(丸)および6.1E-11~
1.0E-06M TPP-17045(三角)
図14.5:6.1E-11~1.0E-06M 77A3(丸)および6.1E-11
~1.0E-06M TPP-17048(菱形)
図14.6:6.1E-11~1.0E-06M 77A3(丸)および6.1E-11
~1.0E-06M TPP-17051(三角).
図14.7:6.1E-11~1.0E-06M 77A3(丸)および6.1E-11
~1.0E-06M TPP-17053(四角)。
0.03μMまでの77A3の濃度の増加は、プラスミンによる蛍光基質I-1275
の切断に起因する蛍光シグナルの増加をもたらした。しかし、77A3の濃度のさらなる
増加は、蛍光シグナルの減少をもたらした。これは、0,03μMの濃度までの実施例4
に記載の生化学アッセイにおける抗体77A3の試験が、α2-アンチプラスミンの遮断
をもたらし、77A3抗体濃度のさらなる増加がプラスミン活性の低下をもたらし、1μ
Mの77A3の濃度でプラスミン活性の完全な阻害をもたらすことを示す(図14.1)
。驚くべきことに、この発見と比較して、1μMまでの本発明の試験抗体は、蛍光シグナ
ルの減少をもたらさず、このことは本発明の試験抗体がプラスミン活性に影響を及ぼさな
いことを示す(図14.2-14.7)。
図15:本発明による好ましい抗体のアミノ酸配列 本発明による好ましい抗体のVH、H-CDR1、H-CDR2、H-CDR2、H-CDR3、VL、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。
図16:プラスミンのタンパク質分解活性に対する本発明の77A3およ び抗体の効果 77A3(四角)およびTPP-17928(丸)について、実施例11に記載の使用した抗体濃度に応じたプラスミン活性を示す。二重反復で実施された2~3回の独立した実験からの1つの用量応答曲線が、例として示される。77A3は、濃度依存的にプラスミン活性に対する阻害作用(IC50 1.7μM)を示すが、TPP-17928は驚くべきことに、10μMの濃度までプラスミン活性を阻害しない(実施例11におけるIC50値の表による概要も参照されたい)。
の切断に起因する蛍光シグナルの増加をもたらした。しかし、77A3の濃度のさらなる
増加は、蛍光シグナルの減少をもたらした。これは、0,03μMの濃度までの実施例4
に記載の生化学アッセイにおける抗体77A3の試験が、α2-アンチプラスミンの遮断
をもたらし、77A3抗体濃度のさらなる増加がプラスミン活性の低下をもたらし、1μ
Mの77A3の濃度でプラスミン活性の完全な阻害をもたらすことを示す(図14.1)
。驚くべきことに、この発見と比較して、1μMまでの本発明の試験抗体は、蛍光シグナ
ルの減少をもたらさず、このことは本発明の試験抗体がプラスミン活性に影響を及ぼさな
いことを示す(図14.2-14.7)。
実施例
実施例1:BioInvent抗体ライブラリーからの抗体TPP-12387の生成
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー(BioInvent n-CoDe
R Fabラムダライブラリー)を使用して、ヒト由来およびウサギ由来のヒトα2-ア
ンチプラスミンである可溶性ビオチン化抗原に対する選択によってヒトモノクローナル抗
体を単離した。
実施例1:BioInvent抗体ライブラリーからの抗体TPP-12387の生成
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー(BioInvent n-CoDe
R Fabラムダライブラリー)を使用して、ヒト由来およびウサギ由来のヒトα2-ア
ンチプラスミンである可溶性ビオチン化抗原に対する選択によってヒトモノクローナル抗
体を単離した。
ヒトα2-アンチプラスミンを商業的供給源(抗体オンライン;カタログ番号ABIN
2544306)から使用したが、ウサギ抗原は組換え発現および精製によって自家生産
された。このために、ウサギα2-アンチプラスミンからのcDNAを標準発現ベクター
にクローニングし、HEK293細胞を、製造説明書に従って293fectinトラン
スフェクション試薬(Invitrogen、カタログ番号12347-019)を用い
てこの構築物で一過性にトランスフェクトした。発現したウサギα2-アンチプラスミン
を、Ni-IMACおよびサイズ排除クロマトグラフィーを介して細胞培養上清から精製
した。
2544306)から使用したが、ウサギ抗原は組換え発現および精製によって自家生産
された。このために、ウサギα2-アンチプラスミンからのcDNAを標準発現ベクター
にクローニングし、HEK293細胞を、製造説明書に従って293fectinトラン
スフェクション試薬(Invitrogen、カタログ番号12347-019)を用い
てこの構築物で一過性にトランスフェクトした。発現したウサギα2-アンチプラスミン
を、Ni-IMACおよびサイズ排除クロマトグラフィーを介して細胞培養上清から精製
した。
Sulfo-NHS-LC-Biotinキット(Thermo Scientifi
c、カタログ番号A39257)を用いて抗原をビオチン化した。遊離ビオチンを、適切
な緩衝液に対する透析によって反応物から除去した。
c、カタログ番号A39257)を用いて抗原をビオチン化した。遊離ビオチンを、適切
な緩衝液に対する透析によって反応物から除去した。
パンニング手順のために、以下のプロトコールを適用した:ストレプトアビジン結合D
ynabeads M-280(Invitrogen、カタログ番号11205D)を
、それぞれビオチン化抗原(1チューブ)およびビオチン化オフターゲット(3チューブ
)で室温(RT)で1時間被覆した。ダイナビーズを洗浄し、その後、エンドオーバーエ
ンド回転を伴いRTで1時間ブロックした。オフターゲット結合剤の枯渇のために、ブロ
ッキングされたファージライブラリーを、ブロッキングされたオフターゲットロードダイ
ナビーズに添加し、エンドオーバーエンド回転を伴い室温で10分間インキュベートした
。この枯渇工程を2回繰り返した。枯渇したファージライブラリーを、ブロックされた標
的ロードダイナビーズに添加し、エンドオーバーエンド回転を伴いRTで60分間インキ
ュベートした。ストリンジェントな洗浄後(3xブロッキング緩衝液中、9x0.05%
Tween-20を伴うPBS中(150mM NaCl;8mM Na2HPO4;
1.5mM KH2PO4;pH=7.4~7.6に調整))、コーティングされた標的
に特異的に結合するFab-ファージを有するダイナビーズを直接使用して、大腸菌(E
scherichia coli)株HB101を感染させた。続いて、M13KO7ヘ
ルパーファージ(Invitrogen、カタログ番号18311019)を用いて、フ
ァージを大腸菌株HB101中で増幅する。以下の選択ラウンドにおいて、標的濃度を低
下させて、高親和性結合剤の選択圧を増大させた。
ynabeads M-280(Invitrogen、カタログ番号11205D)を
、それぞれビオチン化抗原(1チューブ)およびビオチン化オフターゲット(3チューブ
)で室温(RT)で1時間被覆した。ダイナビーズを洗浄し、その後、エンドオーバーエ
ンド回転を伴いRTで1時間ブロックした。オフターゲット結合剤の枯渇のために、ブロ
ッキングされたファージライブラリーを、ブロッキングされたオフターゲットロードダイ
ナビーズに添加し、エンドオーバーエンド回転を伴い室温で10分間インキュベートした
。この枯渇工程を2回繰り返した。枯渇したファージライブラリーを、ブロックされた標
的ロードダイナビーズに添加し、エンドオーバーエンド回転を伴いRTで60分間インキ
ュベートした。ストリンジェントな洗浄後(3xブロッキング緩衝液中、9x0.05%
Tween-20を伴うPBS中(150mM NaCl;8mM Na2HPO4;
1.5mM KH2PO4;pH=7.4~7.6に調整))、コーティングされた標的
に特異的に結合するFab-ファージを有するダイナビーズを直接使用して、大腸菌(E
scherichia coli)株HB101を感染させた。続いて、M13KO7ヘ
ルパーファージ(Invitrogen、カタログ番号18311019)を用いて、フ
ァージを大腸菌株HB101中で増幅する。以下の選択ラウンドにおいて、標的濃度を低
下させて、高親和性結合剤の選択圧を増大させた。
このライブラリのパンニング中に、4つの異なる選択戦略が実施された:
戦略Iは、両方ともN末端を欠く、全長ヒトα2-アンチプラスミンおよびウサギα2-
アンチプラスミンに対してそれぞれ結合活性を示す抗体を同定するように設計された。ビ
オチン化された無関係なタンパク質を使用して、枯渇工程を含めた。
戦略Iは、両方ともN末端を欠く、全長ヒトα2-アンチプラスミンおよびウサギα2-
アンチプラスミンに対してそれぞれ結合活性を示す抗体を同定するように設計された。ビ
オチン化された無関係なタンパク質を使用して、枯渇工程を含めた。
戦略IIは、α2-アンチプラスミンのプラスミン結合部位を認識する抗体を目的とした
。戦略Iと同様に、成功の確率を高めるために、抗原としてプラスミン結合部位を欠くα
2-アンチプラスミン変異体を用いて、枯渇工程を含めた。
。戦略Iと同様に、成功の確率を高めるために、抗原としてプラスミン結合部位を欠くα
2-アンチプラスミン変異体を用いて、枯渇工程を含めた。
2つのさらなる戦略(戦略IIIおよびIV)において、α2-アンチプラスミンのいわ
ゆる反応中心ループ(RCL)を表すビオチン化直鎖およびビオチン化環状ペプチドをそ
れぞれ使用した。どちらの場合も、無関係なビオチン化タンパク質を枯渇工程に使用した
。
ゆる反応中心ループ(RCL)を表すビオチン化直鎖およびビオチン化環状ペプチドをそ
れぞれ使用した。どちらの場合も、無関係なビオチン化タンパク質を枯渇工程に使用した
。
パンニング戦略の詳細な概要を図1に示す。
実施例2:組換えDNA構築物ならびにFabおよび完全長抗体の発現、精製および定
量化
HEK293-6E細胞における産生
一過的にトランスフェクトされたHEK293-6E細胞を使用する哺乳動物細胞培養
によって、Fabならびに全長抗体を産生した。重鎖および軽鎖を適切な発現ベクター系
にクローニングした。細胞を3~4日間インキュベートした。上清を回収し、Fabおよ
び抗体を記載のように精製した。
量化
HEK293-6E細胞における産生
一過的にトランスフェクトされたHEK293-6E細胞を使用する哺乳動物細胞培養
によって、Fabならびに全長抗体を産生した。重鎖および軽鎖を適切な発現ベクター系
にクローニングした。細胞を3~4日間インキュベートした。上清を回収し、Fabおよ
び抗体を記載のように精製した。
Fabおよび抗体の精製および定量
抗体を、プロテインAクロマトグラフィー(ThermoFischer、カタログ番
号A26455)により、製造業者の説明書に従って精製した。
抗体を、プロテインAクロマトグラフィー(ThermoFischer、カタログ番
号A26455)により、製造業者の説明書に従って精製した。
標準的なタンパク質精製法を使用することによって、抗体、抗原結合部分、またはそれ
らの誘導体を培地から回収した。
らの誘導体を培地から回収した。
Fabを、無菌濾過された哺乳動物細胞上清から、3段階の研究下流プロセスを用いて
精製した。捕捉工程として、PBS pH7.4中で平衡化した「Capture Se
lect IgG-CH1」アフィニティーカラム(ThermoFisher、カタロ
グ番号494320005)を使用した。洗浄緩衝液(PBS pH7.4)で、10カ
ラム容量で洗浄した後、グリシン0.1M pH3.0(6CV)を用いてFabの溶出
を達成した。Tris Baseで中和すると、サイズ排除クロマトグラフィー(GE
Healthcare、Superdex 200、カタログ番号GE29321905
)を用いて、DPBS pH7.4への緩衝液交換および凝集物除去を行った。分析用サ
イズ排除クロマトグラフィーは、得られたバッチ中に二量体が存在しないことを実証した
。
精製した。捕捉工程として、PBS pH7.4中で平衡化した「Capture Se
lect IgG-CH1」アフィニティーカラム(ThermoFisher、カタロ
グ番号494320005)を使用した。洗浄緩衝液(PBS pH7.4)で、10カ
ラム容量で洗浄した後、グリシン0.1M pH3.0(6CV)を用いてFabの溶出
を達成した。Tris Baseで中和すると、サイズ排除クロマトグラフィー(GE
Healthcare、Superdex 200、カタログ番号GE29321905
)を用いて、DPBS pH7.4への緩衝液交換および凝集物除去を行った。分析用サ
イズ排除クロマトグラフィーは、得られたバッチ中に二量体が存在しないことを実証した
。
完全長抗体の定量のために、抗ヒトIgG Fc特異的抗体(Sigma、カタログ番
号I2136)を、4℃で384ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)に一晩、
5μg/mlの濃度でコーティングした。目的のIgGを含有する溶液を、異なる濃度で
添加して、室温で1時間インキュベートした。検出のために、検出抗体A0170(Si
gma)および基質としてAmplex Redを添加した。蛍光は、SpectraF
luorplusリーダー(Tecan)を用いて535/590nmでモニターした。
号I2136)を、4℃で384ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)に一晩、
5μg/mlの濃度でコーティングした。目的のIgGを含有する溶液を、異なる濃度で
添加して、室温で1時間インキュベートした。検出のために、検出抗体A0170(Si
gma)および基質としてAmplex Redを添加した。蛍光は、SpectraF
luorplusリーダー(Tecan)を用いて535/590nmでモニターした。
Fabのような抗体変異体の定量のために、Human Kappa ELISA K
it(Abcam、カタログ番号ab157709)を製造業者の説明書に従って使用し
た。
it(Abcam、カタログ番号ab157709)を製造業者の説明書に従って使用し
た。
実施例3:抗α2-アンチプラスミン結合活性を試験するための酵素結合免疫吸着アッ
セイ(ELISA)
標準ELISAフォーマットを用いて、ヒトおよびウサギα-2-アンチプラスミンに
対する本発明のFabの結合親和性をそれぞれ分析した。抗原を黒色384ウェルMax
isorpマイクロタイタープレート(Nunc;カタログ番号460518)にコーテ
ィングし、1Xコーティング緩衝液(Candor Bioscience;カタログ番
号121125)中で1μg/mlの濃度に希釈した。プレートを4℃で一晩インキュベ
ートした。一晩インキュベートした後、PBS+0,05% Tween20を用いてプ
レートを2X50μl/ウェルで洗浄した。その後、50μl/ウェルのブロッキング緩
衝液(Smart Block;Candor Bioscience;カタログ番号1
13500)を加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。その後、プレートを
、50μl/ウェルのPBS+0,05% Tween20緩衝液を用いて3X洗浄した
。本発明のFabを、30μl/ウェルの最終容量で異なる濃度で添加した。プレートを
室温で1時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、プレートを、50
μl/ウェルのPBS+0,05% Tween20緩衝液を用いて3X洗浄した。結合
したFabおよび完全長抗体の検出のために、抗ヒトラムダ軽鎖(結合および遊離)-ペ
ルオキダーゼ抗体(シグマ;カタログ番号A5175)を、10%ブロッキング緩衝液中
で1:10.000の係数で希釈した。30μl/ウェルのこの希釈検出抗体を加え、プ
レートを室温で1時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、プレート
を、50μl/ウェルのPBS+0,05% Tween20緩衝液を用いて3X洗浄し
た。基質として、30μl/ウェルの1:1000希釈Amplexレッド(Invit
rogen;カタログ番号12222;DMSO中10mMの原液)および1:10.0
00の過酸化水素(Merck;カタログ番号107209;30%原液)の混合物を加
え、プレートを暗所で20分間インキュベートした。
セイ(ELISA)
標準ELISAフォーマットを用いて、ヒトおよびウサギα-2-アンチプラスミンに
対する本発明のFabの結合親和性をそれぞれ分析した。抗原を黒色384ウェルMax
isorpマイクロタイタープレート(Nunc;カタログ番号460518)にコーテ
ィングし、1Xコーティング緩衝液(Candor Bioscience;カタログ番
号121125)中で1μg/mlの濃度に希釈した。プレートを4℃で一晩インキュベ
ートした。一晩インキュベートした後、PBS+0,05% Tween20を用いてプ
レートを2X50μl/ウェルで洗浄した。その後、50μl/ウェルのブロッキング緩
衝液(Smart Block;Candor Bioscience;カタログ番号1
13500)を加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。その後、プレートを
、50μl/ウェルのPBS+0,05% Tween20緩衝液を用いて3X洗浄した
。本発明のFabを、30μl/ウェルの最終容量で異なる濃度で添加した。プレートを
室温で1時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、プレートを、50
μl/ウェルのPBS+0,05% Tween20緩衝液を用いて3X洗浄した。結合
したFabおよび完全長抗体の検出のために、抗ヒトラムダ軽鎖(結合および遊離)-ペ
ルオキダーゼ抗体(シグマ;カタログ番号A5175)を、10%ブロッキング緩衝液中
で1:10.000の係数で希釈した。30μl/ウェルのこの希釈検出抗体を加え、プ
レートを室温で1時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、プレート
を、50μl/ウェルのPBS+0,05% Tween20緩衝液を用いて3X洗浄し
た。基質として、30μl/ウェルの1:1000希釈Amplexレッド(Invit
rogen;カタログ番号12222;DMSO中10mMの原液)および1:10.0
00の過酸化水素(Merck;カタログ番号107209;30%原液)の混合物を加
え、プレートを暗所で20分間インキュベートした。
測定には、Infinite f500リーダー(Tecan)を使用した。測定モー
ド:蛍光;トップリーディング;Ex 535nm;Em 590nm。
ド:蛍光;トップリーディング;Ex 535nm;Em 590nm。
スクリーニングされた2×1010のFab変異体の総数から、2944の変異体を、
それぞれヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンの結合について試験される潜在的な候
補として選択した。
それぞれヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンの結合について試験される潜在的な候
補として選択した。
実施例2に記載されるように、HEK293細胞を一過性にトランスフェクトした。得
られた上清を、ヒトおよびウサギ抗原に結合するそれらの能力を試験するために、さらな
る精製または希釈なしで直接使用した。これらの2944個のFabから、異なる配列を
示す88個の候補が、2つの抗原に対して要求される種間結合活性を示した。
られた上清を、ヒトおよびウサギ抗原に結合するそれらの能力を試験するために、さらな
る精製または希釈なしで直接使用した。これらの2944個のFabから、異なる配列を
示す88個の候補が、2つの抗原に対して要求される種間結合活性を示した。
コンホメーションについて、本発明の88の変異体を、それらの結合能力について再試
験した。このために、トランスフェクトされた細胞の上清を、リン酸緩衝生理食塩水(P
BS)中で、1:1,5、1:4,5、1:13,5、1:40,5、1:121,5、
1:364,5、1:1093,5の係数で希釈した。これらの希釈試料を、ヒトおよび
ウサギα-2-アンチプラスミンの結合について試験した。
験した。このために、トランスフェクトされた細胞の上清を、リン酸緩衝生理食塩水(P
BS)中で、1:1,5、1:4,5、1:13,5、1:40,5、1:121,5、
1:364,5、1:1093,5の係数で希釈した。これらの希釈試料を、ヒトおよび
ウサギα-2-アンチプラスミンの結合について試験した。
1つの用量応答曲線を、四重反復で実施された2~3回の独立した実験の例として図4
に示す。3つの独立した実験について、ヒトα2-アンチプラスミンに対するTPP-1
2387の結合活性についてのEC50値は、以下の通りであった:それぞれ、1.2E
-07M(図4に示す通り)、1.0E-07M、および1.3E-07M。ウサギα2
-アンチプラスミンに対する結合活性は、それぞれ、6.0E-09M(図4に示す通り
)、6.07E-09Mおよび6.2E-09Mであった。
に示す。3つの独立した実験について、ヒトα2-アンチプラスミンに対するTPP-1
2387の結合活性についてのEC50値は、以下の通りであった:それぞれ、1.2E
-07M(図4に示す通り)、1.0E-07M、および1.3E-07M。ウサギα2
-アンチプラスミンに対する結合活性は、それぞれ、6.0E-09M(図4に示す通り
)、6.07E-09Mおよび6.2E-09Mであった。
実施例4:α2-アンチプラスミン機能遮断活性の選択された候補を試験するための生
化学アッセイ
抗α2アンチプラスミン分子の機能的遮断活性を試験するために、Fabsまたは完全
長抗体を、1nMのヒトα2-アンチプラスミン(抗体オンライン;カタログ番号ABI
N2544306)、または自社生産のウサギα2-アンチプラスミンまたは自社生産の
カニクイザルα2-アンチプラスミンと、50mM TRIS-HCl(GIBCO;カ
タログ番号15567-027(50mM))、100mM NaCl(Sigma;カ
タログ番号S7653)、5mM CaCl2(Sigma;カタログ番号21115-
100ML)、0,1%アルブミン0,1%(Sigma;BSA、カタログ番号A45
03-100g)からなる緩衝液中で、pH7,4で、37℃で20分間予めインキュベ
ートした。
化学アッセイ
抗α2アンチプラスミン分子の機能的遮断活性を試験するために、Fabsまたは完全
長抗体を、1nMのヒトα2-アンチプラスミン(抗体オンライン;カタログ番号ABI
N2544306)、または自社生産のウサギα2-アンチプラスミンまたは自社生産の
カニクイザルα2-アンチプラスミンと、50mM TRIS-HCl(GIBCO;カ
タログ番号15567-027(50mM))、100mM NaCl(Sigma;カ
タログ番号S7653)、5mM CaCl2(Sigma;カタログ番号21115-
100ML)、0,1%アルブミン0,1%(Sigma;BSA、カタログ番号A45
03-100g)からなる緩衝液中で、pH7,4で、37℃で20分間予めインキュベ
ートした。
その後、最終濃度400pMのヒトプラスミン(Haematologic Tech
nologies INC;カタログ番号HCPM0140)および最終濃度50μmの
蛍光基質I-1275(Bachem;MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC
トリフルオロアセテート塩;カタログ番号I-1275(ストック:DMSO中10mM
))を加え、反応物を37℃で1時間インキュベートした。この反応を384ウェルマイ
クロタイタープレート(Nunc;カタログ番号262260)中で実施した。蛍光発生
シグナルを、以下の条件で測定した:モード蛍光トップリーディング、Ex 360nM
、Em 465nm、Ex帯域幅5nm、Em帯域幅5nm。
nologies INC;カタログ番号HCPM0140)および最終濃度50μmの
蛍光基質I-1275(Bachem;MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC
トリフルオロアセテート塩;カタログ番号I-1275(ストック:DMSO中10mM
))を加え、反応物を37℃で1時間インキュベートした。この反応を384ウェルマイ
クロタイタープレート(Nunc;カタログ番号262260)中で実施した。蛍光発生
シグナルを、以下の条件で測定した:モード蛍光トップリーディング、Ex 360nM
、Em 465nm、Ex帯域幅5nm、Em帯域幅5nm。
Fabおよび/または完全長抗体機能遮断活性の用量依存性を決定するために、これら
の分子の濃度を上記のように測定した。定義された濃度で開始して、続いて1:3または
1:4希釈工程が続く異なる濃度のFabおよび/または完全長抗体を、それぞれ1nM
のヒト、カニクイザル、またはウサギα2-アンチプラスミンとプレインキュベートした
。
の分子の濃度を上記のように測定した。定義された濃度で開始して、続いて1:3または
1:4希釈工程が続く異なる濃度のFabおよび/または完全長抗体を、それぞれ1nM
のヒト、カニクイザル、またはウサギα2-アンチプラスミンとプレインキュベートした
。
88個のFab候補を、ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンでの単一点測定にお
ける機能遮断活性について試験し、これは、一過的にトランスフェクトされたHEK29
3細胞から得られた上清から、最大可能体積を活性アッセイに加えたことを意味する。こ
れにより、約30%のα2-アンチプラスミン活性の少なくとも低下を示す17個のFa
bが同定された。
ける機能遮断活性について試験し、これは、一過的にトランスフェクトされたHEK29
3細胞から得られた上清から、最大可能体積を活性アッセイに加えたことを意味する。こ
れにより、約30%のα2-アンチプラスミン活性の少なくとも低下を示す17個のFa
bが同定された。
次の工程において、これらの17個のFabを完全長IgG1抗体フォーマットに再フ
ォーマットした。これらのうち12種は、妥当な発現率を示した。
ォーマットした。これらのうち12種は、妥当な発現率を示した。
実施例3に記載の方法に従って、これらの12種の抗体を、ヒトおよびウサギα2-ア
ンチプラスミンに用量依存的に結合する能力について試験した。生成されたデータは、G
raphPadPrismソフトウェアを用いて分析した。抗体の結合活性をEC50値
として計算した。四重反復で2~3回の独立した実験を実施した。
ンチプラスミンに用量依存的に結合する能力について試験した。生成されたデータは、G
raphPadPrismソフトウェアを用いて分析した。抗体の結合活性をEC50値
として計算した。四重反復で2~3回の独立した実験を実施した。
次の工程において、これらの12個の完全長抗体は、ヒトおよびウサギα2-アンチプ
ラスミンに対する活性を遮断することを用量依存的に再試験した。
ラスミンに対する活性を遮断することを用量依存的に再試験した。
ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミン抗体に対するその結合活性および機能遮断活
性に基づいて、TPP-12387をさらなる試験および最適化のために選択した。図2
は、実施例3において決定された、ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンに対するT
PP-12387に対応するFabフラグメントの結合活性を示す。図3は、実施例4に
おいて決定された、ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンに対するTPP-1238
7に対応するFabフラグメントの機能遮断活性を示す。図4は、実施例3に記載される
結合アッセイにおいて決定される、ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンに対するI
gG1抗体TPP-12387の結合活性を示す。図5は、実施例4に記載の機能遮断ア
ッセイにおいて決定された、ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンに対するIgG1
抗体TPP-12387の機能遮断活性を示す。ヒトおよびウサギアルファ2-アンチプ
ラスミンに対するTPP-12387の中和活性についての1つの用量応答曲線を、四重
反復で実施した2~3回の独立した実験の例として図5に示す。3つの独立した実験につ
いて、ヒトα2-アンチプラスミンに対するTPP-12387の機能遮断活性のIC5
0値は、以下の通りであった:それぞれ、1.7E-07M(図5に示す通り)、1.8
E-07M、および1.8E-07M。ウサギα2-アンチプラスミンに対する結合活性
は、1.4E-08M(図4に示す)、1.3E-08Mおよび1.5E-08Mであっ
た。
性に基づいて、TPP-12387をさらなる試験および最適化のために選択した。図2
は、実施例3において決定された、ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンに対するT
PP-12387に対応するFabフラグメントの結合活性を示す。図3は、実施例4に
おいて決定された、ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンに対するTPP-1238
7に対応するFabフラグメントの機能遮断活性を示す。図4は、実施例3に記載される
結合アッセイにおいて決定される、ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンに対するI
gG1抗体TPP-12387の結合活性を示す。図5は、実施例4に記載の機能遮断ア
ッセイにおいて決定された、ヒトおよびウサギα2-アンチプラスミンに対するIgG1
抗体TPP-12387の機能遮断活性を示す。ヒトおよびウサギアルファ2-アンチプ
ラスミンに対するTPP-12387の中和活性についての1つの用量応答曲線を、四重
反復で実施した2~3回の独立した実験の例として図5に示す。3つの独立した実験につ
いて、ヒトα2-アンチプラスミンに対するTPP-12387の機能遮断活性のIC5
0値は、以下の通りであった:それぞれ、1.7E-07M(図5に示す通り)、1.8
E-07M、および1.8E-07M。ウサギα2-アンチプラスミンに対する結合活性
は、1.4E-08M(図4に示す)、1.3E-08Mおよび1.5E-08Mであっ
た。
次の工程において、TPP-12387を、カニクイザルα2-アンチプラスミンに対
するその結合活性について、ならびにその機能遮断活性について試験した。カニクイザル
α2-アンチプラスミンを、ウサギα2-アンチプラスミンと同じ方法で作製した。カニ
クイザルα2-アンチプラスミンに対するTPP-12387の結合活性およびその機能
阻止活性の値を図6に示す。カニクイザルα2-アンチプラスミンに対する抗体TPP-
12387の結合活性および機能遮断活性についての1つの用量応答曲線を、四重反復で
実施した2~3回の独立した実験の例として図6に示す。これにより、カニクイザルα2
-アンチプラスミンに対するTPP-12387の結合活性についてのEC50値は、第
2の独立した実験において9.0E-08M(図6.1に示す)および9.0E-08M
であり、カニクイザルα2-アンチプラスミンの機能遮断活性についてのIC50は、第
2の実験において1.6E-07M(図6.2に示す)および1.6E-07Mであった
。
するその結合活性について、ならびにその機能遮断活性について試験した。カニクイザル
α2-アンチプラスミンを、ウサギα2-アンチプラスミンと同じ方法で作製した。カニ
クイザルα2-アンチプラスミンに対するTPP-12387の結合活性およびその機能
阻止活性の値を図6に示す。カニクイザルα2-アンチプラスミンに対する抗体TPP-
12387の結合活性および機能遮断活性についての1つの用量応答曲線を、四重反復で
実施した2~3回の独立した実験の例として図6に示す。これにより、カニクイザルα2
-アンチプラスミンに対するTPP-12387の結合活性についてのEC50値は、第
2の独立した実験において9.0E-08M(図6.1に示す)および9.0E-08M
であり、カニクイザルα2-アンチプラスミンの機能遮断活性についてのIC50は、第
2の実験において1.6E-07M(図6.2に示す)および1.6E-07Mであった
。
実施例5:リード抗体TPP-12387の親和性最適化
抗体TPP-12387を、その親和性を最適化し、その機能効率を高めることを目的
とするリード最適化手順に供した。
抗体TPP-12387を、その親和性を最適化し、その機能効率を高めることを目的
とするリード最適化手順に供した。
親和性成熟は、最初の単一突然変異収集ラウンドと、それに続く最も親和性および効力
を増加させるアミノ酸交換の組換えと、それに続く生殖細胞系列化および配列最適化キャ
ンペーンによって行った。NNK(N=AまたはGまたはCまたはT、K=GまたはT)
を集める突然変異については、以下の個々のアミノ酸位置でのランダム化を、残基AAW
DDSLSGWV(CDR-L3を含む残基91~101)およびAREYYDSSGY
YHLDY(CDR-H3残基98~110およびそのN末端部位でCDRに隣接する2
つの追加のアミノ酸を含む残基96~110)のNNKコドン多様化を含む合成オリゴヌ
クレオチドを使用する部位特異的突然変異誘発によって生成した。
を増加させるアミノ酸交換の組換えと、それに続く生殖細胞系列化および配列最適化キャ
ンペーンによって行った。NNK(N=AまたはGまたはCまたはT、K=GまたはT)
を集める突然変異については、以下の個々のアミノ酸位置でのランダム化を、残基AAW
DDSLSGWV(CDR-L3を含む残基91~101)およびAREYYDSSGY
YHLDY(CDR-H3残基98~110およびそのN末端部位でCDRに隣接する2
つの追加のアミノ酸を含む残基96~110)のNNKコドン多様化を含む合成オリゴヌ
クレオチドを使用する部位特異的突然変異誘発によって生成した。
得られた単一のNNKライブラリーを配列決定し、CDR-L3および156CDR-
H3に対するTPP-12387の139個のアミノ酸交換変異体を同定した(表3.1
および3.2を参照されたい)。
H3に対するTPP-12387の139個のアミノ酸交換変異体を同定した(表3.1
および3.2を参照されたい)。
全ての変異体を、哺乳動物細胞株HEK293の一過性トランスフェクションによって
発現させ、得られた発現上清を、ヒトα2-アンチプラスミンに対するそれらの結合能力
ならびにそれらの機能遮断活性について直接試験した。
発現させ、得られた発現上清を、ヒトα2-アンチプラスミンに対するそれらの結合能力
ならびにそれらの機能遮断活性について直接試験した。
抗体TPP-12387よりも高い結合および機能遮断活性を示す変異体をHEK29
3細胞において1回以上発現させ、実施例2に記載のように抗体を精製および定量し、親
変異体TPP-12387と直接比較して、ヒトα2-アンチプラスミンに対するそれら
の結合能力およびそれらの機能遮断能力について再試験した。
3細胞において1回以上発現させ、実施例2に記載のように抗体を精製および定量し、親
変異体TPP-12387と直接比較して、ヒトα2-アンチプラスミンに対するそれら
の結合能力およびそれらの機能遮断能力について再試験した。
これにより、CDR-L3内の5つの交換およびCDR-H3内の7つの交換が、親抗
体TPP-12387と比較して改善された活性で同定された。改善された親和性および
機能的効率を有するこれらの11個の単一置換変異体を、TPP-12387に基づく1
つの組換えライブラリー中で組換えた。ここで、選択された突然変異または対応する野生
型アミノ酸を選択された各位置に導入するためにオリゴヌクレオチドを作製した。重複伸
長PCRの連続ラウンドを用いてライブラリー構築を行った。最終PCR産物を哺乳動物
IgG1発現ベクターに連結し、変異体を配列決定した。
体TPP-12387と比較して改善された活性で同定された。改善された親和性および
機能的効率を有するこれらの11個の単一置換変異体を、TPP-12387に基づく1
つの組換えライブラリー中で組換えた。ここで、選択された突然変異または対応する野生
型アミノ酸を選択された各位置に導入するためにオリゴヌクレオチドを作製した。重複伸
長PCRの連続ラウンドを用いてライブラリー構築を行った。最終PCR産物を哺乳動物
IgG1発現ベクターに連結し、変異体を配列決定した。
この組換えライブラリーにおいて生成された抗体は、TPP-14290、TPP-1
4291、TPP-14292、TPP-14293、TPP-14294、TPP-1
4295、TPP-14296、TPP-14297、TPP-14298、TPP-1
4299、TPP-14300、TPP-14301、TPP-14302、TPP-1
4303、TPP-14304、TPP-14305、TPP-14306、TPP-1
4307、TPP-14308、TPP-14309、TPP-14310、TPP-1
4311、TPP-14312、TPP-14313、TPP-14314、TPP-1
4315、TPP-14316、TPP-14317、TPP-14318、TPP-1
4319、TPP-14320、TPP-14322、TPP-14323、TPP-1
4324であった。
4291、TPP-14292、TPP-14293、TPP-14294、TPP-1
4295、TPP-14296、TPP-14297、TPP-14298、TPP-1
4299、TPP-14300、TPP-14301、TPP-14302、TPP-1
4303、TPP-14304、TPP-14305、TPP-14306、TPP-1
4307、TPP-14308、TPP-14309、TPP-14310、TPP-1
4311、TPP-14312、TPP-14313、TPP-14314、TPP-1
4315、TPP-14316、TPP-14317、TPP-14318、TPP-1
4319、TPP-14320、TPP-14322、TPP-14323、TPP-1
4324であった。
実施例2に記載されるように、抗体を上清から精製し、それらの濃度を決定した。次に
、抗体を、ヒトα2-アンチプラスミンに結合する能力およびヒトα2-アンチプラスミ
ンを遮断する能力について試験した(実施例3および4に記載)。
、抗体を、ヒトα2-アンチプラスミンに結合する能力およびヒトα2-アンチプラスミ
ンを遮断する能力について試験した(実施例3および4に記載)。
抗体TPP-14293、TPP-14298、TPP-14303、TPP-143
05、TPP-14308、TPP-14313、TPP-14314、TPP-143
18、TPP-14323は、ヒトα2-アンチプラスミンの結合およびヒトα2-アン
チプラスミンの活性の遮断に関して最も強力であると同定されたTPP-12387の最
も改善された組換え変異体を表す。これらの抗体の結合および活性データを図7に示す。
05、TPP-14308、TPP-14313、TPP-14314、TPP-143
18、TPP-14323は、ヒトα2-アンチプラスミンの結合およびヒトα2-アン
チプラスミンの活性の遮断に関して最も強力であると同定されたTPP-12387の最
も改善された組換え変異体を表す。これらの抗体の結合および活性データを図7に示す。
実施例3および実施例4に記載の方法によれば、TPP-14323、TPP-143
18、TPP-14314、TPP-14313、TPP-14308、TPP-143
05、TPP-14303、TPP-14298、およびTPP-14293を、用量依
存的にヒトα2-アンチプラスミンに結合し、その活性を遮断する能力について試験した
。各抗体について、図7.1~図7.18に例として、四重反復で実施した2~3回の独
立した実験から1回の用量反応曲線を示す。(表3.3参照)
表3.3:3つの独立した実験の結合活性EC[M]および機能遮断活性IC50[M
]
*図7に示す
実施例6:配列に基づく免疫原性のリスク低減
配列に基づく免疫原性のリスクを低減するために、さらなる最適化のために抗体TPP
-14308を選択した。このために、最も近い生殖系列配列とは異なるアミノ酸を交換
し、対応するcDNAを合成し、HEK293細胞を一過性にトランスフェクトし、本発
明の発現抗体を定量したが、精製せず、ヒトα2-アンチプラスミンに結合し、ヒトα2
-アンチプラスミンの機能を遮断する能力について試験した。
18、TPP-14314、TPP-14313、TPP-14308、TPP-143
05、TPP-14303、TPP-14298、およびTPP-14293を、用量依
存的にヒトα2-アンチプラスミンに結合し、その活性を遮断する能力について試験した
。各抗体について、図7.1~図7.18に例として、四重反復で実施した2~3回の独
立した実験から1回の用量反応曲線を示す。(表3.3参照)
表3.3:3つの独立した実験の結合活性EC[M]および機能遮断活性IC50[M
]
実施例6:配列に基づく免疫原性のリスク低減
配列に基づく免疫原性のリスクを低減するために、さらなる最適化のために抗体TPP
-14308を選択した。このために、最も近い生殖系列配列とは異なるアミノ酸を交換
し、対応するcDNAを合成し、HEK293細胞を一過性にトランスフェクトし、本発
明の発現抗体を定量したが、精製せず、ヒトα2-アンチプラスミンに結合し、ヒトα2
-アンチプラスミンの機能を遮断する能力について試験した。
このアプローチの結果は47の抗体であった。
ほとんどの生殖系列交換は、両方の機能性においてわずかな改善しか示さない。
フレームワーク配列内ならびにCDRH1およびCDRH2のアミノ酸のみが交換され
ているが、驚くべきことに、抗体TPP-14308と比較して、さらに高い結合活性お
よび/または改善された機能遮断活性を示す6つの変異体が同定された。
ているが、驚くべきことに、抗体TPP-14308と比較して、さらに高い結合活性お
よび/または改善された機能遮断活性を示す6つの変異体が同定された。
これらの変異体の結合および機能遮断活性の用量反応曲線を図8に示す。
次の工程において、最も活性な抗体TPP-17044をより多量に発現させ、精製し
、定量した。精製され定量化された抗体を、ヒト、カニクイザル、およびウサギα2-ア
ンチプラスミンの機能遮断活性について再試験した。結果を図9に示す。四重反復で実施
した2~3回の独立した実験から得られた用量反応曲線を一例として示す。ヒトα2-ア
ンチプラスミンに対するTPP-17044の機能遮断活性は、4.4E-10M(図9
.1に示す)であり、2回目の実験では5.4E-10M、3回目の実験では5E-10
Mであった。カニクイザルα2-アンチプラスミンの阻害について、値は、4.6E-1
0M(図9.2)、第2の実験については4.9E-10M、第3の実験については5.
1E-10Mであった。ウサギα2-アンチプラスミンは、2.7E-08M、2回目の
実験では3.6E-08M、3回目の実験では2.9E-08MのIC50値で、TPP
-17044によってその活性が遮断された(図9.3)。
、定量した。精製され定量化された抗体を、ヒト、カニクイザル、およびウサギα2-ア
ンチプラスミンの機能遮断活性について再試験した。結果を図9に示す。四重反復で実施
した2~3回の独立した実験から得られた用量反応曲線を一例として示す。ヒトα2-ア
ンチプラスミンに対するTPP-17044の機能遮断活性は、4.4E-10M(図9
.1に示す)であり、2回目の実験では5.4E-10M、3回目の実験では5E-10
Mであった。カニクイザルα2-アンチプラスミンの阻害について、値は、4.6E-1
0M(図9.2)、第2の実験については4.9E-10M、第3の実験については5.
1E-10Mであった。ウサギα2-アンチプラスミンは、2.7E-08M、2回目の
実験では3.6E-08M、3回目の実験では2.9E-08MのIC50値で、TPP
-17044によってその活性が遮断された(図9.3)。
最後に、免疫原性反応の理論的リスクをさらに最小限にするために、TPP-1704
4をヒトIgG4Fcバージョンのヒト抗体に再クローニングした。得られた抗体TPP
-17928を、ヒト、カニクイザル、およびウサギα2-アンチプラスミンに対するそ
の機能遮断活性について再度試験した。結果を図10に示す。四重反復で実施した2~3
回の独立した実験から得られた用量反応曲線を一例として示す。ヒトα2-アンチプラス
ミンに対するTPP-17928の機能遮断活性は、1.1E-10M(図10.1に示
す)であり、第2の実験では1.6E-10Mであった。カニクイザルα2-アンチプラ
スミンの阻害について、値は、2.6E-10M(図10.2)、2回目の実験では3.
4E-10M、3回目の実験では2.9E-10Mであった。ウサギα2-アンチプラス
ミンは、TPP-17928によってその活性が1.5E-08M(図10.3)、第2
の実験の1.9E-10M、第3の実験の1.6E-10MのIC50値で遮断された。
4をヒトIgG4Fcバージョンのヒト抗体に再クローニングした。得られた抗体TPP
-17928を、ヒト、カニクイザル、およびウサギα2-アンチプラスミンに対するそ
の機能遮断活性について再度試験した。結果を図10に示す。四重反復で実施した2~3
回の独立した実験から得られた用量反応曲線を一例として示す。ヒトα2-アンチプラス
ミンに対するTPP-17928の機能遮断活性は、1.1E-10M(図10.1に示
す)であり、第2の実験では1.6E-10Mであった。カニクイザルα2-アンチプラ
スミンの阻害について、値は、2.6E-10M(図10.2)、2回目の実験では3.
4E-10M、3回目の実験では2.9E-10Mであった。ウサギα2-アンチプラス
ミンは、TPP-17928によってその活性が1.5E-08M(図10.3)、第2
の実験の1.9E-10M、第3の実験の1.6E-10MのIC50値で遮断された。
実施例7:インビトロ凝血溶解
過去10日間投薬されていない健常被験体から静脈穿刺によりヒト血を採取した(倫理
委員会「Aerztekammer Nordrhein」、#2017029によって
承認された手続き)。血液を、1/10体積の3.8%クエン酸三ナトリウムを含有する
プラスチックチューブに採取した。血小板不良血漿(PPP)は、2500gで、10分
間4℃で直ちに遠心分離し、-20℃で保存した。
過去10日間投薬されていない健常被験体から静脈穿刺によりヒト血を採取した(倫理
委員会「Aerztekammer Nordrhein」、#2017029によって
承認された手続き)。血液を、1/10体積の3.8%クエン酸三ナトリウムを含有する
プラスチックチューブに採取した。血小板不良血漿(PPP)は、2500gで、10分
間4℃で直ちに遠心分離し、-20℃で保存した。
全ての実験について、少なくともn=3の独立したドナーからの血漿を使用した。血餅
溶解アッセイは以下のように実施した。凍結血漿を解凍し(37℃で30分間)、96ウ
ェルプレート中で規定濃度の試験化合物[0.015μM~1μMの間で変化する]また
は対照としてのみ溶媒と混合した。第2の96ウェルプレート上で、CaCl2(Sig
ma;カタログ番号21115~100ML)[最終濃度:12.5mM]を凝血塊誘導
剤として、低用量tPA(Actilyse(登録商標)、Boehringer In
gelheim)[最終濃度0.3μg/ml]を溶解開始剤として調製した。試験化合
物を血漿中で短時間インキュベートした後(37℃で5分間)、混合物を第2のプレート
に加え、マイクロプレートリーダー(Tecan infinite 200 Pro)
に直接移して、吸収(405nm、37℃、1/分)を経時的に3時間測定した。溶解時
間短縮の最終決定のために、tPA誘導溶解時間を100%(各ドナー血漿について個別
に)に設定し、溶解時間短縮を用量-応答曲線において各試験化合物について計算した。
溶解アッセイは以下のように実施した。凍結血漿を解凍し(37℃で30分間)、96ウ
ェルプレート中で規定濃度の試験化合物[0.015μM~1μMの間で変化する]また
は対照としてのみ溶媒と混合した。第2の96ウェルプレート上で、CaCl2(Sig
ma;カタログ番号21115~100ML)[最終濃度:12.5mM]を凝血塊誘導
剤として、低用量tPA(Actilyse(登録商標)、Boehringer In
gelheim)[最終濃度0.3μg/ml]を溶解開始剤として調製した。試験化合
物を血漿中で短時間インキュベートした後(37℃で5分間)、混合物を第2のプレート
に加え、マイクロプレートリーダー(Tecan infinite 200 Pro)
に直接移して、吸収(405nm、37℃、1/分)を経時的に3時間測定した。溶解時
間短縮の最終決定のために、tPA誘導溶解時間を100%(各ドナー血漿について個別
に)に設定し、溶解時間短縮を用量-応答曲線において各試験化合物について計算した。
ウサギ血漿の分析のために、雄のニュージーランド白色ウサギからの全血を静脈穿刺に
より得て、ヒト血漿について上記のように調製し、使用した。
より得て、ヒト血漿について上記のように調製し、使用した。
図11に示されるように、抗体TPP-17928は、ヒト血漿およびウサギ血漿にお
いて、それぞれ、用量依存的に、tPA誘導性凝血塊溶解時間を減少させる。ヒト血漿に
ついては、TPP-17928の機能遮断活性の値は、2.5E-07Mであり、ウサギ
血漿については2.3E-07Mであった。
いて、それぞれ、用量依存的に、tPA誘導性凝血塊溶解時間を減少させる。ヒト血漿に
ついては、TPP-17928の機能遮断活性の値は、2.5E-07Mであり、ウサギ
血漿については2.3E-07Mであった。
実施例8:ウサギにおける急性肺塞栓症におけるTPP-17928のインビボ試験
肺塞栓症における血餅溶解に対する本発明の抗α2-アンチプラスミン抗体の効果を研
究するために、ウサギインビボモデルを使用した。
肺塞栓症における血餅溶解に対する本発明の抗α2-アンチプラスミン抗体の効果を研
究するために、ウサギインビボモデルを使用した。
雄ニュージーランド白ウサギにキシラジン/ケタミン(5mg/kg+40mg/kg
、Sigma、カタログ番号X1126およびK2753)を筋肉内注射して麻酔した。
耳、頸部および左後肢(大腿三角の領域)を剃毛した。ウサギを麻酔状態に保つために、
キシラジン/ケタミン(80ml+800ml、60ml NaCl 0.9%)を5m
l/hで耳静脈から注入した。ウサギを加熱プレート上に置き、全実験時間37℃に保っ
た。左大腿静脈を化合物投与および採血のためにカニューレ挿入し、右頸静脈を血餅注入
のためにカニューレ挿入した。
、Sigma、カタログ番号X1126およびK2753)を筋肉内注射して麻酔した。
耳、頸部および左後肢(大腿三角の領域)を剃毛した。ウサギを麻酔状態に保つために、
キシラジン/ケタミン(80ml+800ml、60ml NaCl 0.9%)を5m
l/hで耳静脈から注入した。ウサギを加熱プレート上に置き、全実験時間37℃に保っ
た。左大腿静脈を化合物投与および採血のためにカニューレ挿入し、右頸静脈を血餅注入
のためにカニューレ挿入した。
蛍光標識血餅の調製のために、ウサギ血小板不良血漿を、ALEXA488蛍光標識ヒ
トフィブリノゲン(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号
F13191)と混合した。2.5μlのバトロキソビン[20U/ml](LOXO、
カタログ番号101-04)および2.5μlのCaCl2[0.1mM]を45μlの
血漿混合物に添加することによって凝固を開始した;最終血餅容量50μlは、75μg
の蛍光標識フィブリノゲンを含有する。
トフィブリノゲン(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号
F13191)と混合した。2.5μlのバトロキソビン[20U/ml](LOXO、
カタログ番号101-04)および2.5μlのCaCl2[0.1mM]を45μlの
血漿混合物に添加することによって凝固を開始した;最終血餅容量50μlは、75μg
の蛍光標識フィブリノゲンを含有する。
血餅の成熟(37℃で30分)後、2血餅/kg体重を麻酔ウサギの頸静脈に注射し、
肺における血餅の塞栓をもたらした。30分後に、生理食塩水、抗体TPP-17928
、tPA、または抗体TPP-17928とtPAの組み合わせのいずれかのボーラス静
脈内注射によって塞栓治療を開始した。360分の期間にわたって、ウサギの静脈から血
液サンプルを採取し、血漿蛍光を血餅溶解の間接的パラメータとして分析した。同時に、
治療開始直後および治療300分後に、耳出血時間を決定した。耳出血時間にアクセスす
るために、3-5mmのアプリの切開を、耳の外縁(外耳静脈に近い)に平行にメス刃を
用いて作製した。30秒毎に、切開部のすぐそばに小さなフィルターチップで穏やかに叩
くことによって、切開部がまだ出血しているかどうかが証明された。
肺における血餅の塞栓をもたらした。30分後に、生理食塩水、抗体TPP-17928
、tPA、または抗体TPP-17928とtPAの組み合わせのいずれかのボーラス静
脈内注射によって塞栓治療を開始した。360分の期間にわたって、ウサギの静脈から血
液サンプルを採取し、血漿蛍光を血餅溶解の間接的パラメータとして分析した。同時に、
治療開始直後および治療300分後に、耳出血時間を決定した。耳出血時間にアクセスす
るために、3-5mmのアプリの切開を、耳の外縁(外耳静脈に近い)に平行にメス刃を
用いて作製した。30秒毎に、切開部のすぐそばに小さなフィルターチップで穏やかに叩
くことによって、切開部がまだ出血しているかどうかが証明された。
図12.1に示すように、抗体TPP-17928を用いたウサギにおける肺塞栓症の
治療は血餅溶解の増加をもたらし、これは、経時的にtPA治療に匹敵すると考えられる
。TPP-17928は、血餅溶解の間接測定パラメータとして、血漿蛍光を用量依存的
に増加させる(対照と比較してAUCの2.1倍増加)。15mg/kgのTPP-17
928と低濃度のtPA(0,125mg/kg)との併用は、血餅の溶解をより速く促
進した。tPA治療はまた、血餅の溶解に対する用量依存的効果を示す(図12.2)。
治療は血餅溶解の増加をもたらし、これは、経時的にtPA治療に匹敵すると考えられる
。TPP-17928は、血餅溶解の間接測定パラメータとして、血漿蛍光を用量依存的
に増加させる(対照と比較してAUCの2.1倍増加)。15mg/kgのTPP-17
928と低濃度のtPA(0,125mg/kg)との併用は、血餅の溶解をより速く促
進した。tPA治療はまた、血餅の溶解に対する用量依存的効果を示す(図12.2)。
血餅溶解のパラメータとしての血漿蛍光の増加を伴う同様の結果が、さらなるウサギ肺
塞栓実験において、30mg/kgのTPP-12387(対照と比較してAUCの2.
6倍の増加)および15mg/kgのTPP-17044(対照と比較してAUCの2.
1倍の増加)について観察された。
塞栓実験において、30mg/kgのTPP-12387(対照と比較してAUCの2.
6倍の増加)および15mg/kgのTPP-17044(対照と比較してAUCの2.
1倍の増加)について観察された。
耳出血時間の測定
上記の実験では、同時に耳出血時間を測定した。治療適用の直後(0分)に、耳出血時
間を以下のように測定した。耳出血時間にアクセスするために、3-5mmのアプリの切
開を、耳の外縁(外耳静脈に近い)に平行にメス刃を用いて作製した。30秒毎に、切開
部のすぐそばに小さなフィルターチップで穏やかに叩くことによって、切開部がまだ出血
しているかどうかが証明された。耳出血時間は、tPA治療と比較して、抗a2AP抗体
治療の優れた安全性プロファイルを明らかにする。化合物投与の直後には使用された抗体
濃度のいずれについても検出可能な出血時間の増加はないが、tPA治療は、特に1mg
/kgの最高濃度で、耳出血時間の延長に対する即時の効果を示す。驚くべきことに、低
用量のtPA(0.125mg/kg)と組み合わせた15mg/kgのTPP-179
28の組み合わせも、出血時間の有意な増加をもたらさない。このことは、有害事象、こ
の場合は出血に関して、抗a2AP抗体治療がtPA治療よりも優れていることを明らか
に証明している。結果を図13に示す。出血時間の延長は、tPA[1mg/kg]2.
03倍、TPP-17928[15mg/kg]0.95倍、tPA[0.125mg/
kg]+TPP-17928[15mg/kg]1.56倍である。さらなるウサギ耳出
血実験において、耳出血時間の延長に影響を及ぼさない同様の結果が、30mg/kgの
TPP-12387(0.91倍)および15mg/kgのTPP-17044(1.0
5倍)について観察された。
上記の実験では、同時に耳出血時間を測定した。治療適用の直後(0分)に、耳出血時
間を以下のように測定した。耳出血時間にアクセスするために、3-5mmのアプリの切
開を、耳の外縁(外耳静脈に近い)に平行にメス刃を用いて作製した。30秒毎に、切開
部のすぐそばに小さなフィルターチップで穏やかに叩くことによって、切開部がまだ出血
しているかどうかが証明された。耳出血時間は、tPA治療と比較して、抗a2AP抗体
治療の優れた安全性プロファイルを明らかにする。化合物投与の直後には使用された抗体
濃度のいずれについても検出可能な出血時間の増加はないが、tPA治療は、特に1mg
/kgの最高濃度で、耳出血時間の延長に対する即時の効果を示す。驚くべきことに、低
用量のtPA(0.125mg/kg)と組み合わせた15mg/kgのTPP-179
28の組み合わせも、出血時間の有意な増加をもたらさない。このことは、有害事象、こ
の場合は出血に関して、抗a2AP抗体治療がtPA治療よりも優れていることを明らか
に証明している。結果を図13に示す。出血時間の延長は、tPA[1mg/kg]2.
03倍、TPP-17928[15mg/kg]0.95倍、tPA[0.125mg/
kg]+TPP-17928[15mg/kg]1.56倍である。さらなるウサギ耳出
血実験において、耳出血時間の延長に影響を及ぼさない同様の結果が、30mg/kgの
TPP-12387(0.91倍)および15mg/kgのTPP-17044(1.0
5倍)について観察された。
実施例9:本発明の抗体の結合親和性の決定
結合アッセイは、Biacore T200装置で、プロテインGセンサーチップおよ
びアッセイ緩衝液HBS-EP+を用いて25℃で行った。抗体を約150RUまで捕捉
し、全動力学のために1.56~200nMの濃度で分析物を使用した。相互作用パート
ナーとして、ヒト、カニクイザルおよびウサギ由来のα2-アンチプラスミンを使用した
。再生は、pH1.5のグリシン-HClを用いて行った。反応速度パラメータは、実験
センサグラムを1:1ラングミュア結合モデルに適合させることによって導出した。結果
を表4に示す。
結合アッセイは、Biacore T200装置で、プロテインGセンサーチップおよ
びアッセイ緩衝液HBS-EP+を用いて25℃で行った。抗体を約150RUまで捕捉
し、全動力学のために1.56~200nMの濃度で分析物を使用した。相互作用パート
ナーとして、ヒト、カニクイザルおよびウサギ由来のα2-アンチプラスミンを使用した
。再生は、pH1.5のグリシン-HClを用いて行った。反応速度パラメータは、実験
センサグラムを1:1ラングミュア結合モデルに適合させることによって導出した。結果
を表4に示す。
実施例10:77A3および本発明の抗体の機能遮断活性の直接比較
A2AP活性に対する試験抗体77A3の遮断活性を、本発明の試験抗体と比較するた
めに、実施例4に詳細に記載される機能遮断アッセイを使用した。簡単に述べると、試験
抗体を6.1E-11~3.0E-08Mおよび.0E-06Mの濃度で、それぞれA2
APとプレインキュベートした。プラスミンおよびI-1275(プラスミンセリンプロ
テアーゼ活性のための蛍光発生基質)をアッセイに添加した後、プラスミンのセリンプロ
テアーゼ活性の尺度としての蛍光シグナルを決定した。
A2AP活性に対する試験抗体77A3の遮断活性を、本発明の試験抗体と比較するた
めに、実施例4に詳細に記載される機能遮断アッセイを使用した。簡単に述べると、試験
抗体を6.1E-11~3.0E-08Mおよび.0E-06Mの濃度で、それぞれA2
APとプレインキュベートした。プラスミンおよびI-1275(プラスミンセリンプロ
テアーゼ活性のための蛍光発生基質)をアッセイに添加した後、プラスミンのセリンプロ
テアーゼ活性の尺度としての蛍光シグナルを決定した。
0.03μMまでの77A3濃度の増加は、プラスミンによる蛍光基質I-1275の
切断に起因する蛍光シグナルの増加をもたらした。しかし、77A3濃度のさらなる増加
は、蛍光シグナルの減少をもたらした。これは、0,03μMの濃度までの実施例4に記
載の生化学アッセイにおける抗体77A3の試験が、α2-アンチプラスミンの遮断をも
たらし、77A3抗体濃度のさらなる増加がプラスミン活性の低下をもたらし、1μMの
77A3濃度でプラスミン活性の完全な阻害をもたらすことを示す(図14.1)。本発
明の抗体について、A2APの機能遮断活性についての以下のIC50値を生成した:T
PP-17041-6.4E-10M、TPP-17044-3.9E-10M、TPP
-17045-1.4E-10M、TPP-17048-1.2E-09M、TPP-1
7051-3.3E-10M、TPP-17053-1.5E-10M。1μMの濃度ま
で試験した本発明の抗体のいずれも、蛍光シグナルの減少をもたらさず、このことは、本
発明の試験抗体がプラスミン活性に影響を及ぼさないことを示している(図14.2-1
4.7)。
切断に起因する蛍光シグナルの増加をもたらした。しかし、77A3濃度のさらなる増加
は、蛍光シグナルの減少をもたらした。これは、0,03μMの濃度までの実施例4に記
載の生化学アッセイにおける抗体77A3の試験が、α2-アンチプラスミンの遮断をも
たらし、77A3抗体濃度のさらなる増加がプラスミン活性の低下をもたらし、1μMの
77A3濃度でプラスミン活性の完全な阻害をもたらすことを示す(図14.1)。本発
明の抗体について、A2APの機能遮断活性についての以下のIC50値を生成した:T
PP-17041-6.4E-10M、TPP-17044-3.9E-10M、TPP
-17045-1.4E-10M、TPP-17048-1.2E-09M、TPP-1
7051-3.3E-10M、TPP-17053-1.5E-10M。1μMの濃度ま
で試験した本発明の抗体のいずれも、蛍光シグナルの減少をもたらさず、このことは、本
発明の試験抗体がプラスミン活性に影響を及ぼさないことを示している(図14.2-1
4.7)。
実施例11:プラスミンのタンパク質分解活性を阻害することについて本発明の抗体を
試験するための生化学的アッセイ
実施例10において抗体77A3について得られた驚くべき結果をさらに調査するため
に、本発明の抗α2-アンチプラスミン抗体ならびに抗体77A3を、生化学的プラスミ
ンアッセイにおいて阻害活性について試験した。このために、定義された濃度で開始し、
続いて1:2または1:3希釈工程を行う異なる濃度の抗体を、Haematologi
c Technologies INC.から入手した400pMのヒトプラスミン;カ
タログ番号HCPM140)および1μMの最終濃度での蛍光発生基質I-1275(B
achem;MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMCトリフルオロアセテート塩
;カタログ番号I-1275(ストック:DMSO中10mM))と共に、37℃で1時
間インキュベートした。この反応を384ウェルマイクロタイタープレート(Nunc;
カタログ番号262260)中で実施した。蛍光発生シグナルを、以下の条件で測定した
:モード蛍光トップリーディング、Ex 360nM、Em 465nm、Ex帯域幅5
nm、Em帯域幅5nm。
試験するための生化学的アッセイ
実施例10において抗体77A3について得られた驚くべき結果をさらに調査するため
に、本発明の抗α2-アンチプラスミン抗体ならびに抗体77A3を、生化学的プラスミ
ンアッセイにおいて阻害活性について試験した。このために、定義された濃度で開始し、
続いて1:2または1:3希釈工程を行う異なる濃度の抗体を、Haematologi
c Technologies INC.から入手した400pMのヒトプラスミン;カ
タログ番号HCPM140)および1μMの最終濃度での蛍光発生基質I-1275(B
achem;MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMCトリフルオロアセテート塩
;カタログ番号I-1275(ストック:DMSO中10mM))と共に、37℃で1時
間インキュベートした。この反応を384ウェルマイクロタイタープレート(Nunc;
カタログ番号262260)中で実施した。蛍光発生シグナルを、以下の条件で測定した
:モード蛍光トップリーディング、Ex 360nM、Em 465nm、Ex帯域幅5
nm、Em帯域幅5nm。
図16に示されるように、TPP-17928(本発明の全ての抗体について例示的に
示される)は生化学的活性に影響を及ぼさないが、77A3は1.7μMのIC50値で
プラスミンのタンパク質分解活性を遮断する。
示される)は生化学的活性に影響を及ぼさないが、77A3は1.7μMのIC50値で
プラスミンのタンパク質分解活性を遮断する。
表5:77A3および本発明の試験抗体によるプラスミンタンパク質分解活性の阻害。
*77A3およびTPP-17928について、二重反復で実施された2~3回の独立し
た実験からの用量反応曲線を、図16に例として示す。
た実験からの用量反応曲線を、図16に例として示す。
実施例12:TPP-12387および77A3のエピトープマッピング
エピトープマッピングは、PEPperCHIP(登録商標)Peptide Mic
roarrayプラットフォームを使用することによって、PEPperPRINT社(
Heidelberg、Germany)によって実施した。
エピトープマッピングは、PEPperCHIP(登録商標)Peptide Mic
roarrayプラットフォームを使用することによって、PEPperPRINT社(
Heidelberg、Germany)によって実施した。
線状エピトープマッピングのために、抗原配列を、14アミノ酸のペプチド-ペプチド
重複を有する重複線状15アミノ酸ペプチドに翻訳した。得られたペプチドマイクロアレ
イは、二度繰り返してプリントされた491種の異なるペプチドを含んでいた。
重複を有する重複線状15アミノ酸ペプチドに翻訳した。得られたペプチドマイクロアレ
イは、二度繰り返してプリントされた491種の異なるペプチドを含んでいた。
立体配座エピトープマッピングのために、抗原配列を、6、9および12アミノ酸のペ
プチド-ペプチド重複を有する重複する7、10および13アミノ酸ペプチドに翻訳した
。ペプチド合成後、全てのペプチドを、C末端システイン側鎖と適切に修飾されたN末端
との間のチオエーテル結合を介して環化した。得られた立体配座ペプチドマイクロアレイ
は、二度繰り返してプリントされた1,488種の異なる環状拘束ペプチドを含んでいた
。
プチド-ペプチド重複を有する重複する7、10および13アミノ酸ペプチドに翻訳した
。ペプチド合成後、全てのペプチドを、C末端システイン側鎖と適切に修飾されたN末端
との間のチオエーテル結合を介して環化した。得られた立体配座ペプチドマイクロアレイ
は、二度繰り返してプリントされた1,488種の異なる環状拘束ペプチドを含んでいた
。
マイクロアレイを、ロックランドブロッキングバッファーMB-070(最初のアッセ
イの30分前)を使用することによってブロックし、抗体インキュベーションを、PBS
からなるインキュベーションバッファー中、10%ブロッキングバッファーを含む0.0
5%(線状エピトープマッピング)または0.005%(立体構造エピトープマッピング
)Tween20でpH7.4、で行った。
イの30分前)を使用することによってブロックし、抗体インキュベーションを、PBS
からなるインキュベーションバッファー中、10%ブロッキングバッファーを含む0.0
5%(線状エピトープマッピング)または0.005%(立体構造エピトープマッピング
)Tween20でpH7.4、で行った。
インキュベーション後、アレイを、PBS用いて、0.05%(線状エピトープマッピ
ング)または0.005%(立体配座エピトープマッピング)Tween20でpH7.
4、で洗浄した。アレイを3×1分(線状エピトープマッピング)または2×10秒(立
体配座エピトープマッピング)洗浄した。
ング)または0.005%(立体配座エピトープマッピング)Tween20でpH7.
4、で洗浄した。アレイを3×1分(線状エピトープマッピング)または2×10秒(立
体配座エピトープマッピング)洗浄した。
抗体を、インキュベーション緩衝液中、1μg/ml、10μg/mlおよび100μ
g/mlの濃度でマイクロアレイ上でインキュベートした。インキュベーション時間は4
℃で16時間、140rpmで振盪した。
g/mlの濃度でマイクロアレイ上でインキュベートした。インキュベーション時間は4
℃で16時間、140rpmで振盪した。
対照として、マウスモノクローナル抗HA(12CA5)DyLight800を1:
2000の希釈で使用した;この検出抗体を室温でインキュベーション緩衝液中で45分
染色してマイクロアレイ上でインキュベートした。
2000の希釈で使用した;この検出抗体を室温でインキュベーション緩衝液中で45分
染色してマイクロアレイ上でインキュベートした。
二次抗体として、ヤギ抗ヒトIgG(Fc)DyLight680を1:5000の希
釈で使用した。この検出抗体を、室温でインキュベーション緩衝液中で45分染色してマ
イクロアレイ上でインキュベートした。
釈で使用した。この検出抗体を、室温でインキュベーション緩衝液中で45分染色してマ
イクロアレイ上でインキュベートした。
LI-COR Odyssey Imaging Systemを用いて、走査オフセ
ット0.65mm、解像度21μm、走査強度7/7(赤=700nm/緑=800nm
)で信号を検出した。
ット0.65mm、解像度21μm、走査強度7/7(赤=700nm/緑=800nm
)で信号を検出した。
スポット強度およびペプチドアノテーションの定量化は、24ビットカラー化tiff
ファイルよりも高いダイナミックレンジを示す7/7の走査強度での16ビットグレース
ケールtiffファイルに基づいた。マイクロアレイ画像分析は、PepSlide(登
録商標)Analyzerで行った。ソフトウェアアルゴリズムを用いて、各スポットの
蛍光強度を生信号、前景信号および背景信号に分解し、前景強度の平均中央値およびスポ
ット複製のスポット間偏差を計算した。前景強度の平均中央値に基づいて、強度マップが
生成され、ペプチドマップ中の相互作用が、高いスポット強度については赤色、低いスポ
ット強度については白色を有する強度カラーコードによって強調された。アッセイの平均
スポット強度を、N末端からC末端までの抗原配列に対する抗体試料でプロットし、全体
的なスポット強度およびシグナル対ノイズ比を可視化した。強度プロットは、試験した抗
体のエピトープを同定するために、ペプチドおよび強度マップ、ならびにマイクロアレイ
スキャンの目視検査と関連付けた。
ファイルよりも高いダイナミックレンジを示す7/7の走査強度での16ビットグレース
ケールtiffファイルに基づいた。マイクロアレイ画像分析は、PepSlide(登
録商標)Analyzerで行った。ソフトウェアアルゴリズムを用いて、各スポットの
蛍光強度を生信号、前景信号および背景信号に分解し、前景強度の平均中央値およびスポ
ット複製のスポット間偏差を計算した。前景強度の平均中央値に基づいて、強度マップが
生成され、ペプチドマップ中の相互作用が、高いスポット強度については赤色、低いスポ
ット強度については白色を有する強度カラーコードによって強調された。アッセイの平均
スポット強度を、N末端からC末端までの抗原配列に対する抗体試料でプロットし、全体
的なスポット強度およびシグナル対ノイズ比を可視化した。強度プロットは、試験した抗
体のエピトープを同定するために、ペプチドおよび強度マップ、ならびにマイクロアレイ
スキャンの目視検査と関連付けた。
二次ヤギ抗ヒトIgG(Fc)DyLight680抗体(1:5000)および対照
マウスモノクローナル抗HA(12CA5)DyLight800抗体(1:2000)
による線状および立体配座ペプチドマイクロアレイの前染色は、抗原の線状または環状拘
束ペプチドとのバックグラウンド相互作用を示さなかった。対照的に、目的の抗体とのイ
ンキュベーションは、以下の観察をもたらした:
表6に示されるように、TPP-12387は、コンセンサスモチーフSRMSLSS
を有するペプチドに対して高いシグナル対ノイズ比を示し、これは、A2APの反応中心
ループ(配列番号1のアミノ酸400~412)に位置する配列番号1のアミノ酸402
~408に対応する。
マウスモノクローナル抗HA(12CA5)DyLight800抗体(1:2000)
による線状および立体配座ペプチドマイクロアレイの前染色は、抗原の線状または環状拘
束ペプチドとのバックグラウンド相互作用を示さなかった。対照的に、目的の抗体とのイ
ンキュベーションは、以下の観察をもたらした:
表6に示されるように、TPP-12387は、コンセンサスモチーフSRMSLSS
を有するペプチドに対して高いシグナル対ノイズ比を示し、これは、A2APの反応中心
ループ(配列番号1のアミノ酸400~412)に位置する配列番号1のアミノ酸402
~408に対応する。
対照的に、抗体77A3については、基本コンセンサスモチーフRPTKVRLPKを
有するペプチドに対する非常に弱いシグナル対ノイズ比が同定され、これは配列番号1の
アミノ酸330~338に対応する。A2APのこの部分については、明確な記載はない
。
有するペプチドに対する非常に弱いシグナル対ノイズ比が同定され、これは配列番号1の
アミノ酸330~338に対応する。A2APのこの部分については、明確な記載はない
。
Claims (24)
- A2APに結合し、A2APの活性を阻害することができる単離された抗体またはその
抗原結合フラグメントであって、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが
プラスミン活性を阻害しない、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが、解離定数(KD)≦100nM
、≦50nM、≦25nM、≦10nM、≦1nM、または≦0.5nMで、配列番号1
のアミノ酸40~491の配列のヒトA2APに結合し、および
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが、インビトロA2AP機能遮断ア
ッセイにおいて、≦500nM、≦250nM、≦100nM、≦50nM、≦25nM
、≦10nM、≦1nM、または≦0.5nMのEC50で、配列番号1のアミノ酸40
~491の配列のヒトA2APの活性を阻害する、
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 請求項1または2に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが、インビトロプラスミン阻害アッ
セイにおいて、1μM、2μM、5μMまたは10μMの前記単離された抗体またはその
抗原結合フラグメントの濃度までプラスミン活性を阻害しない、
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 請求項1、2または3に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであっ
て、
前記プラスミンが、ヒトプラスミンであり、特に前記プラスミンが、配列番号118およ
び配列番号119を含むヒトプラスミンである、
前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 請求項1~4のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントであ
って、
i)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号8を含むH-CDR2、および配列番号1
3を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR1
、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽鎖
抗原結合領域;または
ii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域;または
iii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番
号11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CD
R1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号17を含むL-CDR3を含む
軽鎖抗原結合領域;または
iv)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
11を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域;または
v)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号1
2を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR1
、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽鎖
抗原結合領域;または
vi)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号19を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域;または
vii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番
号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CD
R1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む
軽鎖抗原結合領域;または
viii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列
番号14を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-C
DR1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号20を含むL-CDR3を含
む軽鎖抗原結合領域;または
ix)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号
15を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR
1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽
鎖抗原結合領域;または
x)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号7を含むH-CDR2、および配列番号1
6を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CDR1
、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む軽鎖
抗原結合領域;または
xi)配列番号21を含むH-CDR1、配列番号8を含むH-CDR2、および配列番
号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-CD
R1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含む
軽鎖抗原結合領域;または
xii)配列番号6を含むH-CDR1、配列番号22を含むH-CDR2、および配列
番号13を含むH-CDR3を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号9を含むL-C
DR1、配列番号10を含むL-CDR2、および配列番号18を含むL-CDR3を含
む軽鎖抗原結合領域
を含む、前記単離された抗体または抗原結合フラグメント。 - 請求項1~5のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントであ
って、
xiii)配列番号32を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメ
イン;または
xiv)配列番号23を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号37を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
xv)配列番号24を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン
;または
xvi)配列番号25を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
xvii)配列番号26を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメ
イン;または
xviii)配列番号27を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号39を含む可変軽鎖ド
メイン;または
xix)配列番号27を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
xx)配列番号28を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイン
;または
xxi)配列番号28を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号40を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
xxii)配列番号29を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメ
イン;または
xxiii)配列番号30を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ド
メイン;または
xxiv)配列番号31を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメ
イン;または
xxv)配列番号33を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメイ
ン;または
xxvi)配列番号34を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ドメ
イン;または
xxvii)配列番号35を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖ド
メイン;または
xxviii)配列番号36を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号38を含む可変軽鎖
ドメイン
を含む、前記単離された抗体または抗原結合フラグメント。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、
IgG抗体、特にIgG1またはIgG4抗体である、前記単離された抗体。 - 請求項1~7のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、
xxix)配列番号55を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xxx)配列番号41を含む重鎖および配列番号56を含む軽鎖;または
xxxi)配列番号42を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xxxii)配列番号43を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xxxiii)配列番号44を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xxxiv)配列番号45を含む重鎖および配列番号58を含む軽鎖;または
xxxv)配列番号45を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xxxvi)配列番号46を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xxxvii)配列番号46を含む重鎖および配列番号59を含む軽鎖;または
xxxviii)配列番号47を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xxxix)配列番号48を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xl)配列番号49を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xli)配列番号50を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xlii)配列番号51を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xliii)配列番号52を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xliv)配列番号53を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖;または
xlv)配列番号54を含む重鎖および配列番号57を含む軽鎖
を含む、前記単離された抗体。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメントであって、
scFv、Fab、Fab’フラグメントまたはF(ab’)2フラグメントである、前
記抗原結合フラグメント。 - 請求項1~9のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントであ
って、
モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである、前記単離された抗体または抗原
結合フラグメント。 - 請求項1~10のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントで
あって、
ヒト、ヒト化またはキメラ抗体または抗原結合フラグメントである、前記単離された抗体
または抗原結合フラグメント。 - A2APへの結合について、請求項1~11のいずれか一項に記載の単離された抗体ま
たは抗原結合フラグメントと競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント
。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントを
含む、抗体コンジュゲート。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする
、単離された核酸配列。 - 請求項14に記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメントを発現する
、および/または請求項14に記載の核酸もしくは請求項15に記載のベクターを含む、
単離された細胞。 - 請求項16に記載の単離された細胞であって、前記細胞が、原核細胞または真核細胞で
ある、前記単離された細胞。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントを
産生する方法であって、請求項16または17のいずれか一項に記載の細胞を培養するこ
と、および任意に抗体または抗原結合フラグメントを精製することを含む、前記方法。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント
、または請求項13に記載の抗体コンジュゲート、および任意に1つ以上の薬学的に許容
される賦形剤を含む、医薬組成物。 - 疾患の治療または予防に使用するための、請求項1~12のいずれか一項に記載の単離
された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または請求項13に記載のコンジュゲート、
または請求項19に記載の医薬組成物。 - 診断薬としての使用のための、請求項1~12のいずれか一項に記載の単離された抗体
もしくは抗原結合フラグメント、または請求項13に記載の抗体コンジュゲート。 - 虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、
静脈血栓症、またはシャント血栓症などの、部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血
性事象に関連する障害または疾患の治療または予防に使用するための、請求項1~12の
いずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント、または請求項13に
記載のコンジュゲート、または請求項19に記載の医薬組成物。 - 1つ以上のさらなる治療活性化合物、特に凝固カスケードの阻害剤、抗凝固剤および血
小板凝集阻害剤から選択される化合物と同時に、別々に、または連続的に組み合わせて使
用するための、請求項1~12のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合
フラグメント、または請求項16に記載のコンジュゲート、または請求項19に記載の医
薬組成物。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント
、または請求項13に記載のコンジュゲート、または請求項19に記載の医薬組成物、お
よび使用説明書を含むキット。
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