JP7177284B2 - 抗ａｎｇ２抗体及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、アンジオポエチン－２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２；Ａｎｇ－２）に特異的に結合して機能を阻害する抗体に関し、抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、これを含む血管新生阻害剤及びアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の治療用組成物、及び前記抗体を含むアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の診断用組成物、前記抗体を含む眼疾患、又は癌予防又は治療用薬学的組成物、及びＡｎｇ２に結合する抗体以外の組成物との併用投与用組成物に関する。

血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、既存血管から新しい血管が生成される機序を意味し、器官の形成、正常な生理学的成長、傷治癒などに重要な役割を担うものと知られている。また、腫瘍の成長と転移に重要な役割を担うと知られており、正常でない血管新生は、腫瘍の成長と転移、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜病症、乾癬、リウマチ性関節炎、慢性炎症のような疾病に決定的な役割を担うものと知られている。

したがって、血管新生に関与する因子が、癌などの疾病の新しい治療剤の開発のための重要なターゲットとなっており、高齢化と西欧化した食習慣により糖尿疾患患者数が急増するに伴って新生血管眼疾患患者も急増している。主な眼疾患としては、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ；Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；以下‘黄斑変性症’という。）、糖尿病性網膜症（ＤＲ；Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ；Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｍａｃｕｌａｒ Ｅｄｅｍａ）などがある。特に、黄斑変性症と糖尿病性網膜症は、世界的に主要な失明原因疾患である。

加齢黄斑変性の進行と関連した要因は様々なものがあるが、酸化的ストレス、炎症反応、そして新生血管形成と関連があると知られている。しかし、最も主要な因子としては血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）が最も広く知られている。治療剤として単一クローン抗体、抗体断片、或いは融合タンパク質を用いたＶＥＧＦ抑制剤開発が試みられており、現在、黄斑変性治療剤として広く用いられている代表的な薬物は、アイリーア（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）ルセンティス（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）である。これらの薬物の作用機序は、ＶＥＧＦ信号抑制による血管形成抑制を誘導することが知られている。しかし、これらの薬物の投与患者の１０～１５％が既存治療法に反応しないと知られている。これは、既存の抗ＶＥＧＦ治療は病理的な血管形成だけを抑制したのに対し、他の経路の血管形成要因が疾病の進行に影響を与えたためと知られている。アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）は、血管壁の内皮細胞にあるＴｉｅ２受容体に結合して新生血管形成を促進するサイトカインと知られている。以前の動物実験及び臨床試験などから、ＡＮＧ２信号を抑制することにより、腫瘍内血管形成を抑制して抗癌効果を発揮することが知られている。さらに、ＡＮＧの発現は、加齢黄斑変性患者の眼球の防水液中に高く存在することが知られている。したがって、抗ＶＥＧＦ治療剤とともに、抗ＡＮＧ２治療剤の開発及び併用療法が黄斑変性治療に役立ち得ると期待される。そこで、当社は加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜病症の治療剤を開発する上でＡｎｇ－２に注目した。

アンジオポエチン－２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２；Ａｎｇ２）は、血管内皮細胞に存在する受容体Ｔｉｅ２の拮抗的なリガンド（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｌｉｇａｎｄ）であり、Ｔｉｅ２の作用物質（ａｇｏｎｉｓｔ）であるアンジオポエチン－１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１；Ａｎｇ１）とＴｉｅ２結合に対して競合することによってＴｉｅ２による信号伝達を抑制する作用を果たし、Ｔｉｅ２受容体を活性化させるリガンドであるＡｎｇ１は、血管内皮細胞の障壁機能（ｂａｒｒｉｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を保持させることによって血管の安定化（ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を維持する主要調節因子（ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）として作用する。ＶＥＧＦの過発現又は炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）状態では、血管内皮細胞が活性化され、血管透過性（ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）が増加する。

このとき、Ａｎｇ１は、血管内皮細胞の接合部統合（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を促進することによって血管内皮細胞の安定化を誘導し、血管透過性を減少させるのに対し、活性化された血管内皮細胞で増加したＡｎｇ２は、Ｔｉｅ－２に結合することによって血管内皮細胞の移動とティップ形成（ｔｉｐ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関与する。その結果、新生血管の形成を促進する。

糖尿病性網膜症の場合、ＰＤＧＦシグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）が血管周辺細胞を調節することから血液網膜関門（ｂｌｏｏｄ－ｒｅｔｉｎａｌ ｂａｒｒｉｅｒ）の形成及び成熟に必須であることが究明され、成体網膜血管において血管周辺細胞の消失がＶＥＧＦ－Ａに対する血管内皮細胞の反応性を増加させてＦＯＸＯ１－Ａｎｇ２ ｌｏｏｐを活性化させることによって糖尿網膜病症を悪化させることが証明された。すなわち、Ａｎｇ２遮断及びＴｉｅ２活性化を誘導すれば、糖尿病性網膜症の新しい治療法開発が可能であると判断される。

また、Ａｎｇ－２は、癌組織における新生血管形成にも寄与する。癌組織において新生血管形成のために癌細胞が既存の血管を選択する血管共用（ｃｏｏｐｔｉｏｎ）が発生する。その後、Ａｎｇ－２経路によって既存の血管の機能を破壊させる血管退化が起きる。既存血管の退化によって癌組織内の環境は低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）環境となり、新生血管が形成され得る条件を提供する。前記条件下で、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の過発現が誘導され、上述したように新生血管が誘導される。このような理由から、Ａｎｇ－２は血管新生抑制剤を用いる抗癌剤開発の主要ターゲットにされてきた。

このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、抗Ａｎｇ２抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者らは、Ａｎｇ２に目的とする結合力を示す抗Ａｎｇ２抗体を開発し、このような抗Ａｎｇ２抗体が、目的とする免疫抗癌剤又は眼科疾患治療剤の役割を果たすことができることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、Ａｎｇ２に対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞及びその製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む血管新生阻害剤及びアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の治療用組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む血管新生阻害剤及びアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の診断用組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む眼疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む腫瘍又は癌の予防又は治療用組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗Ａｎｇ２抗体又は抗Ａｎｇ２抗体と併用投与するための組成物を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号１、７、１３、１９及び２５からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、８、１４、２０及び２６からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３、９、１５、２１、２７、５１、５２及び５３からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号４、１０、１６、２２、及び２８からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１１、１７、２３及び２９からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１２、１８、２４及び３０からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、Ａｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２）に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。

本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。

本発明は、また、前記核酸を含むベクターを提供する。

本発明は、また、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。

本発明は、また、次の段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。

本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を含む血管新生阻害剤及びアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の治療用組成物を提供する。本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を含む血管新生阻害剤及びアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の診断用組成物を提供する。本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を含む腫瘍又は癌の予防又は治療用組成物を提供する。本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を含む眼疾患の予防又は治療用組成物を提供する。本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗Ａｎｇ２抗体又は抗Ａｎｇ２抗体と併用投与するための組成物を提供する。

選別された単クローンｓｃＦｖファージがＡｎｇ２／Ｔｉｅ２結合を阻害する能力があることを確認した結果である。

選別した抗Ａｎｇ２抗体を一時発現及び精製後に、産物に対する還元条件及び非還元条件でＳＤＳ－ＰＡＧＥした結果である。

一時発現及び精製した抗Ａｎｇ２抗体のヒト及びマウスＡｎｇ２とＡｎｇ１に対する結合を評価したＥＬＩＳＡ結果である。

選別された抗Ａｎｇ２抗体のヒト及びマウスＡｎｇ２／Ｔｉｅ２結合を中和できる能力を示す結果である。

選別された抗Ａｎｇ２抗体のＡｎｇ２／インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）の結合を中和できる能力を示す結果である。

選別された抗Ａｎｇ２抗体がＡｎｇ２／Ｔｉｅ２信号伝達を阻害できることを示す結果である。

選別された抗Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体を大腸菌で発現させて精製段階別純度を確認した結果である。

大腸菌で発現した抗Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体のヒトＡｎｇ２タンパク質に対する結合を評価したＥＬＩＳＡ結果である。

選別された抗Ａｎｇ２ ＳｃＦｖ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効能をＣＮＶマウスモデルから確認した結果である。

ヒト由来三重陰性乳癌モデルを用いた抗Ａｎｇ２抗体の抗腫瘍効果に対する結果である。

特に断りのない限り、本明細書で使われた全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。

本発明は、一観点において、配列番号１、７、１３、１９及び２５からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、８、１４、２０及び２６からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３、９、１５、２１、２７、５１、５２及び５３からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号４、１０、１６、２２、及び２８からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１１、１７、２３及び２９からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１２、１８、２４及び３０からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、Ａｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２）に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。

本明細書で使われた用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、Ａｎｇ２に特異的に結合する抗Ａｎｇ２抗体を意味する。本発明の範囲には、Ａｎｇ２に特異的に結合する完全な抗体形態の他に、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。

完全な抗体は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。

抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうちＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の定常領域及び重鎖の最初の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと相違する。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有する最小の抗体片である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ，ｓｃＦｖ）は一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり又はＣ末端で直接に連結されているため、二重鎖Ｆｖと同様にダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、遺伝子組換え技術を用いて作製することもできる。

一実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はエプシロン（ε）のいずれか一アイソタイプから選ばれてよい。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ型であってよい。

本明細書で使われる用語“重鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片のいずれをも意味する。また、本明細書で使われる用語“軽鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片のいずれをも意味する。

本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド－結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、又はこれらの抗体のエピトープ結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。

前記単一クローン抗体は、実質的に同質的な抗体集団から得た抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異を除けば同一であるものを指す。単一クローン抗体は、高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に、異なる決定因子（エピトープ）に対して示された異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一決定因子に対して示される。

“エピトープ”は、抗体が特異的に結合し得るタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、通常、化学的に活性である表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖から構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴の他にも特定の電荷特性を有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失するが、後者に対しては消失しないという点で区別される。

前記“ヒト化”形態の非ヒト（例えば、ネズミ類（ｍｕｒｉｎｅ））抗体は、非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を、目的とする特異性、親和性及び能力を保有している非ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域からの残基に取り替えたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。

前記“ヒト抗体”とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されているものを意味する。

重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来するか、特別な抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか或いはこれと相同性であるのに対し、残りの鎖は、他の種から由来するか、さら他の抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか或いはこれと相同性である“キメラ”抗体（免疫グロブリン）の他に、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片も含まれる。

本願に使用されているような“抗体可変ドメイン”は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分のことを指す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインのことを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインのことを指す。

“相補性決定領域”（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基のことを指す。各可変ドメインは典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。本発明は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び配列番号２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

本発明において、前記Ａｎｇ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

“骨格領域”（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。

“Ｆｖ”断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えば、ｓｃＦｖとして強固に事実上共有的に連合した二量体からなる。

“Ｆａｂ”断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般に、それらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近に共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。

“単一鎖Ｆｖ”又は“ｓｃＦｖ”抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、それらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。

抗Ａｎｇ２抗体は、単鎖又は二重鎖を含むことができる。機能的に、抗Ａｎｇ２抗体の結合親和性は、１０^－５Ｍ～１０^－１２Ｍの範囲内にある。例えば、抗Ａｎｇ２抗体の結合親和性は、１０^－６Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－１０Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－７Ｍ又は１０^－５Ｍ～１０^－６Ｍである。

前記Ａｎｇ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３２、３６、４０、４４、４８、５５、５７、５９及び６１からなる群から選ばれる重鎖可変領域を含むことができる。また、前記Ａｎｇ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３４、３８、４２、４６及び５０からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことができる。

特に、抗Ａｎｇ２抗体の生産性及び高濃縮剤形の開発のために、生産性及び溶解度の改善を目標に重鎖可変領域のフレームワーク部分に突然変異を誘導した。突然変異は、重鎖可変領域１２番アミノ酸であるバリンをセリンに変換して作製した。これにより、配列番号６１の重鎖可変領域を含む抗体を実験した。その結果、向上した生産性及び溶解度を示すことを確認した。

本発明に係る具体的実施例において、配列番号３２の重鎖可変領域及び配列番号３４の軽鎖可変領域；
配列番号３６の重鎖可変領域及び配列番号３８の軽鎖可変領域；
配列番号４０の重鎖可変領域及び配列番号４２の軽鎖可変領域；
配列番号４４の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域；
配列番号４８の重鎖可変領域及び配列番号５０の軽鎖可変領域；
配列番号５５の重鎖可変領域及び配列番号４２の軽鎖可変領域；
配列番号５７の重鎖可変領域及び配列番号４２の軽鎖可変領域；
配列番号５９の重鎖可変領域及び配列番号４２の軽鎖可変領域；又は、配列番号６１の重鎖可変領域及び配列番号４２の軽鎖可変領域を含むことができる。

“ファージディスプレイ”は、変異体ポリペプチドを、ファージ、例えば、繊維状ファージ粒子の表面上に、外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速に且つ効率的に分類できるという事実にある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を持つポリペプチドを調べるために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに用いられてきた。

ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例えば、抗原）と結合する新規タンパク質を生成及び選別するための強力な道具を提供した。ファージディスプレイ技術を用いて、タンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を速かに分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮タンパク質、例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質又はポリペプチドを暗号化する核酸配列を、遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた１価ファージディスプレイシステムが開発された。１価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現して粒子感染性が維持される。

繊維状ファージの表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、多数の方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法、又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象にして、目的とする特徴を伴う抗体又は抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。

ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を有する抗体を製造するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べて、いくつかの利点を有する。このような技術は、動物を使用しなくとも短時間で様々な配列を持つ大きい抗体ライブラリーを生成可能にする。ハイブリドーマの製造又はヒト化抗体の製造は、数ヶ月の製造期間がかかり得る。また、免疫が全く要求されないため、ファージ抗体ライブラリーは、毒性であるか又は抗原性の低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。また、ファージ抗体ライブラリーを用いて新規な治療的抗体を生成及び確認することができる。

ファージディスプレイライブラリーを用いて免疫又は非免疫させたヒト、生殖細胞系配列、又は未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を用いることができる。各種リンパ系組織を用いて、未感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。

ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離できる技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーのサイズ、細菌性細胞中での生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーのサイズは、抗体又は抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディング及び停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞での発現は、抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォーディングされない場合には抑制され得る。発現は、可変／定常界面の表面又は選別されたＣＤＲ残基における残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一要素である。

高親和性抗体分離において抗体又は抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、それらがしばしば抗原結合に参加することが明らかにされた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、サイズ、配列及び構造的立体形態面において非常に様々であり、これを用いて様々なライブラリーを製造することができる。

また、各位置において２０個アミノ酸を全て使用して可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個の全てのアミノ酸を使用すれば、多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を確認する機会が増加し得る。

本発明の抗体又は抗体断片は、Ａｎｇ２を特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗Ａｎｇ２抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性をより改善させるために、抗体のアミノ酸配列に更なる変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいてなる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形態及び種類に対する分析により、アルギニン、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは、類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の形態を有するということがわかる。したがって、このような考慮事項に基づき、アルギニン、リジン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは生物学的に機能均等物といえる。

上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界における通常のアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知されている。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ＮＣＢＩなどから接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認できる。

これに基づき、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体と比較して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当業界に公知の方法による配列比較及び／又は整列によって決定されてよい。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。

本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。

本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体又はその抗原結合断片を組み換えして生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入して、さらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又はさらに発現させる。これに基づき、本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含むベクターに関する。

“核酸”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他に、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形されてよい。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

本発明に係る具体的実施例において、前記核酸は、重鎖可変領域をコードする配列番号３１、３５、３９、４３、４７、５４、５６、５８、６０からなる群から選ばれる重鎖可変領域を含むことができる。また、前記核酸は、軽鎖可変領域をコードする配列番号３３、３７、４１、４５及び４９からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことができる。

具体的に、重鎖可変領域をコードする配列番号３１の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号３３の核酸；
重鎖可変領域をコードする配列番号３５の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号３７の核酸；
重鎖可変領域をコードする配列番号３９の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号４１の核酸；
重鎖可変領域をコードする配列番号４３の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号４５の核酸；
重鎖可変領域をコードする配列番号４７の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号４９の核酸；
重鎖可変領域をコードする配列番号５４の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号４１の核酸；
重鎖可変領域をコードする配列番号５６の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号４１の核酸；
重鎖可変領域をコードする配列番号５８の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号４１の核酸；又は
重鎖可変領域をコードする配列番号６０の核酸及び軽鎖可変領域をコードする配列番号４１の核酸を含むことができる。

前記抗体を暗号化するＤＮＡは通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に、次のいずれか一つ以上が含まれるが、これに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。

本明細書で使われる用語“ベクター”は、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて抗体をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。

“作動的に連結”とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節する。

原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解読終結配列を含むのが一般である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス***腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられてよく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有する。

場合によって、ベクターは、それから発現する抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。

前記ベクターは選択標識として当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。

本発明は、さらに他の観点において、前記言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために用いられた細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり、それに制限されるものではない。

エシェリキアコライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属の菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を用いることができる。

ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０が挙げられるが、これに制限されるものではない。

本発明は、さらに他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。

前記細胞は、各種の培地で培養できる。市販培地はいずれも培養培地として使用可能である。当業者に公知のその他全ての必須補充物が適当な濃度で含まれてよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に用いられており、これは当業者に明らかであろう。

前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって不純物を除去し、その結果を、例えば親和クロマトグラフィーなどを用いて精製できる。更なるその他精製技術、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが用いられてもよい。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗体を有効成分として含む腫瘍の予防又は治療用組成物に関する。前記抗体は、ＩｇＧ又は可変領域を含む断片、すなわち、ＳｃＦｖ、Ｆａｂであってよい。また、重鎖の可変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４であってよい。

本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＡｎｇ２に対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む眼疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物であってよい。本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を腫瘍患者に投与する段階を含む眼疾患の予防又は治療方法であってよい。本発明はさらに、前記抗体又はその抗原結合断片のＡｎｇ２の機序妨害用途及びこれを用いた眼疾患の予防又は治療用途であってよい。

眼疾患と関連して、角膜は無血管組織であり、視力保存のために常に透明性を維持しなければならない。しかし、新生血管生成は眼でも起き、眼球の新生血管関連疾患を誘発するものと知られている。すなわち、角膜における新生血管生成は、眼球の透明性を阻害して視力の損失をもたらし、網膜における新生血管生成は、正常でない血管の生成により血液の滲出現象が起きて網膜細胞の変性による失明を誘導する。

これに基づき、本発明は、眼疾患、例えば、未熟児網膜病症、角膜新生血管生成症、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管疾患、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性）などの予防又は治療に用いることができる。

本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＡｎｇ２に対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む腫瘍又は癌の予防又は治療用薬剤学的組成物であってよい。本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を腫瘍又は癌患者に投与する段階を含む腫瘍又は癌の予防又は治療方法であってよい。本発明はさらに、前記抗体又はその抗原結合断片のＡｎｇ２の機序妨害用途及びこれを用いた腫瘍又は癌の予防又は治療用途であってよい。

前記組成物に適用される疾患である腫瘍又は癌は、典型的に、Ａｎｇ２を過発現する腫瘍又は癌、及びＡｎｇ２を過発現しない腫瘍又は癌を含む。治療用として好ましい腫瘍又は癌の非制限的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、透明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応前立腺癌腫）、膵臓腺癌腫、乳癌（場合によって三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平細胞癌腫、肝癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、及びその他新生物癌腫を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体を用いて治療できる不応又は再発癌を含む。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む血管新生阻害用薬学組成物に関する。さらに他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含むアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の予防及び／又は治療用薬学組成物を提供する。

本発明は、例えば、前記抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片の治療的有効量を血管新生阻害を必要とする患者に投与する段階を含む、血管新生阻害方法が提供される。前記血管新生阻害方法は、前記投与段階前に、血管新生阻害を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。他と例において、前記抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片の治療的有効量を、アンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者に投与する段階を含む、アンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の予防及び／又は治療方法が提供される。前記予防及び／又は治療方法は、前記投与段階前に、アンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。

前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、前記担体は、薬物の製剤化に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。前記薬学組成物は、また、薬学組成物の製造に通常用いられる希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤からなる群から選ばれる１種以上をさらに含むことができる。

前記薬学組成物、又は前記抗体又はその抗原結合断片の有効量は、経口又は非経口で投与できる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。経口投与時に、タンパク質又はペプチドが消化されることから、経口用組成物は、活性薬剤をコートしたり、或いは胃における分解から保護されるように剤形化してよい。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてよい。

前記薬学組成物中の抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片の含有量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、***速度及び反応感応性のような要因によって様々に処方されてよい。例えば、前記抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片の１日投与量は、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、具体的に０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、より具体的に０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、さらに具体的に０．１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、これに制限されるものではない。前記１日投与量は、単位容量の形態で一つの製剤として製剤化されたり、適切に分量して製剤化されたり、或いは多回容量容器内に内入させて製造されてよい。

前記薬学組成物は、他の血管新生阻害剤又はアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の治療剤のような他の薬物と併用投与可能であり、その投与量、投与方法及び他の薬物の種類は、患者の状態によって適切に処方されてよい。

前記薬学的組成物は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤などの形態に剤形化でき、剤形化のために分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

特に、前記抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片を含む薬学組成物は、抗体又は抗原結合断片を含むので、免疫リポソームとして剤形化できる。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法によって製造されてよい。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びポリエチレングリコール誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であり、逆相蒸発法によって製造されてよい（韓国公開特許１０－２０１５－００８９３２９）。例えば、抗体のＦａｂ’断片はジスルフィド交替反応によってリポソームに接合され得る。

一方、前記抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片は、アンジオポエチン－２に特異的に結合するので、これを用いてアンジオポエチン－２の活性化及び／又は過生成の有無が確認できる。したがって、本発明のさらに他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片を含むアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成、及び／又はアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の診断用薬学組成物を提供する。さらに他の例において、患者から得られた生物試料に前記抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片を処理する段階；抗原－抗体反応の有無を確認する段階；及び、抗原－抗体反応が探知される場合、前記患者を、アンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成症状が存在したり、或いはアンジオポエチン－２の活性化及び／又は過生成関連疾病を有すると判断する段階を含む、診断方法又は診断に情報を提供する方法を提供する。前記生物試料は、患者から得られた細胞、組織、体液などからなる群から選ばれるものでよい。

前記抗原－抗体反応の有無を確認する段階は、当業界に公知の様々な方法で行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光及び／又は放射線検出によって測定することができ、具体的に、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅｌｉｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ）などからなる群から選ばれる方法によって測定できるが、これに制限されるものではない。

前記薬学組成物の投与又は診断対象患者は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類であってよい。

前記アンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病は、癌；癌転移；未熟児網膜病症、角膜新生血管生成症、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管疾患、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性）などの眼疾患；喘息；リウマチ性関節炎；乾癬；肺炎、慢性炎症などの炎症性疾患；高血圧、動脈硬化などの心血管疾患又は敗血症などであってよい。前記癌は、アンジオポエチン－２を過発現するものでよく、固形癌又は血液癌でよく、次に制限されないが、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚又は眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、膵癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌（場合によって、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、大腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群から選ばれる１種以上であってよい。前記癌は原発性癌又は転移性癌であってよい。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

実施例１．Ａｎｇ２に結合する抗体の選別
Ａｎｇ２に結合する抗体を選別するための抗体ライブラリー及びライブラリーの準備は、韓国特許出願（公開特許１０－２００８－０１０９４１７号）のような自社のヒト未感作ｓｃＦｖ（ｈｕｍａｎ ｎａｉｖｅ ＳｃＦｖ）ライブラリーを用いた。９６－ウェル免疫プレートに抗原（ｈＡｎｇ２－ｈｉｓ：ＲＮＤ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃａｔ．Ｎｏ６２３－ＡＮ／ＣＦ、ｈＡｎｇ２－Ｆｃ：ｐｈａｒｍａｂｃｉｎｅ）を２μｇ／ｍｌで１００μｌずつウェルに入れ、４℃オーバーナイト（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）させる。翌日、抗原コーティングプレート（ｃｏａｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ）は５ｍＭのＣａＣｌ_２ ＴＢＳで３回洗浄後に２％ ＢＳＡ遮断バッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）２００μｌを入れて室温で２時間反応させる。２ｘ ＹＴ－ＴＥＴ（テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ）成長培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）２ｍｌにＸＬ１－Ｂｌｕｅストック（ｓｔｏｃｋ）５０μｌを入れ、３７℃、２００ｒｐｍで２時間程度育てた後、１３ｍｌをさらに添加し、ＯＤ_６００が０．５となるまで育てる。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）２時間が過ぎると、１Ｘ ５ｍＭ ＣａＣｌ_２ ＴＢＳで３回洗浄する。洗浄した各ウェルに、ファージライブラリーグループ（ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｇｒｏｕｐ）を合わせてファージライブラリー量と４％ ＢＳＡ量を同一に混ぜた後に２００μｌずつ添加し、室温で３０分間ロッキング（ｒｏｃｋｉｎｇ）した後に２時間反応させる。ファージライブラリー反応が終わると、上澄液は捨て、０．１％ ＴＢＳＴ（５ｍＭ ＣａＣｌ_２）で５回洗浄し、ＴＢＳ（５ｍＭ ＣａＣｌ_２）で５回洗浄して、各ウェルに１００ｍＭ ＴＥＡ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１００μｌを入れた後、室温で１０分間振り動かす。１０分経つと、各ウェルに１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）５０μｌを入れて混ぜる。上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）は、ＯＤ_６００ ０．５となったＸＬ１－ｂｌｕｅ １０ｍｌに入れ、３７℃で３０分間感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させる。感染が終わると、１００μｌはアウトプットタイター（ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）として使用し、残りは６，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。上澄液は捨て、沈殿物はラージスクエアプレート（ｌａｒｇｅ ｓｑｕａｒｅ ｐｌａｔｅ：ＣＭ ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）にスプレッド（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）し、３０℃でオーバーナイトインキュベーション（ｏｖｅｒｎｉｎｇｔ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する。アウトプットタイターとして残した１００μｌは、１／１０、１／１００、１／１０００に希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）してＣＭプレートにスプレッドし、３７℃でオーバーナイトする。翌日、スクエアプレートに育てたコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）は、２ｘ ＹＴ培地５０ｍｌを入れた後、ループ（ｌｏｏｐ）を用いてかき集めた後、６０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して上澄液は捨て、沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）に対して１次パンニングストック（ｐａｎｎｉｎｇ ｓｔｏｃｋ）を作り、２ｘ ＹＴ培養培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ：ＣＭ ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れた後、ＯＤ_６００ ０．２となるように細胞を入れ、２００ｒｐｍ、３７℃でＯＤ ０．５になるまで育てる。ＯＤ_６００値が０．５になるまで細胞を培養した後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ：Ｍ１３ＫＯ７ ｍｕｔａｎｔ）を細胞の２０倍となるように入れる。ヘルパーファージを入れて３７℃、３０分感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、６０００ｒｐｍ、１０分遠心分離する。上澄液を捨て、細胞は２ｘＹＴ培地（ＣＭ ３４μｇ／ｍｌ＋Ｋａｎ．７０μｇ／ｍｌ＋１ｍＭ ＩＰＴＧ＋５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）１００ｍｌに取り替えて入れた後、２００ｒｐｍ、３０℃でオーバーナイトする。翌日、育った細胞は７０００ｒｐｍ、１０分、遠心分離し、同じ方法でさらに遠心分離する。集めた上澄液は、上澄液の１／５（ｖ／ｖ）に２０％ ＰＥＧ／２．５ｍ ＮａＣｌを入れ、アイス（ｉｃｅ）で１時間沈殿させる。沈殿させた後、９０００ｒｐｍ、１時間遠心分離する。上澄液は捨て、ＴＢＳ ３ｍｌで沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）を解いた後、０．４５μｍフィルター（ｆｉｌｔｅｒ）に濾過して４℃に保管し、これを次回のパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）過程で使用する。この過程を３～４回反復し、抗原に結合する抗体をＥＬＩＳＡで確認した。

実施例２．Ａｎｇ２に特異的に結合し、Ｔｉｅ２との結合を中和する単クローンＳｃＦｖファージ選別（結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）ＥＬＩＳＡ／競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡ）
パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）過程が終わると、最後ラウンドの細胞ストック（ｒｏｕｎｄ ｃｅｌｌ ｓｔｏｃｋ）をＣＭアガープレート（ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）に２００～５００個のコロニーが形成され得るように希釈してスプレッドした後、３７℃でオーバーナイトする。翌日、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）が育つと、９６ウェルディーププレート（９６ｗｅｌｌ ｄｅｅｐ ｐｌａｔｅ）に２ｘＹＴ培地（ＣＭ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）２００μｌを入れ、各ウェルにコロニーを一つずつ入れた後、３７℃、３０００ｒｐｍでオーバーナイトする。翌日、新しい９６ウェルディーププレートに２ｘＹＴ培地（ＣＭ ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）２００μｌを入れ、各ウェルに前日に育てた細胞を各ウェルごとに２０ｍｌずつ入れた後、３７℃、３０００ｒｐｍ、１時間１０分育てる。残りの細胞は、５０％グリセロール１００μｌずつ添加して－７０℃に保管する。細胞が育つと、ヘルパーファージ１μｌと２ｘＹＴ培地１９μｌを混ぜた後、各ウェルに２０μｌずつ添加後に３７℃で３０分インキュベーションする。インキュベーションが終わると、３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離する。上澄液を捨て、２ｘＹＴ培地（ＣＭ３４μｇ／ｍｌ＋Ｋａｎ．７０μｇ／ｍｌ＋１ｍＭ ＩＰＴＧ＋５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）２００μｌを入れ、メガグロー（ｍｅｇａｇｒｏｗ）で３０℃、３０００ｒｐｍでオーバーナイトする。

Ａｎｇ２に特異的に結合するファージを選別するために、まず、９６ウェル免疫プレートに、Ａｇ（ｈＡｎｇ２－Ｆｃ，ｈＡｎｇ１－ｈｉｓ：ＲＮＤ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃａｔ．Ｎｏ９２３－ＡＮ／ＣＦ又はｍＡｎｇ１－Ｆｃ，ｐｈｒｍａｂｃｉｎｅ）１μｇ／ｍｌを１００μｌ／ｗｅｌｌずつ入れ、４℃でオーバーナイトする。翌日、前日に育てた細胞は３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して４℃に保管する。スプレッドしておいたＡｇは、０．１％ ＴＢＳＴ（５ｍＭ ＣａＣｌ_２）で３回洗浄後に２％ ＢＳＡ遮断バッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を２００μｌずつ入れた後、２５℃２時間インキュベーションする。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）が終わると、０．１％ ＴＢＳＴ（５ｍＭ ＣａＣｌ_２）で３回洗浄する。各ウェルに４％ＢＳＡ ５０μｌと、冷却して（ｃｏｏｌｅｄ ｄｏｗｎ）して４℃で保管していたファージ５０μｌとを混ぜ、室温で１時間振って反応させる。ファージ結合（ｐｈａｇｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）が終わると、０．１％ ＴＢＳＴ（５ｍＭ ＣａＣｌ_２）で３回洗浄後に、ＨＲＰ接合マウス抗Ｍ１３抗体１：３０００（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－Ｍ１３Ａｂ）（Ｓｉｎｏ，１１９７３－ＭＭ０５）を１００μｌずつ入れた後、２５℃１時間反応させる。反応が終わると、０．１％ ＴＢＳＴ（５ｍＭ ＣａＣｌ_２）で３回洗浄後にＴＭＢ（＃ＢＤ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｓｅｔ ５５５２１４）１００μｌずつ入れて３～５分発色させた後、停止溶液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０μｌずつ入れ、ＥＬＩＳＡリーダ（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）で分析する。

選別された抗体の塩基配列は、次の表２、表３の通りである。

競合（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡでは、Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２の結合を中和するファージを選別するために、９６ウェル免疫プレートにＡｇ（ｈＴｉｅ２－Ｆｃ：ｐｈｒｍａｂｃｉｎｅ）１μｇ／ｍｌを１００μｌ／ｗｅｌｌずつ入れて４℃でオーバーナイトさせる。スプレッドしておいたＡｇは、１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄後に３％ ＢＳＡ遮断バッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を２００μｌずつ入れた後、２５℃、２時間インキュベーションする。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）が終わると、０．１％ ＰＢＳＴで２回洗浄する。各ウェルにｈＡｎｇ２－ｈｉｓ（ＲＮＤ，６２３－ＡＮ／ＣＦ）５μｇ／ｍｌ ２０μｌと冷却して４℃で保管したファージとを、体積別に（８０μｌ、４０μｌ＋１Ｘ ＰＢＳ ４０μｌ、２０μｌ＋１Ｘ ＰＢＳ ６０μｌ）混ぜた後、室温で１時間振って反応させる。ファージ結合（ｐｈａｇｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）が終わると、０．０５％ ＰＢＳＴで３回洗浄後に、抗Ａｎｇ２マウス抗体（ＲＮＤ，ＭＡＢ０９８）を０．５μｇ／ｍｌで室温で１時間反応させる。抗体結合が終わると、０．０５％ ＰＢＳＴで３回洗浄後に、ＨＲＰ接合マウス抗ＩｇＧ抗体１：２０００（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍＩｇＧ Ａｂ）（ＲＮＤ，ＨＡＦ００７）を１００μｌずつ入れた後、２５℃、１時間反応させる。反応が終わると、０．０５％ ＰＢＳＴで３回洗浄後に、ＴＭＢ（＃ＢＤ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｓｅｔ ５５５２１４）１００μｌずつ入れて３～５分発色させた後、停止溶液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０μｌずつ入れ、ＥＬＩＳＡリーダ（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）で分析する。その結果を図１に示した。図１に見られるように、選別されたファージはＴｉｅ２／Ａｎｇ２の結合を中和させる能力があることを確認した。

実施例３．Ａｎｇ２に対する高親和力を持つ抗体選別（Ｏｆｆ－ｒａｔｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
選別された抗体の抗原に対する結合力をＯｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて測定した。そのために、Ａｎｇ２をバイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）に固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）した後、ｓｃＦｖ形態で発現した候補抗体を入れて結合させた後、解離速度定数を測定した。その結果を表４に示す。

実施例４．抗Ａｎｇ２抗体発現
選別したｓｃＦｖファージのＩｇＧ形態への転換は、分子生物学的手法を用いて行った。選別したＥ．Ｃｏｌｉクローンにおいてファージミド（Ｐｈａｇｅｍｉｄ）を抽出し、ＰＣＲ手法を用いて可変領域を増幅した。増幅した重鎖可変領域を、重鎖定常領域を含む発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ｐｆｕｓｅｓｓ－ｈｃｈｇ１）に挿入し、増幅した軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域を含む発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ｐｆｕｓｅ２ｓｓ－ｈｃｌｋ）に挿入することで、ＩｇＧ形態のＤＮＡクローニングを完了した。

ＩｇＧの一時発現は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現システムキット（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）を使用した。キットに含まれたＥｘｐｉ２９３細胞を専用培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ_２環境下で１２５ｒｐｍオービタルシェーカー上で浮遊培養した。３日ごとに３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように継代培養し、発現ベクター導入時には３×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞数を調整して使用した。遺伝子導入は、専用試薬であるＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用し、細胞懸濁液１ｍｌ当たりに発現ベクターＤＮＡ １μｇとＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２．７μｌを含有するＬｉｐｉｄ－ＤＮＡ複合体を作製し、細胞懸濁液に添加した後、導入１６～１８時間後にエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）１／２を添加して発現を誘導した。その後、同一条件で３～４日間培養後に遠心分離してＩｇＧ含有上澄液を取った。

実施例５．抗Ａｎｇ２抗体の精製
取得した上澄液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入し、親和力クロマトグラフィーを用いてＩｇＧを精製した。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ７．０）で平衡化させた後に上澄液を注入し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０（ｐＨ ７．０）溶液で洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１Ｍ グリシン－ＨＣｌ（ｐＨ ３．５）で溶出後に１Ｍ Ｔｒｉｓで中和した。溶出されたタンパク質は、ＭＷＣＯ １０，０００ ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ，ＵＳ）を用いた透析過程により溶媒をＰＢＳに取り替えた。その後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｔｏｒｉｕｓ，ＤＥ）を用いて必要濃度に濃縮して分注後に－８０℃で保管した。

精製後、各抗体は非還元及び還元ＬＤＳサンプルバッファー（Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ及びＲｅｄｕｃｉｎｇ ＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に処理し、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて電気泳動した。その結果、５０ｋＤａの重鎖及び２５ｋＤａの軽鎖を含む総分子量約１５０ｋＤａのＩｇＧを得た（図２）。

実施例６．抗Ａｎｇ２抗体の結合特異性分析
結合特異性分析にはＥＬＩＳＡ法とＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて結合定数を測定した。

９６ウェル免疫プレート（Ｎｕｎｃ，ＵＳ）の各ウェルに、１μｇ／ｍｌのＨｉｓ－ｔａｇされたヒト（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，６２３－ＡＮ／ＣＦ）又はマウス（ｓｉｎｏ，５０２９８－Ｍ０７Ｈ）Ａｎｇ２タンパク質、若しくはヒト（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，９２３－ＡＮ／ＣＦ）又はマウス（ｓｉｎｏ，５０３００－Ｍ０７Ｈ）Ａｎｇ１溶液を１００μｌ添加後に、４℃で一晩静置して吸着させた。翌日、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、２％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ溶液を各ウェル当たりに２００μｌ添加後に常温で２時間静置してブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄後に各試験抗体溶液を濃度別に１００μｌずつ添加して常温で１時間結合させた後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２０００の比率に希釈したＨＲＰ接合されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｋａｐｐａ）（ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂ ＃Ａ８０－１１５Ｐ）を１００μｌ添加して常温で１時間反応させて結合を誘導し、ＰＢＳＴで３回洗浄後に１００μｌのＴＭＢ基質試薬を用いて発色させた。発色反応は、５０μｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することにより停止させ、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ，ＣＨ）を用いて特異的吸光度ＯＤ_{４５０－６３０}を測定した（図３）。図３に見られるように、選別された抗体はヒトとマウスＡｎｇ２に特異的に結合し、ヒトとマウスＡｎｇ１には結合しない。

選別された抗Ａｎｇ２抗体の結合力を分析するために、ヒトＡｎｇ２とマウスＡｎｇ２に対する親和度分析をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセンサーチップを用い、メーカーのマニュアルに従って実験した。分析の細部的な条件は次の通りである。Ｐｏｒｏｔｅｉｎ Ａ固定は、２０００ＲＵ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｕｎｉｔ）であり、抗Ａｎｇ２抗体候補は２５ＲＵで結合し、ヒトＡｎｇ２とマウスＡｎｇ２を様々な濃度で結合した。分析開始濃度はそれぞれ、１００ｎＭと１５０ｎＭである。分析は、流速３０μｌ／ｍｉｎで行い、ヒトＡｎｇ２の結合区間は３００秒、解離区間は２０００秒と測定し、マウスＡｎｇ２は、結合区間３００秒、解離区間１０００秒と分析した。分析モデルは、１：１結合モデルを使用して分析した。分析結果は、表５に示す。

実施例７．抗Ａｎｇ２抗体の中和能力確認（Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２、Ａｎｇ２／インテグリン）
９６ウェル免疫プレート（Ｎｕｎｃ，ＵＳ）の各ウェルに、１μｇ／ｍｌのヒトＴｉｅ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，３１３－ＴＩ）、マウスＴｉｅ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，７６２－Ｔ２－１００）、インテグリンα３／β１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２８４０－Ａ３－０５０）そしてインテグリンα５／β１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，３２３０－Ａ５－０５０）溶液を１００μｌ添加後に、４℃で一晩静置して吸着させた。翌日、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、２％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ溶液を各ウェル当たりに２００μｌ添加後に、常温で１時間静置してブロッキングした。抗Ａｎｇ２候補抗体は、最高１０００ｎＭで４倍に段階希釈し、一部は、ビオチン結合したヒトＡｎｇ２タンパク質が最終１００ｎｇ／ｍＬとなるようにし、一部は、ビオチン結合したヒトＡｎｇ２タンパク質が最終６２５ｎｇ／ｍＬとなるようにしてあらかじめ常温で１時間結合させた。ブロッキングの終わったプレートは、ＰＢＳＴで４回洗浄後に、あらかじめ抗原抗体反応を誘導した試料を入れ、常温で１時間結合させる。上のプレートをＰＢＳＴで３回洗浄後に、１：２００の比率に希釈したＨＲＰ接合されたストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹ９９８）を１００μｌ添加し、常温で１時間反応させて結合を誘導し、ＰＢＳＴで４回洗浄後に１００μｌのＴＭＢ基質試薬を用いて発色させた。発色反応は、５０μｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することで停止させ、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ，ＣＨ）を用いて特異的吸光度ＯＤ_４５０を測定した（図４、図５）。図４に見られるように、選別された抗体は、ヒトとマウスの両方においてＡｎｇ２／Ｔｉｅ２結合を中和した。中和能力は、ＩＣ_５０値を求めて数値化し、表６に示した。また、図５に見られるように、インテグリン／Ａｎｇ２の結合も中和した。インテグリン／Ａｎｇ２の中和能力はＩＣ_５０値を求めて数値化し、表７に示した。

実施例８．抗Ａｎｇ２抗体のＡｎｇ２／Ｔｉｅ２信号抑制効果分析（ｐ－Ｔｉｅ２ ａｓｓａｙ）
ヒトＴｉｅ２過発現細胞（１×１０^５）を９６ウェルプレートに入れ、３７℃、二酸化炭素が供給されるインキュベーターで一晩育てる。上の細胞を無血清培地で一晩育てて血清飢餓状態にする。ヒトＡｎｇ２（５μｇ／ｍｌ）と様々な濃度の抗Ａｎｇ２を常温で１時間あらかじめ反応させた後、細胞の入っているプレートに入れて２０分間反応させる。このとき、抗体がなく、Ａｎｇ２タンパク質のみ入っているウェルを含めて信号抑制効果分析の基準値とする。細胞は、溶解緩衝液を入れて溶解させた後に定量する。リン酸化反応を測定するために、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社のヒトリン酸化Ｔｉｅ２デュオセットＩＣ ＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔｉｅ２ Ｄｕｏｓｅｔ ＩＣ ＥＬＩＳＡ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹＣ２７２０－５）を使用した。９６ウェル免疫プレート（Ｎｕｎｃ，ＵＳ）の各ウェルに４μｇ／ｍｌのヒトＴｉｅ２キャプチャータンパク質を添加後に４℃で一晩静置して吸着させた。翌日、希釈剤をウェル当たりに２００μｌ添加後に常温で２時間静置してブロッキングした。細胞溶解物を５０μｇずつ入れて常温で２時間結合させた。反応が終わった後、抗ホスホチロシン抗体を２７００：１に希釈して常温で２時間結合させる。反応の終わったプレートは、ＴＭＢ基質試薬を用いて発色させた。発色反応は５０μｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することで停止させ、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ，ＣＨ）を用いて特異的吸光度ＯＤ_４５０を測定した（図６）。図６に見られるように、抗体の濃度が上がるにつれてリン酸化が減ることが確認できた。リン酸化程度は、ＩＣ_５０値を求めて数値化し、表８に示した。

実施例９：親和度増進のための変異体作製及び選別
抗Ａｎｇ２抗体クローンＮｏ．８の親和度増進のために抗体最適化を行った。Ｎｏ．８の元来ＤＮＡ配列を７０％保存しながらランダム化（ｒａｎｄｏｍｉｚｅ）させるソフト－ランダム化（ｓｏｆｔ－ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）法を活用して、Ｎｏ．８の軽鎖ＣＤＲ３と重鎖ＣＤＲ３に無作為変異を導入したプライマーを作製した。これを使用したＰＣＲにより変異の導入された軽鎖可変領域、重鎖可変領域コーディングＤＮＡ断片を確保した。このＤＮＡ断片をそれぞれ、Ｎｏ．８ｓｃＦｖファージミドの軽鎖可変領域及びＮｏ．８ｓｃＦｖファージミドの重鎖可変領域と置換し、軽鎖ＣＤＲ３と重鎖ＣＤＲ３変異体ｓｃＦｖファージＤＮＡライブラリーを作製した。

変異体ｓｃＦｖファージＤＮＡライブラリーをフェノール－クロロホルムで精製後に、電気穿孔法を用いて大腸菌株ＸＬ－１ Ｂｌｕｅに形質転換した。形質転換効率分析及び、ＤＮＡ配列分析によって多様性が確保されたことを確認した後、５００ｍｌ規模に培養してファージ発現を誘導し、ＰＥＧ－沈殿法を用いて軽鎖と重鎖のＣＤＲ３変異体ｓｃＦｖファージライブラリーを作製した。

各変異体ｓｃＦｖファージライブラリーを用いて、実施例１で提示した方法でバイオパンニングを行った。その後、選別過程では、結合を維持する能力の定量的評価指標としてｓｃＦｖの解離速度定数ｋｄｉｓを測定した。選別された最適化クローン３種に対するアミノ酸配列（表９、表１０）と解離速度定数測定結果（表１１）を示した。

実施例１０：最適化された抗Ａｎｇ２抗体のＳｃＦｖ生産
最適化された抗Ａｎｇ２抗体（Ｎｏ．４）を大腸菌で発現させるためにｐＥＴ－２２ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ＢＬ２１（Ｄｅ３）に形質転換して生成されたコロニーを選別し、ＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ）培地に１００μｌ／ｍｌアンピシリンを添加して３７℃、２００ｒｐｍ条件で前培養した大腸菌を、１００μｌ／ｍｌのアンピシリン抗生剤を含むＬＢ培地に１％接種した。３７℃、２００ｒｐｍ条件で培養してＯＤ６００＝０．６～０．８に達すると培養器の温度を２０℃に下げ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して１６時間培養した。

培養した大腸菌を８０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して集菌した。培地を除去した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を細胞重さｇ当たりに１０ｍｌバッファーを用いて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。超音波破砕機を用いてＰｏｗｅｒ：２０Ｗ、ｒｅｓｔ：３Ｓｅｃ、Ｗｏｒｋ：３Ｓｅｃ、Ｔｉｍｅ：５Ｍｉｎ条件で細胞を破砕した。破砕された細胞を１１，０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、上澄液と沈殿した物質を分離した。

ＳｃＦｖは不溶解性（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）の形態で発現し、リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を行うためにペレット洗浄を行った。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーを用いてホモジナイザー（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で均質化させた後、１１０００ｒｐｍ、１ｈ遠心分離する方法でペレットを２回洗浄した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２Ｍウレア、０．５％トリプトンＸ－１００バッファーを用いてペレット内に残っている大腸菌由来の物質を除去し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーで３回洗浄を反復した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍウレア、１０ｍＭ ＤＴＴバッファーで封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を再懸濁させた後に３０分程度反応させ、ＳｃＦｖをフォールドされていない（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）形態に作り、１１０００ｒｐｍ、１時間遠心分離して沈殿物質と分離した。

ＳｃＦｖ抗体を段階希釈（Ｓｔｅｐ Ｄｉａｌｙｓｉｓ）によりウレアを除去してリフォールディングを誘導した。希釈バッファーは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌを基本としてウレア濃度を１／２ずつ下げながら行った。構造の大部分が形成される４－２－１Ｍウレア濃度区間で０．１Ｍ Ｌ－アルギニンを添加して凝集（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）形成を抑制してリフォールディングを行った。リフォールディングが完了したＳｃＦｖ抗体は、ＨｉｓＴｒａｐとＣａｐｏ Ｌカラムを用いて分離精製を行った。

分離精製は次のような順序で行った。ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システム用いて精製し、５ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐパッキングカラムを使用した。５０ｍＭリン酸三ナトリウム、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールｐＨ ７．４バッファーでＨｉｓｔｒａｐカラム体積の１０カラム体積を流して平衡化させた後、ＳｃＦｖ抗体サンプルを５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＨｉｓｔｒａｐカラムに流してカラム内レジンと結合させた。５０ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールｐＨ ７．４バッファーでレジン中の非特異的な結合物質を除去するために、約１０カラム体積を流した後、５０ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾールｐＨ ７．４バッファーを濃度勾配するように流してＳｃＦｖ抗体を溶出させた。溶出した抗体試料は５ｍｌ Ｃａｐｔｏ Ｌカラムを用いて次の精製を行った。ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）ｐＨ ７．４バッファーでＣａｐｔｏ Ｌカラムを平衡化させた後、サンプルを５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＣａｐｔｏ Ｌカラムに流してカラム中のレジンと結合させる。ＰＢＳバッファーを約１０カラム体積流して非特異的結合物質を除去した。０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ ２．６バッファーを１０カラム体積流してＳｃＦｖ抗体を溶出させた。図７は、最終的に精製後に得たタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果である。その結果、純度の高いＳｃＦｖ抗体が得られた。

実施例１１：最適化された抗Ａｎｇ２ ＳｃＦｖ抗体の結合特異性分析
結合特異性分析にはＥＬＩＳＡ法とＯｃｔｅｔシステム（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＬＬＣ．ＵＳ）を用いて結合定数を測定した。

９６ウェル免疫プレート（Ｎｕｎｃ，ＵＳ）の各ウェルに、１μｇ／ｍｌのＨｉｓ－ｔａｇされたヒトＡｎｇ２タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，６２３－ＡＮ／ＣＦ）溶液を１００μｌ添加後に、４℃で一晩静置して吸着させた。翌日、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、２％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ溶液を各ウェル当たりに２００μｌ添加後に常温で２時間静置してブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄後に各試験抗体溶液を濃度別に１００μｌずつ添加して常温で１時間結合させた後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１：１０００の比率で希釈したＨＲＰ接合された抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ ｔａｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＭＡＢ０５０Ｈ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）を１００μｌ添加して常温で１時間反応させて結合を誘導し、ＰＢＳＴで３回洗浄後に１００μｌのＴＭＢ基質試薬を用いて発色させた。発色反応は、５０μｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することで停止させ、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ，ＣＨ）を用いて特異的吸光度ＯＤ_４５０を測定した（図８）。図８に見られるように、精製された抗体はヒトＡｎｇ２に結合した。

精製されたＳｃＦｖ抗体のヒトＡｎｇ２に対する結合力を、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．ＵＳ）を用いて測定した。そのために、抗Ａｎｇ２抗体をバイオセンサーに固定化し、ヒトＡｎｇ２の濃度別結合動力学を測定して、結合速度定数（ｋ_ａ）、解離速度定数（ｋ_ｄｉｓ）及び結合定数（Ｋ_Ｄ）を算出した（表１２）。

実施例１２：選別された抗Ａｎｇ２ ＳｃＦｖ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効能分析（ＣＮＶマウスモデル）
抗Ａｎｇ２ ｓｃＦｖ抗体の新生血管形成の抑制効能があるかどうか確認するために、レーザー誘起（ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ）脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ＣＮＶ）のためのマウスモデルで薬効試験を行った。その効力は、商用薬物であるアフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）を対照群として試験した。マウスをケタミンで全身麻酔させた後、麻酔点眼剤を眼球に点眼してさらに局所痲酔させ、散瞳剤を点眼して散瞳誘導する。マウスを載物台上に載せ、Ｍｉｃｒｏｎ－ＩＶを用いてＣＮＶ誘導条件（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ５３２ｎｍ、ｄｉａｍｅｔｅｒ ５０μｍ、ｄｕｒａｔｉｏｎ ８０ｍＳ、ｐｏｗｅｒ ｌｅｖｅｌ ２００ｍＷ）によってレーザー火傷（ｌａｓｅｒ ｂｕｒｎ）を誘導し、ブルッフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を破壊させる。レーザー火傷誘導過程でバブリングが観察されなかった病変は、不成功レーザー火傷（ｕｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｌａｓｅｒ ｂｕｒｎ）と分類し、Ｇｏｎｇ Ｙ．等が提案した基準を変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した除外基準（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）に基づいて結果分析及び統計処理過程から除外した。

ＣＮＶ誘導及び薬物による血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制効果を確認するために、ＣＮＶ誘導後１０日にマウスをケタミンで全身麻酔させた後、蛍光造影剤を腹腔注射した。麻酔点眼剤を眼球に点眼してさらに局所麻酔をさせた後、散瞳剤を点眼して散瞳を誘導した。マウスを載物台上に載せ、Ｍｉｃｒｏｎ－ＩＶの映像カメラで基部（ｆｕｎｄｕｓ）に映像を合わせた後、当該眼球に潤滑ゲルを点眼した後、ＯＣＴのレンズをマウスの角膜と接触させた。ＦＦＡ／ＯＣＴ撮影を実施した後、マウス眼球に抗生剤点眼液を１滴点眼した。ＦＦＡ及びＯＣＴイメージに対する分析は、‘Ｉｍａｇｅ－Ｊ’プログラムを用いて行った。ただし、Ｇｏｎｇ Ｙ．等が提案した除外基準に該当するＣＮＶ病変は、最終結果及び統計分析過程から除外された。

視神経回復効果を確認するために、網膜電位図（ＥＲＧ）検査を行った。マウスは、ＥＲＧ評価１２時間前から暗室で暗順応を誘導した。評価当日（ＣＮＶ誘導後１１日）に、ロムプン（登録商標）とケタミン（登録商標）で全身麻酔させた後、アルカイン（登録商標）を眼球に点眼してさらに局所痲酔を誘導し、散瞳剤を点眼して散瞳を誘導した。マウスをＥＲＧ載物台上に載せ、ＥＲＧのプローブをそれぞれ、尻尾、頭及び角膜に接触させた。ＥＲＧは、単一フラッシュ刺激（０．９ｌｏｇ ｃｄｓ／ｍ２（１０ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ／ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））に対する網膜電位図変化で測定した。ＥＲＧ評価が終了すると、マウス眼球にトブレックスを１滴点眼した。ＥＲＧ分析は、‘ＬａｂＳｃｒｉｂｅＥＲＧ（ｉＷｏｒｘ ＤａｔａＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）’プログラムを用いて行った。ただし、Ｇｏｎｇ Ｙ．等が提案した除外基準に該当する眼球は、最終結果及び統計分析過程から除外された。

ＣＮＶマウスモデルに対する抗Ａｎｇ２ ＳｃＦｖ抗体の新生血管減少効能の結果は、図９に示した。ＦＦＡ上で観察されたＣＮＶ病変のサイズにおいて、ＳｃＦｖを１０μｇ／μＬ投与した試験群においてＣＮＶ対照群に対比して統計的に有意な減少が観察され（Ｐ＜０．０１）、アフリベルセプトを投与した試験群と比較する時にも、より優れた効果を示すことが確認された。図１０でＯＣＴ測定により病変の体積をＣＮＶ対照群と比較したときも、ＳｃＦｖを投与した全ての試験群において統計的に有意に病変の体積を濃度依存的に減少させることを確認した（それぞれ、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０００１、Ｐ＜０．０５）。また、図１１で、ｓｃｏｔｏｐｉｃ－ＥＲＧにより網膜電位図をＣＮＶ対照群と比較したとき、統計的に有意なＢ波の振幅（Ｂ－ｗａｖｅ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）の増加が観察された（それぞれ、Ｐ＜０．０００１）。

実施例１３：選別された抗Ａｎｇ２抗体の抗腫瘍効能分析（ＴＮＢＣモデル）
抗Ａｎｇ２抗体の新生血管形成の抑制効能があるかどうか確認するために、ヒト由来三重陰性乳癌（ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，ＴＮＢＣ）モデル（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）で抗腫瘍効力試験を行った。抗Ａｎｇ２抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ヒト由来乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１を左横腹に移植したＮＳＧマウスにおいて、アイソタイプコントロール（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）、ネスバクマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、抗Ａｎｇ２抗体治療剤の微静脈投与による抗癌薬効を評価しようとした。実験は、米国Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙに依頼して行った。

ヒト由来乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を解凍（ｔｈａｗｉｎｇ）した後、ＣＯ_２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ，ＵＳＡ）内で温度３７℃とＣＯ_２濃度５％にして培養した。培養最終日に全ての癌細胞を回収して計数し、無血清培地（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）を用いて細胞濃度を１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調節した。このように調節された細胞培養液を、マウス左横腹に０．１ｍｌ（１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）ずつ注入した。マウスの群分離は、腫瘍の体積が１００～１５０ｍｍ^３になる時、各処理群当たり８匹ずつジグザグ方式で群分離を行った。群分離直後に薬物の投与を始めた。陰性対照群にはアイソタイプコントロールを１０ｍｇ／ｍｌ、抗Ａｎｇ２抗体処理群には３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、ネスバクマブ処理群には３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌをそれぞれ週２回の頻度で３週間静脈注射方式で投与した。薬物投与後に週２回ずつ２０日間、腫瘍体積を測定した。測定過程中にマウスの臨床的毒性反応は示さなかった。抗Ａｎｇ２抗体の抗腫瘍効果は、１０ｍｇ／ｋｇ処理群において約７０％の腫瘍成長抑制効果を示し、対照薬物であるネスバクマブ１０ｍｇ／ｍｌ処理群に比べて約２倍の抗腫瘍効果を示した。腫瘍体積の計算式は、次の通りである。腫瘍体積（ＴＶ）＝幅２×長さ×０．５２。各個体別重さは平均で５％程度の均一な増加傾向を示すことから、特に毒性反応はないことが確認された（図１２）。

本発明に係る抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合断片は、Ａｎｇ２に目的とする結合力を示し、目的とする癌／腫瘍又は血管新生阻害剤及びアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の予防又は治療に有用に用いることができる。本発明によって既存のＡｎｇ２を標的とする治療剤とは異なる標的ポイントを持つ治療剤を開発することにより、腫瘍の治療において既存治療剤との併用治療及び単独治療法を提供することができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

Claims (15)

1. 配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
   配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号５３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
   を含む、Ａｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２）に結合する抗体又はその抗原結合断片。
2. 配列番号３２、３６、４０、４４、４８、５５、５７、５９及び６１からなる群から選ばれる重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
3. 配列番号３４、３８、４２、４６及び５０からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
5. 重鎖可変領域をコードする配列番号３１、３５、３９、４３、４７、５４、５６、５８及び６０からなる群から選ばれる、請求項４に記載の核酸。
6. 軽鎖可変領域をコードする配列番号３３、３７、４１、４５及び４９からなる群から選ばれる、請求項４に記載の核酸。
7. 請求項４に記載の核酸を含む発現ベクター。
8. 請求項７に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
9. 次の段階を含む、Ａｎｇ２に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
   （ａ）請求項８に記載の細胞を培養する段階；及び
   （ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
10. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、アンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の予防又は治療用組成物。
11. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、血管新生阻害用組成物。
12. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、アンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成と関連した疾病の診断用組成物。
13. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、眼疾患予防又は治療用組成物。
14. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、腫瘍又は癌の予防又は治療用組成物。
15. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む併用投与用組成物。

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