JP2023518900A - 抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターの構築方法および用途 - Google Patents
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Abstract
本出願では、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを構築するための方法が開示される。この方法は、特定の粘着性末端を有する４つの核酸断片を得るために、制限部位を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼを使用して処理し、次に、核酸断片を方向性ライゲーションできるようにすることを含む。本出願では、本方法に従って製造される抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターおよび細菌ライブラリーがさらに開示される。本出願に記載の方法は、抗原特異的抗原結合性ポリペプチドまたはその断片を効果的にスクリーニングするために使用することができる。
Description
本出願は、生物医学の分野に関し、具体的には、抗原特異的結合ポリペプチドをスクリーニングするために使用することができる抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを構築するための方法に関する。
現在、従来技術で一般的に使用される抗体発見方法には、ハイブリドーマ技術と抗体ディスプレイ技術の２つの主要なカテゴリーがある。ハイブリドーマ技術は、２種類のマウスハイブリドーマおよびトランスジェニックマウスハイブリドーマをさらに含む。抗体ディスプレイ技術には主に、それぞれファージディスプレイ、酵母ディスプレイおよび哺乳動物細胞ディスプレイの３種類がある。各抗体発見技術は、非常に明確な利点を有するが、非常に重大な欠点および制限も有する。例えば、抗体薬物シードバンクの構築過程における品質管理の欠如は、抗体ライブラリーの品質の低下、小さなライブラリー容量、低い多様性、低い有効クローン割合をもたらし、したがって、高品質のリード抗体をスクリーニングすることを困難にする。あるいは、抗体ライブラリースクリーニング技術には定量的スクリーニングがなく、スクリーニング処理量が少なく、スクリーニング効果が低く、スクリーニングに時間がかかる。
したがって、革新的な抗体薬物をスクリーニングするためのリード抗体分子の品質、量および多様性を改善し、抗体薬物の開発を加速し、開発の成功率を改善するための革新的な抗体発見技術が必要である。
本出願は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを構築するための方法を提供する。抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターは、４つの断片から構成され、４つの断片の５’および３’末端には、それらが方向性に環化されて抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを形成するように成分ライブラリーおよびディスプレイベクターを構築することによって、特異的配列の粘着末端が提供される。本出願の抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターの構築方法および本出願の抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを用いた抗原特異的結合ポリペプチドのスクリーニング方法は、以下の特性の少なくとも１つを有する：１）制限エンドヌクレアーゼの特別な認識部位を本出願の抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターの構築に使用することができ、これにより、方向性ライゲーションを確実にするだけでなく、誤ったライゲーションも防止し、ライゲーション中に各成分断片の分子数を１：１に制御することができ、したがってライゲーションおよび形質転換の効率を改善する。一方、各断片のライゲーションおよび形質転換の効率を改善するために、ＶＨ成分ライブラリーおよびＬＣ成分ライブラリーを構築する戦略が採用される；２）当技術分野における従来の抗体ライブラリー構築方法で使用されるコンビナトリアルＰＣＲ戦略は使用されず、ＰＣＲによって生じる突然変異が導入される確率が効果的に低下する；３）品質管理がより容易になり、工業的な大量生産のニーズに応えることができる；４）ディスプレイベクターを細胞に導入した後、生物学的活性分析実験により直接スクリーニングすることができ、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを構築してからユニーク配列の抗原特異的ポリペプチドをスクリーニングするまでの時間が効果的に短縮される。例えば、ディスプレイベクターを構築してからユニーク配列の陽性クローンをスクリーニングするまでの時間は、少なくとも約１週間（少なくとも約１０日間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間）であり得る；５）ディスプレイベクター細菌ライブラリー中のクローンの多様性が大きく、スクリーニング効率が高い。いくつかの場合、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを含むライブラリーでは、有効なクローンの割合は最大約５０％超（例えば、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超またはそれ以上）であり得、その結果、形質転換効率が高く、ライブラリー構築の成功率が高い。
一態様では、本出願は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを構築するための方法を提供する。本方法は、ａ）５’から３’の方向にＢ２－ディスプレイＶＨ－Ｂ３を含む第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを提供することと、ｂ）５’から３’の方向にＳ５－ディスプレイＬＣ－Ｓ６を含む第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを提供することと、ｃ）５’から３’の方向にＢ３－ディスプレイベクター断片Ｉ－Ｓ５を含む第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを提供することと、ｄ）５’から３’の方向にＳ６－ディスプレイベクター断片ＩＩ－Ｂ２を含む第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを提供することと、ｅ）切断された第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得るために、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼで特異的に切断することであって、制限エンドヌクレアーゼは、それぞれＢ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６を特異的に認識することと、ｆ）切断された第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを形成することができるように混合することとを含み、ディスプレイＶＨは抗原特異的結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードし、ディスプレイＬＣは抗原特異的結合ポリペプチドの軽鎖をコードし、Ｂ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６は、各々独立して、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位である。
いくつかの実施形態では、Ｂ２を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼによるＢ２の特異的切断から生成された末端は、対応する制限エンドヌクレアーゼによるＢ３、Ｓ５およびＳ６のいずれか１つの特異的切断から生成された末端を認識しないか、または互いに連結しない。
いくつかの実施形態では、Ｂ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼによるＢ３の特異的切断から生成された末端は、対応する制限エンドヌクレアーゼによるＢ２、Ｓ５およびＳ６のいずれか１つの特異的切断から生成された末端を認識しないか、または互いに連結しない。
いくつかの実施形態では、Ｓ５を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼによるＳ５の特異的切断から生成された末端は、対応する制限エンドヌクレアーゼによるＢ２、Ｂ３およびＳ６のいずれか１つの特異的切断から生成された末端を認識しないか、または互いに連結しない。
いくつかの実施形態では、Ｓ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼによるＳ６の特異的切断から生成された末端は、対応する制限エンドヌクレアーゼによるＢ２、Ｂ３およびＳ５のいずれか１つの特異的切断から生成された末端を認識しないか、または互いに連結しない。
いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ＳｆｉＩ、Ｅｓｐ３ＩおよびＢｓｍＢＩから選択される。
いくつかの実施形態では、Ｂ２およびＢ３は、ＢｓｍＢＩおよびＥｓｐ３Ｉからなる群から選択される酵素によって特異的に認識および切断され得る。
いくつかの実施形態では、Ｓ５およびＳ６は、Ｓｆｉｌによって特異的に認識および切断され得る。
いくつかの実施形態では、Ｂ２は、配列番号８に示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｂ３は、配列番号９に示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｓ５は、配列番号１０に示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｓ６は、配列番号１１に示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーを得るために、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第１のディスプレイ細菌に導入することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイＶＨ保存ライゲーション産物を形成するために、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ成分ベクターに挿入することと、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーを得るために、ディスプレイＶＨ保存ライゲーション産物を第１のディスプレイ細菌に導入することとを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーを得るために、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第２のディスプレイ細菌に導入することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイＬＣ保存ライゲーション産物を形成するために、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ成分ベクターに挿入することと、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーを得るために、ディスプレイＬＣ保存ライゲーション産物を第２のディスプレイ細菌に導入することとを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーを得るために、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第３のディスプレイ細菌に導入することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイベクター断片Ｉ保存ライゲーション産物を形成するために、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ成分ベクターに挿入することと、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーを得るために、保存ライゲーション産物を第３のディスプレイ細菌に導入することとを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーを得るために、第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第４のディスプレイ細菌に導入することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイベクター断片ＩＩ保存ライゲーション産物を形成するために、第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ成分ベクターに挿入することと、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーを得るために、保存ライゲーション産物を第４のディスプレイ細菌に導入することとを含む。
いくつかの実施形態では、ディスプレイベクター成分ベクターはｐＵＣベクターに由来する。
いくつかの実施形態では、ｐＵＣベクターはｐＵＣ１９ベクターであるか、またはｐＵＣ１９ベクターに由来する。
いくつかの実施形態において、本方法は、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを含むディスプレイＶＨ成分プラスミドをディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーから取得することと、切断された第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイＶＨ成分プラスミドから取得することとをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイＶＨ成分プラスミドを、Ｂ２およびＢ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、切断された第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを含むディスプレイＬＣ成分プラスミドをディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーから取得することと、切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイＬＣ成分プラスミドから取得することとをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイＬＣ成分プラスミドを、Ｓ５およびＳ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、発現ベクター成分Ｉ細菌ライブラリーから、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを含むディスプレイ断片成分プラスミドＩを取得することと、切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ断片成分プラスミドＩから取得することとをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイ断片成分プラスミドＩを、Ｂ３およびＳ５を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、発現ベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーから、第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを含むディスプレイ断片成分プラスミドＩＩを取得することと、切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ断片成分プラスミドＩＩから取得することとをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイ断片成分プラスミドＩＩを、Ｓ６およびＢ２を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）５’から３’の方向にＢ抗原特異的ＶＨ－Ｂを含む第５のポリヌクレオチドを提供することと、
ｂ）ＶＨ成分ベクターを提供することであって、ＶＨ成分ベクターは、５’から３’の方向にＢ３－ＶＨ成分ベクターライゲーション断片－Ｂ２を含む第６のポリヌクレオチドを含むことと、
ｃ）切断された第５のポリヌクレオチドおよび放出された第６のポリヌクレオチドを得るために、第５のポリヌクレオチドおよびＶＨ成分ベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断することと、
ｄ）切断された第５のポリヌクレオチドおよび放出された第６のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを形成することができるように混合することと
を含み、
Ｂは、Ｂ２および／またはＢ３を特異的に認識することができる制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり、抗原特異的ＶＨは、抗原特異的結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードする。
ａ）５’から３’の方向にＢ抗原特異的ＶＨ－Ｂを含む第５のポリヌクレオチドを提供することと、
ｂ）ＶＨ成分ベクターを提供することであって、ＶＨ成分ベクターは、５’から３’の方向にＢ３－ＶＨ成分ベクターライゲーション断片－Ｂ２を含む第６のポリヌクレオチドを含むことと、
ｃ）切断された第５のポリヌクレオチドおよび放出された第６のポリヌクレオチドを得るために、第５のポリヌクレオチドおよびＶＨ成分ベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断することと、
ｄ）切断された第５のポリヌクレオチドおよび放出された第６のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを形成することができるように混合することと
を含み、
Ｂは、Ｂ２および／またはＢ３を特異的に認識することができる制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり、抗原特異的ＶＨは、抗原特異的結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードする。
いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）５’から３’の方向にＳ抗原特異的ＬＣ－Ｓを含む第７のポリヌクレオチドを提供することと、
ｂ）ＬＣ成分ベクターを提供することであって、ＬＣ成分ベクターは、５’から３’の方向にＳ６－ＬＣ成分ベクターライゲーション断片Ｓ５を含む第８のポリヌクレオチドを含むことと、
ｃ）切断された第７のポリヌクレオチドおよび放出された第８のポリヌクレオチドを得るために、第７のポリヌクレオチドおよびＬＣ成分ベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断することと、
ｄ）切断された第７のポリヌクレオチドおよび放出された第８のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを形成することができるように混合することと
を含み、
Ｓは、Ｓ５および／またはＳ５を特異的に認識することができる制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり、抗原特異的ＬＣは、抗原特異的結合ポリペプチドの軽鎖をコードする。
ａ）５’から３’の方向にＳ抗原特異的ＬＣ－Ｓを含む第７のポリヌクレオチドを提供することと、
ｂ）ＬＣ成分ベクターを提供することであって、ＬＣ成分ベクターは、５’から３’の方向にＳ６－ＬＣ成分ベクターライゲーション断片Ｓ５を含む第８のポリヌクレオチドを含むことと、
ｃ）切断された第７のポリヌクレオチドおよび放出された第８のポリヌクレオチドを得るために、第７のポリヌクレオチドおよびＬＣ成分ベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断することと、
ｄ）切断された第７のポリヌクレオチドおよび放出された第８のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを形成することができるように混合することと
を含み、
Ｓは、Ｓ５および／またはＳ５を特異的に認識することができる制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり、抗原特異的ＬＣは、抗原特異的結合ポリペプチドの軽鎖をコードする。
いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）５’から３’の方向にＢ２－ＶＨ成分ベクターツール断片Ｂ３を含む第９のポリヌクレオチドを提供することと、
ｂ）ＶＨ成分ベクターを得るために、第９のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入することと
を含む。
ａ）５’から３’の方向にＢ２－ＶＨ成分ベクターツール断片Ｂ３を含む第９のポリヌクレオチドを提供することと、
ｂ）ＶＨ成分ベクターを得るために、第９のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入することと
を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）５’から３’の方向にＳ５－ＬＣ成分ベクターツール断片Ｓ６を含む第１０のポリヌクレオチドを提供することと、
ｂ）ＬＣ成分ベクターを得るために、第１０のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入することと
を含む。
ａ）５’から３’の方向にＳ５－ＬＣ成分ベクターツール断片Ｓ６を含む第１０のポリヌクレオチドを提供することと、
ｂ）ＬＣ成分ベクターを得るために、第１０のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入することと
を含む。
いくつかの実施形態では、発現成分ベクターはｐＭＤベクターに由来する。
いくつかの実施形態では、ｐＭＤベクターはｐＭＤ１９ベクターであるか、またはｐＭＤ１９ベクターに由来する。
いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリーを得るために、第９の細菌にＶＨ成分ベクターを導入するステップと、
ｂ）ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリーからＶＨ成分ベクター保存プラスミドを取得するステップと、
ｃ）放出された第６のポリヌクレオチドをＶＨ成分ベクター保存プラスミドから取得するステップと
を含む。
ａ）ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリーを得るために、第９の細菌にＶＨ成分ベクターを導入するステップと、
ｂ）ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリーからＶＨ成分ベクター保存プラスミドを取得するステップと、
ｃ）放出された第６のポリヌクレオチドをＶＨ成分ベクター保存プラスミドから取得するステップと
を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＶＨ成分ベクター保存プラスミドを、Ｂ２およびＢ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、放出された第６のポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリーを得るために、第１０の細菌にＬＣ成分ベクターを導入するステップと、
ｂ）ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリーからＬＣ成分ベクター保存プラスミドを取得するステップと、
ｃ）放出された第８のポリヌクレオチドをＬＣ成分ベクター保存プラスミドから取得するステップと
を含む。
ａ）ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリーを得るために、第１０の細菌にＬＣ成分ベクターを導入するステップと、
ｂ）ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリーからＬＣ成分ベクター保存プラスミドを取得するステップと、
ｃ）放出された第８のポリヌクレオチドをＬＣ成分ベクター保存プラスミドから取得するステップと
を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＬＣ成分ベクター保存プラスミドを、Ｓ５およびＳ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、放出された第８のポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを提供することであって、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーは、５’から３’の方向にＢ２抗原特異的ＶＨ－Ｂ３を含む第１のポリヌクレオチドを含むことと、
ｂ）抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを提供することであって、抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーは、５’から３’の方向にＳ５－抗原特異的ＬＣ－Ｓ６を含む第２のポリヌクレオチドを含むことと、
ｃ）ディスプレイベクターを提供することであって、ディスプレイベクターは、５’から３’の方向にＢ３－ディスプレイベクター断片Ｉ－Ｓ５を含む第３のポリヌクレオチドと、５’から３’の方向にＳ６－ディスプレイベクター断片ＩＩ－Ｂ２を含む第４のポリヌクレオチドとを含むことと、
ｄ）放出された第１のポリヌクレオチド、放出された第２のポリヌクレオチド、放出された第３のポリヌクレオチドおよび放出された第４のポリヌクレオチドを得るために、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリー、抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーおよびディスプレイベクターを制限エンドヌクレアーゼで特異的に切断することであって、制限エンドヌクレアーゼは、それぞれＢ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６を特異的に認識することと、
ｅ）放出された第１のポリヌクレオチド、放出された第２のポリヌクレオチド、放出された第３のポリヌクレオチドおよび放出された第４のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを形成することができるように混合することと
を含み、
抗原特異的ＬＣは、抗原特異的結合ポリペプチドの軽鎖をコードし、抗原特異的ＶＨは、抗原特異的結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードし、
Ｂ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６は、各々独立して、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位である。
ａ）抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを提供することであって、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーは、５’から３’の方向にＢ２抗原特異的ＶＨ－Ｂ３を含む第１のポリヌクレオチドを含むことと、
ｂ）抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを提供することであって、抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーは、５’から３’の方向にＳ５－抗原特異的ＬＣ－Ｓ６を含む第２のポリヌクレオチドを含むことと、
ｃ）ディスプレイベクターを提供することであって、ディスプレイベクターは、５’から３’の方向にＢ３－ディスプレイベクター断片Ｉ－Ｓ５を含む第３のポリヌクレオチドと、５’から３’の方向にＳ６－ディスプレイベクター断片ＩＩ－Ｂ２を含む第４のポリヌクレオチドとを含むことと、
ｄ）放出された第１のポリヌクレオチド、放出された第２のポリヌクレオチド、放出された第３のポリヌクレオチドおよび放出された第４のポリヌクレオチドを得るために、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリー、抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーおよびディスプレイベクターを制限エンドヌクレアーゼで特異的に切断することであって、制限エンドヌクレアーゼは、それぞれＢ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６を特異的に認識することと、
ｅ）放出された第１のポリヌクレオチド、放出された第２のポリヌクレオチド、放出された第３のポリヌクレオチドおよび放出された第４のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを形成することができるように混合することと
を含み、
抗原特異的ＬＣは、抗原特異的結合ポリペプチドの軽鎖をコードし、抗原特異的ＶＨは、抗原特異的結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードし、
Ｂ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６は、各々独立して、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位である。
いくつかの実施形態において、方法は、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを、Ｂ２およびＢ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、放出された第１のポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを、Ｓ５およびＳ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、放出された第２のポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、Ｂ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼおよびＳ５を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼでディスプレイベクターを消化し、それにより、放出された第３のポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、Ｓ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼおよびＢ２を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼでディスプレイベクターを消化し、それにより、放出された第４のポリヌクレオチドを得ることを含む。
いくつかの実施形態において、第５のポリヌクレオチド、第７のポリヌクレオチド、第９のポリヌクレオチド、第１０のポリヌクレオチド、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび／または第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、サンプル材料から得られる。
いくつかの実施形態では、サンプル材料は、特定の抗原を標的とする抗体またはその抗原結合断片および／またはＩｇＧを含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＲ１、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１を標的とする。
いくつかの実施形態において、ＩｇＧはヒトＩｇＧである。
いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２である。
いくつかの実施形態において、方向性ライゲーションはリガーゼの使用を伴う。
いくつかの実施形態において、リガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを細胞に導入することと、細胞から抗原特異的結合ポリペプチドを取得することとを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーを得るために、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを第１の細菌に導入することと、
ｂ）抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーから抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイ遺伝子ライブラリーを取得することと、
ｃ）抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイ遺伝子ライブラリーから抗原特異的結合ポリペプチド発現ベクターＤＮＡを取得することと、
ｄ）抗原特異的結合ポリペプチド発現ベクターＤＮＡを細胞に導入することと、
ｅ）細胞から抗原特異的結合ポリペプチドを取得することと
を含む。
ａ）抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーを得るために、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを第１の細菌に導入することと、
ｂ）抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーから抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイ遺伝子ライブラリーを取得することと、
ｃ）抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイ遺伝子ライブラリーから抗原特異的結合ポリペプチド発現ベクターＤＮＡを取得することと、
ｄ）抗原特異的結合ポリペプチド発現ベクターＤＮＡを細胞に導入することと、
ｅ）細胞から抗原特異的結合ポリペプチドを取得することと
を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリー、ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリー、ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリー、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリー、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリー、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーおよびディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーを凍結保存することを含む。
いくつかの実施形態において、ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリーは、少なくとも１０個の異なるクローンを含む。
いくつかの実施形態において、ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリーは、少なくとも１０個の異なるクローンを含む。
いくつかの実施形態において、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーは、少なくとも１０個の異なるクローンを含む。
いくつかの実施形態において、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーは、少なくとも１０個の異なるクローンを含む。
いくつかの実施形態において、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーは、少なくとも１０個の同一のクローンを含む。
いくつかの実施形態において、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーは、少なくとも１０個の同一のクローンを含む。
いくつかの実施形態では、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリー中の有効なクローンの割合は、少なくとも約１０％である。
いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。
別の態様では、本出願は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを使用することを含む、抗原特異的結合ポリペプチドまたはその断片をスクリーニングする方法を提供する。
別の態様では、本出願は、本方法によって製造された抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを提供する。
別の態様では、本出願は、本方法によって製造された抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーを提供する。
本出願の他の態様および利点は、以下の詳細な説明から当業者によって容易に認識され得る。以下の詳細な説明では、本出願の例示的な実施形態のみが示され説明される。当業者によって認識されるように、本出願の内容は、当業者が、本出願に含まれる本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることを可能にする。これに対応して、本出願の明細書における図面および説明は、限定的ではなく単なる例示である。
本出願に含まれる本発明の特定の特徴は、添付の特許請求の範囲に示される通りである。本出願に含まれる本発明の特徴および利点は、以下に詳細に説明する例示的な実施形態および添付の図面を参照することによってよりよく理解することができる。図面の簡単な説明は以下の通りである。
本出願の実施態様は、具体例によって以下に説明され、本出願の他の利点および効果は、本明細書に開示された内容から当業者には容易に知られるであろう。
用語の定義
本出願において、「抗原結合ポリペプチド」という用語は、一般に、特定の抗原を特異的に認識および／または中和することができるポリペプチド分子を指す。この用語は、抗体もしくはその抗原結合部分、またはインタクトな抗体の抗原結合領域および／もしくは抗体可変領域を含み得る。塩基性４鎖抗体単位は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、各Ｌ鎖は共有ジスルフィド結合を介してＨ鎖に連結され、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じた数の１つ以上のジスルフィド結合を介して互いに連結される。各Ｈ鎖およびＬ鎖はまた、規則的に間隔を置いて配置された鎖内ジスルフィド結合を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に３つ（α鎖およびγ鎖のそれぞれについて）または４つ（μアイソタイプおよびεアイソタイプについて）の定常ドメイン（ＣＨ）が続く。抗原結合性ポリペプチドは、化学的方法および／または遺伝子工学的方法によって得ることができる。例えば、ペプシンおよびパパインを含むプロテアーゼを使用して抗体を消化して、抗原結合断片を生成することができる。本出願において、抗体断片はＦａｂであり得る。
本出願において、「抗原結合ポリペプチド」という用語は、一般に、特定の抗原を特異的に認識および／または中和することができるポリペプチド分子を指す。この用語は、抗体もしくはその抗原結合部分、またはインタクトな抗体の抗原結合領域および／もしくは抗体可変領域を含み得る。塩基性４鎖抗体単位は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、各Ｌ鎖は共有ジスルフィド結合を介してＨ鎖に連結され、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じた数の１つ以上のジスルフィド結合を介して互いに連結される。各Ｈ鎖およびＬ鎖はまた、規則的に間隔を置いて配置された鎖内ジスルフィド結合を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に３つ（α鎖およびγ鎖のそれぞれについて）または４つ（μアイソタイプおよびεアイソタイプについて）の定常ドメイン（ＣＨ）が続く。抗原結合性ポリペプチドは、化学的方法および／または遺伝子工学的方法によって得ることができる。例えば、ペプシンおよびパパインを含むプロテアーゼを使用して抗体を消化して、抗原結合断片を生成することができる。本出願において、抗体断片はＦａｂであり得る。
本出願において、「Ｆａｂ」という用語は、一般に、インタクトな構造（例えば、Ｆｃ領域およびヒンジ領域が除去された状態）を有する抗体をパパインによって消化することによって産生される２つの同一の抗原結合断片を指す。Ｆａｂは、インタクトな軽鎖、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）から構成され得る。各Ｆａｂは、単一の抗原結合部位を有し得る。
本出願において、「第１のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有し得る、抗原特異的ＶＨを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ２抗原特異的ＶＨ－Ｂ３を含むことができ、Ｂ２、Ｂ３は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第１のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂ２およびＢ３を認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｍＢＩ）で消化された後、放出された第１のポリヌクレオチドは抗原特異的ＶＨを含み得、抗原特異的ＶＨの２つの末端はまた、切断後に特異的配列の粘着末端を有し得る。
本出願において、「第２のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有し得る、抗原特異的ＬＣを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ５－抗原特異的ＬＣ－Ｓ６を含むことができ、Ｓ５、Ｓ６は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第１のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳ５およびＳ６を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、放出された第１のポリヌクレオチドは、抗原特異的ＬＣを含むことができ、抗原特異的ＬＣはまた、切断後に特異的配列の粘着性末端をその２つの末端に有することもできる。
本出願において、「抗原特異的ＶＨ」という用語は、一般に、抗原に特異的に結合することができる抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチドを指し、「抗原特異的ＬＣ」という用語は、一般に、抗原に特異的に結合することができる抗体の軽鎖をコードするヌクレオチドを指す。抗原特異的ＶＨおよび抗原特異的ＬＣの配列は、ファージディスプレイ技術、酵母表面ディスプレイ技術、リボソームディスプレイ技術、ｍＲＮＡディスプレイ技術および／またはハイブリドーマ技術を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、ファージライブラリーディスプレイ法によって得ることができる。
本出願において、「第３のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができる、ディスプレイベクター断片Ｉを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第３のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ３－ディスプレイベクター断片Ｉ－Ｓ５を含むことができ、Ｂ３、Ｓ５は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。第３のポリヌクレオチドは、ディスプレイベクターに含まれていてもよい。第３のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩ、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３ＩなどのＢ３およびＳ５を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、第３のポリヌクレオチドは放出され得る。放出された第３のポリヌクレオチドは、ディスプレイベクター断片Ｉを含むことができ、これはまた、その２つの末端において切断後に特定の配列の粘着末端を有することができる。
本出願において、「放出された第３のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、ディスプレイベクターで処理された後に放出された第３のポリヌクレオチドの断片を指す。本出願では、処理は制限エンドヌクレアーゼによる消化であり得る。例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩ、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）を、放出された第３のポリヌクレオチドがディスプレイベクターから放出され、単離され得るように、ディスプレイベクター上の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位のために選択することができる。
本出願において、「第４のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができる、ディスプレイベクター断片ＩＩを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第４のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ６－ディスプレイベクター断片ＩＩ－Ｂ２を含むことができ、Ｓ６、Ｂ２は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。第４のポリヌクレオチドは、ディスプレイベクターに含まれていてもよい。第４のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩ、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３ＩなどのＳ６およびＢ２を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、第４のポリヌクレオチドは放出され得る。放出された第４のポリヌクレオチドは、ディスプレイベクター断片ＩＩを含むことができ、これはまた、その２つの末端において切断後に特定の配列の粘着末端を有することができる。
本出願において、「放出された第４のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、ディスプレイベクターで処理された後に放出された第４のポリヌクレオチドの断片を指す。本出願では、処理は制限エンドヌクレアーゼによる消化であり得る。例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩ、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）を、放出された第４のポリヌクレオチドがディスプレイベクターから放出され、単離され得るように、ディスプレイベクター上の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位のために選択することができる。
本出願において、「第５のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができる、抗原特異的ＶＨを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第５のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ抗原特異的ＶＨ－Ｂを含むことができ、Ｂは制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得、制限エンドヌクレアーゼはＢ２および／またはＢ３を認識することができる制限エンドヌクレアーゼであり得る。切断された第５のポリヌクレオチドは、第５のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３ＩなどのＢを認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、抗原特異的ＶＨを含むことができる。
本出願において、「第７のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができる、抗原特異的ＬＣを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第５のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ抗原特異的ＬＣ－Ｓを含むことができ、Ｓは制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得、制限エンドヌクレアーゼはＳ５および／またはＳ６を認識することができる制限エンドヌクレアーゼであり得る。切断された第７のポリヌクレオチドは、第７のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、抗原特異的ＬＣを含むことができる。
本出願において、「ＶＨ成分ベクター」という用語は、一般に、第６のポリヌクレオチドおよび／またはＶＨ成分ベクターツール断片を含む環状ポリヌクレオチドを指す。
本出願において、「ＶＨ成分ベクター」という用語は、一般に、第８のポリヌクレオチドおよび／またはＬＣ成分ベクターツール断片を含む環状ポリヌクレオチドを指す。
本出願において、「ディスプレイベクター」という用語は、一般に、ディスプレイＶＨおよびディスプレイＬＣをさらに含み得る、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩを含む環状ポリヌクレオチドを指す。処理後、ディスプレイベクターは、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第４のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび／または第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを放出することができる。
本出願において、「第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができるディスプレイＶＨを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ２－ディスプレイＶＨ－Ｂ３を含むことができ、Ｂ２、Ｂ３は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂ２およびＢ３を認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｍＢＩ）で消化された後、切断された第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドはディスプレイＶＨを含むことができ、ディスプレイＶＨは、切断後に特定の配列の粘着末端をその２つの末端に有することもできる。
本出願において、「第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができるディスプレイＬＣを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ５－ディスプレイＬＣ－Ｓ６を含むことができ、Ｓ５、Ｓ６は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳ５およびＳ６を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドはディスプレイＬＣを含むことができ、ディスプレイＬＣは、切断後に特定の配列の粘着末端をその２つの末端に有することもできる。
本出願において、「ディスプレイＶＨ」という用語は、一般に、抗原結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードするヌクレオチドを指し、「ディスプレイＬＣ」という用語は、一般に、抗原結合ポリペプチドの軽鎖をコードするヌクレオチドを指す。本出願における「ディスプレイＶＨ」および「抗原特異的ＶＨ」は、同じ抗原に対する結合ポリペプチドに由来する重鎖可変領域をコードするヌクレオチドであってもよく、異なる抗原に対する結合ポリペプチドに由来する重鎖可変領域をコードするヌクレオチドであってもよい。本出願における「ディスプレイＬＣ」および「抗原特異的ＬＣ」は、同じ抗原に対する結合ポリペプチドに由来する軽鎖をコードするヌクレオチドであってもよく、異なる抗原に対する結合ポリペプチドに由来する軽鎖をコードするヌクレオチドであってもよい。
本出願において、「ディスプレイベクター断片」という用語は、一般に、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩなど、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＳｆｉＩ）を用いたディスプレイベクターの切断によって得られた断片を指す。ディスプレイベクター断片の５’末端および３’末端は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むことができる。
本出願において、「第３のディスプレイベクターポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができる、ディスプレイベクター断片Ｉを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ３－ディスプレイベクター断片Ｉ－Ｓ５を含むことができ、Ｂ３、Ｓ５は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳ５を認識する制限エンドヌクレアーゼ、またはＢｓｍＢＩおよび／もしくはＥｓｐ３ＩなどのＢ３を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、ディスプレイベクター断片Ｉを含むことができ、これはまた、切断後に特定の配列の粘着末端をその２つの末端に有することができる。
本出願において、「第４のディスプレイベクターポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができる、ディスプレイベクター断片ＩＩを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ６－ディスプレイベクター断片ＩＩ－Ｂ２を含むことができ、Ｓ６、Ｂ２は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳ６を認識する制限エンドヌクレアーゼ、またはＢｓｍＢＩおよび／もしくはＥｓｐ３ＩなどのＢ２を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、ディスプレイベクター断片ＩＩを含むことができ、これはまた、切断後に特定の配列の粘着末端をその２つの末端に有することができる。
本出願において、「ＶＨ成分ベクター」という用語は、一般に、第９のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入することによって形成される環状ポリヌクレオチドを指す。
本出願において、「ＬＣ成分ベクター」という用語は、一般に、第１０のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入することによって形成される環状ポリヌクレオチドを指す。
本出願において、「発現成分ベクター」という用語は、一般に、ポリヌクレオチド（例えば、第９のポリヌクレオチドおよび／または第１０のポリヌクレオチド）を挿入することができるベクターを指す。発現成分ベクターはｐＭＤベクターに由来する。例えば、発現成分ベクターは、ｐＭＤ１９ベクターであってもよく、またはｐＭＤ１９ベクターから誘導されてもよい。
本出願において、「第９のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に対する認識部位を有することができるＶＨ成分ベクターツール断片を含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第９のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ２－ＶＨ成分ベクターツール断片Ｂ３を含むことができ、Ｂ２、Ｂ３は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。
本出願において、「第１０のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に対する認識部位を有することができるＬＣ成分ベクターツール断片を含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第１０のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ５－ＬＣ成分ベクターツール断片Ｓ６を含むことができ、Ｓ５、Ｓ６は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。
本出願において、「成分ベクターツール断片」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有し得るが、その中にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有さない任意のポリヌクレオチドを指す。成分ベクターツール断片の長さは、通常、抗原特異的ＶＨおよび抗原特異的ＬＣの長さとは異なる。場合によっては、成分ベクターツール断片の長さは約１ｋｂであり得る。いくつかの場合、成分ベクターツール断片はＩｇＧのＦｃ領域に由来し得る。例えば、成分ベクターツール断片は、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ２からなる群から選択されるＦｃ領域に由来し得る。例えば、エンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位は、Ｂ２およびＢ３であり得る。別の例では、エンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位は、Ｓ５およびＳ６であり得る。
本出願において、「成分ベクター」という用語は、一般に、第９のポリヌクレオチドおよび／または第１０のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入することによって形成される環状ポリヌクレオチドを指す。
本出願において、「第９の細菌」という用語は、一般に、第９のヌクレオチドを導入または含む細菌を指す。第９の細菌は、ＶＨ成分ベクターを含むことができる。本出願では、第９の細菌は、第９のヌクレオチドおよび／またはＶＨ成分ベクターを発現、複製および／または保存（例えば、凍結保存）することができる。本出願では、第９の細菌から、ＶＨ成分ベクターを含むＶＨ成分ベクター保存プラスミドを得ることができる。
本出願において、「第１０の細菌」という用語は、一般に、第１０のヌクレオチドを導入または含む細菌を指す。第９の細菌は、ＬＣ成分ベクターを含むことができる。本出願では、第１０の細菌は、第１０のヌクレオチドおよび／またはＬＣ成分ベクターを発現、複製および／または保存（例えば、凍結保存）することができる。本出願では、第１０の細菌から、ＬＣ成分ベクターを含むＬＣ成分ベクター保存プラスミドを得ることができる。
本出願において、「第６のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に対する認識部位を有することができるＶＨ成分ベクターライゲーション断片を含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第４のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ３－ＶＨ成分ベクターライゲーション断片Ｂ２を含むことができ、Ｂ３、Ｂ２は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。第６のポリヌクレオチドは、ＶＨ成分ベクターに含めることができる。第６のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３ＩなどのＢ３およびＢ２を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、第６のポリヌクレオチドは放出され得る。放出された第４のポリヌクレオチドは、抗原特異的ＶＨを含むことができ、これはまた、その２つの末端において切断後に特異的配列の粘着性末端を有することができる。
本出願において、「放出された第６のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、ＶＨ成分ベクターで処理された後に放出された第６のポリヌクレオチドの断片を指す。本出願では、処理は制限エンドヌクレアーゼによる消化であり得る。例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）を、放出された第６のポリヌクレオチドがＶＨ成分ベクターから放出され、単離され得るように、ディスプレイベクター上の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位のために選択することができる。
本出願において、「第８のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に対する認識部位を有することができるＬＣ成分ベクターライゲーション断片を含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第４のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ６－ＬＣ成分ベクターライゲーション断片Ｓ５を含むことができ、Ｓ６、Ｓ５は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。第８のポリヌクレオチドは、ＬＣ成分ベクターに含めることができる。第８のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなど、Ｓ６およびＳ５を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、第８のポリヌクレオチドは放出され得る。放出された第８のポリヌクレオチドは、抗原特異的ＬＣを含むことができ、これはまた、その２つの末端において切断後に特異的配列の粘着性末端を有することができる。
本出願において、「放出された第８のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、ＬＣ成分ベクターで処理された後に放出された第８のポリヌクレオチドの断片を指す。本出願では、処理は制限エンドヌクレアーゼによる消化であり得る。例えば、放出された第８のポリヌクレオチドがＬＣ成分ベクターから放出され、単離され得るように、適切な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩ）を、ディスプレイベクター上の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位のために選択することができる。
本出願において、「制限エンドヌクレアーゼ」という用語は、一般に、二本鎖ＤＮＡを切断する酵素を指す。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡリガーゼに結合することができる突出した一本鎖ＤＮＡを有する粘着末端を生成することができる。本出願において、制限エンドヌクレアーゼは、認識および制限切断の効果を有することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、その認識部位から一定の距離にある。例えば、制限エンドヌクレアーゼは、ＳｆｉＩ、ＢｓｍＢＩおよびＥｓｐ３Ｉから選択され得る。
本出願において、「第１の細菌」という用語は、一般に、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを導入または含む細菌を指す。第１の細菌は、抗原特異的ＶＨ、抗原特異的ＬＣ、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩを含み得る。本出願では、第１の細菌は、抗原特異的ＶＨ、抗原特異的ＬＣ、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩ、または抗原特異的結合ポリペプチド発現ベクターＤＮＡを発現、複製および／または保存（例えば、凍結保存）することができる。
本出願において、「抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリー」という用語は、一般に、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを第１の細菌に導入することによって得られる細菌ライブラリーを指す。本出願において、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーは、抗原特異的結合ポリペプチドの軽鎖または抗原特異的ポリペプチドの重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む細菌ライブラリーであり得る。本出願において、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーは、抗原特異的結合ポリペプチドをコードする核酸配列を約１０５～約１０９含むことができる（例えば、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、約１０６～約１０７含むことができる）。本出願において、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーは、第１の細菌を約１０７～約１０１２含むことができる（例えば、約１０７～約１０１１、約１０７～約１０１０、約１０７～約１０９、約１０７～約１０８含むことができる）。
本出願において、「第１のディスプレイ細菌」という用語は、一般に、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを導入または含む細菌を指す。第１の細菌は、ディスプレイＶＨを含むことができる。本出願では、第１のディスプレイ細菌は、ディスプレイＶＨおよび／または第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを発現、複製および／または保存（例えば、凍結保存）することができる。
本出願において、「ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリー」という用語は、一般に、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第１のディスプレイ細菌に導入することによって得られる細菌ライブラリーを指す。本出願では、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーは、抗原特異的ポリペプチドの重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む細菌ライブラリーであり得る。本出願において、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーは、ディスプレイＶＨをコードする核酸配列を約１０５～約１０９含むことができる（例えば、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、約１０６～約１０７含むことができる）。本出願において、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーは、第１のディスプレイ細菌を約１０７～約１０１２含むことができる（例えば、約１０７～約１０１１、約１０７～約１０１０、約１０７～約１０９、約１０７～約１０８含むことができる）。
本出願において、「第２のディスプレイ細菌」という用語は、一般に、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを導入または含む細菌を指す。第２の細菌は、ディスプレイＬＣを含むことができる。本出願では、第２のディスプレイ細菌は、ディスプレイＬＣおよび／または第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを発現、複製および／または保存（例えば、凍結保存）することができる。
本出願において、「ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリー」という用語は、一般に、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第２のディスプレイ細菌に導入することによって得られる細菌ライブラリーを指す。本出願では、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーは、抗原特異的ポリペプチドの軽鎖をコードする核酸配列を含む細菌ライブラリーであり得る。本出願において、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーは、ディスプレイＬＣをコードする核酸配列を約１０５～約１０９含むことができる（例えば、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、約１０６～約１０７含むことができる）。本出願において、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーは、第２のディスプレイ細菌を約１０７～約１０１２含むことができる（例えば、約１０７～約１０１１、約１０７～約１０１０、約１０７～約１０９、約１０７～約１０８含むことができる）。
本出願において、「第３のディスプレイ細菌」という用語は、一般に、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを導入または含む細菌を指す。第３の細菌は、ディスプレイベクター断片Ｉを含むことができる。本出願では、第３のディスプレイ細菌は、ディスプレイベクター断片Ｉおよび／または第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを発現、複製および／または保存（例えば、凍結保存）することができる。
本出願において、「ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリー」という用語は、一般に、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第３のディスプレイ細菌に導入することによって得られる細菌ライブラリーを指す。本出願では、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーは、ディスプレイベクター成分Ｉをコードする核酸配列を含む細菌ライブラリーであり得る。本出願では、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーは、ディスプレイＬＣをコードする核酸配列を約１０５～約１０９含むことができる（例えば、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、約１０６～約１０７含むことができる）。本出願において、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーは、第３のディスプレイ細菌を約１０７～約１０１２含むことができる（例えば、約１０７～約１０１１、約１０７～約１０１０、約１０７～約１０９、約１０７～約１０８含むことができる）。
本出願において、「第４のディスプレイ細菌」という用語は、一般に、第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを導入または含む細菌を指す。第４の細菌は、ディスプレイベクター断片ＩＩを含むことができる。本出願では、第４のディスプレイ細菌は、ディスプレイベクター断片ＩＩおよび／または第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを発現、複製および／または保存（例えば、凍結保存）することができる。
本出願において、「ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリー」という用語は、一般に、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第４のディスプレイ細菌に導入することによって得られる細菌ライブラリーを指す。本出願では、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーは、ディスプレイベクター成分ＩＩをコードする核酸配列を含む細菌ライブラリーであり得る。本出願において、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーは、ディスプレイＬＣをコードする核酸配列を約１０５～約１０９含むことができる（例えば、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、約１０６～約１０７含むことができる）。本出願において、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーは、第４のディスプレイ細菌を約１０７～約１０１２含むことができる（例えば、約１０７～約１０１１、約１０７～約１０１０、約１０７～約１０９、約１０７～約１０８含むことができる）。
本出願において、「導入」という用語は、一般に、外因性ポリヌクレオチドを細胞に移入または導入するプロセスを指す。細胞は宿主細胞であり得る。導入された細胞は、対象の初代細胞およびそれらの子孫を含む。細胞は原核細胞であってもよく、例えば細菌細胞であってもよい。
本出願において、「ライゲーション」という用語は、一般に、２つ以上のポリヌクレオチド分子を一緒にライゲーションすることを指す。例えば、ライゲーションは、リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼ）によって達成することができる。例えば、１つのポリヌクレオチドの３’末端を別のポリヌクレオチドの５’末端にライゲーションして、インタクトなポリヌクレオチド分子を形成する。
本出願において、「クローン」という用語は、一般にコロニーの数を指す。例えば、クローンは、細菌ライブラリー（例えば、軽鎖成分細菌ライブラリー、重鎖成分細菌ライブラリー、ディスプレイ細菌ライブラリーおよび／またはファージライブラリー）中のコロニー数であり得る。いくつかの場合、クローンは、細菌ライブラリー中の異なるコロニーの数であり得る。いくつかの場合、クローンは、単一のクローンによって産生される子孫集団の数であり得る。
本出願では、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用することができ、一般に、例えば２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、１万、１０万などを含む、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体などの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドはホスホジエステル結合を含み得る。
本出願において、「および／または」という用語は、代替形態のいずれかまたは両方を意味すると理解されるべきである。
本出願において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、一般に、明示的に指定された特徴を含むが、他の要素を除外しないことを指す。
本出願において、「約」という用語は、一般に、指定値の上または下０．５％～１０％の範囲内で変化すること、例えば指定値の上または下０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％の範囲内で変化することを指す。
詳細な説明
一態様では、本出願は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを構築するための方法を提供する。
一態様では、本出願は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを構築するための方法を提供する。
本出願の抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターは、方向性環化によって連結された４つの断片から構成することができ、それぞれ、抗原特異的ＶＨ、抗原特異的ＬＣ、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩを含むことができる。
成分ベクター
本出願の方法は、ポリヌクレオチド、例えば第９のポリヌクレオチドおよび第１０のポリヌクレオチドを提供することを含むことができる成分ベクターを構築することを含むことができる。第９のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ２－ＶＨ成分ベクターツール断片Ｂ３を含むことができ、第１０のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ５－ＬＣ成分ベクターツール断片Ｓ６を含む。ベクターツール断片は、ＩｇＧのＦｃ断片に由来し得る。例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片が挙げられる。別の例では、ヒトＩｇＧ２のＦｃ断片が挙げられる。いくつかの場合、第９のヌクレオチドは、ＤＤＢ２１４およびＤＤＢ２１５をプライマーとして使用し、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を鋳型として使用する増幅によって得ることができ、ＤＤＢ２１４は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むことができ、ＤＤＢ２１５は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの場合、第１０のヌクレオチドは、ＤＤＢ２１６およびＤＤＢ２１７をプライマーとして使用し、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を鋳型として使用する増幅によって得ることができ、ＤＤＢ２１６は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むことができ、ＤＤＢ２１７は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むことができる。第９のヌクレオチドは、その２つの末端に制限エンドヌクレアーゼの認識部位Ｂ２およびＢ３を含むことができ、第１０のヌクレオチドは、その２つの末端に制限エンドヌクレアーゼの認識部位Ｓ５およびＳ６を含むことができる。
本出願の方法は、ポリヌクレオチド、例えば第９のポリヌクレオチドおよび第１０のポリヌクレオチドを提供することを含むことができる成分ベクターを構築することを含むことができる。第９のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ２－ＶＨ成分ベクターツール断片Ｂ３を含むことができ、第１０のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ５－ＬＣ成分ベクターツール断片Ｓ６を含む。ベクターツール断片は、ＩｇＧのＦｃ断片に由来し得る。例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片が挙げられる。別の例では、ヒトＩｇＧ２のＦｃ断片が挙げられる。いくつかの場合、第９のヌクレオチドは、ＤＤＢ２１４およびＤＤＢ２１５をプライマーとして使用し、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を鋳型として使用する増幅によって得ることができ、ＤＤＢ２１４は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むことができ、ＤＤＢ２１５は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの場合、第１０のヌクレオチドは、ＤＤＢ２１６およびＤＤＢ２１７をプライマーとして使用し、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を鋳型として使用する増幅によって得ることができ、ＤＤＢ２１６は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むことができ、ＤＤＢ２１７は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むことができる。第９のヌクレオチドは、その２つの末端に制限エンドヌクレアーゼの認識部位Ｂ２およびＢ３を含むことができ、第１０のヌクレオチドは、その２つの末端に制限エンドヌクレアーゼの認識部位Ｓ５およびＳ６を含むことができる。
この方法は、成分ベクター（例えば、ＶＨ成分ベクターおよびＬＣ成分ベクター）を得るために、ポリヌクレオチド（例えば、第９のポリヌクレオチドおよび第１０のポリヌクレオチド）を発現成分ベクターに挿入することを含み得る。
発現成分ベクターは、任意のベクター、例えば、増幅および／または容易に保存することができる任意のベクターから誘導することができる。場合によっては、発現成分ベクターとして使用されるベクターは、高コピー数、低分子量などの特性を有し得る。場合によっては、発現成分ベクターはｐＭＤベクターから誘導され得る。例えば、発現成分ベクターは、ｐＭＤ１９ベクターであってもよく、またはｐＭＤ１９ベクターから誘導されてもよい。
本出願において、発現成分ベクターを構築する目的で、ｐＭＤベクターまたはｐＭＤ由来のベクターを操作／改変することができる。例えば、ベクター中のエンドヌクレアーゼに対する１つ以上の認識部位は、部位特異的突然変異誘発によって除去することができる（例えば、その中のＢｓｍＢＩおよび／またはＳｆｉＩのための１つ以上の認識部位を除去する）。場合によっては、エンドヌクレアーゼに対する１つ以上の認識部位を、部位特異的突然変異誘発によってベクターに付加することもできる（例えば、選択された位置にＢｓｍＢＩおよび／またはＳｆｉＩのための１つ以上の認識部位を追加する）。
例えば、部位特異的突然変異誘発によって、ベクターに元々含まれるＢｓｍＢＩの１つ以上の認識部位を除去することができ、次に、ＢｓｍＢＩの１つ以上の追加の認識部位をベクター内の別の位置に追加して、改変ベクター（例えば、改変ｐＭＤベクター）を得ることができる。
本出願において、発現成分ベクター（例えば、ＶＨ成分ベクターの発現成分ベクター）は、ＢｓｍＢＩに対する認識部位を含み得る。場合によっては、発現成分ベクターは、ＢｓｍＢＩに対する２つの認識部位を含み得る。
別の例では、部位特異的突然変異誘発によって、ベクターに元々含まれるＳｆｉＩの１つ以上の認識部位を除去することができ、次に、ＳｆｉＩの１つ以上の追加の認識部位をベクター内の別の位置に追加して、改変ベクター（例えば、改変ｐＭＤベクター）を得ることができる。
本出願において、発現成分ベクター（例えば、ＬＣ成分ベクターの発現成分ベクター）は、ＳｆｉＩに対する認識部位を含み得る。場合によっては、発現成分ベクターは、ＳｆｉＩに対する２つの認識部位を含み得る。
いくつかの場合、本方法は、成分ベクター保存プラスミド（例えば、ＶＨ成分ベクター保存プラスミドおよびＬＣ成分ベクター保存プラスミド）を得るために、ポリヌクレオチド（例えば、第９のポリヌクレオチドおよび第１０のポリヌクレオチド）を発現成分ベクターに挿入することと、次に成分ベクター保存細菌ライブラリー（例えば、ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリーおよびＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリー）を得るために、成分ベクター保存プラスミドを細菌（例えば、第９の細菌および第１０の細菌）に導入することとをさらに含み得る。
例えば、本出願のＶＨ成分ベクターを図３に示すが、これは第９のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入するライゲーションによって得ることができる。ＶＨ成分ベクターは、５’から３’の方向にＢ３－ＶＨ成分ベクターライゲーション断片－Ｂ２を含むことができる第６のポリヌクレオチドを含み、Ｂ２およびＢ３は、それぞれＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉによって特異的に認識および切断され得る。例えば、Ｂ２は、配列番号８に示される核酸配列を含み得、Ｂ３は、配列番号９に示される核酸配列を含み得る。
処理（例えば消化）された後、ＶＨ成分ベクターは、その５’および３’末端において切断後に生成された特定の配列の粘着性末端を有することができる放出された第６のポリヌクレオチドを生成することができる。
例えば、本出願のＬＣ成分ベクターを図４に示すが、これは第１０のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入するライゲーションによって得ることができる。ＬＣ成分ベクターは、５’から３’の方向にＳ６－ＬＣ成分ベクターライゲーション断片Ｓ５を含むことができる第８のポリヌクレオチドを含み、Ｓ６およびＳ５はそれぞれＳｆｉＩによって特異的に認識および切断され得る。例えば、Ｓ６は、配列番号１１に示される核酸配列を含み得、Ｓ５は、配列番号１０に示される核酸配列を含み得る。
処理（例えば消化）された後、これは、その５’および３’末端において切断後に生成された特定の配列の粘着性末端を有することができる放出された第８のポリヌクレオチドを生成することができる。
抗原特異的ＶＨおよび抗原特異的ＬＣ
本出願の方法は、５’から３’の方向にＢ抗原特異的ＶＨ－Ｂを含む第５のポリヌクレオチドを提供することを含み、Ｂは、Ｂ２および／またはＢ３を特異的に認識することができる制限エンドヌクレアーゼの認識部位である。例えば、抗原特異的ＶＨの５’末端および３’末端が制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）の認識部位に結合するように、抗原特異的ＶＨ断片を鋳型として抗原特異的ＶＨを増幅することができる。
本出願の方法は、５’から３’の方向にＢ抗原特異的ＶＨ－Ｂを含む第５のポリヌクレオチドを提供することを含み、Ｂは、Ｂ２および／またはＢ３を特異的に認識することができる制限エンドヌクレアーゼの認識部位である。例えば、抗原特異的ＶＨの５’末端および３’末端が制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）の認識部位に結合するように、抗原特異的ＶＨ断片を鋳型として抗原特異的ＶＨを増幅することができる。
本出願の方法は、５’から３’の方向にＳ抗原特異的ＬＣ－Ｓを含む第７のポリヌクレオチドを提供することを含み、Ｓは、Ｓ５および／またはＳ６を特異的に認識することができる制限エンドヌクレアーゼの認識部位である。例えば、抗原特異的ＬＣの５’末端および３’末端が制限エンドヌクレアーゼ（例えばＳｆｉＩ）の認識部位に結合するように、抗原特異的ＬＣ断片を鋳型として抗原特異的ＬＣを増幅することができる。
場合によっては、抗原特異的ＶＨ断片および抗原特異的ＬＣ断片は、先行技術の方法によって得ることができる。例えば、それらは、抗原で免疫した動物から得ることができ、コンビナトリアル抗体ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、酵母表面ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、ｍＲＮＡディスプレイライブラリーを含む抗体ライブラリーから得ることもできる。
成分ライブラリー
本出願の方法は、切断された第５のポリヌクレオチドおよび放出された第６のポリヌクレオチドを得るために、第５のポリヌクレオチドおよびＶＨ成分ベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断することと、次に、切断された第５のポリヌクレオチドおよび放出された第６のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを形成することができるように混合することとを含み得る。
本出願の方法は、切断された第５のポリヌクレオチドおよび放出された第６のポリヌクレオチドを得るために、第５のポリヌクレオチドおよびＶＨ成分ベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断することと、次に、切断された第５のポリヌクレオチドおよび放出された第６のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを形成することができるように混合することとを含み得る。
抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーは、抗原特異的ＶＨを含み得る。抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂ２およびＢ３を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で切断した後、放出された抗原特異的ＶＨを得ることができ、その５’および３’末端は特定の配列の粘着性末端を有することができる。
本出願の方法は、切断された第７のポリヌクレオチドおよび放出された第８のポリヌクレオチドを得るために、第７のポリヌクレオチドおよびＬＣ成分ベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断することと、次に、切断された第７のポリヌクレオチドおよび放出された第８のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを形成することができるように混合することとを含み得る。
抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーは、抗原特異的ＬＣを含み得る。抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ５およびＳ６を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で切断した後、放出された抗原特異的ＬＣを得ることができ、その５’および３’末端は特定の配列の粘着性末端を有することができる。
ディスプレイベクター
本出願の方法はまた、４つのディスプレイベクターポリヌクレオチド（例えば、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび第４のディスプレイベクターポリヌクレオチド）から構成され得るディスプレイベクターを構築することを含み得る。
本出願の方法はまた、４つのディスプレイベクターポリヌクレオチド（例えば、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび第４のディスプレイベクターポリヌクレオチド）から構成され得るディスプレイベクターを構築することを含み得る。
本出願のディスプレイベクターポリヌクレオチド（第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび第４のディスプレイベクターポリヌクレオチド）は、ディスプレイＬＣおよび／またはディスプレイＶＨなどの抗原結合ポリペプチドまたはその断片を含むことができる。本出願において、ディスプレイＬＣは抗原結合ポリペプチドの軽鎖をコードすることができ、ディスプレイＶＨは抗原結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードすることができ、軽鎖は重鎖可変領域に結合して、標的を認識するＦａｂを形成することができる。いくつかの場合、標的は抗原であり得る。例えば、標的はＰＤ－１である。
本出願のディスプレイベクターポリヌクレオチド（例えば、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび第４のディスプレイベクターポリヌクレオチド）は、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩなどのディスプレイベクター断片を含むことができる。ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩの所望の長さまたは種類は、それぞれ、発現させる抗原結合ポリペプチドまたはその断片の長さまたは性質、および制限部位の長さまたは性質に応じて選択することができる。
場合により、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩは、標的遺伝子を発現することができる任意の１つのベクター断片に由来し得る。例えば、発現ベクター断片Ｉおよび発現ベクター断片ＩＩは、ディスプレイベクターｐＤＧＢ４の断片に由来し得る（ｐＤＧＢ４に関しては、Ｉｖａｎ Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ「哺乳動物細胞ベースの全長抗体ディスプレイライブラリーを構築するための４方ライゲーション（Ｆｏｕｒ－ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）」Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ ２０１１，４３：２３２－２３８を参照されたい）。
本出願のディスプレイベクター断片（例えば、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩ）は、プロモーター、エンハンサー、シグナルペプチド、スクリーニングマーカー（例えば、それらは酵素認識部位、耐性遺伝子、レポーター遺伝子、およびスクリーニング遺伝子を含み得る）を含むがこれらに限定されない特定の機能を有するヌクレオチド配列を含むことができ、これは所望の機能に従って当業者によってディスプレイベクター断片中で調整することができる（特定の機能を有する上記ヌクレオチド配列の挿入／置換および／または欠失）。場合によっては、ディスプレイベクター断片を異なる場合に調整して、異なるヌクレオチド配列を得ることができる。
本出願では、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ２－ディスプレイＶＨ－Ｂ３を含むことができ、Ｂ２およびＢ３は各々独立して制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得、ディスプレイＶＨは抗原結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードし得る。場合によっては、Ｂ２およびＢ３は、それぞれＢｓｍＢＩによって特異的に認識および切断され得る。例えば、Ｂ２は、配列番号８に示される核酸配列を含み得、Ｂ３は、配列番号９に示される核酸配列を含み得る。
第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ５－ディスプレイＬＣ－Ｓ６を含むことができ、Ｓ５およびＳ６は各々独立して制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得、ディスプレイＬＣは抗原結合ポリペプチドの軽鎖をコードし得る。場合によっては、Ｓ５およびＳ６は、それぞれＳｆｉＩによって特異的に認識および切断され得る。例えば、Ｓ５は、配列番号０に示される核酸配列を含み得、Ｓ６は、配列番号１１に示される核酸配列を含み得る。
第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ３－ディスプレイベクター断片Ｉ－Ｓ５を含むことができ、Ｂ３およびＳ５は各々独立して制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。場合によっては、Ｓ５はＳｆｉｌによって特異的に認識および切断され得、Ｂ３はＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉによって特異的に認識および切断され得る。例えば、Ｂ３は、配列番号９に示される核酸配列を含み得、Ｓ５は、配列番号１０に示される核酸配列を含み得る。
第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ６－ディスプレイベクター断片ＩＩ－Ｂ２を含むことができ、Ｓ６およびＢ２は各々独立して制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。場合によっては、Ｓ６はＳｆｉｌによって特異的に認識および切断され得、Ｂ２はＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉによって特異的に認識および切断され得る。例えば、Ｂ２は、配列番号８に示される核酸配列を含み得、Ｓ６は、配列番号１１に示される核酸配列を含み得る。
本出願の第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび／または第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、サンプル材料から得ることができる。いくつかの場合、サンプル材料は、抗原標的化抗体またはその抗原結合断片を含み得る。抗原は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＣＤ４７、ＣＤ３を含むがこれらに限定されない任意の免疫原性断片または決定基であり得る。例えば、抗体またはその抗原結合断片はＰＤ－１を標的とする。
ディスプレイベクターポリヌクレオチドが導入された陽性細菌をスクリーニングするために、ディスプレイベクターポリヌクレオチド（例えば、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび第４のディスプレイベクターポリヌクレオチド）は、シグナルペプチド、例えば天然耐性遺伝子を発現するシグナルペプチドをコードする核酸配列も含み得る。一例では、シグナルペプチドをコードする核酸配列の３’末端は、ポリヌクレオチドの５’末端の制限部位に結合することができる。場合によっては、シグナルペプチドをコードする核酸配列の３’末端部分に適切な制限部位を導入するために、その塩基配列を意図しない突然変異によって変更することができるが、シグナルペプチドのアミノ酸配列は変化しないままである。例えば、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１２および配列番号１４から選択されるいずれか１つに示される核酸配列を含み得る。あるいは、シグナルペプチドは、配列番号１３および配列番号１５から選択されるいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み得る。
ポリヌクレオチドは、当技術分野における従来の方法によって得ることができ、それには、標準的なＰＣＲ、ロングＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲおよび等温増幅が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの場合、プライマーは、標的断片（例えば、ディスプレイＬＣ、ディスプレイＶＨ、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩ）の配列に従ってそれぞれ設計することができ、次に、それらを増幅のための鋳型として使用してポリヌクレオチドを得た。例えば、ディスプレイＬＣを増幅するためのプライマーは、配列番号２０および配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ディスプレイＶＨを増幅するためのプライマーは、配列番号２２および配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ディスプレイベクター断片Ｉを増幅するためのプライマーは、配列番号１８および配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ディスプレイベクター断片ＩＩを増幅するためのプライマーは、配列番号１６および配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含み得る。
ディスプレイベクターポリヌクレオチドを得た後、それらを細菌に別々に導入して細菌ライブラリーを得ることができる。したがって、本出願の方法は、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーを得るために、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第１のディスプレイ細菌に導入するステップと、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーを得るために、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第２のディスプレイ細菌に導入するステップと、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーを得るために、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第３のディスプレイ細菌に導入するステップと、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーを得るために、第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第４のディスプレイ細菌に導入するステップとをさらに含み得る。
本出願では、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドは全て直鎖状核酸分子であり得る。
場合により、ディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ成分ベクターに挿入して、保存ライゲーション産物を形成することができる。場合により、ポリヌクレオチドは、ＰＣＲクローニングを使用することによって成分ベクターに挿入することができる。成分ベクターは、プラスミドベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣベクター）、ファージベクター（例えば、Ｍ１３ベクター、λベクター）、ファージ由来プラスミド（例えば、ファージミド、コスミド）、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、成分ベクターはｐＵＣベクターから誘導され得る。例えば、成分ベクターは、ｐＵＣ１９ベクターであってもよく、またはｐＵＣ１９ベクターから誘導されてもよい。
次に、保存ライゲーション産物を細菌に導入して、ディスプレイ細菌ライブラリーを得ることができる。
本出願では、ディスプレイ細菌ライブラリー（例えば、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーおよびディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリー）は、少なくとも約１０個（例えば、少なくとも約１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１万以上）の異なるクローンを含むことができる。
本出願では、ディスプレイ細菌ライブラリー（例えば、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーおよびディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリー）は、少なくとも約１０個（例えば、少なくとも約１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１万以上）の同一のクローンを含むことができる。
本出願では、ディスプレイ細菌ライブラリー（例えば、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリー、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリー、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーおよびディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリー）中の有効なクローンの割合は、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）であり得る。
本出願では、ディスプレイ細菌ライブラリー（例えば、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリー、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリー、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーおよびディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリー）中の細菌を液体中で培養することができる。液体培養のための時間は、約８時間以下であり得、例えば、約４時間以下、約５時間以下、約６時間以下または約７時間以下であり得る。本出願では、液体培養の操作は簡単である。場合によっては、ディスプレイ細菌ライブラリー中の細菌は、皿に広げて少量の細菌ブロス中で培養することができ、次にコロニーを選別する。プレート培養のための時間は、約１２～１８時間であり得、例えば、約１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間または１８時間であり得る。本出願では、プレート培養は、配列決定分析の前にコロニーの選択（例えば、モノクローンの選択）を可能にする。
抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクター
本出願の方法は、放出された第１のポリヌクレオチド、放出された第２のポリヌクレオチド、放出された第３のポリヌクレオチドおよび放出された第４のポリヌクレオチドを得るために、ＶＨ成分ライブラリー、ＬＣ成分ライブラリーおよびディスプレイベクターを制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ５、Ｓ６、Ｂ２およびＢ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ）で特異的に切断することをさらに含み得る。
本出願の方法は、放出された第１のポリヌクレオチド、放出された第２のポリヌクレオチド、放出された第３のポリヌクレオチドおよび放出された第４のポリヌクレオチドを得るために、ＶＨ成分ライブラリー、ＬＣ成分ライブラリーおよびディスプレイベクターを制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ５、Ｓ６、Ｂ２およびＢ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ）で特異的に切断することをさらに含み得る。
放出された第１のポリヌクレオチドの５’末端は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂ２を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）による切断後に粘着性末端を有することができ、３’末端は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）による切断後に粘着性末端を有することができる。
放出された第２のポリヌクレオチドの５’末端は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ５を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＳｆｉＩ）による切断後に粘着末端を有し、３’末端は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＳｆｉＩ）による切断後に粘着末端を有する。
放出された第３のポリヌクレオチドの５’末端は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）による切断後に粘着末端を有し、３’末端は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ５を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＳｆｉＩ）による切断後に粘着末端を有する。
放出された第４のポリヌクレオチドの５’末端は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＳｆｉＩ）による切断後に粘着末端を有し、３’末端は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂ２を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）による切断後に粘着末端を有する。
本出願において、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドおよび第４のポリヌクレオチドは全て直鎖状核酸分子であり得る。
本出願の方法は、放出された第１のポリヌクレオチド、放出された第２のポリヌクレオチド、放出された第３のポリヌクレオチドおよび放出された第４のポリヌクレオチドを、それらが方向性にライゲーションされ、環化されて、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを形成することができるように混合することをさらに含み得る。場合によっては、方向性ライゲーションは、リガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼの使用を含み得る。
いくつかの場合、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを第１の細菌に導入して、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーを得ることができる。
本出願において、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーは、少なくとも約１０個（例えば、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、少なくとも約１万以上）のクローンを含み得る。
本出願では、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリー中の有効なクローンの割合は、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）であり得る。
ディスプレイベクターを構築してから、本出願の方法を用いてユニーク配列の抗原特異的結合ポリペプチドをスクリーニングするまでに要する時間は、少なくとも約１週間（例えば、少なくとも約１０日間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間）とすることができる。
本出願では、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリー中の細菌を液体中で培養することができる。液体培養のための時間は、約２４時間以下であってもよく、例えば、約５時間以下であってもよく、約１０時間以下であってもよく、約１５時間以下であってもよく、約２０時間以下であってもよく、約２２時間以下であってもよく、または約２２時間以下であってもよい。本出願では、液体培養の操作は簡単である。場合によっては、細菌ライブラリー中の細菌は、皿に広げて少量の細菌ブロス中で培養することができ、次にコロニーを選択する。プレート培養のための時間は、約１２～１８時間であり得、例えば、約１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間または１８時間であり得る。本出願では、プレート培養は、配列決定分析の前にコロニーの選択（例えば、モノクローンの選択）を可能にする。
本方法は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを細胞に導入することと、細胞から抗原特異的結合ポリペプチドを取得することとをさらに含み得る。例えば、細胞は哺乳動物細胞であり得る。次に、抗原特異的結合ポリペプチドを細菌から得ることができる。
制限部位
本出願において、制限エンドヌクレアーゼの認識部位配列は、抗原結合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドに含まれないように設計される。本出願の制限エンドヌクレアーゼは、Ｂ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６をそれぞれ特異的に認識することができる。Ｂ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６は、各々独立して、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位であり得る。
本出願において、制限エンドヌクレアーゼの認識部位配列は、抗原結合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドに含まれないように設計される。本出願の制限エンドヌクレアーゼは、Ｂ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６をそれぞれ特異的に認識することができる。Ｂ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６は、各々独立して、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位であり得る。
本出願における制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、それぞれ１、２、３、４以上の制限エンドヌクレアーゼによって特異的に認識することができる。いくつかの場合、制限エンドヌクレアーゼは、ＳｆｉＩ、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉから選択され得る。他の場合には、他の実行可能な制限エンドヌクレアーゼも選択することができる。
本出願では、制限エンドヌクレアーゼは、ＳｆｉＩ、ＢｓｍＢＩ、およびＥｓｐ３Ｉから選択され得る。本出願では、ＢｓｍＢＩおよびＥｓｐ３Ｉは、制限エンドヌクレアーゼの同じ認識部位を認識することができるアイソザイムであり得る。
本出願では、例えば、Ｓ５およびＳ６は、ＳｆｉＩによって認識および切断され得る。本出願では、例えば、Ｂ２およびＢ３は、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉによって認識および切断され得る。
例えば、ＳｆｉＩは、１３塩基（５’から３’）のＧＧＣＣＮＮＮＮ／ＮＧＧＣＣから構成される配列を認識することができ、これは酵素的切断後に３’末端にオーバーハング配列（例えば、３塩基を含む一本鎖配列）を形成することができ、Ｎは４塩基のＧＡＴＣのいずれかを表し得る。したがって、ＳｆｉＩによって認識され得る４～５個の異なる配列が存在する。
例えば、ＢｓｍＢＩおよびＥｓｐ３Ｉは、１２塩基（５’から３’）のＣＧＴＣＴＣＮ／ＮＮＮＮＮから構成される配列を認識することができ、これは酵素的切断後に５’末端にオーバーハング配列（例えば、４塩基を含む一本鎖配列）を形成することができ、Ｎは４塩基のＧＡＴＣのいずれか１つを表し得る。したがって、ＢｓｍＢＩおよびＥｓｐ３Ｉによって認識され得る４～６個の異なる配列が存在する。
場合によっては、制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、ＳｆｉＩによって特異的に認識および切断される部位であり得る。例えば、部位はそれぞれＳ５、Ｓ６と称することができる。例えば、Ｓ５は、配列番号１０に示される核酸配列を含み得る。別の例では、Ｓ６は、配列番号１１に示される核酸配列を含み得る。
制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉによって特異的に認識および切断される部位であり得る。例えば、部位はそれぞれＢ２およびＢ３と呼ぶことができる。例えば、Ｂ２は、配列番号８に示される核酸配列を含み得る。さらに、例えば、Ｂ３は、配列番号９に示される核酸配列を含み得る。
本出願における制限エンドヌクレアーゼの認識部位には、本明細書に列挙される認識部位が含まれるが、これらに限定されず、また、標的配列（例えば、抗原結合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド）の望ましくない認識または切断を引き起こさない限り、列挙されていない他の制限エンドヌクレアーゼの認識部位、ならびに制限エンドヌクレアーゼの他の認識部位も含まれ得ることに留意されたい。
別の態様では、本出願は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーをさらに提供する。
別の態様では、本出願は、本方法によって生成されたディスプレイベクターをさらに提供する。
いかなる理論によっても限定されることを意図するものではないが、以下の例は、融合タンパク質、その調製方法および本出願の使用を例示するためのものにすぎず、本出願の発明の範囲を限定するために使用されるものではない。
例
例１ ヒトＰＢＭＣのファージ表面抗体（Ｆａｂ）ディスプレイライブラリーの構築
１．１ 免疫材料の全ＲＮＡ／ｍＲＮＡの取得
ヒト末梢血リンパ球から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｍＲＮＡをさらに単離した（タカラカタログ番号Ｚ６５２Ｎ／６３６５９２、具体的な試験工程については、製品説明書を参照されたい）。
例１ ヒトＰＢＭＣのファージ表面抗体（Ｆａｂ）ディスプレイライブラリーの構築
１．１ 免疫材料の全ＲＮＡ／ｍＲＮＡの取得
ヒト末梢血リンパ球から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｍＲＮＡをさらに単離した（タカラカタログ番号Ｚ６５２Ｎ／６３６５９２、具体的な試験工程については、製品説明書を参照されたい）。
１．２ プライマーの設計および合成
ファージディスプレイ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＩＳＢＮ ０－８７９６９－５４６－３）を参照して、ヒト重鎖可変領域ＶＨ、軽鎖ＫＬＣ（全長カッパ軽鎖）および軽鎖ＬＬＣ（全長ラムダ軽鎖）のためのプライマーを設計した。軽鎖フォワードプライマーの５’末端はＲ１のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣ（配列番号７８）を含み、リバースプライマーの５’末端はＲ２のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＡＣＡＴＡＧＧＣＣ（配列番号７９）を含み、重鎖可変領域フォワードプライマーの５’末端はＲ５のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣ（配列番号８０）を含み、リバースプライマーの５’末端はＲ６のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＣ（配列番号８１）を含む。プライマーはＧＥＮＥＷＩＺによって合成された。
ファージディスプレイ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＩＳＢＮ ０－８７９６９－５４６－３）を参照して、ヒト重鎖可変領域ＶＨ、軽鎖ＫＬＣ（全長カッパ軽鎖）および軽鎖ＬＬＣ（全長ラムダ軽鎖）のためのプライマーを設計した。軽鎖フォワードプライマーの５’末端はＲ１のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣ（配列番号７８）を含み、リバースプライマーの５’末端はＲ２のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＡＣＡＴＡＧＧＣＣ（配列番号７９）を含み、重鎖可変領域フォワードプライマーの５’末端はＲ５のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣ（配列番号８０）を含み、リバースプライマーの５’末端はＲ６のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＣ（配列番号８１）を含む。プライマーはＧＥＮＥＷＩＺによって合成された。
リンカーを増幅するためのフォワードおよびリバースプライマーを、ｐＣｏｍｂ３ｘベクターを鋳型として設計した。フォワードプライマーの５’末端はＲ３のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＡＣＡＴＡＧＧＣＣ（配列番号７９）を含み、リバースプライマーの５’末端はＲ４のヌクレオチド配列ＧＧＣＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣ（配列番号８０）を含む。
特定のプライマー配列については、以下の表１－１を参照することができる。
１．３ 第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドの取得
成分抗体遺伝子ライブラリーを２段階アプローチによって増幅した。
成分抗体遺伝子ライブラリーを２段階アプローチによって増幅した。
工程１．例１．１で得られたｍＲＮＡを鋳型とし、Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＭＭＬＶを用いて逆転写によりｃＤＮＡを合成した（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．の製品説明書によると、プライマーはＴｈｅｒｍｏ Ｃａｔ＃Ｎ８０８０１２７であり、逆転写酵素はＰｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃Ｍ１７０１であった）。
工程２．工程１で得られたｃＤＮＡを鋳型とし、例１．２で得られたプライマーを用いて、成分抗体のＫＬＣ、ＬＬＣおよびＶＨ遺伝子ライブラリーをＰＣＲにより増幅した（タカラカタログ番号ＲＲ９００Ａ、会社の製品指示による）。ゲル電気泳動による精製および回収の後（Ａｘｙｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用し、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」の指示に従って操作する）、ＰＣＲ産物、すなわちＫＬＣ断片、ＬＬＣ断片およびＶＨ断片をそれぞれ得た。
１．４ 保存ベクターの構築
１．４．１ プライマーの設計
プライマーは例１．２の内容を参照して設計した。
１．４．１ プライマーの設計
プライマーは例１．２の内容を参照して設計した。
保存ベクターを得るためのプライマーを設計し、合成した。特定のプライマー配列については、以下の表１－２を参照することができる。
１．４．２ ＰＣＲ増幅
例１．４．１で調製したプライマーであるＲ１－１ｋｂ－Ｒ２のフォワードプライマーとＲ１－１ｋｂ－Ｒ２のリバースプライマーを用いて、長さ１ｋｂのヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号１６４）を鋳型としてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後（Ａｘｙｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用）、ＰＣＲ産物Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２（配列番号１６５）を得た。
例１．４．１で調製したプライマーであるＲ１－１ｋｂ－Ｒ２のフォワードプライマーとＲ１－１ｋｂ－Ｒ２のリバースプライマーを用いて、長さ１ｋｂのヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号１６４）を鋳型としてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後（Ａｘｙｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用）、ＰＣＲ産物Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２（配列番号１６５）を得た。
ｐＣｏｍｂ３ｘベクターを鋳型として、Ｒ３リンカーＲ４（配列番号１６０）のフォワードプライマーとＲ３リンカーＲ４（配列番号１６１）のリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後（Ａｘｙｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用）、ＰＣＲ産物Ｒ３リンカーＲ４（配列番号１６７）を得た。リンカーは７２ｂｐの長さを有し得、そのヌクレオチド配列は配列番号１６６に示される通りである。
例１．４．１で調製したプライマーであるＲ５－１ｋｂ－Ｒ６のフォワードプライマーとＲ５－１ｋｂ－Ｒ６のリバースプライマーを用いて、長さ１ｋｂのヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号１６４）を鋳型としてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後、ＰＣＲ産物Ｒ５－１ｋｂ－Ｒ６（配列番号１６８）を得た。
１．４．３ 軽鎖保存ベクターおよび重鎖保存ベクターの構築
ＴＡクローニング法（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．から購入したＴＡクローニングキット）を用いて、１．４．２で作製したＲ１－１ｋｂ－Ｒ２断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに挿入し、全長軽鎖遺伝子ライブラリーに挿入するための軽鎖保存ベクターＤＤＢ－Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２を得て、そのベクターマップを図９に示した。
ＴＡクローニング法（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．から購入したＴＡクローニングキット）を用いて、１．４．２で作製したＲ１－１ｋｂ－Ｒ２断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに挿入し、全長軽鎖遺伝子ライブラリーに挿入するための軽鎖保存ベクターＤＤＢ－Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２を得て、そのベクターマップを図９に示した。
ＴＡクローニング法（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．から購入したＴＡクローニングキット）により、１．４．２で調製したＲ５－１ｋｂ－Ｒ６断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに挿入してＲ５－１ｋｂ－Ｒ６断片を含むベクターを得、これを鋳型として、プライマー変異によりこのベクター中の元のＢｓｍＢＩ制限部位を除去して、ＶＨ遺伝子ライブラリーに挿入するための重鎖保存ベクターＤＤＢ－Ｒ５－１ｋｂ－Ｒ６を得て、そのベクターマップを図１０に示した。
特定のプライマー配列については、以下の表１－３を参照することができる。
１．４．４ リンカー保存ベクターの構築およびリンカー成分細菌の取得
ＴＡクローニング法（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．から購入したＴＡクローニングキット）を用いて、例１．４．２で調製したＲ３リンカーＲ４をｐＭＤ１９－Ｔベクターに挿入し、リンカー保存ベクターＤＤＢ－Ｒ３リンカーＲ４を得て、そのベクターマップを図１１に示した。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏ．）をリンカー保存ベクターで形質転換し、プレート上で３７℃にて一晩培養した。コロニーを配列決定のために送った後、コロニーを回収してリンカー成分細菌を得、これを後で使用するために凍結保存することができる。
ＴＡクローニング法（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．から購入したＴＡクローニングキット）を用いて、例１．４．２で調製したＲ３リンカーＲ４をｐＭＤ１９－Ｔベクターに挿入し、リンカー保存ベクターＤＤＢ－Ｒ３リンカーＲ４を得て、そのベクターマップを図１１に示した。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏ．）をリンカー保存ベクターで形質転換し、プレート上で３７℃にて一晩培養した。コロニーを配列決定のために送った後、コロニーを回収してリンカー成分細菌を得、これを後で使用するために凍結保存することができる。
１．５ 成分細菌ライブラリーの取得
１．５．１ 軽鎖成分細菌ライブラリーの取得
例１．３で作製したＫＬＣ、ＬＬＣを含むポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼＲ１、Ｒ２で消化し、標的軽鎖断片（約０．６５ｋｂ）を得た。
１．５．１ 軽鎖成分細菌ライブラリーの取得
例１．３で作製したＫＬＣ、ＬＬＣを含むポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼＲ１、Ｒ２で消化し、標的軽鎖断片（約０．６５ｋｂ）を得た。
例１．４で調製した軽鎖保存ベクターＤＤＢ－Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２を制限エンドヌクレアーゼＲ１、Ｒ２で消化し、軽鎖保存ベクター断片（約２．７ｋｂ）を得た。
得られた標的軽鎖断片を軽鎖保存ベクター断片と混合した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｔｈｅｒｍｏから購入）を用いてライゲーションし、軽鎖保存ライゲーション産物を得た。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２－２、製造業者の指示に従って操作）を軽鎖保存ライゲーション産物で形質転換し、アンピシリン耐性プレート（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２４０８４５）上に広げ、３７℃で一晩培養した。コロニーを配列決定のために送った後、全てのコロニーを回収して軽鎖成分細菌ライブラリーを得、その品質を検出することができ、および／または後で使用するために凍結保存することができる。
１．５．２ 重鎖成分細菌ライブラリーの取得
例１．３で調製したポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼＲ５、Ｒ６で消化し、標的重鎖可変領域断片（約０．３５ｋｂ）を得た。
例１．３で調製したポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼＲ５、Ｒ６で消化し、標的重鎖可変領域断片（約０．３５ｋｂ）を得た。
例１．４で調製した重鎖保存ベクターＤＤＢ－Ｒ５－１ｋｂ－Ｒ６を制限エンドヌクレアーゼＲ５、Ｒ６で消化して、重鎖保存ベクター断片（約２．７ｋｂ）を得た。
得られた標的重鎖可変領域断片を重鎖保存ベクター断片と混合した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｔｈｅｒｍｏから購入）を用いてライゲーションし、重鎖保存ライゲーション産物を得た。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２－２、製造業者の指示に従って操作）を重鎖保存ライゲーション産物で形質転換し、アンピシリン耐性プレート（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２４０８４５）上に広げ、３７℃で一晩培養した。コロニーを配列決定のために送った後、全てのコロニーを回収して重鎖成分細菌ライブラリーを得、その品質を検出することができ、および／または後で使用するために凍結保存することができる。
１．６ 軽鎖成分プラスミド、重鎖成分プラスミドおよびリンカー断片の取得
プラスミド抽出キット（Ａｘｙｇｅｎより購入）を用いて、例１．５．１で調製した軽鎖成分細菌ライブラリーと例１．５．２で調製した重鎖成分細菌ライブラリーのプラスミドを別々に抽出し、それぞれ軽鎖成分プラスミドと重鎖成分プラスミドを得た。
プラスミド抽出キット（Ａｘｙｇｅｎより購入）を用いて、例１．５．１で調製した軽鎖成分細菌ライブラリーと例１．５．２で調製した重鎖成分細菌ライブラリーのプラスミドを別々に抽出し、それぞれ軽鎖成分プラスミドと重鎖成分プラスミドを得た。
例１．５．１で調製した軽鎖成分プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＲ１、Ｒ２で消化した後、ゲル電気泳動により精製および回収し、軽鎖挿入断片ＬＣを得た。
例１．５．２で調製した重鎖成分プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＲ５、Ｒ６で消化した後、ゲル電気泳動により精製および回収し、重鎖挿入断片ＨＣを得た。
プラスミド抽出キット（Ａｘｙｇｅｎより購入）を用いて、例１．４．４で調製したリンカー成分細菌中のプラスミドを抽出し、リンカー成分プラスミドを得た。例１．４．４のリンカー成分プラスミドまたはリンカー保存ベクターを鋳型として使用し、リンカーを含む０．８ｋｂの断片をリンカーフォワードプライマー（配列番号１５６）およびリンカーリバースプライマー（配列番号１５７）で増幅した後、０．８ｋｂのＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＲ３、Ｒ４で消化し、ゲル電気泳動により精製および回収し（Ｌｉｆｅｆｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ（カタログ番号ＤＫ４０２）から購入した小型断片ゲル抽出キットを使用）、７２ｐｂのリンカー断片を得た。
１．７ ディスプレイベクターの取得
ｐＣｏｍｂ３ｘベクターを購入し、そのベクターマップを図１２に示し、抗体Ｆａｂディスプレイに使用した改変ｐＣｏｍｂ３ｘ－ｆａｂベクターのマップを図１３に示した。
ｐＣｏｍｂ３ｘベクターを購入し、そのベクターマップを図１２に示し、抗体Ｆａｂディスプレイに使用した改変ｐＣｏｍｂ３ｘ－ｆａｂベクターのマップを図１３に示した。
ｐＣｏｍｂ３ｘ－ｆａｂベクター中のＦａｂ遺伝子の３’末端のＳｆｉＩ制限部位をナンセンス変異によって除去した。
その後、ナンセンス変異後のベクターにおける軽鎖終止コドンの下流に制限エンドヌクレアーゼＲ２制限部位を付加し、重鎖可変領域のシグナルペプチドの末端にナンセンス変異を介して制限エンドヌクレアーゼＲ５制限部位を導入することにより、改変型ファージディスプレイベクターＤＤＢ－Ｒ１Ｒ２Ｒ５Ｒ６を得て、そのマップを図１４に示した。
１．８ ディスプレイ細菌ライブラリーの調製
例１．７で作製したディスプレイベクターＤＤＢ－Ｒ１Ｒ２Ｒ５Ｒ６を制限エンドヌクレアーゼＲ７および制限エンドヌクレアーゼＲ８で消化し、３．６ｋｂのディスプレイベクター断片を得た。
例１．７で作製したディスプレイベクターＤＤＢ－Ｒ１Ｒ２Ｒ５Ｒ６を制限エンドヌクレアーゼＲ７および制限エンドヌクレアーゼＲ８で消化し、３．６ｋｂのディスプレイベクター断片を得た。
例１．６で得られた軽鎖挿入断片ＬＣ（０．６５ｋｂ）、重鎖挿入断片ＨＣ（０．３５ｋｂ）、リンカー断片（７２ｂｐ）、およびファージディスプレイベクター断片（３．６ｋｂ）を分子比１：１：１：１で混合し、２０℃で２０時間以上Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとライゲーションして、ディスプレイ用ライゲーション産物を得た。
ライゲーション産物をＰＣＲクリーンアップによって精製し、ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２－２、製造業者の指示に従って操作）に移し、抗生物質を含まない２ＹＴ培地で２５０ｒｐｍで６０分間振盪しながら３７℃で培養し、次にアンピシリン耐性プレート（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２４０８４５）上に広げ、３７℃で一晩増殖させた。コロニーを配列決定のために選別し、プレート上で増殖させた全てのコロニー、すなわちファージディスプレイ細菌ライブラリーを回収し、これを後で使用するために保存することができる。
１．９ ディスプレイ抗体ファージライブラリーの調製
例１．８で調製したディスプレイ細菌ライブラリーから適量の細菌液を採取し、２ＹＴ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％グルコースを含有）中、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で培養した。次に、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢから購入、カタログ番号Ｎ０３１５Ｓ、ＭＯＩ約１０～２０）を細菌溶液に添加し、均一に混合した。混合後、３７℃で３０分間静置し、３７℃、２５０ｒｐｍで３０分間振盪した。遠心分離の際に、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを含有する培養培地の上清部分を廃棄した。細菌を、細菌溶液の元の体積の４倍の培養培地（アンピシリンおよびカナマイシンを含有）に再懸濁し、３０℃および２５０ｒｐｍで一晩振盪した。翌日、ファージをＰＥＧ沈殿によって回収した。ファージの濃度を滴定し、ファージをアリコートに保存して、ディスプレイ抗体ファージライブラリーを得た。
例１．８で調製したディスプレイ細菌ライブラリーから適量の細菌液を採取し、２ＹＴ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％グルコースを含有）中、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で培養した。次に、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢから購入、カタログ番号Ｎ０３１５Ｓ、ＭＯＩ約１０～２０）を細菌溶液に添加し、均一に混合した。混合後、３７℃で３０分間静置し、３７℃、２５０ｒｐｍで３０分間振盪した。遠心分離の際に、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを含有する培養培地の上清部分を廃棄した。細菌を、細菌溶液の元の体積の４倍の培養培地（アンピシリンおよびカナマイシンを含有）に再懸濁し、３０℃および２５０ｒｐｍで一晩振盪した。翌日、ファージをＰＥＧ沈殿によって回収した。ファージの濃度を滴定し、ファージをアリコートに保存して、ディスプレイ抗体ファージライブラリーを得た。
例２ ディスプレイベクターの構築
２．１ サンプル材料の取得
図１に示すようなディスプレイベクターを構築するために、ＰＤ－１標的化抗体ペンブロリズマブならびにｐＤＧＢ４ベクターを例として選択した。ペンブロリズマブの軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号５であり、ペンブロリズマブの重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号６であり、ｐＤＧＢ４ベクターのヌクレオチド配列は配列番号７であった。
２．１ サンプル材料の取得
図１に示すようなディスプレイベクターを構築するために、ＰＤ－１標的化抗体ペンブロリズマブならびにｐＤＧＢ４ベクターを例として選択した。ペンブロリズマブの軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号５であり、ペンブロリズマブの重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号６であり、ｐＤＧＢ４ベクターのヌクレオチド配列は配列番号７であった。
２．２ 制限部位の設計
制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩおよびＳｆｉＩを選択して、２つのＢｓｍＢＩ認識部位（Ｂ２およびＢ３）の配列および２つのＳｆｉＩ認識部位（Ｓ５およびＳ６）の配列を設計し、Ｂ２のヌクレオチド配列は配列番号８に示される通りであり、Ｂ３のヌクレオチド配列は配列番号９に示される通りであり、Ｓ５のヌクレオチド配列は配列番号１０に示される通りであり、Ｓ６のヌクレオチド配列は配列番号１１に示される通りであった。
制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩおよびＳｆｉＩを選択して、２つのＢｓｍＢＩ認識部位（Ｂ２およびＢ３）の配列および２つのＳｆｉＩ認識部位（Ｓ５およびＳ６）の配列を設計し、Ｂ２のヌクレオチド配列は配列番号８に示される通りであり、Ｂ３のヌクレオチド配列は配列番号９に示される通りであり、Ｓ５のヌクレオチド配列は配列番号１０に示される通りであり、Ｓ６のヌクレオチド配列は配列番号１１に示される通りであった。
２．３ シグナルペプチドの選択
ネイティブ抗体遺伝子を発現する２つのシグナルペプチドＳＰ１およびＳＰ２を選択した。シグナルペプチドの３’末端部分に適切な制限部位を導入するために、２つのシグナルペプチドの塩基配列を意図しない突然変異によって変更したが、シグナルペプチドのアミノ酸配列は不変のままであった。ＳＰ１はディスプレイＶＨを発現し、そのヌクレオチド配列は配列番号１２に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列番号１３に示される通りであった。ＳＰ２はディスプレイＬＣを発現し、そのヌクレオチド配列は配列番号１４に示される通りであり、アミノ酸配列は配列番号１５に示される通りであった。
ネイティブ抗体遺伝子を発現する２つのシグナルペプチドＳＰ１およびＳＰ２を選択した。シグナルペプチドの３’末端部分に適切な制限部位を導入するために、２つのシグナルペプチドの塩基配列を意図しない突然変異によって変更したが、シグナルペプチドのアミノ酸配列は不変のままであった。ＳＰ１はディスプレイＶＨを発現し、そのヌクレオチド配列は配列番号１２に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列番号１３に示される通りであった。ＳＰ２はディスプレイＬＣを発現し、そのヌクレオチド配列は配列番号１４に示される通りであり、アミノ酸配列は配列番号１５に示される通りであった。
２．４ ディスプレイベクターポリヌクレオチドの取得
ディスプレイＶＨ、ディスプレイＬＣならびにディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩのためのプライマーをそれぞれ設計し、それらの発現を全てＣＭＶプロモーターによって駆動した。合成プライマーを、２．１の配列を鋳型としてＰＣＲによって増幅した。配列を表２に列挙した。
ディスプレイＶＨ、ディスプレイＬＣならびにディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩのためのプライマーをそれぞれ設計し、それらの発現を全てＣＭＶプロモーターによって駆動した。合成プライマーを、２．１の配列を鋳型としてＰＣＲによって増幅した。配列を表２に列挙した。
４つのディスプレイベクターポリヌクレオチドをＰＣＲによって増幅し（ＬＡ Ｔａｑ，Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．、製品指示に従って実施）、使用した鋳型およびプライマー配列を表２に示した。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動による精製および回収後にそれぞれ得られた（「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」の指示に従って操作）。ＴＡクローニング（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．から購入したＴＡクローニングキット）の方法により、ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９プラスミドベクターに挿入して、保存ライゲーション産物を得た。ＤＨ５ａコンピテント細菌（Ｔａｋａｒａ Ｃｏ．）を保存ベクター産物で形質転換し、プレート上で３７℃にて一晩培養した。コロニーを配列決定のために送った後、所望の配列を含むディスプレイベクターポリヌクレオチドである細菌、すなわち、ディスプレイＶＨを含む第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、ディスプレイＬＣを含む第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、ディスプレイベクター断片Ｉを含む第３のディスプレイベクターポリヌクレオチド、および発現ベクター断片ＩＩを含む第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得た。細菌は、後の使用のために細菌ライブラリーとして凍結保存することができる。
２．５ 消化
プラスミド抽出キット（Ａｘｙｇｅｎから購入）を用いて、例２．４の細菌ライブラリー中の細菌のプラスミドをそれぞれ抽出した。次に、プラスミドベクターを制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩおよびＳｆｉＩで消化し、電気泳動によって単離および精製して、４つの切断されたディスプレイベクターポリヌクレオチドを得た。
プラスミド抽出キット（Ａｘｙｇｅｎから購入）を用いて、例２．４の細菌ライブラリー中の細菌のプラスミドをそれぞれ抽出した。次に、プラスミドベクターを制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩおよびＳｆｉＩで消化し、電気泳動によって単離および精製して、４つの切断されたディスプレイベクターポリヌクレオチドを得た。
２．６ ライゲーションによるディスプレイベクターの取得
例２．５で得られた切断された４つのディスプレイベクターポリヌクレオチドを等しい分子割合で混合し、リガーゼを加えて、それらを方向性にライゲーションし、環化して発現ベクターを形成した。発現ベクターをＤＨ５ａコンピテント細菌に移入し（Ｔａｋａｒａ、製造元の指示に従って操作）、抗生物質を含まない２ＹＴ培地で３７℃、２５０ｒｐｍで６０分間振盪しながら培養し、次にアンピシリン耐性プレート（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２４０８４５）上に広げ、３７℃で一晩増殖させた。コロニーを配列決定のために選別し、正しい配列を含むディスプレイベクターを得た。ディスプレイベクターの具体的な構造を図２に示した。
例２．５で得られた切断された４つのディスプレイベクターポリヌクレオチドを等しい分子割合で混合し、リガーゼを加えて、それらを方向性にライゲーションし、環化して発現ベクターを形成した。発現ベクターをＤＨ５ａコンピテント細菌に移入し（Ｔａｋａｒａ、製造元の指示に従って操作）、抗生物質を含まない２ＹＴ培地で３７℃、２５０ｒｐｍで６０分間振盪しながら培養し、次にアンピシリン耐性プレート（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２４０８４５）上に広げ、３７℃で一晩増殖させた。コロニーを配列決定のために選別し、正しい配列を含むディスプレイベクターを得た。ディスプレイベクターの具体的な構造を図２に示した。
例３ ＶＨ成分ベクターおよびＬＣ成分ベクターの構築
３．１ ＶＨ成分ベクター
長さ１ｋｂのヒトＩｇＧ１ Ｆｃを鋳型として使用し、プライマーＤＤＢ２１４およびＤＤＢ２１５を用いてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後、ＰＣＲ産物Ｂ２－ＫＢ－Ｂ３が得られ、ＤＤＢ２１４のヌクレオチド配列は配列番号１に示す通りであり、ＤＤＢ２１５のヌクレオチド配列は配列番号２に示す通りであった。ｐＭＤ１９ベクターである発現成分ベクターにＢ２－ＫＢ－Ｂ３を挿入し、ＶＨ成分ベクター保存プラスミドを得た。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏ．）をＶＨ成分ベクター保存プラスミドで形質転換し、プレート上で３７℃にて一晩培養した。コロニーを配列決定のために選別して、正しい配列を含むＶＨ成分ベクターを決定した。ＶＨ成分ベクターの構造を図３に示した。
３．１ ＶＨ成分ベクター
長さ１ｋｂのヒトＩｇＧ１ Ｆｃを鋳型として使用し、プライマーＤＤＢ２１４およびＤＤＢ２１５を用いてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後、ＰＣＲ産物Ｂ２－ＫＢ－Ｂ３が得られ、ＤＤＢ２１４のヌクレオチド配列は配列番号１に示す通りであり、ＤＤＢ２１５のヌクレオチド配列は配列番号２に示す通りであった。ｐＭＤ１９ベクターである発現成分ベクターにＢ２－ＫＢ－Ｂ３を挿入し、ＶＨ成分ベクター保存プラスミドを得た。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏ．）をＶＨ成分ベクター保存プラスミドで形質転換し、プレート上で３７℃にて一晩培養した。コロニーを配列決定のために選別して、正しい配列を含むＶＨ成分ベクターを決定した。ＶＨ成分ベクターの構造を図３に示した。
３．２ ＬＣ成分ベクター
長さ１ｋｂのヒトＩｇＧ１ Ｆｃを鋳型として使用し、プライマーＤＤＢ２１６およびＤＤＢ２１７を用いてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後、ＰＣＲ産物Ｓ５－ＫＢ－Ｓ６が得られ、ＤＤＢ２１６のヌクレオチド配列は配列番号３に示す通りであり、ＤＤＢ２１７のヌクレオチド配列は配列番号４に示す通りであった。発現成分ベクターであるｐＭＤ１９ベクターにＳ５－ＫＢ－Ｓ６を挿入し、ＬＣ成分ベクター保存プラスミドを得た。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏ．）をＬＣ成分ベクター保存プラスミドで形質転換し、プレート上で３７℃にて一晩培養した。コロニーを配列決定のために選別して、正しい配列を含むＬＣＨ成分ベクターを決定した。ＬＣ成分ベクターの構造を図４に示した。
長さ１ｋｂのヒトＩｇＧ１ Ｆｃを鋳型として使用し、プライマーＤＤＢ２１６およびＤＤＢ２１７を用いてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後、ＰＣＲ産物Ｓ５－ＫＢ－Ｓ６が得られ、ＤＤＢ２１６のヌクレオチド配列は配列番号３に示す通りであり、ＤＤＢ２１７のヌクレオチド配列は配列番号４に示す通りであった。発現成分ベクターであるｐＭＤ１９ベクターにＳ５－ＫＢ－Ｓ６を挿入し、ＬＣ成分ベクター保存プラスミドを得た。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏ．）をＬＣ成分ベクター保存プラスミドで形質転換し、プレート上で３７℃にて一晩培養した。コロニーを配列決定のために選別して、正しい配列を含むＬＣＨ成分ベクターを決定した。ＬＣ成分ベクターの構造を図４に示した。
例４ 抗原特異的ＶＨおよび抗原特異的ＬＣの取得
４．１ １回目のスクリーニング
例１で構築したファージライブラリー５００μｌを採取した（Ｆａｂライブラリー、元のライブラリー容量は４×１０１０であり、有効クローンは８０％超であり、調製されたファージライブラリーは２×１０１３／ｍｌであった）。ビオチン標識ＲＯＲ１抗原（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＲＯ１－Ｈ８２Ｅ６）をファージライブラリーと混合し（抗原濃度１０μｇ／ｍｌ）、室温で２時間振盪して、抗原特異的Ｆａｂを提示するファージをビオチン標識抗原に結合させた。次に、磁性ビーズ８０μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をファージライブラリー抗原と混合し、室温で２０分間振盪し、磁性ビーズ表面のアビジンとビオチンの結合により抗原特異的ファージを捕捉し、磁性ビーズ－アビジン－ビオチン－抗原－Ｆａｂ抗体断片架橋剤を形成した。そして、ＲＯＲ１抗原特異的Ｆａｂを担持する形成された架橋剤を磁気スタンドで回収し、ＲＯＲ１抗原特異的Ｆａｂを提示するファージをｐＨ２．２のグリシン溶液で溶出し、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ緩衝液でｐＨ７．０に中和し、最終的に５５０μｌのファージ溶液を得た。
４．１ １回目のスクリーニング
例１で構築したファージライブラリー５００μｌを採取した（Ｆａｂライブラリー、元のライブラリー容量は４×１０１０であり、有効クローンは８０％超であり、調製されたファージライブラリーは２×１０１３／ｍｌであった）。ビオチン標識ＲＯＲ１抗原（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＲＯ１－Ｈ８２Ｅ６）をファージライブラリーと混合し（抗原濃度１０μｇ／ｍｌ）、室温で２時間振盪して、抗原特異的Ｆａｂを提示するファージをビオチン標識抗原に結合させた。次に、磁性ビーズ８０μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をファージライブラリー抗原と混合し、室温で２０分間振盪し、磁性ビーズ表面のアビジンとビオチンの結合により抗原特異的ファージを捕捉し、磁性ビーズ－アビジン－ビオチン－抗原－Ｆａｂ抗体断片架橋剤を形成した。そして、ＲＯＲ１抗原特異的Ｆａｂを担持する形成された架橋剤を磁気スタンドで回収し、ＲＯＲ１抗原特異的Ｆａｂを提示するファージをｐＨ２．２のグリシン溶液で溶出し、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ緩衝液でｐＨ７．０に中和し、最終的に５５０μｌのファージ溶液を得た。
４．２ ２回目のスクリーニング
１回目のスクリーニングから得られたファージ溶液２５０μｌを等量の４％Ｍｉｌｋ－ＰＢＳと混合し、最終容量を０．５ｍｌとした。次に、４μｇのビオチン標識抗原を８μｇ／ｍｌの最終抗原濃度になるようにファージ溶液と混合し、室温で３時間振盪して、抗原特異的Ｆａｂを提示するファージをビオチン標識抗原に結合させた。次に、磁性ビーズ４０μｌをファージ溶液－抗原と混合し、室温で２０分間振盪し、磁性ビーズ表面のアビジンとビオチンの結合により抗原特異的ファージを捕捉し、磁性ビーズ－アビジン－ビオチン－抗原－Ｆａｂ抗体断片架橋剤を形成した。ＲＯＲ１抗原特異的Ｆａｂを担持する形成された架橋剤を磁気スタンドによって回収した。その後、１×ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１×ＰＢＳで４回洗浄した。最後に、ＲＯＲ１抗原特異的Ｆａｂを提示するファージを５０μｌのｐＨ２．２グリシン溶液で溶出し、２０μｌのｐＨ８．０ Ｔｒｉｓ緩衝液でｐＨ７．０に中和し、最終的に７５μｌのファージ溶液を得た。
１回目のスクリーニングから得られたファージ溶液２５０μｌを等量の４％Ｍｉｌｋ－ＰＢＳと混合し、最終容量を０．５ｍｌとした。次に、４μｇのビオチン標識抗原を８μｇ／ｍｌの最終抗原濃度になるようにファージ溶液と混合し、室温で３時間振盪して、抗原特異的Ｆａｂを提示するファージをビオチン標識抗原に結合させた。次に、磁性ビーズ４０μｌをファージ溶液－抗原と混合し、室温で２０分間振盪し、磁性ビーズ表面のアビジンとビオチンの結合により抗原特異的ファージを捕捉し、磁性ビーズ－アビジン－ビオチン－抗原－Ｆａｂ抗体断片架橋剤を形成した。ＲＯＲ１抗原特異的Ｆａｂを担持する形成された架橋剤を磁気スタンドによって回収した。その後、１×ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１×ＰＢＳで４回洗浄した。最後に、ＲＯＲ１抗原特異的Ｆａｂを提示するファージを５０μｌのｐＨ２．２グリシン溶液で溶出し、２０μｌのｐＨ８．０ Ｔｒｉｓ緩衝液でｐＨ７．０に中和し、最終的に７５μｌのファージ溶液を得た。
４．３ ＴＧ１細菌の感染
例４．２の２回目のスクリーニングで得られたファージ溶液７５μｌを対数増殖期のＴＧ１細菌５００μｌと混合し、３７℃で３０分間静置した。次に、感染したＴＧ１細菌溶液をＡｍｐ耐性プレート上に広げ、３７℃で一晩培養した。
例４．２の２回目のスクリーニングで得られたファージ溶液７５μｌを対数増殖期のＴＧ１細菌５００μｌと混合し、３７℃で３０分間静置した。次に、感染したＴＧ１細菌溶液をＡｍｐ耐性プレート上に広げ、３７℃で一晩培養した。
４．４ ＥＬＩＳＡによる陽性クローンのスクリーニング
プレート上で増殖したコロニーを計数し、各ウェルに培養培地（２ＹＴ＋Ａｍｐ＋０．２％グルコース）４００μｌを含む９６ウェルディープウェルプレート２枚に接種し、３７℃で６時間振盪しながら培養した。各ウェルに、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを含む培養液（２ＹＴ＋Ａｍｐ＋２ｍＭ ＩＰＴＧ）４００μｌを添加し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート２枚を、ビオチン標識なしのＲＯＲ１抗原で１００ｎｇ／１００μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングした。
プレート上で増殖したコロニーを計数し、各ウェルに培養培地（２ＹＴ＋Ａｍｐ＋０．２％グルコース）４００μｌを含む９６ウェルディープウェルプレート２枚に接種し、３７℃で６時間振盪しながら培養した。各ウェルに、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを含む培養液（２ＹＴ＋Ａｍｐ＋２ｍＭ ＩＰＴＧ）４００μｌを添加し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート２枚を、ビオチン標識なしのＲＯＲ１抗原で１００ｎｇ／１００μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングした。
抗原で一晩コーティングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを洗浄およびブロッキングした後、一晩培養した１００μｌの細菌溶液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄した。次に、二次抗体（ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ－Ｆａｂ抗体）を添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。洗浄後、現像液を加え、暗所で３０分間保存した。ＯＤ６００値をマイクロプレートリーダーによって読み取り、結果を以下の表３－１および表３－２に示した。
読み取り値が０．２５を超える合計３５個のクローンを配列決定のために送った。配列分析は、３４個のユニークなＶＨおよび２８個のユニークなＬＣが存在することを示した。軽鎖アミノ酸配列の比較結果を図５Ａに示し、重鎖可変領域アミノ酸配列の比較結果を図５Ｂに示した。
例５ ＶＨ成分ライブラリーおよびＬＣ成分ライブラリーの構築
５．１ 抗原特異的ＶＨおよび抗原特異的ＬＣの増幅
制限エンドヌクレアーゼ（Ｅｓｐ３ＩおよびＳｆｉＩ）の認識部位を含むプライマーを設計した。２４個のフォワードプライマーおよび５個のリバースプライマーを含む、抗原特異的ＶＨを増幅するための２９個のプライマーと、１８個のフォワードプライマーおよび１個のリバースプライマーを含む、抗原特異的ＫＬＣ（カッパ軽鎖）を増幅するための１９個のプライマーと、２５個のフォワードプライマーおよび１個のリバースプライマーを含む、抗原特異的ＬＬＣ（ラムダ軽鎖）を増幅するための２６個のプライマーがあった。フォワードプライマーの各セット中の各プライマーを等しい割合で混合し、ＶＨのリバースプライマーも等しい割合で混合し、次にフォワードプライマーおよびリバースプライマーを等しい割合で混合して３セットのプライマーを形成し、これらをそれぞれＶＨ、ＫＬＣおよびＬＬＣを増幅するために使用した。例示として、この実施形態ではＫＬＣを例として取り上げ、ＶＨのフォワードプライマーは配列番号３０～５３に示される通りであり、ＶＨのリバースプライマーは配列番号５４～５８に示される通りであり、ＫＬＣのフォワードプライマーは配列番号５９～７６に示される通りであり、ＫＬＣのリバースプライマーは配列番号７７に示される通りであった。
５．１ 抗原特異的ＶＨおよび抗原特異的ＬＣの増幅
制限エンドヌクレアーゼ（Ｅｓｐ３ＩおよびＳｆｉＩ）の認識部位を含むプライマーを設計した。２４個のフォワードプライマーおよび５個のリバースプライマーを含む、抗原特異的ＶＨを増幅するための２９個のプライマーと、１８個のフォワードプライマーおよび１個のリバースプライマーを含む、抗原特異的ＫＬＣ（カッパ軽鎖）を増幅するための１９個のプライマーと、２５個のフォワードプライマーおよび１個のリバースプライマーを含む、抗原特異的ＬＬＣ（ラムダ軽鎖）を増幅するための２６個のプライマーがあった。フォワードプライマーの各セット中の各プライマーを等しい割合で混合し、ＶＨのリバースプライマーも等しい割合で混合し、次にフォワードプライマーおよびリバースプライマーを等しい割合で混合して３セットのプライマーを形成し、これらをそれぞれＶＨ、ＫＬＣおよびＬＬＣを増幅するために使用した。例示として、この実施形態ではＫＬＣを例として取り上げ、ＶＨのフォワードプライマーは配列番号３０～５３に示される通りであり、ＶＨのリバースプライマーは配列番号５４～５８に示される通りであり、ＫＬＣのフォワードプライマーは配列番号５９～７６に示される通りであり、ＫＬＣのリバースプライマーは配列番号７７に示される通りであった。
例４でスクリーニングして得られた３５個の陽性クローンのミニＤＮＡを等量混合し、それぞれ上記３組のプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲで得られた認識部位を有する精製した抗原特異的ＶＨおよび抗原特異的ＬＣ（例としてＫＬＣを有する）を電気泳動で分析した。
５．２ 消化およびライゲーション
例５．１で得られた抗原特異的ＶＨをＥｓｐ３Ｉで消化し、消化後の精製した抗原特異的ＶＨを電気泳動により分析した。例３．１で得られたＶＨ成分ベクターをＥｓｐ３Ｉで消化し、消化後の成分ベクター断片の精製した２．８ｋｂを電気泳動により分析した。精製した抗原特異的ＶＨと２．８ｋｂの成分ベクター断片をライゲーションして、ＲＯＲ１特異的ＶＨ成分ライブラリーを得た。
例５．１で得られた抗原特異的ＶＨをＥｓｐ３Ｉで消化し、消化後の精製した抗原特異的ＶＨを電気泳動により分析した。例３．１で得られたＶＨ成分ベクターをＥｓｐ３Ｉで消化し、消化後の成分ベクター断片の精製した２．８ｋｂを電気泳動により分析した。精製した抗原特異的ＶＨと２．８ｋｂの成分ベクター断片をライゲーションして、ＲＯＲ１特異的ＶＨ成分ライブラリーを得た。
例５．１で得られた抗原特異的ＬＣをＳｆｉＩで消化し、消化後の精製した抗原特異的ＬＣを電気泳動により分析した。例３．２で得られたＬＣ成分ベクターをＳｆｉＩで消化し、消化後の成分ベクター断片の精製した２．８ｋｂを電気泳動により分析した。精製した抗原特異的ＬＣと２．８ｋｂの成分ベクター断片をライゲーションして、ＲＯＲ１特異的ＬＣ成分ライブラリーを得た。
例６ 抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイライブラリーの構築
ＶＨ成分ライブラリーをＥｓｐ３Ｉで消化し、消化後に粘着末端を有する抗原特異的ＶＨ（すなわち、放出された第１のポリヌクレオチド）の精製された０．３５ｋｂを電気泳動によって分析した。ＫＬＣ成分ライブラリーをＳｆｉＩで消化し、消化後に粘着末端を有する抗原特異的ＬＣ（すなわち、放出された第２のポリヌクレオチド）の精製された０．６５ｋｂを電気泳動によって分析した。例１で得られたディスプレイベクターをＥｓｐ３ＩとＳｆｉＩで二重消化し、精製することで、粘着末端を有する３ｋｂのディスプレイベクター断片Ｉ（すなわち、放出された第３のポリヌクレオチド）と、粘着末端を有する５ｋｂのディスプレイベクター断片ＩＩ（すなわち、放出された第４のポリヌクレオチド）を得た。上記消化した４つの断片を等量混合し、総量２５ｎｇの断片を含む１０μｌのライゲーション系で２０℃で４時間ライゲーションし、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを得た。
ＶＨ成分ライブラリーをＥｓｐ３Ｉで消化し、消化後に粘着末端を有する抗原特異的ＶＨ（すなわち、放出された第１のポリヌクレオチド）の精製された０．３５ｋｂを電気泳動によって分析した。ＫＬＣ成分ライブラリーをＳｆｉＩで消化し、消化後に粘着末端を有する抗原特異的ＬＣ（すなわち、放出された第２のポリヌクレオチド）の精製された０．６５ｋｂを電気泳動によって分析した。例１で得られたディスプレイベクターをＥｓｐ３ＩとＳｆｉＩで二重消化し、精製することで、粘着末端を有する３ｋｂのディスプレイベクター断片Ｉ（すなわち、放出された第３のポリヌクレオチド）と、粘着末端を有する５ｋｂのディスプレイベクター断片ＩＩ（すなわち、放出された第４のポリヌクレオチド）を得た。上記消化した４つの断片を等量混合し、総量２５ｎｇの断片を含む１０μｌのライゲーション系で２０℃で４時間ライゲーションし、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを得た。
ライゲーション産物をＰＣＲクリーンアップキットによって精製し、１０μｌのｄｄＨ２Ｏで溶出することによって回収した。４μｌの精製されたライゲーション産物をエレクトロポレーションのために採取し（Ｔａｋａｒａ ＤＨ５ａ、エレクトロポレートしたコンピテント細菌）、プレート上に広げ、３７℃で一晩培養した。コロニー数を数え、ライブラリー容量が２．３×１０５に達した時点で、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーを得た。全てのコロニーを回収し、そこからベクターＤＮＡを抽出して抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイライブラリーを得た。
例７ モノクローナル抗体のスクリーニング
例６で得られた抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイライブラリーからＲＯＲ１特異的結合ポリペプチド発現ベクターＤＮＡを得て、４０μｇのＤＮＡをＦＣＨＯ細胞に形質転換した。形質転換の６０時間後、細胞表面上の全長抗体の発現および抗体のＲＯＲ１抗原特異性をＦＡＣＳによって分析した。図６の結果から、細胞表面にＲＯＲ１全長抗体が発現しており、発現した抗体はＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１（ＦＩＴＣ標識キットで標識したもの）に特異的に結合できることが示された。ビオチン標識なしのＲＯＲ１抗原は、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製（カタログ番号ＲＯ１－Ｈ５２５０－１ｍｇ）であった。図６は、ＰＥ標識マウス抗ヒトκ軽鎖抗体およびＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１抗原で二重染色した細胞、ならびにＦＡＣＳによって分析した細胞表面の蛍光シグナルを示し、Ａは陰性対照を示す。Ｂは、ＲＯＲ１特異的抗体を発現する細胞ライブラリーを示す。
例６で得られた抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイライブラリーからＲＯＲ１特異的結合ポリペプチド発現ベクターＤＮＡを得て、４０μｇのＤＮＡをＦＣＨＯ細胞に形質転換した。形質転換の６０時間後、細胞表面上の全長抗体の発現および抗体のＲＯＲ１抗原特異性をＦＡＣＳによって分析した。図６の結果から、細胞表面にＲＯＲ１全長抗体が発現しており、発現した抗体はＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１（ＦＩＴＣ標識キットで標識したもの）に特異的に結合できることが示された。ビオチン標識なしのＲＯＲ１抗原は、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製（カタログ番号ＲＯ１－Ｈ５２５０－１ｍｇ）であった。図６は、ＰＥ標識マウス抗ヒトκ軽鎖抗体およびＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１抗原で二重染色した細胞、ならびにＦＡＣＳによって分析した細胞表面の蛍光シグナルを示し、Ａは陰性対照を示す。Ｂは、ＲＯＲ１特異的抗体を発現する細胞ライブラリーを示す。
安定に形質転換されたＦＣＨＯ細胞ライブラリーを、ハイグロマイシン（５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン濃度）を用いて加圧下でスクリーニングした。加圧下でハイグロマイシンと共に培養した１０日後、安定に形質転換された細胞ライブラリーが得られた。細胞ライブラリーを、ＰＥ標識マウス抗ヒトκ軽鎖抗体（ＢＤ）およびＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１抗原で二重染色し、ＰＥおよびＦＩＴＣ二重陽性細胞をＦＡＣＳによって選別した。単一細胞クローンを９６ウェルプレートにウェルあたり１つの細胞で加え、加圧下でハイグロマイシンと共に培養した。
加圧下でハイグロマイシンと共に培養した１４日後、安定に形質転換された９２個の単一細胞クローンを得た。細胞を０．５ｍＭのＥＤＴＡ－ＰＢＳ緩衝液で消化した。９２個の単一細胞クローンを、ＰＥ標識マウス抗ヒトκ軽鎖抗体およびＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１抗原（抗原濃度は０．１５ｎｇ／５０μｌ）で二重染色した。
ＦＡＣＳ分析により、７１個のＰＥおよびＦＩＴＣ蛍光二重陽性細胞クローンが得られ、陽性率は７７％（７１／９２＝７７％）であった。
例８ 陽性クローン配列の取得
ＦＡＣＳ分析チャートにおける陽性細胞集団の位置に応じて、抗体遺伝子のＰＣＲ増幅のために、異なる位置にある合計３０個の細胞クローン（異なる親和性を表す）を選択した。陽性クローンの細胞をそれぞれ遠心分離によって回収し、上清を捨て、２０μｌの細胞ゲノム抽出溶液（クイック抽出緩衝液、Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して、試薬の指示に従って細胞ゲノムＤＮＡを抽出した。各クローンから２μｌの細胞ゲノムＤＮＡ抽出物を採取し、各クローンのＶＨおよびＬＣをＰＣＲによって増幅した。ＶＨ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣ（配列番号２４）であり、ＶＨ断片を増幅するためのリバースプライマーはＡＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＣ（配列番号２５）であり、ＬＣ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧ（配列番号２６）であり、ＬＣ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＴＡＡＡＴＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ（配列番号２７）であった。
ＦＡＣＳ分析チャートにおける陽性細胞集団の位置に応じて、抗体遺伝子のＰＣＲ増幅のために、異なる位置にある合計３０個の細胞クローン（異なる親和性を表す）を選択した。陽性クローンの細胞をそれぞれ遠心分離によって回収し、上清を捨て、２０μｌの細胞ゲノム抽出溶液（クイック抽出緩衝液、Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して、試薬の指示に従って細胞ゲノムＤＮＡを抽出した。各クローンから２μｌの細胞ゲノムＤＮＡ抽出物を採取し、各クローンのＶＨおよびＬＣをＰＣＲによって増幅した。ＶＨ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣ（配列番号２４）であり、ＶＨ断片を増幅するためのリバースプライマーはＡＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＣ（配列番号２５）であり、ＬＣ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧ（配列番号２６）であり、ＬＣ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＴＡＡＡＴＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ（配列番号２７）であった。
ＰＣＲによって増幅されたＶＨおよびＬＣ断片を電気泳動によって単離および精製した。精製されたＶＨおよびＬＣ断片を配列決定によって分析し、１４個のユニークＶＨおよび１３個のユニークＬＣを決定し、これらを組み合わせることにより、ユニーク配列を有する１７個の陽性クローンを得ることができる（軽鎖および重鎖の６つのＣＤＲは、少なくとも１つのアミノ酸によって異なっていた）。一例として、ＶＨおよびＬＣの一対のユニーク配列をここに列挙し、ユニーク配列のＶＨアミノ酸配列は配列番号２８に示す通りであり、ユニーク配列のカッパＬＣアミノ酸配列は配列番号２９に示す通りであった。
例９ 抗体親和性の分析
例８で得られたユニーク配列を有する陽性ＶＨ断片をＥｓｐ３Ｉで消化し、例８で得られたユニーク配列を有する陽性ＬＣ断片をＳｆｉＩで消化した。消化したＶＨおよびＬＣ断片をＰＣＲクリーンアップによって精製した。ＶＨ断片およびＬＣ断片を可溶性重鎖発現ベクターに別々に挿入し、コロニーを配列決定によって決定した。シーケンシングによって決定したＶＨおよびＬＣ発現ベクターのＤＮＡを抽出した。
例８で得られたユニーク配列を有する陽性ＶＨ断片をＥｓｐ３Ｉで消化し、例８で得られたユニーク配列を有する陽性ＬＣ断片をＳｆｉＩで消化した。消化したＶＨおよびＬＣ断片をＰＣＲクリーンアップによって精製した。ＶＨ断片およびＬＣ断片を可溶性重鎖発現ベクターに別々に挿入し、コロニーを配列決定によって決定した。シーケンシングによって決定したＶＨおよびＬＣ発現ベクターのＤＮＡを抽出した。
２９３個のＥＸＰ細胞を懸濁培養によって増幅し、例８で決定した軽鎖および重鎖の対合に従って、合計１７個の抗体軽鎖および重鎖発現ベクターの対を形成した。各対を軽鎖発現ベクター１８μｇと重鎖発現ベクター１２μｇの比率で混合し、３０ｍｌの懸濁２９３ＥＸＰ細胞の形質転換に用いた（１．２×１０６／ｍｌ）。形質転換の６日目に培養上清を回収し、抗体をＧｅｎＳｃｒｉｐｔの磁気ビーズ（カタログ番号Ｌ００６９５）で製品説明書に従って精製し、ＰＢＳ－抗体溶液への透析によって平衡化し、－８０℃で保存した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ変性ゲル電気泳動（図７）を用いて分析を行ったところ、抗体純度は９０％を超えていた。抗原に対する精製抗体の結合親和性をＥＬＩＳＡによって分析し、８つの例示的抗体のＥＣ５０をここに例示のために列挙し、結果を以下の表４に示す。
例１０ 抗原特異的ポリペプチドの迅速なスクリーニング
例４のファージライブラリーからスクリーニングすることによって得られた陽性クローンのＥＬＩＳＡデータに従って、０．８を超えるＥＬＩＳＡ読み取り値を有する１５個のクローンを表３－１および表３－２から選択した。等量の細菌液と混合した後、ベクターＤＮＡをミニ抽出した。例５の手順に従って、１５個のクローンの抗原特異的ＶＨおよび抗原特異的ＬＣをそれぞれＰＣＲにより増幅し、消化により精製した。例６の手順に従って、抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイライブラリーを構築した。次に、４８個のコロニーをランダムに選別し、配列決定のために送った。配列決定結果を分析した後、正しいＶＨおよびＬＣを有する３６個のクローンを選別し、そこからベクターＤＮＡをミニ抽出し、ＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトした。６０時間後、細胞を０．５ｍＭのＥＤＴＡ－ＰＢＳ緩衝液で消化した。３６個の細胞集団を、ＰＥ標識マウス抗ヒトκ軽鎖抗体およびＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１抗原（抗原濃度は０．１５ｎｇ／５０μｌ）で二重染色した。ＦＡＣＳ解析結果を図８に示した。６個のＰＥおよびＦＩＴＣ二重陽性細胞クローンが得られ、陽性率は１７％（６／３６）であった。図８は、ＰＥ標識マウス抗ヒトκ軽鎖抗体およびＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１抗原で二重染色した細胞、ならびにＦＡＣＳによって分析した細胞表面の蛍光シグナルを示す。Ａは陰性対照を示す。Ｂは、非ＲＯＲ１特異的抗体を発現する細胞クローンを示す。Ｃ～Ｈは、ＲＯＲ１特異的抗体を発現する６個の例示的な陽性細胞クローンを示す。
例４のファージライブラリーからスクリーニングすることによって得られた陽性クローンのＥＬＩＳＡデータに従って、０．８を超えるＥＬＩＳＡ読み取り値を有する１５個のクローンを表３－１および表３－２から選択した。等量の細菌液と混合した後、ベクターＤＮＡをミニ抽出した。例５の手順に従って、１５個のクローンの抗原特異的ＶＨおよび抗原特異的ＬＣをそれぞれＰＣＲにより増幅し、消化により精製した。例６の手順に従って、抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイライブラリーを構築した。次に、４８個のコロニーをランダムに選別し、配列決定のために送った。配列決定結果を分析した後、正しいＶＨおよびＬＣを有する３６個のクローンを選別し、そこからベクターＤＮＡをミニ抽出し、ＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトした。６０時間後、細胞を０．５ｍＭのＥＤＴＡ－ＰＢＳ緩衝液で消化した。３６個の細胞集団を、ＰＥ標識マウス抗ヒトκ軽鎖抗体およびＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１抗原（抗原濃度は０．１５ｎｇ／５０μｌ）で二重染色した。ＦＡＣＳ解析結果を図８に示した。６個のＰＥおよびＦＩＴＣ二重陽性細胞クローンが得られ、陽性率は１７％（６／３６）であった。図８は、ＰＥ標識マウス抗ヒトκ軽鎖抗体およびＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１抗原で二重染色した細胞、ならびにＦＡＣＳによって分析した細胞表面の蛍光シグナルを示す。Ａは陰性対照を示す。Ｂは、非ＲＯＲ１特異的抗体を発現する細胞クローンを示す。Ｃ～Ｈは、ＲＯＲ１特異的抗体を発現する６個の例示的な陽性細胞クローンを示す。
配列表１ ＜２２３＞ＤＤＢ２１４
配列表２ ＜２２３＞ＤＤＢ２１５
配列表３ ＜２２３＞ＤＤＢ２１６
配列表４ ＜２２３＞ＤＤＢ２１７
配列表５ ＜２２３＞ＰＤ１－ＬＣ
配列表６ ＜２２３＞ＰＤ１－ＶＨ
配列表７ ＜２２３＞ｐＤＧＢ４
配列表８ ＜２２３＞Ｂ２
配列表９ ＜２２３＞Ｂ３
配列表１０ ＜２２３＞Ｓ５
配列表１１ ＜２２３＞Ｓ６
配列表１２～１３ ＜２２３＞ＳＰ１
配列表１４～１５ ＜２２３＞ＳＰ２
配列表１６ ＜２２３＞Ｐ１
配列表１７ ＜２２３＞Ｐ２
配列表１８ ＜２２３＞Ｐ３
配列表１９ ＜２２３＞Ｐ４
配列表２０ ＜２２３＞Ｐ５
配列表２１ ＜２２３＞Ｐ６
配列表２２ ＜２２３＞Ｐ７
配列表２３ ＜２２３＞Ｐ８
配列表２４ ＜２２３＞ＶＨ断片フォワードプライマー
配列表２５ ＜２２３＞ＶＨ断片リバースプライマー
配列表２６ ＜２２３＞ＬＣ断片フォワードプライマー
配列表２７ ＜２２３＞ＬＣ断片リバースプライマー
配列表２８ ＜２２３＞抗原結合ペプチドＶＨ
配列表２９ ＜２２３＞抗原結合ペプチドＫＬＣ
配列表３０ ＜２２３＞第１のＶＨフォワードプライマー
配列表３１ ＜２２３＞第２のＶＨフォワードプライマー
配列表３２ ＜２２３＞第３のＶＨフォワードプライマー
配列表３３ ＜２２３＞第４のＶＨフォワードプライマー
配列表３４ ＜２２３＞第５のＶＨフォワードプライマー
配列表３５ ＜２２３＞第６のＶＨフォワードプライマー
配列表３６ ＜２２３＞第７のＶＨフォワードプライマー
配列表３７ ＜２２３＞第８のＶＨフォワードプライマー
配列表３８ ＜２２３＞第９のＶＨフォワードプライマー
配列表３９ ＜２２３＞第１０のＶＨフォワードプライマー
配列表４０ ＜２２３＞第１１のＶＨフォワードプライマー
配列表４１ ＜２２３＞第１２のＶＨフォワードプライマー
配列表４２ ＜２２３＞第１３のＶＨフォワードプライマー
配列表４３ ＜２２３＞第１４のＶＨフォワードプライマー
配列表４４ ＜２２３＞第１５のＶＨフォワードプライマー
配列表４５ ＜２２３＞第１６のＶＨフォワードプライマー
配列表４６ ＜２２３＞第１７のＶＨフォワードプライマー
配列表４７ ＜２２３＞第１８のＶＨフォワードプライマー
配列表４８ ＜２２３＞第１９のＶＨフォワードプライマー
配列表４９ ＜２２３＞第２０のＶＨフォワードプライマー
配列表５０ ＜２２３＞第２１のＶＨフォワードプライマー
配列表５１ ＜２２３＞第２２のＶＨフォワードプライマー
配列表５２ ＜２２３＞第２３のＶＨフォワードプライマー
配列表５３ ＜２２３＞第２４のＶＨフォワードプライマー
配列表５４ ＜２２３＞第１のＶＨリバースプライマー
配列表５５ ＜２２３＞第２のＶＨリバースプライマー
配列表５６ ＜２２３＞第３のＶＨリバースプライマー
配列表５７ ＜２２３＞第４のＶＨリバースプライマー
配列表５８ ＜２２３＞第５のＶＨリバースプライマー
配列表５９ ＜２２３＞第１のＬＣフォワードプライマー
配列表６０ ＜２２３＞第２のＬＣフォワードプライマー
配列表６１ ＜２２３＞第３のＬＣフォワードプライマー
配列表６２ ＜２２３＞第４のＬＣフォワードプライマー
配列表６３ ＜２２３＞第５のＬＣフォワードプライマー
配列表６４ ＜２２３＞第６のＬＣフォワードプライマー
配列表６５ ＜２２３＞第７のＬＣフォワードプライマー
配列表６６ ＜２２３＞第８のＬＣフォワードプライマー
配列表６７ ＜２２３＞第９のＬＣフォワードプライマー
配列表６８ ＜２２３＞第１０のＬＣフォワードプライマー
配列表６９ ＜２２３＞第１１のＬＣフォワードプライマー
配列表７０ ＜２２３＞第１２のＬＣフォワードプライマー
配列表７１ ＜２２３＞第１３のＬＣフォワードプライマー
配列表７２ ＜２２３＞第１４のＬＣフォワードプライマー
配列表７３ ＜２２３＞第１５のＬＣフォワードプライマー
配列表７４ ＜２２３＞第１６のＬＣフォワードプライマー
配列表７５ ＜２２３＞第１７のＬＣフォワードプライマー
配列表７６ ＜２２３＞第１８のＬＣフォワードプライマー
配列表７７ ＜２２３＞ＬＣリバースプライマー
配列表７８ ＜２２３＞Ｒ１またはＲ８
配列表７９ ＜２２３＞Ｒ２またはＲ３
配列表８０ ＜２２３＞Ｒ４またはＲ５
配列表８１ ＜２２３＞Ｒ６またはＲ７
配列表８２～９９ ＜２２３＞軽鎖ＫＬＣのフォワードプライマー
配列表１００ ＜２２３＞軽鎖ＫＬＣのリバースプライマー
配列表１０１～１２５ ＜２２３＞軽鎖ＬＬＣのフォワードプライマー
配列表１２６ ＜２２３＞軽鎖ＬＬＣのリバースプライマー
配列表１２７～１５０ ＜２２３＞ＶＨのフォワードプライマー
配列表１５１～１５５ ＜２２３＞ＶＨのリバースプライマー
配列表１５６ ＜２２３＞リンカーのフォワードプライマー
配列表１５７ ＜２２３＞リンカーのリバースプライマー
配列表１５８ ＜２２３＞Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２のフォワードプライマー
配列表１５９ ＜２２３＞Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２のリバースプライマー
配列表１６０ ＜２２３＞Ｒ３－リンカー－Ｒ４のフォワードプライマー
配列表１６１ ＜２２３＞Ｒ３－リンカー－Ｒ４のリバースプライマー
配列表１６２ ＜２２３＞Ｒ５－１ｋｂ－Ｒ６のフォワードプライマー
配列表１６３ ＜２２３＞Ｒ５－１ｋｂ－Ｒ６のリバースプライマー
配列表１６５ ＜２２３＞Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２
配列表１６６ ＜２２３＞７２ｂｐ－ロングリンカー
配列表１６７ ＜２２３＞Ｒ３－リンカー（７２ｂｐ）－Ｒ４
配列表１６８ ＜２２３＞Ｒ５－１ｋｂ－Ｒ６
配列表１６９ ＜２２３＞ｐＵＣ１９ベクターの変異のフォワードプライマー
配列表１７０ ＜２２３＞ｐＵＣ１９ベクターの変異のリバースプライマー
配列表１７１ ＜２２３＞９０ｂｐロングリンカー
配列表１７２ ＜２２３＞Ｒ３－リンカー（９０ｂｐ）－Ｒ４
配列表１７３～１７４ ＜２２３＞９０ｂｐリンカーのフォワードプライマー
配列表１７５ ＜２２３＞９０ｂｐリンカーのリバースプライマー
配列表２ ＜２２３＞ＤＤＢ２１５
配列表３ ＜２２３＞ＤＤＢ２１６
配列表４ ＜２２３＞ＤＤＢ２１７
配列表５ ＜２２３＞ＰＤ１－ＬＣ
配列表６ ＜２２３＞ＰＤ１－ＶＨ
配列表７ ＜２２３＞ｐＤＧＢ４
配列表８ ＜２２３＞Ｂ２
配列表９ ＜２２３＞Ｂ３
配列表１０ ＜２２３＞Ｓ５
配列表１１ ＜２２３＞Ｓ６
配列表１２～１３ ＜２２３＞ＳＰ１
配列表１４～１５ ＜２２３＞ＳＰ２
配列表１６ ＜２２３＞Ｐ１
配列表１７ ＜２２３＞Ｐ２
配列表１８ ＜２２３＞Ｐ３
配列表１９ ＜２２３＞Ｐ４
配列表２０ ＜２２３＞Ｐ５
配列表２１ ＜２２３＞Ｐ６
配列表２２ ＜２２３＞Ｐ７
配列表２３ ＜２２３＞Ｐ８
配列表２４ ＜２２３＞ＶＨ断片フォワードプライマー
配列表２５ ＜２２３＞ＶＨ断片リバースプライマー
配列表２６ ＜２２３＞ＬＣ断片フォワードプライマー
配列表２７ ＜２２３＞ＬＣ断片リバースプライマー
配列表２８ ＜２２３＞抗原結合ペプチドＶＨ
配列表２９ ＜２２３＞抗原結合ペプチドＫＬＣ
配列表３０ ＜２２３＞第１のＶＨフォワードプライマー
配列表３１ ＜２２３＞第２のＶＨフォワードプライマー
配列表３２ ＜２２３＞第３のＶＨフォワードプライマー
配列表３３ ＜２２３＞第４のＶＨフォワードプライマー
配列表３４ ＜２２３＞第５のＶＨフォワードプライマー
配列表３５ ＜２２３＞第６のＶＨフォワードプライマー
配列表３６ ＜２２３＞第７のＶＨフォワードプライマー
配列表３７ ＜２２３＞第８のＶＨフォワードプライマー
配列表３８ ＜２２３＞第９のＶＨフォワードプライマー
配列表３９ ＜２２３＞第１０のＶＨフォワードプライマー
配列表４０ ＜２２３＞第１１のＶＨフォワードプライマー
配列表４１ ＜２２３＞第１２のＶＨフォワードプライマー
配列表４２ ＜２２３＞第１３のＶＨフォワードプライマー
配列表４３ ＜２２３＞第１４のＶＨフォワードプライマー
配列表４４ ＜２２３＞第１５のＶＨフォワードプライマー
配列表４５ ＜２２３＞第１６のＶＨフォワードプライマー
配列表４６ ＜２２３＞第１７のＶＨフォワードプライマー
配列表４７ ＜２２３＞第１８のＶＨフォワードプライマー
配列表４８ ＜２２３＞第１９のＶＨフォワードプライマー
配列表４９ ＜２２３＞第２０のＶＨフォワードプライマー
配列表５０ ＜２２３＞第２１のＶＨフォワードプライマー
配列表５１ ＜２２３＞第２２のＶＨフォワードプライマー
配列表５２ ＜２２３＞第２３のＶＨフォワードプライマー
配列表５３ ＜２２３＞第２４のＶＨフォワードプライマー
配列表５４ ＜２２３＞第１のＶＨリバースプライマー
配列表５５ ＜２２３＞第２のＶＨリバースプライマー
配列表５６ ＜２２３＞第３のＶＨリバースプライマー
配列表５７ ＜２２３＞第４のＶＨリバースプライマー
配列表５８ ＜２２３＞第５のＶＨリバースプライマー
配列表５９ ＜２２３＞第１のＬＣフォワードプライマー
配列表６０ ＜２２３＞第２のＬＣフォワードプライマー
配列表６１ ＜２２３＞第３のＬＣフォワードプライマー
配列表６２ ＜２２３＞第４のＬＣフォワードプライマー
配列表６３ ＜２２３＞第５のＬＣフォワードプライマー
配列表６４ ＜２２３＞第６のＬＣフォワードプライマー
配列表６５ ＜２２３＞第７のＬＣフォワードプライマー
配列表６６ ＜２２３＞第８のＬＣフォワードプライマー
配列表６７ ＜２２３＞第９のＬＣフォワードプライマー
配列表６８ ＜２２３＞第１０のＬＣフォワードプライマー
配列表６９ ＜２２３＞第１１のＬＣフォワードプライマー
配列表７０ ＜２２３＞第１２のＬＣフォワードプライマー
配列表７１ ＜２２３＞第１３のＬＣフォワードプライマー
配列表７２ ＜２２３＞第１４のＬＣフォワードプライマー
配列表７３ ＜２２３＞第１５のＬＣフォワードプライマー
配列表７４ ＜２２３＞第１６のＬＣフォワードプライマー
配列表７５ ＜２２３＞第１７のＬＣフォワードプライマー
配列表７６ ＜２２３＞第１８のＬＣフォワードプライマー
配列表７７ ＜２２３＞ＬＣリバースプライマー
配列表７８ ＜２２３＞Ｒ１またはＲ８
配列表７９ ＜２２３＞Ｒ２またはＲ３
配列表８０ ＜２２３＞Ｒ４またはＲ５
配列表８１ ＜２２３＞Ｒ６またはＲ７
配列表８２～９９ ＜２２３＞軽鎖ＫＬＣのフォワードプライマー
配列表１００ ＜２２３＞軽鎖ＫＬＣのリバースプライマー
配列表１０１～１２５ ＜２２３＞軽鎖ＬＬＣのフォワードプライマー
配列表１２６ ＜２２３＞軽鎖ＬＬＣのリバースプライマー
配列表１２７～１５０ ＜２２３＞ＶＨのフォワードプライマー
配列表１５１～１５５ ＜２２３＞ＶＨのリバースプライマー
配列表１５６ ＜２２３＞リンカーのフォワードプライマー
配列表１５７ ＜２２３＞リンカーのリバースプライマー
配列表１５８ ＜２２３＞Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２のフォワードプライマー
配列表１５９ ＜２２３＞Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２のリバースプライマー
配列表１６０ ＜２２３＞Ｒ３－リンカー－Ｒ４のフォワードプライマー
配列表１６１ ＜２２３＞Ｒ３－リンカー－Ｒ４のリバースプライマー
配列表１６２ ＜２２３＞Ｒ５－１ｋｂ－Ｒ６のフォワードプライマー
配列表１６３ ＜２２３＞Ｒ５－１ｋｂ－Ｒ６のリバースプライマー
配列表１６５ ＜２２３＞Ｒ１－１ｋｂ－Ｒ２
配列表１６６ ＜２２３＞７２ｂｐ－ロングリンカー
配列表１６７ ＜２２３＞Ｒ３－リンカー（７２ｂｐ）－Ｒ４
配列表１６８ ＜２２３＞Ｒ５－１ｋｂ－Ｒ６
配列表１６９ ＜２２３＞ｐＵＣ１９ベクターの変異のフォワードプライマー
配列表１７０ ＜２２３＞ｐＵＣ１９ベクターの変異のリバースプライマー
配列表１７１ ＜２２３＞９０ｂｐロングリンカー
配列表１７２ ＜２２３＞Ｒ３－リンカー（９０ｂｐ）－Ｒ４
配列表１７３～１７４ ＜２２３＞９０ｂｐリンカーのフォワードプライマー
配列表１７５ ＜２２３＞９０ｂｐリンカーのリバースプライマー
本出願において、「第２のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有し得る、抗原特異的ＬＣを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ５－抗原特異的ＬＣ－Ｓ６を含むことができ、Ｓ５、Ｓ６は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第２のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳ５およびＳ６を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、放出された第２のポリヌクレオチドは、抗原特異的ＬＣを含むことができ、抗原特異的ＬＣはまた、切断後に特異的配列の粘着性末端をその２つの末端に有することもできる。
本出願において、「第７のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができる、抗原特異的ＬＣを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第７のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ抗原特異的ＬＣ－Ｓを含むことができ、Ｓは制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得、制限エンドヌクレアーゼはＳ５および／またはＳ６を認識することができる制限エンドヌクレアーゼであり得る。切断された第７のポリヌクレオチドは、第７のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、抗原特異的ＬＣを含むことができる。
本出願において、「ＬＣ成分ベクター」という用語は、一般に、第８のポリヌクレオチドおよび／またはＬＣ成分ベクターツール断片を含む環状ポリヌクレオチドを指す。
本出願において、「ディスプレイベクター」という用語は、一般に、ディスプレイＶＨおよびディスプレイＬＣをさらに含み得る、ディスプレイベクター断片Ｉおよびディスプレイベクター断片ＩＩを含む環状ポリヌクレオチドを指す。処理後、ディスプレイベクターは、第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび／または第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを放出することができる。
本出願において、「第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができるディスプレイＬＣを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ５－ディスプレイＬＣ－Ｓ６を含むことができ、Ｓ５、Ｓ６は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳ５およびＳ６を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドはディスプレイＬＣを含むことができ、ディスプレイＬＣは、切断後に特定の配列の粘着末端をその２つの末端に有することもできる。
本出願において、「第３のディスプレイベクターポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができる、ディスプレイベクター断片Ｉを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ３－ディスプレイベクター断片Ｉ－Ｓ５を含むことができ、Ｂ３、Ｓ５は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第３のディスプレイベクターポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳ５を認識する制限エンドヌクレアーゼ、またはＢｓｍＢＩおよび／もしくはＥｓｐ３ＩなどのＢ３を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、ディスプレイベクター断片Ｉを含むことができ、これはまた、切断後に特定の配列の粘着末端をその２つの末端に有することができる。
本出願において、「第４のディスプレイベクターポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）の認識部位を有することができる、ディスプレイベクター断片ＩＩを含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ６－ディスプレイベクター断片ＩＩ－Ｂ２を含むことができ、Ｓ６、Ｂ２は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。例えば、第４のディスプレイベクターポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなどのＳ６を認識する制限エンドヌクレアーゼ、またはＢｓｍＢＩおよび／もしくはＥｓｐ３ＩなどのＢ２を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、ディスプレイベクター断片ＩＩを含むことができ、これはまた、切断後に特定の配列の粘着末端をその２つの末端に有することができる。
本出願において、「第１０の細菌」という用語は、一般に、第１０のヌクレオチドを導入または含む細菌を指す。第１０の細菌は、ＬＣ成分ベクターを含むことができる。本出願では、第１０の細菌は、第１０のヌクレオチドおよび／またはＬＣ成分ベクターを発現、複製および／または保存（例えば、凍結保存）することができる。本出願では、第１０の細菌から、ＬＣ成分ベクターを含むＬＣ成分ベクター保存プラスミドを得ることができる。
本出願において、「第６のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に対する認識部位を有することができるＶＨ成分ベクターライゲーション断片を含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第６のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＢ３－ＶＨ成分ベクターライゲーション断片Ｂ２を含むことができ、Ｂ３、Ｂ２は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。第６のポリヌクレオチドは、ＶＨ成分ベクターに含めることができる。第６のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３ＩなどのＢ３およびＢ２を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、第６のポリヌクレオチドは放出され得る。放出された第６のポリヌクレオチドは、抗原特異的ＶＨを含むことができ、これはまた、その２つの末端において切断後に特異的配列の粘着性末端を有することができる。
本出願において、「放出された第６のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、ＶＨ成分ベクターで処理された後に放出された第６のポリヌクレオチドの断片を指す。本出願では、処理は制限エンドヌクレアーゼによる消化であり得る。例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｓｍＢＩおよび／またはＥｓｐ３Ｉ）を、放出された第６のポリヌクレオチドがＶＨ成分ベクターから放出され、単離され得るように、ＶＨ成分ベクター上の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位のために選択することができる。
本出願において、「第８のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、５’末端および／または３’末端にエンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に対する認識部位を有することができるＬＣ成分ベクターライゲーション断片を含むポリヌクレオチドを指す。例えば、第８のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ６－ＬＣ成分ベクターライゲーション断片Ｓ５を含むことができ、Ｓ６、Ｓ５は制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得る。第８のポリヌクレオチドは、ＬＣ成分ベクターに含めることができる。第８のポリヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩなど、Ｓ６およびＳ５を認識する制限エンドヌクレアーゼ）で消化された後、第８のポリヌクレオチドは放出され得る。放出された第８のポリヌクレオチドは、抗原特異的ＬＣを含むことができ、これはまた、その２つの末端において切断後に特異的配列の粘着性末端を有することができる。
本出願において、「放出された第８のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、ＬＣ成分ベクターで処理された後に放出された第８のポリヌクレオチドの断片を指す。本出願では、処理は制限エンドヌクレアーゼによる消化であり得る。例えば、放出された第８のポリヌクレオチドがＬＣ成分ベクターから放出され、単離され得るように、適切な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｆｉＩ）を、ＬＣ成分ベクター上の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位のために選択することができる。
本出願において、「ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリー」という用語は、一般に、第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第４のディスプレイ細菌に導入することによって得られる細菌ライブラリーを指す。本出願では、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーは、ディスプレイベクター成分ＩＩをコードする核酸配列を含む細菌ライブラリーであり得る。本出願において、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーは、ディスプレイＬＣをコードする核酸配列を約１０５～約１０９含むことができる（例えば、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、約１０６～約１０７含むことができる）。本出願において、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーは、第４のディスプレイ細菌を約１０７～約１０１２含むことができる（例えば、約１０７～約１０１１、約１０７～約１０１０、約１０７～約１０９、約１０７～約１０８含むことができる）。
処理（例えば消化）された後、ＬＣ成分ベクターは、その５’および３’末端において切断後に生成された特定の配列の粘着性末端を有することができる放出された第８のポリヌクレオチドを生成することができる。
第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドは、５’から３’の方向にＳ５－ディスプレイＬＣ－Ｓ６を含むことができ、Ｓ５およびＳ６は各々独立して制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり得、ディスプレイＬＣは抗原結合ポリペプチドの軽鎖をコードし得る。場合によっては、Ｓ５およびＳ６は、それぞれＳｆｉＩによって特異的に認識および切断され得る。例えば、Ｓ５は、配列番号１０に示される核酸配列を含み得、Ｓ６は、配列番号１１に示される核酸配列を含み得る。
いくつかの場合、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを細菌に導入して、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーを得ることができる。
本方法は、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを細胞に導入することと、細胞から抗原特異的結合ポリペプチドを取得することとをさらに含み得る。例えば、細胞は哺乳動物細胞であり得る。次に、抗原特異的結合ポリペプチドを細胞から得ることができる。
３．２ ＬＣ成分ベクター
長さ１ｋｂのヒトＩｇＧ１ Ｆｃを鋳型として使用し、プライマーＤＤＢ２１６およびＤＤＢ２１７を用いてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後、ＰＣＲ産物Ｓ５－ＫＢ－Ｓ６が得られ、ＤＤＢ２１６のヌクレオチド配列は配列番号３に示す通りであり、ＤＤＢ２１７のヌクレオチド配列は配列番号４に示す通りであった。発現成分ベクターであるｐＭＤ１９ベクターにＳ５－ＫＢ－Ｓ６を挿入し、ＬＣ成分ベクター保存プラスミドを得た。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏ．）をＬＣ成分ベクター保存プラスミドで形質転換し、プレート上で３７℃にて一晩培養した。コロニーを配列決定のために選別して、正しい配列を含むＬＣ成分ベクターを決定した。ＬＣ成分ベクターの構造を図４に示した。
長さ１ｋｂのヒトＩｇＧ１ Ｆｃを鋳型として使用し、プライマーＤＤＢ２１６およびＤＤＢ２１７を用いてＰＣＲを行った。ゲル電気泳動による精製および回収の後、ＰＣＲ産物Ｓ５－ＫＢ－Ｓ６が得られ、ＤＤＢ２１６のヌクレオチド配列は配列番号３に示す通りであり、ＤＤＢ２１７のヌクレオチド配列は配列番号４に示す通りであった。発現成分ベクターであるｐＭＤ１９ベクターにＳ５－ＫＢ－Ｓ６を挿入し、ＬＣ成分ベクター保存プラスミドを得た。ＴＧ１コンピテント細菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏ．）をＬＣ成分ベクター保存プラスミドで形質転換し、プレート上で３７℃にて一晩培養した。コロニーを配列決定のために選別して、正しい配列を含むＬＣ成分ベクターを決定した。ＬＣ成分ベクターの構造を図４に示した。
例８ 陽性クローン配列の取得
ＦＡＣＳ分析チャートにおける陽性細胞集団の位置に応じて、抗体遺伝子のＰＣＲ増幅のために、異なる位置にある合計３０個の細胞クローン（異なる親和性を表す）を選択した。陽性クローンの細胞をそれぞれ遠心分離によって回収し、上清を捨て、２０μｌの細胞ゲノム抽出溶液（クイック抽出緩衝液、Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して、試薬の指示に従って細胞ゲノムＤＮＡを抽出した。各クローンから２μｌの細胞ゲノムＤＮＡ抽出物を採取し、各クローンのＶＨおよびＬＣをＰＣＲによって増幅した。ＶＨ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣ（配列番号２４）であり、ＶＨ断片を増幅するためのリバースプライマーはＡＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＣ（配列番号２５）であり、ＬＣ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧ（配列番号２６）であり、ＬＣ断片を増幅するためのリバースプライマーはＴＡＡＡＴＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ（配列番号２７）であった。
ＦＡＣＳ分析チャートにおける陽性細胞集団の位置に応じて、抗体遺伝子のＰＣＲ増幅のために、異なる位置にある合計３０個の細胞クローン（異なる親和性を表す）を選択した。陽性クローンの細胞をそれぞれ遠心分離によって回収し、上清を捨て、２０μｌの細胞ゲノム抽出溶液（クイック抽出緩衝液、Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して、試薬の指示に従って細胞ゲノムＤＮＡを抽出した。各クローンから２μｌの細胞ゲノムＤＮＡ抽出物を採取し、各クローンのＶＨおよびＬＣをＰＣＲによって増幅した。ＶＨ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣ（配列番号２４）であり、ＶＨ断片を増幅するためのリバースプライマーはＡＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＣ（配列番号２５）であり、ＬＣ断片を増幅するためのフォワードプライマーはＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧ（配列番号２６）であり、ＬＣ断片を増幅するためのリバースプライマーはＴＡＡＡＴＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ（配列番号２７）であった。
Claims (66)
- ａ）５’から３’の方向にＢ２－ディスプレイＶＨ－Ｂ３を含む第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを提供するステップと、
ｂ）５’から３’の方向にＳ５－ディスプレイＬＣ－Ｓ６を含む第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを提供するステップと、
ｃ）５’から３’の方向にＢ３－ディスプレイベクター断片Ｉ－Ｓ５を含む第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを提供するステップと、
ｄ）５’から３’の方向にＳ６－ディスプレイベクター断片ＩＩ－Ｂ２を含む第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを提供するステップと、
ｅ）前記第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、前記第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、前記第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび前記第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼで特異的に切断して、切断された第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得るステップであって、前記制限エンドヌクレアーゼが、それぞれＢ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６を特異的に認識するステップと、
ｆ）前記切断された第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、前記切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、前記切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび前記切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを混合して、それらを、方向性を持ってライゲーションし、環化して、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを形成するステップと
を含み、
前記ディスプレイＶＨが抗原特異的結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードし、前記ディスプレイＬＣが抗原特異的結合ポリペプチドの軽鎖をコードし、
前記Ｂ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６が、各々独立して、前記制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位である、
抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターの構築方法。 - 前記Ｂ２を特異的に認識する前記制限エンドヌクレアーゼによる前記Ｂ２の特異的切断から生成された末端が、前記Ｂ３、Ｓ５およびＳ６のいずれか１つの対応する制限エンドヌクレアーゼによる特異的切断から生成された末端を認識しないか、または互いに連結しない、請求項１に記載の方法。
- 前記Ｂ３を特異的に認識する前記制限エンドヌクレアーゼによる前記Ｂ３の特異的切断から生成された末端が、前記Ｂ２、Ｓ５およびＳ６のいずれか１つの対応する制限エンドヌクレアーゼによる特異的切断から生成された末端を認識しないか、または互いに連結しない、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｓ５を特異的に認識する前記制限エンドヌクレアーゼによる前記Ｓ５の特異的切断から生成された末端が、前記Ｂ２、Ｂ３およびＳ６のいずれか１つの対応する制限エンドヌクレアーゼによる特異的切断から生成された末端を認識しないか、または互いに連結しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｓ６を特異的に認識する前記制限エンドヌクレアーゼによる前記Ｓ６の特異的切断から生成された末端が、前記Ｂ２、Ｂ３およびＳ５のいずれか１つの対応する制限エンドヌクレアーゼによる特異的切断から生成された末端を認識しないか、または互いに連結しない、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記制限エンドヌクレアーゼが、ＳｆｉＩ、Ｅｓｐ３ＩおよびＢｓｍＢＩから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｂ２およびＢ３が、ＢｓｍＢＩおよびＥｓｐ３Ｉからなる群から選択される酵素によって特異的に認識および切断され得る、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｓ５およびＳ６が、Ｓｆｉｌによって特異的に認識および切断され得る、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｂ２が、配列番号８に示される核酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｂ３が、配列番号９に示される核酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｓ５が、配列番号１０に示される核酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｓ６が、配列番号１１に示される核酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第１のディスプレイ細菌に導入して、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーを得るステップをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ成分ベクターに挿入して、ディスプレイＶＨ保存ライゲーション産物を形成するステップと、前記ディスプレイＶＨ保存ライゲーション産物を前記第１のディスプレイ細菌に導入して、ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーを得るステップとを含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第２のディスプレイ細菌に導入して、ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーを得るステップをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ成分ベクターに挿入して、ディスプレイＬＣ保存ライゲーション産物を形成するステップと、前記ディスプレイＬＣ保存ライゲーション産物を前記第２のディスプレイ細菌に導入して、前記ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーを得るステップとを含む、請求項１５に記載の方法。
- 前記第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第３のディスプレイ細菌に導入して、ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーを得るステップをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ成分ベクターに挿入して、ディスプレイベクター断片Ｉ保存ライゲーション産物を形成するステップと、前記保存ライゲーション産物を前記第３のディスプレイ細菌に導入して、前記ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーを得るステップとを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを第４のディスプレイ細菌に導入して、ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーを得るステップをさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドをディスプレイ成分ベクターに挿入して、ディスプレイベクター断片ＩＩ保存ライゲーション産物を形成するステップと、前記保存ライゲーション産物を前記第４のディスプレイ細菌に導入して、前記ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーを得るステップとを含む、請求項１９に記載の方法。
- 前記ディスプレイベクター成分ベクターがｐＵＣベクターに由来する、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｐＵＣベクターがｐＵＣ１９ベクターであるか、またはｐＵＣ１９ベクターに由来する、請求項２１に記載の方法。
- 前記ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーから前記第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを含むディスプレイＶＨ成分プラスミドを取得するステップと、前記ディスプレイＶＨ成分プラスミドから前記切断された第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを取得するステップとをさらに含む、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイＶＨ成分プラスミドを、前記Ｂ２およびＢ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記切断された第１のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項１３～２３に記載の方法。
- 前記ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーから前記第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを含むディスプレイＬＣ成分プラスミドを取得するステップと、前記ディスプレイＬＣ成分プラスミドから前記切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを取得するステップとをさらに含む、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイＬＣ成分プラスミドを、前記Ｓ５およびＳ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記切断された第２のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項１５～２５に記載の方法。
- 前記ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーから前記第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを含むディスプレイ断片成分プラスミドＩを取得するステップと、前記ディスプレイ断片成分プラスミドＩから前記切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを取得するステップとをさらに含む、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイ断片成分プラスミドＩを、前記Ｂ３およびＳ５を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記切断された第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項１７～２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーから、前記第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを含むディスプレイ断片成分プラスミドＩＩを取得するステップと、前記ディスプレイ断片成分プラスミドＩＩから前記切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを取得するステップとをさらに含む、請求項１９～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイ断片成分プラスミドＩＩを、前記Ｓ６およびＢ２を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記切断された第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項１９～２９のいずれか一項に記載の方法。
- ａ）５’から３’の方向にＢ抗原特異的ＶＨ－Ｂを含む第５のポリヌクレオチドを提供するステップと、
ｂ）ＶＨ成分ベクターを提供するステップであって、前記ＶＨ成分ベクターが、５’から３’の方向にＢ３－ＶＨ成分ベクターライゲーション断片－Ｂ２を含む第６のポリヌクレオチドを含むステップと、
ｃ）前記第５のポリヌクレオチドおよび前記ＶＨ成分ベクターを前記制限エンドヌクレアーゼで切断して、切断された第５のポリヌクレオチドおよび放出された第６のポリヌクレオチドを得るステップと、
ｄ）前記切断された第５のポリヌクレオチドおよび前記放出された第６のポリヌクレオチドを混合して、それらを方向性を持ってライゲーションし、環化して、抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを形成するステップと
を含み、
前記Ｂが、Ｂ２および／またはＢ３を特異的に認識することができる制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり、前記抗原特異的ＶＨが、前記抗原特異的結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードする、
請求項１～３０に記載の方法。 - ａ）５’から３’の方向にＳ抗原特異的ＬＣ－Ｓを含む第７のポリヌクレオチドを提供するステップと、
ｂ）ＬＣ成分ベクターを提供するステップであって、前記ＬＣ成分ベクターが、５’から３’の方向にＳ６－ＬＣ成分ベクターライゲーション断片Ｓ５を含む第８のポリヌクレオチドを含むステップと、
ｃ）前記第７のポリヌクレオチドおよび前記ＬＣ成分ベクターを前記制限エンドヌクレアーゼで切断して、切断された第７のポリヌクレオチドおよび放出された第８のポリヌクレオチドを得るステップと、
ｄ）前記切断された第７のポリヌクレオチドおよび前記放出された第８のポリヌクレオチドを混合して、それらを方向性を持ってライゲーションし、環化して、抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを形成するステップと
を含み、
前記Ｓが、Ｓ５および／またはＳ５を特異的に認識することができる前記制限エンドヌクレアーゼの認識部位であり、抗原特異的ＬＣが、前記抗原特異的結合ポリペプチドの軽鎖をコードする、
請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。 - ａ）５’から３’の方向にＢ２－ＶＨ成分ベクターツール断片Ｂ３を含む第９のポリヌクレオチドを提供するステップと、
ｂ）前記第９のポリヌクレオチドを発現成分ベクターに挿入して、前記ＶＨ成分ベクターを得るステップと
を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。 - ａ）５’から３’の方向にＳ５－ＬＣ成分ベクターツール断片Ｓ６を含む第１０のポリヌクレオチドを提供するステップと、
ｂ）前記第１０のポリヌクレオチドを前記発現成分ベクターに挿入して、前記ＬＣ成分ベクターを得るステップと
を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記発現成分ベクターがｐＭＤベクターに由来する、請求項３３～３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｐＭＤベクターがｐＭＤ１９ベクターであるか、またはｐＭＤ１９ベクターに由来する、請求項３５に記載の方法。
- ａ）前記ＶＨ成分ベクターを第９の細菌に導入して、ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリーを得るステップと、
ｂ）前記ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリーからＶＨ成分ベクター保存プラスミドを取得するステップと、
ｃ）前記ＶＨ成分ベクター保存プラスミドから前記放出された第６のポリヌクレオチドを取得するステップと
を含む、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＶＨ成分ベクター保存プラスミドを、前記Ｂ２およびＢ３を特異的に認識する前記制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記放出された第６のポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項３７に記載の方法。
- ａ）前記ＬＣ成分ベクターを第１０の細菌に導入して、ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリーを得るステップと、
ｂ）前記ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリーからＬＣ成分ベクター保存プラスミドを取得するステップと、
ｃ）前記ＬＣ成分ベクター保存プラスミドから前記放出された第８のポリヌクレオチドを取得するステップと
を含む、請求項３２～３８に記載の方法。 - 前記ＬＣ成分ベクター保存プラスミドを、前記Ｓ５およびＳ６を特異的に認識する前記制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記放出された第８のポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項３９に記載の方法。
- ａ）前記抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを提供するステップであって、前記抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーが、５’から３’の方向にＢ２抗原特異的ＶＨ－Ｂ３を含む第１のポリヌクレオチドを含むステップと、
ｂ）前記抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを提供するステップであって、前記抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーが、５’から３’の方向にＳ５－抗原特異的ＬＣ－Ｓ６を含む第２のポリヌクレオチドを含むステップと、
ｃ）前記ディスプレイベクターを提供するステップであって、前記ディスプレイベクターが、５’から３’の方向にＢ３－ディスプレイベクター断片Ｉ－Ｓ５を含む第３のポリヌクレオチドと、５’から３’の方向にＳ６－ディスプレイベクター断片ＩＩ－Ｂ２を含む第４のポリヌクレオチドとを含むステップと、
ｄ）前記抗原特異的ＶＨ成分ライブラリー、前記抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーおよび前記ディスプレイベクターを制限エンドヌクレアーゼで特異的に切断して、放出された第１のポリヌクレオチド、放出された第２のポリヌクレオチド、放出された第３のポリヌクレオチドおよび放出された第４のポリヌクレオチドを得るステップであって、前記制限エンドヌクレアーゼが、それぞれＢ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６を特異的に認識するステップと、
ｅ）前記放出された第１のポリヌクレオチド、前記放出された第２のポリヌクレオチド、前記放出された第３のポリヌクレオチドおよび前記放出された第４のポリヌクレオチドを混合して、それらを方向性を持ってライゲーションし、環化して、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを形成するステップと
を含み、
前記抗原特異的ＬＣが、前記抗原特異的結合ポリペプチドの軽鎖をコードし、前記抗原特異的ＶＨが、前記抗原特異的結合ポリペプチドの重鎖可変領域をコードし、
前記Ｂ２、Ｂ３、Ｓ５およびＳ６が、各々独立して、前記制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位である、
請求項３１～４０のいずれか一項に記載の方法。 - 前記抗原特異的ＶＨ成分ライブラリーを、前記Ｂ２およびＢ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記放出された第１のポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項４１に記載の方法。
- 前記抗原特異的ＬＣ成分ライブラリーを、前記Ｓ５およびＳ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記放出された第２のポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項４１～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイベクターを、前記Ｂ３を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼおよび前記Ｓ５を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記放出された第３のポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイベクターを、前記Ｓ６を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼおよび前記Ｂ２を特異的に認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより、前記放出された第４のポリヌクレオチドを得るステップを含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第５のポリヌクレオチド、前記第７のポリヌクレオチド、前記第９のポリヌクレオチド、前記第１０のポリヌクレオチド、前記第１のディスプレイベクターポリヌクレオチド、前記第２のディスプレイベクターポリヌクレオチド、前記第３のディスプレイベクターポリヌクレオチドおよび／または前記第４のディスプレイベクターポリヌクレオチドが、サンプル材料から得られる、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプル材料が、特定の抗原を標的とする抗体またはその抗原結合断片および／またはＩｇＧを含む、請求項４６に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＲＯＲ１、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１を標的とする、請求項４７に記載の方法。
- 前記ＩｇＧがヒトＩｇＧである、請求項４７に記載の方法。
- 前記ヒトＩｇＧが、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２である、請求項４９に記載の方法。
- 前記方向性を持ったライゲーションがリガーゼの使用を含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リガーゼがＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む、請求項５１に記載の方法。
- 前記抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを細胞に導入するステップと、前記細胞から抗原特異的結合ポリペプチドを取得するステップとを含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
- ａ）前記抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを第１の細菌に導入して、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーを得るステップと、
ｂ）前記抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリーから抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイ遺伝子ライブラリーを取得するステップと、
ｃ）前記抗原特異的結合ポリペプチドディスプレイ遺伝子ライブラリーから抗原特異的結合ポリペプチド発現ベクターＤＮＡを取得するステップと、
ｄ）前記抗原特異的結合ポリペプチド発現ベクターＤＮＡを細胞に導入するステップと、
ｅ）前記細胞から前記抗原特異的結合ポリペプチドを取得するステップと
を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリー、前記ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリー、前記ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリー、前記ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリー、前記ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリー、前記ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーおよび前記ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーを凍結保存することを含む、請求項５４に記載の方法。
- 前記ＶＨ成分ベクター保存細菌ライブラリーが、少なくとも１０個の異なるクローンを含む、請求項５４～５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＬＣ成分ベクター保存細菌ライブラリーが、少なくとも１０個の異なるクローンを含む、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイＶＨ成分細菌ライブラリーが、少なくとも１０個の異なるクローンを含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイＬＣ成分細菌ライブラリーが、少なくとも１０個の異なるクローンを含む、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイベクター成分Ｉ細菌ライブラリーが、少なくとも１０個の同一のクローンを含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ディスプレイベクター成分ＩＩ細菌ライブラリーが、少なくとも１０個の同一のクローンを含む、請求項５４～６０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリー中の有効なクローンの割合が、少なくとも約１０％である、請求項５４～６１に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５４～６２に記載の方法。
- 請求項１～６３のいずれか一項に記載の抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクターを使用することを含む、抗原特異的結合ポリペプチドまたはその断片をスクリーニングする方法。
- 請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法により製造される、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイベクター。
- 請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法により製造される、抗原特異的結合ポリペプチド遺伝子ディスプレイ細菌ライブラリー。
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