JP2023539457A - 変形抗体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、溶解度が増加し、高濃度で濃縮可能な改善された変形抗体及びその製造方法に関し、抗体の骨格領域に位置するアミノ酸が置換された変形抗体及びその製造方法に関する。
Description
本発明は、溶解度が増加し、高濃度で濃縮可能な改善された変形抗体及びその製造方法に関し、抗体の骨格領域に位置するアミノ酸が置換された変形抗体及びその製造方法に関する。
抗体は、癌、自己免疫疾患などの疾患を治療するのに非常に効果的な治療剤として使用されている。抗体の開発可能性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ）は、高い収率、安定的剤形化、高い物理化学的及び生体内安定性、高い溶解度、ＰＫ特性などを考慮して評価される。
抗体は、タンパク質医薬品であって、共有結合での変化などによって化学的に不安定であったり、３次元空間構造の変形などによって物理的に不安定であり得る。抗体は、化学的に加水分解、酸化、脱アミド化、二硫化変形又はラセミ化などによって不安定化されるおそれがあり、凝集、吸着又は溶解などによって物理的に不安定であり得る。
このような抗体の不安定性は、溶解度、効能などに影響を与える可能性があり、抗体の安定性及び溶解度を低下させことによって、生産性の低下及び生産収率の減少が誘導されるだけでなく、凝集性向が増加し、免疫原性の危険度が上昇するようになる。
このような技術的背景の下で、本出願の発明者等は、抗体の溶解度を向上させ、高濃度で濃縮可能な変形抗体（改変抗体、修飾抗体等ともいう。）を開発するために努力した。その結果、特定の位置のアミノ酸置換を通じて改善された溶解度を示し、高濃度で濃縮可能であることを確認し、本発明を完成するに至った。
Next generation antibody drugs:pursuit of the ‘high-hanging fruit’（次世代の抗体医薬:「達成困難な課題」の追求）, Nat.Rev.Drug Discovery.,2018.17:197-223.
本発明の目的は、抗体の特性が改善された変形抗体又はその断片を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記変形抗体又はその断片を製造する方法を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のうち１３番の位置、４２番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）、及び軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のうち９４番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸が置換された、変形抗体又はその断片を提供する。
また、本発明は、重鎖可変領域のうち１３番の位置、４２番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）、及び軽鎖可変領域のうち９４番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸を置換することを含む、変形抗体又はその断片の製造方法を提供する。
他の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるのと同一の意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
本出願の発明者等は、重鎖可変領域のうちＡＨＯナンバリングによる１３番の位置（Ｖ１２）、４２番の位置（Ｎ３５）、及び軽鎖可変領域のうちＡＨＯナンバリングによる９４番の位置（Ｎ７６）で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸が置換される場合、向上した溶解度を示し、高濃度で濃縮可能であり、生産性が向上することを確認した。
特に、重鎖可変領域のうちＡＨＯナンバリングによって１３番の位置（Ｖ１２）がセリン（Ｓ）、４２番の位置（Ｎ３５）がトレオニン（Ｔ）に置換されたり、又は軽鎖可変領域のうちＡＨＯナンバリングによって９４番の位置（Ｎ７６）がセリン（Ｓ）に置換される場合、向上した溶解度を示し、高濃度で濃縮可能であり、生産性が向上することを確認した。
これに基づいて、本発明は、一観点において、重鎖可変領域のうち１３番の位置、４２番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）、及び軽鎖可変領域のうち９４番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸が置換された、変形抗体又はその断片に関する。
また、本発明は、重鎖可変領域のうち１３番の位置、４２番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）、及び軽鎖可変領域のうち９４番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸を置換することを含む、変形抗体又はその断片の製造方法に関する。
本発明で開示された抗体又はその断片に対するアミノ酸位置は、ＡＨＯナンバリングシステムによって定義又は確認され得る。場合によって、本発明で開示された抗体又はその断片に対するアミノ酸位置は、配列番号３４の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のうちＮ末端で開始されるアミノ酸を１番とし、順次ナンバリングされた位置を意味し得る。
一つの実施例において、前記重鎖可変領域の１３番の位置、４２番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）、及び軽鎖可変領域の９４番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）は、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）に置換され得る。
具体的な実施例において、次のように構成された群から選ばれる一つ以上の位置（ＡＨＯナンバリングによる）でアミノ酸置換を含むことができる。
重鎖可変領域の１３番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の４２番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換；及び
軽鎖可変領域の９４番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換。
本発明の具体的な実施例によると、次のような位置（ＡＨＯナンバリングによる）でアミノ酸置換を含むことができる：
重鎖可変領域の１３番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の４２番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換；
軽鎖可変領域の９４番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の１３番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換し、重鎖可変領域の４２番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換；
重鎖可変領域の１３番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換し、軽鎖可変領域の９４番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の４２番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換し、軽鎖可変領域の９４番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換；又は
重鎖可変領域の１３番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換し、重鎖可変領域の４２番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換し、軽鎖可変領域の９４番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換。
上記のようなアミノ酸置換により、抗体の溶解度が改善され、高濃度で濃縮可能であり、これによって生産性が改善されることを確認した。
上記のアミノ酸置換と異なり、重鎖可変領域の１１番（ＡＨＯナンバリングによる）のロイシンをトレオニンに置換したり、重鎖可変領域の１０３番（ＡＨＯナンバリングによる）のバリンをセリンに置換したり、軽鎖可変領域の７７番（ＡＨＯナンバリングによる）のグルタミンをアルギニンに置換した場合は、目的とする溶解度の改善効果を確認できなかった。
具体的な実施例において、本発明に係る変形抗体又はその断片は、次のように構成された群から選ばれた一つ以上の骨格領域を含むことができる：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＸ１ＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（前記Ｘ１はＳ）；
ＭＸ２ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ（前記Ｘ２はＴ）；及び
ＮＬＱＳＧＶＳＳＱＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＸ３ＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（前記Ｘ３はＳ）。
具体的には、配列番号３４の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域を含む抗－Ａｎｇ２抗体クローンであるＯ４を対象にして、重鎖可変領域の１２番の位置、３５番の位置、及び軽鎖可変領域の７６番の位置で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸がそれぞれセリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）に置換され得る。
一つの実施例において、配列番号３４の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域を含む抗－Ａｎｇ２抗体クローンであるＯ４のうち、次のように構成された群から選ばれる一つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。
重鎖可変領域の１２番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の３５番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換；及び
軽鎖可変領域の７６番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換。
具体的には、本発明によると、次のようなアミノ酸置換を含むことができる：
重鎖可変領域の１２番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の３５番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換；
軽鎖可変領域の７６番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の１２番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換し、重鎖可変領域の３５番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換；
重鎖可変領域の１２番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換し、軽鎖可変領域の７６番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の３５番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換し、軽鎖可変領域の７６番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換；又は
重鎖可変領域の１２番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換し、重鎖可変領域の３５番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換し、軽鎖可変領域の７６番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換。
配列番号３４の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域を含む抗－Ａｎｇ２抗体クローンであるＯ４を対象にして物性改善を行った結果、重鎖可変領域のＦＲ１にＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＸ１ＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（前記Ｘ１はＳ）の配列を有する骨格領域を含んだり、ＦＲ３にＭＸ２ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ（前記Ｘ２はＴ）の配列を有する骨格領域を含んだり、ＦＲ１にＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＸ１ＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（前記Ｘ１はＳ）、及びＦＲ３にＭＸ２ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ（前記Ｘ２はＴ）の配列を有する骨格領域を含む場合、抗体の溶解度が改善され、高濃度で濃縮可能であり、これによって生産性が改善されることを確認した。
また、軽鎖可変領域のＦＲ３にＮＬＱＳＧＶＳＳＱＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＸ３ＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（前記Ｘ３はＳ）の配列を有する骨格領域を含む場合、抗体の溶解度が改善され、高濃度で濃縮可能であり、これによって生産性が改善されることを確認した。
さらに、重鎖可変領域のＦＲ１にＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＸ１ＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（前記Ｘ１はＳ）の配列を有する骨格領域を含み、軽鎖可変領域のＦＲ３にＮＬＱＳＧＶＳＳＱＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＸ３ＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（前記Ｘ３はＳ）の配列を有する骨格領域を含んだり、
重鎖可変領域のＦＲ３にＭＸ２ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ（前記Ｘ２はＴ）の配列を有する骨格領域を含み、軽鎖可変領域のＦＲ３にＮＬＱＳＧＶＳＳＱＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＸ３ＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（前記Ｘ３はＳ）の配列を有する骨格領域を含んだり、又は
重鎖可変領域のＦＲ１にＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＸ１ＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（前記Ｘ１はＳ）の配列を有する 骨格領域を含み、重鎖可変領域のＦＲ３にＭＸ２ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ（前記Ｘ２はＴ）の配列を有する骨格領域を含み、軽鎖可変領域のＦＲ３にＮＬＱＳＧＶＳＳＱＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＸ３ＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（前記Ｘ３はＳ）の配列を有する骨格領域を含む場合、抗体の溶解度が改善され、高濃度で濃縮可能であり、これによって生産性が改善されることを確認した。
場合によって、本発明に係る変形抗体又はその断片は、Ａｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２）に結合する抗体又はその抗原結合断片であり得る。
このとき、前記抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１、７、１３、１９及び２５で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、８、１４、２０及び２６で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３、９、１５、２１、２７、４３、４４及び４５で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号４、１０、１６、２２、及び２８で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１１、１７、２３及び２９で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１２、１８、２４及び３０で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
本明細書で使用された用語である「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、Ａｎｇ２に特異的に結合する抗－Ａｎｇ２抗体を意味する。本発明の範囲には、Ａｎｇ２に特異的に結合する完全な抗体の形態のみならず、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であって、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうちＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域及び重鎖の１番目の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと相違する。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体断片である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ、ｓｃＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり、又はＣ－末端で直接連結されており、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体の抗体をパパインで制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる。）、遺伝子組換え技術を通じて製作することもできる。
一つの実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖの形態（例えば、ｓｃＦｖ）であったり、完全な抗体の形態である。また。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）のうちいずれか一つのアイソタイプから選ばれ得る。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ型であり得る。
本明細書で使用される用語である「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長の重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書で使用される用語である「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長の軽鎖及びその断片を全て意味する。
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド－結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗－イディオタイブ（抗－Ｉｄ）抗体、又は前記各抗体のエピトープ－結合断片などを含むが、これに限定されることはない。
前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異を除いては、同一のものを称する。単一クローン抗体は高度に特異的であるので、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に、相違する決定因子（エピトープ）に対して指示された相違する抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクロナール抗体は、抗原上の単一決定因子に対して指示される。
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合できるタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、通常、化学的に活性である表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成されており、一般に、特定の３次元の構造的特徴のみならず、特定の電荷特性を有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失するが、後者に対する結合は消失しないという点で区別される。
前記「ヒト化」形態の非ヒト（例：ミュリン）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容体の超可変領域からの残基を、目的とする特異性、親和性及び能力を保有している非ヒト種（供与体抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域路からの残基に取り替えたヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。
前記「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域及び構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されていることを意味する。
重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来したり、特別な抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一であったり、これと相同性である一方で、残りの鎖は、他の種から由来したり、他の抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一であったり、これと相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）のみならず、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。
本願に使用された「抗体可変ドメイン」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分を称する。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを称する。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを称する。
「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を称する。各可変ドメインは、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。本発明は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
本発明において、前記Ａｎｇ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号４５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
「骨格領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。本出願の発明者等は、改善された抗体の生産性及び高濃縮の剤形を開発するために、生産性及び溶解度の改善を目標にして骨格領域に突然変異を誘導した。
「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えば、ｓｃＦｖで堅固に、実質的に共有結合された二量体からなる。
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般に、それらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近に共有結合される一対のＦａｂ断片を含む。
「単一鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
本発明に係る抗体は、機能的に１０－５Ｍ乃至１０－１２Ｍの結合親和性を示す範囲内にある。本発明に係るアミノ酸置換にもかかわらず、抗原に対する親和度は低下したり、親和度に否定的影響を及ぼさない場合がある。
例えば、変形抗体の抗原に対する結合親和性は、１０－６Ｍ乃至１０－１２Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－１２Ｍ、１０－８Ｍ乃至１０－１２Ｍ、１０－９Ｍ乃至１０－１２Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－８Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－９Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－１０Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－８Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－９Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－９Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－９Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－９Ｍ、１０－８Ｍ乃至１０－９Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－８Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－８Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－８Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－７Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－７Ｍ又は１０－５Ｍ乃至１０－６Ｍである。
本発明に係る変形抗体は、配列番号３１、３３、３６で構成される群から選ばれる重鎖可変領域及び／又は配列番号３５の軽鎖可変領域を含むことができる。
本発明に係る具体的な実施例において、配列番号３１の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域；
配列番号３３の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域；
配列番号３４の重鎖可変領域及び配列番号３５の軽鎖可変領域；
配列番号３６の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域；
配列番号３１の重鎖可変領域及び配列番号３５の軽鎖可変領域；
配列番号３３の重鎖可変領域及び配列番号３５の軽鎖可変領域；又は
配列番号３６の重鎖可変領域及び配列番号３５の軽鎖可変領域；を含むことができる。
本発明の変形抗体又はその断片は、目的とする機能を維持する範囲内で、本明細書に記載された抗体の配列のみならず、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他の生物学的特性をより改善させるために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいている。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析により、アルギニン、リシン及びヒスチジンはいずれも正電荷を帯びた残基で；アラニン、グリシン及びセリンは類似する大きさを有し、；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似する形状を有することが分かる。よって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは生物学的に機能均等物であると言える。
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮したとき、本発明の抗体又はこれをコーディングする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記実質的な同一性は、上記の本発明の配列と任意の他の配列とを最大限対応するようにアラインし、当業界で通常的に用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合、最小９０％の相同性、最も好ましくは、最小９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知となっている。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ＮＣＢＩなどで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘなどの配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
これに基づいて、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体と比較して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当業界に公知となった方法による配列比較及び／又は整列によって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ ２．０）、手動整列及び肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。
本発明は、他の観点において、前記変形抗体又はその断片をコーディングする核酸に関する。
本発明の抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸を分離し、抗体又はその抗原結合断片を組み換える形態で生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入した後、さらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又はさらに発現させる。これに基づいて、本発明は、更に他の観点において、前記核酸を含むベクターに関する。
「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドのみならず、糖又は塩基部位が変形した類似体（ａｎａｌｏｇ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコーディングする核酸の配列は変形し得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、非保存的置換又は保存的置換を含む。
本発明に係る具体的な実施例において、前記核酸は、
配列番号３７の重鎖可変領域をコーディングする配列及び配列番号３８の軽鎖可変領域をコーディングする配列；
配列番号３９の重鎖可変領域をコーディングする配列及び配列番号３８の軽鎖可変領域をコーディングする配列；
配列番号４０の重鎖可変領域をコーディングする配列及び配列番号４１の軽鎖可変領域をコーディングする配列；
配列番号４２の重鎖可変領域をコーディングする配列及び配列番号３８の軽鎖可変領域をコーディングする配列；
配列番号３７の重鎖可変領域をコーディングする配列及び配列番号４１の軽鎖可変領域をコーディングする配列；
配列番号３９の重鎖可変領域をコーディングする配列及び配列番号４１の軽鎖可変領域をコーディングする配列；又は
配列番号４２の重鎖可変領域をコーディングする配列及び配列番号４１の軽鎖可変領域をコーディングする配列；を含むことができる。
前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を使用することによって（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には、一般に、次のうち一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終決配列。
本明細書で使用される用語である「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターなどを含む。前記ベクターで抗体をコーディングする核酸は、プロモーターと作動的に連結されている。
「作動的に連結」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
原核細胞を宿主とする場合は、転写を進行できる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解読終決配列を含むことが一般的である。また。例えば、真核細胞を宿主とする場合は、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘログロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用可能であり、一般に、転写終決配列としてポリアデニル化配列を有する。
場合によって、ベクターは、それから発現される抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されることもある。融合される配列としては、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがある。
前記ベクターは、選択標識として当業界で通常的に用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、前記ベクターとしては、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
本発明は、更に他の観点において、前記言及したベクターに形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使用された細胞は、原核生物、酵母又は高等真核細胞であり得るが、これに制限されることはない。
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブティリス及びバチルス・チューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））などの原核宿主細胞を用いることができる。
ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であり得るが、これに制限されることはない。
本発明は、更に他の観点において、重鎖可変領域のうち１２番の位置又は３５番の位置、及び／又は軽鎖可変領域のうち７６番の位置のアミノ酸をそれぞれセリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）に置換することを含む変形抗体又はその断片の製造方法に関する。
前記変形抗体又はその断片をコーディングする核酸を細胞に導入することができる。前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用培地は、いずれも制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知となっているその他の全ての必須補充物が適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者にとって明白であろう。
前記抗体又はその断片を回収する方法は、例えば、遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果物を、例えば、親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加的なその他の精製技術としては、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが使用され得る。
本発明は、更に他の観点において、前記抗体又はその断片を有効成分として含む腫瘍の予防又は治療用組成物に関する。前記抗体は、ＩｇＧ又は可変領域を含む断片、すなわち、ＳｃＦｖ又はＦａｂであり得る。また、重鎖の可変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４であり得る。
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係る抗体又はその断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体；を含む眼疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を眼疾患の患者に投与する段階を含む眼疾患の予防又は治療方法であり得る。さらに、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片のＡｎｇ２のメカニズム妨害用途、及びこれを通じた眼疾患の予防又は治療用途であり得る。
眼疾患と関連して、角膜は、無血管組織であって、視力保存のために常に透明性を維持しなければならない。しかし、新生血管の生成は、目でも表れ、眼球の新生血管と関連した疾患を誘発すると知られている。すなわち、角膜での新生血管の生成は、眼球の透明性を阻害することによって視力の損失をもたらし、網膜での新生血管の生成により、非正常的な血管が生成されることによって血液の滲出現象が起こり、網膜細胞の変性を通じた失明を誘導する。
これに基づいて、本発明は、眼疾患、例えば、未熟児網膜症、角膜血管新生性疾患、糖尿病網膜症、脈絡膜新生血管疾患、黄斑変性（例えば、年齢と関連した黄斑変性）などの予防又は治療に使用され得る。
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係る抗体又はその断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体；を含む腫瘍の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を腫瘍患者に投与する段階を含む腫瘍の予防又は治療方法であり得る。さらに、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片のＡｎｇ２のメカニズム妨害用途、及びこれを通じた腫瘍の予防又は治療用途であり得る。
前記組成物に適用される疾患である腫瘍は、典型的に、Ａｎｇ２を過剰発現する腫瘍又は癌、及びＡｎｇ２を過剰発現していない腫瘍又は癌を含む。治療用として好ましい腫瘍又は癌の非制限的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、淡明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺癌）、膵臓腺癌、乳癌（場合によって、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頚部扁平細胞癌、肝癌、卵巣癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、膠芽腫、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、及びその他の新生物性癌を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体を使用して治療できる不応又は再発癌を含む。
本発明は、更に他の観点において、前記抗体又はその断片を有効成分として含む血管新生阻害用薬学組成物に関する。更に他の例は、前記抗体又はその断片を有効成分として含むＡｎｇ２活性化及び／又は過剰生成と関連した疾病の予防及び／又は治療用薬学組成物を提供する。
本発明においては、例えば、前記抗体又はその断片の治療的有効量を、血管新生阻害を必要とする患者に投与する段階を含む、血管新生阻害方法が提供される。前記血管新生阻害方法は、前記投与段階以前に血管新生阻害を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。更に他の例において、前記抗体又はその断片の治療的有効量を、Ａｎｇ２活性化及び／又は過剰生成と関連した疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者に投与する段階を含む、Ａｎｇ２活性化及び／又は過剰生成と関連した疾病の予防及び／又は治療方法が提供される。前記予防及び／又は治療方法は、前記投与段階以前にＡｎｇ２活性化及び／又は過剰生成と関連した疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。
前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、前記担体は、通常、薬物の製剤化に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群から選ばれた１種以上であり得るが、これに限定されることはない。また、前記薬学組成物は、通常、薬学組成物の製造に使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤からなる群から選ばれた１種以上をさらに含むことができる。
前記薬学組成物、前記抗体又はその抗原結合断片の有効量は、経口又は非経口で投与することができる。非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などがあり得る。経口投与時、タンパク質又はペプチドが消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、上記の分解から保護されるように剤形化され得る。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与され得る。
前記薬学組成物内の抗体又はその断片の含有量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与間隔、投与経路、***速度及び反応感応性などの各要因によって多様に処方され得る。例えば、前記抗体又はその断片の１日投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、具体的には０．０１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には０．１ｍｇ／ｋｇ乃至５０ｍｇ／ｋｇ、さらに具体的には０．１ｍｇ／ｋｇ乃至２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、これに制限されることはない。前記１日投与量は、単位容量の形態で一つの製剤に製剤化されたり、適切に分量して製剤化されたり、多容量容器内に入り込ませて製造され得る。
前記薬学組成物は、他の血管新生阻害剤又はＡｎｇ２活性化及び／又は過剰生成と関連した疾病の治療剤などの他の薬物と併用投与可能であり、その投与量、投与方法及び他の薬物の種類は、患者の状態によって適切に処方され得る。
前記薬学的組成物は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤又は乳化液の形態であったり、エキス剤、パウダー、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤などの形態で剤形化可能であり、剤形化のために分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
特に、前記抗体又はその断片を含む薬学組成物は、抗体又は抗原結合断片を含むので、免疫リポソームに剤形化され得る。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られている方法によって製造され得る。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びポリエチレングリコール－誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であって、逆相蒸発法によって製造され得る（韓国公開特許第１０－２０１５－００８９３２９号）。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を通じてリポソームに接合され得る。
一方、前記抗体又はその断片はＡｎｇ２に特異的に結合するので、これを用いてＡｎｇ２の活性化及び／又は過剰生成の有無を確認することができる。よって。本発明の更に他の例は、前記抗体又はその抗原結合断片を含むＡｎｇ２活性化及び／又は過剰生成及び／又はＡｎｇ２活性化及び／又は過剰生成と関連した疾病の診断用薬学組成物を提供する。更に他の例において、患者から得られた生物試料に前記抗体又はその断片を処理する段階；抗原－抗体反応の有無を確認する段階；及び抗原－抗体反応が探知される場合、前記患者が、Ａｎｇ２活性化及び／又は過剰生成症状を有したり、Ａｎｇ２の活性化及び／又は過剰生成と関連した疾病を有すると判断する段階；を含む、診断方法又は診断に情報を提供する方法を提供する。前記生物試料は、患者から得られた細胞、組織、体液などからなる群から選ばれたものであり得る。
前記抗原－抗体反応の有無を確認する段階は、当業界に公知となっている多様な方法を通じて行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光及び／又は放射線検出を通じて測定可能であり、具体的には、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）などからなる群から選ばれた方法によって測定できるが、これに制限されることはない。
前記薬学組成物の投与又は診断対象患者は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類であり得る。
前記Ａｎｇ２活性化及び／又は過剰生成と関連した疾病は、癌；癌転移；未熟児網膜症、角膜血管新生性疾患、糖糖尿病網膜症、脈絡膜新生血管疾患、黄斑変性（例えば、年齢と関連した黄斑変性）などの眼疾患；喘息；関節リウマチ；乾癬；肺炎、慢性炎症などの炎症性疾患；高血圧、動脈硬化などの心血管疾患又は敗血症などであり得る。前記癌は、Ａｎｇ２を過剰発現するものであったり、固形癌又は血液癌であり得る。また、これに制限されないが、前記癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚又は眼球内黒色腫、直腸癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性又は急性白血病、リンパ球性リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌（場合によって、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、大腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頚部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群から選ばれた１種以上であり得る。前記癌は、原発性癌又は転移性癌であり得る。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
抗－Ａｎｇ２抗体を眼球疾患に適用し、多量の抗－Ａｎｇ２抗体を注射することによってより良い効果が期待される。眼球に注射可能なボリュームが限定的であったので、既存には、物質より高濃縮条件で安定的な製剤を必要としていた。既存の抗－Ａｎｇ２抗体より高濃縮製剤を作るために、抗体構造をベースにしたホットスポット分析（Ｈｏｔ Ｓｐｏｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）及び剤形化バッファー（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）を使用することによって高濃度の製剤を作るのに成功した。
実施例１．物性改善のための変異体の製作
抗－Ａｎｇ２抗体クローンであるＯ４（配列番号３４の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域を含む）の物性改善を行った。
抗Ａｎｇ２抗体の凝集現象を起こす可能性が高いアミノ酸をＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（ＢＩＯＢＩＡ）ソフトウェアを使用して分析した。ＶＨにＬｅｕ １１、Ｖａｌ １２、Ａｓｎ ３５、Ｖａｌ ９３アミノ酸、ＶＬにＧｌｎ ６１、Ａｓｎ ７６アミノ酸が物性に影響を与えるホットスポットで分析した（図１、表２）。ホットスポットで分析されたアミノ酸を変異させ、物性が改善された変異体で発現して選別した。
実施例２．物性改善のための変異体の製作
抗Ａｎｇ２抗体（Ｏ４）の物性を改善するために、ホットスポット分析で選別されたアミノ酸を置換した。アミノ酸が変更されたコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の発現テストを進行した。抗Ａｎｇ２抗体（Ｏ４）遺伝子にＰＣＲ技法を用いて、点変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）されたクローンを増幅した。増幅された遺伝子を発現ベクター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｐＥＴ ２２ｂ（＋））に挿入し、クローニングを完了した。クローニングが完了したプラスミドは、発現宿主細胞（Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＢＬ２１（ＤＥ３）））に挿入して形質転換した。発現テストは、２ＸＹＴ培地に１００μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを添加し、形質転換された細胞を接種した後、８時間及び３７℃の条件で培養した。２５℃に温度を下げた後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを入れながら誘導し、１８時間培養した。８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞を収穫した。沈澱された細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４バッファーで浮遊させ、超音波を用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、１３０００ｒｐｍで１時間遠心分離しながら上澄み液と分離させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで発現を確認した（図２、図３及び図４）。
実施例３．最適化された抗Ａｎｇ２抗体のＳｃＦｖ生産
物性が改善された抗Ａｎｇ２抗体を大腸菌で発現させるために、ｐＥＴ－２２ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して生成されたコロニーを選別し、ＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ）培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加し、３７℃及び２００ｒｐｍの条件で前培養した大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン抗生剤を含むＬＢ培地に１％接種した。３７℃及び２００ｒｐｍの条件で培養し、ＯＤ６００＝０．６～０．８に至ると、培養器の温度を２０℃に下げ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して１６時間培養した。
培養した大腸菌は、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離しながら集菌した。培地を除去した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）の溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を細胞の重さｇ当たり１０ｍｌのバッファーを用いて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。超音波破砕機を使用し、Ｐｏｗｅｒ：２０Ｗ、ｒｅｓｔ：３Ｓｅｃ、Ｗｏｒｋ：３Ｓｅｃ、Ｔｉｍｅ：１０Ｍｉｎの条件で細胞を破砕した。破砕された細胞を１３０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、上澄み液と沈澱された物質とを分離した。
ＳｃＦｖは、不溶性（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）形態で発現され、再折り畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を進行するためにペレット洗浄（ｐｅｌｌｅｔ ｗａｓｈ）を進行した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーを用いてホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で均質化させた後、１３０００ｒｐｍで１時間遠心分離する方法でペレットを２回洗浄した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２Ｍ Ｕｒｅａ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００バッファーを用いてペレット内に残っている大腸菌由来の各物質を除去し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーで３回洗浄を繰り返した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素（ｕｒｅａ）、１０ｍＭ ＤＴＴバッファーで封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を再懸濁させた後で約３０分間反応させ、ＳｃＦｖをフォールディングされていない（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）形態に作り、１３０００ｒｐｍで１時間遠心分離しながら沈澱物質と分離した。
ＳｃＦｖ抗体は、段階的透析（ｓｔｅｐ ｄｉａｌｙｓｉｓ）を通じて尿素を除去することによって再折り畳みを誘導した。透析バッファー（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌをベースにし、尿素の濃度を１／２ずつ下げながら進行した。構造がほとんど形成される４－２－１Ｍ Ｕｒｅａ濃度区間で０．１Ｍ Ｌ－アルギニン及び１０％グリセロールを添加し、凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）形成を抑制しながら再折り畳みを進行した。再折り畳みが完了したｓｃＦｖ抗体は、ＨｉｓＴｒａｐ及びＣａｐｏ Ｌカラムを用いて分離・精製した。
分離・精製は、次のような順序で進行した。ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムを用いて精製し、５ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐパッキングカラム（ｐａｃｋｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）を使用した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール ｐＨ７．４バッファーをＨｉｓＴｒａｐカラム体積の１０倍になるカラム体積だけ流して平衡化させた後、ＳｃＦｖ抗体のサンプルを３ｍｌ／ｍｉｎの流速でＨｉｓＴｒａｐカラムに流しながらカラム内のレジン（ｒｅｓｉｎ）と結合させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール ｐＨ７．４バッファーを、レジンに存在する非特異的な結合物質を除去するためにカラム体積の約１０倍になるカラム体積だけ流した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾール ｐＨ７．４バッファーを濃度勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）に応じて流し、ｓｃＦｖ抗体を溶出させた。溶出された抗体試料に対しては、５ｍｌ Ｃａｐｔｏ Ｌカラムを用いて次の精製を進行した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４バッファーでＣａｐｔｏ Ｌカラムを平衡化させた後、サンプルを３ｍｌ／ｍｉｎの流速でＣａｐｔｏ Ｌカラムに流しながらカラム内のレジンと結合させる。ＰＢＳバッファーをカラム体積の約１０倍になるカラム体積だけ流し、非特異的結合物質を除去した。ＰＢＳバッファーで除去できなかった非特異的結合物質は、５０ｍＭ Ｍｅｓ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ５．５バッファーを１０ＣＶだけ流しながら除去した。０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ、５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ２．５バッファーをカラム体積の約１０倍になるカラム体積だけ流し、ｓｃＦｖ抗体を溶出させた。１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４バッファーで溶出サンプルのｐＨを中性化した。図５ａ乃至図５ｇは、最終的に精製した後で得たタンパク質にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果である。その結果、純度が高いＳｃＦｖ抗体を得ることができた。
物性が改善された抗Ａｎｇ２抗体の具体的な配列は、次の通りである。
実施例４．最適化された抗Ａｎｇ２抗体のＳｃＦｖ濃縮
凝集現象が表れない最高濃度の分析のために、遠心分離を使用して濃縮した。精製された抗－Ａｎｇ２抗体は、ＰＢＳ及び商用化製品に使用された剤形組成を含む剤形化バッファー（１０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３％ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ、５％ Ｓｕｃｒｏｓｅ ｐＨ６．２）で透析し、バッファ交換を行う。Ｖｉｖａ Ｓｐｉｎ Ｔｕｒｂｏ ５，０００ ＭＷＣＯ ＰＥＧチューブ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）にＰＢＳ又は剤形化バッファー１０ｍｌを入れた後、３４００ｇで１０分間遠心分離しながら平衡化させる。バッファ交換が行われたサンプルをチューブに１０ｍｌ入れた後、３４００ｇ及び４℃で１０分間遠心分離して濃縮させる。ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）で吸光度を測定し、濃度を測定した（表４）。
実施例５．最適化された抗Ａｎｇ２ ＳｃＦｖ抗体の結合特異性分析
結合特異性分析にはＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＬＬＣ．ＵＳ）を使用し、結合定数を測定した。
精製されたＳｃＦｖ抗体のヒトＡｎｇ２及びマウスＡｎｇ２に対する結合力をＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．ＵＳ）を使用して測定した。ＡＲ２Ｇバイオセンサーを２０分間水和（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）させた。ＡＲ２Ｇバイオセンサーは、９０％３次蒸留水に５％ ｓ－ＮＨＳ及び５％ ＥＤＣを添加した溶液を使用して活性化した。抗－Ａｎｇ２抗体をＡＲ２Ｇセンサーに１μｇ／ｍｌの濃度で固定化した。１Ｍエタノールアミンでクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）した。ＰＢＳで平衡化し、ヒトＡｎｇ２の濃度５０、４０、３０、２０ｎＭ別に結合動力学を測定し、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄｉｓ）及び結合定数（ＫＤ）を算出した（表５）。
実施例６：抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体の熱安定性（Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）分析
抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体の熱安定性を分析するために、ＲＴ－ＰＣＲ方法を用いてＴｍを測定した。分析試料は、５μｌのプロテインサーマルシフトバッファー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｂｕｆｆｅｒ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１２．５μｌの抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体（１ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ ｐＨ７．４ ｂｕｆｆｅｒ）、２．５μｌの８Ｘプロテインサーマルシフトダイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｄｙｅ）の組成で２回の反復実験が可能になるように準備した。Ｔｍ分析は、Ｑｕａｎｔａｓｔｕｄｉｏ ５ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に内蔵されている溶融曲線実験法（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ）を使用して２５℃から９９℃まで１．６℃／ｓの速度で温度を増加させ、０．０５℃／ｓごとに蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（吸光度ａ（５８０±１０ｎｍ）－吸光度ｂ（６２３±１４ｎｍ））を測定し、プロテインサーマルシフトソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））を使用してＴｍ値を計算した。ボルツマン式（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ）で計算された抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体のＴｍ Ｂ値は７７．３１℃であって、技術的変形前に比べてＴｍが７℃以上増加しており、これは、技術的変形によって熱安定性が大きく改善されたことを示した（図６）。
実施例７：マウスＣＮＶモデルを用いた抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体の抗血管生成効能評価
抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体の新生血管形成の抑制効能があるかどうかを確認するために、レーザー誘導脈絡膜血管新生マウス（ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｕｓｅ）モデルで薬効試験を実施した。その効力は、商用薬物であるアフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）を対照群として試験した。マウスをケタミンで全身麻酔を行った後、麻酔点眼剤を眼球に点眼することによって追加的に局所麻酔を行い、散瞳剤を点眼することによって散瞳を誘導した。マウスを載物台上に載せた後、Ｍｉｃｒｏｎ－ＩＶを用いてＣＮＶ誘導条件（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ５３２ｎｍ、ｄｉａｍｅｔｅｒ ５０μｍ、ｄｕｒａｔｉｏｎ ８０ｍＳ、ｐｏｗｅｒ ｌｅｖｅｌ ２００ｍＷ）によってレーザー火傷（ｌａｓｅｒ ｂｕｒｎ）を誘導し、ブルック膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を破壊させた。レーザー火傷の誘導過程でバブリング（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）が観察されていない病変は、失敗したレーザー火傷（ｕｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｌａｓｅｒ ｂｕｒｎ）と分類し、Ｇｏｎｇ Ｙ．等が提案した基準を変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した除外基準（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）に基づいて結果分析及び統計処理過程から除外した。
ＣＮＶ誘導及び薬物による血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制効果を確認するために、ＣＮＶ誘導後１０日にマウスをケタミンで全身麻酔を行った後、蛍光造影剤を腹腔注射した。麻酔点眼剤を眼球に点眼することによって追加的に局所麻酔を行った後、散瞳剤を点眼することによって散瞳を誘導した。マウスを載物台上に載せ、Ｍｉｃｒｏｎ－ＩＶのイメージングカメラ（ｉｍａｇｉｎｇ ｃａｍｅｒａ）で眼底（ｆｕｎｄｕｓ）に映像を合わせた後、該当の眼球に潤滑ジェルを点眼し、ＯＣＴのレンズをマウスの角膜と接触させた。ＦＦＡ／ＯＣＴ撮影を実施した後、マウスの眼球に抗生剤点眼液を一滴だけ点眼した。ＦＦＡ及びＯＣＴイメージに対する分析は、「Ｉｍａｇｅ－Ｊ」プログラムを用いて実施した。
視神経回復効果を確認するために網膜電位図（ＥＲＧ）検査を進行した。マウスに対しては、ＥＲＧ評価をする１２時間前から暗室で暗順応を誘導した。評価当日（ＣＮＶ誘導後１１日）にＲｕｍｐｕｎ（登録商標）及びケタミン（登録商標）で全身麻酔を行った後、アルカイン（登録商標）を眼球に点眼することによって追加的に局所麻酔を誘導し、散瞳剤を点眼することによって散瞳を誘導した。マウスをＥＲＧ載物台上に載せ、ＥＲＧのプローブをそれぞれ尻尾、頭及び角膜に接触させた。ＥＲＧは、単一フラッシュ刺激（０．９ｌｏｇ ｃｄｓ／ｍ２（１０ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ／ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））に対する網膜電位図の変化で測定した。ＥＲＧ評価が終了すると、マウスの眼球にトブレックスを一滴だけ点眼した。ＥＲＧ分析は、「ＬａｂＳｃｒｉｂｅＥＲＧ（ｉＷｏｒｘ ＤａｔａＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）」プログラムを用いて実施した。
アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）は、滅菌ＰＢＳで希釈し、２０μｇ／μｌ／ｅｙｅの容量で、抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体の場合は、５μｇ／μｌ／ｅｙｅ、１０μｇ／μｌ／ｅｙｅ及び２０μｇ／μｌ／ｅｙｅの容量でＣＮＶ誘導した翌日に、ＩＶＴ（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）経路を通じて単回投与した。ＣＮＶ誘導後１０日目に、ＦＦＡ（ｆｕｎｄｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ）及びＯＣＴ（ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を用いた網膜映像評価を実施し、これに基づいてＣＮＶ病変の大きさ及び断面積をそれぞれ測定して比較・評価した。また、ＣＮＶ誘導後１１日目に、夜間（ｓｃｏｔｏｐｉｃ）ＥＲＧ（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ）で単一フラッシュ（０．９ｌｏｇ ｃｄｓ／ｍ２）刺激に対する網膜電位図の変化をＡ－波からＢ－波までの振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）としてまとめて比較・評価した。その結果、ＦＦＡ上で測定したＣＮＶ病変の大きさにおいて、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）投与群（Ｐ＜０．０１）と１０μｇ／μｌ／ｅｙｅ及び２０μｇ／μｌ／ｅｙｅの抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体投与群の病変の大きさが、賦形剤投与群の病変の大きさより統計的に有意に減少したことを確認した（それぞれＰ＜０．０５）（図７ａ）。また、ＯＣＴ上で測定したＣＮＶ病変の体積測定結果においても、抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体を１０μｇ／μｌ／ｅｙｅ及び２０μｇ／μｌ／ｅｙｅ投与した群のＣＮＶ病変の体積が統計的に有意に減少したことを確認した（それぞれＰ＜０．０１及びＰ＜０．００１）（図７ｂ）。ＥＲＧ上での網膜電位図を賦形剤投与群と比較したとき、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）投与群及び抗－Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体投与群の全て（Ｇ３、Ｇ４及びＧ５）において、網膜電位図がＣＮＶ対照群であるＧ１群より有意に増加したことを確認した（それぞれＰ＜０．０００１、Ｐ＜０．０００１、Ｐ＜０．０００１及びＰ＜０．０１）（図７ｃ）。
本発明に係る抗体又はその断片は、骨格領域に突然変異を含むことによって、溶解度が改善され、高濃度で濃縮可能であり、これによって抗体生産性が向上し得る。
以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は好適な実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項及びそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。
電子ファイルを添付した。
Claims (17)
- 重鎖可変領域のうち１３番の位置、４２番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）、及び軽鎖可変領域のうち９４番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸が置換された、変形抗体又はその断片。
- 前記重鎖可変領域の１３番の位置、４２番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）、及び軽鎖可変領域の９４番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）は、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）に置換された、請求項１に記載の変形抗体又はその断片。
- 次のように構成された群から選ばれる一つ以上の位置（ＡＨＯナンバリングによる）でアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変形抗体又はその断片：
重鎖可変領域の１３番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の４２番のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換；及び
軽鎖可変領域の９４番のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換。 - アミノ酸が置換された重鎖可変領域は、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＸ１ＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（前記Ｘ１はＳ）及び／又はＭＸ２ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ（前記Ｘ２はＴ）の配列を有する骨格領域を含む、請求項１に記載の変形抗体又はその断片。
- アミノ酸が置換された軽鎖可変領域は、
ＮＬＱＳＧＶＳＳＱＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＸ３ＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（前記Ｘ３はＳ）の配列を有する骨格領域を含む、請求項１に記載の変形抗体又はその断片。 - 次のように構成された群から選ばれた一つ以上の骨格領域を含む、請求項１に記載の変形抗体又はその断片：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＸ１ＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（前記Ｘ１はＳ）；
ＭＸ２ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ（前記Ｘ２はＴ）；及び
ＮＬＱＳＧＶＳＳＱＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＸ３ＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（前記Ｘ３はＳ）。 - 配列番号１、７、１３、１９及び２５で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、８、１４、２０及び２６で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３、９、１５、２１、２７、４３、４４及び４５で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号４、１０、１６、２２及び２８で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１１、１７、２３及び２９で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１２、１８、２４及び３０で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の変形抗体又はその断片。 - 配列番号３１、３３、３６で構成される群から選ばれる重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の変形抗体又はその断片。
- 配列番号３５に記載の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の変形抗体又はその断片。
- 配列番号３１に記載の重鎖可変領域及び配列番号３２に記載の軽鎖可変領域；
配列番号３３に記載の重鎖可変領域及び配列番号３２に記載の軽鎖可変領域；
配列番号３４に記載の重鎖可変領域及び配列番号３５に記載の軽鎖可変領域；
配列番号３６に記載の重鎖可変領域及び配列番号３２に記載の軽鎖可変領域；
配列番号３１に記載の重鎖可変領域及び配列番号３５に記載の軽鎖可変領域；
配列番号３３に記載の重鎖可変領域及び配列番号３５に記載の軽鎖可変領域；又は
配列番号３６に記載の重鎖可変領域及び配列番号３５に記載の軽鎖可変領域；を含む、請求項１に記載の変形抗体又はその断片。 - 重鎖可変領域のうち１３番の位置、４２番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）、及び軽鎖可変領域のうち９４番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）で構成された群から選ばれた一つ以上のアミノ酸を置換することを含む、変形抗体又はその断片の製造方法。
- 前記重鎖可変領域の１３番の位置、４２番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）、及び軽鎖可変領域の９４番の位置（ＡＨＯナンバリングによる）をセリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）に置換することを含む、請求項１１に記載の製造方法。
- 次のように構成された群から選ばれる一つ以上の位置（ＡＨＯナンバリングによる）でアミノ酸を置換することを含む、請求項１１に記載の製造方法：
重鎖可変領域の１３番のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換；
重鎖可変領域の４２番（ＡＨＯナンバリングによる）のアスパラギン（Ｎ）をトレオニン（Ｔ）に置換；及び
軽鎖可変領域の９４番（ＡＨＯナンバリングによる）のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換。 - 請求項１～１０のいずれか１項に記載の変形抗体又はその断片をコーディングする核酸。
- 請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項１５に記載の発現ベクターに形質転換された細胞。
- 次の段階を含む変形抗体又はその断片を製造する方法：
（ａ）請求項１６に記載の細胞を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
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