JP2023544769A - 多重特異性抗体の構築のためのビルディングブロックの合理的選択 - Google Patents

多重特異性抗体の構築のためのビルディングブロックの合理的選択 Download PDF

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Abstract

複数の標的を同時に認識することができる単一の抗体ベースのコンストラクトを生成する能力は、多くの治療薬候補を臨床に進めるために最も重要である。これはしばしば、広範なタンパク質設計が行われ、その成功の度合いが様々であることを意味する。多重特異性抗体コンストラクトの場合、選択すべき複数のモジュールがあり、多くの場合、複数の抗原結合成分も同様に存在する。本明細書に記載されるのは、共通軽鎖の選択を含む、抗原結合成分を適切な形態で最適に対合させるための新しい方法の発見である。

Description

本発明は、バイオ医薬品の技術分野に関する。特に、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを作製する方法、及びそのようなコンストラクトのための最適な多重特異性モジュールを選択する方法に関する。
二重特異性抗体（バイスペシフィック）は、今日、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって支配されている技術分野において、興味深い新世代の高分子治療薬である１、２。バイスペシフィックの決定的な特徴は、同じ又は異なる標的上に位置する２つのエピトープを認識する能力である。この二重認識能力は従来のｍＡｂの機能性を拡張し、腫瘍細胞を破壊するための免疫細胞の動員、別個の細胞表面受容体の架橋、又は組織特異性の増強などの多様な用途を可能にする１、３。例えば、Ａｍｇｅｎの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））は、Ｔ細胞表面のＣＤ３エピトープと腫瘍関連抗原４、５の両方に結合し、免疫学的に活性なＴ細胞と標的腫瘍細胞とを連結する橋として効果的に作用する。これまでに１００以上の二重特異性の形態が報告されており、開発中が８５以上、ＦＤＡの承認を受けたのは３例である１、６、７。一般に、バイスペシフィックは次の３つのカテゴリーに分類することができる：ｉ）断片融合（例えば、タンデムｓｃＦｖ及びＤＡＲＴ）、ｉｉ）ＩｇＧ融合（例えば、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ及びＤＶＤ－Ｉｇ）、及びｉｉｉ）ＩｇＧ様分子（例えば、ヘテロＦｃ）７、８。断片融合及びＩｇＧ融合は、精製及び安定な細胞株生成に有利な単純な操作された構成（１つ又は２つのポリペプチド鎖のみ）を示すが、これらの形態は低収率で、且つ望ましくない安定性プロファイルを示すことが多い。対照的に、ＩｇＧ分子の天然構造を模倣するＩｇＧ様バイスペシフィック（例えば、ヘテロＦｃ）は、安定性がより高く、より優れた細胞産生を示す。さらに、それらは、おそらく血清中の良好な半減期プロファイルと、免疫原性の低い可能性のために、臨床試験において最も代表的な二重特異性の形態の１つである１。しかしながら、これらの形態では、鎖の数が多い（３～４）ために、誤対合した種が重大な汚染物質となり、それらを除去するために複数の精製工程を必要とし、最終精製収率を大きく低下させ得る。
操作ＩｇＧ様二重特異性抗体において、複数の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）は２つの異なるエピトープの認識を可能にするために、単一の分子に組み立てられる。したがって、ＩｇＧ様バイスペシフィックを開発するための課題は、正しい鎖対合を確実にすることである。４本鎖ヘテロＦｃの場合、同じ細胞におけるこれらの鎖の共発現は、誤対合ＩｇＧ種の９つの可能な組み合わせをもたらし得る９、１０。過去数年間に、ノブ・イントゥ・ホール１１、鎖交換操作ドメイン１２及び電荷対変異（ＣＰＭ）１３、１４を含むいくつかの戦略が、ＨＣ／ＨＣ及びＨＣ／ＬＣ対合の問題に対処するために開発されている。ＨＣ／ＬＣエンジニアリングでは、ほとんどの場合、その理論的根拠は、非同族よりも同族のＨＣ／ＬＣ対合に有利に働くように鎖界面を操作することである。しかしながら、最良のエンジニアリング努力にもかかわらず、配列多様性（相補性決定領域（ＣＤＲ）、フレームワーク、及びＬＣアイソタイプ）が、これらのエンジニアリングツールをＨＣ／ＬＣ対合に厳格なプラットフォームとして適用した場合に、その成功をしばしば制限する。
これらの困難を克服するために、共通の軽鎖（ｃＬＣ）の使用は、特定のＨＣとＬＣとの間の対合を駆動する必要性を回避するので、魅力的である。しかしながら、異なるＨＣと対合させた場合に異なるエピトープへの所望の結合プロファイルを維持するｃＬＣの特定はいずれも困難であり、薬物開発プロセスの初期にかなりの投資を必要とすることが多い１５。一般に、ｃＬＣを有する抗体を発見するために、２つの方法が最も一般的に使用される。第１は、多様なＨＣ配列からなるが、ＬＣは１つ又は少数のみからなるディスプレイライブラリーのスクリーニングを含む。或いは、ユニバーサルＬＣを発現するマウスを、所望の標的のそれぞれについて免疫する１６、１７。いずれの方法も利用可能なＬＣを制限するので、これらのｃＬＣ抗体は多くの場合、標的親和性を最適化するために、主にＨＣにおいて、大規模な操作を必要とする準最適の結合親和性を示す。対照的に、通常のｍＡｂにおいて、ＨＣ及びＬＣの両方を最適化の対象とすることができる。さらに、抗体－抗原複合体の構造は、抗体／エピトープ相互作用の多くがＨＣ駆動型であり、稀にＬＣがいかなる生産的相互作用も行わない場合があることを明らかにしている１８。したがって、いくつかのＬＣが、標的結合親和性を保持しながら、非同族のＨＣと対合するのに好適であり得る。同族ＨＣ及び非同族ＨＣとともに、このようなＬＣで組み立てられたｃＬＣヘテロＦｃは、同族ＨＣ／ＬＣアームにおける天然の親和性を保持するので、最適化の必要性は少ない。
治療用抗体の開発は通常、選択された抗原によるヒト化動物モデルの免疫化から始まり１９、２０、リードｍＡｂの同定及び単離に至る。これらのｍＡｂは、とりわけ、標的特異性、結合親和性、異種間反応性、収率、安定性、及び免疫原性なしなどの設計目標を満たすように選択されるが、バイスペシフィックのためのビルディングブロックとなるものに必要とされる特性についてはほとんど知られていない。多くの場合、これには、全ての親ｍＡｂの組み合わせを評価するために、何百というバイスペシフィックの経験的試験を必要とされ、タイムライン及びリソースの増加につながる。
したがって、バイスペシフィック及びマルチスペシフィックを作製するためのリードｍＡｂの合理的選択を容易にする２つのハイスループットスクリーニング方法が必要とされている。本出願は、競合及び非競合連鎖選択性評価（ＣＳＡ）を記載する。競合ＣＳＡ（ｃＣＳＡ）を用いて、ＨＣ及びＬＣが効果的にヘテロＦｃ分子に組み立てられるｍＡｂを、２つのＦａｂ間の交差対合がほとんど生じないか又は最小限に抑えられた状態で選択する。非競合ＣＳＡ（ｎｃＣＳＡ）は、費用対効果の高い方法でｃＬＣを同定するための強力なツールである。
Ｌａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．，Ｊａｎｍａａｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．＆ Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８，５８５－６０８（２０１９） Ｌｕ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ ２７，１（２０２０） Ｆａｎ，Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｈａｏ，Ｍ．＆ Ｌｉ，Ｊ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ８，１３０（２０１５） Ｗｏｌｆ，Ｅ．，Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｒ．，Ｋｕｆｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ，Ｂ．＆ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．ＢｉＴＥｓ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １０，１２３７－１２４４（２００５） Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７６，８３６－８４７（２０１７） Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．＆ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＭＡｂｓ ９，１８２－２１２（２０１７） Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂａｓｅｌ）８（２０１９） Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．，Ｚｈａｉ，Ｑ．＆ Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７，９５－１０６（２０１５） Ｓｕｒｅｓｈ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｙｂｒｉｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １２１，２１０－２２８（１９８６） Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１） Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．＆ Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６） Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ：ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｉｎ ａｎ Ｆｃ ａｎａｌｏｇｕｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｂｉｎｄｅｒｓ ｏｒ ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３，１９５－２０２（２０１０） Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＩｇＧ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５，１９６３７－１９６４６（２０１０） Ｄｉｌｌｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｓｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．ＭＡｂｓ ９，２１３－２３０（２０１７） Ｓｈｉｒａｉｗａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＥＲＹ９７４．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４，１０－２０（２０１９） Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６，６７７－６８１（１９９８） Ｋｒａｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａｎｉｍａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ３０，２９１－３０１（２０１７） Ｇａｒｃｅｓ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＧＲＰＲ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ Ｍｉｇｒａｉｎｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｉｍｏｖｉｇ（Ｅｒｅｎｕｍａｂ）．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ３０，１７１４－１７２３ ｅ１７１６（２０２０） Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）６３，１０１－１０８（２０１５） Ｆｏｌｔｚ，Ｉ．Ｎ．，Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．＆ Ｋｉｎｇ，Ｃ．Ｔ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｂｉｏ－ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２７０，５１－６４（２０１６）
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）ベクターに
（ｉ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｉｉｉ）
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｃ）第１の抗原にも又は第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
をクローニングする工程であって、
ベクターは１つのタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲを含む複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
（ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの第１の抗原及び第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の同じ軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の結合親和性を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一実施形態では、複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む。
一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（「ＣＯＳ－７」）、ヒト胎児腎臓株２９３（「ＨＥＫ２９３」）、ベビーハムスター腎臓細胞（「ＢＨＫ」）、マウスセルトリ細胞（「ＴＭ４」）、サル腎臓細胞（「ＣＶ１」）、アフリカミドリザル腎臓細胞（「ＶＥＲＯ－７６」）、ヒト子宮頸癌細胞（「ＨＥＬＡ」）、イヌ腎臓細胞（「ＭＤＣＫ」）、バッファローラット肝臓細胞（「ＢＲＬ」）、ヒト胚細胞（「Ｗ１３８」）、ヒトヘパトーマ細胞（「Ｈｅｐ Ｇ２」）、マウス乳癌（「ＭＭＴ」）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、発現レベルは、Ａ２８０測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、ブラッドフォードアッセイ、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイからなる群から選択される方法によって決定される。
一実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原に対する各多重特異性抗体コンストラクトの結合親和性は、Ｏｃｔｅｔ、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ、ＳＰＲ及びフローサイトメトリーを使用して測定される。
一実施形態では、各多重特異性抗体コンストラクトは、プロテインＡ、ラムダ及びカッパ樹脂、並びにアフィニティータグ精製によって精製される。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）ベクターに
（ｉ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｉｉｉ）
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｃ）第１の抗原にも又は第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
をクローニングする工程であって、
ベクターは多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲを含む複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
（ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）Ｏｃｔｅｔを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの第１の抗原及び第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程、
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の同じ軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の結合親和性を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）２つの複数のＣＤＲを、多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードするベクターにクローニングする工程であって、各抗原に結合するＣＤＲを含む複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
（ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、並びに（ｉｉ）生成された正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一実施形態では、複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択される。
一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（「ＣＯＳ－７」）、ヒト胎児腎臓株２９３（「ＨＥＫ２９３」）、ベビーハムスター腎臓細胞（「ＢＨＫ」）、マウスセルトリ細胞（「ＴＭ４」）、サル腎臓細胞（「ＣＶ１」）、アフリカミドリザル腎臓細胞（「ＶＥＲＯ－７６」）、ヒト子宮頸癌細胞（「ＨＥＬＡ」）、イヌ腎臓細胞（「ＭＤＣＫ」）、バッファローラット肝臓細胞（「ＢＲＬ」）、ヒト胚細胞（「Ｗ１３８」）、ヒトヘパトーマ細胞（「Ｈｅｐ Ｇ２」）、マウス乳癌（「ＭＭＴ」）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、発現レベルは、Ａ２８０測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、ブラッドフォードアッセイ、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイからなる群から選択される方法によって決定される。
一実施形態では、正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合は、液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）、Ｃａｌｉｐｅｒ、ＨＰＬＣ ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びマイクロチップキャピラリー電気泳動（「ＭＣＥ」）からなる群から選択される方法によって決定される。
一実施形態では、各多重特異性抗体コンストラクトは、プロテインＡ、ラムダ及びカッパ樹脂、並びにアフィニティータグ精製によって精製される。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）２つの複数のＣＤＲを、多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードするベクターにクローニングし、各抗原に結合する複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
（ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）を用いて、正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択される。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）ベクターに
（ｉ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｉｉｉ）
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｃ）第１の抗原にも又は第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
をクローニングする工程であって、
ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において異なるモジュールの各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
（ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの第１の抗原及び第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の同じ軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の結合親和性を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む。
一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（「ＣＯＳ－７」）、ヒト胎児腎臓株２９３（「ＨＥＫ２９３」）、ベビーハムスター腎臓細胞（「ＢＨＫ」）、マウスセルトリ細胞（「ＴＭ４」）、サル腎臓細胞（「ＣＶ１」）、アフリカミドリザル腎臓細胞（「ＶＥＲＯ－７６」）、ヒト子宮頸癌細胞（「ＨＥＬＡ」）、イヌ腎臓細胞（「ＭＤＣＫ」）、バッファローラット肝臓細胞（「ＢＲＬ」）、ヒト胚細胞（「Ｗ１３８」）、ヒトヘパトーマ細胞（「Ｈｅｐ Ｇ２」）、マウス乳癌（「ＭＭＴ」）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、発現レベルは、Ａ２８０測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、ブラッドフォードアッセイ、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイからなる群から選択される方法によって決定される。
一実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原に対する各多重特異性抗体コンストラクトの結合親和性は、Ｏｃｔｅｔ、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ、ＳＰＲ及びフローサイトメトリーを使用して測定される。
一実施形態では、各多重特異性抗体コンストラクトは、プロテインＡ、ラムダ及びカッパ樹脂、並びにアフィニティータグ精製によって精製される。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）ベクターに
（ｉ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｉｉｉ）
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｃ）第１の抗原にも又は第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
をクローニングする工程であって、
ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
（ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）Ｏｃｔｅｔを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの第１の抗原及び第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程、
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の同じ軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の結合親和性を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ及び第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖのＣＤＲをベクターにクローニングする工程であって
ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合するＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
（ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、並びに（ｉｉ）生産された正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む。
一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（「ＣＯＳ－７」）、ヒト胎児腎臓株２９３（「ＨＥＫ２９３」）、ベビーハムスター腎臓細胞（「ＢＨＫ」）、マウスセルトリ細胞（「ＴＭ４」）、サル腎臓細胞（「ＣＶ１」）、アフリカミドリザル腎臓細胞（「ＶＥＲＯ－７６」）、ヒト子宮頸癌細胞（「ＨＥＬＡ」）、イヌ腎臓細胞（「ＭＤＣＫ」）、バッファローラット肝臓細胞（「ＢＲＬ」）、ヒト胚細胞（「Ｗ１３８」）、ヒトヘパトーマ細胞（「Ｈｅｐ Ｇ２」）、マウス乳癌（「ＭＭＴ」）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、発現レベルは、Ａ２８０測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、ブラッドフォードアッセイ、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイからなる群から選択される方法によって決定される。
一実施形態では、正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合は、液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）、Ｃａｌｉｐｅｒ、ＨＰＬＣ ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びマイクロチップキャピラリー電気泳動（「ＭＣＥ」）からなる群から選択される方法によって決定される。
一実施形態では、各多重特異性抗体コンストラクトは、プロテインＡ、ラムダ及びカッパ樹脂、並びにアフィニティータグ精製によって精製される。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ及び第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖのＣＤＲをベクターにクローニングする工程であって
ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合するＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
（ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）を用いて、正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む。
図１は、ＨＣ－ＬＣ界面の構造解析を示す。Ａ）ＩｇＧ構造配置の模式図及びＦｖ領域の表面表現。青色に着色されたＦａｂアームにおいて、Ｆｖ（ＶＨ／ＶＬ）界面、ＣＨ１／ＣＬ界面及びＣＤＲ領域は、それぞれ破線で囲んでいる。ＩｇＧ（ＰＤＢ：１ＨＺＨ）のＶＨ及びＶＬドメインの表面は、各ＣＤＲの色コードを有するＰｙＭｏｌを用いて作製した。ＶＨとＶＬの界面は、破線で強調している。Ｂ）ＰＤＢｅＰＩＳＡによって実施された６つの構造を用いたＨＣ／ＬＣ界面残基の算出２９。対応する領域における界面残基の数を列挙する。Ｃ）タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）に寄託された構造を有する５０８のヒト抗体の配列アラインメントは、ＣＤＲの多様性を強調する。 図１は、ＨＣ－ＬＣ界面の構造解析を示す。Ａ）ＩｇＧ構造配置の模式図及びＦｖ領域の表面表現。青色に着色されたＦａｂアームにおいて、Ｆｖ（ＶＨ／ＶＬ）界面、ＣＨ１／ＣＬ界面及びＣＤＲ領域は、それぞれ破線で囲んでいる。ＩｇＧ（ＰＤＢ：１ＨＺＨ）のＶＨ及びＶＬドメインの表面は、各ＣＤＲの色コードを有するＰｙＭｏｌを用いて作製した。ＶＨとＶＬの界面は、破線で強調している。Ｂ）ＰＤＢｅＰＩＳＡによって実施された６つの構造を用いたＨＣ／ＬＣ界面残基の算出２９。対応する領域における界面残基の数を列挙する。Ｃ）タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）に寄託された構造を有する５０８のヒト抗体の配列アラインメントは、ＣＤＲの多様性を強調する。 図１は、ＨＣ－ＬＣ界面の構造解析を示す。Ａ）ＩｇＧ構造配置の模式図及びＦｖ領域の表面表現。青色に着色されたＦａｂアームにおいて、Ｆｖ（ＶＨ／ＶＬ）界面、ＣＨ１／ＣＬ界面及びＣＤＲ領域は、それぞれ破線で囲んでいる。ＩｇＧ（ＰＤＢ：１ＨＺＨ）のＶＨ及びＶＬドメインの表面は、各ＣＤＲの色コードを有するＰｙＭｏｌを用いて作製した。ＶＨとＶＬの界面は、破線で強調している。Ｂ）ＰＤＢｅＰＩＳＡによって実施された６つの構造を用いたＨＣ／ＬＣ界面残基の算出２９。対応する領域における界面残基の数を列挙する。Ｃ）タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）に寄託された構造を有する５０８のヒト抗体の配列アラインメントは、ＣＤＲの多様性を強調する。 図２は、高スループット連鎖選択的評価法（ＣＳＡ）の設計の模式図を示す。Ａ）ハイスループットＣＳＡの模式図。標的Ａ（青色）及び標的Ｂ（緑色）に対する親ｍＡｂの２つのパネルを、２つの可能な産物、４本鎖ヘテロＦｃ及びｃＬＣヘテロＦｃを用いたハイスループットスクリーニングに供する。Ｂ）２つの高スループットＣＳＡ法の概略及びタイムライン。競合ＣＳＡ（ｃＣＳＡ）実験では、各抗標的Ａ ｍＡｂを全ての抗標的Ｂ ｍＡｂと組み合わせる。ＨＣヘテロ二量体化を確実にするために、赤色及び青色のドットで示したＣＰＭをＣＨ３ドメインに操作した。したがって、４つのＨＣ／ＬＣ対合シナリオが、鎖界面内の天然の特性として残る。２つのＨＣと２つのＬＣの全ての組み合わせをＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞に同時トランスフェクトし、続いて各ＩｇＧ種のＰｒｏＡ精製及びＬＣ－ＭＳ定量を行う。正しいＭＷ ＩｇＧ種の割合が高い試料は、対応する抗体の組み合わせが、交差対合を最小限に抑えながら、同族ＨＣ／ＬＣ対合に対して高い選好性を有することを示す。非競合ＣＳＡ（ｎｃＣＳＡ）実験では、非同族ＨＣ／ＬＣ対のＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞における発現を試験した後、ＰｒｏＡ精製及びタンパク質濃度（Ａ２８０）の決定を行う。高レベルのハイブリッドＩｇＧ発現は、ｃＬＣヘテロＦｃに選択されるべき無差別なＬＣが同族及び非同族ＨＣとともに集合することを示唆する。陽性バインダーを同定するために、精製ハイブリッドＩｇＧをＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸによってさらに分析する。 図２は、高スループット連鎖選択的評価法（ＣＳＡ）の設計の模式図を示す。Ａ）ハイスループットＣＳＡの模式図。標的Ａ（青色）及び標的Ｂ（緑色）に対する親ｍＡｂの２つのパネルを、２つの可能な産物、４本鎖ヘテロＦｃ及びｃＬＣヘテロＦｃを用いたハイスループットスクリーニングに供する。Ｂ）２つの高スループットＣＳＡ法の概略及びタイムライン。競合ＣＳＡ（ｃＣＳＡ）実験では、各抗標的Ａ ｍＡｂを全ての抗標的Ｂ ｍＡｂと組み合わせる。ＨＣヘテロ二量体化を確実にするために、赤色及び青色のドットで示したＣＰＭをＣＨ３ドメインに操作した。したがって、４つのＨＣ／ＬＣ対合シナリオが、鎖界面内の天然の特性として残る。２つのＨＣと２つのＬＣの全ての組み合わせをＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞に同時トランスフェクトし、続いて各ＩｇＧ種のＰｒｏＡ精製及びＬＣ－ＭＳ定量を行う。正しいＭＷ ＩｇＧ種の割合が高い試料は、対応する抗体の組み合わせが、交差対合を最小限に抑えながら、同族ＨＣ／ＬＣ対合に対して高い選好性を有することを示す。非競合ＣＳＡ（ｎｃＣＳＡ）実験では、非同族ＨＣ／ＬＣ対のＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞における発現を試験した後、ＰｒｏＡ精製及びタンパク質濃度（Ａ２８０）の決定を行う。高レベルのハイブリッドＩｇＧ発現は、ｃＬＣヘテロＦｃに選択されるべき無差別なＬＣが同族及び非同族ＨＣとともに集合することを示唆する。陽性バインダーを同定するために、精製ハイブリッドＩｇＧをＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸによってさらに分析する。 図３は、ｃＣＳＡ実験における低交差対合抗体の組み合わせのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）タンパク質発現レベルの分析。１２個の親ｍＡｂ（８個の抗標的－Ａ及び４個の抗標的－Ｂ）及び得られた３２個のヘテロＦｃ組み合わせを、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において一過性に発現させた。馴化培地中の分子をハイスループットＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘシステムで精製した後、タンパク質濃度を測定した（Ａ２８０）。発現レベルを、馴化培地１リットル当たりのミリグラム（ｍｇ）で算出したＰｒｏＡ収率によって示す。Ｂ）強調された２つのＰｒｏＡ精製試料（Ａ３×Ｂ４及びＡ４×Ｂ２）の代表的な高分解能ＬＣ－ＭＳ分析（正しい及び誤対合したＩｇＧ種を示す模式図を含む）。Ｃ）ヘテロＨＣを有するＩｇＧ種の割合をＬＣ－ＭＳデータから算出し、プロットした。正しいＭＷを有するＩｇＧ種（１×ＨＣ１＋１×ＬＣ１＋１×ＨＣ２＋１×ＬＣ２）の割合は、正しいＨＣ／ＬＣ対合を反映する。＊、ＭＷ差が小さく、ＬＣ－ＭＳによるＩｇＧ種の識別ができない。 図３は、ｃＣＳＡ実験における低交差対合抗体の組み合わせのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）タンパク質発現レベルの分析。１２個の親ｍＡｂ（８個の抗標的－Ａ及び４個の抗標的－Ｂ）及び得られた３２個のヘテロＦｃ組み合わせを、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において一過性に発現させた。馴化培地中の分子をハイスループットＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘシステムで精製した後、タンパク質濃度を測定した（Ａ２８０）。発現レベルを、馴化培地１リットル当たりのミリグラム（ｍｇ）で算出したＰｒｏＡ収率によって示す。Ｂ）強調された２つのＰｒｏＡ精製試料（Ａ３×Ｂ４及びＡ４×Ｂ２）の代表的な高分解能ＬＣ－ＭＳ分析（正しい及び誤対合したＩｇＧ種を示す模式図を含む）。Ｃ）ヘテロＨＣを有するＩｇＧ種の割合をＬＣ－ＭＳデータから算出し、プロットした。正しいＭＷを有するＩｇＧ種（１×ＨＣ１＋１×ＬＣ１＋１×ＨＣ２＋１×ＬＣ２）の割合は、正しいＨＣ／ＬＣ対合を反映する。＊、ＭＷ差が小さく、ＬＣ－ＭＳによるＩｇＧ種の識別ができない。 図３は、ｃＣＳＡ実験における低交差対合抗体の組み合わせのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）タンパク質発現レベルの分析。１２個の親ｍＡｂ（８個の抗標的－Ａ及び４個の抗標的－Ｂ）及び得られた３２個のヘテロＦｃ組み合わせを、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において一過性に発現させた。馴化培地中の分子をハイスループットＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘシステムで精製した後、タンパク質濃度を測定した（Ａ２８０）。発現レベルを、馴化培地１リットル当たりのミリグラム（ｍｇ）で算出したＰｒｏＡ収率によって示す。Ｂ）強調された２つのＰｒｏＡ精製試料（Ａ３×Ｂ４及びＡ４×Ｂ２）の代表的な高分解能ＬＣ－ＭＳ分析（正しい及び誤対合したＩｇＧ種を示す模式図を含む）。Ｃ）ヘテロＨＣを有するＩｇＧ種の割合をＬＣ－ＭＳデータから算出し、プロットした。正しいＭＷを有するＩｇＧ種（１×ＨＣ１＋１×ＬＣ１＋１×ＨＣ２＋１×ＬＣ２）の割合は、正しいＨＣ／ＬＣ対合を反映する。＊、ＭＷ差が小さく、ＬＣ－ＭＳによるＩｇＧ種の識別ができない。 図４は、４本鎖ヘテロＦｃにおけるＨＣ／ＬＣ対合の予測可能性を示す。Ａ）９０％を超える純度目標でのＣＩＥＸ精製後に観察された最終収率。ヘテロＦｃ及びそれらの対応する親ｍＡｂの収率を並べてプロットした。Ｂ）ＣＩＥＸ収率及び正しいＩｇＧ種の％の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）プロット。Ｃ）ＣＩＥＸ収率とＨＣ／ＬＣ対合相関解析。破線は、ＬＣ－ＭＳによって決定された正しいＩｇＧ種の５０％ベンチマークを示す。Ｄ）２つの代表的な分子のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｅ）ｃＣＳＡ実験の各段階における分子数の内訳。 図４は、４本鎖ヘテロＦｃにおけるＨＣ／ＬＣ対合の予測可能性を示す。Ａ）９０％を超える純度目標でのＣＩＥＸ精製後に観察された最終収率。ヘテロＦｃ及びそれらの対応する親ｍＡｂの収率を並べてプロットした。Ｂ）ＣＩＥＸ収率及び正しいＩｇＧ種の％の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）プロット。Ｃ）ＣＩＥＸ収率とＨＣ／ＬＣ対合相関解析。破線は、ＬＣ－ＭＳによって決定された正しいＩｇＧ種の５０％ベンチマークを示す。Ｄ）２つの代表的な分子のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｅ）ｃＣＳＡ実験の各段階における分子数の内訳。 図４は、４本鎖ヘテロＦｃにおけるＨＣ／ＬＣ対合の予測可能性を示す。Ａ）９０％を超える純度目標でのＣＩＥＸ精製後に観察された最終収率。ヘテロＦｃ及びそれらの対応する親ｍＡｂの収率を並べてプロットした。Ｂ）ＣＩＥＸ収率及び正しいＩｇＧ種の％の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）プロット。Ｃ）ＣＩＥＸ収率とＨＣ／ＬＣ対合相関解析。破線は、ＬＣ－ＭＳによって決定された正しいＩｇＧ種の５０％ベンチマークを示す。Ｄ）２つの代表的な分子のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｅ）ｃＣＳＡ実験の各段階における分子数の内訳。 図４は、４本鎖ヘテロＦｃにおけるＨＣ／ＬＣ対合の予測可能性を示す。Ａ）９０％を超える純度目標でのＣＩＥＸ精製後に観察された最終収率。ヘテロＦｃ及びそれらの対応する親ｍＡｂの収率を並べてプロットした。Ｂ）ＣＩＥＸ収率及び正しいＩｇＧ種の％の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）プロット。Ｃ）ＣＩＥＸ収率とＨＣ／ＬＣ対合相関解析。破線は、ＬＣ－ＭＳによって決定された正しいＩｇＧ種の５０％ベンチマークを示す。Ｄ）２つの代表的な分子のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｅ）ｃＣＳＡ実験の各段階における分子数の内訳。 図４は、４本鎖ヘテロＦｃにおけるＨＣ／ＬＣ対合の予測可能性を示す。Ａ）９０％を超える純度目標でのＣＩＥＸ精製後に観察された最終収率。ヘテロＦｃ及びそれらの対応する親ｍＡｂの収率を並べてプロットした。Ｂ）ＣＩＥＸ収率及び正しいＩｇＧ種の％の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）プロット。Ｃ）ＣＩＥＸ収率とＨＣ／ＬＣ対合相関解析。破線は、ＬＣ－ＭＳによって決定された正しいＩｇＧ種の５０％ベンチマークを示す。Ｄ）２つの代表的な分子のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｅ）ｃＣＳＡ実験の各段階における分子数の内訳。 図５は、ｎｃＣＳＡによるｃＬＣヘテロＦｃのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）２つの二重特異性パネル（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）における１４４の非同族ＨＣ／ＬＣ対の相対発現。各非同族ＨＣ／ＬＣ対のＰｒｏＡ収率を、対応する同族ＨＣ／ＬＣ対（ｍＡｂ）対照の収率に対して正規化した。相対発現レベルが０．５超の非同族ＨＣ／ＬＣ対は、そのＬＣが対合する非同族ＨＣに対し無差別であり、同族ＨＣと一緒にｃＬＣヘテロＦｃを構築するために選択されることを示唆している。Ｂ）選択されたＰｒｏＡ精製非同族ＨＣ／ＬＣ対及びｍＡｂ対照を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分析し、Ａ２８０により測定して収率を決定した。Ｃ）２つの可能なｃＬＣヘテロＦｃの模式図。ＣＰＭは、ＣＨ３ドメインにおいて赤色及び青色のドットとして示す。Ｄ）及びＥ）２つの二重特異性パネル（それぞれＡ×Ｂ及びＣ×Ｂ）のｃＬＣヘテロＦｃの発現レベル（馴化培地１リットル当たりのｍｇで算出したＰｒｏＡ収率によって示す）。破線は６０ｍｇ／Ｌを強調する。Ｆ）ｃＬＣヘテロＦｃの、それらの同族及び非同族抗原に対する相対結合親和性のヒートマッププロット。可溶性抗原Ａ、Ｂ又はＣに対する１０６個のｃＬＣヘテロＦｃｓと２２個の対応するｍＡｂの結合親和性（ＫＤ）を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔにより測定した。次いで、対応する同族及び非同族ＨＣ ｍＡｂのものと比較したｃＬＣヘテロＦｃの相対結合親和性を算出し、プロットした。Ｇ）ｎｃＣＳＡ実験の各段階における分子の数を示す逆ピラミッド図。 図５は、ｎｃＣＳＡによるｃＬＣヘテロＦｃのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）２つの二重特異性パネル（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）における１４４の非同族ＨＣ／ＬＣ対の相対発現。各非同族ＨＣ／ＬＣ対のＰｒｏＡ収率を、対応する同族ＨＣ／ＬＣ対（ｍＡｂ）対照の収率に対して正規化した。相対発現レベルが０．５超の非同族ＨＣ／ＬＣ対は、そのＬＣが対合する非同族ＨＣに対し無差別であり、同族ＨＣと一緒にｃＬＣヘテロＦｃを構築するために選択されることを示唆している。Ｂ）選択されたＰｒｏＡ精製非同族ＨＣ／ＬＣ対及びｍＡｂ対照を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分析し、Ａ２８０により測定して収率を決定した。Ｃ）２つの可能なｃＬＣヘテロＦｃの模式図。ＣＰＭは、ＣＨ３ドメインにおいて赤色及び青色のドットとして示す。Ｄ）及びＥ）２つの二重特異性パネル（それぞれＡ×Ｂ及びＣ×Ｂ）のｃＬＣヘテロＦｃの発現レベル（馴化培地１リットル当たりのｍｇで算出したＰｒｏＡ収率によって示す）。破線は６０ｍｇ／Ｌを強調する。Ｆ）ｃＬＣヘテロＦｃの、それらの同族及び非同族抗原に対する相対結合親和性のヒートマッププロット。可溶性抗原Ａ、Ｂ又はＣに対する１０６個のｃＬＣヘテロＦｃｓと２２個の対応するｍＡｂの結合親和性（ＫＤ）を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔにより測定した。次いで、対応する同族及び非同族ＨＣ ｍＡｂのものと比較したｃＬＣヘテロＦｃの相対結合親和性を算出し、プロットした。Ｇ）ｎｃＣＳＡ実験の各段階における分子の数を示す逆ピラミッド図。 図５は、ｎｃＣＳＡによるｃＬＣヘテロＦｃのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）２つの二重特異性パネル（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）における１４４の非同族ＨＣ／ＬＣ対の相対発現。各非同族ＨＣ／ＬＣ対のＰｒｏＡ収率を、対応する同族ＨＣ／ＬＣ対（ｍＡｂ）対照の収率に対して正規化した。相対発現レベルが０．５超の非同族ＨＣ／ＬＣ対は、そのＬＣが対合する非同族ＨＣに対し無差別であり、同族ＨＣと一緒にｃＬＣヘテロＦｃを構築するために選択されることを示唆している。Ｂ）選択されたＰｒｏＡ精製非同族ＨＣ／ＬＣ対及びｍＡｂ対照を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分析し、Ａ２８０により測定して収率を決定した。Ｃ）２つの可能なｃＬＣヘテロＦｃの模式図。ＣＰＭは、ＣＨ３ドメインにおいて赤色及び青色のドットとして示す。Ｄ）及びＥ）２つの二重特異性パネル（それぞれＡ×Ｂ及びＣ×Ｂ）のｃＬＣヘテロＦｃの発現レベル（馴化培地１リットル当たりのｍｇで算出したＰｒｏＡ収率によって示す）。破線は６０ｍｇ／Ｌを強調する。Ｆ）ｃＬＣヘテロＦｃの、それらの同族及び非同族抗原に対する相対結合親和性のヒートマッププロット。可溶性抗原Ａ、Ｂ又はＣに対する１０６個のｃＬＣヘテロＦｃｓと２２個の対応するｍＡｂの結合親和性（ＫＤ）を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔにより測定した。次いで、対応する同族及び非同族ＨＣ ｍＡｂのものと比較したｃＬＣヘテロＦｃの相対結合親和性を算出し、プロットした。Ｇ）ｎｃＣＳＡ実験の各段階における分子の数を示す逆ピラミッド図。 図５は、ｎｃＣＳＡによるｃＬＣヘテロＦｃのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）２つの二重特異性パネル（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）における１４４の非同族ＨＣ／ＬＣ対の相対発現。各非同族ＨＣ／ＬＣ対のＰｒｏＡ収率を、対応する同族ＨＣ／ＬＣ対（ｍＡｂ）対照の収率に対して正規化した。相対発現レベルが０．５超の非同族ＨＣ／ＬＣ対は、そのＬＣが対合する非同族ＨＣに対し無差別であり、同族ＨＣと一緒にｃＬＣヘテロＦｃを構築するために選択されることを示唆している。Ｂ）選択されたＰｒｏＡ精製非同族ＨＣ／ＬＣ対及びｍＡｂ対照を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分析し、Ａ２８０により測定して収率を決定した。Ｃ）２つの可能なｃＬＣヘテロＦｃの模式図。ＣＰＭは、ＣＨ３ドメインにおいて赤色及び青色のドットとして示す。Ｄ）及びＥ）２つの二重特異性パネル（それぞれＡ×Ｂ及びＣ×Ｂ）のｃＬＣヘテロＦｃの発現レベル（馴化培地１リットル当たりのｍｇで算出したＰｒｏＡ収率によって示す）。破線は６０ｍｇ／Ｌを強調する。Ｆ）ｃＬＣヘテロＦｃの、それらの同族及び非同族抗原に対する相対結合親和性のヒートマッププロット。可溶性抗原Ａ、Ｂ又はＣに対する１０６個のｃＬＣヘテロＦｃｓと２２個の対応するｍＡｂの結合親和性（ＫＤ）を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔにより測定した。次いで、対応する同族及び非同族ＨＣ ｍＡｂのものと比較したｃＬＣヘテロＦｃの相対結合親和性を算出し、プロットした。Ｇ）ｎｃＣＳＡ実験の各段階における分子の数を示す逆ピラミッド図。 図５は、ｎｃＣＳＡによるｃＬＣヘテロＦｃのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）２つの二重特異性パネル（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）における１４４の非同族ＨＣ／ＬＣ対の相対発現。各非同族ＨＣ／ＬＣ対のＰｒｏＡ収率を、対応する同族ＨＣ／ＬＣ対（ｍＡｂ）対照の収率に対して正規化した。相対発現レベルが０．５超の非同族ＨＣ／ＬＣ対は、そのＬＣが対合する非同族ＨＣに対し無差別であり、同族ＨＣと一緒にｃＬＣヘテロＦｃを構築するために選択されることを示唆している。Ｂ）選択されたＰｒｏＡ精製非同族ＨＣ／ＬＣ対及びｍＡｂ対照を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分析し、Ａ２８０により測定して収率を決定した。Ｃ）２つの可能なｃＬＣヘテロＦｃの模式図。ＣＰＭは、ＣＨ３ドメインにおいて赤色及び青色のドットとして示す。Ｄ）及びＥ）２つの二重特異性パネル（それぞれＡ×Ｂ及びＣ×Ｂ）のｃＬＣヘテロＦｃの発現レベル（馴化培地１リットル当たりのｍｇで算出したＰｒｏＡ収率によって示す）。破線は６０ｍｇ／Ｌを強調する。Ｆ）ｃＬＣヘテロＦｃの、それらの同族及び非同族抗原に対する相対結合親和性のヒートマッププロット。可溶性抗原Ａ、Ｂ又はＣに対する１０６個のｃＬＣヘテロＦｃｓと２２個の対応するｍＡｂの結合親和性（ＫＤ）を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔにより測定した。次いで、対応する同族及び非同族ＨＣ ｍＡｂのものと比較したｃＬＣヘテロＦｃの相対結合親和性を算出し、プロットした。Ｇ）ｎｃＣＳＡ実験の各段階における分子の数を示す逆ピラミッド図。 図５は、ｎｃＣＳＡによるｃＬＣヘテロＦｃのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）２つの二重特異性パネル（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）における１４４の非同族ＨＣ／ＬＣ対の相対発現。各非同族ＨＣ／ＬＣ対のＰｒｏＡ収率を、対応する同族ＨＣ／ＬＣ対（ｍＡｂ）対照の収率に対して正規化した。相対発現レベルが０．５超の非同族ＨＣ／ＬＣ対は、そのＬＣが対合する非同族ＨＣに対し無差別であり、同族ＨＣと一緒にｃＬＣヘテロＦｃを構築するために選択されることを示唆している。Ｂ）選択されたＰｒｏＡ精製非同族ＨＣ／ＬＣ対及びｍＡｂ対照を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分析し、Ａ２８０により測定して収率を決定した。Ｃ）２つの可能なｃＬＣヘテロＦｃの模式図。ＣＰＭは、ＣＨ３ドメインにおいて赤色及び青色のドットとして示す。Ｄ）及びＥ）２つの二重特異性パネル（それぞれＡ×Ｂ及びＣ×Ｂ）のｃＬＣヘテロＦｃの発現レベル（馴化培地１リットル当たりのｍｇで算出したＰｒｏＡ収率によって示す）。破線は６０ｍｇ／Ｌを強調する。Ｆ）ｃＬＣヘテロＦｃの、それらの同族及び非同族抗原に対する相対結合親和性のヒートマッププロット。可溶性抗原Ａ、Ｂ又はＣに対する１０６個のｃＬＣヘテロＦｃｓと２２個の対応するｍＡｂの結合親和性（ＫＤ）を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔにより測定した。次いで、対応する同族及び非同族ＨＣ ｍＡｂのものと比較したｃＬＣヘテロＦｃの相対結合親和性を算出し、プロットした。Ｇ）ｎｃＣＳＡ実験の各段階における分子の数を示す逆ピラミッド図。 図５は、ｎｃＣＳＡによるｃＬＣヘテロＦｃのハイスループットスクリーニングを示す。Ａ）２つの二重特異性パネル（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）における１４４の非同族ＨＣ／ＬＣ対の相対発現。各非同族ＨＣ／ＬＣ対のＰｒｏＡ収率を、対応する同族ＨＣ／ＬＣ対（ｍＡｂ）対照の収率に対して正規化した。相対発現レベルが０．５超の非同族ＨＣ／ＬＣ対は、そのＬＣが対合する非同族ＨＣに対し無差別であり、同族ＨＣと一緒にｃＬＣヘテロＦｃを構築するために選択されることを示唆している。Ｂ）選択されたＰｒｏＡ精製非同族ＨＣ／ＬＣ対及びｍＡｂ対照を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分析し、Ａ２８０により測定して収率を決定した。Ｃ）２つの可能なｃＬＣヘテロＦｃの模式図。ＣＰＭは、ＣＨ３ドメインにおいて赤色及び青色のドットとして示す。Ｄ）及びＥ）２つの二重特異性パネル（それぞれＡ×Ｂ及びＣ×Ｂ）のｃＬＣヘテロＦｃの発現レベル（馴化培地１リットル当たりのｍｇで算出したＰｒｏＡ収率によって示す）。破線は６０ｍｇ／Ｌを強調する。Ｆ）ｃＬＣヘテロＦｃの、それらの同族及び非同族抗原に対する相対結合親和性のヒートマッププロット。可溶性抗原Ａ、Ｂ又はＣに対する１０６個のｃＬＣヘテロＦｃｓと２２個の対応するｍＡｂの結合親和性（ＫＤ）を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔにより測定した。次いで、対応する同族及び非同族ＨＣ ｍＡｂのものと比較したｃＬＣヘテロＦｃの相対結合親和性を算出し、プロットした。Ｇ）ｎｃＣＳＡ実験の各段階における分子の数を示す逆ピラミッド図。 図６は、２つの選択されたｃＬＣヘテロＦｃ分子の発現特性、精製特性及び結合特性を示す。Ａ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）とそれらの対応する親ｍＡｂの最終ＣＩＥＸ収率。Ｂ）Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｃ～Ｅ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）及びそれぞれの対照（２つのハイブリッドＩｇＧ（ＨＣ－Ａ２／ＬＣ－Ｂ４及びＨＣ－Ｃ４／ＬＣ－Ｂ３）及び２つの親ｍＡｂ（Ｂ４及びＢ３））の結合動態。全ての結合動態センサーグラムは、１：１結合モデルに対する全体的適合で重ね合わせたデータを示す。抗原Ｃへの弱い結合は急速な平衡であり、曲率の欠如により、反復測定での分散が大きくなる。結合親和性（ＫＤ）は、３つの独立した測定値から平均±ＳＤとして算出した。 図６は、２つの選択されたｃＬＣヘテロＦｃ分子の発現特性、精製特性及び結合特性を示す。Ａ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）とそれらの対応する親ｍＡｂの最終ＣＩＥＸ収率。Ｂ）Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｃ～Ｅ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）及びそれぞれの対照（２つのハイブリッドＩｇＧ（ＨＣ－Ａ２／ＬＣ－Ｂ４及びＨＣ－Ｃ４／ＬＣ－Ｂ３）及び２つの親ｍＡｂ（Ｂ４及びＢ３））の結合動態。全ての結合動態センサーグラムは、１：１結合モデルに対する全体的適合で重ね合わせたデータを示す。抗原Ｃへの弱い結合は急速な平衡であり、曲率の欠如により、反復測定での分散が大きくなる。結合親和性（ＫＤ）は、３つの独立した測定値から平均±ＳＤとして算出した。 図６は、２つの選択されたｃＬＣヘテロＦｃ分子の発現特性、精製特性及び結合特性を示す。Ａ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）とそれらの対応する親ｍＡｂの最終ＣＩＥＸ収率。Ｂ）Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｃ～Ｅ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）及びそれぞれの対照（２つのハイブリッドＩｇＧ（ＨＣ－Ａ２／ＬＣ－Ｂ４及びＨＣ－Ｃ４／ＬＣ－Ｂ３）及び２つの親ｍＡｂ（Ｂ４及びＢ３））の結合動態。全ての結合動態センサーグラムは、１：１結合モデルに対する全体的適合で重ね合わせたデータを示す。抗原Ｃへの弱い結合は急速な平衡であり、曲率の欠如により、反復測定での分散が大きくなる。結合親和性（ＫＤ）は、３つの独立した測定値から平均±ＳＤとして算出した。 図６は、２つの選択されたｃＬＣヘテロＦｃ分子の発現特性、精製特性及び結合特性を示す。Ａ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）とそれらの対応する親ｍＡｂの最終ＣＩＥＸ収率。Ｂ）Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｃ～Ｅ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）及びそれぞれの対照（２つのハイブリッドＩｇＧ（ＨＣ－Ａ２／ＬＣ－Ｂ４及びＨＣ－Ｃ４／ＬＣ－Ｂ３）及び２つの親ｍＡｂ（Ｂ４及びＢ３））の結合動態。全ての結合動態センサーグラムは、１：１結合モデルに対する全体的適合で重ね合わせたデータを示す。抗原Ｃへの弱い結合は急速な平衡であり、曲率の欠如により、反復測定での分散が大きくなる。結合親和性（ＫＤ）は、３つの独立した測定値から平均±ＳＤとして算出した。 図６は、２つの選択されたｃＬＣヘテロＦｃ分子の発現特性、精製特性及び結合特性を示す。Ａ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）とそれらの対応する親ｍＡｂの最終ＣＩＥＸ収率。Ｂ）Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３のＣＩＥＸクロマトグラフ。Ｃ～Ｅ）２つのｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）及びそれぞれの対照（２つのハイブリッドＩｇＧ（ＨＣ－Ａ２／ＬＣ－Ｂ４及びＨＣ－Ｃ４／ＬＣ－Ｂ３）及び２つの親ｍＡｂ（Ｂ４及びＢ３））の結合動態。全ての結合動態センサーグラムは、１：１結合モデルに対する全体的適合で重ね合わせたデータを示す。抗原Ｃへの弱い結合は急速な平衡であり、曲率の欠如により、反復測定での分散が大きくなる。結合親和性（ＫＤ）は、３つの独立した測定値から平均±ＳＤとして算出した。 図７は、多重特異性抗体コンストラクトモジュールを示す。 図８は、３２個の４本鎖ヘテロＦｃ及び対応する親ｍＡｂの精製及び分析の概要を示す。 図９は、２つの二重特異性プログラム（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）における１４４の非同族ＨＣ／ＬＣ対の相対的発現を示す。各非同族ＨＣ／ＬＣ対のＰｒｏＡ収率を、対応する同族ＨＣ／ＬＣ対（ｍＡｂ）対照の収率に対して正規化し、プロットした。 図１０は、非競合ＣＳＡ実験における非同族ＨＣ／ＬＣ対及び親ｍＡｂ（灰色で強調表示）の発現を示す。 図１０は、非競合ＣＳＡ実験における非同族ＨＣ／ＬＣ対及び親ｍＡｂ（灰色で強調表示）の発現を示す。 図１０は、非競合ＣＳＡ実験における非同族ＨＣ／ＬＣ対及び親ｍＡｂ（灰色で強調表示）の発現を示す。 図１０は、非競合ＣＳＡ実験における非同族ＨＣ／ＬＣ対及び親ｍＡｂ（灰色で強調表示）の発現を示す。 図１１は、抗標的Ｃ親ｍＡｂの発現を示す。 図１２は、２つの二重特異性プログラム（Ａ×Ｂ（Ａ）及びＣ×Ｂ（Ｂ））についての、ＰｒｏＡ精製ｃＬＣヘテロＩｇＧの高分解能ＬＣ－ＭＳ分析を示す。正しいＭＷを有するＩｇＧ種の割合をＬＣ－ＭＳデータから算出し、プロットした。ｃＬＣヘテロＩｇＧ及び４本鎖ヘテロＩｇＧの平均値（図３Ｃ）を破線で強調表示する。 図１２は、２つの二重特異性プログラム（Ａ×Ｂ（Ａ）及びＣ×Ｂ（Ｂ））についての、ＰｒｏＡ精製ｃＬＣヘテロＩｇＧの高分解能ＬＣ－ＭＳ分析を示す。正しいＭＷを有するＩｇＧ種の割合をＬＣ－ＭＳデータから算出し、プロットした。ｃＬＣヘテロＩｇＧ及び４本鎖ヘテロＩｇＧの平均値（図３Ｃ）を破線で強調表示する。 図１３は、親ｍＡｂのそれらの対応する抗原への結合動態を示す。 図１３は、親ｍＡｂのそれらの対応する抗原への結合動態を示す。 図１４は、２つのｃＬＣヘテロＩｇＧ及びそれらの親ｍＡｂの精製及び分析の概要を示す。 図１５は、単一細胞における２つの異なるＨＣ及び２つの異なるＬＣの共発現後の、１つの正しく構築されたＩｇＧ種及び９つの誤対合ＩｇＧ種の模式図を示す。 図１６は、競合ＣＳＡ実験における親ｍＡｂ及び４本鎖ヘテロＩｇＧの発現を示す。Ａ）非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによるＰｒｏＡ精製タンパク質の分析。Ｂ）ＰｒｏＡ精製工程後の１リットル当たりのミリグラムで示すタンパク質発現レベルの分析。 図１６は、競合ＣＳＡ実験における親ｍＡｂ及び４本鎖ヘテロＩｇＧの発現を示す。Ａ）非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによるＰｒｏＡ精製タンパク質の分析。Ｂ）ＰｒｏＡ精製工程後の１リットル当たりのミリグラムで示すタンパク質発現レベルの分析。 図１７は、親ｍＡｂと比較した４本鎖ヘテロＩｇＧの相対結合親和性を示す。１１種のＳＰ精製ヘテロＩｇＧ及びそれらの対応するｍＡｂの可溶性抗原Ａ及び／又は抗原Ｂに対する結合親和性（ＫＤ）を、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔによって測定した。次いで、対応する親ｍＡｂと比較したヘテロＩｇＧの相対結合親和性を算出し、プロットした。
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者であれば、単なる通例的な実験により、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか又は確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明に包含されることが意図されている。
用語「及び／又は」は、本明細書のいずれの箇所で使用される場合でも、「及び」、「又は」及び「前記用語によって接続される要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
用語「約」又は「略」は、本明細書で使用する場合、所与の値又は範囲の±２０％以内、好ましくは±１５％以内、より好ましくは±１０％以内及び最も好ましくは±５％以内を意味する。
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、述べられる整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。本明細書で使用する場合、用語「含む」は、用語「含有する」若しくは「包含する」又は本明細書で使用する場合にはときに用語「有する」と置き換えることができる。
本明細書で使用する場合、「～からなる」は、請求項の要素で特定されていない要素、工程又は成分は全て除外する。本明細書で使用する場合、「～から実質的になる」は、請求項の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。
本明細書では、各場合において、「含む」、「～から実質的になる」及び「～からなる」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかに置き換えられてもよい。
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合タンパク質」は、１つ又は複数の標的抗原に特異的に結合するタンパク質を指す。抗原結合タンパク質には、抗体及びその機能的断片を含めることができる。「機能的抗体断片」とは、完全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、それでもなお抗原に特異的に結合することができる、抗体の一部である。機能的抗体断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられるが、これらに限定されず、また、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、又はラクダ科の動物などの任意の哺乳動物源に由来するものとすることができる。機能的抗体断片は、標的抗原の結合について、インタクトな抗体と比肩することができ、断片は、インタクトな抗体の改変（例えば、酵素的又は化学的切断）によって生成され得るか、又は組換えＤＮＡ技術又はペプチド合成を使用して新規に合成され得る。
抗原結合タンパク質はまた、単一のポリペプチド鎖又は複数のポリペプチド鎖に組み込まれた１つ又は複数の機能的抗体断片を含むタンパク質を含むこともできる。例えば、抗原結合タンパク質としては、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：６４４４－６４４８，１９９３を参照）；細胞内抗体；ドメイン抗体（単一ＶＬ若しくはＶＨドメイン、又はペプチドリンカーによって結合した２つ以上のＶＨドメイン；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４１：５４４－５４６，１９８９を参照）；マキシボディ（Ｆｃ領域に融合した２つのｓｃＦｖ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１７：９５－１０６，２００４、及びＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２５１：１２３－１３５，２００１を参照）；トリアボディ；テトラボディ；ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合したｓｃＦｖ；Ｏｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，Ｖｏｌ．１７：３１５－２３，２００４を参照）；ペプチボディ（Ｆｃ領域に付着した１つ又は複数のペプチド、国際公開第００／２４７８２号パンフレットを参照）；線状抗体（相補的軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．８：１０５７－１０６２，１９９５を参照）；小モジュラー免疫薬（米国特許出願公開第２００３０１３３９３９号明細書を参照）；及び免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＶＨ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ＶＨ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
「多重特異性」とは、抗原結合タンパク質が、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合することができることを意味する。「二重特異性」とは、抗原結合タンパク質が、２つの異なる抗原に特異的に結合することができることを意味する。本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質は、類似の結合アッセイ条件下で、他の無関係なタンパク質に対するその親和性と比較して、標的抗原に対して有意に高い結合親和性を有し、その結果、その抗原を識別することができる場合に、標的抗原に「特異的に結合する」。抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、平衡解離定数（ＫＤ）≦１×１０－６Ｍを有し得る。抗原結合タンパク質は、ＫＤが≦１×１０－８Ｍである場合に「高親和性」をもって抗原に特異的に結合する。
親和性は様々な技術を使用して決定され、その一例は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイである。様々な実施形態では、親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）によるアッセイ）によって決定される。この方法を使用して、会合速度定数（ｋａ、単位：Ｍ－１ｓ－１）及び解離速度定数（ｋｄ、単位：ｓ－１）を測定することができる。次いで、平衡解離定数（ＫＤ、単位：Ｍ）を、運動速度定数の比（ｋｄ／ｋａ）から算出することができる。いくつかの実施形態では、親和性は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８に記載されているような結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）などの速度論的方法によって決定される。ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いて、平衡解離定数（ＫＤ、単位：Ｍ）及び会合速度定数（ｋａ、単位：Ｍ－１ｓ－１）を測定することができる。解離速度定数（ｋｄ、単位：ｓ－１）は、これらの値（ＫＤ×ｋａ）から算出することができる。他の実施形態では、親和性は、平衡／溶液法によって決定される。ある特定の実施形態では、親和性は、ＦＡＣＳ結合アッセイによって決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質は、ｋｄ（解離速度定数）によって測定される結合親和力が、約１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０ｓ－１以下（値が低いほど結合親和力が高いことを示す）、及び／又はＫＤ（平衡解離定数）によって測定される結合親和性が、約１０－９、１０－１０、１０－１１、１０－１２、１０－１３、１０－１４、１０－１５、１０－１６Ｍ以下（値が低いほど結合親和性が高いことを示す）などの望ましい特性を示す。
本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」と互換的に使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原と相互作用し、その抗原に対する特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合タンパク質の領域を指す。
本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも呼ばれる）を指す。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。「ＣＤＲ領域」という用語は、本明細書で使用する場合、単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲ（すなわち、３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）の群を指す。２つの鎖の各々におけるＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列させられ、標的タンパク質の特異的エピトープ又はドメインと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、天然に存在する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は両方とも、通常、以下のこれらの要素の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４と一致する。これらのドメインの各々において位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための付番方式が考案されている。この付番方式は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）又はＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３に定義されている。所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、このシステムを使用して同定され得る。
本発明の多重特異性抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態では、結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はナノボディを含む。一実施形態では、両方の結合ドメインがＦａｂ断片である。別の実施形態では、１つの結合ドメインはＦａｂ断片であり、他方の結合ドメインはｓｃＦｖである。
抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同じ抗原結合性断片（その各々が単一の抗原結合部位を有する）及び残部の「Ｆｃ」断片（免疫グロブリン定常領域を含有する）が産生される。Ｆａｂ断片は、可変ドメイン、並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）の全てを含有する。このように、「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））並びに１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆｃ断片は炭水化物を示し、抗体の１つのクラスを別のクラスから識別する多くの抗体エフェクター機能（結合補体及び細胞受容体など）に関与する。「Ｆｄ断片」は、免疫グロブリン重鎖に由来するＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆｄ断片は、Ｆａｂ断片の重鎖成分を表す。
「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１ドメインのＣ末端に、抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片である。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域で、重鎖間のジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片である。
「Ｆｖ」断片は、抗体由来の完全抗原認識及び結合部位を含有する最小の断片である。この断片は、緊密な非共有会合での、１つの免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）の二量体からなる。この構成において、各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定する。単一の軽鎖又は重鎖の可変領域（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖ断片の半分）は、抗原を認識し、結合する能力を有するが、ＶＨ及びＶＬの両方を含む結合部位全体よりも親和性は低い。
「単鎖可変抗体断片」又は「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在し、任意選択により、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするペプチドリンカーを、ＶＨ領域とＶＬ領域の間に含む（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４２：４２３－４２６，１９８８；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５：５８７９－５８８３，１９８８を参照）。
本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の特定の実施形態では、結合ドメインは、所望の抗原に特異的に結合する抗体又は抗体断片の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
本明細書において「可変ドメイン」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））と互換的に使用される「可変領域」は、抗体の抗原への結合に直接関与する、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖のそれぞれにおける領域を指す。上記のように、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域は、同じ一般構造を有し、各領域は４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、それらの配列は、広範に保存され、３つのＣＤＲによって連結されている。フレームワーク領域は、β－シート構造を採用し、ＣＤＲは、ベータ－シート構造を連結するループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造中に保持され、他方の鎖のＣＤＲとともに抗原結合部位を形成する。
標的抗原に特異的に結合する結合ドメインは、ａ）これらの抗原に対する既知の抗体、又はｂ）抗原タンパク質若しくはその断片を使用する新規な免疫化法により、ファージディスプレイにより、又は他の常法により得られる新規な抗体若しくは抗体断片に由来するものとすることができる。多重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源である抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体とすることができる。ある特定の実施形態では、結合ドメインの起源である抗体は、モノクローナル抗体である。これらの及び他の実施形態では、抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型のものとすることができる。
「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能性のある天然の変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、通常、様々なエピトープに対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、個別の抗原部位又はエピトープに対するものである。モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られる任意の技術を使用して、例えば、免疫化スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって産生することができる。脾臓細胞は、当該技術分野において知られる任意の技術を使用して、例えば、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生することによって不死化することができる。ハイブリドーマを産生する融合手順において使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体産生性であり、融合効率が高く、酵素が欠損しているため、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持するある特定の選択培地の中では増殖が不可能である。マウス融合における使用に好適な細胞株の例としては、Ｓｐ－２０、Ｐ３－Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０－Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ－１１、ＭＰＣ１１－Ｘ４５－ＧＴＧ １．７及びＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合において使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３－Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ－２６６、ＧＭ１５００－ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ－ＬＯＮ－ＨＭｙ２及びＵＣ７２９－６である。
いくつかの例では、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）を標的抗原で免疫化し、免疫化した動物から脾臓細胞を採取し、採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合し、それにより、ハイブリドーマ細胞を生成し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、ハイブリドーマ細胞株が産生される。
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において知られる任意の技術、例えば、プロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどを使用して精製することができる。ハイブリドーマ又はｍＡｂｓをさらにスクリーニングして、例えば、標的抗原を発現している細胞に結合する能力、標的抗原リガンドが、そのそれぞれの受容体への結合をブロック若しくは妨害する能力、又は受容体のいずれもを機能的にブロックする能力など、特定の性質を有するｍＡｂｓを、例えば、ｃＡＭＰアッセイを使用して同定することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインは、ヒト化抗体に由来するものであり得る。「ヒト化抗体」は、領域（例えば、フレームワーク領域）が、対応するヒト免疫グロブリン由来の領域を含むように改変された抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、最初に非ヒト動物で作られたモノクローナル抗体から産生することができる。典型的には、抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体のある特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同となるように改変される。ヒト化は、例えば、種々の方法を用いて、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより行うことができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び米国特許第５，６９３，７６２号明細書、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２：３２３－２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９：１５３４－１５３６，１９８８を参照）。別の種において生成された抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲを、コンセンサスヒトＦＲにグラフト化することができる。コンセンサスヒトＦＲを作り出すために、複数のヒト重鎖アミノ酸配列又はヒト軽鎖アミノ酸配列に由来するＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を同定することができる。
本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源とすることができる標的抗原に対して生成される新規な抗体は、完全ヒト抗体とすることができる。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来するか、又はそれを示す、可変領域及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体の産生を実施するために提供される１つの具体的な手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性のＩｇ遺伝子が不活性化されたマウスに、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することは、任意の所望の抗原で免疫化することができる動物であるマウスにおいて、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生させる一手段である。完全ヒト抗体を使用すると、マウスのｍＡｂ又はマウス由来のｍＡｂを治療剤としてヒトに投与することによって生じることがあり得る免疫原性及びアレルギー性の応答を最小化することができる。
完全ヒト抗体は、内因性の免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫化することによって産生することができる。この目的のための抗原は、通常、６つ以上の連続アミノ酸を有し、任意選択により、担体にコンジュゲートされる（ハプテンなど）。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１－２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。そのような方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性のマウス免疫グロブリン遺伝子座を無能化し、ヒト重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大型断片をマウスゲノムに挿入することによって作製される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補体より少ない補体を有する部分的に修飾された動物を交雑して、所望の免疫系修飾を全て有する動物を得る。免疫原が投与されると、これらのトランスジェニック動物は、その免疫原に免疫特異性があるが、可変領域を含めて、マウスのアミノ酸配列ではなく、ヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。そのような方法の追加詳細については、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び国際公開第９４／０２６０２号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関連するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，７１３，６１０号明細書、米国特許第６，６７３，９８６号明細書、米国特許第６，１６２，９６３号明細書、米国特許第５，９３９，５９８号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，３００，１２９号明細書、米国特許第６，２５５，４５８号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、及び米国特許第５，５４５，８０６号明細書、ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３０４９８号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、並びに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書に記載されている。
本明細書中で「ＨｕＭａｂ」マウスと称される上記のトランスジェニックマウスは、内因性のミュー及びカッパ鎖遺伝子座を不活化する標的変異とともに、再配列されていないヒト重鎖（ミュー及びガンマ）及びカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭ又はカッパの発現の引下げを示し、且つ免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧカッパモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６）。ＨｕＭａｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７－６２９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７－６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２－２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９－１０１；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９－５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－８５１に詳細に記載されており、これらの文献は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、及び米国特許第５，７７０，４２９号明細書、並びに米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４６号パンフレット、及び国際公開第９２／０３９１８号パンフレットを参照されたい（これらの全ての開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。こうしたトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の生成に利用される技術は、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６においても開示されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
ヒト由来抗体は、また、ファージディスプレイ技術を使用して生成することができる。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、及びＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０－６４５４（１９９０）に記載されており、これらの各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって生成される抗体は、通常、細菌において、抗原結合断片、例えばＦｖ又はＦａｂ断片として生成され、したがってエフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、２つの戦略のうち１つによって導入することができる。断片を操作して、必要に応じて、哺乳動物細胞内で発現する完全な抗体にすることも、エフェクター機能をトリガーすることができる第２の結合部位を有する多重特異性抗体断片にすることもできる。通常、抗体のＦｄ断片（ＶＨ－ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）は、ＰＣＲによって別々にクローン化され、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーにおいてランダムに組換えられ、その後、特定の抗原に結合するために選択することができる。抗体断片はファージ表面に発現し、Ｆｖ又はＦａｂ（したがって抗体断片をコードするＤＮＡを含有するファージ）の抗原結合による選択は、パニングと呼ばれる手順である抗原結合及び再増幅を数ラウンド行うことによって実現される。抗原に特異的な抗体断片は濃縮され、最終的に単離される。ファージディスプレイ技術はまた、「ガイデッドセレクション（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにおいて使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９－９０３（１９９４）を参照）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片は、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示され得、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーは、抗原を用いて選択され得る。これにより、マウスＦｄ断片は、選択を誘導するテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わされる。得られたライブラリーの選択により、完全なヒトＦａｂが得られる。
ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は抗体である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）及び２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０～７０ｋＤａ）を含む四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。用語「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端までに、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）とすることができる。「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」という用語は、アミノ末端からカルボキシル末端までに、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）及び任意選択により、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）及びイプシロン（ε）として分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラス抗体及びＩｇＡクラス抗体は、サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２に、それぞれさらに分けられる。ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、及びＩｇＤ抗体の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有し、ＩｇＭ抗体及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（すなわち、軽鎖と重鎖との間）、及び抗体重鎖のヒンジ領域間の、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して連結されている。
特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、ヘテロ二量体の抗体（本明細書では「ヘテロ免疫グロブリン」又は「ヘテロＩｇ」と互換的に使用される）であり、これは２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖を含む抗体を指す。
ヘテロ二量体の抗体は、任意の免疫グロブリン定常領域を含むことができる。「定常領域」という用語は、本明細書で使用する場合、可変領域以外の抗体の全てのドメインを指す。定常領域は、抗原の結合に直接には関与しないが、種々のエフェクター機能を発揮する。上記のように、抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、特定のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）及びサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域、例えば、５つの抗体アイソタイプ全てに見出されるヒトのカッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域とすることができる。
ヘテロ二量体の抗体の重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型の重鎖定常領域、例えば、ヒトのアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型の重鎖定常領域とすることができる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。一実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。
用語「抗体コンストラクト」は、その構造及び／又は機能が抗体、例えば完全長又は完全免疫グロブリン分子の構造及び／又は機能に基づく分子を指す。したがって、抗体コンストラクトは、その特異的な標的又は抗原に結合することができる。さらに、本発明による抗体コンストラクトは、標的結合を可能にする抗体の最小限の構造要件を含む。この最小限の要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在により定義され得る。本発明によるコンストラクトが基づく抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体が含まれる。「多重特異性抗体コンストラクト」は、２つ以上の抗原に結合するか、又は単一の抗原の複数のエピトープに結合することができる抗体コンストラクトである。
「抗体コンストラクトモジュール」は、抗体コンストラクトの全体的な設計を指し、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は「ｒ ＩｇＧ」（「半抗体」）などの完全長抗体の断片を含むことできる。本発明による抗体コンストラクトモジュールはまた、ｓｃＦｖ、ジ－ｓｃＦｖ又はビ（ス）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、以下の：（ＶＨ－ＶＬ－ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ－ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３）又は（ｓｃＦｖ－ＣＨ３－ｓｃＦｖ）２のような構造により例示される「ミニボディ」、トリアボディ又はテトラボディなどのマルチボディ、及び、他のＶ領域又はドメインと無関係に抗原又はエピトープに特異的に結合する、ＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬであり得る１つの可変ドメインのみを含むナノボディ又は単一可変ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体などの、抗体バリアントとも呼ばれる抗体の改変された断片であってもよい。「多重特異性抗体コンストラクトモジュール」は、２つ以上の抗原に結合するか、又は単一の抗原の複数のエピトープに結合する抗体コンストラクトモジュールである。非限定的な例を図７に示す。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む。
明確にするために、「多重特異性抗体コンストラクト」は１つの特定の分子を指し、一方「多重特異性抗体コンストラクトモジュール」は多重特異性抗体コンストラクトの全体的な設計を指す。例えば、各抗体コンストラクトエレメントは、相互に、及び任意のＦｃ領域に関係して位置する。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆｃ部分を含む。そのようなＦｃ部分は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。そのようなＦｃ部分はまた、単鎖Ｆｃ（「ｓｃＦｃ」）であってもよく、又は代わりに、２つの別個のポリペプチドによって形成されてもよい。
一実施形態では、本開示の多重特異性抗体はＤｕｏｂｏｄｙ（商標）である。Ｄｕｏｂｏｄｙは、ＤｕｏＢｏｄｙ（商標）テクノロジープラットフォーム（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）によって、例えば、国際公開第２００８／１１９３５３号パンフレット、国際公開第２０１１／１３１７４６号パンフレット、国際公開第２０１１／１４７９８６号パンフレット、及び国際公開第２０１３／０６０８６７号パンフレット、Ｌａｂｒｉｊｎ Ａ Ｆ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１０（１３）：５１４５－５１５０（２０１３）、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，５（６）：９６２－９７３（２０１３）、並びにＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，９（１０）：２４５０－２４６３（２０１４）に記載されているように作製することができる。この技術を使用して、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含有する第１の単一特異性抗体の半分を、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含有する第２の単一特異性抗体の半分と組み合わせることができる。得られるヘテロ二量体は、第１の抗体に由来する１つの重鎖及び１つの軽鎖と、第２の抗体に由来する１つの重鎖及び１つの軽鎖とを対にして含有する。両方の単一特異性抗体が異なる抗原の異なるエピトープを認識する場合、得られるヘテロ二量体は二重特異性抗体である。
ＤｕｏＢｏｄｙ（商標）プラットフォームについては、単一特異性抗体のそれぞれは、重鎖中に単一の点変異を有する重鎖定常領域を含む。これらの点変異により、得られる多重特異性抗体の重鎖間では、変異のない単一特異性抗体のいずれかの重鎖間よりも、強い相互作用が可能になる。各単一特異性抗体の単一の点変異は、重鎖定常領域の重鎖中の３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位又は４０９位（ＥＵ付番）の残基とすることができる（国際公開第２０１１／１３１７４６号パンフレットを参照）。さらに、単一の点変異は、１つの単一特異性抗体の中で、他方の単一特異性抗体に対して異なる残基に位置する。例えば、１つの単一特異性抗体は、変異Ｆ４０５Ｌ（ＥＵ付番；４０５位の残基でのフェニルアラニンからロイシンへの変異）、又はＦ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｄ、Ｆ４０５Ｅ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｋ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｎ、Ｆ４０５Ｑ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｗ及びＦ４０５Ｙの変異のうち１つを含むことができ、他方の単一特異性抗体は、変異Ｋ４０９Ｒ（ＥＵ付番；４０９位の残基でのリシンからアルギニンへの変異）を含むことができる。単一特異性抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）とすることができ、ＤｕｏＢｏｄｙ（商標）技術によって生成される多重特異性抗体は、改変されて、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を変化（例えば、低減）させ、且つ／又は半減期を改善することができる。Ｄｕｏｂｏｄｙ（商標）を作製する一方法は、以下を含む：（ｉ）単一の一致する点変異（すなわち、Ｋ４０９Ｒと、Ｆ４０５Ｌ（又はＦ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｄ、Ｆ４０５Ｅ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｋ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｎ、Ｆ４０５Ｑ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｗ及びＦ４０５Ｙの変異のうちの１つ）（ＥＵ付番））を重鎖中に含有する２つの親ＩｇＧ１を個別に発現させる工程；（ｉｉ）インビトロにて許容酸化還元条件下で親ＩｇＧ１を混合して、半分子の組換えを可能にする工程；（ｉｉｉ）還元剤を除去して、鎖間ジスルフィド結合を再酸化させる工程；及び（ｉｖ）クロマトグラフィー又は質量分析（ＭＳ）による方法を使用して、交換効率及び最終産物を分析する工程（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，９（１０）：２４５０－２４６３（２０１４）を参照）。
多重特異性抗体を作製する別の例示的な方法は、ノブ・イントゥ・ホール技術（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９：６１７－６２１（１９９６）；国際公開第２００６／０２８９３６号パンフレット）によるものである。多重特異性抗体を作製するための主要な欠点であるＩｇ重鎖の誤対合の問題は、この技術において、ＩｇＧ中の重鎖の界面を形成する選択されたアミノ酸を変異させることによって低減される。２つの重鎖が直接的に相互作用する重鎖内の位置で、小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が一方の重鎖の配列に導入され、大きい側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が他方の重鎖の、相手として相互作用する残基の位置に導入される。いくつかの例では、本開示の抗体は、多重特異性抗体を優先的に形成するために、２つのポリペプチド間の界面で相互作用する選択されたアミノ酸を変異させることによって重鎖が改変された免疫グロブリン鎖を有する。多重特異性抗体は、同じサブクラス又は異なるサブクラスの免疫グロブリン鎖から構成され得る。一例では、ｇｐ１２０及びＣＤ３に結合する多重特異性抗体は、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ付番）変異を「ノブ鎖」に含み、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（ＥＵ付番）の変異を「ホール鎖」に含む。ある特定の実施形態では、例えば、Ｙ３４９Ｃ変異を「ノブ鎖」に導入し、Ｅ３５６Ｃ変異又はＳ３５４Ｃ変異を「ホール鎖」に導入することによって、追加の鎖間ジスルフィド架橋が重鎖間に導入される。ある特定の実施形態では、Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅの変異が「ノブ鎖」に導入され、Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋの各変異が「ホール鎖」に導入される。他の実施形態では、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの変異が鎖の一方に導入され、Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異が相手側の鎖に導入される。いくつかの実施形態では、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの変異が一方の鎖に導入され、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異が相手側の鎖に導入される。いくつかの実施形態では、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの各変異が一方の鎖に導入され、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異が相手側の鎖に導入される。さらに他の実施形態では、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの変異が一方の鎖に導入され、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異が相手側の鎖に導入される（全てＥＵ付番）。
多重特異性抗体を作製するさらに別の方法は、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術である。ＣｒｏｓｓＭａｂは、２つの完全長抗体の各半分で構成されるキメラ抗体である。この技術は、鎖を正しく対合させるために、次の２つの技術を組み合わせている：（ｉ）２つの重鎖間の正しい対合に有利なノブ・イントゥ・ホール；及び（ｉｉ）軽鎖の誤対合を回避する非対称を導入するための、２つのＦａｂのうち一方の重鎖と軽鎖との間の交換。Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９：６１７－６２１（１９９６）；Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０８：１１１８７－１１１９２（２０１１）を参照されたい。ＣｒｏｓｓＭａｂは、２つ以上の標的を標的とするために、又は２：１形態などの１つの標的に対して二価性を導入するために、２つ以上の抗原－結合ドメインを組み合わせることができる。
特定の重鎖とその同族の軽鎖との会合を促進するために、重鎖及び軽鎖の両方は、相補的アミノ酸置換を含有し得る。本明細書で使用する場合、「相補的アミノ酸置換」とは、一方の鎖における正荷電アミノ酸への置換と、他方の鎖における負荷電アミノ酸置換とを対にすることを指す。例えば、いくつかの実施形態では、重鎖は、荷電アミノ酸を導入するために少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、対応する軽鎖は、荷電アミノ酸を導入するために少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、重鎖に導入される荷電アミノ酸は、軽鎖に導入されるアミノ酸の反対の電荷を有する。ある特定の実施形態では、１つ又は複数の正荷電残基（例えば、リシン、ヒスチジン又はアルギニン）を、第１の軽鎖（ＬＣ１）に導入することができ、１つ又は複数の負荷電残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を、対になる重鎖（ＨＣ１）に、ＬＣ１／ＨＣ１の結合界面で導入することができ、一方、１つ又は複数の負荷電残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を、第２の軽鎖（ＬＣ２）に導入することができ、１つ又は複数の正荷電残基（例えば、リシン、ヒスチジン又はアルギニン）を、対になる重鎖（ＨＣ２）に、ＬＣ２／ＨＣ２の結合界面で導入することができる。静電相互作用は、界面で反対に荷電した残基（極性）が引き合うため、ＬＣ１をＨＣ１と対合させ、且つＬＣ２をＨＣ２と対合させるように誘導する。界面で同じ荷電残基（極性）を有する重鎖／軽鎖の対（例えば、ＬＣ１／ＨＣ２及びＬＣ２／ＨＣ１）は、反発し、結果として所望しないＨＣ／ＬＣの対合が抑制される。
これらの及び他の実施形態では、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の正荷電アミノ酸が、１つ又は複数の負荷電アミノ酸で置換される。或いは、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の負荷電アミノ酸が、１つ又は複数の正荷電アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｌ１２８、Ａ１４１、Ｌ１４５、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｈ１６８、Ｆ１７０、Ｐ１７１、Ｖ１７３、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｓ１８３、Ｖ１８５及びＫ２１３から選択されるＥＵ位置でのヘテロ二量体の抗体中の第１の及び／又は第２の重鎖のＣＨ１ドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸は、荷電アミノ酸で置換される。ある特定の実施形態では、負荷電又は正荷電のアミノ酸で置換するのに好ましい残基はＳ１８３（ＥＵ付番方式）である。いくつかの実施形態では、Ｓ１８３は正荷電アミノ酸で置換される。代替的な実施形態では、Ｓ１８３は負荷電アミノ酸で置換される。例えば、一実施形態では、Ｓ１８３は、第１の重鎖において負荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１８３Ｅ）で置換され、Ｓ１８３は、第２の重鎖において正荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１８３Ｋ）で置換される。
軽鎖がカッパ軽鎖である実施形態では、Ｆ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２３、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｎ１３７、Ｎ１３８、Ｑ１６０、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７４及びＳ１７６から選択される位置（カッパ軽鎖におけるＥＵ及びＫａｂａｔ付番）の、ヘテロ二量体の抗体中の第１の及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸は、荷電アミノ酸で置換される。軽鎖がラムダ軽鎖である実施形態では、Ｔ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｅ１２３、Ｅ１２４、Ｋ１２９、Ｔ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１３７、Ｅ１６０、Ｔ１６２、Ｓ１６５、Ｑ１６７、Ａ１７４、Ｓ１７６及びＹ１７８から選択される位置（ラムダ鎖におけるＫａｂａｔ付番）の、ヘテロ二量体の抗体中の第１の及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸は、荷電アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、負荷電又は正荷電のアミノ酸で置換するのに好ましい残基は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかのＣＬドメインのＳ１７６（ＥＵ及びＫａｂａｔ付番方式）である。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、正荷電アミノ酸で置換される。代替的な実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、負荷電アミノ酸で置換される。一実施形態では、Ｓ１７６は、第１の軽鎖において正荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｋ）で置換され、Ｓ１７６は、第２の軽鎖において負荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｅ）で置換される。
ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおける相補的アミノ酸置換に加えて、又はその代替として、ヘテロ二量体の抗体中の軽鎖及び重鎖の可変領域は、荷電アミノ酸を導入するために１つ又は複数の相補的アミノ酸置換を含有していてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の抗体中の重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の正荷電アミノ酸が、１つ又は複数の負荷電アミノ酸で置換される。或いは、重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の負荷電アミノ酸は、１つ又は複数の正荷電アミノ酸で置換される。
ＶＨ領域内のＶ領域界面残基（すなわち、ＶＨ領域及びＶＬ領域のアセンブリを媒介するアミノ酸残基）には、Ｋａｂａｔの１位、３位、３５位、３７位、３９位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、５０位、５９位、８９位、９１位及び９３位が含まれる。ＶＨ領域中のこれらの界面残基のうち１つ又は複数は、荷電（正荷電又は負荷電）アミノ酸で置換することができる。ある特定の実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ３９位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸、例えば、リシンに置換される。代替的な実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ３９位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ３９位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸に置換され（例えば、Ｇ３９Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ３９位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸に置換される（例えば、Ｇ３９Ｋ）。いくつかの実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ４４位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸、例えば、リシンに置換される。代替的な実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ４４位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。ある特定の実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ４４位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸に置換され（例えば、Ｇ４４Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ４４位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸に置換される（例えば、Ｇ４４Ｋ）。
ＶＬ領域内のＶ領域界面残基（すなわち、ＶＨ領域及びＶＬ領域のアセンブリを媒介するアミノ酸残基）には、Ｋａｂａｔの３２位、３４位、３５位、３６位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４８位、４９位、５０位、５１位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、８５位、８７位、８９位、９０位、９１位及び１００位が含まれる。ＶＬ領域中の１つ又は複数の界面残基は、荷電アミノ酸、好ましくは、同族の重鎖のＶＨ領域に導入されたものと反対の電荷を有するアミノ酸で置換することができる。いくつかの実施形態では、第１の及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ１００位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸、例えば、リシンに置換される。代替的な実施形態では、第１の及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ１００位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。ある特定の実施形態では、第１の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ１００位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸に置換され（例えば、Ｇ１００Ｋ）、第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ１００位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸に置換される（例えば、Ｇ１００Ｅ）。
一実施形態では、第１のＦｃ領域は、４０９位及び３９２位に対応する残基に負に荷電したアミノ酸を含み、第２のＦｃ領域は３９９位及び３５６位に対応する残基に正に荷電したアミノ酸を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
一実施形態では、第１のＦｃ領域は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの変異を含み、第２のＦｃ領域は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋの変異を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
一実施形態では、第１のＦｃ領域は、４０９位、４３９位及び３９２位に対応する残基に負に荷電したアミノ酸を含み、第２のＦｃ領域は３９９位及び３５６位に対応する残基に正に荷電したアミノ酸を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
一実施形態では、第１のＦｃ領域は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ、Ｋ４３９Ｄ及びＫ３９２Ｄの変異を含み、第２のＦｃ領域は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋの変異を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
一実施形態では、一方のＦｃ領域は、Ｆ４０５Ｌ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｄ、Ｆ４０５Ｅ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｋ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｎ、Ｆ４０５Ｑ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｗ又はＦ４０５Ｙの変異を含み、他方のＦｃ領域は、Ｋ４０９Ｒ変異を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。一実施形態では、一方のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、他方のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。一実施形態では、一方のＦｃ領域は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅの変異を含み、他方のＦｃ領域は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋの変異を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
特定の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、３９２位及び４０９位に対応する残基に負荷電アミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄの置換）を含む第１のＦｃ領域、及び３５６位及び３９９位に対応する残基に正荷電アミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋの置換）を含む第２のＦｃ領域を含む。他の特定の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、３９２位、４０９位及び４３９位に対応する残基に負荷電アミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ及びＫ４３９Ｄの置換）を含む第１のＦｃ領域、及び３５６位及び３９９位に対応する残基に正荷電アミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋの置換）を含む第２のＦｃ領域を含む。他の特定の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、３９２位、４０９位及び３７０位に対応する残基に負荷電アミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄの置換）を含む第１のＦｃ領域、及び３５６位、３９９位及び３５７位に対応する残基に正荷電アミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ及びＤ３５７Ｋの置換）を含む第２のＦｃ領域を含む。
一実施形態では、一方のＦｃ領域は、Ｙ３４９Ｃ変異を含み、他方のＦｃ領域は、Ｅ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃの変異を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。一実施形態では、一方のＦｃ領域は、Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を含み、他方のＦｃ領域は、Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの変異を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。一実施形態では、一方のＦｃ領域は、Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を含み、他方のＦｃ領域は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異を含む（ここで、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う）。
ある特定の実施形態では、本発明のヘテロ二量体の抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖、並びに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、アミノ酸置換を１８３位（ＥＵ）、３９２位（ＥＵ）及び４０９位（ＥＵ）に含み、第２の重鎖は、アミノ酸置換を１８３位（ＥＵ）、３５６位（ＥＵ）及び３９９位（ＥＵ）に含み、第１の及び第２の軽鎖は、アミノ酸置換を１７６位（ＥＵ）に含み、アミノ酸置換は前記の各位置に荷電アミノ酸を導入する。関連する実施形態では、第１の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがリシンで置換され、第２の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の３９２位（ＥＵ）のリシンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の４０９位（ＥＵ）のリシンがアスパラギン酸で置換され、第２の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがリシンで置換され、第２の重鎖の３５６位（ＥＵ）のグルタミン酸がリシンで置換され、且つ／又は第２の重鎖の３９９位（ＥＵ）のアスパラギン酸がリシンで置換される。
ある特定の実施形態では、本発明のヘテロ二量体の抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖、並びに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、アミノ酸置換を１８３位（ＥＵ）、３９２位（ＥＵ）、４０９位（ＥＵ）及び４３９位（ＥＵ）に含み、第２の重鎖は、アミノ酸置換を１８３位（ＥＵ）、３５６位（ＥＵ）及び３９９位（ＥＵ）に含み、第１の及び第２の軽鎖は、アミノ酸置換を１７６位（ＥＵ）に含み、アミノ酸置換は前記の各位置に荷電アミノ酸を導入する。関連する実施形態では、第１の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがリシンで置換され、第２の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の３９２位（ＥＵ）のリシンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の４０９位（ＥＵ）のリシンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の４３９位（ＥＵ）のリシンがアスパラギン酸で置換され、第２の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがリシンで置換され、第２の重鎖の３５６位（ＥＵ）のグルタミン酸がリシンで置換され、且つ／又は第２の重鎖の３９９位（ＥＵ）のアスパラギン酸がリシンで置換される。
ある特定の実施形態では、本発明のヘテロ二量体の抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖、並びに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、アミノ酸置換を４４位（Ｋａｂａｔ）、１８３位（ＥＵ）、３９２位（ＥＵ）及び４０９位（ＥＵ）に含み、第２の重鎖は、アミノ酸置換を４４位（Ｋａｂａｔ）、１８３位（ＥＵ）、３５６位（ＥＵ）及び３９９位（ＥＵ）に含み、第１の及び第２の軽鎖は、アミノ酸置換を１００位（Ｋａｂａｔ）及び１７６位（ＥＵ）に含み、アミノ酸置換は前記の各位置に荷電アミノ酸を導入する。関連する実施形態では、第１の重鎖の４４位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがグルタミン酸で置換され、第２の重鎖の４４位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがリシンで置換され、第１の軽鎖の１００位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがリシンで置換され、第２の軽鎖の１００位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがグルタミン酸で置換され、第１の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがリシンで置換され、第２の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の３９２位（ＥＵ）のリシンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の４０９位（ＥＵ）のリシンがアスパラギン酸で置換され、第２の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがリシンで置換され、第２の重鎖の３５６位（ＥＵ）のグルタミン酸がリシンで置換され、且つ／又は第２の重鎖の３９９位（ＥＵ）のアスパラギン酸がリシンで置換される。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」という用語は、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成され得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択により、ＣＨ４ドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び貪食などのエフェクター機能を保持し得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、本明細書にさらに詳細に記載されるように、エフェクター機能を低減又は排除するように修飾される場合がある。
本発明の抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のカルボキシル末端に位置する結合ドメイン（すなわち、カルボキシル末端の結合ドメイン）はｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによって連結された重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。可変領域は、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨの向きで、ｓｃＦｖ内に配置され得る。例えば、一実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端までに、ＶＨ領域、ペプチドリンカー及びＶＬ領域を含む。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端までに、ＶＬ領域、ペプチドリンカー及びＶＨ領域を含む。ｓｃＦｖのＶＨ領域及びＶＬ領域は、１つ又は複数のシステイン置換を含有して、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にジスルフィド結合の形成を可能にすることができる。そのようなシステインのクランプは、抗原－結合性配置における２つの可変ドメインを安定化させる。一実施形態では、ＶＨ領域中の４４位（Ｋａｂａｔ付番）及びＶＬ領域中の１００位（Ｋａｂａｔ付番）は、それぞれシステイン残基で置換される。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）ベクターに
（ｉ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｉｉｉ）
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｃ）第１の抗原にも又は第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
をクローニングする工程であって、
ベクターは１つのタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲを含む複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
（ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの第１の抗原及び第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の同じ軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の結合親和性を比較する工程
を含む方法を対象とする。
複数のベクターを同じ哺乳動物細胞にトランスフェクトする限り、ＣＤＲを同じベクター又は異なるベクターにクローニングすることができる。ＣＤＲのベクターへのクローニングには、ＶＨフレームワークへのＣＤＲＨの挿入とＶＬフレームワークへのＣＤＲＬの挿入が含まれる。このようにして形成されたＶＨ及びＶＬは、次いで、リンカーを介して互いに融合してｓｃＦｖを形成し得、又はＣＨ１及びＣＬ定常領域に融合し得る。
次いで、作製されたベクターを哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトし、１つのタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールを発現させる。しかしながら、この特定のモジュールの多くの異なるタイプの多重特異性抗体コンストラクトが、それらを形成する複数のＦａｂ断片及び／又はｓｃＦｖ断片が原因で産生される。
上記の方法を用いて、いずれかの抗原に結合することができる共通の軽鎖を同定する。これらの軽鎖の供給源は、第１の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲ、第２の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲ、又は完全に異なる第３の抗原に結合することによって同定されたＦａｂ及び／若しくはｓｃＦｖ断片に由来するＣＤＲのいずれかであり得る。この場合、重鎖ＣＤＲは抗原への結合の大部分を担い、軽鎖ＣＤＲの役割はより受動的である。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）２つの複数のＣＤＲを、多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードするベクターにクローニングする工程であって、各抗原に結合するＣＤＲを含む複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
（ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、並びに（ｉｉ）生成された正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
を含む方法を対象とする。
複数のベクターを同じ哺乳動物細胞にトランスフェクトする限り、ＣＤＲを同じベクター又は異なるベクターにクローニングすることができる。ＣＤＲのベクターへのクローニングには、ＶＨフレームワークへのＣＤＲＨの挿入とＶＬフレームワークへのＣＤＲＬの挿入が含まれる。このようにして形成されたＶＨ及びＶＬは、次いで、リンカーを介して互いに融合してｓｃＦｖを形成し得、又はＣＨ１及びＣＬ定常領域に融合し得る。
次いで、作製されたベクターを哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトし、１つのタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールを発現させる。しかしながら、この特定のモジュールの多くの異なるタイプの多重特異性抗体コンストラクトが、それらを形成する複数のＦａｂ断片及び／又はｓｃＦｖ断片が原因で産生される。
上記の方法を用いて、特定のモジュール中の各抗原に結合する最適な結合対を同定する。
一実施形態では、複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）ベクターに
（ｉ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｉｉｉ）
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｃ）第１の抗原にも又は第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
をクローニングする工程であって、
ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において異なるモジュールの各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
（ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの第１の抗原及び第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の同じ軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の結合親和性を比較する工程
を含む方法を対象とする。
複数のベクターを同じ哺乳動物細胞にトランスフェクトする限り、ＣＤＲを同じベクター又は異なるベクターにクローニングすることができる。ＣＤＲのベクターへのクローニングには、ＶＨフレームワークへのＣＤＲＨの挿入とＶＬフレームワークへのＣＤＲＬの挿入が含まれる。このようにして形成されたＶＨ及びＶＬは、次いで、リンカーを介して互いに融合してｓｃＦｖを形成し得、又はＣＨ１及びＣＬ定常領域に融合し得る。
次いで、作製されたベクターを哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトし、ここで、複数のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールが発現されるが、抗原結合部分は同じＣＤＲを有する（１つの抗原結合部分のための６つのＣＤＲ、他の抗原結合部分のための６つのＣＤＲ、しかし、特定のモジュールには複数の抗原結合部分が存在し得る；図７を参照）。
上記の方法を用いて、ｃＬＣを利用する抗原結合部分に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールを同定する。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ及び第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖのＣＤＲをベクターにクローニングする工程であって
ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合するＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
（ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、並びに（ｉｉ）生成された正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
を含む方法を対象とする。
複数のベクターを同じ哺乳動物細胞にトランスフェクトする限り、ＣＤＲを同じベクター又は異なるベクターにクローニングすることができる。ＣＤＲのベクターへのクローニングには、ＶＨフレームワークへのＣＤＲＨの挿入とＶＬフレームワークへのＣＤＲＬの挿入が含まれる。このようにして形成されたＶＨ及びＶＬは、次いで、リンカーを介して互いに融合してｓｃＦｖを形成し得、又はＣＨ１及びＣＬ定常領域に融合し得る。
次いで、作製されたベクターを哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトし、ここで、複数のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールが発現されるが、抗原結合部分は同じＣＤＲを有する（１つの抗原結合部分のための６つのＣＤＲ、他の抗原結合部分のための６つのＣＤＲ、しかし、特定のモジュールには複数の抗原結合部分が存在し得る；図７を参照）。
上記の方法を用いて、抗原結合部分に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールを同定する。
一実施形態では、多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む。
一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（「ＣＯＳ－７」）、ヒト胎児腎臓株２９３（「ＨＥＫ２９３」）、ベビーハムスター腎臓細胞（「ＢＨＫ」）、マウスセルトリ細胞（「ＴＭ４」）、サル腎臓細胞（「ＣＶ１」）、アフリカミドリザル腎臓細胞（「ＶＥＲＯ－７６」）、ヒト子宮頸癌細胞（「ＨＥＬＡ」）、イヌ腎臓細胞（「ＭＤＣＫ」）、バッファローラット肝臓細胞（「ＢＲＬ」）、ヒト胚細胞（「Ｗ１３８」）、ヒトヘパトーマ細胞（「Ｈｅｐ Ｇ２」）、マウス乳癌（「ＭＭＴ」）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、発現レベルは、Ａ２８０測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、ブラッドフォードアッセイ、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイからなる群から選択される方法によって決定される。
一実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原に対する各多重特異性抗体コンストラクトの結合親和性は、Ｏｃｔｅｔ、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ、ＳＰＲ及びフローサイトメトリーを使用して測定される。
一実施形態では、正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合は、液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）、Ｃａｌｉｐｅｒ、ＨＰＬＣ ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びマイクロチップキャピラリー電気泳動（「ＭＣＥ」）からなる群から選択される方法によって決定される。
一実施形態では、各多重特異性抗体コンストラクトは、プロテインＡ、ラムダ及びカッパ樹脂、並びにアフィニティータグ精製によって精製される。特定の実施形態では、アフィニティータグは、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、ストレプトアビジン、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、及びｍｙｃタグからなる群から選択される。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）ベクターに
（ｉ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｉｉｉ）
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｃ）第１の抗原にも又は第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
をクローニングする工程であって、
ベクターは多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲを含む複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
（ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）Ｏｃｔｅｔを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの第１の抗原及び第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の同じ軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の結合親和性を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）２つの複数のＣＤＲを、多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードするベクターにクローニングし、各抗原に結合する複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
（ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）を用いて、正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）ベクターに
（ｉ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｉｉｉ）
（ａ）第１の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
（ｃ）第１の抗原にも又は第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
をクローニングする工程であって、
ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
（ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）Ｏｃｔｅｔを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの第１の抗原及び第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程、
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の同じ軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の結合親和性を比較する工程
を含む方法を対象とする。
一態様では、本発明は、多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
（ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
（ｃ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ及び第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖのＣＤＲをベクターにクローニングする工程であって
ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合するＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
（ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
（ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
（ｆ）（ｉ）Ａ２８０を用いて各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）を用いて、正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
（ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
（ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
を含む方法を対象とする。
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、そのアミノ末端で、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域のカルボキシル末端（例えば、ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端）に融合されるか、又はそうでなければ連結される。したがって、一実施形態では、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第１のペプチドリンカー、ＶＨ領域、第２のペプチドリンカー、及びＶＬ領域を含むように、ｓｃＦｖがＦｃ領域に融合される。別の実施形態では、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第１のペプチドリンカー、ＶＬ領域、第２のペプチドリンカー、及びＶＨ領域を含むように、ｓｃＦｖがＦｃ領域に融合される。「融合タンパク質」は、２つ以上の親タンパク質又はポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むタンパク質である。通常、融合タンパク質は、１つのタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と一緒にインフレームに付加され、任意選択によりリンカーによって、その配列から分離される、融合遺伝子から発現する。この融合遺伝子は、その後、組換え宿主細胞によって発現されて、単一の融合タンパク質を産生することができる。
「ペプチドリンカー」とは、１つのポリペプチドを別のポリペプチドに共有結合させる約２～約５０アミノ酸のオリゴペプチドを指す。ペプチドリンカーは、ｓｃＦｖにおいてＶＨドメインとＶＬドメインとを連結するために使用される。ペプチドリンカーはまた、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、又は他の機能的抗体断片をＦｃ領域のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結して、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質を作り出すために使用することができる。好ましくは、ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、約５アミノ酸長～約４０アミノ酸長である。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、約８アミノ酸長～約３０アミノ酸長である。さらに他の実施形態では、ペプチドリンカーは、約１０アミノ酸長～約２０アミノ酸長である。好ましくは、必ずしもというわけではないが、ペプチドリンカーは、２０の標準的なアミノ酸の中のアミノ酸、特に、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及び／又はセリンを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン、セリン及びアラニンなど、立体障害のない大多数のアミノ酸で構成される。したがって、いくつかの実施形態において好ましいリンカーには、ポリグリシン、ポリセリン、及びポリアラニン、又はこれらのうちいずれかの組み合わせが含まれる。いくつかの例示的なペプチドリンカーとしては、以下に限定されないが、ポリ（Ｇｌｙ）２～８（配列番号２２～２６、３０及び５１）、特に（Ｇｌｙ）３（配列番号２２）、（Ｇｌｙ）４（配列番号２３）、（Ｇｌｙ）５（配列番号２４）、（Ｇｌｙ）６（配列番号２５）及び（Ｇｌｙ）７（配列番号２６）、並びにポリ（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ（配列番号４８）、ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）２～４（配列番号３３～３５）及びポリ（Ａｌａ）２～８（配列番号３６～４２）が挙げられる。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎであり、ここで、ｘ＝３又は４であり、ｎ＝２、３、４、５又は６である（配列番号２９、３１、３２及び４３～５０）。そのようなペプチドリンカーとしては、「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ又は「Ｇ４Ｓ」；配列番号２７）、「Ｌ９」（ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「Ｇ３ＳＧ４Ｓ」；配列番号２８）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「（Ｇ４Ｓ）２」；配列番号２９）、「Ｌ１５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「（Ｇ４Ｓ）３」；配列番号３１）、及び「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「（Ｇ４Ｓ）５」；；配列番号３２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ中でＶＨ領域とＶＬ領域とを連結しているペプチドリンカーは、Ｌ１５又は（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３１）である。これらの及び他の実施形態では、カルボキシル末端の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ）をＦｃ領域のＣ末端に連結しているペプチドリンカーは、Ｌ９若しくはＧ３ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２８）又はＬ１０（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号２９）である。
本発明の多重特異性抗原結合タンパク質に使用することができるペプチドリンカーの他の特定の例としては、（Ｇｌｙ）５Ｌｙｓ（配列番号１）；（Ｇｌｙ）５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号２）；（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号３）；（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号４）；（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号５）；ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号６）；ＧＧＥＧＧＧ（配列番号７）；ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号８）；ＧＥＥＥＧ（配列番号９）；ＧＥＥＥ（配列番号１０）；ＧＧＤＧＧＧ（配列番号１１）；ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号１２）；ＧＤＤＤＧ（配列番号１３）；ＧＤＤＤ（配列番号１４）；ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号１５）；ＷＥＷＥＷ（配列番号１６）；ＦＥＦＥＦ（配列番号１７）；ＥＥＥＷＷＷ（配列番号１８）；ＥＥＥＦＦＦ（配列番号１９）；ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号２０）；及びＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号２１）が挙げられる。
本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質の重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／又はエフェクター機能に影響する１つ又は複数のアミノ酸置換を含んでいてもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つは、免疫グロブリンがその標的に結合するときに免疫系に伝達することである。これは、一般に「エフェクター機能」と呼ばれる。伝達は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）につながる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面のＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑと、Ｆｃとの結合を介して媒介される。いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性を含むエフェクター機能、及び／又は抗原結合タンパク質のクリアランス若しくは半減期を増強するために、定常領域に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を増強することができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ付番）としては、以下に限定されないが、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又は上記のもののいずれかの組み合わせが挙げられる。
他の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、エフェクター機能を低減するために、定常領域に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を低減することができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ付番）としては、以下に限定されないが、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、又は上記のいずれかの組み合わせが挙げられる。
グリコシル化は、抗体、特にＩｇＧ１抗体のエフェクター機能の要因となり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、結合タンパク質のグリコシル化のレベル又はタイプに影響を及ぼす１つ又は複数のアミノ酸置換を含んでいてもよい。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（Ｘは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。ゆえに、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうち１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリシンを使用することもできる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ又は複数のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域に付加することによって増加される。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列のうち１つ又は複数を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に実現することができる（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。改変は、１つ又は複数のセリン残基若しくはトレオニン残基の、開始配列への付加又は開始配列による置換によってなされることもできる（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。容易にするために、抗原結合タンパク質アミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、予め選択された塩基の位置で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、改変することができる。
本発明はまた、炭水化物構造が改変されて、エフェクター活性が改変されている多重特異性抗原結合タンパク質分子、例えば、フコシル化がないか又は減少して、ＡＤＣＣ活性の向上を示す抗原結合タンパク質の産生も包含する。フコシル化を減少させる又は排除する様々な方法が当該技術分野において知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基でのＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、高い親和性でこの受容体に結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクター機能を天然のフコシル化抗体よりも効率的に誘発する。例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え産生は、ＡＤＣＣ活性が１００倍増加した抗体を生じる（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４－２２，２００４を参照）。同様の効果は、フコシル化経路におけるアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素又は他の酵素の活性を低下させることによって、例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするような細胞株の操作、又は選択的グリコシル化阻害剤を用いる培養によって、達成することができる（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３－２３，１９８９を参照）。いくつかの宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－４０，２００２及びＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６－７３，２００３を参照）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え産生することによる、二分された糖鎖レベルの増加もＡＤＣＣ活性を増加させることが判明している（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６－８０，１９９９を参照）。
他の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ又は複数のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域から除去することによって、低減又は排除される。Ｎ結合型グリコシル化部位を排除又は改変するアミノ酸置換により、抗原結合タンパク質のＮ結合型グリコシル化を低減又は排除することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、又はＮ２９７ＧなどのＮ２９７位（ＥＵ付番）での変異を含む。特定の一実施形態では、本発明の多二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を向上させるために、分子のＦｃ領域はさらに操作されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域における１つ又は複数のアミノ酸は、二量体状態でジスルフィド結合形成を促進するためにシステインで置換される。したがって、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２（ＥＵ付番）に対応する残基は、システインで置換され得る。好ましくは、残基の特定の対が、互いにジスルフィド結合を優先的に形成するようにシステインで置換され、このため、ジスルフィド結合のスクランブルが制限又は防止される。好ましい対としては、以下に限定されないが、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃに変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。このような実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ｇ変異も含む場合がある。
例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組み込み又は付加による（例えば、適切な領域の変異による、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、続いて、例えば、ＤＮＡ若しくはペプチド合成によって、いずれかの末端又は中央で抗原結合タンパク質に融合させることによる；例えば、国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照）、或いはＰＥＧ又は他の水溶性ポリマー、例えば、多糖ポリマーなどの分子の付加による、血清半減期を延長するための本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の修飾もまた望ましい場合がある。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の任意の１つ又は複数のアミノ酸残基が抗原結合タンパク質中の類似の位置に移入される領域を構成する。より一層好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の３つ以上の残基が移入される。さらにより好ましくは、エピトープはＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域）のＣＨ２ドメインから採取され、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３、若しくはＶＨ領域、又は２つ以上のそのような領域に移入される。或いは、エピトープはＦｃ領域のＣＨ２ドメインから採取され、抗原結合タンパク質のＣＬ領域若しくはＶＬ領域、又はその両方に移入される。Ｆｃ変異体及びそれらのサルベージ受容体との相互作用の説明については、国際出願の、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照されたい。
本発明は、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質及びその成分をコードする、１つ又は複数の単離された核酸を含む。本発明の核酸分子には、単鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、完全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子並びにそれらの断片の組み合わせが含まれる。本発明の核酸は、優先的にはヒト供給源に由来するが、本発明には非ヒト種に由来するものも含まれる。
免疫グロブリン又はその領域（例えば、可変領域、Ｆｃ領域など）又は目的のポリペプチド由来の該当するアミノ酸配列は、直接タンパク質配列解析法によって決定することができ、好適なコードヌクレオチド配列は普遍コドン表に従ってデザインすることができる。或いは、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源となり得る、モノクローナル抗体をコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、そのような抗体を産生する細胞から単離し、配列決定することができる。
本明細書において「単離されたポリヌクレオチド」と互換的に使用される「単離された核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離されている核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子又はオリゴヌクレオチドなど、鋳型から酵素的に、又は化学的に合成された核酸の場合、このようなプロセスから得られる核酸は、単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子、又はより大きな核酸コンストラクトの成分としての核酸分子を指す。好ましい一実施形態では、核酸は、不純にする内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋な形態で、且つ標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されているもの）によるその成分ヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収を可能にする量又は濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡから誘導されている。このような配列は、好ましくは、通常、真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／又は構築される。非翻訳のＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側又は３’側に存在することができ、この場合、これは、コード領域の操作又は発現を妨害しない。特に明記しない限り、本明細書に記載される任意の単鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への産生の方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
本発明はまた、中程度にストリンジェントな条件下、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸も含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響する基本パラメータ及び好適な条件を考案するためのガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３－６．４）によって示されており、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて当業者が容易に決定することができる。中程度にストリンジェントな条件を達成する一方法が、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予洗溶液、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファ、約５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は他の類似のハイブリダイゼーション溶液、例えば、約４２℃のハイブリダイゼーション温度による、約５０％ホルムアミドを含有するもの）、及び０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の約６０℃の洗浄条件の使用を含む。一般に、高度にストリンジェントな条件は、およそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄すること以外は上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義される。ＳＳＰＥ（ｌ×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、及び１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーション緩衝液及び洗浄緩衝液中のＳＳＣ（ｌ×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に置換することができ、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間洗浄を行う。当然のことながら、当業者に知られており、以下にさらに説明されるように、ハイブリダイゼーション反応及び二本鎖の安定性を決定する基本原理を適用することにより、所望の程度のストリンジェンシーを達成するために必要に応じて、洗浄温度及び洗浄塩濃度を調節することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照）。核酸を未知の配列の標的核酸へとハイブリダイズする場合、ハイブリッド長はハイブリダイズする核酸の長さであると仮定する。既知の配列の核酸がハイブリダイズされる場合、ハイブリッド長は、両核酸の配列を整列させ、最適な配列相補性の領域又は領域群を同定することによって決定することができる。５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５～１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは、以下の式に従って決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長を超えるハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）、（式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である）（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、このようなハイブリダイズする核酸の各々は、少なくとも１５ヌクレオチド（又はより好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、若しくは少なくとも２０ヌクレオチド、若しくは少なくとも２５ヌクレオチド、若しくは少なくとも３０ヌクレオチド、若しくは少なくとも４０ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）の長さ、或いはそれがハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％）である長さを有し、且つそれがハイブリダイズする本発明の核酸と、少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、及び最も好ましくは少なくとも９９．５％）を有する。ここで、配列同一性は、上でより詳細に記載されているように、ハイブリダイズする核酸の配列を、重複及び同一性が最大となり、配列ギャップが最小になるように整列させたときの、当該核酸の配列を比較することによって決定される。
本明細書に記載される抗原結合タンパク質のバリアントは、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的な変異誘発により、カセット若しくはＰＣＲ変異誘発、又は当該技術分野において周知の他の技術を使用して、変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後、本明細書に概説するように、細胞培養物中で組換えＤＮＡを発現させることによって調製することができる。しかし、約１００～１５０個までの残基を有するバリアントＣＤＲを含む抗原結合タンパク質は、確立された技術を使用してインビトロ合成によって調製することができる。バリアントは、典型的には、天然の類似体と同様の定性的生物学的活性、例えば抗原への結合を示す。このようなバリアントは、例えば、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行って、最終コンストラクトに至るのであるが、但し、最終コンストラクトは所望の特性を保持するものとする。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるなど、抗原結合タンパク質の翻訳後プロセスを改変する場合もある。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質変異体は、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を修飾する目的で調製される。他の実施形態では、本明細書に記載の目的のため、エピトープ結合に直接関与しない残基、又はエピトープ結合に何ら関与しない残基の修飾が望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域のいずれかにおける変異誘発が企図される。抗原結合タンパク質のアミノ酸配列における有用な修飾をデザインするために、当業者は共分散分析技術を使用することができる。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４１：４７５－４８４，２０００；Ｄｅｍａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１－４８，２００４；Ｈｕｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（５）：３８１－８６，２００３；Ａｕｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００８／０３１８２０７Ａ１号明細書；Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００９／００４８１２２Ａ１号明細書；Ｕｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２００８／１１０３４８Ａ１号パンフレット；Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２００９／００００９９Ａ２号パンフレットを参照されたい。共分散分析によって決定されるそのような改変は、抗原結合タンパク質の効力、薬物動態学的、薬力学的及び／又は製造可能性の特性を改善することができる。
本発明はまた、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の１つ又は複数の成分（例えば、可変領域、軽鎖、重鎖、修飾された重鎖、及びＦｄ断片）をコードする１つ又は複数の核酸を含むベクターを含む。「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を指す。ベクターの例としては、以下に限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが挙げられる。「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の宿主細胞において作動可能に連結されるコード配列の発現に必要な、所望のコード配列及び適切な核酸制御配列を含有する組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を及ぼすか又はそれを制御し、且つイントロンが存在する場合、それに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含むことができるが、これに限定されない。原核生物での発現に必要な核酸配列には、プロモーター、任意選択によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、及び場合によりその他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、並びに終結シグナル及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列もまた、任意選択により発現ベクターによってコードされ、目的のコード配列に作動可能に連結されることが可能であり、これにより、所望の場合、細胞から目的のポリペプチドがより容易に単離されるように、組換え宿主細胞に発現ポリペプチドを分泌させることができる。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号５２）、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号５３）、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号５４）、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５５）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号５６）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５７）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５８）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号５９）、及びＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号６０）からなる群から選択される。
通常、本発明の多重特異性抗原タンパク質を産生するために宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、並びに多重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする外因性ヌクレオチド配列のクローン化及び発現のための配列を含有する。集合的に「隣接配列」と呼ばれるこのような配列は、ある特定の実施形態において、典型的には、以下のヌクレオチド配列：プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメントのうち１つ又は複数を含む。これらの配列の各々を以下に記載する。
任意選択により、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、ポリペプチドコード配列の５’末端又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有することができ、このオリゴヌクレオチドタグ配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、ストレプトアビジン、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ、又は市販の抗体が存在する別の「タグ」分子をコードする。このタグは、通常、ポリペプチドが発現すると、ポリペプチドに融合され、宿主細胞からのポリペプチドの親和性精製又は検出のための手段としての役目をすることができる。親和性精製は、例えば、タグに対する抗体を親和性マトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーによって実現することができる。任意選択により、その後、ある特定の切断用ペプチダーゼを使用するなどの様々な手段によって、精製されたポリペプチドからタグを除去することができる。
隣接配列は、同族性（すなわち、宿主細胞と同一の種及び／又は株に由来する）、異種性（すなわち、宿主細胞の種又は株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源に由来する隣接配列の組み合わせ）、合成、又は天然とすることができる。したがって、隣接配列の供給源は、任意の原核生物若しくは真核生物、任意の脊椎動物若しくは無脊椎動物、又は任意の植物とすることができるが、但し、その隣接配列が宿主細胞機構において機能し、且つ宿主細胞機構によって活性化され得るものとする。
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該技術分野においてよく知られた複数の方法のいずれかによって得ることができる。通常、本明細書において有用な隣接配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって事前に同定されているであろうから、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用し、適切な組織源から単離することができる。場合により、隣接配列の全ヌクレオチド配列は既知であり得る。この場合、隣接配列は、核酸合成又はクローン化の常法を使用して合成することができる。
隣接配列の全てが既知であるか、又はその一部のみが既知であるかを問わず、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用して、且つ／又は同じ若しくは別の種に由来するオリゴヌクレオチド及び／若しくは隣接配列断片などの好適なプローブを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列を得ることができる。隣接配列が不明である場合、隣接配列を含有するＤＮＡの断片を、例えば、コード配列又は１つ若しくは複数の別の遺伝子を含有し得るＤＮＡの大型断片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を産生し、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、又は当業者に知られた他の方法を使用して単離することにより実現することができる。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者には容易に分かるであろう。
複製起点は、通常、市販のものを購入した原核生物発現ベクターの一部であり、その起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。選択したベクターが複製起点部位を含有しない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターにライゲートしてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、様々なウイルス性の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はパピローマウイルス、例えば、ＨＰＶ若しくはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるベクターのクローン化に有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要でない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターも含有するという理由でのみ、使用されることが多い）。
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の３’末端側に位置し、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ－Ｃに富む断片とそれに続くポリＴ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化されるか、又はベクターの一部として、市販品を購入する場合さえあるが、既知の核酸合成の方法を使用して容易に合成することもできる。
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物の宿主細胞に、抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するタンパク質；又は（ｃ）複合培地又は限定培地からは利用不能の重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことには、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物の宿主細胞及び真核生物の宿主細胞の両方における選択に使用することができる。
他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅してもよい。増幅は、増殖又は細胞生存に重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、組換え細胞の累代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体を、この形質転換体のみが唯一、ベクター中に存在する選択遺伝子によって生存するように適合されている選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に増加する条件下で形質転換された細胞を培養することによって課され、それにより、選択遺伝子と、本明細書中に記載される多重特異性抗原結合タンパク質の１つ又は複数の成分などの別の遺伝子をコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く。その結果、増幅されたＤＮＡから多量のポリペプチドが合成される。
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側、及び発現されることになるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。ある特定の実施形態では、１つ又は複数のコード領域は、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結され得、単一のＲＮＡ転写産物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。
真核生物の宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望されるなどの場合には、グリコシル化又は収率を向上させるために、種々のプレ配列又はプロ配列を操作することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変するか、又はプロ配列を付加することができ、これもグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は－１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に、発現に付随する１つ又は複数の追加のアミノ酸を有する場合があり、これは、完全には除去されていなくてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される１つ又は２つのアミノ酸残基を有し得る。代わりに、いくつかの酵素切断部位を使用すると、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、所望のポリペプチドがわずかに切断された形態を生じ得る。
本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用する場合、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指令することができる核酸分子が産生されるように、２つ以上の核酸配列が連結されていることを指す。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性と適合する条件下で行われるように、タンパク質コード配列にライゲートされる。より具体的には、プロモーター及び／又はエンハンサー配列（シス作用性転写制御エレメントの任意の組み合わせを含む）は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。
プロモーターは、構造遺伝子（一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。通常、プロモーターは、２つのクラス：誘導性プロモーター及び構成的プロモーターの一方に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無又は温度の変化などの培養条件の何らかの変化に応じ、その制御下で、ＤＮＡからの転写レベルの増加を開始する。一方、構成的プロモーターは、それが作動可能に連結されている遺伝子を均一に、すなわち遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。好適なプロモーターは、供給源ＤＮＡから制限酵素消化によりプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の、例えば、重鎖、軽鎖、修飾された重鎖、又は他の成分をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
酵母宿主とともに使用するのに好適なプロモーターも当該技術分野においてよく知られている。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに使用されるのが有利である。哺乳動物宿主細胞とともに使用するのに好適なプロモーターはよく知られており、以下に限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。
対象となり得るさらなるプロモーターとしては、以下に限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９－６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４－１４４５）；メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）；並びにベータ－ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５）が挙げられる。組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている以下の動物転写制御領域も対象となる：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５－５１５）；膵ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５－１２２）；リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）；精巣、***、リンパ球及び肥満細胞において活性であるマウス***腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５－４９５）；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８－２７６）；肝臓において活性であるアルファ－フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３－５８）；肝臓において活性であるアルファ１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）；骨髄細胞において活性であるベータ－グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９－９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３－７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３－２８６）；並びに視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２－１３７８）。
エンハンサー配列をベクターに挿入し、高等真核生物によって、多重特異性抗原結合タンパク質の成分（例えば、軽鎖、重鎖、修飾された重鎖、Ｆｄ断片）をコードするＤＮＡの転写を増加させることができる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常、約１０～３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、方向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’側及び３’側の双方の位置にて見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能な複数のエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ－フェト－タンパク質、及びインスリン）。しかしながら、通常、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野において公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ベクターにおいてコード配列の５’側又は３’側のいずれに位置してもよいが、典型的には、プロモーターから５’側の部位に位置する。適切な天然又は異種性のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込んで、細胞外への抗体の分泌を促進することができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体が産生されることになる宿主細胞の型に依存し、異種性のシグナル配列が天然のシグナル配列に取って代わることができる。シグナルペプチドの例は、上に記載されている。哺乳動物宿主細胞において機能する他のシグナルペプチドとして、米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されるインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されるインターロイキン－２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７ ５６６号明細書に記載されるインターロイキン－４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されるＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０ ４６０ ８４６号明細書に記載されるＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチドが挙げられる。
提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築してもよい。そのようなベクターは、所望の隣接配列の全てを含有していてもしていなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列のうち１つ又は複数がベクターに最初から存在していない場合、それらを個々に取得してベクターにライゲートしてもよい。隣接配列の各々を取得するために使用される方法は、当業者によく知られている。発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質を含むタンパク質を産生することができる。
ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の異なる成分をコードする核酸を、同じ発現ベクターに挿入してもよい。そのような実施形態では、軽鎖及び重鎖が同じｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により、単一のプロモーターの制御下で、２つの核酸が分離されてもよい。代わりに、２つの核酸は、軽鎖及び重鎖が２つの別個のｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、２つの別個のプロモーターの制御下にあってもよい。
同様に、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ多重特異性抗原結合タンパク質については、軽鎖をコードする核酸は、修飾された重鎖（重鎖及びｓｃＦｖを含む融合タンパク質）をコードする核酸と同じ発現ベクターにクローン化されてもよく、その場合、２つの核酸は単一のプロモーターの制御下にあってＩＲＥＳによって分離されるか、又は２つの核酸は２つの別個のプロモーターの制御下にある。ＩｇＧ－Ｆａｂ多重特異性抗原結合タンパク質については、３つの成分の各々をコードする核酸は、同じ発現ベクターにクローン化されてもよい。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ－Ｆａｂ分子の軽鎖をコードする核酸、及び第２のポリペプチド（Ｃ末端のＦａｂドメインのもう半分を含む）をコードする核酸は、１つの発現ベクターにクローン化され、一方、修飾された重鎖（重鎖及びＦａｂドメインの半分を含む融合タンパク質）をコードする核酸は、第２の発現ベクターにクローン化される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質の全ての成分は、同じ宿主細胞集団から発現される。例えば、１つ又は複数の成分が別個の発現ベクターにクローン化される場合でも、宿主細胞に両方の発現ベクターを同時トランスフェクトして、１つの細胞が多二重特異性抗原結合タンパク質の全ての成分を産生するようにする。
ベクターが構築され、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする１つ又は複数の核酸分子が、１つ又は複数のベクターの適切な部位に挿入された後、完成したベクターは、増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入することができる。したがって、本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする１つ又は複数の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞を包含する。「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸で形質転換されているか、又は形質転換されることが可能であり、それにより、目的の遺伝子を発現する細胞を指す。この用語には、目的の遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫の形態又は遺伝的構造が元の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫が含まれる。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に作動可能に連結された、本発明の単離された核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
抗原結合タンパク質の発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、又は他の既知の技術を含む周知の方法によって実現することができる。選択される方法は、ある程度、使用される宿主細胞の型に応じることになる。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者にはよく知られており、例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に示されている。
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると抗原結合タンパク質を合成し、抗原結合タンパク質はその後、（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合は）培養培地から、又は（それが分泌されない場合は）それを産生する宿主細胞から直接的に、採取することができる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化など）に望ましいか又は必要であるポリペプチドの修飾、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの様々な要因に依存することになる。
例示的な宿主細胞には、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞が含まれる。原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、組換えポリペプチドに好適なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、並びに糸状菌、例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの複数の他の属、種及び株が、ここで一般に利用可能であり、有用である。
グリコシル化された抗原結合タンパク質の発現のための宿主細胞は、多細胞生物由来とすることができる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルスの株及び変異体、並びにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の、対応する昆虫の許容宿主細胞が同定されている。このような細胞のトランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１変異体、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公に入手可能である。
脊椎動物宿主細胞もまた好適な宿主であり、このような細胞からの抗原結合タンパク質の組換え産生は常法となっている。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野においてよく知られており、以下に限定されないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、以下に限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養での増殖用にサブクローン化された２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞、及び多くの他の細胞株が挙げられる。別の実施形態では、それ自体の抗体は作製しないが、異種性抗体を作製及び分泌する能力を有するＢ細胞系統由来の細胞株を選択することができる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞が、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質を発現するのに好ましい宿主細胞である。
多重特異性抗原結合タンパク質の産生のために、宿主細胞は上記の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地中で培養される。加えて、選択マーカーによって分離された転写単位の複数のコピーを有する新規なベクター及びトランスフェクトされた細胞株は、抗原結合タンパク質の発現に特に有用である。したがって、本発明はまた、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質を調製する方法であって、本明細書に記載される１つ又は複数の発現ベクターを含む宿主細胞を、当該１つ又は複数の発現ベクターによってコードされる多重特異性抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下にて培養培地中で培養する工程と、培養培地から多重特異性抗原結合タンパク質を回収する工程とを含む方法を提供する。
本発明の抗原結合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９；Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０；米国特許第４，７６７，７０４号明細書；米国特許第４，６５７，８６６号明細書；米国特許第４，９２７，７６２号明細書；米国特許第４，５６０，６５５号明細書；若しくは米国特許第５，１２２，４６９号明細書；国際公開第９０１０３４３０号パンフレット；国際公開第８７／００１９５号パンフレット；又は米国再発行特許第３０，９８５号明細書に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地のうちいずれかは、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充することができる。他に必要な任意の栄養補助物質もまた、当業者に公知の適切な濃度で含めてもよい。温度及びｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
宿主細胞を培養すると、多重特異性抗原結合タンパク質は、細胞内、細胞膜周辺腔内で産生されること、又は培地中に直接分泌されることが可能である。抗原結合タンパク質が細胞内で産生される場合、第１の工程として、粒状の破片である宿主細胞又は溶解した断片を、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン若しくは陰イオン交換クロマトグラフィー、又は好ましくは、親和性リガンドとして目的の抗原又はプロテインＡ若しくはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３，１９８３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５，１９８６）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて実現することができるよりも、流速を速く、処理時間を短くすることが可能である。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収されるべき特定の多重特異性抗原結合タンパク質に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術もまた可能である。
材料及び方法
プラスミドの構築
抗体ＨＣ及びＬＣ遺伝子をＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより合成し、次いで、ゴールデンゲートアセンブリ法を用いて哺乳動物一過性発現ベクターに個々にクローニングした３０。タンパク質の異質性を減少させるために、全てのＨＣを、非グリコシル化変異及び新規の操作されたジスルフィド結合を有するヒトＩｇＧ１スキャホールド（ＩｇＧ１－ＳＥＦＬ２）を用いて構築した３１。ＨＣヘテロ二量体化を必要とするヘテロＦｃについて、電荷対変異（ＣＰＭ）をＦｃ領域に導入した。サンガーによるシーケンシング確認の後、トランスフェクショングレードのＤＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉプラスミド精製キットを用いて調製し、次いで、モノクローナル抗体及びハイブリッドＩｇＧ（非同族ＨＣ／ＬＣ対）については１：１（ＨＣ：ＬＣ）、４本鎖ヘテロＦｃについては１：１：１：１（ＨＣ１：ＬＣ１：ＨＣ２：ＬＣ２）、及びｃＬＣヘテロＦｃ（３本鎖ヘテロＦｃ）については２：１：１（ｃＬＣ：ＨＣ１：ＨＣ２）の比で混合した。
細胞培養及びタンパク質発現
全てのタンパク質を、社内の改良されたプロトコル（Ｒｅｆ Ｇｒａｃｅ’ｓ ｐａｐｅｒ）を用いて、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（ＮＲＣ－ＢＲＩ）の懸濁液中で一過性に発現させた。簡潔に記載すると、細胞を、０．１％ Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８（Ｓｉｇｍａ）、２５μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）及び６ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ－１７培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で維持した。
最適なトランスフェクションのために、細胞をトランスフェクションの２６時間前に継代し、１ｍｌ当たり２×１０６個の生細胞密度を達成した。
細胞１ｍｌあたり、０．５μｇのＤＮＡを、１００μｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ－１７培地中で１．５μｌのＰＥＩｍａｘ試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１０分間複合化し、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの１日後、細胞培養物にトリプトンＮ１溶液（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）及びグルコース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をそれぞれ２．５ｇ／Ｌ及び４．５ｇ／Ｌの最終濃度となるように加えた。３日後、３．７５ｍＭバルプロ酸ナトリウム（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を加えて、タンパク質発現を増強した。トランスフェクション後６日目に、馴化培地を精製のために回収した。
ＰｒｏＡ磁気ビーズを用いたハイスループットタンパク質精製
ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）Ｆｌｅｘシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、磁気ＰｒｏＡビーズ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたハイスループットタンパク質精製に使用した。簡潔に記載すると、２４ウェルディープブロック中の４ｍｌのＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞をタンパク質発現のためにトランスフェクトし、続いて、１００μｌの磁気ＰｒｏＡビーズを添加し、１日後に採取した。次いで、ビーズを回収し、２４ディープウェル磁気ヘッドを用いてＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ精製を行った。ＰＢＳで３回、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で２回洗浄した後、タンパク質を５００μｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．６）で１０分間溶出し、次いで、１０μｌの３Ｍトリス（ｐＨ１１．０）を添加することによって直ちに中和した。
ＰｒｏＡ及び陽イオン交換クロマトグラフィーによる２段階精製
４０ｍｌのＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において発現したタンパク質を、ＰｒｏＡアフィニティーキャプチャー（１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製し、１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．６）で溶出した後、直ちに、前述のように、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．２）へ緩衝液交換を行った３２。
イオン交換クロマトグラフィーのために、ＰｒｏＡ溶出液（１．５～１．８ｍｌ）を２０ｍｌの２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．２）で希釈し、１ｍｌの陽イオン交換カラム（ＳＰ－ＨＰ ＨｉＴｒａｐ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に１ｍｌ／分でロードした。カラムを８カラム容量の同じ緩衝液により１ｍｌ／分で洗浄し、０．４ｍｌ／分で４０カラム容量にわたって０～４００ｍＭ ＮａＣｌの線形勾配でタンパク質を溶出した。９０％以上の純度の画分（ＳＥＣ及びＭＳにより測定）をプールし、その濃度をＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＧＯマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定した３３。
非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＰｒｏＡ精製試料を分析するために、還元剤の非存在下で、１～２μｇのタンパク質をＮｏｖｅｘ ４～２０％トリス－グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。各ゲルには、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ染色済みタンパク質ラダー１０～２５０ｋＤ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が含まれた。１５０Ｖで１時間泳動させた後、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅクマシータンパク質染色試薬（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を用いてゲルを染色し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で簡単に洗浄し、次いで、Ｇｅｌ Ｄｏｃシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で画像化した。
液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によるタンパク質質量分析
タンパク質種の定量を、多少の変更を加えて前述したように、高分解能ＬＣ－ＭＳシステムで行った３４。簡潔に記載すると、約１５μｇの各精製試料を非還元ＬＣ－ＭＳによって分析し、試料の完全性を維持し、鎖対合情報を保持した。ＬＣ－ＭＳシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２２４ ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析計に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＰＬＣから構成された。クロマトグラフィー分離には、７０℃に加熱したＺｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００ＳＢ－Ｃ８ ２．１×５０ｍｍ、１．８μｍ ＵＰＬＣカラムを用い、流量０．５ｍｌ／分で行った。ＭＳ法は、０．７スペクトル／秒を取得するｍ／ｚ［１０００－７０００］を走査する。得られたスペクトルを合計し、次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（バージョンＢ．０７．００）又はＰｒｏｔｅｉｎ ＭｅｔｒｉｃｓのＩｎｔａｃｔ Ｐｒｏｇｒａｍモジュールを使用してデコンボリューションした。Ｅｘｃｅｌベースのツールを使用して、様々な正しい種及び誤対合した種のインタクト質量及び強度を算出した。４本鎖ヘテロＦｃの場合、以下の種を算出する：４つの固有の鎖を有するＩｇＧ種、ＨＣヘテロ二量体を有するが１つのＬＣの２×を有するＩｇＧ種、ＨＣホモ二量体を有するＩｇＧ種、及び１／２ Ａｂ種。
結合親和性の特徴付け
可溶性抗原に対する精製抗体（二重特異性又はモノクローナル）の結合親和性（ＫＤ平衡解離定数）を測定するために、抗体をまずビオチン化ポリクローナル捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてストレプトアビジンＳＡＸバイオセンサーチップに捕捉し、次いで、各可溶性抗原の希釈系列でインキュベートした。このアッセイ形式は、二価抗体が固定化され、バイオセンサーチップ上にあり、各可溶性抗原の同じ連続希釈に対して試験されるように選択された。したがって、測定された定量的ＫＤ親和性は、一価の１：１結合相互作用を示し、直接比較することができる。実験は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ装置において、２７℃及び１０００ＲＰＭで標準的な５Ｈｚデータ取得速度を有する９６チップモードを用いて行った。Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｖ１６ソフトウェアを使用して、生のＯｃｔｅｔ結合データを、インストールしたＳＰＲ速度曲線フィッティングパッケージを用いて処理し、１：１結合モデルにグローバルに適合させて、会合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）を決定した。次いで、平衡解離定数（ＫＤ）をｋｄ／ｋａの比として算出した。
結果
抗体可変領域の多様性は、連鎖選択性評価の理論的根拠を提供する
ＩｇＧ分子は、エピトープを認識する２つの断片抗原結合（Ｆａｂ）領域と、細胞表面の受容体と相互作用する断片結晶化可能（Ｆｃ）領域から構成される（図１Ａ）。Ｆａｂ領域では、２つの主要な接触点がＨＣ／ＬＣ相互作用を媒介する：ＶＨ／ＶＬドメイン及びＣＨ１／ＣＬドメイン。抗体は、ＣＨ１／ＣＬ界面をほとんど保存するが（ＬＣカッパ／ラムダ多様性のみが考慮される）、ＶＨ－ＶＬ界面は可変性が高く、各抗体に固有である。実際、ここでは、フレームワーク（ＦＷ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）の両方が界面全体で直接係合している（図１Ａ）。ＶＨ／ＶＬ界面の本来の特性をさらに評価するために、様々な関連する治療標的に対して生成されたＡｂの６つのｘ線構造を分析した。これらの６つの構造にわたって、約１００（９４～１１２）個の残基がＨＣ／ＬＣ界面（１，６２０～１，８８０Å２の埋込み表面積）に介在し、それらの４０％超がＶＨ／ＶＬ界面に位置し、ＣＤＲは全体の約２０％を占めると算出された（図１Ｂ）。全ての６つのＣＤＲの中で、ＨＣ中のＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３並びにＬＣ中のＣＤＲ－Ｌ３は最も接触する残基を有し、全体的なＨＣ／ＬＣ相互作用の１５％超を占めている。ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３は、抗体標的特異性の主要な決定因子であるため、可変性が高く、低い配列同一性（それぞれ１１．１％及び２３．３％（図１Ｃ））を示す。多様性の高いＣＤＲがＨＣ／ＬＣ相互作用に寄与し得るという事実のために、他より好ましいＨＣ／ＬＣ対及び界面が存在する可能性があると仮定された。さらに、ＶＨ／ＶＬ相互作用は、報告によれば、第四次ＩｇＧ構造のアセンブリ中の第一段階であるので２１、２２、好ましいＶＨ／ＶＬ対は、同族ＨＣ／ＬＣ対合をプライミングするための鍵であり得る。したがって、正しいＨＣ／ＬＣ対合が４本鎖ヘテロＦｃのアセンブリにとって重要であるので、非同族よりも同族ＨＣ／ＬＣ対合に高い優先性を示す親ｍＡｂが理想的なビルディングブロックとして機能し得ることが合理的に説明された。同時に、非特異的であることが示された鎖（すなわち、無差別なＬＣ）は、ｃＬＣを探索する機会を提供する。したがって、抗体の配列の本来の特性を深く理解することにより、設計目標により適したバイスペシフィックの作製が容易になり得る。
連鎖選択性評価スクリーニング法の説明
ＩｇＧ様バイスペシフィックの開発を容易にするために、ＨＣ／ＬＣ選択性を評価するハイスループットスクリーニングプロセスＣＳＡ（図２Ａ）が想定される。
抗体ＨＣはＬＣに結合したときにのみ分泌されるので２１、２２、所与のＨＣ／ＬＣ対の発現レベル量は、ＨＣ／ＬＣ対合効率と相関し得る。２つの親抗体パネル（抗標的Ａ及び抗標的Ｂ）から出発して、ハイスループットＣＳＡを２つの異なるシナリオ（競合及び非競合）で展開して、ヘテロＦｃ（４本の鎖）のアセンブリにおける特異性を評価し、ｃＬＣヘテロＦｃ（３本の鎖）の無差別ＬＣをそれぞれ同定した（図２Ａ及び２Ｂ）。ｃＣＳＡ実験は４つの異なる鎖（２×ＨＣ及び２×ＬＣ）の共発現シナリオを模倣し、抗標的Ａ親抗体と抗標的Ｂ親抗体との間の全ての可能な組み合わせをもたらす。発現したヘテロＦｃを、ＰｒｏＡビーズを含む馴化培地から精製し、正しいＨＣ／ＬＣ対合の割合を、高分解能液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって定量した（図２Ｂ及び１５）。４つのヘテロＦｃ種のうち２つは同じＭＷを示し得、そのうちの１つは、両ＬＣ（ＬＣＡ及びＬＣＢ）が反対の非同族ＨＣとの完全な交差対を有するシナリオを表すことは注目に値する（図２Ｂ）。このＬＣ－ＭＳはそのような種を区別することができないが、ＬＣのこのスクランブルは限られたタンパク質分解の後でもめったに見られず、ＬＣ－ＭＳによって検出される正確なＭＷが正しいＨＣ／ＬＣ対合を示すことを強く示唆する。正しい種の割合の高さは、非同族よりも同族ＨＣ／ＬＣ対合の優先性を示す指標である。高レベルの正しい種を有する抗体の組み合わせは、正しい／特異的なＨＣ／ＬＣ対合を必要とするバイスペシフィックのための最適なビルディングブロックとして選択される（図２Ｂ）。ｎｃＣＳＡ実験に関しては、抗標的Ａ由来の各単一ＨＣが抗標的Ｂ由来の各ＬＣと１：１の比で対合し、逆もまた同様である。ＰｒｏＡ捕捉によって測定される高い発現レベル（ＨＣ／ＬＣ同族対に匹敵するか又はそれ以上）は、ＬＣが良好に対合し、非同族ＨＣが折り畳まれて分泌されることを示す（図２Ｂ）。対照的に、低い発現レベルは、これらの鎖のＶＨ／ＶＬ界面がそれらの同族界面に特異的であり、結果として他のものに適応できないことを示唆する。次に、同じＰｒｏＡ精製材料を使用し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔにより結合親和性を特徴付けるために、第２のハイスループット工程を組み込んだ。このプロトコルにより、迅速（５週間未満）且つ効率的なツールによって、ｃＬＣ二重特異性抗体のビルディングブロックとして使用することができる稀で価値のあるＬＣをスクリーニングし同定することが可能になる。
競合ＣＳＡ法を用いた低交差対合抗体組み合わせの同定
ｃＣＳＡ法を検証するために、２つの親抗体パネル（８つの抗標的ＡＡｂ（Ａ１～Ａ８）及び４つの抗標的ＢＡｂ（Ｂ１～Ｂ４））を選択した。重－重鎖対合を駆動するために変異を導入し、各標的由来の抗体を組み合わせ、評価のために３２の組み合わせを得た。馴化培地からの分泌ＩｇＧを精製した後、組み合わせ及び親ｍＡｂの発現レベルをＡ２８０によって測定した（図３Ａ及び１６）。特に、親ｍＡｂは、５０～２５０ｍｇ／Ｌの範囲の発現レベルの大きい変動を示した。驚くべきことに、抗体の組み合わせのほとんどは、少数の例外（Ａ３×Ｂ１、Ａ３×Ｂ３、Ａ３×Ｂ４及びＡ６×Ｂ１）（これらは、低発現親Ａ３及びＢ１に関連し得る）を除いて１００ｍｇ／Ｌより高いレベルで発現した。構築され分泌された種が正しいＨＣ／ＬＣ対合を有するかどうかを同定するために、非還元ＬＣ－ＭＳを用いてＰｒｏＡ精製タンパク質を分析した（図３Ｂに例示）。ＰｒｏＡビーズによる精製のために分子のＦｃ領域を使用することによって、ＨＣ含有分子のみが選択され、他のすべての種（例えば、ＬＣ二量体）は廃棄される。ＬＣ－ＭＳ分析は、２対の同族ＨＣ／ＬＣが正しく対合されているかどうかを確認することができないが、各種が４つの鎖のそれぞれのコピーを有するかどうかは決定することができる。決定的ではないが、これはヘテロＦｃの構築及び生成に必要な条件である。したがって、これらの３つの可能なＨＣ／ＬＣシナリオのそれぞれの割合を算出した：１×ＨＣＡ＋１×ＨＣＢ＋１×ＬＣＡ＋１×ＬＣＢ、１×ＨＣＡ＋１×ＨＣＢ＋２×ＬＣＡ＋０×ＬＣＢ及び１×ＨＣＡ＋１×ＨＣＢ＋０×ＬＣＡ＋２×ＬＣＢ（全て、ＨＣヘテロ二量体を含む）（図３Ｃ）。２つの組み合わせ（Ａ２×Ｂ３及びＡ４×Ｂ３）は、２つのＬＣ間のＭＷ差が小さい（＜６０Ｄａ）ため、ＬＣ－ＭＳ分析において失敗したが、他の３０の組み合わせの全てで、ＩｇＧ種の定量に成功した。さらに、Ａｂの組み合わせにおけるＦｃ ＣＰＭはＨＣヘテロ二量体化を増強するために配置されたが、少量のホモ二量体及び／又は１／２ Ａｂがなお存在した（図８）。しかし、本研究の焦点はＨＣ／ＬＣ対合にあるため、これらの種はさらなる分析から除外した。興味深いことに、データは、試験した分子の約半分（１７／３２）において、検出された所望の種（１×ＨＣＡ＋１×ＬＣＡ＋１×ＨＣＢ＋１×ＬＣＢ）の割合がＰｒｏＡ精製試料中に存在する全種の５０％以上であったことを示した（図３Ｃ）。驚くべきことに、２つの組み合わせ（Ａ６×Ｂ３及びＡ６×Ｂ４）では、正しい生成物の割合は７５％超であった。対照的に、残りの１３種の組み合わせのＰｒｏＡ精製試料は目的の種を含有する割合が５０％未満であり、これらの組み合わせのうちの５種（Ａ１×Ｂ１、Ａ２×Ｂ１、Ａ３×Ｂ２、Ａ４×Ｂ１及びＡ７×Ｂ１）は、所望の種を含有する割合は２５％未満であった（図３Ｃ）。ほとんどの場合に（２３／３２）、望ましくない生成物（１×ＨＣＡ＋１×ＨＣＢ＋２×ＬＣＡ＋０×ＬＣＢ及び１×ＨＣＡ＋１×ＨＣＢ＋０×ＬＣＡ＋２×ＬＣＢ）において１／２のＬＣのみが出現しており、ＬＣのいずれか一方が過剰発現しているか、又はＬＣＡ及びＬＣＢが発現及び分子構築の間に競合し、他方の完全又は部分的抑制をもたらしている可能性があることが示唆された（図３Ｃ）。したがって、この情報を用いて、ｃＣＳＡ法は、単一細胞における発現時のヘテロＦｃの正しいアセンブリを可能にする本来の特性を有する親ｍＡｂの好適な組み合わせを効率的にスクリーニングし、同定することができる。これにより、より有望な特性を有する候補に努力を向けながら、候補を除外することが可能になり、時間及びリソースを節約することができる。
低交差対合抗体組み合わせは、４本鎖ヘテロＦＣを作製するための良好な候補である
上記のｃＣＳＡ法では、組み合わせの半分超（１７／３２）が、高レベル（≧５０％）の所望の種（１×ＨＣＡ＋１×ＬＣＡ＋１×ＨＣＢ＋１×ＬＣＢ）を示した（図３Ｃ）。しかしながら、このハイスループット法が正しい同族ＨＣ／ＬＣ対合を真に予測するかどうかを評価するために、３２個のヘテロＦｃをスケールアップし、ＰｒｏＡ後に陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）を続ける２段階精製を行うこととした。目的は、所望の種の最終収率を定量化することだけでなく、ＣＩＥＸ工程における分離プロファイルを研究することであった。３２個のヘテロＦｃから、ＳＥＣ及びＬＣ－ＭＳによって決定されるように、１１個を９０％超の最終純度で首尾よく精製した（図４Ａ及び図８）。興味深いことに、これらのヘテロＦｃのビルディングブロックである親ｍＡｂの最終収率は、得られる二重特異性分子の収率と相関するようである。実際、最も高いタンパク質収率を示すヘテロＦｃのＡ１×Ｂ３、Ａ１×Ｂ４、Ａ４×Ｂ３及びＡ８×Ｂ３は全て、高発現親ｍＡｂのＡ１、Ａ４及びＡ８の少なくとも１つを含有する（図４Ａ）。最終的な検証のために、９０％超のＬＣ－ＭＳ純度を有する最終プールを、同族ＨＣ／ＬＣ対合を評価するために重要な標的Ａ及び標的Ｂに対する結合について評価した。それぞれの標的に対する二重特異性分子中の各アームの親和性は、親ｍＡｂの親和性と同等であり（図１７）、１１個のヘテロＦｃの全てが両方のアームにおいて正しいＨＣ／ＬＣを有することが確認された。
全体として、このデータはｃＣＳＡ実験とよく一致する（図４Ｅ）。１１個の首尾よく精製されたヘテロＦｃから、ＬＣ－ＭＳによって予測された正しいＨＣ／ＬＣ対合の割合は、８分子で高く（５０％以上正しいＨＣ／ＬＣ種、Ａ１×Ｂ３、Ａ１×Ｂ４、Ａ３×Ｂ３、Ａ４×Ｂ２、Ａ４×Ｂ４、Ａ６×Ｂ２、Ａ６×Ｂ４及びＡ８×Ｂ３）、Ａ７×Ｂ４は良好であり（４７．４％正しい種）、Ａ２×Ｂ３及びＡ４×Ｂ３は不明であった（鎖間のＭＷ差が小さいため不定）。最も重要なことに、ＣＳＡによる低ＨＣ／ＬＣ対合を示した分子はいずれも、ＣＩＥＸによって精製することができなかった（図３Ｃ及び４Ａ）。実際、ｃＣＳＡによって決定された正しい種の割合は、良好なヘテロＦｃをもたらすＡｂの組み合わせを予測した（ＲＯＣ ＡＵＣ ０．８０、図４Ｂ）。さらに、ｃＣＳＡによって予測されたＨＣ／ＬＣ対合の割合と最終収率との間の相関を構築することも試みた。図４Ｃに示すように、ｃＣＳＡによる正しいＨＣ／ＬＣ対合が５０％未満の組み合わせ（１２／１３）の大部分は、後のＣＩＥＸ精製中に失敗した。１つの例外はＡ７×Ｂ４分子であり、４７．４％の対合を示しながら、適切な分離を伴うＣＩＥＸプロファイルを示した（図４Ｄ）。興味深いことに、ＣＩＥＸは、ｃＣＳＡによって予測された５０％以上の正しいＨＣ／ＬＣ対合を有する１７分子のうち９分子を精製することができなかった（図４Ｃ）。実際、この現象を説明するために、本発明者らは、ｃＣＳＡ実験において６９．４％の正しい対合を示したＡ８×Ｂ４ヘテロＦｃの例を選択した。この分子は、２つの異なる種（１×ＨＣＡ＋１×ＨＣＢ＋１×ＬＣＡ＋１×ＬＣＢ及び１×ＨＣＡ＋１×ＨＣＢ＋２×ＬＣＡ＋０×ＬＣＢ）間の分解能が観察されないように、誤対合した種を隠す良好な形状のピークを示す（図４Ｄ）。したがって、ｃＣＳＡ法は、本来のＶＨ／ＶＬ界面に基づいて高性能のヘテロＦｃ分子を予測することができるが、ｃＣＳＡによってスクリーニングされない特性（例えば、イオン交換クロマトグラフィーカラムの分離プロファイルに影響を及ぼす特性）もまた、ヘテロＦｃを選択する際に重要な役割を果たす。
非競合ＣＳＡ法による共通ＬＣのスクリーニング
上記に示すように、いくつかのＬＣは、好ましくはそれらの同族ＨＣと対合するが、他のＬＣは非同族ＨＣに効率的に結合することもできる。得られた非同族ＨＣ／ＬＣ対が結合を保持する場合、そのようなＬＣは、共通ＬＣ（ｃＬＣ）として機能することができる。ｎｃＣＳＡ法は、親ｍＡｂがそのようなＬＣを提供するかどうかを評価するための日和見的アプローチとして想定される（図２Ｂ）。この方法の有効性を実証するために、８種の抗標的Ａ親ｍＡｂ、４種の抗標的Ｂ親ｍＡｂ、及び１０種の抗標的Ｃ親ｍＡｂを含む２つの二重特異性プログラム（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）を選択した。図９に示すように、抗標的Ｂの各ＬＣは、抗標的Ａ又は抗標的Ｃの各ｍＡｂ由来の個々のＨＣと対合した。一方、抗標的Ｂの各ＨＣを、異なる抗標的Ａ又は抗標的Ｃの各ｍＡｂ由来の個々のＬＣと組み合わせた。得られた１４４種の非同族ＨＣ／ＬＣ対を、２９３ ６Ｅにおいて、２２種の親ｍＡｂ（対照）とともに発現させ、ＰｒｏＡビーズで精製し、続いて、非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル及びＡ２８０定量法を用いて分析した（図１０）。これらの１４４種の非同族ＨＣ／ＬＣ対（図５Ａ及び図９）についてのＰｒｏＡ収率のさらなる分析は、１４４種の組み合わせのうちの３８種（２６．４％）のみが発現レベルの有意な減少（対照に対して５０％以下）を示したことを示し、ＨＣ／ＬＣ対内の全体的な広範な無差別の挙動を示唆する。残りの１０６種の組み合わせのうち、６８（４７．２％）のＨＣ／ＬＣ非同族対合分子は、対応する親ｍＡｂ対照よりも高い発現レベルを示した（図５Ａ）。しかし、多くのＬＣは広く無差別ではなかった。２つの例を詳しく見ることが、この現象を説明するのに役立つ。ＬＣ－Ｂ１～４をＨＣ－Ａ７と対合させた場合、タンパク質発現は、同族ＬＣ－Ａ７（対照）と比較して有意に低かった（図５Ｂ）。対照的に、ＨＣ－Ａ８と対合した同じ抗標的ＢのＬＣの発現レベルは、同族ＬＣ－Ａ８（対照）と同等か又はそれより高い。したがって、抗標的Ｂ ＬＣはＨＣ－Ａ８に関して無差別であるが、ＨＣ－Ａ７に対しては無差別でないことを示唆し、ＨＣがＬＣ交差対合の決定に果たしている役割を強調している。
共通ＬＣヘテロＦＣ候補を特定する結合分析
よく発現する非同族Ａｂの組み合わせは、ｃＬＣバイスペシフィックを構築するための有望な候補であるが、発現レベルのみでは機能についての洞察を提供しない。機能的バイスペシフィックを選択するために、選択された無差別ＬＣ（ｎｃＣＳＡアッセイにおいて、同族対照に対して５０％以上の発現レベルを示す（図５Ａ））を、ＨＣ二量体化を促進するために、Ｆｃ ＣＰＭを含有する同族ＨＣ及び非同族ＨＣの両方を有するヘテロＦｃ形態に組み立てた（図５Ｃ）。これらのｃＬＣヘテロＦｃをハイスループット結合アッセイで評価して、両方の標的への結合を可能にする候補を同定した。ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞を用いた４ｍＬディープウェルブロック（ＤＷＢ）中でのハイスループット発現後、ｃＬＣヘテロＦｃをＰｒｏＡにより精製した。１０６分子中９２分子（８６．８％）の収率は約１００ｍｇ／Ｌであり、これは親ｍＡｂに匹敵し（図３Ａ及び図１１）、１４のｃＬＣヘテロＦｃ（１３．２％）のみが６０ｍｇ／Ｌ未満のＰｒｏＡ収率を示した（図５Ｄ及びＥ）。ｃＬＣ Ｂ１を有する全ての分子は著しく低い発現を示し、このＬＣが、これらのバイスペシフィックの全体的な発現において制限因子として作用し得ることを示唆した（図５Ｄ）。実際、４１．６ｍｇ／ＬのＢ１抗体のＰｒｏＡ収率は、これらのバイスペシフィックの生成のためのビルディングブロックとして使用された全ての親ｍＡｂの中で最も低かった（図３Ａ）。Ａ３及びＡ６親ｍＡｂもまた、比較的低いＰｒｏＡ回収（それぞれ、６０．３及び６９．３ｍｇ／Ｌ）を示したが、これらの２つのビルディングブロックを含有するｃＬＣヘテロＦｃは、Ｂ１以外の任意のＢ親と組み合わせた場合、許容されるタンパク質収率を示し、この場合、非同族ＨＣが発現レベルを救済した可能性があることを示唆する（図５Ｄ）。別の重要な観察は、ｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ×Ｂ及びＣ×Ｂ）もまた、ＰｒｏＡ精製直後に４本鎖ヘテロＦｃｓよりも全体的に正しい対合の約２倍の増加を示し、これらの分子の生成レベルにおけるＨＣ／ＬＣ対合の影響を強調していることである（図１２）。
次いで、迅速な結合スクリーニングのために、これらの一段階精製試料をＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔによって評価した。残留不純物による干渉を最小限にするために、ｃＬＣヘテロＦｃ分子を、Ｆｃ領域を介してビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃポリクローナル抗体を有するストレプトアビジン光ファイバーバイオセンサーに最初に捕捉し、可溶性抗原Ａ、Ｂ又はＣをインキュベーションのためにロードした。予想どおり、全てのｃＬＣヘテロＦｃは、親ｍＡｂに匹敵する親和性で、同族ＨＣ／ＬＣアームを介してそれらのそれぞれの標的への結合を示した（図５Ｆ）。２ｃＬＣヘテロＦｃ（Ａ２×Ｂ４及びＣ４×Ｂ３）はまた、標的Ａ又は標的Ｃを認識する非同族ＨＣ／ＬＣアームを介して検出可能な結合を示した（図５Ｆ）。Ａ２×Ｂ４の場合、Ｂ４ ＬＣは両方のＨＣ（Ａ２及びＢ４）と対合し、一方、Ｃ４×Ｂ３の場合、ＨＣ（Ｃ４及びＢ３）は両方ともＢ３ ＬＣと対合した。注目すべきことに、これらのｃＬＣは両方とも標的Ｂに対して生成された。この非標準結合は、親ｍＡｂに典型的に観察される１桁のｎＭ結合よりも低いが（図１３）、ｎｃＣＳＡ法が非同族ＨＣとの高効率の対合を可能にする固有の構造的特徴を有するＬＣを同定する新たな機会をどのように提供するかを示している（図５Ｇ）。さらに、迅速な結合分析は、新たなエピトープへの結合も保持する稀なｃＬＣを明らかにすることができる。ＩｇＧ様バイスペシフィックの製造可能性は、多くの場合、ｍＡｂの生産レベルを下回る生産レベルで困難であるので２３、これらのｃＬＣヘテロＦｃの発現及び精製特性を調ベた。治療候補に必要とされるスケール及び精製プロセスをよりよく模倣するために、これらの２つの分子を２５０ｍＬのＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中で発現させ、ＰｒｏＡ、続くＣＩＥＸを用いた２段階精製に供し、９５％超の純度目標を満たした。特に、ＰｒｏＡによるタンパク質分泌のレベルは、親ｍＡｂと比較した場合、これらの２ｃＬＣヘテロＦｃについて２倍を超えて高かった（図１４）。より重要なことに、これらのｃＬＣヘテロＦｃは、親ｍＡｂに匹敵するか、又はそれより高い最終収率を示し（図６Ａ）、全てが所望の種の９７％を超える純度を示した（図１４）。さらに、これらのバイスペシフィックは、不純物から容易に分離される正しい種を有する好ましいＣＩＥＸプロファイルを示した（図６Ｂ）。次いで、結合アッセイを、十分に精製したｃＬＣヘテロＦｃを用いて繰り返し、それぞれの抗原に対する親和性を確認した。最初に観察されたように（図５Ｆ）、これらの２つの分子は、抗原Ｂに対する同族アームにおける結合特性を保持しながら、抗原Ａ又は抗原Ｃに対し、それらの非同族ＨＣ／ＬＣアームを介して結合親和性を示した（図６Ｃ及びＳ７）。これらのｃＬＣヘテロＦｃについて測定された親和性を検証するために、非同族ＨＣ及びＬＣから構成される２つのハイブリッドＩｇＧ（それぞれＨＣ－Ａ２／ＬＣ－Ｂ４及びＨＣ－Ｃ４／ＬＣ－Ｂ３）を発現させ、精製した。ハイブリッド分子の非同族アームを介した抗原Ａ及び抗原Ｃに対する同等の親和性（図６Ｄ）は、ｃＬＣヘテロＦｃ結合をさらに確認した。ハイブリッドＩｇＧの結合シグナルは、ｃＬＣヘテロＦｃの非同族アームで観察されたシグナルよりも約２倍高く、これらの分子に存在する結合部位の数と一致する（それぞれ２対１）。さらに、それらのいずれも抗原Ｂへの結合を保持しないようであるので、ハイブリッドＩｇＧの結合能力はほとんどがＨＣ ＣＤＲによって駆動され、ＬＣによっては駆動されないことが示唆される。逆に、ｃＬＣヘテロＦｃにおける同族アームによる抗原Ａ又は抗原Ｃへの非特異的結合の可能性も排除するために、Ｂ４及びＢ３の親ｍＡｂに対する結合を試験した。図６Ｅに示すように、Ｂ４及びＢ３の各ｍＡｂはこれらの抗原に結合せず、非同族アームについて検出される結合は同族アームと抗原Ａ又は抗原Ｃとの間の非特異的相互作用に由来せず、ｃＬＣ単独の結果でもないことをさらに示した。
まとめると、ｎｃＣＳＡ法は、ｍＡｂ様生産性を示す非同族ＨＣと対合したｍＡｂのプールから２つの稀なＬＣを首尾よく同定し、一方、この非同族ＨＣ／ＬＣアーム中のＨＣが結合活性を保持することを可能にした。
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３．Ｆａｎ，Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｈａｏ，Ｍ．＆ Ｌｉ，Ｊ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ８，１３０（２０１５）．
４．Ｗｏｌｆ，Ｅ．，Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｒ．，Ｋｕｆｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ，Ｂ．＆ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．ＢｉＴＥｓ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １０，１２３７－１２４４（２００５）．
５．Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７６，８３６－８４７（２０１７）．
６．Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．＆ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＭＡｂｓ ９，１８２－２１２（２０１７）．
７．Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂａｓｅｌ）８（２０１９）．
８．Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．，Ｚｈａｉ，Ｑ．＆ Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７，９５－１０６（２０１５）．
９．Ｓｕｒｅｓｈ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｙｂｒｉｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １２１，２１０－２２８（１９８６）．
１０．Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１）．
１１．Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．＆ Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）．
１２．Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ：ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｉｎ ａｎ Ｆｃ ａｎａｌｏｇｕｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｂｉｎｄｅｒｓ ｏｒ ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３，１９５－２０２（２０１０）．
１３．Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＩｇＧ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５，１９６３７－１９６４６（２０１０）．
１４．Ｄｉｌｌｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｓｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．ＭＡｂｓ ９，２１３－２３０（２０１７）．
１５．Ｓｈｉｒａｉｗａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＥＲＹ９７４．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４，１０－２０（２０１９）．
１６．Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６，６７７－６８１（１９９８）．
１７．Ｋｒａｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａｎｉｍａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ３０，２９１－３０１（２０１７）．
１８．Ｇａｒｃｅｓ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＧＲＰＲ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ Ｍｉｇｒａｉｎｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｉｍｏｖｉｇ（Ｅｒｅｎｕｍａｂ）．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ３０，１７１４－１７２３ ｅ１７１６（２０２０）．
１９．Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）６３，１０１－１０８（２０１５）．
２０．Ｆｏｌｔｚ，Ｉ．Ｎ．，Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．＆ Ｋｉｎｇ，Ｃ．Ｔ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｂｉｏ－ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２７０，５１－６４（２０１６）．
２１．Ｆｅｉｇｅ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ＣＨ１ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３４，５６９－５７９（２００９）．
２２．Ｆｅｉｇｅ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８４４，２０２４－２０３１（２０１４）．
２３．Ｑｉｏｎｇ Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，Ｊａｅｙｏｕｎｇ Ｐａｒｋ ，Ｘｉａｏ Ｌｉｕ，Ｙｉｆｅｎｇ Ｈｕ，Ｔｉｅｘｉｎ Ｗａｎｇ，＆ Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ，Ｋ．Ｍ．ａ．Ｍ．Ｊ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２０１９）．
２４．Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ａｓ ａ ｇｅｎｅｒｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８，１１１８７－１１１９２（２０１１）．
２５．Ｖａｎ Ｂｌａｒｃｏｍ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｙｉｅｌｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐａｎｅｌｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＭＡｂｓ １０，２５６－２６８（２０１８）．
２６．Ｆｅｉｇｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｌ．Ｍ．＆ Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｈｏｗ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｌｄ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ３５，１８９－１９８（２０１０）．
２７．Ｓａｐｈｉｒｅ，Ｅ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＩＧＧ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ－１：ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３，１１５５－１１５９（２００１）．
２８．Ｓｃａｐｉｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ＰＤ１ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＩｇＧ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２，９５３－９５８（２０１５）．
２９．Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，Ｅ．＆Ｈｅｎｒｉｃｋ，Ｋ．Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｓｔａｔｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７２，７７４－７９７（２００７）．
３０．Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．，Ｋａｎｄｚｉａ，Ｒ．＆ Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．Ａ ｏｎｅ ｐｏｔ，ｏｎｅ ｓｔｅｐ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ３，ｅ３６４７（２００８）．
３１．Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｆ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎ ＩｇＧ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｌａｃｋｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２，１８６５－１８７５（２０１７）．
３２．Ｙｏｏ，Ｄ．，Ｐｒｏｖｃｈｙ，Ｊ．，Ｐａｒｋ，Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｃ．＆ Ｗａｌｋｅｒ，Ｋ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｎ ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ ａｎｄ ａ ＣＥＴＡＣ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １３４４，２３－３０（２０１４）．
３３．Ｗｉｎｔｅｒｓ，Ｄ．，Ｃｈｕ，Ｃ．＆ Ｗａｌｋｅｒ，Ｋ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｔｗｏ－ｓｔｅｐ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｕｓｉｎｇ ａｎ ＡＫＴＡ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ－ｌｉｎｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １４２４，５１－５８（２０１５）．
３４．Ｓｐａｈｒ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｃ－ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．ＭＡｂｓ １０，１２９１－１３００（２０１８）．

Claims (36)

  1. 多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
    （ａ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｂ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｃ）ベクターに
    （ｉ）前記第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
    （ｉｉ）前記第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
    （ｉｉｉ）
    （ａ）前記第１の抗原に特異的に結合する前記３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
    （ｂ）前記第２の抗原に特異的に結合する前記３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
    （ｃ）前記第１の抗原にも前記第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
    からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
    をクローニングする工程であって、
    前記ベクターは１つのタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する前記重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の前記軽鎖ＣＤＲを含む複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
    （ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
    （ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
    （ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの前記第１の抗原及び前記第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程、
    （ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
    （ｇ）第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の前記軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の前記同じ軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の前記発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の前記結合親和性を比較する工程
    を含む方法。
  2. 前記複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（「ＣＯＳ－７」）、ヒト胎児腎臓株ＨＥＫ２９３－６Ｅ（「ＨＥＫ２９３－６Ｅ」）、ヒト胎児腎臓株ＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ２９３」）、ベビーハムスター腎臓細胞（「ＢＨＫ」）、マウスセルトリ細胞（「ＴＭ４」）、サル腎臓細胞（「ＣＶ１」）、アフリカミドリザル腎臓細胞（「ＶＥＲＯ－７６」）、ヒト子宮頸癌細胞（「ＨＥＬＡ」）、イヌ腎臓細胞（“ＭＤＣＫ”）、バッファローラット肝臓細胞（“ＢＲＬ”）、ヒト胚細胞（“Ｗ１３８”）、ヒトヘパトーマ細胞（“Ｈｅｐ Ｇ２”）、マウス乳癌（“ＭＭＴ”）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記発現レベルは、Ａ２８０測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、ブラッドフォードアッセイ、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイからなる群から選択される方法によって決定される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記第１の抗原及び前記第２の抗原に対する各多重特異性抗体コンストラクトの結合親和性は、Ｏｃｔｅｔ、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ、ＳＰＲ及びフローサイトメトリーを使用して測定される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 各多重特異性抗体コンストラクトは、プロテインＡ、ラムダ及びカッパ樹脂、並びにアフィニティータグ精製によって精製される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
    （ａ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｂ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｃ）ベクターに
    （ｉ）前記第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
    （ｉｉ）前記第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
    （ｉｉｉ）
    （ａ）前記第１の抗原に特異的に結合する前記３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
    （ｂ）前記第２の抗原に特異的に結合する前記３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
    （ｃ）前記第１の抗原にも前記第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
    からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
    をクローニングする工程であって、
    前記ベクターは多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する前記重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の前記軽鎖ＣＤＲを含む複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
    （ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、前記哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
    （ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
    （ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）Ｏｃｔｅｔを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの前記第１の抗原及び前記第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程、
    （ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
    （ｇ）第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の前記軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の前記同じ軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の前記発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の前記結合親和性を比較する工程
    を含む方法。
  10. 前記多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
    （ａ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｂ）複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｃ）前記２つの複数のＣＤＲを、多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードするベクターにクローニングする工程であって、各抗原に結合する前記ＣＤＲを含む複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
    （ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
    （ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
    （ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、並びに（ｉｉ）生成された正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
    （ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
    （ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の前記発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
    を含む方法。
  12. 前記複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記複数の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ（ここで、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む）は、少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも３つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも４つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも５つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも６つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも７つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも８つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；少なくとも９つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせ；及び少なくとも１０の抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 前記多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（「ＣＯＳ－７」）、ヒト胎児腎臓株ＨＥＫ２９３－６Ｅ（「ＨＥＫ２９３－６Ｅ」）、ヒト胎児腎臓株ＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ２９３」）、ベビーハムスター腎臓細胞（「ＢＨＫ」）、マウスセルトリ細胞（「ＴＭ４」）、サル腎臓細胞（「ＣＶ１」）、アフリカミドリザル腎臓細胞（「ＶＥＲＯ－７６」）、ヒト子宮頸癌細胞（「ＨＥＬＡ」）、イヌ腎臓細胞（“ＭＤＣＫ”）、バッファローラット肝臓細胞（“ＢＲＬ”）、ヒト胚細胞（“Ｗ１３８”）、ヒトヘパトーマ細胞（“Ｈｅｐ Ｇ２”）、マウス乳癌（“ＭＭＴ”）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞からなる群から選択される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記発現レベルは、Ａ２８０測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、ブラッドフォードアッセイ、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイからなる群から選択される方法によって決定される、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合は、液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）、Ｃａｌｉｐｅｒ、ＨＰＬＣ ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びマイクロチップキャピラリー電気泳動（「ＭＣＥ」）からなる群から選択される方法によって決定される、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 各多重特異性抗体コンストラクトは、プロテインＡ、ラムダ及びカッパ樹脂、並びにアフィニティータグ精製によって精製される、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
    （ａ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｂ）複数の少なくとも２つの抗体Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、又はそれらの組み合わせを得る工程であって、各Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｃ）前記２つの複数のＣＤＲを、多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードするベクターにクローニングする工程であって、各抗原に結合する複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
    （ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、前記哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
    （ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
    （ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）を用いて、正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
    （ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
    （ｇ）第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合と、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲの最適な対合を特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
    を含む方法。
  20. 前記多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
    （ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｃ）ベクターに
    （ｉ）前記第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
    （ｉｉ）前記第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
    （ｉｉｉ）
    （ａ）前記第１の抗原に特異的に結合する前記３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
    （ｂ）前記第２の抗原に特異的に結合する前記３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
    （ｃ）前記第１の抗原にも前記第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
    からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
    をクローニングする工程であって、
    前記ベクターは複数のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する前記重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の前記軽鎖ＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
    （ｄ）哺乳動物宿主細胞において前記異なるモジュールの各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
    （ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
    （ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの前記第１の抗原及び前記第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程、
    （ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
    （ｇ）第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の前記軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の前記同じ軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の前記発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の前記結合親和性を比較する工程
    を含む方法。
  22. 前記多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（「ＣＯＳ－７」）、ヒト胎児腎臓株ＨＥＫ２９３－６Ｅ（「ＨＥＫ２９３－６Ｅ」）、ヒト胎児腎臓株ＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ２９３」）、ベビーハムスター腎臓細胞（「ＢＨＫ」）、マウスセルトリ細胞（「ＴＭ４」）、サル腎臓細胞（「ＣＶ１」）、アフリカミドリザル腎臓細胞（「ＶＥＲＯ－７６」）、ヒト子宮頸癌細胞（「ＨＥＬＡ」）、イヌ腎臓細胞（“ＭＤＣＫ”）、バッファローラット肝臓細胞（“ＢＲＬ”）、ヒト胚細胞（“Ｗ１３８”）、ヒトヘパトーマ細胞（“Ｈｅｐ Ｇ２”）、マウス乳癌（“ＭＭＴ”）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞からなる群から選択される、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 前記発現レベルは、Ａ２８０測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、ブラッドフォードアッセイ、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイからなる群から選択される方法によって決定される、請求項２１又は２２に記載の方法。
  25. 前記第１の抗原及び前記第２の抗原に対する各多重特異性抗体コンストラクトの結合親和性は、Ｏｃｔｅｔ、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ、ＳＰＲ又はフローサイトメトリーを使用して測定される、請求項２１又は２２に記載の方法。
  26. 各多重特異性抗体コンストラクトは、プロテインＡ、ラムダ及びカッパ樹脂、並びにアフィニティータグ精製によって精製される、請求項２１又は２２に記載の方法。
  27. 多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
    （ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｃ）ベクターに
    （ｉ）前記第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
    （ｉｉ）前記第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
    （ｉｉｉ）
    （ａ）前記第１の抗原に特異的に結合する前記３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、
    （ｂ）前記第２の抗原に特異的に結合する前記３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ、及び
    （ｃ）前記第１の抗原にも前記第２の抗原にも特異的に結合しない３つの軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ
    からなる群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲ
    をクローニングする工程であって、
    前記ベクターは複数のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する前記重鎖ＣＤＲ及び（ｃ）（ｉｉｉ）の前記軽鎖ＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
    （ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、前記哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
    （ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
    （ｆ）（ｉ）Ａ２８０測定を用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）Ｏｃｔｅｔを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトの前記第１の抗原及び前記第２の抗原に対する結合親和性を測定する工程、
    （ｇ）第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の前記軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲと（ｃ）（ｉｉｉ）の前記同じ軽鎖ＣＤＲの対合に最適なモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の前記発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の前記結合親和性を比較する工程
    を含む方法。
  28. 前記多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
    （ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｃ）前記第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ及び前記第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖのＣＤＲをベクターにクローニングする工程であって
    前記ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する前記ＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
    （ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程；
    （ｅ）各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
    （ｆ）（ｉ）各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、並びに（ｉｉ）生成された正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
    （ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
    （ｇ）第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
    を含む方法。
  30. 前記多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（「ＣＯＳ－７」）、ヒト胎児腎臓株ＨＥＫ２９３－６Ｅ（「ＨＥＫ２９３－６Ｅ」）、ヒト胎児腎臓株ＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ２９３」）、ベビーハムスター腎臓細胞（「ＢＨＫ」）、マウスセルトリ細胞（「ＴＭ４」）、サル腎臓細胞（「ＣＶ１」）、アフリカミドリザル腎臓細胞（「ＶＥＲＯ－７６」）、ヒト子宮頸癌細胞（「ＨＥＬＡ」）、イヌ腎臓細胞（“ＭＤＣＫ”）、バッファローラット肝臓細胞（“ＢＲＬ”）、ヒト胚細胞（“Ｗ１３８”）、ヒトヘパトーマ細胞（“Ｈｅｐ Ｇ２”）、マウス乳癌（“ＭＭＴ”）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞からなる群から選択される、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 前記発現レベルは、Ａ２８０測定、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）、ブラッドフォードアッセイ、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイからなる群から選択される方法によって決定される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合は、液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）、Ｃａｌｉｐｅｒ、ＨＰＬＣ ＳＥＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びマイクロチップキャピラリー電気泳動（「ＭＣＥ」）からなる群から選択される方法によって決定される、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 各多重特異性抗体コンストラクトは、プロテインＡ、ラムダ及びカッパ樹脂、並びにアフィニティータグ精製によって精製される、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 多重特異性抗体コンストラクトを選択するための方法であって、
    （ａ）第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第１の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｂ）第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖを得る工程であって、各Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖは、第２の抗原に特異的に結合する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、工程；
    （ｃ）前記第１の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ及び前記第２の抗体Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖのＣＤＲをベクターにクローニングする工程であって
    前記ベクターは２つ以上のタイプの多重特異性抗体コンストラクトモジュールをコードし、各抗原に結合する前記ＣＤＲを含む異なるモジュールの複数の多重特異性抗体コンストラクトをコードする複数のベクターが生成される、工程；
    （ｄ）哺乳動物宿主細胞において各多重特異性抗体コンストラクトを発現させる工程であって、前記哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、工程；
    （ｅ）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、各多重特異性抗体コンストラクトを精製する工程；
    （ｆ）（ｉ）Ａ２８０を用いて各多重特異性抗体コンストラクトの発現レベルを測定する工程、及び（ｉｉ）液体クロマトグラフィー－質量分析（「ＬＣ－ＭＳ」）を用いて、正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を算出する工程
    （ここで、工程（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）は同時に、又は任意の順序で実施することができる）；並びに
    （ｇ）第１の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールと、第２の抗原に特異的に結合する前記３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲの対合に最適な多重特異性抗体コンストラクトモジュールを特定するために、各多重特異性抗体コンストラクトについて、（ｆ）（ｉ）の発現レベル及び（ｆ）（ｉｉ）の正しい及び正しくない多重特異性抗体コンストラクトモジュール種の割合を比較する工程
    を含む方法。
  36. 前記多重特異性抗体コンストラクトモジュールは、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ、ｓｃＦａｂ／ｓｃＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／Ｆａｂ－ｓｃＦｖヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ－ＦａｂヘテロＦｃ、Ｆａｂ／ＦａｂヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる群から選択されるモジュールのうちの少なくとも２つを含む、請求項３５に記載の方法。
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