JP2023528479A - 肺がん及び前立腺がんの治療に使用するダクラタスビル - Google Patents

Abstract

本発明は、がん、好ましくは肺がん及び／又は前立腺がん、より好ましくはエンザルタミド耐性前立腺がんの治療及び／又は予防に使用するためのダクラタスビル（ＤＣＶ）を開示する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月５日に出願された米国仮特許出願第６３／０３５，３５３号の優先権の利益を主張し、その全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

特に、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）の使用を含む、がんを予防及び／又は治療するための新しい方法が記載され、特許請求され、非がん細胞と比較してより高いレベルのＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）を発現するがんを有する、それを必要とする対象におけるその使用が同様に記載され、特許請求される。

エンザルタミド（Ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ）は、前立腺がんの治療に使用されるアンドロゲン受容体阻害剤である。患者は治療に対する初期応答を示すが、エンザルタミドに対する耐性が発現し得る。エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）は、不治の終末期疾患であり、そのための好適な標的又は薬剤は現在利用可能ではない。したがって、がんの治療において実施可能な新しい治療的アプローチの同定の必要性が存在する。

肺がんは、世界におけるがん関連死亡の主な原因である。標的療法の最近の発展は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）における治療パラダイムの変化をもたらした。Ｍｏｋ ＴＳ，Ｗｕ ＹＬ，Ｔｈｏｎｇｐｒａｓｅｒｔ Ｓ，Ｙａｎｇ ＣＨ，Ｃｈｕ ＤＴ，Ｓａｉｊｏ Ｎ，Ｓｕｎｐａｗｅｒａｖｏｎｇ Ｐ，Ｈａｎ Ｂ，Ｍａｒｇｏｎｏ Ｂ，Ｉｃｈｉｎｏｓｅ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ Ｙ，Ｏｈｅ Ｙ，Ｙａｎｇ ＪＪ，Ｃｈｅｗａｓｋｕｌｙｏｎｇ Ｂ，Ｊｉａｎｇ Ｈ，Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ＥＬ，Ｗａｔｋｉｎｓ ＣＬ，Ａｒｍｏｕｒ ＡＡ，Ｆｕｋｕｏｋａ Ｍ．Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｏｒ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ－ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９ Ｓｅｐ ３；３６１（１０）：９４７－５７。Ｍａｅｍｏｎｄｏ Ｍ，Ｉｎｏｕｅ Ａ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ，Ｓｕｇａｗａｒａ Ｓ，Ｏｉｚｕｍｉ Ｓ，Ｉｓｏｂｅ Ｈ，Ｇｅｍｍａ Ａ，Ｈａｒａｄａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ｈ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｉ，Ｆｕｊｉｔａ Ｙ，Ｏｋｉｎａｇａ Ｓ，Ｈｉｒａｎｏ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｋ，Ｈａｒａｄａ Ｔ，Ｏｇｕｒａ Ｔ，Ａｎｄｏ Ｍ，Ｍｉｙａｚａｗａ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｓａｉｊｏ Ｙ，Ｈａｇｉｗａｒａ Ｋ，Ｍｏｒｉｔａ Ｓ，Ｎｕｋｉｗａ Ｔ；Ｎｏｒｔｈ－Ｅａｓｔ Ｊａｐａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｏｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｅｄ ＥＧＦＲ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊｕｎ ２４；３６２（２５）：２３８０－８。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であるゲフィチニブ及びエルロチニブ、並びに未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）ＴＫＩであるクリゾチニブは、ＥＧＦＲ変異又はＡＬＫ遺伝子再構成を有するＮＳＣＬＣ患者において臨床活性を示した。Ｋｗａｋ ＥＬ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｃａｍｉｄｇｅ ＤＲ，Ｓｈａｗ ＡＴ，Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｂ，Ｍａｋｉ ＲＧ，Ｏｕ ＳＨ，Ｄｅｚｕｂｅ ＢＪ， Ｊａｎｎｅ ＰＡ，Ｃｏｓｔａ ＤＢ，Ｖａｒｅｌｌａ－Ｇａｒｃｉａ Ｍ，Ｋｉｍ ＷＨ，Ｌｙｎｃｈ ＴＪ，Ｆｉｄｉａｓ Ｐ，Ｓｔｕｂｂｓ Ｈ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｓｅｑｕｉｓｔ ＬＶ，Ｔａｎ Ｗ，Ｇａｎｄｈｉ Ｌ，Ｍｉｎｏ－Ｋｅｎｕｄｓｏｎ Ｍ，Ｗｅｉ ＧＣ，Ｓｈｒｅｅｖｅ ＳＭ，Ｒａｔａｉｎ ＭＪ，Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ Ｊ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＪＧ，Ｈａｂｅｒ ＤＡ，Ｗｉｌｎｅｒ Ｋ，Ｓａｌｇｉａ Ｒ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＧＩ，Ｃｌａｒｋ ＪＷ，Ｉａｆｒａｔｅ ＡＪ。したがって、肺がん及びエンザルタミド耐性前立腺がんにおける主要なドライバー遺伝子を同定し、各サブセットの患者に対する治療を開発することがより重要になっている。

本明細書に記載されるように、Ｔｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）は、エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）細胞の生存において役割を果たす。現在、ＴＲＩＢ２の阻害剤は存在しない。本開示は、抗ウイルス薬ダクラタスビル（ＤＣＶ）がＴＲＩＢ２タンパク質を阻害することができ、ＤＣＶが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、燕麦細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞（未分化）がん、乳頭がん、腺扁平上皮がん、カルチノイド腫瘍、腺様嚢胞がんリンパ腫、並びに肉腫及び肉腫様がんを含むがこれらに限定されない、ＥＲＰＣ細胞及びＴＲＩＢ２陽性肺がんを含むＴＲＩＢ２陽性がん細胞において抗腫瘍効果を示すことを実証する。様々な実施形態では、上記の肺がんは、ＴＲＩＢ２陽性肺がんである。本開示は、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）を治療を必要とする対象に投与することによって、前立腺がん、特にＥＲＰＣ、及び／又は肺がん等のＴＲＩＢ２陽性がんを治療するための有効な方法を提供する。

本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含む、方法を記載する。種々の実施形態では、がんは、ＴＲＩＢ２陽性がんである。

更に、本開示は、がんを治療する必要がある対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）を対象に投与することを含み、対象におけるがん細胞が、非がん性及び／又は非過剰増殖性であるがん細胞に隣接する同じ細胞型の細胞の対応する非がん細胞によって発現されるＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現する、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含む、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に治投与することを含み、がんが、前立腺がん又は肺がんである、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、対象が、治療を未だ経験していないか、又は抗がん剤で以前に治療されており、抗がん剤に対して難治性である、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）を投与することをがんに罹患している対象に含み、上記の抗がん剤が、アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）である、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんを患っている対象に投与することを含み、前立腺がんが、ＡＤＴに耐性であり、任意選択で、対象が、以前にＡＤＴで治療されており、がんが、ＡＤＴに対する耐性を発達させている、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、ＡＤＴが、薬学的ＡＤＴであり、任意選択で、薬学的ＡＤＴが、抗アンドロゲン薬による治療である。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、抗アンドロゲン薬が、エンザルタミドである、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんを罹患している対象に投与することを含み、がんが、エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）である、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、がんが、肺がんである、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんを患っている対象に投与することを含み、対象のがん由来のがん細胞が、対応する非がん細胞におけるＴＲＩＢ２のレベルと比較して、より高いレベルのＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）を発現する、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、（ｉ）がん細胞が、対象の対応する非がん細胞におけるＴＲＩＢ２のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現する、かつ／又は（ｉｉ）がん細胞が、がんに罹患していない対象に由来する対応する非がん細胞におけるＴＲＩＢ２のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現する、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、がん細胞及び非がん細胞が、同じ種類の組織に由来し、任意選択で、がん細胞及び非がん細胞が、前立腺組織に由来する、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、ＤＣＶが、併用療法の一部として投与され、任意選択で、併用療法が、ＤＣＶ及びエンザルタミドを含む、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、治療が、（ｉ）対象における腫瘍体積又は負荷の減少、（ｉｉ）対象における腫瘍成長の阻害、及び／又は（ｉｉｉ）対象の腫瘍におけるＴＲＩＢ２タンパク質のレベルの減少を含む、方法を記載する。

本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、対象におけるがん細胞が、対応する非がん細胞によって発現されるＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現する、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、対象におけるがん細胞が、対応する非がん細胞によって発現されるＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現し、（ｉ）対応する非がん細胞が、対象に由来し、かつ／又は（ｉｉ）対応する非がん細胞が、がんに罹患していない対象に由来する、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、対象におけるがん細胞が、対応する非がん細胞によって発現されるＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現し、がん細胞及び対応する非がん細胞が、前立腺組織に由来し、任意選択で、がん細胞及び対応する非がん細胞が、前立腺の細胞である、方法を記載する。

更に、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含み、対象におけるがん細胞が、対応する非がん細胞によって発現されるＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現し、がん細胞及び対応する非がん細胞が、肺組織に由来し、がん細胞が、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん、乳頭がん、腺がん、扁平上皮がん、細気管支肺胞上皮がん、及び大細胞がんであるか、又はそれらに由来する、方法を記載する。

図１Ａ～図１Ｃは、Ｔｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）を下方制御する化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングからの代表的な化合物を示す。図１Ａは、Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ融合構築物をトランスフェクトしたヒト***線維芽細胞（ＨＦＦ）細胞に対する１０４個のＦＤＡ承認化合物の代表的なセットの効果を示す表である。ここで、ダクラタスビル（ＤＣＶ）は赤で強調されている。右端の列は、１００％として採用される対照溶媒（０．４％ ＤＭＳＯ）処置に対して正規化された、所与の薬物処置後に残るルシフェラーゼ活性パーセントを示す。図１Ｂは、ダクラタスビル（ＤＣＶ）の化学構造を図示する。図１Ｃは、レジパスビル（ＬＤＶ）の化学構造を図示する。 図２Ａ～図２Ｂは、ＴＲＩＢ２陽性がん細胞に対するＤＣＶ対他の化合物の効果を示す。図２Ａは、１０μＭの種々の薬物で２４時間処理したＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞由来の溶解物のウエスタンブロットを示す。標識されたレーンは次の通りである：（１）対照、すなわち溶媒（０．４％ ＤＭＳＯ）処理（ＤＭＳＯは、試験化合物がＤＭＳＯ中に可溶化されるために対照として選択され、薬物とともに細胞に添加されたＤＭＳＯの最終濃度は約０．４％である）、（２）アンピロキシカム、（３）プラゾシン、（４）ダクラタスビル、（５）オルニプレシン、（６）レジパスビル、（７）ラパチニブ、（８）ヴォラパクサル、（９）ポナチニブ、（１０）ミアンセリン。図２Ｂは、示される用量のＤＣＶ又はＬＤＶで７２時間処理したＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞の細胞生存性を示す。結果を、対照処置細胞（すなわち、対照ＤＭＳＯ（０．４％）処置細胞）に正規化する。データは、３回の複製を表す。誤差バーは、平均からの標準偏差を表す。 図３Ａ～図３Ｄは、ＴＲＩＢ２陽性腫瘍細胞におけるＤＣＶのインビトロ処置効果を示す。図３Ａは、示された濃度のＤＣＶ又は対照（０．４％ ＤＭＳＯ）処理で２４時間処理されたＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞からの溶解物のウエスタンブロットを示す。図３Ｂは、軟寒天コロニー形成アッセイにおいて示された濃度のＤＣＶによるＥＲＰＣ細胞の処理を示す。図３Ｃは、対照又はＤＣＶ処理ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞のフローサイトメトリー分析によって測定されるアネキシンＶ結合を示す。図３Ｄは、エンザルタミド、ＤＣＶ、又はそれらの組み合わせで処理した後のＬＮＣａＰ細胞生存の阻害を示す。ここで、対照値（すなわち、溶媒のみ、約０．４％ ＤＭＳＯ処理を使用した結果）を各実験値から引いた。誤差バーは、標準誤差（ＳＥ）を示す。＊＊は、ｐ＜０．００５であり、＊＊＊は、ｐ＜０．０００５である。 図４Ａ～図４Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＥＲＰＣ腫瘍のＤＣＶ処置を用いたインビボ異種移植片研究の結果を示す。図４Ａは、ビヒクル又はＤＣＶ処置動物の平均腫瘍体積を示す（群当たりｎ＝３、＊＊ｐ＜０．００５）。誤差バーは、平均からの標準偏差を表す。図４Ｂは、処置の４週間で撮影した代表的なビヒクル処置及びＤＣＶ処置マウスを示す。図４Ｃは、モノクローナル抗Ｔｒｉｂ２抗体を使用したＩＨＣによる、ビヒクル及びＤＣＶ処置マウス腫瘍におけるＴＲＩＢ２タンパク質レベルを示す。 図５は、Ｔｒｉｂ２－Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ活性の阻害に基づいて化合物を選択するために使用されるが、Ｌｕｃ細胞においては使用されない、スクリーニング戦略を示す。スクリーニングした化合物は、Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ融合構築物をトランスフェクトしたＨＦＦ細胞上の１０４個のＦＤＡ承認化合物の代表的なセットを含んだ。細胞を化合物（１０μＭ）で２４時間処理し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のキットを使用してルシフェラーゼ活性を測定した。更なる開発のために、対照ルシフェラーゼをトランスフェクしたＨＦＦ細胞を用いて、選択された化合物を対応スクリーニングする。注釈：ダクラタスビルは、２４時間でＴｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性の７０％以上の阻害を示し、対応スクリーニング試験に合格した。 図６は、ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞におけるＴｒｉｂ２タンパク質レベルに対する（１）ＤＣＶ（１２μＭ）、又はシクロヘキシミド（ＣＨＸ）（１０μｇ／ｍＬ）の効果を示すウエスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。各レーン上の「＋」及び／又は「－」は、それぞれＤＣＶ又はＣＨＸの存在又は不存在を示す。 図７は、ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞におけるＴｒｉｂ２タンパク質レベルに対する（１）ＤＣＶ（１５μＭ）、又は（２）Ｃ_２６Ｈ_４１Ｎ_３Ｏ_５（ＣＡＳ番号１３３４０７－８２－６）（ベンジルＮ－［（２Ｓ）－４－メチル－１－［［（２Ｓ）－４－メチル－１－［［（２Ｓ）－４－メチル－１－オキソペンタン－２－イル］アミノ］－１－オキソペンタン－２－イル］アミノ］－１－オキソペンタン－２－イル］カルバメート）（「ＭＧ１３２」）（２．５μＭ）の効果を示すウエスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。各レーン上の「＋」及び／又は「－」は、それぞれＤＣＶ又はＣＨＸの存在又は不存在を示す。 図８は、示差走査分光法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｓｐｅｃｔｒｏ－ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）による純粋なＴｒｉｂ２タンパク質の熱シフトアッセイの結果を示すグラフを示す。ここで、結果は、ＤＣＶがＴｒｉｂ２の溶融曲線を左にシフトすることを示す。そして、Ｔｍは４１℃から３７℃に減少し、ＤＣＶによるタンパク質の不安定化が示唆された。 図９は、三次元ビューで提示される、Ｔｒｉｂ２（タンパク質）及びダクラタスビル（リガンド）の分子ドッキング分析の結果を示す。 図１０は、Ｔｒｉｂ２の二次構造並びにアミノ酸Ａｒｇ－１３２、Ｓｅｒ－１３３、Ｇｌｕ－１９４、Ｇｌｕ－１９７、及びＡｓｐ－１９８を強調する図で提示される、Ｔｒｉｂ２（タンパク質）及びダクラタスビル（リガンド）の分子ドッキング分析の結果を示す。 図１１は、リガンド及びＴｒｉｂ２のアミノ酸の空間配置を示す図で提示される、Ｔｒｉｂ２（タンパク質）及びダクラタスビル（リガンド）の分子ドッキング分析の結果を示す。 図１２は、ＤＣＶとＴＲＩＢ２との間の極性接触の確立を示す三次元モデルを示す。ここで、ＴＲＩＢ２のＡｒｇ－１３２、Ｓｅｒ－１３３、Ｇｌｕ－１９４、Ｇｌｕ－１９７、及びＡｓｐ－１９８残基は、ＤＣＶと水素結合を形成することが示された。 図１３は、ＤＣＶと相互作用する残基を含む、Ｔｒｉｂ２のアミノ酸配列を示す（赤色で強調表示）。 図１４は、対照で２４時間処理したＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞におけるアポトーシスを評価するフローサイトメトリーの結果を示す。細胞をＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５アネキシンＶで染色した。 図１５は、様々な用量の２４時間ダクラタスビルで処理したＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞におけるアポトーシスを評価するフローサイトメトリーの結果を示す。細胞をＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５アネキシンＶで染色した。 図１６は、ダクラタスビル（８μＭ）で処理した細胞と比較した対照細胞における細胞周期分布を要約したグラフを示す。 図１７は、ＤＮＡ分解アッセイによって測定したＤＣＶのアポトーシス効果を示すグラフを示す。 図１８は、Ｔｒｉｂ２を過剰発現させるために完全長ヒト遺伝子をトランスフェクトし、エンザルタミドで処理した前立腺がん細胞の結果を示すグラフを示す。興味深いことに、ＤＣＶ（６μＭ）でのＴｒｉｂ２の阻害は、耐性細胞を再びエンザルタミドに再び感受性にする。Ｔｒｉｂ２ ｓｉＲＮＡは、陽性対照として並列実験で使用した。誤差バーは、標準誤差（ＳＥ）を示す。＊は、ｐ＜０．０５であり、＊＊は、ｐ＜０．００５であり、＊＊＊は、ｐ＜０．０００５である。 図１９は、ＭＴＳ／ＰＥＳアッセイによって測定した、前立腺がん細胞の細胞生存を阻害するＤＣＶ及びエンザルタミドの相乗効果を示すグラフを示す。誤差バーは、標準誤差（ＳＥ）を示す。＊は、ｐ＜０．０５であり、＊＊は、ｐ＜０．００５であり、＊＊＊は、ｐ＜０．０００５である。 図２０は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＥＲＰＣ腫瘍増殖のＤＣＶ阻害を評価する異種移植片研究の処置タイムラインを示す。簡潔に述べると、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、高腫瘍原性Ｅ００６ＡＡ（Ｅ００６ＡＡ－ｈＴ）細胞（１匹のマウス当たり１×１０^６個）を皮下注入して、腫瘍を発達させ、次いで、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＤＣＶ又は溶媒で４週間にわたって経口的に処理した（ｎ＝３）。腫瘍サイズ及びマウスの体重を週に１回測定した。 図２１は、抗Ｔｒｉｂ２抗体で染色した腫瘍切片の免疫組織化学を示す。腫瘍の種類は以下の通りである：（１）ヒト患者肺腺がん、（２）ヒト患者肺乳頭がん、（３）ヒト患者肺扁平上皮がん、及び（４）ヒト患者肺腺がん。 図２２は、肺がん細胞株におけるＴｒｉｂ２タンパク質レベルを評価するウエスタンブロットを示す。各レーンは、以下の細胞株に対応している：ＮＣＩ－Ｈ２２６及びＳＫ－ＭＥＳ－１＝扁平上皮がん、ＮＣＩ－Ｈ２２２８＝非小細胞肺がん、並びにＮＣＩ－Ｈ５９６＝腺がん。 図２３は、ＤＣＶで処理した肺がん細胞株における７２時間の細胞生存アッセイの結果を示す。肺がん細胞株は、以下の通りである：ＮＣＩ－Ｈ２２６及びＳＫ－ＭＥＳ－１＝扁平上皮がん、ＮＣＩ－Ｈ２２２８＝非小細胞肺がん、並びにＮＣＩ－Ｈ５９６＝腺がん。誤差バーは、標準誤差（ＳＥ）を示す。 図２４は、転移性エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）を有する患者におけるダクラタスビル（ＤＣＶ）の第Ｉ相用量漸増試験のための用量漸増設計概略図を示す。「ＭＴＤ」＝最大忍容量、「ＰＫ」＝薬物動態。

定義
「組み合わせ」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上の治療剤の投与を指す。この用語は、治療剤の同時投与、別個の投与及び／又は連続投与を包含する。

本明細書で使用される「対応する非がん細胞」は、がん細胞への参照として使用される正常な非形質転換細胞であり、典型的には、それが比較されるがん細胞と同じ組織又は前駆細胞に由来する。対照的に、悪性の形質転換を受けた細胞は、がん細胞である。

本明細書で使用される場合、「由来する」という語句は、細胞に関する場合、細胞が由来する実体及び／又は位置を指す。例えば、細胞は、その細胞がその対象に見出されるか、又はその対象から採取される対象に由来し得る。細胞は、生検又は血液試料の採取による１つ以上の細胞の収集を含む、当該技術分野で既知の任意の方法によって対象に由来し得る。別の例として、細胞は、対象における特定の臓器又は組織に由来し得る。がんを有する患者において、がん細胞は、例えば、腫瘍生検を含む方法によって患者に由来し得る。別の例として、分化される細胞は、前駆細胞等の分化の少ない細胞に由来し得る。

「発現」という用語は、細胞又は細胞集団に関する場合、細胞又は細胞集団による遺伝子発現又はタンパク質産生を指す。本明細書で使用される場合、「発現する」又は「発現」は、以下のうちの１つ以上を指すことができる：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）、（３）ポリペプチド又はタンパク質へのＲＮＡの翻訳、（４）ポリペプチド又はタンパク質のフォールディン、並びに（５）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。本開示のいくつかの実施形態では、タンパク質は、異なる細胞において過剰発現され得るか、又はより高いレベルで発現され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、ＴＲＩＢ２）は、対応する非がん細胞等の非がん細胞と比較して、がん細胞において過剰発現され得るか、又はより高いレベルで発現され得る。

「阻害する」又は「の阻害」という用語は、測定可能な量だけ減少若しくは妨害することを意味し、又は完全に減少若しくは遮断することを意味する。本明細書で使用される阻害という用語は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の阻害又は低減を指すことができる。

本明細書で使用される「予防」という用語は、状態若しくはその生物学的発現の可能性若しくは重症度を実質的に減少させること、又はそのような状態若しくはその生物学的発現の開始を遅延させることを意図した予防的アプローチを指す。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含むよう意図されている。「対象」及び「患者」という用語は、互換的に使用され、ヒト患者、並びに非ヒト霊長類又は実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、及び他の動物を指すことができる。本開示の好ましい対象には、疾患又は障害の治療を必要とするヒト患者が含まれる。本明細書に記載される組成物及び方法は、Ｔｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）の阻害から利益を受ける疾患又は障害を有する対象の治療に好適である。本開示の対象は、肺がん及び／又は前立腺がん等のがんに罹患している患者であり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、肺がん、及び／又は前立腺がん、例えば、エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）の治療に特に好適である。

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、所望の生物学的又は治療的結果を付与するのに十分な量を指す。治療有効量の治療剤は、疾患、障害、及び／若しくは状態を治療し、疾患、障害、及び／若しくは状態の症状を改善し、疾患、障害、及び／若しくは状態を予防し、並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは状態の発症を遅延させることができる。がんに関して、治療有効量は、腫瘍を縮小させ、及び／又は腫瘍成長を抑制させるのに十分な量を含み得る。治療有効量は、望ましくない細胞増殖を予防若しくは遅延させるか、腫瘍の発達を遅延させるか、症状を改善するか、生存期間を延長するか、又はがん若しくは腫瘍の安定化を誘導することができる。治療有効量の治療剤又は治療剤の組み合わせは、以下のうちの１つ以上をもたらし得る：（ｉ）がん細胞の数を減少させること、（ｉｉ）腫瘍サイズを減少させること、（ｉｉｉ）末梢臓器へのがん細胞の浸潤を阻害すること、遅延させること、若しくは停止させること、（ｉｖ）腫瘍転移を阻害すること（すなわち、ある程度遅延させること、好ましくは停止させること）、（ｖ）腫瘍成長を阻害すること、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／若しくは再発を予防若しくは遅延させること、並びに／又は（ｖｉｉ）がんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度緩和すること。治療有効量は、１つ以上の投与において投与することができる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、単回用量で提供される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、複数の用量を含む投与レジメンで投与される。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び特定の組成物又は選択される投与経路等の因子に基づいて、対象を治療するための治療有効量を決定することができるであろう。

本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、有益な又は所望の結果、好ましくは、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチを指す。そのような有益な又は所望の臨床結果には、（１）状態（例えば、疾患）、状態の症状、若しくは状態の生物学的症状を治癒する（ｃｕｒｉｎｇ）、治癒する（ｈｅａｌｉｎｇ）、緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）、緩和する（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、変更する、修復する、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善する（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、妨害する、若しくは影響を与えること、（２）状態をもたらすか若しくはその原因となる生物学的カスケードにおける１つ以上の点を妨害すること、（３）疾患若しくは状態の症状、合併症、生物学的症状、及び／若しくは生化学的徴候の発症若しくは進行を予防する、遅くする、若しくは遅延させること、又は（４）その他では、疾患、状態、若しくは障害の更なる発達を阻止若しくは阻害することが含まれるが、これらに限定されない。本開示の組成物及び方法は、有益又は所望の結果を得ること、例えば、がん性細胞若しくは他の疾患細胞の増殖を低減すること（若しくはそれらを破壊すること）、がんに見出されるがん性細胞の転移を低減すること、腫瘍のサイズを縮小すること、疾患に起因する症状を低減すること、疾患に罹患している者の生活の質を向上させること、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量を低減すること、疾患の進行を遅延させること、及び／又は個体の生存性を延長することに適している。治療は、本明細書に記載の有益又は所望の結果を達成する目的で１つ以上の治療剤を投与することを含むことができる。

「腫瘍」及び「がん」という用語は、互換的に使用され、その成長、増殖、又は生存が、対応する正常細胞の成長、増殖、又は生存を上回る細胞又は細胞集団を指す。腫瘍又はがんにおける細胞又は細胞集団は、異常な成長を有し、典型的には、成長が制御されない。「悪性」という用語は、近傍組織に侵入する能力を有する腫瘍又はがん細胞の特性を指す。「転移」という用語は、対象内の他の部位、位置、又は領域への腫瘍、がん、又は新生物の拡散又は散在を指し、その部位、位置又は領域は、原発腫瘍又はがんとは異なる。

「耐性である」又は「耐性」という用語は、本明細書で使用される場合、（ｉ）対象における疾患若しくは状態、又は（ｉｉ）疾患若しくは状態の特性を有することを特徴とする細胞若しくは細胞集団が、特定の治療に応答しない状態を指す。疾患又は状態に罹患している対象は、疾患又は状態が治療に全く応答しないことを意味する、一次耐性を有する疾患又は状態を有し得る。あるいは、対象は、疾患又は状態が最初に治療に応答するが、後に耐性を発症することを意味する、二次的耐性を有する疾患又は状態を有し得る。細胞又は細胞集団はまた、一次耐性又は二次耐性を有し得る。細胞は、研究目的のために特定の治療に耐性であるように改変され得る。本開示で使用される場合、耐性とは、単離されているか又はがんに罹患している対象における疾患若しくは状態に関連している、がん細胞又はがん細胞集団であって、特定の治療に応答しない、がん細胞又はがん細胞の集団を指す。

本明細書で使用される場合、「約」は、値の測定又は決定方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従って、１以内の又は１より大きい標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は最大２０％の範囲を意味し得る。本出願及び特許請求の範囲において特定の値が提供される場合、別段の記載がない限り、「約」の意味は、その特定の値の許容誤差範囲内であるとみなすべきである。

本明細書で使用される場合、「有効量」は、治療される患者に治療効果を付与するために必要な量として定義され、典型的には、患者の年齢、表面積、体重、及び状態に基づいて決定される。動物及びヒトに対する投与量の相互関係（体表面積１平方メートル当たりのミリグラムに基づく）は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．，５０：２１９（１９６６）に記載されている。体表面積は、患者の身長及び体重からおよそで決定され得る。例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｓｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５３７（１９７０）を参照されたい。本明細書で使用される場合、「患者」は、ヒトを含む哺乳動物を指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」には、活性成分と組み合わせた場合、成分が生物学的活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と非応答性であり、生理学的に適合性であり、非毒性であり、当業者に既知であるように、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩の作用機序を妨げない、任意かつ全ての溶媒、希釈剤、担体、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことができる、任意の材料が含まれる（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照されたい）。

好ましくは、薬学的に許容される賦形剤は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に好適である。投与経路に応じて、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩は、酸の作用及び化合物を不活性化し得る他の天然条件から化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。薬学的に許容される賦形剤は、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で既知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物と適合性のない場合を除いて、本開示の医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的な活性化合物も組成物に組み入れることができる。

「安定的又は化学的に実現可能な」という語句は、本明細書で使用される場合、製造、検出、並びに好ましくは回収、精製、及び本明細書に開示される１つ以上の目的のための使用を可能にする条件に供されたときに実質的に変更されない化合物を指す。いくつかの実施形態では、安定な化合物又は化学的に実現可能な化合物は、少なくとも１週間、水分又は他の化学反応性条件の不在下で、４０℃以下の温度で維持されるときに実質的に変化しない化合物である。

本開示の治療方法は、安全かつ有効量の本明細書に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与することを含む。

「等」は、「等であるが、これに限定されるものではない」と同じ意味を有する。同様に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、「含むが、これらに限定されない」と同じ意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含むがこれらに限定されない」と同じ意味を有する。

「腫瘍」、「がん」及び「新生物」という用語は、互換的に使用され、その成長、増殖又は生存が正常な対応する細胞の成長、増殖、又は生存性を上回る細胞又は細胞集団、例えば、細胞増殖性又は分化性障害を指す。典型的には、成長が制御されないことである。「悪性腫瘍」という用語は、近傍組織への侵入を指す。「転移」という用語は、対象内の他の部位、位置、又は領域への、腫瘍、がん、又は新生物の拡散又は散在を指し、その部位、位置、又は領域は、原発腫瘍又はがんとは異なる。

更に、別段で記載されない限り、本明細書に示される構造はまた、１つ以上の同位体に富む（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ）原子の存在のみ異なる化合物を含むことを意味する。本発明の化合物及びその薬学的に許容される塩に組み込まれ得る同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、ヨウ素、及び塩素の同位体、例えば、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７０、１８０、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、１２３Ｉ、及び１２５Ｉが含まれる。

上記の同位体及び／又は他の原子の他の同位体を含む本発明のＤＣＶ及びＤＣＶの薬学的に許容される塩は、本発明の範囲内である。本発明の同位体標識化合物、例えば、３Ｈ及び１４Ｃ等の放射性同位体が組み込まれた化合物は、薬物及び／又は基質の組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム化水素（３Ｈ）及び炭素－１４（１４Ｃ）同位体は、それらの調製の容易性及び検出可能性のために特に好ましい。１１Ｃ及び１８Ｆ同位体は、ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）において特に有用であり、１２５Ｌ同位体は、ＳＰＥＣＴ（単一光子放出コンピュータ断層撮影）において特に有用であり、これらは全て、脳撮像において有用である。更に、重水素（２Ｈ）等のより重い同位体での置換は、より高い代謝安定性、例えば、インビボ半減期の増加又は必要な用量の減少から生じる特定の治療上の利点を提供することができ、いくつかの状況において好ましい場合がある。本発明の同位体標識化合物は、概して、スキーム及び／又は実施例で開示される手順を行い、容易に入手可能な同位体標識試薬を非同位体標識試薬に置き換えることによって調製することができる。

別段で記載されない限り、本明細書に示される構造はまた、構造の全ての異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び幾何学的（又は立体配座））形態を含むことを意味する。「異性体」とは、同一の組成及び分子量を有するが、物理的及び／又は化学的特性が異なる化合物、例えば（Ｚ）及び（Ｅ）二重結合異性体、並びに（Ｚ）及び（Ｅ）立体構造異性体を指す。構造的差異は、構成（幾何異性体）又は偏光平面を回転させることができること（立体異性体）であり得、例えば、各不斉中心のＲ及びＳ構成である。本発明の化合物は、キラル中心とも称される１つ以上の不斉中心を含み得、したがって、個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、若しくは他の立体異性体形態として、又はそれらの混合物として存在し得る。全てのそのような異性体形態は、それらの混合物を含む本発明に含まれる。キラル中心はまた、アルキル基等の置換基に存在し得る。

本発明のＤＣＶ又は本明細書に示される任意の化学構造に存在するキラル中心の立体化学が特定されていない場合、構造は、任意の立体異性体及びそれらの全ての混合物を包含することが意図される。したがって、１つ以上のキラル中心を含む本発明の化合物は、ラセミ混合物、エナンチオマー的に豊富化された（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ）混合物、又はエナンチオマー的に純粋な個々の立体異性体として使用され得る。

１つ以上の不斉中心を含む本発明の化合物の個々の立体異性体は、当業者に既知の方法によって分解され得る。例えば、そのような分解は、（１）ジアステレオ異性体塩、複合体、若しくは他の誘導体の形成、（２）例えば、酵素的酸化若しくは還元による、立体異性体特異的試薬との選択的応答、又は（３）キラル環境、例えば、結合したキラルリガンドを有するシリカ等のキラル支持体上、若しくはキラル溶媒の存在下における、ガス－液体若しくは液体クロマトグラフィーによって行われ得る。当業者は、所望の立体異性体が上記の分離手順のうちの１つによって別の化学物質に変換される場合、所望の形態を遊離するために更なるステップが必要であることを理解するであろう。あるいは、特定の立体異性体は、光学活性試薬、基質、触媒、若しくは溶媒を使用した不斉合成によって、又は不斉変換によって一方のエナンチオマーを他方に変換することによって合成され得る。

別段で記載しない限り、本発明の化合物の全ての互変異性形態は、本発明の範囲内である。

本明細書に開示される任意の数値範囲は、別段で明記しない限り、上限及び下限並びに各介在値を包含する。実施例において又は別段で示されている場合を除き、本明細書及び特許請求の範囲において使用される数値（例えば、成分の量、反応条件を表す数値）は、「約」という用語によって修飾される。したがって、反意が示されない限り、そのような数値は、取得しようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとする試みとしてではなく、各数値パラメータは、有効桁の数及び通常の四捨五入技術に照らして解釈されるべきである。

開示された主題の範囲を示す数値パラメータは近似値であるが、実施例に記載された数値はできるだけ正確に報告される。しかしながら、任意の数値には、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必ず生じる特定の誤差が含まれる。

別段で定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語の意味は、開示される主題が属する当業者に一般に理解されるものである。

ダクラタスビル（本明細書で「ＤＣＶ」と同義に称される）は、ＦＤＡによって承認され、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療するために、他の抗ウイルス剤と組み合わせて一般的に使用される経口利用可能な抗ウイルス化合物であるＭａｒｇｕｓｉｎｏ－Ｆｒａｍｉｎａｎ，Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．（２０１９）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｄａｃｌａｔａｓｖｉｒ／ｓｏｆｏｓｂｕｖｉｒ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｉｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ３ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｒｅａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｒｅｖ Ｅｓｐ Ｑｕｉｍｉｏｔｅｒ．３２（２）：１３７－１４４。ＤＣＶは、ＩＵＰＡＣ公式名を有する：４，４’－ビス［２－（（２Ｓ）－１－｛（２Ｓ）－２－［（メトキシカルボニル）アミノ］－３－メチルブタノイル｝－２－ピロリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－１，１’－ビフェニル、ＣＡＳ番号１００７８８４－６０－７。「ＤＣＶ」という用語はまた、本明細書で定義及び例示されるＤＣＶの薬学的に許容される塩を含む。

前立腺がんの治療
世界的に、前立腺がんは男性で２番目に一般的ながんである。前立腺がんは、前立腺の細胞が変異してがん細胞に変化するときに発達する。がん細胞が制御不能に***し、周囲の前立腺組織に広がると、腫瘍が形成される。いくつかの場合には、腫瘍は成長を続け、原発部位から体内の異なる部位に広がり、このプロセスは転移と呼ばれる。前立腺がん細胞は、近くの臓器に侵入することができ、血流及びリンパ系に侵入することができる。前立腺がんの転移の一般的な部位は、骨及びリンパ節である。

前立腺がんの臨床評価及び管理
前立腺がんの初期評価には、がんの拡大の程度を判断するための臨床病期分類が含まれる。臨床病期分類は、疾患のリスク階層化に重要であり、臨床医が疾患予後を評価するのに役立つ。

いくつかの試験が、前立腺がんの検出、診断、及びリスク層別化のために利用可能である。これらには、デジタル直腸検査、血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の評価、画像撮影、及び生検が含まれる。画像撮影は、疾患が局所的又は転移性であるかどうかを判断するのに役立つ。生検は、前立腺がんの診断を確認するために使用される。ゲノムプロファイリング及び組織ベースの分子アッセイも、疾患評価のために利用可能である。これらの試験に加えて、疾患の初期管理及び評価において考慮される他の要因には、患者の年齢、寿命、全医学的状態、症状の有無、及び異なる治療選択肢に対する患者の好みが含まれる。

診断された前立腺がんの治療計画は、管理及び／又は根治的治療を含み得る。前立腺がんの管理は、積極的監視又は注意深い待機を伴う。積極的監視は、がんの拡散を防止することを目的としており、慎重な監視と組み合わせた即時療法の延期を伴う。積極的監視を追跡する過程で疾患進行リスクの増加の証拠がある場合、根治的治療を開始することができる。注意深く待機することは、積極的監視とは異なり、上記の根治的治療を放棄し、症状を緩和するための全身又は局所治療を提供するという最初の決定を伴う。前立腺がんの根治的治療には、手術、放射線療法、ホルモン療法、又は化学療法が含まれる。疾患が骨に広がった場合、鎮痛薬、ビスホスホネート、及び標的療法を含む他の治療は、ケアの一部として考慮される。

リスク層別化は、前立腺がんの治療決定に情報を与える。臨床的に局所的な、非常に低リスク、及び低リスクの前立腺がんについては、積極的監視が適切なアプローチであり得る。一部の患者については、根治的前立腺切除術、小線源治療、又は放射線療法を含む根治的療法も適切であり得る。例えば、最初に非常に低リスクの疾患を有すると考えられた患者については、疾患の進行の可能性が高い場合又は進行の証拠が存在する場合に、根治的療法を開始することができる。両方の症例（臨床的に局所的な、非常に低リスクかつ臨床的に局所的な、低リスクの前立腺がん）において、治療アプローチの決定は、各治療アプローチのリスク及び利点、並びに患者の個々の好みを考慮する。臨床的に局所的な場合、中リスク前立腺がん、放射線療法、及び根治的前立腺切除術はいずれも適切な選択肢である。積極的監視は、好ましい中等度リスクの疾患を有する患者のための選択肢として提供されるが、この選択肢は、根治的治療と比較して転移を発症するリスクを増加させる。臨床的に局所的又は局所進行であるリスクの高い前立腺がんの場合、治療選択肢には、放射線療法、小線源治療、及びアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）等のホルモン療法が含まれる。局所進行性かつ非常に危険性の高い前立腺がんを有する一部の患者には、拡張リンパ節の切除を伴う根治的前立腺全摘除術も選択肢である。ステージＩＶ（転移性）疾患は、患者が臨床リンパ節関与又は播種性転移を有する場合に分類される。臨床リンパ節関与を有する患者の典型的な治療は、根治的放射線療法及びＡＤＴである。播種性疾患の場合、初期治療アプローチは、通常、ホルモン療法／ＡＤＴであり、これは、ドセタキセル等の化学療法と組み合わされ得る。

前立腺がん治療のためのアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）
アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）は、テストステロン等のアンドロゲンホルモンのレベルを低下させ、それによって、成長のためにアンドロゲンホルモンに依存する前立腺がん細胞を標的化する。外科的ＡＤＴは、外科的去勢を伴い、したがって積極的かつ永続的な治療方法とみなされる。薬学的ＡＤＴには、化学的去勢及び抗アンドロゲン薬による治療が含まれる。化学的去勢には、ＬＨＲＨアゴニスト及びアンタゴニストが含まれ、これらは両方ともテストステロン産生量を低下させる。ＡＤＴに使用されるＬＨＲＨアゴニスト及びアンタゴニストの例には、ロイプロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ヒストレリン、ブセレリン、及びデガレリクスが含まれる。抗アンドロゲン薬は、身体がアンドロゲンを使用することができることを妨げることによって機能する。例えば、抗アンドロゲン薬はテストステロンのアンドロゲン受容体への結合を防止する。前立腺細胞に見られるアンドロゲン受容体へのテストステロンの結合は、成長を促進し、かつ、前立腺分化を維持するシグナル伝達を開始する。しかしながら、これらの成長促進シグナルは、がん細胞の関連において発がん性である。抗アンドロゲン薬は、テストステロン合成及びアンドロゲン受容体核移行を標的化することもできる。抗アンドロゲン薬の例は、エンザルタミド、酢酸シプロテロン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸アビラテロン、セビテロネル、アパルタミド、及びダロルタミドである。

エンザルタミド耐性前立腺がん
エンザルタミドは、去勢耐性前立腺がん（ＣＲＰＣ）及び転移性去勢感受性前立腺がん（ｍＣＳＰＣ）の患者の治療に適応される、非ステロイド性抗アンドロゲン（ＮＳＡＡ）薬である。エンザルタミドは、アンドロゲン受容体阻害剤として機能し、腫瘍細胞におけるアンドロゲン受容体シグナル伝達経路の複数の工程に影響を与えると考えられる。一部の患者は治療に対する初期応答を示すが、エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）は臨床的に文書化されている。

ＥＲＰＣは、悪性腫瘍の中で最も致命的な形態の１つであり、骨転移及び最終的な死のために耐え難い痛み及び苦痛の原因である。現在、ＥＲＰＣのために利用可能な有効な治療はなく、ほとんどの前立腺がんによる死は、エンザルタミド耐性型の侵襲性前立腺がんのために起こる。

エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）の分子標的としてのＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）
Ｔｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）は、ＴＲＩＢ２遺伝子によってヒトでコードされる偽キナーゼである。ＴＲＩＢ２は、触媒的に障害がある偽キナーゼドメインを有し、かつ、非常に低いホスホトランスフェラーゼ活性を有するか又はホスホトランスフェラーゼ活性を全く示さない、セリン／スレオニン偽キナーゼの哺乳類Ｔｒｉｂｂｌｅｓファミリー（ＴＲＩＢ１、ＴＲＩＢ２、及びＴＲＩＢ３）に属する。ＴＲＩＢタンパク質は、基質タンパク質のユビキチン化及びその後のプロテアソーム分解を媒介する足場タンパク質として機能すると考えられている。タンパク質安定性の関連での役割に加えて、ＴＲＩＢタンパク質はまた、規範的なＡＫＴ経路等のシグナル伝達経路の活性を調節することが認識されている。

ＴＲＩＢ２の調節不全は、白血病、黒色腫、肺がん、及び肝臓がんを含む様々な悪性腫瘍に関連付けられている。しかしながら、発がん性タンパク質として関与しているにもかかわらず、ＴＲＩＢ２に関連する発がん性メカニズム及び治療機会をよりよく理解するために利用可能な標的検証された（ｔａｒｇｅｔ－ｖａｌｉｄａｔｅｄ）小分子化合物の欠如が存在する。

本明細書に記載されるように、ＴＲＩＢ２は過剰発現されており、エンザルタミド耐性型前立腺がん（ＥＲＰＣ）細胞の生存において重要な役割を果たす。ｓｈＲＮＡによるＴｒｉｂ２の阻害は、アポトーシスを引き起こすことによってＥＲＰＣ細胞を死滅させる。これらの観察及び本開示の実施例は、ＥＲＰＣの治療のための新しい分子標的としてのＴＲＩＢ２を追求するための説得力のある動機を提供する。

ＴＲＩＢ２阻害剤を同定するために使用され得るツール、薬剤、及び方法が本開示において提供される。非限定的な例として、ＴＲＩＢ２レベル及び／又は活性の読み出しと組み合わせて既存の低分子を使用するハイスループット薬物スクリーニングを使用して、ＴＲＩＢ２の阻害剤を同定し得る。検出可能な形態のＴＲＩＢ２タンパク質を発現するように改変された細胞、又は高レベルのＴＲＩＢ２タンパク質を通常で発現する細胞を含む、様々な細胞株を使用して、提供される方法に従ってＴＲＩＢ２阻害剤を同定し得る。初期スクリーニングからのヒットの検証を行い、同定されたＴＲＩＢ２阻害剤の有効性を特徴付ける及び／又は確認することができる。検証方法の例には、ＴＲＩＢ２レベルを検出するためのイムノアッセイ、ＴＲＩＢ２機能を必要とする細胞を使用する細胞生存性アッセイ、及びＴＲＩＢ２機能に依存する腫瘍細胞に対する推定ＴＲＩＢ２阻害剤の効果を決定するためのインビボアッセイが含まれる。

前立腺がん治療のための抗ウイルス薬ダクラタスビル（ＤＣＶ）の別目的利用
ダクラタスビル（ＤＣＶ）は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症の治療に使用される
ダクラタスビル（ＤＣＶ）は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療するために他の抗ウイルス剤と組み合わせて一般的に使用されるＦＤＡ承認された経口利用可能な抗ウイルス化合物である。ＤＣＶは、以下のＩＵＰＡＣ公式名を有する：４，４’－ビス［２－（（２Ｓ）－１－｛（２Ｓ）－２－［（メトキシカルボニル）アミノ］－３－メチルブタノイル｝－２－ピロリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－１，１’－ビフェニル、ＣＡＳ番号１００７８８４－６０－７。ＤＣＶは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａから市販されている（製品ＩＤ：ＡＤＶ４６５７４９２０７－１０ＭＧ、販売会社ＳＫＵ：１０３１０－１０ＭＧ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ，ＵＳＡ））

ＤＣＶは、直接結合によって、ＨＣＶ非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）を阻害する。ＮＳ５Ａは、ＨＣＶ複製に重要である。ＮＳ５Ａタンパク質の活性を阻害することにより、ＤＣＶは、ウイルスＲＮＡ複製複合体の破壊、ウイルスＨＣＶ ＲＮＡ産生の妨害、及びウイルス複製の阻害を引き起こす。ＨＣＶ感染のためにＤＣＶと併用される他の薬剤には、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂタンパク質）の阻害剤であるソホスブビル、及びヌクレオシド類似体であるリバビリンが含まれる。ＤＣＶは、フェニトイン、カルバマゼピン、リファンピン、及びセントジョンズワートを含むＣＹＰ３Ａを強く誘導する薬物と組み合わせることは禁忌である。

ソホスブビルと組み合わせた、かつ、リバビリンと組み合わせた、又はリバビリンとの組み合わせなしのＤＣＶの有効性は、３つの第３相臨床試験であるＡＬＬＹ－１、ＡＬＬＹ－２、及びＡＬＬＹ－３で評価された。ＡＬＬＹ－１は、慢性ＨＣＶ感染及びＣｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ Ａ、Ｂ、又はＣ肝硬変、又は肝移植後のＨＣＶ再発を有する対象において、ＤＣＶ、ソホスビル、及びリバビリンを評価した。ＡＬＬＹ－２は、慢性Ｃ型肝炎及びＨＩＶ共感染を有する対象においてＤＣＶ及びソホスブビルを評価した。ＡＬＬＹ－３は、治療を未だ受けていないか、又は治療を経験した、慢性ＨＣＶ遺伝子型３型感染及び代償性肝疾患を有する対象においてＤＣＶ及びソホスブビルを評価した。１５２名の患者において１日１回６０ｍｇの経口投与を１２週間使用した、ＡＬＬＹ－３の無作為化、多施設、非盲検、実薬対照臨床試験（ＮＣＴ０２３１９０３１）に基づき、ＤＣＶは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染のための使用の承認を２０１５年７月に与えられた。

がんの治療としてのダクラタスビル（ＤＣＶ）の適用
エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）の治療としてのダクラタスビル（ＤＣＶ）の適用
本開示は、ＤＣＶがＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）を阻害することができることを実証する。上記で論じたように、ＴＲＩＢ２は、様々な悪性腫瘍と関連し、本開示によれば、エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）のための提案された分子標的である。したがって、本開示によれば、ＤＣＶ治療は、ＥＲＰＣ等のＴＲＩＢ２過剰発現がんに対して別目的利用することができる。

本明細書に示されるように、ＴＲＩＢ２タンパク質レベルは、対照で処置されたヒトＥＲＰＣ細胞と比較して、ＤＣＶ処置されたヒトＥＲＰＣ細胞で低下する。ＤＣＶは、ＥＲＰＣ細胞の生存能を低下させ、急速なアポトーシス細胞死を誘導する。ＴＲＩＢ２タンパク質レベルの観察された低下及びアポトーシス死は、マイクロモル濃度のＤＣＶで生じる。ＥＲＰＣ細胞とは対照的に、ＤＣＶは、同じ実験条件下で正常な非がん細胞に対しては最小限の効果しか示さない。

一態様では、本開示は、がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんの予防又は治療方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）を過剰発現するか、又はＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）のより高い発現レベルを有するがんを予防又は治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、前立腺がんを予防又は治療する方法を提供する。本開示の方法に従って治療され得る前立腺がんには、アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）（例えば、エンザルタミド）で以前に治療されたがん、ＡＤＴに耐性のがん、又はＡＤＴで以前に治療され、かつ、ＡＤＴ治療に対する耐性を発達させたがんが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＣＶは、本開示に従って、エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）を治療するために使用することができる。

いくつかの実施形態では、ＤＣＶは、がん細胞（例えば、ＴＲＩＢ２及び／又は前立腺がん細胞を過剰発現するがん細胞）を選択的に攻撃する。いくつかの実施形態では、ＤＣＶは、非がん細胞に最小限の影響しか与えない。いくつかの実施形態では、ＤＣＶは、低レベルのＴＲＩＢ２を発現又は発現しない細胞に最小限の影響しか与えない。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、対象における腫瘍体積又は負荷の低減、対象における腫瘍成長の阻害、又は腫瘍におけるＴＲＩＢ２タンパク質のレベルの低下に有用であり得る。

医薬的に許容される組成物及び製剤
ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩は、治療又は予防有効量の化合物又は塩、及び１つ以上の薬学的に適合性の（許容される）成分を含む医薬組成物として製剤化することができる。いくつかの態様では、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩及び薬学的賦形剤の医薬組成物であって、有効量の化合物又は塩が、哺乳動物への投与に好適な賦形剤と混合されている、医薬組成物が提供される。好ましい態様では、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩は、ヒトへの投与用に製剤化される。本開示は、それを必要とするヒト対象に投与するために製剤化された、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を提供する。ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩を含む製剤化組成物は、一般に、１つ以上の薬学的に適合性の（許容される）成分を含む。

例示的な医薬組成物又は非医薬組成物は、典型的には、１つ以上の担体（滅菌液体、例えば、水、及び石油、動物、植物、又は合成由来の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む油）を含む。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合、より典型的な担体である。生理食塩水並びにデキストロース及びグリセロー水溶液が、液体担体、特に注射可能溶液のための担体として好ましく使用される。好適な賦形剤には、例えば、アミノ酸、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。必要に応じて、組成物は、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝剤を少量含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、持続放出製剤等の形態をとることができる。好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、典型的には、対象への適切な投与のための形態を提供するために、好適な量の担体とともに、治療有効量の精製形態のＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩を含む。製剤は、投与様式に対応する。

薬学的に許容される担体又はビヒクルは、組成物が例えば錠剤又は粉末の形態であるように、粒子状であり得る。担体は、液体であり得、組成物は、例えば、経口シロップ、香味水、又は注射可能な液体である。

経口投与が意図される場合、組成物は、固体又は液体の形態であることが好ましく、半固体、半液体、懸濁液、及びゲルの形態が、本明細書で固体又は液体のいずれかとみなされる形態に含まれる。

経口投与のための固体組成物として、組成物は、散剤、粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル、咀嚼剤、ウエハー（ｗａｆｅｒ）等の形態に製剤化することができる。このような固体組成物は、典型的には、１つ以上の不活性希釈剤を含む。更に、以下のうちの１つ以上が存在し得る：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、又はゼラチン等の結合剤、デンプン、ラクトース、又はデキストリン等の賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｘ等の滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤、スクロース又はサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料等の香料、及び着色剤。

組成物は、カプセル、例えばゼラチンカプセルの形態である場合、上記の種類の材料に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、又は脂肪油等の液体担体を含むことができる。

組成物は、液体、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、乳濁液、又は懸濁液の形態であり得る。液体は、経口投与又は注射による送達に有用であり得る。経口投与を目的とする場合、組成物は、甘味剤、防腐剤、染料／着色剤、及び香味増強剤のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの態様では、組成物は粉末に製剤化され、最終使用者は経口投与のために水溶液中で粉末を混合する。（上記の）注射による投与のための組成物には、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤、及び等張剤のうちの１つ以上も含まれ得る。

カプセル剤の組成物及び調製は、当技術分野で周知である。例えば、カプセル剤は、ゼラチン（例えば、Ａ型、Ｂ型）、カラギーナン（例えば、カッパ、イオタ、ラムダ）、及び／又は修飾セルロース（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート）、及び任意選択で１つ以上の賦形剤、例えば、油（例えば、魚油、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油、ココナッツ油、トリグリセリド、ジグリセリド、及びモノグリセリド）、可塑剤（例えば、グリセロール、グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコール、クエン酸、クエン酸エステル、例えば、トリエチルクエン酸、ポリアルアルコール）、共溶媒（例えば、トリアセチン、プロピレンカーボネート、乳酸エチル、プロピレングリコール、オレイン酸、ジメチルイソソルビド、ステアリルアルコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ベヘン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル）、界面活性剤、緩衝剤、滑沢剤、保湿剤、防腐剤、着色剤、並びに香料から調製され得る。カプセル剤は、硬質又は軟質であり得る。ハードカプセル剤の例には、ＣｏｎｉＳｎａｐ（登録商標）、ＤＲｃａｐｓ（登録商標）、ＯｃｅａｎＣａｐｓ（登録商標）、Ｐｅａｒｌｃａｐｓ（登録商標）、Ｐｌａｎｔｃａｐｓ（登録商標）、ＤＵＯＣＡＰ（登録商標）、Ｖｃａｐｓ（登録商標）、及びＶｃａｐｓ（登録商標）が含まれる。更に、カプセル剤は、Ｃａｐｓｕｇｅｌ（登録商標）から入手可能である。ハードカプセル剤は、例えば、２つの伸縮カプセル半分を形成し、半分のうちの１つをＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩を含む充填物で充填し、カプセル半分を一緒に密封することによって調製され得る。充填は、乾燥散剤、粒剤、懸濁液、又は液体等の任意の好適な形態であり得る。ソフトカプセル剤の例には、ＳＧｃａｐｓ（登録商標）等のソフトゼラチン（ソフトゲル又はソフトエラスティックとも呼ばれる）カプセルが含まれる。ソフトカプセル剤は、例えば、回転ダイ、プレート、往復運動ダイ、又はＡｃｃｏｇｅｌ（登録商標）機械方法によって調製され得る。実施形態では、カプセル剤は、液体が充填されたハードカプセル又はソフトゼラチンカプセルであり得る。

錠剤は、任意選択で１つ以上の副成分とともに、圧縮又は成形することにより作製することができる。圧縮錠剤は、任意選択で、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤、又は分散剤と混合された、粉末又は顆粒等の自由流動形態のＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩を、好適な機械で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を好適な機械で成形することによって作製することができる。錠剤は、任意選択で、持続放出、延長放出、遅延放出、又は制御放出を提供するようにコーティング又はスコアリングすることができることができる。限定されないが、そのような持続放出、延長放出、遅延放出、又は制御放出組成物を製剤化する方法は、当技術分野で既知であり、米国特許第４，３６９，１７４号、同第４，８４２，８６６号、及びそれらの中で引用される参照文献を含む、発行された米国特許に開示されている。コーティング、例えば、腸溶性コーティングは、化合物を腸に送達するために使用することができる（例えば、米国特許第６，６３８，５３４号、同第５，２１７，７２０号、同第６，５６９，４５７号、及びその中で引用されている参考文献を参照されたい）。錠剤に加えて、持続放出、延長放出、遅延放出又は制御放出を提供するために、カプセル剤、粒剤、及びゲルキャップ剤（ｇｅｌ－ｃａｐｓ）等の他の剤形を製剤化することができる。

一実施形態では、医薬組成物は、非経口投与用に製剤化される。非経口投与に好適な医薬組成物の例には、各々が例えば抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び／又は製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含む、水性滅菌注射液及び非水性滅菌注射液、並びに各々が例えば懸濁剤及び／又は増粘剤を含む、水性滅菌懸濁液及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量又は複数用量の容器、例えば、密封アンプル又はバイアル中に提供することができ、使用直前に、水等の無菌液体担体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保存することができる。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を更に含む。薬学的に許容される賦形剤は、それ自体が治療剤ではなく、患者への治療剤の送達のための担体、希釈剤、助剤、結合剤、及び／又はビヒクルとして使用されるか、あるいは、その取り扱い若しくは貯蔵特性を改善するため、又は化合物若しくは医薬組成物を投与のための単位剤形へと形成を可能にするか若しくはその形成を促進するために医薬組成物に添加される、任意の物質であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、医薬分野で既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１．ｓｕｐ．ｓｔ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２００５）に開示されている。当業者に既知であるように、薬学的に許容される賦形剤は、様々な機能を提供することができ、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、滑沢剤、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、防腐剤、界面活性剤、着色剤、香料、及び甘味料として記載され得る。薬学的に許容される賦形剤の例には、限定されないが、（１）ラクトース、グルコース、及びスクロース等の糖類、（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン等のデンプン、（３）カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース及びその誘導体、（４）粉末トラガント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバター及び坐剤ワックス等の賦形剤、（９）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油等の油、（１０）プロピレングリコール等のグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール等のポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル類、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質不含水、（１７）等張食塩水、（１８）リンガー液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、及び／又はポリ無水物、並びに（２２）医薬製剤に使用される他の非毒性の適合性物質が含まれる。

医薬組成物を調製する際に使用される材料は、使用される量において無毒であり得る。医薬組成物中の活性成分の最適な投与量が様々な要因に依存することは、当業者には明らかであろう。関連する要因には、動物の種類（例えば、ヒト）、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩の特定の形態、投与様式、使用される組成物、及び治療される疾患又は状態の重症度が含まれるが、限定されない。

原料化学物質として化合物を投与することに加えて、本開示の化合物は、化合物を薬学的に使用可能な調製物へと処置することを容易にする賦形剤及び補助剤を含む好適な薬学的に許容される担体を含む薬学的調製物の一部として投与され得る。調製物、特に、経口又は局所投与可能であり、かつ、投与のうちの１種として使用される調製物、例えば、錠剤、糖衣錠、緩徐放出性ロゼンジ剤及びカプセル剤、口すすぎ剤及び口洗浄剤、ゲル剤、液体懸濁液、ヘアリンス、ヘアゲル、シャンプー、及び直腸投与可能な製剤、例えば、坐剤、並びに静脈内注入、注射、局所又は経口投与による投与のための好適な溶液は、賦形剤とともに、約０．０１～９９パーセント、一実施形態では、約０．２５～７５パーセントの活性化合物を含む。

本開示の医薬組成物は、本開示の化合物の有益な効果を経験し得る任意の患者に投与され得る。そのような患者の中で最も重要なのは、哺乳動物、例えば、ヒトであるが、本開示は、そのように限定されることを意図するものではない。他の患者には、獣医動物（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ等）が含まれる。

化合物及びその医薬組成物は、それらの意図された目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、投与は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、口腔、髄腔内、頭蓋内、鼻腔内、又は局所経路により得る。あるいは又は同時に、投与は、経口経路により得る。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康、及び体重、もしあれば同時治療の種類、治療の頻度、並びに所望の効果の性質に依存するであろう。

本開示の医薬調製物は、それ自体が既知である様式で、例えば、従来の混合、造粒、糖衣錠作製、溶解、又は凍結乾燥プロセスによって製造される。したがって、経口使用のための医薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と合わせ、必要に応じて好適な補助剤を添加した後、任意選択で、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工して、錠剤又は糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。

好適な賦形剤は、特に、充填剤、例えば糖類、例えば、ラクトース又はスクロース、マンニトール、又はソルビトール、セルロース調製物及び／又はリン酸カルシウム、例えば、リン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウム、並びに結合剤、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドンを使用するデンプンペーストである。所望に応じて、崩壊剤、例えば、上記のデンプン、並びにカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムを添加することができる。補助剤は、特に、流れ調節剤及び滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン若しくはその塩、例えば、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム、及び／又はポリエチレングリコールである。糖衣錠コアには、必要に応じて、胃液に耐性のある好適なコーティングが提供されている。この目的のために、アラビア酸ガム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに好適な有機溶媒又は溶媒混合物を任意に含み得る、濃縮糖溶液を使用し得る。胃液に耐性のあるコーティングを製造するために、アセチルセルロースフタレート又はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の好適なセルロース調製物の溶液が使用される。染料又は顔料を、例えば、同定のために、又は活性化合物の用量の組み合わせを特徴付けるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに添加され得る。

経口的に使用することができる他の医薬調製物には、ゼラチンから作製されたプッシュフィットカプセル、並びにゼラチンから作製された軟質密封カプセル、及びグリセロール又はソルビトール等の可塑剤が含まれる。プッシュフィット（ｐｕｓｈ－ｆｉｔ）カプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、及び任意選択で安定剤と混合され得る、顆粒の形態の活性化合物を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活性化合物は、一実施形態では、脂肪油又は液体パラフィン等の好適な液体中に溶解又は懸濁される。更に、安定剤を添加し得る。

直腸で使用することができる可能な医薬調製物には、例えば、１つ以上の活性化合物と坐剤基剤との組み合わせからなる坐剤が含まれる。好適な坐剤基剤は、例えば、天然若しくは合成のトリグリセリド、又はパラフィン炭化水素である。加えて、活性化合物と基剤の組み合わせからなるゼラチン直腸カプセル剤を使用することも可能である。可能な塩基の材料には、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、又はパラフィン炭化水素が含まれる。

非経口投与のための好適な製剤には、水溶性形態の活性化合物、例えば、水溶性の塩の水溶液、及びアルカリ性溶液が含まれる。更に、好適な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与し得る。好適な親油性溶媒又はビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル若しくはトリグリセリド、又はポリエチレングリコール－４００が含まれる。水性注射懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランが含まれる、懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。任意選択で、懸濁液はまた、安定剤を含み得る。

本開示の局所組成物は、一実施形態では、好適な担体の選択によって、油、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤等として製剤化される。好適な担体には、植物油又は鉱物油、白色ワセリン（白色軟質パラフィン）、分枝鎖脂肪又は油、動物性脂肪、及び高分子量アルコール（Ｃ１２より大きい）が含まれる。担体は、活性成分が可溶性である担体であり得る。必要に応じて、乳化剤、安定剤、湿潤剤、及び抗酸化剤、並びに着色剤又は香料を付与する薬剤も含めることができる。更に、経皮浸透促進剤は、これらの局所製剤において使用され得る。そのような促進剤の例は、米国特許第３，９８９，８１６号及び同第４，４４４，７６２号（各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。

軟膏剤は、アーモンド油等の植物油中の活性成分の溶液を温かい軟質パラフィンと混合し、混合物を冷却させることによって製剤化され得る。そのような軟膏剤の典型的な例は、約３０重量％のアーモンド油及び約７０重量％の白色軟質パラフィンを含む軟膏である。ローション剤は、活性成分を、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等の好適な高分子量アルコール中に溶解することによって好都合に調製され得る。

当業者は、上記事項は、本開示の特定の好ましい実施形態の詳細な説明に過ぎないことを容易に理解するであろう。上記の組成物及び方法の様々な修正及び変更は、当該技術分野で利用可能な専門知識を使用して容易に達成することができ、本開示の範囲内である。

治療方法
本開示のいくつかの実施形態では、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩は、がんを含む様々な免疫学的状態を治療するために様々な条件及び治療的使用下で用いることができる。

それを必要とする対象に投与される用量は、使用される本開示の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の***の速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、年齢、性別、体重、サイズ、状態、全身の健康状態、治療される患者の以前の病歴、標的疾患、治療の目的、状態、実体の免疫原性、及び生物学的マトリックス中の標的細胞へのアクセス容易性等を含む、種々の要因に応じて変動し得る。本開示の組み合わせが、成人対象において、免疫チェックポイントに直接又は間接的に関連する様々な状態及び疾患を治療するために使用される場合、本開示の抗体を静脈内又は皮下投与することが有利である。

様々な実施形態では、本明細書に記載の活性剤の適切な用量は、例えば、治療に影響を及ぼすか又は治療に影響を及ぼすと予測されることが当該技術分野で既知であるか又は疑われるパラメータ又は因子を使用して、臨床医によってなされ得る。いくつかの実施形態では、健全な医療行為は、初期用量が最適用量よりもいくらか少ない量で開始され、任意の負の副作用に対して所望の又は最適な効果が達成されるまで、その後に小さな増分で増加されることを指示するであろう。重要な診断測定には、がん疾患経過における、例えば炎症の症状の測定、あるいは、産生される炎症性サイトカインのレベル、組織損傷、又は推定される活性若しくは病期の測定が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対する有毒なしに、特定の対象、組成物、及び投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変化し得る。

本開示の組み合わせを含む組成物は、例えば、１つ以上の投与様式、例えば、連続注入によって、又は例えば、１日、１週間、若しくは１週当たり１～７回の間隔で投与することによって、対象、例えば、ヒト対象に投与することができる。用量は、非経口的に、例えば、静脈内又は皮下用に提供され得る。

単に例示として、かつ、適切な用量及び投与頻度を決定するための様々な要因を考慮に入れると、それを必要とする患者に投与されるＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩の例示的な用量には、約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５、又は約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ（投与される体重）、１日に１回以上及び／又は１週間に１回以上での、例えば、１～４週間、又は１～８週間、若しくは１～１２週間、又は１～１４週間にわたる、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩の単一用量が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、例示的な投与レジメンは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量の投与又は投与頻度を含むことができる。いくつかの実施形態では、組み合わせの各活性剤の１週総用量は、独立して、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも１μｇ／ｋｇ、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、若しくは少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも１００ｍｇ／ｋｇであり得る。別の例では、それを必要とする患者に投与される本開示の組み合わせの各活性剤の例示的な用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）であり得る。

それを必要とする対象への投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ、及びそれらの間の任意の投与量であり得る。非限定的な例として、本開示による治療は、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩の各活性剤の１日用量として、１日当たり、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇの量で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日目のうちの少なくとも１つで、又は代替的に、治療開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０週目のうちの少なくとも１つで、又はこれらの任意の組み合わせで、２４、１２、８、６、４、若しくは２時間毎の分割用量又はこれらの任意の組み合わせを使用して提供され得る。

状態の重症度及び本明細書で論じられる様々な要因に応じて、治療の用量、頻度、及び期間は、当業者に既知である適切な医学的基準を考慮して、それに応じて調整され得る。特定の例示的な実施形態では、本開示の組み合わせの各活性剤は、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約５００ｍｇ、約５～約３００ｍｇ、又は約１０～約２００ｍｇ、約１００ｍｇ、又は約５０ｍｇの初回用量として投与することができる。組み合わせの一方又は両方の活性剤の第１の用量は、初回の充填用量であり得、その後に複数回の維持用量が続き得る。

特定の例示的な実施形態では、初回用量に続いて、初回用量とほぼ同じか又は初期用量未満であり得る量で、抗体又はその抗原結合断片の２回目又は複数回の後続用量の投与を行ってもよく、後続の用量は、少なくとも１日～３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、若しくは少なくとも１４週間離れ、又は本開示の組み合わせの用量を繰り返してもよく、投与は少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３ヶ月、若しくは少なくとも６ヶ月間離れ得る。

ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩を含む組成物の投与経路は、例えば、局所若しくは皮膚への適用、静脈内、腹腔内、皮下、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、皮内、脳脊髄内、病変内、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内への注射及び注入による注射若しくは注入、又は持続放出システム若しくはインプラントによって、単一の製剤で、独立して又は組み合わせとして投与され得る。注入可能な調製物には、静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内注射、点滴注入等のための剤形が含まれ得る。多くの再利用可能なペン送達デバイス及び自動注入送達デバイスは、本開示の医薬組成物の皮下送達での用途を有する。

例には、本発明の組み合わせの投与において本明細書で企図される例示的なペンベース送達方法として、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳ－ＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡ－ＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ，ＩＩ ａｎｄ ＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒ－ｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれるが、これらに限定されない。本開示の医薬組成物の皮下送達での用途を有するペンベースのデバイスの例示的な例には、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）が含まれる。

一般に、動物、例えばヒト対象に投与されるＤＣＶあるいはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、若しくは溶媒和物、又はそのエナンチオマー、エナンチオマー混合物、２つ以上のジアステレオマー混合物、若しくは同位体変異体の経口投与量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（動物体重）、より典型的には、約０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、又は３００ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ（動物体重）である。いくつかの態様では、動物に投与されるＤＣＶあるいはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、若しくは溶媒和物、又はそのエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、若しくは同位体変異体の投与量は、約１ｍｇ、約５ｍｇ、若しくは約１０ｍｇ～約３５０ｍｇ／日、又は約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、若しくは約２０ｍｇ～約１００ｍｇ／日である。

ＤＣＶあるいはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、又はそのエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、若しくは同位体変異体は、所望の効果に従って、毎日、毎週、隔週、又は毎月のスケジュールで投与することができる。いくつかの態様では、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩は、約１～５、約１～約１０、約１～約１５、又はそれ以上のサイクルで投与することができ、各サイクルは、１ヶ月の期間である。各サイクル内の用量は、毎日（１日１回、１日２回、又は１日２回より多い）、隔日、週２回、毎週、隔週、３週間毎に１回、又は月単位で投与することができる。サイクルは、任意選択で、休止期間を含み得る。あるいは、休止期間をサイクル間に含めることもできる。いくつかの態様では、投与は、疾患の期間中である。

本明細書に記載のように、本明細書に記載の方法に有効なＤＣＶあるいはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、若しくは溶媒和物、又はそのエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、若しくは同位体変異体の量は、障害又は状態の性質に依存し、標準的な臨床的技術によって決定することができる。更に、インビトロ又はインビボアッセイを任意選択で使用して、最適な投与量範囲を特定することができる。組成物に使用される正確な用量はまた、投与経路及び疾患又は障害の重症度に依存し、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。

本開示の範囲内の組成物には、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩がその意図される目的を達成するのに有効な量で含まれる全ての組成物が含まれる。個々の必要性は変動するが、各構成要素の有効量の最適範囲の決定は当業者の技術範囲内である。典型的には、ＤＣＶあるいはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、プロドラッグ、又はそのエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、若しくはその同位体変異体は、治療されるがんのために治療される哺乳動物の体重の１日当たり、０．００２５～１００ｍｇ／ｋｇの用量、又は薬学的に許容される塩のその同等量で、哺乳動物、例えばヒトに経口投与され得る。一実施形態では、約０．０１～約２５ｍｇ／ｋｇが、そのような障害を治療、改善、又は予防するために経口投与される。静脈内注射又は注入注射の場合、チェックポイント阻害剤抗体又はその抗原結合断片の用量は、約０．１～約１０００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ（患者体重）である。

ＤＣＶあるいはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、プロドラッグ、又はそのエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、若しくは同位体変異体の単位経口用量は、約０．０１ｍｇ～約１０００ｍｇ、例えば、約０．１～約１００ｍｇの化合物を含み得る。単位用量は、各々が約０．１～約１０ｍｇ、好都合には約０．２５～５０ｍｇの化合物又はその溶媒和物を含む１つ以上の錠剤又はカプセル剤として、１日１回以上投与され得る。

局所製剤では、ＤＣＶ又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、若しくは溶媒和物、若しくはそのエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、若しくはその同位体変異体は、担体１グラム当たり約０．０１～１００ｍｇの濃度で存在し得る。一実施形態では、化合物は、約０．０７～１．０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．１～０．５ｍｇ／ｍＬで存在し、一実施形態では、約０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

本開示は、固形がん又は非固形がん等の腫瘍性疾患を治療するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「治療」には、腫瘍性疾患の予防、軽減、制御、及び／又は阻害が包含される。そのような疾患には、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、燕麦細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞（未分化）がん、乳頭がん、腺扁平上皮がん、カルチノイド腫瘍、腺様嚢胞がんリンパ腫、並びに肉腫及び肉腫様がんを含むがこれらに限定されない、ＥＲＰＣ細胞及びＴＲＩＢ２陽性肺がんを含むＴＲＩＢ２陽性がん細胞が含まれる。様々な実施形態では、上記の肺がんは、ＴＲＩＢ２陽性肺がんである。本開示は、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）を治療を必要とする対象に投与することによって、前立腺がん、特にＥＲＰＣ、及び／又は肺がん等のＴＲＩＢ２陽性がんを治療するための有効な方法を提供する。

新生物、腫瘍、及びがんには、良性、悪性、転移性、及び非転移性種が含まれ、任意の病期（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、若しくはＶ）又はグレード（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３等）の新生物、腫瘍、若しくはがん、又は進行している、悪化している、安定した、若しくは寛解中の新生物、腫瘍、がん、若しくは転移が含まれる。本開示に従って治療され得るがんには、肺及び前立腺の細胞又は腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍は、転移性又は悪性腫瘍であり得る。非小細胞肺がん、小細胞肺がん、燕麦細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞（未分化）がん、乳頭がん、腺扁平上皮がん、カルチノイド腫瘍、腺様嚢胞がんリンパ腫、並びに肉腫及び肉腫様がんを含むがこれらに限定されない、ＥＲＰＣ細胞及びＴＲＩＢ２陽性肺がんを含むＴＲＩＢ２陽性がん細胞。様々な実施形態では、上記の肺がんは、ＴＲＩＢ２陽性肺がんである。本開示は、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）を治療を必要とする対象に投与することによって、前立腺がん、特にＥＲＰＣ、及び／又は肺がん等のＴＲＩＢ２陽性がんを治療するための有効な方法を提供する。

いくつかの実施形態では、治療される新生物疾患は、肺がん、前立腺がん、及び前立腺がんである。最も好ましくは、治療される新生物疾患は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、燕麦細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞（未分化）がん、乳頭がん、腺扁平上皮がん、カルチノイド腫瘍、腺様嚢胞がんリンパ腫、並びに肉腫及び肉腫様がんを含むがこれらに限定されない、ＥＲＰＣ細胞及びＴＲＩＢ２陽性肺がんを含むＴＲＩＢ２陽性がん細胞である。

併用療法
本発明のいくつかの実施形態は、有効量の本発明の化合物及び少なくとも１つの追加の治療剤（化学療法用の抗新生物剤、アポトーシス調節剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、及び抗炎症剤を含むが、これらに限定されない）、並びに／又は治療技術（例えば、外科的介入、及び／又は放射線療法）を投与するための方法を提供する。特定の実施形態では、追加の治療剤は、抗がん剤である。

多くの好適な抗がん剤が、本発明の方法で使用されることが企図される。実際、本発明は、限定するものではないが、多くの抗がん剤、例えば、アポトーシスを誘導する薬剤、ポリヌクレオチド（例えば、抗センス剤、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）、ポリペプチド（例えば、酵素及び抗体）、生物学的模倣物、アルカロイド、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、ホルモン、白金化合物、モノクローナル又はポリクローナル抗体（例えば、抗がん剤、毒素、ディフェンシンとコンジュゲートされる抗体）、毒素、放射性核種、生物学的反応修飾物質（例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α）及びインターロイキン（例えば、ＩＬ－２））、養子免疫療法剤、造血成長因子、腫瘍分化誘導薬（例えば、オールトランス－レチノイン酸）、遺伝子療法試薬（例えば、アンチセンス療法試薬及びヌクレオチド）、腫瘍ワクチン、血管新生阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ＮＦ－КＢ調節剤、抗ＣＤＫ化合物、ＨＤＡＣ阻害剤等の投与を企図する。開示される化合物との共投与に好適な化学療法化合物及び抗がん療法の他の多くの例が、当業者に既知である。

特定の実施形態では、抗がん剤は、アポトーシスを誘導又は刺激する薬剤を含む。アポトーシスを誘導する薬剤には、放射線（例えば、Ｘ線、γ線、紫外線）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連因子（例えば、ＴＮＦファミリー受容体タンパク質、ＴＮＦファミリーリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１又はＴＲＡＩＬ－Ｒ２に対する抗体）、キナーゼ阻害剤（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、血管成長因子受容体（ＶＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、及びＢｃｒ－Ａｂｌキナーゼ阻害剤（例えば、グリベック（ＧＬＥＥＶＥＣ）））、アンチセンス分子、抗体（例えば、ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、リツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ）、ゼバリン（ＺＥＶＡＬＩＮ）、及びアバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ））、抗エストロゲン（例えば、ラロキセン及びタロキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、アミノグルテタミド、ケトコナゾール、及びコルチコステロイド）、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）阻害剤（例えば、セレコキシブ、メロキシカム、ＮＳ－３９８、及び非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ））、抗炎症薬（例えば、ブタゾリジン、デカドロン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ）、デルタゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ）、デキサメタゾン、デキサメタゾンインテンソール、デキソン（ＤＥＸＯＮＥ）、ヘキサドロール（ＨＥＸＡＤＲＯＬ）、ヒドロキシクロロキン、メチコルテン（ＭＥＴＩＣＯＲＴＥＮ）、オラデクソン（ＯＲＡＤＥＸＯＮ）、オラソン（ＯＲＡＳＯＮＥ）、オキシフェンブタゾン、ペディアプレッド（ＰＥＤＩＡＰＲＥＤ）、フェニルブタゾン、プラケニル（ＰＬＡＱＵＥＮＩＬ）、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン（ＰＲＥＬＯＮＥ）、及びタンデアリル（ＴＡＮＤＥＡＲＩＬ））、及びがん化学療法薬（例えば、イリノテカン（カムプスター（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ））、ＣＰＴ－１１、フルダラビン（フルダラ（ＦＬＵＤＡＲＡ））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、デキサメタゾン、ミトキサントロン、ミロタルグ（ＭＹＬＯＴＡＲＧ）、ＶＰ－１６、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、５－ＦＵ、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、タキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、又はタキソール（ＴＡＸＯＬ））、細胞シグナル伝達分子、セラミド及びサイトカイン、スタウロスポリン等が含まれるが、これらに限定されない。

更に他の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、本発明の化合物、並びにアルキル化剤、代謝拮抗剤、及び天然物（例えば、ハーブ並びに他の植物及び／又は動物由来の化合物）から選択される少なくとも１つの抗過剰増殖剤又は抗腫新生物剤を提供する。

本組成物及び方法での使用に好適なアルキル化剤には、１）ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ－サルコリシン）、及びクロラムブシル）、２）エチレンイミン及びメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、３）アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）、４）ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）；セムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）、及びストレプトゾシン（ストレプトゾトシン））、並びに５）トリアゼン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ジメチルトリアゼノイミド－アゾレカルボキサミド））が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法での使用に好適な代謝拮抗剤には、１）葉酸類似体（例えば、メトトレキサート（アメトプテリン））、２）ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル（５－フルオロウラシル、５－ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン、ＦｕｄＲ）、及びシタラビン（シトシンアラビノシド））、並びに３）プリン類似体（例えば、メルカプトプリン（６－メルカプトプリン、６－ＭＰ）、チオグアニン（６－チオグアニン、ＴＧ）、及びペントスタチン（２’－デオキシコホルマイシン））が含まれるが、これらに限定されない。

なお更なる実施形態では、本発明の組成物及び方法における使用に好適な化学療法剤には、１）ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン）、２）エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド及びテニポシド）、３）抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、及びマイトマイシン（マイトマイシンＣ））、４）酵素（例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ）、５）生物学的反応修飾因子（例えば、インターフェロンアルファ）、６）白金配位複合体（例えば、シスプラチン（シス－ＤＤＰ）及びカルボプラチン）、７）アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、８）置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、９）メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎーメチルヒドラジン、ＭＩＨ）、１０）副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド）、１１）副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、１２）プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、及び酢酸メゲストロール）、１３）エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール）、１４）抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、１５）アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン）、１６）抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド）、並びに１７）ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（（例えば、ロイプロリド）が含まれるが、これらに限定されない。

がん療法の関連で日常的に使用される任意の腫瘍溶解剤は、本発明の組成物及び方法に使用される。例えば、米国食品医薬品局は、米国での使用が承認された腫瘍溶解剤の処方集を保持している。Ｕ．Ｓ．Ｆ．Ｄ．Ａ．の国際的な対応機関は、同様の処方集を保持している。表２は、米国において使用が承認された例示的な抗新生物剤のリストを提供する。当業者は、米国において承認された全ての化学療法剤に必要な「製品標識」が、例示的な薬剤についての承認された適応症、投与情報、毒性データ等を記載していることを理解するであろう。

抗がん剤には、抗がん活性を有することが同定されている化合物が更に含まれる。例には、３－ＡＰ、１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール－１３－酢酸塩、１７ＡＡＧ、８５２Ａ、ＡＢＩ－００７、ＡＢＲ－２１７６２０、ＡＢＴ－７５１、ＡＤＩ－ＰＥＧ２０、ＡＥ－９４１、ＡＧ－０１３７３６、ＡＧＲＯ１００、アラノシン、ＡＭＧ ７０６、抗体Ｇ２５０、アンチネオプラストン、ＡＰ２３５７３、アパジコン、ＡＰＣ８０１５、アチプリモド、ＡＴＮ－１６１、アトラセンテン、アザシチジン、ＢＢ－１０９０１、ＢＣＸ－１７７７、ベバシズマブ、ＢＧ００００１、ビカルタミド、ＢＭＳ２４７５５０、ボルテゾミブ、ブリオスタチン－１、ブセレリン、カルシトリオール、ＣＣＩ－７７９、ＣＤＢ－２９１４、セフィキシム、セツキシマブ、ＣＧ００７０、シレンギチド、クロファラビン、コンブレタスタチンＡ４リン酸塩、ＣＰ－６７５，２０６、ＣＰ－７２４，７１４、ＣｐＧ７９０９、クルクミン、デシタビン、ＤＥＮＳＰＭ、ドキセルカルシフェロール、Ｅ７０７０、Ｅ７３８９、エクテナサイジン７４３、エファプロキシラル、エフロルニチン、ＥＫＢ－５６９、エンザスタウリン、エルロチニブ、エクシスリンド、フェンレチニド、フラボピリドール、フルダラビン、フルタミド、フォテムスチン、ＦＲ９０１２２８、Ｇ１７ＤＴ、ガリキシマブ、ゲフィチニブ、ゲニステイン、グルフォスファミド、ＧＴＩ－２０４０、ヒストレリン、ＨＫＩ－２７２、ホモハリングトニン、ＨＳＰＰＣ－９６、ｈｕ１４．１８－インターロイキン－２融合タンパク質、ＨｕＭａｘ－ＣＤ４、イロプロスト、イミキモド、インフリキシマブ、インターロイキン－１２、ＩＰＩ－５０４、イロフルベン、イクサベピロン、ラパチニブ、レナリドマイド、レスタウルチニブ、ロイプロリド、ＬＭＢ－９免疫毒素、ロナファルニブ、ルニリキシマブ、マホスファミド、ＭＢ０７１３３、ＭＤＸ－０１０、ＭＬＮ２７０４、モノクローナル抗体３Ｆ８、モノクローナル抗体Ｊ５９１、モテキサフィン、ＭＳ－２７５、ＭＶＡ－ＭＵＣ１－ＩＬ２、ニルタミド、ニトロカンプトテシン、ノラトレキセド二塩酸塩、ノルバデックス、ＮＳ－９、Ｏ６－ベンジルグアニン、オブリメルセンナトリウム、ＯＮＹＸ－０１５、オレゴボマブ、ＯＳＩ－７７４、パニツムマブ、パラプラチン、ＰＤ－０３２５９０１、ペメトレキセド、ＰＨＹ９０６、ピオグリタゾン、ピルフェニドン、ピクサントロン、ＰＳ－３４１、ＰＳＣ８３３、ＰＸＤ１０１、ピラゾロアクリジン、Ｒ１１５７７７、ＲＡＤ００１、ランピルナーゼ、レベッカマイシン類似体、ｒｈｕアンギオスタチンタンパク質、ｒｈｕＭａｂ ２Ｃ４、ロシグリタゾン、ルビテカン、Ｓ－１、Ｓ－８１８４、サトラプラチン、ＳＢ－、１５９９２、ＳＧＮ－００１０、ＳＧＮ－４０、ソラフェニブ、ＳＲ３１７４７Ａ、ＳＴ１５７１、ＳＵ０１１２４８、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スラミン、タラボスタット、タランパネル、タリキダール、テムシロリムス、ＴＧＦａ－ＰＥ３８免疫毒素、サリドマイド、チマルファシン、チピファルニブ、チラパザミン、ＴＬＫ２８６、トラベクテジン、グルクロン酸トリメトレキサート、ＴｒｏＶａｘ、ＵＣＮ－１、バルプロ酸、ビンフルニン、ＶＮＰ４０１０１Ｍ、ボロシキシマブ、ボリノスタット、ＶＸ－６８０、ＺＤ１８３９、ＺＤ６４７４、ジレウトン、並びにゾスキダル三塩酸塩が含まれる。

抗がん剤及び他の治療剤のより詳細な説明については、当業者により、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ及びＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎの「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」第１０版、Ｅｄｓ．Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２を含むがこれらに限定されない、任意の数の取扱説明書が参照される。

本発明は、本発明の化合物を放射線療法とともに投与するための方法を提供する。本発明は、治療用量の放射線を動物に送達するために使用される種類、量、又は送達及び投与システムによって限定されない。例えば、動物は、光子放射線療法、粒子線放射線療法、他の種類の放射線療法、及びそれらの組み合わせを受け得る。いくつかの実施形態では、放射線は、直線加速器を使用して動物に送達される。更に他の実施形態では、放射線は、ガンマナイフを使用して送達される。

放射線源は、動物の外部又は内部であり得る。外部放射線療法は最も一般的であり、例えば、線形加速器を使用して、高エネルギー放射線のビームを皮膚を通して腫瘍部位に導くことを伴う。放射線ビームは腫瘍部位に局在しているが、正常で健康な組織への曝露を避けることはほとんど不可能である。しかしながら、外部放射は、通常、動物によって十分に忍容されている。内部放射線療法は、（例えば、がん細胞結合リガンドに結合した粒子を使用して）がん細胞を特異的に標的化する送達システムの使用を含む、腫瘍部位又はその近くの体内にビーズ、ワイヤー、ペレット、カプセル、粒子等の放射線放出源を留置することを含む。そのような留置は、治療後に除去するか、又は不活性にして体内に放置することができる。内部放射線療法の種類には、小線源治療、組織内照射、腔内照射、放射免疫療法等が含まれるが、これらに限定されない。

動物は、任意選択で、放射線増感剤（例えば、メトロニダゾール、ミソニダゾール、動脈内Ｂｕｄｒ、静脈内ヨードオキシウリジン（ＩｕｄＲ）、ニトロイミダゾール、５－置換－４－ニトロイミダゾール、２Ｈ－イソインドールジオン、［［（２－ブロモエチル）－アミノ］メチル］－ニトロ－１Ｈ－イミダゾール－１－エタノール、ニトロアニリン誘導体、ＤＮＡ親和性低酸素選択的サイトトキシン、ハロゲン化ＤＮＡリガンド、１，２，４ベンゾトリアジンオキシド、２－ニトロイミダゾール誘導体、フッ素含有ニトロアゾール誘導体、ベンズアミド、ニコチンアミド、アクリジン－インターカレーター、５－チオトラゾール誘導体、３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール、４，５－ニトロイミダゾール誘導体、ヒドロキシル化テキサプライン、シスプラチン、マイトマイシン、チリパザミン、ニトロソウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート、フルオロウラシル、ブレオマイシン、ビンクリスチン、カルボプラチン、エピルビシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンデシン、エトポシド、パクリタキセル、熱（ハイパーセミア）等）、放射線防護剤（例えば、システアミン、アミノアルキル二水素ホスホロチオエート、アミホスチン（ＷＲ２７２１）、ＩＬ－１、ＩＬ－６等）を受け得る。放射線増感剤は、腫瘍細胞の死滅を増強する。放射線防護剤は、放射線の有害な影響から健康な組織を保護する。

放射線の用量が許容できない負の副作用なしに動物によって忍容される限り、任意の種類の放射線を動物に投与することができる。好適な種類の放射線療法には、例えば、電離性（電磁）放射線療法（例えば、Ｘ線又はγ線）又は粒子ビーム放射線療法（例えば、高い線エネルギー放射線）が含まれる。電離性放射線は、電離、すなわち、電子の獲得又は喪失を生成するのに十分なエネルギーを有する粒子又は光子を含む放射線として定義される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．５，７７０，５８１に記載される）。放射線の効果は、臨床医によって少なくとも部分的に制御することができる。一実施形態では、放射線の用量は、最大の標的細胞曝露及び毒性の低減のために分けられる。

一実施形態では、動物に投与される放射線の総用量は、約０．０１グレイ（Ｇｙ）～約１００Ｇｙである。別の実施形態では、約１０Ｇｙ～約６５Ｇｙ（例えば、約１５Ｇｙ、２０Ｇｙ、２５Ｇｙ、３０Ｇｙ、３５Ｇｙ、４０Ｇｙ、４５Ｇｙ、５０Ｇｙ、５５Ｇｙ、又は６０Ｇｙ）が、治療経過にわたって投与される。いくつかの実施形態では、放射線の完全な用量は１日の経過にわたって投与することができるが、総用量は、理想的には分けられ、数日にわたって投与される。望ましくは、放射線療法は、少なくとも約３日間、例えば、少なくとも５、７、１０、１４、１７、２１、２５、２８、３２、３５、３８、４２、４６、５２、又は５６日間（約１～８週間）の経過にわたって投与される。したがって、１日の放射線量は、約１～５Ｇｙ（例えば、約１Ｇｙ、１．５Ｇｙ、１．８Ｇｙ、２Ｇｙ、２．５Ｇｙ、２．８Ｇｙ、３Ｇｙ、３．２Ｇｙ、３．５Ｇｙ、３．８Ｇｙ、４Ｇｙ、４．２Ｇｙ、又は４．５Ｇｙ）、又は１～２Ｇｙ（例えば、１．５～２Ｇｙ）を含む。１日の放射線量は、標的化される細胞の破壊を誘発するのに十分である必要がある。ある期間にわたって延長される場合、一実施形態では、放射線は毎日投与されず、それによって動物が休息することができ、療法の効果を実現する。例えば、放射線は、望ましくは、治療の各週において、５日間連続して投与され、２日間投与されず、それによって、週に２日間の休息を可能にする。しかしながら、放射線は、動物の応答及び任意の潜在的な副作用に応じて、１日／週、２日／週、３日／週、４日／週、５日／週、６日／週、又は７日／週全てで投与することができる。

放射線療法は、治療期間の任意の時点で開始することができる。一実施形態では、放射線は、１週間又は２週間中に開始され、治療期間の残りの期間にわたって投与される。例えば、放射線は、例えば固形腫瘍を治療するための６週間を含む治療期間の１～６週目又は２～６週目に投与される。あるいは、放射線は、５週間を含む治療期間の１～５週間又は２～５週間に投与される。しかしながら、これらの例示的な放射線療法の投与スケジュールは本発明を限定するものではない。

抗菌治療剤はまた、本発明における治療剤として使用され得る。微生物の機能を死滅、阻害、又はその他では減衰させることができる任意の薬剤、及びそのような活性を有することが企図される任意の薬剤を使用され得る。抗菌剤には、単独で又は組み合わせて使用される、天然及び合成の抗生物質、抗体、阻害タンパク質（例えば、ディフェンシン）、アンチセンス核酸、膜破壊剤等が含まれるが、これらに限定されない。実際には、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤等を含むが、これらに限定されない、任意の種類の抗生物質が使用され得る。

本発明のいくつかの実施形態では、本発明の化合物及び１つ以上の治療剤又は抗がん剤は、以下の条件：異なる周期、異なる持続時間、異なる濃度、異なる投与経路によることうちの１つ以上において、動物に投与される。いくつかの実施形態では、化合物は、治療剤又は抗がん剤の投与の前に、例えば、治療剤又は抗がん剤の投与の０．５、１、２、３、４、５、１０、１２、若しくは１８時間前、１、２、３、４、５、若しくは６日前、又は１、２、３、若しくは４週間前に投与される。いくつかの実施形態では、化合物は、治療剤又は抗がん剤の後に、例えば、抗がん剤の投与の０．５、１、２、３、４、５、１０、１２、若しくは１８時間後、１、２、３、４、５、若しくは６日後、又は１、２、３、若しくは４週間後に投与される。いくつかの実施形態では、化合及び治療剤又は抗がん剤は、同時に投与されるが、異なるスケジュールで投与され、例えば、化合物は、毎日投与されるが、治療剤又は抗がん剤は、週に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、又は４週毎に１回投与される。他の実施形態では、化合物は週に１回投与され、治療剤又は抗がん剤は、１日に１回、１週に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、又は４週毎に１回投与される。

実施例１．ＴＲＩＢ２を下方制御する化合物を同定するための高スループットスクリーニング
本実施例は、Ｔｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）の阻害剤としてのダクラタスビル（ＤＣＶ）の同定を実証する。

ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、一連の市販薬物のコレクション（カタログ番号ＨＹ－Ｌ０２２，Ｍｅｄｃｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ）から選択された１６００個の化合物を用いて行った。スクリーニングには、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、及びＩｎｄｏＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ，ＮＪ）からの追加の化合物も含まれた。

ヒト***線維芽細胞（ＨＦＦ）細胞を、Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ－Ｔｒｉｂ２）融合構築物でトランスフェクトした。細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、化合物（１０μＭ）で２４時間処理した。ルシフェラーゼ活性は、ＥｎｄｕＲｅｎ（商標）生細胞基質キット（ＰＲＯＭＥＧＡ ＣＯＲＰ．（登録商標）、ＷＩ）を使用して測定した。ダクラタスビルは、Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性の７０％超の阻害を示した（図１Ａ及び図１Ｂ）。対照的に、別の抗ウイルス化合物であるレジパスビル（ＬＤＶ）は、同じアッセイにおいて阻害を示さなかった（図１Ａ及び図１Ｃ）。更なる開発のために、対照ルシフェラーゼでトランスフェクトしたＨＦＦ細胞を用いて、選択された化合物を対応スクリーニングした。ダクラタスビルはまた、ルシフェラーゼのみを用い、かつ、Ｔｒｉｂ２を用いずに、ＤＣＶをスクリーニングする、対応スクリーニング試験にも合格、これにより、ＤＣＶがルシフェラーゼ活性を直接阻害しないことが示された。

これらの結果は、ＤＣＶがルシフェラーゼ融合タンパク質ベースのアッセイにおいてＴＲＩＢ２を阻害することを示し、ＤＣＶがＴＲＩＢ２タンパク質の新しい阻害剤であり得ることを実証する。Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性に対するＤＣＶの阻害効果は、レジパスビル（ＬＤＶ）等の他の抗ウイルス薬については観察されなかった。ＤＣＶ及びＬＤＶの両方が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療に使用される。ＤＣＶと同様に、ＬＤＶはまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）の阻害剤である。本実施例におけるＤＣＶ対ＬＤＶの効果の違いは、ＴＲＩＢ２タンパク質に対するＤＣＶの阻害効果が本化合物に特異的であり得、全てのＨＣＶ抗ウイルス薬に対して一般的に観察されないことを示している。

実施例２．ＥＲＰＣ細胞を用いた新規なＴＲＩＢ２阻害剤の検証
本実施例は、別の抗ウイルス薬ではないが、ダクラタスビルがＴＲＩＢ２タンパク質レベルを下方制御し、ＥＲＰＣ細胞の生存率を低下させることを実証する。

エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）細胞（ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞）をプレーティングし、各々１０μＭの様々な化合物で２４時間処理した。ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞を開発及び使用するための例示的な方法は、Ｍｏｎｇａ，Ｊ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｄ．，Ｂｈａｒａｔｈａｎ，Ａ．，ａｎｄ Ｇｈｏｓｈ，Ｊ．（２０２０）“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ５－ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｓ ｃ－Ｍｙｃ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｋｉｌｌｓ ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０：６６４９に開示され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。全細胞溶解物タンパク質をウエスタンブロットによって分析した。ＴＲＩＢ２抗体を使用して、ＴＲＩＢ２のタンパク質レベルを検出し、ＧＡＰＤＨを充填対照として使用した。モノクローナル抗Ｔｒｉｂ２抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡから購入した。ＴＲＩＢ２タンパク質レベルは、ダクラタスビルによって下方制御されたが、別の抗ウイルス薬物レジパスビル（ＬＤＶ）によっては下方制御されなかった（図２Ａ）。

生存率アッセイのため、ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞（１ウェル当たり２，０００個の細胞）を、完全増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＢＳ）での９６ウェルプレート中でプレーティングし、様々な用量のＤＣＶ又はＬＤＶで処理した。プレートをＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で７２時間インキュベートした。細胞生存率をＭＴＳ／ＰＥＳ細胞力価アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって測定した。細胞生存率は、ダクラタスビルによって効果的に低下したが、レジパスビルによっては低下しなかった（図２Ｂ）。

これらの結果は、ＤＣＶがＴＲＩＢ２を阻害することができ、マイクロモル濃度でＥＲＰＣ細胞の生存率を低下させることができることを示す。ＤＣＶ処置細胞におけるＴＲＩＢ２タンパク質のレベルの低下は、ＤＣＶがＴＲＩＢ２タンパク質の分解を引き起こすことの指標であり得る。ＴＲＩＢ２タンパク質レベルを下方制御し、かつ、ＥＲＰＣ細胞の生存率を低下させることに対するＤＣＶの効果は、ＴＲＩＢ２ ｓｈＲＮＡの効果を模倣する（データは未公開）。別の抗ウイルス薬レジパスビル（ＬＤＶ）は、ＴＲＩＢ２を下方制御せず、ＥＲＰＣ細胞を死滅させず、これは、ＴＲＩＢ２タンパク質に対するＤＣＶの選択的効果がその構造的差異に起因することを示唆している。

実施例３．ＤＣＶのインビトロ抗腫瘍効果
本実施例は、前立腺がん細胞におけるＤＣＶ処置の抗腫瘍効果を実証する。

ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞を、様々な用量（４μＭ、８μＭ、又は１２μＭ）のＤＣＶで２４時間処理した。ＴＲＩＢ２タンパク質レベル及びその下流の標的（例えば、ｐＡｋｔ、Ｂｃｌ－ｘＬ、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、及びＦＯＸＯ３）に対する効果をウエスタンブロットによって分析した。ＧＡＰＤＨを充填対照として使用した。ＴＲＩＢ２、ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、Ｂｃｌ－ｘＬ、及びサバイビンのタンパク質レベルが、対照で処理した細胞と比較して、１２μＭのＤＣＶで処理した細胞で低下した（図３Ａ）。ＦＯＸＯ３タンパク質のレベルは、対照処理と比較して、１２μＭのＤＣＶ処理で増加した。ＦＯＸＯ３レベルがＴｒｉｂ２によって低下することが既知であるため、このことは予想された。細胞タンパク質レベルに対するこれらの効果は、ＤＣＶ濃度依存的であり、試験した最高濃度（１２μＭ）で最も顕著な効果が観察された。

軟寒天コロニー形成に対するＤＣＶの効果も分析した。ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞（６ウェルプレート中、１ウェル当たり１０，０００個）を０．６％寒天のベース層の上部の０．３％軟寒天においてプレーティングした。細胞をＤＣＶで処理し、ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で３週間インキュベートした。細胞に、新鮮な培地及び薬物を４日毎に与えた。インキュベーション期間の最後に、コロニーを０．０２５％のクリスタルバイオレットで染色し、コロニーの写真を２００倍のニコンデジタルカメラで撮影した。Ｑ－Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｒｏ－７ソフトウェアを使用して画像処理を行った。上記の技術の例示的な方法は、Ｓａｒｖｅｓｗａｒａｎ，Ｓｉｖａｌｏｋａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｔｅｍｎｅｓｓ ａｎｄ ｋｉｌｌｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ－Ｊｕｎ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ．”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ｖｏｌ．１０，４ ４２４－４３６．１１ Ｊａｎ． ２０１９に見出すことができ、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。８μＭのＤＣＶは、軟寒天コロニー形成を完全に妨げた（図３Ｂ）。

がん細胞アポトーシスに対するＤＣＶ効果を試験するために、ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞を８μＭのＤＣＶで２４時間処理し、フローサイトメトリーによって分析した。ＤＣＶによる処置は、アポトーシスのための読み出しにおいてアネキシンＶ結合の増加を示した（図３Ｃ）。

前立腺がん細胞におけるＤＣＶ処置単独及びエンザルタミドとの組み合わせの効果を評価するために、ＬＮＣａＰ細胞株を使用して細胞生存率アッセイを行った。ＬＮＣａＰ細胞は、エンザルタミド処置に応答するアンドロゲン感受性ヒト前立腺腺がん細胞である。細胞をエンザルタミド（１０μＭ又は２０μＭ）、ＤＣＶ（６μＭ）、又はエンザルタミドとＤＣＶの組み合わせで７２時間処理し、ＭＴＳ／ＰＥＳアッセイで分析した。エンザルタミド及びＤＣＶによる併用処理は、各薬物単独での処理と比較して、細胞生存率の阻害に対する相乗効果を示した（図３Ｄ）。

これらの結果は、ＤＣＶによるＴＲＩＢ２陽性腫瘍細胞の処置が、腫瘍細胞アポトーシスを誘発し、ＴＲＩＢ２タンパク質及びｐＡｋｔ及びＢｃｌ－ｘＬ等のＴＲＩＢ２の下流の標的のタンパク質レベルを低下させたことを示す。腫瘍形成性のインビトロ試験である軟寒天アッセイにおいて、ＤＣＶは、ＥＲＰＣ細胞によるコロニー形成を妨げた。ＥＲＰＣ細胞によるコロニー形成の完全な阻害は、ＤＣＶが浸透して、ＥＲＰＣ細胞のゴツゴツした塊の核におけるコンパクト性及び低酸素環境に起因する腫瘍耐性を克服することができることを意味する。更に、本実施例は、ＤＣＶ及びエンザルチミドとの併用治療が、エンザルタミド単剤療法に他の方法で応答する前立腺がん細胞の生存率を相乗的に阻害することを示す。纏めると、これらの結果により、ＤＣＶが、侵襲的かつエンザルタミド耐性の致死性前立腺がんの治療のための有効な治療剤であり得ることが示される。

実施例４．ＤＣＶのインビボ抗腫瘍効果
本実施例は、ＤＣＶでのインビボ処置により、マウス異種移植片モデルにおけるＥＲＰＣ腫瘍増殖が阻害されることを実証する。

ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞（マウス当たり１×１０^６細胞）を皮下注射し、腫瘍を発生させた。腫瘍が約１００立方ｍｍのサイズに達したときに、マウスを３０ｍｇ／ｋｇ／日のＤＣＶ又は１：１：８のＤＭＳＯ：クレモフォア：ＰＢＳの溶液で４週間にわたり（ｎ＝３）経口的に処理した。腫瘍サイズ及び体重を週に１回測定した。腫瘍体積は、以下の式を使用して計算した：

式（Ｉ）
式中、「ＴＶ」は、腫瘍体積を意味し、
「ａ」は、腫瘍の長径であり、
「ｂ」は、腫瘍の短径である。

腫瘍試料を処置の４週間後に収集し、腫瘍におけるＴＲＩＢ２タンパク質レベルをモノクローナル抗Ｔｒｉｂ２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ；カタログ番号１００８７８）を１：１００で使用した免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定した。

ＤＣＶで処置した動物の腫瘍体積は、ビヒクルで処置した動物と比較して有意に低下した（図４Ａ及び図４Ｂ）。更に、ＤＣＶ処置動物由来の腫瘍は、ＩＨＣによるＴＲＩＢ２タンパク質レベルの低下を示した（図４Ｃ）。ＤＣＶ処置では、４週間にわたって、明らかな毒性（動物体重の著しい減少、又は運動の変化、食物摂取、皮膚色、下痢、尿の色、全身の内臓）の兆候は観察されなかった。

これらの結果は、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＤＣＶ（ＤＣＶの最大耐用量（ＭＴＤ）：＞２００ｍｇ／ｋｇ／日）により、腫瘍におけるＴＲＩＢ２タンパク質レベルが低下し、動物の健康に対する明らかな毒性なしに、ヌードマウスにおけるＥＲＰＣ腫瘍成長が阻害された。したがって、ＤＣＶは、ＴＲＩＢ２陽性腫瘍に対する有望なインビボ抗腫瘍活性を示し、ＥＲＰＣに対する新しい治療を提供することができる。

実施例５．抗ウイルス薬であるダクラタスビルは、Ｔｒｉｂｂｌｅｓ２偽キナーゼを阻害し、アポトーシスを介してエンザルタミド耐性前立腺がん細胞を死滅させる
ＦＤＡ承認されているエンザルタミドは、アンドロゲン受容体機能を妨げることによって進行性前立腺がんの成長を低下させるために一般的に処方されている。しかしながら、初期の良好な応答後であっても、エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）は必ず発生し、これはしばしば広範囲の転移性疾患に進行し、致死的となる。前立腺がんによる罹患率及び死亡率の多くは、抗アンドロゲン療法を上回る前立腺がんの進行のために起こる。ＥＲＰＣの管理は、利用可能な治療レジメンがＥＲＰＣ細胞を効果的に死滅させることができないだけでなく、それらが大きな骨に侵入する傾向があるため、特に問題となる。エンザルタミド耐性の背後にあるメカニズムが正確に理解されておらず、これにより、エンザルタミド耐性を克服するためのより新しい薬剤の開発が遅れている。本開示は、Ｔｒｉｂｂｌｅｓ２偽キナーゼが、エンザルタミド処置時に前立腺がん細胞及び腫瘍において過剰発現されていることを実証する。Ｔｒｉｂｂｌｅｓ２の強制発現は、前立腺がん細胞の成長を増強し、エンザルタミドの生理学的用量に対する完全な耐性を付与し、Ｔｒｉｂ２がＥＲＰＣの発生及び進行に重要な役割を果たすことを示唆する。Ｔｒｉｂ２は優れた分子標的として出現しているが、有効な標的化のための好適な阻害剤は市販されていない。ルシフェラーゼ標識Ｔｒｉｂ２融合タンパク質ベースのスクリーニングアッセイを設計することにより、本開示は、抗ウイルス薬であるダクラタスビルがＴｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性を強力に阻害することを実証する。本開示はまた、ＤＣＶが直接結合によってＴｒｉｂ２タンパク質を分解し、ＥＲＰＣ細胞を再び感受性にすることを実証する。ＤＣＶは、ヒトにおいて既にＦＤＡの承認を受けており、ヒトにおいて十分に忍容性があるため、本明細書に提示される知見は、ＤＣＶが、進行性のエンザルタミド耐性型前立腺がんの有効な療法の開発のための有望な新しい薬剤として出現し得ることを示す。

本発明者は、ヒトＬＮＣａＰ及びＭＤＡ－ＰＣＡ－２Ｂ前立腺がん細胞を、長期エンザルタミド療法における臨床条件を模倣するために徐々に増大させた用量（最大３０μＭ）で長期的に処置することによるインビトロモデルを開発した。得られたエンザルタミド耐性細胞の包括的な遺伝子発現分析は、偽キナーゼであるＴｒｉｂ２が、親エンザルタミド感受性細胞と比較して、エンザルタミド耐性細胞において過剰発現することを明らかにした（図１Ａ及び１Ｂ）。更に、Ｔｒｉｂ２の過剰発現は、エンザルタミド処置ＰＤＸ腫瘍及び患者の前立腺腫瘍でも見出された。Ｔｒｉｂ２の阻害は、ＥＲＰＣ細胞を効果的に死滅させ、これは、Ｔｒｉｂ２を阻害することによって標的療法を今や開発することができることを示唆している。しかしながら、その非酵素的性質により、及び任意の深いポケットが存在しないため、そのタンパク質－タンパク質相互作用を妨げることによるＴｒｉｂ２の特異的標的化は、極めて困難である。したがって、抗アンドロゲン療法耐性前立腺がんの真正なプロモーターとして認識されているにもかかわらず、Ｔｒｉｂ２は、エンザルタミド耐性を克服するための戦略を開発するための捉え難い分子標的のままである。

Ｔｒｉｂ２を阻害する薬剤を開発するための主な障害は、多数の化合物を効果的にスクリーニングするための迅速かつ容易なアッセイ手順が欠如していることである。この問題を克服するために、本開示は、Ｔｒｉｂ２タンパク質の活性状態を測定するための新しいアッセイシステムの設計を提供する。本開示は、完全長ヒトＴｒｉｂ２遺伝子をＲｅｎｉｌｌａ由来のルシフェラーゼ遺伝子と組み合わせることによるＴｒｉｂ２－ルシフェラーゼ遺伝子構築物を記載する。得られたＴｒｉｂ２－ｌｕｃ融合タンパク質の三次元立体構造の不安定化は、ルシフェラーゼの酵素活性の変化を介して報告可能な転帰をもたらすことができる。ルシフェラーゼのみの活性に影響する化合物を排除するように、第２のスクリーニングを設計した。この二重スクリーニングアッセイシステムを使用して、１６００個のＦＤＡ承認化合物のライブラリをスクリーニングし、抗ウイルス薬であるダクラタスビル（ＤＣＶ）がＴｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性を強力に阻害することを明らかにした。ＤＣＶは、Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼの活性を阻害するが、Ｔｒｉｂ２が融合タンパク質として結合していない場合、ルシフェラーゼの活性を阻害しないことが後で見出された。本開示はまた、ＤＣＶが純粋なＴｒｉｂ２タンパク質に直接結合してこれを不安定化し、最大融解温度（Ｔｍ）の半分を低下させることを見出した。更に、ＤＣＶが、前立腺、肺、及び腎臓を含む様々な侵襲的がん細胞株におけるＴｒｉｂ２タンパク質レベルを下方制御することが見出された。したがって、本開示のルシフェラーゼベースのアッセイシステム（第１のスクリーニング及び対応スクリーニングを含む）は、培養物中の単純な遺伝子トランスフェクト細胞株を使用してＴｒｉｂ２標的化薬物を同定するための有効な方法として出現する。

結果
ハイスループットスクリーニングにより、ＤＣＶはＴｒｉｂｂｌｅｓ２を下方制御する新規の薬剤として同定された。

Ｔｒｉｂ２タンパク質のアミノ酸配列は、標準的なキナーゼと類似性を有し、ＡＴＰに結合するが、強力なキナーゼ活性を欠く（偽キナーゼ）。したがって、本開示は、完全長ヒトＴｒｉｂ２遺伝子をＲｅｎｉｌｌａ由来のルシフェラーゼ遺伝子と組み合わせることによる、融合構築物を作製するためのアッセイシステムの設計を提供する。Ｔｒｉｂ２タンパク質の重要なＣ末端を保存するために、ルシフェラーゼ遺伝子をＴｒｉｂ２遺伝子の上流に配置させ、ルシフェラーゼ構成要素がＮ末端に留まるようにした。ここで、得られた融合構築物が、強力なルシフェラーゼ活性を有する約７２ｋＤａのサイズのタンパク質産物に翻訳されることが観察された。

一連の確立された細胞株をスクリーニングした後、ヒト***線維芽細胞（ＨＦＦ）が検出可能なＴｒｉｂ２タンパク質を発現しないことが見出された。したがって、本開示では、ルシフェラーゼでタグ付けされたＴｒｉｂ２遺伝子構築物でＨＦＦ細胞をトランスフェクトした。２ラウンドの薬物（Ｇ４１８）選択により、融合遺伝子の過剰発現について細胞を選択した。得られた細胞（ＨＦＦ－Ｔｒｉｂ２－Ｌｕｃ）を使用して、Ｍｅｄｃｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ）から購入した約１６００個のＦＤＡ承認化合物（＃ＨＹ－Ｌ０２２）のライブラリをスクリーニングした。９６ウェル組織培養プレートにおいて、標準化された２４時間アッセイプロトコルに従い、薬物効果を試験した。本開示のアッセイは、約１％の化合物がＴｒｉｂ２－ｌｕｃ活性を７０％以上阻害することができることを明らかにした。興味深いことに、本開示は、ダクラタスビルが第１のスクリーニングにおけるルシフェラーゼ活性を７４％下方調節することを見出した。（表３、図５）。更に、ＤＣＶは、第２のスクリーニングにおける対照ルシフェラーゼ活性を阻害せず、これは、ＤＣＶの効果がＴｒｉｂ２との相互作用に起因し得ることを示唆する。同じ実験システムでＴｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性を阻害するのに全く効果がなかったレジパスビル（ＬＤＶ）、ダルナビル、及びドルテグラビル等のいくつかの他の抗ウイルス化合物も試験し、化合物の一般化された抗ウイルス特性ではなくて、重要な構造成分／構成がＴｒｉｂ２を阻害するための鍵であることを示した。Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ融合タンパク質ベースのアッセイにおいて明らかになった未知の化合物の効果から、スクリーニングにおけるヒット率は約１％であることを見出された。

表３．Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ融合構築物をトランスフェクトしたＨＦＦ細胞に対する１０４個のＦＤＡ承認化合物の代表的なセットの効果を示す。細胞を本明細書に開示される化合物（１０μＭ）で２４時間処置し、次いで、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のキットを使用してルシフェラーゼ活性を測定した。更なる開発のために、対照ルシフェラーゼをトランスフェクしたＨＦＦ細胞を用いて、選択された化合物を対応スクリーニングする。注釈：ダクラタスビルは、２４時間でＴｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性の７０％以上の阻害を示し、対応スクリーニング試験に合格した。

化合物を選択するために使用したスクリーニング戦略を図５に示す。ここで、スクリーニング戦略をＴｒｉｂ２－Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ活性の阻害に基づいて化合物を選択するために使用されたが、Ｌｕｃ細胞では使用しなかった。スクリーニングした化合物は、Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ融合構築物をトランスフェクトしたＨＦＦ細胞上の１０４個のＦＤＡ承認化合物の代表的なセットを含んだ。細胞を化合物（１０μＭ）で２４時間処理し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のキットを使用してルシフェラーゼ活性を測定した。更なる開発のために、対照ルシフェラーゼをトランスフェクしたＨＦＦ細胞を用いて、選択された化合物を対応スクリーニングする。注釈：ダクラタスビルは、２４時間でＴｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性の７０％以上の阻害を示し、対応スクリーニング試験に合格した。

ＤＣＶは、プロテアソーム分解を介してＴｒｉｂ２タンパク質レベルを下方制御する。
本開示は、ＤＣＶ（＃４）がＴｒｉｂ２タンパク質レベルを効率的に下方制御し、ＥＲＰＣ細胞の生存率を低下させ、Ｔｒｉｂ２ ｓｈＲＮＡの効果を模倣することを実証する（図２Ａ、２Ｂ）。ＤＣＶは、直接に結合することによってＣ型肝炎ウイルスタンパク質（ＮＳ５Ａ）を阻害することが既知である。本明細書に提示されるアッセイにおいて、ＤＣＶがマイクロモル用量でＴｒｉｂ２を阻害するが、別の抗ウイルス薬であるレジパスビル（ＬＤＶ、＃７）は、Ｔｒｉｂ２を下方制御せず、ＥＲＰＣ細胞を死滅させないことはことが見出され、これは、Ｔｒｉｂ２タンパク質に対するＤＣＶの選択的効果がその構造的な差異に起因することを示唆している。本開示はまた、ＤＣＶが、ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞及びＭＲ４９Ｆ ＥＲＰＣ細胞の両方による細胞外マトリックスを通したインビトロ侵入を劇的に低減することを示した（データ図示せず）。本開示はまた、ＤＣＶが、軟寒天上のＥＲＰＣ細胞の場非依存性のコロニー形成能を完全に妨げることを見出した（図３Ｂ）。したがって、Ｔｒｉｂ２阻害剤薬物は、進行がん表現型の特徴である侵入及び再コロニー形成を停止させることができる（図３Ｂ、実施例３を参照されたい）。ＤＣＶの効果を検証するために、Ｔｒｉｂ２下流マーカーへの効果を分析し、ＤＣＶがｐＡＫＴ、Ｂｃｌ－ｘＬ、及びサバイビンのタンパク質レベルを阻害し、ＦＯＸＯ３のレベルを増加させることが明らかになった。したがって、ＤＣＶの効果は、周知のＴｒｉｂ２阻害剤の公開された報告に適合する。したがって、本開示の知見は、Ｔｒｉｂ２の効果を阻害する新しい化合物としてＤＣＶを検証し、したがって、Ｔｒｉｂ２を過剰発現するＥＲＰＣ細胞及び腫瘍に対して使用することができる。興味深いことに、並行して実験に使用されたレジパスビルは、ＥＲＰＣ細胞による侵入又は軟寒天コロニー形成を妨げるのに全く効果がないことを見出し、これは、これらのプロセスにおけるＤＣＶの非常に選択的な効果を示唆している。

図６は、ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞におけるＴｒｉｂ２タンパク質レベルに対する（１）ＤＣＶ（１２μＭ）、又はシクロヘキシミド（ＣＨＸ）（１０μｇ／ｍＬ）の効果を示すウエスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。各レーン上の「＋」及び／又は「－」は、それぞれＤＣＶ又はＣＨＸの有無を示す。

図７は、ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞におけるＴｒｉｂ２タンパク質レベルに対する（１）ＤＣＶ（１５μＭ）、又は（２）Ｃ_２６Ｈ_４１Ｎ_３Ｏ_５（ＣＡＳ番号１３３４０７－８２－６）（ベンジルＮ－［（２Ｓ）－４－メチル－１－［［（２Ｓ）－４－メチル－１－［［（２Ｓ）－４－メチル－１－オキソペンタン－２－イル］アミノ］－１－オキソペンタン－２－イル］アミノ］－１－オキソペンタン－２－イル］カルバメート（「ＭＧ１３２」）（２．５μＭ）の効果を示すウエスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。各レーン上の「＋」及び／又は「－」は、それぞれＤＣＶ又はＣＨＸの存在又は不存在を示す。

ＤＣＶは、Ｔｒｉｂ２タンパク質に直接結合して、これを不安定化する。
単離されたＴｒｉｂ２タンパク質の熱シフトアッセイにより、ＤＣＶがＴｒｉｂ２の融解曲線を左にシフトすることが示された。Ｔｍは、４１℃から３７℃に減少した（図８）。ヒトＴｒｉｂ２タンパク質の完全アミノ酸配列を用いたＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔコンピュータモデリングは、ＤＣＶと相互作用する５つのアミノ酸を明らかにした。これらは、Ａｒｇ－１３２、Ｓｅｒ－１３３、Ｇｌｕ－１９４、Ｇｌｕ－１９７、及びＡｓｐ－１９８である。このモデルは、ＤＣＶがＴｒｉｂ２タンパク質に非共有結合し、これを不安定化することを示唆している。

図９～１１は、Ｔｒｉｂ２（タンパク質）及びダクラタスビル（リガンド）の分子ドッキング分析の結果を示す。ＴＲＩＢ２の活性部位におけるダクラタスビル（ＤＣＶ）の分子ドッキング。分子ドッキングについては、ヒトＴＲＩＢ２のホモロジーモデル（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ：Ｑ９２５１９）を、サーバー上にＦＡＳＴＡ配列を送信することによってＳｗｉｓｓモデルで構築した。ドッキング研究には、配列類似性に基づく上位ランクモデルを用いた。ダクラタスビル（ＤＣＶ）（ＣＩＤ２５１５４７１４）の化学構造をＰｕｂＣｈｅｍから取り出した。ＰｙＲｘプラットフォームを使用したＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａを用いて、リガンド（ＤＣＶ）をＴＲＩＢ２モデルにドッキングした。サーチスペースは、センターＸ＝７．６５６６、Ｙ＝３０．１１９１、Ｚ＝１８６．２０５６、寸法（Å）Ｘ＝４８．１５１９、Ｙ＝６３．３０７３、及びＺ＝４０．９３２５と定義した。ＰｙＭＯＬ分子可視化ツールを使用して、ドッキングした複合体を可視化した。水素、疎水性、及びファンデルワールス相互作用に関与するＴＲＩＢ２の活性部位結合ポケット残基におけるＤＣＶの三次元配向を強調している。

更に、リガンドとタンパク質との間に極性接触が確立された。ＴＲＩＢ２のＡｒｇ－１３２、Ｓｅｒ－１３３、Ｇｌｕ－１９４、Ｇｌｕ－１９７、及びＡｓｐ－１９８残基は、ＤＣＶと水素結合を形成することが示された（図１２）。

図１３は、ＤＣＶと相互作用する残基を含む、Ｔｒｉｂ２のアミノ酸配列を示す（赤色で強調表示）。

ＤＣＶは、アポトーシスを誘導することによってＥＲＰＣ細胞を死滅させる。
本実施例は、ＤＣＶが、Ｔｒｉｂ２タンパク質レベルを効果的に低下させ、ＥＲＰＣ細胞の生存性を低下させたことを示している（図１４）。ＤＣＶ（商品名「ダクルインザ（Ｄａｋｌｉｎｚａ）」）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ－Ｓｑｕｉｂｂによって製造されたＦＤＡ承認薬物であり、ウイルスの複製に重要であるＨＣＶ非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）の阻害剤であることを主に意図している。ここで、がん細胞を用いた実験により、ＤＣＶがＴｒｉｂ２タンパク質の分解を引き起こし、ＥＲＰＣ細胞の生存能を低下させることを明らかとなり、ＥＲＰＣ等のＴｒｉｂ２過剰がんに対するその別目的利用のための新たな手段を開いた。また、ＤＣＶはアポトーシスを誘導し、ＥＲＰＣ細胞によって軟寒天コロニー形成（腫瘍形成性のためのインビトロ試験）を顕著に妨げる（図１５）。ＥＲＰＣ細胞によるコロニー形成の完全な阻害は、ＤＣＶが浸透し、ＥＲＰＣ細胞のゴツゴツした塊の核におけるコンパクト性及び低酸素環境に起因して耐性を克服することができることを意味する。したがって、ＥＲＰＣに対するＤＣＶの優れたインビボでの有効性が期待できる。また、ＤＣＶは、アポトーシスを誘導し、エンザルタミドと相乗作用して、前立腺がん細胞の生存性を阻害する（図１６；図３Ｃも参照されたい）。

ＥＲＰＣ細胞におけるＤＣＶ誘導アポトーシスの根底にある作用機序を調べるために、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）に対するＤＣＶの効果を分析した。ＪＮＫは、アポトーシス経路に重要な役割を果たす。本開示は、ＤＣＶがＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞において用量依存的様式でｃ－ＪＮＫの迅速かつ堅牢な活性化を引き起こすことを見出した（図１４～１７）。カスパーゼ依存性及びカスパーゼ非依存性アポトーシス細胞死プロセスの両方が既知である。ここで、ＤＣＶでの処置は、ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞においてカスパーゼ３の活性化を誘導することが観察された（図１４～１７）。更に、細胞をカスパーゼ阻害剤であるＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫで前処置したときに、ＥＲＰＣにおけるＤＣＶ処置誘導アポトーシスが阻害されることが見出されたが、これは、ＥＲＰＣ細胞におけるＤＣＶ誘発アポトーシスが、カスパーゼ活性に依存することが示唆している（図３Ｃ、１７）。興味深いことに、レジパスビル（Ｃ型肝炎ウイルスの阻害剤でもある）で処置した細胞は、アポトーシス特徴の任意の兆候を示さなかったが、これは、ＥＲＰＣ細胞におけるアポトーシスを誘導するＤＣＶの効果が非常に選択的であることを示唆している。

ＤＣＶは、エンザルタミド耐性前立腺がん細胞を再び感受性にし、エンザルタミドとの相乗作用によって前立腺がん細胞を死滅させる。
本開示は、ＤＣＶがＴｒｉｂ２タンパク質レベルを効果的に低下させ、ＥＲＰＣ細胞の生存性を低下させたことを実証する（データは図示せず）。

ここで、図１８～１９は、エンザルタミド耐性前立腺がん細胞を再び感受性にしたことを実証する結果を示す。前立腺がん細胞を完全長ヒト遺伝子でトランスフェクトして、Ｔｒｉｂ２を過剰発現させた（図１８）。Ｔｒｉｂ２－ＯＥ細胞は、臨床的に関連する用量のエンザルタミドに完全に耐性がある。興味深いことに、ＤＣＶ（６μＭ）でのＴｒｉｂ２の阻害は、耐性細胞を再びエンザルタミドに再び感受性にする。Ｔｒｉｂ２ ｓｉＲＮＡは、陽性対照として並列実験で使用した。更に、ＤＣＶ及びエンザルタミドは、ＭＴＳ／ＰＥＳアッセイによって測定した際に、前立腺がん細胞の細胞生存の阻害に関して相乗効果を実証した（図３Ｄ、１９）。

ＤＣＶは、ヌードマウスにおけるＥＲＰＣ腫瘍増殖を阻害する。
パイロット異種移植実験では、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＤＣＶ（ＤＣＶのＭＴＤ：＞２００ｍｇ／ｋｇ／日）は、動物の健康に対する明らかな毒性なしに、ヌードマウスにおけるＥＲＰＣ腫瘍成長を阻害する（図２０；図４Ａ、４Ｂ、４Ｃも参照されたい）。これは、ＤＣＶが優れたインビボ効果を有する好適な化合物であることを実験的に実証し、本開示の薬物スクリーニング及び試験が、致死性のＥＲＰＣ細胞を効果的に排除して、致死性のＥＲＰＣの治療のための新しい基盤を確立するために、魅力的なＴｒｉｂ２標的化剤を開発することができるという概念に強力な作用機序的支持を提供する顕著な発見である。治療タイムラインの概要を図２０に示す。簡潔に述べると、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＥＲＰＣ腫瘍成長のＤＣＶ阻害を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、高腫瘍形成性Ｅ００６ＡＡ（Ｅ００６ＡＡ－ｈＴ）細胞（１匹当たり１０６個）を皮下に注入して腫瘍を発達させ、次いで、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＤＣＶ又は溶媒で４週間にわたって経口的に処置した（ｎ＝３）。腫瘍サイズ及びマウスの体重を週に１回測定した。異種移植片研究の結果を、上記の図４Ａ～４Ｃ及び実施例４に示す。

図４Ｃに示すように、ＤＣＶの強力な効果がＴｒｉｂ２及び腫瘍成長上で観察され、４週間にわたるＤＣＶ処置により、明らかな毒性の兆候（例えば、動物体重の著しい減少、又は運動、食物摂取、皮膚の色、下痢、尿の色、全身の内臓の変化）は観察されなかった。

考察
第二世代アンドロゲン受容体遮断薬の導入は、前立腺がん療法のために過去１０年間に起こった最も顕著な成果の１つである。しかしながら、その初期の有益な効果にもかかわらず、アンドロゲン耐性疾患は必ず発生し、それは致死的である。耐性表現型の分子的根拠を理解するために、本開示は臨床的に関連する細胞及び組織を包括的に分析した：これは、前立腺がんがアンドロゲン依存的状態からアンドロゲン非依存的状態への移行中に、Ｔｒｉｂ２偽キナーゼの上方制御が重大かつ重要な遺伝的事象であることを明らかにした。本開示は、Ｔｒｉｂ２がＥＲＰＣ細胞において強く発現し、ｓｈＲＮＡによるＴｒｉｂ２の阻害が、Ｔｒｉｂ２を下方制御し、カスパーゼ媒介性アポトーシスを介してＥＲＰＣ細胞を死滅させることを示した。本開示はまた、高レベルのＴｒｉｂ２を発現するＥＲＰＣ細胞とは対照的に、正常な非がん細胞（例えば、アストロサイト、ヒト***線維芽細胞）におけるＴｒｉｂ２の発現が検出不可能であり、正常な非がん細胞がＴｒｉｂ２阻害の影響を受けないことを見出した。これらの新規の知見は、Ｔｒｉｂ２がん遺伝子の特有の調節及びＴｒｉｂ２媒介性シグナル伝達によるＥＲＰＣ細胞の生存性を文書化し、Ｔｒｉｂ２を標的とすることが、アポトーシスの誘導を介してＥＲＰＣ細胞を効果的かつ選択的に排除するための優れたアプローチであり得、これはＥＲＰＣを克服し、前立腺がんの再発を防止するための新しい基盤を確立するのに役立ち得ることが示唆された。

Ｔｒｉｂ２は、アンドロゲン耐性前立腺がんの新しいバイオマーカー及び分子標的として出現したが、Ｔｒｉｂ２活性を阻害する標的化可能な薬剤は市販されていない。本明細書で実施された盲検スクリーニングでは、ダクラタスビルは、２４時間で７０％を超える阻害を示す、Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性の強力な阻害剤であることが見出された（図５、表３）。対応スクリーニングでは、ダクラタスビルがＴｒｉｂ２の非存在下でルシフェラーゼ活性を阻害しないことが見出されたが、これは、ダクラタスビルが、ルシフェラーゼ自体ではなく、Ｔｒｉｂ２と相互作用することを示唆している。

興味深いことに、ダクラタスビルは、Ｔｒｉｂ２－ルシフェラーゼ活性を阻害するが、レジパスビル、ドルテグラビル、ダルナビル、及びペンシクロビル等のいくつかの他の抗ウイルス化合物は、有効ではなく、これは、Ｔｒｉｂ２を阻害するためには、ダクラタスビル分子の重要な構造成分が必要であることを示唆している。ダクラタスビルは、Ｃ型肝炎ウイルスに対する直接作用型抗ウイルス剤（ＤＡＡ）である。したがって、化合物のライブラリをスクリーニングして直接結合を介するＴｒｉｂ２の阻害剤としてのダクラタスビルを見出すための、本開示のルシフェラーゼタグ付き融合タンパク質ベースのアッセイ及び熱シフトアッセイの設計は、画期的な観察である。

結果は、抗ウイルス化合物であるＤＣＶがＴｒｉｂ２を阻害し、ＥＲＰＣ細胞を死滅させることを初めて示した。Ｔｒｉｂ２は、現在難治性であるＥＲＰＣに対する新たな療法を開発するための非常に有望な分子標的であると考えられる。Ｔｒｉｂ２を阻害してＥＲＰＣ細胞を死滅させるのに有効な化学的阻害剤の欠如は、主にＥＲＰＣの効果的な療法の開発を遅らせている。ダクラタスビル（商品名ダクリンザ）は、ＦＤＡ承認の抗Ｃ型肝炎ウイルス薬である。１５２名の患者（ＮＣＴ０２３１９０３１）において１２週間にわたり１日１回の経口投与による、６０ｍｇのダクラタスビル（６６ｍｇのダクラタスビル二塩酸塩に相当）を４００ｍｇのソホスブビル（ソバルディ）と一緒に使用した、ＡＬＬＹ－３無作為化、多施設、非盲検、実薬対照臨床試験に基づいて、２０１５年７月にダクラタスビルをＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染に使用することが承認された。ダクラタスビルは、主に、ウイルスＲＮＡ複製複合体の重要な成分であるＨＣＶ非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）の阻害剤であることを意図していた。ＮＳ５Ａは、亜鉛結合、プロリン豊富なリンタンパク質であり、ＨＣＶの複製に重要な役割を果たす。ダクラタスビルは、水性溶媒に自由に可溶性であり、経口送達した場合、その摂取率は約６７％である。ダクラタスビルは、約１５時間の半減期を有する哺乳動物宿主において非常に良好な忍容性を有し、インビボでタンパク質結合（約９９％）としてほとんど留まる。ダクラタスビル（ビフェニルカルバメート）の代謝は、主に肝臓を介して行われ、ｐ糖タンパク質（ＰＧＰ）の阻害薬である。したがって、ダクラタスビルは優れた薬理学的特性を有するが、哺乳動物細胞に対するダクラタスビルの直接的な効果は十分に研究されておらず、以前にがん細胞に対するその効果は試験されたことがない。

細胞培養システムにおいて、ＤＣＶが、２４時間以内に、Ｔｒｉｂ２のタンパク質レベルを実質的に低下させることが決定された。これは、Ｔｒｉｂ２タンパク質と、ユビキチン化状態を変化させるＤＣＶとの直接的な相互作用、続いてプロテアソーム活性化による分解に起因すると推測される。Ｔｒｉｂ２タンパク質の増強された分解は、その下流標的、例えば、ｐ－Ａｋｔ、Ｂｃｌ－ｘＬ、及び生存の減少に対応する（図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、６及び７）。また、予想の通り、ＤＣＶ処置は、おそらくＡｋｔの活性化を介してＴｒｉｂ２によって下方制御されるＴｒｉｂ２の阻害を介して、腫瘍抑制因子ＦＯＸＯ３－αのタンパク質レベルを増加させた。

治療耐性のがん細胞は、周囲の組織に侵入し、遠位部位に移動し、再コロニー化して、最終的には転移性結節を生成する卓越した能力を発達させる。ここで、ＤＣＶは、致死量未満でＬＮＣａＰ－ＥＮＲ細胞及びＰＣＡ－２Ｂ－ＥＮＲ細胞の両方によるインビトロマトリゲル侵入（データは示していない）及び軟寒天コロニー形成（図３Ｂ）を強力に阻害することが見出された。ＤＣＶによるＥＲＰＣ細胞の侵襲性並びに軟寒天コロニー形成能の劇的な低減のインビトロでの所見は、ＥＲＰＣ細胞の侵襲性及び転移性腫瘍形成能が、ＤＣＶ又は同様の他の薬剤によって効果的に制御され得ることを示唆している。本開示はまた、ＤＣＶによる処置によって、エンザルタミド耐性前立腺がん細胞の生存が低下すること観察した。ＤＣＶは、明確な用量依存的様式で、エンザルタミド耐性ＬＮＣａＰ－ＥＮＲ及びＰＣＡ－２Ｂ－ＥＮＲ前立腺がん細胞の形態を大幅に変化させ（データは図示せず）、かつ、その生存性を低下させる（図３Ｄ、１８、及び１８）。同様に、ＥＲＰＣ細胞をＴｒｉｂ２ ｓｈＲＮＡで処置したときにも、形態学的変化及び生存性の低下が見出され、ＥＲＰＣ細胞の生存性におけるＴｒｉｂ２の重要な役割が確認された（図３Ｂ）。本開示は、侵襲的、エンザルタミド耐性、致死性の前立腺がんに対する効果的な新規の治療戦略を提供する。

熱シフトアッセイは、ＤＣＶがＴｒｉｂ２タンパク質と直接相互作用し、Ｔｒｉｂ２タンパク質を不安定化させたことを示し、これは、ＤＭＳＯのみと比較したときに、純粋なタンパク質を変性させるのに必要な温度によって反映される（Ｔ_ｍが４１℃から３７℃に低下した（図８）。ＴＲＩＢ２の活性部位におけるＤＣＶの３次配向（図９）極性接触は、リガンドとタンパク質との間で確立された。ＴＲＩＢ２のＡｒｇ－１３２、Ｓｅｒ－１３３、Ｇｌｕ－１９４、Ｇｌｕ－１９７、及びＡｓｐ－１９８残基は、ＤＣＶと水素結合を形成した（図１０）。水素相互作用、疎水性相互作用、及びファンデルワールス相互作用に関与するＴＲＩＢ２の結合ポケット残基が強調されている。本開示は、ＤＣＶが、細胞周期進行をＧ０／Ｇ１期に停止させることによって細胞周期進行を縦方向にチェックすることを見出した（図１４～１６）。ＤＣＶ誘導前立腺がん細胞の形態的変化は、アポトーシスの誘導を想起させた。したがって、細胞死の作用機序が特徴付けられ、ＤＣＶ処置から数時間以内のホスファチジルセリンの外在化に対応する、増強されたアネキシンＶ結合が見出された（図１５及び１６）。更に、ＤＣＶがクロマチンＤＮＡのヌクレオソーム断片への分解を引き起こすことが観察されたが、これは、ＥＲＰＣ細胞がＤＣＶ処置によってアポトーシスを受けていることを示唆している（図１７）。ＥＲＰＣ細胞は、前立腺がん患者の健康を致死性表現型へと悪化させる急速な成長及び転移によって特徴付けられる。したがって、ＥＲＰＣ細胞におけるアポトーシス死の誘導は、がん細胞を死滅させることによって腫瘍負荷を減量させるために有用であり得る有意な事象である。

抗アンドロゲン療法は、寿命を延ばす診療所で一般的に使用されるが、去勢耐性疾患は必ず発症する。ＣＲＰＣ患者の９０％以上が骨転移を起こし、耐え難い痛み及び苦痛を生じる。ＦＤＡが承認したアンドロゲン受容体阻害剤であるエンザルタミドは、ＣＲＰＣにおけるＡＲ軸の標的化の成功が強調されるＣＲＰＣ患者の生存及び生活の質を改善するが、これらの療法は、耐性疾患の発症が不可避であり、かつ、耐性細胞が利用可能な他の臨床レジメンによって効果的に死滅されないため、治癒的ではない。本開示は、ＤＣＶがＥＲＰＣ細胞をエンザルタミドに再び感受性にすることを明らかにし、これは、ＤＣＶが抵抗の作用機序における主な障害を除去することを示唆している（図１８及び１９）。この所見は、ＥＲＰＣの新しい療法の開発に大きな影響を及ぼし得る。また、本開示は、ＤＣＶがＥＲＰＣ腫瘍成長を低下させるためにインビボで有効であることを見出した（図４Ａ～４Ｃ及び２０）。ドセタキセル失敗後に処方されるエンザルタミドは寿命を延ばすが、エンザルタミド耐性が発達すると効果的な治療選択肢を維持しないため、ＥＲＰＣは興味深い。現在、前立腺がんで命を落としている男性のほとんどは、ＥＲＰＣの発症によるものであることは言うまでもない。したがって、本開示の知見は、ＤＣＶが既にＦＤＡによって承認されており、かつヒト使用のための十分に忍容性のある薬物であるため、臨床開発に向けてＤＣＶを更に調べるための更なる支持を提供する。

実施例６．肺がんに対するＤＣＶの活性
Ｔｒｉｂｂｌｅｓ２は、黒色腫、肺がん、前立腺がん、骨髄腫、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がん等の様々ながん種において過剰発現される。したがって、ダクラタスビル（ＤＣＶ）を、Ｔｒｉｂｂｌｅｓ２が過剰発現される（肺、腎臓、膵臓）様々ながん細胞で試験した。本明細書に提示されるデータに基づいて、理論に拘束されることを望まないが、ＤＣＶは、前立腺がんに加えて、いくつかの他の種類のがんの療法のための良好な薬物として機能し得る。

以下のように肺がん研究を行った：腫瘍切片において１：１００（細胞シグナル伝達技術）で抗Ｔｒｉｂ２抗体を使用して、免疫組織化学（ＩＨＣ）により、Ｔｒｉｂ２を検出した。評価された腫瘍は、（１）腺がん、（２）乳頭がん、（３）腺がん、扁平上皮がん、及び（４）腺がんであり、全ての腫瘍は、ヒト患者肺腫瘍試料であった。（図２１）。更に、ＡＴＣＣから得た細胞培養株における細胞株のＴｒｉｂ２タンパク質レベルをウエスタンブロットによって検出した（図２２）。図２３に示されるように、ＤＣＶは、７２時間の細胞生存アッセイ、例えば、以下の肺がん細胞株において、様々な肺がん細胞を効果的に死滅させる：ＮＣＩ－Ｈ２２６及びＳＫ－ＭＥＳ－１＝扁平上皮がん、ＮＣＩ－Ｈ２２２８＝非小細胞肺がん、並びにＮＣＩ－Ｈ５９６＝腺がん。

実施例７．前立腺がん及び転移性前立腺がんの治療方法
本開示は、転移性エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）を有する患者におけるダクラタスビル（ＤＣＶ）の第Ｉ相用量漸増試験の予想例を提供する。治験の主な目的は、前立腺がんにおけるダクラタスビルの推奨第ＩＩ相用量を決定することである。ここでは、ＲＰ２Ｄを決定する際に、安全性及び薬物動態（ＰＫ）データの両方を考慮され得る。ＲＰ２Ｄは、定常状態ＰＫデータが、前臨床前立腺がんモデリングにおける有効濃度である４μＭの濃度に達する場合に確立され得る（例えば、図２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ｂ、及び４Ｃを参照されたい）。用量漸増は、目標血漿濃度に達するまで、又は最大耐用量が得られるまで継続し得る。

用量漸増は、Ｃ型肝炎患者の現在のＦＤＡ承認用量であるダクラタスビルを毎日６０ｍｇ経口投与で開始し得る。試験される用量は、毎日６０ｍｇ経口、１日２回６０ｍｇ経口、１日３回６０ｍｇ経口（「ｐｏ」）、及び必要に応じて１日２回最大１２０ｍｇであり得る。６０ｍｇのＤＣＶの１回投与後の血漿中ピーク濃度の中央値が約２μｇ／ｍｌ（２．５μＭ）であるため、４μＭの標的血漿中濃度を達成するために必要なのは２倍の漸増である。ＤＣＶは、１日１００ｍｇ ｐｏの用量で良好な忍容性を有することが以前に報告されている。ＤＣＶは、２８日周期で投与され得る。

修正された３＋３用量漸増設計を実施してもよい（図２４）。連続した参加者のコホート（３人の参加者／コホート）はそれぞれ、固定用量のＤＣＶで開始され得る。用量制限毒性（ＤＬＴ）が３３％超の参加者で観察されるか、又は所定の血漿濃度に達するまで、用量漸増は継続され得る。ある用量レベルでＤＬＴが観察されない場合、新しいコホートが次の計画用量レベルに登録され得る。ＤＬＴがコホートのうちの１人の参加者で観察される場合、別の３人の参加者は、同じ用量レベルで治療され得る。最大耐用量（ＭＴＤ）は、ＤＬＴが参加者の３３％超で観察される用量を下回る１用量レベルとして定義される。すなわち、３人の参加者のうちの少なくとも２人でＤＬＴが観察された場合、ＭＴＤは、前のコホートに投与された用量であると決定される。同様に、６人の参加者のコホートにおいて、６人の参加者のうちの３人が、ＭＴＤを決定するためにＤＬＴを経験する必要があり得る。任意の用量レベルで、血漿濃度が満たされる場合、用量漸増を停止する。最適な第ＩＩ相用量は、ＭＴＤを超えることなく、所定の血漿濃度が達成される用量レベルである。

ＤＣＶの血漿中ピーク濃度は、投与後１～２時間以内に到達し、ＤＣＶの平均末端半減期は１２～１５時間である。３日間の投与後、定常状態レベルに達する。したがって、ＰＫ試料を、Ｃ１Ｄ１４上のＤＣＶ投与の１．５時間後に取り出して、定常状態のピークＤＣＶ血漿濃度を評価し得る。血漿ＤＣＶ濃度は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８逆相（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）カラムを使用して決定され得る。試料の溶出は、９ｍＭのオルトリン酸水素二カリウム緩衝液（ｏ－リン酸で調整したｐＨ４±０．１）：アセトニトリル（６０：４０ｖ／ｖ）からなる移動相を使用して達成し得る。調製した移動相を０．４５μｍ膜フィルターで濾過し、超音波浴中で３０分間脱気してから使用し得る。注入速度は０．１ｍＬ／分であり、注入量は１０μＬであり得る。カラム温度は４０℃に維持され得る。静止相の平衡、コンディショニング、及び事前洗浄は、３０～４５分間行われ得る。

有害事象は、臨床試験を通じてモニタリングすることができる。患者は、各サイクルの１日目に、病歴、身体、及び血液検査を受けることができる。血液検査を使用して、血液学的、腎臓、及び肝臓の機能を評価し得る。毒性は、有害事象ｖ５．０の一般用語基準で等級付けされ得る。独立した医療観察者が治験データをレビューするように任命され、過剰な毒性が観察された場合は治験の中止を勧告する。ＣＴ及び骨スキャンは、３サイクル毎に実施され得る。

ＤＣＶの予備的な有効性エビデンスは、６ヶ月時点のＰＳＡ応答率（少なくとも５０％のＰＳＡ低下）、疾患制御率（ＤＣＲ）、及び全生存期間（ＯＳ）に基づいて導出され得る。以前のデータは、Ｔｒｉｂ２がエンザルタミド耐性前立腺がんにおいて過剰発現されることを示唆している。探索的分析では、ＰＳＡ応答率は、治療前の生検試料を使用して評価された陽性及び陰性のＴｒｉｂ２発現患者において別々に記載され得る。統計的仮説検定は任意選択による。

試験対象集団：プロトコルは、エンザルタミド治療後に進行した、組織学的に確認された転移性前立腺がんを有する男性を登録することができる。事前のエンザルタミド治療及び事前のドセタキセル療法が必要である。患者は、更なる標準治療を使い果たすか又は拒否すべきである。ＤＣＶは、Ｂ型肝炎の再活性化、徐脈及び低血糖の警告を伴うため、これらの状態は除外される。

ダクラタスビルは、ＣＹＰ３Ａの基質であり、薬物間相互作用の可能性を有する。その他の適格性基準には以下が含まれる：
－１８歳以上、ＫＰＳ＞７０％
－過去１４日以内に投与された治験薬はない
－活動性脳転移、精神疾患、過去６ヶ月間にＴＩＡ若しくはＣＶＡ、活動性感染（ＨＩＶを含む）、活動性続発性悪性腫瘍、又は他の重大な制御不能の併存疾患がない。
－過去１ヶ月間に管理されていない糖尿病又は低血糖のエピソードを有する任意の患者は、不適格である
－クラスＩＩＩ又はＩＶのＣＨＦ、不安定狭心症、アミオダロン療法を必要とする、又は心臓ブロック若しくは徐脈性不整脈の病歴がある場合、心疾患の患者は不適格である
－強力なＣＹＰ３Ａ４誘導薬及び阻害薬による治療を必要とする患者は不適格である。
－現在又は以前のＨＢＶ又はＨＣＶ感染の証拠がない
－ＡＮＣ＞１００Ｋ、血小板＞１００Ｋ、総ビリルビン＜１．５×ＵＬＮ、ＡＳＴ／ＡＬＴ＜３．０ ×ＵＬＮ、ＣｒＣｌ＞５０ｍｌ／分、ヘモグロビン＞９ｇｍ／ｄＬ、血清アルブミン＞２．８ｇｍ／ｄＬによって証明される、十分な臓器機能が必要である

試料サイズの妥当性：上記の方法論に基づいて、ＲＰ２Ｄを決定するために必要な最小サンプルサイズは、３人の患者である。ＤＬＴは開始用量では予想されず、このレベルで治療された３人の患者で標的血漿濃度が達成された場合、１日６０ｍｇ ｐｏがＲＰ２Ｄであり得る。低用量レベルのいずれかで標的血漿濃度が満たされない場合、及びＤＬＴが各用量レベルでコホート拡大を必要とする場合、必要な最大サンプルサイズは、４つの用量レベルの各々で処置された６人の患者、又は合計２４人の患者となる。

実現可能性：例えば、ヘンリーフォード病院、ヘンリーフォードヘルスシステム、デトロイトキャンパス（２７９９ Ｅ ＧｒａｎｄＢｌｖｄ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ ４８２０２）等の施設での、転移性去勢耐性前立腺がん（ｍＣＲＰＣ）臨床試験における過去の発生は、１ヶ月に約１～２回である。患者は、追加の病院、地域保健センター、及び／又はサテライト（例えば、Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＨＦＣＩ）内のサテライト及び地域センター、例えば、Ａｌｌｅｇｉａｎｃｅ、Ｍａｃｏｍｂ、Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）から積極的に募集されてもよく、適格な患者集団を約２倍にする機会を提供する。この第Ｉ相試験の標的患者集団は、標準的な選択肢を使い果たしたｍＣＲＰＣ患者であるため、全てのＨＦＣＩ部位について参加意思のある患者の増加したプールが予想される。そして、１ヶ月に約２～３人の患者の合計の発生を伴って、１２ヶ月未満で発生を完了する実現可能性が高い。

Claims (18)

1. がんの予防又は治療を必要とする対象においてがんを予防又は治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）をがんに罹患している対象に投与することを含む、方法。
2. 前記がんが、前立腺がん又は肺がんである、請求項１に記載の方法。
3. 前記対象が、治療ナイーブであるか、又は抗がん剤で以前に治療されており、前記抗がん剤に対して難治性である、請求項２に記載の方法。
4. 前記以前の抗がん剤が、アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）である、請求項２に記載の方法。
5. 前記前立腺がんが、ＡＤＴに耐性があり、任意選択で、前記対象が、以前にＡＤＴで治療されており、前記がんが、ＡＤＴに対する耐性を発達させている、請求項２に記載の方法。
6. 前記ＡＤＴが、薬学的ＡＤＴであり、任意選択で、前記薬学的ＡＤＴが、抗アンドロゲン剤による治療である、請求項２又は３に記載の方法。
7. 前記抗アンドロゲン薬が、エンザルタミドである、請求項４に記載の方法。
8. 前記がんが、エンザルタミド耐性前立腺がん（ＥＲＰＣ）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記がんが、肺がんである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記対象のがん由来のがん細胞が、対応する非がん細胞におけるＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
11. （ｉ）前記がん細胞が、前記対象の前記対応する非がん細胞におけるＴＲＩＢ２のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現する、かつ／又は
    （ｉｉ）前記がん細胞が、がんに罹患していない対象に由来する前記対応する非がん細胞におけるＴＲＩＢ２のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現する、請求項１１に記載の方法。
12. 前記がん細胞及び前記非がん細胞が、同じ種類の組織に由来し、任意選択で、前記がん細胞及び前記非がん細胞が、前立腺組織に由来する、請求項１１又は１２に記載の方法。
13. 前記ＤＣＶが、併用療法の一部として投与され、任意選択で、前記併用療法が、ＤＣＶ及びエンザルタミドを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記治療が、
    （ｉ）前記対象における腫瘍体積又は腫瘍量を減少させること、
    （ｉｉ）対象における腫瘍成長を阻害すること、及び／又は
    （ｉｉｉ）前記対象の腫瘍におけるＴＲＩＢ２タンパク質のレベルを低下させることを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
15. がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量のダクラタスビル（ＤＣＶ）を前記対象に投与することを含み、前記対象におけるがん細胞が、対応する非がん細胞によって発現されるＴｒｉｂｂｌｅｓホモログ２（ＴＲＩＢ２）のレベルと比較して、より高いレベルのＴＲＩＢ２を発現する、方法。
16. （ｉ）前記対応する非がん細胞が、前記対象に由来する、かつ／又は
    （ｉｉ）前記対応する非がん細胞が、がんに罹患していない対象に由来する、請求項１６に記載の方法。
17. 前記がん細胞及び前記対応する非がん細胞が、前立腺組織に由来し、任意選択で、前記がん細胞及び前記対応する非がん細胞が、前立腺の細胞である、請求項１６又は１７に記載の方法。
18. 前記がん細胞及び前記対応する非がん細胞が、肺組織に由来し、前記がん細胞が、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん、腺がん、扁平上皮がん、細気管支肺胞上皮がん、及び大細胞がんであるか、又はそれらに由来する、請求項１６又は１７に記載の方法。

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