JP2023519931A - 癌を治療するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
癌を治療するための方法及び組成物が本明細書に開示される。本方法は、プロテインホスファターゼ2調節サブユニットBα(PPP2R2A)が欠損している癌細胞におけるプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)の発現又は活性の差異を生じさせるための治療有効量の1つ以上の治療用薬剤の使用を含み得る。
Description
相互参照
[0001] 本願は、2020年4月1日に出願された米国仮特許出願第63/003,736号の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、参照により本明細書に援用される。
[0001] 本願は、2020年4月1日に出願された米国仮特許出願第63/003,736号の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、参照により本明細書に援用される。
背景
[0002] 癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)の治療は、進歩にもかかわらず、依然として比較的難しい。化学療法などの全身的治療は毒性の恐れがあり、患者に負の副作用を及ぼし得る。更に、特異的バイオマーカーがないことにより、標的化治療の開発又は使用は複雑化し得る。
[0002] 癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)の治療は、進歩にもかかわらず、依然として比較的難しい。化学療法などの全身的治療は毒性の恐れがあり、患者に負の副作用を及ぼし得る。更に、特異的バイオマーカーがないことにより、標的化治療の開発又は使用は複雑化し得る。
[0003] 癌細胞の治療手法の一つには、標的遺伝子及びバイオマーカーを同定して、そうした標的遺伝子の活性の変化に対して感受性があり得るのはどの癌細胞かを同定することが含まれる。
概要
[0004] 合成致死性遺伝子対とは、両方の遺伝子の阻害又は第2の遺伝子の突然変異若しくは欠失の存在下における一方の遺伝子の阻害が細胞死につながり得るものであり、本明細書において認識されるとおり、これを同定することは、非癌細胞の生存能力を維持しつつ癌細胞を死滅させるのに治療上有用であり得る。
[0004] 合成致死性遺伝子対とは、両方の遺伝子の阻害又は第2の遺伝子の突然変異若しくは欠失の存在下における一方の遺伝子の阻害が細胞死につながり得るものであり、本明細書において認識されるとおり、これを同定することは、非癌細胞の生存能力を維持しつつ癌細胞を死滅させるのに治療上有用であり得る。
[0005] 本明細書においては、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を有する又は有する疑いがある対象を治療するための標的化した治療及び療法用の治療用薬剤の必要性が認識される。癌を有する又は有する疑いがある対象は、健常又は非癌対照と比較して、癌の1つ以上の癌細胞に、第1の遺伝子の突然変異、その欠失、その発現の差異(例えば、低下又は増加)、又はその活性レベルの差異(例えば、低下、増加又は変化)を有し得る。本明細書には、第1の遺伝子の発現のかかる差異(例えば、その低下又は増加)又はその活性レベルの差異(例えば、低下、増加又は変化)を有する癌又は癌細胞若しくは組織を、その癌又は癌細胞における第2の遺伝子の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせることによって治療するための、それによって対象を治療する方法及び組成物が開示される。第1の遺伝子と第2の遺伝子とは、合成致死性対を形成し得る。第1の遺伝子は調節タンパク質(例えば細胞周期を調節するもの)をコードしてもよく、第2の遺伝子は治療上修飾可能なタンパク質(例えばキナーゼ)をコードしてもよい。
[0006] ある態様において、本明細書には、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を有する又は有する疑いがある対象を治療するための方法であって、対象におけるプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1)の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を対象に投与することを含み、それによって対象を癌に関して治療する方法が開示され、癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連しているか、又は癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している。
[0007] 一部の実施形態において、癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連している。
[0008] 一部の実施形態において、癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している。一部の実施形態において、突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在は、対象から入手された組織に由来する細胞のアッセイによって同定される。一部の実施形態において、アッセイは、次世代シーケンシングベースのアッセイである。
[0009] 一部の実施形態において、1つ以上の治療用薬剤は、小分子(例えば、分子量が900ダルトン未満の分子)、タンパク質、イントラボディ、ペプチド、リボ核酸(RNA)分子、並びに、エンドヌクレアーゼ複合体及びデオキシリボ核酸(DNA)コンストラクトからなる群から選択される1つ以上のメンバーを含む。
[0010] 一部の実施形態において、DNAコンストラクトはエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼ遺伝子は、CRISPR関連(Cas)タンパク質をコードする。一部の実施形態において、Casは、Cas9である。
[0011] 一部の実施形態において、DNAコンストラクトは、PKMYT1遺伝子を標的とするガイドRNAを含む。
[0012] 一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼ複合体はエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、CRISPR関連(Cas)タンパク質である。
[0013] 一部の実施形態において、小分子はPKMYT1阻害薬を含む。一部の実施形態において、PKMYT1阻害薬は、5-((5-メトキシ-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリミジン-4-イル)アミノ)-2-メチルフェノール、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド(ダサチニブ)、4-((2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)アミノ)-6-メトキシ-7-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロポキシ)キノリン-3-カルボニトリル(ボスチニブ)、N-(5-クロロベンゾ[d][1,3]ジオキソール-4-イル)-7-(2-(4-メチルピペラジン-1-イル)エトキシ)-5-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)オキシ)キナゾリン-4-アミン(サラカチニブ)、(E)-N-(4-((3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ)-3-シアノ-7-エトキシキノリン-6-イル)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エンアミド(ペリチニブ)、N-(3-クロロフェニル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-4-アミン(チルホスチンAG 1478)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173952)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((3-(メチルチオ)フェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173955)、又は6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-フルオロ-3-メチルフェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-180970)を含む。
[0014] 一部の実施形態において、小分子はWEE1阻害薬を含む。一部の実施形態において、WEE1阻害薬は、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、2-アリル-1-(6-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)ピリジン-2-イル)-6-((4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)アミノ)-1,2-ジヒドロ-3H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-オン(MK-1775)、9-ヒドロキシ-4-フェニルピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン(PD-407824)、6-ブチル-4-(2-クロロフェニル)-9-ヒドロキシピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン、又は6-(2-クロロ-6-フルオロフェニル)-2-((2,4,4-トリメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-7-イル)アミノ)イミダゾ[1,2-a]ピリミド[5,4-e]ピリミジン-5(6H)-オンを含む。
[0015] 一部の実施形態において、PP2Aサブユニットは、65kDa調節サブユニットAα(PPP2R1A)、65kDa調節サブユニットAβ(PPP2R1B)、55kDa調節サブユニットBα(PPP2R2A)、55kDa調節サブユニットBβ(PPP2R2B)、55kDa調節サブユニットBγ(PPP2R2C)、55kDa調節サブユニットBδ(PPP2R2D)、72/130kDa調節サブユニットB(PPP2R3A)、48kDa調節サブユニットB(PPP2R3B)、調節サブユニットB”サブユニットγ(PPP2R3C)、調節サブユニットB’(PPP2R4)、56kDa調節サブユニットα(PPP2R5A)、56kDa調節サブユニットβ(PPP2R5B)、56kDa調節サブユニットγ(PPP2R5C)、56kDa調節サブユニットδ(PPP2R5D)、56kDa調節サブユニットε(PPP2R5E)、触媒サブユニットα(PPP2CA)、及び触媒サブユニットβ(PPP2CB)からなる群から選択される。一部の実施形態において、PP2Aサブユニットは、PPP2R2Aである。
[0016] 一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、PPP2R2Aの発現又は活性の差異(例えば、その低下)を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を対象に投与することを更に含む。
[0017] 一部の実施形態において、健常対照は、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を呈しない1個体以上の対象からのものである。
[0018] 一部の実施形態において、癌性組織は、***組織、膵臓組織、子宮組織、膀胱組織、結腸直腸組織、前立腺組織、肝組織、又は卵巣組織である。一部の実施形態において、癌性組織は、肝組織である。一部の実施形態において、癌性組織は、卵巣組織である。
[0019] 別の態様において、本明細書には、少なくとも1つの治療用薬剤を含む製剤を含む、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を有する又は有する疑いがある対象を治療するための組成物が開示され、ここで少なくとも1つの治療用薬剤は、対象への投与後にプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1)の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるのに有効な量で存在し、及び癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連しているか、又は癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している。
[0020] 一部の実施形態において、癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連している。
[0021] 一部の実施形態において、癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している。一部の実施形態において、突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在は、対象から入手された組織に由来する細胞のアッセイによって同定される。一部の実施形態において、アッセイは、次世代シーケンシングベースのアッセイである。
[0022] 一部の実施形態において、少なくとも1つの治療用薬剤は、小分子(例えば、分子量が900ダルトン未満の分子)、タンパク質、イントラボディ、ペプチド、リボ核酸(RNA)分子、並びに、エンドヌクレアーゼ複合体及びデオキシリボ核酸(DNA)コンストラクトからなる群から選択される1つ以上のメンバーを含む。
[0023] 一部の実施形態において、DNAコンストラクトはエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼ遺伝子は、CRISPR関連(Cas)タンパク質をコードする。一部の実施形態において、Casは、Cas9である。
[0024] 一部の実施形態において、DNAコンストラクトは、PKMYT1遺伝子に向けられるガイドRNAを含む。
[0025] 一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼ複合体はエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、CRISPR関連(Cas)タンパク質である。
[0026] 一部の実施形態において、小分子はPKMYT1阻害薬を含む。一部の実施形態において、PKMYT1阻害薬は、5-((5-メトキシ-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリミジン-4-イル)アミノ)-2-メチルフェノール、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド(ダサチニブ)、4-((2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)アミノ)-6-メトキシ-7-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロポキシ)キノリン-3-カルボニトリル(ボスチニブ)、N-(5-クロロベンゾ[d][1,3]ジオキソール-4-イル)-7-(2-(4-メチルピペラジン-1-イル)エトキシ)-5-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)オキシ)キナゾリン-4-アミン(サラカチニブ)、(E)-N-(4-((3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ)-3-シアノ-7-エトキシキノリン-6-イル)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エンアミド(ペリチニブ)、N-(3-クロロフェニル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-4-アミン(チルホスチンAG 1478)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173952)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((3-(メチルチオ)フェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173955)、又は6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-フルオロ-3-メチルフェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-180970)を含む。
[0027] 一部の実施形態において、小分子はWEE1阻害薬を含む。一部の実施形態において、WEE1阻害薬は、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、2-アリル-1-(6-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)ピリジン-2-イル)-6-((4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)アミノ)-1,2-ジヒドロ-3H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-オン(MK-1775)、9-ヒドロキシ-4-フェニルピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン(PD-407824)、6-ブチル-4-(2-クロロフェニル)-9-ヒドロキシピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン、又は6-(2-クロロ-6-フルオロフェニル)-2-((2,4,4-トリメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-7-イル)アミノ)イミダゾ[1,2-a]ピリミド[5,4-e]ピリミジン-5(6H)-オンを含む。
[0028] 一部の実施形態において、PP2Aサブユニットは、65kDa調節サブユニットAα(PPP2R1A)、65kDa調節サブユニットAβ(PPP2R1B)、55kDa調節サブユニットBα(PPP2R2A)、55kDa調節サブユニットBβ(PPP2R2B)、55kDa調節サブユニットBγ(PPP2R2C)、55kDa調節サブユニットBδ(PPP2R2D)、72/130kDa調節サブユニットB(PPP2R3A)、48kDa調節サブユニットB(PPP2R3B)、調節サブユニットB”サブユニットγ(PPP2R3C)、調節サブユニットB’(PPP2R4)、56kDa調節サブユニットα(PPP2R5A)、56kDa調節サブユニットβ(PPP2R5B)、56kDa調節サブユニットγ(PPP2R5C)、56kDa調節サブユニットδ(PPP2R5D)、56kDa調節サブユニットε(PPP2R5E)、触媒サブユニットα(PPP2CA)、及び触媒サブユニットβ(PPP2CB)からなる群から選択される。一部の実施形態において、PP2Aサブユニットは、PPP2R2Aである。
[0029] 一部の実施形態において、組成物は、PPP2R2Aの発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるのに有効な量で存在する少なくとも1つの治療用薬剤を含む製剤を更に含む。
[0030] 一部の実施形態において、健常対照は、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を呈しない1個体以上の対象からのものである。
[0031] 一部の実施形態において、癌性組織は、***組織である。一部の実施形態において、癌性組織は、肝組織である。一部の実施形態において、癌性組織は、卵巣組織である。
[0032] 一部の実施形態において、製剤は賦形剤を更に含む。一部の実施形態において、賦形剤は、少なくとも1つの治療用薬剤が賦形剤の存在なしに対象に投与されるのと比較したとき、対象への投与後に少なくとも1つの治療用薬剤を安定化させるか、又は少なくとも1つの治療用薬剤の治療増強を提供する。
[0033] 別の態様において、本明細書には、癌を有する又は有する疑いがある対象を治療するためのキットであって、
少なくとも1つの治療用薬剤を含む製剤を含む組成物であって、少なくとも1つの治療用薬剤が、対象への投与後にプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1)の発現又は活性の差異を生じさせるのに有効な量で存在し、及び癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連しているか、又は癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している、組成物;及び
対象への組成物の投与に関する1つ以上の説明書
を含むキットが開示される。一部の実施形態において、発現又は活性レベルの差異は、発現又は活性レベルの低下である。
少なくとも1つの治療用薬剤を含む製剤を含む組成物であって、少なくとも1つの治療用薬剤が、対象への投与後にプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1)の発現又は活性の差異を生じさせるのに有効な量で存在し、及び癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連しているか、又は癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している、組成物;及び
対象への組成物の投与に関する1つ以上の説明書
を含むキットが開示される。一部の実施形態において、発現又は活性レベルの差異は、発現又は活性レベルの低下である。
[0034] 一部の実施形態において、癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連している。一部の実施形態において、発現又は活性レベルの差異は、発現又は活性レベルの低下である。
[0035] 一部の実施形態において、癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している。一部の実施形態において、突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在は、対象から入手された組織に由来する細胞のアッセイによって同定される。一部の実施形態において、アッセイは、次世代シーケンシングベースのアッセイである。
[0036] 別の態様において、本明細書には、対象の疾患を同定するための方法であって、対象から入手された組織に由来する細胞をアッセイして、健常対照と比較したときのプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子における突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在を同定すること、及び健常対照と比較したときのプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子における突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在を指示する報告を出力することを含む方法が開示される。一部の実施形態において、この方法は、次世代シーケンシングベースのアッセイを含む。
[0037] 当業者には、あくまでも本開示の例示的実施形態が図示及び説明されるに過ぎない以下の詳細な説明から、本開示の更なる態様及び利点が容易に明らかになるであろう。認識されるであろうとおり、本開示は他の異なる実施形態が可能であり、その幾つかの詳細は、いずれも本開示から逸脱することなく、様々な自明の点で変更が可能である。従って、図面及び説明は、限定的ではなく、例示的な性質のものと見なされるべきである。
参照による援用
[0038] 本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、又は特許出願が参照によって援用されることが具体的且つ個別に示されたものとするのと同程度に本明細書において参照により援用される。参照によって援用される刊行物及び特許又は特許出願が、本明細書に含まれる本開示と矛盾する限りにおいて、いかなるかかる矛盾する資料に対しても本明細書が優先し、及び/又は上位に立つことが意図される。
[0038] 本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、又は特許出願が参照によって援用されることが具体的且つ個別に示されたものとするのと同程度に本明細書において参照により援用される。参照によって援用される刊行物及び特許又は特許出願が、本明細書に含まれる本開示と矛盾する限りにおいて、いかなるかかる矛盾する資料に対しても本明細書が優先し、及び/又は上位に立つことが意図される。
図面の簡単な説明
[0039] 添付の特許請求の範囲には、本発明の新規の特徴が詳細に示される。本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面(本明細書ではまた「図(Figure)」及び「図(FIG.)」)を参照することにより、本発明の特徴及び利点の更なる理解が得られるであろう。
[0039] 添付の特許請求の範囲には、本発明の新規の特徴が詳細に示される。本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面(本明細書ではまた「図(Figure)」及び「図(FIG.)」)を参照することにより、本発明の特徴及び利点の更なる理解が得られるであろう。
詳細な説明
[0052] 本明細書には、本発明の様々な実施形態が示され、及び説明されるが、当業者には、かかる実施形態が単に例として提供されるに過ぎないことは明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱することなく、多数の変形例、変更例、及び置換例が想起され得る。本明細書に記載される発明の実施形態についての様々な選択肢を用い得ることは理解されるであろう。
[0052] 本明細書には、本発明の様々な実施形態が示され、及び説明されるが、当業者には、かかる実施形態が単に例として提供されるに過ぎないことは明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱することなく、多数の変形例、変更例、及び置換例が想起され得る。本明細書に記載される発明の実施形態についての様々な選択肢を用い得ることは理解されるであろう。
[0053] 2つ以上の一連の数値において最初の数値の前に用語「少なくとも~」、「~より大きい」、又は「~以上」が付くときは常に、その一連の数値の中にある各々の数値に用語「少なくとも~」、「~より大きい」、又は「~以上」が適用される。例えば、1、2、又は3以上とは、1以上、2以上、又は3以上に等しい。
[0054] 2つ以上の一連の数値において最初の数値の前に用語「~を超えない」、「~未満」、又は「~以下」が付くときは常に、その一連の数値の中にある各々の数値に用語「~を超えない」、「~未満」、又は「~以下」が適用される。例えば、3、2、又は1以下とは、3以下、2以下、又は1以下に等しい。
[0055] 用語「対象」は、本明細書で使用されるとき、概して、哺乳類(例えば、ヒト)、爬虫類、又は鳥類(例えば、トリ)などの動物、又はその他、植物などの生物を指す。例えば、対象は、脊椎動物、哺乳類、げっ歯類(例えば、マウス)、霊長類、サル又はヒトであり得る。対象は、健常個体、疾患(例えば、肝癌又は卵巣癌)に関して無症候の個体、疾患(例えば、肝癌又は卵巣癌)又は疾患に罹り易い素因を有する又は有する疑いがある個体、又は疾患に関して症候がある個体であり得る。対象は治療法を必要としている者であってもよい。対象は、治療担当医師など、医療提供者によるモニタリング又は治療を受けている患者であり得る。
[0056] 用語「ゲノム」は、本明細書で使用されるとき、概して、対象からのゲノム情報を指し、これは、例えば、対象の遺伝情報の少なくとも一部又は全てであってもよい。ゲノムは、1つ又は複数のデオキシリボ核酸(DNA)分子にコードされることができ、1つ又は複数のリボ核酸(RNA)分子に発現し得る。ゲノムは、コード領域(例えば、タンパク質をコードするもの)並びに非コード領域を含み得る。ゲノムは、生物における全染色体配列をまとめて含み得る。例えば、ヒトゲノムは通常、合計46個の染色体を有する。これら全ての配列がまとまってヒトゲノムを成し得る。
[0057] 本明細書において遺伝子が言及されるときは常に、単一の遺伝子が異なる名称によって言及され得ることが理解されるであろう。例えば、「プロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1」及び「膜結合性チロシン特異的及びトレオニン特異的cdc2阻害性キナーゼ」は、両方とも同じ遺伝子、PKMYT1を指す。別の例として、「プロテインホスファターゼ2調節サブユニットBα」及び「セリン/トレオニン-プロテインホスファターゼ2A 55kDa調節サブユニットBαアイソフォーム」は、両方とも同じ遺伝子、PPP2R2Aを指す。
癌の治療方法
[0058] ある態様において、本明細書には、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を治療するための方法及び組成物が提供される。癌を有する又は有する疑いがある対象の治療方法は、1つ以上の遺伝子の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を対象に投与することを含んでもよく、それによって対象を癌に関して治療する。癌は、第1の遺伝子の発現の差異(例えば、その低下又は増加)又は活性レベルの差異(例えば、低下、増加又は変化)を有する細胞を含んでもよく、第2の遺伝子の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせる1つ以上の治療用薬剤を投与すると、又はそれに曝露すると、細胞の阻害又は死滅が起こり得る。一部の例では、第1の遺伝子と第2の遺伝子とは合成致死性遺伝子対を形成する。ある場合には、第1の遺伝子はプロテインホスファターゼ2 55kDa調節サブユニットBα(PPP2R2A)であり、第2の遺伝子は、キナーゼ、例えば、プロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1)をコードする。
[0058] ある態様において、本明細書には、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を治療するための方法及び組成物が提供される。癌を有する又は有する疑いがある対象の治療方法は、1つ以上の遺伝子の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を対象に投与することを含んでもよく、それによって対象を癌に関して治療する。癌は、第1の遺伝子の発現の差異(例えば、その低下又は増加)又は活性レベルの差異(例えば、低下、増加又は変化)を有する細胞を含んでもよく、第2の遺伝子の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせる1つ以上の治療用薬剤を投与すると、又はそれに曝露すると、細胞の阻害又は死滅が起こり得る。一部の例では、第1の遺伝子と第2の遺伝子とは合成致死性遺伝子対を形成する。ある場合には、第1の遺伝子はプロテインホスファターゼ2 55kDa調節サブユニットBα(PPP2R2A)であり、第2の遺伝子は、キナーゼ、例えば、プロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1)をコードする。
[0059] 一部の例では、第1の遺伝子は、癌細胞において欠損している(例えば、過小発現している、突然変異している、過剰発現している)バイオマーカーをコードし、第2の遺伝子は、ノックダウン又はノックアウトしようとする遺伝子標的を含み、それによって第2の遺伝子の発現又は活性レベルを低下させる。一部の例では、第1の遺伝子は、癌細胞において発現の差異(例えば、その低下又は増加)又は活性レベルの差異(例えば、低下、増加又は変化)を有し、癌又は癌細胞において第2の遺伝子の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を投与すると、又はそれに曝露すると、細胞の阻害又は死滅が生じる。一部の例では、第1の遺伝子は、細胞周期を調節するタンパク質、例えばPPP2R2Aをコードし、第2の遺伝子は、キナーゼ、例えばPKMYT1をコードする。
[0060] 一部の例では、第1の遺伝子は、健常対照と比較したとき突然変異及び/又は欠失を示す。かかる突然変異の存在又は非存在は、対象から入手された組織由来細胞をアッセイすることによって同定し得る。適切なアッセイとしては、ゲノムDNA、mRNA、又はcDNAが関わるものを挙げることができる。例として、核酸ベースの検出方法については、初めに、検査しようとする対象の細胞(例えば、卵巣細胞)から(任意の標準技法を用いて)ゲノムDNAが入手される。適切であるならば、cDNAが調製されてもよく、又はmRNAが入手されてもよい。一部の例では、核酸が任意の公知の核酸増幅技法(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)によって十分な分量及び純度に増幅され、更に分析されることにより、突然変異が検出され得る。例えば、試料からゲノムDNAを単離することができ、全てのエクソン配列、及びエクソン/イントロンスプライシングに必要な領域を含むイントロン/エクソン接合領域を1つ以上のアンプリコンへと増幅し、突然変異の存在又は非存在に関して更に分析することができる。一部の例では、アッセイは、FoundationOne(登録商標)CDx(商標)又はTempus xT(商標)などの次世代シーケンシングベースのアッセイである。
[0061] 第1の遺伝子(例えば、PPP2R2A)と第2の遺伝子(例えば、PKMYT1)とは合成致死性対を形成してもよく、つまり、第1の遺伝子及び第2の遺伝子の両方の発現又は活性レベルの阻害又は低下は細胞に致死性となる(例えば、アポトーシス、壊死、増殖阻害等を引き起こす)が、第1の遺伝子単独又は第2の遺伝子単独の活性の阻害又は低下は、細胞を死滅させるには十分ではないことになる。ある場合には、第1の遺伝子(例えば、PPP2R2A)又は第2の遺伝子(例えば、PKMYT1)単独の発現又は活性の阻害又は低下は、細胞又は細胞集団の生存能力の減少を引き起こすが、両方の遺伝子の発現又は活性の低下(例えば、PPP2R2A及びPKMYT1のノックダウン又はノックアウト)は、細胞又は細胞集団の生存能力の更に大きい減少を引き起こす。例えば、PPP2R2A及びPKMYT1の発現又は活性の低下は相乗的に作用してもよく、この遺伝子対の各メンバーの発現又は活性の低下による生存能力の減少の和よりも生存能力の減少が大きくなる。
[0062] 細胞(例えば、癌性細胞)が第1の遺伝子(例えば、PPP2R2A)の欠損を有する場合、第2の遺伝子(本明細書ではまた「標的遺伝子」、例えばPKMYT1)の発現又は活性レベルを(例えば、ノックダウン又はノックアウトによって)強制的に低下させることは、第1の遺伝子の欠損を有する細胞にとっては致死的となり得るが、第1の遺伝子の欠損を有しない細胞では非毒性又は非致死性であり得る。第1の遺伝子(例えば、PPP2R2A)の欠損を有する細胞を含む癌性組織に関連している癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を有する対象を、単一の阻害薬(例えば、PKMYT1の発現又は活性の低下を生じさせる治療用薬剤の治療有効量)を使用して治療するかかる方法は、対象の正常細胞における毒性を減少させて、それによって癌治療の毒性又は副作用を減少させるのに有益であり得る。
[0063] ある場合には、第1の遺伝子は、第2の遺伝子の上流アゴニスト若しくはアンタゴニストであるタンパク質であってもよく、又はそれをコードしてもよく、又は第2の遺伝子が、第1の遺伝子の上流アゴニスト若しくはアンタゴニストであるタンパク質であってもよく、又はそれをコードしてもよい。例として、第1の遺伝子はPPP2R2Aであってもよく、第2の遺伝子はPKMYT1であってもよい。PPP2R2Aは、正常な(例えば、突然変異していない)細胞で発現するとき、PKMYT1の間接的な正の調節因子として作用することができ、これはタンパク質シグナル伝達カスケード又はシグナル伝達経路の中で様々なタンパク質の上流調節因子であるキナーゼである(図1A~図1Bを参照)。例えば、PKMYT1はCDK1と相互作用し、又はそれを調節し、それによって細胞周期進行に影響を及ぼすことができる。正常な又は非癌性の細胞では、PPP2R2Aの発現はPKMYT1を正に調節し、ひいてはCDK1を間接的に阻害し、無制御な細胞周期進行を防ぐことができる。PPP2R2A発現はまた、DNA修復を促進することも公知である(Cancer Res.2012 Dec 15;72(24):6414-24.)。それ故、PPP2R2Aが欠損している細胞(例えば、突然変異したPPP2R2Aを有する細胞)では、損傷したDNAが修復されないままになり得るとともに、PKMYT1は阻害されないことになり得るため、下流タンパク質CDK1の発現の増加が生じる。従って、PPP2R2A欠損細胞におけるPKMYT1阻害は、損傷したDNAを有する細胞の無制御な細胞周期進行につながり、ひいては細胞死を誘導し得る。
[0064] PPP2R2A及びPKMYT1が例として示されるが、他の遺伝子相互作用も可能であり得る。かかる例の一つでは、第1の遺伝子が、第2の遺伝子を調節する別の遺伝子(又はコードされるタンパク質)のアゴニスト若しくはアンタゴニストであってもよく、又は第2の遺伝子が、第1の遺伝子を調節する別の遺伝子又はコードされるタンパク質のアゴニスト若しくはアンタゴニストであってもよい。同様に、第1の遺伝子が、第2の遺伝子を調節し得る更に別の遺伝子(又はコードされるタンパク質)を調節する別の遺伝子(又はコードされるタンパク質)のアゴニスト又はアンタゴニストであってもよく、又は第2の遺伝子が、第1の遺伝子を調節し得る更に別の遺伝子(又はコードされるタンパク質)を調節する別の遺伝子(又はコードされるタンパク質)のアゴニスト又はアンタゴニストであってもよい。ある場合には、第1又は第2の遺伝子は、それぞれ第2又は第1の遺伝子の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8個、又はそれ以上上流にある成分(例えば、ノード又は他の遺伝子、タンパク質、又はシグナル伝達因子)である別の遺伝子又はタンパク質を調節し得る。
[0065] 一部の例では、第1の遺伝子及び第2の遺伝子は、同じ遺伝子の下流にあるサブセットを調節し得る。例えば、第1の遺伝子が複数の下流遺伝子を調節し、その下流遺伝子のサブセットがまた、第2の遺伝子によっても調節されるものであってもよい。癌細胞では、下流遺伝子は、例えば、HIPPO経路、上皮間葉転換、P13K経路、DNA複製、細胞遊走、細胞転移等の癌関連過程において重要な遺伝子を含み得る。或いは、又はそれに加えて、第1の遺伝子及び第2の遺伝子は、同じ遺伝子のサブセットによって調節されてもよい。
[0066] ある場合には、第1の遺伝子又は第2の遺伝子はまた、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)のバイオマーカーであってもよい。例えば、第1の遺伝子はPPP2R2Aであってもよい。ある場合には、癌細胞において、PPP2R2Aは、対照細胞又は細胞集団と比較したとき癌細胞で低発現であるか、突然変異しているか、又は他に何らか欠損しているものであり得る。例えば、図2は、異なる癌種(X軸)におけるPPP2R2A不活性化又は欠損の頻度(Y軸)のプロットを示す。ある種の癌では(例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌)、PPP2R2Aの突然変異頻度は約15%もの高さに上り得る。他のある癌種では(例えば、卵巣漿液性嚢胞腺癌、直腸腺癌)、PPP2R2Aの突然変異頻度は10%を上回り得る。様々な癌種において、不活性化につながるPPP2R2Aの欠損には、PPP2R2A遺伝子における同じ遺伝子の複数のコピー、過剰メチル化、深い欠失、又は突然変異が含まれ得る。PPP2R2A突然変異を含む癌では、PKMYT1の発現又は活性の低下を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を投与すると、又はそれに曝露すると、PPP2R2A突然変異細胞の合成致死が起こり得る。
[0067] ある場合には、第2の遺伝子(例えば、PKMYT1)の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される1つ以上の治療用薬剤は、小分子(例えば、分子量が900ダルトン未満の分子)、タンパク質、イントラボディ、ペプチド、リボ核酸(RNA)分子、デオキシリボ核酸(DNA)コンストラクト、又はこれらの組み合わせ(例えば、タンパク質-核酸複合体)を含み得る。ある例では、1つ以上の治療用薬剤は、タンパク質-核酸複合体、例えば、エンドヌクレアーゼ複合体及びDNAコンストラクトを含み得る。ある場合には、エンドヌクレアーゼ複合体は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(Cas)タンパク質又はその変異体(例えば、改変された変異体)を含む。そのような場合、DNAコンストラクトはエンドヌクレアーゼ複合体と共投与されてもよい。或いは、又はそれに加えて、DNAコンストラクトはエンドヌクレアーゼ遺伝子を含んでもよい。そのような場合、DNAコンストラクトは、Casタンパク質又はその変異体(例えば、改変された変異体)をコードする遺伝子を含み得る。細胞(例えば、癌細胞)へのDNAコンストラクトの導入又は送達後、DNAコンストラクトは細胞により、細胞自らの機構(例えば、ポリメラーゼ、リボソーム等)を用いて転写され、翻訳されてもよい。
[0068] 一部の例では、標的遺伝子(例えば、PKMYT1)の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される1つ以上の治療用薬剤は、小分子阻害薬(例えば、分子量が900ダルトン未満の分子)を含む。小分子は、標的遺伝子単独の発現レベル又は活性レベルを低下させるように構成されてもよく、又は小分子は、欠損している又は突然変異している遺伝子(例えば、癌細胞のPPP2R2A)との組み合わせで標的遺伝子の発現レベル又は活性レベルを低下させるように構成されてもよい。ある場合には、小分子は、第1の遺伝子及び第2の遺伝子の両方と直接相互作用し得る。例えば、小分子は、それぞれ第1の遺伝子及び第2の遺伝子の一方又は両方によってコードされるタンパク質又は1つ若しくは複数のタンパク質を阻害し得る。或いは、又はそれに加えて、小分子は、それらの遺伝子の一方又は両方が相互作用するシグナル伝達経路内の上流エフェクター又は下流タンパク質を阻害し得る。
[0069] ある場合には、小分子阻害薬は、PKMYT1阻害薬を含み得る。PKMYT1阻害薬は、例えば、5-((5-メトキシ-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリミジン-4-イル)アミノ)-2-メチルフェノール、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド(ダサチニブ)、4-((2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)アミノ)-6-メトキシ-7-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロポキシ)キノリン-3-カルボニトリル(ボスチニブ)、N-(5-クロロベンゾ[d][1,3]ジオキソール-4-イル)-7-(2-(4-メチルピペラジン-1-イル)エトキシ)-5-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)オキシ)キナゾリン-4-アミン(サラカチニブ)、(E)-N-(4-((3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ)-3-シアノ-7-エトキシキノリン-6-イル)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エンアミド(ペリチニブ)、N-(3-クロロフェニル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-4-アミン(チルホスチンAG 1478)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173952)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((3-(メチルチオ)フェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173955)、又は6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-フルオロ-3-メチルフェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-180970)であり得る。小分子阻害薬は、PKMYT1(遺伝子)の発現又はプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1遺伝子に由来するタンパク質)の活性を、直接、又は間接的のいずれかで阻害し、又は低下させるように構成されてもよい。例えば、小分子阻害薬は、プロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1タンパク質、又は限定はされないが、図1A~図1Bに示されるものなど、シグナル伝達経路においてプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1の上流又は下流にあり得る別のタンパク質を阻害し得る。例えば、小分子阻害薬は、WEE1、CHK1、CDK1、CDK2、PPP2R2A、FOXM1、PLK1、EZH2等の発現又は活性レベルを阻害し、又は他に何らか低下させるものであり得る。
[0070] ある場合には、小分子阻害薬は、WEE1阻害薬を含み得る。WEE1阻害薬は、例えば、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、2-アリル-1-(6-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)ピリジン-2-イル)-6-((4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)アミノ)-1,2-ジヒドロ-3H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-オン(MK-1775)、9-ヒドロキシ-4-フェニルピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン(PD-407824)、6-ブチル-4-(2-クロロフェニル)-9-ヒドロキシピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン、又は6-(2-クロロ-6-フルオロフェニル)-2-((2,4,4-トリメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-7-イル)アミノ)イミダゾ[1,2-a]ピリミド[5,4-e]ピリミジン-5(6H)-オンであり得る。小分子阻害薬は、WEE1(遺伝子)の発現又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1遺伝子に由来するタンパク質)の活性を、直接、又は間接的のいずれかで阻害し、又は低下させるように構成されてもよい。例えば、小分子阻害薬は、WEE1 G2チェックポイントキナーゼタンパク質、又は限定はされないが、図1Aに示されるものなど、シグナル伝達経路においてWEE1 G2チェックポイントキナーゼの上流又は下流にあり得る別のタンパク質を阻害し得る。例えば、小分子阻害薬は、CDK1、CDK2等の発現又は活性レベルを阻害し、又は他に何らか低下させるものであり得る。
[0071] ある場合には、小分子阻害薬は、小分子阻害薬又はその誘導体の組み合わせを含み得る。例えば、小分子阻害薬は、二重特異性となるように改変され、又は修飾されてもよく、第1の遺伝子及び第2の遺伝子(例えば、PKMYT1及びPPP2R2A)の両方の発現又は活性を低下させてもよい。或いは、又はそれに加えて、小分子阻害薬の組み合わせ(例えば、小分子「カクテル」)を使用して、標的遺伝子(例えば、PKMYT1)単独又は第1の遺伝子及び第2の遺伝子の両方の発現又は活性を低下させてもよい。ある場合には、小分子阻害薬は、別の薬剤種(例えば、タンパク質、RNA分子、DNA分子等)と共に投与されてもよい。
[0072] 小分子阻害薬は、任意の有用な濃度で投与されてもよい。例えば、小分子は、約0.5ナノモル(nM)、約1nM、約10nM、約20nM、約30nM、約40nM、約50nM、約60nM、約70nM、約80nM、約90nM、約100nM、約200nM、約300nM、約400nM、約500nM、約600nM、約700nM、約800nM、約900nM、約1マイクロモル(μM)、約2μM、約3μM、約4μM、約5μM、約6μM、約7μM、約8μM、約9μM、約10μMの濃度で投与されてもよい。小分子は、少なくとも約0.5ナノモル(nM)、少なくとも約1nM、少なくとも約10nM、少なくとも約20nM、少なくとも約30nM、少なくとも約40nM、少なくとも約50nM、少なくとも約60nM、少なくとも約70nM、少なくとも約80nM、少なくとも約90nM、少なくとも約100nM、少なくとも約200nM、少なくとも約300nM、少なくとも約400nM、少なくとも約500nM、少なくとも約600nM、少なくとも約700nM、少なくとも約800nM、少なくとも約900nM、少なくとも約1マイクロモル(μM)、少なくとも約2μM、少なくとも約3μM、少なくとも約4μM、少なくとも約5μM、少なくとも約6μM、少なくとも約7μM、少なくとも約8μM、少なくとも約9μM、少なくとも約10μMの濃度で投与されてもよい。小分子は、多くても約10μM、多くても約9μM、多くても約8μM、多くても約7μM、多くても約6μM、多くても約5μM、多くても約4μM、多くても約3μM、多くても約2μM、多くても約1μM、多くても約900nM、多くても約800nM、多くても約700nM、多くても約600nM、多くても約500nM、多くても約400nM、多くても約300nM、多くても約200nM、多くても約100nM、多くても約90nM、多くても約80nM、多くても約70nM、多くても約60nM、多くても約50nM、多くても約40nM、多くても約30nM、多くても約20nM、多くても約10nM、多くても約1nM、多くても約0.5nM等の濃度で投与されてもよい。ある範囲の濃度、例えば22nM~1μMが用いられてもよい。1つ以上の小分子が使用されるとき、それらの濃度は同じであっても、又は使用される小分子毎に異なってもよい。
[0073] ある場合には、小分子阻害薬は、類似の遺伝子(例えば、WEE1等)と比べてPKMYT1に対してより高い選択性を有するように構成されてもよい。小分子阻害薬は、類似の遺伝子と比べてPKMYT1に対して約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、又はそれ以上の高い選択性を有し得る。小分子阻害薬は、類似の遺伝子と比べてPKMYT1に対して少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも400倍、少なくとも500倍、又はそれ以上の高い選択性を有し得る。
[0074] 第1の遺伝子(例えば、PPP2R2A)の欠損を含む癌では、標的遺伝子(例えば、PKMYT1)の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される1つ以上の治療用薬剤は、治療有効性を得るために対象に送達する必要のある濃度又は投薬量が低くなり得る。例えば、PPP2R2A及びPKMYT1は合成致死性であってもよく、PPP2R2Aの欠損を有する癌細胞を有する対象へのPKMYT1阻害薬の投与が治療上有効であり得る。このような例では、PPP2R2A欠損を有しない細胞(例えば、非癌細胞)と比較して、PPP2R2A欠損癌細胞を死滅させるために、より低い投薬量のPKMYT1阻害薬が十分であり得る。対象におけるPKMYT1阻害の投薬量又は濃度が高くなると、毒性が増加し得るため、選択した又は予めスクリーニングした癌種(例えば、PPP2R2A突然変異を含む癌)においてより低い濃度又は投薬量のPKMYT1阻害薬を投与することは、対象への毒性及び副作用を減少させるのに有利であり得る。
[0075] ある場合には、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を有する対象の治療方法は、PPP2R2Aの発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を対象に投与することを更に含む。ある場合には、癌を有する対象の治療方法は、CDK1の発現又は活性の低下を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を対象に投与することを更に含む。
[0076] ある場合には、標的遺伝子の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される1つ以上の治療用薬剤は、DNAコンストラクトを含む。例として、標的遺伝子はPKMYT1であってもよい。DNAコンストラクトはガイドRNA(gRNA)配列を含んでもよく、これは、タンパク質(例えば、Casタンパク質)を標的遺伝子(例えば、PKMYT1)に向かわせるために用いられるものであり得る。DNAコンストラクトはgRNA配列を含んでもよく、これは、タンパク質(例えば、Casタンパク質)を標的遺伝子(例えば、PKMYT1)に向かわせるものであってよい。DNAコンストラクトは、RNA配列、DNA配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。ある場合には、DNAコンストラクトは、(i)第1のgRNA配列(これは、エンドヌクレアーゼ(例えば、Casタンパク質)を標的遺伝子(例えば、PKMYT1)についての標的となる位置又は遺伝子座に向かわせるために用いられるものであり得る)と、(ii)遺伝子に対応する第1の配列(例えば、DNA配列)(例えば、PKMYT1の遺伝子置換体)とを含む。DNAコンストラクトにおいては、異なる組み合わせのRNA配列及びDNA配列が使用されてもよいことは理解されるであろう。更に、限定はされないが、バーコード配列、タグ、又は他の識別用配列、プライマー配列、制限部位、転位部位等を含め、他の機能配列がDNA配列に含まれてもよい。
[0077] エンドヌクレアーゼ複合体は、エンドヌクレアーゼ、例えば、Casタンパク質、又は他の核酸相互作用酵素(例えば、リガーゼ、ヘリカーゼ、逆転写酵素、転写酵素、ポリメラーゼ等)を含み得る。Casタンパク質は、任意のCas型(例えば、Cas I、Cas IA、Cas IB、Cas IC、Cas ID、Cas IE、Cas IF、Cas IU、Cas III、Cas IIIA、Cas IIIB、Cas IIIC、Cas IIID、Cas IV、Cas IVA、Cas IVB、Cas II、Cas IIA、Cas IIB、Cas IIC、Cas V、Cas VI)を含み得る。一部の例では、Casタンパク質は、他のタンパク質(例えば、融合タンパク質)を含んでもよく、核酸分子に関連したものであり得る追加の酵素(例えば、リガーゼ、転写酵素、トランスポザーゼ、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ等)を含んでもよい。エンドヌクレアーゼ複合体は、外因的に送達されてもよく、又は細胞内での転写及び翻訳用にDNAコンストラクトにコードされてもよい。
[0078] ある場合には、標的遺伝子(例えば、PKMYT1)の発現の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される1つ以上の治療用薬剤は、タンパク質又はペプチドを含み得る。例えば、1つ以上の治療用薬剤は、抗体、抗体断片、ホルモン、リガンド、又は免疫グロブリンを含み得る。タンパク質又はペプチドは、天然に存在するものであってもよく、又は合成であってもよい。タンパク質は、タンパク質の改変された変異体(例えば、組換えタンパク質)、又はその断片であってもよい。タンパク質は、限定はされないが、グリコシル化、アシル化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アミド化、アセチル化、メチル化、ホルミル化、ブチリル化、カルボキシル化、リン酸化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、プロピオニル化、S-ニトロシル化、S-グルタチオン化、スクシニル化、硫酸化、糖化、カルバミル化、カルボニル化、ビオチン化、カルバミル化、酸化、ペグ化、SUMO化、ユビキチン化、ユビキチン化、ラセミ化等を含めた他の修飾、例えば翻訳後修飾に供されてもよい。タンパク質又はペプチドに1つ以上の修飾が行われてもよい。
[0079] ある場合には、標的遺伝子(例えば、PKMYT1)の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される1つ以上の治療用薬剤は、核酸分子、例えばRNA分子を含み得る。RNA分子は、標的遺伝子(例えば、PKMYT1)の発現レベル又は活性を低下させるのに十分な任意の好適なRNA分子及びサイズを含み得る。RNA分子は、低分子ヘアピンRNA(shRNA)分子、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、又は他の有用なRNA分子を含み得る。一部の例において、RNA分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、piwi相互作用性(piRNA)、非コードRNA(ncRNA)、長鎖非コードRNA、(lncRNA)、及び前述のうちのいずれかの断片を含み得る。RNA分子は、一本鎖、二本鎖、又は部分的一本鎖若しくは二本鎖であってもよい。
[0080] 1つ以上の治療用薬剤(例えば、ペプチド、RNA分子、タンパク質-核酸複合体)は例として挙げられること、及び治療用薬剤各種の組み合わせを用いて対象を治療し得ることは理解されるであろう。例えば、1つ以上の異なる種類の治療用薬剤の投与を用いて標的遺伝子(例えば、PKMYT1)の発現又は活性を低下させてもよい。例えば、タンパク質又はペプチドは、小分子(例えば、分子量が900ダルトン未満の分子)、RNA分子、DNA分子、又は複合体化した分子(例えば、タンパク質-核酸分子)と共投与されてもよい。同様に、RNA分子は、小分子、DNA分子、又は複合体化した分子と共に投与されてもよい。別の例において、小分子は、DNA分子又は複合体化した分子と共投与されてもよい。これらの組み合わせのいずれかを用いて、第1の遺伝子(例えば、PPP2R2A)に突然変異を含む細胞において標的遺伝子(PKMYT1)の発現又は活性を低下させてもよい。これらの組み合わせは、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を有する又は有する疑いがある対象の治療に使用し得る薬剤の異なる組み合わせの非限定的な例である。
[0081] 例えば、図3は、2つの異なる遺伝子を標的とする一対のガイドRNAによる培養癌細胞集団の治療効果を決定するための例示的ワークフローを概略的に図解する。このような例では、治療は、第1の遺伝子(例えば、PPP2R2A)及び第2の遺伝子(例えば、PKMYT1)の活性又は発現を低下させるための核酸分子の投与を含み得る。この核酸分子は、第1のgRNA配列(sgRNA-A)と、第2のgRNA配列(sgRNA-B)と、第1のDNA配列(BC-B)と、第2のDNA配列(BC-A)とを含み得るDNAコンストラクトを含むことができる。第1のDNA配列又は第2のDNA配列、又は第1及び第2の両方のDNA配列は、バーコード配列を含み得る。第1のガイド配列は、第1の遺伝子(例えば、PPP2R2A)との配列相同性を有してもよく、ひいては第1の遺伝子がタンパク質(例えば、エンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9)による突然変異誘発の標的となってもよく、第2のガイド配列は、第2の遺伝子(例えば、PKMYT1)との配列相同性を有してもよく、ひいては第2の遺伝子がタンパク質(例えば、エンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9)による突然変異誘発の標的となってもよい。細胞(例えば、癌細胞)は、治療有効量のDNAコンストラクト及びタンパク質(例えば、Cas9)で治療され得る。ある場合には、DNAコンストラクトは、トランスフェクション(例えば、リポソーム又は他のナノ粒子を用いる)又は形質導入(例えば、ウイルスを用いる)によって導入されてもよい。タンパク質は、ナノ粒子又は他の小胞を用いるか、又はタンパク質を細胞培養培地に加えることにより投与されてもよい。タンパク質(例えば、Cas9)は、sgRNA-A及びsgRNA-Bを使用して、タンパク質を細胞ゲノム中の特異的遺伝子座又は位置(例えば、PPP2R2A及びPKMYT1の遺伝子座)に向かわせ得る。次に、タンパク質は、内因性遺伝子(例えば、PPP2R2A及びPKMYT1)を切り出し、及び/又は置き換え得る。内因性遺伝子を置き換える場合、タンパク質(例えば、Cas9)は、内因性遺伝子を第1のDNA配列(BC-B)及び第2のDNA配列(BC-A)に置き換え得る。次に細胞が、ある継続期間(例えば、7日、14日、20日等)にわたって培養されてもよい。培養された細胞集団からのDNAをシーケンシングすると、存在する可能性のあるガイドRNA対の各々の存在量を確定することができる。特定のガイド対の存在量が実質的に減少していれば、当該の遺伝子ノックダウンの組み合わせがそれらの細胞の増殖能力に有害な効果を及ぼすことが示唆され得る。
[0082] ある場合には、細胞又は細胞集団中で標的遺伝子のみがノックアウトされてもよく、この細胞は、標的遺伝子と合成致死性を持つ欠損遺伝子を含む。図4は、遺伝子(例えば、PPP2R2A)が欠損している培養癌細胞集団の治療効果を決定するための例示的ワークフローを概略的に図解する。このような例では、治療は、標的遺伝子(例えば、PKMYT1)の活性又は発現を低下させるための核酸分子の投与を含み得る。核酸分子は、gRNA配列(sgRNA-A)及びDNA配列(BC-A)を含み得るDNAコンストラクトを含むことができる。DNA配列はバーコード配列を含んでもよく、ガイド配列は、標的遺伝子(例えば、PKMYT1)との配列相同性を有してもよく、ひいては標的遺伝子がタンパク質(例えば、エンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9)による突然変異誘発の標的となり得る。突然変異(例えば、PPP2R2A突然変異)を含む細胞(例えば、癌細胞)の集団は、治療有効量のDNAコンストラクト及びタンパク質(例えば、Cas9)で治療され得る。ある場合には、DNAコンストラクトは、トランスフェクション(例えば、リポソーム又は他のナノ粒子を用いる)又は形質導入(例えば、ウイルスを用いる)によって導入されてもよい。タンパク質は、ナノ粒子又は他の小胞を用いるか、又はタンパク質を細胞培養培地に加えることにより投与されてもよい。タンパク質(例えば、Cas9)はsgRNA-Aを使用してタンパク質を細胞ゲノム中の特異的遺伝子座又は位置(例えば、PKMYT1の遺伝子座)に向かわせ得る。次に、タンパク質は、内因性遺伝子(例えば、PKMYT1)を切り出し、及び/又は置き換え得る。内因性遺伝子を置き換える場合、タンパク質(例えば、Cas9)は、内因性遺伝子をDNA配列(BC-A)に置き換え得る。次に細胞が、ある継続期間(例えば、7日、14日、20日等)にわたって培養されてもよい。細胞の増殖又は生存能力が測定され、一部の例では、細胞(例えば、非突然変異体PPP2R2A細胞)の対照集団と比較されてもよい。培養された細胞集団からのDNAをシーケンシングすると、存在する可能性のあるガイドRNAの各々の存在量を確定することができる。特定のガイドの存在量が実質的に減少していれば、当該の遺伝子ノックダウンがそれらの細胞の増殖能力に有害な効果を及ぼすことが示唆され得る。PPP2R2A突然変異細胞の増殖を減少させるが、野生型細胞については減少させないガイドRNAは、PPP2R2Aとの合成致死性を有すると見なし得る。
[0083] ある場合には、標的遺伝子との合成致死性のある欠損遺伝子は、PP2Aのサブユニットのうちの1つをコードする遺伝子である。ある場合には、PP2Aサブユニットは、65kDa調節サブユニットAα(PPP2R1A)、65kDa調節サブユニットAβ(PPP2R1B)、55kDa調節サブユニットBα(PPP2R2A)、55kDa調節サブユニットBβ(PPP2R2B)、55kDa調節サブユニットBγ(PPP2R2C)、55kDa調節サブユニットBδ(PPP2R2D)、72/130kDa調節サブユニットB(PPP2R3A)、48kDa調節サブユニットB(PPP2R3B)、調節サブユニットB”サブユニットγ(PPP2R3C)、調節サブユニットB’(PPP2R4)、56kDa調節サブユニットα(PPP2R5A)、56kDa調節サブユニットβ(PPP2R5B)、56kDa調節サブユニットγ(PPP2R5C)、56kDa調節サブユニットδ(PPP2R5D)、56kDa調節サブユニットε(PPP2R5E)、触媒サブユニットα(PPP2CA)、及び触媒サブユニットβ(PPP2CB)からなる群から選択される。ある場合には、サブユニットは、PPP2R2Aである。
[0084] 別の態様において、本明細書には、(i)少なくとも1つの治療用薬剤と(ii)賦形剤とを含む製剤を含む、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を治療するための組成物が開示され、ここで少なくとも1つの治療用薬剤は、対象への投与後又は曝露後にプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるのに有効な量で存在し、賦形剤は、少なくとも1つの治療用薬剤が賦形剤の存在なしに対象に投与されるのと比較したとき、対象への投与後又は曝露後に少なくとも1つの治療用薬剤を安定化させるか、又は少なくとも1つの治療用薬剤の治療増強を提供し、及び癌は、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現の差異(例えば、その低下又は増加)又は活性レベルの差異(例えば、低下、増加又は変化)を有する細胞を含む癌性組織に関連している。
[0085] ある場合には、癌性組織は、***組織、膵臓組織、子宮組織、膀胱組織、結腸直腸組織、前立腺組織、肝組織、又は卵巣組織である。ある場合には、癌性組織は、肝組織である。ある場合には、癌性組織は、卵巣組織である。
[0086] ある場合には、PKMYT1の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される少なくとも1つの治療用薬剤は、小分子(例えば、分子量が900ダルトン未満の分子)、タンパク質、ペプチド、リボ核酸(RNA)分子、デオキシリボ核酸(DNA)コンストラクト、又はこれらの組み合わせ(例えば、タンパク質-核酸複合体)を含み得る。ある例では、少なくとも1つの治療用薬剤は、タンパク質-核酸複合体、例えば、エンドヌクレアーゼ複合体及びDNAコンストラクトを含み得る。ある場合には、エンドヌクレアーゼ複合体は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(Cas)タンパク質又はその変異体(例えば、改変された変異体)を含む。そのような場合、DNAコンストラクトはエンドヌクレアーゼ複合体と共投与されてもよい。或いは、又はそれに加えて、DNAコンストラクトはエンドヌクレアーゼ遺伝子を含んでもよい。そのような場合、DNAコンストラクトは、Casタンパク質又はその変異体(例えば、改変された変異体)をコードする遺伝子を含み得る。細胞(例えば、癌細胞)へのDNAコンストラクトの導入又は送達後、DNAコンストラクトは細胞により、細胞自らの機構(例えば、ポリメラーゼ、リボソーム等)を用いて転写され、翻訳されてもよい。
[0087] 一部の例では、PKMYT1の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される少なくとも1つの治療用薬剤は、小分子阻害薬(例えば、分子量が900ダルトン未満の分子)を含む。小分子は、標的遺伝子単独の発現レベル又は活性レベルを低下させるように構成されてもよく、又は小分子は、PKMYT1及びPPP2R2Aの発現レベル又は活性レベルを低下させるように構成されてもよい。ある場合には、小分子は、PKMYT1、又はPKMYT1及びPPP2R2Aと直接相互作用し得る。例えば、小分子は、それぞれ、PKMYT1単独、又はPKMYT1とPPP2R2Aとの組み合わせによってコードされる1つ又は複数のタンパク質を阻害し得る。或いは、又はそれに加えて、小分子は、PKMYT1又はPPP2R2Aが相互作用するシグナル伝達経路における上流エフェクター又は下流タンパク質を阻害し得る。
[0088] ある場合には、小分子阻害薬は、PKMYT1阻害薬を含み得る。PKMYT1阻害薬は、例えば、ダサチニブ、サラカチニブ、ペリチニブ、チルホスチンAG 1478、PD-0166285、PD-173952、PD-173955、又はPD-180970であり得る。小分子阻害薬は、PKMYT1(遺伝子)の発現又はプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1遺伝子に由来するタンパク質)の活性を直接、又は間接的に阻害し、又は低下させるように構成されてもよい。例えば、小分子阻害薬は、プロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1タンパク質、又は限定はされないが、図1A~図1Bに示されるものなど、シグナル伝達経路においてプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1の上流又は下流にあり得る別のタンパク質を阻害し得る。
[0089] ある場合には、小分子阻害薬は、WEE1阻害薬を含み得る。WEE1阻害薬は、例えば、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、2-アリル-1-(6-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)ピリジン-2-イル)-6-((4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)アミノ)-1,2-ジヒドロ-3H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-オン(MK-1775)、9-ヒドロキシ-4-フェニルピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン(PD-407824)、6-ブチル-4-(2-クロロフェニル)-9-ヒドロキシピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン、又は6-(2-クロロ-6-フルオロフェニル)-2-((2,4,4-トリメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-7-イル)アミノ)イミダゾ[1,2-a]ピリミド[5,4-e]ピリミジン-5(6H)-オンであり得る。小分子阻害薬は、WEE1(遺伝子)の発現又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1遺伝子に由来するタンパク質)の活性を、直接、又は間接的のいずれかで阻害し、又は低下させるように構成されてもよい。例えば、小分子阻害薬は、WEE1 G2チェックポイントキナーゼタンパク質、又は限定はされないが、図1Aに示されるものなど、シグナル伝達経路においてWEE1 G2チェックポイントキナーゼの上流又は下流にあり得る別のタンパク質を阻害し得る。例えば、小分子阻害薬は、CDK1、CDK2等の発現又は活性レベルを阻害し、又は他に何らか低下させるものであり得る。
[0090] ある場合には、小分子阻害薬は、小分子阻害薬又はその誘導体の組み合わせを含み得る。例えば、小分子阻害薬は、二重特異性となるように改変され、又は修飾されてもよく、PKMYT1及びPPP2R2Aの両方の発現又は活性を低下させてもよい。或いは、又はそれに加えて、小分子阻害薬の組み合わせ(例えば、小分子「カクテル」)を使用して、PKMYT1、又はPKMYT1とPPP2R2Aとの組み合わせの発現を低下させてもよい。ある場合には、小分子阻害薬は、別種の治療用薬剤(例えば、タンパク質、RNA分子、DNA分子等)と共に投与されてもよい。
[0091] 小分子阻害薬は、任意の有用な濃度で投与されてもよい。例えば、小分子は、約0.5ナノモル(nM)、約1nM、約10nM、約20nM、約30nM、約40nM、約50nM、約60nM、約70nM、約80nM、約90nM、約100nM、約200nM、約300nM、約400nM、約500nM、約600nM、約700nM、約800nM、約900nM、約1マイクロモル(μM)、約2μM、約3μM、約4μM、約5μM、約6μM、約7μM、約8μM、約9μM、約10μMの濃度で投与されてもよい。小分子は、少なくとも約0.5ナノモル(nM)、少なくとも約1nM、少なくとも約10nM、少なくとも約20nM、少なくとも約30nM、少なくとも約40nM、少なくとも約50nM、少なくとも約60nM、少なくとも約70nM、少なくとも約80nM、少なくとも約90nM、少なくとも約100nM、少なくとも約200nM、少なくとも約300nM、少なくとも約400nM、少なくとも約500nM、少なくとも約600nM、少なくとも約700nM、少なくとも約800nM、少なくとも約900nM、少なくとも約1マイクロモル(μM)、少なくとも約2μM、少なくとも約3μM、少なくとも約4μM、少なくとも約5μM、少なくとも約6μM、少なくとも約7μM、少なくとも約8μM、少なくとも約9μM、少なくとも約10μMの濃度で投与されてもよい。小分子は、多くても約10μM、多くても約9μM、多くても約8μM、多くても約7μM、多くても約6μM、多くても約5μM、多くても約4μM、多くても約3μM、多くても約2μM、多くても約1μM、多くても約900nM、多くても約800nM、多くても約700nM、多くても約600nM、多くても約500nM、多くても約400nM、多くても約300nM、多くても約200nM、多くても約100nM、多くても約90nM、多くても約80nM、多くても約70nM、多くても約60nM、多くても約50nM、多くても約40nM、多くても約30nM、多くても約20nM、多くても約10nM、多くても約1nM、多くても約0.5nM等の濃度で投与されてもよい。ある範囲の濃度、例えば22nM~1μMが用いられてもよい。1つ以上の小分子が使用されるとき、それらの濃度は同じであっても、又は使用される小分子毎に異なってもよい。本明細書の他の部分に記載されるとおり、PPP2R2A欠損を有する細胞を含む癌においては、非欠損癌細胞と比較すると、PKMYT1の阻害に1つ以上の治療用薬剤のより低い濃度又は投薬量が治療上有効であり得る。
[0092] ある場合には、組成物は、PPP2R2Aの発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるのに有効な量で存在する少なくとも1つの治療用薬剤を更に含み得る。ある場合には、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を有する対象の治療方法は、CDK1の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を対象に投与することを更に含む。
[0093] ある場合には、発現PKMYT1の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される1つ以上の治療用薬剤は、DNAコンストラクトを含む。DNAコンストラクトはガイドRNA(gRNA)配列を含んでもよく、これは、タンパク質(例えば、Casタンパク質)をPKMYT1に向かわせるために用いられるものであり得る。DNAコンストラクトはgRNA配列を含んでもよく、これは、タンパク質(例えば、Casタンパク質)をPKMYT1に向かわせるものであり得る。DNAコンストラクトは、RNA配列、DNA配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。ある場合には、DNAコンストラクトは、(i)第1のgRNA配列(これは、エンドヌクレアーゼ(例えば、Casタンパク質)をPKMYT1についての標的となる位置又は遺伝子座に向かわせるために用いられるものであり得る)と、(ii)PKMYT1遺伝子に対応する配列(例えば、DNA配列)(例えば、PKMYT1の遺伝子置換体)とを含む。DNAコンストラクトにおいては、異なる組み合わせのRNA配列及びDNA配列が使用されてもよいことは理解されるであろう。更に、限定はされないが、バーコード配列、タグ、又は他の識別用配列、プライマー配列、制限部位、転位部位等を含め、他の機能配列がDNA配列に含まれてもよい。
[0094] エンドヌクレアーゼ複合体は、エンドヌクレアーゼ、例えば、Casタンパク質、又は他の核酸相互作用酵素(例えば、リガーゼ、ヘリカーゼ、逆転写酵素、転写酵素、ポリメラーゼ等)を含み得る。Casタンパク質は、任意のCas型(例えば、Cas I、Cas IA、Cas IB、Cas IC、Cas ID、Cas IE、Cas IF、Cas IU、Cas III、Cas IIIA、Cas IIIB、Cas IIIC、Cas IIID、Cas IV、Cas IVA、Cas IVB、Cas II、Cas IIA、Cas IIB、Cas IIC、Cas V、Cas VI)を含み得る。一部の例では、Casタンパク質は、他のタンパク質(例えば、融合タンパク質)を含んでもよく、核酸分子に関連したものであり得る追加の酵素(例えば、リガーゼ、転写酵素、トランスポザーゼ、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ等)を含んでもよい。エンドヌクレアーゼ複合体は、外因的に送達されてもよく、又は細胞内での転写及び翻訳用にDNAコンストラクトにコードされてもよい。
[0095] ある場合には、PKMYT1の発現の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される少なくとも1つの治療用薬剤は、タンパク質又はペプチドを含み得る。例えば、1つ以上の治療用薬剤は、抗体、抗体断片、ホルモン、リガンド、又は免疫グロブリンを含み得る。タンパク質又はペプチドは、天然に存在するものであってもよく、又は合成であってもよい。タンパク質は、タンパク質の改変された変異体(例えば、組換えタンパク質)、又はその断片であってもよい。タンパク質は、限定はされないが、グリコシル化、アシル化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アミド化、アセチル化、メチル化、ホルミル化、ブチリル化、カルボキシル化、リン酸化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、プロピオニル化、S-ニトロシル化、S-グルタチオン化、スクシニル化、硫酸化、糖化、カルバミル化、カルボニル化、ビオチン化、カルバミル化、酸化、ペグ化、SUMO化、ユビキチン化、ユビキチン化、ラセミ化等を含めた他の修飾、例えば翻訳後修飾に供されてもよい。タンパク質又はペプチドに1つ以上の修飾が行われてもよい。
[0096] ある場合には、PKMYT1の発現又は活性の差異(例えば、その低下又は増加)を生じさせるために使用される少なくとも1つの治療用薬剤は、核酸分子、例えばRNA分子を含み得る。RNA分子は、PKMYT1、及び、一部の例ではPPP2R2Aの発現レベル又は活性を低下させるのに十分な任意の好適なRNA分子及びサイズを含み得る。RNA分子は、低分子ヘアピンRNA(shRNA)分子、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、又は他の有用なRNA分子を含み得る。一部の例において、RNA分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、piwi相互作用性(piRNA)、非コードRNA(ncRNA)、長鎖非コードRNA、(lncRNA)、及び前述のうちのいずれかの断片を含み得る。RNA分子は、一本鎖、二本鎖、又は部分的一本鎖若しくは二本鎖であってもよい。
[0097] 治療用薬剤(例えば、ペプチド、RNA分子、タンパク質-核酸複合体)は例として挙げられること、及び治療用薬剤各種の組み合わせを用いて対象を治療し得ることが理解されるであろう。例えば、組成物は、PKMYT1の発現又は活性を低下させるために使用し得る1つ以上の異なる種類の治療用薬剤を含み得る。例えば、タンパク質又はペプチドは、小分子(例えば、分子量が900ダルトン未満の分子)、RNA分子、DNA分子、又は複合体化した分子(例えば、タンパク質-核酸分子)と共投与されてもよい。同様に、RNA分子は、小分子、DNA分子、又は複合体化した分子と共に投与されてもよい。別の例において、小分子は、DNA分子又は複合体化した分子と共投与されてもよい。これらの組み合わせは、癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)を有する又は有する疑いがある対象の治療に使用し得る薬剤の異なる組み合わせの非限定的な例である。
[0098] 組成物はまた、賦形剤も含み得る。賦形剤は、物質であって、PKMYT1の発現又は活性レベルを低下させるために使用される治療用薬剤又は1つ若しくは複数の治療用薬剤に特性を付与するために使用され得る物質を含み得る。例えば、賦形剤は、治療用薬剤の安定化用物質を含み得る。賦形剤は、治療用薬剤の固体、液体、又はゲル製剤の増量用物質を含み得る。ある場合には、物質は、治療用薬剤に(例えば、溶解度を増強することによって)治療増強を付与し得る。物質は、粘度など、組成物の特性を変化させるために使用されてもよい。物質は、治療用薬剤の特性、例えば、バイオアベイラビリティ、吸収、親水性、疎水性、薬物動態等を変化させるために使用されてもよい。賦形剤は、結合剤、抗接着剤、コーティング、崩壊剤、流動化剤(例えば、シリカゲル、タルク、炭酸マグネシウム)、滑沢剤、保存剤、吸着剤、甘味料、媒体、又はこれらの組み合わせを含み得る。例えば、賦形剤は、粉末、ミネラル、金属、糖(例えばサッカリド又は多糖)、糖アルコール、天然に存在するポリマー(例えば、セルロース、メチルセルロース)、合成ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール又はポリビニルピロリドン)、アルコール、増粘剤、デンプン、巨大分子(例えば、脂質、タンパク質、炭水化物、核酸分子)等を含み得る。
1つ以上の治療用薬剤の送達又は投与
[0099] 本開示は、本明細書に記載される1つ以上の治療用薬剤を送達し、それを投与し、又はそれに曝露するための方法及び組成物を提供する。1つ以上の治療用薬剤は、対象に(例えば、インビボで)、又は対象からの細胞若しくは細胞集団に(例えば、エキソビボ又はインビボで)送達されてもよい。ある場合には、1つ以上の治療用薬剤は、ナノ粒子など、1つ以上の送達小胞で対象に送達されてもよい。ナノ粒子は、任意の好適なナノ粒子であってよく、固体、半固体、半液体又はゲルであってもよい。ナノ粒子は、親油性粒子及び両親媒性粒子であってもよい。例えば、ナノ粒子は、ミセル、リポソーム、エキソソーム、又は他の脂質含有小胞を含み得る。ある場合には、ナノ粒子は、特定の細胞又は細胞種(例えば、癌細胞)への標的化した送達となるように構成されてもよい。そのような場合、ナノ粒子は、特定の細胞又は細胞種(例えば、癌細胞)に特異的に結合し得る幾つものリガンド、例えば、抗体、核酸分子(例えば、リボ核酸(RNA)分子又はデオキシリボ核酸(DNA)分子)、タンパク質、ペプチドで装飾されてもよい。
[0099] 本開示は、本明細書に記載される1つ以上の治療用薬剤を送達し、それを投与し、又はそれに曝露するための方法及び組成物を提供する。1つ以上の治療用薬剤は、対象に(例えば、インビボで)、又は対象からの細胞若しくは細胞集団に(例えば、エキソビボ又はインビボで)送達されてもよい。ある場合には、1つ以上の治療用薬剤は、ナノ粒子など、1つ以上の送達小胞で対象に送達されてもよい。ナノ粒子は、任意の好適なナノ粒子であってよく、固体、半固体、半液体又はゲルであってもよい。ナノ粒子は、親油性粒子及び両親媒性粒子であってもよい。例えば、ナノ粒子は、ミセル、リポソーム、エキソソーム、又は他の脂質含有小胞を含み得る。ある場合には、ナノ粒子は、特定の細胞又は細胞種(例えば、癌細胞)への標的化した送達となるように構成されてもよい。そのような場合、ナノ粒子は、特定の細胞又は細胞種(例えば、癌細胞)に特異的に結合し得る幾つものリガンド、例えば、抗体、核酸分子(例えば、リボ核酸(RNA)分子又はデオキシリボ核酸(DNA)分子)、タンパク質、ペプチドで装飾されてもよい。
[00100] 1つ以上の治療用薬剤は、ウイルス手法を用いて送達されてもよい。例えば、1つ以上の治療用薬剤は、ウイルスベクターを用いて投与されてもよい。そのような場合、1つ以上の治療用薬剤は、細胞、細胞集団、又は対象への送達用のウイルスに封入されてもよい。ウイルスは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、又は他の有用なウイルスであり得る。ウイルスは改変されてもよく、又は天然に存在するものであってもよい。
[00101] 1つ以上の治療用薬剤は、対象(例えば、ヒト患者)又は対象の体へと(例えば、腫瘍部位に)、単一の又は様々な手法を用いて送達されてもよい。例えば、1つ以上の治療用薬剤は、経口的に、静脈内に、腹腔内に、腫瘍内に、皮下に、局所的に、経皮的に、経粘膜的に、又は別の投与手法を通じて送達され、又は投与されてもよい。
[00102] 1つ以上の治療用薬剤は、対象に経腸的に送達されてもよい。例えば、1つ以上の治療用薬剤は、対象に経口的に、経鼻的に、経直腸的に、舌下に、唇下に、頬側的に、局所的に、又は浣腸を通じて投与されてもよい。そのような場合、1つ以上の治療用薬剤は、錠剤、カプセル、点滴薬又は他の製剤に製剤化されてもよい。製剤は、経腸的に送達されるように構成されてもよい。
[00103] 1つ以上の治療用薬剤は、対象に非経口的に送達されてもよい。例えば、1つ以上の治療用薬剤は、注射によって対象の一部位に投与されてもよい。部位は中枢神経系を含んでもよく、1つ以上の治療用薬剤は、硬膜外、脳内、脳室内等に送達されてもよい。部位は皮膚を含んでもよく、1つ以上の治療用薬剤は、表皮に送達されてもよい。例えば、1つ以上の治療用薬剤は経皮パッチに製剤化されてもよく、これは1つ以上の治療用薬剤を対象の皮膚に送達することができる。1つ以上の治療用薬剤は、舌下に及び/又は頬側に(bucally)、羊膜外に、鼻腔的に、動脈内に、関節内に、静脈内に(intravavernously)、心臓内に(intracardiacally)、皮内に、病巣内に、筋肉内に、眼内に、骨内に、腹腔内に、髄腔内に、子宮内に、膣内に、静脈内に、膀胱内に、硝子体内に、皮下に、経皮的に、血管周囲に、経粘膜的に、又は別の投与経路を通じて送達されてもよい。ある場合には、1つ以上の治療用薬剤は、局所的に送達されてもよい。
[00104] 1つ以上の治療用薬剤は、エアロゾル、丸薬、錠剤、カプセル(例えば、非対称膜カプセル)、トローチ、エリキシル剤、エマルション、散剤、溶液、懸濁液、チンキ剤、液剤、ゲル、ドライパウダー、吸入剤、点滴薬、軟膏、パッチ、又はこれらの組み合わせに製剤化されてもよい。例えば、1つ以上の治療用薬剤は、ゲル又はポリマーに製剤化され、薄膜フィルムによって送達されてもよい。
[00105] 一部の例では、1つ以上の治療用薬剤は、標的化した送達手法(例えば、腫瘍部位への標的化した送達のための)を用いるか、又は細胞による1つ以上の治療用薬剤の取込みを増加させる送達手法を用いて対象に送達されてもよい。送達手法は、磁気的薬物送達(例えば、磁気ナノ粒子ベースの薬物送達)、音響的標的化薬物送達手法、自己マイクロエマルション化薬物送達システム、又は他の送達手法を含み得る。ある場合には、1つ以上の治療用薬剤は、標的化した送達用に、又は細胞による取込みが増加するように製剤化されてもよい。例えば、1つ以上の治療用薬剤は、1つ以上の治療用薬剤の溶解性、疎水性、親水性、吸収性、半減期、バイオアベイラビリティ、放出プロファイル、又は他の特性を改善し得る別の薬剤と共に製剤化されてもよい。例えば、1つ以上の治療用薬剤は、1つ以上の治療用薬剤の放出プロファイルを制御し得るポリマーと共に製剤化されてもよい。1つ以上の治療用薬剤は、1つ以上の治療用薬剤の特性(例えば、バイオアベイラビリティ、薬物動態等)を変化させるため、コーティングとして、又はコーティング(例えば、ウシ顎下腺ムチンコーティング、ポリマーコーティング等)を施して製剤化されてもよい。
[00106] 一部の例では、1つ以上の治療用薬剤は、レトロメタボリックドラッグデザインを用いて製剤化されてもよい。そのような場合、1つ以上の治療用薬剤が細胞における代謝効果に関して評価されてもよく、誘導体(例えば、化学的に合成された代替品又は改変された変異体)を含む新規製剤が、1つ以上の治療用薬剤の特性を変更する(例えば、有効性を増加させる、望ましくない副作用を最小限に抑える、バイオアベイラビリティを変化させる等)ように設計されてもよい。
実施例
実施例1-合成致死性対としてのPKMYT1及びPPP2R2Aの同定
[00107] 文献及び公開データから、癌細胞における有用なバイオマーカーを掘り起こすことができ、例えば、マルチオミクス分析、腫瘍種(例えば原発腫瘍)の判定、細胞株、標的の取り扱い易さ、バイオマーカー保因率等の考察を用いて候補の更なる精緻化を実施することができる。かかるスクリーニングの一例では、例えば、癌細胞におけるPPP2R2Aの頻度が非癌細胞と比較して高いこと、及び癌細胞におけるPKMYT1の発現レベルが非癌細胞と比較して高いことを理由に、PPP2R2A及びPKMYT1を有用なバイオマーカーとして同定し得る。調査される癌種としては、限定はされないが、急性骨髄性白血病(LAML)、副腎皮質癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、脳低悪性度神経膠腫(LGG)、浸潤性乳癌(BRCA)、子宮頸部扁平上皮癌・子宮頸管腺癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、慢性骨髄球性白血病(LCML)、腺癌(COAD)、食道癌(ESCA)、多形性膠芽腫(GBM)、頭頸部扁平上皮癌(HNSC)、色素嫌性腎(KICH)、腎臓腎明細胞癌(KIRC)、腎臓腎乳頭細胞癌(KIRP)、肝臓肝細胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺扁平上皮癌(LUSC)、リンパ系新生物びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBC)、中皮腫(MESO)、卵巣漿液性嚢胞腺癌(OV)、膵臓腺癌(PAAD)、褐色細胞腫・傍神経節腫(PCPG)、ホルモン不応性前立腺腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、肉腫(SARC)、皮膚皮膚黒色腫(SKCM)、精巣胚細胞腫瘍(TGCT)、胸腺腫(THYM)、甲状腺癌(THCA)、子宮癌肉腫(UCS)、子宮体部子宮内膜癌(UCEC)、及びぶどう膜黒色腫(UVM)を挙げることができる。
実施例1-合成致死性対としてのPKMYT1及びPPP2R2Aの同定
[00107] 文献及び公開データから、癌細胞における有用なバイオマーカーを掘り起こすことができ、例えば、マルチオミクス分析、腫瘍種(例えば原発腫瘍)の判定、細胞株、標的の取り扱い易さ、バイオマーカー保因率等の考察を用いて候補の更なる精緻化を実施することができる。かかるスクリーニングの一例では、例えば、癌細胞におけるPPP2R2Aの頻度が非癌細胞と比較して高いこと、及び癌細胞におけるPKMYT1の発現レベルが非癌細胞と比較して高いことを理由に、PPP2R2A及びPKMYT1を有用なバイオマーカーとして同定し得る。調査される癌種としては、限定はされないが、急性骨髄性白血病(LAML)、副腎皮質癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、脳低悪性度神経膠腫(LGG)、浸潤性乳癌(BRCA)、子宮頸部扁平上皮癌・子宮頸管腺癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、慢性骨髄球性白血病(LCML)、腺癌(COAD)、食道癌(ESCA)、多形性膠芽腫(GBM)、頭頸部扁平上皮癌(HNSC)、色素嫌性腎(KICH)、腎臓腎明細胞癌(KIRC)、腎臓腎乳頭細胞癌(KIRP)、肝臓肝細胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺扁平上皮癌(LUSC)、リンパ系新生物びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBC)、中皮腫(MESO)、卵巣漿液性嚢胞腺癌(OV)、膵臓腺癌(PAAD)、褐色細胞腫・傍神経節腫(PCPG)、ホルモン不応性前立腺腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、肉腫(SARC)、皮膚皮膚黒色腫(SKCM)、精巣胚細胞腫瘍(TGCT)、胸腺腫(THYM)、甲状腺癌(THCA)、子宮癌肉腫(UCS)、子宮体部子宮内膜癌(UCEC)、及びぶどう膜黒色腫(UVM)を挙げることができる。
[00108] 例えば、図2は、異なる癌種(X軸)におけるPPP2R2A不活性化又は欠損の頻度(Y軸)のプロットを示す。ある種の癌では(例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌)、PPP2R2Aの突然変異頻度は約15%もの高さに上り得る。他のある癌種では(例えば、卵巣漿液性嚢胞腺癌、直腸腺癌)、PPP2R2Aの突然変異頻度は10%を上回り得る。様々な癌種において、不活性化につながるPPP2R2Aの欠損には、PPP2R2A遺伝子の過剰メチル化、深い欠失、又は突然変異が含まれ得る。
[00109] 図5は、様々な癌種(X軸)における正常(非癌)細胞と比べた癌細胞におけるPKMYT1の発現レベル(Y軸、変化倍数として示される)のプロットを示す。ある種の癌では(例えば、肺扁平上皮癌)、非癌細胞と比較してPKMYT1の発現レベルが上昇する。図6は、正常細胞(n=50)と比較した癌(腫瘍)細胞(n=371)におけるPKMYT1の発現レベル(Y軸、ln(発現)として示される)の散布図を示す。このプロットから分かるとおり、癌細胞のPKMYT1発現は、正常細胞と比べて有意に高くなり得る。まとめると、図5~図6は、様々な癌種でPKMYT1が高発現となり得ることを実証している。
[00110] 可能性のある合成致死性対としてのPPP2R2A及びPKMYT1の更なるスクリーニングを実施し得る。例えば、不活性の又は欠損しているPPP2R2Aを有する細胞の集団全体にわたるPKMYT1の発現レベルを、PPP2R2Aの正常な又は野生型の遺伝子型又は表現型を有する細胞の集団全体にわたるPKMYT1の発現レベルと比較し得る。図7Aは、不活性の又は欠損しているPPP2R2A(例えば、突然変異型PPP2R2A)を有するか(n=7細胞)又は野生型PPP2R2Aを有するか(n=15細胞)のいずれかである2つの細胞集団におけるPKMYT1のAchilles必須性スコア(Y軸)の散布図を示す。図7Bは、不活性の又は欠損しているPPP2R2A(例えば、突然変異型PPP2R2A)を有するか(n=6細胞)又は野生型PPP2R2Aを有するか(n=12細胞)のいずれかである2つの細胞集団におけるPKMYT1のDEMETER必須性スコア(Y軸)の散布図を示す。PPP2R2A欠損を有する細胞集団では、野生型PPP2R2Aを有する細胞集団と比べてPKMYT1の必須性がより高く;即ち、PPP2R2A欠損細胞では、野生型細胞と比べてPKMYT1ノックダウンの致死性がより高い。これらのデータは、PPP2R2A及びPKMYT1が合成致死性対の潜在的な候補であり得ること、及び両方の遺伝子のノックダウンが細胞死を引き起こし得ること、又はPPP2R2A欠損細胞におけるPKMYT1のノックダウンが細胞死を引き起こし得ることを示唆するものであり得る。
実施例2-合成致死性対としてのPKMYT1及びPPP2R2A
[00111] PKMYT1-PPP2R2A合成致死性は、実験的に試験し得る。一つの具体的な手法では、コンビナトリアルジェネティクスCRISPR手法(例えば、コンビナトリアル・ジェネティクス・アンマス(combinatorial genetics en masse:CombiGEM))を用いてPKMYT1及びPPP2R2A遺伝子を細胞のゲノムからノックダウン又はノックアウトし得る。このような例では、DNAコンストラクトを作成し得る。このDNAコンストラクトは、エンドヌクレアーゼ(例えば、Casタンパク質)をPKMYT1遺伝子に向かわせるためのPKMYT1 gRNA、並びにエンドヌクレアーゼ(例えば、Casタンパク質)をPPP2R2A遺伝子に向かわせるためのPPP2R2A gRNAを含み得る。PKMYT1 gRNA及びPPP2R2A gRNAは、それぞれ内因性PKMYT1遺伝子及びPPP2R2A遺伝子の配列と相同又は相補的な配列を含み得る。一部の例では、DNAコンストラクトはまた、ゲノム中のPKMYT1及びPPP2R2Aを置き換えるための置換遺伝子(例えば、機能不全配列、ランダムDNA配列)も含み得る。
[00111] PKMYT1-PPP2R2A合成致死性は、実験的に試験し得る。一つの具体的な手法では、コンビナトリアルジェネティクスCRISPR手法(例えば、コンビナトリアル・ジェネティクス・アンマス(combinatorial genetics en masse:CombiGEM))を用いてPKMYT1及びPPP2R2A遺伝子を細胞のゲノムからノックダウン又はノックアウトし得る。このような例では、DNAコンストラクトを作成し得る。このDNAコンストラクトは、エンドヌクレアーゼ(例えば、Casタンパク質)をPKMYT1遺伝子に向かわせるためのPKMYT1 gRNA、並びにエンドヌクレアーゼ(例えば、Casタンパク質)をPPP2R2A遺伝子に向かわせるためのPPP2R2A gRNAを含み得る。PKMYT1 gRNA及びPPP2R2A gRNAは、それぞれ内因性PKMYT1遺伝子及びPPP2R2A遺伝子の配列と相同又は相補的な配列を含み得る。一部の例では、DNAコンストラクトはまた、ゲノム中のPKMYT1及びPPP2R2Aを置き換えるための置換遺伝子(例えば、機能不全配列、ランダムDNA配列)も含み得る。
[00112] 対照DNAコンストラクトもまた作成し得る。例えば、遺伝子対が合成致死性であるかどうかを決定するため、PKMYT1及びPPP2R2Aを個別的に、並びにこの遺伝子対の組み合わせを破壊する効果をモニタすることが重要となることもある。更に、陰性対照の効果をモニタすることが重要となることもあり、ここでは、一方又は両方の遺伝子についての「ノンカット」対照として無効なgRNA、例えば非特異的gRNAを含むDNAコンストラクトが構築されてもよい。陰性対照コンストラクトの別の例は、媒体対照を含み得る。ある場合には、陽性対照もまた使用し得る。陽性対照は、例えば、ポリメラーゼ(例えば、RNAポリメラーゼ、例えばPOLR2D)用のgRNAを含むDNAコンストラクトを含んでもよく、これは、細胞の生存又は増殖に必須の遺伝子のノックアウト(及びそれを実行する送達機構)が致死性を引き起こすことを実証できる。陽性対照の別の例では、合成致死性対であることが公知の2つの遺伝子(例えば、メチルチオアデノシンホスホリラーゼ(MTAP)及びタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ5(PRMT5))のノックアウトを、例えば、その公知の合成致死性遺伝子の各々に向けられるgRNAを含むDNAコンストラクトを用いて実施し得る。
[00113] 次にDNAコンストラクトを癌(例えば、肝癌又は卵巣癌)細胞に導入してもよく、この細胞は、一次供給源からの(例えば、腫瘍又は癌から単離された)細胞又は細胞株を含み得る。エンドヌクレアーゼ、例えばCas9もまた、癌細胞に導入し得る。次にCas9が、処理下の細胞のPKMYT1及びPPP2R2A遺伝子を置換し、編集し、又は欠失させてもよく、場合によっては、ゲノム中のPKMYT1及びPPP2R2A遺伝子をDNAコンストラクト中の置換遺伝子に置き換え得る。次に時間の経過に伴う細胞の増殖又は生存能力をモニタして、治療の有効性を決定し得る。細胞の生存能力は、未処理の細胞の陰性対照又は対照集団で正規化するか、又はそれと比較し得る。
[00114] 代謝活性を有する細胞による基質(無色)からのレゾルフィン(青色)の生成に基づく高感度蛍光(florescence)PrestoBlueアッセイを開発することにより、生存細胞を定量化した。簡潔に言えば、試験プレートは、96ウェルプレートにウェル当たり18,000細胞を播種することから開始した。90%を超える形質導入を実現するために達成されるウイルス力価に応じて、細胞をウェル当たり2~10μLのウイルス容積で形質導入した。形質導入から32時間後、培地を抗生物質(ピューロマイシン)含有培地に交換し、アッセイの残りの間にわたって抗生物質を維持した。3日目、プレートを分割し、以前に14日でコンフルエンシーに達するのに適格とされた量になるまで再び播種した。
[00115] 試験した各遺伝子対につき合計8個のコンストラクトを調製した:NTCと対の、遺伝子Aについて各2つのsgRNA(sg1、sg2)、NTCと対の、遺伝子Bについて各2つのsgRNA(sg1、sg2)、4つのsgRNAの組み合わせ(1,1;1,2;2,1;2,2)。
[00116] 図8A~図8Bは、CRISPRベースのPKMYT1及びPPP2R2Aノックアウト手法の例示的データを示す。図8Aは、導入されたDNAコンストラクトの関数としての細胞生存能力の棒グラフを図示する。これらのDNAコンストラクトはノックアウトに使用することができ、(i)二重陰性対照(NTC)配列、(ii)必須遺伝子のノックアウト用の陽性対照としてのポリメラーゼ(POL2)配列、(iii)ノックアウト用のMTAP配列、(iv)ノックアウト用のPRMT5配列、(v)ノックアウト用のMTAP及びPRMT5配列、これは陽性合成致死性対照として働き得る、(vi)ノックアウト用のPPP2R2A配列、(vii)ノックアウト用のPKMYT1配列、及び(viii)二重ノックアウト用のPPP2R2A及びPKMYT1配列を含み得る。陽性対照配列は、内因性POLR2D遺伝子を置き換えるための機能不全RNAポリメラーゼ遺伝子(例えば、POLR2D遺伝子)を含むDNAコンストラクトであってもよく、又はDNAコンストラクトは、ポリメラーゼ遺伝子をノックダウン又はノックアウトするように構成されてもよい。この陽性対照配列を使用すると、例えば、DNAコンストラクトが予想どおり機能するか、例えば、DNA複製、ひいては細胞増殖に必須の遺伝子のノックアウトが細胞生存能力の低下を引き起こすかを決定し得る。
[00117] 処理下の細胞の生存能力は、陰性対照(例えば、未処理細胞、又はスクランブルgRNAを含むか、若しくはPKMYT1及びPPP2R2Aの正常なコピーを含むDNAコンストラクトで処理した細胞)で正規化することができる。図8Aを見ると分かるとおり、陰性対照細胞群(NTC)は、試験した群の中で最も高い生存能力を有する。ポリメラーゼをノックアウトするためのDNAコンストラクトによって細胞が処理される陽性対照(POL2)は、予想どおり、正規化後の生存能力の劇的な低下を引き起こす。MTAP及びPRMT5をノックアウトするためのDNAコンストラクトによって細胞が処理される陽性対照(MTAP-PRMT5)もまた、陰性対照群と比較して生存能力の低下を引き起こす。PPP2R2A又はPKMYT1のいずれかの、単一遺伝子ノックアウトで処理される細胞もまた、陰性対照群と比較して生存能力の減少を示す。PPP2R2A及びPKMYT1のノックアウトは、PPP2R2Aの単一ノックアウト(p<0.0001)及び陰性対照と比べてはるかに低い生存能力を引き起こす。エラーバーは標準偏差を表す、n=3。
[00118] 図8Bは、導入されたDNAコンストラクトの関数としての細胞生存能力の棒グラフの別の例を図示する。生存能力は、陰性対照と比較した生存細胞の割合として測定することができる。これらのDNAコンストラクトはノックアウトに使用することができ、(i)二重陰性対照(NTC)配列、(ii)必須遺伝子のノックアウト用の陽性対照としてのポリメラーゼ(POL2)配列、(iii)ノックアウト用のMTAP配列、(iv)ノックアウト用のPRMT5配列、(v)ノックアウト用のMTAP及びPRMT5配列、これは陽性合成致死性対照として働き得る、(vi)ノックアウト用のPPP2R2A配列、(vii)ノックアウト用のPKMYT1配列、及び(viii)二重ノックアウト用のPPP2R2A及びPKMYT1配列を含み得る。
[00119] 処理下の細胞の生存能力は、陰性対照(例えば、未処理細胞、又はスクランブルgRNAを含むか、若しくはPKMYT1及びPPP2R2Aの正常なコピーを含むDNAコンストラクトで処理した細胞)で正規化することができる。図8Aと同様に、図8Bの陰性対照細胞群(NTC)は、試験した群の中で最も高い生存能力を有する。ポリメラーゼをノックアウトするためのDNAコンストラクトによって細胞が処理される陽性対照(POLR2D)は、予想どおり、正規化後の生存能力の劇的な低下を引き起こす。MTAP及びPRMT5をノックアウトするためのDNAコンストラクトによって細胞が処理される陽性対照(MTAP-PRMT5)もまた、陰性対照群と比較して生存能力の低下を引き起こし、MTAP又はPRMT5単独の単一遺伝子ノックアウトと同様である。PPP2R2A又はPKMYT1のいずれかの、単一遺伝子ノックアウトで処理される細胞もまた、陰性対照群と比較して生存能力の減少を示す。PPP2R2A及びPKMYT1のノックアウトは、PPP2R2Aの単一ノックアウト又はPKMYT1の単一ノックアウトと比べて有意に低い生存能力を引き起こす。エラーバーは標準偏差を表す、n=2。
[00120] 図9は、コロニー形成アッセイ(例えば-クローン原性(clonogeneic)アッセイ)における導入されたDNAコンストラクトの関数としての細胞生存能力の棒グラフの別の例を図示する。生存能力は、陰性対照と比較した生存細胞の割合として測定することができる。これらのDNAコンストラクトはノックアウトに使用することができ、(i)陰性対照(NTC)配列、(ii)ノックアウト用の第1のsgRNA PPP2R2A配列、(iii)ノックアウト用の第2のsgRNA PPP2R2A配列、(iv)ノックアウト用の第1のsgRNA PKMYT1配列、(v)ノックアウト用の第2のsgRNA PKMYT1配列、(vi)二重ノックアウト用の第1のsgRNA PPP2R2A配列及び第1のsgRNA PKMYT1配列、(vii)二重ノックアウト用の第1のsgRNA PPP2R2A配列及び第2のsgRNA PKMYT1配列、(viii)二重ノックアウト用の第2のsgRNA PPP2R2A配列及び第1のsgRNA PKMYT1配列、及び(ix)二重ノックアウト用の第2のsgRNA PPP2R2A配列及び第2のsgRNA PKMYT1配列を含み得る。
[00121] 処理下の細胞の生存能力は、陰性対照(例えば、未処理細胞、又はスクランブルgRNAを含むか、若しくはPKMYT1及びPPP2R2Aの正常なコピーを含むDNAコンストラクトで処理した細胞)で正規化することができる。図8A~図8Bと同様に、図9の陰性対照細胞群(NTC)は、試験した群の中で最も高い生存能力を有する。PPP2R2A又はPKMYT1のいずれかの、単一遺伝子ノックアウトで処理される細胞は、陰性対照群と比較して生存能力の減少を示す。PPP2R2A及びPKMYT1のノックアウトは、PPP2R2Aの単一ノックアウト又はPKMYT1の単一ノックアウトと比べて有意に低い生存能力を引き起こす。
[00122] Huh1は、PPP2R2Aのホモ接合性欠失を有する。PKMYT1欠失は、PPP2R2A CRISPR KOとは無関係に、致死性であるものと思われる。予想どおり、PKMYT1ノックアウト単独は、PPP2R2A遺伝子座の内因性欠失を有するHuh1細胞において強力な細胞死滅を示す(図10)。結腸直腸癌細胞株HCT116を含めた4つの異なる細胞株について、PPP2R2A-PKMYT1の合成致死性相互作用の強度を表1に要約する。
[00123] 表2に示されるとおりHuh1ではPPP2R2Aの低い残留発現(residual expression)がある。Huh1においてPKMYT1及びPPP2R2Aの両方をCRISPRノックアウトすると、この細胞株でのPPP2R2Aの残留発現(residual expression)が消失し、細胞生存能力の更なる減少が生じる。
[00124] 表3に示されるとおりHuh1ではPKMYT1の高発現がある。Huh1においてPKMYT1及びPPP2R2Aの両方をCRISPRノックアウトすると、この細胞株でのPKMYT1の発現が消失し、細胞生存能力の更なる減少が生じる。
[00125] DNA修復に関わる一連の選び出された遺伝子が、PPP2R2AとPKMYT1の合成致死性を説明する可能性のある経路としてシステム生物学分析により同定された。相同組換え修復機構(HDR)によるDNA修復に関わることが公知の一連の選び出された22個の異なる遺伝子をスクリーニングして、PKMYT1とのその相互作用を決定した。このスクリーニングの結果は表4及び図11に要約する。これらのスクリーニングから、PPP2R2AのみがPKMYT1との高い相乗作用(excess over Bliss「EOB」)及び強力な細胞死滅(生存割合、FV)を有することが示された。PPP2R2AとPKMYT1との間のこの唯一強力な相互作用は、文献に報告されたことがなかったものであり、予期しない観察結果であった。
[00126] 小分子阻害薬によるPKMYT1の阻害は、CRISPRの媒介によるPKMYT1のノックアウトに関する知見を再現し得る。CRISPRノックアウトを用いてPPP2R2A発現を減少させた後、続いて細胞に小分子薬物を適用する(表5、図12)。PPP2R2Aがノックアウトされない対照細胞もまた使用される。細胞株においてPPP2R2Aがノックアウトされると、PKMYT1阻害薬が効力の増加を示すことが観察される。
[00127] まとめると、これらの結果は、PPP2R2A及びPKMYT1が合成致死性対であり得ることを裏付けている。そのような場合、PKMYT1の活性レベル又は発現の低下を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量でPPP2R2A欠損細胞を治療することは、実行可能な治療選択肢であり得る。
[00128] 本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、当業者には、かかる実施形態が単に例として提供されるに過ぎないことは明らかであろう。本発明が、本明細書内に提供される具体的な例によって限定されることは意図されない。本発明は前述の明細書を参照して説明されているが、本明細書における実施形態の説明及び例示は、限定的な意味で解釈されるべきであることを意図するものではない。当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形例、変更例、及び置換例が想起されるであろう。更に、本発明の態様はいずれも、本明細書に示される具体的な描写、構成又は相対的比率に限定されず、それらは種々の条件及び変数に依存すると理解されるものとする。本発明の実施においては、本明細書に記載される発明の実施形態の様々な代替例を用い得ることは理解されるであろう。従って、本発明はまた、任意のかかる代替例、改良例、変形例又は均等物も包含するものとすることが企図される。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、並びに特許請求の範囲内にある方法及び構造並びにその均等物がそれに包含されることが意図される。
Claims (58)
- 癌を有する又は有する疑いがある対象の治療方法であって、前記対象におけるプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1)の発現又は活性の差異を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を前記対象に投与することを含み、それによって前記対象を前記癌に関して治療する方法において、前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連しているか、又は前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している、方法。
- 前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連している、請求項1に記載の方法。
- 前記発現又は活性レベルの差異が、発現又は活性レベルの低下である、請求項2に記載の方法。
- 前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している、請求項1に記載の方法。
- 前記突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在が、前記対象から入手された組織に由来する細胞のアッセイによって同定される、請求項4に記載の方法。
- 前記アッセイが、次世代シーケンシングベースのアッセイである、請求項5に記載の方法。
- 前記1つ以上の治療用薬剤が、小分子、タンパク質、イントラボディ、ペプチド、リボ核酸(RNA)分子、並びに、エンドヌクレアーゼ複合体及びデオキシリボ核酸(DNA)コンストラクトからなる群から選択される1つ以上のメンバーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAコンストラクトがエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼ遺伝子が、CRISPR関連(Cas)タンパク質をコードする、請求項8に記載の方法。
- 前記Casが、Cas9である、請求項9に記載の方法。
- 前記DNAコンストラクトが、PKMYT1遺伝子を標的とするガイドRNAを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼ複合体がエンドヌクレアーゼを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、CRISPR関連(Cas)タンパク質である、請求項12に記載の方法。
- 前記小分子がPKMYT1阻害薬を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記PKMYT1阻害薬が、5-((5-メトキシ-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリミジン-4-イル)アミノ)-2-メチルフェノール、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド(ダサチニブ)、4-((2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)アミノ)-6-メトキシ-7-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロポキシ)キノリン-3-カルボニトリル(ボスチニブ)、N-(5-クロロベンゾ[d][1,3]ジオキソール-4-イル)-7-(2-(4-メチルピペラジン-1-イル)エトキシ)-5-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)オキシ)キナゾリン-4-アミン(サラカチニブ)、(E)-N-(4-((3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ)-3-シアノ-7-エトキシキノリン-6-イル)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エンアミド(ペリチニブ)、N-(3-クロロフェニル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-4-アミン(チルホスチンAG 1478)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173952)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((3-(メチルチオ)フェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173955)、又は6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-フルオロ-3-メチルフェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-180970)を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記小分子がWEE1阻害薬を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記WEE1阻害薬が、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、2-アリル-1-(6-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)ピリジン-2-イル)-6-((4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)アミノ)-1,2-ジヒドロ-3H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-オン(MK-1775)、9-ヒドロキシ-4-フェニルピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン(PD-407824)、6-ブチル-4-(2-クロロフェニル)-9-ヒドロキシピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン、又は6-(2-クロロ-6-フルオロフェニル)-2-((2,4,4-トリメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-7-イル)アミノ)イミダゾ[1,2-a]ピリミド[5,4-e]ピリミジン-5(6H)-オンを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記PP2Aサブユニットが、65kDa調節サブユニットAα(PPP2R1A)、65kDa調節サブユニットAβ(PPP2R1B)、55kDa調節サブユニットBα(PPP2R2A)、55kDa調節サブユニットBβ(PPP2R2B)、55kDa調節サブユニットBγ(PPP2R2C)、55kDa調節サブユニットBδ(PPP2R2D)、72/130kDa調節サブユニットB(PPP2R3A)、48kDa調節サブユニットB(PPP2R3B)、調節サブユニットB”サブユニットγ(PPP2R3C)、調節サブユニットB’(PPP2R4)、56kDa調節サブユニットα(PPP2R5A)、56kDa調節サブユニットβ(PPP2R5B)、56kDa調節サブユニットγ(PPP2R5C)、56kDa調節サブユニットδ(PPP2R5D)、56kDa調節サブユニットε(PPP2R5E)、触媒サブユニットα(PPP2CA)、及び触媒サブユニットβ(PPP2CB)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記PP2Aサブユニットが、PPP2R2Aである、請求項18に記載の方法。
- PPP2R2Aの発現又は活性の低下を生じさせる1つ以上の治療用薬剤の治療有効量を前記対象に投与することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記健常対照が、前記癌を呈しない1個体以上の対象からのものである、請求項1に記載の方法。
- 前記癌性組織が、***組織、膵臓組織、子宮組織、膀胱組織、結腸直腸組織、前立腺組織、肝組織、又は卵巣組織である、請求項1に記載の方法。
- 前記癌性組織が、肝組織である、請求項22に記載の方法。
- 前記癌性組織が、卵巣組織である、請求項22に記載の方法。
- 少なくとも1つの治療用薬剤を含む製剤を含む、癌を有する又は有する疑いがある対象を治療するための組成物であって、前記少なくとも1つの治療用薬剤が、前記対象への投与後にプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1)の発現又は活性の差異を生じさせるのに有効な量で存在し、及び前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連しているか、又は前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している、組成物。
- 前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連している、請求項25に記載の組成物。
- 前記発現又は活性レベルの差異が、発現又は活性レベルの低下である、請求項26に記載の組成物。
- 前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している、請求項25に記載の組成物。
- 前記突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在が、前記対象から入手された組織に由来する細胞のアッセイによって同定される、請求項28に記載の組成物。
- 前記アッセイが、次世代シーケンシングベースのアッセイである、請求項29に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの治療用薬剤が、小分子、タンパク質、イントラボディ、ペプチド、リボ核酸(RNA)分子、並びに、エンドヌクレアーゼ複合体及びデオキシリボ核酸(DNA)コンストラクトからなる群から選択される1つ以上のメンバーを含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記DNAコンストラクトがエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む、請求項31に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼ遺伝子が、CRISPR関連(Cas)タンパク質をコードする、請求項32に記載の組成物。
- 前記Casが、Cas9である、請求項33に記載の組成物。
- 前記DNAコンストラクトが、PKMYT1遺伝子に向けられるガイドRNAを含む、請求項31に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼ複合体がエンドヌクレアーゼを含む、請求項31に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼが、CRISPR関連(Cas)タンパク質である、請求項36に記載の組成物。
- 前記小分子がPKMYT1阻害薬を含む、請求項31に記載の組成物。
- 前記PKMYT1阻害薬が、5-((5-メトキシ-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリミジン-4-イル)アミノ)-2-メチルフェノール、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)チアゾール-5-カルボキサミド(ダサチニブ)、4-((2,4-ジクロロ-5-メトキシフェニル)アミノ)-6-メトキシ-7-(3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロポキシ)キノリン-3-カルボニトリル(ボスチニブ)、N-(5-クロロベンゾ[d][1,3]ジオキソール-4-イル)-7-(2-(4-メチルピペラジン-1-イル)エトキシ)-5-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)オキシ)キナゾリン-4-アミン(サラカチニブ)、(E)-N-(4-((3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ)-3-シアノ-7-エトキシキノリン-6-イル)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エンアミド(ペリチニブ)、N-(3-クロロフェニル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-4-アミン(チルホスチンAG 1478)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((4-モルホリノフェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173952)、6-(2,6-ジクロロフェニル)-8-メチル-2-((3-(メチルチオ)フェニル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-173955)、又は6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-フルオロ-3-メチルフェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-180970)を含む、請求項38に記載の組成物。
- 前記小分子がWEE1阻害薬を含む、請求項31に記載の組成物。
- 前記WEE1阻害薬が、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-((4-(2-(ジエチルアミノ)エトキシ)フェニル)アミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン(PD-0166285)、2-アリル-1-(6-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)ピリジン-2-イル)-6-((4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)アミノ)-1,2-ジヒドロ-3H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-オン(MK-1775)、9-ヒドロキシ-4-フェニルピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン(PD-407824)、6-ブチル-4-(2-クロロフェニル)-9-ヒドロキシピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H,6H)-ジオン、又は6-(2-クロロ-6-フルオロフェニル)-2-((2,4,4-トリメチル-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-7-イル)アミノ)イミダゾ[1,2-a]ピリミド[5,4-e]ピリミジン-5(6H)-オンを含む、請求項40に記載の組成物。
- 前記PP2Aサブユニットが、65kDa調節サブユニットAα(PPP2R1A)、65kDa調節サブユニットAβ(PPP2R1B)、55kDa調節サブユニットBα(PPP2R2A)、55kDa調節サブユニットBβ(PPP2R2B)、55kDa調節サブユニットBγ(PPP2R2C)、55kDa調節サブユニットBδ(PPP2R2D)、72/130kDa調節サブユニットB(PPP2R3A)、48kDa調節サブユニットB(PPP2R3B)、調節サブユニットB”サブユニットγ(PPP2R3C)、調節サブユニットB’(PPP2R4)、56kDa調節サブユニットα(PPP2R5A)、56kDa調節サブユニットβ(PPP2R5B)、56kDa調節サブユニットγ(PPP2R5C)、56kDa調節サブユニットδ(PPP2R5D)、56kDa調節サブユニットε(PPP2R5E)、触媒サブユニットα(PPP2CA)、及び触媒サブユニットβ(PPP2CB)からなる群から選択される、請求項25に記載の組成物。
- 前記PP2Aサブユニットが、PPP2R2Aである、請求項42に記載の組成物。
- 前記組成物が、PPP2R2Aの発現又は活性の低下を生じさせるのに有効な量で存在する少なくとも1つの治療用薬剤を含む製剤を更に含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記健常対照が、前記癌を呈しない1個体以上の対象からのものである、請求項25に記載の組成物。
- 前記癌性組織が、***組織である、請求項25に記載の組成物。
- 前記癌性組織が、肝組織である、請求項25に記載の組成物。
- 前記癌性組織が、卵巣組織である、請求項25に記載の組成物。
- 前記製剤が賦形剤を更に含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記賦形剤が、前記賦形剤の存在なしに前記少なくとも1つの治療用薬剤が前記対象に投与されるのと比較したとき、前記対象への投与後に前記少なくとも1つの治療用薬剤を安定化させるか、又は前記少なくとも1つの治療用薬剤の治療増強を提供する、請求項49に記載の組成物。
- 癌を有する又は有する疑いがある対象を治療するためのキットであって、
少なくとも1つの治療用薬剤を含む製剤を含む組成物であって、前記少なくとも1つの治療用薬剤が、前記対象への投与後にプロテインキナーゼ、膜結合性チロシン/トレオニン1(PKMYT1)又はWEE1 G2チェックポイントキナーゼ(WEE1)の発現又は活性の差異を生じさせるのに有効な量で存在し、及び前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連しているか、又は前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している、組成物;及び
前記対象への前記組成物の投与に関する1つ以上の説明書
を含むキット。 - 前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)又はそのサブユニットの発現又は活性レベルの差異を有する細胞を含む癌性組織に関連している、請求項51に記載のキット。
- 前記発現又は活性レベルの差異が、発現又は活性レベルの低下である、請求項52に記載のキット。
- 前記癌が、健常対照と比較したときプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子の突然変異及び/又は欠失を示す細胞を含む癌性組織に関連している、請求項51に記載のキット。
- 前記突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在が、前記対象から入手された組織に由来する細胞のアッセイによって同定される、請求項54に記載のキット。
- 前記アッセイが、次世代シーケンシングベースのアッセイである、請求項55に記載のキット。
- 対象の疾患を同定するための方法であって、対象から入手された組織に由来する細胞をアッセイして、健常対照と比較したときのプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子における突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在を同定すること、及び健常対照と比較したときのプロテインホスファターゼ2(PP2A)のサブユニットをコードする遺伝子における突然変異及び/又は欠失の存在又は非存在を指示する報告を出力することを含む方法。
- 次世代シーケンシングベースのアッセイを含む、請求項57に記載の方法。
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