JP2023548115A - ヒト多能性幹細胞からのｃｄ４＋エフェクターおよび制御性ｔ細胞の生成 - Google Patents

Abstract

本明細書では、ＣＤ４陽性エフェクターＴ細胞および制御性Ｔ細胞を生成するための改良された方法および組成物、ならびにそれらの使用方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２８日に出願された米国仮出願６３／１０６，５９１号に基づく優先権を主張し、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の背景
健康な免疫システムとは、バランスが取れている状態のことである。適応免疫に関与する細胞には、ＢおよびＴリンパ球が含まれる。Ｔリンパ球には、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の２つの一般的なタイプがある。エフェクターＴ細胞には、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞と細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の２つの一般的なタイプがある。ＣＤ４を発現するエフェクターＴ細胞は通常、Ｔｈ細胞（ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞）として機能するが、ＣＤ８を発現するエフェクターＴ細胞は通常、ＣＴＬ（ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞）として機能する。Ｔｈ細胞には、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、およびＴｈ１７細胞が含まれる。Ｔｈ細胞に加えて、非従来型Ｔ細胞（例えば、ＮＫ Ｔ細胞、ガンマ／デルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞など）もＣＤ４を発現できる。もう１つのユニークなタイプのＴリンパ球であるＴｒｅｇは、ＣＤ４を発現することが一般に知られている。Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞を調節し、過剰な免疫応答および自己免疫を防止する（例えば、Romano et al., Front Imm. (2019) 10:43を参照）。従来定義されているＴｒｅｇはＣＤ４^＋であるが、ＣＤ８^＋Ｔｒｅｇについても記載されている（Yu et al., Oncology Letters (2018) 15:6）。

Ｔｅｆｆ細胞は、抗原攻撃後の細胞性免疫において中心的な役割を果たしており、ナイーブＴ細胞、記憶細胞、記憶幹細胞、または最終分化したエフェクターＴ細胞が含まれる。Ｔｅｆｆ細胞は、抗原を経験し、エフェクター機能（「ヘルパー」および／または細胞性免疫応答を促進するサイトカインまたは因子を分泌するなど）を実行しているナイーブＴ細胞から分化する。記憶または幹細胞記憶Ｔヘルパー細胞も存在する可能性があり、これもその後ヘルパーＴエフェクター細胞に再分化してエフェクター機能を実行できる。

一部のＴｒｅｇは胸腺で生成され；それらは天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）または胸腺Ｔｒｅｇ（ｔＴｒｅｇ）として知られている。他のＴｒｅｇは、抗原との遭遇後の末梢または細胞培養で生成され、誘導型Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）または適応型Ｔｒｅｇとして知られている。Ｔｒｅｇは、特定の細胞表面受容体を含む細胞間接触や、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＩＬ－３５などの抑制性サイトカインの分泌を通じて、寛容の誘導など、他の免疫細胞の増殖と活性化を積極的に制御する（Dominguez-Villar and Hafler., Nat Immunol. (2018) 19:665-73）。耐性が失われると、自己免疫および慢性炎症が引き起こされる可能性がある。耐性の喪失は、Ｔｒｅｇ機能の欠陥または不十分なＴｒｅｇ数、または無反応または過剰活性化されたＴｅｆｆによって引き起こされる可能性がある（Sadlon et al., Clin Transl Imm. (2018) 7:e1011）。

近年、疾患を治療するためのＴｒｅｇの使用に大きな関心が集まっている。自己免疫疾患を治療するために、Ｔｒｅｇの数と機能を高めるために、養子細胞療法を含むいくつかのアプローチが研究されている。Ｔｒｅｇ移入（Ｔｒｅｇの活性化および拡大された集団の送達）は、Ｉ型糖尿病、皮膚エリテマトーデス、クローン病などの自己免疫疾患患者および臓器移植でテストされている（Dominguez-Villar, supra; Safinia et al., Front Immunol. (2018) 9:354）。

ＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞は、養子細胞療法においても関心が高まっている。ＣＤ４^＋Ｔｅｆｆは、特定の樹状細胞やその他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を介した抗腫瘍または抗病原体（抗ウイルスなど）プライミング中のＣＴＬ応答の規模と質を最適化することにより、ＣＤ８^＋ＣＴＬの機能を強化することが知られている（Borst et al., Nat Rev Immunol. (2018) 18:635-47）。ＣＤ４^＋Ｔｅｆｆは、ＨＩＶの疾患モデルにおいて治療的に有用であることも示されている（Maldini et al., Mol Ther. (2020) 28(7):1585-99）。Ｔ濾胞性ヘルパー細胞（Ｔｆｈ）は、Ｂ細胞応答を増強することによって治療が期待できるＣＤ４^＋Ｔｅｆｆの追加のサブセットである（Kamphorst et al., Immunotherapy (2013) 5(9):975-98）。

現在、細胞治療用のＣＤ４^＋ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇの唯一の供給源は、成人または青少年の一次血液（全血またはアフェレーシス製品など）および組織（胸腺など）である。これらの供給源からのＣＤ４^＋ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇの分離は侵襲的で時間がかかり、得られる細胞、特にＴｒｅｇの数は少数である。さらに、これらの供給源から得られるＣＤ４^＋ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇは本質的にポリクローナルであり、潜在的な免疫抑制応答にばらつきをもたらす可能性がある。また、Ｔｒｅｇの数を単に増加させるだけでは疾患を制御するのに十分ではない可能性があるという証拠もある（McGovern et al., Front Immunol. (2017) 8:1517）。

したがって、抗原特異的なＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞、特に遺伝子操作された細胞を大量に効率的に取得する必要性が依然として存在する。

発明の概要
本開示は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が濃縮された細胞の集団を取得する方法であって、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋未熟Ｔ細胞の出発集団を提供すること、ホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン（Ｉ）を含む培地中で細胞集団を培養すること、それによってＣＤ４シングルポジティブＴ細胞が濃縮された細胞集団を取得することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞は未成熟ＣＤ４^＋Ｔ細胞であり、場合によりＴ細胞はＴｈＰＯＫを発現する。特定の実施形態では、未成熟ＣＤ４^＋Ｔ細胞はエフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞であり、場合によりＴｅｆｆ細胞はＣＤ２５^ｌｏｗである。

いくつかの実施形態では、培地は、約０．００６２５～約０．１μｇ／ｍｌのＰＭＡおよび約０．１２５～約２μｇ／ｍｌのイオノマイシンを含む。さらなる実施形態では、培地は、０．００６２５μｇ／ｍｌのＰＭＡおよび０．１２５μｇ／ｍｌのイオノマイシンを含む。いくつかの実施形態では、培地中のＰＭＡ対イオノマイシンの重量比は、約１：１０～１：１０００（例えば、１：２０、１：５０、１：１００、１：２００、１：２５０、または１：５００）である。特定の実施形態では、この比は１：２０である。

いくつかの実施形態では、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の出発集団を培地中で約１～５日間培養する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（例えば、ヒト細胞）が濃縮された細胞集団を取得する方法であって、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の出発集団を提供すること、ホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン（Ｉ）を含む培地中で細胞集団を培養すること、それによってＣＤ４単一陽性Ｔ細胞が濃縮された細胞集団を取得すること、ＩＬ－２、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ２８抗体を含む第２の培地中でＣＤ４単一陽性Ｔ細胞を培養すること（例えば、約５～１０日間）、それにより、ＣＤ４^＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が濃縮された細胞集団を得ること、を含む方法を提供する。さらなる実施形態では、第２の培地は、ＴＧＦ－βおよびオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）をさらに含む。第２の培地は、ＩＬ－２を添加したＴ細胞特異的培地で構成することもでき；さらなる実施形態では、第２の培地は、ＴＧＦ－β、ＡＴＲＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ２８抗体のうちの１つまたは複数を添加したＴ細胞特異的培地で構成される。

いくつかの実施形態では、ＣＤ４単一陽性Ｔｅｆｆ細胞、またはＣＤ４単一陽性およびＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇ細胞は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって組織培養物から単離され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４単一陽性Ｔｅｆｆ細胞またはＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、ＦＡＣＳによって組織培養物から単離され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗおよびＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｌｏｗＣＤ１２７^ｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、ＦＡＣＳによって組織培養物から単離され得る。

特定の実施形態では、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、例えば、Ｔ細胞から再プログラムされたｉＰＳＣに由来する。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ゲノム中に異種配列を含み、異種配列は、系統コミットメント因子（例えば、ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、またはＴｈＰＯＫ）をコードする導入遺伝子を含み、系統コミットメント因子は、（ｉ）ｉＰＳＣのＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞への分化を促進するか、または（ｉｉ）ｉＰＳＣのＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞への分化を促進するか、またはＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞の表現型の維持を促進する。さらなる実施形態では、異種配列は、導入遺伝子の発現が遺伝子座における転写調節エレメントの制御下にあるように、Ｔ細胞特異的遺伝子座（例えば、Ｔ細胞受容体α定常またはＴＲＡＣ遺伝子座）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、異種配列は、ＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１、２、または３に組み込まれる。

さらなる実施形態では、導入遺伝子は、追加のポリペプチド（例えば、別の系統コミットメント因子、治療用タンパク質、またはキメラ抗原受容体などの抗原受容体）のコード配列を含み、ここで、系統コミットメント因子のコード配列と追加のポリペプチドのコード配列は、自己切断ペプチドのインフレームコード配列または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。

いくつかの実施形態では、異種配列は、Ｔ細胞特異的遺伝子座のエクソンに組み込まれ、導入遺伝子のすぐ上流に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または導入遺伝子のすぐ上流およびインフレームの自己切断ペプチドの第２のコード配列を含む。

特定の実施形態では、Ｔ細胞特異的遺伝子座は無傷のＴ細胞特異的遺伝子産物を発現できるままであるように、異種配列は、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドの第２のコード配列のすぐ上流に、組み込み部位の下流にあるＴ細胞特異的遺伝子座のすべてのエクソン配列を含むヌクレオチド配列をさらに含む。

特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＦＯＸＰ３のコード配列、Ｈｅｌｉｏｓのコード配列、および／またはＴｈＰＯＫのコード配列を含み、これらのコード配列はインフレームであり、自己切断ペプチドのインフレームコード配列によって分離されている。

いくつかの実施形態では、出発細胞集団は、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ＨＬＡクラスＩまたはＩＩ遺伝子、抗原プロセシングに関連するトランスポーター、マイナー組織適合性抗原遺伝子およびβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子から選択される遺伝子にヌル変異を含む。

いくつかの実施形態では、細胞の出発集団は、任意にＨＳＶ－ＴＫ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、チトクロームＰ４５０遺伝子、またはカスパーゼ－９遺伝子から選択される自殺遺伝子を含む。

いくつかの態様では、本開示はまた、本方法によって得られる、ＣＤ４単一陽性細胞が濃縮された細胞の集団、またはＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞が濃縮された細胞の集団を提供する。関連する態様において、本開示は、本明細書で得られたＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞が濃縮された細胞集団を投与することを含む、それを必要とする患者における癌、感染症、アレルギー、喘息、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患を治療する方法；治療方法における薬剤の製造のための、本明細書で得られたＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞が濃縮された細胞集団の使用；治療方法で使用するために本明細書で得られる、ＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞が濃縮された細胞集団、を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書で得られるＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞が濃縮された細胞集団を提供する。関連する態様において、本開示は、本方法により得られたＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞が濃縮された細胞集団を投与することを含む、免疫抑制を必要とする患者を治療する方法；免疫抑制を必要とする患者の治療における薬剤の製造における、本発明の方法によって得られるＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞が濃縮された細胞集団の使用；免疫抑制を必要とする患者の治療に使用するための、本発明の方法によって得られるＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞が濃縮された細胞集団、を提供する。いくつかの実施形態では、患者は自己免疫疾患を患っているか、または組織移植を受けた、またはこれから受ける予定である。

本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。 しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示しているが、限定ではなく例示のみを目的として与えられていることが理解されるべきである。 本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者には明らかとなるであろう。

図１は、造血幹細胞および造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）、リンパ系前駆細胞、二重陽性（ＤＰ）Ｔ細胞、ＣＤ４単一陽性（ＣＤ４ｓｐ）Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔｈ細胞およびＴｒｅｇをｉＰＳＣから生成するために使用されるプロセスを示す図である。リンパ前駆細胞：ＣＤ５^＋ＣＤ７^＋。二重陽性：ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋。単一陽性：ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋。

図２は、ＩＬ－２を含むＴ細胞特異的培地（「Ｔ細胞培地」）の存在下で培養されたｉＰＳＣからＴｒｅｇを生成するプロセスを示す図である。

図３および４は、３５日目（図３）または４２日目（図４）に添加した場合に、ＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡＩ）がＤＰ Ｔ細胞のＣＤ４ｓｐ細胞への分化を促進する能力を評価する一群のフローサイトメトリープロットである。ＰＭＡＩをさまざまな濃度で添加したが、濃度が低いほど（０．１２５Ｘ、０．２５Ｘ、０．５０Ｘ、１Ｘ、または２Ｘ）、より多くのＣＤ４ｓｐ細胞が生成された。段階希釈したＰＭＡＩの成分を表Ａに示す。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上

図５は、ＰＭＡＩ誘導ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞におけるＣＤ４分子の再発現を示す一群のグラフである。細胞を漸増濃度のプロナーゼ酵素（未処理、０．０２％、０．０４％、０．０８％、０．１％）で処理してＣＤ４を除去し、ＣＤ４の再発現を防ぐか許容するために４℃または３７℃でインキュベートした。ＣＤ４ ＭＦＩ（平均蛍光強度）をプロナーゼ処理後１または２日後に測定した。棒グラフ（左）は、３７℃で２日間培養した後の４℃の細胞に対するＣＤ４ ＭＦＩの増加を示し、フロープロット（右）は、４℃の細胞と比較して０．１％濃度でのＣＤ４の再発現を示す。 同上 同上 同上

図６Ａおよび６Ｂは、ＴＧＦ－β１、ＡＴＲＡ、ＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化因子で処理されたＰＭＡＩ誘導ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞におけるＴｒｅｇマーカーの発現を示す一群のフローサイトメトリーヒストグラムである。様々な濃度のＰＭＡＩを３５日目（図６Ａ）または４２日目（図６Ｂ）に添加して、ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞を誘導した。ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ－４、ＧＡＲＰ、ＬＡＰの発現を調べた。 同上 同上 同上 同上 同上

図７は、活性化されたＰＭＡＩ誘導性およびＴＧＦ－β１処理されたＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞（ｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇ）におけるＴｒｅｇマーカーの発現を示す一群のフローサイトメトリーヒストグラムである。ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ－４、ＧＡＲＰ、ＬＡＰの発現を調べた。 同上 同上

図８は、レスポンダーＴ細胞の増殖に対する０．１２５Ｘ ＰＭＡＩ誘導およびＴＧＦ－β１処理されたｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇの抑制能力を示す一群のフローサイトメトリーヒストグラムである。Ｔｒｅｓｐ：レスポンダーＴ細胞。 同上 同上

図９は、ＴＧＦ－β、ＡＴＲＡ、ＩＬ－２、およびＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子で処理されたＰＭＡＩ誘導ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞におけるＴｒｅｇマーカーの発現を示す一群のフローサイトメトリープロットおよびヒストグラムである。ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞は、１００％ＳｔｅｍＳｐａｎ^ＴＭＴ細胞成熟培地（成熟）、またはＩＬ－２を追加した成熟培地とＴ細胞特異的培地の５０％混合物のいずれかで分化した。ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞は、追加のＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２アクチベーターを含む成熟培地とＴ細胞特異的培地の５０％混合物中で分化したが、対照としてＴＧＦＢおよびＡＴＲＡは使用しなかった。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＦＯＸＰ３の発現を調べた。ＦＯＸＰ３の発現をＣＤ４ｓｐＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞およびＣＤ４ｓｐＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ２５^ｌｏｗ細胞で調べた。 同上 同上 同上

図１０は、ＣＤ２５^ｈｉｇｈｉＰＳＣ－ＴｒｅｇおよびＣＤ２５^ｌｏｗｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇを選別するために使用される選別戦略を示す一群のフローサイトメトリーグラフである。ソーティングのためのゲートを配置するために、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７の発現を決定した。

図１１は、非活性化および活性化されたＣＤ２５^ｈｉｇｈおよびＣＤ２５^ｌｏｗで選別されたｉＰＳＣ－ＴｒｅｇにおけるＴｒｅｇマーカーの発現を示す一群のフローサイトメトリープロットである。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＣＤ６９、およびＧＡＲＰの発現を調べた。 同上 同上

図１２は、非活性化および活性化されたＣＤ２５^ｈｉｇｈおよびＣＤ２５^ｌｏｗで選別されたｉＰＳＣ－ＴｒｅｇにおけるＴｒｅｇマーカーの発現を示す一群のフローサイトメトリーグラフである。ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＰの発現を調べた。 同上 同上

図１３は、レスポンダーＴ増殖に対する選別されたｉＰＳＣ－ＴｒｅｇまたはｉＰＳＣ－ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞の抑制能力を示す一群のグラフである。ｉＰＳＣ－ＴｒｅｇまたはｉＰＳＣ－ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞を、最大１：１（Ｔｒｅｇ：レスポンダーＴ）まで濃度を増加させてレスポンダーＴ細胞と共培養した（ｎ＝３）。

図１４は、２つの異なるクローンからのｉＰＳＣ由来Ｔｒｅｇ中のＦＯＸＰ３Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）で脱メチル化された細胞の割合を示す。ＰＭＡＩおよびＴＧＦ－β１で処理した後のｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇ（パネルＡ）、０．１２５ＸＰＭＡＩのみで処理した後のＣＤ４ｓｐ細胞、および一次ＴｒｅｇおよびレスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）対照（パネルＢ）でメチル化を測定した。ＦＯＸＰ３の発現も、ＰＭＡＩおよびＴＧＦ－β１処理細胞におけるフローサイトメトリーによって検査された（パネルＣ）。 同上 同上 同上

図１５は、死細胞の除去前（フィコール前）および除去後（フィコール後）、ならびに標的細胞（Ｔｒｅｇ）および非標的細胞（フロースルー）におけるＴｒｅｇ濃縮後の、ｉＰＳＣ由来ＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３ＴＳＤＲで脱メチル化された細胞の割合を示す（パネルＡ）。パネルＢは、死細胞除去およびＴｒｅｇ濃縮後のｉＰＳＣ－ＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３の発現を示すフローサイトメトリープロットを示す。 同上 同上

図１６は、選別されたｉＰＳＣ－ＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）で脱メチル化された細胞のパーセンテージを示す。メチル化は、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ、ＣＤ２５^ｌｏｗｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇ、および未分類のバルク集団で測定された。一次ＴｒｅｇおよびＴｒｅｓｐを対照として使用した。

図１７Ａ～Ｃは、様々な種類のＴ細胞刺激がＴｒｅｇを生成する能力を示す一群のフローサイトメトリープロットである。成熟ＣＤ４^＋Ｔ細胞（図１７Ａ）、Ｔｒｅｇ（図１７Ｂ）、およびナイーブＴｒｅｇ（図１７Ｃ）のマーカーを調べた。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上

図１８は、様々な濃度のＰＭＡＩがＤＰ Ｔ細胞からＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞を生成し、続いてＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡ処理後にｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇを生成する能力を示す一群のフローサイトメトリープロットである。 同上 同上

図１９は、１つ以上のＴｒｅｇコミットメント（または誘導）因子（「ＴＦ」）をコードする導入遺伝子をヒトＴＲＡＣ遺伝子のエクソン２に組み込むためのゲノム編集アプローチを示す概略図である。導入されたｍＲＮＡから生成されるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、エクソン２の特定の部位（稲妻）で二本鎖を切断する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）６ベクターによって導入されたドナー配列には、５’から３’までに次のものが含まれる：相同領域１；自己切断ペプチドＴ２Ａのコード配列；第１のＴＦ、自己切断ペプチドＰ２Ａ、第２のＴＦ２、自己切断ペプチドＥ２Ａ、および第３のＴＦ３の融合体のコード配列；ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列；およびホモロジー領域２。相同領域は、ＺＦＮ切断部位に隣接するゲノム領域と相同である。組み込み部位の上流のＴＲＡＣエクソン２部分、Ｔ２Ａコード配列、およびＴＦコード配列は互いにインフレームである。このアプローチでは、導入遺伝子の組み込みの結果として、ＴＲＡＣタンパク質の発現がノックアウトされる。組み込まれた配列の発現は、内在性ＴＣＲα鎖プロモーターによって制御される。

図２０は、図１９に示されるものと同様のゲノム編集アプローチを示す概略図であるが、ここでは、異種配列は、組込み部位の下流のＴＲＡＣエクソン配列（すなわち、エクソン２配列３’から組み込み部位およびエクソン３配列まで）を包含する部分ＴＲＡＣ ｃＤＮＡを含む。）。この部分的なＴＲＡＣ ｃＤＮＡは、Ｔ２Ａコード配列のすぐ上流にインフレームで配置され、操作された遺伝子座が内在性ＴＣＲα鎖プロモーターの下で無傷のＴＣＲα鎖およびＴＦを発現するようになっている。

図２１は、１つ以上のコミットメント因子をコードする導入遺伝子を組み込むさらに別のゲノム編集アプローチを示す概略図である。このアプローチでは、導入遺伝子はゲノムの安全な場所に組み込まれる。この図では、導入遺伝子はヒトＡＡＶＳ１遺伝子座のイントロン１に挿入され、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性プロモーターに作動可能に連結される。ＳＡ：スプライスアクセプター。２Ａ：自己切断ペプチド２Ａのコード配列。ＰｕｒｏＲ：ピューロマイシン耐性遺伝子。ＴＩ：標的化インテグレーション。

図２２は、図２１に概要を示した概略図を使用して編集された細胞から生成されたデータを示す一群のグラフである。導入遺伝子は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン。Ｄｏｘ：ドキシサイクリン。Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン。 同上 同上 同上

図２３は、１つ以上のコミットメント因子をコードする導入遺伝子がヒトＡＡＶＳ１遺伝子のイントロン１に組み込まれるゲノム編集アプローチを示す概略図である。ゲノムに組み込まれた異種配列には、ＣＡＲをコードする配列が含まれる。Ｔｒｅｇの分化が完了すると、コミットメント因子（２つのＬｏｘＰ部位の間に配置）をコードする導入遺伝子が切除され、組み込み部位にはＣＡＲ発現カセットのみが残る。

図２４は、１つ以上のコミットメント因子をコードする導入遺伝子をヒトＴＲＡＣ遺伝子のエクソン２に組み込むためのゲノム編集アプローチを示す概略図である。このアプローチでは、ゲノムに組み込まれる異種配列には、ＣＡＲをコードする配列が含まれる。Ｔｒｅｇの分化が完了すると、コミットメント因子（２つのＬｏｘＰ部位の間に配置）をコードする導入遺伝子が切除され、組み込み部位にはＣＡＲ発現カセットのみが残る。

図２５は、単一の再構成されたＴＣＲを有する成熟Ｔｒｅｇを誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラムするプロセスを示す概略図である。増殖後、ｉＰＳＣは再分化してＴｒｅｇ表現型に戻る。ここでのＴＣＲは、同種抗原ではない抗原を標的とする。

図２６は、ｉＰＳＣがＴｒｅｇに分化する過程を示す模式図である。ＨＳＣ：造血幹細胞。単一陽性：ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋。二重陽性：ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋。

図２７は、ＩＬ－７受容体のαユニット（ＩＬ－７Ｒａ）に対する抗体の組織培養培地への導入が、ｉＰＳＣ由来前駆体Ｔ細胞の分化を、ＣＤ８単一陽性細胞の形成から（左上の象限）て、ＣＤ４単一陽性細胞を形成（右下の象限）まで歪めることを実証する一群の細胞選別グラフである。抗体を３つの濃度（低、中、高）で組織培養培地に添加した。この効果は、２つの別々の実験（実験＃１および実験＃２）で示された。 同上 同上 同上 同上

図２８は、ｉＰＳＣをＴｒｅｇに分化させるための複数のプロセスを示す概略図である。細胞は、リンパ球分化コーティング材料上（フィーダー非依存性）、またはＯＰ９間質細胞またはＯＰ９－ＤＬＬ１間質細胞（Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するＯＰ９細胞、デルタ様１）間質細胞（フィーダー依存性）とともに培養される。次いで、図２６に示すように細胞をさらに培養して、Ｔｒｅｇへの分化を促進する。別の経路では、三次元胚性中胚葉オルガノイド（ＥＭＯ）は、ｉＰＳＣをＭＳＳ－ＤＬＬ１／４またはＥｐＣＡＭ^－ＣＤ５６^＋間質細胞と共培養することによって形成され；ＥＭＯの造血誘導後、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）が形成され、胸腺で選択されたＴｒｅｇにより類似したＴＣＲレパートリーを持つ成熟Ｔｒｅｇを生成するように誘導される。

発明の詳細な説明
本開示は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞および造血前駆細胞のＣＤ４^＋エフェクターおよび／または制御性Ｔ細胞への分化を促進するための方法および組成物を提供する。

一態様では、本開示は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）経路および／または他のＴ細胞シグナル伝達経路（例えば、ＴＣＲ活性化経路）を活性化することによって、例えば、胸腺内の天然のＣＤ４^＋Ｔｅｆｆおよび／またはＴｒｅｇの発達を模倣する程度まで、細胞内カルシウム流動の増加を介して幹細胞および前駆細胞（例えば、ｉＰＳＣ、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、リンパ系前駆細胞、または未熟前駆Ｔ細胞）からＣＤ４^＋Ｔ細胞を生成するための組織培養法および組成物を提供する。これらの組織培養法は、小分子と生物学的因子を利用して、目的の発生経路を促進する。本方法は、ＣＤ４ｓｐエフェクターＴ細胞および抑制機能を有するＦＯＸＰ３^＋Ｔｒｅｇ様細胞にさらに成熟できるＣＤ４単一陽性（ＣＤ４ｓｐ）Ｔ細胞をｉＰＳＣから生成することができる。

他の態様では、本開示は、幹細胞および前駆細胞のＣＤ４^＋ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇへの分化をさらに促進するための遺伝子工学的方法および組成物を提供する。これらの方法では、親細胞は、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞系統コミットメント因子（例えば、Ｇａｔａ３およびＴｈＰＯＫ）および／またはＴｒｅｇ系統コミットメント因子（例えば、ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ）を過剰発現する（すなわち、通常の細胞よりも高いレベルで発現する）ように遺伝子操作される。これらの因子は、操作された幹細胞および／または前駆細胞の目的の細胞型への分化を促進する。

本方法により得られるＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞は、自己由来または同種異系であり得、細胞ベースの治療に使用することができる。例えば、Ｔｅｆｆ細胞は、癌または感染症（例えば、ウイルス感染症）を患っている患者など、免疫力の強化が必要な患者を治療するために使用することができる。Ｔｒｅｇ細胞は、臓器移植または同種異系細胞療法を受けている患者および自己免疫疾患を有する患者など、免疫寛容の誘導または免疫恒常性の回復を必要とする患者を治療するために使用され得る。

本開示のＴｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞はモノクローナルであり、過去のＴ細胞治療におけるポリクローナル性によって引き起こされる変動を回避できるため、治療効果が向上する。さらに、Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞は、それらの抗原特異性に基づいて選択され得る。例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または抗原に特異的な編集されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、ＴＣＲまたはＣＡＲがＴ細胞をその部位（例えば、Ｔｒｅｇ細胞の場合は炎症部位、またはＴｅｆｆ細胞の場合は腫瘍部位）に誘導し、それによって細胞の効力を増強するように、Ｔ細胞が必要とされる生体内部位で発現するために、Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞を選択することができる。

本開示のＴｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞は、自己複製特性および多能性（例えば、ｉＰＳＣ）または多分化性（例えば、ＨＳＰＣ、リンパ系前駆細胞、または未熟前駆Ｔ細胞）を有する細胞集団に由来することができる。したがって、一次Ｔ細胞と比較して、本開示のＣＤ４ｓｐ ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇは、一次ＣＤ４ｓｐ ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇと比較して、腫瘍学、感染症、自己免疫および炎症性疾患、およびその他の治療用途で使用するための比較的低コストの養子細胞療法を生み出す可能性がある。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞」および「ＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ」は、表現型ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｌｏｗによって特徴づけられるＴリンパ球のサブセットを指す。これらは、高レベルのＣＤ２５を発現することが知られているＴｒｅｇを含まないＣＤ４^＋Ｔ細胞のサブセットである。

本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞」、「制御性Ｔリンパ球」、および「Ｔｒｅｇ」という用語は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、一般にＴエフェクター細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御するＴ細胞の部分集団を指す。Ｔｒｅｇ表現型は部分的に、免疫抑制機能に必須の遺伝子ネットワークの発現を調節するマスター転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現に依存している（例えば、Fontenot et al., Nature Immunology (2003)4(4):330-6を参照）。Ｔｒｅｇは、多くの場合、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^ｌｏＦＯＸＰ３^＋の表現型によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇはまた、ＣＤ４５ＲＡ^＋、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉ、Ｈｅｌｉｏｓ^＋、および／またはＧＩＴＲ^＋である。特定の実施形態では、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^ｌｏＣＤ６２Ｌ^＋またはＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２５^ｈｉＣＤ１２７^ｌｏによってマークされる。

Ｉ．多能性細胞および多分化能細胞からＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞を生成するための組織培養法
ＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞を生成するための出発細胞集団は、ヒト細胞、家畜（例えば、牛、豚、または馬）の細胞、ペット（例えば、猫または犬）の細胞などの哺乳類細胞である。細胞は多能性幹細胞（ＰＳＣ）であってもよい。多能性幹細胞（ＰＳＣ）は無限に増殖し、人体内であらゆる種類の細胞を生じさせることができる。ＰＳＣは、治療用途のために多数の分化した細胞を生産するための理想的な出発源となる。ＰＳＣには、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体細胞核移植によって誘導されたＰＳＣ、および誘導ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）が含まれる。例えば、ｉＰＳＣからＴ細胞への分化についてはIriguchi and Kaneko, Cancer Sci. (2019) 110(1):16-22を参照のこと。本明細書で使用される「胚性幹細胞」という用語は、初期胚から得られる多能性幹細胞を指し；いくつかの実施形態では、この用語は、以前に樹立された胚性幹細胞株から得られたＥＳＣを指し、ヒト胚の最近の破壊によって得られた幹細胞は除外される。

他の実施形態では、出発細胞集団は、中胚葉幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞（例えば、骨髄または臍帯血から単離されたもの）、または造血前駆細胞（例えば、リンパ系前駆細胞）などの多分化能細胞であり得る。多分化能細胞は複数の細胞型に発達することができるが、細胞型の可能性は多能性細胞よりも制限されている。多分化能細胞は、樹立された細胞株に由来するものであってもよいし、ヒトの骨髄または臍帯から単離されたものであってもよい。例として、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）誘導性動員、プレリキサフォア誘導性動員、またはそれらの組み合わせの後に、患者または健康なドナーから単離され得る。血液または骨髄からＨＳＣを単離するには、ＣＤ４およびＣＤ８（Ｔ細胞）、ＣＤ４５（Ｂ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）に対する抗体などの不要な細胞に結合する抗体によって血液または骨髄中の細胞を選別する必要がある（例えば、Inaba, et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702を参照）。その後、ＣＤ３４に対する抗体によってＨＳＣをポジティブに選択できる。

いくつかの実施形態では、出発細胞集団は、線維芽細胞などのヒト体細胞、または非同種抗原を標的とするＴＣＲを発現する成熟ＴｒｅｇなどのＴｒｅｇ（Takahashi et al. (2007) Cell 131(5):861-72）などの成熟Ｔ細胞から再プログラムされたヒトｉＰＳＣである。図２５および以下のさらなる議論を参照されたい。

本開示は、誘導ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）などのＰＳＣからＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞を生成する方法を提供する。また、本開示には、中胚葉前駆細胞、造血幹細胞、またはリンパ前駆細胞などの多分化能細胞からＴｒｅｇ細胞を生成する方法も含まれる。多能性幹細胞や組織前駆細胞を含む多分化能細胞は、多能性細胞と比較して、異なる細胞型に分化する能力がより制限されている。

本方法では、多能性細胞または多分化能性細胞は、ＰＫＣ経路および／または他のＴ細胞シグナル伝達経路（例えば、ＴＣＲ活性化経路）を活性化することによって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇを含む）に分化することができる。このような活性化は、胸腺内での自然なＣＤ４^＋Ｔｅｆｆおよび／またはＴｒｅｇの発生を模倣する。これらの経路の活性化は、経路のアゴニストとして作用する小分子および／または高分子の存在下でＣＤ４^＋ＣＤ８^＋細胞を培養することによって達成され得る。このようなアゴニストの例は、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ；ＰＫＣ活性化用）；イオノフォアイオノマイシン（細胞内カルシウムレベルを高め、カルシニューリンとＮＦＡＴ脱リン酸化を増加させるため）、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤（Ｌｃｋ活性を遮断するため；例えば、ＪＮＪ１０１９８４０９、Ａ４１９２５９三塩酸塩、ＡＺＭ４７５２７１、およびアルスターパウロン、例えば、Ｔｏｃｒｉｓで入手可能）；およびＴＣＲおよび共受容体の結合および活性化を促進する抗体または他のタンパク質（例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで入手可能なＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ^ＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ Ｃｅｌｌ ＡｃｔｉｖａｔｏｒなどのＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ２多量体抗体またはアゴニスト複合体）である。ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞（例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞）と細胞を共培養すると、胸腺選択中のＣＤ４^＋ＴＣＲ結合を模倣することもできる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞（二重陽性Ｔ細胞）をＰＭＡおよびイオノマイシンの存在下で培養して、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞への細胞の分化を促進する。特定の実施形態では、ＰＭＡ対イオノマイシンの重量比は、約１：１０～約１：１０００（例えば、１：２０、１：５０、１：１００、１：２５０、または１：５００）である。いくつかの実施形態では、二重陽性細胞は、ＰＭＡおよびイオノマイシンの存在下で約１～５日間、例えば約２４時間培養される。

例として、図１は、ｉＰＳＣから造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、リンパ系前駆細胞、二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４ｓｐ ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇを生成するための段階的プロセスを示す。この例示的なプロセスでは、ｉＰＳＣをまずサイトカインおよび成長因子中で約５～１２日間（例えば、約８日間）胚様体（ＥＢ）に成長させて、それらを中胚葉系譜に分化させ、次にＨＳＰＣに分化させてもよい。例えば、ｉＰＳＣは、約５～２０（例えば、１０）ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、約５～２０（例えば、１０）ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約１０～１００（例えば、５０）ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約５～２０（例えば、１０）ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび約５～２０（例えば、１０）μＭのＹ－２７６３２二塩酸塩の存在下で、約１～５日間（例えば、１日）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ^ＴＭ ＡＰＥＬ２^ＴＭ培地（StemCell Technologies）中で培養して胚様体（ＥＢ）の形成を促進してもよい。次いで、ＥＢは、約１０～５０（例えば、２０）ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約５０～２００（例えば、１００）ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約５～２０（例えば、１０）ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、約１０～５０（例えば、２０）ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３、約１０～５０（例えば、２０）ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、および約１０～１００（例えば、４０）ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で、約１～１０日（例：７日）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ^ＴＭ ＡＰＥＬ２^ＴＭ培地中で、次いで約５０～２００（例えば、１００）ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約１０～５０（例えば、２０）ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３、約１０～５０（例えば、２０）ｎｇ／ｍＬのＴＰＯおよび約１０～１００（例えば、４０）ｍｇ／ｍＬのＩＬ－３の存在下で、約８～１４日間（例えば、６日間）ＳｔｅｍＰｒｏ^ＴＭ－３４（Thermo Fisher）中で培養して、ＨＳＰＣが濃縮された細胞集団を生成してもよい。

ＥＢからのＨＳＰＣはさらに１４日間ほどかけてリンパ前駆細胞に分化する。その後、リンパ系前駆細胞は約７～１４日間かけて、（例えば、Ｔ細胞前駆体成熟培地中で；この培地は、例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ^ＴＭ ＳＦＥＭ ＩＩとＴ細胞前駆体成熟サプリメント（StemCell Technologies）を混合することによって入手可能）ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋（二重陽性）Ｔ細胞に分化され、その時点でホルボール１２－ミリステート１３－アセテートおよびイオノマイシン（ＰＭＡＩ）が約１～３日間（例えば、約１日または約２４時間）培養系に添加され、ＣＤ４系統へのコミットメントを誘導する。ＰＭＡＩ誘導細胞は、ＰＭＡＩの非存在下で約５～１５日間（例えば、７日間）さらに培養することができる。次いで、得られたＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞は、約１～１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１、約１～１０ｎＭのオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、約１０～１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２、およびＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ヒトＴ細胞活性化因子（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ^ＴＭ；またはThermo FisherのＤｙｎａｂｅａｄｓ）を添加して約５～１０日間（例えば、約７日間）で、Ｔｒｅｇにさらに分化させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞への分化は、Ｔ細胞特異的培地を含む培地中で起こり；この培地は、Ｔ細胞前駆体成熟培地とＴ細胞特異的培地などの基本培地を（例えば、体積比１：１で）混合し、ＩＬ－２（例えば、約１０～１０００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２）を補充することによって調製することができる（図２）。Ｔ細胞特異的培地は、Ｔリンパ球の増殖と拡大を促進する培地であり、任意に無血清である。Ｔ細胞特異的培地の例として、ＯｐＴｍｉｚｅｒ^ＴＭ（Thermo Fisher）、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ^ＴＭ－ＸＦ（StemCell Technologies）、およびＸ－ＶＩＶＯ^ＴＭ１５（Ｌｏｎｚａ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法では、ｉＰＳＣからＴｒｅｇへの分化プロセスは完全にフィーダーに依存せずともよい。二重陽性（ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋）Ｔ細胞の発生段階での培養系へのＰＭＡＩの添加は、未熟二重陽性Ｔ細胞をＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞、そして最終的にはＴｅｆｆおよびＴｒｅｇに分化させるための重要なステップである。ＩＬ－２の添加とＴ細胞特異的培地での分化により、集団内の全体的なＴｒｅｇの数が増加する。

いくつかの実施形態では、ＰＭＡは、０．０００１～０．２（例えば、０．０００３１２５～０．１）ｎｇ／μｌで、０．００５～５（例えば、０．００６２５～２）ｎｇ／μｌのイオノマイシンとともに二重陽性Ｔ細胞の組織培養物に添加される。特定の実施形態では、１ＸＰＭＡＩは、組織培養物中の０．０５ｎｇ／μｌのＰＭＡおよび１ｎｇ／μｌのイオノマイシンを指し、二重陽性細胞は、０．００６２５Ｘ、０．１２５Ｘ、０．２５Ｘ、０．５０Ｘ、１Ｘまたは２ＸＰＭＡＩの存在下で約２４時間培養される。二重陽性細胞は、０．００４ＸＰＭＡおよび０．２Ｘイオノマイシン中で約２４時間培養することもできる。本培養法に有用な例示的なＰＭＡＩ濃度（例えば、０．００６２５Ｘ～２Ｘ）を以下の表Ａに示す。

ＰＭＡＩ誘導細胞は、ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞が濃縮された細胞集団を得るために、ＰＭＡＩの非存在下で約１週間さらに培養され得る。本明細書で使用される場合、特定の細胞型が「濃縮された」細胞集団とは、特定の細胞型が全細胞集団の少なくとも３０％（例えば、少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０％）を占めることを意味する。いくつかの実施形態では、ＰＭＡＩ誘導細胞集団は、少なくとも６０～８０％のＣＤ４ｓｐ細胞を含む。

ＣＤ４ｓｐ細胞はさらにＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞またはＴｒｅｇ細胞に分化し得る。例えば、図１および２に示すように、ＣＤ４ｓｐが濃縮されたＴ細胞集団は、ＴＧＦ－β、ＡＴＲＡ、ＩＬ－２、ならびにＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ２８に対する抗体、ならびにＴ細胞特異的培地の存在下で約１週間培養され、Ｔｒｅｇ細胞を取得し得る。Liu et al., Cell Mol Immunol. (2015) 12(5):553-7; Chen and Konkel, Eur J Immunol. (2015) 45(4):958-65も参照。

あるいは、ＣＤ４ｓｐ細胞をＩＬ－１２の存在下で培養して、Ｔｈ１が濃縮されたＴ細胞集団を取得すること；ＩＬ－４の存在下でＴｈ２が濃縮されたＴ細胞集団を取得すること；または、ＩＬ－６およびＴＧＦ－βの存在下でＴｈ１７が濃縮されたＴ細胞集団を取得すること、もできる。

ＣＤ４^＋Ｔｅｆｆおよび／またはＴｒｅｇは、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用し、その細胞型に特異的な細胞表面または細胞内マーカーを使用して、培養細胞集団から精製できる。総ＣＤ４ｓｐ細胞の場合、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβのマーカーを使用できる。総Ｔｒｅｇについては、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７のマーカーを使用できる。ナイーブＴｒｅｇの場合は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡのマーカーを使用できる。精製された細胞は、その後の治療用途のために凍結保存または増殖される。

ｉＰＳＣから分化したＴ細胞を取得するためのプロセスについては、図２６および２８も参照されたい。

ＩＩ．多能性細胞および多分化能細胞からＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞を生成するための遺伝子工学的手法
ｉＰＳＣなどの前駆細胞または幹細胞のＴｅｆｆおよびＴｒｅｇへの分化をさらに促進するために、前駆細胞または幹細胞の系統コミットメントを促進してＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞になり、最終的にＴｒｅｇ細胞になる１つ以上のタンパク質を発現するように細胞を操作してもよい。これらのコミットメント因子は、Ｔｒｅｇ分化プロセスの全体または一部で構成的に過剰発現され得るか、またはＴｒｅｇ分化プロセスの特定の期間中に誘導的に発現され得る（例えば、ドキシサイクリン誘導性ＴｅｔＲ媒介遺伝子発現を介して）。

いくつかの実施形態では、コミットメント因子は、（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはトランスポゾンを使用することによって）幹細胞または前駆細胞のゲノムにランダムに組み込まれた導入遺伝子によってコードされる。

あるいは、コミットメント因子は、部位特異的に幹細胞または前駆細胞のゲノムに組み込まれる導入遺伝子によってコードされる。例えば、導入遺伝子は、ゲノムのセーフハーバー部位、またはＴ細胞受容体α鎖定常領域（すなわち、Ｔ細胞受容体α定常またはＴＲＡＣ）遺伝子などのＴ細胞特異的遺伝子のゲノム遺伝子座に組み込まれる。前者のアプローチでは、必要に応じて、導入遺伝子をＴ細胞特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターの転写制御下に置くことができる。後者のアプローチでは、導入遺伝子は、内因性プロモーターおよびＴ細胞特異的遺伝子の他の転写調節エレメント（ＴＣＲα鎖プロモーターなど）の制御下で発現できる。導入遺伝子をＴ細胞特異的プロモーターの制御下に置くことの利点は、意図どおりに導入遺伝子がＴ細胞でのみ発現されることにより、操作された細胞の臨床安全性が向上することである。

１．ＣＤ４^＋ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇコミットメント因子をコードする導入遺伝子
ｉＰＳＣなどの前駆細胞または幹細胞のＴｅｆｆおよびＴｒｅｇへの分化をさらに促進するには、前駆細胞または幹細胞の系統コミットメントを促進してＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞になり、最終的にＴｒｅｇ細胞になる１つ以上のタンパク質を発現するように細胞を操作し得る。本方法において、幹細胞または前駆細胞のＣＤ４^＋Ｔｅｆｆへの分化を促進するためにそのゲノムに導入される導入遺伝子は、限定されないが、ＣＤ４、ＣＴＬＡ－４、Ｇａｔａ３およびＴｈＰＯＫである。ＣＤ４^＋Ｔｒｅｇへのさらなる分化を促進することができる導入遺伝子は、限定されないが、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＣＤ４ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、Ｈｅｌｉｏｓ、ＧＩＴＲ、Ｉｋａｒｏｓ、ＣＴＬＡ４、Ｇａｔａ３、Ｔｏｘ、ＥＴＳ１、ＬＥＦ１、ＲＯＲＡ、ＴＮＦＲ２、およびＴｈＰＯＫのうちの１つまたは複数をコードするものであり得る。これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびその他のよく知られた遺伝子データベースで入手できる。これらのタンパク質の１つまたは複数の発現は、分化中に幹細胞または前駆細胞をＴｒｅｇ運命（Ｔｒｅｇ ｆａｔｅ）に委ねるのに役立つ。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、Ｔｒｅｇ系統決定因子ＦＯＸＰ３および／またはＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞系統コミットメント因子ＴｈＰＯＫをコードする（He et al., Nature (2005) 433(7028):826-33）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、Ｔｒｅｇの部分集団において発現されるＨｅｌｉｏｓをコードする（Thornton et al., Eur J Immunol. (2019) 49(3):398-412）。

いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）多分化能を増強するコミットメント因子を過剰発現するように操作され得る（Sugimura et al., Nature (2017) 545(7655):432-38を参照）。これらの因子には、ＨＯＸＡ９、ＥＲＧ、ＲＯＲＡ、ＳＯＸ４、ＬＣＯＲ、ＨＯＸＡ５、ＲＵＮＸ１、およびＭＹＢが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＨＳＣ多分化能を増強するために、操作された部位特異的転写抑制構築物（例えば、ＺＦＰ－ＫＲＡＢ、ＣＲＩＳＰＲｉなど）、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを介してＥＺＨＩを下方制御するように操作され得る（Vo et al., Nature (2018) 553(7689):506-510を参照）。

Ｔｒｅｇ の表現型は不安定になりがちである。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ表現型を維持するため、および／または操作されたＴｒｅｇ細胞におけるＴｒｅｇ系統コミットメント因子および導入遺伝子の発現を増加させるために、細胞は、ラパマイシンおよび／または高濃度のＩＬ－２を含有する組織培養培地中で培養され得る（例えば、MacDonald et al., Clin Exp Immunol. (2019) 197:11-13を参照）。可塑性は、ほぼすべての種類の免疫細胞に固有の特性である。Ｔｒｅｇ細胞は炎症および環境条件下でＴｅｆｆ細胞に移行（「ドリフト」）できるようである（Sadlon et al., Clin Transl Imm. (2018) 7(2):e1011）。ＣＡＲまたは改変ＴＣＲなどの抗原特異的部分を有する改変モノクローナルＴｒｅｇは、自己免疫活性または臓器移植部位での免疫調節応答の増強を可能にし得る。

２．コミットメント因子をコードする導入遺伝子の組み込み
幹細胞または前駆細胞を遺伝的に操作するために、目的の導入遺伝子を運ぶ異種ヌクレオチド配列が細胞に導入される。ここでの「異種」という用語は、その配列が天然には存在しないゲノムの部位に挿入されることを意味する。いくつかの実施形態では、異種配列は、Ｔｒｅｇ細胞において特異的に活性なゲノム部位に導入される。このような部位の例は、Ｔ細胞受容体鎖（例えば、ＴＣＲα鎖、β鎖、γ鎖、またはδ鎖）、ＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３ζ、ε、δまたはγ鎖）、ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ４、Ｉｋａｒｏｓ、ＴＮＦＲ２またはＣＤ４をコードする遺伝子である。

例として、異種配列は、ゲノム内の一方または両方のＴＲＡＣ対立遺伝子に導入される。ＴＲＡＣ遺伝子座のゲノム構造を図１９および２０に示す。ＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＣＲα鎖ＶおよびＪ遺伝子の下流にある。ＴＲＡＣには３つのエクソンが含まれており、これらはＴＣＲα鎖の定常領域に転写される。ヒトＴＲＡＣ遺伝子の遺伝子配列およびエクソン／イントロン境界は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ２８７５５または６９５５で見つけることができる。組込みの標的部位は、例えば、イントロン（例えば、イントロン１または２）、ＴＲＡＣ遺伝子の最後のエクソンの下流領域、エクソン（例えば、エクソン１、２、または３）、またはイントロンとその隣接するエクソンの間の接合部であってもよい。

図１９および２０は、遺伝子編集を通じてヒトＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン２への異種配列の組み込みを標的とする２つの異なるアプローチを示す。両方のアプローチにおいて、導入遺伝子は、自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｔ２Ａ）によって分離された、１つ以上のＴｒｅｇコミットメント因子または誘導因子（例えば、ＦＯＸＰ３）を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＦＯＸＰ３導入遺伝子は、Ｔｒｅｇ抑制活性を増強するために、アセチル化されることが知られているリジン残基をアルギニン残基（例えば、Ｋ３１Ｒ、Ｋ２６３Ｒ、Ｋ２６８Ｒ）に変換するように操作される（Kwon et al., J Immunol. (2012) 188(6):2712-21を参照）。

図１９に示すアプローチでは、操作された細胞におけるＴＣＲα鎖の発現は、異種配列の挿入によって破壊される。このアプローチでは、ゲノムに組み込まれる異種配列には、５’から３’まで、（ｉ）自己切断ペプチドＴ２Ａのコード配列（または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列）、（ｉｉ）コミットメント因子のコード配列および（ｉｉｉ）ポリアデニル化（ポリＡ）部位が含まれる。組み込まれると、操作されたＴＲＡＣ遺伝子座は内因性プロモーターの下でコミットメント因子を発現する。ここで、Ｔ２Ａペプチドにより、最初のコミットメント因子（すなわち、任意のＴＣＲ可変ドメイン配列ならびにエクソン１およびエクソン２の５’から組み込み部位までの部分によってコードされる任意の定常領域配列）からのＴＣＲα鎖配列の除去が可能になる。ＴＲＡＣ遺伝子が破壊されているため、操作された細胞では機能的なＴＣＲα鎖を生成できない。導入遺伝子にＰ２Ａコード配列が含まれているため、操作された遺伝子座はすべての個々のＴｒｅｇ誘導因子を別個のポリペプチドとして発現できる。このアプローチの下では、幹細胞または前駆細胞は、所望の抗原認識受容体（例えば、対象の抗原を標的とするＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現するようにさらに操作され得る。

図２０に示すアプローチでは、異種配列は、５’から３’まで、（ｉ）組込み部位の３’側にＴＲＡＣエクソン配列（すなわち、組込み部位の下流にある残りのエクソン２配列、およびエクソン３配列全体）、（ｉｉ）Ｔ２Ａのコード配列（またはＩＲＥＳ配列）、（ｉｉｉ）１つ以上のコミットメント因子のコード配列、および（ｉｖ）ポリＡ部位を含み得る。異種配列にＴＲＡＣエクソン配列およびＴ２Ａを含めることにより、完全なＴＣＲα鎖の生成が可能になる。Ｐ２Ａを含めることにより、コミットメント因子を別個のポリペプチドとして生成することが可能になる。ＴＣＲα鎖、外因的に導入されたコミットメント因子はすべて、内因性ＴＣＲα鎖プロモーターの制御下で発現される。このアプローチは、ＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子座がすでに再構成されている成熟Ｔｒｅｇから再プログラムされたｉＰＳＣを操作するのに特に適している（図２５および以下のディスカッションを参照）。このような遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化したＴｒｅｇは、祖先Ｔｒｅｇ細胞の抗原特異性を保持する。さらに、ＴＣＲシグナル伝達は胸腺におけるＴ細胞およびＴｒｅｇの発生に一体的に関与しているため、ＴＣＲα鎖発現の保持によりＴ細胞およびＴｒｅｇの分化が促進され得る。

別の実施形態では、導入遺伝子は、ＴＲＡＣエクソンではなく、ＴＲＡＣイントロンに組み込まれてもよい。例えば、導入遺伝子はエクソン２またはエクソン３の上流のイントロンに組み込まれる。このような実施形態では、導入遺伝子を有する異種配列は、５’から３’まで、スプライスアクセプター（ＳＡ）配列、１つ以上のＴｒｅｇコミットメント因子をコードする導入遺伝子、およびポリＡ部位を含み得る。再構成されたＴＣＲα鎖遺伝子の発現が望ましい場合、異種配列は５’から３’まで、（ｉ）ＳＡ配列、（ｉｉ）異種配列組み込み部位の下流の任意のエクソン、（ｉｉｉ）自己切断ペプチドまたはＩＲＥＳ配列のコード配列、（ｉｖ）１つまたは複数のコミットメント因子をコードする導入遺伝子、および（ｖ）ポリＡ部位を含み得る。ＳＡが組み込まれると、無傷（すなわち、完全長）ＴＣＲα鎖、自己切断ペプチド、およびコミットメント因子をコードするＲＮＡ転写物の発現が可能になる。このＲＮＡ転写物の翻訳により、２つ（またはそれ以上）の別個のポリペプチド生成物、つまり無傷のＴＣＲα鎖と１つまたは複数のコミットメント因子が生成される。ＳＡ配列の例は、ＴＲＡＣエクソンの配列および当技術分野で知られている他のＳＡ配列である。

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、操作された細胞のゲノムセーフハーバーに組み込まれる。ゲノムのセーフハーバー部位には、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、アルブミン、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４の遺伝子座、および遺伝子操作された細胞内で内因性遺伝子がノックアウトされる遺伝子座（例えば、Ｔ細胞受容体α鎖またはβ鎖遺伝子座、ＨＬＡ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはβ２－ミクログロブリン遺伝子座）が含まれるが、これらに限定されない。図２１は、そのようなアプローチを示している。この例では、異種配列は、例えばイントロン１でヒトＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれる。導入遺伝子をコードするコミットメント因子の発現は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターによって制御される。ドキシサイクリン誘導性プロモーターは、Ｔｅｔ応答エレメントの５－ｍｅｒ反復を含み得る。ドキシサイクリンを組織培養に導入すると、構成的に発現した誘導型のテトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）がＴｅｔ応答エレメントに結合し、コミットメント因子の転写を開始する。導入されたｍＲＮＡから生成されるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、イントロン１の特定の部位（稲妻）で二本鎖を切断する。プラスミドＤＮＡまたは線状二本鎖ＤＮＡによって導入されるドナー配列には、５’から３’に相同領域１、ＡＡＶＳ１エクソン１にスプライスするためのスプライスアクセプター（ＳＡ）、自己切断ペプチド２Ａのコード配列、ピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列、ポリＡシグナル配列、５’ゲノムインシュレーター配列、ドキシサイクリン誘導性コミットメント因子カセット、ＣＡＧＧプロモーターから駆動され、その後にポリＡ配列が続くｒｔＴＡコード配列、３’ゲノムインスレーター配列、および相同領域２が含まれる。ゲノムインスレーター配列は、その中の導入遺伝子が分化の過程でエピジェネティックにサイレンシングされないことを保証する。相同領域は、ＺＦＮ切断部位に隣接するゲノム領域と相同である。標的組み込み（ＴＩ）に成功した細胞は、ピューロマイシンを培養物に導入することによってポジティブに選択できる。特定の因子は中胚葉、造血、またはリンパ球の発生中に毒性を示す可能性があるため、Ｔｒｅｇ誘導因子の誘導発現は有用であり、したがってＴ細胞の発生中にのみ因子をオンにして分化をＴｒｅｇ系統に偏らせることが有利である。

いくつかの実施形態では、異種配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原結合受容体のための発現カセットを含む。図２３および２４は、そのような実施形態の例を示す。図２３では、異種配列はプラスミドＤＮＡまたは線状二本鎖ＤＮＡによって導入され、５’から３’まで、相同性領域１、それ自体のプロモーターから駆動され、ポリＡ部位を含むＣＡＲ発現カセット（ドナーに対してアンチセンス方向）、５’ＬｏｘＰ部位、ＡＡＶＳ１エクソン１にスプライスするスプライスアクセプター、自己切断ペプチド２Ａのコード配列、ピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列、自殺遺伝子ＨＳＶ－ＴＫのコード配列、ポリＡ部位、５’ゲノムインスレーター配列、ドキシサイクリン誘導性コミットメント因子発現カセット、ＣＡＧＧプロモーターから駆動されるｒｔＴＡコード配列、２Ａペプチドを介してｒｔＴＡ配列に結合し、その後にポリＡ配列が続くＣｒｅリコンビナーゼの４－ヒドロキシ－タモキシフェン（４－ＯＨＴ）誘導型のコード配列、３’ゲノムインシュレーター配列、３’ＬｏｘＰ部位、および相同領域２を含む。ゲノムインスレーター配列は、その中の導入遺伝子が分化の過程でエピジェネティックにサイレンシングされないことを保証する。相同領域は、ＺＦＮ切断部位に隣接するゲノム領域と相同である。組織培養にピューロマイシンを導入することにより、標的化された組み込みが成功した細胞をポジティブに選択できる。構成的に発現された４－ＯＨＴ誘導性Ｃｒｅにより、培養物に４－ＯＨＴを添加した後、ＬｏｘＰ部位間のカセット全体の切除が可能になる。リコンビナーゼ媒介切除を受けていない細胞は依然としてＨＳＶ－ＴＫを発現するため、組織培養にガンシクロビル（ＧＣＶ）を添加することでネガティブに選択（除去）できる。ＧＣＶは、ＨＳＶ－ＴＫを発現するあらゆる細胞の細胞死をもたらす。このシステムは、遺伝子操作されたＴｒｅｇにおける標的免疫抑制を可能にするために統合されたＣＡＲカセットを残しながら、Ｔｒｅｇ誘導カセットを完全に傷跡なく除去することを可能にする。

図２４は、操作されたＴＲＡＣ遺伝子からのＣＡＲの発現を示す。この例では、プラスミドＤＮＡまたは直鎖状ｄｓＤＮＡによって導入された異種配列には、５’から３’に相同領域１、その後にポリＡ部位が続くＣＡＲコード配列に直接融合された２Ａコード配列、５’ＬｏｘＰ部位、５’ゲノムインスレーター配列、ＡＡＶＳ１エクソン１にスプライスするスプライスアクセプター、２Ａコード配列、両方とも独自のプロモーターから駆動され、その後にポリＡシグナル配列が続く、ピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列と自殺遺伝子ＨＳＶ－ＴＫの２Ａペプチド結合コード配列、ドキシサイクリン誘導性Ｔｒｅｇ誘導因子発現カセット、ＣＡＧＧプロモーターから駆動されるｒｔＴＡコード配列、２Ａペプチドを介してｒｔＴＡ配列に結合し、その後にポリＡ配列が続くＣｒｅリコンビナーゼの４－ＯＨＴ誘導型のコード配列、３’ゲノムインシュレーター配列、３’ＬｏｘＰ部位、および相同領域２が含まれる。ゲノムインスレーター配列は、その中の導入遺伝子が分化の過程でエピジェネティックにサイレンシングされないことを保証する。相同領域は、ＺＦＮ切断部位に隣接するゲノム領域と相同である。標的組み込みが成功した細胞は、ピューロマイシンを組織培養に導入することによってポジティブに選択できる（任意に、組み込まれていないドナーエピソームが希釈されるまで１週間以上待つこともある）。構成的に発現された４－ＯＨＴ誘導性Ｃｒｅにより、培養物に４－ＯＨＴを添加した後、ＬｏｘＰ部位間のカセット全体の切除が可能になる。リコンビナーゼ媒介切除を受けていない細胞は依然としてＨＳＶ－ＴＫを発現するため、組織培養にＧＣＶを添加することで除去できる。このシステムは、内在性ＴＲＡＣプロモーターから駆動されるＣＡＲカセットを統合したままにして、Ｔｒｅｇ誘導カセットを完全に傷跡なく除去することを可能にし、操作されたＴｒｅｇにおける標的免疫抑制を可能にする。

上述の図は、本発明のいくつかの実施形態を単に例示するものである。例えば、他の自己切断ペプチドを、図に示されるＴ２ＡおよびＰ２Ａペプチドの代わりに使用することができる。自己切断ペプチドは、典型的な長さが１８～２２アミノ酸のウイルス由来のペプチドである。自己切断性２Ａペプチドには、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａが含まれる。さらに、２Ａペプチドのコドン多様化バージョンを使用して、１つの大きな統合導入遺伝子カセット上で複数のＴｒｅｇ誘導遺伝子を組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドコード配列の代わりにＩＲＥＳが使用される。イントロンとエクソンの両方がターゲットになる場合がある。追加の要素が異種配列に含まれていてもよい。例えば、異種配列には、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）などのＲＮＡ安定化エレメントが含まれ得る。

３．遺伝子編集方法
異種配列を特定のゲノム部位に標的として組み込むための任意の遺伝子編集方法を使用することができる。導入遺伝子の部位特異的組込みの精度を高めるために、異種配列を有する構築物は、その末端の一方または両方に、標的ゲノム部位と相同である相同領域を含み得る。いくつかの実施形態では、異種配列は、５’末端領域および３’末端領域の両方に、Ｔ細胞特異的遺伝子座またはゲノムセーフハーバー遺伝子座における標的ゲノム部位と相同である配列を保有する。異種配列上の相同領域の長さは、例えば、５０～１，０００塩基対の長さであり得る。異種配列内の相同領域は、標的ゲノム配列と同一であってもよいが、同一である必要はない。例えば、異種配列中の相同領域は、標的ゲノム配列（例えば、異種配列中の相同領域によって置換される配列）と８０パーセント以上（例えば、８５パーセント以上、９０パーセント以上、９５パーセント以上、９９パーセント以上）相同または同一であり得る。さらなる実施形態では、構築物は、線状化された場合、一方の端に相同領域１を含み、他方の端に相同領域２を含み、ここで、相同領域１および２は、それぞれ、ゲノム中の組込み部位に隣接するゲノム領域１およびゲノム領域２と相同である。

異種配列を有する構築物は、化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクションおよびリポフェクション）、非化学的方法（例えば、エレクトロポレーションおよび細胞圧搾）粒子ベースの方法（例えば、マグネフェクション）、およびウイルス形質導入（例えば、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、およびハイブリッドウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用することによる）などの任意の既知の技術によって標的細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、構築物はＡＡＶウイルスベクターであり、昆虫細胞／バキュロウイルス生産系や哺乳類細胞生産系などの生産系におけるＡＡＶビリオンの生産を可能にするために両端にＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を有することを含む構築物をゲノムに含む組換えＡＡＶビリオンによって標的ヒト細胞に導入される。ＡＡＶは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、またはＡＡＶ２／６などの偽型のいずれであってもよい。

異種配列は、任意の部位特異的遺伝子ノックイン技術によってＴＲＡＣゲノム遺伝子座に組み込むことができる。このような技術には、限定されないが、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはニッカーゼ（本明細書では集合的に「ＺＦＮ」）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはニッカーゼ（本明細書では集合的に「ＴＡＬＥＮ」）、クラスタ化調節的スペース間短パリンドローム反復システム（ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９またはｃｐｆ１を使用するものなど）、メガヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、およびトランスポーズに基づく遺伝子編集技術が含まれる。以下の実施例で示すように、部位特異的遺伝子編集の場合、編集ヌクレアーゼは典型的に、標的ゲノム配列（例えば、本明細書に記載の構築物）に対して相同性を有するドナーポリヌクレオチドがＤＮＡ切断修復のための鋳型として使用されるように、標的ゲノム配列内にＤＮＡ切断（例：一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断）を生成し、その結果、ゲノム部位へのドナーポリヌクレオチドの導入がもたらされる。

遺伝子編集技術は当技術分野でよく知られている。例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術については、米国特許第８，６９７，３５９号、８，７７１，９４５号、８，７９５，９６５号、８，８６５，４０６号、８，８７１，４４５号、８，８８９，３５６号、８，８９５，３０８号、８，９０６，６１６号、８，９３２，８１４号、８，９４５，８３９号、８，９９３，２３３号、８，９９９，６４１号、９，７９０，４９０号、１０，０００，７７２号、１０，１１３，１６７号、および１０，１１３，１６７号を参照されたい。例えば、ＺＦＮ技術とＴ細胞および幹細胞の編集におけるその応用については、米国特許第８，７３５，１５３号、８，７７１，９８５号、８，７７２，００８号、８，７７２，４５３号、８，９２１，１１２号、８，９３６，９３６号、８，９４５，８６８号、８，９５６，８２８号、９，２３４，１８７号、９，２３４，１８８号、９，２３８，８０３号、９，３９４，５４５号、９，４２８，７５６号、９，５６７，６０９号、９，５９７，３５７号、９，６１６，０９０号、９，７１７，７５９号、９，７５７，４２０号、９，７６５，３６０号、９，８３４，７８７号、９，９５７，５２６号、１０，０７２，０６２号、１０，０８１，６６１号、１０，１１７，８９９号、１０，１５５，０１１号、および１０，２６０，０６２号を参照されたい。前述の特許の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

遺伝子編集技術では、複合体のＤＮＡ結合特異性を変更することで、特定のゲノム部位を標的とするように遺伝子編集複合体を調整できる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ技術では、特定のゲノム領域に結合するようにガイドＲＮＡ配列を設計でき、また、ＺＦＮ技術では、ＺＦＮのジンクフィンガータンパク質ドメインは、ＺＦＮのヌクレアーゼまたはニッカーゼドメインが部位特異的な方法でゲノムＤＮＡを切断できるように、特定のゲノム領域に特異的なジンクフィンガーを有するように設計することができる。所望のゲノム標的部位に応じて、遺伝子編集複合体をそれに応じて設計することができる。

遺伝子編集複合体の成分は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ヴィロソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡまたはｍＲＮＡ、人工ビリオンなどの周知の方法により、導入遺伝子構築物と同時に、または導入遺伝子構築物に続いて、標的細胞に送達され得る。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Rich-Mar）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼまたはニッカーゼを含む遺伝子編集複合体の１つまたは複数の成分が、編集される細胞にｍＲＮＡとして送達される。

４．Ｔｒｅｇの抗原特異性
いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原認識受容体をコードする導入遺伝子を含むように（例えば、本明細書に記載の遺伝子編集方法を使用して）さらに操作されてもよい。あるいは、幹細胞または前駆細胞は、すでにＴＣＲα／β（またはδ／γ）遺伝子座を再構成した成熟Ｔｒｅｇから再プログラムされた細胞であり、そのような幹細胞または前駆細胞から再分化したＴｒｅｇはそれらの祖先であるＴｒｅｇの抗原特異性を保持する。いずれにせよ、Ｔｒｅｇは、特定の治療目標に対する目的の抗原に対する特異性によって選択され得る。

いくつかの実施形態では、目的の抗原は、固形臓器移植における細胞によって、または細胞ベースの治療（例えば、骨髄移植、癌ＣＡＲＴ治療、または細胞ベースの再生療法）における細胞によって発現されるものなどの、多型同種異系ＭＨＣ分子である。そのように標的化されるＭＨＣ分子には、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、またはＨＬＡ－ＤＲが含まれるが、これらに限定されない。一例として、対象の抗原はクラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ２である。ＨＬＡ－Ａ２は、移植において一般的に不一致となる組織適合性抗原である。ＨＬＡ－Ａの不一致は、移植後の予後不良と関連する。ＭＨＣクラスＩ分子に特異的なＣＡＲを発現する改変Ｔｒｅｇは、ＭＨＣクラスＩ分子がすべての組織で広く発現されるため、移植の組織型に関係なく臓器移植に使用できるため、有利である。ＨＬＡ－Ａ２に対するＴｒｅｇは、ＨＬＡ－Ａ２がヒト集団のかなりの割合で発現され、したがって多くのドナー臓器で発現されるというさらなる利点を提供する。Ｔｒｅｇ細胞におけるＨＬＡ－Ａ２ＣＡＲの発現が、移植拒絶反応を防ぐＴｒｅｇ細胞の効力を高めることができることを示す証拠がある（例えば、Boardman、前出；MacDonald et al., J Clin Invest. (2016) 126(4):1413-24；およびDawson、前出を参照）。

いくつかの実施形態では、目的の抗原は自己抗原、すなわち、身体の特定の組織の自己免疫炎症部位で一般的にまたは独特に発現される内因性抗原である。このような抗原に特異的なＴｒｅｇは、炎症を起こした組織に到達し、局所的な免疫抑制を引き起こすことで組織特異的な活性を発揮する。自己抗原の例は、アクアポリン水チャネル（例えば、アクアポリン－４水チャネル）、腫瘍随伴抗原Ｍａ２、アンフィフィシン、電位依存性カリウムチャネル、Ｎ－メチル－ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソオキサゾールプロピオン酸受容体（ＡＭＰＡＲ）、甲状腺ペルオキシダーゼ、サイログロブリン、抗Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＲ１サブユニット）、Ｒｈ血液型抗原、デスモグレイン１または３（Ｄｓｇｌ／３）、ＢＰ１８０、ＢＰ２３０、アセチルコリンニコチン性シナプス後受容体、甲状腺刺激ホルモン受容体、血小板インテグリン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、カルパスタチン、シトルリン化タンパク質、α－β－クリスタリン、胃壁細胞の内因子、ホスホリパーゼＡ２受容体１（ＰＬＡ２Ｒ１）、およびトロンボスポンジン１型ドメイン－含有７Ａ（ＴＨＳＤ７Ａ）である。自己抗原のさらなる例は、多発性硬化症関連抗原（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、希突起膠細胞ミエリンオリゴタンパク質（ＯＭＧＰ）、ミエリン関連希突起膠細胞塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ／Ｃｌａｕｄｉｎ１１）、希突起膠細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン関連神経突起伸長阻害剤ＮＯＧＯＡ、糖タンパク質Ｐｏ、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、２’３’－環状ヌクレオチド３’－ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）およびそのフラグメント）；関節関連抗原（例えば、シトルリン置換環状および直鎖フィラグリンペプチド、ＩＩ型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９ペプチド、ケラチン、ビメンチン、フィブリノーゲン、およびＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＶ型コラーゲンペプチド）；および眼関連抗原（例えば、レチナールアレスチン、Ｓ－アレスチン、光受容体間レチノイド結合タンパク質、β－クリスタリンＢ１、網膜タンパク質、脈絡膜タンパク質、およびそれらの断片）などである。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞によって標的化される自己抗原は、ＩＬ２３－Ｒ（例えば、クローン病、炎症性腸疾患、または関節リウマチの治療用）、ＭＯＧ（多発性硬化症の治療用）、またはＭＢＰ（多発性硬化症の治療用）である。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇは、他の目的の抗原（例えば、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９およびＣＤ２０）を標的とすることができる。

いくつかの実施形態では、同種異系抗原ではなく外来ペプチド（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、およびＨＳＶ）を認識するＴｒｅｇは、ＴＣＲ発現のノックアウトを必要とせずに、同種異系抗原を認識することによって常に活性化されるリスクを伴うことなく、同種異系養子細胞移入設定において使用することができる。

５．追加のゲノム編集
本発明の操作された細胞は、上記のゲノム編集の前または後にさらに遺伝子操作されて、細胞をより有効にし、より多くの患者集団に対してより使用可能にし、および／またはより安全にすることができる。遺伝子操作は、例えば、目的の異種配列のランダム挿入（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはトランスポゾンを使用することによって）、または標的ゲノム組み込み（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、部位特異的操作リコンビナーゼ、またはメガヌクレアーゼによって媒介されるゲノム編集を使用することによって）によって行われ得る。

例えば、細胞は、細胞のゲノムへのＣＡＲまたはＴＣＲ導入遺伝子の部位特異的組み込みを通じて１つまたは複数の外因性ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作され得る。外因性ＣＡＲまたはＴＣＲは、上記のように、目的の抗原を標的とすることができる。

細胞は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を促進する１つまたは複数の治療薬をコードするように編集することもできる。治療薬の例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０）、ケモカイン（例えば、ＣＣＲ７）、成長因子（例えば、多発性硬化症の治療のための再ミエリン化因子）、およびシグナル伝達因子（例えば、アンフィレグリン）が含まれる。

さらなる実施形態では、細胞は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および／または神経毒性などの細胞療法の重篤な副作用および／または毒性を軽減する因子（例えば、抗ＩＬ－６ｓｃＦｖまたは分泌型ＩＬ－１２）を発現するようにさらに操作される（例えば、Chmielewski et al., Immunol Rev. (2014) 257(1):83-90を参照）。

いくつかの実施形態では、ＥＺＨ１シグナル伝達は、操作された細胞において破壊されて、それらのリンパ球への関与を増強する（例えば、Vo et al., Nature (2018) 553(7689):506-10を参照）。

いくつかの実施形態では、編集された細胞は、患者にとっての同種異系細胞であり得る。このような場合、細胞は、これらの細胞に対する宿主の拒絶反応（移植片拒絶）および／またはこれらの細胞による宿主に対する潜在的な攻撃（移植片対宿主病）を軽減するようにさらに操作され得る。さらに操作された同種細胞は、適合性の問題なく複数の患者に使用できるため、特に有用である。したがって、同種異系細胞は「汎用」と呼ばれ、「既製」で使用できる。「ユニバーサル」細胞の使用により、効率が大幅に向上し、採用される細胞療法のコストが削減される。

「ユニバーサル」な同種異系細胞を生成するためには、例えば以下の１つまたは複数についてヌル遺伝子型を持つように細胞を操作することができる：（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲα鎖またはβ鎖）；（ｉｉ）多型主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、またはＨＬＡ－ＤＲ；またはβ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ））；（ｉｉｉ）抗原プロセシングに関連するトランスポーター（例えば、ＴＡＰ－１またはＴＡＰ－２）；（ｉｖ）クラスＩＩＭＨＣトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）；（ｖ）マイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ；例えば、ＨＡ－１／Ａ２、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－８、ＨＢ－１Ｈ、またはＨＢ－１Ｙ）；（ｖｉ）ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント阻害剤；（ｖｉｉ）ＶＩＭ；および（ｖｉ）それらの任意の組み合わせ。

同種遺伝子操作細胞はまた、宿主のナチュラルキラー細胞および抗移植片拒絶に関与する他の免疫細胞に対する操作細胞（特にＨＬＡクラスＩノックアウトまたはノックダウンを有する細胞）の耐性を高めるために、不変ＨＬＡまたはＣＤ４７を発現することもできる。例えば、コミットメント因子導入遺伝子を有する異種配列は、インバリアントＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、およびＨＬＡ－Ｆ）またはＣＤ４７のコード配列をさらに含んでもよい。不変ＨＬＡまたはＣＤ４７コード配列は、自己切断ペプチドまたはＩＲＥＳ配列のコード配列を介して、異種配列の一次導入遺伝子に連結され得る。

６．操作細胞の安全スイッチ
細胞治療においては、患者内での細胞の存在が望まれなくなったときに細胞の増殖を停止できるように、移植細胞がそのゲノムに「安全スイッチ」を含むことが望ましい場合がある（例えば、Hartmann et al., EMBO Mol Med. (2017) 9:1183-97を参照）。安全スイッチは、例えば、患者に医薬化合物を投与すると、細胞がアポトーシスに入るように活性化または不活性化される自殺遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、ヒトの細胞内で無害な物質を有毒な代謝物に変換する、ヒトには見られない酵素（細菌またはウイルスの酵素など）をコードし得る。

いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子であり得る。ＴＫは、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ファムシクロビル、または別の同様の抗ウイルス薬を代謝して、ＤＮＡ複製を妨げ、細胞アポトーシスを引き起こす有毒化合物を生成する。したがって、そのような抗ウイルス薬の１つを患者に投与することによって、宿主細胞内のＨＳＶ－ＴＫ遺伝子が作動して細胞を殺すことができる。

他の実施形態では、自殺遺伝子は、例えば、他のチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ（またはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ；抗真菌薬の５－フルオロシトシンを５－フルオロウラシルに変換する）、ニトロレダクターゼ（ＣＢ１９５４（［５－（アジリジン－１－イル）－２，４－ジニトロベンズアミド］）を有毒化合物（４－ヒドロキシルアミン）に変換する）、およびシトクロムＰ４５０（イホスファミドをアクロレイン（窒素マスタード）に変換する）（Rouanet et al., Int J Mol Sci. (2017) 18(6):E123１）、または誘導性カスパーゼ－９（Jones et al., Front Pharmacol. (2014) 5:254）をコードする。さらなる実施形態では、自殺遺伝子は、細胞内抗体、テロメラーゼ、他のカスパーゼ、またはＤＮＡアーゼをコードし得る。例えば、Zarogoulidis et al., J Genet Syndr Gene Ther. (2013) doi:10.4172/2157-7412.1000139を参照。

安全スイッチはまた、「オン」または「加速」スイッチ、低分子干渉ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または細胞生存に重要な細胞タンパク質の発現を干渉するアンチセンスをコードする遺伝子であり得る。

安全スイッチは、任意の適切な哺乳類および他の必要な転写調節配列を利用することができる。安全スイッチは、本明細書に記載の遺伝子編集技術または当技術分野で知られている他の技術を使用して、ランダム組込みまたは部位特異的組込みを通じて細胞に導入することができる。遺伝子操作された細胞の遺伝的安定性および臨床的安全性が維持されるように、ゲノムのセーフハーバーに安全スイッチを組み込むことが望ましい場合がある。本開示で使用されるセーフハーバーの例は、ＡＡＶＳ１遺伝子座；ＲＯＳＡ２６遺伝子座；ＣＬＹＢＬ遺伝子座；アルブミン、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４の遺伝子座；および遺伝子操作された細胞内で内因性遺伝子がノックアウトされる遺伝子座（例えば、Ｔ細胞受容体α鎖またはβ鎖遺伝子座、ＨＬＡ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはβ２－ミクログロブリン遺伝子座）である。

ＩＩＩ．Ｔｅｆｆ細胞とＴｒｅｇ細胞の使用
本開示のＴｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞は、免疫寛容の誘導または免疫恒常性の回復を必要とする患者（例えば、ヒト患者）を治療するための細胞療法に使用することができる。「治療する」および「治療」という用語は、治療される状態の１つまたは複数の症状の緩和または除去、症状の発生または再発の予防、組織損傷の逆転または修復、および／または疾患の進行の遅延を指す。

本明細書における患者は、自己免疫疾患などの望ましくない炎症状態を有するか、またはそのリスクを有する患者であり得る。自己免疫疾患の例としては、アジソン病、ＡＩＤＳ、強直性脊椎炎、抗糸球体基底膜疾患自己免疫性肝炎、皮膚炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎など）、多発性筋炎、肺胞蛋白症、多発性硬化症、重症筋無力症、視神経脊髄炎、ＰＡＮＤＡＳ、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性皮膚硬化症、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田病が挙げられる。

いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇは、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（多発性硬化症）、ミエリンタンパク質ゼロ（自己免疫性末梢神経障害）、ＨＩＶ ｅｎｖまたはｇａｇタンパク質（ＡＩＤＳ）、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症）、ＣＤ３７（全身性エリテマトーデス）、ＣＤ２０（Ｂ細胞媒介自己免疫疾患）、およびＩＬ－２３Ｒ（クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患）などの自己免疫疾患に関連する自己抗原を標的とする抗原結合受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現する。

本明細書における患者は、同種組織移植または固形臓器移植または同種細胞療法などの同種移植を必要とする患者であり得る。本開示のＴｒｅｇ、例えば、１つ以上の同種異系ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を標的とするＣＡＲを発現するＴｒｅｇは、患者に導入され、Ｔｒｅｇは移植にホーミングし、宿主免疫系および／または移植片対宿主拒絶反応によって引き起こされる同種移植片拒絶反応を抑制し得る。組織移植、臓器移植、または同種細胞療法を必要とする患者には、例えば、腎臓移植、心臓移植、肝臓移植、膵臓移植、腸移植、静脈移植、骨髄移植、および皮膚移植を必要とする患者、再生細胞療法を必要とする患者、遺伝子治療（ＡＡＶベースの遺伝子治療）を必要とする患者、およびがんＣＡＲ Ｔ療法を必要とする患者が含まれる。

所望の場合、本明細書において改変されたＴｒｅｇを受ける患者（これには、インビボでＴｒｅｇに分化するであろう改変された多能性細胞または多能性細胞を受ける患者が含まれる）は、細胞移植片の導入に先立って、軽度のリンパ球枯渇処置により、または強力な骨髄破壊的前処置療法により治療される。

いくつかの実施形態では、本発明のＴｅｆｆは、修飾されたもしくは未修飾のＴＣＲ、またはキメラ抗原受容体などの抗原受容体を発現するように操作される。抗原受容体は目的の抗原を標的とする。Ｔｅｆｆは炎症反応を増加させ、有害な細胞を殺すための他の免疫細胞（ＮＫ細胞やＣＴＬなど）の活性を促進し得る。有害な細胞として、例えば以下のようなものが挙げられる：腫瘍学環境における腫瘍細胞；感染症環境においてウイルスまたは他の病原体に感染した細胞；自己免疫または炎症環境における自己抗体産生Ｂ細胞または自己反応性細胞；およびアレルギー環境における病原性アレルゲン応答性細胞。いくつかの実施形態では、Ｔｅｆｆ細胞は、ＣＤ４^＋コンパートメントに欠陥がある患者（例えば、ＡＩＤＳ）における細胞置換療法に使用することができる。

本開示の操作された細胞は、細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として提供され得る。例えば、医薬組成物は、滅菌水、生理食塩水または中性緩衝食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）、塩、抗生物質、等張剤、および他の賦形剤（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）；アミノ酸（例えば、グリシンおよびアルギニン）；抗酸化物質（例えば、グルタチオン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；および防腐剤）を含む。医薬組成物は、Ｔｒｅｇ表現型および増殖を支持する因子（例えば、ＩＬ－２およびラパマイシンまたはその誘導体）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－３５）、および細胞療法用の他の細胞（例えば、癌療法用のＣＡＲ Ｔエフェクター細胞または再生療法用の細胞）を追加で含み得る。保管および輸送のために、細胞は任意に凍結保存されてもよい。使用前に、細胞を解凍し、薬学的に許容される担体で希釈してもよい。

本開示の医薬組成物は、全身投与（例えば、静脈内注射または注入による）または局所注射または対象組織への注入（例えば、肝動脈を介した注入および脳、心臓、筋肉への注射による）によって、治療有効量で患者に投与される。「治療有効量」という用語は、患者に投与された場合に治療を達成するのに十分な医薬組成物の量または細胞の数を指す。

いくつかの実施形態では、医薬組成物の単一投与単位は、１０^４個を超える細胞（例えば、約１０^５個から約１０^６個の細胞、約１０^６個から約１０^１０個の細胞、約１０^６個から約１０^７個の細胞、約１０^６個から約１０^８個の細胞、約１０^７個から約１０^８個の細胞、約１０^７個から約１０^９個の細胞、または約１０^８個から約１０^９個の細胞）を含む。特定の実施形態では、組成物の単一投与単位は、約１０^６個、約１０^７個、約１０^８個、約１０^９個、または約１０^１０個以上の細胞を含む。患者には、２日に１回、３日に１回、４日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、月に１回、または必要に応じて別の頻度で、患者内に遺伝子操作されたＴｒｅｇ細胞の十分な集団を確立するために医薬組成物を投与することができる。

本明細書に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼまたは他のヌクレアーゼおよびポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物も提供される。

本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。矛盾が生じた場合には、定義を含む本明細書が優先される。一般に、本明細書に記載される免疫学、医学、医薬化学、および細胞生物学に関連して使用される命名法およびその技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。さらに、文脈により別途要求されない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。この明細書および実施形態を通じて、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｉｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数または整数のグループを含むことを意味するが、他の整数または整数のグループを除外することを意味すると理解されない。本明細書で言及されるすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書では多数の文書が引用されているが、この引用は、これらの文書のいずれかが当該技術分野における共通一般知識の一部を形成することを認めるものではない。本明細書で使用される場合、１つまたは複数の対象の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記載された基準値と同様の値を指す。特定の実施形態では、この用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかな場合を除き、記載された基準値に対していずれかの方向で（より多いまたはより少ない）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲に収まる値の範囲を指す。

本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は説明のみを目的としており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１：フィーダーフリーのＴｉＰＳＣ株の導出
この例では、再プログラミング因子を使用してＴ細胞（ＴｉＰＳＣ株）からｉＰＳＣ細胞株を誘導するプロセスについて説明する。このプロセスで、ｉＰＳＣは、健康なヒトのドナーからの白血球除去パック（AllCells、米国）から事前に分離された、凍結保存されたＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の混合集団から派生した。細胞を解凍し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ＋１０％ヒトＡＢ血清（ｈｕＡＢＳ）中で培養した。細胞は、１：１（細胞：ビーズ）の比率のＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）で活性化された。活性化細胞を１０^６細胞／ｍＬの密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養した。

一晩培養した後、細胞を染色し、総ＣＤ４^＋Ｔ細胞、総ＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびナイーブＴｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ^＋）について選別した。選別後、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞はＲＰＭＩ＋１０％ｈｕＡＢＳ＋１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２で回収され、ナイーブＴｒｅｇはＲＰＭＩ＋１０％ｈｕＡＢＳ＋１０００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２で一晩回収された。

選別されたＴ細胞は、翌日、Ｃｙｔｏｔｕｎｅ－ｉＰＳ２．０Ｓｅｎｄａｉ再プログラミングキット（Thermo Fisher、米国）を製造元の指示に従って使用して再プログラムされた。選別された各集団からの約０．５×１０^６細胞に、再プログラミング因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃ）を保有するセンダイウイルス（ＳｅＶ）によるスピン感染によって形質導入し、ウイルスを除去せずにそれぞれの培地にプレーティングした。

感染から１日後、細胞を回収し、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（StemCell Technologies、カナダ）中のマトリゲル上にプレーティングした。ＲｅｐｒｏＴｅＳＲを７日目まで培地を除去せずに１～２日ごとにウェルに添加した。７日目以降、毎日培地交換を行った。再プログラミングから約２～３週間後、形態に基づいてｉＰＳＣコロニーを手動で選択した。形態が安定するまでコロニーを手動で継代し、その後さらに数週間ｍＴｅＳＲ培地（StemCell Technologies）で増殖させた。

実施例２：ｉＰＳＣから造血幹細胞および前駆細胞への分化
この実施例では、組織培養においてｉＰＳＣが造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）に分化するプロセスについて説明する。このプロセスを図１に示す。

このプロセスでは、開始ｉＰＳＣを０日目に、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、および１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２二塩酸塩）の存在下でＡＰＥＬ２培地（StemCell Technologies）に播種した。ＥＢ形成を促進するために、細胞を短時間遠心分離した。

ＥＢ形成後１日目または２日目に、すべてのウェルの培地を２０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ－３、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、および４０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－３を含むＡＰＥＬ２培地に交換することにより、完全な培地交換を実行した。培地を８日目まで２～３日ごとに交換した。

８ 日目に、非必須アミノ酸、ＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭおよび０．１ｍＭ β－メルカプトエタノールを補充し、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ－３、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、および４０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－３を含む完全ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地（Thermo Fisher、米国）に培地を交換することにより、完全な培地交換を実行した。さらに６～７日間、培地を２～３日ごとに交換した。

完全分化の１４日目または１５日目に、ＨＳＰＣを収集し、セルストレーナーで濾別して、押し出されたＨＳＰＣからＥＢを分離した。

実施例３：ｉＰＳＣ－ＨＳＰＣのＣＤ４ｓｐＴ細胞およびＴｒｅｇへの分化
この実施例では、ｉＰＳＣ由来ＨＳＰＣ（ｉＰＳＣ－ＨＳＰＣ）がＣＤ４ｓｐＴ細胞とＴｒｅｇに分化するプロセスについて説明した。このプロセスは図１と図２に示されている。

このプロセスでは、ｉＰＳＣ－ＨＳＰＣを、ＳｔｅｍＳｐａｎ^ＴＭリンパ前駆体拡大培地（StemCell Technologies）でリンパ系分化コーティング材料でプレコートした組織培養処理プレート上に、１×１０^４～５×１０^４細胞／ｍＬの密度で播種した（１４日目）。メーカーの指示に従い、１７日目または１８日目、２１日目、および２４日目または２５日目に細胞に栄養を与え、２８日目までリンパ球前駆体（Ｔ細胞前駆体）を生成した。

２８日目に、リンパ前駆細胞を採取し、ＳｔｅｍＳｐａｎ^ＴＭＴ細胞前駆細胞成熟培地中のリンパ球分化コーティング材料でコーティングした新しいプレートに０．２×１０^６細胞／ｍＬの密度で播種した。細胞には、３５日目または４２日目まで３日または４日ごとに栄養を与えた。

ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞を生成するために、３５日目または４２日目に細胞を０．００６２５～０．１ｎｇ／μＬのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）および０．１２５～２ｎｇ／μＬのイオノマイシン（Ｉ）（０．１２５Ｘ～２Ｘ ＰＭＡＩ）で処理してＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞を生成しました。処理の２４時間後に、ＳｔｅｍＳｐａｎ^ＴＭ Ｔ細胞前駆体成熟培地で培地を完全に交換することにより、ＰＭＡＩを培養物から除去した。処理した細胞には、さらに７日間、３～４日ごとに栄養を与えた。ＰＭＡＩ処理ｉＰＳＣ由来ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞にもプロナーゼ処理を施し、ＣＤ４系統へのコミットメントを決定した。細胞は培地中のプロナーゼの割合を０．１％まで増加させて処理し、ＣＤ４の再発現を防ぐために４℃で、または再発現を可能にするために３７℃でインキュベートした。ＣＤ４およびＣＤ８発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、処理の１日および２日後にフローサイトメトリーによって検査した。データは、ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞がプロナーゼ処理後にＣＤ４およびＣＤ８を再発現できたことを示し、プロナーゼ処理前のこれらの細胞が系統にコミットしていたことを実証した（図５）。

ｉＰＳＣ由来Ｔｒｅｇを生成するために、ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞をヒト組換えＴＧＦ－β１、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、およびＩＬ－２を含むＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ^ＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（StemCell Technologies）で４３日目または５０日目に、メーカーの指示に従って（培地４９ｍＬあたりサプリメント１ｍＬ）処理した。ＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡ処理の日に、細胞をヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子（StemCell Technologies）（１２．５μＬ／ｍＬ）でも活性化した。次の７日間、細胞に３～４日ごとに栄養を与えた。

ｉＰＳＣ由来のＴｒｅｇは、ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞をＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ^ＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（StemCell Technologies）（培地４９ｍＬあたりサプリメント１ｍＬ）で処理することによっても生成され、ヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子（StemCell Technologies）（１２．５μＬ／ｍＬ）で活性化され、ＳｔｅｍＳｐａｎ^ＴＭ Ｔ細胞前駆体成熟培地とＴ細胞特異的培地（ＯｐＴｍｉｚｅｒ^ＴＭ、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ^ＴＭ、またはＸ－ＶＩＶＯ^ＴＭ １５）の５０％混合物中でＩＬ－２が補充された。次の７日間、細胞に３～４日ごとに栄養を与えた。

最初のＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡ処理から７日後、１０～１０００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２を添加した１２．５～５０μＬ／ｍＬのＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子で細胞を刺激し、下流の機能アッセイまたは特性評価アッセイに使用した。

フローサイトメトリー分析は、ＰＭＡＩが発生中の２つの時点で二重陽性Ｔ細胞をＣＤ４ｓｐ細胞に分化させる能力を実証する：ＰＭＡＩは３５日目（図３）または４２日目（図４）に添加。ＰＭＡＩを様々な濃度で添加したが、より低い濃度（０．１２５Ｘ～０．２５Ｘ）では、より高い濃度のＰＭＡＩと比較して、より高いパーセンテージのＣＤ４ｓｐ細胞が生成された。ＰＭＡＩ処理ＣＤ４^＋ＣＤ８^－細胞（すべてのプロットのＱ７）はＴｈＰＯＫを発現したが、ＦＯＸＰ３は発現しなかった（すべてのプロットのＱ９）。細胞はＣＤ３およびＴＣＲαβも発現した。ＰＭＡＩで処理されなかった二重陽性細胞は主に二重陽性のままであり、ＣＤ４^＋ＣＤ８^－細胞はＴｈＰＯＫを発現しなかった。

ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞のアイデンティティと機能をさらに分析した。フローサイトメトリー分析により、ＴＧＦ－β１、ＡＴＲＡ、ＩＬ－２、およびＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化因子で処理されたＰＭＡＩ誘導ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞（ＰＭＡＩは３５日目または４２日目に添加）における活性化Ｔｒｅｇマーカーの発現が示された。ＦＯＸＰ３は、分化３５日目に二重陽性細胞に添加されたより低い濃度のＰＭＡＩ（０．１２５Ｘおよび０．２５Ｘ）で観察できたが（図６Ａ）、分化４２日目に添加されたＰＭＡＩのすべての濃度で高度に発現された（図６Ｂ）。この細胞はＨｅｌｉｏｓおよびＣＴＬＡ－４も発現したが、ＬＡＰまたはＧＡＲＰは発現しなかった。ＰＭＡＩで処理しなかった細胞は、ＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡ処理にもかかわらず、ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ－４、ＧＡＲＰ、およびＬＡＰをほとんどまたはまったく発現しなかった。Ｈｅｌｉｏｓはこれらの細胞でも発現した。

ＰＭＡＩ誘導およびＴＧＦ－β１処理ｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇのさらなる特徴付けでは、ＣＤ４ｓｐ集団におけるＣＤ２５の発現とＣＤ１２７の発現がほとんどまたはまったくないことも示された。ＣＤ２５^＋集団内では、細胞の大部分（７５％）がＦＯＸＰ３^＋であった。ＣＤ２５^＋集団内のさらなるサブゲーティングは、ＣＤ２５を高度に発現する細胞（ＣＤ２５^ｈｉｇｈ）が９０％を超えるＦＯＸＰ３^＋であった一方、低／中レベルのＣＤ２５を発現する細胞（ＣＤ２５^ｌｏｗ）がＦＯＸＰ３^＋細胞とＦＯＸＰ３^－細胞の混合物を含んでいたことを示す（図９）。

フローサイトメトリー分析により、活性化されたＰＭＡＩ誘導およびＴＧＦ－β１処理ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞（ｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇ）におけるＴｒｅｇマーカーの発現がさらに示された。データは、ＦＯＸＰ３およびＣＴＬＡ－４がこれらの細胞上で高度に発現された一方、ＨｅｌｉｏｓおよびＬＡＰはそれぞれ中レベルおよび低レベルで発現されたことを示している（図７）。中程度ではあるが明確なＧＡＲＰ^＋細胞集団が、０．１２５Ｘ、０．２５Ｘ、および０．５Ｘ ＰＭＡＩ濃度でのみ観察された。ＰＭＡＩで処理されなかった細胞は、これらのマーカーを高度に発現しなかった。

フローサイトメトリー分析では、レスポンダーＴ細胞の増殖に対する０．１２５Ｘ ＰＭＡＩおよびＴＧＦ－β１処理ｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇの抑制能力も示された。レスポンダーＴ細胞の数が増加すると、ｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇはその増殖を１５～２１％抑制することができた（図８）。ＰＭＡＩで処理されず、ＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡで処理された細胞は、Ｔレスポンダーの増殖を抑制せず、標的細胞の増殖を刺激するように見えた。

ＰＭＡＩおよびＴＧＦ－β１で処理したｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇには、不純な細胞集団が含まれていた。したがって、細胞を選別して不要な集団（ＣＤ８単一陽性、ＣＤ４およびＣＤ８二重陽性、ＣＤ４およびＣＤ８二重陰性細胞）を除去し、主にＣＤ４単一陽性、ＣＤ２５陽性、ＣＤ１２７陰性／低、およびＦＯＸＰ３陽性である細胞の集団を得た。ＣＤ２５^ｈｉｇｈで選別された細胞には９０％以上のＦＯＸＰ３^＋細胞が含まれ、ＣＤ２５^ｌｏｗで選別された細胞にはＦＯＸＰ３陽性と陰性の両方の細胞の混合物が含まれていた。これらのデータは、ＣＤ２５の蛍光強度をゲーティングすることにより、ＦＯＸＰ３^＋細胞の所望の集団が得られることを示している（図９および１０）。

これらの選別された細胞は、フローサイトメトリーによって測定されるように、活性化されたＴｒｅｇのマーカーを発現するように活性化された。ＣＤ２５^ｈｉｇｈで刺激された細胞は、非活性化細胞と比較して、活性化後にＣＴＬＡ－４レベルの上昇と、ＨｅｌｉｏｓおよびＬＡＰの中程度の増加を示した。ＦＯＸＰ３発現レベルは、活性化の前後で同様のままであった。ＣＤ２５^ｈｉｇｈで刺激された細胞は、ＣＤ６９およびＧＡＲＰの発現増加とＴｒｅｇマーカー（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋）の保持も示した。ＣＤ２５^ｌｏｗで刺激された細胞は、ＣＴＬＡ－４発現の増加と、活性化後のＨｅｌｉｏｓおよびＬＡＰ発現の中程度の増加も示したが；活性化にもかかわらず、ＦＯＸＰ３レベルはＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞よりもはるかに低いままであった（＜１８％）。ＣＤ２５^ｌｏｗ刺激細胞はまた、活性化時にＣＤ６９およびＧＡＲＰを発現した（図１１および１２）。

選別された細胞は、Ｔ細胞の増殖を抑制する能力も示した。ｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇに対するレスポンダーＴ細胞の比率が等しい場合、ＣＤ２５^ｈｉｇｈおよびＣＤ２５^ｌｏｗｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇは両方とも、活性化時にレスポンダーＴ細胞の増殖をそれぞれ６６～４９％および５４～３８％抑制できた。しかしながら、ＰＭＡＩ誘導ＣＤ４ｓｐ細胞は、レスポンダーＴ増殖に対する抑制効果を示さなかった（図１３）。

ＦＯＸＰ３ Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）脱メチル化の分析は、ＰＭＡＩ誘導および刺激を受けたＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡ処理ｉＰＳＣ－ＴｒｅｇからのゲノムＤＮＡに対して実施された。これらの細胞は、より低い濃度のＰＭＡＩで脱メチル化の増加を示した。ＰＭＡＩ誘導ではないが、ＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡのみで刺激および処理した細胞は、ＦＯＸＰ３ ＴＳＤＲでの脱メチル化をほとんどまたはまったく示さなかった（図１４、パネルＡ）。一次ＴｒｅｇからのゲノムＤＮＡは８０％を超える脱メチル化を示したが、一次Ｔｒｅｓｐおよび０．１２５Ｘ ＰＭＡＩ誘導Ｔ細胞はＴＳＤＲで高度にメチル化されなかった（図１４、パネルＢ）。フローサイトメトリーによるＦＯＸＰ３発現の分析は、ＦＯＸＰ３レベルが高いほど、ＦＯＸＰ３ ＴＳＤＲ脱メチル化のより高い割合と相関していることを示唆している。さらに、より低いレベルのＰＭＡＩで処理した細胞は、刺激およびＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡ処理後に、より多くのＦＯＸＰ３^＋細胞を生成した（図１４、パネルＣ）。

ＦＯＸＰ３ ＴＳＤＲ脱メチル化は、死細胞除去後に増加し（フィコール前バルク対フィコール後バルク）、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗ細胞を標的とした免疫磁気分離によるＴｒｅｇ濃縮後にさらに富化された。フロースルー集団または非標的集団には、効率的に単離されなかった可能性が高い、またはＣＤ８Ｔｒｅｇの存在を示す可能性があるＴＳＤＲ脱メチル化細胞も含まれていた。一次Ｔｒｅｇは高度にＴＳＤＲ脱メチル化され、Ｔｒｅｓｐ細胞は高度にメチル化された（図１５、パネルＡ）。フローサイトメトリーによるＦＯＸＰ３発現の分析は、より高いレベルのＦＯＸＰ３がより高い割合のＦＯＸＰ３ ＴＳＤＲ脱メチル化と相関することを示唆している（図１５、パネルＢ）。

ｉＰＳＣ－ＴｒｅｇをＣＤ２５^ｈｉｇｈ集団とＣＤ２５^ｌｏｗ集団に分類すると、２つの集団間の違いがさらに明らかになった。ＣＤ２５^ｈｉｇｈでソートされたｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇは、ＣＤ２５^ｌｏｗでソートされたｉＰＳＣ－Ｔｒｅｇ（～１４％）と比較して、ＦＯＸＰ３ ＴＳＤＲで高度に脱メチル化されていた（＞９０％）。一次Ｔｒｅｇも高度に脱メチル化されていたが、一次Ｔレスポンダー細胞はＦＯＸＰ３ ＴＳＤＲにおいて高度にメチル化されていた（図１６）。

一般的に使用されるＴ細胞刺激試薬を、ｉＰＳＣ由来ＤＰ Ｔ細胞からＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞を生成する能力について評価した。ＣＤ３とＣＤ２８、またはＣＤ３、ＣＤ２８およびＣＤ２のいずれかに結合する可溶性四量体抗体複合体（StemCell Technologies）を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体に結合した磁気ビーズであるＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Thermo Fisher）と並行してテストした。ＰＭＡＩ処理を行わなかった細胞、または０．１２５Ｘ ＰＭＡＩで処理した細胞を対照として使用した。様々な試薬で刺激してから８日後、０．１２５Ｘ ＰＭＡＩ処理細胞のみが、やはりＴｈＰＯＫ^＋であるＣＤ４ｓｐ細胞の別個の集団を生成することができた（図１７Ａ）。次いで、刺激された細胞をＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡで処理した。ＰＭＡＩ刺激細胞のみが、ＴｈＰＯＫおよびＦＯＸＰ３も発現するＣＤ４ｓｐ細胞を生成した（図１７Ｂ）。さらに、ＰＭＡＩ刺激細胞のみが、ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ^＋ＦＯＸＰ３^＋であるナイーブＴｒｅｇを生成した（図１７Ｃ）。

０．００４Ｘ ＰＭＡと０．２Ｘ イオノマイシンの組み合わせも、ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞の生成を促進する能力について評価した（図１８）。この濃度のＰＭＡＩでは、０．１２５Ｘ ＰＭＡＩから生成されたＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞の約７４％と比較して、約３３％のＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞が生成された。０．００４Ｘ ＰＭＡおよび０．２Ｘ イオノマイシン誘導ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞と比較して、０．１２５Ｘ ＰＭＡＩ誘導ＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞はほぼすべてＴｈＰＯＫ^＋であり、陽性率はわずか約７７％であった。ＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡを０．００４Ｘ ＰＭＡおよび０．２Ｘイオノマイシン誘導細胞に添加すると、細胞はＣＤ８^＋およびＤＰ Ｔ細胞に変換された。０．１２５Ｘ誘導ＰＭＡＩにＴＧＦ－β１およびＡＴＲＡを添加すると、８０％ＴｈＰＯＫ^＋ＦＯＸＰ３^＋であるＣＤ４ｓｐ Ｔ細胞の集団が保持された。

実施例４：ｉＰＳＣのＡＡＶＳ１遺伝子座への導入遺伝子の組み込み
この実施例は、図２１に示されるように、緑色蛍光タンパク質発現カセットがＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれた実験を説明する。ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ ｍＲＮＡおよびドナープラスミドを、－７日目にエレクトロポレーションによってｉＰＳＣに送達した。１週間後（０日目）、ピューロマイシンを組織培養物に添加し（０．３μｇ／ｍＬ）、標的化された組込みを受けた細胞のポジティブ選択を開始した。ドキシサイクリンを１５日目に添加し、３つの異なる用量（０．３、１、および３μｇ／ｍＬ）で培養物中に維持して、ｄｏｘ誘導性ＧＦＰ発現カセットの発現を誘導した。対照細胞には培養中にドキシサイクリンが添加されなかった。細胞をドキシサイクリンの存在下で１３日間維持した。この期間中、３μｇ／ｍＬ用量のドキシサイクリンは、最高レベルの誘導性ＧＦＰ導入遺伝子発現をもたらした（９４％；図２２）。この高レベルの発現は、培養中にドキシサイクリンが存在する間維持された。細胞をピューロマイシンおよびドキシサイクリン中で１５～２８日目に維持し、さらにポジティブに選択しました（標的化された組込みにより対立遺伝子が～５０％から～７０％に増加）。

実施例５：ＣＤ４^＋ Ｔｒｅｇ系統に向けたｉＰＳＣの分化の偏り
ｉＰＳＣの分化をＣＤ４^＋Ｔ細胞、最終的にはＴｒｅｇ細胞に偏らせるために、ＩＬ－７受容体のαユニット（ＩＬ－７Ｒａ）を標的とする抗体を使用して、幹細胞をＩＬ－７受容体を介したシグナル伝達遮断に供した。抗ＩＬ－７Ｒａ抗体は、Ｔ細胞発生の後期段階で濃度を増加しながら細胞培養培地に添加された。２つの二重実験（実験１および実験２）はどちらも、抗ＩＬ－７Ｒａ抗体の添加によりＣＤ４^＋単一陽性細胞（右下の象限）の割合が増加し、未処理細胞の２．８１％または４．７８％と比較して、６．９％（実験１）または７．７％（実験２）に達した一方、ＣＤ８^＋単一陽性細胞（左上の象限）の割合は減少したことを示す（図２７）。

Claims (40)

1. ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の出発集団を提供すること、
   ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンを含む培地中で出発細胞集団を培養し、それによってＣＤ４単一陽性Ｔ細胞が濃縮された細胞集団を得ること、
   を含む、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞が濃縮された細胞集団を取得する方法。
2. 培地が０．００６２５～０．１μｇ／ｍｌのＰＭＡおよび０．１２５～２μｇ／ｍｌのイオノマイシンを含む、請求項１に記載の方法。
3. ＰＭＡ対イオノマイシンの重量比が１：１０～１：１０００、任意に１：２０である、請求項１または２に記載の方法。
4. 培地が０．００６２５μｇ／ｍｌのＰＭＡおよび０．１２５μｇ／ｍｌのイオノマイシンを含む、請求項３に記載の方法。
5. 細胞を培地中で約１～５日間培養する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞が未成熟ＣＤ４^＋Ｔ細胞であり、任意にＴ細胞がＴｈＰＯＫを発現する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 未成熟ＣＤ４^＋Ｔ細胞がエフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞であり、任意にＴｅｆｆ細胞がＣＤ２５^ｌｏｗである、請求項６に記載の方法。
8. ＴＧＦ－βおよびオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）を含む第２の培地でＣＤ４単一陽性Ｔ細胞を培養し、それによってＣＤ４^＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が濃縮された細胞集団を得ることをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
9. 第２の培地が、ＩＬ－２、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ２８抗体をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 第２の培地が、Ｔ細胞特異的培地、ならびにＴＧＦ－β、ＡＴＲＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のうちの１つまたは複数を含む、請求項８に記載の方法。
11. ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞が第２の培地中で約５～１０日間培養される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって組織培養物からＣＤ４単一陽性Ｔｅｆｆ細胞またはＴｒｅｇ細胞を単離することをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって組織培養物からＣＤ４単一陽性Ｔｅｆｆ細胞またはＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離することをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
14. ＦＡＣＳによって組織培養物からＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗおよびＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｌｏｗＣＤ１２７^ｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離することをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
15. ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の出発集団がヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. ｉＰＳＣがＴ細胞から再プログラムされる、請求項１５に記載の方法。
17. ｉＰＳＣがゲノム中に異種配列を含み、
    異種配列は系統コミットメント因子をコードする導入遺伝子を含み、
    系統コミットメント因子は、
    （ｉ）ｉＰＳＣからＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞への分化を促進する、または
    （ｉｉ）ｉＰＳＣのＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞への分化を促進し、および／またはＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞の表現型の維持を促進する、
    請求項１５または１６に記載の方法。
18. 導入遺伝子の発現が遺伝子座における転写調節エレメントの制御下にあるように、異種配列がＴ細胞特異的遺伝子座に組み込まれる、請求項１７に記載の方法。
19. 導入遺伝子が追加のポリペプチドのコード配列を含み、系統コミットメント因子のコード配列と追加のポリペプチドのコード配列は、自己切断ペプチドのインフレームコード配列または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 追加のポリペプチドが、他の系統コミットメント因子、治療用タンパク質、またはキメラ抗原受容体である、請求項１９に記載の方法。
21. 異種配列が、Ｔ細胞特異的遺伝子座のエクソンに組み込まれており：
    導入遺伝子のすぐ上流にある内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；または
    導入遺伝子のすぐ上流およびインフレームにある自己切断ペプチドの第２のコード配列、
    を含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 異種配列が、Ｔ細胞特異的遺伝子座が無傷のＴ細胞特異的遺伝子産物を発現できるままになるように、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドの第２のコード配列のすぐ上流に、組み込み部位の下流にあるＴ細胞特異的遺伝子座のすべてのエクソン配列を含むヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. Ｔ細胞特異的遺伝子座が、Ｔ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座である、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 異種配列が、ＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１、２、または３に組み込まれる、請求項２３に記載の方法。
25. 導入遺伝子がＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、またはＴｈＰＯＫをコードする、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 導入遺伝子が、ＦＯＸＰ３のコード配列およびＴｈＰＯＫのコード配列を含み、これら２つのコード配列がインフレームであり、自己切断ペプチドのインフレームコード配列によって分離されている、請求項２５に記載の方法。
27. 細胞の出発集団がヒト細胞である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 出発細胞集団が、
    クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、
    ＨＬＡクラスＩまたはＩＩ遺伝子、
    抗原処理に関連するトランスポーター、
    マイナー組織適合性抗原遺伝子、および
    β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、
    から選択される遺伝子にヌル突然変異を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 出発細胞集団が、ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、シトクロムＰ４５０遺伝子、またはカスパーゼ－９遺伝子から任意に選択される自殺遺伝子を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ＣＤ４単一陽性細胞が濃縮された細胞の集団。
31. 請求項１～７および１２～２９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞が濃縮された細胞の集団。
32. 請求項３１に記載の細胞集団を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌、感染症、アレルギー、喘息、自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する方法。
33. 癌、感染症、アレルギー、喘息、自己免疫疾患または炎症性疾患を、それを必要とする患者において治療するための薬剤の製造のための、請求項３１に記載の細胞集団の使用。
34. 癌、感染症、アレルギー、喘息、自己免疫疾患または炎症性疾患を、それを必要とする患者において治療する際に使用するための、請求項３１に記載の細胞の集団。
35. 請求項１～６および８～２９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞が濃縮された細胞の集団。
36. 請求項３５に記載の細胞集団を患者に投与することを含む、免疫抑制を必要とする患者を治療する方法。
37. 免疫抑制を必要とする患者を治療するための薬剤の製造のための、請求項３５に記載の細胞集団の使用。
38. 免疫抑制を必要とする患者の治療に使用するための、請求項３５に記載の細胞集団。
39. 患者が自己免疫疾患を有するか、組織移植を受けたか、組織移植を受ける予定である、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法、使用、または使用のための細胞集団。
40. 請求項３０、３１、または３５に記載の細胞集団と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。

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