CN115769077A - 用于治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于治疗癌症的方法和组合物。方法可以包括使用治疗有效量的一种或多种治疗性药剂，以在蛋白磷酸酶2调节亚基Bα(PPP2R2A)缺陷型癌细胞中引起蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1)的表达或活性差异。

Description

用于治疗癌症的方法和组合物

交叉引用

本申请要求于2020年4月1日提交的美国临时申请第63/003,736号的权益，该申请通过引用并入本文。

背景技术

癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的治疗尽管有进展，但仍然相对困难。全身治疗(例如化疗)可能是毒性的，因此可能对患者具有副作用。此外，缺乏特异性生物标志物可能使靶向治疗的开发或使用复杂化。

治疗癌细胞的一种方法包括鉴定靶基因和生物标志物，该生物标志物鉴定哪些癌细胞可能对那些靶基因活性的改变敏感。

发明内容

如本文所认识到的，鉴定合成致死基因对(Synthetic lethal gene pairs)(其中抑制两个基因或在第二基因中存在突变或缺失的情况下抑制一个基因可以导致细胞死亡)可以在治疗上用于杀死癌细胞，同时维持非癌细胞的活力。

本文认识到需要用于靶向治疗的治疗性药剂以及用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的对象的疗法。与健康或非癌症对照相比，患有或疑似患有癌症的对象可以在癌症的一个或多个癌细胞中具有第一基因的突变、缺失、表达差异(例如，降低或增加)或活性水平差异(例如降低、增加或改变)。本文公开了用于通过在癌症或癌细胞中引起第二基因的表达或活性差异(例如，降低或增加)来治疗具有第一基因的这种表达差异(例如，降低或增加)或活性水平差异(例如降低、增加或改变)的癌症或癌症细胞或组织，从而治疗对象的方法和组合物。第一基因和第二基因可以形成合成致死对。第一基因可以编码(例如调节细胞周期的)调节蛋白，第二基因可以编码治疗上可修饰的蛋白质(例如激酶)。

在一方面，本文公开了一种用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的对象的方法，其包括向对象施用治疗有效量的一种或多种治疗性药剂，该治疗性药剂引起对象的蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1)或WEE1 G2检查点激酶(WEE1)的表达或活性差异(例如，降低或增加)，从而治疗对象的癌症，其中癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞，或者其中癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。

在一些实施方案中，癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞。

在一些实施方案中，癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。在一些实施方案中，通过测定来源于从对象获得的组织的细胞来鉴定突变和/或缺失的存在或不存在。在一些实施方案中，测定是基于下一代测序的测定。

在一些实施方案中，一种或多种治疗性药剂包括选自以下的一个或多个成员：小分子(例如，分子量小于900道尔顿的分子)、蛋白质、胞内抗体、肽、核糖核酸(RNA)分子，以及核酸内切酶复合物和脱氧核糖核酸(DNA)构建体。

在一些实施方案中，DNA构建体包含核酸内切酶基因。在一些实施方案中，核酸内切酶基因编码CRISPR相关(Cas)蛋白。在一些实施方案中，Cas是Cas9。

在一些实施方案中，DNA构建体包含靶向PKMYT1基因的指导RNA。

在一些实施方案中，核酸内切酶复合物包含核酸内切酶。在一些实施方案中，核酸内切酶是CRISPR相关(Cas)蛋白。

在一些实施方案中，小分子包括PKMYT1抑制剂。在一些实施方案中，PKMYT1抑制剂包括5-((5-甲氧基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基苯酚、N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼)、4-((2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-3-甲腈(博舒替尼)、N-(5-氯苯并[d][1,3]二氧戊环-4-基)-7-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)-5-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)喹唑啉-4-胺(塞卡替尼)、(E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺(培利替尼)、N-(3-氯苯基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-胺(酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1478)、6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173952)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((3-(甲硫基)苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173955)或6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-氟-3-甲基苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-180970)。

在一些实施方案中，小分子包括WEE1抑制剂。在一些实施方案中，WEE1抑制剂包括6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(MK-1775)、9-羟基-4-苯基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮(PD-407824)、6-丁基-4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮或6-(2-氯-6-氟苯基)-2-((2,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)咪唑并[1,2-a]嘧啶并[5,4-e]嘧啶-5(6H)-酮。

在一些实施方案中，PP2A亚基选自65kDa调节亚基Aα(PPP2R1A)、65kDa调节亚基Aβ(PPP2R1B)、55kDa调节亚基Bα(PPP2R2A)、55kDa调节亚基Bβ(PPP2R2B)、55kDa调节亚基Bγ(PPP2R2C)、55kDa调节亚基Bδ(PPP2R2D)、72/130kDa调节亚基B(PPP2R3A)、48kDa调节亚基B(PPP2R3B)、调节亚基B”亚基γ(PPP2R3C)、调节亚基B’(PPP2R4)、56kDa调节亚基α(PPP2R5A)、56kDa调节亚基β(PPP2R5B)、56kDa调节亚基γ(PPP2R5C)、56kDa调节亚基δ(PPP2R5D)、56kDa调节亚基ε(PPP2R5E)、催化亚基α(PPP2CA)和催化亚基β(PPP2CB)。在一些实施方案中，PP2A亚基是PPP2R2A。

在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括向对象施用治疗有效量的一种或多种治疗性药剂，该治疗性药剂引起PPP2R2A的表达或活性差异(例如，降低)。

在一些实施方案中，健康对照来自未表现出癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的一个或多个对象。

在一些实施方案中，癌性组织是乳腺组织、胰腺组织、子宫组织、膀胱组织、结肠直肠组织、***组织、肝组织或卵巢组织。在一些实施方案中，癌性组织是肝组织。在一些实施方案中，癌性组织是卵巢组织。

在另一方面，本文公开了一种用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的对象的组合物，其包含含有至少一种治疗性药剂的制剂，其中至少一种治疗性药剂以在向对象施用后有效引起蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1)或WEE1 G2检查点激酶(WEE1)的表达或活性差异(例如，降低或增加)的量存在，并且其中癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞，或者其中癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。

在一些实施方案中，癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞。

在一些实施方案中，癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。在一些实施方案中，通过测定来源于从对象获得的组织的细胞来鉴定突变和/或缺失的存在或不存在。在一些实施方案中，测定是基于下一代测序的测定。

在一些实施方案中，至少一种治疗性药剂包括选自以下的一个或多个成员：小分子(例如，分子量小于900道尔顿的分子)、蛋白质、胞内抗体、肽、核糖核酸(RNA)分子，以及核酸内切酶复合物和脱氧核糖核酸(DNA)构建体。

在一些实施方案中，DNA构建体包含核酸内切酶基因。在一些实施方案中，核酸内切酶基因编码CRISPR相关(Cas)蛋白。在一些实施方案中，Cas是Cas9。

在一些实施方案中，DNA构建体包含针对PKMYT1基因的指导RNA。

在一些实施方案中，核酸内切酶复合物包含核酸内切酶。在一些实施方案中，核酸内切酶是CRISPR相关(Cas)蛋白。

在一些实施方案中，小分子包括PKMYT1抑制剂。在一些实施方案中，PKMYT1抑制剂包括5-((5-甲氧基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基苯酚、N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼)、4-((2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-3-甲腈(博舒替尼)、N-(5-氯苯并[d][1,3]二氧戊环-4-基)-7-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)-5-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)喹唑啉-4-胺(塞卡替尼)、(E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺(培利替尼)、N-(3-氯苯基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-胺(酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1478)、6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173952)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((3-(甲硫基)苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173955)或6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-氟-3-甲基苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-180970)。

在一些实施方案中，小分子包括WEE1抑制剂。在一些实施方案中，WEE1抑制剂包括6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(MK-1775)、9-羟基-4-苯基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮(PD-407824)、6-丁基-4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮或6-(2-氯-6-氟苯基)-2-((2,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)咪唑并[1,2-a]嘧啶并[5,4-e]嘧啶-5(6H)-酮。

在一些实施方案中，PP2A亚基选自65kDa调节亚基Aα(PPP2R1A)、65kDa调节亚基Aβ(PPP2R1B)、55kDa调节亚基Bα(PPP2R2A)、55kDa调节亚基Bβ(PPP2R2B)、55kDa调节亚基Bγ(PPP2R2C)、55kDa调节亚基Bδ(PPP2R2D)、72/130kDa调节亚基B(PPP2R3A)、48kDa调节亚基B(PPP2R3B)、调节亚基B”亚基γ(PPP2R3C)、调节亚基B’(PPP2R4)、56kDa调节亚基α(PPP2R5A)、56kDa调节亚基β(PPP2R5B)、56kDa调节亚基γ(PPP2R5C)、56kDa调节亚基δ(PPP2R5D)、56kDa调节亚基ε(PPP2R5E)、催化亚基α(PPP2CA)和催化亚基β(PPP2CB)。在一些实施方案中，PP2A亚基是PPP2R2A。

在一些实施方案中，组合物进一步包含含有至少一种治疗性药剂的制剂，该治疗性药剂以有效引起PPP2R2A的表达或活性差异(例如，降低或增加)的量存在。

在一些实施方案中，健康对照来自未表现出癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的一个或多个对象。

在一些实施方案中，癌性组织是乳腺组织。在一些实施方案中，癌性组织是肝组织。在一些实施方案中，癌性组织是卵巢组织。

在一些实施方案中，制剂进一步包含赋形剂。在一些实施方案中，与在不存在赋形剂的情况下向对象施用至少一种治疗性药剂相比，赋形剂在向对象施用后使至少一种治疗性药剂稳定或提供至少一种治疗性药剂的治疗性增强。

在另一方面，本文公开了一种用于治疗患有或疑似患有癌症的对象的试剂盒，其包含：

组合物，其包含含有至少一种治疗性药剂的制剂，其中至少一种治疗性药剂以在向对象施用后有效引起蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1)或WEE1 G2检查点激酶(WEE1)的表达或活性差异的量存在，并且其中癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞，或者其中癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞；以及

一份或多份说明书，用于向对象施用组合物。在一些实施方案中，表达或活性水平差异是表达或活性水平降低。

在一些实施方案中，癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞。在一些实施方案中，表达或活性水平差异是表达或活性水平降低。

在一些实施方案中，癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。在一些实施方案中，通过测定来源于从对象获得的组织的细胞来鉴定突变和/或缺失的存在或不存在。在一些实施方案中，测定是基于下一代测序的测定。

在另一方面，本文公开了一种用于鉴定对象的疾病的方法，其包括测定来源于从对象获得的组织的细胞，以鉴定与健康对照相比在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中存在或不存在突变和/或缺失，以及输出指示与健康对照相比在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中存在或不存在突变和/或缺失的报告。在一些实施方案中，该方法包括基于下一代测序的测定。

从以下详细描述中，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅示出和描述了本发明的说明性实施方案。如将认识到的，本发明能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些均不脱离本发明。因此，附图和说明书本质上将被认为是说明性的，而不是限制性的。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地表明通过引用并入。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾材料。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别阐述。通过参照以下阐述说明性实施方案(其中利用了本发明原理)的详细描述和附图(本文也称为“图”)，将更好地理解本发明的特征和优点，在附图中：

图1A-B示意性地示出了蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1、MYT1)、Wee1和蛋白磷酸酶2 55kDa调节亚基Bα(PPP2R2A)的信号转导途径。

图2示出了不同癌症类型中PPP2R2A失活或缺陷的频率图。

图3示意性地示出了用于确定用核酸分子治疗培养的癌细胞群体的效果的示例工作流程。

图4示意性地示出了用于确定使用能够在特定基因中诱导突变的单指导RNA来治疗培养的基因缺陷型癌细胞的效果的另一示例工作流程。

图5示出了在各种癌症类型中，PKMYT1在癌症中的表达水平相对于正常细胞的图。

图6示出了与正常细胞相比，PKMYT1在癌(肿瘤)细胞中的表达水平的散点图。

图7A-B示出了PKMYT1在具有失活PPP2R2A或具有野生型PPP2R2A的细胞的两个不同数据库(Achilles、Demeter)中的必需性(essentiality)的散点图。

图8A-B示出了在来自两种癌症类型的细胞中敲除PKMYT1和PPP2R2A的基于CRISPR的方法的示例数据。

图9示出了PKMYT1和PPP2R2A双重敲除的HEP3B集落形成数据。

图10示出了具有PPP2R2A基因座内源性缺失的Huh1细胞中PKMYT1敲除的结果。

图11示出了筛选21种不同基因以确定与PKMYT1的合成致死性的结果。

图12示出了在PPP2R2A敲除的等基因细胞系中用小分子抑制剂抑制PKMYT1的结果。

具体实施方式

尽管本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一连串两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该一连串数值中的数值中的每一个。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1、大于或等于2，或者大于或等于3。

每当术语“不多于”、“小于”或“小于或等于”在一连串两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“不多于”、“小于”或“小于或等于”适用于该一连串数值中的数值中的每一个。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3、小于或等于2，或者小于或等于1。

如本文所用，术语“对象”通常是指动物，例如哺乳动物(例如，人)、爬行动物或禽类(例如，鸟)，或其他生物体，例如植物。例如，对象可以是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如，小鼠)、灵长类动物、猿或人。对象可以是健康个体、就疾病(例如，肝癌或卵巢癌)而言无症状的个体、患有或疑似患有疾病(例如，肝癌或卵巢癌)或疾病倾向的个体，或者就疾病而言有症状的个体。对象可能需要治疗。对象可以是正经受健康护理提供者(例如治疗医生)监测或治疗的患者。

如本文所用，术语“基因组”通常是指来自对象的基因组信息，其可以是例如对象的遗传信息的至少一部分或全部。基因组可以以脱氧核糖核酸(DNA)分子编码，并且可能以核糖核酸(RNA)分子表达。基因组可以包含(例如，编码蛋白质的)编码区以及非编码区。基因组可以包括生物体中在一起的所有染色体的序列。例如，人类基因组通常总共具有46条染色体。所有这些序列一起可以构成人类基因组。

每当本文提及基因时，应理解，单个基因可以用不同的名称提及。例如，“蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1”和“膜相关酪氨酸和苏氨酸特异性cdc2-抑制激酶”都是指相同的基因PKMYT1。作为另一实例，“蛋白磷酸酶2调节亚基Bα”和“丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶2A55kDa调节亚基Bα同种型”都是指相同的基因PPP2R2A。

用于治疗癌症的方法

在一方面，本文提供了用于治疗癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的方法和组合物。用于治疗患有或疑似患有癌症的对象的方法可以包括向对象施用治疗有效量的一种或多种治疗性药剂，该治疗性药剂引起一种或多种基因的表达或活性差异(例如，降低或增加)，从而治疗对象的癌症。癌症可以包含具有第一基因的表达差异(例如，降低或增加)或活性水平差异(例如，降低、增加或改变)的细胞，并且施用或暴露于引起第二基因的表达或活性差异(例如，降低或增加)的一种或多种治疗性药剂可以导致细胞的抑制或死亡。在一些情况下，第一基因和第二基因形成合成致死基因对。在一些情况下，第一基因是蛋白磷酸酶255kDa调节亚基Bα(PPP2R2A)，第二基因编码激酶，例如，蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1)或WEE1 G2检查点激酶(WEE1)。

在一些情况下，第一基因编码在癌细胞中有缺陷(例如，低表达、突变、过表达)的生物标志物，第二基因包含待敲低或敲除的基因靶，从而降低第二基因的表达或活性水平。在一些情况下，第一基因在癌细胞中具有表达差异(例如，降低或增加)或活性水平差异(例如，降低、增加或改变)，并且施用或暴露于治疗有效量的引起第二基因在癌症或癌细胞中的表达或活性差异(例如，降低或增加)的一种或多种治疗性药剂导致细胞的抑制或死亡。在一些情况下，第一基因编码调节细胞周期的蛋白质，例如，PPP2R2A，第二基因编码激酶，例如，PKMYT1。

在一些情况下，与健康对照相比，第一基因显示突变和/或缺失。可以通过测定从对象获得的组织来源的细胞来鉴定这种突变的存在或不存在。合适的测定可以包括涉及基因组DNA、mRNA或cDNA的那些。作为实例，对于基于核酸的检测方法，首先(使用任何标准技术)从待测试对象的细胞(例如，卵巢细胞)中获得基因组DNA。如果合适，可以制备cDNA或可以获得mRNA。在一些情况下，可以通过任何已知的核酸扩增技术(例如，聚合酶链反应)扩增核酸至足够的量和纯度，并进一步分析以检测突变。例如，可以从样品中分离基因组DNA，并且可以将所有外显子序列和内含子/外显子接合区(包括外显子/内含子剪接所需的区域)扩增为一个或多个扩增子，并进一步分析存在或不存在突变。在一些情况下，测定是基于下一代测序的测定，例如

CDx^TM或Tempus xT^TM。

第一基因(例如，PPP2R2A)和第二基因(例如，PKMYT1)可以形成合成致死对，使得第一基因和第二基因两者中抑制或降低的表达或活性水平对于细胞是致死的(例如，导致细胞凋亡、坏死、增殖的抑制等)，但单独的第一基因或单独的第二基因抑制或降低的活性不足以杀死细胞。在一些情况下，单独的第一基因(例如，PPP2R2A)或第二基因(例如，PKMYT1)抑制或降低的表达或活性导致细胞或细胞群体的活力降低，但这两个基因降低的表达或活性(例如，PPP2R2A和PKMYT1的敲低或敲除)导致细胞或细胞群体的活力降低更多。例如，与基因对每个成员降低的表达或活性导致的活力降低总和相比，PPP2R2A和PKMYT1表达或活性的降低可以协同起作用，活力降低更多。

在细胞(例如，癌性细胞)在第一基因(例如，PPP2R2A)中具有缺陷的情况下，第二基因(本文也称为“靶基因”，例如，PKMYT1)强制降低的表达或活性水平(例如，经由敲低或敲除)可能对于在第一基因中具有缺陷的细胞是致死的，但在第一基因中没有缺陷的细胞中是无毒的或非致死的。这种使用单一抑制剂(例如，治疗有效量的引起PKMYT1的表达或活性降低的治疗性药剂)治疗患有癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的对象的方法可以有益于降低对象正常细胞中的毒性，从而降低癌症治疗的毒性或副作用，其中该癌症与癌性组织相关，癌性组织包含在第一基因(例如，PPP2R2A)中具有缺陷的细胞。

在一些情况下，第一基因可以是或编码作为第二基因的上游激动剂或拮抗剂的蛋白质，或者第二基因可以是或编码作为第一基因的上游激动剂或拮抗剂的蛋白质。作为实例，第一基因可以是PPP2R2A，第二基因可以是PKMYT1。当在正常(例如，非突变)细胞中表达时，PPP2R2A可以用作PKMYT1的间接正调节剂，该PKMYT1是激酶，是作为蛋白质信号级联放大或信号转导途径内各种蛋白质的上游调节剂(参见，图1A-B)。例如，PKMYT1可以与CDK1相互作用或调节CDK1，从而影响细胞周期进程。在正常或非癌性细胞中，PPP2R2A的表达可以正向调节PKMYT1，因此间接抑制CDK1并防止不受控制的细胞周期进程。还已知PPP2R2A表达促进DNA修复(Cancer Res.2012 Dec 15；72(24):6414-24.)。因此，在PPP2R2A缺陷型细胞(例如，具有突变的PPP2R2A的细胞)中，受损DNA可能未进行修复，并且PKMYT1可能不被抑制，从而导致下游蛋白CDK1的表达增加。因此，PPP2R2A缺陷型细胞中的PKMYT1抑制可以导致具有受损DNA的细胞的不受控制的细胞周期进程，并因此诱导细胞死亡。

尽管PPP2R2A和PKMYT1作为实例示出，但其他基因相互作用也可以是可能的。在一个这种实例中，第一基因可以是调节第二基因的另一基因(或编码的蛋白质)的激动剂或拮抗剂，或者第二基因可以是调节第一基因的另一基因或编码的蛋白质的激动剂或拮抗剂。相似地，第一基因可以是另一基因(或编码的蛋白质)的激动剂或拮抗剂，该另一基因调节可以调节第二基因的又一基因(或编码的蛋白质)，或者第二基因可以是另一基因(或编码的蛋白质)的激动剂或拮抗剂，该另一基因调节可以调节第一基因的又一基因(或编码的蛋白质)。在一些情况下，第一或第二基因可以分别调节另一基因或蛋白质，该另一基因或蛋白质是第二或第一基因上游的至少1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个组分(例如，节点或其他基因、蛋白质或信号转导子)。

在一些情况下，第一基因和第二基因可以调节下游相同基因的子集。例如，第一基因可以调节多个下游基因，其子集也由第二基因调节。在癌细胞中，下游基因可以包括在癌症相关过程(例如，HIPPO途径、上皮细胞向间充质细胞转化、P13K途径、DNA复制、细胞迁移、细胞转移等)中重要的基因。可替代地或另外，第一基因和第二基因可以由相同基因的子集调节。

在一些情况下，第一基因或第二基因也可以是癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的生物标志物。例如，第一基因可以是PPP2R2A。在一些情况下，在癌细胞中，当与对照细胞或细胞群体相比时，PPP2R2A可能在癌细胞中低表达、突变或以其他方式缺陷。例如，图2示出了不同癌症类型(X轴)中PPP2R2A失活或缺陷的频率(Y轴)图。在某些类型的癌症(例如，***腺癌)中，PPP2R2A的突变频率可以高达约15％。在某些其他癌症类型(例如，卵巢浆液性囊腺癌、直肠腺癌)中，PPP2R2A的突变频率可以大于10％。在各种癌症类型中，导致失活的PPP2R2A的缺陷可以包括：PPP2R2A基因中的相同基因的多个拷贝、超甲基化、深度缺失或突变。在包含PPP2R2A突变的癌症中，施用或暴露于治疗有效量的引起PKMYT1的表达或活性降低的一种或多种治疗性药剂可以导致PPP2R2A突变细胞的合成致死性。

在一些情况下，用于引起第二基因(例如，PKMYT1)的表达或活性差异(例如，降低或增加)的一种或多种治疗性药剂可以包括小分子(例如，分子量小于900道尔顿的分子)、蛋白质、胞内抗体、肽、核糖核酸(RNA)分子、脱氧核糖核酸(DNA)构建体或其组合(例如，蛋白质-核酸复合物)。在实例中，一种或多种治疗性药剂可以包括蛋白质-核酸复合物，例如，核酸内切酶复合物和DNA构建体。在一些情况下，核酸内切酶复合物包含规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白或其变体(例如，工程化变体)。在这种情况下，DNA构建体可以与核酸内切酶复合物共同施用。可替代地或另外，DNA构建体可以包含核酸内切酶基因。在这种情况下，DNA构建体可以包含编码Cas蛋白或其变体(例如，工程化变体)的基因。在将DNA构建体引入或递送至细胞(例如，癌细胞)后，可以使用细胞自身机制(例如，聚合酶、核糖体等)由细胞转录和翻译DNA构建体。

在一些情况下，用于引起靶基因(例如，PKMYT1)的表达或活性差异(例如，降低或增加)的一种或多种治疗性药剂包括小分子抑制剂(例如，分子量小于900道尔顿的分子)。小分子可以配置为降低单独的靶基因的表达水平或活性水平，或者小分子可以配置为降低与缺陷型或突变基因(例如，癌细胞中的PPP2R2A)组合的靶基因的表达水平或活性水平。在一些情况下，小分子可以直接与第一基因和第二基因两者相互作用。例如，小分子可以分别抑制由第一基因和第二基因中的一个或两个编码的蛋白质。可替代地或另外，小分子可以抑制信号转导途径中的上游效应物或下游蛋白质，该信号转导途径中基因中的一个或两个相互作用。

在一些情况下，小分子抑制剂可以包括PKMYT1抑制剂。PKMYT1抑制剂可以是例如5-((5-甲氧基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基苯酚、N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼)、4-((2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-3-甲腈(博舒替尼)、N-(5-氯苯并[d][1,3]二氧戊环-4-基)-7-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)-5-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)喹唑啉-4-胺(塞卡替尼)、(E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺(培利替尼)、N-(3-氯苯基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-胺(酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1478)、6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173952)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((3-(甲硫基)苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173955)或6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-氟-3-甲基苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-180970)。小分子抑制剂可以配置为直接或间接抑制或降低PKMYT1(基因)的表达或蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(来源于PKMYT1基因的蛋白质)的活性。例如，小分子抑制剂可以抑制蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1蛋白或者可能在信号转导途径中蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1的上游或下游的另一蛋白质，例如但不限于图1A-B中所示的那些。例如，小分子抑制剂可以抑制或以其他方式降低WEE1、CHK1、CDK1、CDK2、PPP2R2A、FOXM1、PLK1、EZH2等的表达或活性水平。

在一些情况下，小分子抑制剂可以包括WEE1抑制剂。WEE1抑制剂可以是例如6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(MK-1775)、9-羟基-4-苯基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮(PD-407824)、6-丁基-4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮或6-(2-氯-6-氟苯基)-2-((2,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)咪唑并[1,2-a]嘧啶并[5,4-e]嘧啶-5(6H)-酮。小分子抑制剂可以配置为直接或间接抑制或降低WEE1(基因)的表达或WEE1 G2检查点激酶(来源于WEE1基因的蛋白质)的活性。例如，小分子抑制剂可以抑制WEE1 G2检查点激酶蛋白或者可能在信号转导途径中WEE1 G2检查点激酶的上游或下游的另一蛋白质，例如但不限于图1A中所示的那些。例如，小分子抑制剂可以抑制或以其他方式降低CDK1、CDK2等的表达或活性水平。

在一些情况下，小分子抑制剂可以包括小分子抑制剂或其衍生物的组合。例如，小分子抑制剂可以被工程化或修饰为双重特异性，并且可以降低第一基因和第二基因(例如，PKMYT1和PPP2R2A)两者的表达或活性。可替代地或另外，小分子抑制剂的组合(例如，小分子“鸡尾酒”)可以用于降低单独的靶基因(例如，PKMYT1)或者第一基因和第二基因两者的表达或活性。在一些情况下，小分子抑制剂可以与另一种药剂类型(例如，蛋白质、RNA分子、DNA分子等)一起施用。

小分子抑制剂可以以任何有用的浓度施用。例如，小分子可以以约0.5纳摩尔(nM)、约1nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约200nM、约300nM、约400nM、约500nM、约600nM、约700nM、约800nM、约900nM、约1微摩尔(μM)、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM的浓度施用。小分子可以以至少约0.5纳摩尔(nM)、至少约1nM、至少约10nM、至少约20nM、至少约30nM、至少约40nM、至少约50nM、至少约60nM、至少约70nM、至少约80nM、至少约90nM、至少约100nM、至少约200nM、至少约300nM、至少约400nM、至少约500nM、至少约600nM、至少约700nM、至少约800nM、至少约900nM、至少约1微摩尔(μM)、至少约2μM、至少约3μM、至少约4μM、至少约5μM、至少约6μM、至少约7μM、至少约8μM、至少约9μM、至少约10μM的浓度施用。小分子可以以至多约10μM、至多约9μM、至多约8μM、至多约7μM、至多约6μM、至多约5μM、至多约4μM、至多约3μM、至多约2μM、至多约1μM、至多约900nM、至多约800nM、至多约700nM、至多约600nM、至多约500nM、至多约400nM、至多约300nM、至多约200nM、至多约100nM、至多约90nM、至多约80nM、至多约70nM、至多约60nM、至多约50nM、至多约40nM、至多约30nM、至多约20nM、至多约10nM、至多约1nM、至多约0.5nM等的浓度施用。可以使用的浓度范围例如在22nM-1μM之间。在使用多于一种小分子的情况下，所用的每种小分子的浓度可以相同或不同。

在一些情况下，小分子抑制剂可以配置为对PKMYT1的选择性比对相似基因(例如，WEE1等)高。小分子抑制剂对PKMYT1的选择性可以是相似基因的约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更多。小分子抑制剂对PKMYT1的选择性可以是相似基因的至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍或更多。

在包含第一基因(例如，PPP2R2A)缺陷的癌症中，用于引起靶基因(例如，PKMYT1)的表达或活性差异(例如，降低或增加)的一种或多种治疗性药剂可能需要较低的浓度或剂量以递送至对象获得治疗功效。例如，PPP2R2A和PKMYT1可以是合成致死的，并且向具有PPP2R2A缺陷的癌细胞的对象施用PKMYT1抑制剂可以是治疗有效的。在这个实例中，与没有PPP2R2A缺陷的细胞(例如，非癌细胞)相比，较低剂量的PKMYT1抑制剂可足以杀死PPP2R2A缺陷型癌细胞。由于对象中较高剂量或浓度的PKMYT1抑制可能增加毒性，因此在选定或预筛选的癌症类型(例如，包含PPP2R2A突变的癌症)中施用较低浓度或剂量的PKMYT1抑制剂可以有利于降低对对象的毒性和副作用。

在一些情况下，用于治疗患有癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的对象的方法进一步包括向对象施用治疗有效量的一种或多种治疗性药剂，该治疗性药剂引起PPP2R2A的表达或活性的差异(例如，降低或增加)。在一些情况下，用于治疗患有癌症的对象的方法进一步包括向对象施用治疗有效量的一种或多种治疗性药剂，该治疗性药剂引起CDK1的表达或活性降低。

在一些情况下，用于引起靶基因的表达或活性差异(例如，降低或增加)的一种或多种治疗性药剂包括DNA构建体。作为实例，靶基因可以是PKMYT1。DNA构建体可以包含指导RNA(gRNA)序列，其可以用于将蛋白质(例如，Cas蛋白)引导至靶基因(例如，PKMYT1)。DNA构建体可以包含gRNA序列，其可以将蛋白质(例如，Cas蛋白)引导至靶基因(例如，PKMYT1)。DNA构建体可以包含RNA序列、DNA序列或其组合。在一些情况下，DNA构建体包含：(i)第一gRNA序列，其可以用于将核酸内切酶(例如，Cas蛋白)引导至靶基因(例如，PKMYT1)的靶位置或基因座，以及(ii)对应于该基因(例如，PKMYT1的基因置换)的第一序列(例如，DNA序列)。应理解，RNA序列和DNA序列的不同组合可以用于DNA构建体。此外，DNA序列中可以包括其他功能性序列，包括但不限于条形码序列、标签或其他识别序列、引物序列、限制性酶切位点、转座位点等。

核酸内切酶复合物可以包含核酸内切酶(例如，Cas蛋白)或其他核酸相互作用酶(例如，连接酶、解旋酶、逆转录酶、转录酶、聚合酶等)。Cas蛋白可以包括任何Cas类型(例如，Cas I、Cas IA、Cas IB、Cas IC、Cas ID、Cas IE、Cas IF、Cas IU、Cas III、Cas IIIA、Cas IIIB、Cas IIIC、Cas IIID、Cas IV、Cas IVA、Cas IVB、Cas II、Cas IIA、Cas IIB、CasIIC、Cas V、Cas VI)。在一些情况下，Cas蛋白可以包括其他蛋白质(例如，融合蛋白)，并且可以包括可与核酸分子缔合的另外的酶(例如，连接酶、转录酶、转座酶、核酸酶、核酸内切酶、逆转录酶、聚合酶、解旋酶等)。核酸内切酶复合物可以外源递送或可以以DNA构建体编码，用于在细胞内转录和翻译。

在一些情况下，用于引起靶基因(例如，PKMYT1)中表达差异(例如，降低或增加)的一种或多种治疗性药剂可以包括蛋白质或肽。例如，一种或多种治疗性药剂可以包括抗体、抗体片段、激素、配体或免疫球蛋白。蛋白质或肽可以是天然存在的或可以是合成的。蛋白质可以是蛋白质的工程化变体(例如，重组蛋白质)或其片段。蛋白质可以进行其他修饰，例如，翻译后修饰，包括但不限于：糖基化、酰化、异戊烯化、脂化、烷基化、酰胺化、乙酰化、甲基化、甲酰化、丁酰化、羧化、磷酸化、丙二酰化、羟基化、碘化、丙酰化、S-亚硝基化、S-谷氨酰化、琥珀酰化、硫酸化、糖化、氨甲酰化、羰基化、生物素化、氨甲酰化、氧化、聚乙二醇化、SUMO化、泛素化(ubiquitination、ubiquitylation)、外消旋化等。可以对蛋白质或肽进行一种或多种修饰。

在一些情况下，用于引起靶基因(例如，PKMYT1)的表达或活性差异(例如，降低或增加)的一种或多种治疗性药剂可以包括核酸分子，例如，RNA分子。RNA分子可以包括任何合适的RNA分子和足以降低靶基因(例如，PKMYT1)的表达水平或活性的大小。RNA分子可以包括小发夹RNA(shRNA)分子、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或其他有用的RNA分子。在一些实例中，RNA分子可以包括信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、piwi-相互作用RNA(piRNA)、非编码RNA(ncRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)以及前述中任一种的片段。RNA分子可以是单链、双链或者部分单链或双链的。

应理解，一种或多种治疗性药剂(例如，肽、RNA分子、蛋白质-核酸复合物)作为实例列出，并且治疗性药剂类型的组合可以用于治疗对象。例如，施用一种或多种不同类型的治疗性药剂可以用于降低靶基因(例如，PKMYT1)的表达或活性。例如，蛋白质或肽可以与小分子(例如，分子量小于900道尔顿的分子)、RNA分子、DNA分子或复合分子(例如，蛋白质-核酸分子)共同施用。相似地，RNA分子可以与小分子、DNA分子或复合分子一起施用。在另一实例中，小分子可以与DNA分子或复合分子共同施用。这些组合中的任一种可以用于降低细胞中靶基因(PKMYT1)的表达或活性，该细胞在第一基因(例如，PPP2R2A)中包含突变。这些组合是可以用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的对象的药剂不同组合的非限制性实例。

例如，图3示意性地示出了用于确定用靶向两个不同基因的一对指导RNA治疗培养的癌细胞群体的效果的示例工作流程。在这种实例中，治疗可以包括施用核酸分子以降低第一基因(例如，PPP2R2A)和第二基因(例如，PKMYT1)的活性或表达。核酸分子可以包括DNA构建体，其可以包含第一gRNA序列(sgRNA-A)、第二gRNA序列(sgRNA-B)、第一DNA序列(BC-B)和第二DNA序列(BC-A)。第一DNA序列或第二DNA序列或者第一和第二DNA序列两者可以包含条形码序列。第一指导序列可以与第一基因(例如，PPP2R2A)具有序列同源性，因此可以靶向第一基因用于由蛋白质(例如，核酸内切酶，例如，Cas9)诱变，并且第二指导序列可以与第二基因(例如，PKMYT1)具有序列同源性，因此可以靶向第二基因用于由蛋白质(例如，核酸内切酶，例如，Cas9)诱变。可以用治疗有效量的DNA构建体和蛋白质(例如，Cas9)治疗细胞(例如，癌细胞)。在一些情况下，可以经由(例如，使用脂质体或其他纳米颗粒的)转染或(例如，使用病毒的)转导引入DNA构建体。可以使用纳米颗粒或其他囊泡，或者通过将蛋白质加入至细胞培养基中来施用蛋白质。蛋白质(例如，Cas9)可以使用sgRNA-A和sgRNA-B来将蛋白质引导至细胞基因组中的特定基因座或位置(例如，PPP2R2A和PKMYT1的基因座处)。接着，蛋白质可以切除和/或置换内源性基因(例如，PPP2R2A和PKMYT1)。如果置换内源性基因，则蛋白质(例如，Cas9)可以用第一DNA序列(BC-B)和第二DNA序列(BC-A)置换内源性基因。然后，可以培养细胞一段时间(例如，7天、14天、20天等)。可以对来自培养的细胞群体的DNA进行测序，以确定可能存在的指导RNA对中每一个的丰度。特定指导RNA对的丰度的显著降低可以表明基因敲低的组合对那些细胞的增殖能力具有有害影响。

在一些情况下，在细胞或细胞群体中仅可以敲除靶基因，该细胞包含与靶基因合成致死的缺陷型基因。图4示意性地示出了用于确定治疗基因(例如，PPP2R2A)缺陷型的经培养癌细胞群体的效果的示例工作流程。在这种实例中，治疗可以包括施用核酸分子以降低靶基因(例如，PKMYT1)的活性或表达。核酸分子可以包括DNA构建体，其可以包含gRNA序列(sgRNA-A)和DNA序列(BC-A)。DNA序列可以包含条形码序列，并且指导序列可以与靶基因(例如，PKMYT1)具有序列同源性，因此可以靶向靶基因用于由蛋白质(例如，核酸内切酶，例如，Cas9)诱变。可以用治疗有效量的DNA构建体和蛋白质(例如，Cas9)治疗包含突变(例如，PPP2R2A突变)的细胞(例如，癌细胞)群体。在一些情况下，可以经由(例如，使用脂质体或其他纳米颗粒的)转染或(例如，使用病毒的)转导引入DNA构建体。可以使用纳米颗粒或其他囊泡，或者通过将蛋白质加入至细胞培养基中来施用蛋白质。蛋白质(例如，Cas9)可以使用sgRNA-A来将蛋白质引导至细胞基因组中的特定基因座或位置(例如，PKMYT1的基因座处)。接着，蛋白质可以切除和/或置换内源性基因(例如，PKMYT1)。如果置换内源性基因，则蛋白质(例如，Cas9)可以用DNA序列(BC-A)置换内源性基因。然后，可以培养细胞一段时间(例如，7天、14天、20天等)。可以测量细胞的增殖或活力，并且在一些情况下，与对照细胞群体(例如，非突变PPP2R2A细胞)进行比较。可以对来自培养的细胞群体的DNA进行测序，以确定可能存在的指导RNA中每一个的丰度。特定指导RNA的丰度的显著降低可以表明基因敲低对那些细胞的增殖能力具有有害影响。降低PPP2R2A突变细胞(而非野生型细胞)增殖的指导RNA可以被认为与PPP2R2A具有合成致死性。

在一些情况下，与靶基因合成致死的缺陷型基因是编码PP2A亚基中的一个的基因。在一些情况下，PP2A亚基选自65kDa调节亚基Aα(PPP2R1A)、65kDa调节亚基Aβ(PPP2R1B)、55kDa调节亚基Bα(PPP2R2A)、55kDa调节亚基Bβ(PPP2R2B)、55kDa调节亚基Bγ(PPP2R2C)、55kDa调节亚基Bδ(PPP2R2D)、72/130kDa调节亚基B(PPP2R3A)、48kDa调节亚基B(PPP2R3B)、调节亚基B”亚基γ(PPP2R3C)、调节亚基B’(PPP2R4)、56kDa调节亚基α(PPP2R5A)、56kDa调节亚基β(PPP2R5B)、56kDa调节亚基γ(PPP2R5C)、56kDa调节亚基δ(PPP2R5D)、56kDa调节亚基ε(PPP2R5E)、催化亚基α(PPP2CA)和催化亚基β(PPP2CB)。在一些情况下，亚基是PPP2R2A。

在另一方面，本文公开了一种用于治疗癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的组合物，其包含含有(i)至少一种治疗性药剂和(ii)赋形剂的制剂，其中至少一种治疗性药剂以在向对象施用或暴露于对象后有效引起蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1)的表达或活性差异(例如，降低或增加)的量存在，其中与在不存在赋形剂的情况下向对象施用至少一种治疗性药剂相比，赋形剂在向对象施用或暴露于对象后使至少一种治疗性药剂稳定或提供至少一种治疗性药剂的治疗性增强，并且其中癌症与癌性组织相关，该癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达差异(例如，降低或增加)或活性水平差异(例如，降低、增加或改变)的细胞。

在一些情况下，癌性组织是乳腺组织、胰腺组织、子宫组织、膀胱组织、结肠直肠组织、***组织、肝组织或卵巢组织。在一些情况下，癌性组织是肝组织。在一些情况下，癌性组织是卵巢组织。

在一些情况下，用于引起PKMYT1的表达或活性差异(例如，降低或增加)的至少一种治疗性药剂可以包括小分子(例如，分子量小于900道尔顿的分子)、蛋白质、肽、核糖核酸(RNA)分子、脱氧核糖核酸(DNA)构建体或其组合(例如，蛋白质-核酸复合物)。在实例中，至少一种治疗性药剂可以包括蛋白质-核酸复合物，例如，核酸内切酶复合物和DNA构建体。在一些情况下，核酸内切酶复合物包含规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白或其变体(例如，工程化变体)。在这种情况下，DNA构建体可以与核酸内切酶复合物共同施用。可替代地或另外，DNA构建体可以包含核酸内切酶基因。在这种情况下，DNA构建体可以包含编码Cas蛋白或其变体(例如，工程化变体)的基因。在将DNA构建体引入或递送至细胞(例如，癌细胞)后，可以使用细胞自身机制(例如，聚合酶、核糖体等)由细胞转录和翻译DNA构建体。

在一些情况下，用于引起PKMYT1的表达或活性差异(例如，降低或增加)的至少一种治疗性药剂包括小分子抑制剂(例如，分子量小于900道尔顿的分子)。小分子可以配置为降低单独的靶基因的表达水平或活性水平，或者小分子可以配置为降低PKMYT1和PPP2R2A的表达水平或活性水平。在一些情况下，小分子可以直接与PKMYT1或者PKMYT1和PPP2R2A相互作用。例如，小分子可以分别抑制由单独的PKMYT1或者PKMYT1和PPP2R2A的组合编码的蛋白质。可替代地或另外，小分子可以抑制信号转导途径中的上游效应物或下游蛋白质，该信号转导途径中PKMYT1或PPP2R2A相互作用。

在一些情况下，小分子抑制剂可以包括PKMYT1抑制剂。PKMYT1抑制剂可以是例如达沙替尼、塞卡替尼、培利替尼、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1478、PD-0166285、PD-173952、PD-173955或PD-180970。小分子抑制剂可以配置为直接或间接抑制或降低PKMYT1(基因)的表达或蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(来源于PKMYT1基因的蛋白质)的活性。例如，小分子抑制剂可以抑制蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1蛋白或者可能在信号转导途径中蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1的上游或下游的另一蛋白，例如但不限于图1A-B中所示的那些。

在一些情况下，小分子抑制剂可以包括WEE1抑制剂。WEE1抑制剂可以是例如6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(MK-1775)、9-羟基-4-苯基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮(PD-407824)、6-丁基-4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮或6-(2-氯-6-氟苯基)-2-((2,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)咪唑并[1,2-a]嘧啶并[5,4-e]嘧啶-5(6H)-酮。小分子抑制剂可以配置为直接或间接抑制或降低WEE1(基因)的表达或WEE1 G2检查点激酶(来源于WEE1基因的蛋白质)的活性。例如，小分子抑制剂可以抑制WEE1 G2检查点激酶蛋白或者可能在信号转导途径中WEE1 G2检查点激酶的上游或下游的另一蛋白，例如但不限于图1A中所示的那些。例如，小分子抑制剂可以抑制或以其他方式降低CDK1、CDK2等的表达或活性水平。

在一些情况下，小分子抑制剂可以包括小分子抑制剂或其衍生物的组合。例如，小分子抑制剂可以被工程化或修饰为双重特异性，并且可以降低PKMYT1和PPP2R2A两者的表达或活性。可替代地或另外，小分子抑制剂的组合(例如，小分子“鸡尾酒”)可以用于降低PKMYT1或者PKMYT1和PPP2R2A的组合的表达。在一些情况下，小分子抑制剂可以与另一种治疗性药剂类型(例如，蛋白质、RNA分子、DNA分子等)一起施用。

小分子抑制剂可以以任何有用的浓度施用。例如，小分子可以以约0.5纳摩尔(nM)、约1nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约200nM、约300nM、约400nM、约500nM、约600nM、约700nM、约800nM、约900nM、约1微摩尔(μM)、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM的浓度施用。小分子可以以至少约0.5纳摩尔(nM)、至少约1nM、至少约10nM、至少约20nM、至少约30nM、至少约40nM、至少约50nM、至少约60nM、至少约70nM、至少约80nM、至少约90nM、至少约100nM、至少约200nM、至少约300nM、至少约400nM、至少约500nM、至少约600nM、至少约700nM、至少约800nM、至少约900nM、至少约1微摩尔(μM)、至少约2μM、至少约3μM、至少约4μM、至少约5μM、至少约6μM、至少约7μM、至少约8μM、至少约9μM、至少约10μM的浓度施用。小分子可以以至多约10μM、至多约9μM、至多约8μM、至多约7μM、至多约6μM、至多约5μM、至多约4μM、至多约3μM、至多约2μM、至多约1μM、至多约900nM、至多约800nM、至多约700nM、至多约600nM、至多约500nM、至多约400nM、至多约300nM、至多约200nM、至多约100nM、至多约90nM、至多约80nM、至多约70nM、至多约60nM、至多约50nM、至多约40nM、至多约30nM、至多约20nM、至多约10nM、至多约1nM、至多约0.5nM等的浓度施用。可以使用的浓度范围例如在22nM-1μM之间。在使用多于一种小分子的情况下，所用的每种小分子的浓度可以相同或不同。如本文别处所述，与非缺陷型癌细胞相比，抑制PKMYT1的较低浓度或剂量的一种或多种治疗性药剂在包含具有PPP2R2A缺陷的细胞的癌症中可以是治疗有效。

在一些情况下，组合物可以进一步包含至少一种治疗性药剂，其以有效引起PPP2R2A的表达或活性差异(例如，降低或增加)的量存在。在一些情况下，用于治疗患有癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的对象的方法进一步包括向对象施用治疗有效量的一种或多种治疗性药剂，该治疗性药剂引起CDK1的表达或活性差异(例如，降低或增加)。

在一些情况下，用于引起PKMYT1表达差异(例如，降低或增加)的一种或多种治疗性药剂包括DNA构建体。DNA构建体可以包含指导RNA(gRNA)序列，其可以用于将蛋白质(例如，Cas蛋白)引导至PKMYT1。DNA构建体可以包含gRNA序列，其可以将蛋白质(例如，Cas蛋白)引导至PKMYT1。DNA构建体可以包含RNA序列、DNA序列或其组合。在一些情况下，DNA构建体包含：(i)第一gRNA序列，其可以用于将核酸内切酶(例如，Cas蛋白)引导至PKMYT1的靶位置或基因座，以及(ii)对应于PKMYT1基因(例如，PKMYT1的基因置换)的序列(例如，DNA序列)。应理解，RNA序列和DNA序列的不同组合可以用于DNA构建体。此外，DNA序列中可以包括其他功能性序列，包括但不限于条形码序列、标签或其他识别序列、引物序列、限制性酶切位点、转座位点等。

核酸内切酶复合物可以包含核酸内切酶(例如，Cas蛋白)或其他核酸相互作用酶(例如，连接酶、解旋酶、逆转录酶、转录酶、聚合酶等)。Cas蛋白可以包括任何Cas类型(例如，Cas I、Cas IA、Cas IB、Cas IC、Cas ID、Cas IE、Cas IF、Cas IU、Cas III、Cas IIIA、Cas IIIB、Cas IIIC、Cas IIID、Cas IV、Cas IVA、Cas IVB、Cas II、Cas IIA、Cas IIB、CasIIC、Cas V、Cas VI)。在一些情况下，Cas蛋白可以包括其他蛋白质(例如，融合蛋白)，并且可以包括可与核酸分子缔合的另外的酶(例如，连接酶、转录酶、转座酶、核酸酶、核酸内切酶、逆转录酶、聚合酶、解旋酶等)。核酸内切酶复合物可以外源递送或可以以DNA构建体编码，用于在细胞内转录和翻译。

在一些情况下，用于引起PKMYT1中表达差异(例如，降低或增加)的至少一种治疗性药剂可以包括蛋白质或肽。例如，一种或多种治疗性药剂可以包括抗体、抗体片段、激素、配体或免疫球蛋白。蛋白质或肽可以是天然存在的或可以是合成的。蛋白质可以是蛋白质的工程化变体(例如，重组蛋白质)或其片段。蛋白质可以进行其他修饰，例如，翻译后修饰，包括但不限于：糖基化、酰化、异戊烯化、脂化、烷基化、酰胺化、乙酰化、甲基化、甲酰化、丁酰化、羧化、磷酸化、丙二酰化、羟基化、碘化、丙酰化、S-亚硝基化、S-谷氨酰化、琥珀酰化、硫酸化、糖化、氨甲酰化、羰基化、生物素化、氨甲酰化、氧化、聚乙二醇化、SUMO化、泛素化、外消旋化等。可以对蛋白质或肽进行一种或多种修饰。

在一些情况下，用于引起PKMYT1的表达或活性差异(例如，降低或增加)的至少一种治疗性药剂可以包括核酸分子，例如，RNA分子。RNA分子可以包括任何合适的RNA分子和足以降低PKMYT1和在一些情况下PPP2R2A的表达水平或活性的大小。RNA分子可以包括小发夹RNA(shRNA)分子、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或其他有用的RNA分子。在一些实例中，RNA分子可以包括信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、piwi-相互作用RNA(piRNA)、非编码RNA(ncRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)以及前述中任一种的片段。RNA分子可以是单链、双链或者部分单链或双链的。

应理解，治疗性药剂(例如，肽、RNA分子、蛋白质-核酸复合物)作为实例列出，并且治疗性药剂类型的组合可以用于治疗对象。例如，组合物可以包含一种或多种不同类型的治疗性药剂，其可以用于降低PKMYT1的表达或活性。例如，蛋白质或肽可以与小分子(例如，分子量小于900道尔顿的分子)、RNA分子、DNA分子或复合分子(例如，蛋白质-核酸分子)共同施用。相似地，RNA分子可以与小分子、DNA分子或复合分子一起施用。在另一实例中，小分子可以与DNA分子或复合分子共同施用。这些组合是可以用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，肝癌或卵巢癌)的对象的药剂不同组合的非限制性实例。

组合物还可以包含赋形剂。赋形剂可以包括物质，该物质可以用于赋予治疗性药剂以降低PKMYT1的表达或活性水平的特性。例如，赋形剂可以包括用于稳定治疗性药剂的物质。赋形剂可以包括用于填充治疗性药剂的固体、液体或凝胶制剂的物质。在一些情况下，该物质可以(例如，通过增强溶解度)赋予治疗性药剂以治疗性增强。该物质可以用于改变组合物的特性，例如粘度。该物质可以用于改变治疗性药剂的特性，例如，生物利用度、吸收、亲水性、疏水性、药代动力学等。赋形剂可以包括粘合剂、抗粘附剂、包衣、崩解剂、助流剂(例如，硅胶、滑石、碳酸镁)、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂、媒介物或其组合。例如，赋形剂可以包括粉末、矿物质、金属、糖(例如糖类或多糖)、糖醇、天然存在的聚合物(例如，纤维素、甲基纤维素)、合成聚合物(例如，聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)、醇、增稠剂、淀粉、大分子(例如，脂质、蛋白质、碳水化合物、核酸分子)等。

一种或多种治疗性药剂的递送或施用

本发明提供了用于递送、施用或暴露于本文所述的一种或多种治疗性药剂的方法和组合物。一种或多种治疗性药剂可以(例如，体内)递送至对象，或者(例如，离体或体内)递送至来自对象的细胞或细胞群体。在一些情况下，一种或多种治疗性药剂可以以一种或多种递送囊泡(例如纳米颗粒)递送至对象。纳米颗粒可以是任何合适的纳米颗粒，并且可以是固体、半固体、半液体或凝胶。纳米颗粒可以是亲脂性和两亲性颗粒。例如，纳米颗粒可以包括胶束、脂质体、外泌体或其他含脂质的囊泡。在一些情况下，纳米颗粒可以配置用于靶向递送至某一细胞或细胞类型(例如，癌细胞)。在这种情况下，纳米颗粒可以修饰有任意数量的配体，例如，抗体、核酸分子(例如，核糖核酸(RNA)分子或脱氧核糖核酸(DNA)分子)、蛋白质、肽，其可以特异性地结合至某一细胞或细胞类型(例如，癌细胞)。

一种或多种治疗性药剂可以使用病毒方法来递送。例如，一种或多种治疗性药剂可以使用病毒载体来施用。在这种情况下，一种或多种治疗性药剂可以被包封在病毒中，用于递送至细胞、细胞群体或对象。病毒可以是腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或其他有用的病毒。病毒可以是工程化的或可以是天然存在的。

一种或多种治疗性药剂可以使用单一或多种方法来递送至对象(例如，人类患者)或对象的身体(例如，肿瘤部位)。例如，一种或多种治疗性药剂可以口服、静脉内、腹膜内、瘤内、皮下、局部、经皮、经粘膜或通过另一种施用方法递送或施用。

一种或多种治疗性药剂可以肠内递送至对象。例如，一种或多种治疗性药剂可以口服、经鼻、经直肠、舌下、唇下、经颊、局部或通过灌肠施用至对象。在这种情况下，一种或多种治疗性药剂可以配制为片剂、胶囊、滴剂或其他制剂。制剂可以配制为肠内递送。

一种或多种治疗性药剂可以肠胃外递送至对象。例如，一种或多种治疗性药剂可以经由注射施用至对象的位置中。该位置可以包括中枢神经***，并且一种或多种治疗性药剂可以经硬膜外、脑内、脑室内等递送。该位置可以包括皮肤，并且一种或多种治疗性药剂可以经表皮递送。例如，一种或多种治疗性药剂可以配制在经皮贴剂中，其可以将一种或多种治疗性药剂递送至对象的皮肤。一种或多种治疗性药剂可以舌下和/或经口腔、羊膜外、经鼻、动脉内、关节内、海绵窦内(intravavernously)、心内、皮内、病变内、肌内、眼内、骨内、腹膜内、鞘内、子宫内、***内、静脉内、膀胱内、玻璃体内、皮下、经皮、血管周、经粘膜或通过另一种施用途径递送。在一些情况下，一种或多种治疗性药剂可以局部递送。

一种或多种治疗性药剂可以配制为气溶胶、丸剂、片剂、胶囊(例如，不对称膜胶囊)、锭剂、酏剂、乳液、粉末、溶液、悬浮液、酊剂、液体、凝胶、干粉、蒸气、小滴、软膏、贴剂或其组合。例如，一种或多种治疗性药剂可以配制在凝胶或聚合物中，并且经由薄膜递送。

在一些情况下，一种或多种治疗性药剂可以使用靶向递送方法(例如，用于靶向递送至肿瘤部位)或使用增加一种或多种治疗性药剂的细胞摄取的递送方法来递送至对象。递送方法可以包括磁性药物递送(例如，基于磁性纳米颗粒的药物递送)、声靶向药物递送方法、自微乳化药物递送***或其他递送方法。在一些情况下，一种或多种治疗性药剂可以配制用于靶向递送或用于增加细胞摄取。例如，一种或多种治疗性药剂可以与另一种药剂一起配制，其可以改善一种或多种治疗性药剂的溶解度、疏水性、亲水性、吸收性、半衰期、生物利用度、释放曲线或其他特性。例如，一种或多种治疗性药剂可以与聚合物一起配制，其可以控制一种或多种治疗性药剂的释放曲线。一种或多种治疗性药剂可以配制为包衣或具有包衣(例如，牛颌下粘蛋白包衣、聚合物包衣等)，以改变一种或多种治疗性药剂的特性(例如，生物利用度、药代动力学等)。

在一些情况下，一种或多种治疗性药剂可以使用逆向代谢药物设计来配制。在这种情况下，可以评估一种或多种治疗性药剂在细胞中的代谢效应，并且可以设计包含衍生物(例如，化学合成的可替代或工程化变体)的新制剂，以改变一种或多种治疗性药剂的特性(例如，以增加功效、最小化不期望的副作用、改变生物利用度等)。

实施例

实施例1－PKMYT1和PPP2R2A作为合成致死对的鉴定

癌细胞中有价值的生物标志物可以从文献和公开数据中挖掘，并且可以使用例如多组学分析、肿瘤类型(例如原发性肿瘤)评估、细胞系、靶标可追踪性、生物标志物流行度等考虑来进行候选物的进一步细化。在这种筛选的一个实例中，PPP2R2A和PKMYT1可以被鉴定为有价值的生物标志物，这是因为例如PPP2R2A在癌细胞中的频率与非癌细胞相比更高，并且PKMYT1在癌细胞中的表达水平与非癌细胞相比更高。所研究的癌症类型可以包括但不限于：急性髓样白血病(LAML)、肾上腺皮质癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、脑低级别胶质瘤(LGG)、乳腺浸润性癌(BRCA)、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、慢性髓细胞性白血病(LCML)、腺癌(COAD)、食管癌(ESCA)、多形性成胶质细胞瘤(GBM)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肾嫌色细胞癌(KICH)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾***状细胞癌(KIRP)、肝细胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、间皮瘤(MESO)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、胰腺腺癌(PAAD)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)、***腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、肉瘤(SARC)、皮肤黑色素瘤(SKCM)、睾丸生殖细胞肿瘤(TGCT)、胸腺瘤(THYM)、甲状腺癌(THCA)、子宫癌肉瘤(UCS)、子宫体子宫内膜癌(UCEC)以及葡萄膜黑色素瘤(UVM)。

例如，图2示出了不同癌症类型(X轴)中PPP2R2A失活或缺陷的频率(Y轴)图。在某些类型的癌症(例如，***腺癌)中，PPP2R2A的突变频率可以高达约15％。在某些其他癌症类型(例如，卵巢浆液性囊腺癌、直肠腺癌)中，PPP2R2A的突变频率可以大于10％。在各种癌症类型中，导致失活的PPP2R2A的缺陷可以包括：PPP2R2A基因中的超甲基化、深度缺失或突变。

图5示出了在各种癌症类型(X轴)中，PKMYT1在癌症中的表达水平相对于正常(非癌)细胞(Y轴，显示为倍数变化)的图。在某些类型的癌症(例如，肺鳞状细胞癌)中，PKMYT1的表达水平与非癌细胞相比升高。图6示出了与正常细胞(n＝50)相比，PKMYT1在癌(肿瘤)细胞(n＝371)中的表达水平(Y轴，显示为In(表达))的散点图。如从图中可以看出的，PKMYT1在癌细胞中的表达可能显著高于正常细胞。总之，图5-6证明了PKMYT1在各种癌症类型中可能更高表达。

可以进行PPP2R2A和PKMYT1作为可能的合成致死对的进一步筛选。例如，可以将PKMYT1在具有失活或缺陷型PPP2R2A的细胞群体中的表达水平与PKMYT1在具有PPP2R2A的正常或野生型基因型或表型的细胞群体中的表达水平进行比较。图7A示出了PKMYT1在两个细胞群体中的Achilles必需性分数(Y轴)的散点图，该细胞群体具有失活或缺陷型PPP2R2A(例如，突变的PPP2R2A)(n＝7个细胞)或具有野生型PPP2R2A(n＝15个细胞)。图7B示出了PKMYT1在两个细胞群体中的DEMETER必需性分数(Y轴)的散点图，该细胞群体具有失活或缺陷型PPP2R2A(例如，突变的PPP2R2A)(n＝6个细胞)或具有野生型PPP2R2A(n＝12个细胞)。PKMYT1在具有PPP2R2A缺陷的细胞群体中比在具有野生型PPP2R2A的细胞群体中更必需；即，PKMYT1敲低在PPP2R2A缺陷型细胞中比在野生型细胞中更致死。这些数据可以表明PPP2R2A和PKMYT1可能是合成致死对的潜在候选物，并且这两个基因的敲低可以导致细胞死亡，或PPP2R2A缺陷型细胞中PKMYT1的敲低可以导致细胞死亡。

实施例2－PKMYT1和PPP2R2A作为合成致死对

PKMYT1-PPP2R2A合成致死性可以通过实验测试。在一种特定方法中，可以使用组合遗传学CRISPR方法(例如，整体组合遗传学(CombiGEM))来将PKMYT1和PPP2R2A基因从细胞基因组中敲低或敲除。在这个实例中，可以产生DNA构建体。DNA构建体可以包含将核酸内切酶(例如，Cas蛋白)引导至PKMYT1基因的PKMYT1 gRNA，以及将核酸内切酶(例如，Cas蛋白)引导至PPP2R2A基因的PPP2R2AgRNA。PKMYT1 gRNA和PPP2R2A gRNA可以分别包括与内源性PKMYT1基因和PPP2R2A基因上的序列同源或互补的序列。在一些情况下，DNA构建体还可以包含置换基因，以置换基因组中的PKMYT1和PPP2R2A(例如，功能失调序列、随机DNA序列)。

也可以产生对照DNA构建体。例如，为了确定基因对是否是合成致死的，监测单独破坏PKMYT1和PPP2R2A以及基因对的组合的效果可能是重要的。此外，监测阴性对照的效果可能是重要的，其中可以构建包含无效gRNA(例如，作为一个或两个基因的“非切割”对照的非特异性gRNA)的DNA构建体。阴性对照构建体的另一实例可以包括载体对照。在一些情况下，也可以使用阳性对照。阳性对照可以包括例如包含聚合酶(例如，RNA聚合酶，例如，POLR2D)的gRNA的DNA构建体，其可以证明细胞活力或增殖必需的基因的敲除(以及这样做的递送机制)导致致死性。在阳性对照的另一实例中，可以例如使用包含针对已知合成致死基因中的每一个的gRNA的DNA构建体进行已知为合成致死对的两个基因(例如，甲硫基腺苷磷酸化酶(MTAP)和蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5))的敲除。

然后，可以将DNA构建体引入癌(例如，肝癌或卵巢癌)细胞中，其可以包括来自初始来源(例如，分离自肿瘤或癌症)的细胞或细胞系。也可以将核酸内切酶(例如，Cas9)引入癌细胞中。然后，Cas9可以置换、编辑或缺失经处理的细胞中的PKMYT1和PPP2R2A基因，并且在一些情况下，用DNA构建体中的置换基因置换基因组中的PKMYT1和PPP2R2A基因。然后，可以随时间监测细胞的增殖或活力，以确定治疗的有效性。细胞的活力可以相对于未经处理的阴性对照或对照细胞群体进行归一化或比较。

开发了基于由代谢活性细胞从底物(无色)产生试卤灵(蓝色)的灵敏荧光PrestoBlue测定，以定量活细胞。简言之，测试板从在96孔板中每孔接种18,000个细胞开始。用每孔2-10μL(取决于获得的病毒滴度)的病毒体积转导细胞，以实现大于90％的转导。在转导后的32h之后，将培养基更换为含有抗生素(嘌呤霉素)的培养基，并维持抗生素用于其余测定。在第3天，将板分开并重新接种至先前合格的量，以在14天内达到汇合。

为每个测试的基因对制备了总共8个构建体：基因A各2个sgRNA，与NTC配对(sg1、sg2)，基因B各2个sgRNA，与NTC配对(sg1、sg2)，4个sgRNA组合(1，1；1，2；2，1；2，2)。

图8A-B示出了敲除PKMYT1和PPP2R2A的基于CRISPR的方法的示例数据。图8A示出了作为引入的DNA构建体的函数的细胞活力柱状图。DNA构建体可以用于敲除，并且可以包含：(i)双阴性对照(NTC)序列，(ii)作为必需基因敲除的阳性对照的聚合酶(POL2)序列，(iii)用于敲除的MTAP序列，(iv)用于敲除的PRMT5序列，(v)用于敲除的MTAP和PRMT5序列，其可以用作阳性合成致死对照，(vi)用于敲除的PPP2R2A序列，(vii)用于敲除的PKMYT1序列，以及(viii)用于双重敲除的PPP2R2A和PKMYT1序列。阳性对照序列可以是包含功能失调的RNA聚合酶基因(例如，POLR2D基因)以置换内源性POLR2D基因的DNA构建体，或者DNA构建体可以配置为敲低或敲除聚合酶基因。阳性对照序列可以用于例如确定DNA构建体如预期的发挥功能，例如，敲除对DNA复制必需并因此对细胞增殖必需的基因导致细胞活力降低。

经处理的细胞的活力可以相对于阴性对照(例如，未经处理的细胞，或用包含混杂的gRNA或包含PKMYT1和PPP2R2A的正常拷贝的DNA构建体处理的细胞)归一化。如图8A所示，细胞的阴性对照组(NTC)具有在测试组中最高的活力。如预期的，用DNA构建体处理细胞以敲除聚合酶的阳性对照(POL2)导致显著降低的归一化活力。与阴性对照组相比，用DNA构建体处理细胞以敲除MTAP和PRMT5的阳性对照(MTAP-PRMT5)也导致活力降低。与阴性对照组相比，用单一基因敲除(PPP2R2A或PKMYT1)处理的细胞也显示出降低的活力。PPP2R2A和PKMYT1的敲除导致比PPP2R2A的单敲除(p<0.0001)和阴性对照低得多的活力。误差线表示标准偏差，n＝3。

图8B示出了作为引入的DNA构建体的函数的细胞活力柱状图的另一实例。活力可以测量为与阴性对照相比的活细胞百分比。DNA构建体可以用于敲除，并且可以包含：(i)双阴性对照(NTC)序列，(ii)作为必需基因敲除的阳性对照的聚合酶(POL2)序列，(iii)用于敲除的MTAP序列，(iv)用于敲除的PRMT5序列，(v)用于敲除的MTAP和PRMT5序列，其可以用作阳性合成致死对照，(vi)用于敲除的PPP2R2A序列，(vii)用于敲除的PKMYT1序列，以及(viii)用于双重敲除的PPP2R2A和PKMYT1序列。

经处理的细胞的活力可以相对于阴性对照(例如，未经处理的细胞，或用包含混杂的gRNA或包含PKMYT1和PPP2R2A的正常拷贝的DNA构建体处理的细胞)归一化。与图8A相似，图8B中细胞的阴性对照组(NTC)具有在测试组中最高的活力。如预期的，用DNA构建体处理细胞以敲除聚合酶的阳性对照(POLR2D)导致显著降低的归一化活力。与阴性对照组以及单独的MTAP或PRMT5单基因敲除相比，用DNA构建体处理细胞以敲除MTAP和PRMT5的阳性对照(MTAP-PRMT5)也导致活力降低。与阴性对照组相比，用单一基因敲除(PPP2R2A或PKMYT1)处理的细胞也显示出降低的活力。PPP2R2A和PKMYT1的敲除导致比PPP2R2A的单敲除或PKMYT1的单敲除显著更低的活力。误差线表示标准偏差，n＝2。

图9示出了作为在集落形成测定(例如产克隆测定)中引入的DNA构建体的函数的细胞活力柱状图的另一实例。活力可以测量为与阴性对照相比的活细胞百分比。DNA构建体可以用于敲除，并且可以包含：(i)阴性对照(NTC)序列，(ii)用于敲除的第一sgRNAPPP2R2A序列，(iii)用于敲除的第二sgRNA PPP2R2A序列，(iv)用于敲除的第一sgRNAPKMYT1序列，(v)用于敲除的第二sgRNA PKMYT1序列，(vi)用于双重敲除的第一sgRNAPPP2R2A序列和第一sgRNA PKMYT1序列，(vii)用于双重敲除的第一sgRNA PPP2R2A序列和第二sgRNA PKMYT1序列，(viii)用于双重敲除的第二sgRNA PPP2R2A序列和第一sgRNAPKMYT1序列，以及(ix)用于双重敲除的第二sgRNA PPP2R2A序列和第二sgRNA PKMYT1序列。

经处理的细胞的活力可以阴性对照(例如，未经处理的细胞，或用包含混杂的gRNA或包含PKMYT1和PPP2R2A的正常拷贝的DNA构建体处理的细胞)归一化。与图8A-B相似，图9中细胞的阴性对照组(NTC)具有在测试组中最高的活力。与阴性对照组相比，用单基因敲除(PPP2R2A或PKMYT1)处理的细胞显示出降低的活力。PPP2R2A和PKMYT1的敲除导致比PPP2R2A的单敲除或PKMYT1的单敲除显著更低的活力。

Huh1具有PPP2R2A的纯合缺失。PKMYT1缺失预计是致死的，与PPP2R2A CRISPR KO无关。如预测的，单独的PKMYT1敲除在具有PPP2R2A基因座的内源性缺失的Huh1细胞中显示出强细胞杀伤作用(图10)。表1中总结了4种不同细胞系(包括结肠直肠癌细胞系HCT116)的PPP2R2A-PKMYT1合成致死相互作用的强度。

*合成致死(SL)的基因组合的活力分数(FV)<0.2(20％)。合成病(SyntheticSick，SS)的基因组合的活力分数为0.2至0.5(20％-50％)。无作用(NE)的基因组合的活力分数为0.5至1.0(50％-100％)。

**EOB＝(FV基因A x FV基因B)-(FV基因AB)。

表1：4种细胞系中的PPP2R2A-PKMYT1

如表2所示，在Huh1中存在PPP2R2A的低残余表达。Huh1中PKMYT1和PPP2R2A两者的CRISPR敲除消除了该细胞系中PPP2R2A的残余表达，并导致细胞活力进一步降低。

*在所述的不同处理条件下，使用针对细胞系中PPP2R2A蛋白的抗体确定PPP2R2A的表达水平。

表2：细胞系中的PPP2R2A表达

如表3所示，在Huh1中存在PKMYT1的高表达。Huh1中PKMYT1和PPP2R2A两者的CRISPR敲除消除了该细胞系中PKMYT1的表达，并导致细胞活力进一步降低。

*在所述的不同处理条件下，使用针对细胞系中PKMYT1蛋白的抗体确定PMKYT1的表达水平。

表3：细胞系中的PKMYT1表达

通过***生物学分析将参与DNA修复的一系列基因鉴定为解释PPP2R2A与PKMYT1的合成致死性的潜在途径。筛选已知通过同源定向修复机制(HDR)参与DNA修复的一系列22种不同基因，以确定它们与PKMYT1的相互作用。表4和表11中总结了该筛选的结果。这些筛选显示出只有PPP2R2A与PKMYT1具有高协同作用(excess over Bliss“EOB”)和强细胞杀伤作用(活力分数，FV)。PPP2R2A和PKMYT1之间的这种独特的强相互作用在文献中没有过报道，是出乎意料的观察结果。

在Hep3B细胞中筛选已知的通过同源定向修复机制(HDR)参与DNA修复的一系列22种不同基因，以确定它们与PKMYT1的相互作用。这些筛选显示出只有PPP2R2A具有高协同作用(EOB)和作为活力分数

(FV)的强细胞杀伤作用。

表4：合成致死性筛选结果

小分子抑制剂对PKMYT1的抑制可以重复CRISPR介导的PKMYT1敲除的结果。使用CRISPR敲除降低PPP2R2A表达，随后将小分子药物施加至细胞(表5，图12)。也使用其中PPP2R2A未被敲除的对照细胞。观察到当在细胞系中敲除PPP2R2A时，PKMYT1抑制剂显示出效力增加。

通过对PKMYT1和Wee1的选择性结合测定来评估在PPP2R2A和对照细胞系中测试的三种化合物的体外效力。

表5：小分子抑制剂

总之，这些结果支持PPP2R2A和PKMYT1可能是合成致死对。在这种情况下，用治疗有效量的引起PKMYT1的活性水平或表达降低的一种或多种治疗性药剂治疗PPP2R2A缺陷型细胞可能是可行的治疗选择。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。本发明不受说明书中提供的具体实施例的限制。尽管已经参照前述说明书描述了本发明，但本文中实施方案的描述和图示并不意味着以限制意义来解释。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应理解，在实践本发明时，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还将涵盖任何这种替代、修改、变化或等效物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且因此涵盖这些权利要求及其等效物的范围内的方法和结构。

Claims (58)

1.一种用于治疗患有或疑似患有癌症的对象的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的一种或多种治疗性药剂，所述治疗性药剂引起所述对象的蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1)或WEE1G2检查点激酶(WEE1)的表达或活性差异，从而治疗所述对象的所述癌症，其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞，或者其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达或活性水平差异是表达或活性水平降低。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中通过测定来源于从所述对象获得的组织的细胞来鉴定所述突变和/或缺失的存在或不存在。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述测定是基于下一代测序的测定。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种治疗性药剂包括选自以下的一个或多个成员：小分子、蛋白质、胞内抗体、肽、核糖核酸(RNA)分子，以及核酸内切酶复合物和脱氧核糖核酸(DNA)构建体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述DNA构建体包含核酸内切酶基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酸内切酶基因编码CRISPR相关(Cas)蛋白。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述Cas是Cas9。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述DNA构建体包含靶向PKMYT1基因的指导RNA。

12.根据权利要求7所述的方法，其中所述核酸内切酶复合物包含核酸内切酶。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸内切酶是CRISPR相关(Cas)蛋白。

14.根据权利要求7所述的方法，其中所述小分子包括PKMYT1抑制剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述PKMYT1抑制剂包括5-((5-甲氧基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基苯酚、N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼)、4-((2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-3-甲腈(博舒替尼)、N-(5-氯苯并[d][1,3]二氧戊环-4-基)-7-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)-5-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)喹唑啉-4-胺(塞卡替尼)、(E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺(培利替尼)、N-(3-氯苯基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-胺(酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1478)、6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173952)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((3-(甲硫基)苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173955)或6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-氟-3-甲基苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-180970)。

16.根据权利要求7所述的方法，其中所述小分子包括WEE1抑制剂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述WEE1抑制剂包括6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(MK-1775)、9-羟基-4-苯基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮(PD-407824)、6-丁基-4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮或6-(2-氯-6-氟苯基)-2-((2,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)咪唑并[1,2-a]嘧啶并[5,4-e]嘧啶-5(6H)-酮。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述PP2A亚基选自65kDa调节亚基Aα(PPP2R1A)、65kDa调节亚基Aβ(PPP2R1B)、55kDa调节亚基Bα(PPP2R2A)、55kDa调节亚基Bβ(PPP2R2B)、55kDa调节亚基Bγ(PPP2R2C)、55kDa调节亚基Bδ(PPP2R2D)、72/130kDa调节亚基B(PPP2R3A)、48kDa调节亚基B(PPP2R3B)、调节亚基B”亚基γ(PPP2R3C)、调节亚基B’(PPP2R4)、56kDa调节亚基α(PPP2R5A)、56kDa调节亚基β(PPP2R5B)、56kDa调节亚基γ(PPP2R5C)、56kDa调节亚基δ(PPP2R5D)、56kDa调节亚基ε(PPP2R5E)、催化亚基α(PPP2CA)和催化亚基β(PPP2CB)。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述PP2A亚基是PPP2R2A。

20.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括向所述对象施用治疗有效量的一种或多种治疗性药剂，所述治疗性药剂引起PPP2R2A的表达或活性降低。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述健康对照来自未表现出所述癌症的一个或多个对象。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌性组织是乳腺组织、胰腺组织、子宫组织、膀胱组织、结肠直肠组织、***组织、肝组织或卵巢组织。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌性组织是肝组织。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌性组织是卵巢组织。

25.一种用于治疗患有或疑似患有癌症的对象的组合物，其包含含有至少一种治疗性药剂的制剂，其中所述至少一种治疗性药剂以在向所述对象施用后有效引起蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1)或WEE1 G2检查点激酶(WEE1)的表达或活性差异的量存在，并且其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞，或者其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述表达或活性水平差异是表达或活性水平降低。

28.根据权利要求25所述的组合物，其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中通过测定来源于从所述对象获得的组织的细胞来鉴定所述突变和/或缺失的存在或不存在。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述测定是基于下一代测序的测定。

31.根据权利要求25所述的组合物，其中所述至少一种治疗性药剂包括选自以下的一个或多个成员：小分子、蛋白质、胞内抗体、肽、核糖核酸(RNA)分子，以及核酸内切酶复合物和脱氧核糖核酸(DNA)构建体。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述DNA构建体包含核酸内切酶基因。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述核酸内切酶基因编码CRISPR相关(Cas)蛋白。

34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述Cas是Cas9。

35.根据权利要求31所述的组合物，其中所述DNA构建体包含针对PKMYT1基因的指导RNA。

36.根据权利要求31所述的组合物，其中所述核酸内切酶复合物包含核酸内切酶。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述核酸内切酶是CRISPR相关(Cas)蛋白。

38.根据权利要求31所述的组合物，其中所述小分子包括PKMYT1抑制剂。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述PKMYT1抑制剂包括5-((5-甲氧基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基苯酚、N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼)、4-((2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-3-甲腈(博舒替尼)、N-(5-氯苯并[d][1,3]二氧戊环-4-基)-7-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)-5-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)喹唑啉-4-胺(塞卡替尼)、(E)-N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺(培利替尼)、N-(3-氯苯基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-胺(酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1478)、6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((4-吗啉代苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173952)、6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-((3-(甲硫基)苯基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-173955)或6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-氟-3-甲基苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-180970)。

40.根据权利要求31所述的组合物，其中所述小分子包括WEE1抑制剂。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述WEE1抑制剂包括6-(2,6-二氯苯基)-2-((4-(2-(二乙氨基)乙氧基)苯基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD-0166285)、2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(MK-1775)、9-羟基-4-苯基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮(PD-407824)、6-丁基-4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮或6-(2-氯-6-氟苯基)-2-((2,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)咪唑并[1,2-a]嘧啶并[5,4-e]嘧啶-5(6H)-酮。

42.根据权利要求25所述的组合物，其中所述PP2A亚基选自65kDa调节亚基Aα(PPP2R1A)、65kDa调节亚基Aβ(PPP2R1B)、55kDa调节亚基Bα(PPP2R2A)、55kDa调节亚基Bβ(PPP2R2B)、55kDa调节亚基Bγ(PPP2R2C)、55kDa调节亚基Bδ(PPP2R2D)、72/130kDa调节亚基B(PPP2R3A)、48kDa调节亚基B(PPP2R3B)、调节亚基B”亚基γ(PPP2R3C)、调节亚基B’(PPP2R4)、56kDa调节亚基α(PPP2R5A)、56kDa调节亚基β(PPP2R5B)、56kDa调节亚基γ(PPP2R5C)、56kDa调节亚基δ(PPP2R5D)、56kDa调节亚基ε(PPP2R5E)、催化亚基α(PPP2CA)和催化亚基β(PPP2CB)。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述PP2A亚基是PPP2R2A。

44.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物进一步包含含有至少一种治疗性药剂的制剂，所述治疗性药剂以有效引起PPP2R2A的表达或活性降低的量存在。

45.根据权利要求25所述的组合物，其中所述健康对照来自未表现出所述癌症的一个或多个对象。

46.根据权利要求25所述的组合物，其中所述癌性组织是乳腺组织。

47.根据权利要求25所述的组合物，其中所述癌性组织是肝组织。

48.根据权利要求25所述的组合物，其中所述癌性组织是卵巢组织。

49.根据权利要求25所述的组合物，其中所述制剂进一步包含赋形剂。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中与在不存在所述赋形剂的情况下向所述对象施用所述至少一种治疗性药剂相比，所述赋形剂在向所述对象施用后使所述至少一种治疗性药剂稳定或提供所述至少一种治疗性药剂的治疗性增强。

51.一种用于治疗患有或疑似患有癌症的对象的试剂盒，其包含：

组合物，所述组合物包含含有至少一种治疗性药剂的制剂，其中所述至少一种治疗性药剂以在向所述对象施用后有效引起蛋白激酶膜相关酪氨酸/苏氨酸1(PKMYT1)或WEE1 G2检查点激酶(WEE1)的表达或活性差异的量存在，并且其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞，或者其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞；以及

一份或多份说明书，用于向所述对象施用所述组合物。

52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含具有蛋白磷酸酶2(PP2A)或其亚基的表达或活性水平差异的细胞。

53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述表达或活性水平差异是表达或活性水平降低。

54.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述癌症与癌性组织相关，所述癌性组织与健康对照相比包含在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中显示突变和/或缺失的细胞。

55.根据权利要求54所述的试剂盒，其中通过测定来源于从所述对象获得的组织的细胞来鉴定所述突变和/或缺失的存在或不存在。

56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述测定是基于下一代测序的测定。

57.一种用于鉴定对象的疾病的方法，其包括测定来源于从对象获得的组织的细胞，以鉴定与健康对照相比在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中存在或不存在突变和/或缺失，以及输出指示与健康对照相比在编码蛋白磷酸酶2(PP2A)亚基的基因中存在或不存在突变和/或缺失的报告。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述方法包括基于下一代测序的测定。

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