JP2024046503A - 細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定する方法、キャリブレータ及び結合体 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞外小胞の測定に用いられるキャリブレータを提供することを課題とする。【解決手段】アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞が表面に有する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体を含むキャリブレータを用いて、試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得することによって課題を解決する。【選択図】図９
Description
本発明は、細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼ(ALP)の活性を測定する方法に関する。本発明は、細胞外小胞に含まれるALPの活性を測定するために用いられるキャリブレータに関する。本発明は、細胞外小胞に含まれるALPの活性を測定するために用いられる結合体に関する。
細胞外小胞は、脂質二重膜で囲まれたナノサイズ(数十nm～数百nm)の膜小胞であり、ほぼ全ての細胞から分泌される。細胞外小胞は、血液、尿などの様々な生体試料中に存在する。細胞外小胞内には、細胞由来のタンパク質、DNA、mRNA、miRNA、脂質、糖鎖、代謝物などの種々の物質が含まれる。近年、細胞外小胞に含まれる物質が、細胞間情報伝達分子として機能して、種々の生理学的又は病理学的プロセスに関与することが報告されている。例えば、血管の石灰化に細胞外小胞が関与することが報告されている(特許文献１)。
生体内の石灰化は、主にハイドロキシアパタイトがコラーゲン繊維に沈着することで生じる。石灰化が血管で起こると虚血性心疾患、脳血管障害、心不全などの原因となるため、血管の石灰化を判別するための分析系を構築することが重要である。血管の石灰化の判別方法として、例えば、特許文献１では、血液中の細胞外小胞を単離し、細胞外小胞中の小胞化合物(カルシウム塩)を測定している。特許文献１では、細胞外小胞を破壊し、細胞外小胞に含まれる成分を分析している。
血管の石灰化を判別するための分析系として、発明者らは、細胞外小胞の表面に存在するALPの活性を測定することを試みた。しかし、細胞外小胞の表面に存在するALPの活性を測定する際に、その対照になり得るキャリブレータは存在せず、測定が困難であった。本発明は、細胞外小胞の測定に用いられるキャリブレータとそれを用いる測定方法を提供することを目的とする。
本発明は、以下の項１～項１８の発明を提供する。
[項１]
キャリブレータを用いて試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得することを含み、
前記キャリブレータが、アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体を含む、
試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定する方法。
[項１]
キャリブレータを用いて試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得することを含み、
前記キャリブレータが、アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体を含む、
試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定する方法。
[項２]
前記試料に含まれる細胞外小胞を固相上に固定する第１固定工程と、
前記固定された細胞外小胞と、アルカリフォスファターゼの基質とを接触させることにより生じるシグナルを測定する第１測定工程と、
前記キャリブレータに含まれる前記結合体を固相上に固定する第２固定工程と、
前記固定された結合体と、アルカリフォスファターゼの基質とを接触させることにより生じるシグナルを測定する第２測定工程と、
前記第１測定工程で得られた測定値及び前記第２測定工程で得られた測定値から、前記試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得する工程と
を含む、項１に記載の方法。
前記試料に含まれる細胞外小胞を固相上に固定する第１固定工程と、
前記固定された細胞外小胞と、アルカリフォスファターゼの基質とを接触させることにより生じるシグナルを測定する第１測定工程と、
前記キャリブレータに含まれる前記結合体を固相上に固定する第２固定工程と、
前記固定された結合体と、アルカリフォスファターゼの基質とを接触させることにより生じるシグナルを測定する第２測定工程と、
前記第１測定工程で得られた測定値及び前記第２測定工程で得られた測定値から、前記試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得する工程と
を含む、項１に記載の方法。
[項３]
前記第１固定工程が、前記試料と、前記固相と、前記試料中の細胞外小胞に含まれる膜タンパク質と結合可能な捕捉抗体とを接触させることにより、前記細胞外小胞と前記捕捉抗体との免疫複合体を前記固相上に形成することを含む、項２に記載の方法。
前記第１固定工程が、前記試料と、前記固相と、前記試料中の細胞外小胞に含まれる膜タンパク質と結合可能な捕捉抗体とを接触させることにより、前記細胞外小胞と前記捕捉抗体との免疫複合体を前記固相上に形成することを含む、項２に記載の方法。
[項４]
前記第２固定工程が、前記キャリブレータと、前記固相と、前記結合体に含まれる膜タンパク質と結合可能な捕捉抗体とを接触させることにより、前記結合体と前記捕捉抗体との免疫複合体を前記固相上に形成することを含む、項２又は３に記載の方法。
前記第２固定工程が、前記キャリブレータと、前記固相と、前記結合体に含まれる膜タンパク質と結合可能な捕捉抗体とを接触させることにより、前記結合体と前記捕捉抗体との免疫複合体を前記固相上に形成することを含む、項２又は３に記載の方法。
[項５]
前記膜タンパク質のアミノ酸配列が、CD9の細胞外領域、CD63の細胞外領域、CD81の細胞外領域、アネキシンI、アネキシンVI及びPit 1からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む、項１～４のいずれか１つに記載の方法。
前記膜タンパク質のアミノ酸配列が、CD9の細胞外領域、CD63の細胞外領域、CD81の細胞外領域、アネキシンI、アネキシンVI及びPit 1からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む、項１～４のいずれか１つに記載の方法。
[項６]
前記アルカリフォスファターゼが、組織非特異型アルカリフォスファターゼ、小腸型アルカリフォスファターゼ、胎盤型アルカリフォスファターゼ及び生殖細胞型アルカリフォスファターゼからなる群から選択される1つである、項１～５のいずれか１つに記載の方法。
前記アルカリフォスファターゼが、組織非特異型アルカリフォスファターゼ、小腸型アルカリフォスファターゼ、胎盤型アルカリフォスファターゼ及び生殖細胞型アルカリフォスファターゼからなる群から選択される1つである、項１～５のいずれか１つに記載の方法。
[項７]
前記第１固定工程及び第２固定工程の前記捕捉抗体が、抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗アネキシンI抗体、抗アネキシンVI抗体及び抗Pit 1抗体からなる群から選択される1つである、項２～４、項２を引用する項５又は６のいずれか１つに記載の方法。
前記第１固定工程及び第２固定工程の前記捕捉抗体が、抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗アネキシンI抗体、抗アネキシンVI抗体及び抗Pit 1抗体からなる群から選択される1つである、項２～４、項２を引用する項５又は６のいずれか１つに記載の方法。
[項８]
前記アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチド及び／又は前記膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドが組換えポリペプチドである、項１～７のいずれか１つに記載の方法。
前記アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチド及び／又は前記膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドが組換えポリペプチドである、項１～７のいずれか１つに記載の方法。
[項９]
前記固相が磁性粒子である、項２～４、８、項２を引用する項５～７のいずれか１つに記載の方法。
前記固相が磁性粒子である、項２～４、８、項２を引用する項５～７のいずれか１つに記載の方法。
[項１０]
前記試料が血液試料である、項１～９のいずれか１つに記載の方法。
前記試料が血液試料である、項１～９のいずれか１つに記載の方法。
[項１１]
前記キャリブレータが、前記結合体を含む試薬である、項１～１０のいずれか１つに記載の方法。
前記キャリブレータが、前記結合体を含む試薬である、項１～１０のいずれか１つに記載の方法。
[項１２]
前記キャリブレータが、前記結合体をそれぞれ含む複数の試薬を含む試薬セットであり、前記複数の試薬における前記結合体の濃度が互いに異なっている、項１～１１のいずれか１つに記載の方法。
前記キャリブレータが、前記結合体をそれぞれ含む複数の試薬を含む試薬セットであり、前記複数の試薬における前記結合体の濃度が互いに異なっている、項１～１１のいずれか１つに記載の方法。
[項１３]
前記第２測定工程が、濃度が異なる複数の試薬由来の結合体に対してそれぞれ行われ、前記濃度が異なる複数の試薬由来の結合体から得られた測定値から作成した検量線に基づいて前記試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得する工程が行われる、項２を引用する項１２に記載の方法。
前記第２測定工程が、濃度が異なる複数の試薬由来の結合体に対してそれぞれ行われ、前記濃度が異なる複数の試薬由来の結合体から得られた測定値から作成した検量線に基づいて前記試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得する工程が行われる、項２を引用する項１２に記載の方法。
[項１４]
試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定するために用いられるキャリブレータであって、
アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体を含む、キャリブレータ。
試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定するために用いられるキャリブレータであって、
アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体を含む、キャリブレータ。
[項１５]
前記膜タンパク質のアミノ酸配列が、CD9の細胞外領域、CD63の細胞外領域、CD81の細胞外領域、アネキシンI、アネキシンVI及びPit 1からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む、項１４に記載のキャリブレータ。
前記膜タンパク質のアミノ酸配列が、CD9の細胞外領域、CD63の細胞外領域、CD81の細胞外領域、アネキシンI、アネキシンVI及びPit 1からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む、項１４に記載のキャリブレータ。
[項１６]
前記アルカリフォスファターゼが、組織非特異型アルカリフォスファターゼ、小腸型アルカリフォスファターゼ、胎盤型アルカリフォスファターゼ及び生殖細胞型アルカリフォスファターゼからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、項１４又は１５に記載のキャリブレータ。
前記アルカリフォスファターゼが、組織非特異型アルカリフォスファターゼ、小腸型アルカリフォスファターゼ、胎盤型アルカリフォスファターゼ及び生殖細胞型アルカリフォスファターゼからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、項１４又は１５に記載のキャリブレータ。
[項１７]
前記アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチド及び／又は前記膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドが組換えポリペプチドである、項１４～１６のいずれか１つに記載のキャリブレータ。
前記アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチド及び／又は前記膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドが組換えポリペプチドである、項１４～１６のいずれか１つに記載のキャリブレータ。
[項１８]
試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定するために用いられる結合体であって、アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体。
試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定するために用いられる結合体であって、アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体。
本発明によれば、細胞外小胞に含まれるALPの活性の測定に用いられるキャリブレータとそれに用いる測定方法、及びキャリブレータに含まれる結合体が提供される。
キャリブレータとは一般に、被検物質に対応した標準物質を含む試薬をいう。被検物質の試料中の濃度は通常不明であり、キャリブレータを用いて定量的に測定され得る。被検物質は膜タンパク質とALPとを有する細胞外小胞であり、当該被検物質のALP活性が測定される。標準物質は、被検物質と本質的に同じまたは類似した構造および性質を有する物質である。したがって、本実施形態の標準物質は、ALP活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体(以下、「本実施形態の結合体」ともいう)である。なお、「ポリペプチド」との用語は、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合した物質を指し、タンパク質及びその断片を包含する。
本実施形態の結合体は、ALP活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質(以下、単に膜タンパク質ともいう)のアミノ酸配列を含むポリペプチドから構成される。結合体の一例の模式図を図１に示す。ALP活性を有するポリペプチドは、天然のポリペプチドでもよいし、組換えポリペプチドであってもよい。膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、天然のポリペプチドでもよいし、組換えポリペプチドであってもよい。ALP活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、試料中の細胞外小胞に含まれるALPと同じアミノ酸配列であってもよいし、アミノ酸配列が改変されていてもよい。膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列は、試料中の細胞外小胞に含まれる膜タンパク質と同じアミノ酸配列であってもよいし、アミノ酸配列が改変されていてもよい。ALP活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の改変は該アミノ酸配列の一部を削除、置換、付加又はそれらの組み合わせであり得るが、当該アミノ酸配列のALPが失活しない改変である。膜タンパク質のアミノ酸配列の改変は、該アミノ酸配列の一部を削除、置換、付加又はそれらの組み合わせであり得るが、当該改変を含むアミノ酸配列は後述の捕捉抗体が認識可能なアミノ酸配列であることが好ましい。
ALPの由来は特に限定されず、ヒト由来のALPであっても非ヒト由来のALPであってもよい。非ヒト由来のALPとしては、ウシ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等に由来するALPが挙げられ、それらの中でもウシ小腸由来ALP(BIAP)が好ましい。ALPの種類としては、例えば組織非特異型ALP、小腸型ALP、胎盤型ALP及び生殖細胞型ALPが挙げられる。
BIAPとしては、例えばBIAP I、BIAP II、BIAP III、BIAP IV、BIAP V、BIAP VI、BIAP VIIなどが挙げられる(Manes T.ら, (1998) J.Biol.Chem., vol.273, pp.23353-23360、米国特許第6,406,899号明細書など参照)。BIAPは市販品であってもよく、例えば、オリエンタル酵母社製のALP(HighSpecific Activity)が挙げられる。
本実施形態の結合体において、「細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質」とは、一般的に細胞外小胞の表面に存在することが知られている膜タンパク質であればよい。例えばCD9、CD63、CD81、CD82、CD53、CD37、アネキシンA1(アネキシン I)、アネキシンA2、アネキシンA4、アネキシンA5(アネキシンV)、アネキシンA6(アネキシンVI)、アネキシンA7、アネキシンA11、Pit 1、Pit 2、ソルチリン(Sortilin)、Rab、アリックス(Alix)、Tsg101、Rab、セレクチン、ラクトアドヘリン、インテグリン、フロチリン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ヒートショックプロテイン(HSP-60、HSP-70、HSP-A5、CCT2、HSP90等)、マトリックスメタプロテイナーゼ(MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13等)、S100タンパク質ファミリー(S100-A9等)、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)-I、MHC-II等が挙げられる。細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列は、上述の膜タンパク質の部分配列であってもよいし、全長配列であってもよい。例えば、CD9の細胞外領域、CD63の細胞外領域、CD81の細胞外領域、アネキシンA1(アネキシン I)、アネキシンA2、アネキシンA4、アネキシンA5(アネキシンV)、アネキシンA6(アネキシンVI)、アネキシンA7、アネキシンA11、Pit 1、Pit 2、ソルチリン、S100-A9から選択されるアミノ酸配列が好ましい。これらの膜タンパク質のアミノ酸配列自体は公知であり、例えばNCBI(National Center for Biotechnology Information)により提供されるデータベースなどの公知のデータベースから取得できる。後述の捕捉抗体が存在するか又は製造できる限り、ポリペプチドは、改変されたアミノ酸配列を有していてもよい。結合体が、これらの膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを有することで、該ポリペプチドに結合可能な捕捉抗体により、結合体を捕捉することができる。この結合体は、細胞外小胞の膜タンパク質の測定に用いる捕捉抗体と結合できるように設計されるので、この結合体を含むキャリブレータを用いることで試料中の細胞外小胞の濃度を取得できる。
具体的な結合体の例としては、例えばCD9の細胞外領域とALPとが共有結合により結合した結合体、CD9の全領域とALPとが共有結合により結合した結合体、CD63の細胞外領域とALPとが共有結合により結合した結合体、CD81の細胞外領域とALPとが共有結合により結合した結合体、アネキシンIの全領域とALPとが共有結合により結合した結合体、アネキシンVIの全領域とALPとが共有結合により結合した結合体等が挙げられる。CD9の細胞外領域のアミノ酸配列を配列番号１に示す。CD9の全領域のアミノ酸配列を配列番号２に示す。CD63の細胞外領域のアミノ酸配列を配列番号３に示す。CD81の細胞外領域のアミノ酸配列を配列番号４に示す。アネキシンIの全領域のアミノ酸配列を配列番号５に示す。アネキシンVI全領域から構成された組換えタンパク質であるアネキシンVI/ANXA6 Protein, Human, Recombinant (His Tag), 11161-H08E(Sino Biological社)のアミノ酸配列(以下アネキシンVI(FL)ともよぶ)を配列番号６に示す。配列番号１～６について以下に示す。
配列番号１：CD9の細胞外領域のアミノ酸配列
SHKDEVIKEVQEFYKDTYNKLKTKDEPQRETLKAIHYALNCCGLAGGVEQFISDICPKKDVLETFTVKSCPDAIKEVFDNKFHI
SHKDEVIKEVQEFYKDTYNKLKTKDEPQRETLKAIHYALNCCGLAGGVEQFISDICPKKDVLETFTVKSCPDAIKEVFDNKFHI
配列番号２：CD9の全領域のアミノ酸配列
MPVKGGTKCIKYLLFGFNFIFWLAGIAVLAIGLWLRFDSQTKSIFEQETNNNNSSFYTGVYILIGAGALMMLVGFLGCCGAVQESQCMLGLFFGFLLVIFAIEIAAAIWGYSHKDEVIKEVQEFYKDTYNKLKTKDEPQRETLKAIHYALNCCGLAGGVEQFISDICPKKDVLETFTVKSCPDAIKEVFDNKFHIIGAVGIGIAVVMIFGMIFSMILCCAIRRNREMV
MPVKGGTKCIKYLLFGFNFIFWLAGIAVLAIGLWLRFDSQTKSIFEQETNNNNSSFYTGVYILIGAGALMMLVGFLGCCGAVQESQCMLGLFFGFLLVIFAIEIAAAIWGYSHKDEVIKEVQEFYKDTYNKLKTKDEPQRETLKAIHYALNCCGLAGGVEQFISDICPKKDVLETFTVKSCPDAIKEVFDNKFHIIGAVGIGIAVVMIFGMIFSMILCCAIRRNREMV
配列番号３：CD63の細胞外領域のアミノ酸配列
AGYVFRDKVMSEFNNNFRQQMENYPKNNHTASILDRMQADFKCCGAANYTDWEKIPSMSKNRVPDSCCINVTVGCGINFNEKAIHKEGCVEKIGGWLRKNV
AGYVFRDKVMSEFNNNFRQQMENYPKNNHTASILDRMQADFKCCGAANYTDWEKIPSMSKNRVPDSCCINVTVGCGINFNEKAIHKEGCVEKIGGWLRKNV
配列番号４：CD81の細胞外領域のアミノ酸配列
FVNKDQIAKDVKQFYDQALQQAVVDDDANNAKAVVKTFHETLDCCGSSTLTALTTSVLKNNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
FVNKDQIAKDVKQFYDQALQQAVVDDDANNAKAVVKTFHETLDCCGSSTLTALTTSVLKNNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
配列番号５：アネキシンI(FL)のアミノ酸配列
MAMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVKSSKGGPGSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQETGKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNEDLADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIMVSRSEIDMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN
MAMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVKSSKGGPGSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQETGKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNEDLADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIMVSRSEIDMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN
配列番号６：アネキシンVI(FL)のアミノ酸配列
MAKPAQGAKYRGSIHDFPGFDPNQDAEALYTAMKGFGSDKEAILDIITSRSNRQRQEVCQSYKSLYGKDLIADLKYELTGKFERLIVGLMRPPAYCDAKEIKDAISGIGTDEKCLIEILASRTNEQMHQLVAAYKDAYERDLEADIIGDTSGHFQKMLVVLLQGTREEDDVVSEDLVQQDVQDLYEAGELKWGTDEAQFIYILGNRSKQHLRLVFDEYLKTTGKPIEASIRGELSGDFEKLMLAVVKCIRSTPEYFAERLFKAMKGLGTRDNTLIRIMVSRSELDMLDIREIFRTKYEKSLYSMIKNDTSGEYKKTLLKLSGGDDDAAGQFFPEAAQVAYQMWELSAVARVELKGTVRPANDFNPDADAKALRKAMKGLGTDEDTIIDIITHRSNVQRQQIRQTFKSHFGRDLMTDLKSEISGDLARLILGLMMPPAHYDAKQLKKAMEGAGTDEKALIEILATRTNAEIRAINEAYKEDYHKSLEDALSSDTSGHFRRILISLATGHREEGGENLDQAREDAQVAAEILEIADTPSGDKTSLETRFMTILCTRSYPHLRRVFQEFIKMTNYDVEHTIKKEMSGDVRDAFVAIVQSVKNKPLFFADKLYKSMKGAGTDEKTLTRIMVSRSEIDLLNIRREFIEKYDKSLHQAIEGDTSGDFLKALLALCGGED
MAKPAQGAKYRGSIHDFPGFDPNQDAEALYTAMKGFGSDKEAILDIITSRSNRQRQEVCQSYKSLYGKDLIADLKYELTGKFERLIVGLMRPPAYCDAKEIKDAISGIGTDEKCLIEILASRTNEQMHQLVAAYKDAYERDLEADIIGDTSGHFQKMLVVLLQGTREEDDVVSEDLVQQDVQDLYEAGELKWGTDEAQFIYILGNRSKQHLRLVFDEYLKTTGKPIEASIRGELSGDFEKLMLAVVKCIRSTPEYFAERLFKAMKGLGTRDNTLIRIMVSRSELDMLDIREIFRTKYEKSLYSMIKNDTSGEYKKTLLKLSGGDDDAAGQFFPEAAQVAYQMWELSAVARVELKGTVRPANDFNPDADAKALRKAMKGLGTDEDTIIDIITHRSNVQRQQIRQTFKSHFGRDLMTDLKSEISGDLARLILGLMMPPAHYDAKQLKKAMEGAGTDEKALIEILATRTNAEIRAINEAYKEDYHKSLEDALSSDTSGHFRRILISLATGHREEGGENLDQAREDAQVAAEILEIADTPSGDKTSLETRFMTILCTRSYPHLRRVFQEFIKMTNYDVEHTIKKEMSGDVRDAFVAIVQSVKNKPLFFADKLYKSMKGAGTDEKTLTRIMVSRSEIDLLNIRREFIEKYDKSLHQAIEGDTSGDFLKALLALCGGED
結合体は、ALP活性を有するポリペプチドと膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合している。例えば、マレイミド化したALPと、還元した膜タンパク質とを混合して反応させることで、ALPのマレイミド基と膜タンパク質のチオール基(-SH)との間に共有結合を形成して、結合体を得ることができる。混合の条件は、タンパク質が変性しない条件であれば特に限定されない。例えば、マレイミド化したALPと、還元した膜タンパク質とを混合し、４℃～40℃、好ましくは15℃～37℃で撹拌又は静置してもよい。
ALP活性を有するポリペプチドと膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとの共有結合は、ALP活性を有するポリペプチド及び膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドのそれぞれの官能基を利用して、ALP活性を有するポリペプチド及び膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを共有結合させてもよいし、クロスリンカーを介して結合していてもよい。例えば、縮合剤又はクロスリンカーを用いる反応が簡便で好ましい。そのような反応自体は公知である。官能基は特に限定されないが、スルフヒドリル基、アミノ基及びカルボキシ基は、市販の縮合剤及びクロスリンカーを利用できるので好ましい。
縮合剤は特に限定されないが、例えば、アミド化反応によりALP活性を有するポリペプチドと膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを共有結合させる場合、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1，1，3，3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド、2-クロロ-1, 3-ジメチルイミダゾリニウム、1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩、ジフェニルホスホリルアジド、クロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩、N, N’-ジイソプロピルカルボジイミドなどが例示される。
クロスリンカーは特に限定されず、ALP活性を有するポリペプチドと膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドのそれぞれの官能基に応じて適宜選択できる。
官能基としてスルフヒドリル基を有する化合物は、下図に示すように、マレイミド基又はブロモ(もしくはヨード)アセトアミド基を有する化合物と結合できる。例えば、スルフヒドリル基を有するALP活性を有するポリペプチドと、スルフヒドリル基を有する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを結合する場合、クロスリンカーとして、両端にマレイミドを有するクロスリンク試薬を用いてもよい。
官能基としてアミノ基を有する化合物は、下図に示すように、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル又はイソチオシアノ基を有する化合物と結合できる。例えば、アミノ基を有するALP活性を有するポリペプチドと、アミノ基を有する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを結合する場合、クロスリンカーとして、両端にNHSエステルを有するクロスリンク試薬を用いてもよい。
官能基としてカルボキシ基を有する化合物は、下図に示される３つのステップを経て、反応基としてアミノ基を有する化合物と結合できる。下図の第１ステップに示すように、カルボキシ基を有する化合物と、カルボジイミド基(-N=C=N-)を有する化合物(下図では、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド(WSC))と反応させる。次いで、下図の第２ステップに示すように、第１ステップの生成物とNHSとを反応させることで、不安定なNHSエステルを形成させる。そして、下図の第３ステップに示すように、第２ステップの生成物と、アミノ基を有する化合物とを反応させることにより、両者をクロスリンクできる。例えば、カルボキシ基を有するALP活性を有するポリペプチドと、アミノ基を有する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを結合する場合は、このようにしてクロスリンクできる。カルボキシ基を有するALP活性を有するポリペプチドと、カルボキシ基を有する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを結合する場合は、両端にアミノ基を有するクロスリンク試薬を用いてもよい。
キャリブレータは、固体(例えば粉末、結晶、凍結乾燥品など)の形態にあってもよいし、液体(例えば溶液、懸濁液、乳濁液など)の形態にあってもよい。キャリブレータが固体の場合、通常は溶媒に溶解して用いられる。溶媒としては、水性溶媒が好ましく、例えば生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は、中性付近のpH(例えば６以上８以下のpH)で緩衝作用を有する緩衝液が好ましい。そのような緩衝液は、例えばHEPES、MES、PIPESなどのグッド緩衝液、トリス緩衝生理食塩水(TBS)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。
キャリブレータは、添加物を含んでいてもよい。添加物としては、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)などタンパク質安定化剤、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、塩化ナトリウムなどの無機塩類などが挙げられる。
キャリブレータは、一の試薬の形態にあってもよいし、複数の試薬を含む試薬セットの形態にあってもよい。一の試薬の形態であるキャリブレータは、例えば、CD9の細胞外領域とウシ小腸由来ALPとの結合体を収容した一の容器を含む。
キャリブレータが試薬セットである場合、複数のキャリブレータにおける結合体の濃度が互いに異なっている。試薬セットは、例えば、複数のキャリブレータのそれぞれを収容した複数の容器を含む。複数の容器には、互いに異なる濃度で結合体が含まれている。
試薬セットに含まれるキャリブレータの数は特に限定されないが、例えば２、３、４、５、６及び７から選択できる。各キャリブレータにおける結合体の濃度は、特に限定されないが、後述する検量線が好適に作成できることが好ましい。複数のキャリブレータのうち、結合体の濃度が最も低いキャリブレータの結合体濃度は好ましくは１μg/mL以上、より好ましくは1.25μg/mL以上、さらに好ましくは1.50μg/mL以上である。また、当該キャリブレータの結合体濃度は好ましくは10μg/mL以下、より好ましくは５μg/mL以下、さらに好ましくは２μg/mL以下、最も好ましくは1.64μg/mL以下である。結合体の濃度が最も高いキャリブレータは、最も低い濃度の２倍以上1000倍以下の濃度で結合体を含んでもよい。
一の試薬の形態にあるキャリブレータの一例を、図２に示す。図２において１０は、キャリブレータを含むキットを示し、１１は、本実施形態の結合体を含むキャリブレータを収容した第１容器を示し、１２は梱包箱を示し、１３は添付文書を示す。
複数のキャリブレータを含む試薬セットの一例を、図３Ａに示す。図３Ａにおいて２０は、キャリブレータを含むキットを示し、２１は本実施形態の結合体を含むキャリブレータを収容した第１容器を示し、２２は第１容器中のキャリブレータとは異なる濃度の結合体を含むキャリブレータを収容した第２容器を示し、２３は梱包箱を示し、２４は添付文書を示す。
複数のキャリブレータを含む試薬セットの別の一例を、図３Ｂに示す。図３Ｂにおいて３０は、キャリブレータを含むキットを示し、３１は本実施形態の結合体を含むキャリブレータを収容した第１容器を示し、３２は第１容器中のキャリブレータとは異なる濃度の結合体を含むキャリブレータを収容した第２容器を示し、３３は、第１容器中及び第２容器のキャリブレータとは異なる濃度の結合体を含むキャリブレータを収容した第３容器を示し、３４は梱包箱を示し、３５は添付文書を示す。
複数のキャリブレータを含む試薬セットは、キャリブレータ中の結合体や試料中の細胞外小胞を捕捉するための捕捉抗体や、磁性粒子などの固相、ALPの基質などを別途容器に含んでいてもよい。この場合、試薬セットは免疫測定用試薬キットでもある。捕捉抗体や固相、ALPの基質については後述する。また、試薬セットは、結合体を含まない溶液(ネガティブコントロール)を別途容器に含んでいてもよい。
本実施形態の方法では、本実施形態の結合体を含むキャリブレータを用いて、試料中の細胞外小胞に含まれるALPの活性値を取得する。ALPの活性値とは、本実施形態の結合体及び試料中の細胞外小胞のALPと、検出可能なシグナルを発生できる基質との酵素反応に由来するシグナルの測定値又はこれに基づく値であり得る。シグナルの測定値に基づく値は、例えば酵素反応によって生じるシグナルを光学的に測定することによって得られる測定値を、ALP(を含む試料)のタンパク質量で除算した値などが挙げられる。ALPの基質としては、例えばCDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリクシロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ－インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリン酸等の発色基質が挙げられる。このうち、CDP-Starを用いることが好ましい。具体的には、p-ニトロフェニルリン酸を基質とし、ALPによって加水分解されることにより生じるp-ニトロフェノールを光学的に測定することによって得られた測定値と、ALP(を含む試料)のタンパク質量とから求めることができる。
キャリブレータ中の結合体のALPの酵素活性の測定方法としては、例えばイムノアッセイが挙げられる。好ましくは、膜タンパク質と結合可能な捕捉抗体とALPの基質を用いるイムノアッセイである。イムノアッセイの種類は特に限定されず、例えば、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、免疫沈降／ウェスタンブロット法、免疫複合体転移法(特開平１-254868号公報参照)などの公知の免疫測定方法から利用できる。イムノアッセイはHISCL（登録商標）シリーズ(シスメックス株式会社)などの市販の免疫測定装置により行ってもよい。
イムノアッセイにおいて、キャリブレータ中の結合体は、膜タンパク質と特異的に結合する捕捉抗体により捕捉される。結合体と特異的に結合する捕捉抗体とは、自身が固相に固定されることにより、結合体を固相上に捕捉するための抗体をいう。本明細書において「抗体」との用語は、全長の抗体及びそのフラグメントを包含する。抗体のフラグメントとしては、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、軽鎖、重鎖抗体の重鎖可変領域(VHH)、還元型IgG(rIgG)、一本鎖抗体(scFv)などが挙げられる。
捕捉抗体は、結合体中の膜タンパク質に特異的に結合するように選択される。捕捉抗体としては、例えば、抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗アネキシンI抗体、抗アネキシンVI抗体、抗Pit1抗体等が挙げられる。抗CD9抗体としては、例えばClone:H19a, 12A1等が挙げられる。抗CD63抗体としては、例えばClone:H5C6等が挙げられる。抗CD81抗体としては、例えばClone:5A6等が挙げられる。抗アネキシンI抗体としては、例えばClone: EH17a等が挙げられる。抗アネキシンVI抗体としては、例えばClone:E-5等が挙げられる。抗Pit1抗体としては、例えばClone:6A9-F2等が挙げられる。これらのモノクローナル抗体は市販されている。捕捉抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれでもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
キャリブレータ中の結合体と、捕捉抗体とが結合して、免疫複合体が形成される。免疫複合体の形成は、結合体と、捕捉抗体とを混合することにより行うことができる。混合における温度及びインキュベーション時間の条件は、抗原抗体反応に適した条件であれば特に限定されない。そのような条件自体は公知である。例えば、温度は、４℃以上40℃以下、好ましくは20℃以上37℃以下である。インキュベーション時間は、温度に応じて適宜決定できるが、例えば１分以上24時間以下である。10℃以下の低い温度で接触を行う場合は、時間を長くすること(例えば１時間以上)が好ましい。
捕捉抗体は、結合体と免疫複合体を形成した後、固相と接触してキャリブレータ中の免疫複合体を固相上に固定してもよい。あるいは、捕捉抗体を予め固定した固相と、キャリブレータ中の結合体と混合して免疫複合体を固相上に固定してもよい。固相は、捕捉抗体を固定可能な不溶性の担体であればよい。固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えばマイクロプレート、マイクロチューブ、試験管、粒子、膜などが挙げられる。それらの中でも、マイクロプレート及び粒子(特に磁性粒子)が好ましい。
固相と捕捉抗体との結合は、直接的であっても間接的であってもよい。固相と捕捉抗体との直接的な結合としては、例えば、疎水性相互作用による固相表面への吸着又は共有結合が挙げられる。例えば、固相がELISA用マイクロプレートである場合、吸着により捕捉抗体をプレートのウェル内に固定化できる。また、固相が表面に官能基を有する場合、官能基を利用した共有結合により、捕捉抗体を固相表面に固定化できる。例えば、固相がカルボキシ基を有する粒子である場合、粒子表面のカルボキシ基をWSCで活性化し、次いでNHSと反応させてNHSエステルを形成する。そして、NHSエステルを有する粒子と捕捉抗体とを接触させると、NHSエステルと捕捉抗体のアミノ基とが反応して、捕捉抗体が粒子表面に共有結合で固定化される。
固相と捕捉抗体との間接的な結合としては、捕捉抗体に特異的に結合する分子を介した結合が挙げられる。そのような分子を固相表面にあらかじめ固定化しておくことで、捕捉抗体を固相に固定化できる。捕捉抗体に特異的に結合する分子としては、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、捕捉抗体を特異的に認識する抗体(二次抗体)などが挙げられる。また、捕捉抗体と固相との間を介在する物質の組み合わせを用いて、両者を結合することもできる。そのような物質の組み合わせとしては、ビオチン類とアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体などの組み合わせが挙げられる。ビオチン類とは、ビオチン、及びデスチオビオチンなどのビオチン類縁体を含む。アビジン類とは、アビジン、並びにストレプトアビジン及びタマビジン(登録商標)などのアビジン類縁体を含む。例えば、捕捉抗体をビオチンで修飾している場合、アビジン類が固定化された固相によって、捕捉抗体を当該固相に固定化できる。
上記の免疫複合体に含まれるALPの酵素活性を測定する。上述したように、ALPの酵素活性は、例えば、ALPの酵素反応によって生じるシグナルを光学的に測定することによって得ることができる。本明細書において「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナルの強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。「シグナルの強度を半定量的に検出する」とは、シグナル強度を「シグナル発生せず」、「弱」、「強」などのように複数の段階に検出することをいう。シグナルの検出は、シグナルの強度を定量的に検出することが好ましい。
シグナル強度を定量的に検出する場合、シグナル強度の測定値自体又は該測定値から取得される値を、ALPの活性として用いることができる。シグナル強度の測定値から取得される値としては、例えば、該測定値から陰性対照試料の測定値又はバックグラウンドの値を差し引いた値などが挙げられる。陰性対照試料は適宜選択できるが、例えば、結合体を含まない試料などが挙げられる。
免疫複合体の形成及び検出の間に、免疫複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するB/F(Bound/Free)分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、免疫複合体を構成しない成分をいう。例えば、結合体と結合しなかった捕捉抗体などが挙げられる。B/F分離の手段は特に限定されないが、固相が粒子であれば、遠心分離により、免疫複合体を捕捉した固相だけを回収することによりB/F分離ができる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりB/F分離ができる。また、固相が磁性粒子の場合は、磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズルによって未反応の遊離成分を含む液を吸引除去することによりB/F分離ができ、自動化の観点で好ましい。未反応の遊離成分を除去した後、免疫複合体を捕捉した固相をPBSなどの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
キャリブレータ中の結合体の濃度は既知であるため、濃度が異なる複数のキャリブレータを用いてALPの測定値を取得し、取得された測定値を濃度に対してプロットすることで検量線を作成できる。検量線は、例えば、X軸にキャリブレータ中の結合体の濃度をとり、Y軸にALPのシグナル値をとったXY平面に、複数のキャリブレータから取得した結合体の測定値をプロットし、最小二乗法などの公知の方法により直線又は曲線を得ることで作成できる。この検量線に、試料中のALPの測定値を当てはめることで、試料中のALPを含む細胞外小胞の濃度を取得することができる。あるいは、濃度が異なる複数のキャリブレータを用いてALPの測定値を取得し、取得された測定値からキャリブレータの活性値(U/L)を取得する。なお、ユニット(U)とは、1分間に1μmolの基質に作用する酵素量を指す。例えば、キャリブレータのU/Lが1 U/Lであれば、そのキャリブレータ1Lは、1分間に1μmolの基質に作用する酵素量を含んでいることになる。この活性値(U/L)をX軸に、Y軸にALPのシグナル値をとったXY平面に、複数のキャリブレータから取得した結合体の測定値をプロットし、最小二乗法などの公知の方法により直線又は曲線を得ることでも検量線を作成できる。この検量線に、試料中のALPの測定値を当てはめることで、試料中のALPを含む細胞外小胞の活性値(U/L)を取得することができる。
従来、細胞の石灰化に関するハイドロキシアパタイトを含む細胞外小胞（以下、「cEV」ともいう）は、血中には出ないと考えられていた。本発明者らは、このcEVが血中にも存在することを見いだしている。そして、血液中の細胞外小胞の表面に存在するALPの活性値を血管の石灰化の指標として用いることができることを見いだしている。そのため、試料中の細胞外小胞のALPの活性値を標準物質に基づいて測定することが重要である。
本実施形態の方法では、試料に含まれる細胞外小胞を固相上に固定する工程(以下、「第１固定工程ともいう」)と、固定された細胞外小胞と、ALPの基質とを接触させることにより生じるシグナルを測定する工程(以下、「第１測定工程」ともいう)によって試料に含まれる細胞外小胞を測定するとともに、キャリブレータに含まれる結合体を固相上に固定する工程(以下、「第２固定工程」ともいう)と、固定された結合体と、ALPの基質とを接触させることにより生じるシグナルを測定する工程(以下、「第２測定工程」ともいう)によってキャリブレータに含まれる結合体を測定することによって、第１測定工程で得られた測定値及び第２測定工程で得られた測定値から、試料に含まれる細胞外小胞のALPの活性値を取得する。以下に、各工程について説明する。
第１固定工程では、試料と、固相と、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質と結合可能な捕捉抗体とを接触させることにより、試料中の細胞外小胞と捕捉抗体との免疫複合体を固相上に形成する。固相、捕捉抗体については上述の通りである。免疫複合体は、免疫複合体を形成した後に固相に捕捉されてもよいし、予め捕捉抗体と固相とを結合させた後に細胞外小胞と捕捉抗体を接触させて免疫複合体を形成してもよい。
試料は細胞外小胞を含有していれば特に限定されないが、生体試料であることが好ましい。生体試料としては、例えば血液試料（全血、血漿、または血清）、尿、リンパ液、組織液、脳脊髄液、唾液などが挙げられる。これらの中でも、血液試料（全血、血漿、または血清）であることが好ましい。試料に細胞などの不溶性の夾雑物が含まれる場合、遠心分離、ろ過などの公知の手段により、試料から夾雑物を除去してもよい。試料は、必要に応じて適切な水性媒体で希釈してもよい。そのような水性媒体は、後述の測定を妨げないかぎり特に限定されず、例えば水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は上述のキャリブレータに用いる緩衝液を用いることができる。血液試料として血漿を用いる場合、採血時に抗凝固剤を用いてもよい。抗凝固剤としては、例えばEDTAカリウム塩、EDTAナトリウム塩、クエン酸ナトリウム、ヘパリン塩等を使用することができる。
試料は、固相との固定前に前処理されていてもよい。前処理としては、例えば試料の遠心分離やろ過、抗体を用いた免疫沈降などによる夾雑物の除去、水性媒体の添加等が挙げられる。水性媒体については上述の通りである。
第１測定工程では、第１固定工程で固定された細胞外小胞と、ALPの基質を接触させることにより生じるシグナルを測定する。ALPの基質、シグナルの測定については上述の通りである。第１固定工程、第１測定工程は複数の試料に対してそれぞれ行われてもよい。
第２固定工程では、キャリブレータと、固相と、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質と結合可能な捕捉抗体とを接触させることにより、キャリブレータ中の結合体と捕捉抗体との免疫複合体を固相上に形成する。キャリブレータ、結合体、固相、捕捉抗体については上述の通りである。免疫複合体は、免疫複合体を形成した後に固相に捕捉されてもよいし、予め捕捉抗体と固相とを結合させた後に細胞外小胞と捕捉抗体を接触させて免疫複合体を形成してもよい。第１固定工程及び第２固定工程で用いる捕捉抗体は同じものである必要がある。
第２測定工程では、第２固定工程で固定された結合体と、ALPの基質を接触させることにより生じるシグナルを測定する。ALPの基質、シグナルの測定については上述の通りである。
第２固定工程、第２測定工程に用いるキャリブレータは、濃度が異なる複数のキャリブレータであることが好ましい。キャリブレータ中の結合体の濃度は既知であるため、濃度が異なる複数のキャリブレータを用いる場合は、第２固定工程、第２測定工程を複数の濃度を有するキャリブレータに対して行うことでそれぞれ測定値を取得し、測定値から検量線を作成できる。この検量線に第１測定工程で得られたシグナルの測定値を当てはめることで、試料中の細胞外小胞の濃度を算出できる。また、タンパク質濃度と酵素活性の測定値からALPの活性値を取得することができる。
第１固定工程と第１測定工程との組み合わせと、第２固定工程と第２測定工程との組み合わせはどちらが先に行われてもよいし、同時に行われてもよい。すなわち、第１固定工程と第１測定工程を行った後、第２固定工程と第２測定工程を行ってもよいし、第２固定工程と第２測定工程を行った後、第１固定工程と第１測定工程を行ってもよい。あるいは、第１固定工程と第２固定工程をそれぞれ行ってから、第１測定工程と第２測定工程を行ってもよい。
第１固定工程と第１測定工程の間、又は第２固定工程と第２測定工程との間には、免疫複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するB/F分離が行われていてもよい。B/F分離については上述の通りである。
本発明のさらなる実施形態は、ALP活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体である。結合体は、試料中の細胞外小胞に含まれるALPの活性を測定するためのキャリブレータとして用いることができる。結合体については上述の通りである。
本発明のさらなる実施形態は、上記結合体のキャリブレータとしての使用である。当該結合体をキャリブレータとして用いることにより、試料中の細胞外小胞に含まれるALPの活性値を得ることができる。結合体、試料については上述の通りである。
本発明のさらなる実施形態は、試料中の細胞外小胞の濃度に関する情報を取得する方法であって、ALP活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体を含むキャリブレータを用いて、試料中の細胞外小胞に含まれるALPの酵素活性の測定値を取得することを含む、細胞外小胞の濃度に関する情報を取得する方法である。細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体を含むキャリブレータを用い、キャリブレータ中の結合体のタンパク質濃度とALPの酵素活性を測定し、タンパク質濃度と酵素活性の測定値から、試料中の細胞外小胞の濃度に関する情報を取得することができる。例えば、複数のキャリブレータからそれぞれタンパク質濃度とALPの酵素活性の測定値を取得し、タンパク質濃度と酵素活性の測定値に基づいて検量線を作成し、これに試料の測定値を当てはめることで、試料中の細胞外小胞の濃度を計算することができる。この場合、細胞外小胞の濃度に関する情報とは、試料中の細胞外小胞の濃度そのものである。
本実施形態の方法は、市販の免疫測定装置により行ってもよい。免疫測定装置としては、例えばHISCL(登録商標)-5000、HISCL-2000i、HI-1000 (いずれもシスメックス株式会社製)などが挙げられる。例示的な免疫測定装置の構成を示すブロック図を図４に示す。
免疫測定装置１は、測定部４０と、分析部５０を備える。
測定部４０は、制御部４１と、記憶部４２と、通信部４３と、測定機構部４４と、検出部４５とを備えている。
制御部４１は、例えば、CPU及びその周辺回路を備えて構成される。制御部４１は、測定部４０の各部及び測定機構部４４の動作を、各々の機能に応じて制御する。
記憶部４２は、制御部４１が測定部４０の各部を制御するための各種のプログラム及び各種のデータ等を記憶するハードディスクを備える。
通信部４３は、制御部４１の制御に従って、外部機器との間でデータの入出力を行う。通信部４３は、例えば、イーサネット（登録商標）、及びIEEE1394等の任意の通信規格を用いたインタフェース回路を備えて構成される。
測定機構部４４は、試薬を保持する試薬保持部４４１と、試薬保持部４４１に保持された試薬と測定対象（試料又はキャリブレータ）を反応容器に分注する分注部４４２と、上述したBF分離処理を実行するBF分離部４４３と、反応容器を加温して細胞外小胞又は結合体と試薬との反応を促進する反応部４４４と、を主な構成として備える。
検出部４５は、反応容器中の細胞外小胞又は結合体のALPが基質と接触することによって生じるシグナルを検出し、シグナルに応じたシグナル値を出力する。
分析部５０は、制御部５１と、通信部５２と、記憶部５３と、表示部５４と、入力部５５とを主な構成として備えている。
制御部５１は、分析部５０の各部の動作を、各々の機能に応じて制御する。制御部５１は、例えば、CPU及びその周辺回路を備えて構成される。
通信部５２は、制御部５１の制御に従って、測定部４０の通信部４３を含む外部機器との間でデータの入出力を行う回路である。通信部５２は、例えば、イーサネット（登録商標）、及びIEEE1394等の任意の通信規格を用いたインタフェース回路等を備えて構成される。
記憶部５３は、制御部５１が実行するプログラム及び各種のデータ等を記憶する。記憶部５３は、記憶部４２と同様にハードディスクを備えて構成される。
表示部５４は、液晶ディスプレイ又は有機ＥＬディスプレイ等の表示装置を備えるタッチパネル式のディスプレイである。
入力部５５は、検量線の作成を指示するコマンド等の各種のコマンド、及び、検体分析装置１を動作させる上で必要な各種のデータ等を、検体分析装置１に入力する機器である。入力部５５は、キーボード、マウスまたはタッチパネルなどのポインティングデバイス、及び、所定の機能が割り当てられた複数の入力スイッチ等を備えて構成される。
図５は、免疫測定装置１を用いた測定方法の一例を示すフローチャートである。ステップS1において、制御部４１は、キャリブレータ測定工程を実行する。キャリブレータ測定工程では、制御部４１は、測定機構部４４を制御して、キャリブレータに含まれる結合体を固相上に固定し、固相上に固定された結合体とALPの基質とを接触させる。この工程では、制御部４１が、分注部４４２に、試薬保持部４４１に保持された試薬とキャリブレータを反応容器に分注させる。試薬保持部４４１に保持された試薬は、例えば捕捉抗体を含む捕捉抗体試薬と、磁性粒子からなる固相を含む固相試薬と、ALPの化学発光基質を含む基質溶液を含む。まず、制御部４１は、分注部４４２に、捕捉抗体試薬と固相試薬とキャリブレータを反応容器に分注させる。これによりキャリブレータに含まれる結合体と捕捉抗体の複合体が固相上に形成される。制御部４１は、BF分離部４４３に、反応容器中の未反応成分を除去させる。次に、制御部４１は、分注部４４２に、基質溶液を反応容器に分注させる。これにより、固相上の結合体とALPの基質とが接触する。反応容器は反応部４４４によって所定時間加温される。次いで、制御部４１は、結合体とALPとが接触することにより生じるシグナルを検出部４５に検出させる。検出部４５は検出されたシグナルに応じたシグナル値を出力し、制御部４１は出力されたシグナル値を記憶部４２に記憶する。制御部４１は、記憶部４２に記憶されたシグナル値を通信部４３を介して分析部５０に送信する。制御部５１は、通信部５２を介して受信したシグナル値を記憶部５３に記憶する。ステップＳ１の処理は、測定部４０に供給されたキャリブレータの数だけ繰り返される。
ステップＳ２において、制御部５１は、検量線作成工程を実行する。検量線作成工程では、制御部５１が、測定部４０から受信し記憶部５３に記憶したシグナル値に基づいて検量線を作成する。検量線の作成方法は上述のとおりである。制御部５１は、作成した検量線を記憶部５３に記憶する。
ステップＳ３において、制御部４１は、試料測定工程を実行する。試料測定工程では、制御部４１は、ステップＳ１において述べた処理と同様に測定機構部４４を制御することで、試料に含まれる細胞外小胞を固相上に固定し、固相上に固定された細胞外小胞とALPの基質とを接触させる。制御部４１は、細胞外小胞とALPとが接触することにより生じるシグナルを、検出部４５に検出させる。検出部４５は検出されたシグナルに応じたシグナル値を出力し、制御部４１は出力されたシグナル値を記憶部４２に記憶する。制御部４１は、記憶部４２に記憶されたシグナル値を通信部４３を介して分析部５０に送信する。制御部５１は、通信部５２を介して受信したシグナル値を記憶部５３に記憶する。
ステップＳ４において、制御部５１は、ALP活性値取得工程を実行する。この工程では、制御部５１は、記憶部５３に記憶された検量線に、試料から得られたシグナル値を適用することにより、試料中の細胞外小胞のALPの活性値を取得する。制御部５１は、得られたALP活性値を記憶部５３に記憶する。
ステップＳ５において、制御部５１は、分析結果表示工程を実行する。制御部５１は、試料測定の結果として、記憶部５３に記憶されたALP活性値を表示部５４に表示する。
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
細胞外小胞由来の膜タンパク質と、ALPとを結合させた結合体を以下のようにして調製し、その性質を評価した。
細胞外小胞由来の膜タンパク質と、ALPとを結合させた結合体を以下のようにして調製し、その性質を評価した。
[CD9(ECD)-ALPを含むキャリブレータの調製]
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてCD9 Protein, Human, Recombinant (His Tag), 11029-H08H, Sino Biological社を用いた。以下、このポリペプチドを「CD9(ECD)」とも呼ぶ。CD9(ECD)はCD9の細胞外領域から構成された組換えタンパク質であった。CD9(ECD)のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてCD9 Protein, Human, Recombinant (His Tag), 11029-H08H, Sino Biological社を用いた。以下、このポリペプチドを「CD9(ECD)」とも呼ぶ。CD9(ECD)はCD9の細胞外領域から構成された組換えタンパク質であった。CD9(ECD)のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
ALP活性を有するポリペプチドとして、ウシ小腸由来ALPのALP(HighSpecific Activity)(オリエンタル酵母社)を用いた。以下、このポリペプチドを「BIAP」とも呼ぶ。CD9(ECD)とBIAPとを、リンカーを介する共有結合により結合させて、結合体(CD9(ECD)-ALP)を含むキャリブレータを得た。具体的には、以下の通りであった。
(i) CD9(ECD)の還元
NAP5を用いて0.25 mg/mLの濃度のCD9(ECD) 200μLを還元処理用緩衝液(pH 6.0、100mM リン酸ナトリウム、150 mM NaCl及び 1mM EDTA)で液置換し、CD9(ECD)溶液を調製した。2-メルカプトエチルアミン(MEA)を濃度が350mMになるように還元処理用緩衝液に加え、MEA溶液を調製した。200μLの上記CD9(ECD)溶液にMEAの終濃度が35mMになるようにMEA溶液をCD9(ECD)溶液に加え、37℃で60分間反応させCD9(ECD)を還元した。反応後の混合液を脱塩カラムに供し、CD9(ECD)を回収した。
NAP5を用いて0.25 mg/mLの濃度のCD9(ECD) 200μLを還元処理用緩衝液(pH 6.0、100mM リン酸ナトリウム、150 mM NaCl及び 1mM EDTA)で液置換し、CD9(ECD)溶液を調製した。2-メルカプトエチルアミン(MEA)を濃度が350mMになるように還元処理用緩衝液に加え、MEA溶液を調製した。200μLの上記CD9(ECD)溶液にMEAの終濃度が35mMになるようにMEA溶液をCD9(ECD)溶液に加え、37℃で60分間反応させCD9(ECD)を還元した。反応後の混合液を脱塩カラムに供し、CD9(ECD)を回収した。
(ii) ALPのマレイミド化
NAP5を用いて10mg/mLの濃度のALP100μLをマレイミド化用緩衝液(pH 7.0、100mM TEA、150 mM NaCl及び1mM MgCl2、0.1 mM ZnCl2)で液置換し、ALP溶液を調製した。N-(6-マレイミド カプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)をN, N-ジメチルホルムアミド(DMF)に5mg/mLとなるように加え、EMCS溶液を調製した。ALP溶液に、ALPとEMCSのモル比がALP:EMCS=1:10となるようにEMCS溶液を混合し、37℃で60分間反応させALPをマレイミド化した。反応後の混合液を脱塩カラムに供し、ALPを回収した。
NAP5を用いて10mg/mLの濃度のALP100μLをマレイミド化用緩衝液(pH 7.0、100mM TEA、150 mM NaCl及び1mM MgCl2、0.1 mM ZnCl2)で液置換し、ALP溶液を調製した。N-(6-マレイミド カプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)をN, N-ジメチルホルムアミド(DMF)に5mg/mLとなるように加え、EMCS溶液を調製した。ALP溶液に、ALPとEMCSのモル比がALP:EMCS=1:10となるようにEMCS溶液を混合し、37℃で60分間反応させALPをマレイミド化した。反応後の混合液を脱塩カラムに供し、ALPを回収した。
(iii) CD9(ECD)とALPの結合
上記(i)の還元処理後のCD9(ECD) 70μl（CD9(ECD)濃度0.24mg/mL）と、(ii)のマレイミド化ALP 70μL(ALP濃度 3.24mg/mL)とを混合し、4℃で一晩置いてCD9(ECD)とALPを結合させCD9(ECD)-ALPを調製した。このCD9(ECD)-ALPを、カラムとしてSuperdex 200(Cytiva社)を用いたACTA(登録商標) FPLC(Cytiva社)によるゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。
上記(i)の還元処理後のCD9(ECD) 70μl（CD9(ECD)濃度0.24mg/mL）と、(ii)のマレイミド化ALP 70μL(ALP濃度 3.24mg/mL)とを混合し、4℃で一晩置いてCD9(ECD)とALPを結合させCD9(ECD)-ALPを調製した。このCD9(ECD)-ALPを、カラムとしてSuperdex 200(Cytiva社)を用いたACTA(登録商標) FPLC(Cytiva社)によるゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。
分画結果を図６に示す。回収された各画分の内、図６のFraction 1から後述するALP活性が得られたので、この画分を以後の実験に用いた。このようにして、CD9(ECD)-ALPを含むキャリブレータを得た。なお、図６中のFraction 2の画分からも後述するALP活性が得られているので、Fraction 2もCD9(ECD)-ALPを含むキャリブレータとして使用可能であると考えられた。
(ALP活性の測定)
実施例１の結合体について、HI-1000を用いて、ALP活性を測定した。ALP活性測定のためのR1試薬(捕捉抗体試薬)は以下のようにして調製した。
実施例１の結合体について、HI-1000を用いて、ALP活性を測定した。ALP活性測定のためのR1試薬(捕捉抗体試薬)は以下のようにして調製した。
捕捉抗体としては、市販品の抗CD9抗体(Clone:H19aを用いた。捕捉抗体に、EDTA濃度が1 mMになるように0.1 M EDTA溶液(pH6.0)を加えて捕捉抗体溶液を準備した。この捕捉抗体溶液に、0.3 M 2-メルカプトエチルアミン(MEA)溶液を添加して、37℃で60分間静置することで抗体のジスルフィド結合を還元した。AmiconUltra 30Kを用いてゲルろ過用緩衝液に置換した。Biotin-PEAC5-Maleimideを585.16g/molとなるようにDMSOに加え、さらにゲルろ過用緩衝液で5倍希釈した。還元化した抗体溶液に、抗体とBiotinのモル比が抗体:Biotin=1:10となるようにBiotin溶液を混合し、4℃で一晩反応させた。翌日AmiconUltra 30Kを用いてPBSに置換し、ビオチン抗体保存緩衝液を添加してビオチン標識抗体溶液とした。このビオチン標識捕捉抗体溶液を、以下の表１の組成のR1試薬用緩衝液に抗体濃度が1μg/mLの濃度となるように添加してR1試薬とした。対照として、捕捉抗体を含めないR1溶液も調製した。
R2試薬(固相)として、ストレプトアビジン結合磁性粒子を含むHISCL R2試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R4試薬(測定用緩衝液)として、HISCL R4試薬(シスメックス株式会社)からレバミゾールを除いたものを用いた。R5試薬(基質溶液)として、ALPの化学発光基質であるCDP-star(商標)(アプライドバイオシステムズ社)を含むHISCL R5試薬(シスメックス株式会社)を用いた。
上記試薬を用いてHI-1000により測定を行った。この測定は、磁性粒子上でのサンドイッチELISAをベースとしている。具体的な操作は、次のとおりである。R1試薬(110μL)に各結合体(20μL)を加えて混合した後、R2試薬(30μL)を加えて混合した。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した。上清を除き、磁性粒子にR4試薬(50μL)及びR5試薬(100μL)を添加し、よく混合して、化学発光強度を測定した。測定は、結合体毎に3回行い、その平均をとった。対照として、捕捉抗体を含まないR1溶液に対しても同様に処理して測定を行った。
測定結果を図７に示す。図７に示されるように、CD9(ECD)-ALP結合体から抗体依存的なシグナルが取得できることが分かった。よって、CD9(ECD)-ALPを標準物質として使用できることが示された。
(キャリブレータとしての評価)
作成したCD9(ECD)-ALP結合体の性質を評価した。キャリブレータの値付けは、石灰化細胞に由来するcEVのALPによって行った。石灰化細胞からの石灰化細胞外小胞の調製は以下のプロセスによって行った。
作成したCD9(ECD)-ALP結合体の性質を評価した。キャリブレータの値付けは、石灰化細胞に由来するcEVのALPによって行った。石灰化細胞からの石灰化細胞外小胞の調製は以下のプロセスによって行った。
(石灰化誘導細胞の調製)
ヒト骨肉腫由来細胞株Saos-2細胞(以下Saos-2細胞)の石灰化を誘導し、石灰化細胞を調製した。Saos-2細胞は特定の培養条件において骨芽細胞様細胞への骨分化を行うことができ、その細胞外小胞はALPを含むことが知られている。Saos-2細胞は理化学研究所バイオリソース研究センター(RIKEN BRC)より購入した。細胞はRIKEN BRCの培養方法に従い、15% FBSを添加したMcCoy's 5A培地 (シグマアルドリッチ)を用いて、5% CO2、37℃で培養した。
ヒト骨肉腫由来細胞株Saos-2細胞(以下Saos-2細胞)の石灰化を誘導し、石灰化細胞を調製した。Saos-2細胞は特定の培養条件において骨芽細胞様細胞への骨分化を行うことができ、その細胞外小胞はALPを含むことが知られている。Saos-2細胞は理化学研究所バイオリソース研究センター(RIKEN BRC)より購入した。細胞はRIKEN BRCの培養方法に従い、15% FBSを添加したMcCoy's 5A培地 (シグマアルドリッチ)を用いて、5% CO2、37℃で培養した。
Saos-2細胞を、10% FBSを添加したαMEM培地(GIBCO)に移し、コンフルエントになるまで培養した。そして、石灰化誘導用培地（10% FBS、10 mM HEPES (ナカライテスク)、50μg/mL アスコルビン酸2リン酸(シグマアルドリッチ)及び1.8 mMリン酸2水素カリウム(富士フィルム和光純薬)を含むαMEM培地）に交換し、14日間培養して骨芽細胞様細胞への形質転換を誘導した。石灰化誘導用培地に交換してから10日目まで培地は2-3日に1回交換し、10日目から14日目まで同一培地で培養した。培養後、Saos-2細胞及び培養上清を回収した。回収したSaos-2細胞を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いて10分間4℃で固定した。固定したSaos-2細胞をPBSで3回洗浄し、50 mM Alizarin Red (pH 4.2)を用いて室温で10分間、Alizarin Red染色を行い、骨芽細胞様細胞への形質転換を確認した。
(cEVの調製)
Saos-2細胞の培養上清を遠心分離機に供し、300gで10分間、さらに2,000gで10分間遠心して上清を回収した。この上清を超遠心チューブに移し、100,000g、20分間の遠心を行った。遠心後、超遠心チューブ内の沈殿を採取し、25 mMトレハロースを含むリン酸緩衝液に懸濁することにより、cEVを含む試料（以下、「cEV試料」ともいう）を調製した。cEV試料は－80℃で保存した。
Saos-2細胞の培養上清を遠心分離機に供し、300gで10分間、さらに2,000gで10分間遠心して上清を回収した。この上清を超遠心チューブに移し、100,000g、20分間の遠心を行った。遠心後、超遠心チューブ内の沈殿を採取し、25 mMトレハロースを含むリン酸緩衝液に懸濁することにより、cEVを含む試料（以下、「cEV試料」ともいう）を調製した。cEV試料は－80℃で保存した。
(タンパク質濃度の値付け)
cEV試料を用いてCD9(ECD)-ALP結合体のタンパク質濃度の値付けを行った。まず、上述したcEV試料の吸光度(A280)を測定し、タンパク質濃度(ng/mL)を定量した。そして、上記のR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000によりcEV試料を測定し、カウント値を取得した。
cEV試料を用いてCD9(ECD)-ALP結合体のタンパク質濃度の値付けを行った。まず、上述したcEV試料の吸光度(A280)を測定し、タンパク質濃度(ng/mL)を定量した。そして、上記のR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000によりcEV試料を測定し、カウント値を取得した。
CD9(ECD)-ALP結合体及びcEV試料を、以下の表２の組成のキャリブレータ用希釈液に懸濁した。以下、このキャリブレータ用希釈液に懸濁した状態の溶液を、それぞれの溶液の原液と呼ぶ。さらに、それらの一部をキャリブレータ用希釈液で希釈して、種々の希釈溶液を調製した。調製した各希釈溶液に対して、HI-1000を用い上記と同様にALP活性の測定を行い、カウント値を取得した。
得られたcEV試料のカウント値及びタンパク質濃度の対応関係から、CD9(ECD)-ALP結合体についても、cEV試料と同じカウント値であれば、同じタンパク質濃度を有していると見なしてCD9(ECD)-ALP結合体のタンパク質濃度を算出した。
CD9(ECD)-ALP結合体原液の一部を分取し、上記キャリブレータ用希釈液を用いて重量法に基づいて希釈し、9種類の1次キャリブレータ(C0、C0.5、C1、C1.5、C2、C3、C4、C5、C6。C0はキャリブレータ用希釈液のみ)を調製した。1次キャリブレータは、原液のタンパク質濃度から希釈率に応じてタンパク質濃度をそれぞれ計算した。結果を表３に示す。これらの1次キャリブレータのタンパク質濃度の濃度範囲を参考に、CD9(ECD)-ALP結合体原液の一部を、再度キャリブレータ用希釈液を用いて希釈し、6種類の2次キャリブレータ(C0、C1、C2、C3、C4、C5。C0はキャリブレータ用希釈液のみ)を調製した。6種の2次キャリブレータのタンパク質濃度(ng/mL)を以下の表４に示す。表４の通り、２次キャリブレータのタンパク質濃度はC0からC5にかけて段階的に異なっていた。
(ALP活性値の値付け)
CD9(ECD)-ALP結合体の2次キャリブレータC0～C5に対して、生化学ALP測定を行った。測定装置としては、日立自動分析装置 7180 (株式会社日立ハイテク)を用い、測定試薬としてイアトロ(登録商標)ALP-IF R1/R2(LSIメディエンス社)を、キャリブレータとして酵素キャリブレータープラス(シスメックス株式会社)を用いた。測定結果を以下の表５に示す。表５のとおり、２次キャリブレータのALP活性値はC0からC5にかけて段階的に異なっていた。
CD9(ECD)-ALP結合体の2次キャリブレータC0～C5に対して、生化学ALP測定を行った。測定装置としては、日立自動分析装置 7180 (株式会社日立ハイテク)を用い、測定試薬としてイアトロ(登録商標)ALP-IF R1/R2(LSIメディエンス社)を、キャリブレータとして酵素キャリブレータープラス(シスメックス株式会社)を用いた。測定結果を以下の表５に示す。表５のとおり、２次キャリブレータのALP活性値はC0からC5にかけて段階的に異なっていた。
(キャリブレータを活用した検体試料の測定)
CD9(ECD)-ALP結合体を活用して、検体試料の測定を行った。
(i) タンパク質濃度の検量線の作成
タンパク質濃度を値付けしたCD9(ECD)-ALP結合体の１次キャリブレータC0～C5に対して、抗CD9抗体を用いて調製したR1試薬を含む上記R1、R2、R4及びR5試薬と、HI-1000を用いて測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線1)を作成した。測定結果を表６及び図８に示した。表中、avは平均値を示し、sdは標準偏差を示し、cvは変動係数を示す。表６、図８より、タンパク質濃度を値付けしたCD9(ECD)-ALP結合体の１次キャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
CD9(ECD)-ALP結合体を活用して、検体試料の測定を行った。
(i) タンパク質濃度の検量線の作成
タンパク質濃度を値付けしたCD9(ECD)-ALP結合体の１次キャリブレータC0～C5に対して、抗CD9抗体を用いて調製したR1試薬を含む上記R1、R2、R4及びR5試薬と、HI-1000を用いて測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線1)を作成した。測定結果を表６及び図８に示した。表中、avは平均値を示し、sdは標準偏差を示し、cvは変動係数を示す。表６、図８より、タンパク質濃度を値付けしたCD9(ECD)-ALP結合体の１次キャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
検量線1に対して上記測定で得られたカウント値を適用して得られるタンパク質濃度を、以下の表７に示した。表７より、カウント値を検量線1に当てはめて取得したタンパク質濃度の値が、表６に示したタンパク質濃度の値とほぼ同じであることがわかる。これらのことから、CD9(ECD)-ALP結合体を用いて検量線を作成でき、この結合体をキャリブレータとして用い得ることが示された。
(ii) ALP活性値の検量線の作成
ALP活性値を値付けしたCD9(ECD)-ALP結合体の2次キャリブレータC0～C5に対して、抗CD9抗体を用いて調製したR1試薬を含む上記R1、R2、R4及びR5試薬と、HI-1000を用いて測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線2)を作成した。測定結果を表８及び図９に示した。表８、図９より、ALP活性値を値付けしたCD9(ECD)-ALP結合体の2次キャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
ALP活性値を値付けしたCD9(ECD)-ALP結合体の2次キャリブレータC0～C5に対して、抗CD9抗体を用いて調製したR1試薬を含む上記R1、R2、R4及びR5試薬と、HI-1000を用いて測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線2)を作成した。測定結果を表８及び図９に示した。表８、図９より、ALP活性値を値付けしたCD9(ECD)-ALP結合体の2次キャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
検量線2に対して上記測定で得られたカウント値を適用して得られるALP活性値を以下の表９に示した。表９のcEVは、cEV試料のタンパク質濃度を500ng/ml(吸光度A280に基づく)に調製した試料に対しても同様に行った結果を指す。表８より、カウント値を検量線2に当てはめて取得したALP活性値の値が、表８に示したALP活性値の値とほぼ同じであることがわかる。これらのことから、CD9(ECD)-ALP結合体を用いて検量線を作成でき、この結合体をキャリブレータとして用い得ることが示された。
(iii) 検体試料を用いたタンパク質濃度の定量
実際の検体試料を用い、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。検体試料には、心血管疾患既往患者の血漿検体試料(6検体)を用いた。実験は、凍結された各検体試料を解凍後、キャリブレータ用希釈液で4倍希釈した試料に対して行った。調製した各検体試料に、上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各検体試料に対して3度行った。得られた各測定値を上記検量線1に当てはめて検体試料中に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。測定結果を図１０に示した。図１０より、血漿検体試料中のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のタンパク質濃度を、CD9(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
実際の検体試料を用い、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。検体試料には、心血管疾患既往患者の血漿検体試料(6検体)を用いた。実験は、凍結された各検体試料を解凍後、キャリブレータ用希釈液で4倍希釈した試料に対して行った。調製した各検体試料に、上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各検体試料に対して3度行った。得られた各測定値を上記検量線1に当てはめて検体試料中に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。測定結果を図１０に示した。図１０より、血漿検体試料中のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のタンパク質濃度を、CD9(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
(iv) 検体試料を用いたALP活性値の定量
上記(iii)で得られたカウント値を、検量線2に当てはめることで、各検体試料のALP活性値を算出した。その結果を図１１に示した。図１１より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のALP活性値を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のALP活性値を、CD9(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
上記(iii)で得られたカウント値を、検量線2に当てはめることで、各検体試料のALP活性値を算出した。その結果を図１１に示した。図１１より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のALP活性値を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のALP活性値を、CD9(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
(v) 健常人の血漿検体との比較
健常人の血漿検体試料(5検体)についても、上記(iii)と同様の方法により検体試料に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を求めた。その結果を図１２に示した。図１２には上述した心血管疾患既往患者のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度についても記載している。図１２より、心血管疾患既往患者において、健常人に比べてALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度が増加していることが分かる。このように、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度の検体間の比較を、本発明の結合体をキャリブレータとして用いて行い得ることが示された。
健常人の血漿検体試料(5検体)についても、上記(iii)と同様の方法により検体試料に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を求めた。その結果を図１２に示した。図１２には上述した心血管疾患既往患者のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度についても記載している。図１２より、心血管疾患既往患者において、健常人に比べてALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度が増加していることが分かる。このように、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度の検体間の比較を、本発明の結合体をキャリブレータとして用いて行い得ることが示された。
(自動測定法と用手法による測定の比較)
上述した心血管疾患既往患者の血漿検体試料及び健常人の血漿検体試料に対して、HI-1000の代わりにELISA法を用いた用手法によってALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。ELISA法は、以下のようにして行った。
上述した心血管疾患既往患者の血漿検体試料及び健常人の血漿検体試料に対して、HI-1000の代わりにELISA法を用いた用手法によってALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。ELISA法は、以下のようにして行った。
96ウェルプレート(Nunc, high binding ELISA plate, #436110)を50 mM Tris-HCl (pH7.5)で2回洗浄した。上記抗CD9抗体を、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)で5μg/mLの濃度に調整した。この抗体溶液を96ウェルプレートに50μL/wellで添加し、4℃で一晩静置して抗体をウェルに固定化した。プレートから抗体溶液を除去した後、5 mMリン酸緩衝液で3回洗浄した。洗浄後、以下の表１０の組成のブロッキング用の緩衝液を200μL/wellずつ添加し、室温で2時間30分間、600rpmのシェーカーで撹拌しながらインキュベートしてブロッキングした。ブロッキング後、溶液を除去し、キャリブレータ用希釈液で2倍希釈した各血漿試料を100μL/wellの量で加え、室温で2時間、600 rpmでインキュベートして抗原抗体反応を行った。反応後のウェル中の溶液を廃棄後、HISCL洗浄液を300μL/well用いて、各ウェルを6回洗浄した。洗浄後、100μL/wellのR5試薬を添加し、室温で20分間インキュベートしてからプレートリーダー(TECAN, Infinite Pro200)で化学発光を検出し、ALP活性測定を行った。
心血管疾患既往患者の血漿検体試料及び健常人の血漿検体試料に対するHI-1000での測定結果を検量線1に当てはめて得られたタンパク質濃度をY軸、ELISAによる測定結果をX軸としてプロットしたものを図１３に示した。図１３より、自動測定法と用手法による測定には高い相関関係があることがわかり、本発明のキャリブレータを自動測定法と用手法のいずれにも使用可能であることが示された。
[CD9(ECD)-ALP結合体の安定性試験]
CD9(ECD)-ALP結合体の9種の1次キャリブレータ(C0、C0.5、C1、C1.5、C2、C3、C4、C5、C6)を分注してそれぞれ-80℃で保存し、1日、5日、7日、26日経過後にそれぞれ解凍し、各キャリブレータを、R1試薬を含む上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各キャリブレータに対して3度行った。測定結果を表１１に示す。表１１において1日目の測定結果を100%としている。比較として、cEV試料をキャリブレータ用希釈液で希釈した試料についても同様に行った。その結果を表１２に示した。表１２において0日目の測定結果を100%としている。表１１、１２より、1次キャリブレータは保存によってカウント値に大きな変動がないのに対し、cEV試料をキャリブレータ用希釈液で希釈した試料は保存によりカウント値が大きく変動することが示された。このことから、CD9(ECD)-ALP結合体は高い安定性を有していることが分かり、キャリブレータとして優れていることが分かる。
CD9(ECD)-ALP結合体の9種の1次キャリブレータ(C0、C0.5、C1、C1.5、C2、C3、C4、C5、C6)を分注してそれぞれ-80℃で保存し、1日、5日、7日、26日経過後にそれぞれ解凍し、各キャリブレータを、R1試薬を含む上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各キャリブレータに対して3度行った。測定結果を表１１に示す。表１１において1日目の測定結果を100%としている。比較として、cEV試料をキャリブレータ用希釈液で希釈した試料についても同様に行った。その結果を表１２に示した。表１２において0日目の測定結果を100%としている。表１１、１２より、1次キャリブレータは保存によってカウント値に大きな変動がないのに対し、cEV試料をキャリブレータ用希釈液で希釈した試料は保存によりカウント値が大きく変動することが示された。このことから、CD9(ECD)-ALP結合体は高い安定性を有していることが分かり、キャリブレータとして優れていることが分かる。
[CD9(ECD)-ALP結合体の測定再現性]
CD9(ECD)-ALP結合体の2次キャリブレータC0、C1、C2及びC3に対して、R1試薬を含む上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得し、タンパク質濃度(ng/mL)を算出した。各試料に対して、測定を10回行い、変動係数(CV)を算出した。結果を表１３に示す。表１３より、CD9(ECD)-ALP結合体によるキャリブレータは連続して測定してもCVの値が低いことが分かる。
CD9(ECD)-ALP結合体の2次キャリブレータC0、C1、C2及びC3に対して、R1試薬を含む上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得し、タンパク質濃度(ng/mL)を算出した。各試料に対して、測定を10回行い、変動係数(CV)を算出した。結果を表１３に示す。表１３より、CD9(ECD)-ALP結合体によるキャリブレータは連続して測定してもCVの値が低いことが分かる。
また、複数個に小分け分注し－80℃で保存したCD9(ECD)-ALP結合体の2次キャリブレータC0～C5対して、R1試薬を含む上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定するサンプルは、小分けした複数のサンプルからランダムに3つ選択して解凍し行った。結果を表１４に示す。表１４より、CD9(ECD)-ALP結合体によるキャリブレータはサンプル間の誤差が小さいことが分かる。
これらのことから、CD9(ECD)-ALP結合体によるキャリブレータは、測定試料として高い安定性を有しているため、キャリブレータとして優れていることが分かる。
これらのことから、CD9(ECD)-ALP結合体によるキャリブレータは、測定試料として高い安定性を有しているため、キャリブレータとして優れていることが分かる。
実施例２
[CD9(FL) -ALP結合体をキャリブレータとして用いたALPを含む細胞外小胞の測定]
CD9(FL)-ALP結合体を調製して、検体試料の測定を行った。
[CD9(FL) -ALP結合体をキャリブレータとして用いたALPを含む細胞外小胞の測定]
CD9(FL)-ALP結合体を調製して、検体試料の測定を行った。
[CD9(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてRecombinant Human CD9 protein (Tagged), ab152262, labcam社を用いた。以下、このポリペプチドを「CD9(FL)」とも呼ぶ。CD9(FL)はCD9の全領域から構成された組換えタンパク質であった。CD9(FL)のアミノ酸配列を配列番号２に示した。ALPとして実施例１と同様のBIAPを用いた。CD9(FL)とBIAPとを、リンカーを介する共有結合により結合させて、結合体(CD9(FL)-ALP)を含むキャリブレータを得た。CD9(FL)とBIAPとの結合には、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH(同仁化学社)を用いた。
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてRecombinant Human CD9 protein (Tagged), ab152262, labcam社を用いた。以下、このポリペプチドを「CD9(FL)」とも呼ぶ。CD9(FL)はCD9の全領域から構成された組換えタンパク質であった。CD9(FL)のアミノ酸配列を配列番号２に示した。ALPとして実施例１と同様のBIAPを用いた。CD9(FL)とBIAPとを、リンカーを介する共有結合により結合させて、結合体(CD9(FL)-ALP)を含むキャリブレータを得た。CD9(FL)とBIAPとの結合には、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH(同仁化学社)を用いた。
CD9(FL) -ALP結合体に対して、上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は、結合体毎に3回行い、その平均をとった。対照として、捕捉抗体を含まないR1溶液に対しても同様に処理して測定を行った。
測定結果を図１４に示す。図１４に示されるように、CD9(FL) -ALP結合体から抗体依存的なシグナルが取得できることが分かった。よって、CD9(FL) -ALPが標準物質として使用できることが示された。
CD9(FL)-ALP結合体に対して、キャリブレータ用希釈液を用いて調製した希釈溶液について吸光度(A280)を測定し、タンパク質濃度(ng/mL)を定量した。結果を以下の表１５に示す。
(i) タンパク質濃度の検量線の作成
上記のようにタンパク質濃度を測定したCD9(FL)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5に対して、上記のR1、R2、R4及びR5試薬と、HI-1000を用いて測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線3)を作成した。測定結果を表１６及び図１５に示した。表１６、図１５より、CD9(FL)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
上記のようにタンパク質濃度を測定したCD9(FL)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5に対して、上記のR1、R2、R4及びR5試薬と、HI-1000を用いて測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線3)を作成した。測定結果を表１６及び図１５に示した。表１６、図１５より、CD9(FL)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
検量線3に対して上記測定で得られたカウント値を適用して得られるタンパク質濃度を、以下の表１７に示した。表１７より、カウント値を検量線3に当てはめて取得したタンパク質濃度の値が、表６に示したタンパク質濃度の値とほぼ同じであることがわかる。これらのことから、CD9(FL)-ALP結合体を用いて検量線を作成でき、この結合体をキャリブレータとして用い得ることが示された。
(ii) ALP活性値の検量線の作成
CD9(FL)-ALP結合体について、生化学ALP測定によってALP活性値を値付けし、上記と同様にして検量線を作成した。ALP活性値の値付けは次のようにして行った。
CD9(FL)-ALP結合体について、生化学ALP測定によってALP活性値を値付けし、上記と同様にして検量線を作成した。ALP活性値の値付けは次のようにして行った。
CD9(FL)-ALP結合体のキャリブレータC5に対して、生化学ALP測定を行った。測定は、CD9(ECD)-ALP結合体に対するALP活性値の値付けと同様に、測定装置として日立自動分析装置 7180を用い、測定試薬としてイアトロ(登録商標)ALP-IF R1/R2を用い、キャリブレータとして酵素キャリブレータープラスを用いた。得られた測定結果によってキャリブレータC5をALP活性値で値付けした。C0～C4のキャリブレータは、測定試薬の測定範囲の下限以下の活性値であったため、C5のALP活性値の値と希釈倍率に基づいて計算してALP活性値を値付けした。
ALP活性値で値付けしたCD9(FL)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5に対して、上記R1、R2、R4及びR5試薬と、HI-1000を用いて測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線4)を作成した。測定結果を表１８及び図１６に示した。表１８、図１６より、ALP活性値を値付けしたCD9(FL)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
検量線4に対して上記測定で得られたカウント値を適用して得られるALP活性値を以下の表１９に示した。表１９より、カウント値を検量線4に当てはめて取得したALP活性値の値が、表１８に示したALP活性値の値とほぼ同じであることがわかる。これらのことから、CD9(FL)-ALP結合体を用いて検量線を作成でき、この結合体をキャリブレータとして用い得ることが示された。
(iii) 検体試料を用いたタンパク質濃度の定量
上記心血管疾患既往患者の血漿検体試料(6検体)を用い、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。実験は、凍結された各検体試料を解凍後、キャリブレータ用希釈液で4倍希釈した試料に対して行った。調製した各検体試料に、上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各検体試料に対して3度行った。得られた各測定値を上記検量線3に当てはめて検体試料に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。測定結果を図１７に示した。図１７より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定できることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のタンパク質濃度を、CD9(FL)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
上記心血管疾患既往患者の血漿検体試料(6検体)を用い、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。実験は、凍結された各検体試料を解凍後、キャリブレータ用希釈液で4倍希釈した試料に対して行った。調製した各検体試料に、上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各検体試料に対して3度行った。得られた各測定値を上記検量線3に当てはめて検体試料に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。測定結果を図１７に示した。図１７より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定できることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のタンパク質濃度を、CD9(FL)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
(iv) 検体試料を用いたALP活性値の定量
上記(iii)で得られたカウント値を、検量線4に当てはめることで、各検体試料のALP活性値を算出した。その結果を図１８に示した。図１８より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のALP活性値を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のALP活性値を、CD9(FL)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
上記(iii)で得られたカウント値を、検量線4に当てはめることで、各検体試料のALP活性値を算出した。その結果を図１８に示した。図１８より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のALP活性値を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のALP活性値を、CD9(FL)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
実施例３
[CD63(ECD) -ALP結合体をキャリブレータとして用いたALPを含む細胞外小胞の測定]
CD63(ECD)-ALP結合体を調製して、検体試料の測定を行った。
[CD63(ECD) -ALP結合体をキャリブレータとして用いたALPを含む細胞外小胞の測定]
CD63(ECD)-ALP結合体を調製して、検体試料の測定を行った。
[CD63(ECD) -ALPを含むキャリブレータの調製]
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてCD63 Protein, Human, Recombinant (ECD, His Tag), 11271-H08H, Sino Biological社を用いた。以下、このポリペプチドを「CD63(ECD)」とも呼ぶ。CD63(ECD)はCD63の細胞外領域から構成された組換えタンパク質であった。CD63(ECD)のアミノ酸配列を配列番号３に示した。このCD63(ECD)を用いること以外は[CD9(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]と同様にして、結合体(CD63(ECD) -ALP)を含むキャリブレータを得た。
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてCD63 Protein, Human, Recombinant (ECD, His Tag), 11271-H08H, Sino Biological社を用いた。以下、このポリペプチドを「CD63(ECD)」とも呼ぶ。CD63(ECD)はCD63の細胞外領域から構成された組換えタンパク質であった。CD63(ECD)のアミノ酸配列を配列番号３に示した。このCD63(ECD)を用いること以外は[CD9(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]と同様にして、結合体(CD63(ECD) -ALP)を含むキャリブレータを得た。
CD63(ECD)-ALP結合体に対して、抗CD9抗体の代わりに抗CD63抗体(Clone:H5C6)を用いて調製したR1試薬を含むR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は、結合体毎に3回行い、その平均をとった。対照として、捕捉抗体を含まないR1溶液に対しても同様に処理して測定を行った。
測定結果を図１９に示す。図１９に示されるように、CD63(ECD)-ALP結合体から抗体依存的なシグナルが取得できることが分かった。よって、CD63(FL)-ALP結合体も標準物質として使用できることが示された。
CD63(ECD)-ALP結合体に対して、キャリブレータ用希釈液を用いて調製した希釈溶液について吸光度(A280)を測定し、タンパク質濃度(ng/mL)を定量した。結果を以下の表２０に示す。
(i) タンパク質濃度の検量線の作成
上記のようにタンパク質濃度を測定したCD63(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5に対して、上記のR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000を用いてALP活性の測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線5)を作成した。測定結果を表２１及び図２０に示した。表２１及び図２０より、タンパク質濃度を値付けしたCD63(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
上記のようにタンパク質濃度を測定したCD63(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5に対して、上記のR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000を用いてALP活性の測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線5)を作成した。測定結果を表２１及び図２０に示した。表２１及び図２０より、タンパク質濃度を値付けしたCD63(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
検量線5に対して上記測定で得られたカウント値を適用して得られるタンパク質濃度を以下の表２２に示した。表２２より、カウント値を検量線5に当てはめて計算したタンパク質濃度の値が、表２１に示したタンパク質濃度の値とほぼ同じであることがわかる。これらのことから、CD63(ECD)-ALP結合体を用いて検量線を作成でき、この結合体をキャリブレータとして用い得ることが示された。
(ii) ALP活性値の検量線の作成
CD63(ECD)-ALP結合体について、生化学ALP測定によってALP活性値を値付けし、上記と同様にして検量線を作成した。ALP活性値の値付けは、CD9(FL)-ALP結合体に対するALP活性値の値付けと同様にして行った。
CD63(ECD)-ALP結合体について、生化学ALP測定によってALP活性値を値付けし、上記と同様にして検量線を作成した。ALP活性値の値付けは、CD9(FL)-ALP結合体に対するALP活性値の値付けと同様にして行った。
ALP活性値で値付けしたCD63(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5に対して、上記R1、R2、R4及びR5試薬と、HI-1000を用いて測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線6)を作成した。測定結果を表２３及び図２１に示した。表２３、図２１より、ALP活性値を値付けしたCD63(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
検量線6に対して上記測定で得られたカウント値を適用して得られるALP活性値を以下の表２４に示した。表２４より、カウント値を検量線6に当てはめて計算したALP活性値の値が、表２３に示したALP活性値の値とほぼ同じであることがわかる。これらのことから、CD63(ECD)-ALP結合体を用いて検量線を作成でき、この結合体をキャリブレータとして用い得ることが示された。
(iii) 検体試料を用いたタンパク質濃度の定量
末期腎不全患者から得られた血漿検体試料(10検体)を用い、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。末期腎不全患者において、血管の石灰化がよく認められる。実験は、凍結された各検体試料を解凍後、キャリブレータ用希釈液で4倍希釈した試料に対して行った。調製した各試料に、上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各検体試料に対して3度行った。得られた各測定値を上記検量線5に当てはめて検体試料に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。測定結果を図２２に示した。図２２より、血漿検体試料中のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のタンパク質濃度を、CD63(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
末期腎不全患者から得られた血漿検体試料(10検体)を用い、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。末期腎不全患者において、血管の石灰化がよく認められる。実験は、凍結された各検体試料を解凍後、キャリブレータ用希釈液で4倍希釈した試料に対して行った。調製した各試料に、上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各検体試料に対して3度行った。得られた各測定値を上記検量線5に当てはめて検体試料に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。測定結果を図２２に示した。図２２より、血漿検体試料中のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のタンパク質濃度を、CD63(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
(iv) 検体試料を用いたALP活性値の定量
上記(iii)で得られたカウント値を、検量線6に当てはめることで、各検体試料のALP活性値を算出した。その結果を図２３に示した。図２３より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のALP活性値を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のALP活性値を、CD63(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
上記(iii)で得られたカウント値を、検量線6に当てはめることで、各検体試料のALP活性値を算出した。その結果を図２３に示した。図２３より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のALP活性値を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のALP活性値を、CD63(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
実施例４
[CD81(ECD) -ALP結合体をキャリブレータとして用いたALPを含む細胞外小胞の測定]
CD81(ECD)-ALP結合体を調製して、検体試料の測定を行った。
[CD81(ECD) -ALP結合体をキャリブレータとして用いたALPを含む細胞外小胞の測定]
CD81(ECD)-ALP結合体を調製して、検体試料の測定を行った。
[CD81(ECD) -ALPを含むキャリブレータの調製]
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてCD81 Protein, Human, Recombinant (ECD, His Tag), 14244-H07H, Sino Biological社を用いた。以下、このポリペプチドを「CD81(ECD)」とも呼ぶ。CD81(ECD)はCD81の細胞外領域から構成された組換えタンパク質であった。CD81(ECD)のアミノ酸配列を配列番号４に示した。このCD81(ECD)を用いること以外は[CD9(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]と同様にして、結合体(CD81(ECD) -ALP)を含むキャリブレータを得た。
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてCD81 Protein, Human, Recombinant (ECD, His Tag), 14244-H07H, Sino Biological社を用いた。以下、このポリペプチドを「CD81(ECD)」とも呼ぶ。CD81(ECD)はCD81の細胞外領域から構成された組換えタンパク質であった。CD81(ECD)のアミノ酸配列を配列番号４に示した。このCD81(ECD)を用いること以外は[CD9(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]と同様にして、結合体(CD81(ECD) -ALP)を含むキャリブレータを得た。
CD81(ECD)-ALP結合体に対して、抗CD9抗体の代わりに抗CD81抗体(Clone:5A6)を用いて調製したR1試薬を含むR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は、結合体毎に3回行い、その平均をとった。対照として、捕捉抗体を含まないR1溶液に対しても同様に処理して測定を行った。
測定結果を図２４に示す。図２４に示されるように、CD81(ECD)-ALP結合体からALP活性が得られることがわかる。このことから、CD81(ECD)-ALP結合体も標準物質として使用できることが示された。
CD81(ECD)-ALP結合体に対して、キャリブレータ用希釈液を用いて調製した希釈溶液について吸光度(A280)を測定し、タンパク質濃度(ng/mL)を定量した。結果を以下の表２５に示す。
(i) タンパク質濃度の検量線の作成
上記のようにタンパク質濃度を測定したCD81(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5に対して、上記のR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000を用いてALP活性の測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線7)を作成した。測定結果を表２６及び図２５に示した。表２６、図２５より、CD81(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
上記のようにタンパク質濃度を測定したCD81(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5に対して、上記のR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000を用いてALP活性の測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線7)を作成した。測定結果を表２６及び図２５に示した。表２６、図２５より、CD81(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
検量線7に対して上記測定で得られたカウント値を適用して得られるタンパク質濃度を以下の表２７に示した。表２７より、カウント値を検量線7に当てはめて計算したタンパク質濃度の値が、表２６に示したタンパク質濃度の値とほぼ同じであることがわかる。これらのことから、CD81(ECD)-ALP結合体を用いて検量線を作成でき、この結合体をキャリブレータとして用い得ることが示された。
(ii) ALP活性値の検量線の作成
CD81(ECD)-ALP結合体について、生化学ALP測定によってALP活性値を値付けし、上記と同様にして検量線を作成した。ALP活性値の値付けは、CD9(FL)-ALP結合体に対するALP活性値の値付けと同様にして行った。
CD81(ECD)-ALP結合体について、生化学ALP測定によってALP活性値を値付けし、上記と同様にして検量線を作成した。ALP活性値の値付けは、CD9(FL)-ALP結合体に対するALP活性値の値付けと同様にして行った。
ALP活性値で値付けしたCD81(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5に対して、上記R1、R2、R4及びR5試薬と、HI-1000を用いて測定を行い、各キャリブレータに対してカウント値を取得した。測定は各試料に対して3度行った。得られたカウント値に基づいて、ロジスティック回帰に基づいて検量線(検量線8)を作成した。測定結果を表２８及び図２６に示した。表２８、図２６より、ALP活性値を値付けしたCD81(ECD)-ALP結合体のキャリブレータC0～C5を用いて検量線を作成できることが示された。
検量線8に対して上記測定で得られたカウント値を適用して得られるALP活性値を以下の表２９に示した。表２９より、カウント値を検量線8に当てはめて計算したALP活性値の値が、表２８に示したALP活性値の値とほぼ同じであることがわかる。これらのことから、CD81(ECD)-ALP結合体を用いて検量線を作成でき、この結合体をキャリブレータとして用い得ることが示された。
(iii) 検体試料を用いたタンパク質濃度の定量
末期腎不全患者から得られた血漿検体(10検体)を用い、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。実験は、凍結された各検体試料を解凍後、キャリブレータ用希釈液で4倍希釈した試料に対して行った。調製した各検体試料に、上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各検体試料に対して3度行った。得られた各測定値を上記検量線7に当てはめて検体試料に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。測定結果を図２７に示した。図２７より、血漿検体試料中のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のタンパク質濃度を、CD81(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
末期腎不全患者から得られた血漿検体(10検体)を用い、ALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。実験は、凍結された各検体試料を解凍後、キャリブレータ用希釈液で4倍希釈した試料に対して行った。調製した各検体試料に、上記R1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は各検体試料に対して3度行った。得られた各測定値を上記検量線7に当てはめて検体試料に含まれるALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定した。測定結果を図２７に示した。図２７より、血漿検体試料中のALPを含む細胞外小胞のタンパク質濃度を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のタンパク質濃度を、CD81(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
(iv) 検体試料を用いたALP活性値の定量
上記(iii)で得られたカウント値を、検量線8に当てはめることで、各検体試料のALP活性値を算出した。その結果を図２８に示した。図２８より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のALP活性値を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のALP活性値を、CD81(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
上記(iii)で得られたカウント値を、検量線8に当てはめることで、各検体試料のALP活性値を算出した。その結果を図２８に示した。図２８より、血漿検体中のALPを含む細胞外小胞のALP活性値を測定できていることと、得られたカウント値を検量線に適用できることが分かる。このことから、検体試料のALP活性値を、CD81(ECD)-ALP結合体を用いて作成した検量線を用いて定量できることが示された。
実施例５
[アネキシンI(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてアネキシンI/ANXA1 Protein, Human, Recombinant (His Tag), 3770-AN-050, R&D Systems社を用いた。以下、このポリペプチドを「アネキシンI(FL)」とも呼ぶ。アネキシンI(FL)はアネキシンI全領域から構成された組換えタンパク質であった。アネキシンI(FL)のアミノ酸配列を配列番号５に示した。このアネキシンI(FL)を用いること以外は[CD9(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]と同様にして、結合体(アネキシンI(FL) -ALP)を含むキャリブレータを得た。
[アネキシンI(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてアネキシンI/ANXA1 Protein, Human, Recombinant (His Tag), 3770-AN-050, R&D Systems社を用いた。以下、このポリペプチドを「アネキシンI(FL)」とも呼ぶ。アネキシンI(FL)はアネキシンI全領域から構成された組換えタンパク質であった。アネキシンI(FL)のアミノ酸配列を配列番号５に示した。このアネキシンI(FL)を用いること以外は[CD9(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]と同様にして、結合体(アネキシンI(FL) -ALP)を含むキャリブレータを得た。
アネキシンI(FL) -ALP結合体に対して、抗CD9抗体の代わりに抗アネキシンI抗体(Clone:EH17a)を用いて調製したR1試薬を含むR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は、結合体毎に3回行い、その平均をとった。対照として、捕捉抗体を含まないR1溶液に対しても同様に処理して測定を行った。
測定結果を図２９に示す。図２９に示されるように、アネキシンI(FL) -ALP結合体からALP活性が得られることがわかる。このことから、アネキシンI(FL) -ALP結合体も標準物質として使用できることが示された。
実施例６
[アネキシンVI(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてアネキシンVI/ANXA6 Protein, Human, Recombinant (His Tag), 11161-H08E, Sino Biological社を用いた。以下、このポリペプチドを「アネキシンVI(FL)」とも呼ぶ。アネキシンVI(FL)はアネキシンVI全領域から構成された組換えタンパク質であった。アネキシンVI(FL)のアミノ酸配列を配列番号６に示した。このアネキシンVI(FL)を用いること以外は[CD9(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]と同様にして、結合体(アネキシンVI(FL) -ALP)を含むキャリブレータを得た。
[アネキシンVI(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]
膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしてアネキシンVI/ANXA6 Protein, Human, Recombinant (His Tag), 11161-H08E, Sino Biological社を用いた。以下、このポリペプチドを「アネキシンVI(FL)」とも呼ぶ。アネキシンVI(FL)はアネキシンVI全領域から構成された組換えタンパク質であった。アネキシンVI(FL)のアミノ酸配列を配列番号６に示した。このアネキシンVI(FL)を用いること以外は[CD9(FL) -ALPを含むキャリブレータの調製]と同様にして、結合体(アネキシンVI(FL) -ALP)を含むキャリブレータを得た。
アネキシンVI(FL) -ALP結合体に対して、抗CD9抗体の代わりに抗アネキシンVI抗体(Clone:E-5)を用いて調製したR1試薬を含むR1、R2、R4及びR5試薬を用いてHI-1000により測定を行い、カウント値を取得した。測定は、結合体毎に3回行い、その平均をとった。対照として、捕捉抗体を含まないR1溶液に対しても同様に処理して測定を行った。
測定結果を図３０に示す。図３０に示されるように、アネキシンVI(FL) -ALP結合体からALP活性が得られることがわかる。このことから、アネキシンVI(FL) -ALP結合体も標準物質として使用できることが示された。
１０： キャリブレータ
２０、３０： 試薬セット
１１、２１、３１： 第１容器
１２、２３、３４： 梱包箱
１３、２４、３５： 添付文書
２２、３２： 第２容器
３３： 第３容器
４０： 測定部
４１、５１： 制御部
４２、５３： 記憶部
４３、５２： 通信部
４４： 測定機構部
４５： 検出部
４４１： 試薬保持部
４４２： 分注部
４４３： BF分離部
４４４： 反応部
５０： 分析部
５４： 表示部
５５： 入力部
２０、３０： 試薬セット
１１、２１、３１： 第１容器
１２、２３、３４： 梱包箱
１３、２４、３５： 添付文書
２２、３２： 第２容器
３３： 第３容器
４０： 測定部
４１、５１： 制御部
４２、５３： 記憶部
４３、５２： 通信部
４４： 測定機構部
４５： 検出部
４４１： 試薬保持部
４４２： 分注部
４４３： BF分離部
４４４： 反応部
５０： 分析部
５４： 表示部
５５： 入力部
Claims (18)
- キャリブレータを用いて試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得することを含み、
前記キャリブレータが、アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体を含む、
試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定する方法。 - 前記試料に含まれる細胞外小胞を固相上に固定する第１固定工程と、
前記固定された細胞外小胞と、アルカリフォスファターゼの基質とを接触させることにより生じるシグナルを測定する第１測定工程と、
前記キャリブレータに含まれる前記結合体を固相上に固定する第２固定工程と、
前記固定された結合体と、アルカリフォスファターゼの基質とを接触させることにより生じるシグナルを測定する第２測定工程と、
前記第１測定工程で得られた測定値及び前記第２測定工程で得られた測定値から、前記試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得する工程と
を含む、請求項１に記載の方法。 - 前記第１固定工程が、前記試料と、前記固相と、前記試料中の細胞外小胞に含まれる膜タンパク質と結合可能な捕捉抗体とを接触させることにより、前記細胞外小胞と前記捕捉抗体との免疫複合体を前記固相上に形成することを含む、請求項２に記載の方法。
- 前記第２固定工程が、前記キャリブレータと、前記固相と、前記結合体に含まれる膜タンパク質と結合可能な捕捉抗体とを接触させることにより、前記結合体と前記捕捉抗体との免疫複合体を前記固相上に形成することを含む、請求項３に記載の方法。
- 前記膜タンパク質のアミノ酸配列が、CD9の細胞外領域、CD63の細胞外領域、CD81の細胞外領域、アネキシンI、アネキシンVI及びPit 1からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記アルカリフォスファターゼが、組織非特異型アルカリフォスファターゼ、小腸型アルカリフォスファターゼ、胎盤型アルカリフォスファターゼ及び生殖細胞型アルカリフォスファターゼからなる群から選択される1つである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記第１固定工程及び第２固定工程の前記捕捉抗体が、抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗アネキシンI抗体、抗アネキシンVI抗体及び抗Pit 1抗体からなる群から選択される1つである、請求項４に記載の方法。
- 前記アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチド及び／又は前記膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記固相が磁性粒子である、請求項２又は３に記載の方法。
- 前記試料が血液試料である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記キャリブレータが、前記結合体を含む試薬である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記キャリブレータが、前記結合体をそれぞれ含む複数の試薬を含む試薬セットであり、前記複数の試薬における前記結合体の濃度が互いに異なっている、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記第２測定工程が、濃度が異なる複数の試薬由来の結合体に対してそれぞれ行われ、前記濃度が異なる複数の試薬由来の結合体から得られた測定値から作成した検量線に基づいて前記試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性値を取得する工程が行われる、請求項２を引用する請求項１２に記載の方法。
- 試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定するために用いられるキャリブレータであって、
アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体を含む、キャリブレータ。 - 前記膜タンパク質のアミノ酸配列が、CD9の細胞外領域、CD63の細胞外領域、CD81の細胞外領域、アネキシンI、アネキシンVI及びPit 1からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のキャリブレータ。
- 前記アルカリフォスファターゼが、組織非特異型アルカリフォスファターゼ、小腸型アルカリフォスファターゼ、胎盤型アルカリフォスファターゼ及び生殖細胞型アルカリフォスファターゼからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１４又は１５に記載のキャリブレータ。
- 前記アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチド及び／又は前記膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項１４又は１５に記載のキャリブレータ。
- 試料中の細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定するために用いられる結合体であって、アルカリフォスファターゼ活性を有するポリペプチドと、細胞外小胞の表面に存在する膜タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドとが共有結合により結合した結合体。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022151929A JP2024046503A (ja) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定する方法、キャリブレータ及び結合体 |
| CN202311031520.4A CN117741144A (zh) | 2022-09-22 | 2023-08-16 | 对细胞外囊泡中所含的碱性磷酸酶的活性进行测定的方法、校准物及结合体 |
| US18/469,093 US20240118272A1 (en) | 2022-09-22 | 2023-09-18 | Method for measuring activity of alkaline phosphatease contained in extracellular vesicle, calibrator, and conjugate |
| EP23199030.0A EP4343327A1 (en) | 2022-09-22 | 2023-09-22 | Method for measuring activity of alkaline phosphatase contained in extracellular vesicle, calibrator, and conjugate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022151929A JP2024046503A (ja) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定する方法、キャリブレータ及び結合体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024046503A true JP2024046503A (ja) | 2024-04-03 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022151929A Pending JP2024046503A (ja) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 細胞外小胞に含まれるアルカリフォスファターゼの活性を測定する方法、キャリブレータ及び結合体 |
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-
2022
- 2022-09-22 JP JP2022151929A patent/JP2024046503A/ja active Pending
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2023
- 2023-08-16 CN CN202311031520.4A patent/CN117741144A/zh active Pending
- 2023-09-18 US US18/469,093 patent/US20240118272A1/en active Pending
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| Publication number | Publication date |
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