JP2023520475A - 免疫抗がん療法に対するバイオマーカーおよびその用途 - Google Patents

免疫抗がん療法に対するバイオマーカーおよびその用途 Download PDF

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Abstract

本発明のＤＲＧ２は、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおいて免疫抗がん剤に対するがん患者の治療反応または予後に対する予測因子であり、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおいて免疫抗がん剤の投与決定のためのコンパニオン診断に使用できるバイオマーカーである。本発明を通じて、免疫抗がん剤の投与の有無を決定することによって、治療反応を示す患者に選別的に免疫抗がん剤を投与することができ、より効果的にＰＤ－Ｌ１陽性がんを治療することができることが期待される。【選択図】図６

Description

本発明は、免疫抗がん療法に対するバイオマーカーおよびその用途に関する。
腫瘍細胞は、腫瘍微細環境で免疫防御を避けるために、いくつかの方式で宿主免疫力に作用する。このような現象は、一般的に、「癌免疫回避（ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ）」と称される。このようなシステムにおいて最も重要な構成成分の一つは、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）受容体およびそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ）によって媒介される免疫抑制共シグナル（免疫チェックポイント）である。
ＰＤ－１受容体およびＰＤ－Ｌ１リガンドは、免疫調節において必須の役割を行う。活性化したＴ細胞上で発現するＰＤ－１は、間質細胞、腫瘍細胞、またはその両方により発現するＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２によって活性化し、これを通じて、Ｔ細胞の死滅および局所化した免疫抑制を開始して、腫瘍発達および成長のための免疫寛容される環境を潜在的に提供する。反対に、このような相互作用の抑制は、局所的Ｔ細胞反応を向上させ、抗腫瘍活性を媒介することができる（Ｉｗａｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２；９９：１２２９３－９７）。
したがって、最近では、人体の免疫体系を活性化させてがん細胞を殺す治療法として、免疫抗がん療法（ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、特に免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）が開発されて、がんの治療に使用されている。最も広く使用されている免疫チェックポイント阻害剤としては、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に対するモノクローナル抗体を使用した阻害剤がある。この阻害剤は、Ｔ細胞の表面にあるＰＤ－１とがん細胞の表面にあるＰＤ－Ｌ１との結合を抑制して、Ｔ細胞など免疫細胞を活性化させることによって、がん細胞を除去するが、がん患者の生存率を画期的に増加させ、一部の患者の場合、数年間がんの再発がないことが報告された。
ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に対するモノクローナル抗体を使用した阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１を発現するがん細胞にのみ効果を示す。したがって、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１阻害剤を使用する前に、がん組織でＰＤ－Ｌ１の発現を分析して、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんのみに対して適用している。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんの場合にも、５０％以上のがん患者がＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１阻害剤に反応しないことが報告されているが、まだその理由を知らない。したがって、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１を対象とする免疫抗がん剤を用いてがんを効果的に治療するためには、ＰＤ－Ｌ１を発現するがん細胞がＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１阻害剤に反応しない理由を明らかにし、これに基づいてＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１阻害剤に高い治療効果を示す患者を選別することに対する必要性が提起されているのが現状である。
本発明は、前述のような従来技術上の問題点を解決するためになされたものであって、免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物、キット、またはこれを用いた免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測に関する情報提供方法などを提供することをその目的とする。
より詳しくは、本発明者らは、ＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現レベルが減少した場合、がん細胞においてＰＤ－Ｌ１が発現しているにもかかわらず、がん細胞を死滅させることができるＴ細胞が活性化していることを確認して、ＤＲＧ２の発現レベルが、がん細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現および細胞死滅Ｔ細胞の活性化の両方に関連していることを確認し、ＤＲＧ２の発現レベルの測定を通じてＰＤ－Ｌ１陽性がんの免疫抗がん剤に対する治療反応性を予測することができることを確認することによって、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物またはキットを提供することにある。
本発明の他の目的は、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のためのコンパニオン診断（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）用組成物またはキットを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための情報提供方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための情報提供方法を提供することにある。
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。
本発明は、ＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物を提供する。
また、本発明は、前記免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物を含む、免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用キットを提供する。
また、本発明は、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のためのコンパニオン診断（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）用組成物を提供する。
それだけでなく、本発明は、前記ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のためのコンパニオン診断用組成物を含む、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のためのコンパニオン診断（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）用キットを提供する。
本発明の一具現例において、前記ＤＲＧ２遺伝子のレベルを測定する製剤は、好ましくは、ＤＲＧ２遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブであってもよいが、ＤＲＧ２遺伝子配列の全部または一部を増幅して、ＤＲＧ２遺伝子の発現量を測定できる製剤であれば、これに限定されるものではない。
本発明の他の具現例において、前記ＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤は、好ましくは、ＤＲＧ２タンパク質に特異的に結合する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）であってもよく、前記抗体は、抗体の全部または一部であってもよいが、ＤＲＧ２タンパク質に結合してタンパク質の量を測定できる製剤であれば、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記免疫抗がん剤は、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）またはＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）に特異的に結合する薬物であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記ＰＤ－１に特異的に結合する薬物は、抗ＰＤ－１抗体であってもよく、好ましくは、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）などであってもよいが、ＰＤ－１に特異的に結合して免疫抗がん剤の役割をすると知られている薬物であれば、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する薬物は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体であってもよく、好ましくは、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）などであってもよいが、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合して免疫抗がん剤の役割をすると知られている薬物であれば、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、ＰＤ－Ｌ１陽性がんの免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用であってもよいが、これに限定されるものではない。前記ＰＤ－Ｌ１陽性がんは、一例として、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）検査を通じてＰＤ－Ｌ１発現に対して陽性判定を受けたがんであってもよいが、一般的に使用されているＰＤ－Ｌ１陽性がんを判定する方法によって判定されたＰＤ－Ｌ１陽性がんであれば、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、対照群と比較してＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現レベルが減少したがんを免疫抗がん剤に対する治療反応性の低いがんまたは予後の悪いがんと予測できるが、これに限定されるものではない。前記対照群は、正常ヒト、すなわち、がんを有していないヒトから分離した生物学的試料においてのＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現レベルであるか、または、がん組織でなく、がん組織周囲の正常組織で測定されたＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現レベルであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、対照群と比較して、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現レベルが減少したＰＤ－Ｌ１陽性がんを免疫抗がん剤に対する治療反応性の低いがんまたは予後の悪いがんと予測できるが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現減少は、間接的にがん細胞の表面で発現したＰＤ－Ｌ１レベルの減少を示すことができ、これは、がん細胞ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞ＰＤ－１との結合量の減少を示すことができ、または、がん細胞におけるＰＤ－Ｌ１レベルの増加、およびＣＤ８ Ｔ細胞の数またはその活性増加を示すことができるが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルは、好ましくは、がん患者から分離した生物学的試料から測定することができ、前記生物学的試料は、がん細胞、がん組織、血液、血漿、血清、骨髄、唾液、尿、便などであり、好ましくは、がん細胞またはがん組織であるが、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質を含んでいる試料であれば、これに限定されるものではない。
また、本発明は、がん患者から分離した生物学的試料からＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する段階を含む、免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための情報提供方法を提供する。
さらに、本発明は、ＰＤ－Ｌ１陽性がん患者から分離した生物学的試料からＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する段階を含む、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対するコンパニオン診断のための情報提供方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の測定レベルが対照群と比較して減少した場合、免疫抗がん剤に対する治療反応性が低いかまたは予後が悪いものと予測できるが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、ａ）がん患者から分離した生物学的試料からＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する段階と、ｂ）前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の測定レベルが対照群と比較して減少した患者を選別する段階と、ｃ）前記選別された患者に免疫抗がん剤を投与する段階と、を含む、がんの治療方法を提供する。
また、本発明は、ＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤を含む組成物の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための用途を提供する。
また、本発明は、ＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤を含む組成物の免疫抗がん剤の投与のための患者を選別する用途を提供する。
本発明のＤＲＧ２は、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおいて免疫抗がん剤に対するがん患者の治療反応または予後に対する予測因子であり、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおいて免疫抗がん剤の投与決定のためのコンパニオン診断に使用できるバイオマーカーである。具体的に、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおいて組織細胞の内部および／または表面に存在するＤＲＧ２の量を測定した後、測定されたＤＲＧ２の量を分析して、免疫抗がん剤の投与の有無を決定することができる。本発明の選別方法を通じて免疫抗がん剤の投与の有無を決定することによって、高い治療効果を示す患者に選別的に免疫抗がん剤を投与することができ、より効果的にＰＤ－Ｌ１陽性がんを治療することができることが期待される。
図１は、臨床データベースにおいてのＰＤ－Ｌ１高発現とＤＲＧ２低発現との関連性を示す。 具体的に、図１ａは、ＴＣＧＡ腫瘍における高いＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）遺伝子発現およびＧＥＰＩＡ（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｃｕｒｖｅ）を使用したＧＴＥｘデータに基づく全体生存率を示す。 図１ｂは、ＴＣＧＡ腫瘍における低いＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）遺伝子発現およびＧＥＰＩＡ（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｃｕｒｖｅ）を使用したＧＴＥｘデータに基づく全体生存率を示す。 図２ａ～図２ｅは、黒色腫腫瘍モデルにおいてＤＲＧ２欠乏がＣＤ８ Ｔ細胞の活性を増進させることを示す。 具体的に、図２ａは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（左）およびウェスタンブロット（右）で確認したＤＲＧ２４ノックダウン結果である。 図２ｂは、対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ黒色腫（５×１０５細胞）をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した後、黒色腫の成長を１８日間観察した結果である。 図２ｃは、ＴＩＬｓ（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）内ＣＤ８＋ＩＦＮ－γ＋ Ｔ細胞、ＣＤ３－ＮＫ１．１＋ ＮＫ細胞、ＣＤ１１Ｃ＋Ｆ４／８０＋ Ｍ１ ＭΦおよびＣＤ２０６＋Ｆ４／８０＋ Ｍ２ ＭΦのフローサイトメトリー結果を示す。 図２ｄは、抑制リガンドであるＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｇａｌ－９および活性化リガンドである４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、および抑制および活性化リガンドであるＣＤ８０、ＣＤ８６のようなＴ細胞免疫チェックポイントのレベルを原発性対照群とＤＲＧ２ ＫＤ原発性黒色腫においてｑＲＴ－ＰＣＲで測定した結果である。 図２ｅは、抗体処理された原発性黒色腫溶解物のウェスタンブロット結果（左）およびＰＤ－Ｌ１レベルに対するフローサイトメトリー結果（右）である。 図３ａ～図３ｆは、黒色腫においてＤＲＧ２欠乏がＩＦＮ－γによって誘導された（ＩＦＮ－γ－ｉｎｄｕｃｅｄ）ＰＤ－Ｌ１の発現をＩＦＮ－γｐａｔｈｗａｙの増進を通じて増加させることを示す。 具体的に、図３ａおよび図３ｂは、対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ Ｂ１６Ｆ１０細胞において２４時間の間ＩＦＮ－γの処理（５ｎｇ／ｍｌ）によるＰＤ－Ｌ１発現の変化を示すｑＲＴ－ＰＣＲ結果およびＰＤ－Ｌ１レベルに対するフローサイトメトリー結果をヒストグラムで示した。 図３ｃは、用量依存的に２４時間の間ＩＦＮ－γ処理された対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ Ｂ１６Ｆ１０細胞におけるＩＦＮ－γ－ＳＴＡＴ１シグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対するウェスタンブロット結果である。 図３ｄは、ＰＤ－Ｌ１のＩＲＦ１転写因子に対するｑＲＴ－ＰＣＲ分析結果である。 図３ｅは、ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ウェルプレート（左）および２４ ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレート（右）で４８時間の間ＩＦＮ－γ前処理されたり、処理されない対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ Ｂ１６Ｆ１０細胞と共培養した活性化したｐｒｉｍａｒｙ ＣＤ４ Ｔ細胞のｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ－２のレベルを示す。 図３ｆは、対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ Ｂ１６Ｆ１０細胞の上清液で培養した活性化したｐｒｉｍａｒｙ ＣＤ４ Ｔ細胞のＩＬ－２ ｍＲＮＡ（左）およびｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ－２（右）のレベルを示す。 図４ａ～図４ｃは、ＤＲＧ２欠乏黒色腫においてＰＤ－Ｌ１が組換えＰＤ－１との結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を減少させたことを示す。 具体的に、図４ａは、黒色腫における組換えＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用に対するフローサイトメトリー結果を示す。対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ黒色腫細胞をＩＦＮ－γ（０．５ｎｇ／ｍｌ）で２４時間の間処理したり、処理しなかった後、フローサイトメトリー３０分前に組換えＰＤ－１（１μｇ／ｍｌ）を１０分間処理した。 図４ｂは、ＩＦＮ－γ（０．５ｎｇ／ｍｌ）を２４時間の間処理したり、処理しなかった対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ黒色腫細胞のＰＤ－Ｌ１に対するフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用親和性（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ）は、ＰＤ－Ｌ１＋細胞に対するＰＤ－１＋の％で計算した。 図４ｃは、対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ細胞におけるＰＤ－Ｌ１＋細胞当たりＰＤ－１と相互作用する細胞の割合を示す。 図５ａ～図５ｃは、ＤＲＧ２欠乏が細胞内ＰＤ－Ｌ１を増加させることを示す。 具体的に、図５ａは、ＩＦＮ－γが処理されたり、処理されなかった対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ Ｂ１６Ｆ１０細胞溶解物においてＥｎｄｏ Ｈ処理によるＰＤ－Ｌ１脱グリコシル化（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に対するウェスタンブロット結果（左）およびこれに対するグラフ（右）である。 図５ｂは、対照群およびＤＲＧ２ ＫＤ黒色腫細胞においてＩＦＮ－γ処理または無処理後のＰＤ－Ｌ１のタンパク質発現を示す共焦点顕微鏡イメージ（左）およびこれに対するグラフ（右）である。赤色蛍光がＰＤ－Ｌ１を示し、青色蛍光が核を示す。 図５ｃは、対照群およびＤＲＧ２ ＫＤヒトの卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ３）においてＩＦＮ－γ処理後のＰＤ－Ｌ１のタンパク質発現を示す共焦点顕微鏡イメージ（左）およびこれに対する細胞の表面に発現したＰＤ－Ｌ１割合を示すグラフ（右上）およびＤＲＧ２ ＫＤ、ＩＦＮ－γの効果を確認するウェスタンブロット結果（右下）である。赤色がＰＤ－Ｌ１を示し、青色が核を示す。 図６は、ＤＲＧ２の発現レベルの変化によるがん細胞の表面におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベル変化およびこれによるがん細胞の表面のＰＤ－Ｌ１とＴ細胞のＰＤ－１との相互作用の変化を簡略に示す図である。
本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１陽性がん患者に免疫抗がん剤を投与する場合、２０～３０％のがん患者にのみ免疫抗がん剤が治療効果を示す点に着目して、免疫抗がん剤の投与のための患者を選別する方法について鋭意研究した結果、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現が減少した患者の場合には、ＰＤ－Ｌ１が細胞の表面に正常に位置しなくて、免疫抗がん剤に対する治療効果が低いことを確認して、本発明を完成した。より詳しくは、一般的にＰＤ－Ｌ１の発現が増加する場合、Ｔ細胞など免疫細胞の活性化が減少して生存率が減少するが、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現が減少した場合、ＰＤ－Ｌ１の発現が増加するが、がんの成長は抑制されることを確認した。これについて詳しく研究した結果、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現が減少した場合、発現が増加したＰＤ－Ｌ１が細胞の表面に正常に位置しなくて、ＰＤ－１との結合程度が減少することを確認した。すなわち、ＰＤ－１に対する免疫抗がん剤またはＰＤ－Ｌ１に対する免疫抗がん剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を抑制することによって、免疫抗がん剤の効能を示す、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現量が減少したがんでは、免疫抗がん剤が作用できないことが確認できた。すなわち、従来のＰＤ－Ｌ１の発現量だけを測定して免疫抗がん剤を投与する方法では、免疫抗がん剤に対する治療効果を示すことができる患者を正確に選別できないことが確認できた。したがって、本発明は、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現が増加したがん患者、またはＰＤ－Ｌ１陽性がん患者であり、同時に、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現が増加したがん患者を免疫抗がん剤を投与する患者として選別する方法を提供することによって、免疫抗がん剤に対する治療効率を顕著に高めて、がん患者の苦痛および治療費用を効果的に減少させることができることが期待される。
本明細書において、ＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ２）とは、細胞内の様々な調節に関与するタンパク質であり、ｌａｒｇｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙを成していることが知られており、このようなｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙには、ｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（例えば、ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（例えば、ｒａｓ）およびタンパク質の合成に関与するＧＴＰａｓｅ（例えば、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｔｕ）などのような重要な３個のｓｕｂｆａｍｉｌｙが存在するが、最近、これらと塩基配列および機能が互いに異なる新しいグループのＧ ｐｒｏｔｅｉｎが発見され、これらのうち一つであるＤＲＧ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＧＴＰと結合に必要なＧ１からＧ５までの５個のｒｅｇｉｏｎを全部有しており、サイズは、ｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎと類似している。しかしながら、アミノ酸配列がｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎだけでなく、従来のＧ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｆａｍｉｌｙと全く異なる特性を有していて、新しいｓｕｂｆａｍｉｌｙに区分されている。
また、ＤＲＧにはＤＲＧ１とＤＲＧ２があり、細菌からヒトに至るまでほぼすべての種類の細胞に存在する。例えば、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ，Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ，Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ，Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどに存在することが確認された。しかしながら、まだＤＲＧ２が、がん細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現および細胞死滅Ｔ細胞の活性化と関連していることについては知られていない。
本明細書において、「ＤＲＧ２の遺伝子またはタンパク質のレベル（または発現レベル）」は、ＤＲＧ２遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルとこれから発現するＤＲＧ２タンパク質の発現レベルを全部含む意味で使用される。本明細書において、前記「遺伝子のレベル（発現レベル）」は、免疫抗がん剤に対する治療効果を予測するために、生物学的試料からＤＲＧ２遺伝子のｍＲＮＡ存在の有無および／または発現程度を確認する過程であり、ｍＲＮＡの量を測定することによって確認できる。このための分析方法としては、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＲＮＡ塩基配列決定法（ＲＮＡ－ｓｅｑ；ＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ナノストリング、ＤＮＡマイクロアレイチップなどがあるが、ｍＲＮＡの発現量を測定できる方法であれば、これに限定されない。また、本明細書において、前記「タンパク質のレベル（発現レベル）」は、免疫抗がん剤に対する治療効果を予測するために、生物学的試料からＤＲＧ２遺伝子からコード化されたタンパク質の存在の有無と発現レベルを確認する過程であり、前記タンパク質に対して特異的に結合する抗体、アプタマーなどを用いてタンパク質の量を確認したり、タンパク質の活性を測定することによって確認できる。このための分析方法としては、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（Ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈降分析（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）、リガンドバインディングアッセイ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析、２次元電気泳動分析、液体クロマトグラフィー－質量分析（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＬＣ－ＭＳ）、ＬＣＭＳ／ＭＳ（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）などがあるが、タンパク質の発現量を測定できる方法であれば、これに限定されない。
本明細書において、「コンパニオン診断（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）」とは、特定の治療薬物を特定の患者に適用するための可能性を確認するための診断テストの一つを意味するものであり、本発明では、ＰＤ－Ｌ１陽性がんを有する個体に免疫抗がん剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体）を適用するための可能性を確認するために、がん患者においてＤＲＧ２の発現レベルをコンパニオン診断マーカーとして共に測定することができる。
本明細書において、「免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための情報提供方法」とは、免疫抗がん剤に対する治療効果を予測し、これを介した予後を予測する方法に関し、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現が減少した患者の場合には、免疫抗がん剤に対する治療効果が低い可能性に関する情報を獲得する方法を意味する。
本明細書において、前記ＤＲＧ２遺伝子のレベルを測定する製剤は、ＤＲＧ２遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブであってもよいが、これに限定されるものではない。前記プライマーまたはプローブは、本発明のバイオマーカー（ＤＲＧ２）ヌクレオチド配列に対して相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列を有する。本明細書において使用される用語、「相補的」は、任意の特定のハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）またはアニーリング条件下で上述したヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするに十分な相補性を有することを意味する。したがって、用語「相補的」は、用語「完全相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは異なる意味を有し、本発明のプライマーまたはプローブは、上述したヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズすることができる程度であれば、一つまたはそれ以上のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基配列を有していてもよい。
本明細書において使用される用語、「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」は、好適な温度で好適な緩衝液内で好適な条件（すなわち、４種の異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび重合反応酵素）下で鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）配列と合成の開始点として作用できる一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの好適な長さは、多様な要素、例えば、温度とプライマーの用途によって変化があるが、典型的に１５～３０ヌクレオチドである。短いプライマー分子は、鋳型と十分に安定した混成複合体を形成するために、一般的にさらに低い温度を要求する。プライマーのデザインは、上述したヌクレオチド配列を参照して当業者により容易に実施されることができ、例えば、プライマーデザイン用プログラム（例：ＰＲＩＭＥＲ ３プログラム）を用いて製作することができる。
本明細書において使用される用語、「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」は、自然のまたは変形されたモノマーまたは連鎖（ｌｉｎｋａｇｅｓ）の線状オリゴマーを意味し、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含み、ターゲットヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることができ、自然的に存在したりまたは人為的に合成されたものであってもよい。
本明細書において、前記ＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤は、ＤＲＧ２タンパク質に特異的に結合する抗体またはアプタマーであってもよいが、これに限定されるものではない。
前記抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ＤＲＧ２タンパク質の一部または全部を抗原性部位として認知して、前記抗原性部位に特異的にかつ直接的に結合することを意味し、ポリクロナール（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体、モノクロナール（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体、またはその断片を全部含む。このような抗体は、当業者に知られた公知の方法で製作することができる。すなわち、前記モノクローナル抗体は、当業界に広く公知となった融合方法（ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、組換えＤＮＡ方法またはファージ抗体ライブラリー技術を用いて製造することができる。
前記アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）は、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と呼ばれるオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ライブラリーを用いた進化的な方法によって特定の化学分子や生物学的分子に高い親和力と選別力を持って結合するオリゴマーを分離して収得することができる。アプタマーは、標的に特異的に結合し、標的の活性を調整することができるが、例えば、結合を通じて標的が機能する能力を遮断することができる。
本明細書において、「免疫抗がん剤」は、免疫チェックポイント阻害剤とも呼ばれる、一つ以上の免疫チェックポイントタンパク質を全体的にまたは部分的に抑制、妨害または調節する物質を意味する。免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化または機能を調節する。多数の免疫チェックポイントタンパク質、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４などが公知となっている。これらのタンパク質は、Ｔ細胞反応の共刺激性または抑制性相互作用に関与する。免疫抗がん剤は、抗体を含んでもよいし、抗体に由来してもよい。
本明細書において、前記免疫抗がん剤は、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）に特異的に結合する薬物であってもよいが、これに限定されるものではない。一つの特定例において、前記ＰＤ－１に特異的に結合する薬物は、抗ＰＤ－１抗体であってもよく、前記抗ＰＤ－１抗体の例としては、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）などが挙げられる。
本明細書において、前記免疫抗がん剤は、ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）に特異的に結合する薬物であってもよいが、これに限定されるものではない。一つの特定例において、前記ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する薬物は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体であってもよく、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例としては、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）などが挙げられる。
前記「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイントタンパク質に対して特異的に結合して免疫チェックポイント抑制活性を示す物質である。前記抗体の範囲には、完全な形態の抗体だけでなく、抗体分子の抗原結合部位も含まれる。
本明細書において、「がん（ｃａｎｃｅｒ）」は、浸潤によって局部的にそして転移を通じて体系的に拡張できる低酸素骨髄にある幹細胞から発生した各種血液がんと共に、無限成長が予告される悪性の固形腫瘍をいう。特にこれらに限らないが、がんの具体的な例としては、副腎がん、骨がん、脳がん、乳がん、気管支がん、結腸がんおよび／または直腸がん、胆のうがん、消化管がん、頭頸部がん、腎臓がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、神経組織がん、膵臓がん、前立腺がん、副甲状腺がん、皮膚がん、胃がん、および甲状腺がんが含まれる。がんの他の例としては、腺がん、腺腫、基底細胞がん、子宮頸部異形成および上皮内がん、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）肉腫、扁平上皮がん種、液腺細胞がん、悪性脳腫瘍、母細胞がん、腸の神経節細胞腫、過形成角膜神経がん、島細胞がん、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）肉腫、平滑筋腫、白血病、リンパ腫、悪性がん様腫、悪性黒色腫、悪性高カルシウム血症、マルファン体型（ｍａｒｆａｎｏｉｄ ｈａｂｉｔｕｓ）がん、髄様がん、転移性皮膚がん、粘膜神経種、骨髄異形成症候群、骨髄腫、菌状息肉症、神経芽細胞腫、骨肉腫、骨原性およびその他肉腫、卵巣がん、クロム親和性細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、小細胞性肺がん、潰瘍性および乳頭状扁平上皮がん、精上皮腫、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、網膜芽細胞腫、腎細胞腫瘍または腎細胞がん、網状細胞性肉腫、およびウィルムス腫瘍が含まれる。がんの具体的な例としては、また、星細胞腫、消化管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒ，ＧＩＳＴ）、神経膠腫または神経膠芽腫、腎細胞がん（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＲＣＣ）、肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）、および膵臓神経内分泌がんが含まれる。好ましくは、肺がん、胃がん、神経膠腫、肝がん、黒色腫、腎臓がん、尿路上皮がん、頭頸部がん、メルケル細胞腫、前立腺がん、血液がん、乳がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、脳がん、卵巣がん、膀胱がん、気管支がん、皮膚がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、甲状腺がん、骨がんおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるが、これに限らない。
本発明において、本発明の組成物は、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用でありうるが、これに限定されるものではない。前記ＰＤ－Ｌ１陽性がんは、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）検査を通じてＰＤ－Ｌ１発現に対して陽性判定を受けたがんであってもよく、免疫組織化学検査を通じてＰＤ－Ｌ１陽性がんであるか陰性がんであるかどうかを決定する方法およびそのためのキット（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡＴＭのコンパニオン診断キットであるＰＤ－Ｌ１ ＩＨＣ ２２Ｃ３ ｐｈａｒｍＤｘ）などが公知となっている。
ＰＤ－Ｌ１コンパニオン診断キット（例えば、ＰＤ－Ｌ１ ＩＨＣ ２２Ｃ３ ｐｈａｒｍＤｘ）は、染色時に、細胞膜と細胞質内部のＰＤ－Ｌ１を全部染色させて、ＰＤ－Ｌ１の発現程度がどの程度であるかを確認し、これに基づいて、ＰＤ－Ｌ１陽性がん（Ｔｕｍｏｒ Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ Ｓｃｏｒｅ≧５０％）である場合、治療剤として免疫抗がん剤（例えば、キイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ））を使用する方式で使用されている。すなわち、免疫抗がん剤の投与の有無の決定をがん組織内でＰＤ－Ｌ１を発現するがん細胞の割合に基づいて判断している。がんのＰＤ－Ｌ１は、ＣＤ８ Ｔ細胞を抑制する機序を有していて、これによって、がんの成長をさらに促進させる。反対に、免疫抗がん剤は、ＰＤ－Ｌ１を抑制させてＴ細胞の活性を増加させることによってがん患者を治療する方式である。このような治療をするためには、がん組織においてＰＤ－Ｌ１がよく発現していなければならない。ＰＤ－Ｌ１の発現がうまくいかないがん患者に免疫抗がん剤を投与する場合には、治療効果をほとんど示さない。
本明細書において、「ＰＤ－Ｌ１陽性」は、少なくとも約１％のＰＤ－Ｌ１発現を意味する。ＰＤ－Ｌ１の発現は、関連技術分野において公知となっている任意の方法によって測定されることができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１の発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）により測定されることができる。ＰＤ－Ｌ１陽性がん（腫瘍）は、ＩＨＣによって測定した結果、腫瘍細胞の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％または少なくとも約２０％がＰＤ－Ｌ１を発現するがんでありうる。
本発明において、本発明の「キット（ｋｉｔ）」は、試料内のＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定して、免疫抗がん剤に対する治療効果を予測できる検診用機器を意味し、がん患者から分離した生物学的試料からＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の量を確認できる形態であれば、制限がない。前記キットは、遺伝子増幅キット、マイクロアレイチップなどの形態でありうるが、これに限定されるものではない。前記用語「増幅」は、核酸分子を増幅する反応を意味する。多様な増幅反応が当業界に報告されており、例えば、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号、第４８００１５９号に開示されている。前記マイクロアレイにおいて、プローブを含んでもよいし、プローブは、ハイブリダイゼーションアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として用いられ、基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に固定化される。好ましい基体は、好適な堅固性または半堅固性支持体であり、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウェハー、ファイバー、磁性ビーズまたは非磁性ビーズ、ゲル、チュービング、プレート、高分子、微小粒子および毛細管を含んでもよい。前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、前記基体上に配列されて固定化される。このような固定化は、化学的結合方法またはＵＶのような共有結合的方法によって実施されることができる。本発明のマイクロアレイに適用される試料は、標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）されてもよく、マイクロアレイ上のアレイ要素とハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション条件は多様にすることができる。ハイブリダイゼーション程度の検出および分析は、標識物質によって多様に実施することができる。また、本発明のキットには、対照群としてｈｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎなどをさらに含んでもよい。
本明細書において使用される用語、「基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）または対照群」は、遺伝子（ｍＲＮＡ）またはタンパク質の過発現／低発現を区分する基準となる値を意味する。前記基準値は、例えば、正常ヒトの平均ｍＲＮＡ／タンパク質発現レベルであるか、または、がん組織周囲の正常組織の平均ｍＲＮＡ／タンパク質発現レベルであってもよいが、これに限定されるものではない。また、前記基準値または対照群は、特定の患者群の平均ｍＲＮＡ／タンパク質発現レベルの分布によって定められることができるが、これに限定されるものではない。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、ただ本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
［実施例］
実験材料および実験方法
細胞培養
マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１、Ｂ１６Ｆ１０細胞株およびヒト卵巣がんＳＫＯＶ３細胞株は、韓国細胞株バンク（ＫＣＬＢ－ソウル、韓国）から購入した。細胞を５％ＣＯ２の加湿大気下で３７℃の温度で１０％ウシ胎児血清（ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）が添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。Ｂ１６Ｆ１０細胞株において遺伝子発現に対する低酸素症の効果は、９３％Ｎ２、５％ＣＯ２および２％Ｏ２で構成されたガス混合物を維持したマルチガスインキュベーター（Ｇａｌａｘｙ Ｒ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で細胞をインキュベートすることでテストした。
実験動物
６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをオリエントバイオ（釜山、韓国）から購入した。マウスを特定の病原体のない条件下で蔚山大学校の実験室の動物施設で飼育し、蔚山大学校の動物管理および使用委員会の指針によって使用した。
ＴＣＧＡ（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）データ分析
ＴＣＧＡ正常（ｎｏｒｍａｌ）と比較したＴＣＧＡ腫瘍のＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）遺伝子発現およびＧＥＰＩＡ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いたＧＴＥｘデータに基づいて全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）分析を行った。仮説検定と関連して、ＧＥＰＩＡは、ログ順位検定を考慮した。５０％（中央値）のＣＤ２７４発現臨界値によってＣＤ２７４高発現と低発現コホート（ｃｏｈｏｒｔ）を分類した。したがって、ＣＤ２７４発現レベルが５０％よりも高いかまたは低いサンプルをそれぞれ高発現コホート（ｃｕｔｏｆｆ－ｈｉｇｈ）および低発現コホート（ｃｕｔｏｆｆ－ｌｏｗ）に分類した。ＤＲＧ２発現プロファイルおよび一部の患者の臨床情報を含むデータは、ＧＥＰＩＡ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して収得した。サンプルのレベル（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＦＰＫＭ）標準化）を得た。
プラスミド、ｓｉＲＮＡ、トランスフェクションおよびレポーターアッセイ
マウスＤＲＧ２に対するｓｈＲＮＡ（ＤＲＧ２－ｓｈＲＮＡ、ＴＲＣ０００００４７１９５、５’－ＣＣＧＧＧＣＴＣＡＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＴＡＴＴＣＡＴＧＴＡＧＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＧ－３’（配列番号２５））を含むプラスミドコンストラクトｐＬＫＯ－ＤＲＧ２－ｓｈＲＮＡおよび非ターゲットｓｈＲＮＡ対照群ベクター（ＭＩＳＳＩＯＮ ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ ｎｏｎ－ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｈＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ，ＳＨＣ００２）をＳｉｇｍａから購入した。マウス／ヒトに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＤＲＧ２，５’－ＣＡＵＵＧＡＡＵＡＣＡＡＡＧＧＵＧＣＣＡＡＣＡ－３’（配列番号２６））および対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）は、ＧｅｎｅＰｈａｒｍａから購入した。
ＤＲＧ２－欠乏細胞を製造するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞をｐＬＫＯ－ＤＲＧ２－ｓｈＲＮＡでトランスフェクションさせ、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ９６２０）を用いてＢ１６Ｆ１０／ｓｈＤＲＧ２を選別した。ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ内非ターゲットｓｈＲＮＡを使用して対照群細胞Ｂ１６Ｆ１０／ｐＬＫＯを製造した。細胞は、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してトランスフェクションさせた。トランスフェクションの効率をモニタリングするために、ＧＦＰ発現ベクターｐＥＧＦＰ－Ｎ１／Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプラスミドコンストラクトと共に共同トランスフェクションさせた。トランスフェクション効率（＞８０％）を確認した後、細胞を追加研究に使用した。
リアルタイムおよび半定量（ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＲＴ－ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞からトータルＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してＲＮＡ濃度を測定した後、トータルＲＮＡ２μｇおよびＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｃＤＮＡを合成し、表１に記載された遺伝子特異的プライマーを使用したリアルタイムおよび半定量ＰＣＲで鋳型として使用した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、大田、韓国）を使用して半定量ＲＴ－ＰＣＲを実施した。
Figure 2023520475000002
ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
脱グリコシル化分析（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）のために、細胞抽出物内タンパク質または濃縮された上清液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ａｎｔｉ－ＤＲＧ２（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１（Ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ ＳＴＡＴ１（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ａｎｔｉ－β－ａｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）希釈液をそれぞれ処理した。免疫反応性（Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）バンドは、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して検出した。
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１相互作用分析（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１タンパク質相互作用を測定するために、懸濁細胞を４％パラホルムアルデヒドで常温で１５分間固定し、組換えヒトＰＤ－１ Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に１時間の間インキュベートした。２次抗体としてａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｄｙｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。核をＤＡＰＩ（ｂｌｕｅ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。そして、ＦＡＣＳフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｄｙｅの蛍光強度を測定した。
免疫細胞化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
免疫細胞化学の分析のために、細胞を４％パラホルムアルデヒドで常温で１５分間固定して、５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で５分間透過させた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）後、１次抗体を使用して染色した。２次抗体としてａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５９４ ｄｙｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅおよび／またはａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５９４ ｄｙｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。核は、４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ；ｂｌｕｅ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。マウントした（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）後、Ｏｌｙｍｐｕｓ １０００／１２００ ｌａｓｅｒ－ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｓｙｓｔｅｍを使用して細胞を観察した。
共培養（Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）およびＩＬ－２の測定
Ｔ細胞の不活性化に対する腫瘍細胞の影響を分析するために、腫瘍細胞をマウスＴ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で活性化したマウス脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞と共培養した。５：１（Ｊｕｒｋａｔ：ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ）の比で４８時間の間インキュベートした。培地内に分泌されたＩＬ－２のレベルをマウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。
統計的有意性
すべての実験は、最小３回以上繰り返し行い、結果は、平均値±標準偏差で示した。統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで確認し、Ｐ＜０．０５であれば、統計的に有意性があると判断した。Ｎｓは、ｎｏｎ－ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１を示す。
実験結果
実施例１．ＰＤ－Ｌ１と生存率の相関関係の確認
存知のように、ＰＤ－Ｌ１のレベルが高いとき、低い生存率を示すかについて、臨床データを用いて確認した。その結果は、図１ａおよび図１ｂに示した。
図１ａに示されたように、高いＰＤ－Ｌ１レベルを有するがん患者は、低い生存率を示すことを確認した。このような患者においてＤＲＧ２の発現量を確認した結果、正常な周囲組織と比べて、がん細胞においてＤＲＧ２の発現が増加したことを確認した。
これに対し、図１ｂに示されたように、ＰＤ－Ｌ１のレベルが高いが、生存率が高い患者においてＤＲＧ２の発現量を確認した結果、正常な周囲組織と比べて、がん細胞においてＤＲＧ２の発現が減少したことを確認した。
これを通じて、従来知られているように、ＰＤ－Ｌ１のレベルが高いとは、低い生存率を示すものではなく、これは、ＤＲＧ２の発現程度によって変化することが確認できた。
実施例２．ＤＲＧ２発現レベルによるがん成長および免疫細胞分布の確認
ＤＲＧ２発現レベルががんに及ぼす影響を確認するために、マウスにがんを注入し、がんの成長と免疫細胞の分布を確認した。その結果は、図２ａ～図２ｅに示した。
図２ａは、ＤＲＧ２４ノックダウン黒色腫においてＤＲＧ２のレベルが減少したことを示すｑＲＴ－ＰＣＲ（左）およびウェスタンブロット（右）の実験結果である。図２ａに示されたように、ｓｈＤＲＧ２でトランスフェクションされた細胞は、ＤＲＧ２の発現が減少したことを確認した。
図２ｂは、マウスの脇腹部分に細胞（ｐＬＫＯ／Ｂ１６Ｆ１０またはｓｈＤＲＧ２／Ｂ１６Ｆ１０）を皮下注射した後、時間の経過に伴うがんの成長を測定した結果である。図２ｂに示されたように、ＤＲＧ２のレベルが減少したがん細胞（ｓｈＤＲＧ２／Ｂ１６Ｆ１０）を注射した場合には、対照群（ｐＬＫＯ／Ｂ１６Ｆ１０）と比較して、がんの成長が抑制されたことを確認した。
上記のようながんの成長の差異が、がんの周囲にある免疫細胞の分布の違いによるものであるかを確認するために、フローサイトメトリーを実施した（図２ｃ）。がんの周囲には、多様な免疫細胞が存在し、これらのうち、がんを直接的に死滅させる役割をする主な細胞は、細胞死滅Ｔ細胞（ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ）である。したがって、ＤＲＧ２のレベルが減少したがん組織内のＣＤ８ Ｔ細胞の活性化した形態であるＣＤ８＋ＩＦＮ－ｇａｍｍａ＋ Ｔ細胞の分布を確認した。その結果は、図２ｃに示した。図２ｃに示されたように、ＣＤ８＋ＩＦＮ－ｇａｍｍａ＋ Ｔ細胞は、ｓｈＤＲＧ２／Ｂ１６Ｆ１０がん組織に顕著に増加したが、他の免疫細胞（間接的にＣＤ８ Ｔ細胞に影響を与える細胞）の場合には、対照群と差異がないことを確認した。これを通じて、がん細胞においてＤＲＧ２のレベルが減少すると、がん細胞がＣＤ８ Ｔ細胞の活性を調節せず、このような活性調節が他の免疫細胞による機序でなく、直接的にＣＤ８ Ｔ細胞との交流を通じて行われることを確認した。
Ｔ細胞を調節するのに重要な役割をするがん組織の表面タンパク質の量をｍＲＮＡレベルでｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。その結果は、図２ｄに示した。図２ｄに示されたように、ＤＲＧ２のレベルが減少したがん組織内のＴ細胞を活性化させる表面タンパク質と抑制させる表面タンパク質を全部確認した結果、Ｔ細胞の活性を抑制するＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現量が増加したことを確認した。
タンパク質レベルでも同じ効果を示すかを確認するために、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーを実施した。その結果は、図２ｅに示した。図２ｅに示されたように、ｍＲＮＡ結果と同様に、ＤＲＧ２のレベルが減少したがん組織内でＰＤ－Ｌ１タンパク質レベルが増加していることを確認した。
前記結果を通じて、一般的にがん組織内のＰＤ－Ｌ１の発現増加は、Ｔ細胞の活性化を抑制して、がんの成長および転移を促進させると知られているが、ＤＲＧ２レベルが減少したがん組織内では、ＰＤ－Ｌ１のレベルが増加するが、Ｔ細胞は活性化して、がんの成長を抑制することが確認できた。
実施例３．ＤＲＧ２発現レベルがＰＤ－Ｌ１の発現に及ぼす影響の確認
ＤＲＧ２のレベル減少が直接的にＰＤ－Ｌ１に及ぼす影響を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ上で実験を実施した。その結果は、図３ａ～図３ｆに示した。Ｔ細胞とがん組織間の交流を模倣するために、培地にＰＤ－Ｌ１の発現を増加させるサイトカインであるＩＦＮ－ｇａｍｍａを共に処理し、実験を進めた。
図３ａの上段グラフは、ｓｈＤＲＧ２を用いてＤＲＧ２のレベルを減少させたものであり、下段グラフは、ｓｉＤＲＧ２を用いてＤＲＧ２のレベルを減少させたものである。ＤＲＧ２のレベルを人為的に減少させた後に、ＩＦＮ－ｇａｍｍａによって誘導されるＰＤ－Ｌ１遺伝子のレベルをｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。図３ａに示されたように、ＤＲＧ２のレベルを減少させた場合に、ＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現が増加することを確認した。
また、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のレベルをフローサイトメトリーを通じて確認した。その結果は、図３ｂに示した。図３ｂに示されたように、ＤＲＧ２のレベルを減少させた場合に、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の量が増加することを確認した。
図３ｃおよび図３ｄは、ＤＲＧ２のレベルが減少したとき、ＰＤ－Ｌ１のレベルが増加する機序を確認するために、ＩＦＮ－ｇａｍｍａの主な活性経路であるＳＴＡＴ１リン酸化、ＩＲＦ１の発現程度をウェスタンブロットおよびｑＲＴ－ＰＣＲでそれぞれ確認した結果である。図３ｃおよび図３ｄに示されたように、ＤＲＧ２のレベルの減少は、ＩＦＮ－ｇａｍｍａによるＳＴＡＴ１リン酸化およびＩＲＦ１の発現程度を顕著に増加させることを確認した。そして、これを通じて、ＰＤ－Ｌ１の発現を増加させることができることを確認した。
図３ｅおよび図３ｆは、実施例２のｉｎ ｖｉｖｏ実験結果と同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ上でもＴ細胞の活性に差異を示すかを確認した結果である。がん細胞は、ＰＤ－Ｌ１のような表面タンパク質を用いて直接的な接触を通じてＴ細胞の活性を抑制するが、サイトカインを分泌することによっても、直接的な接触なしでＴ細胞を調節することもできる。したがって、がん細胞とＴ細胞をｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅして直接的な接触が維持される場合（図３ｅの左）、がん細胞が除去されたがん細胞培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）を用いてＴ細胞を培養した場合（図３ｅの右）、そして、トランスウェルを用いてＴ細胞とがん細胞の直接的な接触なしでｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅした場合（図３ｆの左（ＲＴ－ｑＰＣＲ測定結果）および右（ＥＬＩＳＡ測定結果））のそれぞれのＩＬ－２の量を測定した。図３ｅおよび図３ｆに示されたように、Ｔ細胞とがん細胞の直接的な接触がある場合（図３ｅの左）にのみ、ＩＬ－２の量が増加し、直接的な接触がない場合には、ＩＬ－２の量が有意差を示さないことを確認した。これを通じて、直接的な接触を通じてＴ細胞の活性が増加したことを確認した。
前記結果を通じて、ＤＲＧ２のレベルが減少したがん細胞は、ＩＦＮ－ｇａｍｍａによるＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、Ｔ細胞と直接的な接触がある場合にのみ、Ｔ細胞を活性化させることを確認した。
実施例４．ＤＲＧ２の発現レベルの減少がＰＤ－Ｌ１機能に及ぼす影響の確認
ＤＲＧ２のレベルが減少したがんにおいてＰＤ－Ｌ１の発現量は増加するが、正常に機能しない理由を確認するために、一次的にＴ細胞の表面タンパク質であるＰＤ－１とがん細胞の表面タンパク質であるＰＤ－Ｌ１の結合程度を確認した。その結果は、図４ａ～図４ｃに示した。
図４ａに示されたように、ＰＤ－１タンパク質をがん細胞に処理したとき、ＰＤ－１タンパク質と結合しているがん細胞の量をフローサイトメーターを用いて確認した結果、ｐＬＫＯ／Ｂ１６Ｆ１０＋ＩＦＮ－ｇａｍｍａと比べて、ｓｈＤＲＧ２／Ｂ１６Ｆ１０＋ＩＦＮ－ｇａｍｍａのサンプルにおいてＰＤ－１との接触がさらに減少していることを確認した。
図４ｂは、図４ａで利用された細胞のＰＤ－Ｌ１の量をさらに確認した結果であり、ＤＲＧ２のレベルが減少した場合、ＰＤ－Ｌ１の量は増加していることを確認した。
図４ｃは、図４ｂで確認したＰＤ－Ｌ１量と比べて、図４ａで確認されたＰＤ－１との接触量を計算した結果であり、ＤＲＧ２のレベルが減少したとき、ＰＤ－Ｌ１のレベルと比べて、ＰＤ－１との接触量が顕著に減少したことを確認した。
前記結果を通じて、ＤＲＧ２のレベルが減少したがんでは、ＰＤ－Ｌ１の発現が増加するが、ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞のＰＤ－１との結合量は、反対に減少したことが確認できた。すなわち、ＤＲＧ２のレベルが減少したがん細胞の場合には、Ｔ細胞との直接的な接触が抑制されて、Ｔ細胞の活性を増加させ、発現が増加したＰＤ－Ｌ１は、その機能を正常に維持しないことが確認できた。
実施例５．ＤＲＧ２レベル減少によるがん細胞内のＰＤ－Ｌ１機能低下機序の確認
ＤＲＧ２のレベル減少は、ＰＤ－Ｌ１の発現を増加させるが、ＰＤ－Ｌ１の機能を抑制させる機序を確認するために、ＰＤ－Ｌ１のグリコシル化程度とＰＤ－Ｌ１ががん細胞内に存在する位置を確認した。その結果は、図５ａ～図５ｄに示した。
図５ａは、ＰＤ－Ｌ１のグリコシル化（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）程度をウェスタンブロットで確認した結果（左）およびこれを定量化した結果（右）であり、ＰＤ－Ｌ１のグリコシル化が起こらない場合、ＰＤ－１との相互作用する効率が減少すると知られている。図５ａに示されたように、ＰＤ－Ｌ１の完全なグリコシル化である場合には、５５ｋＤａサイズのＰＤ－Ｌ１が観察されるが、Ｅｎｄｏ Ｈにより不完全なグリコシル化された部分が切られると、３０～３５ｋＤａのサイズでバンドが観察されることを確認した。しかしながら、ＤＲＧ２のレベルが減少しても、依然としてＥｎｄｏ Ｈにより切られない完全なグリコシル化したＰＤ－Ｌ１の量が多いことを確認した。前記結果を通じて、ＤＲＧ２レベルが減少したとき、グリコシル化の不完全性に起因して、ＰＤ－Ｌ１の機能低下を示すものではないことが確認できた。
図５ｂは、ＰＤ－Ｌ１の細胞内位置を確認した結果である。図５ｂに示されたように、ＤＲＧ２のレベルが減少したがん細胞におけるＰＤ－Ｌ１は、細胞内に存在する割合が高いことを確認した。前記結果を通じて、ＰＤ－Ｌ１が細胞内エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって細胞の外部に移動せず、細胞の内部に存在することを意味し、これによって、ＰＤ－１との相互作用効率が減少して、Ｔ細胞を活性化させないことが確認できた。
図５ｃは、ヒト卵巣がん細胞株であるＳＫＯＶ３を用いた実験結果である。図５ｃに示されたように、ｓｉＤＲＧ２を用いてＤＲＧ２のレベルを減少させたヒトがん細胞においても、ＩＦＮ－ｇａｍｍａによってＰＤ－Ｌ１の発現が増加するが（図の左下）、ＰＤ－Ｌ１が細胞表面に正常に位置しないことを確認した。
前記結果を通じて、ＤＲＧ２遺伝子および／またはＤＲＧ２タンパク質のレベルが減少したがんでは、ＰＤ－Ｌ１の発現が増加するが、ＰＤ－Ｌ１が正常に細胞表面に位置しないので、ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞表面のＰＤ－１との結合率が減少し、これを通じて、ＰＤ－Ｌ１が正常に作動しないことが確認できた。これを通じて、一般的に使用されている免疫抗がん剤、すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体などが正常に作動せず、これによって、ＰＤ－Ｌ１陽性がん患者のうちで２０～３０％程度だけが免疫抗がん剤に対する治療効果を示すことが確認できた。
したがって、生物学的試料からＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定することによって、免疫抗がん剤の治療に効果を示すことができる患者を選別することができ、特に、ＰＤ－Ｌ１陽性がん患者の場合には、一般的に免疫抗がん剤を投与するが、ＰＤ－Ｌ１陽性がん患者においてＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定することによって、より効果的に免疫抗がん剤の投与のための患者を選別できることが確認できた。本発明の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物、またはこれを用いた情報提供方法を利用することによって、免疫抗がん剤に対する治療効率を顕著に高めて、がん患者の苦痛および治療費用を効果的に減少させることができることが期待される。
上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。
本発明の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物、またはこれを用いた情報提供方法は、従来のＰＤ－Ｌ１を用いて免疫抗がん剤の投与の有無を決定することと比較して、高い正確性をもって免疫抗がん剤に対する治療反応性を確認できるので、多様ながん患者に免疫抗がん剤の投与の有無をさらに正確に決定することができ、これを通じて、治療効果を高めることができるので、がん患者の苦痛および治療費用を効果的に減少させることができることが期待される。

Claims (25)

  1. ＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  2. 前記ＤＲＧ２遺伝子のレベルを測定する製剤は、ＤＲＧ２遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブであることを特徴とする請求項１に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  3. 前記ＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤は、ＤＲＧ２タンパク質に特異的に結合する抗体またはアプタマーであることを特徴とする請求項１に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  4. 前記免疫抗がん剤は、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）またはＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）に特異的に結合する薬物であることを特徴とする請求項１に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  5. 前記ＰＤ－１に特異的に結合する薬物は、抗ＰＤ－１抗体であることを特徴とする請求項４に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  6. 前記抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）またはセミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）であることを特徴とする請求項５に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  7. 前記ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する薬物は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体であることを特徴とする請求項４に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  8. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）またはデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）であることを特徴とする請求項７に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  9. 前記組成物は、ＰＤ－Ｌ１陽性がんの免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用であることを特徴とする請求項１に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  10. 前記組成物は、対照群と比較して、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現レベルが減少したがんを免疫抗がん剤に対する治療反応性の低いがんまたは予後の悪いがんと予測することを特徴とする請求項１に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  11. 前記組成物は、対照群と比較して、ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現レベルが減少したＰＤ－Ｌ１陽性がんを免疫抗がん剤に対する治療反応性の低いがんまたは予後の悪いがんと予測することを特徴とする請求項１に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  12. 前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現減少は、がん細胞の表面で発現したＰＤ－Ｌ１レベルの減少を示すことを特徴とする請求項１に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  13. 前記がん細胞表面におけるＰＤ－Ｌ１発現レベルの減少は、がん細胞ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞ＰＤ－１との結合減少を示すことを特徴とする請求項１２に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  14. 前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の発現減少は、がん細胞におけるＰＤ－Ｌ１のレベル増加、およびＣＤ８ Ｔ細胞の数またはその活性増加を示すことを特徴とする請求項１に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  15. 前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルは、がん患者から分離した生物学的試料から測定することを特徴とする請求項１に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  16. 前記生物学的試料は、がん細胞、がん組織、血液、血漿、血清、骨髄、唾液、尿、および便からなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１５に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物。
  17. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用組成物を含む、免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測用キット。
  18. ＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のためのコンパニオン診断（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）用組成物。
  19. 請求項１８に記載のＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対するコンパニオン診断用組成物を含む、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対するコンパニオン診断（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）用キット。
  20. がん患者から分離した生物学的試料からＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する段階を含む、免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための情報提供方法。
  21. 前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルが、対照群と比較して減少した場合、免疫抗がん剤に対する治療反応性が低いかまたは予後が悪いものと予測することを特徴とする請求項２０に記載の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための情報提供方法。
  22. ＰＤ－Ｌ１陽性がん患者から分離した生物学的試料からＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する段階を含む、ＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための情報提供方法。
  23. 前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルが、対照群と比較して減少した場合、免疫抗がん剤に対する治療反応性が低いかまたは予後が悪いものと予測することを特徴とする請求項２２に記載のＰＤ－Ｌ１陽性がんにおける免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための情報提供方法。
  24. ａ）がん患者から分離した生物学的試料からＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する段階と、ｂ）前記ＤＲＧ２遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質の測定レベルが対照群と比較して減少した患者を選別する段階と、ｃ）前記選別された患者に免疫抗がん剤を投与する段階と、を含む、がんの治療方法。
  25. ＤＲＧ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）遺伝子またはＤＲＧ２タンパク質のレベルを測定する製剤を含む組成物の免疫抗がん剤に対する治療反応性または予後予測のための用途。
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