JP2023517063A - 操作されたメモリー様ｎｋ細胞を作製するための方法およびその組成物 - Google Patents

操作されたメモリー様ｎｋ細胞を作製するための方法およびその組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成しているかもしくはそれによって提示される変異型ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１ｃ）のネオエピトープに結合するキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞、またはそのような化合物を発現する細胞、および、がんを治療するため、またはその１つもしくは複数の症状を寛解させるための方法におけるそれらの使用に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９８７，６１２号明細書；２０２０年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６３／１１９，９５９号明細書；２０２０年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２１，１２７号明細書；および２０２１年１月８日に出願された米国実用新案出願第１７／１４４，８３４号明細書の利益を主張する。各出願の内容はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
米国政府による資金提供の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号ＣＡ１９７６０５に基づき、政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
細胞ベースの免疫療法が、がんの治療のために開発中である。Ｔ細胞、単球由来細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の養子細胞移入を使用するアプローチが、がん治療として検討されている（例えば、Andreesen, R. et al (1990) Cancer Res 50:7450-7456; Ruggeri, L. et al (2002) Science 295:2097-2100; Rezvani, K. (2019) Bone Marrow Transplantation 54:785-788を参照）。具体的には、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化／増大させたＮＫ細胞を患者に投与する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、現在試験されているがん治療の一つである。これらのアプローチは、患者から採取され、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化／増大されて、次いで腫瘍、例えば、転移性腫瘍と闘うために再注入される自己ＮＫ細胞の使用を伴う。ＡＣＴ ＮＫの持続性、ｉｎ ｖｉｖｏ増大、およびエフェクター機能を増強する戦略が求められている。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療は、がん治療のための戦略の一つとして登場してきた。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原（例えば、リガンド）に対する規定された特異性を免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞または他の免疫細胞）に付与して、抗原を認識してそれに結合した際にエフェクター細胞の活性化をもたらす、遺伝子操作された人工膜貫通受容体である。しかし、細胞系統限定的な抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする現在のＣＡＲは、正常組織で低い抗原発現があるため、強い毒性を伴う可能性がある（Coulie et al., NAT REV CANCER 14: 135 (2014); Srivastava & Riddell, J IMMUNOL 200: 459 (2018)を参照）。さらに、ＴＡＡは腫瘍細胞の生存に必要ではないため、ＴＡＡ発現の喪失は、ＣＡＲ－Ｔ療法に対する腫瘍抵抗性の発生の主な原因となる（Srivastava & Riddell, J IMMUNOL 200: 459 (2018)を参照）。したがって、より効果的なＣＡＲ療法戦略が必要とされている。
一部の態様では、本開示は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団であって、細胞外結合ドメインが、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、操作されたＭＬヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団を提供する。
一部の態様では、本開示の操作されたＮＫ細胞は、（ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、および／または（ｂ）ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合しない細胞外結合ドメインを含むＣＡＲを含み、任意選択で、対照ペプチドがＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープまたはインフルエンザウイルスＭ１エピトープである。
一部の態様では、本開示の操作されたＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合する細胞外結合ドメインを含むＣＡＲを含み、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９を含み、式中、Ｘ１はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＱから選択され、Ｘ３はＱまたはＮから選択され、Ｘ４はＤまたはＥから選択され、Ｘ５はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＦから選択され、Ｘ６はＣ、Ｓ、またはＡから選択され、Ｘ７はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦから選択され、Ｘ８はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ９はＬ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡから選択される。一部の態様では、Ｘ１はＡまたはＶから選択され、Ｘ２はＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ３はＱまたはＮから選択され、Ｘ４はＤまたはＥから選択され、Ｘ５はＬまたはＩから選択され、Ｘ６はＣまたはＳから選択され、Ｘ７はＶ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ８はＡまたはＶから選択され、Ｘ９はＶ、Ｉ、またはＬから選択される。一部の態様では、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ３はＱであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＬであり、Ｘ６はＣであり、Ｘ７はＬであり、Ｘ８はＡであり、Ｘ９はＶ、Ｉ、またはＬから選択される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）またはＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ネオエピトープは、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基長である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質であるか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされる。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされる。
一部の態様では、本開示の操作されたＮＫ細胞は、
（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨであって、前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲである、ＶＨ、ならびに／または
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬであって、前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲである、ＶＬ
を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲを含む。
一部の態様では、本開示の操作されたＮＫ細胞は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含む細胞外ドメインを含むＣＡＲを含み、ＶＨ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、ＶＨ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、ＶＨ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する。一部の態様では、細胞外ドメインは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、ＶＬ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、ＶＬ ＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、ＶＬ ＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する。
一部の態様では、本開示の操作されたＮＫ細胞は、ＶＨおよびＶＬを含む細胞外ドメインを含むＣＡＲを含み、ＶＨは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示の操作されたＮＫ細胞は、ＶＨおよびＶＬを含む細胞外ドメインを含むＣＡＲを含み、ＶＨは配列番号５のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは配列番号３のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示の操作されたＮＫ細胞は、ｓｃＦｖである細胞外ドメインを含むＣＡＲを含む。一部の態様では、ｓｃＦｖはヒトｓｃＦｖである。一部の態様では、ｓｃＦｖは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含み、ＶＨ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、ＶＨ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、ＶＨ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する。一部の態様では、ｓｃＦｖは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、ＶＬ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、ＶＬ ＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、ＶＬ ＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する。一部の態様では、ｓｃＦｖはＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ｓｃＦｖはＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨは配列番号５のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは配列番号３のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、ｓｃＦｖはリンカーを含む。一部の態様では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号５８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号５９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６０）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６１）からなる群から選択される。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号４）を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、ｓｃＦｖは、（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨであって、ＶＨ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、ＶＨ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、ＶＨ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、ＶＨ；および／または（ｂ）ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬであって、ＶＬ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、ＶＬ ＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、ＶＬ ＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、ＶＬを含む。一部の態様では、ｓｃＦｖは配列番号２のアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、抗原は、がん細胞の表面にある。一部の態様では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、細胞外ドメインは、１００ｎＭもしくはそれ未満、５０ｎＭもしくはそれ未満、２０ｎＭもしくはそれ未満、１０ｎＭもしくはそれ未満、０．５ｎＭから１００ｎＭまで、または１ｎＭから１５ｎＭまでの平衡解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合する。
一部の態様では、本開示の操作されたＮＫは、膜貫通ドメインを含むＣＡＲを含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＤＡＰ１２、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインから選択される。一部の態様では、本開示の操作されたＮＫは、細胞内ドメインを含むＣＡＲを含み、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７およびＤＡＰ１２からなる群から選択される１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。一部の態様では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ＣＡＲポリペプチドはＣＤ８ヒンジ領域をさらに含む。一部の態様では、細胞内ドメインは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域を含み、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、細胞外結合ドメインは、抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、細胞外結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、細胞内ドメインは、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断によりサイトカインが放出される。一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、またはＣＣＬ１９である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたＮＫ細胞は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドを含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞または初代ヒトＮＫ細胞の集団の、以下のサイトカイン：ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－１８のうちの１つもしくは複数、またはそれらの任意の組合せへの曝露後に活性化され、任意選択で、サイトカインは組換えヒトサイトカインである。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または細胞の集団は、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５；ＩＬ－１２およびＩＬ－１８；ＩＬ－１５およびＩＬ－１８；またはＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の組合せへの曝露後に活性化される。一部の態様では、ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、１～２０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１２；１～５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１５および１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１８に曝露され、任意選択で、ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、約１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、および約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８に、約３～４８時間、約７～２４時間、約１６～２０時間、約１２～２４時間または約１４～１６時間の期間にわたり、任意選択で約１６時間の期間にわたり曝露される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲポリペプチドは、初代ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団の、１つまたは複数のサイトカインへの曝露後に導入される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団は、
（ｉ）１つもしくは複数のサイトカインおよび／もしくは腫瘍標的の存在下で、対照ヒトＮＫ細胞もしくはヒトＮＫ細胞株に比して、産生するＩＦＮγが増加しており；
（ｉｉ）対照ヒトＮＫ細胞もしくはヒトＮＫ細胞株に比して、抗体依存性細胞傷害が増強しており；ならびに／または
（ｉｉｉ）対照ヒトＮＫ細胞もしくはヒトＮＫ細胞株に比して、抗腫瘍効果が増強しており、
任意選択で、対照ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞、またはＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、以下のポリペプチド：ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、およびＣＤ２５のうちの１つまたは複数の発現は、本開示の操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞株に比して増加しており、任意選択で、対照ヒトＮＫ細胞はＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞であるか、または対照ヒトＮＫ細胞株はＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、以下のポリペプチド：ＫＩＲ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＮＡＭ－１およびＣＤ１３７のうちの１つまたは複数は、本開示の操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞株に比して相対的に不変であり、任意選択で、対照ヒトＮＫ細胞はＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞であるか、または対照ヒトＮＫ細胞株はＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｂの発現は、本開示の操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞株に比して減少しており、任意選択で、対照ヒトＮＫ細胞はＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞であるか、または対照ヒトＮＫ細胞株はＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＩＬ－１５ポリペプチド、任意選択でヒトＩＬ－１５ポリペプチドを発現する。一部の態様では、ＩＬ－１５ポリペプチドは、分泌型ＩＬ－１５ポリペプチドであるか、または膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドである。一部の態様では、膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドは、ＩＬ－１５と異種性膜貫通ドメインの融合物である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に１．５倍、２倍、３倍、または４倍に増大する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に、サイトカインに対する応答増強または活性化受容体の再刺激を示す。一部の態様では、応答増強は、数週間から数か月間にわたり、任意選択で、２週間から３か月間までの期間、３週間から２か月間までの期間、または約１か月間にわたり維持される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、（ｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＩＦＮ－γの発現増加を有し；（ｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、グランザイムＢの発現増加を有し；（ｉｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つもしくは複数の活性化マーカーの発現増加を有し、ここで１つもしくは複数の活性化マーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１０７ａ、およびＣＤ６２Ｌから選択され；（ｉｖ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つもしくは複数の活性化受容体の発現増加を有し、ここで１つもしくは複数の活性化受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４から選択され；（ｖ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つもしくは複数の成熟マーカーの発現増加を有し、ここで１つもしくは複数の成熟マーカーは、ＣＤ５６およびＮＫＧ２Ａから選択され；（ｖｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＣＤ５７の発現減少を有し；（ｖｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＴＩＧＩＴの発現増加を有し；ならびに／または（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＴＲＡＩＬの発現減少を有し；任意選択で、（ｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つのＮＫ細胞の対照集団は、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の非形質導入集団である。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＩＦＮ－γの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、１つまたは複数の活性化マーカーの発現増加を有する。一部の態様では、活性化マーカーはＣＤ１０７ａである。一部の態様では、活性化マーカーはＣＤ６２Ｌである。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、１つまたは複数の活性化受容体の発現増加を有する。一部の態様では、活性化受容体はＮＫＧ２Ｄである。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＣＤ５７の発現減少を有する。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＣＤ５６およびＮＫＧ２Ａの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＴＩＧＩＴの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＴＲＡＩＬの発現減少を有する。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたＮＫ細胞または細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、本開示の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団を作製するための方法であって、
（ｉ）初代ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団を得るステップ；
（ｉｉ）ＮＫ細胞または前記細胞の集団を、ある量のＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、またはそれらの任意の組合せと、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞または前記細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＮＫ細胞または前記細胞の集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードするレンチウイルスベクターと、ＮＫ細胞または前記細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させるステップ；
（ｉｖ）ＣＡＲポリペプチドを発現するＮＫ細胞または前記細胞の集団を単離するステップ；および
（ｖ）任意選択で、単離された細胞を増大させるステップ
を含む方法を提供する。
一部の態様では、初代ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ｉＰＳＣ、臍帯血、またはＰＢＭＣに由来する。一部の態様では、初代ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団は、自己性または同種性である。
一部の態様では、ステップ（ｉｉ）における期間は、約１２～１６時間、任意選択で約１４～１６時間、任意選択で約１６時間である。一部の態様では、ステップ（ｉｉｉ）は、（ｉｖ）の前に約２４～７２時間の期間にわたり、ＮＫ細胞または前記細胞の集団を休ませることをさらに含む。
一部の態様では、レンチウイルスベクターは、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ－ｇｐ）シュードタイプ化レンチウイルスである。一部の態様では、レンチウイルスベクターは、ＢａＥＶ－ｇｐを含むシュードタイプ化レンチウイルスベクターであり、例えば、ＢａＥＶ－ｇｐは配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、対照ヒトＮＫ細胞もしくはＮＫ細胞株に比して、増大したレベルでＩＦＮγを産生し、任意選択で、対照ヒトＮＫ細胞はＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞であるか、または対照ヒトＮＫ細胞株はＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である。
一部の態様では、本開示は、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞の集団を作製する方法であって、ＡＳＣＴ－２を発現するサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、集団に形質導入するための条件下で接触させるステップであって、シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質を含み、それによって、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を作製する、ステップを含む方法を提供する。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞は、初代ヒトＮＫ細胞の集団から得られる。一部の態様では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、ｉＰＳＣ、臍帯血、またはＰＢＭＣに由来する。一部の態様では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、自己性または同種性である。一部の態様では、ＡＳＣＴ－２の発現は、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団において、ヒトＮＫ細胞の対照集団に比して、約１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、または４倍に増加しており、任意選択で、ヒトＮＫ細胞の対照集団は、ＩＬ－１５単独の存在下で活性化されている。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５への曝露によって予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８への曝露によって予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、約８～２４時間、任意選択で１２～２０時間、任意選択で約１２～１６時間、任意選択で約１４～１６時間、任意選択で約１６時間の期間にわたり予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、および約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８への、約３～４８時間、約７～２４時間、約１６～２０時間、約１２～２４時間、約１４～１６時間、または約１６時間の期間にわたる曝露によって予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２および約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８への、約３～４８時間、約７～２４時間、約１６～２０時間、約１２～２４時間、約１４～１６時間、または約１６時間の期間にわたる曝露によって予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を、１つまたは複数のサイトカインへの曝露後、および接触の前に、ある期間にわたって休ませ、その期間は約２４～７２時間である。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団の少なくとも約１０％が形質導入される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団の約１０～９０％が形質導入され、任意選択で約３５～８０％、任意選択で約４０～６０％、任意選択で約６０％が形質導入される。一部の態様では、糖タンパク質は、レトロウイルス糖タンパク質である。一部の態様では、レトロウイルス糖タンパク質は、ヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）糖タンパク質である。一部の態様では、ＢａＥＶ糖タンパク質は、配列番号１０７によって示されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示は、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞の集団を作製する方法であって、（ｉ）初代ヒトＮＫ細胞の集団を得るステップ；（ｉｉ）初代ヒトＮＫ細胞の集団を、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５と、ＡＳＣＴ－２を発現するサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ；ならびに（ｉｉｉ）（ｉｉ）の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させるステップであって、シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質を含み；それによって、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を作製する、ステップを含む方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞の集団を作製する方法であって、（ｉ）初代ヒトＮＫ細胞の集団を得るステップ；（ｉｉ）初代ヒトＮＫ細胞の集団を、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８と、ＡＳＣＴ－２を発現するサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ；ならびに（ｉｉｉ）（ｉｉ）の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させるステップ；を含み、シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質を含み；それによって、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を作製する、方法を提供する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、糖タンパク質は、レトロウイルス糖タンパク質である。一部の態様では、レトロウイルス糖タンパク質は、ヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）糖タンパク質である。一部の態様では、ＢａＥＶ糖タンパク質は、配列番号１０７によって示されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、ｉＰＳＣ、臍帯血、またはＰＢＭＣに由来する。一部の態様では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、自己性または同種性である。一部の態様では、ステップ（ｉｉ）における期間は、約１２～１６時間、任意選択で約１４～１６時間、任意選択で約１６時間である。一部の態様では、（ｉｉｉ）の結果として形質導入される、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団の割合は、少なくとも１０％である。一部の態様では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団の約１０～９０％が形質導入され、任意選択で約３５～８０％、任意選択で約４０～６０％、任意選択で約６０％が形質導入される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、（ｉ）１つもしくは複数のサイトカインおよび／もしくは腫瘍標的の存在下で、対照ヒトＮＫ細胞株に比して、産生するＩＦＮγが増加しており；（ｉｉ）対照ヒトＮＫ細胞株に比して、抗体依存性細胞傷害が増強しており；ならびに／または（ｉｉｉ）対照ヒトＮＫ細胞株に比して、抗腫瘍効果が増強しており、任意選択で、対照ヒトＮＫ細胞株は、ＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である。一部の態様では、以下のポリペプチド：ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、およびＣＤ２５のうちの１つまたは複数の発現は、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して増加している。一部の態様では、ＣＤ９４は、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して増加している。一部の態様では、ＮＫｐ３０は、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して増加している。一部の態様では、ＮＫｐ４４は、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して増加している。一部の態様では、ＮＫＧ２Ｄは、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して増加している。一部の態様では、ＣＤ２５は、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して増加している。一部の態様では、以下のポリペプチド：ＫＩＲ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＮＡＭ－１およびＣＤ１３７のうちの１つまたは複数は、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、ＫＩＲは、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、ＣＤ５７は、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、ＮＫＧ２Ｃは、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、ＤＮＡＭ－１は、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、ＣＤ１３７は、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｂの発現は、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して減少している。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団の多数は、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋である。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に１．５倍、２倍、３倍、または４倍に増大する。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に、サイトカインに対する応答増強または活性化受容体の再刺激を示す。一部の態様では、応答増強は、数週間から数か月間にわたり、任意選択で、２週間から３か月間までの期間、３週間から２か月間までの期間、または約１か月間にわたり維持される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、ＩＬ－１５ポリペプチド、任意選択でヒトＩＬ－１５ポリペプチドをさらにコードする。一部の態様では、ＩＬ－１５ポリペプチドは、分泌型ＩＬ－１５ポリペプチドであるか、または膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドである。一部の態様では、膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドは、異種性膜貫通ドメイン、任意選択でＣＤ８膜貫通ドメインと融合している。一部の態様では、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団の増大は、ＩＬ－１５ポリペプチドを伴わない形質導入を受けた対照ＭＬ ＮＫ集団に比して、形質導入の後に約１．５倍、２倍、３倍、または４倍への増加である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本方法は、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を単離するステップ；および任意選択で、細胞の集団を増大させるステップをさらに含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、異種性ポリペプチドはＣＡＲである。一部の態様では、ＣＡＲは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含み、細胞外結合ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する。一部の態様では、細胞外結合ドメインは、（ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、および／または（ｂ）ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合せず、任意選択で、対照ペプチドはＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープまたはインフルエンザウイルスＭ１エピトープである。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープはアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９を含み、式中、Ｘ１はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＱから選択され、Ｘ３はＱまたはＮから選択され、Ｘ４はＤまたはＥから選択され、Ｘ５はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＦから選択され、Ｘ６はＣ、Ｓ、またはＡから選択され、Ｘ７はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦから選択され、Ｘ８はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ９はＬ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡから選択される。一部の態様では、Ｘ１はＡまたはＶから選択され、Ｘ２はＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ３はＱまたはＮから選択され、Ｘ４はＤまたはＥから選択され、Ｘ５はＬまたはＩから選択され、Ｘ６はＣまたはＳから選択され、Ｘ７はＶ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ８はＡまたはＶから選択され、Ｘ９はＶ、Ｉ、またはＬから選択される。一部の態様では、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ３はＱであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＬであり、Ｘ６はＣであり、Ｘ７はＬであり、Ｘ８はＡであり、Ｘ９はＶ、Ｉ、またはＬから選択される。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）またはＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む。一部の態様では、ネオエピトープは、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基長である。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質であるか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされる。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされる。
一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ネオエピトープは、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基長である。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質であるか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされる。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされる。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲの細胞外ドメインは、（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨであって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲである、ＶＨ、ならびに／または（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬであって、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲである、ＶＬを含む。一部の態様では、細胞外ドメインはＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含み、ＶＨ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、ＶＨ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、ＶＨ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する。一部の態様では、細胞外ドメインは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、ＶＬ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、ＶＬ ＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、ＶＬ ＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する。一部の態様では、細胞外ドメインはＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の態様では、細胞外ドメインはＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨは配列番号５のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは配列番号３のアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ｓｃＦｖを含む。一部の態様では、ｓｃＦｖはヒトｓｃＦｖである。一部の態様では、ｓｃＦｖは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含み、ＶＨ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、ＶＨ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、ＶＨ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する。一部の態様では、ｓｃＦｖは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、ＶＬ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、ＶＬ ＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、ＶＬ ＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する。一部の態様では、ｓｃＦｖはＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ｓｃＦｖはＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨは配列番号５のアミノ酸配列を含み、ならびに／またはＶＬは配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ｓｃＦｖはリンカーを含む。一部の態様では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号５８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号５９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６０）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６１）からなる群から選択される。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号４）を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、ｓｃＦｖは、（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨであって、ＶＨ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、ＶＨ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、ＶＨ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、ＶＨ；ならびに／または（ｂ）ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬであって、ＶＬ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、ＶＬ ＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、ＶＬ ＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、ＶＬを含む。一部の態様では、ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、抗原はがん細胞の表面にある。一部の態様では、がんは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の態様では、細胞外ドメインは、１００ｎＭもしくはそれ未満、５０ｎＭもしくはそれ未満、２０ｎＭもしくはそれ未満、１０ｎＭもしくはそれ未満、０．５ｎＭから１００ｎＭまで、または１ｎＭから１５ｎＭまでの平衡解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合する。
一部の態様では、ＣＡＲは膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＤＡＰ１２、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインから選択される。一部の態様では、ＣＡＲは細胞内ドメインを含み、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７およびＤＡＰ１２からなる群から選択される１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。一部の態様では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ＣＡＲポリペプチドはＣＤ８ヒンジ領域をさらに含む。一部の態様では、細胞内ドメインは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域を含み、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、細胞外結合ドメインは、抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＣＡＲの細胞内ドメインは、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断によりサイトカインが放出される。一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、またはＣＣＬ１９である。一部の態様では、サイトカインはＩＬ－１５ポリペプチドである。一部の態様では、ＩＬ－１５ポリペプチドは発現後に分泌される。一部の態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１０２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＬ－１５ポリペプチドは異種性膜貫通ドメインと融合しており、任意選択で異種性膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインである。一部の態様では、ＩＬ－１５ポリペプチドは、膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドとして発現される。一部の態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号１００に示されるアミノ酸配列、または配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含むＣＡＲを発現する操作されたサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団であって、本明細書に記載される方法に従って調製される集団を提供する。一部の態様では、操作されたＭＬ ＮＫ細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞の存在下で、（ｉ）ＩＦＮγの発現増加を有し；（ｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、グランザイムＢの発現増加を有し；（ｉｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つもしくは複数の活性化マーカーの発現増加を有し、ここで１つもしくは複数の活性化マーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、およびＣＤ６２Ｌから選択され；（ｉｖ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つもしくは複数の活性化受容体の発現増加を有し、ここで１つもしくは複数の活性化受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４から選択され；（ｖ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つもしくは複数の成熟マーカーの発現増加を有し、ここで１つもしくは複数の成熟マーカーは、ＣＤ５６およびＮＫＧ２Ａから選択され；（ｖｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＣＤ５７の発現減少を有し；（ｖｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＴＩＧＩＴの発現増加を有し；ならびに／または（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＴＲＡＩＬの発現減少を有し；任意選択で、ＮＫ細胞の対照集団は、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の非形質導入集団である。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＩＦＮ－γの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、１つまたは複数の活性化マーカーの発現増加を有する。一部の態様では、活性化マーカーはＣＤ１０７ａである。一部の態様では、活性化マーカーはＣＤ６２Ｌである。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、１つまたは複数の活性化受容体の発現増加を有する。一部の態様では、活性化受容体はＮＫＧ２Ｄである。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＣＤ５７の発現減少を有する。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＣＤ５６およびＮＫＧ２Ａの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＴＩＧＩＴの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、ＴＲＡＩＬの発現減少を有する。
一部の態様では、本開示は、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示しており、本明細書に記載される、操作されたＮＫ細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物を、がんを治療するのに十分な量で対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、がんはＡＭＬである。一部の態様では、がんを治療する方法は、がんの量を減少させる方法、または対象における生存期間を延長させる方法である。
他の態様では、本開示は、ＡＭＬの治療を必要とする対象においてＡＭＬを治療する方法であって、本明細書に記載される、操作されたＮＫ細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物を、ＡＭＬを治療するのに十分な量で対象に投与するステップを含む方法を提供する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＡＭＬは、再発性ＡＭＬまたは難治性ＡＭＬである。
他の態様では、本開示は、ＡＭＬから寛解している対象においてＡＭＬの再発を予防する方法であって、本明細書に記載される、操作されたＮＫ細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本明細書に記載される方法のいずれかは、投与のステップの前に、対象がＮＰＭ１ｃを発現するか否か、または対象がＮＰＭ１遺伝子におけるＮＰＭ１ｃ変異を有するか否かを検出するステップ、および対象がＮＰＭ１ｃを発現するかまたはＮＰＭ１ｃ変異を有する場合、投与のステップに進むステップを含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に増大の増強を示す。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本明細書に記載される方法のいずれかは、１つまたは複数の追加の治療薬または手順を投与するステップをさらに含む。
一部の態様では、本開示は、対象におけるがんを治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される、操作されたＮＫ細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物の使用であって、がんを含む細胞の細胞表面が、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示し；任意選択で、１つまたは複数の追加の治療薬または手順と組み合わされる、使用を提供する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、対象はヒトである。
他の態様では、本開示は、（ｉ）本明細書に記載される、操作されたＮＫ細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物；（ｉｉ）任意選択で、１つまたは複数の追加の治療薬、および（ｉｉｉ）対象におけるがんの治療に使用するための説明書を含む１つまたは複数の容器を含むキットを提供する。
ヒトサイトカイン誘導性メモリー様（本明細書では相互交換可能に「メモリー様」、「ＣＩＭＬ」、「ＭＬ」と称する)ＮＫ細胞分化の概要を示す図である。従来型のナイーブＮＫ細胞を、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８の組合せ（または対照としてＩＬ－１５単独）によって１２～１６時間、予め活性化し、洗浄して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（生存のための低用量のＩＬ－１５とともに)またはｉｎ ｖｉｖｏで（生存のためのｒｈ ＩＬ－２またはｒｈ ＩＬ－１５とともにＮＳＧマウスで）分化させる。ＩＬ－１２／１５／１８で予め活性化することによって、大規模な増大およびメモリー様ＮＫ細胞への分化が生じた。２回目の（再）刺激に際して、メモリー様ＮＫ細胞は、対照またはナイーブなＮＫ細胞と比較して、応答の増強を呈する。本例では、白血病標的細胞に応答して、プロトタイプＮＫ細胞機能の読み出しとしてＩＦＮ－γの産生が示される。 初代の従来型ＮＫ細胞およびＣＩＭＬ ＮＫ細胞におけるＬＳＬ－ＲおよびＡＳＣＴ２の発現を示す図である。図２Ａは、従来型初代ヒトＮＫ細胞（ｃＮＫ）またはサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞（ＣＩＭＬ－ＮＫ）であったヒトＮＫ（ｈＮＫ）細胞におけるＬＤＬ－Ｒの発現のパーセント（％）を示すグラフである。図２Ｂは、ｃＮＫ細胞またはＣＩＭＬ－ＮＫ細胞におけるＡＳＣＴ２の発現のパーセント（％）を示すグラフである。 初代の従来型ＮＫ細胞およびＣＩＭＬ ＮＫ細胞におけるＬＳＬ－ＲおよびＡＳＣＴ２の発現を示す図である。図２Ｃは、ヒヒエンベロープ糖タンパク質によってシュードタイプ化したレンチウイルス（ＢａＥＶ－ＬＶ）が標的とするＡＳＣＴ１／２と、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質によってシュードタイプ化したレンチウイルス（ＶＳＶＧ－ＬＶ）が標的とするＬＤＬ－Ｒの、ＮＫ細胞における相対的発現を示す概略図である。 図３Ａは、ＮＫ細胞上に発現された抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ、およびそれによるＡＭＬ細胞上のＨＬＡ－Ａ２複合体によって提示されたＡＩＱ（ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ、配列番号１）（ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体）の認識の概略を示す図である。抗ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲベクターの概略図も示す。図３Ｂは、Ｔ細胞上に発現された抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲがＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を認識することを示すフローサイトメトリーデータを提供する図である。 ＡＭＬにおいてＮＰＭ１が変異していることを示す図である。概略図はXie, et al. Nat Biomed Eng (2021) 5:124から改編した。 非従来型レンチウイルス形質導入アプローチ（ＢａＥＶによってシュードタイプ化したレンチウイルス）を使用するＣＩＭＬ ＮＫ細胞の最適化されたＣＡＲ編集を示す図である。抗ＮＰＭ１ｃ ＮＫ細胞および非形質導入（ＵＴ）細胞におけるＣＡＲ ｓｃＦｖおよびＧＦＰの発現を定量するフロープロットを示す。 図６Ａは、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞を生成するために使用した方法およびレンチウイルス（例えばＢａＥＶによってシュードタイプ化）を使用してＣＡＲ発現ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を生成するＣＡＲ構築物による形質導入を示す概略図である。図６Ｂは、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、および５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８の組合せで１６時間、刺激したＮＫ細胞におけるＡＳＣＴ２の発現のパーセント（％）を示すグラフである。 図６Ｃ～６Ｅは、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８の組合せ（図６Ｃ～図６Ｄ）、またはＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５の組合せ（図６Ｅ）で刺激したｈＮＫ細胞におけるｑＰＣＲによって定量したＡＳＣＴ ｍＲＮＡの発現の倍数変化を定量したグラフを提供する図である。対照細胞は、未処理、またはＩＬ－１５単独、ＩＬ－１２単独、もしくはＩＬ－１８単独で処理した。 図６Ｆは、サイトカインの異なる組合せによって予め活性化したＭＬ ＮＫ細胞における、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲをコードするヒヒエンベロープ糖タンパク質によってシュードタイプ化したレンチウイルス（ＢａＥＶ－ＬＶ）による形質導入効率を示すヒストグラムである。 図７Ａは、フローサイトメトリーを使用してＣＡＲの発現を測定することによって決定した、異なるヒトドナーから得て抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲをコードするＢａＥＶ－ＬＶを形質導入したＭＬ－ＮＫ細胞についての形質導入率のグラフである（プロテインＬ結合の％として表す）。 図７Ｂは、ＧＦＰをコードするＢａＥＶ－ＬＶを形質導入した初代ヒトおよびマウスのＣＩＭＬ ＮＫ細胞における効率的な遺伝子発現を示す図である。ＰＢＭＣ由来の初代ｈＮＫ細胞を組換えヒトＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５とともに終夜、予め活性化して、ヒトＣＩＭＬ ＮＫ細胞を生成させた。マウス脾由来のＮＫ細胞を組換えマウスＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５とともに終夜、予め活性化して、マウスＣＩＭＬ ＮＫ細胞を生成させた。 図７Ｃは、成熟および発達の段階に基づくｈＮＫ細胞の表現型マーカーの特徴を提供する図である。図７Ｄは、フローサイトメトリー分析によって、ｈＮＫ細胞のサブセットを成熟の段階に基づいて低成熟（ＮＫ１＝ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６－）、中成熟（ＮＫ２＝ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＫＩＲｓ－またはＮＫ３＝ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＫＩＲｓ＋ＣＤ５７－）、または完全成熟（ＮＫ４＝ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＫＩＲｓ＋ＣＤ５７＋）から区別する、生存しているＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞についてゲーティングするための戦略を提供する図である。 （図７Ｄの続き） 図７Ｅは、図７Ｄに示すゲーティング戦略に従って区別されるｈＮＫ細胞のサブセットＮＫ１～ＮＫ４についてのＡＳＣＴ２の表面発現を定量する棒グラフを提供する図である。ｈＮＫ細胞は４名の異なるヒトドナーから得た。図７Ｆは、図７Ｄに示すゲーティング戦略に従って区別されるｈＮＫ細胞のサブセットＮＫ１～ＮＫ４についてのＡＳＣＴ２の表面発現を定量するヒストグラムを提供する図である。１名のヒトドナーから得たｈＮＫ細胞についてのデータを示す。 図８Ａは、ＣＡＲ ＭＬ－ＮＫ細胞の強力な抗ＡＭＬ機能を示す図である。ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－Ａ２＋標的細胞との共培養の後の非形質導入（ＵＴ）細胞および抗ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞におけるＩＦＮγおよびＣＤ１０７ａの発現を定量するフロープロット（左パネル）および対応する棒グラフ（右パネル）を示す。 図８Ｂ～８Ｇは、ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－Ａ２＋）細胞との共培養の後の、非形質導入ＮＫ細胞と比較した、ＢａＥＶ－ＬＶを使用して抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲを形質導入したＣＩＭＬ－ＮＫ細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はＣｙＴＯＦによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図８Ｂは、ＣＤ１０７ａ、サイトカイン（ＩＦＮγ）、および細胞傷害性マーカー（グランザイムＢ）の定量を提供する。 図８Ｂ～８Ｇは、ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－Ａ２＋）細胞との共培養の後の、非形質導入ＮＫ細胞と比較した、ＢａＥＶ－ＬＶを使用して抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲを形質導入したＣＩＭＬ－ＮＫ細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はＣｙＴＯＦによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図８Ｃは、活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ６２Ｌ）の定量を提供する。 図８Ｂ～８Ｇは、ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－Ａ２＋）細胞との共培養の後の、非形質導入ＮＫ細胞と比較した、ＢａＥＶ－ＬＶを使用して抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲを形質導入したＣＩＭＬ－ＮＫ細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はＣｙＴＯＦによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図８Ｄは、活性化受容体（ＮＫｐ３０、ＮＧＤ２Ｄ、ＮＫｐ４４）の定量を提供する。 図８Ｂ～８Ｇは、ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－Ａ２＋）細胞との共培養の後の、非形質導入ＮＫ細胞と比較した、ＢａＥＶ－ＬＶを使用して抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲを形質導入したＣＩＭＬ－ＮＫ細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はＣｙＴＯＦによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図８Ｅは成熟マーカー（ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ５７）の定量を提供する。 図８Ｂ～８Ｇは、ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－Ａ２＋）細胞との共培養の後の、非形質導入ＮＫ細胞と比較した、ＢａＥＶ－ＬＶを使用して抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲを形質導入したＣＩＭＬ－ＮＫ細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はＣｙＴＯＦによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図８Ｆは、疲弊マーカー（ＴＩＧＩＴ）の定量を提供する。図８Ｇは、アポトーシスマーカー（ＴＲＡＩＬ）の定量を提供する。 図９Ａは、非形質導入（ＵＴ）ＭＬ ＮＫ細胞、ＣＡＲ－ｓ１５（分泌型ＩＬ１５を発現する抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞）、またはＣＡＲ－ｍ１５（膜結合ＩＬ１５を発現する抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞）の１５日間にわたるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養における細胞の増大を測定するグラフである。 図９Ｂは、ＣＡＲの発現が形質導入の後も維持されていることを示す棒グラフ（図９Ｂ）および対応するフローチャート（図９Ｃ）を提供する図である。ＣＡＲの発現は、非形質導入（ＵＴ）細胞、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲのみのＭＬ ＮＫ細胞、ＣＡＲ－ｓ１５ ＭＬ ＮＫ細胞、およびＣＡＲ－ｍ１５ ＭＬ ＮＫ細胞において形質導入後４日目および２３日目に測定した。ＣＡＲの発現は、生存ＮＫ細胞中のプロテインＬ結合の％として示す。 図９Ｃは、ＣＡＲの発現が形質導入の後も維持されていることを示す棒グラフ（図９Ｂ）および対応するフローチャート（図９Ｃ）を提供する図である。ＣＡＲの発現は、非形質導入（ＵＴ）細胞、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲのみのＭＬ ＮＫ細胞、ＣＡＲ－ｓ１５ ＭＬ ＮＫ細胞、およびＣＡＲ－ｍ１５ ＭＬ ＮＫ細胞において形質導入後４日目および２３日目に測定した。ＣＡＲの発現は、生存ＮＫ細胞中のプロテインＬ結合の％として示す。 図１０Ａは、ＣＡＲ－ｓ１５ ＭＬ ＮＫ細胞およびＣＡＲ－ｍ１５ ＭＬ ＮＫ細胞が、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２発現標的細胞と共培養した場合にＩＦＮγを発現することを示す棒グラフを提供する図である。ＮＫ細胞は、ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋、ＨＬＡ－Ａ２＋、Ｌｕｃ＋、上部グラフ）またはＯＣＩ－ＡＭＬ２（ＮＰＭ１ｃ－、ＨＬＡ－Ａ２＋、Ｌｕｃ＋、下部グラフ）である標的細胞を使用してエフェクター：標的比１：１で共培養した。対照細胞は非形質導入ＭＬ ＮＫ細胞であった。細胞は５時間共培養し、フローサイトメトリーを使用してＩＦＮγの発現について解析した。 図１０Ｂは、ＣＡＲ－ｓ１５ ＭＬ ＮＫ細胞およびＣＡＲ－ｍ１５ ＭＬ ＮＫ細胞が、アポトーシス標的細胞のパーセント（％）によって測定して、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２発現標的細胞のアポトーシスを誘導することを示す線グラフを提供する図である。標的細胞は、ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋、ＨＬＡ－Ａ２＋、Ｌｕｃ＋、上部グラフ）またはＯＣＩ－ＡＭＬ２（ＮＰＭ１ｃ－、ＨＬＡ－Ａ２＋、Ｌｕｃ＋、下部グラフ）であった。細胞は、非形質導入ＭＬ－ＮＫ細胞、ＣＡＲ－ｓ１５ ＭＬ－ＮＫ細胞、またはＣＡＲ ｍ１５ ＭＬ－ＮＫ細胞と４時間、表示したＥ：Ｔ比で共培養し、次いでフローサイトメトリーを使用してアネキシンＶ染色について解析した。 図１０Ｃは、非形質導入ＭＬ－ＮＫ細胞、抗ＣＡＲ ＮＰＭ１ｃのみのＭＬ－ＮＫ細胞、ＣＡＲ－ｓ１５ ＭＬ－ＮＫ細胞、またはＣＡＲ－ｍ１５ ＭＬ－ＮＫ細胞との異なるＥ：Ｔ比での２４時間の培養の後の、標的細胞（ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋、ＨＬＡ－Ａ２＋、Ｌｕｃ＋、左グラフ）またはＯＣＩ－ＡＭＬ２（ＮＰＭ１ｃ－、ＨＬＡ－Ａ２＋、Ｌｕｃ＋、右グラフ）における細胞の生存率を示す線グラフを提供する図である。 図１０Ｄ～１０Ｇは、細胞内ＮＰＭ１ｃから誘導されたネオエピトープを標的とする操作されたメモリー様ＮＫ ＣＡＲが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対して強力な活性および特異性を呈することを示す図である。図１０Ｄは、形質導入後７２時間における初代ヒトＣＩＭＬ ＮＫ細胞における効率的なレンチウイルス媒介（ＢａＥＶ－ＬＶ）ＣＡＲ編集を示す。 図１０Ｄ～１０Ｇは、細胞内ＮＰＭ１ｃから誘導されたネオエピトープを標的とする操作されたメモリー様ＮＫ ＣＡＲが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対して強力な活性および特異性を呈することを示す図である。図１０Ｅは、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲと膜結合ＩＬ－１５との共形質導入によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＡＲ－ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の増大が促進されることを示す。 図１０Ｄ～１０Ｇは、細胞内ＮＰＭ１ｃから誘導されたネオエピトープを標的とする操作されたメモリー様ＮＫ ＣＡＲが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対して強力な活性および特異性を呈することを示す図である。図１０Ｆは、フローサイトメトリー分析の前に、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ単独を形質導入、または抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲおよびｍＩＬ－１５を共形質導入し、ＯＣＩ－ＡＭＬ３標的細胞（ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－２Ａ＋）によって４時間刺激したＣＩＭＬ ＮＫ細胞におけるＩＦＮ－ガンマおよびＣＤ１０７ａの発現を示す。図１０Ｇは、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ単独を形質導入、または抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲおよびｍＩＬ－１５を共形質導入したＣＩＭＬ ＮＫ細胞と４時間共培養したＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－２Ａ＋）標的細胞の殺滅を示す。 図１１Ａは、抗ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞の生成およびＯＣＩ－ＡＭＬ３－Ｌｕｃ細胞を含むマウスの生成、ならびに引き続くＣＡＲ細胞による処置、ならびに腫瘍負荷のモニタリングの時系列を提供する図である。 図１１Ｂは、図１１Ａに概略を示した研究に含めたマウスにおけるルシフェラーゼの発現の画像を提供する図である。ルシフェラーゼは、非形質導入細胞または分泌型ＩＬ－１５（ｓ１５）、膜結合ＩＬ－１５（ｍ１５）、もしくはＣＡＲのみ（ＩＬ－１５なし）を発現する抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞を投与したマウスにおいて、３日目、１０日目、および１３日目に測定した。 図１１Ｃは、腫瘍ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を担持したマウスにおける全体の(全)ルシフェラーゼの発現(画像は図１１Ｂ)を示す線グラフを提供する図である。 ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞選別を示す図である。 ＮＫ細胞の応答が活性化シグナルと阻害シグナルとの正味のバランスによって支配されていることを示す概略図である。 ＮＫ細胞の養子免疫伝達の戦略を示す概略図である。 免疫系におけるメモリーを示す概略図である。Rosenblum et al, 2016から改編した。 ＩＬ－１２およびＩＬ－１８による従来型ＮＫ細胞の活性化によってメモリー様ＮＫ細胞への分化が誘導されることを示す図である。Romee et al, Blood, 2012; Romee, et al, Science TM, 2016を参照されたい。 再発／難治性ＡＭＬにおけるヒトでは最初のメモリー様ＮＫ細胞の第１相試験を示す図である。 養子免疫伝達の後でＣＩＭＬ ＮＫ細胞が増殖し増大することを示す図である。Romee, et al. Science TM, 2016から改編した。 （図１８－１の続き） （図１８－２の続き） メモリー様ＮＫ細胞が安全であり、有望な臨床活性を有していることを示す図である。Romee et al, Science TM, 2016を参照されたい。 幹細胞移植後の再発を有する患者における第１ａ／ｂ相試験の概要を示す概略図である。ハプロにおけるＮＫ細胞の欠損およびその上にハプロＨＣｔの後で再発した患者について効果的かつ安全な治療の選択肢が存在しないことに基づいて、メモリー様ＮＫ細胞の第１相試験を開始した。左パネルに示すように、移植後の再発には極めて不良な転帰が伴っており、ＨＬＡのミスマッチは、ＧＶＨＤのリスクが増大したＤＬＩを使用するためには危険な状況になることがある。ＮＫ細胞を使用し、元の幹細胞移植と同じドナーからの免疫適合性のメモリー様ＮＫ細胞を生成した。次いで患者は低用量ＩＬ－２の７回の投与を受ける。 メモリー様ＮＫ（「Ｍｅｍ－ＮＫ」）細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける多量の増大および長期の／保持された持続性を示す図である。ほぼ５００倍の増大を示す。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は少なくとも６５日間は検出可能で、マウスで観察されたことに類似しており、ヒトにおけるこれらの細胞の長い半減期が確認された。持続性が長いことによって、これらの細胞は、ＮＫ細胞に基づく免疫療法のアプローチのためのプラットフォームとして極めて魅力的なものにされる。 ２８日目におけるＴｒｅｇの最小の増大を伴う成熟ＮＫ細胞の増大を示す図である。 芽球化形質細胞様ＤＣ新生物（ＢＰＤＣＮ）を有する患者がメモリー様ＮＫ細胞の注入によって寛解に達することを示す図である。 進行性の頭頚部がんにおけるＣＴＬＡ－４の阻害およびメモリー様ＮＫ細胞による免疫細胞療法を示す図である。Ｈ＆Ｎがん患者においてＮＫの浸潤によってＰＦＳが予測されることを示すデータがある。また、ＣＴＡＬ４遮断ｉｐｉは腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇を誘導する。例えば、第１相治験は、メモリー様ＮＫ細胞とＩｐｉを組み合わせ、次いで長時間作用型ＩＬ－１５スーパーアゴニストも与える。 抗体動員分子（ＡＲＭ）が新規な二重特異的ＮＫ細胞エンゲージャーであることを示す図である。 自己ＨＣＴを伴うＭＲＤ＋ＭＭにおけるＣＤ３８ ＡＲＭおよびメモリー様ＮＫ細胞の第Ｉ／ＩＩ相治験を示す図である。 ＣＡＲの開発のためのメモリー様ＮＫ細胞プラットフォームの開発を示す図である。 ｐＨＩＶ－ＣＡＲ－ＣＤ１９ｈｓｃＦｖ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（８６０６ｂｐ）のベクターマップを示す図である。
本開示は、異種性ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ）を発現するサイトカイン誘導性メモリー様ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を作製するための方法を提供する。本明細書に記載されるように、本開示の方法は、細胞形質導入の従来の方法、例えば、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶＧ）糖タンパク質を組み込んだ古典的なシュードタイプ化レンチウイルスベクターを使用する方法に比して、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団における形質導入効率の増大をもたらす。本明細書において実証されるように、ＶＳＶＧ糖タンパク質に結合するＬＤＬ受容体は、ＮＫ細胞（例えば、従来のＮＫ細胞またはサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞のいずれも）によってほとんど発現されない。理論には拘束されないが、ＬＤＬ受容体がほとんど発現されないことにより、ＶＳＶＧ糖タンパク質によってシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターがＮＫ細胞への効果的な取り込みを生じることが妨げられる。
対照的に、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞は、アラニン・セリン・システイン輸送体２（ＡＳＣＴ２）を増大したレベルで発現することが発見された。本明細書において実証されるように、（ｉ）ＩＬ－１２およびＩＬ－１８、または（ｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５によって予め活性化されたサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞（例えば、ＩＬ－１５のみによって活性化された従来のＮＫ細胞）に比して、約１．５～２倍に増大したレベルでＡＳＣＴ２を発現する。一部の態様では、ＡＳＣＴのレベルは、対照ＮＫ細胞（例えば、ＩＬ－１５のみによって活性化された従来のＮＫ細胞）に比して、約１．５～３倍に増大した。さらに、ＡＳＣＴ２に結合する糖タンパク質によってシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターは、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞において高レベルの形質導入（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）をもたらすことが発見された。一部の実施形態では、レトロウイルス糖タンパク質は、ＡＳＣＴ２に結合するヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）糖タンパク質である。その上、高レベルのＡＳＣＴ２を発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞における形質導入は、低レベルのＡＳＣＴ２を発現する対照ＮＫ細胞（例えば、ＩＬ－１５のみによって活性化された従来のＮＫ細胞）に比して増加することが実証された。理論には拘束されないが、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞によるＡＳＣＴの発現増加は、ＡＳＣＴ２結合性糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクター（例えば、ＢａＥＶ）の効率的な結合および取り込みを可能にする。
したがって、一部の態様では、本開示は、異種性ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチド）を発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を作製するための方法であって、ＡＳＣＴ２を発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を、ＡＳＣＴに結合する糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクター（例えば、ＢａＥＶ）と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の態様では、ＡＳＣＴ２を発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団の提供は、初代ヒトＮＫ細胞の集団を、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５と接触させることを含む。一部の態様では、ＡＳＣＴ２を発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団の提供は、初代ヒトＮＫ細胞の集団をＩＬ－１２およびＩＬ－１８と接触させることを含む。一部の態様では、初代ヒトＮＫ細胞の集団を、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団、例えば、対照ＮＫ細胞（例えば、ＩＬ－１５のみと接触させた従来のＮＫ細胞）に比して１つまたは複数の最適な特性を有する、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させる。
加えて、本開示は、少なくとも一部には、ヒト初代ＮＫ細胞の集団におけるＡＳＣＴ２の発現が、ＮＫ細胞の成熟および／または発生の段階と相関することの発見に基づく。本明細書において実証されるように、相対的に成熟しておらず、発生が進んでおらず、“幹細胞様”であり、および／または増殖性である表現型に特徴的なマーカーを発現するヒト初代ＮＫ細胞の集団のサブセット（例えば、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６ｌｏｗ／－ＮＫＧ２Ａ＋ＣＤ５７－ＫＩＲｓ－）は、より成熟しており、および／または発生が進んでいる表現型に特徴的な表現型マーカーを発現する集団のサブセット（例えば、ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫＧ２Ａ＋／－ＫＩＲｓ＋ＣＤ５７＋）に比して、ＡＳＣＴ２発現のレベルが増大している。理論には拘束されないが、相対的に成熟していないヒト初代ＮＫ細胞によるＡＳＣＴ２の発現がより高いことは、より成熟している表現型を有し、かつＡＳＣＴ発現がより低いヒト初代ＮＫ細胞に比して、ＡＳＣＴに結合する糖タンパク質によってシュードタイプ化されたレンチウイルス（例えば、ＢａＥＶ）を使用する形質導入効率の増大をもたらすと考えられる。
さらに、本開示は、ヌクレオフォスミンにおける４ヌクレオチド重複でありＡＭＬの約３５％においてがん遺伝子変異のドライバーとなっている、ＮＰＭ１ｃにおいて同定された腫瘍特異的発がんドライバー遺伝子変異に起因する細胞内ネオ抗原に由来するネオエピトープを標的とする新規キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を提供する。この変異は、最も一般的なＨＬＡ－Ａ２アレルによって提示されるネオエピトープを作り出す。
本開示の抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ発現サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞（“ＭＬ ＮＫ”細胞）は、ＮＰＭ１ｃ発現細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで効果的に殺滅することが示されている。理論には拘束されないが、本開示の操作されたＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞は、少なくともサイトカイン放出症候群、神経毒性および／または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を回避する、軽減する、または排除することによって、ＣＡＲを発現するＴ細胞を上回る治療上の利益をもたらすと考えられる。本開示の操作されたＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞は、従来のＮＫ細胞に比して、インターフェロン－γ（ＩＮＦ－γ）産生および腫瘍細胞に対する細胞傷害が増強していることが示されている。本明細書において実証されるように、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲをそのようなＭＬ ＮＫ細胞に組み入れることにより、ＮＰＭ１ｃを発現する標的細胞のアポトーシスを誘導し、かつそのような標的細胞の全生存期間を減少させる細胞がもたされた。さらに、ＮＰＭ１ｃを発現するＡＭＬ細胞をマウスに注射した場合に、本開示の操作されたＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで全体的腫瘍量を減少させた。本明細書にさらに記載されるように、そのような操作されたＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞の有効性は、そのような細胞が分泌型または膜結合型のヒトＩＬ－１５を発現する場合に高くなる。特に、膜結合型のヒトＩＬ－１５を発現する本開示の操作されたＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞は、持続性および生存性の増大、ならびに有効性の増強を示した。
したがって、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞は、ＮＰＭ１ｃ変異を保有するがんを治療するための標的化免疫療法のために有用である。例えば、本明細書に開示されるＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞は、ＡＭＬを治療するための標的化免疫療法のために有用である。一態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープがＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成している（またはそれによって提示される）場合に、そのようなエピトープを含む抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するＭＬ ＮＫ細胞が、本明細書において提供される。一態様では、以下のアミノ酸配列：ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）のうちのネオエピトープがＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成している場合に、そのようなエピトープの１つまたは複数に特異的に結合するＣＡＲを発現するＭＬ ＮＫ細胞が、本明細書において提供される。一態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質単独には結合しないか、または実質的に結合しないＣＡＲを発現するＭＬ ＮＫ細胞が、本明細書において提供される。一態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド（例えば、対照ペプチドは、ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープ（例えば、配列番号６２を含むペプチド）またはインフルエンザウイルスＭ１エピトープ（例えば、配列番号６３を含むペプチド）である）には結合しないか、または実質的に結合しないＣＡＲを発現するＭＬ ＮＫ細胞が、本明細書において提供される。一態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ単独（ＭＨＣクラスＩタンパク質を伴わない）には結合しないか、または実質的に結合しないＣＡＲを発現するＭＬ ＮＫ細胞が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含み、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）である。一部の態様では、抗原はがん細胞の表面にある（例えば、がんがＮＰＭ１ｃ＋である場合、例えば、がんがＡＭＬである場合）。一態様では、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成したＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列に特異的に結合するＣＡＲを発現するＭＬ ＮＫ細胞が、本明細書において提供される。
一態様では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現メモリー様ＮＫ細胞（および任意選択で、薬学的に許容される担体）を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
一態様では、本明細書に記載されるサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞によって発現されるＣＡＲポリペプチドは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成したＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列に特異的に結合する。
一態様では、ＣＡＲポリペプチドの発現は、ＭＬ ＮＫ細胞を、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを表面に提示しているがん細胞（例えば、がんはＡＭＬである）に標的化させる。一態様では、ＣＡＲポリペプチドの発現は、ＭＬ ＮＫ細胞を、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を表面に提示しているがん細胞（例えば、がんはＡＭＬである）に標的化させる。
一態様では、対象（例えば、ヒト）においてがんを治療する方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示しており、本明細書に記載される抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ発現メモリー様ＮＫ細胞または前記細胞の集団を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。一態様では、がんを含む細胞の細胞表面は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する。一態様では、がんを含む細胞の細胞表面は、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成したＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を提示する。
一部の態様では、対象（例えば、ヒト）においてＮＰＭ１ｃ陽性がんを治療する方法であって、本明細書に記載される抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ発現メモリー様ＮＫ細胞または前記細胞の集団を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。
一態様では、対象（例えば、ヒト）においてＡＭＬを治療する方法であって、本明細書に記載される抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ発現メモリー様ＮＫ細胞または前記細胞の集団を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。
サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞を発現する抗ＮＰＭ１ｃキメラ抗原受容体
一部の実施形態では、本開示は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを発現するように操作された、サイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞、または前記細胞の集団を提供する。
キメラ抗原受容体ポリペプチド
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞は、ＣＡＲポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、本明細書に記載される抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含む細胞外ドメインを含む。
ＣＡＲは、遺伝子操作された人工的な膜結合タンパク質であり、免疫エフェクター細胞（例えば、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞）において発現された場合に、そのような免疫エフェクター細胞を抗原に導き、一般に、免疫エフェクター細胞を刺激して、抗原を提示する細胞を殺滅する。したがって、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞に所望の抗原特異性、例えば、抗腫瘍特異性（特に、抗原特異性はＣＡＲの細胞外ドメインによって付与される）を付与するために使用され得る。
ＣＡＲは一般に、細胞上に提示される１つまたは複数の抗原に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞外ドメインが１つまたは複数の抗原に結合した際に活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝達する細胞内ドメインとを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、以下の３つのドメインを含有する：１）典型的にはシグナルペプチド、リガンドまたは抗原認識領域（例えば、ｓｃＦｖ）および可動性スペーサーを含む、細胞外ドメイン；２）膜貫通（ＴＭ）ドメイン；３）典型的には１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン（細胞質ドメインとしても知られる）。ＣＡＲの細胞外ドメインは細胞の外側に存在し、細胞外空間に露出されているため、そのリガンド／抗原との相互作用のためにアクセス可能である。ＴＭドメインは、ＣＡＲがエフェクター細胞の細胞膜に係留されることを可能にする。ＣＡＲの細胞内ドメインは、細胞外ドメインの由来となったタンパク質とは異なるシグナル伝達タンパク質に由来する１つまたは複数の細胞質ドメインを含み得る。細胞内ドメインは、ＣＡＲがそのリガンド／抗原に結合した際にエフェクター細胞活性化を助ける。一部の実施形態では、エフェクター細胞活性化は、サイトカインおよびケモカインの産生の誘導、ならびにエフェクター細胞の細胞溶解活性の活性化を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞傷害性を腫瘍細胞へと再方向付けする。
ＣＡＲの抗原結合ドメインと標的細胞の表面上のその標的抗原とのエンゲージメントは、ＣＡＲのクラスター化をもたらし、活性化刺激をＣＡＲ含有細胞に送達する。一部の実施形態では、ＣＡＲの主な特徴は、免疫エフェクター細胞の特異性を再方向付けし、それによって、増殖、サイトカイン産生、ファゴサイトーシス、またはモノクローナル抗体、可溶性リガンド、もしくは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を活用する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）非依存的な様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を誘発する、その能力である。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲポリペプチドは、ネオ抗原（例えば、がんネオ抗原または腫瘍ネオ抗原）に結合する細胞外ドメインを含む。がんネオ抗原は、そのようながん細胞に生じた変異が原因で、がん細胞のみに存在する抗原である。がん抗原は、細胞内で発現されて、がん細胞の表面上のＭＨＣクラスＩタンパク質によって提示され得る。例えば、本明細書で想定されるＣＡＲポリペプチドによって標的化されるがんネオ抗原は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２であってもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＣＡＲポリペプチドを作るために使用される。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）が、ＣＡＲポリペプチドを作製するために使用される。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドの細胞外結合ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープ（例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ）に結合する。
一部の態様では、細胞外（抗原結合）ドメインと、膜貫通ドメインと、抗原結合ドメインが抗原に結合した際にＮＫ細胞を刺激するのに十分なＣＤ３ζ配列の細胞質配列を含む細胞内（細胞質）ドメインと、さらに任意選択で、抗原結合ドメインが抗原に結合した場合にＮＫ細胞の共刺激をもたらす、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、または４つの）共刺激タンパク質の細胞質配列（例えば、Ｂ７－Ｈ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１２、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドのうちの１つまたは複数の細胞質配列）とを含む、ＣＡＲポリペプチドが、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、リンカーをさらに含み得る。例示的な細胞外（抗原結合）ドメイン、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内（細胞質）ドメインを含む、ＣＡＲおよびＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞のさらなる態様は、例えば、Kakarla et al., Cancer J. 20:151-155, 2014; Srivastava et al., Trends Immunol. 36:494-502, 2015; Nishio et al., Oncoimmunology 4(2): e988098, 2015; Ghorashian et al., Br. J. Haematol. 169:463-478, 2015; Levine, Cancer Gene Ther. 22:79-84, 2015; Jensen et al., Curr. Opin. Immunol. 33:9-15, 2015; Singh et al., Cancer Gene Ther. 22:95-100, 2015; Li et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1753-1756, 2014; Gill et al., Immunol. Rev. 263:68-89, 2015; Magee et al., Discov. Med. 18:265-271, 2014; Gargett et al., Front. Pharmacol. 5:235, 2014; Yuan et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1137-1141, 2014; Pedgram et al., Cancer J. 20:127-133, 2014; Eshhar et al., Cancer J. 20:123-126, 2014; Ramos et al., Cancer J. 20:112-118, 2014; Maus et al., Blood 123:2625-2635, 2014; Jena et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 9:50-56, 2014; Maher et al., Curr. Gene Ther. 14:35-43, 2014; Riches et al., Discov. Med. 16:295-302, 2013; Cheadle et al., Immunol. Rev. 257:83-90, 2014; Davila et al., Int. J. Hematol. 99:361-371, 2014; Xu et al., Cancer Lett. 343:172-178, 2014; Kochenderfer et al., Nat. Rev. Clin. Oncol. 10:267-276, 2013; Hosing et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 8:60-70, 2013; Hombach et al., Curr. Mol. Med. 13:1079-1088, 2013; Xu et al., Leuk. Lymphoma 54:255-260, 2013; Gilham et al., Trends Mol. Med. 18:377-384, 2012; Lipowska-Bhalla et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:953-962, 2012; Chmielewski et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:1269-1277, 2013; Jena et al., Blood 116:1035-1044, 2010; Dotti et al, Immunology Reviews 257(1): 107-126, 2013; Dai et al., Journal of the National Cancer Institute 108(7): djv439, 2016; Wang and Riviere, Molecular Therapy-Oncolytics 3: 16015, 2016；米国特許出願公開第２０１８／００５７６０９号明細書号明細書；同２０１８／００３７６２５号明細書；同２０１７／０３６２２９５号明細書；同２０１７／０１３７７８３号明細書；同２０１６／０１５２７２３号明細書、同２０１６／０２０６６５６号明細書、同２０１６／０１９９４１２号明細書、同２０１６／０２０８０１８号明細書、同２０１５／０２３２８８０号明細書、同２０１５／０２２５４８０号明細書；同２０１５／０２２４１４３号明細書；同２０１５／０２２４１４２号明細書；同２０１５／０１９０４２８号明細書；同２０１５／０１９６５９９号明細書；同２０１５／０１５２１８１号明細書；同２０１５／０１４００２３号明細書；同２０１５／０１１８２０２号明細書；同２０１５／０１１０７６０号明細書；同２０１５／００９９２９９号明細書；同２０１５／００９３８２２号明細書；同２０１５／００９３４０１号明細書；同２０１５／００５１２６６号明細書；同２０１５／００５０７２９号明細書；同２０１５／００２４４８２号明細書；同２０１５／００２３９３７号明細書；同２０１５／００１７１４１号明細書；同２０１５／００１７１３６号明細書；同２０１５／００１７１２０号明細書；同２０１４／０３７００４５号明細書；同２０１４／０３７００１７号明細書；同２０１４／０３６９９７７号明細書；同２０１４／０３４９４０２号明細書；同２０１４／０３２８８１２号明細書；同２０１４／０３２２２７５号明細書；同２０１４／０３２２２１６号明細書；同２０１４／０３２２２１２号明細書；同２０１４／０３２２１８３号明細書；同２０１４／０３１４７９５号明細書；同２０１４／０３０８２５９号明細書；同２０１４／０３０１９９３号明細書；同２０１４／０２９６４９２号明細書；同２０１４／０２９４７８４号明細書；同２０１４／０２８６９７３号明細書；同２０１４／０２７４９０９号明細書；同２０１４／０２７４８０１号明細書；同２０１４／０２７１６３５号明細書；同２０１４／０２７１５８２号明細書；同２０１４／０２７１５８１号明細書；同２０１４／０２７１５７９号明細書；同２０１４／０２５５３６３号明細書；同２０１４／０２４２７０１号明細書；同２０１４／０２４２０４９号明細書；同２０１４／０２２７２７２号明細書；同２０１４／０２１９９７５号明細書；同２０１４／０１７０１１４号明細書；同２０１４／０１３４７２０号明細書；同２０１４／０１３４１４２号明細書；同２０１４／０１２０６２２号明細書；同２０１４／０１２０１３６号明細書；同２０１４／０１０６４４９号明細書；同２０１４／０１０６４４９号明細書；同２０１４／００９９３４０号明細書；同２０１４／００８６８２８号明細書；同２０１４／００６５６２９号明細書；同２０１４／００５０７０８号明細書；同２０１４／００２４８０９号明細書；同２０１３／０３４４０３９号明細書；同２０１３／０３２３２１４号明細書；同２０１３／０３１５８８４号明細書；同２０１３／０３０９２５８号明細書；同２０１３／０２８８３６８号明細書；同２０１３／０２８７７５２号明細書；同２０１３／０２８７７４８号明細書；同２０１３／０２８０２２１号明細書；同２０１３／０２８０２２０号明細書；同２０１３／０２６６５５１号明細書；同２０１３／０２１６５２８号明細書；同２０１３／０２０２６２２号明細書；同２０１３／００７１４１４号明細書；同２０１２／０３２１６６７号明細書；同２０１２／０３０２４６６号明細書；同２０１２／０３０１４４８号明細書；同２０１２／０３０１４４７号明細書；同２０１２／００６０２３０号明細書；同２０１１／０２１３２８８号明細書；同２０１１／０１５８９５７号明細書；同２０１１／０１０４１２８号明細書；同２０１１／００３８８３６号明細書；同２００７／００３６７７３号明細書；および同２００４／００４３４０１号明細書に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
例示的な細胞外（抗原結合）ドメイン、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内（細胞質）ドメインを含む、ＣＡＲおよびＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞のさらなる態様は、国際公開第２０１６／１６８５９５号パンフレット；国際公開第１２／０７９０００号パンフレット号；同２０１５／０１４１３４７号パンフレット；同２０１５／００３１６２４号パンフレット；同２０１５／００３０５９７号パンフレット；同２０１４／０３７８３８９号パンフレット；同２０１４／０２１９９７８号パンフレット；同２０１４／０２０６６２０号パンフレット；同２０１４／００３７６２８号パンフレット；同２０１３／０２７４２０３号パンフレット；同２０１３／０２２５６６８号パンフレット；同２０１３／０１１６１６７号パンフレット；同２０１２／０２３０９６２号パンフレット；同２０１２／０２１３７８３号パンフレット；同２０１２／００９３８４２号パンフレット；同２０１２／００７１４２０号パンフレット；同２０１２／００１５８８８号パンフレット；同２０１１／０２６８７５４号パンフレット；同２０１０／０２９７０９３号パンフレット；同２０１０／０１５８８８１号パンフレット；同２０１０／００３４８３４号パンフレット；同２０１０／００１５１１３号パンフレット；同２００９／０３０４６５７号パンフレット；同２００４／００４３４０１号パンフレット；同２０１４／０３２２２５３号パンフレット；同２０１５／０１１８２０８号パンフレット；同２０１５／００３８６８４号パンフレット；同２０１４／００２４６０１号パンフレット；同２０１２／０１４８５５２号パンフレット；同２０１１／０２２３１２９号パンフレット；同２００９／０２５７９９４号パンフレット；同２００８／０１６０６０７号パンフレット；同２００８／０００３６８３号パンフレット；同２０１３／０１２１９６０号パンフレット；同２０１１／００５２５５４号パンフレット；同２０１０／０１７８２７６号パンフレットに記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
一部の態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むＣＡＲであって、細胞外ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含むＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外結合ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含み、そのような抗体、その抗原結合断片、または二重特異性分子が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合する、ＣＡＲが、本明細書において提供される。
一部の態様では、実施例の項に記載される（例えば、実施例１を参照）、ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲの細胞内、膜貫通および／または細胞外ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、本明細書において提供される。
一部の態様では、以下：ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７およびＤＡＰ１２、からなる群から選択される、１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインと、任意選択で、４－１ＢＢ共刺激ドメインとを含む細胞内ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の態様では、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の態様では、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）変異型ヌクレオフォスミンタンパク質エピトープ（例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ）を含む抗原に特異的に結合する、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）ネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬを含む本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、ＶＨが、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を含む、ＣＡＲポリペプチドが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨを含み、ならびに／または配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含み、ＶＨのＣＤＲが配列番号５のアミノ酸配列を有し、ならびに／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、ＶＬのＣＤＲが配列番号３のアミノ酸配列を有する、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ、または配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドが、本明細書において提供される。
ＣＡＲの細胞外（抗原結合）ドメイン
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞において発現されるＣＡＲポリペプチドは、細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは抗原結合ドメインを含む。
抗原結合ドメインの非限定的な例には、以下のものが挙げられる：モノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）（例えば、完全ヒト抗体またはキメラ（例えば、ヒト化）抗体）、抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２断片）（例えば、完全ヒト抗体またはキメラ（例えば、ヒト化）抗体の断片）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦａｂ、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ｈｃ－ＩｇＧ、ＢｉＴＥ、単一ドメイン抗体（例えば、Ｖ－ＮＡＲドメインまたはＶｈＨドメイン）、ＩｇＮＡＲ、および多重特異性（例えば、二重特異性抗体）抗体。一部の実施形態では、抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含む。これらの抗原結合ドメインを作製する方法は、当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合し得る抗体、例えば、免疫グロブリン分子（例えば、軽鎖または重鎖免疫グロブリン分子）および免疫グロブリン分子の免疫学的活性（抗原結合）断片の、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの）ＣＤＲ（例えば、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン由来の３つのＣＤＲのうちのいずれか、および／または免疫グロブリン重鎖可変ドメイン由来の３つのＣＤＲのうちのいずれか）を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖抗体（例えば、Ｖ－ＮＡＲドメインもしくはＶＨＨドメイン、または本明細書に記載される単鎖抗体のいずれか）である。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体分子全体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）またはマルチマー抗体（例えば、二重特異性抗体）である。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインには、抗体断片および多重特異性（例えば、二重特異性）抗体または抗体断片が含まれる。抗体およびその抗原結合断片の例としては、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含有する断片が挙げられるが、これらには限定されない。
本明細書において提供されるさらなる抗原結合ドメインは、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性（マルチマー、例えば、二重特異性）の、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ）、単鎖抗体、細胞内で生成される抗体（すなわち、イントラボディ）、およびそれらの抗原結合断片である。抗体またはその抗原結合断片は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであり得る。
抗原結合ドメインのさらなる例は、ＩｇＧの抗原結合断片（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の抗原結合断片）（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ、例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４の抗原結合断片）、ＩｇＡの抗原結合断片（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２の抗原結合断片）（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ、例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２の抗原結合断片）、ＩｇＤの抗原結合断片（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＤの抗原結合断片）、ＩｇＥの抗原結合断片（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＥの抗原結合断片）、またはＩｇＭの抗原結合断片（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＭの抗原結合断片）である。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば、食塩水中またはリン酸緩衝食塩水中で、特定の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に、約１×１０－７Ｍまたはより強い（例えば、約１×１０－８Ｍもしくはより強い、約１×１０－９Ｍもしくはより強い、約５００ｎＭもしくはより強い、約１００ｎＭもしくはより強い、約２５ｎＭもしくはより強い、約１５ｎＭもしくはより強い、約７ｎＭもしくはより強い、約５ｎＭまたはそれ未満、または約１ｎＭもしくはより強い）親和性（ＫＤ）で結合することができる。
当業者には理解されるように、ＣＡＲに含められる抗原結合ドメインの選択は、それを必要とする対象において標的とされる細胞（例えば、がん細胞または腫瘍）の表面を規定するリガンドの型および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインを、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、例えば、がんネオ抗原を認識するように選択してもよい。例えば、腫瘍特異的抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＭＰ１ｃネオ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）であってもよい。一部の実施形態では、ＮＭＰ１ｃネオ抗原は、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、急性骨髄性白血病の腫瘍抗原を認識する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、例えば、急性骨髄性白血病ネオ抗原である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞上には存在しない。一実施形態では、腫瘍抗原は腫瘍特異的抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍特異的抗原は、患者の腫瘍細胞を配列決定し、腫瘍中にのみ見出される変異したタンパク質を同定することによって決定される。これらの抗原は、「ネオ抗原」と称される。ネオ抗原がひとたび同定されると、それに対して治療用抗体を産生させて、本明細書に記載される方法に使用することができる。一実施形態では、ネオ抗原はＮＰＭ１ｃネオ抗原である。一実施形態では、ＮＭＰ１ｃネオ抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成している（またはそれによって提示される）。
ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞）によって標的化し得る腫瘍抗原（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ））には、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２が含まれるが、これには限定されない。一実施形態では、腫瘍特異的抗原はＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２である。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＭＨＣタンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ネオエピトープ（例えば、がんネオエピトープ）を含む抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣタンパク質単独には結合しないか、または実質的に結合しない。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合しない。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ネオエピトープ単独（ＭＨＣタンパク質を伴わない）には結合しないか、または実質的に結合しない。
機能的ＭＨＣクラスＩ分子は、α重鎖およびβ２－ミクログロブリン鎖を含む。ＭＨＣクラスＩ分子によるペプチド結合は、ペプチドアミノ酸側鎖と、重鎖のα１およびα２ドメインによって形成されるＭＨＣ分子のペプチド結合グルーブ内部の分散したポケットとの相互作用によって達成される。典型的には、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の場合、主な結合エネルギーは、ペプチドの位置２およびＣ末端の残基とＭＨＣ分子のそれぞれＢおよびＦ結合ポケットとの相互作用に由来するが、ペプチド全域にわたる側鎖がＭＨＣの結合能力を向上させるかまたは減じさせることができる（例えば、Guo, et al (1992) Nature 360:364; Silver et al (1992) Nature 360:367; Gorga et al (1992) Proteins 12;87; Madden (1995) Annu Rev Immunol 13:587; Madden et al (1993) Cell 75;693; Madden et al (1992) Cell 70:1035; Bjorkman, et al (1987) Nature 329:512; Saper et al (1991) J Mol Biol 219:277を参照）。９アミノ酸残基のペプチドの場合、Ｃ末端残基（位置９）は、ＭＨＣ分子のＦ結合ポケットと相互作用する。
ＭＨＣ分子は極めて多型性であり、数千ものアレル変異体がクラスＩＡおよびＢ座位で同定されている。多型のほとんどはペプチド結合ポケットに存在し、その結果、ＭＨＣ分子は多岐にわたるペプチド結合特異性を有する。この多型性にもかかわらず、当技術分野では、ＨＬＡクラスＩ分子を、共通のペプチド結合特異性に基づいて、複数のグループ（すなわち、スーパータイプ）にまとめることができることが公知である。各グループ（スーパータイプ）は、「アンカー残基」またはＭＨＣ結合のために重要な残基であるペプチドの位置を反映するペプチドコンセンサス配列によって定義される。例えば、Ａ２－スーパータイプのＨＬＡクラスＩ分子（すなわち、ＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされるタンパク質）は、ペプチドの位置２に小型の脂肪族残基（例えば、アラニン、チロシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン）、ならびにＣ末端に脂肪族残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン）または小型の疎水性残基（例えば、アラニン、バリン）を有するペプチドに対して、共通の特異的結合を有する（例えば、Sidney, et al (2008) BMC Immunology 9:1を参照）。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した（またはそれによって提示される）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）関連変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に結合する（例えば、特異的に結合する）。
ＡＭＬのゲノム解析により、ＡＭＬは他のほとんどの成人がんよりも変異負荷が少なく、ＡＭＬ患者あたりのコーディング変異は平均１３個であることが示されている（Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Alexandrov et al., NATURE 500: 415 (2013); Kandoth et al., NATURE 502 333 (2013)を参照）。しかし、ＡＭＬにおける体細胞変異は、しばしば同一の遺伝子に存在し（Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Papaemmanuil et al., N Engl J Med 374: 2209 (2016)を参照）、このため、これらのホットスポット変異に由来するネオ抗原は、腫瘍特異的免疫療法の魅力的な標的となっている（van der Lee et al., J CLIN INVEST 129: 774 (2019)を参照）。最もよく見られる変異の一つに、ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１；ＮＰＭ１によってコードされる）をコードする重要なドライバー遺伝子における４ヌクレオチド重複があり、これは成人ＡＭＬ患者全体の３０～３５％に存在する（Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Papaemmanuil et al., N Engl J Med 374: 2209 (2016); Falini et al., N Engl J Med 352: 254 (2005)を参照）。ＮＰＭ１におけるそのような変異は異常な細胞質局在をもたらし、この変異型タンパク質はＮＰＭ１ｃと称される。ＡＭＬに関連するＮＰＭ１ｃ変異型タンパク質は、ＨＬＡクラスＩ拘束性であって、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルおよび他のいくつかのアレルを有する患者の白血病性芽球上に提示される白血病性ネオ抗原を生成する。例えば、ＮＰＭ１ｃは、最も一般的なＨＬＡ－Ａ＊０２０１アレル（ヒト集団の約５０％）によって提示される白血病特異的ネオ抗原エピトープ（ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱと略記）を生じる（Greiner et al., BLOOD 120: 1282 (2012)を参照）。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合する。ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドにとって妥当である任意の長さである。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは、５～２０アミノ酸、６～１９アミノ酸、７～１８アミノ酸、８～１７アミノ酸、８～１６アミノ酸、８～１５アミノ酸、８～１５アミノ酸、８～１４アミノ酸、８～１３アミノ酸、８～１２アミノ酸、９～１２アミノ酸、または９～１１アミノ酸である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは１２アミノ酸である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは１１アミノ酸である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは１０アミノ酸である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは９アミノ酸である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは８アミノ酸である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、１０、１５、２０、３０、４０、５０、または１００アミノ酸残基長のポリペプチドの内部の、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個の連続したアミノ酸のペプチドである。
一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＨＬＡ－Ａ２であるＭＨＣクラスＩタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２に結合するＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列の位置２が小型の脂肪族残基（例えば、アラニン、チロシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン）であって、アミノ酸配列のＣ末端残基が脂肪族残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン）または小型の疎水性残基（例えば、アラニン、バリン）である、アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２に結合するＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列の位置２がバリン、イソロイシンまたはロイシンであって、アミノ酸配列のＣ末端残基がバリン、ロイシン、またはイソロイシンである、アミノ酸配列を含む。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが８アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、Ｃ末端アミノ酸は位置８である。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが９アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、Ｃ末端アミノ酸は位置９である。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが１０アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、Ｃ末端アミノ酸は位置１０である。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが１１アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、Ｃ末端アミノ酸は位置１１である。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが１２アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、Ｃ末端アミノ酸は位置１２である。
ＨＬＡ－Ａ２に結合する、ＮＰＭ１ｃに由来するネオエピトープは、当技術分野で公知である。例えば、Greiner (2012) Blood 120:1282は、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）およびＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）を含む、ＨＬＡ－Ａ２に結合する９ｍｅｒのＮＰＭ１ｃネオエピトープのアミノ酸配列を同定している。さらなる一例として、van der Lee (2019) J Clin Invest 129:774は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）を含む、ＨＬＡ－Ａ２クラスＩ分子に結合するＮＰＭ１ｃネオエピトープのアミノ酸配列、さらには、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）を含む、他のＨＬＡハプロタイプによってコードされるＭＨＣクラスＩ分子に結合するＮＰＭ１ｃネオエピトープのアミノ酸配列を同定している。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質との複合体を形成した（またはそれによって提示される）変異型ヌクレオフォスミンタンパク質のネオエピトープを含む抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に結合し（例えば、特異的に結合し）、ヌクレオフォスミンタンパク質における変異は、ヌクレオフォスミンをコードする遺伝子における４ヌクレオチド重複に起因する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質との複合体を形成した（またはそれによって提示される）細胞質性（細胞質中に位置する）変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に結合する（例えば、特異的に結合する）。一部の実施形態では、ネオエピトープは、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質に由来する８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、ネオエピトープは、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基に由来する、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、ネオエピトープは、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質のＣ末端の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基に由来する、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質は、配列番号５６によって示されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、配列番号５６のアミノ酸配列を含むタンパク質に由来する、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、配列番号５６によって示されるアミノ酸配列の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基に由来する、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、配列番号５６によって示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＣ末端の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基に由来する、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）配列番号５６のアミノ酸配列を含むタンパク質のネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する。
一部の実施形態では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質は、Ｃ末端アミノ酸配列ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）Ｃ末端アミノ酸配列ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むＮＰＭ１ｃタンパク質のネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、ネオエピトープは、ＮＰＭ１ｃタンパク質のＣ末端アミノ酸配列ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）に由来する、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされるタンパク質との複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原（すなわち、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃはヒトＮＰＭ１ｃである。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされるタンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）細胞質性変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原に結合し（例えば、特異的に結合し）、ネオエピトープのアミノ酸配列は、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）またはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含む抗原に結合する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む抗原に結合する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質単独および／またはＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド（例えば、対照ペプチドは、ネオエピトープと同じ数のアミノ酸を有するが、ネオエピトープの由来となったタンパク質とは異なるタンパク質に由来する）には結合しないか、または実質的に結合しない。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、細胞質性変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープ単独（ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ２を伴わない）には結合しないか、または実質的に結合しない。
一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含み、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含み、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）である。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されている。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶを含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶのうちのいずれか１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸は置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ配列（配列番号１）における既存の残基と類似のサイズのアミノ酸残基による置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、抗原への細胞外ドメインの結合に影響しない（または実質的に影響しない）。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶを含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちの１つ、２つ、またはより多くのアンカー残基が置換されている（例えば、配列番号１の位置２および／または位置９、例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）の下線が付された残基）。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、抗原への細胞外ドメインの結合、またはクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）へのネオエピトープの結合に影響しない（または実質的に影響しない）。一部の実施形態では、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）の第２位にあるアミノ酸残基Ｉは、アミノ酸残基Ｌ（ロイシン）で置換されている。一部の実施形態では、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）の第２位にあるアミノ酸残基Ｉは、アミノ酸残基Ｖ（バリン）、Ｍ（メチオニン）、チロシン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはＡ（アラニン）で置換されている。一部の実施形態では、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）の第９位にあるアミノ酸残基Ｖは、アミノ酸残基Ｉ（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｍ（メチオニン）、またはＡ（アラニン）で置換されている。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶを含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されており、置換は保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した、表１に特定されているアミノ酸配列を含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する。
Figure 2023517063000002
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に特異的に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されており、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に対して同じまたは実質的に同じ結合親和性を有する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に特異的に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されており、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に対して、同じまたはより良好な親和性で特異的に結合する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されており、抗体または抗原結合断片は、０．１～１００ｎＭ（例えば、０．１～５０ｎＭ、０．１～２５ｎＭ、０．１～１５ｎＭ）のＫＤを有する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されており、細胞外ドメインは、１００ｎＭ未満（例えば、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満）のＫＤで結合する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＮＰＭ１ｃエピトープに結合し（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）、抗がん効果または抗腫瘍効果（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの抗がん効果、任意選択で、がんはＡＭＬである）を有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、細胞外ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、ネオエピトープは、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループを含むＨＬＡ－Ａアレルによってコードされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＡアレルはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、本明細書に記載される重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、本明細書に記載される１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する（例えば、ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖのＣＤＲを有する。例えば、配列の項および実施例を参照）抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する細胞外ドメインは、ｓｃＦｖを含む。ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するｓｃＦｖの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性の違いの少なくとも９５％は、ｓｃＦｖのフレームワーク領域にある（または相補性決定領域（ＣＤＲ）にはない）。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号５を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性における違いの少なくとも９５％は、ＶＨのフレームワーク領域にある（または相補性決定領域（ＣＤＲ）にはない）。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号３（ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖのＶＬのアミノ酸配列）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３に示されるアミノ酸配列との同一性における違いの少なくとも９５％またはすべては、ＶＬのフレームワーク領域にある（または相補性決定領域（ＣＤＲ）にはない）。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号５を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、およびアミノ酸配列配列番号３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬのそれぞれは、それぞれ配列番号５および配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５および配列番号３に示されるアミノ酸配列との同一性における違いの少なくとも９５％またはすべては、ＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域にある（または相補性決定領域（ＣＤＲ）にはない）。
本開示の抗原結合断片のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ、およびＩＭＧＴを含む、当技術分野における様々な手法で定義される。
一部の態様では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムに従って定義され、これは配列可変性に基づく（例えば、Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391; Kabat EA et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照）。Ｋａｂａｔ ＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、本明細書に記載される抗体およびその断片のＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、Ｋａｂａｔシステムを使用して決定される、ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の態様では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムに従って定義され、これは免疫グロブリン構造ループ領域の位置に基づく（例えば、Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273 : 927-948; Chothia C et al, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82；および米国特許第７，７０９，２２６号明細書を参照）。「Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」という用語および同様の用語は、当技術分野で認識されており、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917の方法に従って決定される抗体ＣＤＲ配列を指し、これを本明細書では「Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」と称する（例えば、米国特許第７，７０９，２２６号明細書およびMartin, A., "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer- Verlag, Berlin (2001)を参照）。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムを使用して決定される、ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の態様では、ＣＤＲは、ＡｂＭシステムに従って定義され、これはＫａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの折衷案に相当するＡｂＭ超可変領域に基づいており、ＣＤＲはＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ．）を使用して決定される。ＡｂＭ ＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、ＣＤＲは、ＡｂＭシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＡｂＭシステムを使用して決定される、ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の態様では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムに従って定義される（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のウェブサイトimgt.org, founder and director: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Franceを参照；例えば、Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136およびLefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212を参照。これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＩＭＧＴ ＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＩＭＧＴシステムを使用して決定される、ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。
一部の態様では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔシステムに従って定義される。Ｃｏｎｔａｃｔの定義は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく（bioinf.org.uk/abs）（MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 5: 732-745を参照；例えば、Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer- Verlag, Berlin (2001)も参照のこと）。Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、Ｃｏｎｔａｃｔシステムを使用して決定される、ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＮＰＭ１ｃエピトープに特異的に結合する抗原結合断片を含み、上記のシステムのいずれかに従って定義される、ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖの１つ、２つ、もしくは３つのＶＨ ＣＤＲおよび／または１つ、２つ、もしくは３つのＶＬ ＣＤＲを含む。例えば、一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＮＰＭ１ｃエピトープに特異的に結合する抗原結合断片を含み、ＩＭＧＴによって定義される、ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖの１つ、２つ、もしくは３つすべてのＶＨ ＣＤＲおよび／または１つ、２つ、もしくは３つすべてのＶＬ ＣＤＲを含む。
当技術分野で公知であるように、ＶＨおよびＶＬは、フレームワーク領域によって囲まれたＣＤＲを含有する（ＣＤＲおよびＦＲ配列は、ＶＨおよびＶＬにおいて以下の順序で出現する：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４）。任意選択で、フレームワーク領域はヒトフレームワーク領域である。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号５を有する重鎖可変領域（ＶＨ）の１つ、２つまたは３つすべてのＶＨ ＣＤＲを有するＶＨを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＩＭＧＴによって定義される、アミノ酸配列配列番号５を有する重鎖可変領域（ＶＨ）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ ＣＤＲを有するＶＨを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）の１つ、２つまたは３つすべてのＶＬ ＣＤＲを有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＩＭＧＴによって定義される、アミノ酸配列配列番号３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）の１つ、２つまたは３つすべてのＶＬ ＣＤＲを有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号５を有する重鎖可変領域（ＶＨ）の１つ、２つまたは３つすべてのＶＨ ＣＤＲを有するＶＨ、およびアミノ酸配列配列番号３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）の１つ、２つまたは３つすべてのＶＬ ＣＤＲを有するＶＬを含む、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号１０のＶＨ ＣＤＲ２、および／またはアミノ酸配列配列番号１１のＶＨ ＣＤＲ３を有するＶＨを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号１０のＶＨ ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号１１のＶＨ ＣＤＲ３を有するＶＨを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含み、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸は置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、類似のサイズのアミノ酸残基による置換である。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、抗原への結合に影響せず（または実質的に影響せず）、または改善する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号６の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号７のＶＬ ＣＤＲ２、および／またはアミノ酸配列配列番号８のＶＬ ＣＤＲ３を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号６の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号７のＶＬ ＣＤＲ２、および／またはアミノ酸配列配列番号８のＶＬ ＣＤＲ３を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含み、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸が置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、類似のサイズのアミノ酸残基による置換である。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、抗原への結合に影響せず（または実質的に影響せず）、または改善する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号１０のＶＨ ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号１１のＶＨ ＣＤＲ３を有するＶＨ、ならびに／またはアミノ酸配列配列番号６の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号７のＶＬ ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号８のＶＬ ＣＤＲ３を有するＶＬを含む、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号１０のＶＨ ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号１１のＶＨ ＣＤＲ３を有するＶＨ、ならびにアミノ酸配列配列番号６の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号７のＶＬ ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号８のＶＬ ＣＤＲ３を有するＶＬを含む、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、本明細書に記載されるＶＨおよびＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原結合断片を含み、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸は置換されている。
一部の態様では、本明細書に記載されるＶＨおよび／またはＶＬ領域における１つまたは複数のＣＤＲは、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２への特異的結合が維持される限り、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸が異なってもよい。
一部の態様では、本明細書に提供される抗体断片は、親和性成熟しており、すなわち、記載される抗体または断片と比較して、１つまたは複数の相補性決定領域において１つまたは複数の変更を有し、そのような１つまたは複数の変更は、記載される抗体または断片に比して、抗原に対する抗体または断片の親和性の改善をもたらす。一部の態様では、本明細書に提供される抗体または断片は、抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、１００ｎＭ未満（例えば、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満）のＫｄを有する。一部の態様では、本明細書に提供される抗体または断片は、抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、７ｎＭ未満、５ｎＭ未満、または１ｎＭ未満（例えば、０．０１から１５ｎＭ、０．０１から１０ｎＭ、０．０１から７ｎＭ、０．０１から５ｎＭ、０．０１から１ｎＭ、０．１から１５ｎＭ、０．１から１０ｎＭ、０．１から７ｎＭ、０．１から５ｎＭ、０．１から１ｎＭ、１から１５ｎＭ、１から１０ｎＭ、１から７ｎＭ、１から５ｎＭ、５から１５ｎＭ、５から１０ｎＭ、または５から７ｎＭ）のＫｄを有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、３つの軽鎖可変領域相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ １～３）および３つの重鎖可変領域相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ １～３）を含む抗原結合断片を含む。一部の態様では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ）に対して少なくとも１０－７Ｍの結合親和性（Ｋｄ）を有する抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも１０－７Ｍもしくはより強い、少なくとも１０－８Ｍもしくはより強い、少なくとも１０－９Ｍもしくはより強い、少なくとも５００ｎＭもしくはより強い、少なくとも２５０ｎＭもしくはより強い、少なくとも１００ｎＭもしくはより強い、少なくとも５０ｎＭもしくはより強い、少なくとも２５ｎＭもしくはより強い、少なくとも２０ｎＭもしくはより強い、少なくとも１５ｎＭもしくはより強い、または少なくとも１０ｎＭもしくはより強い結合親和性（Ｋｄ）を有する。一部の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも約２５ｎＭもしくはより強い、少なくとも約１５ｎＭもしくはより強い、または少なくとも約１０ｎＭもしくはより強い結合親和性（Ｋｄ）を有する。一部の態様では、抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、０．１ｎＭと５００ｎＭ、０．１ｎＭと１００ｎＭ、０．５ｎＭと１００ｎＭ、０．１ｎＭと５０ｎＭ、０．５ｎＭと５０ｎＭ、０．１ｎＭと２５ｎＭ、０．５ｎＭと２５ｎＭ、０．１ｎＭと１５ｎＭ、０．５ｎＭと１５ｎＭ、０．１ｎＭと１０ｎＭ、もしくは０．５ｎＭと１０ｎＭの間（または前の値から後の値まで）、または１ｎＭから１００ｎＭ（またはその間の任意の値）の結合親和性（Ｋｄ）を有する。一部の態様では、抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、約０．１ｎＭと約１００ｎＭまたは約０．５ｎＭと約１００ｎＭの間（または前の値から後の値まで）の結合親和性（Ｋｄ）を有する。一部の態様では、抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、約０．１ｎＭと約５０ｎＭまたは約０．５ｎＭと約５０ｎＭの間（または前の値から後の値まで）の結合親和性（Ｋｄ）を有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも０．５±０．０２×１０４Ｍｓ－１またはより高いＫｏｎを有する抗原結合断片を含む。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも１±０．０２×１０４Ｍｓ－１またはより高いＫｏｎを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも２．５±０．０２×１０４Ｍｓ－１またはより高いＫｏｎを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも５±０．０２×１０４Ｍｓ－１またはより高いＫｏｎを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、０．５±０．０２×１０４Ｍｓ－１と５０±０．０２×１０４Ｍｓ－１の間（または前の値から後の値まで）のＫｏｎを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、１±０．０２×１０４Ｍｓ－１と１０±０．０２×１０４Ｍｓ－１の間（または前の値から後の値まで）のＫｏｎを有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、５０±０．０２×１０－４ｓ－１未満のＫｏｆｆを有する抗原結合断片を含む。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、１０±０．０２×１０－４ｓ－１未満のＫｏｆｆを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、５±０．０２×１０－４ｓ－１未満のＫｏｆｆを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、０．５±０．０２×１０－４ｓ－１と５０±０．０２×１０－４ｓ－１の間（または前の値から後の値まで）のＫｏｆｆを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、ｂｅｔｗｅｅｎ１±０．０２×１０－４ｓ－１と１５±０．０２×１０－４ｓ－１の間（または前の値から後の値まで）のＫｏｆｆを有する。
本明細書に提供される抗原結合分子は、抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に特異的に結合する。一部の態様では、抗原結合分子による結合を受ける抗原は、がん細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）によって提示される。一部の実施形態では、がん細胞はＡＭＬ細胞である。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、単鎖抗体、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。一部の態様では、ｓｃＦｖは、ヒトまたはヒト化ｓｃＦｖである。一部の態様では、ｓｃＦｖはリンカーを含む。一部の態様では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号５８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号５９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６０）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６１）からなる群から選択される。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号４）を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、抗体の抗原結合断片を含み、断片は、限定されないが、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）であり得る。一実施形態では、細胞外ドメインはＦｖ断片を含む。一実施形態では、細胞外ドメインはＦａｂ断片を含む。一実施形態では、細胞外ドメインはＦ（ａｂ’）断片を含む。一実施形態では、細胞外ドメインはＦ（ａｂ’）２断片を含む。
膜貫通ドメイン
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＲポリペプチドは、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、天然の供給源に由来する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。本明細書に記載されるＣＡＲに使用し得る膜貫通ドメインの非限定的な例は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来し得る（例えば、少なくともその膜貫通配列または膜貫通配列の一部を含む）。一実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ４分子に由来する。一実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８分子に由来する。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは合成性である。例えば、膜貫通ドメインが合成供給源に由来する一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、疎水性残基（例えば、ロイシンおよびバリン）を含み得る（例えば、主として含む）。一部の実施形態では、合成膜貫通ドメインは、合成膜貫通ドメインの最後に、少なくとも１つの（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの）フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインを含む。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞質ドメイン内の配列に天然で付随する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑える目的で、ドメインの他の膜貫通ドメイン（例えば、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメイン）への結合を回避するために、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０）のアミノ酸置換によって改変される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＤＡＰ１２、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＮＫｐ３０、ａｃｔＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＩＬ１５Ｒｂ、またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。これらの実施形態のうちの一部では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される共刺激分子の共刺激ドメインを含む。
細胞内（細胞質）ドメイン
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、細胞内ドメインを含む。細胞内ドメインは、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞またはＭＬ ＮＫ細胞の活性化を引き起こすシグナルを伝達するように機能することが知られている任意のポリペプチドドメインであり得る。そのようなドメインまたはモチーフは、ＣＡＲの細胞外ドメインの標的抗原への結合に応答したＴリンパ球の活性化のために必要な一次抗原結合シグナルを伝達することができる。細胞内ドメインの例には、ＩＬＲ鎖、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζが含まれるが、これらに限定されない。
典型的には、細胞内ドメインは、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ）を含む。
一実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達配列（例えば、そのＩＴＡＭ含有部分）であるか、またはそれを含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、リンパ球受容体鎖を含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、ＴＣＲ／ＣＤＲ３複合体タンパク質を含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、Ｆｃ受容体サブユニットを含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、ＩＬ－２受容体サブユニットを含む。
本明細書に提供されるＣＡＲの細胞内ドメインは、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含むことができる：ＴＣＲを介した抗原依存性活性化を開始させるシグナル伝達配列（初代細胞質シグナル伝達配列）（例えば、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達配列）、および二次または共刺激シグナルを与えるように抗原非依存的様式で作用する共刺激タンパク質のうちの１つまたは複数の細胞質配列（二次細胞質シグナル伝達配列）。
ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインが抗原に結合した場合にＴ細胞を刺激するのに十分なＣＤ３ζの細胞質配列、および任意選択で、ＮＫ細胞の共刺激をもたらす共刺激タンパク質のうちの１つまたは複数の細胞質配列（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＣＤ２４４、ＣＤ８０、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫｐ８０、ＮＴＢＡ、ＣＲＡＣＣ、ＣＤ２、ＣＤ３ζ、１つまたは複数のインテグリン、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＲＥ１ａ、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、および本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知であるＩＴＡＭ配列のいずれかのうちの１つまたは複数の細胞質配列）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメイン全体が、ＣＡＲの細胞内ドメインに含められる。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分（例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞においてエフェクター機能シグナルを伝達する細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを、それ自体で、またはＣＡＲの状況において有用な任意の他の所望の細胞質シグナル伝達配列と組み合わせて含むように設計することができる。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激細胞質シグナル伝達配列を含み得る。共刺激細胞質シグナル伝達配列は、共刺激タンパク質（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ（ＣＤ １３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンド）の細胞質シグナル伝達配列を含むＣＡＲの一部分を指す。
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序で配置される。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列は、特定の順序で互いに連結される。一部の実施形態では、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカーのいずれか）を、異なる細胞質シグナル伝達配列の間に連鎖を形成するために使用することができる。
一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達配列および共刺激タンパク質ＣＤ２８の細胞質シグナル伝達配列を含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達配列および共刺激タンパク質４－ＩＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達配列ならびに共刺激タンパク質ＣＤ２８および４－１ＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、４－１ＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含まない。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２６および２７に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２６および２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４に示される核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５に示される核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４および３５に示される核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４および３５に示される核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－ｌＢＢとしても知られる）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０としても知られる）およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られる）などのタンパク質に由来する１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７に由来する共刺激ドメインを含まない。
ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、サイトカインをさらに含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、自己切断性ドメイン（例えば、Ｐ２Ａ自己切断性ペプチド）およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ドメインの切断によりサイトカインが放出される。一部の実施形態では、自己切断性ドメイン（例えば、Ｐ２Ａ自己切断性ペプチド）およびサイトカインは、ＣＡＲタンパク質およびその細胞内ドメインのＣ末端に配置される。一部の実施形態では、サイトカインは、以下のもの：ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－βおよびＣＣＬ１９のうちの１つまたは複数である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－１２である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－７である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－１３である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－１５である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－４である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－１０である。一実施形態では、サイトカインはＴＮＦ－αである。一実施形態では、サイトカインはＩＦＮ－γである。一実施形態では、サイトカインはＴＧＦ－βである。一実施形態では、サイトカインはＣＣＬ１９である。サイトカインを発現するように改変された免疫エフェクター細胞は、当技術分野で公知である（例えば、Adachi et al, 2018, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4086; Liu et al., 2019, J. Immunol., doi:10.4049/jimmunol.1800033; Krenciute et al., 2017, Cancer Immunol. Res. 597):571-581, doi:10.1158/2326-6066,CIR-16-0376; Liu et al., 2018, Leukemia 32:520-531を参照）。ある特定の実施形態では、サイトカインを発現させるための、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞の改変は、Adachi et al, 2018, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4086; Liu et al., 2019, J. Immunol., doi:10.4049/jimmunol.1800033; Krenciute et al., 2017, Cancer Immunol. Res. 597):571-581, doi:10.1158/2326-6066,CIR-16-0376；もしくはLiu et al., 2018, Leukemia 32:520-531に記載されているものと同じであるか、またはそこに記載されている方法に従う。
ＣＡＲドメイン間のリンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲにおける少なくとも１つのドメイン間にリンカーを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、（１）細胞外（抗原結合）ドメインと膜貫通ドメインの間、および／または（２）膜貫通ドメインと細胞内（細胞質）ドメインの間に、リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドリンカーであり得る。例えば、リンカーは、約１アミノ酸と約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、約８アミノ酸、約６アミノ酸、約４アミノ酸、もしくは約２アミノ酸の間；約２アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、約８アミノ酸、約６アミノ酸、もしくは約４アミノ酸まで；約４アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、約８アミノ酸、もしくは約６アミノ酸まで；約６アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、もしくは約８アミノ酸まで；約８アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、もしくは約１０アミノ酸まで；約１０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、もしくは約１２アミノ酸まで；約１２アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、もしくは約１４アミノ酸まで；約１４アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、もしくは約１６アミノ酸まで；約１６アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、もしくは約１８アミノ酸まで；約１８アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、もしくは約２０アミノ酸まで；約２０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、もしくは約２５アミノ酸まで；約２５アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、もしくは約３０アミノ酸まで；約３０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、もしくは約３５アミノ酸まで；約３５アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、もしくは約４０アミノ酸まで；約４０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、もしくは約５０アミノ酸まで；約５０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、もしくは約６０アミノ酸まで；約６０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、もしくは約７０アミノ酸まで；約７０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、もしくは約８０アミノ酸まで；約８０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、もしくは約９０アミノ酸まで；約９０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、もしくは約１００アミノ酸まで；約１００アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、もしくは約２００アミノ酸まで；約２００アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、もしくは約３００アミノ酸まで；約３００アミノ酸から約５００アミノ酸もしくは約４００アミノ酸まで；または約４００アミノ酸から約５００アミノ酸までの長さを有し得る。
ＣＡＲを製造する方法
ＣＡＲポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を製造するための方法は、当業者に公知である。例示的な方法について本明細書に記載する。
本明細書に記載されるＣＡＲにおける使用のために好適な抗体および断片は、当技術分野で公知の方法によって作製することができる。
抗体断片を製造する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片は、ペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成させるため）またはパパイン（Ｆａｂ断片を生成させるため）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク分解切断によって生成させることができる。ｓｃＦｖ断片を製造する方法も当技術分野で公知である（例えば、Ahmad et al., 2012, Clinical and Developmental Immunology, doi: 10.1155/2012/980250; Wang et al., 2006, Anal. Chem. 78, 997-1004; Pansri et al., 2009, BMC Biotechnology 9:6; Chao et al., 2006, Nature Protocols 1(2):755-768を参照）。所望の抗原結合特性を有するｓｃＦｖを、ファージディスプレイ技術または酵母表面ディスプレイ技術によって選択することができる。ｓｃＦｖは、短いポリペプチドリンカーを介して免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインを融合させること（組換え発現手法を使用して）によって構築することができる。単一ドメイン抗体（例えば、軽鎖を欠く抗体）を製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Riechmann & Muyldermans, 1999, J Immunol 231:25- 38; Nuttall et al, 2000, Curr Pharm Biotechnol 1(3):253-263; Muyldermans, 2001, J Biotechnol 74(4): 277-302を参照）。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Konterman, 2012, MAbs 4: 182-197; Gramer et al., 2013, MAbs 5:962-973を参照）。
選択されたＣＤＲアミノ酸配列が短い配列（例えば、１０～１５アミノ酸長未満）である実施形態では、ＣＤＲをコードする核酸を、例えば、Shiraishi et al. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130および米国特許第６，９９５，２５９号明細書に記載されたように化学合成することができる。アクセプター抗体をコードする所与の核酸配列について、ＣＤＲをコードする核酸配列の領域を、標準的な分子生物学の手法を使用して化学合成された核酸で置き換えることができる。化学合成された核酸の５’および３’末端は、その核酸をドナー抗体の可変領域をコードする核酸中にクローニングする際に使用するための突出末端制限酵素部位を含むように合成することができる。
本明細書に記載される抗体のいずれかを、当技術分野で公知の任意の免疫学または生化学に基づく方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、抗原、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に起因する活性または機能のいずれかを調節するその能力について、スクリーニングおよび／または試験することができる。
本明細書に記載されるポリペプチドは、分子生物学およびタンパク質化学の技術分野で公知の種々の手法を使用して作製することができる。例えば、抗体の重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸を、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写停止配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列を含む、転写調節配列および翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができる。調節配列には、プロモーター、ならびに転写開始配列および転写停止配列が含まれる。加えて、発現ベクターは、それが２つの異なる生物において、例えば、発現のための哺乳動物細胞または昆虫細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において維持され得るように、複数の複製系を含み得る。
哺乳動物細胞における核酸からの、本明細書に記載されるいずれかのポリペプチド（例えば、クローニングされた重鎖および軽鎖ポリペプチド）の発現のために、いくつかの可能性のあるベクター系を利用することができる。ベクターの１つのクラスは、所望の遺伝子配列の宿主細胞ゲノムへの組込みに依拠する。安定に組み込まれたＤＮＡを有する細胞は、薬剤耐性遺伝子、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ｇｐｔ（Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072）またはＴｎ５ ｎｅｏ（Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327）を、同時に導入することによって選択することができる。選択マーカー遺伝子は、発現させようとするＤＮＡ遺伝子配列に連結させてもよく、またはコトランスフェクションによって同じ細胞に導入することもできる（Wigler et al. (1979) Cell 16:77）。ベクターの第２のクラスは、染色体外プラスミドに自己複製能を付与するＤＮＡエレメントを利用する。これらのベクターは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス（Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147）、サイトメガロウイルス、ポリオーマウイルス（Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292）、またはＳＶ４０ウイルス（Lusky and Botchan (1981) Nature 293:79）に由来し得る。
発現ベクターは、核酸のその後の発現のために好適な様式で、細胞に導入することができる。導入の方法は、以下に述べるように、標的となる細胞の型によって主に決まる。例示的な方法には、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、カチオン性リポソーム、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、および直接マイクロインジェクションが含まれる。
ポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞には、酵母、細菌、昆虫、植物、および哺乳動物細胞が含まれる。特に関心が持たれるのは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト細胞株）、ならびに初代細胞株である。
ポリペプチドは、抗体または断片をコードする核酸を含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を、タンパク質の発現を可能にするのに十分な条件下で、ある長さの時間をかけて培養することによって、細胞から産生させることができる。タンパク質発現のためのそのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なると考えられ、慣行的な実験を通して当業者によって容易に確認されるであろう。例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で発現された抗体を、封入体からリフォールディングさせることができる（Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30を参照）。細菌発現系およびそれらの使用のための方法は、当技術分野で周知である（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning--A Laboratory Manual --3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)を参照）。コドン、好適な発現ベクターおよび好適な宿主細胞の選択は、いくつかの要因に応じて異なり、必要に応じて容易に最適化され得る。本明細書に記載される抗体（またはその断片）は、哺乳動物細胞において、または酵母、バキュロウイルス、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を含むがこれらに限定されない、他の発現系において発現させることができる（例えば、Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220を参照）。
発現の後に、ポリペプチドを単離することができる。標準的な精製方法には、電気泳動的、分子的、免疫学的な手法、ならびにイオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む、クロマトグラフィー手法が含まれる。例えば、抗体は、標準的な抗抗体カラム（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラム）を使用して精製することができる。タンパク質濃縮と組み合わせた、限外濾過およびダイアフィルトレーションの手法も有用である。例えば、Scopes (1994) “Protein Purification, 3rd edition,”Springer-Verlag, New York City, New Yorkを参照。必要な精製の度合いは、所望の用途よって異なると考えられる。一部の例では、発現された抗体またはその断片の精製は必要ではない。
ポリペプチドの収量または純度を決定するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＵＶ分光法、Ｂｉｕｒｅｔタンパク質アッセイ、Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、質量分析（ＭＳ）法、およびゲル電気泳動法（例えば、タンパク質染色、例えば、クーマシーブルーまたはコロイド銀染色を使用する）が含まれる。
ポリペプチドは、その発現および精製の後に改変することができる。改変は、共有結合性または非共有結合性の改変であり得る。そのような改変は、例えば、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、ポリペプチドに導入することができる。改変のための好適な部位は、例えば、抗体または断片の構造分析またはアミノ酸配列分析を含む、種々の基準のいずれかを使用して選択することができる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、異種部分にコンジュゲートさせることができる。異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療薬もしくは細胞傷害性薬剤（例えば、毒素または薬物）、または検出可能な標識、例えば、限定はされないが、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、重金属標識、発光標識、またはビオチンもしくはストレプトアビジンなどのアフィニティータグであり得る。好適な異種ポリペプチドには、例えば、抗体または断片の精製に使用するための、抗原タグ（例えば、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号４４））、ポリヒスチジン（６－Ｈｉｓ；ＨＨＨＨＨＨ（配列番号４５）、ヘマグルチニン（ＨＡ；ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４６））、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク（ＭＢＰ））が含まれる。異種ポリペプチドにはまた、診断マーカーまたは検出マーカーとして有用であるポリペプチド（例えば、酵素）、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）も含まれる。好適な放射性標識には、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈが含まれる。好適な蛍光標識には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、およびＣｙ７が含まれるが、これらに限定されない。発光標識には、例えば、種々の発光ランタニド（例えば、ユーロピウムまたはテルビウム）キレートのいずれかが含まれる。例えば、好適なユーロピウムキレートには、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはテトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）のユーロピウムキレートが含まれる。酵素標識には、例えば、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれる。
２つのタンパク質（例えば、抗体および異種部分）は、いくつかの公知の化学架橋剤のいずれかを使用して架橋することができる。そのような架橋剤の例は、「妨害された」ジスルフィド結合を含む連結を介して２つのアミノ酸残基を連結するものである。これらの連結において、架橋単位内のジスルフィド結合は、例えば、還元型グルタチオンまたは酵素ジスルフィド還元酵素の作用による還元から、（ジスルフィド結合のいずれか一方の側の妨害基によって）保護される。１つの好適な試薬である４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α（２－ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、一方のタンパク質の末端リシンおよび他方のものの末端システインを利用して、２つのタンパク質間にそのような連結を形成する。各タンパク質上の異なるカップリング部分によって架橋するヘテロ二官能性試薬を使用することもできる。他の有用な架橋剤には、２つのアミノ基を連結する試薬（例えば、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基を連結する試薬（例えば、１，４－ビス－マレイミドブタン）、アミノ基とスルフヒドリル基とを連結する試薬（例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基とカルボキシル基とを連結する試薬（例えば、４－［ｐ－アジドサリチルアミド］ブチルアミン）、およびアミノ基とアルギニンの側鎖に存在するグアニジニウム基とを連結する試薬（例えば、ｐ－アジドフェニルグリオキサール一水和物）が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、放射性標識を、ポリペプチドのアミノ酸骨格に直接コンジュゲートさせることができる。あるいは、放射性標識を、遊離アミノ基に結合して関連タンパク質のメタヨードフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成するより大きな分子（例えば、メタ－［１２５Ｉ］ヨードフェニル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ中の１２５Ｉ）（例えば、Rogers et al. (1997) J Nucl Med 38:1221-1229を参照）またはキレート剤（例えば、ＤＯＴＡまたはＤＴＰＡ）の一部として含めて、次いでそれをタンパク質骨格に結合させてもよい。放射性標識またはそれを含有するより大きな分子／キレート剤を、本明細書に記載されるポリペプチドにコンジュゲートさせる方法は、当技術分野で公知である。そのような方法は、タンパク質への放射性標識またはキレート剤の結合を助長する条件（例えば、ｐＨ、塩濃度、および／または温度）下で、タンパク質を放射性標識とインキュベートすることを伴う（例えば、米国特許第６，００１，３２９号明細書を参照）。
蛍光標識（「フルオロフォア」と称される場合もある）を、タンパク質（例えば、抗体）にコンジュゲートさせる方法は、タンパク質化学の技術分野で公知である。例えば、フルオロフォアを、フルオロフォアに結び付いたスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルまたはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル部分を使用して、タンパク質の遊離アミノ基（例えば、リシンの）またはスルフヒドリル基（例えば、システインの）にコンジュゲートさせることができる。一部の実施形態では、フルオロフォアを、スルホ－ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性架橋剤部分にコンジュゲートさせることができる。好適なコンジュゲーション法は、抗体タンパク質、またはその断片を、フルオロフォアのタンパク質への結合を助長する条件下でフルオロフォアとインキュベートすることを伴う。例えば、Welch and Redvanly (2003) “Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications,”John Wiley and Sons (ISBN 0471495603)を参照。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、グリコシル化されていてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを、ポリペプチドのグリコシル化が減少しているかまたは存在しないように、酵素的もしくは化学的な処理に供するか、または細胞から産生させることができる。グリコシル化が減少した抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９３３，３６８号明細書；Wright et al. (1991) EMBO J 10(10):2717-2723; and Co et al. (1993) Mol Immunol 30:1361に記載されている。
例示的なＣＡＲポリペプチド
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＤＡＰ１２膜貫通および細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、２Ｂ４細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、２Ｂ４膜貫通および細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン、２Ｂ４細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＣＤ１６膜貫通ドメイン、２Ｂ４細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１２細胞内ドメイン、２Ｂ４細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０細胞内ドメイン、２Ｂ４細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ抗原に結合する細胞外ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、２Ｂ４細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、あるサイトカインが細胞内でも発現されるように、そのサイトカインに作動可能に連結される。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドおよびサイトカインの両方が切断後に別々に発現されるように、切断可能なリンカーを介してサイトカインに連結される。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、本明細書に記載されるＩＬ－１５ポリペプチドに作動可能に連結される。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、本明細書に記載されるＩＬ－１５ポリペプチドに、切断可能なリンカーを介して連結される。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＮＰＭ１ｃ結合性ｓｃＦｖ、膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号３３のＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域、配列番号３４の４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ならびに配列番号３５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号３０の核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＣＤ８ヒンジドメイン；（ｉｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン；（ｉｖ）４－１ＢＢ細胞内ドメイン；および（ｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）４－１ＢＢ細胞内ドメイン；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＤ２８細胞内ドメイン；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）ＤＡＰ１２細胞内ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）２Ｂ４細胞内ドメイン；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）２Ｂ４膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）２Ｂ４細胞内ドメイン；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＤ２８細胞内ドメイン；（ｉｖ）４－１ＢＢ細胞内ドメイン；および（ｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＣＤ１６膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）２Ｂ４細胞内ドメイン；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）ＤＡＰ１０細胞内ドメイン；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）２Ｂ４細胞内ドメイン；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）２Ｂ４細胞内ドメイン；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＮＫＧ２ｄ膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）４－１ＢＢ細胞内ドメイン；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）２Ｂ４細胞内ドメイン；（ｉｖ）ＤＡＰ１２細胞内ドメイン；および（ｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）２Ｂ４細胞内ドメイン；（ｉｖ）ＤＡＰ１０細胞内ドメイン；および（ｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）４－１ＢＢ細胞内ドメイン；（ｉｖ）２Ｂ４細胞内ドメイン；および（ｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ細胞内ドメイン；ならびに（ｉｖ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号９７に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドは、異種性膜貫通ドメインをさらに含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）配列番号３２に示される核酸配列によってコードされる抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）配列番号３３に示される核酸配列によってコードされるＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）配列番号３４に示される核酸配列によってコードされる４－１ＢＢ細胞内ドメイン；ならびに（ｉｖ）配列番号３５に示される核酸配列によってコードされるＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、ＩＬ－１５ポリペプチドをコードする、配列番号９８に示される核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドをコードする核酸配列は、異種性膜貫通ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）配列番号３２に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列によってコードされる抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）配列番号３３に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列によってコードされるＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）配列番号３４に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列によってコードされる４－１ＢＢ細胞内ドメイン；ならびに（ｉｖ）配列番号３５に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列によってコードされるＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、ＩＬ－１５ポリペプチドをコードする、配列番号９８に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドをコードする核酸配列は、異種性膜貫通ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
ＣＡＲポリペプチドをコードするベクター
一部の態様では、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、ベクターによってコードされる。
本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドのコード配列がひとたび調製または単離されると、そのような配列を、任意の好適なベクターまたはレプリコンにクローニングすることができる。「コード配列」または選択されたポリペプチド（例えば、ＣＡＲポリペプチド）を「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれた場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで転写（ＤＮＡの場合）され、ポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列としては、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。転写終結配列はコード配列の３’側に位置してもよい。コード配列の転写および翻訳は、典型的には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳停止コドンの３’側に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列の５’側に位置する）、および翻訳終結配列を含むが、これらに限定されない「制御エレメント」によって調節される。
多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は、自由に選択可能な事柄である。他の配列へのライゲーションは、当技術分野で公知の標準的な手順を使用して行われる。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有し、それに連結された別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、この場合は追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることができる。ある特定のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、ある特定のベクターは、それに作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ手法に使用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、互換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）も含むことを意図している。
さらに、「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移行させるかまたは輸送することができる核酸分子を指すことができる。移行される核酸を、ベクター核酸分子に連結すること、例えば、それに挿入することができる。ベクターは、細胞内での自律複製を導く配列を含むことができ、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能にするのに十分な配列を含むことができる。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損レトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「形質導入」または「細胞形質導入」という用語は、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを使用して、核酸を細胞に移入するプロセスを指す。
一部の態様では、本明細書に記載される核酸分子は、発現ベクター中にある状態で提供される。一部の実施形態では、ベクターは、適切な発現制御配列に作動可能に連結されたペプチドをコードする核酸分子を含む。核酸分子がベクターに挿入される前または後のいずれかで、この作動可能な連結に影響を及ぼす方法は周知である。発現制御配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソームヌクレアーゼドメイン、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが含まれる。
「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始させるヌクレオチド配列である。プロモーターとしては、誘導性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって抑制される）、および構成的プロモーターが挙げられる。加えて、そのようなプロモーターが組織特異性を有することもでき、例えば、ＣＤ８０プロモーターはある特定の免疫細胞においてのみ誘導可能であり、ｍｙｏＤプロモーターは筋細胞においてのみ誘導可能である。「プロモーター」または「制御エレメント」という用語は、完全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的（例えば、転写または翻訳を制御する）セグメントを含むことが意図される。プロモーターは、それが共刺激分子のプロモーター領域のある領域、もしくはその相補物と、同じもしくは実質的に同じ塩基対配列を有する場合、またはそれが以下に記載されるような配列同一性を示す場合に、共刺激分子をコードする遺伝子に「由来する」。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、ウイルスベクター中にある状態で提供される。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、例えば、核酸分子の移行もしくは細胞のゲノム中への組込みを助長するウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、移入プラスミド）、または核酸の移行を媒介するウイルス粒子を指すことができる。ウイルス粒子は、核酸の他に、様々なウイルス成分および時に宿主細胞成分をも含むことができる。
使用のために好適なウイルスベクターには、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベクター、およびウシパピローマウイルスベクターが含まれる（例えば、Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）。本明細書で使用される場合、「レトロウイルスベクター」という用語は、目的の遺伝子（すなわち、候補ポリペプチドまたは異種ポリペプチドをコードする遺伝子）を発現するように改変されたレトロウイルスを指すことができる。レトロウイルスベクターは、ウイルス感染プロセスを利用することによって、遺伝子（すなわち、候補ポリペプチドまたは異種ポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に効率的に移入するために使用することができる。レトロウイルスゲノム中にクローニングされた（すなわち、分子生物学的手法を使用して挿入された）外来性または異種性の標的遺伝子は、レトロウイルスによる感染への感受性のある宿主細胞に効率的に送達され得る。公知の遺伝子操作により、レトロウイルスゲノムの複製能を破壊することができる。その結果得られる複製欠損ベクターは、新しい遺伝物質を細胞に導入するために使用し得るが、複製は行えない。ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株は、ベクター粒子の組立ておよび細胞からの放出を可能にするために使用され得る。そのようなレトロウイルスベクターは、目的の１つまたは複数の遺伝子（すなわち、ポリシストロン核酸配列は、目的のいくつかの遺伝子をコードし得る）、５’レトロウイルス長鎖末端反復（５’ＬＴＲ）、および３’レトロウイルス長鎖末端反復（３’ＬＴＲ）を含有する複製欠損レトロウイルスゲノムをコードする核酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクター」という用語は、非***細胞に組み入れることができるレンチウイルス科（例えば、ＨＩＶ、ＭＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、カプリン関節炎脳炎ウイルス）を指す。（例えば、米国特許第５，９９４，１３６号明細書および同第６，０１３，５１６号明細書を参照。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、シュードタイプ化レンチウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、「シュードレンチウイルスベクター」または「シュードタイプ化レンチウイルスベクター」という用語は、その指向性を変更するための異種膜タンパク質、例えば、異種ウイルスエンベロープを含有するレンチウイルスベクターを指す。例えば、Cronin et al (2005) CURR. GENE THER. 5:387-398を参照。例えば、一部の実施形態では、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶＧ）由来である。天然に存在するかまたは操作されたウイルスエンベロープの多様なセットを用いるレンチウイルスベクターのシュードタイプ化は、特定の細胞型の標的化形質導入を可能にする。例えば、ヒヒのレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質によってシュードタイプ化されたレンチウイルスベクター（ＢａＥＶ－ＬＶ）が開発されている。改変ＢａＥＶｇによってシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターは、ＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターと比較して、ＮＫ細胞への形質導入を２０倍またはそれ以上で行うことができ、これは主として、活性化ＮＫ細胞がＡＳＣＴ－２のアップレギュレーションを生じ、ＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスベクターによる形質導入に対して非常に感受性にさせるためである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＡＲポリペプチドを発現することができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製起点を含有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターはプラスミドである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは発現構築物であり、これは一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである。ひとたび発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質が、細胞の転写および翻訳装置であるリボソーム複合体によって産生される。一部の実施形態では、プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用して、発現ベクター上に保有される遺伝子の効率的な転写を招く、調節配列を含有するように操作される。本開示のウイルスベクターは、大量の安定なメッセンジャーＲＮＡを発現し、それ故に大量のタンパク質を発現する。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、発現シグナル、例えば、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローニングされた遺伝子との距離の調整、ならびに転写終止配列およびＰＴＩＳ（ポータブル翻訳開始配列）の挿入を有する。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、環状プラスミドまたは直鎖状核酸である。環状プラスミドおよび直鎖状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、終結シグナルに作動可能に連結されていてもよいＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターは、その成分のうちの少なくとも１つが、他の成分のうちの少なくとも１つに対して異種性であることを意味する。一部の実施形態では、発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、恒常的プロモーター、または宿主細胞が何らかの特定の外部刺激に曝露された場合にのみ転写を開始させる誘導性プロモーターの制御下にある。
サイトカイン誘導性メモリー様ナチュラルキラー細胞
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含む、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または前記細胞の集団を提供する。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または細胞の集団は、自己性または同種性ＮＫ細胞、例えば、ヒトドナーＮＫ細胞から分化しているか、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または細胞の集団は、臍帯血（例えば、ヒト臍帯血）由来のＮＫ細胞から分化しているか、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または細胞の集団は、ヒトＰＢＭＣから分化しているか、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または細胞の集団は、ｉＰＳＣ（例えば、ヒトｉＰＳＣ）由来のＮＫ細胞から分化しているか、またはそれに由来する。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または細胞の集団は、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ヒトＮＫ細胞から分化している。一部の実施形態では、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ヒトＮＫ細胞は、ヒトＰＢＭＣ（例えば、ドナーヒトＰＢＭＣ、例えば、自己性または同種性）から精製される。一部の実施形態では、９５％超のＣＤ５６＋ＣＤ３－ヒトＮＫ細胞が、ＰＢＭＣから精製される。一部の実施形態では、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ヒトＮＫ細胞は、免疫密度細胞分離、例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐを使用して単離される。一部の実施形態では、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ヒトＮＫ細胞をＰＢＭＣから精製するための方法は、（ｉ）特異的抗体を使用して非ＮＫ細胞を赤血球と架橋させて、イムノロゼットを形成させるステップ；（ｉｉ）細胞を密度勾配遠心法に供して、イムノロゼットをペレット化するステップ；（ｉｉｉ）ＮＫ細胞を単離するステップを含む。
一部の実施形態では、ヒトＮＫ（ｈＮＫ）細胞の集団は、成熟および／または発生の段階の異なるサブセットを含む。一部の実施形態では、成熟および／または発生の段階は、表現型マーカーの発現によって決定される。一部の実施形態では、成熟および／または発生の段階は、図７Ｃに示される表現型マーカーに基づいて決定される。一部の実施形態では、相対的に成熟しておらず、発生が進んでおらず、より幹細胞様であり、および／または増殖性が高いｈＮＫ細胞のサブセットは、以下の表現型マーカーを発現する：ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６ｌｏｗ／－ＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲｓ－ＣＤ５７－。一部の実施形態では、成熟および／または発生の段階が中等度であるｈＮＫ細胞のサブセットは、以下の表現型マーカーを発現する：ＣＤ５６ｄｉｍ、ＣＤ１６＋ＮＫＧ２Ａ＋／－ＫＩＲｓ－ＣＤ５７－またはＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫＧ２Ａ＋／－ＫＩＲｓ＋ＣＤ５７－。一部の実施形態では、成熟した、および／または発生が進んでいるｈＮＫ細胞のサブセットは、以下の表現型マーカーを発現する：ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫＧ２Ａ＋／－ＫＩＲｓ＋ＣＤ５７＋。一部の実施形態では、相対的に成熟していない、および／またはより発生が進んでいないｈＮＫ細胞のサブセットは、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、より成熟した、および／またはより発生が進んでいるｈＮＫ細胞のサブセットのＡＳＣＴの平均発現に比して、ＡＳＣＴ２の平均発現が、（例えば、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍に）増加している。
一部の実施形態では、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６ｌｏｗ／－ＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲｓ－ＣＤ５７－であるｈＮＫ細胞のサブセットは、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫＧ２Ａ＋／－ＫＩＲｓ－ＣＤ５７－であるｈＮＫ細胞のサブセットのＡＳＣＴの平均発現に比して、ＡＳＣＴ２の平均発現が、（例えば、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍に）増加している。一部の実施形態では、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６ｌｏｗ／－ＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲｓ－ＣＤ５７－であるｈＮＫ細胞のサブセットは、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫＧ２Ａ＋／－ＫＩＲｓ＋ＣＤ５７－であるｈＮＫ細胞のサブセットのＡＳＣＴの平均発現に比して、ＡＳＣＴ２の平均発現が、（例えば、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍に）増加している。一部の実施形態では、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６ｌｏｗ／－ＮＫＧ２Ａ＋ＫＩＲｓ－ＣＤ５７－であるｈＮＫ細胞のサブセットは、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫＧ２Ａ＋／－ＫＩＲｓ＋ＣＤ５７＋であるｈＮＫ細胞のサブセットのＡＳＣＴの平均発現に比して、ＡＳＣＴ２の平均発現が、（例えば、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍に）増加している。
表現型
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞または細胞の集団に比して、マーカーの特有のセットを発現する。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５単独（例えば、ヒトＩＬ－１５）の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞、またはＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞は、ＭＬ ＮＫ細胞の由来となったＮＫ細胞と同じ表現型を有する。
一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞上で発現される少なくとも１つの細胞表面マーカーの発現が、減少している。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞上で発現される少なくとも１つの細胞表面マーカーが、ＭＬ ＮＫ細胞上では発現されない。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞上では発現されない少なくとも１つの細胞表面マーカーの発現が、ＭＬ ＮＫ細胞上では発現される。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞上では発現のレベルが低い、少なくとも１つの細胞表面マーカーの発現が、ＭＬ ＮＫ細胞上では増加している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、参照により本明細書に組み込まれる、以下に記載されるものとして特徴付けられる：Berrien-Elliott, M. M. et al. Cancer Discovery, DOI: 10.1158/2159-8290.CD-20-0312, December 2020; Romee. R. et al. Sci Transl Med Vol. 8(357), 2016 Sep 21.
一部の実施形態では、以下のポリペプチド：ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧＤ２およびＣＤ２５のうちの１つまたは複数の発現が、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ＮＫ細胞に比して増加している。一部の実施形態では、以下のポリペプチド：ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２５のうちの１つまたは複数の発現が、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ＮＫ細胞に比して増加している。一部の実施形態では、以下のポリペプチド：ＴＲＡＩＬ、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫｐ３０のうちの１つまたは複数が、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ＮＫ細胞に比して増加している。一部の実施形態では、ポリペプチドの発現が、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍に増加している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、ＴＲＡＩＬ＋ＣＤ６９＋ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫ細胞を、増加した頻度で含む。一部の実施形態では、細胞集団の頻度は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍に増加している。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞の集団は、ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＮＫ細胞を、減少した頻度で含む。一部の実施形態では、細胞集団の頻度は、少なくとも１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１または１０分の１に減少している。
一部の実施形態では、ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｂの発現は、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ＮＫ細胞に比して減少している。一部の実施形態では、ポリペプチドの発現は、少なくとも１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１または１０分の１に減少している。
一部の実施形態では、以下のポリペプチド：ＫＩＲ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ１３７、およびＣＤ１１ｂのうちの１つまたは複数の発現が、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団において、初代／従来のＮＫ細胞に比して相対的に不変である。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＣＤ２７ｌｏｗＫＬＲＧ１ｈｉｇｈＣＤ４３ｈｉｇｈ。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋である。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較してＣＤ５６発現が増加している。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較してＣＤ６９発現が増加している。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較してＮＫＧ２Ａ発現が増加している。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較してＮＫＧ２Ｃの発現が増加している。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較してＣＤ９４の発現が増加している。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較してＮＫｐ４６の発現が増加している。
一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞表面マーカーの発現は、少なくとも１つのサイトカインへの曝露から２～２４時間以内または１４～１６時間以内に誘導される。一部の実施形態では、本明細書に記載される発現プロファイルは、少なくとも１つのサイトカインへの曝露から２～２４時間以内または１４～１６時間以内に誘導される。
機能特性
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して、機能特性が増強している。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞、またはＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞は、ＭＬ ＮＫ細胞の由来となったＮＫ細胞と同じ表現型を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるメモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞は、増殖能が増加している。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して増殖が増加している。細胞増殖を測定するための方法は、当業者に公知であり、細胞の数を測定すること、および／または増殖マーカーを測定することが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、増殖は細胞質増殖色素を使用して測定され、この場合には、細胞透過性蛍光化学物質がサイトゾル成分に結合し、細胞***のたびに半分に希釈される。そのような色素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで使用することができる。例として、二酢酸カルボジフルオレセイン（ＣＦＳＥ）の測定が挙げられる。一部の実施形態では、増殖は、細胞周期関連タンパク質のレベルを定量することによって測定される。細胞増殖の測定には複数の手法が適用可能である。手法の例としては、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット分析、および組織顕微鏡検査が挙げられる。総細胞数の計数を含む、細胞増殖を決定するための人手による方法を使用してもよい。
一部の実施形態では、メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞は、ＩＦＮγを産生する。一部の実施形態では、ＩＦＮγ産生は、ＭＬ ＮＫ細胞において、対照ＮＫ細胞（例えば、ヒトＮＫ細胞または活性化ヒトＮＫ細胞）と比較して増加している。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の刺激時のＩＦＮγ産生が増加している。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、活性化受容体または腫瘍標的によって刺激される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、がん細胞への曝露時に、対照ＮＫ細胞と比較してＩＦＮγ産生が増加している。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、がん細胞への曝露時に、対照ＮＫ細胞と比較してＩＦＮγ産生が増加している。一部の実施形態では、ＩＦＮγ産生は、従来のＮＫ細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％増加する。一部の実施形態では、ＩＦＮγ産生は、刺激時に活性化の後、１～７日間、７～１４日間、１４～２１日間、および最長で３０日間増加する。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対象への移植後、ＩＦＮγの増加を１～７日間維持する。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対象への移植後、ＩＦＮγの増加を少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、または少なくとも３か月間維持する。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、移植後、ＩＦＮγの増加を少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、または少なくとも３か月間にわたり維持する。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、ＩＦＮγの増強を子孫細胞に伝える。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増強している。ＡＤＣＣは、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を含む感受性標的を殺滅することができるプロセスであり、ＮＫ細胞がエフェクターである。ＡＤＣＣは、ＮＫ細胞表面上の受容体が、細胞表面に結合したＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体を認識した場合に誘発される。これは、パーフォリンとグランザイムを含有する細胞質顆粒の放出を誘発して、標的細胞死を招く。ＮＫ細胞のＡＤＣＣを測定するための方法は、当業者に公知である。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して、抗腫瘍効果が増強している。ＮＫ細胞の抗腫瘍効果を測定するための方法は、当業者に公知であり、本明細書に記載される。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、（ｉ）は、１つもしくは複数のサイトカインおよび／もしくは腫瘍標的の存在下で、産生するＩＦＮγが増加しており；（ｉｉ）ＡＤＣＣが増強しており；（ｉｉｉ）抗腫瘍効果が増強しており；または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組合せを有する。
メモリー様ＮＫ細胞を製造する方法
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞に分化している。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、活性化され、次いで、一定期間（例えば、数時間、数日間）をかけてＭＬ ＮＫ細胞に分化する。一部の実施形態では、ＮＫ細胞の活性化は、ＭＬ ＮＫ細胞への分化をもたらす。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組合せを使用して活性化される。
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５；ＩＬ－１２およびＩＬ－１８；ＩＬ－１５およびＩＬ－１８；またはＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、１～２０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１２への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、少なくとも１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも９ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２により活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２により活性化される。
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、１～５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１５への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１５への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも９５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１４０ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも１５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５により活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５により活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５により活性化される。
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１８への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８により活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも９５ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８により活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８により活性化される。
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、１～２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、１～５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および１０～１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、サイトカイン活性化メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞を形成させるのに十分な長さの時間にわたり、サイトカインの存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、サイトカイン活性化メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、約８時間から約２４時間、約１２時間、または約１６時間までの間である。一部の実施形態では、サイトカイン活性化メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、約１６時間から約２０時間までの間である。一部の実施形態では、サイトカイン活性化メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、少なくとも約１時間；約２時間；約３時間；約４時間；約５時間；約６時間；約７時間；約８時間；約９時間；約１０時間；約１１時間；約１２時間；約１３時間；約１４時間；約１５時間；約１６時間；約１７時間；約１８時間；約１９時間；約２０時間；約２１時間；約２２時間；約２３時間；約２４時間；約２５時間；約２６時間；約２７時間；約２８時間；約２９時間；約３０時間；約３１時間；約３２時間；約３３時間；約３４時間；約３５時間；約３６時間；約３７時間；約３８時間；約３９時間；約４０時間；約４１時間；約４２時間；約４３時間；約４４時間；約４５時間；約４６時間；約４７時間；または約４８時間である。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、１２～２４時間、１２～４８時間、または１４～１６時間にわたる、少なくとも１つのサイトカインへの曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、１６～２０時間にわたる、少なくとも１つのサイトカインへの曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、１６時間にわたる、少なくとも１つのサイトカインへの曝露によって活性化される。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、１２～２４時間または１４～１６時間にわたる、１～２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、１～５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および１０～１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８への曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、１２～２４時間または１４～１６時間にわたる、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８への曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、１２～２４時間、１６～２０時間、または１４～１６時間にわたる、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８への曝露によって活性化される。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ－１５を用いて維持される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を用いて維持される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞を、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、または５日ごとにＩＬ－１５と接触させる。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞を、２日ごとにＩＬ－１５と接触させる。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞を、３日ごとにＩＬ－１５と接触させる。
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を少なくとも１つのサイトカインを発現する細胞と共培養することによって活性化される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞と、樹状細胞およびマクロファージのうちの１つまたは複数との共培養によって生成される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞と樹状細胞との共培養によって生成される。一部の実施形態では、樹状細胞は、ＮＫ細胞と共培養された場合、ＭＬ ＮＫ細胞を生成させるのに十分なＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８のうちのいずれか１つまたは複数を分泌する。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、マクロファージとＮＫ細胞との共培養によって生成される。一部の実施形態では、マクロファージは、ＮＫ細胞と共培養した場合に、ＭＬ ＮＫ細胞を生成させるのに十分なＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８のうちのいずれか１つまたは複数を分泌する。
例示的なメモリー様ＮＫ細胞
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、本明細書に記載される表現型および少なくとも１つの機能特性を含む。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に比してＩＦＮγを産生する。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、（ｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に対してＩＦＮγを産生し、ならびに（ｉｉ）対照ＮＫ細胞に比してＡＤＣＣ活性が増強している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、（ｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に比してＩＦＮγを産生し、ならびに（ｉｉ）対照ＮＫ細胞に比して抗腫瘍効果が増強している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、（ｉ）対照ＮＫ細胞に比して抗腫瘍効果が増強しており、および（ｉｉ）対照ＮＫ細胞に比してＡＤＣＣ活性が増強している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、（ｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に比してＩＦＮγを産生し；（ｉｉ）対照ＮＫ細胞に比してＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｉｉｉ）対照ＮＫ細胞に比して抗腫瘍効果が増強している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており、１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に比してＩＦＮγを産生する。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；ならびに（ｉｉｉ）ＡＤＣＣ活性が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｉｉ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；ならびに（ｉｉｉ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｉｉ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｉｉｉ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｉｉ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記の集団は、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；（ｉｉｉ）ＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；ならびに（ｉｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し、ここで（ｉ）～（ｉｉｉ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；（ｉｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；ならびに（ｉｖ）ＡＤＣＣ活性が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；（ｉｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；（ｉｉｉ）ＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記の集団は、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；（ｉｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；（ｉｖ）ＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｖ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記の集団は、（ｉ）ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ１６ｌｏｗ／－、ＮＫＧ２Ａ＋、ＫＩＲｓ－、ＣＤ５７であり；（ｉｉ）増殖性が高く；（ｉｉｉ）相対的に成熟しておらず；（ｉｖ）ＡＳＣＴ２の発現が増加しており、ここで（ｉ）～（ｉｖ）は、ＣＤ５６ｄｉｍ、ＣＤ１６＋、ＮＫＧ２Ａ＋／－、ＫＩＲｓ－、ＣＤ５７－；ＣＤ５６ｄｉｍ、ＣＤ１６＋、ＮＫＧ２Ａ＋／－、ＫＩＲｓ＋、ＣＤ５７－；またはＣＤ５６ｄｉｍ、ＣＤ１６＋、ＮＫＧ２Ａ＋／－、ＫＩＲｓ＋、ＣＤ５７＋である対照ＮＫ細胞に比してである。
細胞の形質導入効率を高めるための方法
本開示の複数の態様は、細胞の形質導入効率を高める方法を対象とする。複数の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞を、候補ポリペプチドをコードするベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、サイトカインにより活性化されている。一部の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞を、候補ポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む、細胞の形質導入効率を高める方法を対象とする。
ＡＳＣＴ１（ＳＬＣ１Ａ４によってコードされる）（ＡＳＣＴ１（ヒト、遺伝子名称 ＳＬＣ１Ａ４、遺伝子ＩＤ：６５０９）およびＡＳＣＴ２（ＳＬＣ１Ａ５によってコードされる）（ＡＳＣＴ２（ヒト）、遺伝子名称ＳＬＣ１Ａ５、遺伝子ＩＤ：６５１０）を含むアラニン／セリン／システイン輸送体は、小型の中性アミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＣｙｓおよびＴｈｒのナトリウム依存***換を媒介する。それらの構造は、グルタミン酸輸送体のものに類似していると予想されている。例えば、アラニン／セリン／システイン選好性輸送体２（ＡＳＣＴ２）は、遍在性に発現され、幅広い特異性を示すナトリウム依存性中性アミノ酸交換体であり、細胞外および細胞内のアミノ酸プールの調節に役割を果たすようである。生理的条件下では、ＡＳＣＴ２は体内に遍在して分布している。ＡＳＣＴ２はがんへの関与が指摘されている。例えば、ＡＳＣＴ２の過剰発現は、ＭＹＣのようながん遺伝子によって推進され、前立腺、肺、***、腎臓、消化管および肝臓、女性生殖器、ならびに神経系のがんで観察されている。
本明細書に記載されるように、ＡＳＣＴ２の発現レベルは、従来の初代ＮＫ細胞において高く、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞ではさらに増強している。ＡＳＣＴ２は、ヒヒエンベロープ糖タンパク質ＢａＥＶ－ｇｐの受容体であり、このことは、ＮＫ細胞、例えば、初代ＮＫ細胞およびＣＩＭＬ ＮＫ細胞への非効率的な形質導入を、従来とは異なるＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスを利用して克服し得ることを指し示す。したがって、ＡＳＣＴ２の存在またはレベル（すなわち、ＡＳＣＴ２＋細胞）により、ＢａＥＶ－レンチウイルスベクターによる形質導入に対してより受容性の高い細胞がもたらされる。
一部の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、ＡＳＣＴ２またはその発現の有無によって特徴付けることができる。例えば、ＡＳＣＴ２またはその発現の有無は、当技術分野で公知の手法によって決定することができる。例えば、イムノアッセイを実施するための手順は、例えば、"ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。
一部の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、対照細胞に比して、ＡＳＣＴ２タンパク質をコードする遺伝子の発現の増加またはＡＳＣＴ２タンパク質のレベルの増大によって特徴付けることができる。例えば、ＡＳＣＴ２＋細胞は、対照細胞に比して、ＡＳＣＴ２の発現の増加またはタンパク質レベルの増大を有し得る。本明細書で使用される場合、「対照」または「対照細胞」は、細胞の遺伝型または表現型、例えば、ＡＳＣＴ２の発現またはレベルの変化を測定するための基準点を与える細胞を指すことができる。例えば、対照細胞には、野生型細胞が含まれ得る。他の実施形態では、対照細胞には、遺伝子改変細胞、例えば、ＡＳＣＴ２－／－細胞が含まれ得る。さらに他の実施形態では、対照細胞には、未熟細胞または成熟細胞が含まれ得る。複数の実施形態では、対照細胞は、不活性化ＮＫ細胞であり得る。
「対照と比較して変化した」試料または細胞、例えば、対照細胞に比してのＡＳＣＴ２レベルの増大は、分析物または診断上もしくは治療上の指標（例えば、ＡＳＣＴ２などのマーカー）のレベルが、正常、未治療、または異常状態の対照試料からの試料とは統計的に異なるレベルで検出されることを指すことができる。統計的有意性の決定は当業者の能力の範囲内であり、例えば、陽性または陰性の結果を構成する、平均からの標準偏差の数である。
一部の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、対照細胞のものよりも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％大きい発現レベルまたはタンパク質レベルを有する。
複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、ＡＳＣＴ２をコードする遺伝子の発現、または閾値を上回るＡＳＣＴ２のレベルによって特徴付けることができる。「閾値」という用語、例えば、ＡＳＣＴ２閾値は、ＡＳＣＴ２に対応するポリペプチドなどのバイオマーカーについて、ドナー細胞などの複数の生体試料から導き出される値であって、その値を上回るとトランスフェクション効率の増加などの影響を伴う値を指すことができる。
複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞はＮＫ細胞である。「ＮＫ細胞」は、自然免疫または非従来型免疫に関連するリンパ球の亜集団を指すことができる。ＮＫ細胞は、いくつかの特徴および生物学的特性によって特徴付けることができ、これには例えば、ヒトＮＫ細胞上でのＣＤ５６および／またはＣＤ１６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面上のα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の欠如、「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に細胞の活性化によって結合し、それによって細胞を殺滅する能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍または他の罹患細胞を殺滅する能力、刺激または抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する（「ＮＫ細胞活性」）がある。ＮＫ細胞のあらゆる亜集団も、ＮＫ細胞という用語に含まれる。
ＮＫ細胞の重要な機能としては、ウイルス感染細胞の殺滅、ヒトの生殖への寄与（妊娠脱落膜において支配的なリンパ球）、および抗腫瘍応答が挙げられる。例えば、長期的研究により、ＮＫ細胞活性の低さとがんリスクの増加が相関付けられている。また、がん患者はしばしば、ＮＫ細胞の数および／または機能に欠陥がある。ＮＫ細胞は、事前の感作なしにがん標的細胞（例えば、白血病性芽球）を殺滅することができる。重要なメディエーターには、例えば、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６ａ）を介するＡＤＣＣ（リツキシマブ、セツキシマブなど）が含まれる。
複数の実施形態では、細胞は初代細胞、例えば、初代ＮＫ細胞であり得る。例えば、初代ＮＫ細胞は、磁気標識、または非ＮＫ細胞（すなわち、Ｔ細胞、Ｂ細胞、幹細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、および赤血球細胞）の枯渇を含む、当技術分野で公知の方法などによって、ＰＢＭＣから単離することができる。
一部の実施形態では、細胞はマウス初代ＮＫ細胞である。そのような細胞の形質導入率は約２０％であり、このため、ヒト細胞よりも形質導入に対してさらに抵抗性である可能性がある。したがって、本明細書に記載される実施形態は、トランスジェニックマウスモデルを作出することなく、そうでなければ困難である研究に対して機会を提供する。
一部の実施形態では、細胞は、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞であり得る。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、広範な増殖、およびサイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞への分化をもたらす、サイトカインにより予め活性化されたＮＫ細胞を指すことができる。例えば、Romee, Rizwan, et al. "Cytokine activation induces human memory-like NK cells." Blood 120.24 (2012): 4751-4760を参照。例えば、休止ＮＫ細胞は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、またはそれらの任意の組合せによって活性化される。例えば、図１を参照すると、ナイーブＮＫ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、および任意選択でＩＬ－１５により予め活性化されて、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞が生成する。複数の実施形態では、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を、対照細胞、例えば、活性化されていない細胞に比してＩＦＮ－γ産生が増強していることによって同定することができる。メモリー様ＮＫ細胞の他の好適なバイオマーカーには、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ６９、およびＮＫｐ４６が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＮＫ細胞（例えば、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞、休止ＮＫ細胞、ナイーブＮＫ細胞）を、インターロイキン－１２ファミリーのサイトカインにより予め活性化することができる。インターロイキン－１２ファミリーのメンバーには、例えば、ヘテロ二量体サイトカインであるＩＬ－１２（サブユニットＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）を含む）、ＩＬ－２３（サブユニットＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）およびＩＬ－２３ ｐ１９を含む）、ＩＬ－２７（サブユニットＥＢＩ３およびＩＬ－２７ ｐ２８を含む）、およびＩＬ－３５（サブユニットＥＢＩ３およびＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）を含む）が含まれる。ＥＢＩ３はＩＬ－１２ ｐ４０のホモログである。理論に拘束されることは望まないが、ＮＫ細胞（例えば、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞、休止ＮＫ細胞、ナイーブＮＫ細胞）を、ＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）サブユニットまたはそのホモログ（例えば、ＥＢＩ３）により予め活性化することができる。その全体が参照により組み込まれる、Sun et al., Cytokine. 2015 Oct; 75(2): 249-255も参照。
一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、例えば、哺乳動物ＮＫ細胞である。「哺乳動物細胞」という用語は、哺乳動物由来の細胞を指すことができる。複数の実施形態では、細胞はヒト細胞、例えば、ヒトＮＫ細胞であるが、一方、他の複数の実施形態では、細胞は、飼育動物、実験動物、家畜、または伴侶動物（例えば、齧歯類の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギなど）から得られる。本発明を何らかの特定の種由来の細胞に限定することは意図していないが、これは、本発明があらゆる種類の哺乳動物細胞に用途があるためである。本発明はまた、あらゆる種類の動物から得られる、正常細胞、がん性細胞、前がん細胞、健常細胞、罹患細胞、ウイルス感染細胞、様々な組織由来の細胞、様々な発生段階の細胞、例えば、成体細胞および胎児細胞にも用途がある。さらなる実施形態では、本発明は、あらゆる種類の動物から得られる、天然に存在する変異細胞、ノックアウト技術、挿入、欠失、または置換を使用して遺伝子操作された変異細胞、化学的に誘導された変異細胞、放射線で誘導された変異細胞などを含む変異細胞にも用途がある。本発明はさらに、あらゆる種類の動物に由来する、初代培養細胞、細胞株細胞、および病原体、例えば、ウイルス、細菌、原虫、真菌などが感染した細胞にも用途がある。
本明細書に記載されるように、本開示の複数の態様は、細胞の形質導入効率を高めるための方法を対象とする。例えば、本方法は、少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞を、標的遺伝子をコードするベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む。
複数の実施形態では、本方法は、ＡＳＣＴ２＋細胞を得る、単離する、または同定するステップを含み得る。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、ＡＳＣＴ２－細胞を、１つまたは複数のサイトカイン、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－１５とともに培養（または活性化）することによって提供することができる。細胞を「培養すること」は、細胞を細胞培地と、細胞の生存および／または成長および／または増殖に適した条件下で接触させることを指すことができる。例えば、図１を参照すると、ナイーブＮＫ細胞はＡＳＣＴ－細胞であり、これは、１つまたは複数のサイトカインとともに培養して、それらによって予め活性化された後に、ＡＳＣＴ２＋細胞であるサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞に分化する。一部の実施形態では、細胞をある期間にわたり培養することができる。例えば、細胞を、１つまたは複数のサイトカインにより予め活性化する前、その間、またはその後に培養することができる。例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－１５により予め活性化した後に、細胞をＩＬ－１５とともにある期間にわたり培養することができる。別の例として、細胞を、形質導入の前、その間、またはその後に培養することができる。
したがって、複数の実施形態は、ＡＳＣＴ２＋細胞、例えば、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞を得る、単離する、または同定するステップを含むことができる。本明細書に記載されるように、ＡＳＣＴ２の発現レベルは、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞において増強しており、したがって、ＡＳＣＴ２の発現レベルまたはタンパク質レベルを使用して、ＡＳＣＴ２＋細胞を同定することができる。ＡＳＣＴ２はヒヒエンベロープ糖タンパク質ＢａＥＶ－ｇｐの受容体であり、このことは、ＮＫ細胞、例えば、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の非効率的な形質導入を、従来とは異なるＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスを利用して克服し得ることを指し示す。したがって、したがって、ＡＳＣＴ２の存在またはレベル（すなわち、ＡＳＣＴ２＋細胞）により、ＢａＥＶ－レンチウイルスベクターによる形質導入に対してより受容性の高い細胞がもたらされる。
候補ポリペプチド
細胞の成長、増殖、および死を制御する腫瘍特異的抗原が、細胞内に存在する可能性がある。細胞内タンパク質の認識には、ＨＬＡ分子によって提示される抗原ペプチドを認識する能力が必要である。通常、ＮＫ細胞は、ＨＬＡ分子によって提示される、ネオエピトープを含むエピトープを認識する手段を持たない。これまで見てきたように、本明細書に記載される遺伝子操作されたＮＫ細胞は、細胞内抗原を標的とすることができる。例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）様／模倣抗体と呼ばれる特定の抗体の群は、これらの細胞内抗原を標的とする。細胞内の腫瘍特異的抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩシグナル伝達経路を経て、腫瘍細胞表面に腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体として提示される。ＴＣＲ様抗体は、腫瘍細胞表面のペプチド／ＭＨＣ複合体を、真正のＴＣＲと同じ様式で認識する。Ｔ細胞表面に発現されたＴＣＲによるペプチド／ＭＨＣ複合体の認識は、様々な影響、例えば、Ｔ細胞の増殖および分化、ならびにサイトカインまたはケモカインの分泌を誘発することができる。しかし、ＴＣＲ様抗体によるペプチド／ＭＨＣ複合体の認識は、Ｔ細胞におけるＴＣＲの認識よりもはるかに幅広い薬理学的経路を誘発することができる。ＴＣＲ様抗体は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、またはアポトーシスの直接誘導を誘発し得る。そのような抗体標的としては、ＭＡＧＥ１、ＧＰ１００、ｈＴＥＲＴ、ＭＵＣ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＦＬＴ３、ＴＰ５３、スプライソソーム因子、ＭＡＧＥ３、ｈＣＧβ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＴＡＲＰ、ｐ５３、チロシナーゼ、ｐ６８、ＭＩＦ、プロテイナーゼ３、ＷＴ１、ＨＡ－１Ｈ、およびＰＲＡＭＥが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、He, Qinghua, et al. "TCR-like antibodies in cancer immunotherapy." Journal of hematology & oncology 12.1 (2019): 99を参照。
ヌクレオフォスミン１（ＮＰＭ１）は、リボソームの集合／輸送、細胞質／核輸送、ＤＮＡポリメラーゼα活性の調節、中心体複製、およびｐ５３の調節に関与するリンタンパク質である。ＮＰＭ１は、ヒトではＮＰＭ１遺伝子によってコードされ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の細胞内標的である。細胞質への局在化をもたらすＮＰＭ１における変異は、変異タンパク質細胞質ヌクレオフォスミン１（ＮＰＭ１ｃ）と称することができる。ＮＰＭ１ｃはそのＣ末端に核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含む。
一部の実施形態では、候補ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（またはＣＡＲ）を含む。「キメラ抗原受容体」は、腫瘍細胞によって発現される抗原を認識して、それに結合するように操作された、人工免疫細胞受容体を指すことができる。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のために設計することができ、それはＴ細胞受容体（ＴｃＲ）複合体などのシグナル伝達ドメインと、抗原認識ドメインとのキメラであり得る（例えば、抗体の単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ））（Enblad Et al., Human Gene Therapy., 2015, 26 (8): 498-505）。
したがって、ＣＡＲを使用して、抗体またはその断片の特異性をＮＫ細胞またはＴ細胞に移植することができ、そのコード配列の移行はレトロウイルスベクターによって助長される。これらの受容体がキメラと呼ばれるのは、起源の異なる部分で構成されているためである。標的細胞、例えば、がん細胞に遭遇すると、ＣＡＲ ＮＫ細胞は、例えば、以下の機序によってがん細胞を破壊する：細胞増殖の一般的な刺激、細胞が他の生細胞に対して傷害性である度合い（すなわち、細胞傷害性）を高めること、および免疫系の細胞によって分泌され、生物内部の他の細胞に影響を及ぼす因子の産生を増加させること。
本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるベクター、例えば、ＢａＥＶ－ＬＶは、目的の遺伝子（すなわち、候補ポリペプチドをコードする遺伝子、異種性ポリペプチドをコードする遺伝子、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする遺伝子）を発現する。本明細書で使用される場合、候補ポリペプチドは、ＡＳＣＴ２＋細胞上または細胞内での発現が所望される任意のポリペプチドまたはその断片を指すことができる。例えば、候補ポリペプチドは、抗体もしくはその断片、毒素、ホルモン、増殖因子、受容体、またはシグナル伝達分子であり得る。一部の実施形態では、候補ポリペプチドまたは異種性ポリペプチドは、本明細書に記載されるＣＡＲである。好適な候補ポリペプチドには、抗体およびその断片が含まれ、その非限定的な例には、免疫チェックポイント抗体（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）が含まれる。そのような抗体標的には、４－１ＢＢリガンド、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＤＯ、ＬＩＧＨＴ、ネクチン２、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ２２３、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２２６、ＣＤ２７３、ＣＤ３５７、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ３、ガレクチン９、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬＧ、ＴＩＭ３、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１４、およびＶＩＳＴＡが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「形質導入」または「細胞形質導入」という用語は、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを使用して、核酸を細胞に移入するプロセスを指すことができる。
本明細書に記載される実施形態は、従来のレンチウイルス形質導入アプローチに比して、形質導入効率を改善するかまたは高めることができる。「形質導入効率を高めること」または「形質導入効率を改善すること」は、ポリペプチドをコードする遺伝子が細胞膜を横切って細胞内に送達される標的細胞（例えば、ＡＳＣＴ２＋ ＣＩＭＬ ＮＫ細胞）の集団のパーセンテージまたは割合を改善する、シュードタイプ化レンチウイルスベクターの能力を指すことができる。免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、および他の好適な方法を使用して、形質導入効率を評価することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、および他の好適な方法による測定で、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の形質導入効率を可能にすることができる。例えば、本明細書に記載される方法は、約３日後に細胞の少なくとも４０％の形質導入をもたらし得る。
細胞における形質導入効率を高めるための例示的な方法
複数の態様では、本発明は、細胞の形質導入効率を高める方法を提供する。例えば、本方法は、少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞、例えば、ＮＫ細胞を、候補ポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、インターロイキン－１２ファミリーのメンバーおよびＩＬ－１８により活性化されている。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５により活性化されている。複数の実施形態では、本方法は、ＮＫ細胞を得て、単離して、または同定して、ＮＫ細胞、例えば、ＡＳＣＴ２－細胞を、インターロイキン－１２ファミリーのメンバーおよびＩＬ－１８、ならびに任意選択でＩＬ－１５により活性化するステップを含む。さらなる実施形態では、インターロイキン－１２ファミリーのメンバーは、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、またはＩＬ－３５を含む。さらなる実施形態では、ＮＫ細胞の活性化により、ＡＳＣＴ２＋細胞が生成される。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞である。さらなる実施形態では、本方法は、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞を得る、単離する、または同定するステップを含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋の発現またはレベルは、対照細胞に対して増加している。さらなる実施形態では、対照細胞は、不活性化されたＮＫ細胞である。複数の実施形態では、対照細胞は成熟ＮＫ細胞である。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２発現は、ＡＳＣＴ２＋細胞において、対照細胞に比して約２０％～約３０％増加している。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２の存在またはレベルは、ＢａＥＶレンチウイルスベクターによる形質導入に対してより受容性である細胞をもたらす。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３またはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数により活性化されている。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。さらなる実施形態では、ヒト細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される／単離されている。複数の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ－ｇｐ）によりシュードタイプ化されている。複数の実施形態では、約３日後に少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞のうちの少なくとも４０％が形質導入されている。複数の実施形態では、形質導入効率は、従来のレンチウイルス形質導入アプローチに比して改善している。複数の態様では、候補ポリペプチドには、抗体またはその断片、毒素、ホルモン、増殖因子、受容体、もしくはシグナル伝達分子、またはそれらのキメラ抗原受容体が含まれる。さらなる実施形態では、抗体または断片は、チェックポイント阻害剤に対して特異的である。さらなる実施形態では、抗体は、抗Ｔ細胞受容体抗体またはＴ細胞受容体様抗体である。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、ＮＰＭ１、ＮＰＭ１ｃ、ＭＡＧＥ１、ＧＰ１００、ｈＴＥＲＴ、ＭＵＣ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＦＬＴ１、ＴＰ５３、スプライソソーム因子、ＭＡＧＥ３、ｈＣＨβ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＴＡＲＰ、ｐ５３、チロシナーゼ、ｐ６８、ＭＩＦ、プロテイナーゼ３、ＷＴ１、ＨＡ－１Ｈ、またはＰＲＡＭＥに対して特異的である。複数の態様では、抗体は、腫瘍特異的細胞内タンパク質を標的とする。さらなる実施形態では、細胞内タンパク質は、ＮＰＭ１ｃを含む。複数の態様では、培地は１２／１５／１５／２１およびＩＬ－７を含む。
本発明の複数の態様はまた、本明細書に記載される方法のいずれかによって産生される細胞に向けても描写される。
さらに、本発明の複数の態様は、がんを治療する方法に向けても描写される。例えば、そのような方法は、本明細書に記載される方法のいずれか１つによって産生される細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
さらに、本発明の複数の態様は、遺伝子操作された細胞を製造する方法に向けても描写される。例えば、そのような方法は、少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞を、あるポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、インターロイキン－１２ファミリーのメンバーおよびＩＬ－１８により活性化されている。複数の実施形態では、インターロイキン－１２ファミリーのメンバーは、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、またはＩＬ－３５を含む。
また、本発明の複数の態様は、少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞を、ポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させることによって作製される遺伝子操作された細胞に向けても描写される。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、インターロイキン－１２ファミリーのメンバーおよびＩＬ－１８で活性化されている。
さらに、本発明の複数の態様は、本明細書に記載されるいずれかの方法によって作製された細胞、または少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞を、あるポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させることによって作製される、遺伝子操作された細胞を含む免疫療法に向けても描写される。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、インターロイキン－１２ファミリーのメンバーおよびＩＬ－１８により活性化されている。
また、本発明の複数の態様は、がんを治療する方法に向けても描写される。例えば、そのような方法は、本明細書に記載されるいずれかの方法によって作製された細胞、または少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞を、あるポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させることによって作製される、遺伝子操作された細胞を含む免疫療法を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。複数の実施形態では、ＡＳＣＴ２＋細胞は、インターロイキン－１２ファミリーのメンバーおよびＩＬ－１８により活性化されている。
本発明の他の目的および利点は、以下の説明から容易に明らかになるであろう。
サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の形質導入の方法
異種性ポリペプチドを発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を作製するための方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、異種性ポリペプチドは、本明細書に記載されるいずれかのＣＡＲポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、本方法は、シュードタイプ化レンチウイルスベクターにより、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団に形質導入するステップを含む。本明細書に記載されるように、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、異種性糖タンパク質、例えば、異なるエンベロープウイルス由来の糖タンパク質を含む。一部の実施形態では、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、糖タンパク質によって認識される受容体が存在するか、または宿主細胞によって発現されるかに基づいて、特定の宿主細胞を認識して形質導入することができる。例えば、古典的なシュードタイプ化レンチウイルスベクターは、ＬＤＬ受容体に結合する糖タンパク質ＶＳＶ－Ｇを含み、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、ＬＤＬ受容体を発現する宿主細胞を認識して形質導入する。理論には拘束されないが、ＬＤＬ受容体はＮＫ細胞上（例えば、従来のＮＫ細胞、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞）ではほとんど発現されず、このため、ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクターを使用したこれらの細胞における形質導入効率は効果的でない。
したがって、本開示の方法は、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団に、細胞上に存在する受容体に結合する異種性糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより、形質導入するステップを含む。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞はＡＳＣＴ－２を発現し、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質を含む。理論には拘束されないが、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞上でのＡＳＣＴ－２の高い発現は、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクターを使用したこれらの細胞における有効な形質導入をもたらす。
一部の実施形態では、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質は、ＡＳＣＴ－２への結合を維持しているＢａＥＶ糖タンパク質またはそのバリアントである。一部の実施形態では、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質は、配列番号１０７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質は、配列番号１０７を含む。一部の実施形態では、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質は、配列番号１０７からなる。
一部の実施形態では、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質は、配列番号１０８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質は、配列番号１０８によって示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質は、配列番号１０８によって示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドからなる。
一部の実施形態では、集団は、ＡＳＣＴ－２を発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞を含む。一部の実施形態では、異種性ポリペプチドを発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を作製するための方法は、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと（例えば、サイトカイン誘導性のメモリー様ＮＫ細胞の集団に形質導入する条件下で）接触させるステップであって、シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質（例えば、ＢａＥＶ）を含むステップを含む。
一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される方法によるサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を提供するステップを含む。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、対照ＮＫ細胞の集団に比して、本明細書に記載される１つまたは複数の表現型マーカーおよび／または機能特性を含む。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞の集団から得られる。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞の同じまたは異なる集団から得られる。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、本明細書に記載される方法による（例えば、自己性または同種性）ｉＰＳＣ、臍帯血、またはＰＢＭＣに由来する。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団および対照ＮＫ細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞の同じ集団から得られ、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、本明細書に記載される方法による（例えば、自己性または同種性）ｉＰＳＣ、臍帯血、またはＰＢＭＣに由来する。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞の集団を予め活性化することによって得られる。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、Romee R, et al. Blood. 2012;120(24) and/or Romee R, Sci. Transl. Med. 2016; 21:357ra123（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法に従って得られる。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、１つまたは複数のサイトカインへの、ある期間にわたる曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびそれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５；ＩＬ－１２およびＩＬ－１８；ＩＬ－１８およびＩＬ－１５；またはＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８への、ある期間にわたる曝露によって予め活性化される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１２；約１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１５；および約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１８に、ある期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約５ｎｇ／ｍＬから約１５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１２；約２５ｎｇ／ｍＬから約７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１５；および約２５ｎｇ／ｍＬから約７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１８に、ある期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約５ｎｇ／ｍＬから約１５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１２；および約２５ｎｇ／ｍＬから約７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１８に、ある期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１２；約４０、４５、５０、５５、または６０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１５；および約４０、４５、５０、５５、または６０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１８に、ある期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１２；および約４０、４５、５０、５５、または６０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１８に、ある期間にわたり曝露される。
一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約８時間から約２４時間の間の期間にわたる、１つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１２時間から約２０時間の間の期間にわたる、１つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１２時間から約１６時間の間の期間にわたる、１つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１６時間から約２０時間の間の期間にわたる、１つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１４時間から約１６時間の間の期間にわたる、１つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間の期間にわたる、１つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約８時間から約２４時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１２時間から約２０時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１２時間から約１６時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１６時間から約２０時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１４時間から約１６時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８に曝露される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約８時間から約２４時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１２時間から約２０時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１２時間から約１６時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１６時間から約２０時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１４時間から約１６時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間の間の期間にわたり、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８に曝露される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１２；約１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１５；および約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１８に、約８時間から約２４時間の間；約１２時間から約１６時間の間；約１６時間から約２０時間の間；約１４時間から約１６時間の間；または約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０時間の期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約５ｎｇ／ｍＬから約１５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１２；約２５ｎｇ／ｍＬから約７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１５；および約２５ｎｇ／ｍＬから約７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１８に、約８時間から約２４時間の間；約１２時間から約１６時間の間；約１６時間から約２０時間の間；約１４時間から約１６時間の間；または約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０時間の期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１２；約４０、４５、５０、５５、または６０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１５；および約４０、４５、５０、５５、または６０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１８に、約８時間から約２４時間の間；約１２時間から約１６時間の間；約１６時間から約２０時間の間；約１４から約１６時間の間；または約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０時間の期間にわたり曝露される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、初代ヒトＮＫ細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約１ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１２；および約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１８に、約８時間から約２４時間の間；約１２時間から約１６時間の間；約１６時間から約２０時間の間；約１４時間から約１６時間の間；または約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０時間の期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約５ｎｇ／ｍＬから約１５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１２；および約２５ｎｇ／ｍＬから約７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度範囲にあるＩＬ－１８に、約８時間から約２４時間の間；約１２時間から約１６時間の間；約１６時間から約２０時間の間；約１４時間から約１６時間の間；または約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０時間の期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトＮＫ細胞の集団は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１２；および約４０、４５、５０、５５、または６０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１８に、約８時間から約２４時間の間；約１２時間から約１６時間の間；約１６時間から約２０時間の間、；約１４時間から約１６時間の間；または約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０時間の期間にわたり曝露される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、予めの活性化の後に形質導入される。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を、本明細書に記載される方法による形質導入の前に、ある期間にわたり休ませる。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、休止中にＩＬ－１５に曝露される。一部の実施形態では、休止は、約０．５ｎｇ／ｍＬから５ｎｇ／ｍＬの間の濃度のＩＬ－１５への曝露を含む。一部の実施形態では、休止は、約０．５ｎｇ／ｍＬから２ｎｇ／ｍＬの間の濃度のＩＬ－１５への曝露を含む。一部の実施形態では、休止は、約０．５、０．６、０．７、０，８、０．９、１．０、１．５、または２ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１５への曝露を含む。一部の実施形態では、休止は、形質導入の前に、約１２時間から約９６時間の間、約１２時間から約７２時間の間、約１２時間から約４８時間の間、約１２時間から約２４時間の間、約２４時間から約７２時間の間、または約２４時間から約４８時間の間の期間にわたり行われる。
一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ－１５のみへの、ある期間にわたる初代ヒトＮＫ細胞の曝露によって得られる。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞の集団は、約４０、４５、５０、５５、または６０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１５への、任意選択で約８時間から約２４時間の間、約１６時間から約２０時間の間、約１２時間から約１６時間の間、約１４時間から約１６時間の間、または約１６時間の間の期間にわたる、初代ヒトＮＫ細胞の曝露によって得られる。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ－１５への曝露によって維持される。一部の実施形態では、対照ＮＫ細胞の集団は、約０．５、０．６、０．７、０，８、０．９、１．０、１．５、または２ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１５への、約１２時間から約９６時間の間、約１２時間から約７２時間の間、約１２時間から約４８時間の間、約１２時間から約２４時間の間、約２４時間から約７２時間の間、または約２４時間から約４８時間の間の期間にわたる曝露によって維持される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、本明細書にさらに記載されるように、ＮＫ細胞の対照集団（例えば、ＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたＮＫ細胞の対照集団）に比して、１つまたは複数の特有のマーカーを発現する。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、本明細書にさらに記載されるように、ＮＫ細胞の対照集団（例えば、ＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたＮＫ細胞の対照集団）に比して、１つまたは複数の特有の機能特性を有する。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、ＮＫ細胞の対照集団（例えば、ＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたＮＫ細胞の対照集団）に比して、ＡＳＣＴ－２発現が増加している。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＡＳＣＴ－２の表面発現が増加している。表面マーカーの発現を測定する方法は当技術分野で公知であり、フローサイトメトリー、質量分析イメージング（例えば、ＣｙＴＯＦ）、組織学的検査、および顕微鏡検査が含まれる。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、ＮＫ細胞の対照集団に比してＡＳＣＴ－２の表面発現が増加しており、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、増加は、少なくとも１．１倍、約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、または４倍への増加である。一部の実施形態では、増加は約１．５～３倍への増加である。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＡＳＣＴ－２ ＲＮＡ転写物の発現が増加している。ＲＮＡ発現を定量するための方法は当技術分野で公知であり、定量的ＰＣＲおよびＲＮＡシークエンシングが含まれる。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団におけるＡＳＣＴ－２ ＲＮＡ転写物の発現は、メモリー様ＮＫ細胞の対照集団に比して、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍に増加している。一部の実施形態では、ＡＳＣＴ－２ ＲＮＡ転写物の発現は、約２倍～約４倍に増加している。
一部の実施形態では、異種性ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ）を発現する操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団は、ＡＳＣＴ－２を発現するサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させることによって得られ、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質（例えば、ＢａＥＶ）を含む。
シュードタイプ化レンチウイルスベクターを得るための方法は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、（ｉ）１つまたは複数のレンチウイルスパッケージングプラスミド、伝達プラスミド、および／またはエンベローププラスミドを、標的細胞（例えば、Ａ２９３Ｔ細胞）にトランスフェクトすること；（ｉｉ）標的細胞をほぼ集密にまたは完全な集密になるまで増殖させること；（ｉｉｉ）細胞培地を採取すること；および（ｉｖ）シュードタイプ化レンチウイルスベクターを収集すること、によって作製される。一部の実施形態では、シュードタイプ化レンチウイルスベクターの力価は、当技術分野で記載されている方法、例えば、フローサイトメトリーを使用して決定される。
一部の実施形態では、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫの集団を、集団に形質導入するのに十分な、ある力価のシュードタイプ化レンチウイルスベクター（例えば、ＢａＥＶレンチウイルスベクター）と接触させる。一部の実施形態では、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫの集団を、約５×１０３、約６×１０３、約７×１０３、約８×１０３、約９×１０３、約１０×１０３、約１１×１０３、約１２×１０３、約１３×１０３、約１４×１０３、または約１５×１０３である感染多重度（ＭＯＩ）のシュードタイプ化レンチウイルスベクター（例えば、ＢａＥＶレンチウイルスベクター）と接触させる。一部の実施形態では、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫの集団を、シュードタイプ化レンチウイルスベクター（例えば、ＢａＥＶレンチウイルスベクター）と、約１時間から約５時間の間、任意選択で約１時間から約１．５時間までの期間にわたり接触させる。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫの集団と、異種性ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチド）をコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクター（例えば、ＢａＥＶレンチウイルスベクター）との接触は、集団の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の形質導入をもたらす。一部の実施形態では、形質導入は、当技術分野で公知の方法を使用して、異種性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現および／または異種性ポリペプチドを定量することによって測定される。一部の実施形態では、形質導入は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、フローサイトメトリーまたはＣｙＴＯＦによって、異種性ポリペプチドの表面発現を定量することによって測定される。
一部の実施形態では、本方法は、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞の集団を増大させるステップをさらに含む。
サイトカイン発現ＮＫ細胞
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、サイトカインを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドは、異種性膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、分泌型ＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、配列番号９６に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、配列番号９６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、配列番号９６に示されるアミノ酸配列を含み、異種性膜貫通ドメインと作動可能に連結されているＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、配列番号９６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、異種性膜貫通ドメインと作動可能に連結されているＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、ＩＬ１５Ｒａを発現するように操作される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、以下のもの：（ｉ）自己切断性ペプチドを使用することによるＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒａの同時発現；（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ５Ｒａとの融合タンパク質；（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒａの細胞内ドメインが短縮しているＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合タンパク質；（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒａの膜結合型Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質；（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒとの融合タンパク質；（ｖｉ）ＩＬＩ５Ｒのホモ二量体；ならびに（ｖ）膜貫通ドメインと融合したＩＬ－１５ポリペプチド、のうちの少なくとも１つを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、以下のもの：（ｉ）自己切断性ペプチドを使用することによるＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒａの同時発現；（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ５Ｒａとの融合タンパク質；（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒａの細胞内ドメインが短縮しているＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合タンパク質；（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒａの膜結合型Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質；（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒとの融合タンパク質；（ｖｉ）ＩＬＩ５Ｒのホモ二量体；（ｖ）膜貫通ドメインと融合したＩＬ－１５ポリペプチド、のうちの少なくとも１つを発現するように操作され、（ｉ）～（ｖ）のうちのいずれか１つを、別々の構築物において、またはバイシストロン構築物において、ＣＡＲと同時発現させることができる。一部の実施形態では、細胞表面外因性サイトカインまたは受容体の部分ペプチドまたは完全ペプチドが、本明細書に提供される細胞において一過性に発現される。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１５、分泌性ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５Ｒａのうちのいずれか１つまたは複数を発現するように操作される。一部の実施形態では、操作されたＭＬ ＮＫ細胞は、本明細書に記載されるいずれかのＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作された場合に、細胞増殖および生存期間が増加している。一部の実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作されたメモリー様ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５ポリペプチドを発現していないメモリー様ＮＫ細胞と比較して、細胞増殖が増加している。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作されたメモリー様ＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較して、細胞増殖が増加している。一部の実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドを発現している操作されたメモリー様ＮＫ細胞は、従来のＮＫ細胞またはＩＬ－１５ポリペプチドを発現していないＭＬ ＮＫ細胞よりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％速く増殖する。一部の実施形態では、メモリー様ＮＫ細胞は、本明細書に記載されるいずれかのＩＬ１５ポリペプチドを発現している従来のＮＫ細胞と比較して、細胞生存期間が増加している。一部の実施形態では、操作されたＭＬ ＮＫ細胞は、従来のＮＫ細胞よりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％長く生存する。
例示的な抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ発現サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを発現するサイトカイン誘導性メモリー様ヒトＮＫ細胞が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、本明細書に記載されるいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸により、形質転換される。
一部の実施形態では、（ｉ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号９６に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ヒトＮＫ細胞が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、（ｉ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号９６に示されるアミノ酸配列を含む膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ヒトＮＫ細胞が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、（ｉ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号９６に示されるアミノ酸配列を含み、異種性膜貫通ドメインと融合したＩＬ－１５ポリペプチドを発現するように操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ヒトＮＫ細胞が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に比してＩＦＮγを産生する。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、（ｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に比してＩＦＮγを産生し、ならびに（ｉｉ）対照ＮＫ細胞に比してＡＤＣＣ活性が増強している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、（ｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に比してＩＦＮγを産生し、ならびに（ｉｉ）対照ＮＫ細胞に比して抗腫瘍効果が増強している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、（ｉ）対照ＮＫ細胞に比して抗腫瘍効果が増強しており、および（ｉｉ）対照ＮＫ細胞に比してＡＤＣＣ活性が増強している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋であり、（ｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に比してＩＦＮγを産生し；（ｉｉ）対照ＮＫ細胞に比してＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｉｉｉ）対照ＮＫ細胞に比して抗腫瘍効果が増強している。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており、１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下で、対照ＮＫ細胞に比してＩＦＮγを産生する。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；ならびに（ｉｉｉ）ＡＤＣＣ活性が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｉｉ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；ならびに（ｉｉｉ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｉｉ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｉｉｉ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｉｉ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；（ｉｉｉ）ＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；ならびに（ｉｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し、ここで（ｉ）～（ｉｉｉ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；（ｉｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；ならびに（ｉｖ）ＡＤＣＣ活性が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；（ｉｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；（ｉｉｉ）ＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｉｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチドを発現し、（ｉ）ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており；（ｉｉ）ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｌｂの発現が減少しており；（ｉｉｉ）１つまたは複数のサイトカインおよび／または腫瘍標的の存在下でＩＦＮγを産生し；（ｉｖ）ＡＤＣＣ活性が増強しており；ならびに（ｖ）抗腫瘍効果が増強しており、ここで（ｉ）～（ｖ）は対照ＮＫ細胞に比してである。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＭＬ ＮＫ細胞は、末梢血、臍帯血、またはリンパ液から単離されるかまたは増大されたＮＫ細胞に由来する。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は同種性である。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は自己性である。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＭＬ ＮＫ細胞は、（本明細書に記載されるＣＡＲを発現するようなその改変の後に）それが投与される対象にとって自己性である。一部の実施形態では、本明細書に提供されるＭＬ ＮＫ細胞は、（本明細書に記載されるＣＡＲを発現するようなその改変の後に）それが投与される対象にとって同種性である。同種性ＭＬ ＮＫ細胞を使用してＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を調製する場合、免疫エフェクター細胞を、１つまたは複数の免疫抑制剤と同時投与することができる。
一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、疾患または状態（例えば、がん、例えば、ＡＭＬ）を有する患者に由来し、本明細書に記載されるいずれかの抗原（例えば、ネオ抗原）に対する特異性を有する少なくとも１つのＣＡＲを発現するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子改変されている。例えば、抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質によって提示されるがんネオ抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原）であり得る。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）によって提示されるがんネオ抗原に対する特異性を有するＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたＭＬ ＮＫ細胞は、次いで、患者におけるがん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）を治療するために投与される。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞は、リガンドまたは抗原のＣＡＲへの特異的結合によって刺激または誘導され、同じ患者の疾患または状態の治療のために有用な、少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、サイトカインの誘導）を果たす。
（例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインのがんネオ抗原への結合による）ＣＡＲを含むＭＬ ＮＫ細胞の刺激は、ＣＡＲ細胞の１つまたは複数の抗がん活性の活性化をもたらし得る。例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞の刺激は、サイトカインの分泌を含む、ＣＡＲ細胞の細胞溶解活性またはヘルパー活性の増加をもたらし得る。
一部の実施形態では、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞）は、本明細書に記載されるいずれかの抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に結合するＣＡＲ分子を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含むＭＬ ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＰＭ１ｃネオエピトープ、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する細胞外ドメインを含むＣＡＲを発現する。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞）は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲを発現する。
一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物は、メモリー様ナチュラルキラー（ＭＬ ＮＫ）細胞において発現されること、または機能することができる。
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現していないＮＫ細胞と比較して、標的細胞に対する細胞傷害が増加している。細胞傷害を測定するための方法は当業者に公知であり、目的の標的細胞の細胞数を測定すること、細胞死／生存率に関するマーカーを測定すること、および発光が含まれるが、これらに限定されない。例えば、一部の実施形態では、フローサイトメトリー分析は、総細胞数を定量するために使用される。一部の実施形態では、細胞を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ染色キットを使用して染色し、フローサイトメトリーを使用して定量する。一部の実施形態では、細胞傷害は、ルシフェラーゼ発現標的細胞を使用して測定される。エフェクター細胞とともに培養した場合、標的細胞溶解物の発光を使用して細胞傷害を計算する。
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、１つまたは複数の表現型および／または機能的マーカーの発現が増加する。一部の実施形態では、発現増加を有する１つまたは複数の表現型および／または機能的マーカーは、（ｉ）ＩＦＮγ；（ｉｉ）グランザイムＢ；（ｉｉｉ）ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１０７ａ、およびＣＤ６２Ｌから選択される１つまたは複数の活性化マーカー；（ｉｖ）ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４から選択される１つもしくは複数の活性化受容体；（ｖｉ）ＣＤ５６およびＮＫＧ２Ａから選択される１つもしくは複数の成熟マーカー；ならびに／または（ｖｉｉｉ）ＴＩＧＩＴから選択され、ここで（ｉ）～（ｖｉｉｉ）は対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比してである。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、ＩＦＮ－γの発現が増加している。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、グランザイムＢの発現が増加している。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、ＣＤ１０７ａの発現が増加している。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、ＴＩＧＩＴの発現が増加している。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、活性化マーカーの発現が増加している。一部の実施形態では、活性化マーカーはＣＤ６２Ｌである。一部の実施形態では、活性化マーカーはＣＤ２５である。一部の実施形態では、活性化マーカーはＣＤ６９である。一部の実施形態では、活性化マーカーはＩＣＯＳである。一部の実施形態では、活性化マーカーはＣＤ２２６である。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、活性化受容体の発現が増加している。一部の実施形態では、活性化受容体はＮＫＧ２Ｄである。一部の実施形態では、活性化受容体はＮＫｐ３０である。一部の実施形態では、活性化受容体はＮＫｐ４４である。
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、１つまたは複数の表現型および／または機能的マーカーの発現が減少している。一部の実施形態では、発現減少を有する１つまたは複数の表現型および／または機能的マーカーは、（ｉ）ＣＤ５７；および／または（ｉｉ）ＴＲＡＩＬから選択され、ここで（ｉ）～（ｉｉ）は対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比してである。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、ＴＲＡＩＬの発現が減少している。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞と接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、ＣＤ５７の発現が減少している。
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞に接触された場合に、（ｉ）ＩＦＮγの発現増加；（ｉｉ）グランザイムＢの発現増加；（ｉｉｉ）ＣＤ２５、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、およびＣＤ６２Ｌから選択される１つもしくは複数の活性化マーカーの発現増加；（ｉｖ）ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４から選択される１つもしくは複数の活性化受容体の発現増加；（ｖ）ＣＤ５６およびＮＫＧ２Ａから選択される１つもしくは複数の成熟マーカーの発現増加；（ｖｉ）ＣＤ５７の発現減少；（ｖｉｉ）ＴＩＧＩＴの発現増加；ならびに／または（ｖｉｉｉ）ＴＲＡＩＬの発現減少を有し、ここで（ｉ）～（ｖｉｉ）は対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比してである。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞に接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、ＩＦＮγの発現増加およびＣＤ１０７ａの発現増加を有する。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞に接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、ＩＦＮγ、ＣＤ１０７ａ、およびグランザイムＢの発現増加を有する。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲ）は、ＣＡＲ抗原認識ドメインによって標的化される抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を発現する標的細胞に接触された場合に、対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、ＩＦＮγ、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢの発現増加；および対照ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ非発現ＭＬ ＮＫ細胞）に比して、ＴＲＡＩＬの発現減少を有する。
ＣＡＲ発現サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞を製造する方法
本明細書に記載されるいずれかのＣＡＲポリペプチドを含む、本明細書に記載されるサイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞のいずれかを生成するために使用し得る方法が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドまたはＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子は、当業者に公知の任意の方法を使用して、ＭＬ ＮＫ細胞または前記細胞の集団に導入される。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、または形質導入によって細胞に導入される。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子は、形質導入を介してＭＬ ＮＫ細胞に導入される。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を含むレンチウイルスを、形質導入を介してＭＬ ＮＫ細胞に導入する。
当技術分野で公知の種々の異なる方法を使用して、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする核酸のいずれか、または本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを、ＭＬ ＮＫ細胞に導入することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞を作製するための方法は、（ｉ）末梢血、臍帯血またはリンパ液から（例えば、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）から）細胞を得ること、（ｉｉ）任意選択で、得られた細胞を精製すること、（ｉｉｉ）任意選択で、細胞を増大させること、（ｉｖ）細胞を（例えば、サイトカイン、例えば、これらに限定されないが、ＩＬ－１５、ＩＬ１２、およびＩＬ－１８により）活性化して、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞を形成させること、（ｖ）任意選択で、活性化された細胞を増大させること、（ｖｉ）本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含む発現ベクターにより細胞に形質導入すること、（ｖｉｉ）ＣＡＲを発現する細胞を単離すること、および（ｖｉｉｉ）任意選択で、単離された細胞を増大させることを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞を作製するための方法は、（ｉ）多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を得ること、（ｉｉ）ｉＰＳＣを誘導してＮＫ細胞に分化させること、（ｉｉ）ＮＫ細胞を、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞へと予め活性化すること、（ｉｉｉ）任意選択で、活性化された細胞を増大させること、（ｉｖ）本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含む発現ベクターにより、活性化された細胞に形質導入すること、（ｖ）ＣＡＲを発現するＭＬ ＮＫ細胞を単離すること、および（ｖｉ）任意選択で、単離された細胞を増大させることを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変のいずれかを、レンチウイルスを使用して細胞に形質導入する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのＣＡＲポリペプチドは、ヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質バリアント（ＢａＥＶ－ＬＶ）を使用して、ＭＬ ＮＫ細胞に形質導入される。ＮＫ細胞は、ＢａＥＶ受容体であるアラニン・セリン・システイン輸送体２（ＡＳＣＴ２）を発現する。一部の実施形態では、ＢａＥＶ－ＬＶ形質導入は、参照により本明細書に組み込まれる、Bari, R., et al. 2019 Frontiers in Immuno. Vol. 10, 2001に記載されているように行われる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのＣＡＲポリペプチドは、水疱性口内炎ウイルスＧＰ（ＶＳＶ－Ｇ）－ＬＶを使用して、ＭＬ ＮＫ細胞に形質導入される。ＮＫ細胞は、ＶＳＶ－Ｇ受容体である低密度リポタンパク質（ＬＤＬ－Ｒ）を発現する。一部の実施形態では、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ形質導入は、参照により本明細書に組み込まれる、Tomas, H., et al. 2019 Mol Ther Methods Clin Dev. 15: 1-8に記載されているように行われる。一部の実施形態では、ＢａＥＶの糖タンパク質が、ＶＳＶ糖タンパク質を置き換える。一部の実施形態では、ＶＳＶゲノムは、ＢａＥＶ糖タンパク質を発現する。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドが、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞に、ＩＬ－１５の存在下で、細胞にＣＡＲをウイルス性に形質導入するのに十分な時間にわたり、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス）を介して形質導入されて、その結果、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞がもたらされる。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、約１２時間から約２４時間の間である。一部の実施形態では、ＣＡＲをＭＬ ＮＫ細胞にウイルス性に形質導入する（ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞を形成させる）のに十分な時間の長さは、少なくとも約１時間；約２時間；約３時間；約４時間；約５時間；約６時間；約７時間；約８時間；約９時間；約１０時間；約１１時間；約１２時間；約１３時間；約１４時間；約１５時間；約１６時間；約１７時間；約１８時間；約１９時間；約２０時間；約２１時間；約２２時間；約２３時間；約２４時間；約２５時間；約２６時間；約２７時間；約２８時間；約２９時間；約３０時間；約３１時間；約３２時間；約３３時間；約３４時間；約３５時間；約３６時間；約３７時間；約３８時間；約３９時間；約４０時間；約４１時間；約４２時間；約４３時間；約４４時間；約４５時間；約４６時間；約４７時間；または約４８時間であり得る。
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含むベクターにより形質導入されたＭＬ ＮＫ細胞を、ＩＬ－１５の存在下で、ベクターを発現させてＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞を形成させるのに十分な長さの時間にわたりインキュベートする。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、約３日間から約８日間の間である。一部の実施形態では、ＭＬ ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、少なくとも約１日間；約２日間；約３日間；約４日間；約５日間；約６日間；約７日間；約８日間；約９日間；約１０日間；約１１日間；約１２日間；約１３日間；または約１４日間であり得る。
組成物
一部の態様では、本明細書に開示される、いずれかの抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ発現サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞、または前記細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）が、本明細書において提供される。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。賦形剤および安定剤を含むがこれらに限定されない、適切な薬学的に許容される担体が、当技術分野で公知である（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAを参照）。
医薬組成物は、好ましくは薬学的に許容される担体（例えば、本明細書において想定されるヒトまたは他の対象への投与のために好適な、１つまたは複数の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質）の中に、細胞、係留手段（例えば、脂質ナノ粒子）および／またはタンパク質もしくはペプチドを含む無菌組成物であり得る。担体は、有機または無機成分、天然性または合成性、であり得、それが細胞、係留手段（例えば、脂質ナノ粒子）および／またはタンパク質もしくはペプチドと組み合わされることで、投与が容易になる。医薬組成物の構成成分は、それらの所望の医薬効率を実質的に損なうと考えられる相互作用が起こらないような様式で混合される。
薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、分散剤、等張剤、湿潤剤、キレート剤、封鎖剤、ｐＨ緩衝剤、溶解促進剤、抗菌剤、麻酔剤、および／または抗酸化剤が挙げられるが、これらに限定されない。
医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための手法は、当技術分野で公知である（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照；これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内であると考えられるが、ただし、任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生じることによって、または別様に医薬組成物の他のいずれかの構成成分と有害な様式で相互作用することによって、物質またはその誘導体と不適合であり得る場合を除く。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、エモリエント、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング剤、滑剤（流動増強剤）、潤沢剤、保存剤、印刷用インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和の水が挙げられる。例示的な賦形剤としては、食塩水、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、スクロース、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、麦芽、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、デンプン（例えば、アルファ化デンプン）、プロピレン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、シリカゲル、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、タルク、ベースクリーム、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される塩を含み得る。本開示の組成物中に含まれ得る、薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の酸付加塩、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素塩、塩酸塩、ヨウ化水素塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの他、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されない非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。
医薬組成物は、対象（例えば、ヒト）への投与のために好適であるように製剤化することができる。医薬組成物は、任意の投与経路のために製剤化することができる。
医薬組成物は、それを全身性に送達することが望ましい場合には、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。そのような製剤は、注射の前に溶液または懸濁液にするのに好適な液体溶液、懸濁液、エマルジョンまたは固体形態として調製することができる。注射用の製剤は、例えば、アンプルまたは複数回投与容器の中にある、単位剤形として用意することができる。非経口用の医薬製剤には、成分の水溶液が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有することができる。あるいは、成分の懸濁液を、油性の懸濁液として調製することもできる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、胡麻油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。非経口的に投与される場合、好適な薬学的に許容される担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、または、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはグルコースを含有する溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞または前記細胞の集団は、治療有効量で使用されるか、または本明細書に開示される医薬組成物中に治療有効量で存在することができる。治療有効量は、標準的な臨床手法によって決定することができる。
本明細書において想定される薬学的に許容される組成物は、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞または前記細胞の集団に加えて、追加の抗がん剤（例えば、本明細書に記載される任意の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の抗がん剤）を含み得る。
治療方法および使用
２０１５年に米国だけで、およそ２０，８３０人のＡＭＬの新たな症例が診断され、１０，４６０人がこの疾患が原因で死亡した。高齢がＡＭＬの危険因子であるため、疾患の発生率は人口の高齢化とともに増加し得る。従来の化学療法および同種幹細胞移植に耐えることができる患者は完全寛解を達成することができるが、大多数は再発を経験し、この疾患により死亡する。したがって、我々のがん免疫療法の理解の進歩を利用する、より毒性が少なく、より効果的な標的化療法を開発するニーズがある。
一部の実施形態では、本開示は、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する（例えば、がん増殖を抑制する、がん進行を抑制する）ための方法であって、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するいずれかの免疫エフェクター細胞（例えば、ＭＬ ＮＫ細胞）、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＮＰＭ１ｃ陽性がんを治療するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「ＮＰＭ１ｃ陽性がん」は、ＮＰＭ１遺伝子に変異（例えば、ＮＰＭ１における４ｎｔ重複変異）を有する腫瘍細胞を含むがんを指し、ＮＰＭ１における変異は、野生型ＮＰＭ１を発現する細胞と比較した場合に、ＮＰＭ１タンパク質の細胞質局在の増加をもたらす。特定の遺伝子変異（例えば、ＮＰＭ１における４ｎｔ重複変異）の存在を決定するために、がんにおける遺伝子発現を測定する方法は、当技術分野で公知であり、対象から収集した悪性腫瘍試料（例えば、血液、骨髄、腫瘍、および／または組織試料）の分析が含まれる。一部の実施形態では、遺伝子における小さな重複、挿入、または欠失を検出するための方法は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、液滴デジタルＰＣＲ、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング、および次世代シークエンシング（例えば、全ゲノムシークエンシング、例えば、全エクソームシークエンシング）を使用して行われる。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃ陽性がんは、ＮＰＭ１遺伝子における変異（例えば、遺伝子のエクソン１２における４塩基対フレームシフト挿入、代替的リーディングフレームにおけるＣ末端１１アミノ酸をコードする変異、または以下のＣ末端アミノ酸配列：ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むタンパク質の発現をもたらすＮＰＭ１変異）を有することが検出される。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ陽性がんは、ＮＰＭ１タンパク質の細胞質局在が増加した腫瘍細胞を含む。ＮＰＭ１の細胞局在を評価する方法は当技術分野で公知であり、例えば、標識された抗ＮＰＭ１抗体を使用し、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーによって局在を評価する。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ陽性がんから単離された腫瘍細胞は、健常な非がん性組織試料から単離された細胞と比較した場合に、ＮＰＭ１タンパク質の細胞質局在が増加している。
一部の実施形態では、本開示は、ＮＰＭ１ｃ陽性がんの治療を必要とする対象においてＮＰＭ１ｃ陽性がんを治療する（例えば、がんの増殖または進行を抑制する）ための方法であって、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞、前記細胞の集団、または本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ＡＭＬの治療を必要とする対象においてＡＭＬを治療する（例えば、ＡＭＬの増殖または進行を抑制する）ための方法であって、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するいずれかのＭＬ ＮＫ細胞、前記細胞の集団、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＮＰＭ１ｃ陽性ＡＭＬの治療を提供する。
一部の実施形態では、本開示の、ＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞、前記細胞の集団、または医薬組成物を、がんを治療するための標的化免疫療法の開発に使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の、ＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞、前記細胞の集団、または医薬組成物を、ＡＭＬの治療のために使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の、ＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞、前記細胞の集団、または医薬組成物を、ＡＭＬ細胞を殺滅するための細胞傷害性薬剤として使用することができる。
一部の実施形態では、本開示は、ＨＬＡ－Ａ２をコードするアレル（すなわち、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレル）を保有する対象においてＮＰＭ１ｃ陽性がん（例えば、ＡＭＬ）を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ陽性がん（例えば、ＡＭＬ）は、ＨＬＡ－Ａ２の発現を有する腫瘍細胞を含む。ＨＬＡ発現を決定する方法は当技術分野で公知であり、ＨＬＡ－Ａ２を認識する標識抗体を使用するフローサイトメトリー、免疫組織化学、およびウエスタンブロット法が含まれる。ＨＬＡ発現を、ＲＴ－ＰＣＲおよびＲＮＡシークエンシングによって決定することもできる。
一部の実施形態では、本開示は、がん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）の治療を必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示しており、治療が、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞、前記細胞の集団、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、がん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）の治療を必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされるタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成したＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）ネオエピトープを提示しており、治療が、本明細書に記載されるいずれかのＣＡＲポリペプチド、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を発現するＭＬ ＮＫ細胞を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するいずれかのＭＬ ＮＫ細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、がん（例えば、がんはＮＰＭ１ｃ陽性であり、例えば、がんはＡＭＬである）を有する対象におけるがんの量の減少、または生存期間の延長を提供する。ある特定の実施形態では、がんを含む細胞の細胞表面は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープ（例えば、配列番号１）を提示する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するいずれかのＭＬ ＮＫ細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、がんから寛解している対象におけるがんの予防を提供する。
一部の実施形態では、がんは再発性がんである。一部の実施形態では、がんは難治性がんである。一実施形態では、がんは進行期がんである。一部の実施形態では、がんは、１つまたは複数の他の治療法（例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、または別の免疫療法）に対して抵抗性である。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するいずれかのＭＬ ＮＫ細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、ＡＭＬの予防を必要とする対象におけるＡＭＬの予防を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＭＬから寛解している対象におけるＡＭＬの予防を提供する。
一部の実施形態では、治療しようとするがんはＡＭＬである。一部の実施形態では、がんは再発性ＡＭＬである。一部の実施形態では、がんは難治性ＡＭＬである。一部の実施形態では、がんは進行ＡＭＬである。一部の実施形態では、がんは、１つまたは複数の他の治療法（例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、または別の免疫療法）に対して抵抗性であるＡＭＬである。
本明細書に記載される任意の治療法の有効性は、（例えば、治療される対象または治療されるがんの動物モデルへの）治療法の前後のパラメーター（例えば、腫瘍量）を評価することによって評価することができる。当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して、本明細書に記載される治療法の治療有効性を評価することができる。
投与の方法
本明細書に記載される治療法は、非経口的な投与経路を含むがこれに限定されない任意の好適な手段によって対象に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、患者に非経口的に投与される。非経口的投与の好適な経路の非限定的な例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、腫瘍内、髄腔内および腹腔内投与が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、腹腔内に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、筋肉内に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、皮下に投与される。ある特定の実施形態では、投与は、静脈内、髄腔内、骨内または脊髄内である。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、脊髄内または脊柱管内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、髄腔内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、骨内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、骨髄内に投与される。
適切な投与量は、治療される特定のがん、治療される対象の年齢、体重および身体状態、がんの重症度、投与の経路、治療の期間、治療される対象の反応性、同時または併用療法の性質（もしあれば）、具体的な投与経路、ならびに医療従事者の知識および専門知識の範囲にある同様の要因によって異なると考えられる。ある特定の実施形態では、最大耐量、すなわち、堅実な医学的判断による最大の安全用量が使用されるべきである。好ましい態様では、治療法は、有効量で投与されるべきである。有効量は、医学的に望ましい結果を提供するのに十分な組成物の投与量である。
例えば、対象が腫瘍を有する場合、有効量は、（例えば、腫瘍を画像化することによって決定される）腫瘍体積または負荷を減少させる量であり得る。有効量を、血液または他の体液もしくは組織（例えば、生検試料）中のがん細胞の存在および／または頻度によって評価してもよい。腫瘍が組織または臓器の正常な機能に影響を及ぼしている場合、有効量は、組織または臓器の正常な機能を測定することによって評価することができる。
ある特定の実施形態では、操作されたＭＬ ＮＫ免疫エフェクター細胞は、約または少なくとも１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、または５×１０１１、１×１０１２、または５×１０１２個（またはその間の任意の値もしくは範囲）の量で投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞により治療された対象は、完全寛解を経験する。一部の実施形態では、患者は、いずれかの操作されたＭＬ ＮＫ細胞を０．５×１０６個／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、患者は、ＣＡＲ－ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を１．０×１０６個／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、患者は、ＣＡＲ－ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を１０×１０６個／ｋｇの用量で投与される。
単回投与またはある期間にわたる複数回投与を含む、本明細書に記載される治療法の様々な投薬スケジュールが想定されている。投与の方法には、ボーラス投与および注入（例えば、連続注入またはパルス注入）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される方法に使用するための治療レジメンとしては、１週間に２回、毎週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、１か月間もしくは４週間ごとに１回、６週間ごとに１回、２か月間もしくは８週間ごとに１回、または３か月間もしくは１２週間ごとに１回の治療法の投与を挙げることができる。ある特定の実施形態では、対象は、本明細書に記載されるいずれかの治療法の単回の用量を投与される。ある特定の実施形態では、対象は、本明細書に記載されるいずれかの治療法の少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも８回、または少なくとも１０回の用量を投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、毎日、１日おきに、または１週間に２回投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、ある期間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、または１年間にわたり投与される。
一部の実施形態では、最初の治療期間（治療法が、例えば、単回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に２回、または１か月間に１回投与される）に続いて、抗体が投与されない休薬期間（例えば、１週間、２週間、３週間、１か月間もしくは４週間、６週間、２か月間もしくは８週間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、または１年間にわたる）があり、次いで、第２の治療期間（治療法が、例えば、単回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に２回、または１か月間に１回投与される）がある。そのような最初の治療期間およびそのような第２の治療期間は、例えば、２週間、３週間、４週間、６週間、２か月間、または３か月間継続され得る（最初の治療期間は第２の治療期間と同じであってもよく、または異なってもよい）。
患者集団
本明細書に記載される方法に従って治療される対象としては、ヒトおよび非ヒト脊椎動物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、哺乳動物、例えば、家飼いペット（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレットなど）、家畜または農業動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリまたは別の家禽）、ウマ（例えば、純血種のウマ）、サル、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）その他である。対象にはまた、魚類および他の水生動物種も含まれる。好ましい一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象はヒトである。一実施形態では、本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療のための標的化免疫療法によって利益を得る可能性が高いと考えられるあらゆる対象において実施することができる。一部の実施形態では、本開示は、ＮＰＭ１ｃ陽性がん（例えば、ＡＭＬ）を有する対象における使用のためのものである。
一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、本明細書に記載されるいずれかの免疫療法から利益を得ることができる（またはその可能性が高い）がんを有する（例えば、それを有すると診断された）任意の対象において実施することができる。がん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）を有する対象は、検出可能ながん細胞を有する対象である。本開示は、がん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）を有する対象に対する、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞の投与を想定している。
一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、ＮＰＭ１遺伝子における変異（例えば、遺伝子のエクソン１２における４塩基対フレームシフト挿入、代替的リーディングフレームにおけるＣ末端１１アミノ酸をコードする変異、または以下のＣ末端アミノ酸配列：ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むタンパク質の発現をもたらすＮＰＭ１変異）によって特徴付けられる（例えば、それを有することが知られている、有することが予想される、または有することが検出された）がんを有する、任意の対象において実施することができる。ある特定の実施形態では、本開示の治療方法および使用は、変異型ＮＰＭ１タンパク質（例えば、細胞質局在を有するＮＰＭ１ｃ変異型タンパク質、Ｃ末端ドメインにおける変異を有するタンパク質、フォールディングしたＣ末端ドメインを欠く変異型タンパク質、以下のＣ末端アミノ酸配列：ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むタンパク質、配列番号５６によって示されるタンパク質、またはＮＰＭ１ｃ）の発現によって特徴付けられる（例えば、発現することが知られている、発現することが予想される、または発現することが検出された）がんを有する、任意の対象において実施することができる。ＮＰＭ１ｃの変異したＣ末端配列は当技術分野で公知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、van der Lee et al., 2019, J. Clin. Invest. 129(2):774-785を参照。例えば、図１を参照）。一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、がんを有する任意の対象において実施することができ、そのがんを含む細胞の細胞表面は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンネオエピトープ（例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ、例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１））を提示する（例えば、提示することが知られている、提示することが予想される、または提示することが検出された）。一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、がんを有する任意の対象において実施することができ、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）は、そのがんを含む細胞の細胞表面に、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ（例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１））を提示するかまたは呈する。
任意選択で、本明細書に記載される方法に従って治療される予定の見込みのある患者のがん細胞が、ＮＰＭ１遺伝子もしくはＮＰＭ１タンパク質における変異について検査され、またはがんを含む細胞の細胞表面がクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープ（例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１））を含む抗原を提示するか否かを決定するために検査される。一部の態様では、そのような検査が、ＮＰＭ１遺伝子における変異もしくはＮＰＭ１タンパク質における変異に関して陽性である場合、またはクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープ（例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１））を含む抗原をがん細胞の細胞表面に提示していると決定された場合には、患者は、本明細書に記載される方法に従って治療される。
一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象において実施することができる。特定の一実施形態では、本開示の治療方法および使用は、ＡＭＬと診断された対象において実施される。
本明細書に記載される方法によって治療されるがんを診断するための検査は、当技術分野で公知であり、通常の医療従事者には熟知されていると考えられる。これらの臨床検査には、顕微鏡分析、培養依存性検査（培養など）、および核酸検出検査が挙げられるが、これらに限定されない。これらには、湿式マウント、染色増強顕微鏡検査、免疫顕微鏡検査（例えば、ＦＩＳＨ）、ハイブリダイゼーション顕微鏡検査、粒子凝集、酵素結合免疫吸着検定法、尿スクリーニング検査、ＤＮＡプローブハイブリダイゼーション、血清学的検査などが含まれる。医師は一般に、以上に列挙した臨床検査を実行することに加えて、全病歴を聴取し、完全な身体診察を行う。
ＡＭＬの検出のための方法には、白血病細胞に関するＰＢＭＣのフローサイトメトリーと、それに続くＮＰＭ１ｃ変異に関するＰＣＲおよび配列決定が含まれるが、これらに限定されない。ＡＭＬ診断のための臨床的方法は当技術分野で公知である。ＡＭＬ発症の危険因子には、喫煙、化学療法、放射線療法、特定の血液疾患、および加齢が含まれる。
一実施形態では、治療される対象は、早期がん（例えば、ＡＭＬ）と診断されている。一実施形態では、治療される対象は、進行期がん（例えば、ＡＭＬ）と診断されている。
一部の実施形態では、治療される対象は、ＡＭＬ進行のいずれかの段階にある。
一部の態様では、治療される対象は、以前に１つまたは複数の他のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）を受けている。ある特定の実施形態では、治療される対象は、以前に１つまたは複数の他のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）を受けており、対象のがんが再発している。ある特定の実施形態では、治療される対象は、以前に１つまたは複数の他のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）を受けており、対象は、１つまたは複数の他のがん治療に対して抵抗性を生じている。ある特定の実施形態では、治療される対象は、寛解状態にある（例えば、がんの部分寛解または完全寛解にある）。ある特定の実施形態では、治療される対象は、１つまたは複数の他のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）に対して難治性である。
他の実施形態では、本開示の治療方法および使用に従って、本明細書に記載されるいずれかの免疫療法から利益を得ることができる（または得られる可能性が高い）がんを発症するリスクのある対象を治療することが、本明細書において想定される。がん（例えば、ＡＭＬ）を発症するリスクのある対象は、がんを発症する確率が通常よりも高い対象である。これらの対象には、例えば、がんを発症する可能性の高さと関連することが実証されている遺伝子異常を有する対象、がんの家族性素因を有する対象、タバコ、アスベスト、または他の毒性化学物質などのがん原因物質（すなわち、発がん物質）に曝露された対象、およびがんの治療歴があって見かけ上は寛解状態にある対象が含まれる。本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞の、がん（例えば、ＡＭＬ）を発症するリスクのある対象への投与を想定している。
一部の実施形態では、治療される対象は成人である。一実施形態では、対象は、１８歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、２１歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、４５歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、６５歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、１８歳未満のヒト対象である。一実施形態では、対象は、４５歳未満（または１８歳から４５歳の間、もしくは２１歳から４５歳の間）のヒト対象である。一実施形態では、対象は、６５歳未満（または１８歳から６５歳の間、２１歳から６５歳の間、もしくは４５歳から６５歳の間）のヒト対象である。
併用療法
一部の態様では、本明細書に記載される治療方法および使用は、治療応答を増強する、例えば、対象における抗腫瘍応答を増強する、および／または腫瘍に対して細胞傷害性である（例えば、化学療法剤）、追加の薬剤による対象の治療をさらに含む。
一部の態様では、本明細書に記載される治療法は、１つまたは複数の抗がん療法、例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、抗がん活性を有する小分子、別の抗がん免疫療法（例えば、別の抗がん抗体もしくはその断片、または別のＴ細胞療法）、または当技術分野で公知の任意の他の抗がん療法と組み合わせて、対象に投与される。
一部の態様では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞は、１つまたは複数の抗がん療法、例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、抗がん活性を有する小分子、別の抗がん免疫療法（例えば、別の抗がん抗体もしくはその断片、または別のＴ細胞療法）、または当技術分野で公知の任意の他の抗がん療法と組み合わせて、対象に投与される。
一部の態様では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞のうちの１つもしくは複数、またはそれらを含む組成物は、幹細胞移植または別の抗がん免疫療法（例えば、別の抗がん抗体もしくはその断片、または別のＴ細胞療法）と組み合わせて、対象に投与される。ＣＡＲを含むＭＬ ＮＫ細胞による投与については、細胞の生存性に負の影響を及ぼさないと考えられるいずれかの併用療法が、本明細書において想定される。
併用療法における使用のために好適な治療薬には、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤を含む小分子化学療法薬、ならびに以下でさらに考察するものを含むがこれらに限定されない生物学的抗がん剤、例えば、抗がん抗体が含まれる。
一部の態様では、併用療法は、抗腫瘍免疫を増強するための免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、またはＣＴＬＡ－４阻害剤を、対象に投与するステップを含む。免疫チェックポイントの他のモジュレーターは、ＴＩＭ－３、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０ＬまたはＩＣＯＳを標的とすることができる。一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する薬剤は、抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３またはＯＸ－４０に対する拮抗抗体）である。別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する薬剤は、タンパク質モジュレーターまたは低分子モジュレーターである。別の実施形態では、薬剤（例えば、ｍＲＮＡ）は、免疫チェックポイントの抗体モジュレーターをコードする。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、ＴＩＭ－３阻害剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、ＰＤ－１阻害剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、ＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、ＣＴＬＡ－４阻害剤と組み合わせて投与される。併用療法に使用することができる免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ペムブロリズマブ、アレムツズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＡＭＰ－２２４、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ－１２１０、ＴＳＲ－０４２、アフィマー、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、ＢＭＳ９３６５５９、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＡＧＥＮ１８８４、ＭＥＤＩ６４６９およびＭＯＸＲ０９１６が挙げられる。
特定の一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、化学療法と組み合わせて対象に投与される。本明細書に記載される併用療法に使用することができる化学療法薬の種類の例としては、アルキル化剤、ニトロソ尿素剤、代謝拮抗剤、白金錯体誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、植物由来のアルカロイド、ホルモン拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、およびＰ糖タンパク質阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される併用療法に使用することができる化学療法薬の具体的な例としては、タキソール、パクリタキセル、ｎａｂ－パクリタキセル、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、コルヒチン、ミトキサントロン、タモキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ウラムスチン、ムスタルゲン、イホスファミド、ベンダムスチン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾシン、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン、テトラジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、アルトレタミン、ヘキサレン、トロホスファミド、エストラムスチン、トレオスルファン、マンノスルファン、トリアジクオン、カルボクオン、ニムスチン、ラニムスチン、アザチオプリン、スルファニラミド、フルオロピリミジン、チオプリン、チオグアニン、メルカプトプリン、クラドリビン、カペシタビン、ペメトレキセド、フルダラビン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、ネララビンまたはクロファラビン、シタラビン、デシタビン、プララトレキサート、フロクスウリジン、チオクアニン、アザシチジン、クラドリビン、ペントスタチン、メルカプトプリン、イマチニブ、ダクチノマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、ペリウィンクル、ビンカ、タキサン、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、テニポシド、ピラルビシン、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン、アムサクリン、抗アンドロゲン薬、抗エストロゲン薬、ビカルタミド、メドロキシプロゲステロン、フルオキシメステロン、ジエチルスチルベストロール、エストラース、オクトレオチド、メゲストロール、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、プレドニゾン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルテチミド、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタン、ファドロゾール、アンドロステン、レスベラトロール、ミオスミン、カテキン、アピゲニンエリオジクチオールイソリキリチゲニン、マンゴスチン、アミオダロン、アジスロマイシン、カプトプリル、クラリスロマイシン、シクロスポリン、ピペリン、ケルセチン、キニジン、キニン、レセルピン、リトナビル、タリキダル、ベラパミル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、トランスプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、トリプラチンおよびカルボプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、ＡＭＬの治療のための１つまたは複数の化学療法と組み合わせて、対象に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の化学療法は、シタラビン、ダウノルビシン、イダルビシン、クラドリビン、フルダラビン、ミトキサントロン、エトポシド、６－チオグアニン、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、デキサメタゾン、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、アザシチジン、およびデシタビンから選択される。
特定の一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、放射線療法と組み合わせて対象に投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法は、幹細胞移植と組み合わせて対象に投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法は、１つまたは複数の追加の抗がん治療法の前、その間（すなわち、同時に）またはその後に投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、以前に抗がん治療を受けていない。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、以前に抗がん療法（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）を受けている。
キット
本発明の複数の態様は、キットを対象とする。
「キット」という用語は、試料のプロセス、方法、アッセイ、分析、または操作を容易にする一連の物品を指すことができる。キットは、キットを使用するための説明書（例えば、本発明の方法についての説明書）、資料、溶液、構成成分、試薬、化学物質、または方法に必要とされる酵素、および他の任意の構成成分を含むことができる。
例えば、本明細書に記載される細胞、ベクター、および培地を、キットの中に提供することができる。一実施形態では、キットは、（ａ）ベクターまたはその構成成分を含む組成物を含有する容器、および任意選択で（ｂ）情報資料を含む。情報資料は、本明細書に記載される方法および／または治療上の利益のための薬剤の使用を範囲に含む、記述的資料、指示資料、販売用資料または他の資料であり得る。一実施形態では、キットは、第２の薬剤、例えば、細胞も含む。例えば、キットは、ベクターまたはそれを含む組成物を含有する第１の容器と、第２の薬剤、例えば、細胞を含む第２の容器とを含む。
キットの情報資料は、その形態に限定されない。一実施形態では、情報資料は、化合物の生産についての情報、化合物の分子量、濃度、使用期限、バッチまたは生産の場所の情報などを含み得る。一実施形態では、情報資料は、キットの細胞に形質導入する方法、または遺伝子改変された細胞を、例えば、対象を治療するために、好適な用量、剤形、または投与様式（例えば、本明細書に記載される用量、剤形、または投与様式）で、対象に投与する方法を範囲に含む。情報は、印刷された文面、コンピュータ読み取り可能な資料、ビデオ記録、もしくはオーディオ記録、または重要な資料へのリンクもしくはアドレスを提供する情報を含む、種々の形式で提供することができる。
ベクターおよび／または細胞に加えて、キット中の組成物は、他の成分、例えば、溶媒もしくは緩衝液、培地、安定剤、または保存剤を含むことができる。そのキットの組成物は、任意の形態、例えば、液体、乾燥または凍結乾燥形態で提供することができ、実質的に純粋および／または無菌であり得る。組成物が液体溶液中に提供される場合、液体溶液は水溶液またはアルコール溶液であり得る。組成物またはその成分が乾燥形態として提供される場合、復元は、例えば、好適な溶媒の添加によって行われる。溶媒、例えば、滅菌水または緩衝液を、任意選択でキット中に提供することができる。
キットは、薬剤を含有する１つまたは複数の組成物のための１つまたは複数の容器を含むことができる。一部の実施形態では、本キットは、組成物および情報資料のための別々の容器、仕切り、または区画を含有する。例えば、本組成物は、瓶、バイアル、またはシリンジの中に含有されることが可能であり、情報資料は、プラスチックスリーブまたはパケット内に含有されることが可能である。他の実施形態では、キットの別々の要素は、単一の分割されていない容器に含有されている。例えば、組成物は、ラベルの形態で情報資料が添付された瓶、バイアル、またはシリンジの中に含有されている。一部の実施形態では、キットは、それぞれが薬剤の１つまたは複数の単位剤形（例えば、本明細書に記載される剤形）を含有する、複数（例えば、１パック）の個々の容器を含む。容器は、組合せ単位投与量、例えば、ベクターおよび／または細胞と第２の薬剤とを含む単位を、例えば、所望の比率で含むことができる。例えば、キットは、例えば、それぞれが単回の組合せ単位用量を含有する、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、ブリスター包装、または医用デバイスを含む。キットの容器は、気密性、耐水性（例えば、湿度の変化または蒸発を通さない）、および／または遮光性であり得る。キットは、任意選択で、組成物の投与のために好適なデバイス、例えば、シリンジまたは他の好適な送達デバイスを含む。デバイスは、薬剤の一方もしくは両方が予め充填された上で提供されてもよく、または空であってもよいが、充填には好適である。
一態様では、（ｉ）本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞、前記細胞の集団、または本明細書に記載される医薬組成物；（ｉｉ）任意選択で、１つまたは複数の追加の抗がん剤（例えば、化学療法薬）、および（ｉｉｉ）対象におけるがんの治療に使用するための説明書を含む１つまたは複数の容器を含むキットが、本明細書において提供される。
一実施形態では、キットは、同一または別々の好適な容器内に、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合するＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞と、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝液）とを含み得る。
好適な容器としては、限定はされないが、バイアル、ウェル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、注入バッグ、または他の容器手段を挙げることができ、その中に、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するＭＬ ＮＫ細胞を収めることができる（場合によっては、好適に分割されている）。追加の構成成分が用意される場合、キットは、この構成成分を収めることができる追加の容器を含むことができる。容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器をさらに含んでもよい。容器および／またはキットは、使用上の指示および／または警告を記載したラベルを含むことができる。
定義
本明細書で使用される場合、「ＮＰＭ１ｃ」という用語は、ＮＰＭ１遺伝子における４ヌクレオチド重複に起因し、細胞質局在を有する、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質（ＮＰＭ１）を指す。野生型ＮＰＭ１遺伝子によってコードされるヒトヌクレオフォスミンは、配列番号５４によって示されるアミノ酸配列（受託番号ＮＭ＿００２５２０）を有する。４ヌクレオチド重複を有するＮＰＭ１遺伝子によってコードされる例示的なＮＰＭ１ｃタンパク質は、配列番号５６によって示されるアミノ酸配列を含む。さらに、前記例示的なＮＰＭ１ｃタンパク質のＣ末端アミノ酸配列は、ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含み、これは、太字で強調表示されている、野生型ヌクレオフォスミンタンパク質に比して変異している配列の部分を有する（例えば、van der Lee et al., 2019, JCI 129(2):774-785; Verhaak, R. et al (2005) Blood 106:3747を参照）。一部の実施形態では、本開示のＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むＮＰＭ１ｃタンパク質に由来するネオエピトープを含む。一部の実施形態では、本開示のＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むアミノ酸配列を有するＮＰＭ１ｃの部分に由来するネオエピトープを含む。
本明細書で使用される場合、「ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２」という用語は、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃのネオエピトープを指す。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃのネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値を改変して使用される場合、その数値の最大で上下１０％の偏差が、列挙された値の意図される意味の範囲内にあることを示す。
本明細書で使用される場合、「ＶＨ」または「ＶＨ」という用語は、抗体の重鎖可変領域を指す。
本明細書で使用される場合、「ＶＬ」または「ＶＬ」という用語は、抗体の軽鎖可変領域を指す。
本明細書で使用される場合、参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」または「パーセント配列同一性」という用語は、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野で公知の様々な方法で、例えば、公開されているコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴｐ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、達成することができる。比較の目的のためのギャップありアラインメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されているように利用することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）のアルゴリズムを、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重で使用して、決定することができる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、一般に、２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含む抗体を指す（この用語が使用される文脈が別のものを示唆する場合を除く）。抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプが含まれる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化抗体またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、および完全ヒト抗体を含む。抗体は、種々の種、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、およびマウスのいずれかにおいて作られるか、またはそれらに由来し得る。抗体は、精製された抗体または組換え抗体であることができる。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」、「抗原結合断片」という用語、または類似の用語は、標的抗原に結合する能力を保っている抗体の断片を指す。そのような断片には、例えば、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。この用語には、例えば、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ単一ドメイン抗体も含まれる。例えば、Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem Sci 26:230-235; Nuttall et al. (2000) Curr Pharm Biotech 1:253-263; Reichmann et al. (1999) J Immunol Meth 231:25-38；ＰＣＴ出願国際公開第９４／０４６７８号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５９１号パンフレット；ならびに米国特許第６，００５，０７９号明細書を参照されたく、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本開示は、単一ドメイン抗体が形成されるような改変を有する２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。加えて、イントラボディ、ミニボディ、トリボディ、およびダイアボディも、抗体断片の定義に含まれ、本明細書に記載される方法における使用に適合する。例えば、Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson and Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189; Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Rondon and Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283を参照されたく、それぞれの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換」または「置換された」という用語（そのような用語が置換されたアミノ酸と称される場合）は、所定のアミノ酸配列における少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の、異なるアミノ酸残基による置き換えを指す。「アミノ酸挿入」という用語は、少なくとも１つの追加のアミノ酸の、所定のアミノ酸配列への組み入れを指す。挿入は通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、より大きな「ペプチド挿入」を行うこともできる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、天然に存在するものであってもよく、天然に存在しないもの（改変されたもの）であってもよい。「アミノ酸欠失」という用語は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、これには以下のものが含まれる：
（１）疎水性側鎖：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ；
（２）中性親水性側鎖：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性側鎖：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性側鎖：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する側鎖：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族側鎖：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
例えば、非保存的アミノ酸置換は、実質的に異なる側鎖（すなわち、異なるファミリーのメンバーであるアミノ酸残基）を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換である。
一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基のハイドロパシー指数を考慮することによって行われる。各アミノ酸に、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている。それらは以下の通りである：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（－０．４）；Ｔｈｒ（－０．７）；Ｓｅｒ（－０．８）；Ｔｒｐ（－０．９）；Ｔｙｒ（－１．３）；Ｐｒｏ（－１．６）；Ｈｉｓ（－３．２）；Ｇｌｕ（－３．５）；Ｇｌｎ（－３．５）；Ａｓｐ（－３．５）；Ａｓｎ（－３．５）；Ｌｙｓ（－３．９）；およびＡｒｇ（－４．５）。ポリペプチドに相互作用機能を付与する上でのハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野で理解されている（例えば、Kyte et al (1982) J Mol Biol 157:105-131を参照）。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸残基を、同一または類似の（例えば、約＋２、＋１．５、＋１、＋０．５、－０．５、－１、－１．５、または－２以内）ハイドロパシー指数を有する別のアミノ酸残基で置き換えることによって行われる。
一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性を考慮することによって行われる。以下の親水性値が割り当てられている：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０±１）；Ａｓｐ（＋３．０±１）；Ｇｌｕｔ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｔｈｒ（－０．４）；Ｐｒｏ（－０．５±１）；Ａｌａ（－０．５）；Ｈｉｓ（－０．５）；Ｃｙｓ（－１．０）；Ｍｅｔ（－１．３）；Ｖａｌ（－１．５）；Ｌｅｕ（－１．８）；Ｉｌｅ（－１．８）；Ｔｙｒ（－２．３）；Ｐｈｅ（－２．５）；およびＴｒｐ（－３．４）。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸残基を、同一または類似の（例えば、約＋２、＋１．５、＋１、＋０．５、－０．５、－１、－１．５、または－２以内）親水性を有する別のアミノ酸残基で置き換えることによって行われる。例示的なアミノ酸置換は表２に示されている。
Figure 2023517063000003
本明細書で使用される場合、「サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞」または「ＭＬ ＮＫ細胞」という用語は、少なくとも１つのサイトカインによりｅｘ ｖｉｖｏで活性化され、同じサイトカインの非存在下における負荷後に増強されたメモリー様機能を維持する、ＮＫ細胞に由来するＮＫ細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「ＣＩＭＬ ＮＫ細胞」という用語は、少なくとも１つのサイトカインにより活性化され、増強された活性化およびインターフェロン－γ応答を示す、ＮＫ細胞に由来するＮＫ細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された核酸分子」という用語は、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子は、その天然の染色***置とは異なる位置に存在する。
本明細書で使用される場合、「ネオエピトープ」は、疾患特異的変異によって生じるペプチドを含む疾患特異的抗原を指し、これは自己とは異なるものとして認識され、正常細胞ではなく、疾患によって影響を受けた細胞の表面上に提示される。「腫瘍ネオエピトープ」または「がんネオエピトープ」という用語は、腫瘍特異的またはがん特異的変異から生じるペプチドを含む腫瘍特異的またはがん特異的抗原を指し、これは自己とは異なるものとして認識され、正常細胞ではなく、腫瘍／がん細胞の表面上に提示される。腫瘍特異的またはがん特異的ネオエピトープの提示は、腫瘍細胞内での腫瘍特異的またはがん特異的抗原の細胞内プロセシングおよび切断の後に生じ、それによって、腫瘍特異的またはがん特異的変異を含む８～１５アミノ酸の１つまたは複数の異なるペプチドが生成される。それぞれＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＤ４＋ Ｔ細胞への提示のためにＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子に結合するこれらのペプチドのサブセットが、腫瘍のネオエピトープを構成する。
本明細書で使用される場合、「ＫＤ」または「Ｋｄ」または「ＫＤ」という用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有し、抗体（またはその抗原結合断片）と抗原との間の結合反応の平衡解離定数を指す。ＫＤの値は、抗体オフ速度定数（ｋｏｆｆ）の抗体オン速度定数（ｋｏｎ）に対する比の数値表現である。ＫＤの値は、抗原に対する抗体の結合親和性に反比例する。ＫＤ値が小さいほど、抗原に対する抗体の親和性は高い。親和性は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「ｋｏｆｆ」または「ｋｏｆｆ」は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有し、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関するオフ速度定数を指す。ｋｏｆｆの値は、１秒間あたりに崩壊または解離する複合体の割合の数値表現であり、単位ｓｅｃー１で表される。
本明細書で使用される場合、「ｋｏｎ」または「ｋｏｎ」という用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有し、抗体と抗原との会合に関するオン速度定数を指す。ｋｏｎの値は、抗体および抗原の１モル（１Ｍ）溶液中で１秒間あたりに形成される抗体／抗原複合体の数の数値表現であり、単位Ｍー１ｓｅｃー１で表される。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」および「選択的に結合する」という用語は、特定の抗原またはエピトープ（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して感知可能な親和性を示し、一般に、他の抗原およびエピトープ（例えば、ＨＬＡ－Ａ２単独、例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ単独、例えば、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した非ＮＰＭ１ｃネオエピトープ）には結合しないか、または実質的に結合しない、抗体もしくはその抗原結合断片、または細胞外ドメインを意味することを意図している。「感知可能な」または好ましい結合には、１０－７、１０－８、１０－９、もしくは１０－１０Ｍまたはより良好なＫＤとの結合が含まれる。抗体抗原相互作用のＫＤ（親和定数）は、抗体および抗原分子の５０％が結合する抗体の濃度を示す。したがって、好適な一定の抗原濃度では、親和性のより高い（すなわち、より強い）抗体の５０％は、親和性のより低い抗体と同じパーセント結合を達成するために必要とされるよりも低い抗体濃度で抗原分子に結合すると考えられる。したがって、ＫＤ値が低いほど、より高い（強い）親和性を示す。本明細書で使用される場合、「より良好な」親和性は、より強い親和性であり、その比較対象よりも低い数値であり、１０－７ＭのＫＤは、１０－６ＭのＫＤよりも低い数値であり、したがって、より良好な親和性を表す。１０－７Ｍよりも良好な（すなわち、ＫＤ値が低く、したがってより強い）、好ましくは１０－８Ｍよりも良好な親和性が一般に好ましい。本明細書に記載される値の中間値も想定しており、好ましい結合親和性は親和性の範囲として示すことができ、例えば、本明細書に開示されるＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体について好ましい結合親和性は１０－７～１０－１２Ｍ、より好ましくは１０－８～１０－１２Ｍである。
抗原に「結合しない」または「実質的に結合しない」抗体、抗原結合断片または細胞外ドメインは、オフターゲット抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、例えば、ネオエピトープ単独、例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド）に感知できる程度には結合しないものである。例えば、一実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する抗体は、例えば、ＨＬＡ－Ａ２単独、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ単独、および／またはＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した非ＮＰＭ１ｃネオエピトープよりも、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に対して少なくとも２桁、好ましくは３桁、または４桁もしくはそれを上回る高さの良好な結合親和性（すなわち、２桁、３桁、または４桁もしくはそれよりも小さいＫＤ値を示す結合）を示す。特異的または選択的結合は、そのような結合を決定するための当技術分野で認識されている任意の手段に従って決定することができ、これには例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、バイオレイヤー干渉法、および／または競合的（競合）結合アッセイが含まれる。
本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ－Ａ」という用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有し、ヒトにおけるＨＬＡ－Ａ座位によってコードされるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の群を指す。ＨＬＡは、ヒトに特異的な主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）抗原である。ＨＬＡ－Ａは、ヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体の主要な３種類のうちの１つである。他にはＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃがある。ＨＬＡ－Ａタンパク質はヘテロ二量体であり、α重鎖およびより小さいβ鎖で構成される。α鎖はバリアントＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされ、β鎖（β２－ミクログロブリン）はインバリアントなβ２ミクログロブリン分子である。β２ミクログロブリンタンパク質は、ヒトゲノムの別の領域によってコードされる。ＨＬＡ－Ａ＊０２（Ａ＊０２）は、ＨＬＡ－Ａ血清型群に属するヒト白血球抗原血清型である。この血清型は、ＨＬＡ－Ａα鎖のα２ドメインの抗体認識によって決定される。Ａ＊０２の場合、α鎖はＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子によってコードされ、β鎖はＢ２Ｍ座位によってコードされる。
本明細書で使用される場合、「有効用量」または「有効量」という用語は、所望の治療効果を達成するのに、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。
以下の実施例は、説明のために提供され、限定としては提供されない。本発明の様々な他の実施形態は、本明細書において提供される一般的な説明を前提として、実施することができる。
他の実施形態
Ｅ１．細胞の形質導入効率を高めるための方法であって、少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞を、候補ポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップであって、ＡＳＣＴ２＋細胞がインターロイキン－１２ファミリーのメンバーおよびＩＬ－１８により活性化されているステップを含む方法。
Ｅ２．ＡＳＣＴ２＋細胞がＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５により活性化されている、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．ＮＫ細胞を得る、単離する、または同定するステップ、ならびにＮＫ細胞をインターロイキン－１２ファミリーのメンバーおよびＩＬ－１８、ならびに任意選択で、ＩＬ－１５により活性化するステップを含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ４．インターロイキン－１２ファミリーのメンバーが、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、またはＩＬ－３５を含む、実施形態Ｅ１またはＥ３に記載の方法。
Ｅ５．ＮＫ細胞がＡＳＣＴ２－である、実施形態Ｅ３に記載の方法。
Ｅ６．ＮＫ細胞の活性化により、ＡＳＣＴ２＋細胞が生成される、実施形態Ｅ３に記載の方法。
Ｅ７．ＡＳＣＴ２＋細胞がＮＫ細胞である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ８．ＡＳＣＴ２＋細胞がサイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ９．サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞を得る、単離する、または同定するステップを含む、実施形態Ｅ８に記載の方法。
Ｅ１０．ＡＳＣＴ２＋の発現またはレベルが対照細胞に比して増加している、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１１．対照細胞が不活性化ＮＫ細胞である、実施形態Ｅ１０に記載の方法。
Ｅ１２．対照細胞が成熟ＮＫ細胞である、実施形態Ｅ１０に記載の方法。
Ｅ１３．ＡＳＣＴ２発現が、ＡＳＣＴ２＋細胞において、対照細胞に比して約２０％から約３０％増加している、実施形態Ｅ１０に記載の方法。
Ｅ１４．ＡＳＣＴ２の存在またはレベルが、ＢａＥＶレンチウイルスベクターによる形質導入に対してより受容性である細胞をもたらす、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１５．ＡＳＣＴ２＋細胞が、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３またはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数により活性化されている、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１６．ＡＳＣＴ２＋細胞が哺乳動物細胞である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１７．哺乳動物細胞がヒト細胞である、実施形態Ｅ１６に記載の方法。
Ｅ１８．ヒト細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されている、実施形態Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ１９．レンチウイルスベクターがヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ－ｇｐ）によってシュードタイプ化されている、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ２０．少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞のうちの少なくとも４０％が約３日後に形質導入されている、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ２１．形質導入効率が従来のレンチウイルス形質導入アプローチに比して改善されている、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ２２．候補ポリペプチドが、抗体もしくはその断片、毒素、ホルモン、増殖因子、受容体、またはシグナル伝達分子、キメラ抗原受容体を含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ２３．キメラ抗原受容体が抗体またはその断片を含む、実施形態Ｅ２２に記載の方法。
Ｅ２４．抗体または断片がチェックポイント阻害剤に対して特異的である、実施形態Ｅ２２または実施形態Ｅ２３に記載の方法。
Ｅ２５．抗体が抗Ｔ細胞受容体抗体またはＴ細胞受容体様抗体である、実施形態Ｅ２２または実施形態Ｅ２３に記載の方法。
Ｅ２６．抗体またはその断片が、ＮＰＭ１、ＮＰＭ１ｃ、ＭＡＧＥ１、ＧＰ１００、ｈＴＥＲＴ、ＭＵＣ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＦＬＴ３、ＴＰ５３、スプライソソーム因子、ＭＡＧＥ３、ｈＣＧβ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＴＡＲＰ、ｐ５３、チロシナーゼ、ｐ６８、ＭＩＦ、プロテイナーゼ３、ＷＴ１、ＨＡ－１Ｈ、またはＰＲＡＭＥに対して特異的である、実施形態Ｅ２５に記載の方法。
Ｅ２７．抗体が腫瘍特異的細胞内タンパク質を標的とする、実施形態Ｅ２２または実施形態Ｅ２３に記載の方法。
Ｅ２８．細胞内タンパク質がＮＰＭ１ｃを含む、実施形態Ｅ２７に記載の方法。
Ｅ２９．培地が１２／１５／１５／２１およびＩＬ－７を含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３０．実施形態Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載の方法によって作製された細胞。
Ｅ３１．がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に対して、実施形態Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載の方法によって作製された細胞を投与するステップを含む方法。
Ｅ３２．遺伝子操作された細胞を製造する方法であって、少なくとも１つのＡＳＣＴ２＋細胞を、あるポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップであって、ＡＳＣＴ２＋細胞がインターロイキン－１２ファミリーのメンバーおよびＩＬ－１８により活性化されているステップを含む方法。
Ｅ３３．インターロイキン－１２ファミリーのメンバーが、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、またはＩＬ－３５を含む、実施形態Ｅ３２に記載の方法。
Ｅ３４．実施形態Ｅ３２に記載の方法によって作製される、遺伝子操作された細胞。
Ｅ３５．実施形態Ｅ３０に記載の細胞または実施形態Ｅ３４に記載の遺伝子操作された細胞を含む免疫療法。
Ｅ３６．がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に対して、実施形態Ｅ３５に記載の免疫療法を投与するステップを含む方法。
新生細胞を認識し、これに応答し、これを殺滅する免疫細胞の能力を利用する細胞療法は、進行した悪性疾患を治療するための有望なアプローチを代表している。効率的な細胞形質導入はＴ細胞については達成されているが、ＮＫ細胞については達成されておらず、ＮＫ細胞に基づくがん免疫療法の改善において主要な技術的難点となっている。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染したおよび悪性に転化した細胞を除去することができる先天的なリンパ球様細胞である。従来のレンチウイルス形質導入アプローチでは、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶＧ）によってシュードタイプ化されたカノニカルなレンチウイルスを使用している。しかし、ＮＫ細胞はＶＳＶＧによってシュードタイプ化されたレンチウイルスによる形質導入には極めて抵抗性で、遺伝子編集率は１～３％であることが知られている。本明細書に記載するように、本発明者らは、ＮＫ細胞の形質導入効率を増大させる組成物および方法を特定した。ＮＫ細胞の特有の受容体発現パターンを研究することにより、本発明者らのデータは、ＬＤＬ－Ｒとは大きく異なって、ＡＳＣＴ２の発現レベルが従来型の初代ＮＫ細胞において高く、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞においてさらに増強していることを示した。ＡＳＣＴ２はアミノ酸輸送体であり、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ－ｇｐｌ）の対応する受容体である。非従来型ＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスを利用することにより、初代ヒトＮＫ細胞およびＣＩＭＬ ＮＫ細胞における形質導入のブロックが克服される。ＢａＥＶレンチウイルスを使用する本発明者らのデータによって、初代ＮＫ細胞はこの非従来型遺伝子編集アプローチにとって容易にアクセス可能である一方、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、そのナイーブな対応物よりもレンチウイルスによる形質導入を受けやすいことが確認され、これはそれらのＡＳＣＴ２発現レベルとよく相関している。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞による本発明者らの形質導入効率は、今や４０～７０％に近い。
略語
ＡＩＱ：ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＭＬ：急性骨髄性白血病、アロＳＣＴ：同種造血幹細胞移植、ＢＬＩ：生物発光イメージング、ＣＡＲ:キメラ抗原受容体、ＣＡＲ－ＮＫ：キメラ抗原受容体ＮＫ細胞、ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞選別、ＦＢＳ：ウシ胎児血清、ＧＩＬ：ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号６３）、ＨＳＣ：造血幹細胞、ＭＡＣＳ：磁気活性化細胞選別、ＮＰＭ１：ヌクレオフォスミン、ＮＰＭ１ｃ：変異型ヌクレオフォスミン、ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片、ＳＬＬ：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号６２）；ＴＡＡ：腫瘍随伴抗原、ＨＳＰＣ：造血幹／前駆細胞。
以下の実施例には以下の材料および方法を使用した。
細胞株の培養
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞はＡＴＣＣから購入した。ＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞はＤＳＭＺから購入した。ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞およびＯＣＩ－ＡＭＬ２は、１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈおよびＶＷＲ）および２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。
ＣＡＲベクターの設計
抗ＮＰＭ１ｃ ｓｃＦｖ（配列番号２）、ＣＤ８αリーダー配列、細胞外ヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインからなるＣＡＲの配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって特注で合成した。いくつかの構築物では、切断性リンカーを介してＣＡＲを分泌型または膜結合型のＩＬ－１５ヌクレオチド配列に連結した。ｐＨＩＶベクター(プラスミド＃２１３７３)は、酵素ＸｂａＩおよびＣｌａＩによって二重消化した。ベクター骨格をゲル精製した後、ｐＨＩＶ骨格、ＣＡＲ断片、およびＰ２Ａ－ＧＦＰ断片を、ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用し、製造者のプロトコールに従って、５’および３’末端におけるそれらの重複領域に基づいてアセンブルした。得られたプラスミドを、以下のシーケンシングプライマー、５’－ＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴ－３’（配列番号６９）（フォワード）および５’－ＡＧＧＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＧＣＴＧ－３’（配列番号７０）（リバース）を使用してシーケンシングした。適正な配列を有するプラスミドを、ｐＨＩＶ－ＣＡＲ－ＧＦＰと命名した。
ＣＡＲ発現初代ヒトＮＫ細胞の生成
レンチウイルスは、２９３Ｔ細胞にｐＨＩＶ－ＣＡＲ－ＧＦＰ、ＢａＥＶ－ｇｐ（またはｐＣＭＶ－ＶＳＶＧ）、ｐＣＭＶ－Δ８．９、およびｐＡｄｖプラスミドをトランスフェクトすることによって生成した。４８時間および７２時間で培養上清を採取し、２５，０００ｒｐｍ、４℃、２時間の超遠心によってレンチウイルス粒子をペレット化した。レンチウイルス粒子を１００μＬの無血清ＤＭＥＭ培地中に懸濁し、－８０℃で凍結した。ヒトＮＫ細胞は、ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からフィコール遠心分離を使用して単離し、Ｒｏｓｅｔｔｅ Ｓｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ ９５％以上）を使用して精製した。ＮＫ細胞は、３～５×１０６個の細胞をプレートに播種し、ｒｈＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）または対照条件（ｒｈＩＬ－１５、５０ｎｇ／ｍＬ）を使用して１６時間活性化することによって予め活性化し、ＰＢＳで３回洗浄してサイトカインを除去し、生存を支持するためにｒｈＩＬ－１５（１ｎｇ／ｍＬ）を補充した１０％のヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ)含有完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。培地の５０％を２～３日ごとに新鮮なサイトカインで置き換えた。予め活性化した１日後に、ＮＫ細胞にレンチウイルスを形質導入した（ＭＯＩ＝１０）。ＣＡＲ－ＮＫ細胞は１ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１５を補充した培地中で増大させた。予め活性化し形質導入した後、細胞を１０日間休ませた。
ルシフェラーゼ活性の測定による細胞傷害性のアッセイ
ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞傷害性のアッセイは、ルシフェラーゼ発現標的細胞株を使用して実施した。ＮＫ細胞を標的細胞とともに、表示したエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳ中で１回すすぎ、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、続いてルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。プレート分光光度計（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ、ＴＥＣＡＮ）を使用して、細胞溶解物の発光を解析した。標的細胞単独の発光をベースライン対照として使用した。各試料の比細胞溶解性は、以下の式を使用して計算した。比細胞溶解性（％）＝１００×｛１－［（ＣＡＲ－Ｔ群における発光／標的細胞単独における発光）／（非形質導入Ｔ群における発光／標的細胞単独における発光）］｝
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ－ＮＫ細胞による標的細胞の殺滅
ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの特定病原体のない（ＳＰＦ）動物舎に収容した。マウスでの全ての実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。簡単に述べると、２００μＬのＰＢＳ中のルシフェラーゼ発現ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞（１×１０６個）を、照射したＮＳＧマウスの尾静脈に注射した。４日後に、５００ｋ個のＣＡＲ－ＮＫ細胞を全ＮＫ細胞１×１０６個として腫瘍担持マウスに注射した。３日ごとにＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００ Ｓｐｅｃｔｒｕｍカメラを使用して生体発光イメージング（ＢＬＩ）を実施した。
レンチウイルスの例示的な調製：
（１）プラスミドの増大：
３種全てのレンチウイルスパッケージングプラスミドを、Ｓｔｂｌ３化学的コンピテントな大腸菌（E. coli）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃ７３７３０３）中で増殖させる。バリデートされたプラスミドを増殖させるため、Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ、＃２９４５）用に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢブロス、またはＥｎｄｏ－ｆｒｅｅ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ、＃１２３６２）用に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１０００ｍｌのＬＢブロスを使用する。
（２）２９３Ｔ細胞の増殖
２０ｍｌの１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中で２９３Ｔ細胞を培養し、１００％コンフルエンスに達させる。細胞は１５スプリットを超えて継代しない。細胞は１００％コンフルエンシー近くに増殖するまで継代しない。１５０ｍｍ×２５ｍｍの組織培養皿（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃０８７７２２４）。完全ＤＭＥＭ培地（１０％のＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ＋２ｍＭのＬ－ｇｌｕtを含む)。
（３）２９３Ｔ細胞のトランスフェクション：
トランスフェクションの２～３日前に、１５ｃｍのプレートあたり５Ｅ６個の細胞を播種する。ほぼ１００％コンフルエンスまで増殖させる。使用前に全てのトランスフェクション試薬を室温まで放置して加温する。以下のようにトランスフェクトする。
Figure 2023517063000004
培養皿に均一にらせん状に２９３Ｔに滴下して移す。
（必要に応じて）トランスフェクション後８時間で、合胞体の形成および（適用可能であれば）蛍光について確認する。
２日目（トランスフェクション後４８時間）：収穫し、予め加温した１５ｍＬの完全ＤＭＥＭで置き換える。上清を４℃で１日保存した後で、２次収穫物と一緒の濃縮に進む。
３日目（トランスフェクション後７２時間）：収穫。プレートを脱色して軽く混ぜる。
（４）レンチウイルスの濃縮
ウイルス上清を採取する。
上清を遠心分離機で５分、３５０×ｇで遠心して細胞デブリをペレット化する。上清を超遠心チューブ中に濾過（０．４５μｍシリンジフィルター）する。全体積約３５ｍＬまで培地を加え、ホルダーとともにバランスさせる。
２５，０００ｒｐｍ、４℃で２時間、遠心する。
上清を捨てる。残存した培地を完全に除き、１００μｌの無血清ＤＭＥＭ培地を加えて４℃で終夜、ペレットを溶解する。上下にピペッティングしない。翌日、穏やかに上下にピペッティングして混合し（泡を立てないように注意）、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移す。
１００μＬの無血清ＤＭＥＭ培地を超遠心チューブに加えて洗浄する。穏やかに上下にピペッティングして同じ１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移す。
２０～５０μｌのアリコートを－８０℃で凍結する。
（５）レンチウイルスの滴定
Ｊｕｒｋａｔ細胞株を使用するＦＡＣＳによってウイルスを滴定する。
完全ＲＰＭＩ（１０％のＦＢＳ、Ｐ／Ｓ、および２ｍＭのＬ－ｇｌｕｔを含有）中でＪｕｒｋａｔを増殖させる。
１μＬのポリブレン（ｆ．ｃ．１０μｇ／ｍＬ）を補充した１２ウェルにウイルスあたり２ウェル（二連測定）で、１００万個／１ｍＬをプレートに播種する。さらに２ウェルを非形質導入対照とする。ウェルあたり１μＬの濃縮ＢａＥＶレンチウイルスを添加する。
遠心分離機で、１０００×ｇ、３２℃で１時間、スピンフェクトする。ブレーキはオフまたはローとする（漏洩防止のため）。
７２時間で、ＧＦＰ＋（またはＳｃＦｖ＋）のために流す。
ＦＳＣ／ＳＳＣ、生／死色素陰性、ＧＦＰ＋（またはＳｃＦｖ＋）についてゲーティングする。
ＪｕｒｋａｔについてＭＯＩ＝１と仮定し、以下のようにウイルスタイターを計算する。
非形質導入対照からバックグラウンドＧＦＰ＋（またはＳｃＦｖ＋）を差し引く。
ウイルス濃度（感染単位／μＬ）＝（１Ｅ６）×陽性％
（６）ヒト初代メモリー様ＮＫ細胞のスピンフェクション
４μｇ／ｃｍ２プレート面積に相当する体積の２０μｇ／ｍｌのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（ＰＢＳ）を使用してプレートをコートする。プレートを室温で２時間（あるいは４℃で終夜）放置する。
*２４ウェルプレートの各ウェルに０．５ｍｌ、または６ウェルプレートの各ウェルに２ｍｌを分注する。このステップで未処理の細胞培養グレードの組織培養プレートまたは培養皿を使用することができる。
ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ溶液を除き、次いで適切な体積の無菌ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロックする。プレートを室温で３０分放置する。
２４ウェルプレートの各ウェルに０．５ｍｌ、または６ウェルプレートの各ウェルに２ｍｌを使用する。
ＢＳＡ溶液を取り除き、適切な体積のＰＢＳでプレートを１回洗浄する。洗浄液を取り除いた後、プレートは直ちに使用可能である。
ＮＫ細胞は前日に新鮮ヒトＰＢＭＣ（カラー）から単離し、５％ヒトＡＢ血清を含むＭｉｌｔｅｎｙｉのＮＫ増大培地中、１０６細胞／ｍＬで、ｒｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍｌ）＋ｒｈＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ｒｈＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍｌ）によって予め活性化した。
サイトカイン活性化の１６～２０時間後、細胞を２回洗浄し、次いで５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含む無血清ＮＫ増大培地中に５×１０６細胞／ｍＬで懸濁した。２４ウェルプレートの１つのウェルにおける形質導入のために、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１とレンチウイルスとの混合物（３００μｌ）（最終ＭＯＩ＝１０）を２００μＬの細胞懸濁液に加えた。Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１の最終濃度は１０μｇ／ｍＬであった。
１０００×ｇ、３２℃、１時間のスピノキュレーション(極めて簡単かつ１回のスピンフェクション)の後、細胞をレンチウイルスとともに４８時間培養した。次いで細胞培地を、５％のヒトＡＢ血清および５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含む新鮮な完全細胞培養培地に交換した。
形質導入後３～４日目にＦＡＣＳによってＣＡＲの発現を測定し、形質導入後５～６日目にｉｎ ｖｉｔｒｏのＮＫ細胞の抗腫瘍機能をＦＡＣＳおよびルシフェラーゼアッセイによって評価する。ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性および安全性の試験のため、形質導入後６～１０日目にＣＡＲ－ＮＫ細胞を腫瘍担持ＮＳＧマウスに移入する。
統計解析
他に述べない限り、データは少なくとも３回の独立した実験からの平均±ｓ．ｅ．として表す。２つの独立群を比較するために、両側ｔ検定を使用した。ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍成長は、２方向繰り返し測定ＡＮＯＶＡを使用して比較した。腫瘍担持マウスにおける生存パターンを解析するためにカプラン・マイヤー法を使用し、統計的差はマンテル・コックスログランク検定に従って評価した。ｐ値０．０５未満を統計的有意とみなした。全ての統計解析はＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２２ソフトウェアを使用して実施した。
[実施例１]
ＣＡＲ構築物によるメモリー様ＮＫ細胞の操作
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は治療上の主要な課題であり続けている。
２０１５年に米国だけでほぼ２０，８３０人のＡＭＬの新たな症例が診断され、１０，４６０人がこの疾患が原因で死亡した。高齢がＡＭＬの危険因子であるので、疾患の発生率は人口の高齢化とともに増大し得る。従来の化学療法および同種幹細胞移植に耐えることができる患者は完全奏功を達成することができるが、大多数は再発を経験し、この疾患により死亡する(Falini B, et al. Discov. Med. 2010;10(53):281-92)。したがって、我々のがん免疫療法の理解の進歩を利用した毒性が低くより効果的な標的化療法を開発するニーズがある。同種造血幹細胞移植（アロＨＳＣＴ）は効果的な治療であるが、疾患の進行、年齢、合併症、またはＨＬＡ適合ドナーの欠如のため、多くの患者はその候補ではなく、長期の臨床的成功はグラフト対宿主病（ＧＶＨＤ）、感染、および臓器毒性によって限られている。アロＨＳＣＴの根底にある免疫療法の基礎であるグラフト対白血病（ＧＶＬ）は伝統的にＴ細胞に帰されていたが、最近の研究によって、さらなるＧＶＬに重要な役割を果たしているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が同定されている(Venstrom JM, et al.N. Engl. J. Med. 2012;367(9):805-816; Cooley S, Blood. 2010;116(14):2411-9)。ここで本発明者らは、先天的ＮＫ細胞メモリーに基づく養子免疫療法のためにＮＫ細胞を武装させる新たなアプローチについて述べる。
サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞およびがんの免疫療法
新生細胞を認識し、これに応答し、これを殺滅する免疫細胞の能力を利用する細胞療法は、進行した悪性疾患を治療するための有望なアプローチを代表している。この文脈では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞において観察された劇的な臨床奏功は、このアプローチの大きな可能性を実証している。しかし、大多数のがんにおける腫瘍特異抗原の非存在、腫瘍標的抗原の喪失、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続性の低さ、ならびにサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および神経毒性を含む重篤な毒性が、ＣＡＲ Ｔ細胞療法における主要な課題として残っている。さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞注入後に再発した患者は、治療オプションが極めて限られている。ＮＫ細胞は本来、ウイルス感染した、および悪性に転化した細胞を除去することができる先天的なリンパ球様細胞である。従来型ＮＫ細胞は早期相の臨床試験でいくらかの有望性を示したが、これらの注入は少数の患者で比較的短期の寛解をもたらした。最近、ＮＫ細胞は先天的免疫メモリーを呈するというパラダイムシフト研究が示された。本発明者らは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで短時間、予め活性化することによって、休眠しているＮＫ細胞の活性化および分化がもたらされ、強力な抗白血病活性を有するサイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞が生成することを発見した（図１）(Romee R, et al. Blood. 2012;120(24))。本発明者らのヒトで最初の第１相治験において、ＣＩＭＬ ＮＫは再発した難治性のＡＭＬ患者の５０％超において臨床奏功を誘導し、明らかな毒性はなかった(Romee R, Sci. Transl. Med. 2016; 21:357ra123)。さらに、患者への養子免疫伝達の後で、細胞は増殖し、増大し、増強された抗白血病活性を維持していた（同文献）。これらのデータは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞療法が効果的かつ安全であり、抗白血病臨床活性を提供することを実証している。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、アロＨＳＣＴの後で再発した骨髄悪性疾患を有する患者における本発明者らの進行中の治験を含むいくつかの研究において現在評価中である。
ＣＡＲプラットフォームとしてのＣＩＭＬ ＮＫ細胞。
ＣＤ１９－ＣＡＲを生成するためのプラットフォームとして同種臍帯血由来ＮＫ細胞を使用する最近の研究によって、再発したＢ細胞悪性疾患の患者における有望な臨床奏功が示されてきた(Rezvani et al, ASH 2018)。注目すべきことに、臨床奏功は最小の毒性で、重篤なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または神経毒性の症例を伴わずに達成された。これらの臨床観察は、ＮＫ細胞が遺伝子改変された養子細胞療法のための新たな細胞プラットフォームを代表することを示している。本発明者らは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞療法におけるこれまでの臨床経験とともにこれらの観察に基づいて、ＣＩＭＬ ＮＫ ＣＡＲを生成する方法を開発し、これらの遺伝子改変されたＮＫ細胞の有効性を前臨床モデルで評価する。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、前臨床動物モデルおよび遺伝子改変されていないＣＩＭＬ ＮＫ細胞で処置された患者においてｉｎ ｖｉｖｏで見られた好ましい安全性プロファイル、増加した増殖、延長された持続性、および増強された抗白血病機能に基づくＮＫ細胞ＣＡＲの開発のための独特のプラットフォームを提供する。さらに、骨髄芽細胞を標的とするＣＩＭＬ ＮＫ細胞の本来の傾向により、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、主として良好な表面標的抗原がないためにＣＡＲ Ｔ細胞が僅かな利点しか示さず、または利点を示さないＡＭＬについて魅力的なものになっている。
ＡＭＬにおけるＣＡＲ標的
ＡＭＬは分子的に多様な悪性疾患である。ＮＰＭ１ｃにおける変異は、タンパク質の異常な細胞質内局在および／またはＭＨＣによる提示をもたらす。本発明者らは、ＡＭＬ芽細胞の細胞表面でＮＰＭ１ｃから生成されるネオ抗原を標的とすることができる新たなＣＡＲ構築物の生成およびバリデーションに成功した。
メモリー様ＮＫ細胞プラットフォームを使用するＮＰＭ１ｃ標的ＣＡＲの生成
本明細書に記載した実施形態は、変異したＮＰＭ１ｃを有するＡＭＬに対するＮＫ細胞系ＣＡＲを含む。ＴＣＲおよび従来のＣＡＲのアプローチと比較して、本発明者らのアプローチは、ＮＫ細胞を武装させるという利点を有している。ＮＫ細胞は、ＨＬＡの発現を有しないか、発現が低い標的細胞を認識して殺滅することができる。ＨＬＡの発現を有しないか、低レベルのＨＬＡ分子を有する白血病細胞はＮＫ細胞によって殺滅され、高レベルのＨＬＡを発現する白血病細胞は本発明者らのＣＡＲ－ＮＫ細胞によって効率的に殺滅できるので、これは重要であり得る。抗原の喪失がＣＡＲ－Ｔ療法に続く腫瘍耐性の機序であるので、本発明者らのＣＡＲ－ＮＫ細胞は、療法への耐性および疾患の再発の低減において効果的であることが証明できる。理論に縛られることは望まないが、本発明者らのｍｅｍ－ＮＫ ＣＡＲアプローチは、ＡＭＬにおけるＴ細胞に基づくＣＡＲアプローチに伴う課題の１つであった正常な造血幹細胞および前駆細胞への影響なしに、白血病芽細胞へのターゲティングを顕著に増強することになる。
ＣＩＭＬ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成法の最適化。
本発明者らは、本発明者らのＣＡＲ構築物を使用するＣＩＭＬ ＮＫ細胞の形質導入の最適化を行なっている。ＣＩＭＬ ＮＫは、本発明者らが以前に述べた方法（Romee R, et al. Blood. 2012;120(24)およびRomee R, Sci. Transl. Med. 2016; 21:357ra123)を使用して、従来の（正常健康ボランティアドナー由来の）末梢血ＮＫ細胞から生成している。従来のＮＫ細胞およびＣＩＭＬ ＮＫ細胞（同じドナー由来）に本発明者らのＣＡＲ構築物を形質導入し、それらの形質導入効率について比較する。データは、サイトカインによって活性化されたＮＫ細胞の方が、レンチウイルスによる形質導入およびヌクレオフェクションを受けやすいことを示している。形質導入されたＮＫ細胞をＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＨＬＡ－Ａ２＋抗原＋）、ＧＭＢ（ＨＬＡ－Ａ２－抗原－)、およびＫ５６２（ＨＬＡ陰性であるがＮＫ細胞の影響を受けやすい）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性について評価する。患者由来のＨＬＡ－Ａ２＋抗原＋初代ＡＭＬ芽細胞に対するそれらの活性についても試験する。ＮＫ細胞に特異的なＣｙＴＯＦパネルも開発した。これにより、単一細胞の様式で３８個までのマーカーを評価することができ、免疫サブセットの詳細な解析が可能になる。
本発明者らは、ＡＭＬおよびその他の骨髄悪性疾患（例えばＭＤＳ、ＭＰＮ）におけるその他の変異タンパク質を効果的に標的とするために、本明細書における実施形態を拡張する過程にある。
異種移植およびＰＤＸマウスモデルを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＩＭＬ ＮＫおよびＴ細胞ＣＡＲ（同じＣＡＲ構築物による）の活性の比較。
ＣＩＭＬ ＣＡＲ－ＮＫ 細胞およびＴ細胞ＣＡＲ（同じ構築物を担持する）を、異種移植およびＰＤＸマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの活性化、増殖、持続性、および有効性について評価する。養子免疫伝達後、７日、１４日、２８日、および６０日目に動物を犠牲死させ、ｉｎ ｖｉｖｏにおける持続性、増大、および活性（ＢＬＩ腫瘍イメージングおよび生存に基づく）および細胞の疲弊について評価する。これらのマウスの骨髄および脾を含む重要な臓器へのこれらの細胞のトラフィッキング／ホーミングも評価する。
早期相臨床試験のための既製品を開発するための増大法の最適化。
フィーダー細胞株（ＩＬ２１／４１ＢＢを形質導入したＫ５６２細胞）を使用する種々のｅｘ ｖｉｖｏ増大法と、フィーダーフリー法(Sutlu et al, Cytotherapy 2010)とを、最適の短期の増大および凍結保存なしの新鮮な注入について比較する(Sutlu T, et al. Cytotherapy. 2010;12(8):1044-55; Denman CJ, et al, PLoS One. 2012;7(1):e30264)。これらの増大法をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムにおいても試験する。このシステムは自動化された閉鎖系の製造プロセスが可能であり、したがって将来の治験に理想的である。入れ替え時間が短く、他のＧＭＰ設備にも容易に応用できる自動化細胞製造アプローチを開発する。本明細書に概要を記載したようにプロセスを最適化した後で、このプロセスをＤａｎａ ＦａｒｂｅｒにおけるＣＭＣＦ（Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に移す。本発明者らは既にＣＩＭＬ ＮＫ細胞の製造のための２つの有効なＩＮＤを有しており、これらの細胞の製造プロセスのバリデーションが完了している。本発明者らは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞ＣＡＲを使用するための本発明者らのＩＮＤを提出することを意図している。
[実施例２]
ＡＳＣＴ２の発現に基づくメモリー様ＮＫ細胞の形質導入効率の最適化
遺伝子操作された強力なＣＡＲ－ＮＫ細胞を産生する技術的側面は重要である。効率的な形質導入はＴ細胞については達成されているが、ＮＫ細胞については達成されておらず、ＮＫ細胞に基づくがんの免疫療法の改善において主要な技術的難点となっている。従来のレンチウイルス形質導入アプローチでは、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶＧ）によってシュードタイプ化されたカノニカルなレンチウイルスを使用している。しかし、ＮＫ細胞はＶＳＶＧによってシュードタイプ化されたレンチウイルスによる形質導入には極めて抵抗性で、遺伝子編集率は１～３％であることが知られている。
ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、シュードタイプ化レンチウイルスによる形質導入を媒介するために利用することができる従来型ＮＫ細胞に対して区別できる受容体発現を有するか否かを評価した。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、Romee, R. et al. Blood 120, 4751-4760 (2012)およびRomee, R. et al. Sci Transl Med 8, 357ra123 (2016)に記載し、図１に示すように、正常健康ボランティアドナーから単離した従来型末梢血ＮＫ細胞から調製した。簡単に述べると、ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からフィコール遠心分離およびＲｏｓｅｔｔｅ Ｓｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ ９５％以上)による精製を使用してｈＮＫ細胞を単離した。３～５×１０６個の細胞をプレートに播種し、ｒｈＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）または対照条件（ｒｈＩＬ－１５、５０ｎｇ／ｍＬ）を使用して１６時間活性化することによってｈＮＫ細胞を予め活性化し、ＰＢＳで３回洗浄してサイトカインを除去し、生存を支持するためにｒｈＩＬ－１５（１ｎｇ／ｍＬ）を補充した１０％のヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ)含有完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。培地の５０％を２～３日ごとに新鮮なサイトカインで置き換えた。
ＶＳＶＧタンパク質によってライゲートされる受容体であるＬＤＬ－Ｒの発現を、フローサイトメトリーによって評価した。従来型ＮＫ細胞とＣＩＭＬ ＮＫ細胞との両方がＬＤＬ－Ｒの低い発現を有していることが見出された（図２Ａ）。したがって、ＮＫ細胞における形質導入のブロック（即ちＶＳＶＧ－ＬＶを使用する)は、ＶＳＶＧタンパク質の対応する受容体である低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）の最小の発現に起因すると考えられる（図２Ｃ）。ＶＳＶＧタンパク質のＬＤＬ－Ｒとのライゲーションは標的細胞への侵入に続くレンチウイルスの付着のために重要であり、したがってこれは形質導入効率を制限する要素である（図２Ｃ）。ＮＫ細胞の特有の受容体発現パターンを研究することにより、本発明者らのデータは、ＬＤＬ－Ｒとは大きく異なって、ＡＳＣＴ２の発現レベルが初代の従来型ＮＫ細胞において高く、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞においてさらに増強していることを示した（Romee, R. et al. Blood 120, 4751-4760 (2012); Romee, R., et al. Scientifica (Cairo) 2014, 205796 (2014); Romee, R. et al. Sci Transl Med 8, 357ra123 (2016)）（図２Ｂ、図２Ｃ）。ＡＳＣＴ２はアミノ酸輸送体であり、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ－ｇｐ１）の対応する受容体である。したがって、理論に縛られることは望まないが、非従来型ＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスを利用することにより、初代ヒトＮＫ細胞、特にＣＩＭＬ ＮＫ細胞における形質導入のブロックを克服することができよう（図２Ｃ）。
[実施例３]
抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲメモリー様ＮＫ細胞の生成。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、がん抗原の標的化における公知の方法である。しかし、ＣＡＲ－Ｔ細胞はその持続性および不都合な副反応のために限定されている。活性を失わず、がん細胞に対する能力を示すＣＡＲ－ＮＫ細胞の生成が必要とされている。
ＣＡＲプラットフォームとしてのＣＩＭＬ ＮＫ細胞。
ＣＤ１９－ＣＡＲを生成するためのプラットフォームとして同種臍帯血由来ＮＫ細胞を使用する研究によって、再発したＢ細胞悪性疾患の患者における臨床奏功が示されてきた（Liu et al. NEJM. (2020) 382:545-53）。臨床奏功は最小の毒性で、重篤なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または神経毒性の症例を伴わずに達成され、ＮＫ細胞が遺伝子改変された養子細胞療法のための新たな細胞プラットフォームを代表することを示している。本発明者らは、サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞療法におけるこれまでの臨床経験(Romee R, et al Blood (2012) 120(24):4751-4760; Romee R, et al. Sci Transl Med (2016) 8(357):357ra123)とともにこれらの観察に基づいて、ＣＩＭＬ ＮＫ ＣＡＲを生成する方法を開発し、これらの遺伝子改変されたＮＫ細胞の有効性を前臨床モデルで評価する。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞（図１）は、前臨床モデルおよび改変されていないＣＩＭＬ ＮＫ細胞で処置された患者において見られた好ましい安全性プロファイル、増加した増殖、延長された持続性、および増強された抗白血病機能に基づくＮＫ細胞ＣＡＲの開発のための独特のプラットフォームを提供する（同文献）。
ＡＭＬにおけるＣＡＲ標的としての変異ＮＰＭ１ｃ
大部分のＣＡＲ－Ｔ細胞療法は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的としている。この療法は、正常組織中での発現レベルが低いことによるオンターゲット／オフ腫瘍毒性、および腫瘍細胞による抗原発現の喪失に対する腫瘍耐性をもたらすことがある。この欠点を克服する1つの方法は、腫瘍特異的発がんドライバー遺伝子変異を標的とすることである。ヌクレオフォスミンにおける４ヌクレオチドの複製はＮＰＭ１ｃとも称され、ＡＭＬの約３０％におけるドライバー発がん遺伝子の変異である。ＮＰＭ１ｃはＨＬＡ－Ａ＊０２０１アレルによって提示される白血病特異的ネオ抗原（ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ；配列番号１）を生成する。本発明者らは、酵母表面ディスプレイを使用し、ＮＰＭ１ｃエピトープ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的に結合するヒト一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を単離した。この抗原を標的とする以前同定されたｓｃＦｖは、米国仮特許出願第６２／９８７，６１２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明者らは、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通（ＴＭ）ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ｚ活性化ドメイン、それに続く自己切断性のＰ２ＡおよびＥＧＦＰを含むＣＡＲ骨格にｓｃＦｖをインフレームでクローニングすることによって、ＣＡＲ構築物を創成した（図３Ａおよび表３）。
Figure 2023517063000005
既に述べたように、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を特異的に認識する。簡単に述べると、ビオチン化ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２とインキュベートし、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣによって染色したＧＦＰ＋抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞（配列番号３０の抗ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲを含む）は、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体と結合することが示された（図３Ｂ）が、対照ペプチドエピトープ（例えばＳＬＬ；ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号６２））を提示するＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ２単独（データは示していない）とは結合しなかった。非形質導入Ｔ細胞は、３つの複合体のいずれにも結合性を示さなかった。これらの結果により、ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ－Ｔ細胞（配列番号３０の抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲを含む）のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体への特異性が確認される。単離したｓｃＦｖを含む操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－Ａ２＋の白血病細胞に対してｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で強力な細胞傷害性を呈したが、ＮＰＭ１ｃ－ＨＬＡ－Ａ２＋またはＨＬＡ－Ａ２－の腫瘍細胞に対しては細胞傷害性を呈さなかった（データは示していない）。
ここで本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１との複合体中でＮＰＭ１ｃネオ抗原を認識することができるＣＡＲ構築物を形質導入したＣＩＭＬ ＮＫ細胞を使用することによって、ＡＭＬに対するＮＫ細胞に基づくＣＡＲを開発する。ＮＫ細胞は、ＨＬＡ発現がないか少ない標的細胞を認識してこれを殺滅することができる。低レベルのＨＬＡを有する白血病細胞はＣＡＲによらない機序を介してＮＫ細胞によって殺滅される一方、高レベルのＨＬＡ、したがってより多くのＮＰＭ１ｃネオ抗原－ＨＬＡ－Ａ２標的を発現するこれらの白血病細胞はＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＮＫ細胞によって標的とされ、殺滅され得るので、これは重要であり得る。抗原の喪失はＣＡＲ－Ｔ療法に続く腫瘍の耐性の重要な機序であるので、ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、治療への耐性および疾患の再発の低減において効果的であることが証明できる。
ＣＡＲ ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の強力な抗ＡＭＬ機能。
以下さらに述べるように、本発明者らは、非従来型のレンチウイルス形質導入アプローチを介して抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲをＣＩＭＬ ＮＫ細胞に導入し、５０％を超えるＣＡＲ編集効率を達成した（図５）。それらの非形質導入対照物と比較して、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ（配列番号３０による）を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、ＮＰＭ１ｃ＋標的ＡＭＬ細胞（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）でパルス処理した際にＩＦＮガンマの産生の上昇したレベルおよび脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現の増加によって示される抗ＡＭＬ機能の増強を獲得した。まとめると、本発明者らは、ＮＰＭ１ｃのような腫瘍特異的細胞内タンパク質を特異的かつ効率的に標的とするＣＡＲ－ＮＫプラットフォームを構築した。
メモリー様ＮＫ細胞
サイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ１５を含むサイトカインで予め活性化することによって惹起された長期の増強された機能性を有するＮＫ細胞である。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、初期のサイトカイン刺激がなくても将来の感染またはチャレンジの間にリコール応答を開始する。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を生成するため、実施例２の方法を使用した。簡単に述べると、ヒトから末梢血単核細胞を単離してｒｈＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）または対照条件（ｒｈＩＬ－１５、５０ｎｇ／ｍＬ）で１６時間刺激し、３回洗浄してサイトカインを除去し、生存を支持するためにｒｈＩＬ－１５（１ｎｇ／ｍＬ）を補充した１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
形質導入
初代ヒトおよびマウスＮＫ細胞の形質導入には種々の課題があり、様々な遺伝子移入プロトコールではわずかな成功しか観察されていない。このプロセスを媒介するため、シュードタイプ化されたレンチウイルスに基づく方法を利用した。ＶＳＶＧ（水疱性口内炎ウイルスＧ）タンパク質とＢａＥＶ－ＬＶ（ヒヒエンベロープ糖タンパク質）との両方が遺伝物質をＮＫ細胞に成功裡に移入することが知られている。ＮＫ細胞は、ＶＳＶＧ受容体である低密度リポタンパク質（ＬＤＬ－Ｒ）およびＢａＥＶ受容体であるアラニン、セリン、システイン輸送体２（ＡＳＣＴ２）を発現する。これら両方の受容体の表面発現を、フローサイトメトリーを使用して従来型（サイトカイン誘導性でない）およびＭＬのＮＫ細胞について測定した。実施例２に記載したように、ＬＤＬ－Ｒのレベル（図２Ａ）はＡＳＣＴ２（図２Ｂ）より少なく発現したことを見出された。したがって、より強力なレンチウイルスアプローチを生成するため、ＢａＥＶ由来の糖タンパク質（配列番号１０７で記載されるアミノ酸配列；配列番号１０８で記載されるヌクレオチド配列）をコード配列に挿入し、ＡＳＣＴ２を認識するＢａＥＶ糖タンパク質を有するシュードタイプ化されたレンチウイルスを生成した。ＢａＥＶ糖タンパク質によってシュードタイプ化され、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルス構築物を示すマップを図２８に示す。図３Ａおよび表３で同定した抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲを発現するためにレンチウイルス発現構築物を調製し、ＢａＥＶ糖タンパク質によってシュードタイプ化した（「ＢａＥＶ－ＬＶ」と称する)。ＥＦ－１アルファプロモーターの制御下に構築物をレンチウイルスパッケージングプラスミドにクローニングし、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における一時的トランスフェクションによってレンチウイルスを生成した。ＬＶを含む上清のタイターは、ＦＡＣＳによって定量した。
ＣＡＲ形質導入に先立つ異なるサイトカインによるＭＬ ＮＫ細胞の誘導がＡＳＣＴ２の発現に影響したか否かを理解するため、細胞を誘導して、発現についてアッセイした。具体的には、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取し、試料からヒトＮＫ（ｈＮＫ）細胞を精製した。次いで上記の用量（即ち１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１２、５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１８、５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１５）を使用して、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、および／またはＩＬ－１８の異なる組合せでｈＮＫ細胞を１６時間刺激した。次いで細胞を洗浄し、上記のＢａＥＶ－ＬＶレンチウイルス形質導入を使用して抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ（配列番号３０で記載されるヌクレオチド配列）を形質導入し、７２時間後に機能性抗ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ－ＭＬ ｈＮＫ細胞を生成した（図６Ａ）。
ｈＮＫ細胞をＩＬ－１５、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１８の１つまたは複数で刺激するとＡＳＣＴ２の表面発現はフローサイトメトリーで測定して、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１８の２つ以上による刺激によって増加した（図６Ｂ）。具体的には、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１８による同時処理によって、ＩＬ－１５単独によるよりも発現が増加した。
ＡＳＣＴ２の発現がＣＩＭＬ ＮＫ細胞におけるｍＲＮＡレベルで従来型ＮＫ細胞と比較して変化したか否かを、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用してさらに確認した。簡単に述べると、上記の方法を使用して３名の異なる健康なヒトドナーから得たＰＢＭＣから初代ヒトＮＫ細胞を単離した。ｈＮＫ細胞を１ウェルあたり３～５×１０６個細胞で播種し、（ｉ）ｒｈＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）、または（ｉｉ）ｒｈＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ｒｈＩＬ１５（５０ｎｇ／ｍＬ）への曝露によって１６時間活性化した。対照条件はｒｈＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）単独、ｒｈＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）単独、またはｒｈＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ）単独への曝露であった。活性化の後、細胞をＰＢＳで３回洗浄してサイトカインを除去し、ｑＰＣＲアッセイのためにＲＮＡを抽出した。ＡＳＣＴ２ ＲＮＡ転写物の定量はΔΔＣｔ法を使用して実施した。図６Ｃ～６Ｅに、３名の異なるヒトドナー由来の活性化ｈＮＫ細胞の定量を提供する。図６Ｃ～６Ｄに示すように、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８で活性化したＮＫ細胞は、対照のｈＮＫ細胞と比較して、特にＩＬ－１５のみで活性化した対照のｈＮＫ細胞と比較して、ＡＳＣＴ２ ＲＮＡ転写物の発現が増加していた。図６Ｅに示すように、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１８で活性化したＮＫ細胞は、ＩＬ－１５のみで活性化した対照のｈＮＫ細胞と比較して３倍を超えるＡＳＣＴ２ ＲＮＡ転写物の増加を有していた。
合わせて、これらの知見は、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８、または３種全てのサイトカイン（ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５）による活性化によってＡＳＣＴ２ ＲＮＡ転写物の発現およびｈＮＫ細胞における表面発現が改善され、ＢａＥＶ－ＬＶによる形質導入効率が増大し得ることを示している。
次いでＭＬ－ＮＫ細胞に抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲを形質導入し、形質導入効率を測定した。具体的には、上記のＣＡＲ構築物はＧＦＰレポーターを含んでいる。形質導入した細胞においてＧＦＰ発現レベルを測定した。図６Ｆに、３種全てのサイトカインで予め活性化することによってＢａＥＶ－ＬＶの形質導入効率が改善されたことを示す。
異なるヒトドナーから得たＣＩＭＬ－ＮＫ細胞において、ＢａＥＶ－ＬＶレンチウイルス形質導入による形質導入を評価した。ＣＡＲ発現は、プロテインＬを使用するフローサイトメトリーによって測定した（例えばZheng, et al (2012) J. Transl Med. 10:29を参照）。図７Ａに示すように、形質導入後のプロテインＬ結合によって抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲの発現として決定した全形質導入率は、異なる６名のドナーについて５６±１４％であった。
さらに、ヒトおよびマウスのドナーから得たＣＩＭＬ－ＮＫ細胞において、ＢａＥＶ－ＬＶレンチウイルス形質導入による形質導入を評価した。ヒトＣＩＭＬ－ＮＫ細胞は、上記のようにＰＢＭＣから得た初代ｈＮＫ細胞をｒｈＩＬ－１２、ｒｈＩＬ－１５、およびｒｈＩＬ－１８で予め活性化することによって得た。マウスＣＩＭＬ－ＮＫ細胞は、マウス脾細胞を収穫し、マウスＮＫ細胞を単離し、組換えマウスＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８で予め活性化することによって得た。ＢａＥＶでシュードタイプ化したレンチウイルスはＧＦＰをコードしていた（Ｌｅｎｔｉ－ＧＦＰ（ＢａＥＶ））。図７Ｂに示すように、ＧＦＰの発現によって測定した形質導入率はヒトとマウスとの両方のＣＩＭＬ－ＮＫ細胞で高かった。
[実施例４]
ＭＬ ＮＫ細胞サブセットの中でのＡＳＣＴ２の発現
ＡＳＣＴ２の発現がＮＫ細胞のサブセットの中で変動するか否かをさらに評価した。図７Ｃに示すように、ｈＮＫ細胞はそれらの発達および成熟の段階に基づいて異なる表現型マーカーを発現する。低い成熟度（例えば、より「幹細胞様」）から完全成熟までの特徴的な表現型マーカーを下の表４に示す。
Figure 2023517063000006
フローサイトメトリー分析を使用して、上に示した表現型マーカーに基づくヒトＮＫ細胞サブセットを解析し、それぞれのサブセットについてＡＳＣＴ２の発現を決定した。簡単に述べると、実施例３に記載したように、４名の異なるヒトドナーから得た新鮮または凍結ＰＢＭＣからｈＮＫ細胞を単離した。次いでｈＮＫ細胞を終夜休ませた。ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＫＩＲ、ＣＤ５７、およびＡＳＣＴ２を標的とする標識抗体で細胞を染色し、洗浄し、次いでフローサイトメトリー分析に供した。使用したゲーティング戦略を図７Ｄに示す。これにより、以下のｈＮＫサブセット（低成熟から高成熟の順）の同定が可能になった。
（ｉ）ＮＫ１：ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ；ＣＤ１６－／ｌｏｗ、
（ｉｉ）ＮＫ２：ＣＤ５６ｄｉｍ；ＣＤ１６＋；ＫＩＲ－、
（ｉｉｉ）ＮＫ３：ＣＤ５６ｄｉｍ；ＣＤ１６＋；ＫＩＲ－；ＣＤ５７－、
（ｉｖ）ＮＫ４：ＣＤ５６ｄｉｍ；ＣＤ１６＋；ＫＩＲ＋；ＣＤ５７＋。
図７Ｅ～７Ｆに示すように、高い表面レベルのＡＳＣＴ２を発現する集団の割合は、ｈＮＫ細胞サブセットの成熟の段階と相関していた。具体的には、ＡＳＣＴ２の表面発現の高いものから低いものへ、ｈＮＫ細胞についてＮＫ１＞ＮＫ２＞ＮＫ３＞ＮＫ４であった。データは、異なるヒトドナーから得たｈＮＫ細胞のサブセットにわたって一致していた。
[実施例５]
抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞は急性骨髄性白血病に対して強力である
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）はＮＰＭ１ｃを発現することが知られている。抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞がＡＭＬに対して非形質導入ＮＫ細胞より強力か否かを検討するため、それぞれの細胞集団をＡＭＬ細胞株とともに培養し、いずれもＮＫ細胞の活性化のマーカーであるＩＦＮ－γおよびＣＤ１０７ａの発現を測定した。具体的には、ＮＰＭ１ｃ＋／ＨＬＡ－Ａ２＋であるＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞とともに４時間、共培養した。細胞を採取し、フローサイトメトリー分析を実施した。細胞はＣＤ５６、ＣＤ１０７ａ、およびＩＦＮγについて染色した。抗ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞は、非形質導入細胞（ＩＬ１５、ＩＬ１２、およびＩＬ１８で刺激したＭＬ ＮＫ細胞）と比較して増加したＩＦＮ－γおよびＣＤ１０７ａの発現を示した（図８Ａ）。この発現の増加は、標的ＡＭＬ細胞の存在下において非形質導入細胞と比較したより高い能力およびＮＫ細胞の活性化を示唆している。
マスサイトメトリーは単一細胞上の多数のパラメーターの高スループット解析を可能にし、ヒトＮＫ細胞を深く免疫フェノタイピングするために使用されている（Strauss-Albee (2015) Sci Transl Med 7:297ra115; Amir, et al (2013) Nat Biotech 31:545）。したがって、ＮＰＭ１ｃ＋標的細胞との共培養の後の抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ ＭＬ－ＮＫ細胞の発現プロファイルの広範囲な解析を、ＮＫ特異的ＣｙＴＯＦパネルを使用して実施した（例えばRomee et al (2016) Sci Transl Med 8:357ra123を参照）。簡単に述べると、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ ＭＬ－ＮＫ細胞または非形質導入ＭＬ－ＮＫ細胞を、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と６時間、共培養した。次いでマスサイトメトリーパネルを使用して細胞を解析した。多様性は３名のヒトドナーについて評価した。定量は、以前記載したように実施した（Diggins, et al (2015) Methods 82:55）。図８Ｂに示すように、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、およびグランザイムＢは、ＣＡＲ ＭＬ－ＮＫ細胞において非形質導入ＮＫ細胞と比較して増強していた。これらのデータは、ＣＡＲ－ＮＫ細胞が白血病細胞の殺滅のための増強された機能を有していることを示唆している。図８Ｃに示すように、ＣＡＲ ＭＬ－ＮＫ細胞において多数の活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２２６）が増加した。活性化マーカーＣＤ６２Ｌも（特に１名のドナー由来のＣＡＲ ＭＬ－ＮＫ細胞において）増加していた。これらのデータは、ＣＡＲ－ＮＫ細胞がそれらの非形質導入対応物よりも活性であることを示している。図８Ｄに示すように、多数の活性化受容体（ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、およびＮＫｐ４４）がＣＡＲ－ＮＫ細胞において増加した。全体として、これらのデータは、ＣＡＲ－ＮＫ細胞が非形質導入ＮＫ細胞と比較して高いレベルの活性化受容体を発現することを示している。図８Ｅに示すように、ある種の成熟マーカー（ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ａ）がＣＡＲ－ＮＫ細胞中で増強された一方、マーカーＣＤ５７は減少した。これらのデータは、ＣＡＲ－ＮＫ細胞の成熟度が非形質導入ＮＫ細胞と比較して低いことを示している。図８Ｆに示すように、疲弊マーカーＴＩＧＩＴはＣＡＲ－ＮＫ細胞中で増強していた。図８Ｇに示すように、アポトーシスマーカーＴＲＡＩＬはＣＡＲ－ＮＫ細胞中で減少しており、ＣＡＲ－ＮＫ細胞が非形質導入ＮＫ細胞と比較して改善された寿命を有していることを示している。
[実施例６]
ＩＬ－１５との共形質導入は抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞の効力を改善する
ＩＬ－１５との共形質導入が抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞の効力をさらに増強するか否かを評価した。Ｐ２Ａ自己切断性ペプチドを介して膜結合ＩＬ－１５（ｍＩＬ－１５）または分泌され得るＩＬ－１５の可溶性バージョン（ｓＩＬ－１５）に連結された抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲをコードするレンチウイルス構築物を調製した。ｍＩＬ－１５にはＣ末端ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインとが含まれていた。ｍＩＬ－１５およびｓＩＬ－１５の完全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を表５に記載する。抗ＮＰＭ１ｃ－ｍＩＬ－１５または抗ＮＰＭ１ｃ－ｓＩＬ－１５をコードする、ＢａＥＶ糖タンパク質によってシュードタイプ化したレンチウイルス発現構築物（それぞれ「ＣＡＲ－ｍ１５」および「ＣＡＲ－ｓ１５」と称する)を調製した。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞にＣＡＲ－ｍ１５またはＣＡＲ－ｓ１５を形質導入すると、形質導入された細胞は非形質導入（ＵＴ）細胞と同様にｉｎ ｖｉｔｒｏで増大を維持していた（図９Ａ）。比較は、実施例３に記載したように抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲのみを形質導入したＣＩＭＮＬ ＮＫ細胞に対して行なった。増大全体を通じても、形質導入後４日目および２３日目にフローサイトメトリーによって測定すると、（プロテインＬの結合パーセントによって測定した）ＣＡＲの表面発現が維持されていた（図９Ｂ～９Ｃ）。
Figure 2023517063000007
次に、ＮＰＭ１ｃを発現するＡＭＬ標的細胞の抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞による特異的殺滅を、ＮＰＭ１ｃの発現を欠くＡＭＬ細胞と比較した。これを行なうため、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ－ＮＫ細胞がそのＮＰＭ１ｃ＋細胞に対する効力に加えてＮＰＭ１ｃ－ ＡＭＬ細胞に対して効力があるか否かを検討した。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞にＣＡＲ－ｓ１５ ＬＶまたはＣＡＲ－ｍ１５ ＬＶを形質導入した。ルシフェラーゼを発現する２つのＡＭＬ細胞株、ＯＣＩ－ＡＭＬ３（ＮＰＭ１ｃ＋、ＨＬＡ－Ａ２＋、Ｌｕｃ＋）およびＯＣＩ－ＡＭＬ２（ＮＰＭ１ｃ－、ＨＬＡ－Ａ２＋、Ｌｕｃ＋）の標的細胞殺滅をアッセイした。まず、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＣＩＭＬ ＮＫとＡＭＬ細胞の１：１の比率で細胞を共培養し、共培養の５時間後に採取した。フローサイトメトリー分析によって測定したＩＦＮγの発現は、ＮＰＭ１ｃ＋（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）細胞と共培養した抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ ＭＬ－ＮＫ細胞において増加した（図１０Ａ）。
さらに、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間共培養することによって、標的細胞（ＡＭＬ）のアポトーシス率を測定した。アポトーシスはＮＰＭ１ｃを発現するエフェクター細胞中でＮＰＭ１ｃ陰性細胞と比較して増加した（図１０Ｂ）。両方のＣＡＲ構築物はＮＰＭ１ｃ陽性細胞においてアポトーシスを誘導することができ、これらはアネキシンＶフローサイトメトリーによって測定して早期のアポトーシスを示した。
ＮＫ細胞とそれぞれのＡＭＬ細胞株を２４時間共培養し、続いてルシフェラーゼ発現を測定することによって、効果的な細胞殺滅をさらに測定した。比較は、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲのみを形質導入したＭＬ－ＮＫ細胞に対して行なった。異なるＥ：Ｔ比で２４時間培養した場合、標的細胞の生存率はＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞で低減した（図１０Ｃの左パネル）一方、ＮＰＭ１ｃ－のＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞では生存は影響されなかった（図１０Ｃの右パネル）。さらに、ＩＬ－１５を共形質導入したＭＬ－ＮＫ細胞は、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲのみを形質導入したＭＬ－ＮＫ細胞と比較して、ＮＰＭ１ｃを発現する標的細胞の殺滅の増加を実証した。合わせて、これらの結果は、特にＩＬ－１５と共形質導入した場合に、ＮＰＭ１ｃを発現しているＡＭＬ細胞に対して抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が成功した効力を有し、ＮＰＭ１ｃを発現していないＡＭＬ細胞に対しては細胞傷害効果がないことを実証している。
ＣＡＲ単独またはＣＡＲとｍＩＬ１５とを形質導入したＣＩＭＬ ＮＫ細胞のさらなる比較を実施した。上で説明したように、ＣＡＲによる形質導入は、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲをコードするＢａＥＶ－ＬＶを使用する形質導入後７２時間で測定して、初代ヒトＣＩＭＬ ＮＫ細胞において効率的であることが見出された（図１０Ｄ）。しかし、ＣＡＲおよびｍＩＬ－１５を共形質導入するためにＢａＥＶ－ＬＶを使用することにより、ＣＡＲのみをコードするＢａＥＶ－ＬＶを形質導入した細胞と比較して、より大きな増大が観察された（図１０Ｅ）。ＯＣＩ－ＡＭＬ標的細胞との４時間の刺激の後、ＣＡＲおよびｍＩＬ－１５をコードするＢａＥＶを形質導入したＣＩＭＬ ＮＫ細胞におけるＩＦＮ－ガンマおよびＣＤ１０７ａの発現は、ＣＡＲのみをコードするＢａＥＶを形質導入したＣＩＭＬ ＮＫ細胞と同様であった（図１０Ｆ）。しかし、ＣＡＲおよびｍＩＬ－１５を共形質導入したＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、共培養後４時間で測定すると、標的ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の殺滅がより効果的であった（図１０Ｇ）。細胞死は、７－ＡＡＤを使用するフローサイトメトリー分析によって測定した。
[実施例７]
抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞はｉｎ ｖｉｖｏでＡＭＬに対する有効性を示す
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ細胞の抗白血病活性を検討するため、ＡＭＬマウスモデルを解析した。図１１Ａに示すように、健康なヒトドナーの末梢血単核細胞からＮＫ細胞を単離した。単離に続いて、実施例３に記載したように細胞をサイトカインとともに培養してＭＬ－ＮＫ細胞を生成した。－１０日目に、実施例３に記載した形質導入法を使用して細胞に抗ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ（配列番号３０）を形質導入した。細胞を培養している間、－７日目にマウスに照射して免疫細胞を除去し、－５日目に１×１０６個のＡＭＬ３－ｌｕｃ細胞を注射した。０日目に、マウスにＮＫ細胞を注射した。注射には約０．５×１０６個の抗ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞を含む１×１０６個の全細胞が含まれていた。ＡＭＬ負荷は、３日目、１０日目、および１３日目にルシフェラーゼ構築物のイメージングを使用して測定した（図１１Ｂ）。抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＭＬ ＮＫ(および分泌型ＩＬ１５または膜結合ＩＬ１５)で処置したマウスは、１２日目までにＡＭＬ負荷の低減を示した（図１１Ｃ）。これらの結果は、全ＡＭＬ負荷の低減において非形質導入ＮＫ細胞と比較した抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＣＩＭＬ ＮＫの成功した効力を示している。
[実施例８]
ＡＭＬ腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＣＡＲ ＣＩＭＬ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性および安全性は、液状および固形の腫瘍に対してバリデート中である。本発明者らは、ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ（３種の構築物）を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞および同じ構築物を形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗白血病活性を評価する。理論に縛られることは望まないが、本発明者らの独特のＣＩＭＬ－ＮＫ ＣＡＲアプローチは、正常な造血幹細胞および前駆細胞への影響または重篤な毒性の惹起なしに、白血病芽細胞へのターゲティングを増強することになる。これは、ＡＭＬにおけるＴ細胞に基づくＣＡＲアプローチに伴う主要な課題の１つであった。簡単に述べると、本発明者らは、予めｌｕｃ＋ＯＣＩ－ＡＭＬ３を注射したＮＳＧマウスを使用する異種移植マウスモデルにおける活性化、増殖、持続性、および有効性を評価する。養子免疫伝達後７日目、１４日目、２８日目、および６０日目に動物を犠牲死させ、（生物発光腫瘍イメージングおよび生存に基づいて）ｉｎ ｖｉｖｏの持続性、増大、および活性を評価する。骨髄および脾を含む主要臓器へのこれらの細胞のトラフィッキング／ホーミングもバリデートする。ＮＫ細胞の疲弊はそれらの抗腫瘍活性に負に影響することから検討の活動分野であることを前提として（Felices et al., 2018）、本発明者らのＮＫ特異的ＣｙＴＯＦパネルを介し、また標的再刺激（即ち、ＯＣＩ－ＡＭＬ３およびＫ５６２）におけるそのＩＦＮ－γ分泌によって、細胞のｉｎ ｖｉｖｏ疲弊を特徴解析する。本発明者らは、ＮＳＧマウスにおいて養子免疫伝達したＣＩＭＬ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の増大および持続性を最適化するＩＬ－２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαの効力も比較する。これには、ＮＫ細胞の疲弊を防止する異なる投薬戦略を試験することが含まれる。異種移植マウスにおける初期の最適化の後、ＤＦＣＩで利用可能なＮＰＭ１ｃ＋患者由来の異種移植（ＰＤＸ）モデルにおいてこの戦略をバリデートする。
本発明者らは古典的なＶＳＶＧシュードタイプ化レンチウイルスも試みた。形質導入効率は極めて低く、通常のＮＫ細胞およびＣＩＭＬ ＮＫ細胞において１～３％の範囲であった。例えば、ＢａＥＶレンチウイルスを使用して異なるサイトカイン、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５＋ＩＬ－１２、およびＩＬ－１５＋ＩＬ－１２＋ＩＬ１８によって予め活性化を行なったＮＫ細胞の形質導入性能も比較し、後者（ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を生成（Romee et al., 2016））が最も良く機能したことを見出した。
[実施例９]
がん免疫療法における使用のためのＣＡＲ ＭＬ ＮＫ細胞の有利な特性
本明細書に記載したＣＡＲメモリー様ＮＫ細胞と、ＴＣＲを発現するように操作された他のＮＫ細胞との相違には、例えば以下のものが含まれる。
操作されたＮＫ細胞の進行中の治験の大部分において、他の非メモリー様ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株（例えばＮＫ９２細胞株）に対してメモリー様（「ＣＩＭＬ」）初代ＮＫ細胞を使用した（Xie et al., 2020）。Mensali et al., 2019; Walseng et al., 2017も参照されたい。
親和性：本発明者らのｓｃＦｖ系ＣＡＲ構築物は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して、それらのペプチド／ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲ系対応物の約１００倍強い親和性を有する。標的へのＣＡＲのより強い結合はＮＫ細胞のより強い活性化をもたらし、したがってより強い殺滅活性をもたらす。Ｔ細胞においては、ＴＣＲのペプチド／ＭＨＣとの相互作用は、弱い結合親和性を補償するためにＣＤ４またはＣＤ８等の共受容体を必要とする。対照的に、ＮＫ細胞は、最適化されたシグナル伝達および引き続く強固な活性化および機能の誘導を理想的に支持するためのインタクトなＴＣＲシグナル伝達コンパートメントを有しない。
今までのところ、細胞内抗原を標的とすることができるＴＣＲを発現するために、Ｔ細胞およびＮＫ細胞株（ＮＫ９２細胞）が形質導入された。初代ＮＫ細胞および初代ＮＫ ＣＩＭＬ細胞にＴＣＲを形質導入することはできるが、そのような形質導入に関しては、ｓｃＦｖ系ＣＡＲ構築物と比較して極めて低い抗原／エピトープ親和性に加えて実質的な欠点が存在し得る。ｓｃＦｖ系ＣＡＲ構築物を使用して好ましい形質導入率を達成し、細胞内抗原を標的とすることができる。これは初代ＮＫ細胞およびメモリー様（「ＣＩＭＬ」）ＮＫ細胞ではなされなかった。さらに、ｓｃＦｖはＴＣＲと比較して短いので、高い形質導入率を維持しつつ、ＩＬ－１５の膜型または分泌型のバージョン等のさらなるモジュールを構築物に添加することができる。
[実施例１０]
細胞内ＮＰＭ１Ｃ由来のネオエピトープを標的とする操作されたメモリー様ＮＫ ＣＡＲＳは急性骨髄性白血病に対する強力な活性および特異性を呈する
序論：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は治療上の課題であり続けている。毒性が低く、有効性が高い標的化療法の開発に対するニーズが出現している。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、効果的ながん療法のために重要な鍵となる属性の多くを保有しており、「生まれつきのキラー」であるが、移植片対宿主疾患、サイトカイン放出症候群、または神経傷害性の明らかなリスクはない。さらに、骨髄芽細胞を標的とするＮＫ細胞の本来の傾向により、これらはＡＭＬについて魅力的なものになっている。血液がんにおける有望な臨床結果にも関わらず、ＮＫ細胞に基づく療法の開発は、主としてＮＫ細胞の寿命が短いこと、増殖が不適切であること、および特異的腫瘍ターゲティングの欠如のために、困難なままである。ここで本発明者らは、先天的な細胞記憶に基づく養子免疫療法のためにＮＫ細胞を武装させる新たなアプローチを利用した。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫エフェクター細胞の抗腫瘍特異性および活性を顕著に増強する。本発明者らのＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＡＭＬにおける腫瘍特異的ネオエピトープを標的とし、有効性を増強し毒性を最小化する設計における強力な機能経路を利用している。
方法：
１．ＡＭＬにおけるＣＡＲの標的としての変異ＮＰＭ１ｃ。大部分のＣＡＲ－Ｔ細胞療法は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的としており、これはオンターゲット／オフ腫瘍毒性および腫瘍耐性をもたらすことがある。この欠点を克服する1つの方法は、腫瘍特異的発がんドライバー変異を標的とすることである。ヌクレオフォスミンにおける４ヌクレオチドの複製はＮＰＭ１ｃとも称され、ＡＭＬの約３５％におけるドライバー発がん変異である。変異は、ＨＬＡ－Ａ２アレルによって提示されるネオエピトープを創成する。本発明者らは、酵母表面ディスプレイを使用し、ＮＰＭ１ｃエピトープ－ＨＬＡ－Ａ２複合体には特異的に結合するが、ＨＬＡ－Ａ２単独または対照ペプチドを負荷したＨＬＡ－Ａ２には結合しないヒト一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を単離した。
２．ＣＡＲプラットフォームとしてのサイトカイン誘導性メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞。ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、前臨床モデル(Romee et al, Blood 2012)および未改変のＣＩＭＬ ＮＫ細胞で処置した患者(Romee et al, Science Trans Med 2016)で観察した、好ましい安全性プロファイル、増加した増殖、延長された持続性、および増強された抗白血病機能に基づくＮＫ細胞ＣＡＲの開発のための独特のプラットフォームを提供することができる。
３．初代ＮＫ細胞における効率的な遺伝子編集。本発明者らは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞上で高い発現を有する独特のタンパク質に基づく非従来型のシュードタイプ化レンチウイルスを利用することによって、初代ヒトおよびマウスのＮＫ細胞における形質導入の障害を克服した。
結果
１．単離されたｓｃＦｖを有する操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、ＮＰＭ１ｃ ＨＬＡ－Ａ２白血病細胞（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）および初代ＡＭＬ芽細胞に対して強力な細胞傷害性を呈するが、ＮＰＭ１ｃ ＨＬＡ－Ａ２白血病細胞（ＯＣＩ－ＡＭＬ２）またはＨＬＡ－Ａ２腫瘍細胞（ＰＣ－３）に対しては細胞傷害性を示さない。
２．しかし、抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗白血病有効性は一過性であり（非形質導入Ｔ細胞で養子免疫伝達を行なった対照マウスと比較して、全生存期間は２８日から４２日に、メディアン生存期間は２１日から３７日に延長した）、無視できない毒性があった。
３．本発明者らは、非従来型シュードタイプ化レンチウイルスを利用して健康なドナー血液（ｎ＝５ドナー）由来のＣＩＭＬ ＮＫ細胞を形質導入し、高い形質導入効率を有する抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を生成することに成功した（ＭＯＩ＝１０を使用し、形質導入率平均４８％、範囲３２％～６５％；ＶＳＶＧシュードタイプ化レンチウイルスを使用する従来型アプローチの２％、範囲０．８％～４．５％と比較）。
４．ＣＡＲの設計において鍵となるサイトカイン経路を利用することにより、ＣＡＲ－ＮＫ細胞の生存率（細胞生存率の２９．７％から７５．２％への増強によって示される)および増殖（ｋｉ－６７の６０．２％から９４．５％へのレベルの増加によって特徴付けられる）が実質的に促進された。
５．抗ＮＰＭ１ｃ ＣＡＲは、ＮＰＭ１ｃ発がん遺伝子を有するＡＭＬ（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）に対するＣＩＭＬ ＮＫ細胞の抗腫瘍機能（ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮガンマによって表される）および腫瘍特異的殺滅（アネキシンＶおよび７－ＡＡＤによって測定される）を有意に促進した。
６．ＣＡＲおよびサイトカインシグナル伝達を有する二重武装ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、ＡＭＬ標的に対して最適の特異性および持続性を呈した。
結論：これらの結果は、ＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－Ａ２＋ ＡＭＬを治療するための効率的な細胞免疫療法として、オンターゲット／オフ腫瘍毒性および腫瘍耐性が潜在的に低減した革新的なＣＡＲ－ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を開発することができることを示している。本発明者らの研究は、診療所における骨髄悪性疾患に対するＣＡＲ ＮＫ細胞療法の新たな構想および設計を推進することになる。
本発明者らは、ＡＭＬの３０％に起こるドライバー発がん変異であるＮＭＰ１ｃに由来するネオエピトープを標的とする新たな遺伝子構築物を開発した。
非従来型シュードタイプ化レンチウイルスおよびメモリー様ＮＫ細胞をＣＡＲ開発のプラットフォームとして利用して、本発明者らは、ＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成のための形質導入方法を（約５０％の形質導入率で）最適化した。
ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＮＰＭ１ｃ＋ ＡＭＬ細胞に対する強力かつ特異的な機能を呈した。
異種移植マウスモデルを使用した予備的な結果は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける強固な抗白血病有効性を支持した（特に膜結合ＩＬ－１５を含む構築物について）。
安全性：
ミスマッチしたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞でさえ、重篤なＧｖＨＤを起こさなかった。
ＮＫ細胞ＣＡＲは安全であり（ＣＲＳなし／神経傷害性なし）、奏効率はＣＬＬにおけるＣＡＲ Ｔ細胞と同様である（Liu et al, NEJM, 2020）。
有効性：
ＡＭＬ／ＭＤＳにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の限定された有効性。
第１相治験におけるＡＭＬに対するメモリー様ＮＫ細胞の強固な応答（Romee et al, STM, 2016）。
ＣＡＲで武装したメモリー様ＮＫ細胞による骨髄芽細胞の二重ターゲティング（抗原発現がＣＡＲを誘発する一方、ＨＬＡ喪失がＮＫ細胞の直接細胞傷害性を誘発する）。
配列
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追加参考文献
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均等物
当業者であれば、日常的な実験を超えるものは使用せずに、本明細書に記載した特定の物質および手技に対して数多くの均等物を認識しまたは確認することが可能である。そのような均等物は本発明の範囲内であると考えられ、以下の特許請求の範囲に網羅される。
参照による組み込み
本明細書で引用した特許、特許出願、および刊行物等の全ての参考文献の開示は、全体としてこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (149)

  1. 細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団であって、前記細胞外結合ドメインが、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団。
  2. 前記細胞外結合ドメインが、（ａ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、および／または（ｂ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合せず、任意選択で、前記対照ペプチドがＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープまたはインフルエンザウイルスＭ１エピトープである、請求項１に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  3. 前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープが、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９を含み、式中、Ｘ１はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＱから選択され、Ｘ３はＱまたはＮから選択され、Ｘ４はＤまたはＥから選択され、Ｘ５はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＦから選択され、Ｘ６はＣ、Ｓ、またはＡから選択され、Ｘ７はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦから選択され、Ｘ８はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ９はＬ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡから選択される、請求項１または２に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  4. Ｘ１がＡまたはＶから選択され、Ｘ２がＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ３がＱまたはＮから選択され、Ｘ４がＤまたはＥから選択され、Ｘ５がＬまたはＩから選択され、Ｘ６がＣまたはＳから選択され、Ｘ７がＶ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ８がＡまたはＶから選択され、Ｘ９がＶ、Ｉ、またはＬから選択される、請求項３に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  5. Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ３がＱであり、Ｘ４がＤであり、Ｘ５がＬであり、Ｘ６がＣであり、Ｘ７がＬであり、Ｘ８がＡであり、Ｘ９がＶ、Ｉ、またはＬから選択される、請求項４に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  6. 前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープが、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）またはＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  7. 前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープが、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  8. 前記ネオエピトープが、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  9. 前記ネオエピトープが、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基長である、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  10. 前記ＭＨＣクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質であるか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされる、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  11. 前記ＭＨＣクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  12. 前記細胞外ドメインが、
    （ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨであって、前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲである、ＶＨ、ならびに／または
    （ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬであって、前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲである、ＶＬ
    を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  13. 前記細胞外ドメインが、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含み、前記ＶＨ ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、前記ＶＨ ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、前記ＶＨ ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  14. 前記細胞外ドメインが、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、前記ＶＬ ＣＤ２がアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、前記ＶＬ ＣＤ３がアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、請求項１３に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  15. 前記細胞外ドメインがＶＨおよびＶＬを含み、前記ＶＨが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、ならびに／または前記ＶＬが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  16. 前記細胞外ドメインがＶＨおよびＶＬを含み、前記ＶＨが配列番号５のアミノ酸配列を含み、ならびに／または前記ＶＬが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  17. 前記細胞外ドメインがｓｃＦｖを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  18. 前記ｓｃＦｖがヒトｓｃＦｖである、請求項１７に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  19. 前記ｓｃＦｖがリンカーを含む、請求項１７または１８に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  20. 前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項１９に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  21. 前記ペプチドリンカーがＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである、請求項２０に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  22. 前記Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号５８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号５９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６０）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６１）からなる群から選択される、請求項２１に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  23. 前記Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが、アミノ酸配列ＳＧＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号４）を含む、請求項２１に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  24. 前記ｓｃＦｖが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、前記ｓｃＦｖが、（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨであって、前記ＶＨ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、前記ＶＨ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、前記ＶＨ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、ＶＨ；ならびに／または（ｂ）ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬであって、前記ＶＬ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、前記ＶＬ ＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、前記ＶＬ ＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、ＶＬを含む、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  25. 前記ｓｃＦｖが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  26. 前記抗原ががん細胞の表面にある、請求項１～２５のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  27. 前記がんが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項２６に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  28. 前記細胞外ドメインが、１００ｎＭもしくはそれ未満、５０ｎＭもしくはそれ未満、２０ｎＭもしくはそれ未満、１０ｎＭもしくはそれ未満、０．５ｎＭから１００ｎＭまで、または１ｎＭから１５ｎＭまでの平衡解離定数（Ｋｄ）で前記抗原に結合する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  29. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＤＡＰ１２、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  30. 前記細胞内ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７およびＤＡＰ１２からなる群から選択される１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の共刺激ドメインを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  31. 前記細胞内ドメインがＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、前記膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインを含み、前記ＣＡＲポリペプチドがＣＤ８ヒンジ領域をさらに含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  32. 前記細胞内ドメインが、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、前記ＣＡＲポリペプチドがＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域を含み、前記ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記細胞外結合ドメインが、前記抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  33. 前記細胞外結合ドメインが、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  34. 前記細胞内ドメインが、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断により前記サイトカインが放出される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  35. 前記サイトカインが、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、またはＣＣＬ１９である、請求項３４に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  36. 前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  37. 前記操作されたＮＫ細胞または細胞の集団が、初代ヒトＮＫ細胞または初代ヒトＮＫ細胞の集団の、以下のサイトカイン：ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－１８のうちの１つまたは複数への曝露後に活性化され、任意選択で、前記サイトカインが組換えヒトサイトカインである、請求項１～３６のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  38. ＩＬ－１２およびＩＬ－１５；ＩＬ－１２およびＩＬ－１８；ＩＬ－１５およびＩＬ－１８；またはＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の組合せへの曝露後に活性化される、請求項３７に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  39. 前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団が、１～２０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１２、１～５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１５および１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にあるＩＬ－１８に曝露され、任意選択で、前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団が、約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、約１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、および約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８に、約３～４８時間、約７～２４時間、約１６～２０時間、約１２～２４時間または約１４～１６時間の期間にわたり、任意選択で約１６時間の期間にわたり曝露され、任意選択で、前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団が、約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、および約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８に、約３～４８時間、約７～２４時間、約１６～２０時間、約１２～２４時間または約１４～１６時間の期間にわたり、任意選択で約１６時間の期間にわたり曝露される、請求項３７または３８に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  40. 前記ＣＡＲポリペプチドが、前記初代ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団の、１つまたは複数のサイトカインへの曝露後に導入される、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  41. （ｉ）１つもしくは複数のサイトカインおよび／もしくは腫瘍標的の存在下で、対照ヒトＮＫ細胞もしくはヒトＮＫ細胞株に比して、産生するＩＦＮγが増加している；
    （ｉｉ）対照ヒトＮＫ細胞もしくはヒトＮＫ細胞株に比して、抗体依存性細胞傷害が増強している；ならびに／または
    （ｉｉｉ）対照ヒトＮＫ細胞もしくはヒトＮＫ細胞株に比して、抗腫瘍効果が増強しており、
    任意選択で、前記対照ＮＫ細胞が、ＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞、またはＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  42. 以下のポリペプチド：ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、およびＣＤ２５のうちの１つまたは複数の発現が、前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞株に比して増加しており、任意選択で、前記対照ヒトＮＫ細胞がＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞であるか、または前記対照ヒトＮＫ細胞株がＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  43. 以下のポリペプチド：ＫＩＲ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＮＡＭ－１およびＣＤ１３７のうちの１つまたは複数が、前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞株に比して相対的に不変であり、任意選択で、前記対照ヒトＮＫ細胞がＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞であるか、または前記対照ヒトＮＫ細胞株がＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  44. ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｂの発現が、前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞株に比して減少しており、任意選択で、前記対照ヒトＮＫ細胞がＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞であるか、または前記対照ヒトＮＫ細胞株がＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  45. 前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団が、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  46. ＩＬ－１５ポリペプチド、任意選択でヒトＩＬ－１５ポリペプチドを発現する、請求項１～４５のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  47. 前記ＩＬ－１５ポリペプチドが、分泌型ＩＬ－１５ポリペプチドであるか、または膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドである、請求項４６に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  48. 前記膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドが、ＩＬ－１５と異種性膜貫通ドメインの融合物である、請求項４７に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  49. ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に１．５倍、２倍、３倍、または４倍に増大する、請求項１～４８のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  50. ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に、サイトカインに対する応答増強または活性化受容体の再刺激を示す、請求項１～４９のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  51. 前記応答増強が、数週間から数か月間にわたり、任意選択で、２週間から３か月間までの期間、３週間から２か月間までの期間、または約１か月間にわたり維持される、請求項５０に記載の操作されたＮＫ細胞または細胞の集団。
  52. ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞と接触させた、前記操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団が、
    （ｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＩＦＮγの発現増加を有し；
    （ｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、グランザイムＢの発現増加を有し；
    （ｉｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つもしくは複数の活性化マーカーの発現増加を有し、ここで前記１つもしくは複数の活性化マーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１０７ａ、およびＣＤ６２Ｌから選択され；
    （ｉｖ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つもしくは複数の活性化受容体の発現増加を有し、ここで前記１つもしくは複数の活性化受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４から選択され；
    （ｖ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つもしくは複数の成熟マーカーの発現増加を有し、ここで前記１つもしくは複数の成熟マーカーは、ＣＤ５６およびＮＫＧ２Ａから選択され；
    （ｖｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＣＤ５７の発現減少を有し；
    （ｖｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＴＩＧＩＴの発現増加を有し；ならびに／または
    （ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＴＲＡＩＬの発現減少を有し；
    任意選択で、ＮＫ細胞の前記対照集団が、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の非形質導入集団である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞または前記細胞の集団。
  53. 請求項１～５２のいずれか一項に記載の操作された細胞または細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  54. 請求項１～５２のいずれか一項に記載の操作された細胞または細胞の集団を作製するための方法であって、
    （ｉ）初代ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団を得るステップ；
    （ｉｉ）前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団を、ある量のＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、またはそれらの任意の組合せと、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞または前記細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ；
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団を、前記ＣＡＲポリペプチドをコードするレンチウイルスベクターと、ＮＫ細胞または前記細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させるステップ；
    （ｉｖ）前記ＣＡＲポリペプチドを発現する前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団を単離するステップ；および
    （ｖ）任意選択で、単離された前記細胞を増大させるステップ
    を含む方法。
  55. 前記初代ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団が、ｉＰＳＣ、臍帯血、またはＰＢＭＣに由来する、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記初代ヒトＮＫ細胞または前記細胞の集団が、自己性または同種性である、請求項５４または５５に記載の方法。
  57. ステップ（ｉｉ）における前記期間が、約１２～１６時間、任意選択で約１４～１６時間、任意選択で約１６時間である、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. ステップ（ｉｉｉ）が、（ｉｖ）の前に約２４～７２時間の期間にわたり、前記ＮＫ細胞または前記細胞の集団を休ませることをさらに含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記レンチウイルスベクターが、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ－ｇｐ）シュードタイプ化レンチウイルスである、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞または前記細胞の集団が、対照ヒトＮＫ細胞もしくはＮＫ細胞株に比して、増大したレベルでＩＦＮγを産生し、任意選択で、前記対照ヒトＮＫ細胞がＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞であるか、または前記対照ヒトＮＫ細胞株がＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 異種性ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞の集団を作製する方法であって、
    ＡＳＣＴ－２を発現するサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を、前記異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、前記集団に形質導入するための条件下で接触させるステップであって、
    前記シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質を含み、
    それによって、前記異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団を作製する、ステップ
    を含む方法。
  62. 前記サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞が、初代ヒトＮＫ細胞の集団から得られる、請求項６１に記載の方法。
  63. 初代ヒトＮＫ細胞の前記集団が、ｉＰＳＣ、臍帯血、またはＰＢＭＣに由来する、請求項６１または６２に記載の方法。
  64. 初代ヒトＮＫ細胞の前記集団が、自己性または同種性である、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. ＡＳＣＴ－２の発現が、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団において、ヒトＮＫ細胞の対照集団に比して、約１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、または４倍に増加しており、任意選択で、ヒトＮＫ細胞の前記対照集団がＩＬ－１５単独の存在下で活性化されている、請求項６１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５への曝露によって予め活性化される、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団が、約８～２４時間、任意選択で１２～２０時間、任意選択で約１２～１６時間、任意選択で約１４～１６時間、任意選択で約１６時間の期間にわたり予め活性化される、請求項６６に記載の方法。
  68. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団が、約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、および約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８への、約３～４８時間、約７～２４時間、約１６～２０時間、約１２～２４時間、約１４～１６時間、または約１６時間の期間にわたる曝露によって予め活性化される、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  69. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団を、１つまたは複数のサイトカインへの前記曝露後、および接触の前に、ある期間にわたって休ませ、前記期間が約２４～７２時間である、請求項６１～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団の少なくとも約１０％が形質導入される、請求項６１～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団の１０～９０％が形質導入され、任意選択で３５～８０％、任意選択で約４０～６０％、任意選択で約６０％が形質導入される、請求項７０に記載の方法。
  72. 異種性ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様（ＭＬ）ＮＫ細胞の集団を作製する方法であって、
    （ｉ）初代ヒトＮＫ細胞の集団を得るステップ；
    （ｉｉ）初代ヒトＮＫ細胞の前記集団を、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１５と、ＡＳＣＴ－２を発現するサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ；ならびに
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の前記集団を、前記異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団に形質導入するための条件下で接触させるステップであって、
    前記シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ＡＳＣＴ－２に結合する糖タンパク質を含み；
    それによって、前記異種性ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団を作製する、ステップ
    を含む方法。
  73. 前記糖タンパク質が、レトロウイルス糖タンパク質である、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記レトロウイルス糖タンパク質が、ヒヒエンベロープ（ＢａＥＶ）糖タンパク質である、請求項７３に記載の方法。
  75. 初代ヒトＮＫ細胞の前記集団が、ｉＰＳＣ、臍帯血、またはＰＢＭＣに由来する、請求項７２～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 初代ヒトＮＫ細胞の前記集団が、自己性または同種性である、請求項７２～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. ステップ（ｉｉ）における前記期間が、約１２～１６時間、任意選択で約１４～１６時間、任意選択で約１６時間である、請求項７２～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団が、
    （ｉ）１つもしくは複数のサイトカインおよび／もしくは腫瘍標的の存在下で、対照ヒトＮＫ細胞株に比して、産生するＩＦＮγが増加している；
    （ｉｉ）対照ヒトＮＫ細胞株に比して、抗体依存性細胞傷害が増強している；ならびに／または
    （ｉｉｉ）対照ヒトＮＫ細胞株に比して、抗腫瘍効果が増強しており、
    任意選択で、前記対照ヒトＮＫ細胞株が、ＩＬ－１５単独の存在下で活性化されたヒトＮＫ細胞株である、請求項６１～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. （ｉｉｉ）の結果として形質導入される、サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の前記集団の割合が、少なくとも１０％である、請求項７２～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. サイトカイン誘導性メモリー様ＮＫ細胞の前記集団の１０～９０％が形質導入され、任意選択で約３５～８０％、任意選択で約４０～６０％、任意選択で約６０％が形質導入される、請求項７９に記載の方法。
  81. 以下のポリペプチド：ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、およびＣＤ２５のうちの１つまたは複数の発現が、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の前記集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して増加している、請求項６１～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 以下のポリペプチド：ＫＩＲ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＮＡＭ－１およびＣＤ１３７のうちの１つまたは複数が、サイトカイン誘導性ＮＫ細胞の前記集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して相対的に不変である、請求項６１～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. ＣＤ１６および／またはＣＤ１１ｂの発現が、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団において、対照ヒトＮＫ細胞株に比して減少している、請求項６１～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団の多数が、ＣＤ２５＋ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋である、請求項６１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団が、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に１．５倍、２倍、３倍、または４倍に増大する、請求項６１～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団が、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に、サイトカインに対する応答増強または活性化受容体の再刺激を示す、請求項６１～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記応答増強が、数週間から数か月間にわたり、任意選択で、２週間から３か月間までの期間、３週間から２か月間までの期間、または約１か月間にわたり維持される、請求項６１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ＩＬ－１５ポリペプチド、任意選択でヒトＩＬ－１５ポリペプチドをさらにコードする、請求項６１～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記ＩＬ－１５ポリペプチドが、分泌型ＩＬ－１５ポリペプチドであるか、または膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドである、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドが、異種性膜貫通ドメイン、任意選択でＣＤ８膜貫通ドメインと融合している、請求項８８または８９に記載の方法。
  91. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団の増大が、前記ＩＬ－１５ポリペプチドを伴わない形質導入を受けた対照ＭＬ ＮＫ集団に比して、前記形質導入の後に１．５倍、２倍、３倍、または４倍への増加である、請求項８８～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の前記集団を単離するステップ；および任意選択で、前記細胞集団を増大させるステップをさらに含む、請求項６１～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記異種性ポリペプチドがＣＡＲである、請求項６１～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記ＣＡＲが、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含み、前記細胞外結合ドメインが、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記細胞外結合ドメインが、（ａ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、および／または（ｂ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合せず、任意選択で、前記対照ペプチドがＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープまたはインフルエンザウイルスＭ１エピトープである、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープが、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９を含み、式中、Ｘ１はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＱから選択され、Ｘ３はＱまたはＮから選択され、Ｘ４はＤまたはＥから選択され、Ｘ５はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＦから選択され、Ｘ６はＣ、Ｓ、またはＡから選択され、Ｘ７はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦから選択され、Ｘ８はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ９はＬ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡから選択される、請求項９４または９５に記載の方法。
  97. Ｘ１がＡまたはＶから選択され、Ｘ２がＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ３はＱまたはＮから選択され、Ｘ４はＤまたはＥから選択され、Ｘ５がＬまたはＩから選択され、Ｘ６がＣまたはＳから選択され、Ｘ７がＶ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ８がＡまたはＶから選択され、Ｘ９がＶ、Ｉ、またはＬから選択される、請求項９６に記載の方法。
  98. Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ３がＱであり、Ｘ４がＤであり、Ｘ５がＬであり、Ｘ６がＣであり、Ｘ７がＬであり、Ｘ８がＡであり、Ｘ９がＶ、Ｉ、またはＬから選択される、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープが、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）またはＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９４～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープが、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９４または９５に記載の方法。
  101. 前記ネオエピトープが、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む、請求項９４～９９のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記ネオエピトープが、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基長である、請求項９４～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記ＭＨＣクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質であるか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされる、請求項９４～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記ＭＨＣクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされる、請求項９４～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記細胞外ドメインが、
    （ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨであって、前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲである、ＶＨ、ならびに／または
    （ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬであって、前記ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲである、ＶＬ
    を含む、請求項９４～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記細胞外ドメインが、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含み、前記ＶＨ ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、前記ＶＨ ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、前記ＶＨ ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、請求項９４～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記細胞外ドメインが、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、前記ＶＬ ＣＤ２がアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、前記ＶＬ ＣＤ３がアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記細胞外ドメインがＶＨおよびＶＬを含み、前記ＶＨが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、ならびに／または前記ＶＬが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項９４～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記細胞外ドメインがＶＨおよびＶＬを含み、前記ＶＨが配列番号５のアミノ酸配列を含み、ならびに／または前記ＶＬが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項９４～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記細胞外ドメインがｓｃＦｖを含む、請求項９４～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記ｓｃＦｖがヒトｓｃＦｖである、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記ｓｃＦｖがリンカーを含む、請求項１１０または１１２に記載の方法。
  113. 前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記ペプチドリンカーがＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号５８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号５９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６０）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６１）からなる群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが、アミノ酸配列ＳＧＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号４）を含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記ｓｃＦｖが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、前記ｓｃＦｖが：（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨであって、前記ＶＨ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、前記ＶＨ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、前記ＶＨ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、ＶＨ；ならびに／または（ｂ）ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬであって、前記ＶＬ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、前記ＶＬ ＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、前記ＶＬ ＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、ＶＬを含む、請求項１１１～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記ｓｃＦｖが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１１１～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記抗原ががん細胞の表面にある、請求項９４～１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記がんが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記細胞外ドメインが、１００ｎＭもしくはそれ未満、５０ｎＭもしくはそれ未満、２０ｎＭもしくはそれ未満、１０ｎＭもしくはそれ未満、０．５ｎＭから１００ｎＭまで、または１ｎＭから１５ｎＭまでの平衡解離定数（Ｋｄ）で前記抗原に結合する、請求項９４～１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＤＡＰ１２、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインを含む、請求項９４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記細胞内ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７およびＤＡＰ１２からなる群から選択される１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の共刺激ドメインを含む、請求項９４～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記細胞内ドメインがＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、前記膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインを含み、前記ＣＡＲポリペプチドがＣＤ８ヒンジ領域をさらに含む、請求項９４～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記細胞内ドメインが、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、前記ＣＡＲポリペプチドがＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域を含み、前記ＣＤ８膜貫通ドメインおよび前記ＣＤ８ヒンジ領域が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記細胞外結合ドメインが、前記抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む、請求項９４～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記細胞外結合ドメインが、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項９４～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項９４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記細胞内ドメインが、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断により前記サイトカインが放出される、請求項９４～１２６のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記サイトカインが、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、またはＣＣＬ１９である、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記サイトカインがＩＬ－１５ポリペプチドである、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  131. 前記ＩＬ－１５ポリペプチドが発現後に分泌される、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１０２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３０または１３１に記載の方法。
  133. 前記ＩＬ－１５ポリペプチドが異種性膜貫通ドメインと融合しており、任意選択で前記異種性膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインである、請求項１３０に記載の方法。
  134. 前記ＩＬ－１５ポリペプチドが、膜結合型ＩＬ－１５ポリペプチドとして発現される、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号１００に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３３または１３４に記載の方法。
  136. クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含むＣＡＲを発現する、操作されたサイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の集団であって、請求項９４～１３５のいずれか一項に記載の方法に従って調製される集団。
  137. ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する標的細胞の存在下で、
    （ｉ）ＩＦＮγの発現増加を有し；
    （ｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、グランザイムＢの発現増加を有し；
    （ｉｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つまたは複数の活性化マーカーの発現増加を有し、ここで前記１つまたは複数の活性化マーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、およびＣＤ６２Ｌから選択され；
    （ｉｖ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つまたは複数の活性化受容体の発現増加を有し、ここで前記１つまたは複数の活性化受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４から選択され；
    （ｖ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、１つまたは複数の成熟マーカーの発現増加を有し、ここで前記１つまたは複数の成熟マーカーは、ＣＤ５６およびＮＫＧ２Ａから選択され；
    （ｖｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＣＤ５７の発現減少を有し；
    （ｖｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＴＩＧＩＴの発現増加を有し；ならびに／または
    （ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞の対照集団に比して、ＴＲＡＩＬの発現減少を有し；
    任意選択で、ＮＫ細胞の前記対照集団が、サイトカイン誘導性ＭＬ ＮＫ細胞の非形質導入集団である、請求項１３６に記載の操作されたＭＬ ＮＫ細胞の集団。
  138. がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、前記がんを含む細胞の細胞表面が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示しており、請求項１～５２のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項１３６もしくは１３７に記載の操作されたＭＬ ＮＫ細胞の集団、または請求項５３に記載の医薬組成物を、前記がんを治療するのに十分な量で前記対象に投与するステップを含む方法。
  139. 前記がんがＡＭＬである、請求項１３８に記載の方法。
  140. がんを治療する前記方法が、がんの量を減少させる方法、または対象における生存期間を延長させる方法である、請求項１３８または１３９に記載の方法。
  141. ＡＭＬの治療を必要とする対象においてＡＭＬを治療する方法であって、請求項１～５２のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項１３６もしくは１３７に記載の操作されたＭＬ ＮＫ細胞の集団、または請求項５３に記載の医薬組成物を、ＡＭＬを治療するのに十分な量で前記対象に投与するステップを含む方法。
  142. 前記ＡＭＬが、再発性ＡＭＬまたは難治性ＡＭＬである、請求項１３８～１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. ＡＭＬから寛解している対象においてＡＭＬの再発を予防する方法であって、請求項１～５２のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項１３６もしくは１３７に記載の操作されたＭＬ ＮＫ細胞の集団、または請求項５３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  144. 前記投与のステップの前に、前記対象がＮＰＭ１ｃを発現するか否か、または前記対象がＮＰＭ１遺伝子におけるＮＰＭ１ｃ変異を有するか否かを検出し、前記対象がＮＰＭ１ｃを発現するかまたはＮＰＭ１ｃ変異を有する場合、前記投与のステップに進むステップを含む、請求項１３８～１４３のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記操作された細胞または細胞の集団が、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に増大の増強を示す、請求項１３８～１４４のいずれか一項に記載の方法。
  146. １つまたは複数の追加の治療薬または手順を投与するステップをさらに含む、請求項１３８～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. 対象におけるがんを治療するための医薬の製造における、請求項１～５２のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項１３６もしくは１３７に記載の操作されたＭＬ ＮＫ細胞の集団、または請求項５３に記載の医薬組成物の使用であって、前記がんを含む細胞の細胞表面が、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示し；任意選択で、前記使用が、１つまたは複数の追加の治療薬または手順と組み合わされたものである、使用。
  148. 前記対象がヒトである、請求項１３８～１４６のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４７に記載の使用。
  149. （ｉ）請求項１～５２のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項１３６もしくは１３７に記載の操作されたＭＬ ＮＫ細胞の集団、または請求項５３に記載の医薬組成物；（ｉｉ）任意選択で、１つまたは複数の追加の治療薬、および（ｉｉｉ）対象におけるがんの治療に使用するための説明書を含む１つまたは複数の容器を含むキット。
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