JP2024515301A - 多重特異性及び一価のｉｇｇ分子の会合における鎖対形成の静電ステアリングにおけるバランスのとれた電荷分布 - Google Patents

Abstract

二重特異性抗体及び三重特異性抗体のような多重特異性抗体の臨床的可能性は、複合疾患を標的とするのに大いに有望である。しかしながら、それらの分子の作製は、特に、誤対合ポリペプチドを含まない許容される発現レベルを達成することに関して大きな課題を提示する。本明細書で特許請求される発明は、ヘテロ多量体のＣＨ３領域内に設計された電荷を再分布することによって既存の電荷対技術を改良する多重特異性抗原結合タンパク質に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２０日に出願され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１７７，３２５号の利益を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年４月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、名称がＡ－２７４５－ＷＯ０１－ＳＥＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿０４１５２２＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは１２キロバイトである。

本発明は、バイオ医薬品の技術分野に関する。特に、本発明は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインにおいて変異を挿入することによって作製されるヘテロ多量体に関する。多重特異性抗原結合タンパク質は、ヘテロ多量体のＣＨ３領域内に設計された電荷を再分布することによって既存の電荷対技術を改良する。

同じ又は異なる標的における２つの異なるエピトープを認識するように設計されるとき、二重特異性抗体は、新世代の大分子治療薬となる。二重特異性抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）において見られるＴ細胞及び腫瘍細胞の同時の結合などの新規の治療的機能性を付与する方法として注目を集めている。しかしながら、これらの治療薬は、従来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）より複雑であり、開発の全ての段階においてさらなる課題を提示している。

免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、二重特異性抗体を開発するための最も一般的な足場の１つとして使用される。ＩｇＧ分子は、２つの同一の重鎖（ＨＣ）で構成され、それぞれ対称の「Ｙ」形状において合わせてフォールドする同一の軽鎖（ＬＣ）のコピーと対形成する。野生型（ＷＴ）ＩｇＧ内でのＨＣ／ＨＣ相互作用は、ジスルフィド結合を介して可動性のヒンジ領域、Ｎ結合型グリカンを介してＣＨ２／ＣＨ２’界面、及び直接的なタンパク質相互作用を介してＣＨ３／ＣＨ３界面において発生する。しかしながら、二重特異性抗体を開発するとき、単一の細胞における２つの同一ではないＨＣの発現は、多くの場合、２つの対応するホモ二量体の生成をもたらし得る。そのような不純物は、安全性及び有効性に関連する製品品質に影響を及ぼすだけでなく、商品の生産性の歩留まり及びコストにも影響を及ぼすことになる。したがって、ヘテロ－Ｆｃ含有二重特異性抗体の会合に必要となる２つの異なるＨＣの対形成を促進するために、特異的なヘテロ－二量体形成界面が設計されなければならない。結果として、いくつかの工学的アプローチが、正確な鎖対形成の割合を増加させるために開発されており、限定されないが、「ノブ・イントゥ・ホール」技術、鎖交換操作ドメインボディ技術、及び静電ステアリングが挙げられる。しかしながら、それらの技術は、二重特異性抗体の収量がモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のものと同等になる場合、さらなる改良を必要とする。

電荷対変異（ＣＰＭ）の組み込みによって可能になった静電ステアリング現象は、好ましい技術の１つであり、多くの二重特異性抗体が現在臨床開発中である。一方の鎖に負電荷及び他方に正電荷を導入することによって、誘引性の静電力がヘテロ二量体化を促進する一方で、斥力がホモ二量体形成を妨げる。しかしながら、そのようなアプローチは、最適以下の分子をもたらす可能性があり、さらなる設計技術と組み合わせる必要がある場合がある。

本発明は、ヘテロ多量体のＣＨ３領域内に設計された電荷を再分布することによって既存の電荷対技術を改良する。

一態様では、本発明は、第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチド及び第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドを含むヘテロ二量体免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含み、
（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドが、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドが、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う単離されたヘテロ多量体に関する。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、第１の免疫グロブリンＦｃポリペプチド及び第２の免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、第１の免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＦｃポリペプチドは、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、第１のヒンジドメインポリペプチド及び第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド；並びに第２のヒンジドメインポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチド；並びに第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドを含む二重特異性抗体コンストラクトであり、
第１の重鎖ポリペプチドは、第１のＶＨドメイン、第１のＣＨ１ドメインポリペプチド、第１のヒンジドメインポリペプチド、及び第１のＦｃポリペプチドを含み；且つ第２の重鎖ポリペプチドは、第２のＶＨドメイン、第２のＣＨ１ドメインポリペプチド、第２のヒンジドメインポリペプチド、及び第２のＦｃポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、第１及び第２の抗体軽鎖は、同一である。

ある特定の実施形態では、ｉ）第１の重鎖ポリペプチドは、１８３位でリジンを含み；
ｉｉ）第１の軽鎖ポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；
ｉｉｉ）第２の重鎖ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；且つ
ｉｖ）第２の軽鎖ポリペプチドは、１７６位でリジンを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、ｉ）第１の重鎖ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；
ｉｉ）第１の軽鎖ポリペプチドは、１７６位でリジンを含み；
ｉｉｉ）第２の重鎖ポリペプチドは、１８３位でリジンを含み；且つ
ｉｖ）第２の軽鎖ポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩｇＧ１－、ＩｇＧ２－、ＩｇＧ３－又はＩｇＧ４－免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドに由来するか又はその変異バージョンである。

ある特定の実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩｇＧ１－又はＩｇＧ２－免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドに由来するか又はその変異バージョンである。

一態様では、本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、抗原結合タンパク質が、異なるエピトープに結合する少なくとも２つの結合ドメインを含み、哺乳動物宿主細胞において：
（ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含む第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを発現させることを含み；
アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従い、
第１の結合ドメインが、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、第２の結合ドメインが、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、且つ
結合ドメインが、ＶＨ、ｓｃＦａｂ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される方法に関する。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含む。

ある特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含む。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含み；且つ
第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、第２の結合ドメインは、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含み；且つ
第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、第１の結合ドメインは、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂであり、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂである。

ある特定の実施形態では、結合ドメインは、それらの対応するＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの一方、又は両方のいずれかのＣ末端に融合された第３の結合ドメインを含み、第３の結合ドメインは、受容体リガンド ＶＨ、ｓｃＦａｂ、又はｓｃＦｖである。

一態様では、本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、抗原結合タンパク質が、異なるエピトープに結合する少なくとも２つの結合ドメインを含み、哺乳動物宿主細胞において：
（ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含む第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを発現させることを含み；
アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従い、
第１の結合ドメインが、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、第２の結合ドメインが、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、且つ
結合ドメインが、ＶＨ、ｓｃＦａｂ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される方法に関する。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含む。

ある特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含む。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している第１の抗体軽鎖を含み；且つ
第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、第２の結合ドメインは、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している第２の抗体軽鎖を含み；且つ
第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、第１の結合ドメインは、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、第１及び第２の抗体軽鎖は、同一である。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂであり、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂである。

ある特定の実施形態では、結合ドメインは、それらの対応するＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの一方、又は両方のいずれかのＣ末端に融合された第３の結合ドメインを含み、第３の結合ドメインは、受容体リガンド ＶＨ、ｓｃＦａｂ、又はｓｃＦｖである。

ある特定の実施形態では、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド及び第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現は、第１の哺乳動物宿主細胞において実施され、発現は、第１の哺乳動物宿主細胞と同じ型の第２の哺乳動物宿主細胞における
（ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む第３のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第４のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現と比較してＳＥＣによって測定されるとおりの１／２抗体種不純物のより低いパーセンテージをもたらす。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第３の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含み；且つ
（ｉｉ）第４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＫ４３９Ｄを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド及び第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現は、第１の哺乳動物宿主細胞において実施され、発現は、第１の哺乳動物宿主細胞と同じ型の第２の哺乳動物宿主細胞における
（ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む第３のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第４のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現と比較してプロテインＡ精製後にｍｇ／ｍｌによって測定されるとおり多重特異性抗原結合タンパク質のより高い収量をもたらす。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第３の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含み；且つ
（ｉｉ）第４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＫ４３９Ｄを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ヘテロ－ＩｇＧ分子におけるＣＰＭｖ１０３の合理的な配置を示す。

本明細書で使用する場合、用語「抗原結合タンパク質」は、１種以上の標的抗原に特異的に結合するタンパク質を指す。抗原結合タンパク質は、抗体及びその機能的断片を含み得る。「機能的抗体断片」とは、完全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、それでもなお抗原に特異的に結合することができる抗体の一部である。機能的抗体断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられるが、これらに限定されず、また、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、又はラクダ科の動物などの任意の哺乳動物源に由来するものとすることができる。機能的抗体断片は、標的抗原の結合について、インタクトな抗体と競合する場合があり、断片は、インタクトな抗体の修飾（例えば、酵素的又は化学的切断）によって生成され得るか、又は組換えＤＮＡ技術又はペプチド合成を使用して新規に合成され得る。

また、抗原結合タンパク質には、単一のポリペプチド鎖又は複数のポリペプチド鎖に組み込まれた１つ以上の機能的抗体断片を含むタンパク質を含めることもできる。例えば、抗原結合タンパク質として、下記が挙げられ得るが、これらに限定されない：一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：６４４４－６４４８，１９９３参照）；イントラボディ；ドメイン抗体（単一のＶＬ若しくはＶＨドメイン、又はペプチドリンカーによって連結された２つ以上のＶＨドメイン；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４１：５４４－５４６，１９８９参照）；マキシボディ（Ｆｃ領域に融合した２つのｓｃＦｖ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１７：９５－１０６，２００４及びＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２５１：１２３－１３５，２００１参照）；トリアボディ；テトラボディ；ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合したｓｃＦｖ；Ｏｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，Ｖｏｌ．１７：３１５－２３，２００４を参照）；ペプチボディ（Ｆｃ領域に結合した１つ以上のペプチド、国際公開第００／２４７８２号パンフレットを参照）；線状抗体（相補的軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．８：１０５７－１０６２，１９９５を参照）；小モジュラー免疫薬（米国特許出願公開第２００３０１３３９３９号明細書を参照）；及び免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＶＨ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ＶＨ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）。

「多重特異性」は、抗原結合タンパク質が、２種以上の異なる抗原に特異的に結合することができることを意味する。「二重特異性」は、抗原結合タンパク質が、２種の異なる抗原に特異的に結合することができることを意味する。本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質は、類似の結合アッセイ条件下で、他の無関係なタンパク質に対するその親和性と比較して、標的抗原に対して有意に高い結合親和性を有し、その結果、その抗原を識別することができる場合に、標的抗原に「特異的に結合する」。抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が≦１×１０^－６Ｍであり得る。抗原結合タンパク質は、Ｋ_Ｄが≦１×１０^－８Ｍである場合に、「高い親和性」で抗原に特異的に結合する。

親和性は、種々の技術を用いて判定され、その一例として、親和性ＥＬＩＳＡアッセイがある。様々な実施形態では、親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）に基づくアッセイ）によって決定される。この方法論を用いて、結合速度定数（ｋ_ａ単位：Ｍ^－１ｓ^－１）及び解離速度定数（ｋ_ｄ単位：ｓ^－１）を測定することができる。次に、動力学速度定数の比（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）から、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ、Ｍ）を算出することができる。いくつかの実施形態では、親和性は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８に記載されているような結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）などの速度論的方法によって決定される。ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いて、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ、Ｍ）及び結合速度定数（ｋ_ａ、Ｍ^－１ｓ^－１）を測定することができる。これらの値から、解離速度定数（ｋ_ｄ、ｓ^－１）を算出することができる（Ｋ_Ｄ×ｋ_ａ）。他の実施形態では、親和性は、平衡／溶液法によって決定される。ある特定の実施形態では、親和性は、ＦＡＣＳ結合アッセイによって決定される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、ｋ_ｄ（解離速度定数）によって測定される結合親和力が、約１０^－２、１０^－３、１０^－４、１０^－５、１０^－６、１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０ｓ^－１以下（値が低いほど結合親和力が高いことを示す）、及び／又はＫ_Ｄ（平衡解離定数）によって測定される結合親和性が、約１０^－９、１０^－１０、１０^－１１、１０^－１２、１０^－１３、１０^－１４、１０^－１５、１０^－１６Ｍ以下（値が低いほど結合親和性が高いことを示す）などの望ましい特性を示す。

本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」と互換的に使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原と相互作用し、その抗原に対する特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合タンパク質の領域を指す。

本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも呼ばれる）を指す。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が存在する。「ＣＤＲ領域」という用語は、本明細書で使用する場合、単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲ（すなわち、３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）の群を指す。２つの鎖の各々におけるＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列させられ、標的タンパク質の特異的エピトープ又はドメインと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、天然に存在する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は両方とも、通常、以下のこれらの要素の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４と一致する。これらのドメインの各々において位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための付番方式が考案されている。この付番方式は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３において定義されている。所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）が、この方式を用いて特定され得る。

本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態では、結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はナノボディを含む。一実施形態では、両方の結合ドメインがＦａｂ断片である。別の実施形態では、１つの結合ドメインはＦａｂ断片であり、他方の結合ドメインはｓｃＦｖである。

抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片（各々が単一の抗原結合部位を有する）及び残部の「Ｆｃ」断片（免疫グロブリン定常領域を含有する）が生成される。Ｆａｂ断片は、可変ドメイン、並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）の全てを含有する。したがって、「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））並びに１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆｃ断片は炭水化物を示し、抗体の１つのクラスを別のクラスから識別する多くの抗体エフェクター機能（結合補体及び細胞受容体など）に関与する。「Ｆｄ断片」は、免疫グロブリン重鎖に由来するＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆｄ断片は、Ｆａｂ断片の重鎖成分を表す。

「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１ドメインのＣ末端にて、抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片である。

「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、ヒンジ領域にて重鎖間のジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片である。

「Ｆｖ」断片は、抗体由来の完全抗原認識及び結合部位を含有する最小の断片である。この断片は、緊密な非共有結合状態にある、１つの免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）の二量体からなる。この構成において、各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。単一の軽鎖又は重鎖の可変領域（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖ断片の半分）は、抗原を認識し、結合する能力を有するが、ＶＨ及びＶＬの両方を含む結合部位全体よりも親和性は低い。

「一本鎖可変抗体断片」又は「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在し、任意選択により、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするペプチドリンカーを、ＶＨ領域とＶＬ領域の間に含む（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４２：４２３－４２６，１９８８；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５：５８７９－５８８３，１９８８を参照されたい）。

「ナノボディ」は、重鎖抗体の重鎖可変領域である。そのような可変ドメインは、そのような重鎖抗体の完全に機能的な最小の抗原結合断片であり、分子質量は、わずか１５ｋＤａである。Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３－５７，２００４を参照されたい。軽鎖を欠く機能的重鎖抗体は、特定の種の動物、例えばコモリザメ、テンジクザメ並びにラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びラマでは天然に生じる。これらの動物において、抗原結合部位は、単一ドメインであるＶＨＨドメインになる。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成する、すなわち、これらの機能的な抗体は、構造Ｈ_２Ｌ_２を有するだけの重鎖のホモ二量体（「重鎖抗体」又は「ＨＣＡｂ」とも称される）である。ラクダ化ＶＨＨは、報告によれば、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有し、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ２定常領域及びＩｇＧ３定常領域と再結合する。ラクダ化ＶＨＨドメインは、抗原に高親和性で結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６：２６２８５－９０，２００１）、溶液で高い安定性を有する（Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４１：３６２８－３６，２００２）ことが判明している。ラクダ化重鎖を有する抗体を生成する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号明細書及び米国特許出願公開第２００５／００３７４２１号明細書に記載されている。別の足場は、サメＶ－ＮＡＲ足場とより密接に適合するヒト可変様ドメインから作製することができ、長い貫通性のループ構造のフレームワークを提供し得る。

本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の特定の実施形態では、結合ドメインは、所望の抗原に特異的に結合する抗体又は抗体断片の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

本明細書において「可変ドメイン」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））と互換的に使用される「可変領域」は、抗体の抗原への結合に直接関与する、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖のそれぞれにおける領域を指す。上記のように、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域は、同じ一般的構造を有しており、各領域は、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、これらの配列は、広範に保存されており、３つのＣＤＲによって連結されている。フレームワーク領域は、ベータ－シート構造を採用しており、ＣＤＲは、ベータ－シート構造を連結するループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造中に保持され、他方の鎖のＣＤＲとともに抗原結合部位を形成する。

標的抗原に特異的に結合する結合ドメインは、ａ）この抗原に対する既知の抗体に由来し得るか、或いはｂ）抗原タンパク質若しくはその断片を用いる新規の免疫化法によって、ファージディスプレイによって、又は他の常法によって得られる新規の抗体又は抗体断片に由来し得る。二重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源である抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体とすることができる。ある特定の実施形態では、結合ドメインの起源である抗体は、モノクローナル抗体である。これらの及び他の実施形態では、抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型のものとすることができる。

「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能性のある天然の変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、典型的には、様々なエピトープに対して向けられる様々な抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、個々の抗原部位又はエピトープに対して向けられるものである。モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られる任意の技術を使用して、例えば、免疫化スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって産生することができる。脾臓細胞は、当該技術分野において知られる任意の技術を使用して、例えば、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生することによって不死化することができる。ハイブリドーマを生成する融合手順に用いられる骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体産生性であり、融合効率が高く、且つ酵素が欠損しており、そのため、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で、増殖が不可能となる。マウス融合における使用に好適な細胞株の例としては、Ｓｐ－２０、Ｐ３－Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０－Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ－１１、ＭＰＣ１１－Ｘ４５－ＧＴＧ １．７及びＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合において使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３－Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ－２６６、ＧＭ１５００－ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ－ＬＯＮ－ＨＭｙ２及びＵＣ７２９－６である。

いくつかの例では、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）を標的抗原で免疫化し、免疫化した動物から脾臓細胞を採取し、採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合し、それにより、ハイブリドーマ細胞を生成し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、ハイブリドーマ細胞株が産生される。

ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において知られる任意の技術、例えば、プロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどを使用して精製することができる。ハイブリドーマ又はｍＡｂｓをさらにスクリーニングして、例えば、標的抗原を発現している細胞に結合する能力、標的抗原リガンドが、そのそれぞれの受容体への結合をブロック若しくは妨害する能力、又は受容体のいずれかを機能的にブロックする能力など、特定の性質を有するｍＡｂｓを、例えば、ｃＡＭＰアッセイを使用して同定することができる。

いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインは、ヒト化抗体に由来してもよい。「ヒト化抗体」は、領域（例えば、フレームワーク領域）が、対応するヒト免疫グロブリン由来の領域を含むように改変された抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、最初に非ヒト動物において増やされたモノクローナル抗体から生成され得る。典型的には、抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体のある特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同となるように改変される。ヒト化は、例えば、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより、種々の方法を用いて行うことができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び米国特許第５，６９３，７６２号明細書、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２：３２３－２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９：１５３４－１５３６，１９８８を参照されたい）。別の種において生成された抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを作り出すために、いくつかのヒト重鎖アミノ酸配列又はヒト軽鎖アミノ酸配列に由来するＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を同定してもよい。

本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源とすることができる標的抗原に対して生成される新規な抗体は、完全ヒト抗体であり得る。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来するか、又はそれを示す、可変領域及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体の生成を実施するために提供される具体的な一手段が、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性のＩｇ遺伝子が不活化されているマウス中にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することは、任意の所望の抗原により免疫化され得る動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する一手段である。完全ヒト抗体を使用すると、マウスのｍＡｂ又はマウス由来のｍＡｂを治療剤としてヒトに投与することによって生じることがあり得る免疫原性及びアレルギー性の応答を最小化することができる。

完全ヒト抗体は、内因性の免疫グロブリンを産生せずに、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫化することによって生成され得る。この目的のための抗原は、通常、６つ以上の連続アミノ酸を有し、任意選択により、ハプテンなどの担体にコンジュゲートされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１－２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８；及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。そのような方法の一例において、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能化して、ヒト重鎖タンパク質及びヒト軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大型断片をマウスゲノム中に挿入することによって生成される。次に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補体より少ない補体を有する部分的に改変された動物を交雑して、所望の免疫系の改変を全て有する動物を得る。免疫原が投与されると、このトランスジェニック動物は、当該免疫原に免疫特異性があるが、可変領域を含むマウスアミノ酸配列ではなくヒトアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法のさらなる詳細は、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び国際公開第９４／０２６０２号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体を作るためのトランスジェニックマウスに関連する追加の方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，７１３，６１０号明細書、米国特許第６，６７３，９８６号明細書、米国特許第６，１６２，９６３号明細書、米国特許第５，９３９，５９８号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，３００，１２９号明細書、米国特許第６，２５５，４５８号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、及び米国特許第５，５４５，８０６号明細書、国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３０４９８号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、並びに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書に記載されている。

本明細書中で「ＨｕＭａｂ」マウスと称される上記のトランスジェニックマウスは、内因性のミュー及びカッパ鎖遺伝子座を不活化する標的変異とともに、再配列されていないヒト重鎖（ミュー及びガンマ）及びカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９）。したがって、当該マウスは、マウスＩｇＭ又はカッパの発現の低下を示し、且つ免疫化に応答し、そして導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を経て、高親和性ヒトＩｇＧカッパモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６）。ＨｕＭａｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７－６２９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７－６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２－２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９－１０１；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９－５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－８５１に詳細に説明されており、これらの文献は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、及び米国特許第５，７７０，４２９号明細書、並びに米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４６号パンフレット、及び国際公開第９２／０３９１８号パンフレットを参照されたい（これらの全ての開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。このトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の産生を利用する技術は、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６にも開示されており、これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

また、ヒト由来抗体は、ファージディスプレイ技術を用いて生成され得る。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、及びＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０－６４５４（１９９０）において説明されており、これらの各文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって生成される抗体は、通常、細菌において、抗原結合断片、例えばＦｖ又はＦａｂ断片として生成され、したがってエフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、２つの戦略のうち１つによって導入することができる：断片は、必要に応じて、哺乳動物細胞で発現する完全な抗体に、又はエフェクター機能を誘発し得る第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片に操作され得る。通常、抗体のＦｄ断片（ＶＨ－ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）は、ＰＣＲによって別々にクローン化され、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、その後、特定の抗原に結合するために選択することができる。抗体断片はファージ表面に発現し、Ｆｖ又はＦａｂ（したがって抗体断片をコードするＤＮＡを含有するファージ）の抗原結合による選択は、パニングと呼ばれる手順である抗原結合及び再増幅を数ラウンド行うことによって実現される。抗原に特異的な抗体断片は濃縮され、最終的に単離される。ファージディスプレイ技術はまた、「ガイデッドセレクション（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにおいて使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９－９０３（１９９４）を参照）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片は、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示されてもよく、続いて、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーは、抗原を用いて選択され得る。これにより、マウスＦｄ断片は、選択をガイドするテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わされる。得られたライブラリーの選択により、完全なヒトＦａｂが得られる。

ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は抗体である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）及び２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０～７０ｋＤａ）を含む四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。用語「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端へと、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）であり得る。用語「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端へと、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び任意選択により免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、及びイプシロン（ε）として分類されており、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラス抗体及びＩｇＡクラス抗体は、サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２に、それぞれさらに分けられる。ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、及びＩｇＤ抗体内の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有するが、ＩｇＭ抗体及びＩｇＥ抗体内の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含むあらゆる免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（すなわち、軽鎖と重鎖との間）、及び抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介してともに連結されている。

特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヘテロ二量体抗体（本明細書では「ヘテロ免疫グロブリン」又は「ヘテロＩｇ」と互換的に使用される）であり、これは２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖を含む抗体を指す。しかしながら、ある特定の実施形態では、「共通の軽鎖」が使用され得る。「共通の軽鎖」は、二重特異性又は多重特異性分子内で少なくとも１つの第１及び第２の抗原結合部位、例えば、それぞれが異なる抗原に特異的なＦａｂを形成する２つ以上の重鎖又はその断片と対形成する軽鎖を指す。そのような実施形態では、２つの軽鎖は同じである一方で、重鎖は異なる。たとえ２つの軽鎖が同じであっても、ヘテロＩｇの２つのｆａｂ部分は異なるエピトープに結合する。

ヘテロ二量体抗体は、任意の免疫グロブリン定常領域を含み得る。「定常領域」という用語は、本明細書で使用する場合、可変領域以外の抗体の全てのドメインを指す。定常領域は、抗原の結合に直接には関与しないが、種々のエフェクター機能を発揮する。上記のように、抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、特定のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）及びサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖定常領域は、例えば、５つの抗体アイソタイプ全てにおいて見出されるカッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域、例えばヒトのカッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域であり得る。

ヘテロ二量体抗体の重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型の重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ型、ヒトデルタ型、ヒトイプシロン型、ヒトガンマ型、又はヒトミュー型の重鎖定常領域であり得る。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。

特定の重鎖とその同族の軽鎖との会合を促進するために、重鎖及び軽鎖の両方は、相補的アミノ酸置換を含有し得る。本明細書で使用する場合、「相補的アミノ酸置換」は、一方の鎖における正荷電アミノ酸への置換と対になる他方の鎖における負荷電アミノ酸置換を指す。例えば、いくつかの実施形態では、重鎖は、荷電アミノ酸を導入するために少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、対応する軽鎖は、荷電アミノ酸を導入するために少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、重鎖に導入される荷電アミノ酸は、軽鎖に導入されるアミノ酸の反対の電荷を有する。ある特定の実施形態では、１つ以上の正荷電残基（例えば、リジン、ヒスチジン又はアルギニン）を、第１の軽鎖（ＬＣ１）に導入することができ、且つ１つ以上の負荷電残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を、ＬＣ１／ＨＣ１の結合界面で対になる重鎖（ＨＣ１）に導入することができるが、１つ以上の負荷電残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を、第２の軽鎖（ＬＣ２）に導入することができ、且つ１つ以上の正荷電残基（例えば、リジン、ヒスチジン又はアルギニン）を、ＬＣ２／ＨＣ２の結合界面で対になる重鎖（ＨＣ２）に導入することができる。静電相互作用は、界面で反対に荷電した残基（極性）が引き合うため、ＬＣ１をＨＣ１と対形成させ、且つＬＣ２をＨＣ２と対形成させるように誘導することになる。界面で同じ荷電残基（極性）を有する重鎖／軽鎖の対（例えば、ＬＣ１／ＨＣ２及びＬＣ２／ＨＣ１）は、反発することになり、結果として不所望なＨＣ／ＬＣの対形成が抑制される。

これらの及び他の実施形態では、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の正荷電アミノ酸は、１つ以上の負荷電アミノ酸で置換される。或いは、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の負荷電アミノ酸が、１つ以上の正荷電アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｌ１２８、Ａ１４１、Ｌ１４５、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｈ１６８、Ｆ１７０、Ｐ１７１、Ｖ１７３、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｓ１８３、Ｖ１８５及びＫ２１３から選択されるＥＵ位置でヘテロ二量体抗体中の第１及び／又は第２の重鎖のＣＨ１ドメインにおける１つ以上のアミノ酸は、荷電アミノ酸で置換される。ある特定の実施形態では、負荷電又は正荷電のアミノ酸で置換するのに好ましい残基はＳ１８３（ＥＵ付番方式）である。いくつかの実施形態では、Ｓ１８３は、正荷電アミノ酸で置換される。代替的な実施形態では、Ｓ１８３は、負荷電アミノ酸で置換される。例えば、一実施形態では、Ｓ１８３は、第１の重鎖において負荷電アミノ酸で置換され（例えば、Ｓ１８３Ｅ）、第２の重鎖において、Ｓ１８３は、正荷電アミノ酸で置換される（例えば、Ｓ１８３Ｋ）。

軽鎖がカッパ軽鎖である実施形態では、Ｆ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２３、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｎ１３７、Ｎ１３８、Ｑ１６０、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７４及びＳ１７６から選択される位置（カッパ軽鎖におけるＥＵ及びＫａｂａｔ付番）のヘテロ二量体抗体中の第１の及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸は、荷電アミノ酸で置換される。軽鎖がラムダ軽鎖である実施形態では、Ｔ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｅ１２３、Ｅ１２４、Ｋ１２９、Ｔ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１３７、Ｅ１６０、Ｔ１６２、Ｓ１６５、Ｑ１６７、Ａ１７４、Ｓ１７６及びＹ１７８から選択される位置（ラムダ鎖におけるＫａｂａｔ付番）のヘテロ二量体抗体中の第１の及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸は、荷電アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、負荷電又は正荷電のアミノ酸で置換するのに好ましい残基は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかのＣＬドメインのＳ１７６（ＥＵ及びＫａｂａｔ付番方式）である。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、正荷電アミノ酸で置換される。代替的な実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、負荷電アミノ酸で置換される。一実施形態では、Ｓ１７６は、第１の軽鎖において正荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｋ）で置換され、Ｓ１７６は、第２の軽鎖において負荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｅ）で置換される。

ＣＨ１及びＣＬドメインにおける相補的アミノ酸置換に加えて又はその代わりとして、ヘテロ二量体抗体における軽鎖及び重鎖の可変領域は、荷電アミノ酸を導入するために１つ以上の相補的アミノ酸置換を含有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体中の重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の正荷電アミノ酸が、１つ以上の負荷電アミノ酸で置換される。或いは、重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、その結果、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の負荷電アミノ酸は、１つ以上の正荷電アミノ酸で置換される。

ＶＨ領域内のＶ領域界面残基（すなわち、ＶＨ領域及びＶＬ領域の会合を媒介するアミノ酸残基）には、Ｋａｂａｔの１位、３位、３５位、３７位、３９位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、５０位、５９位、８９位、９１位及び９３位が含まれる。ＶＨ領域内のこれらの界面残基の１つ以上が、荷電（正荷電又は負荷電）アミノ酸により置換され得る。ある特定の実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔの３９位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸、例えば、リジンに置換される。代替的な実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔの３９位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔの３９位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸に置換され（例えば、Ｇ３９Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔの３９位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸に置換される（例えば、Ｇ３９Ｋ）。いくつかの実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔの４４位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸、例えば、リシンに置換される。代替的な実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔの４４位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。ある特定の実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔの４４位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸に置換され（例えば、Ｇ４４Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔの４４位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸に置換される（例えば、Ｇ４４Ｋ）。

ＶＬ領域内のＶ領域界面残基（すなわち、ＶＨ領域及びＶＬ領域の会合を媒介するアミノ酸残基）には、Ｋａｂａｔの３２位、３４位、３５位、３６位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４８位、４９位、５０位、５１位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、８５位、８７位、８９位、９０位、９１位及び１００位が含まれる。ＶＬ領域中の１つ以上の界面残基は、荷電アミノ酸、好ましくは、同族重鎖のＶＨ領域に導入されるものと反対の電荷を有するアミノ酸で置換され得る。いくつかの実施形態では、第１の及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔの１００位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸、例えば、リジンに置換される。代替的な実施形態では、第１の及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔの１００位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。ある特定の実施形態では、第１の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔの１００位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸に置換され（例えば、Ｇ１００Ｋ）、第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔの１００位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸に置換される（例えば、Ｇ１００Ｅ）。

ある特定の実施形態では、本発明のヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖、並びに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、アミノ酸置換を４４位（Ｋａｂａｔ）、１８３位（ＥＵ）、３９２位（ＥＵ）、４０９（ＥＵ）、及び３５６位（ＥＵ）に含み、第２の重鎖は、アミノ酸置換を４４位（Ｋａｂａｔ）、１８３位（ＥＵ）、４３９位（ＥＵ）及び３９９位（ＥＵ）に含み、第１の及び第２の軽鎖は、アミノ酸置換を１００位（Ｋａｂａｔ）及び１７６位（ＥＵ）に含み、アミノ酸置換は前記位置に荷電アミノ酸を導入する。関連する実施形態では、第１の重鎖の４４位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがグルタミン酸で置換され、第２の重鎖の４４位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがリジンで置換され、第１の軽鎖の１００位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがリジンで置換され、第２の軽鎖の１００位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがグルタミン酸で置換され、第１の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがリジンで置換され、第２の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の３９２位（ＥＵ）のリジンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の４０９位（ＥＵ）のリジンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の３５６位（ＥＵ）のグルタミン酸がリジンで置換され、第２の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがリジンで置換され、第２の重鎖の４３９位（ＥＵ）のリジンがアスパラギン酸で置換され、且つ第２の重鎖の３９９位（ＥＵ）のアスパラギン酸がリジンで置換される。

ある特定の実施形態では、本発明のヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖、並びに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、アミノ酸置換を１８３位（ＥＵ）、３９２位（ＥＵ）、４０９位（ＥＵ）及び３５６位（ＥＵ）に含み、第２の重鎖は、アミノ酸置換を１８３位（ＥＵ）、４３９位（ＥＵ）及び３９９位（ＥＵ）に含み、第１の及び第２の軽鎖は、アミノ酸置換を１７６位（ＥＵ）に含み、アミノ酸置換は前記位置に荷電アミノ酸を導入する。関連する実施形態では、第１の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがリジンで置換され、第２の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第１の重鎖の３９２位（ＥＵ）のリジンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の４０９位（ＥＵ）のリジンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の３５６位（ＥＵ）のグルタミン酸がリジンで置換され、第２の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがリジンで置換され、第２の重鎖の４３９位（ＥＵ）のリジンがアスパラギン酸で置換され、且つ第２の重鎖の３９９位（ＥＵ）のアスパラギン酸がリシンで置換される。

関連する実施形態では、第１の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第２の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがリジンで置換され、第１の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがリジンで置換され、第１の重鎖の３９２位（ＥＵ）のリジンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の４０９位（ＥＵ）のリジンがアスパラギン酸で置換され、第１の重鎖の３５６位（ＥＵ）のグルタミン酸がリジンで置換され、第２の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸で置換され、第２の重鎖の４３９位（ＥＵ）のリジンがアスパラギン酸で置換され、且つ第２の重鎖の３９９位（ＥＵ）のアスパラギン酸がリジンで置換される。

一態様では、本発明は、第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチド及び第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドを含むヘテロ二量体免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含み、
（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドが、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドが、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う単離されたヘテロ多量体に関する。

ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、第１の免疫グロブリンＦｃポリペプチド及び第２の免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、第１の免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＦｃポリペプチドは、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、第１のヒンジドメインポリペプチド及び第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド；並びに第２のヒンジドメインポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチド；並びに第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドを含む二重特異性抗体コンストラクトであり、
第１の重鎖ポリペプチドは、第１のＶＨドメイン、第１のＣＨ１ドメインポリペプチド、第１のヒンジドメインポリペプチド、及び第１のＦｃポリペプチドを含み；且つ第２の重鎖ポリペプチドは、第２のＶＨドメイン、第２のＣＨ１ドメインポリペプチド、第２のヒンジドメインポリペプチド、及び第２のＦｃポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ｉ）第１の重鎖ポリペプチドは、１８３位でリジンを含み；
ｉｉ）第１の軽鎖ポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；
ｉｉｉ）第２の重鎖ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；且つ
ｉｖ）第２の軽鎖ポリペプチドは、１７６位でリジンを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、ｉ）第１の重鎖ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；
ｉｉ）第１の軽鎖ポリペプチドは、１７６位でリジンを含み；
ｉｉｉ）第２の重鎖ポリペプチドは、１８３位でリジンを含み；且つ
ｉｖ）第２の軽鎖ポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩｇＧ１－、ＩｇＧ２－ ＩｇＧ３－又はＩｇＧ４－免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドに由来するか又はその変異バージョンである。

ある特定の実施形態では、第１及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩｇＧ１－又はＩｇＧ２－免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドに由来するか又はその変異バージョンである。

一態様では、本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、抗原結合タンパク質が、異なるエピトープに結合する少なくとも２つの結合ドメインを含み、哺乳動物宿主細胞において：
（ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含む第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを発現させることを含み；
アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従い、
第１の結合ドメインが、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、第２の結合ドメインが、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、且つ
結合ドメインが、ＶＨ、ｓｃＦａｂ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される方法に関する。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含む。

ある特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含む。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含み；且つ
第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、第２の結合ドメインは、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含み；且つ
第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、第１の結合ドメインは、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂであり、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂである。

ある特定の実施形態では、結合ドメインは、それらの対応するＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの一方、又は両方のいずれかのＣ末端に融合された第３の結合ドメインを含み、第３の結合ドメインは、受容体リガンド ＶＨ、ｓｃＦａｂ、又はｓｃＦｖである。

一態様では、本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、抗原結合タンパク質が、異なるエピトープに結合する少なくとも２つの結合ドメインを含み、哺乳動物宿主細胞において：
（ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含む第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを発現させることを含み；
アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従い、
第１の結合ドメインが、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、第２の結合ドメインが、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、且つ
結合ドメインが、ＶＨ、ｓｃＦａｂ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される方法に関する。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含む。

ある特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含む。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含み；且つ
第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、第２の結合ドメインは、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含み；且つ
第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、第１の結合ドメインは、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂであり、第２の結合ドメインは、第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂである。

ある特定の実施形態では、結合ドメインは、それらの対応するＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、多重特異性抗原結合タンパク質はさらに、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの一方、又は両方のいずれかのＣ末端に融合された第３の結合ドメインを含み、第３の結合ドメインは、受容体リガンド ＶＨ、ｓｃＦａｂ、又はｓｃＦｖである。

本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」という用語は、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成され得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択により、ＣＨ４ドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び貪食などのエフェクター機能を保持し得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、本明細書にさらに詳細に記載されるように、エフェクター機能を低減又は排除するように改変される場合がある。

本発明の抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のカルボキシル末端に位置する結合ドメイン（すなわち、カルボキシル末端の結合ドメイン）はｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによって連結された重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。可変領域は、ｓｃＦｖ内で、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨの向きに向きを定められ得る。例えば、一実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端までに、ＶＨ領域、ペプチドリンカー及びＶＬ領域を含む。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端までに、ＶＬ領域、ペプチドリンカー及びＶＨ領域を含む。ｓｃＦｖのＶＨ領域及びＶＬ領域は、１つ以上のシステイン置換を含有して、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のジスルフィド結合形成を可能にし得る。そのようなシステインのクランプは、２つの可変ドメインを抗原－結合配置で安定化させる。一実施形態では、ＶＨ領域中の４４位（Ｋａｂａｔ付番）及びＶＬ領域中の１００位（Ｋａｂａｔ付番）は、それぞれシステイン残基で置換される。

ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、そのアミノ末端で、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域のカルボキシル末端（例えば、ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端）に融合されるか、又はそうでなければ連結される。したがって、一実施形態では、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第１のペプチドリンカー、ＶＨ領域、第２のペプチドリンカー、及びＶＬ領域を含むように、ｓｃＦｖがＦｃ領域に融合される。別の実施形態では、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第１のペプチドリンカー、ＶＬ領域、第２のペプチドリンカー、及びＶＨ領域を含むように、ｓｃＦｖがＦｃ領域に融合される。「融合タンパク質」は、２つ以上の親タンパク質又はポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むタンパク質である。通常、融合タンパク質は、１つのタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と一緒にインフレームに付加され、任意選択によりリンカーによって、その配列から分離される、融合遺伝子から発現する。この融合遺伝子は、その後、組換え宿主細胞によって発現されて、単一の融合タンパク質を産生することができる。

「ペプチドリンカー」とは、あるポリペプチドを別のポリペプチドに共有結合させる約２～約５０個のアミノ酸のオリゴペプチドを指す。ペプチドリンカーを使用して、ｓｃＦｖ内でＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結することができる。ペプチドリンカーはまた、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、又は他の機能的抗体断片をＦｃ領域のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結して、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質を作り出すために使用することもできる。好ましくは、ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、約５アミノ酸長～約４０アミノ酸長である。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、約８アミノ酸長～約３０アミノ酸長である。さらに他の実施形態では、ペプチドリンカーは、約１０アミノ酸長～約２０アミノ酸長である。

好ましくは、必ずしもというわけではないが、ペプチドリンカーは、２０種の標準的なアミノ酸の中のアミノ酸、特に、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及び／又はセリンを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン、セリン及びアラニンなど、立体障害のない大多数のアミノ酸で構成される。したがって、いくつかの実施形態において好ましいリンカーには、ポリグリシン、ポリセリン、及びポリアラニン、又はこれらのうちいずれかの組み合わせが含まれる。いくつかの例示的なペプチドリンカーとしては、以下に限定されないが、ポリ（Ｇｌｙ）_２～８（配列番号２２～２８）、特に（Ｇｌｙ）_３（配列番号２３）、（Ｇｌｙ）_４（配列番号２４）、（Ｇｌｙ）_５（配列番号２５）及び（Ｇｌｙ）_７（配列番号２７）、並びにポリ（Ｇｌｙ）_４Ｓｅｒ（配列番号２９）、ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）_２～４（配列番号３０～３２）及びポリ（Ａｌａ）_２～８（配列番号３３～３９）が挙げられる。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_ｘＳｅｒ）_ｎであり、ここで、ｘ＝３又は４であり、ｎ＝２、３、４、５又は６である（配列番号４１～５０）。そのようなペプチドリンカーとしては、「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ又は「Ｇ_４Ｓ」；配列番号４０）、「Ｌ９」（ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「Ｇ_３ＳＧ_４Ｓ」；配列番号５１）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「（Ｇ_４Ｓ）_２」；配列番号４６）、「Ｌ１５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「（Ｇ_４Ｓ）_３」；配列番号４７）、及び「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「（Ｇ_４Ｓ）_５」；配列番号４９）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ中でＶＨ領域及びＶＬ領域を連結しているペプチドリンカーは、Ｌ１５又は（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号４７）である。これらの及び他の実施形態では、カルボキシル末端の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ）をＦｃ領域のＣ末端に連結しているペプチドリンカーは、Ｌ９若しくはＧ_３ＳＧ_４Ｓリンカー（配列番号５１）又はＬ１０（Ｇ_４Ｓ）_２リンカー（配列番号４６）である。

本発明の二重特異性抗原結合タンパク質に使用され得るペプチドリンカーの他の特定の例としては、（Ｇｌｙ）_５Ｌｙｓ（配列番号１）；（Ｇｌｙ）_５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号２）；（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号３）；（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２（配列番号４）；（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号５）；ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号６）；ＧＧＥＧＧＧ（配列番号７）；ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号８）；ＧＥＥＥＧ（配列番号９）；ＧＥＥＥ（配列番号１０）；ＧＧＤＧＧＧ（配列番号１１）；ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号１２）；ＧＤＤＤＧ（配列番号１３）；ＧＤＤＤ（配列番号１４）；ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号１５）；ＷＥＷＥＷ（配列番号１６）；ＦＥＦＥＦ（配列番号１７）；ＥＥＥＷＷＷ（配列番号１８）；ＥＥＥＦＦＦ（配列番号１９）；ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号２０）；及びＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号２１）が挙げられる。

本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質の重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／又はエフェクター機能に影響する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つは、免疫グロブリンがその標的に結合するときに免疫系に伝達することである。これは、一般に「エフェクター機能」と呼ばれる。伝達は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）につながる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面上のＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、補体系のタンパク質（例えばＣ１ｑ）とＦｃの結合を介して媒介される。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、定常領域において、エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性、及び／又は抗原結合タンパク質のクリアランス若しくは半減期を増強する１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を増強できる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ付番）には、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又は上記のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

他の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、定常領域において、エフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を低減できる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ付番）には、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、又は上記のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

グリコシル化は、抗体、特にＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に寄与し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、結合タンパク質のグリコシル化のレベル又は型に影響する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つがヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに結合することを指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンも使用され得る。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ以上のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域に付加することによって増加される。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによって都合よく達成され得る（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。また、改変は、１つ以上のセリン残基若しくはスレオニン残基の開始配列への付加、又はこれによる開始配列への置換によってもなされ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。容易にするために、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化により、特に、所望のアミノ酸に翻訳されることとなるコドンが生成されるように、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを、予め選択された塩基にて変異させることによって改変され得る。

本発明はまた、エフェクター活性の変化をもたらす改変糖鎖構造を有する二重特異性抗原結合タンパク質分子、例えば、ＡＤＣＣ活性の向上を示すフコシル化が存在しないか又は減少した抗原結合タンパク質の産生を包含する。フコシル化を減少させるか又は排除する様々な方法が当該技術分野において知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基でのＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、高い親和性でこの受容体に結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクター機能を天然のフコシル化抗体よりも効率的に誘発する。例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え産生により、ＡＤＣＣ活性が１００倍増大した抗体が生じる（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４－２２，２００４を参照されたい）。同様の効果は、フコシル化経路におけるアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素又は他の酵素の活性を低下させることによって、例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするような細胞株の操作、又は選択的グリコシル化阻害剤を用いる培養によって、達成することができる（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３－２３，１９８９を参照されたい）。いくつかの宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－４０，２００２及びＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６－７３，２００３を参照されたい）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え産生することによる、二分された糖鎖レベルの増加もＡＤＣＣ活性を増加させることが判明している（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６－８０，１９９９を参照されたい）。

他の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ以上のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域から除くことによって減少又は排除される。Ｎ結合型グリコシル化部位を排除又は改変するアミノ酸置換により、抗原結合タンパク質のＮ結合型グリコシル化を減少又は排除することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、又はＮ２９７ＧなどのＮ２９７位（ＥＵ付番）での変異を含む。特定の一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を向上させるために、分子のＦｃ領域はさらに操作されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域における１つ以上のアミノ酸は、二量体状態でジスルフィド結合形成を促進するためにシステインで置換される。したがって、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２（ＥＵ付番）に対応する残基は、システインで置換され得る。好ましくは、残基の特定の対が、互いにジスルフィド結合を優先的に形成するようにシステインで置換され、このため、ジスルフィド結合のスクランブルが制限又は防止される。好ましい対としては、以下に限定されないが、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。このような実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ｇ変異も含み得る。

例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組み込み又は追加（例えば、適切な領域の変異による、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、続いて、例えば、ＤＮＡ若しくはペプチド合成によって、いずれかの末端又は中央で抗原結合タンパク質に融合されることによる；例えば、国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照）、或いは、ＰＥＧ又は他の水溶性ポリマー、例えば、多糖ポリマーなどの分子の追加による血清半減期を増加させるための本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の改変もまた望ましい場合がある。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来のいずれか１つ以上のアミノ酸残基が、抗原結合タンパク質中の類似の位置に移される領域を構成する。さらにより好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の３つ以上の残基が移入されている。さらにより好ましくは、エピトープはＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域）のＣＨ２ドメインから採取され、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３、若しくはＶＨ領域、又は２つ以上のそのような領域に移入される。或いは、エピトープはＦｃ領域のＣＨ２ドメインから採取され、抗原結合タンパク質のＣＬ領域若しくはＶＬ領域、又はその両方に移入される。Ｆｃバリアント及びそれらのサルベージ受容体との相互作用の説明については、国際出願の国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照されたい。

本発明は、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質及びその成分をコードする１つ以上の単離された核酸を含む。本発明の核酸分子には、一本鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ並びに対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、完全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子並びにそれらの断片の組み合わせが含まれる。本発明の核酸は、優先的にはヒト供給源に由来するが、本発明には非ヒト種に由来するものも含まれる。

免疫グロブリン又はその領域（例えば、可変領域、Ｆｃ領域など）又は目的のポリペプチド由来の該当するアミノ酸配列は、直接タンパク質配列解析法によって決定されてもよく、好適なコードヌクレオチド配列は普遍コドン表に従って設計することができる。或いは、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源となり得る、モノクローナル抗体をコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、そのような抗体を産生する細胞から単離し、配列決定することができる。

本明細書において「単離されたポリヌクレオチド」と互換的に使用される「単離された核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離されている核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子又はオリゴヌクレオチドなど、鋳型から酵素的に、又は化学的に合成された核酸の場合、このようなプロセスから得られる核酸は、単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子、又はより大きな核酸コンストラクトの成分としての核酸分子を指す。好ましい一実施形態では、核酸は、混入する内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、好ましくは、標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されているもの）によって、実質的に純粋な形態で、且つその成分ヌクレオチド配列の特定、操作、及び回収を可能にする量又は濃度で少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡから誘導されたものである。このような配列は、好ましくは、通常、真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／又は構築される。非翻訳のＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側又は３’側に存在することができ、この場合、これは、コード領域の操作又は発現を妨害しない。特に明記しない限り、本明細書に記載される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への生成の方向は、転写方向と称され、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。

本発明はまた、中程度にストリンジェントな条件下、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸も含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響する基本パラメーター及び好適な条件を考案するためのガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３－６．４）によって示されており、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて当業者が容易に決定することができる。中程度にストリンジェントな条件を達成する一方法は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予洗溶液、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、及び約５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は他の類似のハイブリダイゼーション溶液、例えば、約４２℃のハイブリダイゼーション温度による、約５０％ホルムアミドを含有するもの）、並びに０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中の約６０℃の洗浄条件の使用を含む。一般に、高度にストリンジェントな条件は、およそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄すること以外は上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義される。ＳＳＰＥ（ｌ×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、及び１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーション緩衝液及び洗浄緩衝液中のＳＳＣ（ｌ×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に置換することができ、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間洗浄を行う。当業者に知られており、以下にさらに記載されるとおり、ハイブリダイゼーション反応及び二重鎖安定性を支配する基本原理を適用することにより、所望の程度のストリンジェンシーを達成するために、洗浄温度及び洗浄塩濃度を必要に応じて調節し得ることが理解されるべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。核酸を未知の配列の標的核酸へとハイブリダイズする場合、ハイブリッド長はハイブリダイズする核酸の長さであると仮定する。既知の配列の核酸がハイブリダイズされる場合、ハイブリッド長は、両核酸の配列を整列させ、最適な配列相補性の領域又は領域群を同定することによって決定することができる。５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５～１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは、以下の式に従って決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長を超えるハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）、（式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である）（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、そのようなハイブリダイズする核酸の各々は、少なくとも１５個のヌクレオチド（又はより好ましくは少なくとも１８個のヌクレオチド、若しくは少なくとも２０個のヌクレオチド、若しくは少なくとも２５個のヌクレオチド、若しくは少なくとも３０個のヌクレオチド、若しくは少なくとも４０個のヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド）の長さ、或いはそれがハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％）である長さを有しており、且つそれがハイブリダイズする本発明の核酸と少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、及び最も好ましくは少なくとも９９．５％）を有しており、ここで、配列同一性は、上でより詳細に記載されているように、ハイブリダイズする核酸の配列を、重複及び同一性が最大となり、配列ギャップが最小になるように整列させた場合に当該核酸の配列を比較することにより決定される。

本明細書に記載される抗原結合タンパク質のバリアントは、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的な変異誘発により、カセット若しくはＰＣＲ変異誘発、又は当該技術分野でよく知られる他の技術を使用して、バリアントをコードするＤＮＡを生成し、その後、本明細書に概説するように、細胞培養物中で組換えＤＮＡを発現させることによって調製することができる。しかしながら、最大約１００～１５０個の残基を有するバリアントＣＤＲを含む抗原結合タンパク質が、確立された技術を用いるインビトロ合成によって調製され得る。バリアントは、典型的には、天然に存在する類似体と同じ定性的生物学的活性、例えば抗原への結合を示す。このようなバリアントは、例えば、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行って、最終コンストラクトに至るのであるが、但し、最終コンストラクトは所望の特性を保持するものとする。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるなど、抗原結合タンパク質の翻訳後プロセスを改変する場合もある。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質バリアントは、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を改変する目的で調製される。他の実施形態では、本明細書に記載の目的のため、エピトープ結合に直接関与しない残基、又はエピトープ結合に何ら関与しない残基の改変が望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域のいずれかにおける変異誘発が企図される。抗原結合タンパク質のアミノ酸配列における有用な改変を設計するために、当業者は共分散分析技術を使用することができる。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４１：４７５－４８４，２０００；Ｄｅｍａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１－４８，２００４；Ｈｕｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（５）：３８１－８６，２００３；Ａｕｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００８／０３１８２０７Ａ１号明細書；Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００９／００４８１２２Ａ１号明細書；Ｕｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２００８／１１０３４８Ａ１号パンフレット；Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２００９／００００９９Ａ２号パンフレットを参照されたい。共分散分析によって決定されるそのような改変は、抗原結合タンパク質の効力、薬物動態学的、薬力学的及び／又は製造可能性の特性を改善することができる。

本発明はまた、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の１つ以上の成分（例えば、可変領域、軽鎖、重鎖、改変された重鎖、及びＦｄ断片）をコードする１つ以上の核酸を含むベクターを含む。「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を指す。ベクターの例として、以下に限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、及び発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが挙げられる。用語「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」は、本明細書で使用する場合、特定の宿主細胞における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な所望のコード配列及び適切な核酸制御配列を含有する組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を及ぼすか又はそれを制御し、且つイントロンが存在する場合、それに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含むことができるが、これに限定されない。原核生物での発現に必要な核酸配列には、プロモーター、任意選択によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、及び場合によりその他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、並びに終結シグナル及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列もまた、任意選択により発現ベクターによってコードされ、目的のコード配列に作動可能に連結されることが可能であり、これにより、所望の場合、細胞から目的のポリペプチドがより容易に単離されるように、組換え宿主細胞に発現ポリペプチドを分泌させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、シグナルペプチド配列は、特許請求されるポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に付加／融合され得る。ある特定の実施形態では、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号５２）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドは、ポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。他の実施形態では、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号５３）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドは、ポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。さらなる他の実施形態では、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドは、ポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。本明細書に記載されるポリペプチド配列のアミノ末端に融合され得る他の適切なシグナルペプチド配列としては、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５５）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号５６）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５７）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５８）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号５９）、及びＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号６０）が含まれる。他のシグナルペプチドが当業者に知られており、例えば、特定の宿主細胞における発現を促進又は最適化するために、ポリペプチド配列のいずれかに融合されてもよい。

通常、本発明の二重特異性抗原タンパク質を産生するために宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、並びに二重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする外因性ヌクレオチド配列のクローン化及び発現のための配列を含有することになる。集合的に「隣接配列」と呼ばれるこのような配列は、ある特定の実施形態において、典型的には、以下のヌクレオチド配列：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメントの１つ以上を含むことになる。これらの配列の各々を、以下で論じる。

任意選択により、ベクターは「タグ」コード配列、すなわち、ポリペプチドコード配列の５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してもよく、このオリゴヌクレオチドタグ配列はポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ、又は商業的に入手可能な抗体が存在する別の「タグ」分子をコードする。このタグは、通常、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのポリペプチドの親和性精製又は検出のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、タグに対する抗体を親和性マトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーによって実現することができる。任意選択により、その後、ある特定の切断用ペプチダーゼを使用するなどの様々な手段によって、精製されたポリペプチドからタグを除去することができる。

隣接配列は、同族性（すなわち、宿主細胞と同一の種及び／又は株に由来する）、異種性（すなわち、宿主細胞の種又は株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源に由来する隣接配列の組み合わせ）、合成、又は天然とすることができる。したがって、隣接配列の供給源は、任意の原核生物若しくは真核生物、任意の脊椎動物若しくは無脊椎動物、又は任意の植物とすることができるが、但し、その隣接配列が宿主細胞機構において機能し、且つ宿主細胞機構によって活性化され得るものとする。

本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該技術分野においてよく知られる複数の方法のいずれかによって得られてもよい。典型的には、本明細書において有用な隣接配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって事前に同定されていることになるため、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用し、適切な組織源から単離することができる。場合により、隣接配列の全ヌクレオチド配列は既知であり得る。この場合、隣接配列は、核酸合成又はクローン化の常法を使用して合成することができる。

隣接配列の全てが既知であるか、又はその一部のみが既知であるかを問わず、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用して、且つ／又は同じ若しくは別の種に由来するオリゴヌクレオチド及び／若しくは隣接配列断片などの好適なプローブを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列を得てもよい。隣接配列が未知である場合、隣接配列を含有するＤＮＡの断片は、例えば、コード配列又は１つ或いは複数の別の遺伝子を含有し得るＤＮＡの大型断片から単離され得る。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を生成し、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、又は当業者に既知の他の方法を用いて単離することによって達成され得る。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者であれば容易に分かるであろう。

複製起点は通常、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、その起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。選択したベクターが複製起点部位を含有しなければ、既知の配列に基づいて化学的に合成して、ベクター中にライゲートしてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、種々のウイルス性の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はパピローマウイルス、例えば、ＨＰＶ若しくはＢＰＶ）が、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要でない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターも含有するという理由でのみ、使用されることが多い）。

転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の３’末端側に位置し、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ－Ｃリッチ断片とそれに続くポリＴ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化されるか、又はベクターの一部として、市販品を購入する場合さえあるが、既知の核酸合成の方法を使用して容易に合成することもできる。

選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物の宿主細胞に、抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するタンパク質；又は（ｃ）複合培地又は限定培地からは利用不能の重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子は、原核宿主細胞及び真核宿主細胞の両方でも選択に使用され得る。

他の選択遺伝子を使用して、発現されることになる遺伝子を増幅してもよい。増幅は、増殖又は細胞生存に重要なタンパク質の生成に必要とされる遺伝子が、組換え細胞の累代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体を、この形質転換体のみが唯一、ベクター中に存在する選択遺伝子によって生存するように適合されている選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に増加する条件下で形質転換された細胞を培養することによって課され、それにより、選択遺伝子及び本明細書中に記載される二重特異性抗原結合タンパク質の１つ以上の成分などの別の遺伝子をコードするＤＮＡの両方の増幅を導く。その結果、増幅されたＤＮＡから多量のポリペプチドが合成される。

リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側、及び発現されることになるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。ある特定の実施形態では、１つ以上のコード領域は、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結され、単一のＲＮＡ転写産物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にし得る。

真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される場合などのいくつかの場合には、グリコシル化又は収率を向上させるために、種々のプレ配列又はプロ配列を操作し得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ開裂部位を改変してもよいし、プロ配列を付加してもよく、これもまたグリコシル化に影響を及ぼし得る。最終タンパク質産物は、－１位（成熟タンパク質の第１のアミノ酸に対して）において、発現に付随する１つ以上の追加のアミノ酸を有する場合があり、これは、完全には除去されていなくてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ開裂部位内に見出される１つ又は２つのアミノ酸残基を有し得る。或いは、いくつかの酵素切断部位を使用すると、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、所望のポリペプチドがわずかに切断された形態を生じ得る。

本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含有することになる。「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用する場合、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指令することができる核酸分子が産生されるように、２つ以上の核酸配列が連結されていることを指す。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が、制御配列の転写活性と適合する条件下で達成されるように、タンパク質コード配列にライゲートされている。より具体的には、プロモーター及び／又はエンハンサー配列（シス作用性転写制御エレメントの任意の組み合わせを含む）は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。

プロモーターは、構造遺伝子（一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。通常、プロモーターは、２つのクラス：誘導性プロモーター及び構成的プロモーターの一方に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無又は温度変化などの培養条件のいくらかの変化に応答してそれらの制御下でＤＮＡからの転写レベルの上昇を惹起する。一方、構成的プロモーターは、それが作動可能に連結されている遺伝子を均一に、すなわち遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。好適なプロモーターは、供給源ＤＮＡから制限酵素消化によりプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の例えば、重鎖、軽鎖、修飾された重鎖、又は他の成分をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。

酵母宿主での使用に好適なプロモーターも当該技術分野においてよく知られている。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに使用されるのが有利である。哺乳動物宿主細胞とともに使用するのに好適なプロモーターはよく知られており、以下に限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。

対象となり得るさらなるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９－６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４－１４４５）；メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）；並びにベータ－ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）、又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５）が挙げられるが、これらに限定されない。組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている以下の動物転写制御領域も対象となる：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５－５１５）；膵ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５－１２２）；リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）；精巣、***、リンパ球、及び肥満細胞において活性であるマウス***腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５－４９５）；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８－２７６）；肝臓において活性であるアルファ－フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３－５８）；肝臓において活性であるアルファ１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）；骨髄細胞において活性であるベータ－グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９－９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３－７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３－２８６）；並びに視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２－１３７８）。

エンハンサー配列をベクターに挿入し、高等真核生物によって、二重特異性抗原結合タンパク質の成分（例えば、軽鎖、重鎖、改変重鎖、Ｆｄ断片）をコードするＤＮＡの転写を増加させることができる。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常、約１０～３００ｂｐ長で、プロモーターに作用して転写を増加させる。エンハンサーは、方向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’側及び３’側の両方の位置に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能な複数のエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ－フェト－タンパク質、及びインスリン）。しかしながら、通常、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野で知られているＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ベクターにおいてコード配列の５’側又は３’側のいずれに位置してもよいが、典型的には、プロモーターから５’側の部位に位置する。適切な天然又は異種性のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込んで、細胞外への抗体の分泌を促進することができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体を産生する宿主細胞の型に依存し、天然のシグナル配列を異種性のシグナル配列と交換することができる。シグナルペプチドの例は、上に記載されている。哺乳動物宿主細胞において機能する他のシグナルペプチドとしては、米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されるインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されるインターロイキン－２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７ ５６６号明細書に記載されるインターロイキン－４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されるＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０ ４６０ ８４６号明細書に記載されるＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチドが挙げられる。

提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築してもよい。そのようなベクターは、所望の隣接配列の全てを含有していてもしていなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列の１つ以上がベクター内に最初から存在していない場合、それらを個々に得てベクターにライゲートしてもよい。隣接配列の各々を取得するために使用される方法は、当業者によく知られている。発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質を含むタンパク質を産生することができる。

ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の異なる成分をコードする核酸を、同じ発現ベクターに挿入してもよい。そのような実施形態では、軽鎖及び重鎖が同じｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により、単一のプロモーターの制御下で、２つの核酸が分離されてもよい。或いは、２つの核酸は、軽鎖及び重鎖が２つの別個のｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、２つの別個のプロモーターの制御下にあってもよい。

同様に、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質については、軽鎖をコードする核酸は、改変された重鎖（重鎖及びｓｃＦｖを含む融合タンパク質）をコードする核酸と同じ発現ベクターにクローン化されてもよく、その場合、２つの核酸は単一のプロモーターの制御下にあってＩＲＥＳによって分離されるか、又は２つの核酸は２つの別個のプロモーターの制御下にある。ＩｇＧ－Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質については、３つの成分の各々をコードする核酸は、同じ発現ベクターにクローン化されてもよい。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ－Ｆａｂ分子の軽鎖をコードする核酸、及び第２のポリペプチド（Ｃ末端のＦａｂドメインのもう半分を含む）をコードする核酸は、１つの発現ベクターにクローン化される一方で、改変された重鎖（重鎖及びＦａｂドメインの半分を含む融合タンパク質）をコードする核酸は、第２の発現ベクターにクローン化される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質の全ての成分は、同じ宿主細胞集団から発現される。例えば、１つ以上の成分が、別個の発現ベクター中にクローニングされる場合でも、宿主細胞に双方の発現ベクターがコトランスフェクトされて、１つの細胞が二重特異性抗原結合タンパク質の全ての成分を生成するようになる。

ベクターが構築されて、本明細書中に記載される二重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする１種以上の核酸分子が、１種以上のベクターの適切な部位中に挿入された後に、完成したベクターは、増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞中に挿入され得る。したがって、本発明は、二重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする１つ以上の発現ベクターを含む単離された宿主細胞を包含する。「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸で形質転換されているか、又は形質転換されることが可能であり、それにより、目的の遺伝子を発現する細胞を指す。この用語には、目的の遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫の形態又は遺伝的構造が元の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫が含まれる。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に作動可能に連結された、本発明の単離された核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。

抗原結合タンパク質の発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、又は他の知られた技術を含むよく知られた方法によって達成され得る。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞型に応じることになる。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者にはよく知られており、例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に示されている。

宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、抗原結合タンパク質を合成し、これはその後、（宿主細胞が培地中に分泌するならば）培養培地から回収され得るか、又は（分泌されなければ）産生する宿主細胞から直接的に回収され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化など）に望ましいか又は必要であるポリペプチドの修飾、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの様々な要因に依存することになる。

例示的な宿主細胞としては、原核生物、酵母、又は高等真核生物の細胞が挙げられる。原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母が、組換えポリペプチドに適したクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的なパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に用いられている。しかしながら、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、並びに糸状菌、例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの複数の他の属、種及び株が、ここで一般に利用可能であり、有用である。

グリコシル化された抗原結合タンパク質の発現のための宿主細胞は、多細胞生物に由来し得る。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及びバリアント並びにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモ虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。このような細胞のトランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１バリアント、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公的に入手可能である。

脊椎動物宿主細胞もまた好適な宿主であり、このような細胞からの抗原結合タンパク質の組換え産生は常法となっている。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野においてよく知られており、以下に限定されないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、以下に限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞、又は懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞）（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞、及びいくつかの他の細胞株が挙げられる。別の実施形態では、それ自体の抗体は作製しないが、異種性抗体を作製及び分泌する能力を有するＢ細胞系統由来の細胞株を選択することができる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞が、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を発現するのに好ましい宿主細胞である。

二重特異性抗原結合タンパク質の産生のために、宿主細胞は上記の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地中で培養される。加えて、選択マーカーによって分離された転写単位の複数のコピーを有する新規なベクター及びトランスフェクトされた細胞株は、抗原結合タンパク質の発現に特に有用である。したがって、本発明はまた、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質を調製する方法であって、本明細書に記載される１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を、当該１つ以上の発現ベクターによってコードされる二重特異性抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下にて培養培地中で培養すること；及び培養培地から二重特異性抗原結合タンパク質を回収することを含む方法も提供する。

本発明の抗原結合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９；Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０；米国特許第４，７６７，７０４号明細書；米国特許第４，６５７，８６６号明細書；米国特許第４，９２７，７６２号明細書；米国特許第４，５６０，６５５号明細書；若しくは米国特許第５，１２２，４６９号明細書；国際公開第９０１０３４３０号パンフレット；国際公開第８７／００１９５号パンフレット；又は米国再発行特許第３０，９８５号明細書に記載される培地のいずれかが、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（商標）薬物）、微量元素（通常はマイクロモル範囲の最終濃度にて存在する無機化合物として定義される）、並びにグルコース又は同等のエネルギー源が補充され得る。また、他の必須のあらゆる栄養補助物質が、当業者に知られている適切な濃度にて含まれ得る。温度及びｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。

宿主細胞を培養すると、二重特異性抗原結合タンパク質は、細胞内で産生されるか、細胞膜周辺腔内で産生されるか、又は培地中に直接分泌され得る。抗原結合タンパク質が細胞内で産生される場合、第１の工程として、粒状の破片である宿主細胞又は溶解した断片を、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン若しくは陰イオン交換クロマトグラフィー、又は好ましくは、親和性リガンドとして目的の抗原又はプロテインＡ若しくはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３，１９８３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５，１９８６）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。コントロールドポアガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて実現することができるよりも、流速を速く、処理時間を短くすることが可能である。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が、精製に有用である。回収されることになる特定の二重特異性抗原結合タンパク質に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術もまた可能である。

ある特定の実施形態では、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド及び第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現は、第１の哺乳動物宿主細胞において実施され、発現は、第１の哺乳動物宿主細胞と同じ型の第２の哺乳動物宿主細胞における
（ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む第３のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第４のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現と比較してＳＥＣによって測定されるとおりの１／２抗体種不純物のより低いパーセンテージをもたらす。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第３の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含み；且つ
（ｉｉ）第４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＫ４３９Ｄを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド及び第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現は、第１の哺乳動物宿主細胞において実施され、発現は、第１の哺乳動物宿主細胞と同じ型の第２の哺乳動物宿主細胞における
（ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む第３のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第４のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現と比較してプロテインＡ精製後にｍｇ／ｍｌによって測定されるとおり多重特異性抗原結合タンパク質のより高い収量をもたらす。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄを含み；且つ
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＥ３５６Ｋを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、（ｉ）第３の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含み；且つ
（ｉｉ）第４の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＫ４３９Ｄを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う。

ある特定の実施形態では、第１及び第２の抗体軽鎖は、同一である。

実験手順
分子生物学
目的の分子、（抗体ＨＣ、抗体ＬＣ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｃ）の可変ドメインのオープンリーディングフレームは、外部の提供者によって合成された後、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ技術を使用する定常ドメイン及びＢｓｍＢＩ制限部位を含有する一過的発現ベクターに個別にクローン化された。ＨＣは、ＣＨ２に付加された安定化ジスルフィドを有するアグリコヒトＩｇＧ１足場において構築された（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１７）。優先的なヘテロ－ＩｇＧ編成のために設計されたＨＣは、Ｆｃ－ＣＨ３ドメイン中に変異された電荷対変異（ＣＰＭ）を有した。配列確認の後、トランスフェクショングレードのＤＮＡを、産業標準のプレップキットを使用して調製した。プラスミドを、モノクローナル抗体に関して１：１の質量比（一価ｓｃＦｖ－Ｆｃ分子に関してｓｃＦｖ－Ｆｃ：Ｆｃ、１：１：１：１（ＬＣ１：ＨＣ１：ＬＣ２：ＨＣ２））で混合した。

哺乳動物発現
全ての一価ヘテロ－ＩｇＧ分子は、カナダ国立研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ）によって開発された一過的ＨＥＫ２９３－６Ｅ発現系を使用して発現された。バルプロ酸ナトリウムもまた、発現系に組み込まれた。この場合、細胞を、トランスフェクションのために２ｅ６個の生存細胞／ｍＬまで増殖させた。トランスフェクションは、０．５μｇ ＤＮＡ／ｍＬを１００μｌ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ－１７培地中で１．５μｌ ＰＥＩｍａｘ／ｍＬ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１０分間混合した後、複合体を９００μＬの細胞培養物に加えることによってなされた。トランスフェクションの２４時間後、新鮮な培地を、培養物の２倍量まで加え、トリプトン－Ｎ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）及びグルコース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をそれぞれ２．５ｇ／Ｌ及び４．５ｇ／Ｌの最終濃度に達するまで加えた。トランスフェクションの４日後、バルプロ酸ナトリウム（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を、３．７５ｍＭの最終濃度まで加えた。トランスフェクションの６日後、条件培地を、遠心分離により収集した後、０．２２ｕｍフィルターに通して真空濾過した。Ｆｃコンストラクトの場合、発現は、トランスポゾン技術の組み込みによる内部の安定なＣＨＯ－Ｋ１プロセスを使用してなされた。トランスフェクションのために、細胞を遠心分離し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中において２Ｅ６個の生存細胞／ｍＬで再懸濁させた。トランスフェクションは、２μｇのプラスミドＤＮＡを１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中において２μｇのトランスポゾンＤＮＡ及び１０μＬのリポフェクタミンＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と混合し、１５～２０分間インキュベートし、複合体を１ｍＬの再懸濁された細胞に加えることによってなされた。培養物を、１２０ＲＰＭに設定された振盪プラットフォーム上において３７℃及び５％ ＣＯ_２でインキュベートした。トランスフェクションの５時間後、２ｍＬの本発明者らの内製の増殖培地を加えた。トランスフェクションの７２時間後、細胞を増殖培地中で再懸濁させ、１０μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び６００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを加え、増殖及び生存率がトランスフェクション前のレベルに達するまで希釈により継代した。培養物を、内製の産生培地中における１．５Ｅ６個の細胞／ｍＬでの培地交換によって産生のために播種した。播種の７日後、条件培地を収集した。

精製
ヘテロ－ＩｇＧ ＣＰＭ分子を、プロテインＡ親和性レジンに続いて、ＤＥＶＤヘテロ－ＩｇＧプロトコルに記載されるとおりであるがＳＥＣカラムを省略したＳＰ ＨＰ ＣＥＸで精製した。各試料を、１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ ＣＥＸカラム上にロードし、各ｐＨ緩衝液において３０ＣＶ ０～４００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で溶出した。ピーク画分を、最終試料に関してＭＣＥ、ＵＰＬＣ及びＬＣ－ＭＳによって分析した。プールを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６中で平衡化された１０ｍＬ ＳＰ ＨＰカラム上にロードし、３０ＣＶ ０～４００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で溶出した。ピーク画分をプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース、ｐＨ５．２中で透析した。

全ての分子に関して、最終タンパク質試料を、Ｃａｌｉｐｅｒ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してマイクロ－キャピラリー電気泳動（ｍＣＥ）によって、及び１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、７．５％ ＥｔＯＨ、ｐＨ６．９中においてＢＥＨ Ｃ－２００、４．６×１５０ｍｍカラムによるＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）によって純度について分析した。ＬＣＭＳ－ＱＣもまた、各分子の正確な質量を決定するために実施された。

ＳＥＣ分析に関して、約７０μｇの各試料を、ＢＥＨ２００、４．６×３００ｍｍカラムを備えたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に注入した。移動相は、０．３ｍＬ／分の流速、ｐＨ６．８の１００ｍＭリン酸ナトリウム及び５００ｍＭ ＮａＣｌであった。データを、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）で分析した。

バランスのとれた電荷コンストラクト
ＣＰＭ設計、ｖ１０３を、４種のヘテロ－ＩｇＧ分子において評価した（図１及び表１）。各ヘテロ－ＩｇＧは、配列多様性の影響を決定するために２つの異なるＦｖ領域を含有した。効率的な対形成はサロゲート分子において明確に実証できたが、追加の配列の導入は、この関連性を歪める可能性がある（１つのポリペプチド鎖の過剰／過小発現など）。さらに、タンパク質発現及び誤対合種に対する目的の種のパーセンテージに対するＣＨ３／ＣＨ３’界面にわたるＣＰＭ分布の影響も理解するために、２つの異なるシナリオが評価された：ｉ）二成分の正／負の分布の交換及びｉｉ）ＣＨ３／ＣＨ３’界面におけるＣＰＭｖ１０３の電荷分布が混合され（ＨＣ＿１におけるＤ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄ／Ｅ（青色）；ＨＣ＿２におけるＫ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ及びＥ３５６Ｋ（緑色））、バランスのとれた電荷分布（ＢＣＤ）を作り出した後、結果として起きる交換。驚くべきことに、発現データ（プロテインＡのカラムで捕捉された）は、シナリオｉ）の場合、１つの配向（ＨＣ＿１上の負に荷電した変異Ｋ４０９Ｄ／Ｅ Ｋ３９２Ｄ／Ｅ Ｋ４３９Ｄ／Ｅ（青色）及びＨＣ＿２上の正に荷電した変異Ｄ３９９Ｋ Ｅ３５６Ｋ（緑色））が、３／４分子の発現を約２倍まで増加させることを示した（図１Ａ）。ｖ１０３に関するこの無作為な配置はまた、タンパク質フォールディング及び不純物に影響を及ぼすように見えた。実際に、ヘテロ－ＩｇＧ Ａ×Ｂは、分析的ＳＥＣによって決定されるとおり、ＣＰＭ交換時（図１Ｂ）に１３．３％を超える１／２－Ａｂ（約７５ｋＤａ）を示していたのが０％付近になった。この約７５ｋＤａの不純物は、一方のＨＣが他方より過剰に発現し、その結果、これらのＣＰＭによって生成される反発電荷のためにホモダイマーを形成できなくなった結果である可能性がある。対照的に、Ｃ×Ｄ、Ｅ×Ｆ及びＧ×Ｈ分子は全て、この不純物が増加した（図１Ｂ）。これは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のタンパク質配列とＣＨ３／ＣＨ３’二量体に配置された５個の荷電変異の間の関連性を示唆しているように見える。著しく対照的に、シナリオｉｉの交換では、ＣＰＭｖ１０３ＢＣＤの交換はこの４分子パネルの発現に影響を与えず、中央値はほぼ同一であった（図１Ａ）。１／２－Ａｂ種に関して、ＣＰＭｖ１０３ＢＣＤ交換におけるＡ×Ｂ分子とは別に、ＢＣＤ設計は、この約７５ｋＤａの不純物を著しく減少させるように見え、これは所望の種のより高い最終的な回収率につながることになる（図１Ｂ）。

Claims (19)

1. 第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチド及び第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドを含むヘテロ二量体免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む単離されたヘテロ多量体であって、
   （ｉ）前記第１の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドが、以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含み；且つ
   （ｉｉ）前記第２の免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドが、以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含み；
   アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う、単離されたヘテロ多量体。
2. 前記ヘテロ多量体が、第１の免疫グロブリンＦｃポリペプチド及び第２の免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、前記第１の免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離されたヘテロ多量体。
3. 前記ヘテロ多量体が、第１のヒンジドメインポリペプチド及び前記第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド；並びに第２のヒンジドメインポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離されたヘテロ多量体。
4. 前記ヘテロ多量体が、第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチド；並びに第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドを含む二重特異性抗体コンストラクトであり、
   前記第１の重鎖ポリペプチドが、第１のＶＨドメイン、第１のＣＨ１ドメインポリペプチド、第１のヒンジドメインポリペプチド、及び前記第１のＦｃポリペプチドを含み；且つ前記第２の重鎖ポリペプチドが、第２のＶＨドメイン、第２のＣＨ１ドメインポリペプチド、第２のヒンジドメインポリペプチド、及び前記第２のＦｃポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離されたヘテロ多量体。
5. ｉ）前記第１の重鎖ポリペプチドが、１８３位でリジンを含み；
   ｉｉ）前記第１の軽鎖ポリペプチドが、１７６位でグルタミン酸を含み；
   ｉｉｉ）前記第２の重鎖ポリペプチドが、１８３位でグルタミン酸を含み；且つ
   ｉｖ）前記第２の軽鎖ポリペプチドが、１７６位でリジンを含み；
   アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う、請求項４に記載の単離されたヘテロ多量体。
6. ｉ）前記第１の重鎖ポリペプチドが、１８３位でグルタミン酸を含み；
   ｉｉ）前記第１の軽鎖ポリペプチドが、１７６位でリジンを含み；
   ｉｉｉ）前記第２の重鎖ポリペプチドが、１８３位でリジンを含み；且つ
   ｉｖ）前記第２の軽鎖ポリペプチドが、１７６位でグルタミン酸を含み；
   アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従う、請求項４に記載の単離されたヘテロ多量体。
7. 前記第１及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、ＩｇＧ１－、ＩｇＧ２－ ＩｇＧ３－又はＩｇＧ４－免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドに由来するか又はその変異バージョンである、請求項１～６のいずれかに記載の単離されたヘテロ多量体。
8. 前記第１及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、ＩｇＧ１－又はＩｇＧ２－免疫グロブリンＣＨ３ドメインポリペプチドに由来するか又はその変異バージョンである、請求項７に記載の単離されたヘテロ多量体。
9. 多重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、前記抗原結合タンパク質が、異なるエピトープに結合する少なくとも２つの結合ドメインを含み、哺乳動物宿主細胞において：
   （ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
   （ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＥ３５６Ｋを含む第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを発現させることを含み；
   アミノ酸残基の付番が、Ｋａｂａｔに記載されるとおりのＥＵインデックスに従い、
   前記第１の結合ドメインが、前記第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、前記第２の結合ドメインが、前記第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合され、且つ
   前記結合ドメインが、ＶＨ、ｓｃＦａｂ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される方法。
10. 前記第１の結合ドメインが、前記第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、前記多重特異性抗原結合タンパク質がさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している第１の抗体軽鎖を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記第２の結合ドメインが、前記第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、前記多重特異性抗原結合タンパク質がさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している第２の抗体軽鎖を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記第１の結合ドメインが、前記第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、前記多重特異性抗原結合タンパク質がさらに、第１のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含み；且つ
    前記第２の結合ドメインが、前記第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の結合ドメインが、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
13. 前記第２の結合ドメインが、前記第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたＶＨであり、前記多重特異性抗原結合タンパク質がさらに、第２のエピトープに結合するＶＨと会合している抗体軽鎖を含み；且つ
    前記第１の結合ドメインが、前記第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第１の結合ドメインが、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
14. 前記第１の結合ドメインが、前記第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂであり、前記第２の結合ドメインが、前記第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合されたｓｃＦａｂである、請求項９に記載の方法。
15. 前記結合ドメインが、それらの対応するＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に融合され、前記多重特異性抗原結合タンパク質がさらに、前記ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの一方、又は両方のいずれかのＣ末端に融合された第３の結合ドメインを含み、前記第３の結合ドメインが、受容体リガンド ＶＨ、ｓｃＦａｂ、又はｓｃＦｖである、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド及び前記第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現が、第１の哺乳動物宿主細胞において実施され、前記発現が、前記第１の哺乳動物宿主細胞と同じ型の第２の哺乳動物宿主細胞における
    （ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む第３のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
    （ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第４のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現と比較してＳＥＣによって測定されるとおりの１／２抗体種不純物のより低いパーセンテージをもたらす、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記第１のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド及び前記第２のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現が、第１の哺乳動物宿主細胞において実施され、前記発現が、前記第１の哺乳動物宿主細胞と同じ型の第２の哺乳動物宿主細胞における
    （ｉ）以下のアミノ酸置換：Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む第３のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチド；及び
    （ｉｉ）以下のアミノ酸置換：Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ、及びＫ４３９Ｄ／Ｅを含む第４のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドの発現と比較してプロテインＡ精製後にｍｇ／ｍｌによって測定されるとおり多重特異性抗原結合タンパク質のより高い収量をもたらす、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記第１の抗体軽鎖及び前記第２の抗体軽鎖が、同一である、請求項４に記載のヘテロ多量体。
19. 前記第１の抗体軽鎖及び前記第２の抗体軽鎖が、同一である、請求項１１に記載の方法。

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