WO2024071010A1

WO2024071010A1 - Ｔ細胞の製造方法

Info

Publication number: WO2024071010A1
Application number: PCT/JP2023/034652
Authority: WO
Inventors: 新金子; 翔一入口; 崇之佐藤; 義明葛西
Original assignee: 国立大学法人京都大学; 武田薬品工業株式会社
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2023-09-25
Publication date: 2024-04-04

Abstract

開示されているのは、制御性Ｔ細胞が増殖した細胞集団の製造方法であって、（１）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む方法、該方法により得られた、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団、並びに該制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を含有してなる、医薬である。

Description

Ｔ細胞の製造方法

　本発明は、制御性Ｔ細胞が増殖した細胞集団の製造方法、該方法により得られた制御性Ｔ細胞を含む細胞集団、当該制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を含有してなる医薬等に関する。
（発明の背景）

　近年、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ（Ｔｒｅｇ））は免疫応答抑制機能を持つため、様々な自己免疫疾患に対する治療目的として、制御性Ｔ細胞を用いた細胞治療（Ｔｒｅｇ　ｔｈｅｒａｐｙ）の研究開発が世界で進められている。このように、制御性Ｔ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患の治療、炎症性疾患、アレルギー性疾患の治療及び予防に用いることが期待されている。

　制御性Ｔ細胞は、内在性制御性Ｔ細胞（ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ（ｎａｔｕｒａｌ　Ｔｒｅｇ）：ｎＴｒｅｇ、又はｔｈｙｍｉｃ　Ｔｒｅｇ：ｔＴｒｅｇ）と誘導性制御性Ｔ細胞（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｔｒｅｇ）：ｉＴｒｅｇ）の大きく２つに分類され、ｎＴｒｅｇは胸腺内で自然発生し、ｉＴｒｅｇは抗原刺激及びＩＬ－２、ＴＧＦ－βなどのサイトカインにより末梢血中のナイーブＴ細胞から分化誘導されることが知られている。これらの制御性Ｔ細胞は更に、その細胞に発現するマーカーの種類に従い細分化されている。

　制御性Ｔ細胞を生体より除去すると、各種の臓器特異的な自己免疫疾患が自然発症し、その際、制御性Ｔ細胞を移植すると、自己免疫疾患の発症が阻止されるため、制御性Ｔ細胞は、末梢での免疫自己寛容の維持に重要な働きをしていると考えられていた。その後、制御性Ｔ細胞は、自己免疫だけでなく、外来抗原による炎症、移植による拒絶反応、感染免疫、アレルギー、腫瘍免疫などのほとんどの免疫反応を抑制し得ることが明らかになってきた。また、現在、この制御性Ｔ細胞のマスターレギュレーターとして、転写因子ＦＯＸＰ３が明らかにされている。

　ＦＯＸＰ３はＴｒｅｇのマスターレギュレーターであり、ＴｒｅｇではＦＯＸＰ３が恒常的に発現していること、及び抑制機能を有さない通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　Ｔ細胞）、エフェクターＴ細胞、炎症性Ｔ細胞と称することもある）では恒常的な発現は見られないことが知られている。そこで、ｐｒｉｍａｒｙ　ＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３の発現維持及びＰｒｉｍａｒｙ　Ｔｃｏｎｖ又はｂｕｌｋのＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ）　Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３発現誘導に関する研究が行われ、それら発現維持及び発現誘導の活性を有する化合物、サイトカイン、その組み合わせが報告されている。そのような化合物、サイトカインとしては、ＩＬ－３（非特許文献１)、ＴＧＦ－β（非特許文献２、３）、ＩＬ－４（非特許文献４、５）などがある。

　さらに、そのような化合物、サイトカイン、及びその組み合わせとしては、ＣＤＫ８／１９阻害薬であるＡＳ２８６３６１９（非特許文献６)、ｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体（非特許文献９、非特許文献１１、非特許文献１２）、サイトカインＴＧＦ－β（非特許文献６、非特許文献１０）などがある。

　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｔｒｅｇに対する、ＩＬ－３、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βの効果についてはそれぞれ上記のように報告されているものの、ＩＬ－４とＴＧＦ－β（さらにそこにＩＬ－３を加えた）の組み合わせが特に好ましいというような報告はない。ＩＬ－４についてはＴｒｅｇの分化及び機能に対して有利又は不利との報告が混在している。また、非特許文献３では、ＩＬ－４を添加することでＴＧＦ－βとは全く異なる効果が得られており、ＩＬ－４によりマウスＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３の発現及びＴｒｅｇの増殖が抑制されることが報告されている。

　多能性幹細胞由来の制御性Ｔ細胞については、ＦＯＸＰ３の発現を維持する化合物及びサイトカイン、並びにその組み合わせ、ＦＯＸＰ３を発現しないＴ細胞からＦＯＸＰ３発現を誘導する化合物及びサイトカイン、並びにその組み合わせなどは知られておらず、先に挙げた文献に記載はされていない。また、工業的であって製造効率（収率）の高い製造方法が望まれるところ、制御性Ｔ細胞は増殖させること、特にその抑制機能を保ったまま増殖させることが難しいことが知られており、その効率的な製造方法が期待されている。

　非特許文献１３では、ＦＯＸＰ３における変異によって引き起こされるＩＰＥＸ（Ｉｍｍｕｎｅ　ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ，ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ，Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ）症候群について、ＦＯＸＰ３の発現を回復させるためにレンチウイルスベクターを使用して自己の造血幹細胞に遺伝子を導入して、当該細胞をＩＰＥＸ症候群のモデルマウスに投与したことが記載されている。その結果、造血幹細胞が機能的な制御性Ｔ細胞に分化し、自己免疫性の表現型から回復したことが報告されている。また、特許文献１にも同様のヒトＦＯＸＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えレンチウイルスベクターについて記載されている。

　特許文献２では、Ｆｏｘｐ３とともに、Ｍｃｌ－１を発現させることがＴｒｅｇの生存向上に重要であることが開示されている。また、特許文献３では、ＣＤ４^＋Ｔｒｅｇへの分化を促進する分化系列決定因子をコードする導入遺伝子を含む遺伝子操作された哺乳動物細胞が開示されている。特許文献４では、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択集団と幹細胞又は前駆細胞の選択集団とを含む三次元細胞凝集体を培養することによる、幹細胞又は前駆細胞からＴ細胞の組成物を調製する方法が開示されている。

国際公開第２０１９／０４０６５５号国際公開第２０１４／１８０９４３号国際公開第２０２１／０９２５８１号国際公開第２０１７／０７５３８９号

Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１１）　１８６：２２６２－２２７２Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ（２００３）　１９８（１２）：１８７５－１８８６Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００９）　１２８：ｅ６７０－ｅ６７８Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１５０８．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１７．０１５０８Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９　Ｊｕｌ；１２７（３）：３３８－３４４Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，ｅａａｗ２７０７（２０１９）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（９），１２０８－１２１９（２０１９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９７（１）：５２－６３．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：５７３（２０１８）ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．，１１（２）：ｅ０１４８４７４．（２０１６）ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．，１１（５），ｅ０１５６３１１（２０１６）Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．１３，ｅａｂａ９６００（２０２０）Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２４，３０９－３１７，Ｆｅｂｒｕａｒｙ　７，２０１９

　本発明は、高い効率、かつ、その抑制機能を維持させたまま、制御性Ｔ細胞を増殖させることができる、制御性Ｔ細胞が増殖した細胞集団の製造方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を培養することで、高い効率、かつ、その抑制機能を維持させたまま、制御性Ｔ細胞を増殖させることができるという知見を得た。

　本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の制御性Ｔ細胞が増殖した細胞集団の製造方法、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団、医薬等を提供するものである。

［１］制御性Ｔ細胞が増殖した細胞集団の製造方法であって、
（１）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む方法。
［２］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３の存在下で行う、［１］に記載の方法。
［３］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３３の存在下で行う、［１］に記載の方法。
［４］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３及びＩＬ－３３の存在下で行う、［１］に記載の方法。
［５］前記工程（１）を、
更にＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上の存在下で行う、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記工程（１）を、
更にＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下で行う、［５］に記載の方法。
［７］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３、ＩＬ－３３、ＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下で行う、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記工程（１）を、
更にＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤の存在下で行う、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記ＴＧＦ－βＲアゴニストが、ＴＧＦ－βである、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンである、［５］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記ＴＮＦＲ２アゴニストが、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体である、［５］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤が、４－［１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル］－１，２，５－オキサジアゾール－３－アミン、３－｛１－［１－（４－メトキシフェニル）ピペリジン－４－イル］－４－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル｝ピラジン－２－アミン、並びにＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９のｓｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種である、［８］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞である、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１３ａ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５^＋／ＣＤ１２７^－細胞である、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１３ｂ］前記制御性Ｔ細胞が、Ｈｅｌｉｏｓ^＋細胞である、［１］～［１３ａ］のいずれかに記載の方法。
［１３ｃ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４^＋細胞である、［１］～［１３ｂ］のいずれかに記載の方法。
［１３ｄ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ３９^＋細胞である、［１］～［１３ｃ］のいずれかに記載の方法。
［１３ｅ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ７３^＋細胞である、［１］～［１３ｄ］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞及びＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞である、［１］～［１３ｅ］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、
（ａ）ＦＯＸＰ３遺伝子のＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＮＳ）１、ＣＮＳ２、及びＣＮＳ３；
（ｂ）プロモーター；及び
（ｃ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸
を含む発現構築物が導入された細胞である、［１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記工程（１）の前に、
（２）多能性幹細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を更に含む、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記工程（２）の前に、
（３）（ａ）ＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ１、ＣＮＳ２、及びＣＮＳ３；
　　　（ｂ）プロモーター；及び
　　　（ｃ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸
を含む発現構築物を多能性幹細胞に導入する工程を更に含む、［１６］に記載の方法。
［１７ａ］（４）多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）、ＣＤ４^＋Ｔ細胞又は制御性Ｔ細胞を含む細胞集団に外来遺伝子（特にキメラ抗原受容体を発現するための遺伝子）を導入する工程を含む、［１］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１８］制御性Ｔ細胞の増殖方法であって、
（１Ａ）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む方法。
［１８ａ］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３の存在下で行う、［１８］に記載の方法。
［１８ｂ］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３３の存在下で行う、［１８］に記載の方法。
［１８ｃ］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３及びＩＬ－３３の存在下で行う、［１８］に記載の方法。
［１８ｄ］前記工程（１）を、
更にＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上の存在下で行う、［１８］～［１８ｃ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｅ］前記工程（１）を、
更にＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下で行う、［１８ｄ］に記載の方法。
［１８ｆ］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３、ＩＬ－３３、ＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下で行う、［１８］～［１８ｅ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｇ］前記工程（１）を、
更にＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤の存在下で行う、［１８］～［１８ｆ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｈ］前記ＴＧＦ－βＲアゴニストが、ＴＧＦ－βである、［１８］～［１８ｇ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｉ］前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンである、［１８ｄ］～［１８ｈ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｊ］前記ＴＮＦＲ２アゴニストが、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体である、［１８ｄ］～［１８ｉ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｋ］前記ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤が、４－［１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル］－１，２，５－オキサジアゾール－３－アミン、３－｛１－［１－（４－メトキシフェニル）ピペリジン－４－イル］－４－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル｝ピラジン－２－アミン、並びにＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９のｓｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種である、［１８ｇ］～［１８ｊ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｌ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞である、［１８］～［１８ｋ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｍ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５^＋／ＣＤ１２７^－細胞である、［１８］～［１８ｌ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｎ］前記制御性Ｔ細胞が、Ｈｅｌｉｏｓ^＋細胞である、［１８］～［１８ｍ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｏ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４^＋細胞である、［１８］～［１８ｎ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｐ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ３９^＋細胞である、［１８］～［１８ｏ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｑ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ７３^＋細胞である、［１８］～［１８ｐ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｒ］前記多能性幹細胞由来の制御性Ｔ細胞が、
（ａ）ＦＯＸＰ３遺伝子のＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＮＳ）１、ＣＮＳ２、及びＣＮＳ３；
（ｂ）プロモーター；及び
（ｃ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸
を含む発現構築物が導入された細胞である、［１８］～［１８ｑ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｓ］前記工程（１）の前に、
（２）多能性幹細胞を制御性Ｔ細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を更に含む、［１８］～［１８ｒ］のいずれかに記載の方法。
［１８ｔ］前記工程（２）の前に、
（３）（ａ）ＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ１、ＣＮＳ２、及びＣＮＳ３；
　　　（ｂ）プロモーター；及び
　　　（ｃ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸
を含む発現構築物を多能性幹細胞に導入する工程を更に含む、［１８ｓ］に記載の方法。
［１８ｕ］（４）多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）又は制御性Ｔ細胞を含む細胞集団に外来遺伝子（特にキメラ抗原受容体を発現するための遺伝子）を導入する工程を含む、［１８］～［１８ｔ］のいずれかに記載の方法。
［１９］制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
（１Ｂ）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来のＣＤ４^＋／ＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む方法。
［１９ａ］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３の存在下で行う、［１９］に記載の方法。
［１９ｂ］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３３の存在下で行う、［１９］に記載の方法。
［１９ｃ］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３及びＩＬ－３３の存在下で行う、［１９］に記載の方法。
［１９ｄ］前記工程（１）を、
更にＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上の存在下で行う、［１９］～［１９ｃ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｅ］前記工程（１）を、
更にＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下で行う、［１９ｄ］に記載の方法。
［１９ｆ］前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３、ＩＬ－３３、ＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下で行う、［１９］～［１９ｅ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｇ］前記工程（１）を、
更にＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤の存在下で行う、［１９］～［１９ｆ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｈ］前記ＴＧＦ－βＲアゴニストが、ＴＧＦ－βである、［１９］～［１９ｇ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｉ］前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンである、［１９ｄ］～［１９ｈ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｊ］前記ＴＮＦＲ２アゴニストが、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体である、［１９ｄ］～［１９ｉ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｋ］前記ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤が、４－［１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル］－１，２，５－オキサジアゾール－３－アミン、３－｛１－［１－（４－メトキシフェニル）ピペリジン－４－イル］－４－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル｝ピラジン－２－アミン、並びにＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９のｓｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種である、［１９ｇ］～［１９ｊ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｌ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞である、［１９］～［１９ｋ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｍ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５^＋／ＣＤ１２７^－細胞である、［１９］～［１９ｋ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｎ］前記制御性Ｔ細胞が、Ｈｅｌｉｏｓ^＋細胞である、［１９］～［１９ｍ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｏ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４^＋細胞である、［１９］～［１９ｎ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｐ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ３９^＋細胞である、［１９］～［１９ｏ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｑ］前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ７３^＋細胞である、［１９］～［１９ｐ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｒ］前記工程（１）の前に、
（２）多能性幹細胞をＣＤ４^＋／ＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－Ｔ細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を更に含む、［１９］～［１９ｑ］のいずれかに記載の方法。
［１９ｓ］（４）多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）、ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－Ｔ細胞又は制御性Ｔ細胞を含む細胞集団に外来遺伝子（特にキメラ抗原受容体を発現するための遺伝子）を導入する工程を含む、［１９］～［１９ｒ］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、［１］～［１９ｓ］のいずれかに記載の方法。
［２１］［１］～［２０］のいずれかに記載の方法により得られた、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団。
［２２］［２１］に記載の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を含有してなる、医薬。
［２３］免疫反応の異常な亢進の予防及び／又は治療に用いるための、［２２］に記載の医薬。
［２４］［２１］に記載の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含む、免疫反応の異常な亢進の予防及び／又は治療方法。
［２５］免疫反応の異常な亢進の予防及び／又は治療において使用するための、［２１］に記載の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団。
［２６］免疫反応の異常な亢進の予防及び／又は治療するための医薬の製造における、［２１］に記載の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の使用。

　本発明によると、高い効率、かつ、その抑制機能を維持したまま、制御性Ｔ細胞を増殖させることが可能となる。

ｉＰＳ細胞からＴｒｅｇへの分化誘導後の細胞を、ＩＬ－４及びＴＧＦ－β１を含む培地で拡大培養をした際の経時的な細胞数の変化の結果を示すグラフである。実施例１で拡大培養をしたＴｒｅｇを用いて、Ｔｒｅｇに発現するタンパク質の発現量を検討した結果を示す図である。図における全てのドットプロットはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^－集団を示す。グラフの一段目の数値は各細胞集団におけるＴｒｅｇ（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^－ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋）の割合を示す。実施例１で拡大培養をしたＴｒｅｇを用いた、ヒトＰＢＭＣ由来の他家Ｔ細胞との共培養後のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。図中の％で表された数値はターゲット細胞の細胞***における抑制率を示す。Ｔｒｅｇ: ＴａｒｇｅｔはＴｒｅｇとヒトT細胞の細胞数の比を示す。ｉＰＳ細胞からＣＤ４^＋Ｔ細胞への分化誘導後の細胞を、ＩＬ－４、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－３及びＩＬ－３３を含む又は含まない培地で拡大培養を繰り返した際の経時的な細胞数の変化の結果を示すグラフである。実施例４で拡大培養をした細胞集団を用いて、Ｔｒｅｇに発現するタンパク質の発現量を検討した結果を示す図である。図における全てのドットプロットはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^－集団を示す。また、グラフの数値は各細胞集団におけるＴｒｅｇ（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^－ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋）の割合を示す。実施例４で拡大培養をした細胞集団を用いた、ヒトＰＢＭＣ由来の他家Ｔ細胞と共培養後のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。図中の％で表された数値はターゲット細胞の細胞***における抑制率を示す。Ｔｒｅｇ: ＴａｒｇｅｔはＴｒｅｇとヒトＴ細胞の細胞数の比を示す。ｉＰＳ細胞からＣＤ４^＋Ｔ細胞への分化誘導後の細胞を、ＩＬ－４、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－３、ＩＬ－３３及びＣＤＫ８／１９阻害剤を含む培地で拡大培養をした際の経時的な細胞数の変化の結果を示すグラフである。実施例７で拡大培養をした細胞集団を用いて、Ｔｒｅｇに発現するタンパク質の発現量を検討した結果を示す図である。図における全てのドットプロットはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^－集団を示す。また、グラフの数値は各細胞集団におけるＴｒｅｇ（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^－ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋）の割合を示す。

　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

　「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）　ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）」とは、その語句に続く任意の要素を包含し、かつ、その要素について本開示で特定された活性又は作用に影響しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。

　本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、又は／及び増殖させることを指す。「培養する」とは、組織外又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、又は／及び増殖させることを意味する。

　本明細書において、「物質の存在下で細胞集団を培養する」とは、例えば、物質を含む培地で細胞集団を培養することを指す。そのような培養としては、例えば、当該物質のみ、又は該物質と他の分化誘導因子などとが共存した培地での培養を挙げることができる。当該物質を培地に添加する場合には、培地に直接添加するか、もしくは適切な溶媒にて当該物質を用時溶解した後、培地中に添加してもよい。また、当該物質を培養の際の基板及び担体表面上に固定化して培養することもできる。

　本明細書において、「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ（＋））」とは、タンパク質又は遺伝子が当該分野で公知の手法による検出可能量で発現していることを意味する。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質（例えば転写因子又はそのサブユニットなど）の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。遺伝子の検出は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ及びＲＮＡｓｅｑ等の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法を利用して行うことができる。

　本明細書において、「陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ（－））」とは、タンパク質又は遺伝子の発現量が、上記のような公知手法の全てあるいはいずれかによる検出下限値未満であること、あるいはその発現の程度が低発現性であることを意味する。タンパク質又は遺伝子の発現の検出下限値は、各手法により異なりえる。タンパク質又は遺伝子の発現の程度（低発現性であるか、高発現性であるか）は、同一条件で測定した対照細胞の結果との比較により、判断することができる。例えば、ある細胞の集団におけるＣＤ２５の発現の程度は、フローサイトメトリーを用い、その細胞集団におけるＣＤ２５発現量を、ＰＢＭＣ由来Ｔｃｏｎｖ（対照：ＣＤ２５低発現性であることが知られている。）におけるＣＤ２５発現量と比較し、対照と同等の発現が見られる場合は低発現性であると判断し、対照細胞より発現が高い場合は高発現性であると判断することができる。

　本明細書において、「マーカー」とは、所定の細胞型において細胞表面、細胞質内、核内等に特異的に発現されるタンパク質又はその遺伝子を意味する。マーカーは、好ましくは「細胞表面マーカー」である。「細胞表面マーカー」とは、蛍光物質により標識（染色）可能であり、細胞表面マーカーを発現している細胞の検出、濃縮、単離等を容易に行える、細胞表面に発現するタンパク質を指す。当該細胞表面マーカーとは、所定の細胞型において特異的に発現する（陽性マーカー）又は発現しない（陰性マーカー）遺伝子、具体的にはゲノム中の当該遺伝子の転写によるｍＲＮＡとして、又はそのｍＲＮＡの翻訳によるタンパク質として、生成する（陽性マーカー）又は生成しない（陰性マーカー）物質を指す。

　このような細胞表面マーカーの検出は、当該細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。

　本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。

　本明細書において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。

　本明細書において、「造血幹細胞（ＨＳＣ）」とは、血球系細胞に分化し得る多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）である。造血幹細胞は、ヒト生体内では、主として骨髄に存在し、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージ）、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞等に分化する。本明細書において、造血幹細胞（ＨＳＣ）はＣＤ３４が陽性であり、ＣＤ７が陰性であり得る（ＣＤ３４^＋／ＣＤ７^－）。なお、本明細書中、「ＣＤ３４^＋／ＣＤ７^－」などの表記において用いられる「／」とは「及び」を意味する。

　本明細書において、本明細書において「造血前駆細胞」（ＨＰＣ）とは、血球系細胞への分化能は有するが、幹細胞ほどの自己再生能は有さない細胞である。造血前駆細胞は、ヒト生体内では、主として骨髄に存在する。本明細書において、造血前駆細胞（ＨＰＣ）はＣＤ３４が陽性であり、ＣＤ４３が陽性であり得る（ＣＤ３４^＋／ＣＤ４３^＋）。また、ＨＰＣは、国際公開第２０１８／１９９１８６号に記載されているように、ＣＤ２４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９０、ＣＤ１４３、ＣＤ２６３、Ｎｏｔｃｈ３、ＣＤ３２、ＣＤ３９、ＣＤ４９ａ、ＣＤ１６４、ＣＤ３１７、ＣＤ２００、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ７、ＣＤ１４４、ＣＤ５６、ＣＤ２２６、ＣＤ２６２及びＣＤ３２５が陽性であり得、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ１０２、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６９、ＣＤ１０２及びＣＤ１５６ｃが陰性であり得る。

　本明細書において、「造血性内皮細胞（ｈｅｍｏｇｅｎｉｃ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ：ＨＥＣ）」とは、ＣＤ３４を発現し、ＣＤ４３、ＣＤ１８４及びＣＤ７３を発現しない（ＣＤ３４^＋／ＣＤ４３^－／ＣＤ１８４^－／ＣＤ７３^－）細胞である（なお、ＣＤ３４^＋／ＣＤ４３^－／ＣＤ１８４^－／ＣＤ７３^－細胞はＣＤ７を発現しないため、ＣＤ３４^＋／ＣＤ４３^－／ＣＤ１８４^－／ＣＤ７３^－細胞はＣＤ３４^＋／ＣＤ７^－／ＣＤ４３^－／ＣＤ１８４^－／ＣＤ７３^－細胞とも表される）。

　本明細書において、「Ｔ前駆細胞（ｐｒｏＴ）」とは、ヒト生体内においては造血幹細胞からＣＤ３陽性Ｔ細胞へ分化する過程で生じる造血系細胞を意味し、ＣＤ３４及びＣＤ７が陽性である（ＣＤ３４^＋／ＣＤ７^＋細胞）。また、本明細書において、ｐｒｏＴはＣＤ４３、ＣＤ１ａ及び／又はＣＤ１１６が陰性であり得る。

　本明細書において、「中胚葉前駆細胞」とは、例えば、Ｔ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙと同義）、ＫＤＲ、ＦＯＸＦ１、ＦＬＫ１、ＢＭＰ４、ＭＯＸ１及びＳＤＦ１から成るマーカー遺伝子から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子が発現する細胞を意味する。中胚葉前駆細胞は、中胚葉細胞と区別されるものではなく、上記マーカー遺伝子の発現が弱いものを中胚葉前駆細胞と称してもよい。

　本明細書において、「制御性Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、エフェクターＴ細胞の活性化を阻害し得る能力を有し、免疫応答の抑制（免疫寛容）を司っているＴ細胞を意味する。制御性Ｔ細胞は、通常ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞又はＣＤ２５^＋／ＣＤ１２７^－細胞であり、その中に、ＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋の細胞が存在する。本発明において、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋の細胞（すなわち、ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋又はＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＣＤ１２７^－）であってもよいし、ＣＤ８^＋の細胞（すなわち、ＣＤ８^＋／ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋又はＣＤ８^＋／ＣＤ２５^＋／ＣＤ１２７^－）であってもよく、ＣＤ４^＋の細胞がより好ましい。また、ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞のマスターレギュレーターとして、転写因子ＦＯＸＰ３が知られている。その他、制御性Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞の抑制機能を示す指標として知られている、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ４（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）　Ａｎｔｉｇｅｎ　４）（ＣＤ１５２）、ＣＤ３９及びＣＤ７３が陽性であり得る。Ｈｅｌｉｏｓは、Ｉｋａｒｏｓ転写因子ファミリーのメンバーであり、Ｆｏｘｐ３プロモーターに結合し、Ｆｏｘｐ３の発現を増加させることが示されている。ＣＴＬＡ４は免疫チェックポイント・タンパク質であり、Ｔ細胞の表面に発現したＣＴＬＡ４が抗原提示細胞の表面でＣＤ８０又はＣＤ８６に結合すると、Ｔ細胞の活性化が抑制される。また、ＣＤ３９及びＣＤ７３はそれぞれＡＴＰとＡＭＰを加水分解して最終産物としてアデノシンを産生し、アデノシンがＴ細胞に作用するとＴ細胞の活性化が抑制されるというメカニズムが知られている。

　本明細書において「ＣＤ４^＋Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ４が陽性である細胞を意味する。好ましくは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞はＣＤ８が陰性であり（ＣＤ４^＋／ＣＤ８^－、ＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ））、その場合、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３及びＣＤ４５が陽性であることによって認識することができることから、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＣＤ８が陰性であり、ＣＤ４、ＣＤ３及びＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる（ＣＤ４^＋／ＣＤ８^－／ＣＤ３^＋／ＣＤ４５^＋細胞）。ＣＤ４^＋Ｔ細胞としては、例えば、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞が挙げられる。本明細書における「ＣＤ４^＋Ｔ細胞」としては、ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－細胞又はＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞が好ましい。

　本明細書において「ＣＤ８^＋Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ８が陽性である細胞を意味する。好ましくは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞はＣＤ４が陰性であり（ＣＤ４^－／ＣＤ８^＋、ＣＤ８シングルポジティブ（ＳＰ））、その場合、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３及びＣＤ４５が陽性であることによって認識することができることから、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４が陰性であり、ＣＤ８、ＣＤ３及びＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる（ＣＤ４^－／ＣＤ８^＋／ＣＤ３^＋／ＣＤ４５^＋細胞）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞としては、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞が挙げられる。本明細書における「ＣＤ８^＋Ｔ細胞」としては、ＣＤ８^＋／ＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－細胞又はＣＤ８^＋／ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞が好ましい。

　本明細書において「間質細胞」とは、生体組織において実質細胞を支える結合組織を構成する細胞であって、特にＴ細胞を産生するＡＴＯ（人工胸腺オルガノイド（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｔｈｙｍｉｃ　ｏｒｇａｎｏｉｄ））を作製できる間質細胞、代表的には骨髄、胸腺等の造血系の組織に含まれる間質細胞を指し、例えば、線維芽細胞、血球細胞、間葉系幹細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、組織幹細胞などが挙げられる。間質細胞は、マウス骨髄細胞株であるＭＳ－５、ＯＰ９、Ｓ１７、ヒト間質細胞株であるＨＳ－５、ＨＳ－２７ａなどの株化細胞、ヒト等から採取された初代細胞、及びヒト等の多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞等）から分化誘導された細胞であってもよく、ヒト等の多能性幹細胞から分化誘導された細胞の場合、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された間質細胞（特にヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された線維芽細胞）が好ましい。

　本明細書において、「ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ４及びＣＤ８が共に陽性である細胞（ＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋）を意味し、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３及びＣＤ４５が陽性であることによって認識することができることから、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３及びＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる（ＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋／ＣＤ３^＋／ＣＤ４５^＋細胞）。

　本明細書において、「ＣＤ４ＣＤ８両陰性Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ４及びＣＤ８が共に陰性である細胞（ＣＤ８^－／ＣＤ４^－）を意味し、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３及びＣＤ４５が陽性であることによって認識することができることから、ＣＤ４ＣＤ８両陰性Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８が陰性であり、ＣＤ３及びＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる（ＣＤ８^－／ＣＤ４^－／ＣＤ３^＋／ＣＤ４５^＋細胞）。

　本明細書において、「細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」とは、同じ種類又は異なる種類の２以上の細胞を意味する。「細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」は、同じ種類又は異なる種類の細胞の一塊（ｍａｓｓ）をも意味する。

　本明細書において、「制御性Ｔ細胞が増殖した」、「制御性Ｔ細胞の増殖」とは、細胞集団における制御性Ｔ細胞の数（絶対数）が、培養前、又は本発明を実施せずに得られた細胞のような対照と比較して増加していることを指し、例えば、培養前又は対照と比較して少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％増加させることを意味する。本発明の特定の実施形態では、本発明により製造される細胞集団における制御性Ｔ細胞の数（絶対数）は、培養前又は対照の細胞の数と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％。１０００％増加するよう、製造される。

　本発明で用いる各種の細胞は、治療への適用の観点からは、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）規格の細胞であることが好ましい。

　多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞が挙げられ、好ましくはｉＰＳ細胞（より好ましくは、ヒトｉＰＳ細胞）である。上記多能性幹細胞がＥＳ細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、又は胚を破壊することなく作製された細胞であってもよく、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。

　「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、ウィスコンシン大学、ＮＩＨ、理研、京都大学、国立成育医療研究センター、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社などが樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトＥＳ細胞株としては、ＥＳＩ　Ｂｉｏ社が分譲するＣＨＢ－１～ＣＨＢ－１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１～ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈが分譲するＨ１株、Ｈ９株等、理研が分譲するＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。

　「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子(核初期化因子)を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」には様々なものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ－Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：　６６３－６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１－８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，　Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｙａｍａｎａｋａ，　Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ　４４８，３１３－３１７．）、ｃ－Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１－１０６）、ウイルスフリー法で６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ；８（５）：４０９－１２，Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８－６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ　Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７－１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ　ＩＨ，Ｄａｌｅｙ　ＧＱ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１－１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（日本国特開２００８－３０７００７号公報）等も用いることができる。

　この他、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ　Ｙ．，Ｄｉｎｇ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ　５，５６８－５７４；Ｋｉｍ　ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ　ＨＲ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６－６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ　７，７９５－７９７）、あるいは特許（例えば、日本国特開２００８－３０７００７号公報、日本国特開２００８－２８３９７２号公報、米国特許出願公開第２００８／２３３６６１０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０４７２６３号明細書、国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２００８／１１８２２０号、国際公開第２００８／１２４１３３号、国際公開第２００８／１５１０５８号、国際公開第２００９／００６９３０号、国際公開第２００９／００６９９７号、国際公開第２００９／００７８５２号）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。

　人工多能性幹細胞株としては、ＮＩＨ、理研、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、京都大学のＦｆ－Ｉ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ株、ＲＷＭＨ株、ＤＲＸＴ株、ＲＪＷＩ株、ＹＺＷＪ株、ＩＬＣＬ株、ＧＬＫＶ株、２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株等が挙げられる。

　「核酸」とは、ヌクレオチド及び該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体、及びヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体を挙げることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。核酸は、一本鎖核酸又は二本鎖核酸であってもよい。二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。

　ヌクレオチド類似体としては、ＲＮＡ又はＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上又は、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、あるいは細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡに修飾を施した分子であればいかなる分子でもよい。ヌクレオチド類似体としては、天然に存在する分子でも非天然の分子でもよく、例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体（例：２’－Ｏ－メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－[２－(グアニジウム)エチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、架橋構造型人工核酸（ＢＮＡ：Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ロックド人工核酸（ＬＮＡ：Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、エチレン架橋構造型人工核酸（ＥＮＡ：Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）、ペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ））、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体（例：ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、Ｎ３’－Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体）等が挙げられる。

　核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよく、その具体例としては、５’－ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６－ＦＡＭ付加誘導体、ビオチン付加誘導体等を挙げることができる。

　本発明の制御性Ｔ細胞が増殖した細胞集団の製造方法（本明細書において、単に「本発明の製造方法」と称することがある）は、以下の工程を含むことを特徴とする。
（１）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程。

　工程（１）は、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストに加えて、ＩＬ－３及び／又はＩＬ－３３の存在下で行うこともできる。すなわち、工程（１）は、ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３の存在下、ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３３の存在下、又はＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３及びＩＬ－３３の存在下などで行うこともできる。

　さらに、工程（１）は、上記成分に加えて、ＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上の存在下、特にＩＬ－２，ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下で行うこともできる。

　また、工程（１）は、上記成分に加えて、ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤の存在下で行うこともできる。

　ＩＬ（インターロイキン）－４、ＩＬ（インターロイキン）－３、ＩＬ（インターロイキン）－２、及びＩＬ（インターロイキン）－３３は、哺乳類由来が好ましく、特にヒト由来が好ましい。また、ＩＬ－４、ＩＬ－３、ＩＬ－２、及びＩＬ－３３は、哺乳動物（特にヒト）から単離及び精製された天然のものであってもよく、又は遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などが施されていてもよい）であってもよい。

　ＴＧＦ－βＲ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－β　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニストとは、ＴＧＦ－βＲに結合して、ＴＧＦ－βＲのシグナル伝達を活性化することができる物質と定義される。ＴＧＦ－βＲアゴニストとしては、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する因子が挙げられ、ＴＧＦ－βスーパーファミリーにはＴＧＦ－βファミリー、アクチビンファミリー、及びＢＭＰファミリー（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）が存在する。そのようなＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する因子としては、例えば、ＴＧＦ－β（ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３）、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１などが挙げられる。ＴＧＦ－βＲアゴニストとしては、好ましくはＴＧＦ－β、より好ましくはＴＧＦ－β１である。ＴＧＦ－βＲアゴニストは、１種類単独で、又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。

　ＴＮＦＲ２（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２）アゴニストとは、ＴＮＦＲ２に結合して、ＴＮＦＲ２のシグナル伝達を活性化することができる物質と定義され、例えば、抗体（例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体）、ペプチド、低分子化合物、タンパク質などである。ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体としては、例えば、クローンＭＲ２－１（Ｈｙｃｕｌｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、クローンＭＡＢ２２６１（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）などのＴＮＦＲ２に結合するモノクローナル抗体などが挙げられる。ＴＮＦＲ２アゴニストはまた、アゴニストとしてＴＮＦＲ２にのみ結合するＴＮＦ－αムテインであってもよい。ＴＮＦＲ２アゴニストは、１種類単独で、又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。

　ＴＮＦＲ２アゴニストとしては、好ましくはＴＮＦＲ２アゴニスト抗体である。当該抗体としては、その機能性断片であってもよく、機能性断片としては、例えば、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ’）_２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）及びミニボディを挙げることができる。抗体としては、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット等の動物由来のものが挙げられる。抗体のアイソタイプは特に制限されず、アイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭが挙げられる。また、抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、好ましくはモノクローナル抗体であり、また、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）などであってもよい。抗体は、公知の方法により製造することが可能であり、例えば、抗体をコードする核酸を含有する発現ベクターを構築し、当該核酸を導入した形質転換体を培養すること、抗体を産生するハイブリドーマを培養することなどにより生産することができる。

　ｍＴＯＲ（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ）阻害剤とは、ｍＴＯＲの機能を阻害する物質として定義され、この中にはｍＴＯＲ自体の機能を阻害する物質、及びｍＴＯＲの複合体であるｍＴＯＲ　ｃｏｍｐｌｅｘ　１（ｍＴＯＲＣ１）及びｍＴＯＲ　ｃｏｍｐｌｅｘ　２（ｍＴＯＲＣ２）の機能を阻害する物質が含まれる。ｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、ラパマイシン又はその誘導体、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、シロリムス、ＫＵ００６３７９４、ＡＺＤ８０５、ＡＺＤ８０５５、ＷＹＥ－３５４、ＷＡＹ－６００、ＷＹＥ－６８７、Ｐｐ１２１、Ｐｐ２４２、Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ、Ｓａｐａｎｉｓｅｒｔｉｂ、Ｏｍｉｐａｌｉｓｉｂ、Ｖｉｓｔｕｓｅｒｔｉｂ、Ｔｏｒｉｎ　１、Ｔｏｒｉｎ　２などが挙げられる。ｍＴＯＲ阻害剤としては、その他にも、ｍＴＯＲをコードする遺伝子及び／又はそれの転写産物に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸及びこれらを発現する発現ベクター、更には、ｍＴＯＲをリン酸化して活性化する酵素をコードする遺伝子及び／又はそれの転写産物に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸及びこれらを発現する発現ベクターなども挙げられる。ｍＴＯＲ阻害剤としては、中でも好ましくは、ラパマイシン又はその誘導体であり、より好ましくは、ラパマイシンである。ｍＴＯＲ阻害剤は、１種類単独で、又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。

　ＣＤＫ８（ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　８）及び／又はＣＤＫ１９阻害剤（本明細書において、ＣＤＫ８／１９阻害剤と称することがある。）とは、ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９の機能を阻害する物質、特にＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９のキナーゼ活性を阻害する物質として定義され、ＣＤＫ８及びＣＤＫ１９の両方の阻害剤であってもよいし、又はいずれか一方の阻害剤であってもよい。ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤としては、例えば、４－［１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル］－１，２，５－オキサジアゾール－３－アミン（ＡＳ２８６３６１９）（以下、「化合物１」と称することもある）、３－｛１－［１－（４－メトキシフェニル）ピペリジン－４－イル］－４－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル｝ピラジン－２－アミン（ＡＳ３３３４３６６）（以下、「化合物２」と称することもある）、ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９をコードする遺伝子及び／又はそれらの転写産物に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸及びこれらを発現する発現ベクター、米国特許第８５９８３４４号明細書、国際公開第２０１３／１１６７８６号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９　１３７９９－１３８０４（２０１２）、国際公開第２０１３／００１３１０号、国際公開第２０１３／０４０１５３号、国際公開第２０１４／０２９７２６号、国際公開第２０１４０６３７７８号、国際公開第２０１４／０７２４３５号、国際公開第２０１４／０９０６９２号、国際公開第２０１４／１０６６０６号、国際公開第２０１４／１２３９００号、国際公開第２０１４／１５４７２３号、国際公開第２０１４／１９４２４５号、国際公開第２０１５／０４９３２５号、国際公開第２０１５／１００４２０号、国際公開第２０１５／１４４２９０号、国際公開第２０１５／１５９９３７号、国際公開第２０１５／１５９９３８号（特に、（２Ｅ）－Ｎ－（２－フルオロ－４－（モルホリン－４－イルメチル）フェニル）－３－（４－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）アクリルアミド（以下、「化合物３」と称することがある）及び（２Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（１－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）アクリルアミド（以下、「化合物４」と称することがある））、国際公開第２０１６／００９０７６号、国際公開第２０１８／１５９８０５号（特に、８－（２，４－ジフルオロフエノキシ）－１－メチル－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｇ］インダゾール－６－カルボキサミド（以下、「化合物５」と称することがある）、４－（（４－フルオロフェニル）スルホニル）－３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルスルファ二ル）エチル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（以下、「化合物６」と称することがある）、２－（ベンジルアミノ）－４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル）ベンズアミド（以下、「化合物７」と称することがある）、３－（３－（ベンジルオキシ）フェニル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン（以下、「化合物８」と称することがある）、４－（４－（２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール（特にそのトリフルオロ酢酸塩）（以下、「化合物９」と称することがある）、Ｎ－ブチル－８－（４－メトキシフェニル）－１，６－ナフチリジン－２－カルボキサミド及び８－（４－メチルフェニル）－Ｎ，Ｎ－ジプロピル－１，６－ナフチリジン－２－カルボキサミド（特にそのトリフルオロ酢酸塩）（以下、「化合物１０」と称することがある））、国際公開第２０２２／１０７８７７号（特に、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート（以下、「化合物１１」と称することがある）、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＢＩ－１３４７）及び４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル（Ｓｅｎｅｘｉｎ　Ｂ））に記載される化合物、ＭＳＣ２５３０８１８（ＣＡＳ番号：１８８３４２３－５９－３）及びＣＣＴ２５１９２１（ＣＡＳ番号：１６０７８３７－３１－９）などが挙げられる。中でも好ましくは、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、ＢＩ－１３４７、Ｓｅｎｅｘｉｎ　Ｂ、ＭＳＣ２５３０８１８、ＣＣＴ２５１９２１、ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９をコードする遺伝子及び／又はそれらの転写産物に対するｓｉＲＮＡであり、より好ましくは、化合物１、化合物２、ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９をコードする遺伝子及び／又はそれらの転写産物に対するｓｉＲＮＡであり、更に好ましくは、化合物１である。ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤は、１種類単独で、又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。その他、ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９を阻害する方法としては、ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９をコードする遺伝子をノックアウトすることにより行うこともできる。そのような遺伝子をノックアウトする方法としては、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム等を利用するゲノム編集などの当技術分野での公知の方法を用いることができる。

　また、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３、ＩＬ－３３、ＴＮＦＲ２アゴニスト、ｍＴＯＲ阻害剤並びにＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤は、フリーの状態又は塩の状態で使用することができる。塩としては、例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩；メチルアミン塩、エチルアミン塩、エタノールアミン塩等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩及びアンモニウム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３、ＩＬ－３３、ＴＮＦＲ２アゴニスト、ｍＴＯＲ阻害剤並びにＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤には、水和物、溶媒和物、結晶多形なども含まれる。

　培地中におけるＩＬ－４の濃度は、特に限定されず、例えば、０．０１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍＬである。

　培地中におけるＴＧＦ－βＲアゴニストの濃度は、特に限定されず、用いるＴＧＦ－βＲアゴニストの種類などによって適宜調整される。ＴＧＦ－βＲアゴニストの濃度は、例えば、０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１～５０ｎｇ／ｍＬである。

　培地中におけるＩＬ－３の濃度は、特に限定されず、例えば、０．０１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍＬである。

　培地中におけるＩＬ－３３の濃度は、特に限定されず、例えば、０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍＬである。

　培地中におけるＩＬ－２の濃度は、特に限定されず、例えば、０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍＬである。

　培地中におけるＴＮＦＲ２アゴニストの濃度は、特に限定されず、用いるＴＮＦＲ２アゴニストの種類などによって適宜調整される。ＴＮＦＲ２アゴニストの濃度は、例えば、０．０００１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１～１０μｇ／ｍＬである。

　培地中におけるｍＴＯＲ阻害剤の濃度は、特に限定されず、用いるｍＴＯＲ阻害剤の種類などによって適宜調整される。ｍＴＯＲ阻害剤の濃度は、例えば、１～１００ｎＭ、好ましくは１０～１００ｎＭである。

　培地中におけるＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤の濃度は、特に限定されず、用いるＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤の種類などによって適宜調整される。ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤の濃度は、例えば、０．０１～３００μＭ、好ましくは０．０５～１５０μＭである。

　工程（１）の培養で使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として、前述するＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト（並びにＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－３３、ＴＮＦＲ２アゴニスト、ｍＴＯＲ阻害剤、ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤等）を含むものである。基礎培地としては、動物細胞の培養に使用できるものであれば特に限定されず、例えば、ＡＩＭＶ、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ、ＥＧＭ２、ＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、グラスゴーＭＥＭ、改良ＭＥＭ亜鉛オプション、ＩＭＤＭ、１９９培地、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ－１６４０、フィッシャー培地などが挙げられる。これらの培地は、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。

　培地は、血清を含有していてもよいし、無血清でもよい。培地はまた、血清代替物（例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール、ＩＴＳ－サプリメント、Ｂ２７（商標）サプリメント等）を含有していてもよい。血清代替物は、１種又は２種以上を使用することができる。

　さらに、培地には、脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸等）、Ｌ－グルタミン、ビタミン、増殖因子、サイトカイン（ＩＬ－２など）、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有することができる。培地としては、血清等の成分が明らかでないものを含まない既知組成（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ）の培地を使用することが、培地のロット間の差が低減され、品質の安定した細胞を調製できるため望ましい。

　培地のｐＨは、通常７．０～７．８、好ましくは７．２～７．６である。培地は、使用前にはコンタミネーションを防止するため、濾過、紫外線照射、加熱滅菌、放射線照射等の方法により好ましくは滅菌される。

　培養は、フィーダー細胞の存在下又は非存在下で実施される。本発明の製造方法は、成分が明らかでないものが混入することがなく、均一な性質を持つ制御性Ｔ細胞を安定して製造させることができるため、フィーダー細胞の非存在下で実施されることが望ましい。

　本発明の製造方法の培養条件は、特に制限されず、培養温度は、例えば、３７～４２℃程度、好ましくは３７～３９℃程度であり、ＣＯ_２濃度は、例えば２％～１０％、好ましくは２～５％であり、酸素濃度は、例えば１～２０％、好ましくは５～２０％である。

　また、培養期間についても、特に制限されず、当業者であれば制御性Ｔ細胞の数などをモニターしながら適宜決定することが可能であり、例えば、７日間以上、好ましくは１４日間以上、より好ましくは２１日以上、更に好ましくは２８日以上である。培養期間の上限は特に限定されず、例えば、４２日間以下、好ましくは３５日間以下、より好ましくは２８日間以下である。本発明における培養では、所望の量の制御性Ｔ細胞を得るために必要な回数継代を行ってもよいし、培地の追加及び交換を行ってもよい。本発明における培養は、公知のＣＯ_２インキュベーターを使用して行うことができる。培養容器は特に限定されるものではなく、プレート、ディッシュ、シャーレ、フラスコ、バッグ、ボトル、タンク（培養槽）、バイオリアクターなどの中から適宜選択することができる。培養容器としては抗ＣＤ３抗体を結合させた容器を用いることができる。

　工程（１）では、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニスト（更にＩＬ－３、ＩＬ－３３、ＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト、ＣＤＫ８／１９阻害剤及び／又はｍＴＯＲ阻害剤を加えてもよい）の存在下で、最初は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を用いて細胞を培養（刺激）した後、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含まない培地で培養を行うことを繰り返すようにして培養を行ってもよい。この繰り返しの培養期間は、例えば、６～１６日であり、好ましくは７～１４日である。具体的には、最初の３日程度を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の存在下で細胞を培養（刺激）した後、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含まない培地で４～１１日間程度培養を行い、この単位の培養を繰り返すことが挙げられる。培養の繰り返しの回数は、特に制限されず、当業者であれば制御性Ｔ細胞の数などをモニターしながら適宜決定することが可能であり、例えば、１～５回である。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を加える工程では、更に抗ＣＤ３０抗体を加えて培養を行ってもよい。

　本発明で使用する、多能性幹細胞、多能性幹細胞を作製するための細胞は、ヒト由来であってもよいし、ヒト以外の哺乳類（非ヒト哺乳類）由来の細胞であってもよく、好ましくはヒトである。非ヒト哺乳類としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サルが挙げられる。また、ユニバーサル化された（多数の患者に対して免疫拒絶を起こさないような特定のＨＬＡ型を有する、又はＨＬＡをノックアウトした）ｉＰＳ細胞を用いることもできる。

　本発明の製造方法で使用するＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞））から分化誘導されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団である。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団に含まれるＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合（細胞数）は、例えば、５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上であり、また上限は、例えば、１００％以下である。

　本発明の製造方法は、得られた制御性Ｔ細胞を濃縮するために、制御性Ｔ細胞を分離する工程を更に含んでいてもよい。制御性Ｔ細胞の分離は、フローサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法などの公知の方法により行うことができる。

　本発明の製造方法により、制御性Ｔ細胞が増殖した、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造することができる。ここで、多能性幹細胞由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞として、制御性Ｔ細胞であるＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞を使用する場合は、本発明の製造方法により制御性Ｔ細胞を拡大培養することができる。一方で、多能性幹細胞由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞として、制御性Ｔ細胞でないＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－細胞を使用する場合は、制御性Ｔ細胞に分化誘導し、制御性Ｔ細胞の含有割合が高い、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造することができる。

　ＣＤ４^＋Ｔ細胞としてＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－細胞を使用する場合に、本発明の製造方法により得られる制御性Ｔ細胞を含む細胞集団に含まれる制御性Ｔ細胞の割合（細胞数）は、例えば、１０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上であり、また上限は、例えば、１００％以下である。

　本発明の製造方法は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団以外にもＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む細胞集団に適用することもできる。

　また、多能性幹細胞由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞として、制御性Ｔ細胞であるＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞を使用する場合の本発明の実施形態における、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の増殖方法は、以下の工程を含むことを特徴とする。
（１Ａ）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程。

　多能性幹細胞由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞として、制御性Ｔ細胞でないＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－細胞を使用する場合の本発明の実施形態における、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法は、以下の工程を含むことを特徴とする。
（１Ｂ）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来のＣＤ４^＋／ＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程。

　工程（１Ａ）及び工程（１Ｂ）は、工程（１）と同様に実施することができる。上記の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の増殖方法、及び制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法は、本発明の製造方法に包含され、本発明の製造方法に関する説明が適用される。

　本発明の製造方法及び増殖方法は、工程（１）の前に、
（２）多能性幹細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を更に含んでいてもよい。

　多能性幹細胞のＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団への分化誘導は、公知の方法に従って実施することができる。そのような方法として、例えば、多能性幹細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞に分化誘導した後、当該ＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団に分化誘導することが挙げられる。ＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞としては、ＣＤ３４^＋細胞、中胚葉前駆細胞、ＣＤ４ＣＤ８両陰性Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞等が挙げられ、好ましくはＣＤ３４^＋細胞又は中胚葉前駆細胞であり、より好ましくは造血性内皮細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、Ｔ前駆細胞、又は中胚葉前駆細胞であり、特に好ましくは造血性内皮細胞である。上記ＣＤ３４^＋細胞は、ＣＤ３４を発現する（ＣＤ３４^＋）細胞であり、特にＣＤ３４を発現し、ＣＤ７を発現しない（ＣＤ３４^＋／ＣＤ７^－）細胞である。ＣＤ３４^＋細胞としては例えば造血性内皮細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞が挙げられる。

　多能性幹細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞への分化誘導は、公知の方法に従って実施することができる（例えば、国際公開第２０２１／０８５５７６号等参照）。例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞は、フィーダーフリー法により作製することができ、その中でも、フィーダー細胞を用いず、ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｂｏｄｙを形成させて造血前駆細胞を産生させる「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｂｏｄｙ法（ＥＢ法）」（ＡＥ　Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（２０１０）．Ｂｌｏｏｄ，１１５（１４）：２７６９－２７７６．参照）が好ましい。

　また、多能性幹細胞をフィーダー細胞上で培養して造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞に分化誘導することもできる（国際公開第２０１１／０９６４８２号、国際公開第２０１３／１７６１９７号参照）。フィーダー細胞は、中胚葉系への分化を誘導し易くするという観点から、間質細胞であることが好ましい。間質細胞は、造血系への分化を誘導し易くするという観点から、ＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）などであることが好ましい。

　多能性幹細胞のＣＤ３４^＋細胞への分化誘導は、公知の方法に従って実施することができ、多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である場合、例えば、国際公開第２０１７／２２１９７５号、国際公開第２０１８／１３５６４６号及びＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２（２０１２）１７２２－１７３５に記載された方法により、造血前駆細胞を分化誘導しＣＤ３４^＋細胞を製造することができる。

　ＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団に分化誘導する方法としては、例えば、ＡＴＯ（人工胸腺オルガノイド（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｔｈｙｍｉｃ　ｏｒｇａｎｏｉｄ））法が挙げられる（国際公開第２０１７／０７５３８９号等参照）。このようなＡＴＯ法としては、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞とＮｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ）とを含む３次元細胞凝集体を培養することであり、これにより高い効率でＣＤ４^＋Ｔ細胞へ分化誘導させることが可能となる。ＡＴＯ法は公知の方法であり、国際公開第２０１７／０７５３８９号、国際公開第２０２１／０８５５７６号等の記載を参考にして実施することができる。また、その他の方法としては、国際公開第２０２１／０９２５８１号に記載の分化誘導方法（ＭＳ５－ＤＬＬ１／４間質細胞、ＯＰ９若しくはＯＰ９－ＤＬＬ１間質細胞又はＥｐＣＡＭ－ＣＤ５６^＋間質細胞と共培養する方法など）が挙げられる。

　ＡＴＯ法を実施する場合、ＡＴＯ法を実施する前にＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞を分離する工程を実施しなくてもよいし、また、公知の方法（例えば、フローサイトメトリー、磁気細胞分離法）に従って分離したＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞にＡＴＯ法を実施することもできる。

　間質細胞にはＮｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸が導入されていることが好ましい。Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞は、間質細胞に上記核酸を導入することにより製造することができる。また、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞））に上記核酸を導入した後、多能性幹細胞を間質細胞に分化させることによっても製造することができる。

　本発明の製造方法で使用する間質細胞としては、例えば、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞））から分化誘導された間質細胞が挙げられ、中でも、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞））を線維芽細胞に分化誘導した細胞を使用することが望ましい。多能性幹細胞の間質細胞への分化誘導は、公知の方法に従って実施することができ、多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である場合、例えば、ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　８（１０）：ｅ７７６７３，２０１３に記載された方法により、ｉＰＳ細胞から分化誘導された線維芽細胞を製造することができる。

　Ｎｏｔｃｈリガンドとしては、特に限定されず、国際公開第２０１７／０７５３８９号に記載の標準的Ｎｏｔｃｈリガンドと非標準的Ｎｏｔｃｈリガンドとを含む。標準的Ｎｏｔｃｈリガンドとしては、例えば、ＤＬＬ４（デルタ様リガンド４）、ＤＬＬ１（デルタ様リガンド１）、ＪＡＧ１（Ｊａｇｇｅｄ１）、ＪＡＧ２（Ｊａｇｇｅｄ２）などが挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。非標準的Ｎｏｔｃｈリガンドとしては、例えば、コンタクチン－１、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、コンタクチン－６、ペリオスチン／ＯＳＦ－２、ＤＬＫ２／ＥＧＦＬ９、Ｐｒｅｆ－１／ＤＬＫ１／ＦＡ１、ＤＮＥＲ、トロンボスポンジン－２、ＭＡＧＰ－１／ＭＦＡＰ２、トロンボスポンジン－３、ＭＡＧＰ－２／ＭＦＡＰ５、トロンボスポンジン－４及びネトリン－１が挙げられる。Ｎｏｔｃｈリガンドとしては、ヒトＤＬＬ４を用いることが好ましい。

　上記Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸を間質細胞又は多能性幹細胞に導入するための手段は特に限定されるものではなく、公知又は一般的な各種の手段を採用することができる。典型的には上記Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸は、発現ベクターを用いて間質細胞に導入し、発現させる。発現ベクターは、直鎖状でも環状でもよく、プラスミドなどの非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。

　発現ベクターを間質細胞に導入するための手法は、実施形態に応じた適切なものとすることができる。例えば、ウイルス感染法、カルシウムリン酸法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などの公知の方法により、発現ベクターを間質細胞に導入することができる。発現ベクターは、公知の手段によって、また適宜市販のキットを用いて（その指示書に従って）、各手法における使用に適した形態に調製することができる。

　発現ベクターは、ウイルス感染法により間質細胞に導入することができる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターを用いる場合は、対応する市販のキットを用いて、上記Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸を含むベクター及び各ウイルスのパッケージングベクター（プラスミド）を宿主細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製した後、得られた組換えウイルスを間質細胞に感染させるようにすればよい。

　発現ベクターは、上記Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸に加えて、必要に応じて、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）等の配列を含んでいてもよい。発現ベクターは更に、レポーター遺伝子（例えば、各色の蛍光タンパク質をコードする遺伝子）、薬剤選択遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）、自殺遺伝子（例えば、ジフテリアＡ毒素、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＡ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、チトクロームＰ４５０（ｃｙｔ－４５０）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶ－ＴＫ）、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、誘導性カスパーゼ９（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｃａｓｐａｓｅ　９）などをコードする遺伝子）のような“機能的遺伝子”をコードする核酸（塩基配列）を含んでいてもよい。

　３次元細胞凝集体は、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞とＮｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞とを遠心分離することにより形成することができる。間質細胞にはＮｏｔｃｈリガンドを発現するための核酸が導入されていることが好ましい。間質細胞：ＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞の比率としては、用いる間質細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞の種類などによって当業者により適宜調整することが可能であり、例えば、１００：１～１：１００、９０：１～１：９０、８０：１～１：８０、７０：１～１：７０、６０：１～１：６０、５０：１～１：５０、４０：１～１：４０、３０：１～１：３０、２０：１～１：２０、１０：１～１：１０などが挙げられる。例えば、間質細胞がマウス骨髄細胞（特にＭＳ－５）の場合、好ましくは２０：１～１：４であり、間質細胞が多能性幹細胞由来間質細胞（特にｉＰＳ細胞（とりわけヒトｉＰＳ細胞）から分化誘導された線維芽細胞）の場合、好ましくは４：１～１：４、更に好ましくは１：１である。

　３次元細胞凝集体を培養するための培地としては、特に限定されず、例えば、血清含有培地、血清不含培地、又はゼノフリー培地であり、好ましくは血清不含培地、特にインスリン（更に、ビオチン、トランスフェリン、及びアルブミン）を含有する血清不含培地が挙げられる。

　３次元細胞凝集体を培養するための基礎培地としては、例えば、ＡＩＭＶ、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ、ＥＧＭ２、ＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、グラスゴーＭＥＭ、改良ＭＥＭ亜鉛オプション、ＩＭＤＭ、１９９培地、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ－１６４０、フィッシャー培地などが挙げられる。これらの培地は、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。

　さらに、培地には、脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸等）、Ｌ－グルタミン、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有することができる。培地としては、血清等の成分が明らかでないものを含まない既知組成（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ）の培地を使用することが、培地のロット間の差が低減され、品質の安定した細胞を調製できるため望ましい。その他、国際公開第２０１７／０７５３８９号に記載の培地成分などが適宜配合され得る。

　３次元細胞凝集体の培養温度は、例えば２０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２濃度は、例えば２～１０％、好ましくは２～５％であり、酸素濃度は、例えば１～２０％、好ましくは５～２０％である。培養開始時の細胞密度は、例えば、１．０×１０^４～１．０～１０^１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度とすることができる。

　３次元細胞凝集体の培養期間は、用いる間質細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞の種類などによって当業者により適宜調整することが可能であり、例えば４週以上、好ましくは５週以上、より好ましくは６週以上である。培養期間の上限は特に限定されず、好ましくは１６週以下、より好ましくは１４週以下、さらに好ましくは１２週以下、特に好ましくは９週以下である。

　３次元細胞凝集体の培養により得られるＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団には、ＣＤ４^＋Ｔ細胞以外の細胞が含まれていることがあるため、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団に対して、例えば、蛍光標識された抗ＣＤ４抗体及びセルソーターを用いたフローサイトメトリー（代表的には蛍光活性化セルソーティング：ＦＡＣＳ）により、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を単離して回収してもよい。さらにＣＤ４ＳＰ　Ｔ細胞を単離して回収してもよい。また、さらにＣＤ２５陰性で分画されるエフェクターＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）を単離して回収してもよい。

　３次元細胞凝集体の培養により得られるＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、工程（１）の前に、公知の方法（例えば、抗ＣＤ３抗体及びＩＬ－２を含む培地中でＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する）による拡大培養工程を行ってもよい。

　工程（１）においてＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を使用する場合は、工程（２）についてはＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を分化誘導するために実施される。

　本発明の製造方法において、ＣＤ４^＋Ｔ細胞として
　　　（ａ）Ｆｏｘｐ３遺伝子のＣＮＳ１、ＣＮＳ２、及びＣＮＳ３；
　　　（ｂ）プロモーター；及び
　　　（ｃ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸
を含む発現構築物 (本明細書において、ＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３と称することがある) が導入された細胞を使用してもよい。

　発現構築物を導入する細胞は、特に限定されず、分化のいずれの段階であってもよく、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、多能性幹細胞又はＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞が挙げられる。発現構築物をＣＤ４^＋Ｔ細胞、多能性幹細胞又はＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞に導入する方法としては、前述する方法が挙げられる

　本発明における発現構築物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ＦＯＸＰ３を発現させるためのものであって、（ａ）Ｆｏｘｐ３遺伝子のＣＮＳ１（保存された非コード配列１）、ＣＮＳ２（保存された非コード配列２）、及びＣＮＳ３（保存された非コード配列３）、（ｂ）プロモーター、及び（ｃ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸を含んでいる。このような発現構築物を、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、多能性幹細胞又はＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞に導入することにより、高い効率で制御性Ｔ細胞を製造することが可能となる。発現構築物は、ＦＯＸＰ３を発現させることができるものであれば特に限定されず、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）以外にも、ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、Ｆｏｘｐ３　３’ＵＴＲなどが含まれることが好ましく、これらが導入された細胞内で機能するものであればより好ましい。

　ヒトのＦｏｘｐ３遺伝子の塩基配列は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１１１４３７７（配列番号１）、ＮＭ＿０１４００９（配列番号２）として登録されており、アミノ酸配列についてもＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１１０７８４９（配列番号３）、ＮＰ＿０５４７２８（配列番号４）として登録されている。ここでのＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＣＢＩのｗｅｂ　ｓｉｔｅに登録されているものである。本発明においては、上記遺伝子には、前述するようなデータベースに登録されている塩基配列を有するもの以外であっても、その縮重物及び変異体も含まれ、変異体としては上記アミノ酸配列からなるタンパク質と同等の生物学的活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。変異体としては、天然のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性のアミノ酸配列を有する変異型のＦＯＸＰ３が挙げられる。本明細書において、ＦＯＸＰ３はタンパク質をＦｏｘｐ３は遺伝子を意味するものとするが、ＦＯＸＰ３、Ｆｏｘｐ３をそれぞれ遺伝子、タンパク質として解釈することが適切な場合は遺伝子、タンパク質を意味するものとする。

　ＦＯＸＰ３をコードする核酸としては、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードする核酸であれば特に限定されず、好ましくはＦＯＸＰ３のｃＤＮＡである。

　本発明で使用するＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３は、全てＦｏｘｐ３遺伝子に由来するものである。ＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３は、Ｆｏｘｐ３エンハンサーエレメントである。本発明で使用するプロモーターは特に限定されず、例えば、ＣＡＧプロモーター、ユビキチン遺伝子のプロモーター、Ｆｏｘｐ３遺伝子のプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどであり、好ましくはＦｏｘｐ３遺伝子のプロモーターである。ヒトのＦｏｘｐ３遺伝子のＣＮＳ１、ＣＮＳ２、ＣＮＳ３及びプロモーターの好ましい塩基配列としては、それぞれ配列番号５～８に記載された塩基配列が挙げられる。当該プロモーター、ＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３には、前述するような塩基配列を有するもの以外であっても、変異体も含まれ、変異体としては上記塩基配列からなるプロモーター、ＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３と同等の生物学的活性を有するものが望ましい。変異体としては、天然の塩基配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性の塩基配列を有するものが挙げられる。

　プロモーター、ＣＮＳ１、ＣＮＳ２、ＣＮＳ３及びＦＯＸＰ３をコードする核酸の発現構築物における配置（順番）は特に限定されず、ＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３がプロモーターの上流に位置していることが好ましく、５’末端側から順にＣＮＳ１－ＣＮＳ２－ＣＮＳ３－プロモーター－ＦＯＸＰ３をコードする核酸であることがより好ましい。

　上記発現構築物を導入する細胞としては、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、多能性幹細胞又はＣＤ４^＋Ｔ細胞に分化可能な細胞であれば特に限定されず、例えば、多能性幹細胞、造血幹細胞、造血性内皮細胞、造血前駆細胞、Ｔ前駆細胞、中胚葉前駆細胞、ヘルパーＴ細胞などが挙げられ、好ましくは多能性幹細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。中でも上記発現構築物を導入する細胞として多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）を使用し、これをＣＤ３４^＋細胞（特に造血性内皮細胞）に分化誘導して、当該ＣＤ３４^＋細胞（特に造血性内皮細胞）にＡＴＯ法を実施し、制御性Ｔ細胞に分化させることが望ましい。

　本発明の製造方法及び増殖方法により得られた制御性Ｔ細胞は、外来遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞であってもよい。

　「外来遺伝子」は、制御性Ｔ細胞に所望のタンパク質を発現させるために、外部より導入される遺伝子であり、制御性Ｔ細胞の用途に応じて適宜選択することができる。

　外来遺伝子は、例えば、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を発現するための遺伝子とすることができ、そこに更に、サイトカイン及び／又はケモカインを発現するための遺伝子を含むことができる。制御性Ｔ細胞が発現するＣＡＲは基本的に、一般的又は公知のＣＡＲと同様に、（ｉ）がん細胞の細胞表面抗原を認識する抗原認識部位（例えば、一本鎖抗体）、（ｉｉ）細胞膜貫通領域、及び（ｉｉｉ）Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域、の各部位のペプチドが、必要に応じてスペーサーを介して連結することによって構成されている。また、外来遺伝子は、例えば、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するための遺伝子とすることもできる。外因性ＴＣＲとは、外因性ＴＣＲをコードする核酸が導入されるＴ細胞にとって外因性であることを意味し、外因性ＴＣＲのアミノ酸配列は当該Ｔ細胞の内因性ＴＣＲと同一であってもよく、異なっていてもよい。外来遺伝子は、１種類、又は２種類以上を導入することができる（例えば、ＣＡＲと外因性ＴＣＲ）。

　外来遺伝子を細胞に導入するための手段としては前述する方法が挙げられる。なお、外来遺伝子を導入する細胞は、特に限定されず、分化のいずれの段階であってもよく、例えば、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞などが挙げられる。

　本発明の製造方法及び増殖方法により製造した制御性Ｔ細胞を含む細胞集団は、免疫反応が異常に亢進している動物（特に、ヒト）の治療に有用であり、例えば、Ｘ染色体連鎖型免疫調節異常・多発性内分泌障害・腸症（ＩＰＥＸ）症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、臓器移植における拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患（花粉症、喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、食品アレルギー、食物過敏症、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、薬剤アレルギー）などの治療及び予防に有用であるが、これらに限定されない。本発明の製造方法により製造した制御性Ｔ細胞は、自家移植に用いてもよく、他家移植に用いてもよい。また、他の薬剤と併用してもよい。

　このような細胞治療を実施する場合、拒絶反応が起こらないという観点から、制御性Ｔ細胞の製造に使用するための細胞が単離される対象は、制御性Ｔ細胞が投与される対象とＨＬＡの型が一致していることが好ましく、制御性Ｔ細胞が投与される対象と同一の対象であることがより好ましい。

　本発明によれば、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を含有してなる医薬（以下、本発明の医薬と称することがある）を製造することができる。本発明の医薬は、公知の手段（例えば、日本薬局方に記載の方法等）に従って、有効量の制御性Ｔ細胞を薬学的に許容される担体と混合するなどして、非経口製剤として製造することが好ましい。本発明の医薬は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造することが好ましい。非経口的な投与方法としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下投与などの方法が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、溶剤、基剤、希釈剤、賦形剤、無痛化剤、緩衝剤、保存料、安定剤、懸濁剤、等張化剤、界面活性剤、溶解補助剤等が挙げられる。

　本発明の医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができるが、通常、細胞数として、体重６０ｋｇの対象に対し、１回当り、通常１×１０^６～１×１０^１０個となるように、好ましくは１×１０^７～１×１０^９個となるように、より好ましくは５×１０^７～５×１０^８個となるように投与される。また、１回で投与してもよく、複数回にわたって投与してもよい。本発明の医薬は、非経口投与に適した公知の形態、例えば、注射又は注入剤とすることができる。また、本発明の医薬は、細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含んでもよい。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１０などの培地が挙げられるが、これらに限定されない。また、該医薬には医薬的に許容される担体（例：ヒト血清アルブミン）、保存剤等が安定化の目的で添加されていてもよい。本発明の医薬は、ヒトを含む哺乳動物に対して適用されるものである。

　本明細書及び請求の範囲で使用される場合、特に文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。したがって、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。

　以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。

　［実施例１］ｉＰＳ－Ｔｒｅｇの拡大培養
　ｉＰＳ細胞からＴｒｅｇへの分化誘導後の細胞を、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βを含む培地で拡大培養を行った。

　ｉＰＳ細胞からＴｒｅｇへの分化誘導は、具体的には以下のとおりである。ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列（ＭＫ０１２４３１）内のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙタンパク質配列をｄＴｏｍａｔｏ配列に変更したＤＮＡ配列を、第３世代レンチウイルスベクター作製用のトランスファープラスミドに組み込んだプラスミド配列をデザイン、合成した。受領したプラスミドをレンチウイルスベクター作製用のパッケージングプラスミドとエンベローププラスミドと共にＨＥＫ２９３系統の細胞にトランスフェクションを行い、産生されたレンチウイルスベクターを含む上清を回収後、高速遠心法で濃縮しｉＰＳ細胞へ導入するレンチウイルスベクターを取得した。次に、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株を２４ウェルプレートに１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、終濃度１０μｇ／ｍＬでプロタミンを添加した後に、ＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３遺伝子を組み込んだレンチウイルス溶液を直接添加して、ウイルス感染ｉＰＳ細胞を作製した。

　超低接着処理された６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウイルス感染させたＦｆ－Ｉ０１ｓ０４株を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し（Ｄａｙ０）、ＥＢ培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｇｉｂｃｏ）に１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、５．５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ，Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、４５ｍＭ　α－モノチオグリセロール（ナカライテスク株式会社）、及び５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸２－リン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加）に５０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（富士フイルム和光純薬株式会社）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、２μＭ　ＳＢ４３１５４２（富士フイルム和光純薬株式会社）を加えて、低酸素条件下（５％Ｏ_２）にて４日間培養を行った（Ｄａｙ４）。続いて、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）が添加された培地でさらに４日間培養を行い（Ｄａｙ８）、ＨＥＣを含む細胞集団を得た。さらにマウス由来間質細胞株ＭＳ５にヒトＤＬＬ４タンパク質を強制発現させたものを支持体として、ＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３導入ヒトｉＰＳ細胞由来ＨＥＣと、４：１の細胞比で共培養した。培地には終濃度で２ｘＢ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｘＰＳＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍＬ　ＦｌＴ３Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだＲＰＭＩ－１６４０（富士フイルム和光純薬株式会社）を用い、３０ｍｍ　Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（親水性ＰＴＦＥ、ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ　０．４μｍ、高さ５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上で共培養したものを６ウェルプレート（ＴＰＰ）内に静置して、３－４日に一回の頻度で培地交換しながら９週間培養した。

　上記で得られたＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３導入ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔｒｅｇを含む細胞集団を、抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を結合させた４８穴細胞培養プレートに２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃、５．０％ＣＯ_２条件下で３日間培養した後、２４穴Ｇ－Ｒｅｘ細胞培養プレートに播き直して培養を続けた。培地には終濃度でＦＢＳ（１５％，Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、インスリン－トランスフェリン－セレン　サプリメント（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸２－リン酸（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ３０抗体（３００ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びカスパーゼ阻害薬（１０μＭ，Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。最初の３日間は抗ＣＤ２８抗体（１．５μｇ／ｍＬ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を上記の組成に対してさらに添加した。培養は培養開始３日目と、それ以降は３－４日に一回の頻度で培地交換しながら１４日間培養した。また、この培養期間の１０日目にＣＤ４　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ４^＋及びＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞を精製した。得られた細胞は再度上記と同様の培養条件で拡大培養を実施し、１０日目にＣＤ８　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いることでＣＤ８発現細胞を除去し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を精製した。

　上記で得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を、抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を結合させた４８穴細胞培養プレートに２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃、５．０％ＣＯ_２条件下で３日間培養した後、２４穴Ｇ－Ｒｅｘ細胞培養プレートに播き直して培養を続けた。培地には終濃度でＦＢＳ（１５％，Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、インスリン－トランスフェリン－セレン　サプリメント（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸２－リン酸（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ３０抗体（３００ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、カスパーゼ阻害薬（１０μＭ，Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、ラパマイシン（１０ｎＭ，ｍｅｒｃｋ　ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び抗ＴＮＦＲ２抗体（３μｇ／ｍＬ，Ｈｙｃｕｌｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含んだα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ＩＬ－３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－３３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＴＧＦ－β１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）添加群は上記の組成に対してさらにそれぞれ６０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬを添加した。最初の３日間は抗ＣＤ２８抗体（１．５μｇ／ｍＬ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を上記の組成に対してさらに添加した。培養は培養開始３日目と、それ以降は３－４日に一回の頻度で培地交換しながら１８日間培養した。３、６、１０、１３、１８日目で細胞数を計測し、折れ線グラフを作製した。結果を図１に示す。

　ＩＬ－４及びＴＧＦ－β１を添加した細胞集団では対照（ＩＬ－４及びＴＧＦ－βを含まない）に比較し、細胞増殖が促進されていることが確認できた（拡大培養１８日目においてＩＬ－４及びＴＧＦ－βを添加した細胞集団では拡大培養開始時と比較して細胞数が５４．７倍だったのに対し、対照群では３８．４倍だった）。また、ＩＬ－４とＴＧＦ－βに加えてＩＬ－３又はＩＬ－３３、或いはその両方を追加で添加した細胞集団ではＩＬ－４及びＴＧＦ－βを添加した群と同程度かそれ以上の細胞増殖の促進がみられた（１８日目においてＩＬ－３を追加で添加した群では５７倍、ＩＬ－３３を追加で添加した群では８７倍、ＩＬ－３及びＩＬ－３３の両方を追加で添加した群では７７．８倍だった）。

　［実施例２］拡大培養におけるＴｒｅｇのタンパク質の発現量の検討
　実施例１で拡大培養をしたＴｒｅｇを用いて、Ｔｒｅｇに発現するタンパク質の発現量を検討した。

　具体的には実施例１で拡大培養をした１８日目の各細胞集団を用いて、以下の抗体セットを用いて染色し、フローサイトメトリーによって解析した；
Ｐａｎｅｌ（１）：Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ，ＢＶ５１０　ＣＤ３，ＢＶ４２１　ＣＤ４，ＰＥ／Ｃｙ７　ＣＤ８β，ＡＰＣ　ＣＤ２５，ＦＩＴＣ　Ｆｏｘｐ３，ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５　ＣＴＬＡ４
Ｐａｎｅｌ（２）：Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ，ＢＶ５１０　ＣＤ３，ＢＶ４２１　ＣＤ４，ＰＥ／Ｃｙ７　ＣＤ８β，ＦＩＴＣ　Ｆｏｘｐ３，ＰＥ　Ｈｅｌｉｏｓ，ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５　ＣＤ３９，ＡＰＣ　ＣＤ７３。
結果を図２に示す。

　ＩＬ－４及びＴＧＦ－βを添加した細胞集団、またＩＬ－４及びＴＧＦ－βに加えてＩＬ－３を添加した細胞集団では対照（ＩＬ－４及びＴＧＦ－βを含まない）に比較し、同程度のＦｏｘｐ３陽性率が見られた。また、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βに加えてＩＬ－３及びＩＬ－３３の両方を追加、或いはＩＬ－３３のみを追加した細胞集団では、対照に比較しＦｏｘｐ３陽性率は低下する傾向が見られた。実施例１の細胞増殖率を考慮すると、いずれの群でも対照に比較し、より高いＴｒｅｇ（ＣＤ２５^＋／Ｆｏｘｐ３^＋細胞）の増殖が確認でき、また、Ｔｒｅｇの抑制機能を示す指標として知られているタンパク質（Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３９及びＣＤ７３）の発現も保たれていることから、Ｔｒｅｇの形質を維持したまま、好ましい増殖率を達成することができた。

　［実施例３］Ｔｒｅｇの抑制性機能の評価
　実施例１で拡大培養をしたＴｒｅｇを用いて、ヒトＰＢＭＣ由来の他家Ｔ細胞と共培養後のフローサイトメトリーによる分析を行った。

　具体的にはＴｒｅｇとは別ドナー由来の抗ＣＤ３抗体未処置又は処置したＴ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色したものをターゲット細胞として用い、Ｔｒｅｇと共培養した。培地には終濃度でＦＢＳ（１５％，Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、インスリン－トランスフェリン－セレン　サプリメント（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びアスコルビン酸２－リン酸（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、４日間培養した。各細胞集団は次の抗体セットを用いて染色した（Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ，ＰＥ／Ｃｙ７　ＣＤ３，ＦＩＴＣ　ＨＬＡ－Ａ２４）。結果を図３に示す。

　ｉＰＳ－Ｔｒｅｇと共培養した群では、Ｔｒｅｇの細胞数依存的にターゲット細胞の細胞***が強く抑制された。またその抑制性機能はＩＬ－３、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βを添加して培養したＴｒｅｇにおいて、対照（ＩＬ－３、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βを含まない）に比較しより強い効果が見られた。Ｔｒｅｇ：Ｔａｒｇｅｔ＝２：１の場合において、対照の抑制率が３１．３％だったのに対し、ＩＬ－３、ＩＬ－４及びＴＧＦ－ｂｅｔａを添加した細胞集団では６６．９％の抑制率が見られた。これらの結果より、Ｔｒｅｇの抑制性機能を保てたまま、十分にＴｒｅｇを増殖させることが出来たことが確認された。

　［実施例４］ｉＰＳ－Ｔｒｅｇの拡大培養
　上記実施例１で得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を、抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を結合させた４８穴細胞培養プレートに２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃、５．０％ＣＯ_２条件下で３日間培養した後、２４穴Ｇ－Ｒｅｘ細胞培養プレートに播き直して培養を続けた。培地には終濃度でＦＢＳ（１５％，Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、インスリン－トランスフェリン－セレン　サプリメント（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸２－リン酸（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ラパマイシン（１０ｎＭ，ｍｅｒｃｋ　ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＴＮＦＲ２抗体（３μｇ／ｍＬ，Ｈｙｃｕｌｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＩＬ－３（６０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－４（３０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－３３（３０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＴＧＦ－β１（５ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含んだα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。また、コントロール条件としては、上記培地組成からラパマイシン、抗ＴＮＦＲ２抗体、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－３３及びＴＧＦ－β１を抜いた培地を用いた。最初の３日間は抗ＣＤ２８抗体（１．５μｇ／ｍＬ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３０抗体（３００ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を上記の組成に対してさらに添加した。培養は培養開始３日目と、それ以降は２－３日に一回の頻度で培地交換しながら１４日間培養した。また、培養１４日目の細胞を一部、上記の抗ＣＤ３抗体を結合させた４８穴細胞培養プレートに２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、同様の方法で再度１４日間培養をおこなった。１４日ごとにこのステップを繰り返すことで合計４２日間培養を続け、細胞数を計測して折れ線グラフを作成した。結果を図４に示す。

　ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－３３及びＴＧＦ－β１を含む培地で拡大培養して得られた細胞集団はコントロール条件で拡大培養して得られた細胞集団より強い増殖力を示した。２ロットのＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３導入ｉＰＳ細胞を用いて検討し、細胞増殖の傾向にバッチ間で差は見られないことが判明した。コントロール条件で拡大培養した群は十分に増殖せず、細胞数が少ないことにより、正確な細胞数が測定できなかったため、４２日より前に検討を打ち切った。

　［実施例５］拡大培養におけるＴｒｅｇのタンパク質の発現量の検討
　実施例４で拡大培養をした細胞集団を用いて、Ｔｒｅｇに発現するタンパク質の発現量を検討した。

　具体的には実施例４で拡大培養をした８日目及び３０日目の各細胞集団を用いて、以下の抗体セットを用いて染色し、フローサイトメトリーによって解析した；
Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ，ＢＶ５１０　ＣＤ３，ＢＶ４２１　ＣＤ４、ＰＥ／Ｃｙ７　ＣＤ８β，ＡＰＣ　ＣＤ２５，ＦＩＴＣ　ＦＯＸＰ３，ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５　ＣＴＬＡ４，ＰＥ　Ｈｅｌｉｏｓ。
結果を図５に示す。

　ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－３３及びＴＧＦ－β１を添加して培養した群では、Ｄａｙ８においてコントロール条件と比べてＴｒｅｇの割合が増加していた（コントロール群で２７．５～２８．９％、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－３３及びＴＧＦ－β１を添加して培養した群は７８．３～８２．４％）。また、２ロットのＣＮＳ－Ｆｏｘｐ３導入ｉＰＳ細胞よりそれぞれ分化させた細胞を用いて検討し、拡大培養した細胞のＴｒｅｇのタンパク質の発現量においてもその傾向に差が見られないことが判明した。

　［実施例６］Ｔｒｅｇの抑制性機能の評価
　実施例４で拡大培養をした細胞集団を用いて、ヒトＰＢＭＣ由来の他家Ｔ細胞と共培養後のフローサイトメトリーによる分析を行った。

　具体的にはＴｒｅｇとは別ドナー由来の抗ＣＤ３抗体未処置又は処置したＴ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色したものをターゲット細胞として用い、Ｔｒｅｇと共培養した。培地には終濃度でＦＢＳ（１５％，Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、インスリン－トランスフェリン－セレン　サプリメント（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びアスコルビン酸２－リン酸（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、５日間培養した。各細胞集団は以下の抗体セットを用いて染色した（Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ，ＰＥ／Ｃｙ７　ＣＤ３，ＦＩＴＣ　ＨＬＡ－Ａ２４）。結果を図６に示す。

　ｉＰＳ－Ｔｒｅｇと共培養した群では、Ｔｒｅｇの細胞数依存的にターゲット細胞の細胞***が強く抑制された。その抑制性機能は、バッチ間で同程度であった。これらの結果より、Ｔｒｅｇの抑制性機能を保てたまま、十分にＴｒｅｇを増殖させることができたことが確認された。

　［実施例７］ｉＰＳ－Ｔｒｅｇの拡大培養
　上記実施例１で得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を、抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を結合させた４８穴細胞培養プレートに２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃、５．０％ＣＯ_２条件下で３日間培養した後、２４穴Ｇ－Ｒｅｘ細胞培養プレートに播き直して培養を続けた。培地には終濃度でＦＢＳ（１５％，Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、インスリン－トランスフェリン－セレン　サプリメント（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸２－リン酸（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、抗ＴＮＦＲ２抗体（３μｇ／ｍＬ，Ｈｙｃｕｌｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＩＬ－３（６０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－４（３０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－３３（３０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＴＧＦ－β１（５ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含んだα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。最初の３日間は抗ＣＤ２８抗体（１．５μｇ／ｍＬ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３０抗体（３００ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を上記の組成に対してさらに添加した。培養は培養開始３日目と、それ以降は２－３日に一回の頻度で培地交換しながら１４日間培養した。このステップを４回繰り返した。

　得られた細胞集団をさらに抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を結合させた４８穴細胞培養プレートに２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃、５．０％ＣＯ_２条件下で３日間培養した後、２４穴Ｇ－Ｒｅｘ細胞培養プレートに播き直して培養を続けた。培地には終濃度でＦＢＳ（１５％，Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、インスリン－トランスフェリン－セレン　サプリメント（１／１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸２－リン酸（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ラパマイシン（１０ｎＭ，ｍｅｒｃｋ　ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＴＮＦＲ２抗体（３μｇ／ｍＬ，Ｈｙｃｕｌｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＩＬ－３（６０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－４（３０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－３３（３０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＴＧＦ－β１（５ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含んだα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、さらにＣＤＫ８／１９阻害剤（ＡＳ２８６３６１９，ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、又は５．０μｇ／ｍＬ添加した。最初の３日間は抗ＣＤ２８抗体（１．５μｇ／ｍＬ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３０抗体（３００ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を上記の組成に対してさらに添加した。培養は培養開始３日目と、それ以降は２－３日に一回の頻度で培地交換しながら１７日間培養し、細胞数を計測して折れ線グラフを作成した。結果を図７に示す。

　ＣＤＫ８／１９阻害剤を添加した群ではＣＤＫ８／１９阻害剤の濃度依存的に細胞増殖が亢進する結果を得た（拡大培養１７日目においてＣＤＫ８／１９阻害剤を５．０μｇ／ｍＬ添加したものは拡大培養前に比べて５８倍増殖したのに対し、非添加群では２．７倍増殖した）。

　［実施例８］拡大培養におけるＴｒｅｇのタンパク質の発現量の検討
　実施例７で拡大培養をした細胞集団を用いて、Ｔｒｅｇに発現するタンパク質の発現量を検討した。
具体的には実施例７で拡大培養した１７日目の各細胞集団を用いて、以下の抗体セットを用いて染色し、フローサイトメトリーによって解析した；
Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ，ＢＶ５１０　ＣＤ３，ＢＶ４２１　ＣＤ４、ＰＥ／Ｃｙ７　ＣＤ８β，ＡＰＣ　ＣＤ２５，ＦＩＴＣ　ＦＯＸＰ３，ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５　ＣＴＬＡ４。
結果を図８に示す。

　実施例７で拡大培養を行って得られた細胞集団はＣＤＫ８／１９阻害剤の濃度依存的にＴｒｅｇの割合の増加がみられた。この際のＴｒｅｇの割合はＣＤＫ８／１９阻害剤の濃度が０．１５μｇ／ｍＬのときにプラトーに達し、これ以上濃度を高くしてもＴｒｅｇの割合が増加することはほとんど見られなかった。ＣＴＬＡ４陽性率についても、ＣＤＫ８／１９阻害剤を添加した細胞ではコントロールに比べて高くなる傾向が見られた。

　本出願は、日本で２０２２年９月２６日に出願された特願２０２２－１５２６０６号を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。

Claims

　制御性Ｔ細胞が増殖した細胞集団の製造方法であって、
（１）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む方法。
　前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
　前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト及びＩＬ－３３の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
　前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３及びＩＬ－３３の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
　前記工程（１）を、
更にＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種以上の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
　前記工程（１）を、
更にＩＬ－2、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下で行う、請求項５に記載の方法。
　前記工程（１）を、
ＩＬ－４、ＴＧＦ－βＲアゴニスト、ＩＬ－３、ＩＬ－３３、ＩＬ－２、ＴＮＦＲ２アゴニスト及びｍＴＯＲ阻害剤の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
　前記工程（１）を、
更にＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
　前記ＴＧＦ－βＲアゴニストが、ＴＧＦ－βである、請求項１に記載の方法。
　前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンである、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
　前記ＴＮＦＲ２アゴニストが、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体である、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
　前記ＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９阻害剤が、４－［１－（２－メチル－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル］－１，２，５－オキサジアゾール－３－アミン、３－｛１－［１－（４－メトキシフェニル）ピペリジン－４－イル］－４－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル｝ピラジン－２－アミン、並びにＣＤＫ８及び／又はＣＤＫ１９のｓｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の方法。
　前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞である、請求項１に記載の方法。
　前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、ＣＤ２５^＋／ＦＯＸＰ３^＋細胞及びＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞である、請求項１に記載の方法。
　前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、
（ａ）ＦＯＸＰ３遺伝子のＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＮＳ）１、ＣＮＳ２、及びＣＮＳ３；
（ｂ）プロモーター；及び
（ｃ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸
を含む発現構築物が導入された細胞である、請求項１に記載の方法。
　前記工程（１）の前に、
（２）多能性幹細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む細胞集団に分化誘導する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
　前記工程（２）の前に、
（３）（ａ）ＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ１、ＣＮＳ２、及びＣＮＳ３；
　　　（ｂ）プロモーター；及び
　　　（ｃ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸
を含む発現構築物を多能性幹細胞に導入する工程を更に含む、請求項１６に記載の方法。
　制御性Ｔ細胞の増殖方法であって、
（１Ａ）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む方法。
　制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
（１Ｂ）ＩＬ－４及びＴＧＦ－βＲアゴニストの存在下で多能性幹細胞由来のＣＤ４^＋／ＣＤ２５^－／ＦＯＸＰ３^－Ｔ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む方法。
　前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項１、１８又は１９に記載の方法。
　請求項１、１８又は１９に記載の方法により得られた、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団。
　請求項２１に記載の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を含有してなる、医薬。
　免疫反応の異常な亢進の予防及び／又は治療に用いるための、請求項２２に記載の医薬。
　請求項２１に記載の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含む、免疫反応の異常な亢進の予防及び／又は治療方法。
　免疫反応の異常な亢進の予防及び／又は治療において使用するための、請求項２１に記載の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団。
　免疫反応の異常な亢進の予防及び／又は治療するための医薬の製造における、請求項２１に記載の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の使用。