JP2023547167A - コロナウイルススパイクタンパク質に特異的な抗体及びその用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、コロナウイルススパイク（spike, S）タンパク質に特異的な抗体及びその用途に関する。

Description

本発明は、コロナウイルススパイク（spike, S）タンパク質に特異的な抗体及びその用途に関する。
コロナウイルス（coronavirus）は、１９３７年にニワトリで初めて発見され、その後イヌ、ブタ、鳥類などの動物を経て、１９６５年にはヒトでも発見された。皆既日食の際に太陽の光球が月に隠れるとその周囲で白く光る現象であるコロナ現象と様相が似ているためこの名称が付けられた。
コロナウイルスは、ヒトや動物で主に肺炎や腸炎を引き起こすことが知られており、時には神経系感染や肝炎を引き起こすことも知られている。コロナウイルスは、コロナウイルス科（Coronaviridae）に属し、球形の外膜を有する、約１００～１２０ｎｍの大きさのｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｎｓｅ ＲＮＡウイルスである。コロナウイルスは、最も外殻にあるｓｐｉｋｅタンパク質（Ｓ）、ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－ｅｓｔｅｒａｓｅ（ＨＥ）タンパク質、ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍ）タンパク質、ｓｍａｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｅ）タンパク質、ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｎ）タンパク質などの計５つの構造タンパク質からなる。これらのうち、ｓｐｉｋｅタンパク質は、細胞受容体に結合するリガンドの役割を果たし、宿主細胞とウイルスの融合を誘導するタンパク質であり、最も変異の激しいタンパク質として知られている。
現在までコロナウイルスは、ヒトにはほとんど感染せず、主にイヌ、ブタ、ウシなどの動物に感染する病原菌であると認識されていた。ヒトに感染しても、呼吸器症状を引き起こす多くのウイルスの一つであり、単なる風邪を引き起こしたり、子供に危険性がそれほど高くない下痢などの腸疾患を引き起こすだけであった。しかし、世界的に数百人を超える死亡者と数千余名の患者が発生した重症急性呼吸器症候群（サーズ；SARS）の原因菌、中東呼吸器症候群（マーズ；MERS）及び新型コロナウイルス感染症（coronavirus disease 2019; COVID-19）の原因菌が新種（変種）のコロナウイルスであることが知られるにつれ、次第に注目されるようになった。
ＣＯＶＩＤ－１９は、２０１９年末に中国の湖北省の省都である武漢で初めて確認され、全世界に拡散、進行してパンデミックを招いた疾患であり、サーズコロナウイルス２により引き起こされる感染性疾患である。２０２０年５月７日の時点で３．７５百万ケース以上が１８７カ国で報告されており、死亡者は２６３千人に達し、１．２４百万人が回復した。普遍的な症状は、発熱（fever）、咳（cough）、疲労（fatigue）、呼吸困難（shortness of breath）及び嗅覚及び味覚の喪失である。ほとんどの場合は症状が軽微であるが、ウイルス性肺炎（viral pneumonia）、多臓器不全（multi-organ failure）及びサイトカインストーム（cyrokine storm）に進行することもある。症状の発現から発症までの期間は、一般に約５日であり、２～１４日の間である。ウイルスは、主に密接接触中、時には咳、くしゃみ及び会話中に発生する飛沫により、ヒトの間で伝播する。症状が発現して最初の３日間が最も伝染性が高く、症状が発現する前や疾患の末期にも伝播することがある。これを診断する標準方法としては、鼻咽頭スワブ（nasopharyngeal swab）からのリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（real-time reverse transcription polymerase chain reaction; rRT-PCR）を用いる。
サーズコロナウイルス２は、ベータコロナウイルス（Beta coronavirus）属に属する変種のコロナウイルスとして知られており、様々なコロナウイルスの一次的な保有宿主であるコウモリ由来のものと考えられているが（非特許文献１）、その正確な感染経路についてはいまだ完全には解明されていない。
一方、これまでに開発された抗ウイルス剤は、激しい副作用があるので、その応用において多くの注意を要する。これらの治療剤は、効果的でなく、副作用も報告されている。また、いまだサーズコロナウイルス２の発生を予防し、治療することができ、感染抑制効果に優れ、毒性の少ない新規なコロナウイルス治療剤はなく、開発の必要性が高まっている。
Antiviral Res., 101:45-56 Lai and Homes, 2001. Fields Virology Cascella, M., Rajnik, M., Cuomo, A., Dulebohn, S. C., & Di Napoli, R. (2020). Features, Evaluation and Treatment Coronavirus (COVID-19). In StatPearls. Treasure Island (FL) Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495
本発明者らは、新規なサーズコロナウイルス２治療剤を開発すべく努力した結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＲｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ（ＲＢＤ）に特異的な新規抗体がコロナウイルス、とりわけＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する治療効果を有することを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明は、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を製造する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を含むコロナウイルス感染診断用組成物、それを含むキットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を用いて、生物学的試料に存在するコロナウイルスを検出するステップを含む、コロナウイルス感染診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む、コロナウイルス予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を用いてコロナウイルスを治療する方法を提供することを目的とする。
本発明の抗体は、コロナウイルス検出及び診断に有用であるだけでなく、コロナウイルスの中和能を有するので、コロナウイルス感染疾患の予防及び治療にも有用である。
抗原を精製してその産物の大きさ及び純度をＳＤＳ ＰＡＧＥにより確認した図である。 Ｌｉｂｒａｒｙスクリーニングにより確保したａｎｔｉ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ａｎｔｉｂｏｄｙの発現及び精製後のＳＤＳ ＰＡＧＥにより産物の大きさ及び純度を確認した図である。具体的には、Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｅｄ ＰＡＧＥにより抗体全体の大きさ（～１５０ｋＤａ）を確認し、Ｒｅｄｕｃｅｄ ＰＡＧＥにより抗体の重鎖（～５０ｋＤａ）、軽鎖（～２５ｋＤａ）の大きさを確認した。 抗原特異的な抗ＣＯＶＩＤ－１９抗体を選択するためにｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。これにより、抗原に特異的結合を示す抗体を選択した。 選択したＡｎｔｉ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体が他のＢｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳ（Ｓ１Ｓ２） ｐｒｏｔｅｉｎにもｂｉｎｄｉｎｇするか否かを実験した結果を示す図である。 ＨｕｍａｎｉｚｅｄクローンのＩｇＧ発現及び精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した結果を示す図である。具体的には、Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｅｄ ＰＡＧＥにより抗体全体の大きさ（～１５０ｋＤａ）を確認し、Ｒｅｄｕｃｅｄ ＰＡＧＥにより抗体の重鎖（～５０ｋＤａ）、軽鎖（～２５ｋＤａ）の大きさを確認した。 抗原特異的な抗ＣＯＶＩＤ－１９ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体を選択するためにｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。具体的には、ｈｕｍａｎｉｚｅｄクローンの全てにおいて従来と同じ結合力を維持することが確認された。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異抗原に対するｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体の結合力を比較した結果を示す図である。具体的には、Ｍ４－４、Ｍ５－４の２つのクローンの両方において突然変異抗原に対してｗｉｌｄ ｔｙｐｅレベル以上の結合力を維持することが確認された。 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する抗体の結合特性のうち、動力学の結果を示す図である。具体的には、ｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体であるＭ４－４において従来の抗体であるＭ４の１０倍以上の高い解離定数値が測定された。 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する抗体の結合特性のうち、Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ突然変異に対する結合力を評価した結果を示す図である。具体的には、Ｍ４－４において全ての突然変異に非常に強い結合力を示すことが確認された。 ＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞のＡＣＥ２発現をフローサイトメーターで観察した結果を示す図である。 候補抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ中和能をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓとＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞を用いて測定した結果を示す図である。 ＨＴ１０８０－Ｓ細胞のＳｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ発現をフローサイトメーターで観察した結果を示す図である。 候補抗体のＡＤＣＣ効果をＡＤＣＣ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌとＨＴ１０８０－Ｓ細胞を用いて測定した結果を示す図である。 候補抗体のＡＤＣＰ効果をＦｃγＲＩＩａ－Ｈ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌとＨＴ１０８０－Ｓ細胞を用いて測定した結果を示す図である。 ａｕｔｈｅｎｔｉｃ、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ抗原、ａｌｐｈａ、ｂｅｔａ、ｇａｍｍａ突然変異抗原に対する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の中和活性を示す図である。具体的には、全ての場合のＭ４－４抗体において比較抗体と同等以上の中和効果が観察された。 Ｍ４－４抗体のエピトープビニングの結果を示す図である。具体的には、Ｍ４－４においてＲＥＧＮ１０９８７、Ｓ３０９、ＡＣＥ２受容体と１００％競合する広いエピトープに結合することが類推される結果である。 Ｍ４－４抗体のエピトープをｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｃｋｉｎｇで予測した結果を示す図である。具体的には、エピトープ予測データに一致することが確認された。
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。さらに、本明細書全体にわたって多くの論文及び特許文献が参照されており、その引用が示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれており、それにより本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
本発明の一態様は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本発明における「コロナウイルス」とは、コロナウイルス科（Coronaviridae）に属し、球形の外膜を有する、約８０～２２０ｎｍの大きさの一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス（positive-sense single-stranded RNA virus, ssRNA）を意味する。コロナウイルスは、最も外殻にあるスパイク（Ｓ）タンパク質、ヘマグルチニンエステラーゼ（hemagglutinin-esterase, HE）タンパク質、メンブレン（membrane, M）タンパク質、エンベロープ（envelope, E）タンパク質、ヌクレオカプシド（nucleocapsid, NP）タンパク質などの５つの構造タンパク質を含むことが知られている（非特許文献２）。
一実施例として、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＭＥＲＳ－ＣｏＶであり、具体的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であるが、これらに限定されるものではない。前記コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）タンパク質の一部ドメインが切断された形態であるスパイク１（spike1, S1)タンパク質であるが、本発明の抗体又はその抗原結合断片が特異的に結合するコロナウイルスであればいかなるものでもよい。
本発明における「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（サーズコロナウイルス２）」とは、呼吸器疾患である新型コロナウイルス感染症（COVID-19）を引き起こすウイルスである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、分類学的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ系統（strain）であり、動物由来感染症の起源（zoonotic origins）を有し、コウモリコロナウイルスに近い遺伝的類似性を有するものとみなされる。前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、主にヒト間の密接な接触により及び／又は咳やくしゃみの際に発生する飛沫により伝播し、主にウイルスの外殻のスパイク（Ｓ）タンパク質がヒト細胞表面に存在する受容体であるアンジオテンシン変換酵素２（angiotensin converting enzyme 2, ACE2）に結合してヒト細胞に侵入することが知られている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（RNA-dependent RNA polymerase）、スパイク（Ｓ）、メンブレン（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）及びヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質並びに／又は前記タンパク質をコードする遺伝子を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質のうち、スパイク（Ｓ）タンパク質は、ウイルス粒子表面に存在し、宿主細胞侵入に関与し、Ｓ１とＳ２に分けられる。Ｓ１タンパク質は、宿主細胞の受容体と相互作用するが、Ｓ１タンパク質中に存在する受容体結合ドメイン（receptor-binding domain, RBD）は、宿主細胞表面に存在するＡＣＥ２受容体に結合する核心部分として知られている。Ｓ２タンパク質は、宿主細胞細胞膜との融合に関与する。上記構造に関する内容は、非特許文献３に詳細に記載されている。
具体的には、本発明において提供する抗体又はその抗原結合断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）タンパク質の一部ドメインが切断された形態であるスパイク１（Ｓ１）タンパク質に特異的に結合するものであってもよい。具体的には、前記コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体は、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であってもよい。
例えば、本発明において提供する抗体又はその抗原結合断片が認識する抗原決定基（エピトープ，epitope）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク１（Ｓ１）タンパク質に存在する結合ドメイン（ＣＤ）の一部であってもよい。
本発明における「抗体」とは、免疫学的に特定の抗原に反応性を有する免疫グロブリン分子を含み、抗原を特異的に認識するリガンドの役割を果たすタンパク質分子を意味し、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、全（whole）抗体及び抗体断片が全て含まれる。また、上記用語には、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、二価（bivalent）又は二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ジアボディ、トリボディ及びテトラボディが含まれる。上記用語には、ＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）に対する結合機能を有する単鎖抗体、ｓｃＡｂ、抗体定常領域の誘導体、及びタンパク質スキャフォールドに基づく人工抗体がさらに含まれる。全抗体とは、２つの全長の軽鎖（light chain, LC）及び２つの全長の重鎖（heavy chain, HC）を有する構造であり、各軽鎖が重鎖にジスルフィド結合により連結されている。前記全抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧが含まれ、ＩｇＧには、サブタイプ（subtype）として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれる。一実施形態として、本発明において提供する抗体は、ＩｇＧ抗体であってもよい。
前記「断片」、「ポリペプチドの結合断片」及び「抗体断片」とは、抗体の抗原結合活性を有する本発明の抗体の任意の断片を意味し、互換的に用いられる。抗体断片の例としては、単鎖抗体、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ又はｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記Ｆｄとは、Ｆａｂ断片に含まれる重鎖部分を意味する。前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域（variable region）、軽鎖の定常領域（framework region, FR）、及び重鎖の第１定常領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であり、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基を含むヒンジ領域（hinge region）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合して生成される。Ｆｖ（variable fragment）とは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有する最小の抗体断片を意味する。ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合により重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合により連結されている。このような抗体断片は、プロテアーゼを用いることにより得られ（例えば、抗体全体をパパインで制限切断するとＦａｂが得られ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片が得られる）、例えば遺伝子組換え技術により作製することができる。
本発明における「抗原決定基」とは、「エピトープ（epitope）」ともいい、抗体又は抗体断片が抗原に特異的に結合する抗原の領域又は部位を意味する。
また、前記抗体又はその抗原結合断片は、カシリビマブ（casirivimab, REGN10933）、イムデビマブ（imdevimab, REGN10987）及び／又はＳ３０９が結合するコロナウイルススパイクに由来するエピトープに競合的に結合するものであるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態として、本発明において提供する抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に同じ抗体集団から得られた単一分子組成の抗体分子を意味し、このモノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和性を示す。
典型的には、免疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を有し、それぞれの重鎖及び軽鎖は定常領域と、可変領域（これらの部位はドメインとしても知られている）とを含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（complementarity-determining region, 以下「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３つの超可変領域と、４つのフレームワーク領域（framework region）とを含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（epitope）に結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にはＮ末端から順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３といい、また、特定のＣＤＲが位置する鎖により識別される。
一般に、免疫グロブリンは重鎖（heavy chain）及び軽鎖（light chain）を有し、それぞれの重鎖及び軽鎖は定常領域（constant region）と、可変領域（variable region）とを含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域と呼ばれる３つの超可変領域（complementarity-determining region, 以下「ＣＤＲ」という）と、４つのフレームワーク領域（framework region, 以下「ＦＲ」という）とを含む。各鎖のＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（epitope）に結合する役割を果たし、典型的には、Ｎ末端から順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３という。また、各鎖のＦＲは、Ｎ末端から順にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４という。
本発明において、重鎖の可変領域を「ＶＨ」といい、軽鎖の可変領域を「ＶＬ」といい、重鎖のＣＤＲをそれぞれ「ＶＨ－ＣＤＲ１」、「ＶＨ－ＣＤＲ２」、「ＶＨ－ＣＤＲ３」といい、軽鎖のＣＤＲをそれぞれ「ＶＬ－ＣＤＲ１」、「ＶＬ－ＣＤＲ２」、「ＶＬ－ＣＤＲ３」といい、重鎖のＦＲをそれぞれ「ＶＨ－ＦＲ１」、「ＶＨ－ＦＲ２」、「ＶＨ－ＦＲ３」、「ＶＨ－ＦＲ４」といい、軽鎖のＦＲを「ＶＬ－ＦＲ１」、「ＶＬ－ＦＲ２」、「ＶＬ－ＦＲ３」、「ＶＬ－ＦＲ４」という。
一実施形態として、本発明のコロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５～４５、配列番号８７～９１、配列番号９７～１１５のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖可変領域と、配列番号４６～８６、配列番号９２～９６及び配列番号１１６～１３１のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含むものであってもよい。具体的には、配列番号５の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域、配列番号６の重鎖可変領域及び配列番号４７の軽鎖可変領域、配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号４８の軽鎖可変領域、配列番号８の重鎖可変領域及び配列番号４９の軽鎖可変領域、配列番号９の重鎖可変領域及び配列番号５０の軽鎖可変領域、配列番号１０の重鎖可変領域及び配列番号５１の軽鎖可変領域、配列番号１１の重鎖可変領域及び配列番号５２の軽鎖可変領域、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号５３の軽鎖可変領域、配列番号１３の重鎖可変領域及び配列番号５４の軽鎖可変領域、配列番号１４の重鎖可変領域及び配列番号５５の軽鎖可変領域、配列番号１５の重鎖可変領域及び配列番号５６の軽鎖可変領域、配列番号１６の重鎖可変領域及び配列番号５７の軽鎖可変領域、配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号５８の軽鎖可変領域、配列番号１８の重鎖可変領域及び配列番号５９の軽鎖可変領域、配列番号１９の重鎖可変領域及び配列番号６０の軽鎖可変領域、配列番号２０の重鎖可変領域及び配列番号６１の軽鎖可変領域、配列番号２１の重鎖可変領域及び配列番号６２の軽鎖可変領域、配列番号２２の重鎖可変領域及び配列番号６３の軽鎖可変領域、配列番号２３の重鎖可変領域及び配列番号６４の軽鎖可変領域、配列番号２４の重鎖可変領域及び配列番号６５の軽鎖可変領域、配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号６６の軽鎖可変領域、配列番号２６の重鎖可変領域及び配列番号６７の軽鎖可変領域、配列番号２７の重鎖可変領域及び配列番号６８の軽鎖可変領域、配列番号２８の重鎖可変領域及び配列番号６９の軽鎖可変領域、配列番号２９の重鎖可変領域及び配列番号７０の軽鎖可変領域、配列番号３０の重鎖可変領域及び配列番号７１の軽鎖可変領域、配列番号３１の重鎖可変領域及び配列番号７２の軽鎖可変領域、配列番号３２の重鎖可変領域及び配列番号７３の軽鎖可変領域、配列番号３３の重鎖可変領域及び配列番号７４の軽鎖可変領域、配列番号３４の重鎖可変領域及び配列番号７５の軽鎖可変領域、配列番号３５の重鎖可変領域及び配列番号７６の軽鎖可変領域、配列番号３６の重鎖可変領域及び配列番号７７の軽鎖可変領域、配列番号３７の重鎖可変領域及び配列番号７８の軽鎖可変領域、配列番号３８の重鎖可変領域及び配列番号７９の軽鎖可変領域、配列番号３９の重鎖可変領域及び配列番号８０の軽鎖可変領域、配列番号４０の重鎖可変領域及び配列番号８１の軽鎖可変領域、配列番号４１の重鎖可変領域及び配列番号８２の軽鎖可変領域、配列番号４２の重鎖可変領域及び配列番号８３の軽鎖可変領域、配列番号４３の重鎖可変領域及び配列番号８４の軽鎖可変領域、配列番号４４の重鎖可変領域及び配列番号８５の軽鎖可変領域、配列番号４５の重鎖可変領域及び配列番号８６の軽鎖可変領域、配列番号８７の重鎖可変領域及び配列番号９２の軽鎖可変領域、配列番号８８の重鎖可変領域及び配列番号９３の軽鎖可変領域、配列番号８９の重鎖可変領域及び配列番号９４の軽鎖可変領域、配列番号９０の重鎖可変領域及び配列番号９５の軽鎖可変領域、配列番号９１の重鎖可変領域及び配列番号９６の軽鎖可変領域、配列番号１００の重鎖可変領域及び配列番号１１６の軽鎖可変領域、配列番号１０１の重鎖可変領域及び配列番号１１７の軽鎖可変領域、配列番号１０２の重鎖可変領域及び配列番号１１８の軽鎖可変領域、配列番号１０３の重鎖可変領域及び配列番号１１９の軽鎖可変領域、配列番号１０４の重鎖可変領域及び配列番号１２０の軽鎖可変領域、配列番号１０５の重鎖可変領域及び配列番号１２１の軽鎖可変領域、配列番号１０６の重鎖可変領域及び配列番号１２２の軽鎖可変領域、配列番号１０７の重鎖可変領域及び配列番号１２３の軽鎖可変領域、配列番号１０８の重鎖可変領域及び配列番号１２４の軽鎖可変領域、配列番号１０９の重鎖可変領域及び配列番号１２５の軽鎖可変領域、配列番号１１０の重鎖可変領域及び配列番号１２６の軽鎖可変領域、配列番号１１１の重鎖可変領域及び配列番号１２７の軽鎖可変領域、配列番号１１２の重鎖可変領域及び配列番号１２８の軽鎖可変領域、配列番号１１３の重鎖可変領域及び配列番号１２９の軽鎖可変領域、配列番号１１４の重鎖可変領域及び配列番号１３０の軽鎖可変領域、配列番号１１５の重鎖可変領域及び配列番号１３１の軽鎖可変領域のいずれかを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の目的上、前記抗体又はその抗原結合断片は、２種以上のコロナウイルスに交差反応を有するものであってもよい。前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＭＥＲＳ－ＣｏＶであるが、交差反応を有するものであればこれらに限定されるものではない。
例えば、前記２種以上のコロナウイルスに交差反応を有する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６～１２、配列番号１４～２２、配列番号２４、２５、３２、３７、４５、配列番号８７～９１及び配列番号９７～９９のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖可変領域と、配列番号４７～５３、配列番号５５～６３、配列番号６５、６６、７３、７８、８６及び配列番号９２～９６のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含むものであるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、配列番号６の重鎖可変領域及び配列番号４７の軽鎖可変領域、配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号４８の軽鎖可変領域、配列番号８の重鎖可変領域及び配列番号４９の軽鎖可変領域、配列番号９の重鎖可変領域及び配列番号５０の軽鎖可変領域、配列番号１０の重鎖可変領域及び配列番号５１の軽鎖可変領域、配列番号１１の重鎖可変領域及び配列番号５２の軽鎖可変領域、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号５３の軽鎖可変領域、配列番号１４の重鎖可変領域及び配列番号５５の軽鎖可変領域、配列番号１５の重鎖可変領域及び配列番号５６の軽鎖可変領域、配列番号１６の重鎖可変領域及び配列番号５７の軽鎖可変領域、配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号５８の軽鎖可変領域、配列番号１８の重鎖可変領域及び配列番号５９の軽鎖可変領域、配列番号１９の重鎖可変領域及び配列番号６０の軽鎖可変領域、配列番号２０の重鎖可変領域及び配列番号６１の軽鎖可変領域、配列番号２１の重鎖可変領域及び配列番号６２の軽鎖可変領域、配列番号２２の重鎖可変領域及び配列番号６３の軽鎖可変領域、配列番号２４の重鎖可変領域及び配列番号６５の軽鎖可変領域、配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号６６の軽鎖可変領域、配列番号３２の重鎖可変領域及び配列番号７３の軽鎖可変領域、配列番号３７の重鎖可変領域及び配列番号７８の軽鎖可変領域、配列番号４５の重鎖可変領域及び配列番号８６の軽鎖可変領域、配列番号８７の重鎖可変領域及び配列番号９２の軽鎖可変領域、配列番号８８の重鎖可変領域及び配列番号９３の軽鎖可変領域、配列番号８９の重鎖可変領域及び配列番号９４の軽鎖可変領域、配列番号９０の重鎖可変領域及び配列番号９５の軽鎖可変領域、配列番号９１の重鎖可変領域及び配列番号９６の軽鎖可変領域のいずれかを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明における「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンに由来する分子であって、相補性決定領域と、フレームワーク領域とを含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列がヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列から構成されるものを意味する。ヒト抗体は、通常、ヒトの疾病の治療に用いられるが、これは少なくとも３つの潜在的な利点を有する。第一に、これはヒト免疫系とより良好に相互作用し、例えば補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity, CDC）又は抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）により標的細胞をより効率的に破壊することができる。第二に、ヒト免疫系が前記抗体を外来のものと認識しないという利点がある。第三に、より少ない量、より少ない頻度の薬物を投与した場合でも、ヒト循環系における半減期が天然発生抗体に類似するという利点がある。よって、本発明によるヒト抗体は、コロナウイルス、とりわけＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する予防又は治療効果を有するので、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療に有用である。
本発明のヒトモノクローナル抗体が定常領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）による定常領域であってもよい。
本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリン定常領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの定常領域からなる群から選択される少なくとも２つの定常領域から二量体又は多量体を形成することができる。
本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖免疫グロブリン重鎖定常領域内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリン重鎖定常領域に相当する配列が存在することを意味し、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ～４つのドメインのハイブリッドが可能である。
また、本発明において、抗体又はその抗原結合断片は、可変領域及び定常領域の由来が同じものであってもよく、異なるものであってもよく、ＣＤＲ、それを除く可変領域及び定常領域の由来が同じものであってもよく、異なるものであってもよい。
例えば、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４２又は１４８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４３又は１４６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４４又は１４７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むが、これらに限定されるものではない。
具体的には、配列番号１３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、又は配列番号１３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むが、これらに限定されるものではない。
また、本発明において、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１０３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号１１９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施形態においては、配列番号１０３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号１１９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む抗体を「Ｍ４－４」又は「ＭＧ１１４１Ａ」と命名した。
また、本発明の抗体は、配列番号１４８、１５２又は１５５の重鎖ＦＲ（Framework region）１、配列番号１４９又は１５６の重鎖ＦＲ２、配列番号１５０、１５３又は１５７の重鎖ＦＲ３、及び配列番号１５１、１５４又は１５８の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域と、配列番号１５９、１６３又は１６６の軽鎖ＦＲ１、配列番号１６０又は１６７の軽鎖ＦＲ２、配列番号１６１、１６４又は１６８の軽鎖ＦＲ３、及び配列番号１６２、１６５又は１６９の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域とを含むが、これらに限定されるものではない。
具体的には、配列番号１４８の重鎖ＦＲ（Framework region）１、配列番号１４９の重鎖ＦＲ２、配列番号１５０の重鎖ＦＲ３、及び配列番号１５１の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域と、配列番号１５９の軽鎖ＦＲ１、配列番号１６０の軽鎖ＦＲ２、配列番号１６１の軽鎖ＦＲ３、及び配列番号１６２の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域とを含むものであるか、配列番号１５２の重鎖ＦＲ（Framework region）１、配列番号１４９の重鎖ＦＲ２、配列番号１５３の重鎖ＦＲ３、及び配列番号１５４の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域と、配列番号１６３の軽鎖ＦＲ１、配列番号１６０の軽鎖ＦＲ２、配列番号１６４の軽鎖ＦＲ３、及び配列番号１６５の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域とを含むものであるか、又は配列番号１５５の重鎖ＦＲ（Framework region）１、配列番号１５６の重鎖ＦＲ２、配列番号１５７の重鎖ＦＲ３、及び配列番号１５８の重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域と、配列番号１６６の軽鎖ＦＲ１、配列番号１６７の軽鎖ＦＲ２、配列番号１６８の軽鎖ＦＲ３、及び配列番号１６９の軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域とを含むものであるが、これらに限定されるものではない。
本発明の他の態様は、前記新規抗体又はその抗原結合断片を製造する方法を提供する。
本発明の新規抗体又はその抗原結合断片は、公知の抗体製造技術で容易に製造することができる。例えば、免疫した動物から得たＢリンパ球を用いてハイブリドーマを作製することにより行うこともでき（非特許文献４）、ファージディスプレイ（phage display）技術を用いることにより行うこともできるが、これらに限定されるものではない。
ファージディスプレイ技術を用いる抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを作製せず、直ちにＢリンパ球から抗体遺伝子を得てファージ（phage）表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いると、Ｂ細胞不死化（immortalization）によるモノクローナル抗体の産生に関する従来の多くの困難を克服することができる。一般に、ファージディスプレイ技術は、１）ファージのコートタンパク質（coat protein）ｐＩＩＩ（又はｐＩＶ）のＮ末端に相当する遺伝子領域にランダム配列のオリゴヌクレオチド（oligonucleotide）を挿入するステップと、２）天然のコートタンパク質の一部と前記ランダム配列のオリゴヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの融合タンパク質を発現させるステップと、３）前記オリゴヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに結合する受容体物質で処理するステップと、４）受容体に結合したペプチド・ファージ粒子を低いｐＨや結合競合力を有する分子を用いて溶出させるステップと、５）パンニング（panning）により溶出したファージを宿主細胞内で増幅するステップと、６）所望の量を得るために上記方法を繰り返すステップと、７）パンニングにより選択したファージクローンのＤＮＡ配列から活性を有するペプチドの配列を決定するステップとから構成される。
本発明のさらに他の態様は、前記新規抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む形質転換体を提供する。
本発明のさらに他の態様は、本発明において提供する抗体又はその抗原結合断片を含む発現ベクター、及び前記ベクターを導入した宿主細胞を提供する。
前記抗体については前述した通りである。
本発明において提供する前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特にこれらに限定されるものではないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞又はバクテリア細胞（例えば、大腸菌など）が含まれる真核又は原核細胞において、前記ポリヌクレオチドを複製及び／又は発現するベクターであり、具体的には、宿主細胞において前記ヌクレオチドが発現するように適切なプロモーターに作動可能に連結され、少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターである。例えば、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルス、レトロウイルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドを導入した形態が挙げられる。
前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであってもよく、重鎖をコードするポリヌクレオチドと軽鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を含む発現ベクターであってもよい。
本発明において提供する前記発現ベクターを導入した形質転換体は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現ベクターを導入して形質転換した、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞、酵母細胞、ピキア・パストリスなどの菌類細胞、ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞，chinese hamster ovary cells）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（human lymphoblastoid）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウメラノーマ細胞、ＨＴ－１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞，baby hamster kidney cells）、ＨＥＫ（ヒト胎児性腎臓細胞，human embryonic kidney cells）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞、又は植物細胞である。
本発明における「導入」とは、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に組み込む方法を意味する。前記導入は、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラン－媒介トランスフェクション法、ポリブレン－媒介トランスフェクション法、電子衝撃法、微量注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン、原形質体融合法などの当該分野で公知の様々な方法で行うことができる。また、形質導入とは、感染（infection）を手段とし、ウイルス粒子を用いて目的物を細胞内に送達することを意味する。さらに、遺伝子ボンバードメントなどによりベクターを宿主細胞に導入することができる。本発明における導入は、形質転換と混用される。
本発明のさらに他の態様は、本発明において提供する抗体又はその抗原結合断片を含むコロナウイルス感染診断用組成物を提供する。
本発明のさらに他の態様は、本発明において提供する抗体又はその抗原結合断片を含むコロナウイルス感染診断用キットを提供する。
本発明のさらに他の態様は、本発明において提供する抗体若しくはその抗原結合断片、それを含む感染診断用組成物、又は前記組成物を含むキットを用いて、コロナウイルス感染の疑いのある個体から分離した生物学的試料に存在するコロナウイルスを検出するステップを含む、コロナウイルス感染診断方法、又は診断のための情報提供方法を提供する。
本発明における「診断」には、特定の疾病若しくは疾患に対する個体の感受性（susceptibility）を判定すること、個体が特定の疾病若しくは疾患を現在有しているか否かを判定すること、又は治療効果に関する情報を提供するために個体の状態をモニタすることが含まれる。
本発明の目的上、前記診断は、コロナウイルス感染疾患を発症したか否か確認することであってもよい。前記「コロナウイルス感染疾患」とは、宿主となる生物体の体内にコロナウイルスが侵入する感染により発症する疾患を意味する。具体的には、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（サーズコロナウイルス２）であってもよい。例えば、前記コロナウイルス感染疾患は、ＣＯＶＩＤ－１９であってもよい。
本発明のコロナウイルス感染診断用組成物は、本発明の抗体又はその抗原結合断片以外の他の抗体もしくはその抗原結合断片を含んでもよい。また、それ以外に、本発明の抗体又はその抗原結合断片と抗原の結合反応に必要な物質、例えば試薬をさらに含んでもよい。さらに、その結合を検出する上で必要な物質、本発明の抗体又はその抗原結合断片の安定化のための物質などをさらに含んでもよい。
例えば、本発明の診断用組成物に含まれる抗体又はその抗原結合断片は、検出のために標識したものであってもよい。分子標識に用いられる様々な方法が当業者に周知であり、本発明の範囲内である。
本発明に用いられる標識の種類の例としては、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物及び生物発光化合物が挙げられる。通常用いられる標識としては、蛍光物質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなど）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ又は１２５Ｉ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド金属、化学発光又は生物発光化合物（例えば、ジオキセタン、ルミノール又はアクリジニウム）が挙げられる。酵素又はビオチニル基の共有結合法、ヨード化法、リン酸化法、ビオチン化法などの標識方法も周知である。
本発明のキットは、本発明の抗体又はその抗原結合断片と抗原の結合を検出する上で必要な試薬、器具などをさらに含んでもよい。
例えば、本発明のキット容器は、固体担体を含んでもよい。本発明の抗体は、固体担体に付着するが、その固体担体は、多孔性又は非多孔性、平面又は非平面であってもよい。
例えば、前記キットは、固体担体と、分析する検体を収容し、バッファ投入部及び検体投入部を備える検体パッドと、前記検体パッドから流入した検体に含有されるコロナウイルスに特異的に結合する抗体を有するコンジュゲートパッドと、前記検体にコロナウイルスが存在するか否かを検出する信号検出部、及び分析物質の存否に関係なく検体が吸収パッドに移動したか否かを確認する対照部を有する信号検出パッドと、信号検出反応が終了した検体を吸収する吸収パッドとを含むものであるが、これに限定されるものではない。
例えば、本発明のキットは、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）キットの形態であってもよい。本発明における「ＥＬＩＳＡ」は、酵素免疫測定法ともいい、抗体に酵素を結合させて抗原抗体複合体を形成し、その酵素と基質の反応により、吸光度を用いて定量する方法である。前記ＥＬＩＳＡには、固体支持体に付着した抗原を認識する標識した抗体を用いる直接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認識する抗体の複合体において捕獲抗体を認識する標識した２次抗体を用いる間接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認識する標識した他の抗体を用いる直接サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認識する他の抗体と反応させ、その後その抗体を認識する標識した２次抗体を用いる間接サンドイッチＥＬＩＳＡなどが含まれる。
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、生物学的試料に接触させ、その反応を確認することにより、生物学的試料中のコロナウイルスの存否の検出に用いてもよい。
前記生物学的試料は、対象の痰、唾、血液、汗、肺細胞、肺組織の粘液、呼吸器組織及び唾液からなる群から選択されるいずれかであるが、これらに限定されるものではなく、当業者に周知の通常の方法で準備することができる。
例えば、本発明のコロナウイルス感染診断のための情報提供方法は、（ａ）本発明において提供する抗体又はその抗原結合断片を生物学的試料に接触させるステップと、（ｂ）前述したように接触させて形成した、本発明の抗体又はその抗原結合断片とコロナウイルススパイクタンパク質の複合体を検出するステップとを含んでもよい。具体的には、前記（ｂ）ステップにおいて、抗体又はその抗原結合断片とコロナウイルススパイクタンパク質の複合体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合ドメイン（ＣＤ）部位の結合体であってもよい。
本発明における「抗原抗体複合体」とは、試料中の当該タンパク質抗原とそれを認識する抗体の結合物を意味する。前記抗原抗体複合体の検出は、当該技術分野で公知の方法、例えば分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、吸光的、化学的及びその他の方法により検出することができ、具体的には比色法（colormetric method）、電気化学法（electrochemical method）、蛍光法（fluorimetric method）、発光法（luminometry）、粒子計数法（particle counting method）、肉眼測定法（visual assessment）及びシンチレーション計数法（scintillation counting method）からなる群から選択される任意の方法で検出することができ、ウェスタンブロッティング（western blotting）、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定法（radioimmunoassay）、放射免疫拡散法（radioimmunodiffusion）、オクタロニー（ouchterlony）免疫拡散法、ロケット（rocket）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降法（immunoprecipitation assay）、補体結合分析法（complement fixation assay）、蛍光活性化セルソーティング（fluorescence-activated cell sorting, FACS）、プロテインチップ（protein chip）などの方法を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体若しくはその抗原結合断片を含むコロナウイルス感染予防又は治療用薬学的組成物を提供する。具体的には、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であってもよい。例えば、前記組成物は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療のためのものであってもよい。
本発明における「ＣＯＶＩＤ－１９」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染して発生する疾患を意味する。本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和能及び感染抑制能を有するので、ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療に用いることができる。
本発明における「予防」とは、前記組成物の投与によりコロナウイルス感染の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、前記「治療」とは、前記組成物の投与によりコロナウイルス感染による症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。
本発明における「薬学的に許容される担体」とは、生物体を刺激することなく、投与化合物の生物学的活性及び特性を損なわない担体又は希釈剤を意味する。液状溶液として製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌されて生体に適合するものであり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、グルコース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノール及びそれらの成分の少なくとも１つを混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑沢剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。
前記薬学的組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口用固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられ、これらの固形製剤は、少なくとも１つの化合物に少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）又はラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も用いられる。経口用液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる通常の希釈剤である水、流動パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられる。非経口用製剤としては、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が挙げられる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有してもよい。
前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。
本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、癌の種類、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により決定される。本発明の組成物は、単独で又は他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次又は同時に投与してもよい。また、単一又は多重投与してもよい。上記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大限の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定される。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体を用いてコロナウイルス感染を予防又は治療する方法を提供する。
具体的には、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であってもよい。
例えば、前記方法は、前記抗体をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いのある個体に投与するステップを含むものであってもよい。
前記方法は、抗体及び薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物をコロナウイルスに感染した個体に投与するステップを含む方法であってもよく、前記薬学的に許容される担体については前述した通りである。
前記個体には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ヒトなどの哺乳動物、鳥類などが含まれ、本発明の前記組成物の投与によりコロナウイルス感染が治療される個体であればいかなるものでもよい。ここで、前記抗体は、薬学的に有効な量で単一又は多重投与してもよい。ここで、抗体は、液剤、散剤、エアゾール剤、カプセル剤、腸溶コーティング剤、カプセル剤又は坐剤の形態で投与してもよい。投与経路としては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、前記方法は、コロナウイルス感染疾患の予防又は治療、具体的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染疾患の予防又は治療に用いられてもよい。例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療に用いられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体をコロナウイルス感染の予防又は治療のための医薬品の製造に用いる用途を提供する。前記医薬品は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染疾患、例えばＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療に用いられるが、これらに限定されるものではない。前記抗体及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防又は治療については前述した通りである。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
実験例１．組換えタンパク質の発現及び精製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の外部ドメイン（spike-ECD）及びＲＢＤ（RBD-his）をコードする遺伝子を合成し、Ｃ末端に６×ヒスチジンタグを有するｐＣＩＷ哺乳類発現ベクターにクローニングした。ＲＢＤ－Ｆｃ及びヒトＡＣＥ２－Ｆｃをコードする遺伝子をｐＣＩＷベクターにクローニングした。ｐＣＩＷ哺乳動物ベクターをＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（カタログ番号Ａ１４３５１０１）に形質転換した。発現を分析する全てのステップは、メーカーの指針に従って行った。細胞培養５～６日後に、遠心分離により細胞を回収し、上清を０．２２μｍフィルターにかけて細胞破片を除去した。組換えタンパク質のＨｉｓ－ｔａｇ精製のために、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を上清に添加した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（Cat. no. 17-5269-02, GE Healthcare）をＦｃ融合タンパク質のｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ精製用樹脂として用いた。全ての精製過程は、メーカーの指針に従って行った。溶出したタンパク質の緩衝液は、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いてＰＢＳ（phosphate-buffered saline）に交換した。タンパク質濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００Ｃ分光光度計（Thermo Scientific）を用いて定量化した（図１）。
実験例２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｓｐｉｋｅタンパク質に対する抗体の生産
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｓｐｋｉｅタンパク質に対する抗体を生産するために、一般的な抗体生産技術を用いた。具体的には、ヒトＢ細胞由来ライブラリー、マウス免疫ライブラリー、ヒトドメイン抗体合成ライブラリーを構築及びスクリーニングした。スクリーニングには、通常用いられるモノクローナルＥＬＩＳＡ法を用いた。モノクローナルＥＬＩＳＡスクリーニング法は、ｓｐｉｋｅタンパク質にモノクローナルで発現する抗体を混合し、当該抗体がｓｐｉｋｅタンパク質に特異的であるか否かを確認する方法であり、スクリーニングにより、ヒトＢ細胞由来ライブラリーにおいて４１個（クローン１～４１）、マウス免疫ライブラリーにおいて５個（クローンＭ１～Ｍ５）、ヒトドメイン抗体合成ライブラリーにおいて３個（クローン５Ｅ９，６Ｄ９，６Ｈ１０）のｓｐｉｋｅタンパク質に特異的なクローンを確保した。配列分析により確保した抗体の重鎖、軽鎖配列を確認した（図３，表１，表２，表３）。ただし、ヒトドメイン抗体合成ライブラリーから確保したクローンは、合成ライブラリー自体が重鎖配列のみからなるライブラリーであるので、重鎖配列情報のみ含む。
実験例３．抗体の発現及び精製
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｃＦｖは、ｐＣＩＷにサブクローニングしてヒトＩｇＧ１の形式に変換した。Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞は、３０ｍＬのＥｘｐｉ２９３ＴＭ発現培地において２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で準備した（３７℃，８％ＣＯ２，１２５ｒｐｍ，生存率≧９５％）。これらの細胞は３０μｇのＤＮＡ（ｐＣＬＷ－抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２重鎖：１５μｇ，ｐｃＩｗ－抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２軽鎖：１５μｇ）、ＯｐｔｉＰｒｏＴＭ ＳＥＭ培地、及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３試薬から構成されるＤＮＡ混合物で形質転換した。発現したｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔにＰＢＳで洗浄したｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ ０．１ｍＬを入れ、その後４℃で一晩インキュベーションした。精製用ｃｏｌｕｍｎに移し、その後ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでｒｅｓｉｎの２０倍以上洗浄した。Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いて、結合したＩｇＧを溶出させた。２８０ｎｍ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈを用いて濃度を測定し、まとめた（図２）。
Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎで１０００ｇ、２ｍｉｎ間の遠心分離を行い、保存液を濾過した。ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒをｃｏｌｕｍｎの容量に合わせて入れ、その後１０００ｇ、２ｍｉｎ間の遠心分離を行い、ｃｏｌｕｍｎ ｗａｓｈｉｎｇを３回繰り返した。試料を入れ、その後１０００ｇ、２ｍｉｎ間の遠心分離を行い、２８０ｎｍ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈを用いて濃度を再測定した。
実験例４．ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ Ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙの確認
ＩｇＧ１の形態への変換に成功したクローン２９種に対するｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ測定のためのＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅに抗原３μｇ／ｍｌ、５０μｌを４℃でｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｃｏａｔｉｎｇした。抗原としては、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＳＡＲＳ（１－１１９０）（Beta Lifescience, BLIT-0210）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１＋Ｓ２ ＥＣＤ，Ｈｉｓ ｔａｇ）（Sino Biological., 40589-V08B1）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＣＤ，ａａ １－１２９７，Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Sino Biological., 40069-V08B）を用いた。翌日、ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅの抗原を除去し、ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％で３回ｗａｓｈｉｎｇした。抗原をコーティングした各ｗｅｌｌにＰＢＳ＋ＢＳＡ ５％ ２００μｌで常温にて１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。１時間後に、ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％で３回ｗａｓｈｉｎｇした。３５種の抗体濃度を３００ｎＭに希釈して測定した。希釈した抗体５０μｌを各ｗｅｌｌに入れ、常温で１時間ｂｉｎｄｉｎｇした。同様に、ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％で３回ｗａｓｈｉｎｇした。Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ＨＲＰ（３０００：１）５０μｌを各ｗｅｌｌに入れ、常温で１時間ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇした。ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％で３回ｗａｓｈｉｎｇした。ＴＭＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０μｌを各ｗｅｌｌに入れ、１～１５分間ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇした。ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０μｌを各ｗｅｌｌに入れて反応を停止した。ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒで発色の程度を測定した。
選択したＩｇＧのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶに対するｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ実験の結果、少なくとも２つのコロナウイルスにｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙを有するクローンが確認された（表４，図４）。
具体的には、ＥＬＩＳＡを用いたｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔにより、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２８、３３、４１、Ｍ３（２１種）抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１にもｂｉｎｄｉｎｇ（ｃｕｔ－ｏｆｆ Ｏ．Ｄ．０．５以上）することが確認された。また、６Ｈ１０、Ｍ３抗体（２種）は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶにもｂｉｎｄｉｎｇ（ｃｕｔ－ｏｆｆ Ｏ．Ｄ．０．５以上）することが確認された。これらの結果から、ａｎｔｉ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体のうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＭＥＲＳ－ＣｏＶ２にもｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙを示すクローンを選択することができる（図４）。
実験例５．Ｍ４及びＭ５に対するキメラ抗体（chimeric antibodies）の作製
マウス免疫クローンのうち、Ｍ４、Ｍ５クローンに対してＨｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎを行った。Ｍ４、Ｍ５抗体のｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ配列は、ｍｏｕｓｅ ｇｅｒｍｌｉｎｅ配列ＩＧＨＶ５－６及びＩＧＫＶ６－３２配列にそれぞれｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎした。Ｍ４、Ｍ５クローンにおいて、ＨＣＤＲ配列は同一であり、ＬＣＤＲは異なる。Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎのために、一般的な方法であるＣＤＲ－ｇｒａｆｔｉｎｇを用いた。Ｍ４、Ｍ５と最も相同性が高いヒトｆｒａｍｅｗｏｒｋを探索するために、Ｉｇｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈを行った。検索の結果、ＩＧＨＶ３－２１及びＩＧＫＶ１－３９と最も相同性が高いことが確認され、Ｍ４、Ｍ５のＣＤＲをヒト抗体フレームワークＩＧＨＶ３－２１及びＩＧＫＶ１－３９にそれぞれｇｒａｆｔｉｎｇした。Ｇｒａｆｔｉｎｇ後に、ｆｒａｍｅｗｏｒｋの変化による安定性及びａｆｆｉｎｉｔｙの減少を最小限に抑えるべく、抗体構造の安定性とＣＤＲのｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅを決定する上で重要な役割を果たすｃｏｒｅ ｒｅｓｉｄｕｅを確認し、その後さらなる突然変異を導入してｖａｒｉａｎｔをデザインした（表５）。
デザインしたＭ４、Ｍ５抗体の遺伝子配列を合成し、ｉｎｓｅｒｔとして用いた（配列番号１３２番～１３８番）。合成した遺伝子は、ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ法でクローニングし、キメラ抗体の培養及び精製は、前述した通り行った（図５）。
実験例６．Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体のＳｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎに対する結合力の評価
各ｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎに特異的に結合するか否かを確認するために、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅにｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ３μｇ／ｍｌ、各ｗｅｌｌ当たり１００μｌを４℃で一晩コーティングした。翌日、ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅのｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎを除去し、各ｗｅｌｌにＰＢＳ＋ＢＳＡ ２％ ２００μｌで３７℃にて１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％で３回洗浄した。Ｍ４、Ｍ５及びそれぞれのｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体を初期濃度（１００ｎＭ）からＰＢＳで３倍ずつ１１回希釈し、最終濃度を０．５ｐＭに設定した。希釈した抗体溶液１００μｌを各ｗｅｌｌに入れ、３７℃で１時間バインディングした。同様に、ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％で３回洗浄した。ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－Ｆｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（５０００：１）５０μｌを各ｗｅｌｌに入れ、３７℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％で４回洗浄した。ＴＭＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０μｌを各ｗｅｌｌに入れ、５分間インキュベーションした。Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０μｌを各ｗｅｌｌに入れて反応を停止した。Ｓｐｉｋｅタンパク質に対するＨｕｍａｎｉｚｅｄクローンの結合力を評価した結果、ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎを行った後も、全てにおいて従来のＭ４、Ｍ５レベルの結合力を維持することが確認された（図６）。
実験例７．ＲＢＤ及びｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｔａｎｔに対する抗体の結合力の評価
Ｍ４のｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体Ｍ４－４、及びＭ５のｈｕｍａｉｚａｅｄ抗体Ｍ５－４がＲＢＤ、ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎのＷＴだけでなく、各種ｍｕｔａｎｔにも結合するか否かを確認するために、ＥＬＩＳＡを行った。Ｍｕｔａｎｔとしては、表６に示す９種を用いた。
ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅにＲＢＤ ＷＴ及びｍｕｔａｎｔをそれぞれ３μｇ／ｍｌ（０．１μＭ）、１００μｌを４℃で一晩コーティングした。Ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎにおいては、ＷＴ及びｍｕｔａｎｔをそれぞれ１４ｕｇ／ｍｌ（０．１μＭ）、１００μｌを４℃で一晩コーティングした。翌日、ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅのＷＴ及びｍｕｔａｎｔを除去し、各ｗｅｌｌにＰＢＳ＋ＢＳＡ ２％ ２００μｌで３７℃にて１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％で３回洗浄した。従来の抗体（Ｓ３０９，ＲＥＧＮ １０９３３＋１０９８７ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、Ｍ４、Ｍ５及びそれぞれのｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体を１ｎＭにし、１００μｌを各ｗｅｌｌに入れ、３７℃で１時間バインディングした。同様に、ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％で３回洗浄した。ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－Ｆｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（５０００：１）５０μｌを各ｗｅｌｌに入れ、３７℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％で４回洗浄した。ＴＭＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０μｌを各ｗｅｌｌに入れ、５分間インキュベーションした。Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０μＬを各ｗｅｌｌに入れて反応を停止した。Ｍｕｔａｎｔに対するＭ４－４及びＭ５－４の結合力を評価した結果、Ｍ４－４、Ｍ５－４の両方においてｍｕｔａｎｔに対するＷＴ ＲＢＤレベル以上の結合力が確認された。比較抗体として用いたＲＥＧＮ１０９３３及びＲＥＧＮ１０９８７においては、単独で処理した場合に、それぞれＹ４５３Ｆ、Ｎ４３９Ｋ ｍｕｔａｎｔに対する結合力が５０％以上減少することが確認された（図７）。
実験例８．Ｓタンパク質及びその変異体に対する抗体の結合特性
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅタンパク質抗体がｓｐｉｋｅタンパク質及びその変異体、アルファ（イギリス）、ベータ（南アフリカ）及びガンマ（ブラジル）に対して異なる結合特性を示すか否かを確認するために、抗原抗体結合特性を確認した。抗Ｓタンパク質抗体の結合特性のうち動力学は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００バイオセンサ（Cytiva）を用いて決定した。抗体をＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で希釈して１０μｇ／ｍＬに濃度を調整し、ＳＡチップにおいてＲｍａｘが２００Ｒｕに達するまで１０μＬ／ｍｉｎの流速で固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液に０．３１２５－２０ｎＭの濃度に希釈したＳタンパク質を３０μＬ／ｍｉｎの流速で、結合のために３分間、解離のために３０分間、抗体が固定化したＳＡチップに流した。次に、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒間反応させ、抗体に結合したＳタンパク質を洗浄した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて、抗体のセンサーグラムを分析した。抗原抗体結合動力学測定の結果、ｍｏｕｓｅ抗体であるＭ４に比べて、ｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体であるＭ４－４において１０倍以上向上した解離定数値が観察された。これは、比較抗体ＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７の約１０倍のレベルであることが確認された（図８ａ）。
次に、アルファ（イギリス）、ベータ（南アフリカ）及びガンマ（ブラジル）変異体のＲＢＤに対する抗体の結合能力を評価した。この実験には、Ｍ４、Ｍ４－４、並びに比較抗体（ＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７及びＲＥＧＮ ｍｉｘ（ＲＥＧＮ１０９３３＋１０９８７，１：１混合））を用いた。ＲＥＧＮ ｍｉｘは、ＲＢＭに対するエピトープが他の２つの抗体を混合物として用いると変異体に対する作用にシナジー効果を示すかという比較のために用いた。
ＲＢＭ標的中和抗体であるＲＥＧＮ１０９３３は、従来のＲＢＤと同様に、アルファ変異体において類似の結合親和性を示すが、ベータ及びガンマ変異体においてはＲＥＧＮ１０９３３の結合が大幅に減少することが確認された。それに対して、Ｍ４及びＭ４－４は、従来のＲＢＤ及び全ての変異体において類似の結合親和性を示した（図８ｂ）。
これは、本発明の抗体が新たに生成したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に結合する能力を維持し、様々な変異ウイルスに対しても結合力を有し、中和できることを示唆するものである。
実験例９．Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓの生産
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長スパイクタンパク質を保有するシュードウイルス、及びホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有する変異体をＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Takara）から生産した。すなわち、１０μｇのｐｓＰＡＸ２（Addgene）、１０μｇのｐＬＶＸ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、及び１０μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（コドン最適化）発現プラスミドをポリエチレンイミン（質量比１：２）Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に形質転換し、７２時間後に上清を６００×ｇで１５分間遠心分離し、次いで０．４５μｍフィルターで濾過し、追加使用のために－７０℃で保管した。シュードウイルスの力価は、相対的なルシフェラーゼ単位を測定することにより決定した。
実験例１０．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓを用いた中和分析
ＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３安定細胞株は、１０％ウシ胎児血清、抗生物質－抗真菌剤カクテルを含むＤＭＥＭ培地で維持した。９６ｗｅｌｌの平底プレートを１０μｇ／ｍＬ Ｉ型コラーゲンでコーティングし、５％ＣＯ２を含む大気中で３７℃にて４時間インキュベーションした。ＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞をＤＭＥＭに懸濁し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでコラーゲンコーティングした９６ｗｅｌｌ平底プレートに分注し、２４時間培養した。抗体は、２％ＦＢＳ及び抗生物質－抗真菌剤カクテルを含むＤＭＥＭで１０μｇ／ｍＬ（６６．６７ｎＭ）から３倍連続希釈した。抗体希釈液をシュードウイルスと１：１で混合し、５％ＣＯ２を含む大気中で３７℃にて１時間培養した。ＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞から上清を除去し、５０μＬの抗体－シュードウイルス混合物に交換した。その後、５％ＣＯ２を含む大気中で細胞を３７℃にて１時間インキュベーションした。５０μＬの感染培地を細胞に添加し、５％ＣＯ２を含む大気中で細胞を３７℃にてさらに４８時間インキュベーションした。細胞を５×レポーター溶解緩衝液（Promega）に溶解し、ルシフェラーゼ分析システム及び発光系を用いて相対的ルシフェラーゼ活性を決定した。相対的ルシフェラーゼ単位を中和パーセントに変換し、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（GraphPad, Prism 8.0）に合うように非線形回帰曲線にフローティングした。その結果、Ｍ４、Ｍ５ ｃｈｉｍｅｒｉｃ抗体、並びにヒト化を経た候補抗体Ｍ４－４、５、７、８及びＭ５－４、５、７、８がＲＥＧＮ１０９３３と同等レベルの中和能を示すことが確認された（図９ａ，図９ｂ）。
実験例１１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を発現する細胞株の生成
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（ＨＴ１０８０－Ｓ）を発現する安定した細胞株を生成するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｐｃＤＮＡ３．１－スパイクｃＤＮＡをトランスフェクションした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を発現する細胞株は、１．５ｍｇ／ｍＬジェネティシンで選択した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の発現は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体であるＲＥＧＮ１０９３３を用いて、フローサイトメーター（FACS LSR Fortessa, BD Biosciences）により確認した（図１０ａ）。
実験例１２．Ｆｃ媒介効果の測定
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体がＦｃ媒介抗体依存性細胞食作用を示すか否かを確認するために、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ効果を測定した。ＡＤＣＣ分析においては、ＨＴ１０８０－Ｓ細胞をｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌとして用い、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＦｃγＲＩＩＩａをｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌとして用いた。ＨＴ１０８０－Ｓ細胞を適切な培地で１８時間培養し、ＡＤＣＣ ａｓｓａｙ緩衝液を添加した。その後、抗体を希釈して添加し、１５分間反応させた。Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌを追加して１８時間培養し、その後Ｂｉｏ－Ｇｌｏ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ試薬を添加し、メーカーの指示に従って発光性を測定した。測定したｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ値からＰｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Graphpad）によりｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｃｕｒｖｅを描き、ＥＣ５０値を得た。ＡＤＣＰ分析においても、前記と同様に測定した。測定の結果、Ｍ４、Ｍ５ ｃｈｉｍｅｒｉｃ抗体、並びにヒト化を経た候補抗体Ｍ４－４、５、７、８及びＭ５－４、５、７、８がＲｅｆｅｒｅｎｃｅ抗体（ＲＥＧＮ１０９８７，ＲＥＧＮ ｍｉｘ）と同等レベルのＡＤＣＣ効果を示すことが確認された（図１０ｂ）。ＡＤＣＣ効果だけでなく、Ｍ４－４が単一Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ抗体又はＲｅｇｅｎｅｒｏｎ抗体カクテルに匹敵するＡＤＣＰ活性を誘導することがさらに確認された（図１０ｃ）。要するに、図１０のデータは、Ｍ４－４が最大治療効果を媒介するために、Ｆｃ媒介抗体効果機能であるＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを誘導する可能性があることを示す（図１０ｂ，図１０ｃ）。
実験例１３．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅタンパク質変異体に対する中和能の測定
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク変異体、アルファ（イギリス）、ベータ（南アフリカ）及びガンマ（ブラジル）に対するＭ４－４の中和効果を評価するために、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｖａｒｉａｎｔを発現するレンチウイルスシステムを用いて、ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓを行った。Ｍ４及びＭ４－４は、ＲＥＧＮ１０９８７又はＲｅｇｅｎｅｒｏｎカクテル（ｍｉｘ）に匹敵する中和効果により、３種の変異型ウイルスを中和できることが確認された。ＲＥＧＮ１０９３３は、高濃度の細胞において、ベータ又はガンマ変異型シュードウイルス感染の１００％の中和を媒介することができなかった（図１１）。
要するに、ヒト化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体のＭ４－４はＷＴ及び選択したスパイク突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス粒子を中和することができ、中和効果はＲｅｇｅｎｅｒｏｎカクテルと同程度であることが確認された（図１１）。
実験例１４．エピトープ（epitope）ビニング（binning）
エピトープビニングは、ＢＬＩシステム（Octet Qke）を用いて３ステップで行った。ステップ１では抗原の固定化を行い、ステップ２は１次抗体結合を含み、ステップ３は２次抗体結合を含む。各ステップ間に６０秒間の基準ステップを設定し、基準線信号を確認した。ステップ１では、２０μｇ／ｍＬに精製した組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質又はＲＢＤ Ｈｉｓを１０００ｒｐｍで２００秒間予め水和したアンチペンタ－Ｈｉｓバイオセンサに固定化した。ステップ２では、３７．５μｇ／ｍＬの異なる１次結合Ａｂが３００秒間結合した。ステップ３では、２次抗体１種（１８．７５μｇ／ｍＬ）を１５０秒間結合させ、自己結合及び競合の程度を確認した。競合の程度は百分率で定義した。固定した抗原に２次抗体のみ結合した場合を１００％と定義した。３３％未満の結合レベルは完全な競合と定義し、３３％から６６％までのレベルは中間競合と定義し、６６％以上のレベルは非競合と定義した。ビニングの結果、Ｍ４－４は、ＲＥＧ１０９８７及びＳ３０９のエピトープと１００％競合し、部分的にＲＥＧＮ１０９３３のエピトープとも競合することが確認された。それに対して、ＲＥＧＮ１０９８７及びＳ３０９は、ＲＥＧＮ１０９３３との非競合エピトープを有することが観察された（図１２）。
これは、Ｍ４－４がＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７、Ｓ３０９より広い領域のエピトープに結合することを示唆するものである。
また、ＡＣＥ２受容体の競合的結合を確認するために、類似の実験を行った。相違点は、組換えヒトＡＣＥ２受容体と組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＲＢＤの結合親和性と、ｍＡｂとＲＢＤの親和性の比が約１０～１００であるという点である。よって、ＡＣＥ２受容体は、２次抗体結合に関するステップ３でのみ用いた。Ｍ４－４は、ＡＣＥ２受容体とも１００％競合することが観察された。よって、Ｍ４－４がＡＣＥ２受容体に対する抗原の結合を１００％阻害することが確認された（図１２）。
実験例１５．Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｃｋｉｎｇ
Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｓｕｉｔｅ内のＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅは、それぞれ重鎖及び軽鎖テンプレートとして抗ＰＤ１（ＰＤＢコード：６ＪＪＰ）及び抗ＳＩＲＰα抗体（ＰＤＢコード：６ＮＭＲ）の構造を使用し、Ｍ４－４のｓｃＦｖ相同性モデリングに用いた。Ｍ４－４のｓｃＦｖ構造のＲＢＤ（ＰＤＢコード：６Ｍ０Ｊ）へのドッキングは、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ５６におけるＰＩＰＥＲを用いて行った。ＲＢＤ及びＣＤＲループのＬｙｓ４４０とＴｈｒ５００間の距離は、エピトープビニング（binning）の結果に基づいて、２Åから１０Åまでに制限した。ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅは、７０，０００個の可能なタンパク質－タンパク質構造を有する３０個の最高の複合体を提案した。Ｍ４－４の最終複合体は、クラスターの大きさ及びエピトープビニング結果との一致により選択し、その後エネルギー最小化を行った。Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｃｋｉｎｇ結果から予測されたＲＢＤに対するＭ４－４の結合部位は、ＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７、Ｓ３０９及びＡＣＥ２受容体の結合を全て阻害する位置であった。これは、ビニングの結果に通じるものであり、Ｍ４－４のエピトープを予測することができる（図１３）。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims (17)

  1. コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  2. 前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５～４５、配列番号８７～９１、配列番号９７～１１５のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖可変領域と、配列番号４６～８６、配列番号９２～９６及び配列番号１１６～１３１のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８７～９１及び配列番号１００～１１５のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖可変領域と、配列番号９２～９６及び配列番号１１６～１３１のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＭＥＲＳ－ＣｏＶである、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記抗体又はその抗原結合断片は、２種以上のコロナウイルスに交差反応を有するものである、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記２種以上のコロナウイルスに交差反応を有する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６～１２、配列番号１４～２２、配列番号２４、２５、３２、３７、４５、配列番号８７～９１及び配列番号９７～９９のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖可変領域と、配列番号４７～５３、配列番号５５～６３、配列番号６５、６６、７３、７８、８６及び配列番号９２～９６のいずれかの配列からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含む、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記抗体又はその抗原結合断片は、
    配列番号１３９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
    配列番号１４２又は１４５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４３又は１４６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４４又は１４７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  8. 前記重鎖可変領域は、配列番号１０３のアミノ酸配列からなり、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号１１９のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
  10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  11. 請求項１０に記載の発現ベクターを導入した形質転換体。
  12. 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、コロナウイルス感染症の予防又は治療用薬学組成物。
  13. 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をヒト以外の個体に投与するステップを含む、コロナウイルス感染症の予防又は治療方法。
  14. 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片に薬物が結合した抗体薬物結合体。
  15. 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含むコロナウイルス感染診断用組成物。
  16. 請求項１５に記載の組成物を含むコロナウイルス感染診断用キット。
  17. 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、それを含む感染診断用組成物、又は前記組成物を含むキットを用いて、コロナウイルス感染の疑いのある個体から分離した生物学的試料に存在するコロナウイルスを検出するステップを含む、コロナウイルス感染診断のための情報提供方法。
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