JP7177284B2 - 抗ang2抗体及びその用途 - Google Patents
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Description
配列番号2、8、14、20及び26からなる群から選ばれる重鎖CDR2、及び
配列番号3、9、15、21、27、51、52及び53からなる群から選ばれる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号4、10、16、22、及び28からなる群から選ばれる軽鎖CDR1、
配列番号5、11、17、23及び29からなる群から選ばれる軽鎖CDR2、及び
配列番号6、12、18、24及び30からなる群から選ばれる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、Ang2(Angiopoietin-2)に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
配列番号2、8、14、20及び26からなる群から選ばれる重鎖CDR2、及び
配列番号3、9、15、21、27、51、52及び53からなる群から選ばれる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号4、10、16、22、及び28からなる群から選ばれる軽鎖CDR1、
配列番号5、11、17、23及び29からなる群から選ばれる軽鎖CDR2、及び
配列番号6、12、18、24及び30からなる群から選ばれる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、Ang2(Angiopoietin-2)に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。
配列番号7の重鎖CDR1、配列番号8の重鎖CDR2及び配列番号9の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号10の軽鎖CDR1、配列番号11の軽鎖CDR2及び配列番号12の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号15の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号19の重鎖CDR1、配列番号20の重鎖CDR2及び配列番号21の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号22の軽鎖CDR1、配列番号23の軽鎖CDR2及び配列番号24の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号25の重鎖CDR1、配列番号26の重鎖CDR2及び配列番号27の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号28の軽鎖CDR1、配列番号29の軽鎖CDR2及び配列番号30の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号51の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号52の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号53の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
配列番号36の重鎖可変領域及び配列番号38の軽鎖可変領域;
配列番号40の重鎖可変領域及び配列番号42の軽鎖可変領域;
配列番号44の重鎖可変領域及び配列番号46の軽鎖可変領域;
配列番号48の重鎖可変領域及び配列番号50の軽鎖可変領域;
配列番号55の重鎖可変領域及び配列番号42の軽鎖可変領域;
配列番号57の重鎖可変領域及び配列番号42の軽鎖可変領域;
配列番号59の重鎖可変領域及び配列番号42の軽鎖可変領域;又は、配列番号61の重鎖可変領域及び配列番号42の軽鎖可変領域を含むことができる。
重鎖可変領域をコードする配列番号35の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号37の核酸;
重鎖可変領域をコードする配列番号39の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号41の核酸;
重鎖可変領域をコードする配列番号43の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号45の核酸;
重鎖可変領域をコードする配列番号47の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号49の核酸;
重鎖可変領域をコードする配列番号54の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号41の核酸;
重鎖可変領域をコードする配列番号56の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号41の核酸;
重鎖可変領域をコードする配列番号58の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号41の核酸;又は
重鎖可変領域をコードする配列番号60の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号41の核酸を含むことができる。
Ang2に結合する抗体を選別するための抗体ライブラリー及びライブラリーの準備は、韓国特許出願(公開特許10-2008-0109417号)のような自社のヒト未感作scFv(human naive ScFv)ライブラリーを用いた。96-ウェル免疫プレートに抗原(hAng2-his:RND systems.Cat.No623-AN/CF、hAng2-Fc:pharmabcine)を2μg/mlで100μlずつウェルに入れ、4℃オーバーナイト(overnight)させる。翌日、抗原コーティングプレート(coating plate)は5mMのCaCl2 TBSで3回洗浄後に2% BSA遮断バッファー(blocking buffer)200μlを入れて室温で2時間反応させる。2x YT-TET(テトラサイクリン10μg/ml)成長培地(growth medium)2mlにXL1-Blueストック(stock)50μlを入れ、37℃、200rpmで2時間程度育てた後、13mlをさらに添加し、OD600が0.5となるまで育てる。遮断(blocking)2時間が過ぎると、1X 5mM CaCl2 TBSで3回洗浄する。洗浄した各ウェルに、ファージライブラリーグループ(phage library group)を合わせてファージライブラリー量と4% BSA量を同一に混ぜた後に200μlずつ添加し、室温で30分間ロッキング(rocking)した後に2時間反応させる。ファージライブラリー反応が終わると、上澄液は捨て、0.1% TBST(5mM CaCl2)で5回洗浄し、TBS(5mM CaCl2)で5回洗浄して、各ウェルに100mM TEA(trimethylamine)100μlを入れた後、室温で10分間振り動かす。10分経つと、各ウェルに1M Tris(pH 7.5)50μlを入れて混ぜる。上澄液(supernatant)は、OD600 0.5となったXL1-blue 10mlに入れ、37℃で30分間感染(infection)させる。感染が終わると、100μlはアウトプットタイター(output titer)として使用し、残りは6,000rpm、10分間遠心分離する。上澄液は捨て、沈殿物はラージスクエアプレート(large square plate:CM 34μg/ml+1%グルコース)にスプレッド(spreading)し、30℃でオーバーナイトインキュベーション(overningt incubation)する。アウトプットタイターとして残した100μlは、1/10、1/100、1/1000に希釈(dilution)してCMプレートにスプレッドし、37℃でオーバーナイトする。翌日、スクエアプレートに育てたコロニー(colony)は、2x YT培地50mlを入れた後、ループ(loop)を用いてかき集めた後、6000rpm、10分遠心分離して上澄液は捨て、沈殿液(precipitate)に対して1次パンニングストック(panning stock)を作り、2x YT培養培地(growth media:CM 34μg/ml+1%グルコース)100mlを500ml三角フラスコに入れた後、OD600 0.2となるように細胞を入れ、200rpm、37℃でOD 0.5になるまで育てる。OD600値が0.5になるまで細胞を培養した後、ヘルパーファージ(helper phage:M13KO7 mutant)を細胞の20倍となるように入れる。ヘルパーファージを入れて37℃、30分感染(infection)させた後、6000rpm、10分遠心分離する。上澄液を捨て、細胞は2xYT培地(CM 34μg/ml+Kan.70μg/ml+1mM IPTG+5mM MgCl2)100mlに取り替えて入れた後、200rpm、30℃でオーバーナイトする。翌日、育った細胞は7000rpm、10分、遠心分離し、同じ方法でさらに遠心分離する。集めた上澄液は、上澄液の1/5(v/v)に20% PEG/2.5m NaClを入れ、アイス(ice)で1時間沈殿させる。沈殿させた後、9000rpm、1時間遠心分離する。上澄液は捨て、TBS 3mlで沈殿液(precipitate)を解いた後、0.45μmフィルター(filter)に濾過して4℃に保管し、これを次回のパンニング(panning)過程で使用する。この過程を3~4回反復し、抗原に結合する抗体をELISAで確認した。
パンニング(panning)過程が終わると、最後ラウンドの細胞ストック(round cell stock)をCMアガープレート(agar plate)に200~500個のコロニーが形成され得るように希釈してスプレッドした後、37℃でオーバーナイトする。翌日、コロニー(colony)が育つと、96ウェルディーププレート(96well deep plate)に2xYT培地(CM34μg/ml+1%グルコース)200μlを入れ、各ウェルにコロニーを一つずつ入れた後、37℃、3000rpmでオーバーナイトする。翌日、新しい96ウェルディーププレートに2xYT培地(CM 34μg/ml+1%グルコース)200μlを入れ、各ウェルに前日に育てた細胞を各ウェルごとに20mlずつ入れた後、37℃、3000rpm、1時間10分育てる。残りの細胞は、50%グリセロール100μlずつ添加して-70℃に保管する。細胞が育つと、ヘルパーファージ1μlと2xYT培地19μlを混ぜた後、各ウェルに20μlずつ添加後に37℃で30分インキュベーションする。インキュベーションが終わると、3000rpm、10分遠心分離する。上澄液を捨て、2xYT培地(CM34μg/ml+Kan.70μg/ml+1mM IPTG+5mM MgCl2)200μlを入れ、メガグロー(megagrow)で30℃、3000rpmでオーバーナイトする。
選別された抗体の抗原に対する結合力をOctet(Fortebio)を用いて測定した。そのために、Ang2をバイオセンサー(biosensor)に固定(immobilize)した後、scFv形態で発現した候補抗体を入れて結合させた後、解離速度定数を測定した。その結果を表4に示す。
選別したscFvファージのIgG形態への転換は、分子生物学的手法を用いて行った。選別したE.Coliクローンにおいてファージミド(Phagemid)を抽出し、PCR手法を用いて可変領域を増幅した。増幅した重鎖可変領域を、重鎖定常領域を含む発現ベクター(Invivogen,pfusess-hchg1)に挿入し、増幅した軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域を含む発現ベクター(Invivogen,pfuse2ss-hclk)に挿入することで、IgG形態のDNAクローニングを完了した。
取得した上澄液をProtein Aカラム(GE Healthcare)に注入し、親和力クロマトグラフィーを用いてIgGを精製した。カラムを20mM Tris-HCl、50mM NaCl、5mM EDTA(pH 7.0)で平衡化させた後に上澄液を注入し、50mM Tris-HCl、500mM NaCl、5mM EDTA、0.2% polysorbate 20(pH 7.0)溶液で洗浄した後、50mM NaCl、0.1M グリシン-HCl(pH 3.5)で溶出後に1M Trisで中和した。溶出されたタンパク質は、MWCO 10,000 spectra/por透析膜(Spectrum Labs,US)を用いた透析過程により溶媒をPBSに取り替えた。その後、Vivaspin(Satorius,DE)を用いて必要濃度に濃縮して分注後に-80℃で保管した。
結合特異性分析にはELISA法とBiacore T200システム(GE Healthcare Life Sciences)を用いて結合定数を測定した。
96ウェル免疫プレート(Nunc,US)の各ウェルに、1μg/mlのヒトTie2-Fc(R&D systems,313-TI)、マウスTie2-Fc(R&D systems,762-T2-100)、インテグリンα3/β1(R&D systems,2840-A3-050)そしてインテグリンα5/β1(R&D systems,3230-A5-050)溶液を100μl添加後に、4℃で一晩静置して吸着させた。翌日、0.05% Tween-20含有PBS(以下、PBST)で4回洗浄し、2% BSA/PBST溶液を各ウェル当たりに200μl添加後に、常温で1時間静置してブロッキングした。抗Ang2候補抗体は、最高1000nMで4倍に段階希釈し、一部は、ビオチン結合したヒトAng2タンパク質が最終100ng/mLとなるようにし、一部は、ビオチン結合したヒトAng2タンパク質が最終625ng/mLとなるようにしてあらかじめ常温で1時間結合させた。ブロッキングの終わったプレートは、PBSTで4回洗浄後に、あらかじめ抗原抗体反応を誘導した試料を入れ、常温で1時間結合させる。上のプレートをPBSTで3回洗浄後に、1:200の比率に希釈したHRP接合されたストレプトアビジン(R&D systems,DY998)を100μl添加し、常温で1時間反応させて結合を誘導し、PBSTで4回洗浄後に100μlのTMB基質試薬を用いて発色させた。発色反応は、50μlの2N H2SO4を添加することで停止させ、Sunriseマイクロプレートリーダ(TECAN,CH)を用いて特異的吸光度OD450を測定した(図4、図5)。図4に見られるように、選別された抗体は、ヒトとマウスの両方においてAng2/Tie2結合を中和した。中和能力は、IC50値を求めて数値化し、表6に示した。また、図5に見られるように、インテグリン/Ang2の結合も中和した。インテグリン/Ang2の中和能力はIC50値を求めて数値化し、表7に示した。
ヒトTie2過発現細胞(1×105)を96ウェルプレートに入れ、37℃、二酸化炭素が供給されるインキュベーターで一晩育てる。上の細胞を無血清培地で一晩育てて血清飢餓状態にする。ヒトAng2(5μg/ml)と様々な濃度の抗Ang2を常温で1時間あらかじめ反応させた後、細胞の入っているプレートに入れて20分間反応させる。このとき、抗体がなく、Ang2タンパク質のみ入っているウェルを含めて信号抑制効果分析の基準値とする。細胞は、溶解緩衝液を入れて溶解させた後に定量する。リン酸化反応を測定するために、R&D systems社のヒトリン酸化Tie2デュオセットIC ELISA(Human Phospho-Tie2 Duoset IC ELISA)(R&D systems,DYC2720-5)を使用した。96ウェル免疫プレート(Nunc,US)の各ウェルに4μg/mlのヒトTie2キャプチャータンパク質を添加後に4℃で一晩静置して吸着させた。翌日、希釈剤をウェル当たりに200μl添加後に常温で2時間静置してブロッキングした。細胞溶解物を50μgずつ入れて常温で2時間結合させた。反応が終わった後、抗ホスホチロシン抗体を2700:1に希釈して常温で2時間結合させる。反応の終わったプレートは、TMB基質試薬を用いて発色させた。発色反応は50μlの2N H2SO4を添加することで停止させ、Sunriseマイクロプレートリーダ(TECAN,CH)を用いて特異的吸光度OD450を測定した(図6)。図6に見られるように、抗体の濃度が上がるにつれてリン酸化が減ることが確認できた。リン酸化程度は、IC50値を求めて数値化し、表8に示した。
抗Ang2抗体クローンNo.8の親和度増進のために抗体最適化を行った。No.8の元来DNA配列を70%保存しながらランダム化(randomize)させるソフト-ランダム化(soft-randomization)法を活用して、No.8の軽鎖CDR3と重鎖CDR3に無作為変異を導入したプライマーを作製した。これを使用したPCRにより変異の導入された軽鎖可変領域、重鎖可変領域コーディングDNA断片を確保した。このDNA断片をそれぞれ、No.8scFvファージミドの軽鎖可変領域及びNo.8scFvファージミドの重鎖可変領域と置換し、軽鎖CDR3と重鎖CDR3変異体scFvファージDNAライブラリーを作製した。
最適化された抗Ang2抗体(No.4)を大腸菌で発現させるためにpET-22bベクター(Novagen)にクローニングした。BL21(De3)に形質転換して生成されたコロニーを選別し、LB(Lysogeny broth)培地に100μl/mlアンピシリンを添加して37℃、200rpm条件で前培養した大腸菌を、100μl/mlのアンピシリン抗生剤を含むLB培地に1%接種した。37℃、200rpm条件で培養してOD600=0.6~0.8に達すると培養器の温度を20℃に下げ、0.5mM IPTGを添加して16時間培養した。
結合特異性分析にはELISA法とOctetシステム(Pall Fortebio LLC.US)を用いて結合定数を測定した。
抗Ang2 scFv抗体の新生血管形成の抑制効能があるかどうか確認するために、レーザー誘起(laser-induced)脈絡膜血管新生(choroidal neovascularization,CNV)のためのマウスモデルで薬効試験を行った。その効力は、商用薬物であるアフリベルセプト(aflibercept)を対照群として試験した。マウスをケタミンで全身麻酔させた後、麻酔点眼剤を眼球に点眼してさらに局所痲酔させ、散瞳剤を点眼して散瞳誘導する。マウスを載物台上に載せ、Micron-IVを用いてCNV誘導条件(wavelength 532nm、diameter 50μm、duration 80mS、power level 200mW)によってレーザー火傷(laser burn)を誘導し、ブルッフ膜(Bruch’s membrane)を破壊させる。レーザー火傷誘導過程でバブリングが観察されなかった病変は、不成功レーザー火傷(unsuccessful laser burn)と分類し、Gong Y.等が提案した基準を変形(modification)した除外基準(exclusion criteria)に基づいて結果分析及び統計処理過程から除外した。
抗Ang2抗体の新生血管形成の抑制効能があるかどうか確認するために、ヒト由来三重陰性乳癌(triple negative breast cancer,TNBC)モデル(MDA-MB-231)で抗腫瘍効力試験を行った。抗Ang2抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ヒト由来乳癌細胞株であるMDA-MB-231を左横腹に移植したNSGマウスにおいて、アイソタイプコントロール(isotype control)、ネスバクマブ(nesvacumab)、抗Ang2抗体治療剤の微静脈投与による抗癌薬効を評価しようとした。実験は、米国Champions Oncologyに依頼して行った。
Claims (15)
- 配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号6の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号7の重鎖CDR1、配列番号8の重鎖CDR2及び配列番号9の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号10の軽鎖CDR1、配列番号11の軽鎖CDR2及び配列番号12の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号15の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号19の重鎖CDR1、配列番号20の重鎖CDR2及び配列番号21の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号22の軽鎖CDR1、配列番号23の軽鎖CDR2及び配列番号24の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号25の重鎖CDR1、配列番号26の重鎖CDR2及び配列番号27の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号28の軽鎖CDR1、配列番号29の軽鎖CDR2及び配列番号30の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号51の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号52の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号53の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域
を含む、Ang2(Angiopoietin-2)に結合する抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号32、36、40、44、48、55、57、59及び61からなる群から選ばれる重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号34、38、42、46及び50からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
- 重鎖可変領域をコードする配列番号31、35、39、43、47、54、56、58及び60からなる群から選ばれる、請求項4に記載の核酸。
- 軽鎖可変領域をコードする配列番号33、37、41、45及び49からなる群から選ばれる、請求項4に記載の核酸。
- 請求項4に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項7に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
- 次の段階を含む、Ang2に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法:
(a)請求項8に記載の細胞を培養する段階;及び
(b)前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。 - 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、アンジオポエチン-2活性化及び/又は過生成と関連した疾病の予防又は治療用組成物。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、血管新生阻害用組成物。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、アンジオポエチン-2活性化及び/又は過生成と関連した疾病の診断用組成物。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、眼疾患予防又は治療用組成物。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、腫瘍又は癌の予防又は治療用組成物。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む併用投与用組成物。
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