JP2023514887A - 遺伝子型決定のためのキット - Google Patents

Abstract

キットの一例は、フローセルと遺伝子型決定プローブ流体とを含む。フローセルは、基材、並びに基材に付着した第１及び第２の捕捉プライマを含む。遺伝子型決定プローブ流体は、液体キャリア、及び液体キャリア中の遺伝子型決定オリゴヌクレオチドを含む。遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは、第１のプライマ配列、標的遺伝子型決定遺伝子座を代表するプローブ配列、制限エンドヌクレアーゼ部位、及び第２の捕捉プライマに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマ配列を含む。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／９８１，８６６号の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

（配列表の参照）
ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファイルの名称はＩＬＩ１８４ＢＰＣＴ＿ＩＰ－１８９７－ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、ファイルサイズは７８８バイトであり、ファイル作成日は２０２０年１２月２９日である。

特定の核酸の検出は、診断医学及び分子生物学研究に使用することができる。遺伝子プローブアッセイは、例えば、細菌及びウイルスなどの感染性生物の識別と、正常遺伝子及び変異遺伝子の発現のプロービングと、がん遺伝子などの変異遺伝子の識別と、組織移植前の適合性に関しての組織の分類と、法医学のための組織又は血液試料のマッチングと、異なる種からの遺伝子間での相同性の調査と、において有用であり得る。

本明細書では、クラスタ形成、直線化、標的遺伝子座識別、及び／又は配列決定において、指定された機能を有するように設計された特定のヌクレオチド配列セクションを含む、遺伝子型決定オリゴヌクレオチドが開示される。遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは、非パターン化又はパターン化フローセル上で遺伝子型決定を行うことを可能にし、更なる固定化構成要素は伴わない。

本明細書に開示される第１の態様は、フローセルと遺伝子型決定プローブ流体とを含むキットであって、フローセルが、基材、並びに基材に付着した第１の捕捉プライマ及び第２の捕捉プライマを含み、遺伝子型決定プローブ流体が、液体キャリア及び液体キャリア中の遺伝子型決定オリゴヌクレオチドを含み、遺伝子型決定オリゴヌクレオチドが、第１のプライマ配列、標的遺伝子型決定遺伝子座を代表するプローブ配列、制限エンドヌクレアーゼ部位、及び第２の捕捉プライマに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマ配列を含む、キットである。

本明細書で開示されるキットの任意の特徴を、任意の望ましい様式及び／又は構成で一緒に組み合わせて、例えば、フローセル上で遺伝子型決定を達成することを含む、本開示に記載される利点を達成し得ることを理解すべきである。

本明細書に開示される第２の態様は、方法であって、複数の遺伝子型決定オリゴヌクレオチドを含む遺伝子型決定プローブ流体を、第１の捕捉プライマ及び第２の捕捉プライマを含むフローセルに導入することであって、遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの各々が、第１のプライマ配列、標的遺伝子型決定遺伝子座をそれぞれ代表するプローブ配列、制限エンドヌクレアーゼ部位、及び第２の捕捉プライマに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマ配列を含み、これによって、それぞれの遺伝子型決定オリゴヌクレオチドが反応して、それぞれの遺伝子型決定オリゴヌクレオチドから、増幅産物のそれぞれのクローン集団を産生する、導入することと、増幅産物を直線化してプローブテンプレートを産生することと、プローブテンプレートの少なくとも１つのプローブ識別セクションを配列決定して、プローブ配列の各々を識別することと、プローブテンプレートから少なくともそれぞれの新生鎖を除去することであって、これによって、プローブテンプレートの末端にある３’ＯＨ基が曝露される、除去することと、それぞれの試料をプローブテンプレートにハイブリダイズすることと、曝露した３’ＯＨ基で試料のそれぞれの遺伝子型決定反応を実行することと、を含む、方法である。

本方法の任意の特徴を、任意の望ましい様式で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。更に、方法及び／若しくはキットの特徴の任意の組合せを、例えば、フローセル上で遺伝子型決定を達成することを含め、本開示に記載される利点を達成するために、一緒に使用することができること、並びに／又は本明細書に開示される実施例のうちのいずれかと組み合わせることができることを、理解されたい。

本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかになろう。図面において、同様の参照番号は、類似なものではあるが、場合により同一ではない構成要素に対応している。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号又は特徴は、それらが現れる他の図面と関連させて記載してもよく、記載しなくてもよい。

図１Ａは、本明細書に開示される遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの一例の概略図である。図１Ｂは、本明細書に開示される遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの別の例の概略図である。 図２Ａは、フローセルの一例の上面図である。図２Ｂは、フローチャネルに沿って形成されたくぼみを含む、フローセルのフローチャネルの一例の拡大及び部分断面図である。 図３Ａは、本明細書に開示される方法の一例を概略的に示す。図３Ｂは、本明細書に開示される方法の一例を概略的に示す。図３Ｃは、本明細書に開示される方法の一例を概略的に示す。 図３Ｄは、本明細書に開示される方法の一例を概略的に示す。図３Ｅは、本明細書に開示される方法の一例を概略的に示す。 図３Ｆは、本明細書に開示される方法の一例を概略的に示す。図３Ｇは、本明細書に開示される方法の一例を概略的に示す。 図３Ｈは、本明細書に開示される方法の一例を概略的に示す。 図４Ａは、本明細書に開示される方法の別の例を概略的に示す。 図４Ｂは、本明細書に開示される方法の別の例を概略的に示す。図４Ｃは、本明細書に開示される方法の別の例を概略的に示す。 図４Ｄは、本明細書に開示される方法の別の例を概略的に示す。図４Ｅは、本明細書に開示される方法の別の例を概略的に示す。 図４Ｆは、本明細書に開示される方法の別の例を概略的に示す。図４Ｇは、本明細書に開示される方法の別の例を概略的に示す。 図４Ｈは、本明細書に開示される方法の別の例を概略的に示す。

本明細書では、特定のヌクレオチド配列セクションを含む遺伝子型決定オリゴヌクレオチドが開示される。遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド配列セクションは、クラスタ形成、直線化、標的遺伝子座識別、及び／又は配列決定において、指定された機能を有するように設計される。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは、その表面上に捕捉プライマを有する非パターン化フローセル、又はその中に捕捉プライマを有するくぼみを含むパターン化フローセルで使用することができる。非パターン化フローセル表面上又はパターン化フローセルのそれぞれのくぼみ内の異なる領域で、増幅産物のモノクローナル集団（クラスタ）は、それぞれの遺伝子型決定オリゴヌクレオチドから生成され得る。特定の領域又はくぼみの増幅産物は、他の領域又はくぼみの各々における増幅産物とは異なってもよく、したがって、増幅産物の各モノクローナル集団は、遺伝子型決定のための固有の標的遺伝子座を表すことができる。

本明細書に開示される遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは、非パターン化フローセル又はパターン化フローセル上で遺伝子型決定を行うことを可能にし、固相ビーズなどの更なる固定化構成要素は伴わない。加えて、本明細書に開示される遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは、クローン増幅クラスタを利用する任意のフローセル表面と共に使用するのに好適であり得る。

本明細書にはまた、遺伝子型決定オリゴヌクレオチドと共に使用され得る標的遺伝子型決定遺伝子座を調製するための方法も開示される。これらの方法は、切断部位を導入し、断片化を実施する必要なく、ゲノムＤＮＡ（genomic DNA：ｇＤＮＡ）断片を生成する増幅方法である。

定義

本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術の通常の意味をとるものと理解されるであろう。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。

本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、単数形並びに複数形の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。

「一つの例」、「別の例」、「一例」などへの本明細書全体を通じての言及は、例に関連して記載されている特定の要素（例えば、特徴、構造、組成、構成、及び／又は特性）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に含まれており、他の例に存在していても存在していなくともよいことを意味している。更に、文脈上明確に別段の指示がない限り、任意の例に関する記載の要素は、様々な例において任意の好適な様式で組み合わせ得ることを理解すべきである。

特許請求の範囲を含む本開示全体で使用される「実質的に」及び「約」という用語は、処理における変動に起因するものなどの小さな変動を記載及び説明するために使用される。それらの用語は、表示値から±１０％以下、例えば、表示値から±５％以下、表示値から±２％以下、表示値から±１％以下、表示から±０．５％以下、表示値から±０．２％以下、表示値から±０．１％以下、表示値から±０．０５％以下を指すことができる。

更に、本明細書で提供される範囲は、明示的に列挙されているかのように、表示範囲及び表示範囲内の任意の値又は部分範囲を含むことを理解すべきである。例えば、約２ｍｍ～約３００ｍｍによって表される範囲は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの明示的に記載された限界だけでなく、約１５ｍｍ、２２．５ｍｍ、２４５ｍｍなどの個々の値、及び約２０ｍｍ～約２２５ｍｍなどの部分範囲も含むと解釈するべきである。

付着：２つのものが、互いに、直接的又は間接的のいずれかで、接合、締結、接着、接続、又は結合されている状態。例えば、核酸は、共有結合又は非共有結合によって官能化ポリマーに結合され得る。共有結合は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる。非共有結合は、電子対の共有を伴わない物理結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用、及び疎水性相互作用を挙げることができる。２つのものが直接付着する場合、介在する構成要素は存在しない。例えば、遺伝子型決定オリゴヌクレオチドのいくつかの例における第１の捕捉プライマ及びプローブ配列は、互いに直接共有結合している。２つのものが間接的に付着する場合、何らかの介在する構成要素が存在する。例えば、遺伝子型決定オリゴヌクレオチドのいくつかの例における第１の捕捉プライマ及びプローブ配列は、インデックス配列部分及びプライミング部位部分を通して互いに間接的に結合される。

堆積：手動又は自動のものであってよく、場合によっては表面特性の変更をもたらす、任意の好適な適用技術。概して、堆積は、蒸着技術、コーティング技術、グラフト技術などを使用して実行され得る。いくつかの特定の例としては、化学蒸着（ＣＶＤ）、スプレーコーティング（例えば、超音波スプレーコーティング）、スピンコーティング、ダンク又はディップコーティング、ドクターブレードコーティング、液滴分配（puddle dispensing）、フロースルーコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷、インクジェット印刷などが挙げられる。

くぼみ：基材又はパターン化樹脂による隙間領域（複数可）によって少なくとも部分的に囲まれる表面開口部を有する、基材又はパターン化樹脂における別個の凹状の機構。くぼみは、表面の開口部において、例として、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を持つ）などの、様々な形状をとることができる。表面と直交するようにとられたくぼみの断面は、湾曲形状、正方形、多角形、双曲線、円錐、角のある形状などであることができる。例として、くぼみは、ウェル又は２つの相互接続されたウェルであり得る。くぼみはまた、尾根、階段状の作りなど、より複雑な構造を有し得る。

各々：アイテムのコレクションを指して使用される場合、各々がコレクション内の個々のアイテムを識別するが、必ずしもコレクション内の全てのアイテムを指すわけではない。明示的な開示又は文脈がそうでないことを明確に指示する場合、例外が生じ得る。

フローセル：反応を実行できるチャンバ（例えば、フローチャネル）と、チャンバに試薬を送達するための入口と、チャンバから試薬を除去するための出口とを有する容器。いくつかの例では、チャンバは、チャンバ内で発生する反応の検出を可能にする。例えば、チャンバは、アレイ、光学標識化分子などの光学的検出を可能にする１つ以上の透明な表面を含み得る。

ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）：真核細胞の核又は原核生物、ウイルス、ミトコンドリア、若しくはクロロプラストで天然に発生し、並びに細胞によってＲＮＡに天然に転写されている配列、及び細胞によってＲＮＡに天然に転写されていない配列を含有する、１つ以上の染色体ポリマーデオキシリボヌクレオチド分子。真核細胞のｇＤＮＡは、少なくとも１つのセントロメア、２つのテロメア、１つの複製起点、及び例えばイントロン又は転写プロモータを含む真核細胞によってＲＮＡに転写されない１つの配列を含有する。原核細胞のｇＤＮＡは、少なくとも１つの複製起点、及び例えば転写プロモータを含む真核細胞によってＲＮＡに転写されない１つの配列を含有する。真核生物のゲノムＤＮＡは、原核生物、ウイルス、又はオルガネラゲノムＤＮＡから、例えば、真核生物ゲノムＤＮＡにおけるイントロンの存在及び他のもののｇＤＮＡにイントロンの非存在によって区別することができる。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド：特定のヌクレオチド配列セクションを含む一本鎖デオキシリボ核酸配列であって、そのうちの１つは、遺伝子型決定のための標的遺伝子座を表すプローブ配列である。遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは、クラスタ生成のテンプレートとして機能し得る。

インデックス配列部分：プローブ配列を識別する、いくつかの例では遺伝子型決定オリゴヌクレオチドのプローブ配列を識別する、１０～３０個の核酸塩基の範囲の短鎖。

遺伝子座（単数）又は遺伝子座（複数）：核酸試料中の配列特異的な位置。この用語は、単離された核酸分子に存在すると予想される所定の核酸配列又は予測された核酸配列を含み得る。これらの所定の核酸配列又は予想された核酸配列は、「標的遺伝子型決定遺伝子座」と本明細書では称することができ、これらは分析のための目的の領域（複数可）であってもよい。この用語は、一塩基多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）、変異、反復配列多型（variable number of tandem repeat：ＶＮＴＲ）及び単純縦列反復（single tandem repeat：ＳＴＲ）、他の多型、挿入、欠失、スプライスバリアント、又は任意の他の既知の遺伝子マーカを包含することを意味する。

核酸：任意の長さのヌクレオチドのオリゴマー又はポリマー形態であり、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、又はそれらの混合物を含み得る。この用語は、一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す場合がある。

ヌクレオチド：窒素含有複素環式塩基（核酸塩基）、糖、及び１つ以上のリン酸基。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位である。リボヌクレオチド（ＲＮＡ）において、糖はリボースであり、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）において、糖は、デオキシリボース、すなわち、リボースの２’位に存在するヒドロキシル基が欠如している糖である。窒素含有複素環式塩基（すなわち、核酸塩基）は、プリン塩基であってもピリミジン塩基であってもよい。プリン塩基としては、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。ピリミジン塩基としては、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１又はプリンのＮ－９に結合される。天然に存在するヌクレオチドは、概して、ホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。核酸類似体は、リン酸骨格、糖、又は核塩基のいずれかが変化し得る。核酸類似体の例としては、例えば、ペプチド核酸（peptide nucleic acid：ＰＮＡ）などのユニバーサル塩基又はリン酸－糖骨格類似体が挙げられる。

ヌクレオチド配列セクション：遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの一部分。遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの各部分は、本明細書に開示される方法（複数可）における特定のプロセスに関与するように設計されてもよい。

プライマ：特定の配列にハイブリダイズすることができる一本鎖デオキシリボ核酸配列。プライマの一つの例は、「捕捉プライマ」である。捕捉プライマは、フローセルのくぼみに存在してもよく、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド又はその増幅産物のプライマ配列にハイブリダイズすることができる。捕捉プライマは、増幅及びクラスタ生成のための開始点として機能することができる。プライマの別の例は、「配列決定プライマ」である。配列決定プライマは、一本鎖プローブテンプレートの少なくとも一部分の合成をプライミングするために、一本鎖プローブテンプレートの一部分にハイブリダイズすることができる。ランダムプライマなどの他のプライマは、標的遺伝子型決定遺伝子座などのｇＤＮＡ断片を生成するため、ランダムプライマ増幅反応で使用されてもよい。任意のプライマは、ヌクレオチド又はそれらの類似体の任意の組合せを含むことができる。プライマの長さは、任意の数の塩基の長さであることができ、様々な非天然ヌクレオチドを含むことができる。一例では、捕捉プライマ又は配列決定プライマは、１０～６０核酸塩基、又は２０～４０核酸塩基の範囲の短鎖である。

プライミング配列部分：インデックス配列部分の配列決定のためのプライミング部位であって、これらは両方とも、遺伝子型決定オリゴヌクレオチドのいくつかの例に含まれる。

プローブ配列：遺伝子型決定のための標的遺伝子座を表すヌクレオチド配列を含む、遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの特定のセクション。プローブ配列又はその増幅産物は、相補的な特定の順序を有する２５～５０個の核酸塩基を含み、したがって、標的遺伝子座配列にハイブリダイズすることができる。

一本鎖プローブテンプレート：クラスタ化中に生成される一本鎖デオキシリボ核酸配列。遺伝子型決定オリゴヌクレオチドはクラスタ生成のテンプレートとして機能し、したがって、一本鎖プローブテンプレートは、増幅産物、又は遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの増幅産物の一部分である。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド

図１Ａ及び図１Ｂは、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０、１０’の２つの異なる例を概略的に示す。遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０、１０’の各々は、第１のプライマ配列１２、プローブ配列１４、制限エンドヌクレアーゼ部位１６又は１６’、及び第２のプライマ配列１８又は１８’を含む、特定のヌクレオチド配列セクションを含む。

図１Ａに示される例示的な遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０は、プローブ配列１４に直接共有結合した第１のプライマ配列１２を含み、これは、制限エンドヌクレアーゼ部位１６に直接共有結合し、第２のプライマ配列１８に直接共有結合している。これらの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０を伴う方法の一例は、図３Ａ～図３Ｈを参照して示され、説明される。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の第１のプライマ配列１２は、フローセル２０（図２Ａ及び図２Ｂを参照）の表面上に存在する第１の捕捉プライマ２２（図２Ｂ参照）と同じ極性及び同じ配列を有してもよい。このようにして、第１のプライマ配列１２の少なくとも一部分における核酸塩基の数、順序、及び種類は、第１の捕捉プライマ２２中の核酸塩基の数、順序、及び種類に依存する。クラスタ化中、第１のプライマ配列１２に相補的な配列（例えば、Ｐ５’）を含む、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の増幅産物が生成される。この相補的な部分（図３ＢではＣ_１２として示される）は、第１の捕捉プライマ２２にハイブリダイズすることができる。

一例では、第１の捕捉プライマ２２は、捕捉及び／又は増幅の目的のためのユニバーサル配列を有する。第１の捕捉プライマ２２の一例としては、例えば、ＨＩＳＥＱ（商標）、ＨＩＳＥＱＸ（商標）、ＭＩＳＥＱ（商標）、ＭＩＳＥＱＤＸ（商標）、ＭＩＮＩＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱＤＸ（商標）、ＮＯＶＡＳＥＱ（商標）、ＩＳＥＱ（商標）ＧＥＮＯＭＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）、及び他の装置プラットフォームでの配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により販売されている、市販のフローセルの表面上で使用される例である、Ｐ５プライマが挙げられる。別の例では、第１の捕捉プライマ２２は、以下を含む。
第１の捕捉プライマ：５’→３’
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ（配列番号１）

第１のプライマ配列１２は、第１の捕捉プライマ２２と同じ配列を有してもよい。一例が提供されているが、第１のプライマ配列１２及び第１の捕捉プライマ２２のために他の配列を使用してもよいことを理解されたい。第１のプライマ配列１２はまた、第１の捕捉プライマ２２と少なくとも部分的に同じであってもよい。「少なくとも部分的に同じ」とは、第１のプライマ配列１２及び第１の捕捉プライマ２２中の充分な数の核酸塩基が同じであり、その結果、ハイブリダイゼーションが１２、２２の２つの間で発生し得ることを意味する。遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の第１のプライマ配列１２は、プローブ配列１４に直接付着している。プローブ配列１４は、標的遺伝子型決定遺伝子座を代表する。したがって、プローブ配列１４は、遺伝子型決定中に標的遺伝子座配列にハイブリダイズすることができる。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の制限エンドヌクレアーゼ部位１６は、プローブ配列１４に直接付着している。この制限エンドヌクレアーゼ部位１６は、消化部位で遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０を提供する。一例では、制限エンドヌクレアーゼ部位１６は、４塩基カッター（base cutter）制限エンドヌクレアーゼ、５塩基カッター制限エンドヌクレアーゼ、６塩基カッター制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、制限酵素に感受性である。いくつかの例の４塩基カッターとしては、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどから市販されている、ＤｐｎＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｌｕＣＩ、ＢｆｕＣＩ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｂｆａｌ、ＢｓｔＵＩ、ＰｍＩＩ、及びＫａｓｌなどが挙げられる。いくつかの例の５塩基カッターとしては、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどから市販されている、ＢｓｓＫＩ、ＳｔｙＤ４１、ＭａｅＩＩＩ、ＰｓｐＧＩ、Ｄｄｅｌ、Ｆｍｕｌ、ＰｓｐＧＩ、及びＴｆｉｌなどが挙げられる。いくつかの例の６塩基カッターとしては、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどから市販されている、ＡｃＩＩ、Ａｆｅｌ、Ｎｓｐｌ、ＨａｅＩＩ及びＴａｔｌなどが挙げられる。制限エンドヌクレアーゼ部位１６は、制限酵素による切断／消化の後、プローブ配列１４の最後の塩基が、配列決定／遺伝子型決定反応のために曝露される最後の３’ＯＨであるように位置付けられる。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の第２のプライマ配列１８は、フローセル２０の表面上に存在する第２の捕捉プライマ２４（図２Ｂ参照）に少なくとも部分的に相補的である。「少なくとも部分的に相補的」とは、第２のプライマ配列１８及び第２の捕捉プライマ２４中の充分な数の核酸塩基が相補的であり、その結果、ハイブリダイゼーションが１８、２４の２つの間で発生し得ることを意味する。このようにして、第２のプライマ配列１８の核酸塩基の数、順序、及び種類は、第２の捕捉プライマ２４中の核酸塩基の数、順序、及び種類に依存する。

一例では、第２の捕捉プライマ２４は、捕捉及び／又は増幅の目的のためのユニバーサル配列を有する。第２の捕捉プライマ２４の一例としては、例えば、ＨＩＳＥＱ（商標）、ＨＩＳＥＱＸ（商標）、ＭＩＳＥＱ（商標）、ＭＩＳＥＱＤＸ（商標）、ＭＩＮＩＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱＤＸ（商標）、ＮＯＶＡＳＥＱ（商標）、ＩＳＥＱ（商標）ＧＥＮＯＭＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）、及び他の装置プラットフォームでの配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により販売されている、市販のフローセルの表面上で使用される例である、Ｐ７プライマが挙げられる。別の例では、第２の捕捉プライマ２４は、以下を含む。
第２の捕捉プライマ：５’→３’
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ（配列番号２）
第２の捕捉プライマ配列１８は、第２のプライマ配列２４の配列と少なくとも部分的に相補的である。この例では、第２のプライマ配列１８は、以下を含んでもよい。
第２のプライマ配列：５’→３’
ＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＡＴＧＣＴ（配列番号３）
一例が提供されているが、第２のプライマ配列１８及び第２の捕捉プライマ２４のために他の配列を使用してもよいことを理解されたい。

フローセル２０上の第２の捕捉プライマ２４はまた、切断部位を含む（図３Ａの参照番号４６を参照されたい）。切断部位を使用して、クラスタ形成後に架橋プローブテンプレートを直線化してもよい（図３Ｅを参照してより詳細に説明される）。第２の捕捉プライマ２４の切断部位の化学的性質は、制限エンドヌクレアーゼ部位１６の早期消化が起こらないように、遺伝子型決定ヌクレオチド１０の制限エンドヌクレアーゼ部位１６の化学的性質とは異なってもよい。切断部位及び制限エンドヌクレアーゼ部位１６は、別々かつ特定の切断反応を有する。これらの反応は、一方の反応が他の反応を開始しない、影響を及ぼさない、又は他の方法で妨害しないという点で、直交していると見なされてもよい。第２の捕捉プライマ２４の好適な切断部位の例としては、酵素的に切断可能な核酸塩基若しくは化学的に切断可能な核酸塩基、修飾核酸塩基、又はリンカ（例えば、核酸塩基の間に付着）が挙げられる。酵素的に切断可能な核酸塩基は、グリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼとの反応、又はエキソヌクレアーゼとの反応による切断の影響を受けやすい場合がある。切断可能な核酸塩基の具体的な一例は、デオキシウラシル（ｄＵ）であり、ＵＳＥＲ酵素で標的化することができる。一例では、ウラシル塩基は、第２の捕捉プライマ２４の３’末端から７番目の塩基位置に組み込まれてもよい。また、他の無塩基部位を使用してもよい。化学的に切断可能な核酸塩基、修飾核酸塩基、又はリンカの例としては、８－オキソグアニン、ビシナルジオール、ジスルフィド、シラン、アゾベンゼン、光切断可能な基、アリルＴ（アリル官能基を有するチミンヌクレオチド類似体）、アリルエーテル、又はアジド官能性エーテルが挙げられる。

ここで図１Ｂを参照すると、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’の別の例が概略的に示されている。図１Ｂに示される例示的な遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’は、図１Ａに示される遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０よりも多くのヌクレオチド配列セクションを含む。具体的には、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’は、インデックス配列部分２６及びプライミング部位部分２８を更に含む。この例では、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’は、インデックス配列部分２６に直接共有結合した第１のプライマ配列１２を含み、これは、プライミング部位部分２８に直接共有結合し、プローブ配列１４に直接共有結合し、第２のプライマ配列１８’に結合している。この例では、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’は、プローブ配列１４と第２のプライマ配列１８’との間に位置付けられてもよく、又は第２のプライマ配列１８’に組み込まれてもよい。これらの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’を伴う方法の一例は、図４Ａ～図４Ｈを参照して示され、説明される。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’の第１のプライマ配列１２は、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の本明細書に記載される任意の例であってもよい。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’の第１のプライマ配列１２は、インデックス配列部分２６に直接付着している。インデックス配列部分２６は、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’におけるプローブ配列１４に固有である。このようにして、インデックス配列部分２６は、プローブ配列１４によって表される標的遺伝子座配列を識別するために使用され得る、識別子又は別個のバーコードを提供する。

インデックス配列部分２６は、プライミング部位部分２８に直接付着している。プライミング部位部分２８は、インデックス配列部分２６に沿って、テンプレート依存的な方法で、一度に１つの核酸塩基のヌクレオチド導入を開始する配列決定プライマにハイブリダイズすることができる。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’のプライミング部位部分２８は、プローブ配列１４に直接付着している。本明細書に記載されるように、プローブ配列１４は、遺伝子型決定中に標的遺伝子座配列にハイブリダイズすることができる。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’では、プローブ配列１４は、第２のプライマ配列１８’に付着している。いくつかの例では、プローブ配列１４は、第２のプライマ配列１８’に間接的に付着し、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’は、２つのセクション１４、１８’の間に位置付けられる。他の例では、プローブ配列１４は、第２のプライマ配列１８’に直接付着し、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’は、第２のプライマ配列１８’に組み込まれる。これらの実施例のいずれかにおいて、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’は、ＩＩＳ型制限酵素に感受性であってもよい。ＩＩＳ型制限酵素は、メチル感受性であってもよく、又はメチル感受性でなくてもよい。ＩＩＳ型制限酵素は、非対称性ＤＮＡ配列（例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’）を認識し、認識配列の外側の規定の距離（例えば、１ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド）で切断する酵素の特定の群である。メチル感受性ではないＩＩＳ型制限酵素のいくつかの例は、ＢｂｖＩ（ＢｓｅＸＩ）、ＢｍｒＩ、Ｂｖｅｌ（ＢｓｐＭＩ）などからなる群から選択される。メチル感受性であるいくつかのＩＩＳ型制限酵素は、ＳｆａＮＩ、ＦｏＫＩ、ＨＧＡＩなどからなる群から選択される。いくつかの例が提供されているが、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’の認識配列に応じて、任意の好適なＩＩＳ型制限酵素を使用してもよい。メチル感受性酵素及び非メチル感受性酵素は、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどから市販されている。

制限エンドヌクレアーゼ部位１６’が第２のプライマ配列１８’の末端に付着した場合、第２のプライマ配列１８の任意の例が使用されてもよい。制限エンドヌクレアーゼ部位１６’が第２のプライマ配列１８’に組み込まれた場合、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’は、第２のプライマ配列１８’の長さに沿って任意の望ましい位置で導入されてもよい。位置は、第２の捕捉プライマ２４’に沿った第２の制限エンドヌクレアーゼ部位の位置、使用されるＩＩＳ型制限酵素の規定の切断距離、及び切断が遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’（又はその増幅産物）に沿って望まれる場所に依存してもよい。この切断は、遺伝子型決定反応の前（本明細書で更に論じられるような直線化の間）に行われ、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’又はその増幅産物を、目的の核酸塩基における標的遺伝子型決定遺伝子座の分析の準備に供する。一例として、遺伝子型決定反応中、一本鎖ＤＮＡ試料、例えば標的遺伝子型決定遺伝子座は、例えば増幅産物にハイブリダイズされ、単一の配列解読（sequencing by synthesis）反応が実施されて、目的の核酸塩基を識別する。この分析を行うために、増幅産物は規定の位置で切断されるべきであり、配列決定される次の核酸塩基は、目的の核酸塩基に相補的である。このようにして、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’は、制限酵素での切断／消化後に、プローブ配列１４の最後の塩基が、配列決定／遺伝子型決定反応に曝露される最終３’ＯＨであるように位置付けられる。一つの例では、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’は、第２のプライマ配列１８’の３’末端より７番目の塩基位置～１５番目の塩基位置のどこにでも組み込むことができる。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’では、第２のプライマ配列１８’は、フローセル２０の表面上に存在する第２の捕捉プライマ２４（図２Ｂ参照）に相補的である。このようにして、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’は、フローセル２０上の第２の捕捉プライマ２４’にハイブリダイズすることができる。

第２の捕捉プライマ２４’はまた、第２の制限エンドヌクレアーゼ部位（図４Ａにおける参照番号４６’を参照されたい）を含んでもよく、第２の制限エンドヌクレアーゼ部位は、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’の制限エンドヌクレアーゼ部位１６’に相補的である。非対称配列は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼに対して感受性であってもよい。ハイブリダイズされた制限エンドヌクレアーゼ部位１６’、４６’のいくつかの所定の距離内での切断は、直線化中に実行される（上述のように、図４Ｆを参照して更に説明される）。これは遺伝子型決定される対象ではない鎖を除去する。第２の制限エンドヌクレアーゼ部位４６’の位置は、２つの制限エンドヌクレアーゼ部位１６’、４６’が、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識部位をハイブリダイズして形成することができる限り、第２の捕捉プライマ２４’の末端にあり得るか、又は第２の捕捉プライマ２４’に組み込まれ得る。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０、１０’のいずれかの例は、オリゴヌクレオチド合成プロセスを用いて調製されてもよい。

フローセル

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０、１０’は、任意のパターン化フローセル２０で使用されてもよい。図示されていないが、本明細書に開示されるクラスタ化の化学を利用する他の非パターン化フローセル（例えば、くぼみを含まない）は、本明細書に開示される実施例において代替的に使用されてもよいことを理解されたい。非パターン化フローセルでは、ソフトウェアを用いてクラスタを識別してもよい。

パターン化フローセル２０の一例を図２Ａに示し、フローセル２０内のパターン化構造の一例を図２Ｂに示す。フローセル２０は、レーン又はフローチャネル３２を少なくとも部分的に画定する基材３０を含む。

基材３０は、単一層／材料であり得る。好適な単一層基材の例としては、エポキシシロキサン、ガラス、改質又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、及びスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、Ｃｈｅｍｏｕｒｓ製のＴＥＦＬＯＮ（登録商標））、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（cyclo-olefin polymer：ＣＯＰ）（例えば、Ｚｅｏｎ製ＺＥＯＮＯＲ（登録商標））、ポリイミドなど）、ナイロン（ポリアミド）、セラミック／セラミック酸化物、シリカ、溶融シリカ、又はシリカ系材料、ケイ酸アルミニウム、ケイ素及び改質ケイ素（例えば、ホウ素ドープｐ＋ケイ素）、窒化ケイ素（Ｓｉ_３Ｎ_４）、酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、五酸化タンタル（Ｔａ_２Ｏ_５）、又は他の酸化タンタル（ＴａＯ_ｘ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ_２）、炭素、金属、無機ガラスなどが挙げられる。

基材３０が単一層である場合、くぼみ３８（図２Ｂを参照）は、単一層に画定される。

図２Ｂに示すように、基材３０はまた、多層基材３０’であってもよい。多層基材３０’のいくつかの例としては、ガラス又はケイ素が挙げられ、その表面に酸化タンタル又は別のセラミック酸化物のコーティング層を有する。多層基材３０’の他の例としては、シリコン・オン・インシュレータ（silicon-on-insulator：ＳＯＩ）基材を挙げることができる。図２Ｂに示される例では、多層基材３０’は、下部支持体３４（例えば、ガラス又はケイ素）と、支持体３４上に位置付けられたパターン化材料３６とを含む。

パターン化材料３６は、隙間領域４０によって分離されたくぼみ３８を画定する。くぼみ３８は、フローチャネル（複数可）３２の各々の内に位置する。

くぼみ３８及び隙間領域４０を形成するために選択的に堆積、又は堆積及びパターン化され得る任意の材料が、パターン化材料３６に使用され得ることを理解すべきである。

一つの例として、無機酸化物は、蒸着、エアロゾル印刷、又はインクジェット印刷を介して支持体３４に選択的に適用され得る。好適な無機酸化物の例としては、酸化タンタル（例えば、Ｔａ_２Ｏ_５）、酸化アルミニウム（例えば、Ａｌ_２Ｏ_３）、酸化ケイ素（例えば、ＳｉＯ_２）、酸化ハフニウム（例えば、ＨｆＯ_２）などが挙げられる。

別の例として、樹脂は支持体３４に適用された後、パターン化され得る。好適な堆積技術としては、化学蒸着、ディップコーティング、ダンクコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング、パドル分配、超音波スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷などが挙げられる。好適なパターン化技術としては、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ（nanoimprint lithography：ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術などが挙げられる。好適な樹脂のいくつかの例としては、多面体オリゴマーシルセスキオキサンベースの樹脂（例えば、Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ製のＰＯＳＳ（登録商標））、非多面体オリゴマーシルセスキオキサンエポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂（例えば、開環エポキシ）、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、メタクリレート樹脂、アモルファスフルオロポリマー樹脂（例えば、ＢｅｌｌｅｘからのＣＹＴＯＰ（登録商標））、及びそれらの組合せが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「多面体オリゴマーシルセスキオキサン」という用語は、シリカ（ＳｉＯ_２）とシリコーン（Ｒ_２ＳｉＯ）との間のハイブリッド中間体（例えば、ＲＳｉＯ_１．５）である化学組成物を指す。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの一例は、Ｋｅｈａｇｉａｓら、「Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」第８６巻（２００９年）第７７６～７７８頁に記載されているものであり得、これは、参照によりその全体が組み込まれる。一例では、組成物は、化学式［ＲＳｉＯ_３／２］_ｎを有する有機ケイ素化合物であり、式中、Ｒ基は同じであっても異なってもよい。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例示的なＲ基としては、エポキシ、アジド（azide）／アジド（azido）、チオール、ポリ（エチレングリコール）、ノルボルネン、テトラジン、アクリレート、及び／若しくはメタクリレート、又は更に、例えば、アルキル、アリール、アルコキシ、及び／若しくはハロアルキル基が挙げられる。本明細書に開示される樹脂組成物は、モノマー単位として１つ以上の異なるケージ又はコア構造を含み得る。

一例では、基材３０、３０’は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径を有する円形ウェーハ、又は最大約１０フィート（約３メートル）の最大寸法を有する長方形シート若しくはパネルを用いて、製作することができる。一例では、基材３０、３０’は、約２００ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径を有する円形ウェーハを用いて製作される。別の例では、３００ｍｍの円形ウェーハよりも大きな表面積を有する、長方形の支持体であるパネルを使用してもよい。ウェーハ、パネル、及び他の大きな基材材料は、個々のフローセル基材３０、３０’にダイシングされてもよい。別の例では、基材３０、３０’は、約０．１ｍｍ～約１０ｍｍの範囲の幅を有するダイである。例示的な寸法を提示しているが、任意の好適な寸法を有する基材材料を使用して基材３０、３０’を製作してもよいことを理解すべきである。

フローセル２０はまた、フローチャネル３２も含む。いくつかのフローチャネル３２が図２Ａに示されるが、任意の数のチャネル３２がフローセル２０（例えば、単一のチャネル３２、４つのチャネル３２など）に含まれ得ることを理解すべきである。各フローチャネル３２は、２つの結合された構成要素（例えば、基材３０、３０’と蓋、又は２つの基材３０、３０’）の間に画定される領域であり、これは、流体をそこに導入し、そこから除去することができる。各フローチャネル３２は、任意の特定のフローチャネル３２に導入される流体が、任意の隣接するフローチャネル３２に流入しないように、フローチャネル３２ごとに単離されていてもよい。フローチャネル３２に導入される流体のいくつかの例は、反応成分（例えば、標的遺伝子型決定遺伝子座ライブラリ断片、ポリメラーゼなど）、洗浄溶液などを導入することができる。

上述のように、フローチャネル３２は、基材３０、３０’と蓋との間（図示せず）、又は基材３０、３０’と別の基材との間（図示しないが、基材３０、３０’と同様）に画定される。

一例では、蓋又は追加の基材は、例えば隙間領域４０の一部において、基材３０、３０’の少なくとも一部分に結合され得る。蓋又は追加の基材と基材３０、３０’との間に形成される結合は、化学結合、又は機械的結合（例えば、締結具などを使用して）であってもよい。

蓋は、基材３０、３０’に向けられる励起光に対して透過性である任意の材料であり得る。例として、蓋は、ガラス（例えば、ホウケイ酸、溶融シリカなど）、プラスチックなどであり得る。好適なホウケイ酸ガラスの市販の例は、Ｓｃｈｏｔｔ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．から入手可能なＤ ２６３（登録商標）である。好適なプラスチック材料、すなわち、シクロオレフィンポリマーの市販の例は、Ｚｅｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌ．Ｐ．から入手可能なＺＥＯＮＯＲ（登録商標）製品である。

蓋又は追加の基材は、レーザー結合、拡散結合、陽極結合、共晶結合、プラズマ活性化結合、ガラスフリット結合、又は当該技術分野において公知の他の方法などの任意の好適な技術を使用して、基材３０、３０’に結合され得る。一例では、スペーサ層は、蓋又は追加の基材を基材３０、３０’に結合するために使用され得る。スペーサ層は、基材３０、３０’の少なくとも一部と、蓋又は追加の基材とを一緒に封止する任意の材料であり得る。いくつかの例では、スペーサ層は、結合を助ける放射線吸収材料であり得る。

一例では、フローチャネル３２は長方形の構成を有する。フローチャネル３２の長さ及び幅は、それぞれ、基材３０、３０’の長さ及び幅よりも小さくてもよく、その結果、フローチャネル３２を取り囲む基材表面の一部分は、蓋（図示せず）又は別の基材３０、３０’への付着に利用可能である。場合によっては、各フローチャネル３２の幅は、少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約２．５ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍ、又はそれ以上であり得る。場合によっては、各レーン／フローチャネル３２の長さは、少なくとも約１０ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約５０ｍｍ、少なくとも約１００ｍｍ、又はそれを超え得る。各フローチャネル３２の幅及び／又は長さは、上で指定された値よりも大きいか、より小さいか、又はそれらの間であり得る。別の例では、フローチャネル３２は正方形（例えば、１０ｍｍ×１０ｍｍ）である。

各フローチャネル３２の深さは、例えば、マイクロコンタクト、エアロゾル、又はインクジェット印刷を使用してフローチャネル壁部を画定するスペーサ層を堆積させる場合、単一層の厚さと同程度に小さいものであり得る。フローチャネル３２の深さは、例えば、フローチャネル３２が基材３０、３０’内に部分的に画定される場合（例えば、エッチング、リソグラフィなどを介する）、基材及びスペーサ層の一部分がフローチャネル壁を画定するように、より大きくてもよい。他の例では、各フローチャネル３２の深さは、約１μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。一例では、深さは、約１０μｍ～約１００μｍの範囲であり得る。別の例では、深さは、約１０μｍ～約３０μｍの範囲であり得る。更に別の例では、深さは、約５μｍ以下である。各フローチャネル３２の深さは、上で指定された値よりも大きいか、小さいか、又はそれらの間であり得ることを理解すべきである。

ここで特に図２Ｂを参照すると、フローセル２０のフローチャネル３２のうち１つの内の構造の一例が示されている。

図２Ｂに示されるように、パターン化材料３６は、内部に画定されるくぼみ３８と、隣接するくぼみ３８を分離する隙間領域４０とを含む。規則的、繰り返し、及び非規則的なパターンを含む、くぼみ３８の多くの異なるレイアウトが想定され得る。一例では、くぼみ３８は、密なパッキング及び改善された密度のために六角形グリッドに配置される。他のレイアウトは、例えば、長方形のレイアウト、三角形のレイアウトなどを含んでもよい。いくつかの例では、レイアウト又はパターンは、行及び列をなしているくぼみ３８のｘ－ｙ形式であり得る。他のいくつかの例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ３８及び／又は隙間領域４０の繰り返し配置であり得る。更に他の例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ３８及び／又は隙間領域４０のランダムな配置であり得る。パターンは、ストライプ、渦巻き、線、三角形、長方形、円、円弧、格子柄、対角線、矢印、正方形、及び／又は網目模様を含んでもよい。

くぼみ３８のレイアウト又はパターンは、規定の面積内のくぼみ３８の密度（くぼみ３８の数）に関して特徴付けてもよい。例えば、くぼみ３８は、１ｍｍ^２あたり、およそ２００万の密度で存在してもよい。密度は、例えば、おおよそで、１ｍｍ^２あたり約１００、１ｍｍ^２あたり約１，０００、１ｍｍ^２あたり約１０万、１ｍｍ^２あたり約１００万、１ｍｍ^２あたり約２００万、１ｍｍ^２あたり約５００万、１ｍｍ^２あたり約１０００万、又は１ｍｍ^２あたり約５０００万の密度を含む、異なる密度に調整され得る。パターン化材料３６のくぼみ３８の密度は、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間にあり得ることを更に理解すべきである。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満で分離されたくぼみ３８を有するものとして特徴付けられ得、中密度アレイは、約４００ｎｍから約１μｍ分離されたくぼみ３８を有するものとして特徴付けられ得、低密度アレイは、約１μｍを超えて分離されたくぼみ３８を有するものとして特徴付けられ得る。密度の例が提供されるが、任意の好適な密度を使用できることを理解すべきである。くぼみ３８の密度は、くぼみ３８の深さに部分的に依存してもよい。場合によっては、くぼみ３８間の間隔が、本明細書に記載された例よりも更に大きいことが望ましい場合がある。

くぼみ３８のレイアウト又はパターンはまた、又は代替的に、平均ピッチ、又はくぼみ３８の中心から隣接するくぼみ３８の中心までの間隔（中心間の間隔）、又は１つのくぼみ３８の左端から隣接するくぼみ３８の右端までの間隔（端から端までの間隔）に関して特徴付けられ得る。パターンは、平均ピッチ周辺の変動係数が小さくなるように規則的である場合もあれば、パターンが不規則である場合もあり、その場合、変動係数は比較的大きくなる可能性がある。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、おおよそで約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、又は約１００μｍであってもよい。くぼみ３８の特定のパターンの平均ピッチは、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間であり得る。一例では、くぼみ３８は、約１．５μｍのピッチ（中心間の間隔）を有する。平均ピッチ値の例が提供されるが、他の平均ピッチ値も使用され得ることを理解すべきである。

各くぼみ３８のサイズは、その容積、開口部の面積、深さ、及び／又は直径によって特徴付けられ得る。

各くぼみ３８は、流体を閉じ込めることができる任意の容積を有し得る。最小又は最大の容積は、例えば、フローセル２０の下流での使用に予想されるスループット（例えば、多重度）、解像度、ヌクレオチド、又は分析物の反応性に対応するように選択され得る。例えば、容積は、少なくとも約１×１０－^３μｍ^３、少なくとも約１×１０－^２μｍ^３、少なくとも約０．１μｍ^３、少なくとも約１μｍ^３、少なくとも約１０μｍ^３、少なくとも約１００μｍ^３、又はそれ以上であり得る。あるいは、又は更に、容積は、最大で約１×１０^４μｍ^３、最大で約１×１０^３μｍ^３、最大で約１００μｍ^３、最大で約１０μｍ^３、最大で約１μｍ^３、最大で約０．１μｍ^３、又はそれ以下であり得る。

各くぼみの開口部が占める面積は、上記の容積についてと同様の基準に基づいて選択され得る。例えば、各くぼみの開口部の面積は、少なくとも約１×１０^－３μｍ^２、少なくとも約１×１０^－２μｍ^２、少なくとも約０．１μｍ^２、少なくとも約１μｍ^２、少なくとも約１０μｍ^２、少なくとも約１００μｍ^２、又はそれ以上であり得る。あるいは、又は更に、面積は、最大で約１×１０^３μｍ^２、最大で約１００μｍ^２、最大で約１０μｍ^２、最大で約１μｍ^２、最大で約０．１μｍ^２、最大で約１×１０^－２μｍ^２、又はそれ以下であり得る。各くぼみの開口部が占める面積は、上記の値よりも大きいか、小さいか、又はそれらの間であり得る。

各３８の深さは、高分子ヒドロゲル４２の一部を収容するのに充分な大きさであり得る。一例では、深さは、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。あるいは、又は更に、深さは、最大で約１×１０^３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、又はそれ以下であり得る。いくつかの例では、深さは約０．４μｍである。各くぼみ３８の深さは、上で示された値よりも大きいか、それよりも小さいか、又はそれらの間であり得る。

場合によっては、各くぼみ３８の直径又は長さ及び幅は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。あるいは、又は更に、直径又は長さ及び幅は、最大で約１×１０^３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、最大で約１μｍ、最大で約０．５μｍ、最大で約０．１μｍ、又はそれ以下（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。いくつかの例では、直径又は長さ及び幅は約０．４μｍである。各くぼみ３８の直径又は長さ及び幅は、上で指定された値よりも大きいか、小さいか、又はそれらの間であり得る。

図２Ｂに示す例では、高分子ヒドロゲル４２は、くぼみ３８の各々の中に位置付けられる。高分子ヒドロゲル４２の一例としては、アクリルアミドコポリマー、例えば、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミドペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド、ＰＡＺＡＭが挙げられる。ＰＡＺＡＭ及び他のいくつかの形態のアクリルアミドコポリマーは、次の構造（Ｉ）で表される。

（式中、
Ｒ^Ａは、アジド、任意選択で置換アミノ、任意選択で置換アルケニル、任意選択で置換アルキン、ハロゲン、任意選択で置換ヒドラゾン、任意選択で置換ヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意選択で置換テトラゾール、任意選択で置換テトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、サルフェート、及びチオールからなる群から選択され、
Ｒ^ＢはＨ又は任意選択で置換アルキルであり、
Ｒ^Ｃ、Ｒ^Ｄ、及びＲ^Ｅは、各々、Ｈ及び任意選択で置換アルキルからなる群から独立して選択され、
－（ＣＨ_２）_ｐ－の各々は、任意選択で置き換えられ得、
ｐは１～５０の範囲の整数であり、
ｎは１～５０，０００の範囲の整数であり、及び
ｍは、１～１００，０００の範囲の整数である）。

当業者は、構造（Ｉ）において繰り返される「ｎ」及び「ｍ」個の特徴部の配置が代表的なものであり、モノマーサブユニットがポリマー構造（例えば、ランダム、ブロック、パターン化、又はそれらの組み合わせ）中に任意の順序で存在し得ることを認識する。

ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーの分子量は、約５ｋＤａ～約１５００ｋＤａ若しくは約１０ｋＤａ～約１０００ｋＤａの範囲であり得、又は、特定の例では約３１２ｋＤａであり得る。

いくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは線状ポリマーである。他のいくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは、軽度に架橋されたポリマーである。

他の例では、高分子ヒドロゲル４２は、構造（Ｉ）の変形であってもよい。一つの例では、アクリルアミド単位はＮ，Ｎージメチルアクリルアミド

で置き換えられ得る。この例では、構造（Ｉ）のアクリルアミド単位は

で置き換えられてもよく、式中、Ｒ^Ｄ、Ｒ^Ｅ、及びＲ^Ｆは、各々Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ^Ｇ及びＲ^Ｈは、各々Ｃ１～Ｃ６アルキルである（アクリルアミドの場合のようにＨではない）。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。別の例では、アクリルアミド単位に加えて、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドが使用され得る。この例では、構造（Ｉ）は繰り返す「ｎ」及び「ｍ」個の特徴部に加えて

を含み得、式中、Ｒ^Ｄ、Ｒ^Ｅ、及びＲ^Ｆは、各々Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ^Ｇ及びＲ^Ｈは、各々Ｃ１～Ｃ６アルキルである。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。

高分子ヒドロゲル４２の別の例として、構造（Ｉ）における繰り返す「ｎ」個の特徴部は、構造（ＩＩ）、

（式中、Ｒ^１はＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ_２はＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｌは、炭素、酸素、及び窒素からなる群から選択される２～２０個の原子と、炭素上の１０個の任意選択の置換基及び鎖中の任意の窒素原子を有する線状鎖を含むリンカであり、Ｅは、炭素、酸素、及び窒素からなる群から選択される１～４個の原子を含む線状鎖であり、その線状鎖中の炭素原子及び任意の窒素原子上に任意選択の置換基を含み、Ａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ４アルキルがＮに結合したＮ置換アミドであり、Ｚは窒素含有複素環である）を有する複素環式アジド基を含むモノマーで置き換えられ得る。Ｚの例としては、単環式構造又は縮合構造として存在する５～１０員環が挙げられる。Ｚのいくつかの特定の例としては、ピロリジニル、ピリジニル、又はピリミジニルが挙げられる。

更に別の例として、高分子ヒドロゲル４２は、構造（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）、

（式中、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^１ｂ及びＲ^２ｂの各々は、水素、任意選択では置換アルキル又は任意選択では置換フェニルから独立して選択され、Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂの各々は、水素、任意選択で置換アルキル、任意選択で置換フェニル、又は任意選択で置換Ｃ７～Ｃ１４アラルキルから独立して選択され、Ｌ^１及びＬ^２の各々は、任意選択で置換アルキレンリンカ又は任意選択で置換ヘテロアルキレンリンカから独立して選択される）の各々の繰り返し単位を含んでもよい。

捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’をグラフトするように官能化されるものである限り、その他の分子を使用して、高分子ヒドロゲル４２を形成することもできることを理解すべきである。好適なポリマー層の他の例としては、アガロースなどのコロイド構造、又はゼラチンなどのポリマーメッシュ構造、又はポリアクリルアミドポリマー及びコポリマー、シランフリーアクリルアミド（silane free acrylamide：ＳＦＡ）、又はアジド分解バージョンのＳＦＡなどの架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。好適なポリアクリルアミドポリマーの例は、アクリルアミドとアクリル酸若しくはビニル基を含むアクリル酸とから、又は［２＋２］光付加環化反応物を形成するモノマーから合成され得る。好適な高分子ヒドロゲル４２の更に他の例としては、アクリルアミドとアクリレートとの混合コポリマーが挙げられる。本明細書に開示される実施例では、星状ポリマー、星型又は星状ブロックポリマー、デンドリマーなどを含む分岐ポリマーなど、アクリルモノマー（例えば、アクリルアミド、アクリレートなど）を含む様々なポリマー構造が利用され得る。例えば、モノマー（例えば、アクリルアミドなど）は、ランダム又はブロックのいずれかで、星型ポリマーの分岐（アーム）に組み込まれ得る。

高分子ヒドロゲル４２をフローチャネル３２内に導入するために、高分子ヒドロゲル４２の混合物が生成され、次いで基材３０、３０’（くぼみ３８を含む）に適用され得る。一つの例では、高分子ヒドロゲル４２は、混合物状態で（例えば、水と共に又はエタノール及び水と共に）存在し得る。混合物は、次いで、スピンコーティング、又は浸漬若しくはディップコーティング、スプレーコーティング、又は陽圧若しくは陰圧下での材料の流れ、又は別の好適な技術を使用して、基材表面（くぼみ３８に含まれる）に適用してもよい。これらの種類の技術は、基材３０、３０’上に（例えば、くぼみ３８内に及びくぼみ３８を取り囲む隙間領域４０上に）全面を覆うように高分子ヒドロゲル４２を堆積させる。他の選択的堆積技術（例えば、マスク、制御された印刷技術などを伴う）は、くぼみ３８内で高分子ヒドロゲル４２を特異的に堆積させ、隙間領域４０上では堆積させないようにに使用されてもよい。

いくつかの例では、基材表面（くぼみ３８において曝露される部分を含む）が活性化されてもよく、次いで、混合物（高分子ヒドロゲル４２を含む）がそれに適用されてもよい。一つの例では、シラン又はシラン誘導体（例えば、ノルボルネンシラン）は、蒸着、スピンコーティング、又は他の堆積方法を使用し、基材表面に堆積され得る。別の例では、基材表面をプラズマ灰化に曝露して、高分子ヒドロゲル４２に接着し得る界面活性化剤（例えば、－ＯＨ基）を生成させることができる。

高分子ヒドロゲル４２に応じて、適用された混合物は、硬化プロセスに曝露され得る。一例では、硬化は、室温（例えば、約１８℃～約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間にわたって行ってもよい。

いくつかの例では、次いで、くぼみ３８の周囲の隙間領域４０から高分子ヒドロゲル４２を除去するために研磨を実行し、一方で、くぼみ３８内の表面上に高分子ヒドロゲル４２を少なくとも実質的に無傷のまま残すことができる。

フローセル２０また、第１及び第２の捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’を含む。本明細書に記載の捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’の任意の例を使用してもよい。特定のフローセル２０に対して選択される捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’のセットは、部分的には、どの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０、１０’がそれで使用されるべきかに依存してもよい。

グラフトプロセスを実行して、くぼみ３８内の高分子ヒドロゲル４２に第１及び第２の捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’をグラフトしてもよい。一例では、第１及び第２の捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’は、第１及び第２の捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’の各々の５’末端又はその近傍における一点共有結合によって、高分子ヒドロゲル４２に固定化され得る。この付着は、（ｉ）プライマ配列特異的部分の同族プライマ配列１２又はコピーされたプライマ配列Ｃ_１８、Ｃ_１８’に自由にアニーリングする、捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’のプライマ配列特異的部分、及び（ｉｉ）捕捉プライマ伸長を自由にさせる、３’ヒドロキシル（ＯＨ）基、を残す。任意の好適な共有結合は、第１及び第２の捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’を、高分子ヒドロゲル４２に付着させるために使用してもよい。使用され得る末端プライマの例としては、高分子ヒドロゲル４２のアジド部分に付着し得るアルキン末端プライマが挙げられる。上述のように、好適な捕捉プライマ２２、２４の特定の例としてはＰ５及びＰ７プライマが挙げられ、好適な捕捉プライマ２４’の特定の例は、第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように修飾されているＰ７である。

一例では、グラフトは、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合された又は恒久的に結合された蓋若しくは追加の基材を使用）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、パドル分配を伴ってもよく、又は捕捉プライマ（複数可）２２、２４又は２２、２４’を高分子ヒドロゲル４２に付着させる別の好適な方法によるものを伴ってもよい。これらの例示的な技術の各々は、捕捉プライマ（複数可）２２、２４又は２２、２４’、水、緩衝液、及び触媒を含み得る、プライマ溶液又は混合物を利用してもよい。グラフト方法のいずれかを用いると、捕捉プライマ（複数可）２２、２４又は２２、２４’は、くぼみ３８内の高分子ヒドロゲル４２の反応性基と反応し、周囲の隙間領域４０に対して親和性を有しない。このようにして、捕捉プライマ（複数可）２２、２４又は２２、２４’は、くぼみ３８内の高分子ヒドロゲル４２に選択的にグラフトする。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチドを伴う方法

本明細書に開示される方法の例は、全般的に、遺伝子型決定プローブ流体を、個々のくぼみ３８、及び個々のくぼみ３８の各々における第１及び第２の捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’を含むフローセル２０に導入することであって、この遺伝子型決定プローブ流体が、複数の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０又は１０’を含み、それによって、それぞれの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０又は１０’が、個々のくぼみ３８の少なくともいくつかにおいて反応して、それぞれの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０又は１０’から増幅産物のそれぞれのクローン集団を産生する、導入することと、増幅産物を直線化してプローブテンプレートを産生することと、プローブテンプレートの少なくとも１つのプローブ識別セクションを配列決定して、プローブ配列の各々を識別することと、プローブテンプレートから少なくともそれぞれの新生鎖を除去することであって、これによって、プローブテンプレートの末端にある３’ＯＨ基が曝露される、除去することと、それぞれの試料をプローブテンプレートにハイブリダイズすることと、曝露した３’ＯＨ基で試料のそれぞれの遺伝子型決定反応を実行することと、を含む。

方法の例では、フローセル２０は、システム（図示せず）中に導入されてもよく、これは、流体制御システム（例えば、ポンプ、弁など）と流体連通し、照明システム及び検出システムと光通信状態にある。

図３Ａ～図３Ｈは、一緒に、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０を伴う方法の一例を示す。

図３Ａは、それに付着した第１及び第２の捕捉プライマ２２、２４を有する高分子ヒドロゲル４２を含む、フローセル２０の１つのくぼみ３８を示す。本明細書に記載されるように、第２の捕捉プライマ２４は、切断部位４６を含む。

図３Ｂでは、遺伝子型決定プローブ流体（図示せず）が、フローセル２０（例えば、各フローチャネル３２内に）中に導入される。この例では、遺伝子型決定プローブ流体は、液体キャリア、及び液体キャリア中の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０を含む。遺伝子型決定プローブ流体の液体キャリアは、トリス－ＨＣｌ緩衝液又は０．５×生理食塩水クエン酸ナトリウム（saline sodium citrate：ＳＳＣ）緩衝液などの、任意の好適なハイブリダイゼーション緩衝液であってもよい。いくつかの例では、遺伝子型決定プローブ流体は、複数の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０を含み、各遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０は、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０ごとに異なるプローブ配列１４を含む。この流体では、異なる遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０（固有のプローブ配列１４を各々有する）は、異なるくぼみ３８に送達され得る。

図３Ｂに示すように、１つの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０は、くぼみ３８内に播種される。より具体的には、１つの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の第２のプライマ配列１８は、くぼみ３８内の第２の捕捉プライマ２４のうち１つにハイブリダイズする。

１つの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０が播種された場合、クラスタ生成が直ちに開始されてもよい。他の例では、別個のハイブリダイゼーション（播種）及びクラスタ生成を行ってもよい。クラスタ生成に関与するプロセスを、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、及び図３Ｅに示す。

図３Ｂ中に矢印で表されるように、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０は、ＤＮＡポリメラーゼを用いた３’伸長によって、ハイブリダイズしたプライマからコピーされる。これは、第２の捕捉プライマ２４を介してフローセル表面に付着した増幅産物４４Ａを生成する。増幅産物４４ＡのＣ_１６、Ｃ_１４、Ｃ_１２の標識化セクションは、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼ部位１６、プローブ配列１４、及び第１のプライマ配列１２の相補的コピーである。

元の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０が変性されることで、第２の捕捉プライマ２４を介してくぼみ３８に固定化された増幅産物４４Ａが残る。一本鎖増幅産物４４Ａは、例えば、隣接する相補的な第１の捕捉プライマ２２への第１のプライマ配列コピーＣ_１２のハイブリダイゼーションによって、反転して架橋を形成する。これを図３Ｃに示す。図３Ｃ中に矢印で表されるように、ハイブリダイズしたプライマ（第１の捕捉プライマ２２）は、次いで、ポリメラーゼ（複数可）によって伸長されて、別の増幅産物４４Ｂを形成する。増幅産物４４ＢのセクションＣＣ_１６、ＣＣ_１４は、セクションＣ_１６、Ｃ_１４の相補的コピーであり、したがって、それぞれ元の制限エンドヌクレアーゼ部位１６及びプローブ配列１４と同じ配列を有する。増幅産物４４ＢのセクションＣ_２４は、第２の捕捉プライマ２４の相補的コピーであり、したがって、第２のプライマ配列１８と同じ配列を有する。図３Ｃに示すように、増幅産物４４Ｂの形成は、増幅産物４４Ａ及び４４Ｂを含む二本鎖架橋を生成する。

二本鎖架橋は、次いで、図３Ｄに示すように変性される。これにより、フローセル２０に共有結合している２つのコピー（増幅産物４４Ａ及び４４Ｂ）が得られる。等温架橋増幅又は他の何らかの他の形態の増幅は、固定化されたコピーを増幅する。例えば、コピーされたテンプレートはループオーバして、隣接する相補的な捕捉プライマ２２、２４にハイブリダイズし、ポリメラーゼはコピーされたテンプレートをコピーして二本鎖架橋を形成し、これは変性して２本の一本鎖を形成する。これら２本の鎖は、ループオーバして隣接する相補的な捕捉プライマ２２、２４にハイブリダイズし、再度伸長して、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって各テンプレートコピーに対して繰り返して、二本鎖架橋の密集したクローンクラスタを作り出す。２つの二本鎖架橋を含む、簡略化されたクラスタを図３Ｅに示す。

それぞれのくぼみ３８におけるそれぞれの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の播種、及びそれぞれのくぼみ３８におけるそのような遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の増幅は、増幅速度が播種速度を超える条件下において行われ得ることを理解されたい。このようにして、１つの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０が播種されたくぼみ３８内でコピー（増幅産物４４Ａ、４４Ｂ）を作製する、比較的急速な速度は、増幅のためのそのくぼみ３８内における播種から、第２の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０を効果的に除外する。このようにして、異なる遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０（固有のプローブ配列１４を有する）は、くぼみ３８の各々において捕捉及び増幅され得、これは、複数の異なる標的遺伝子型決定遺伝子座を、フローセル２０上で同時に分析することを可能にする。

架橋増幅産物４４Ａ、４４Ｂの直線化は、第２の捕捉プライマ２４のそれぞれの切断部位４６において第２の捕捉プライマ（例えば、増幅産物４４Ａ）に付着した増幅産物を切断することと、第２の捕捉プライマ２４に付着した増幅産物（例えば、増幅産物４４Ａ）の切断部分を変性し、プローブテンプレート４８を産生するすることとによって行ってもよい（図３Ｆ）。

切断を開始するために、切断剤を、例えば投入ポート（図示せず）を介してフローセル２０に導入してもよい。選択される切断剤は、第２の捕捉プライマ２４の切断部位４６に依存するであろう。切断剤は、切断部位４６に応じて、化学的切断剤又は酵素的切断剤であってもよい。切断部位４６における切断は、第２の捕捉プライマ２４と増幅産物配列の残り（セクションＣ_１６、Ｃ_１４、及びＣ_１２、又はセクションＣ_１６、Ｃ_１４、及びＣ_２２（捕捉プライマ２２の相補的なコピーである）を含む）との間で、増幅産物４４Ａを切断する。

切断の結果として、セクションＣ_１６、Ｃ_１４、及びＣ_１２、並びにセクションＣ_１６、Ｃ_１４、及びＣ_２２は、プライマ２４を介してフローセル表面にもはや付着しておらず、したがって、変性を介して除去することができる。変性は任意の好適な条件を用いて行われてもよい。セクションＣ_１６、Ｃ_１４、及びＣ_１２、並びにセクションＣ_１６、Ｃ_１４、及びＣ_２２の除去は、第１の捕捉プライマ２２を通してフローセル表面に付着し、第２の捕捉プライマ２４に（セクションＣ_２４を通して）ハイブリダイズした、増幅産物４４Ｂを残す。この例では、増幅産物４４Ｂの曝露した一本鎖部分、具体的にはセクションＣＣ_１６及びＣＣ_１４は、プローブテンプレート４８を構成する。セクションＣＣ_１４はセクションＣ_１４の相補的なコピーであり、したがって、プローブ配列１４と同じ配列を有する。このセクションＣＣの配列決定_１４は、元のプローブ配列１４を識別／デコードすることができる。場合によっては、セクションＣＣ_１４の一部分は、元のプローブ配列を識別又はデコードするように配列決定されてもよい。セクションＣＣ_１６はセクションＣ_１６の相補的なコピーであり、したがって、制限酵素部位１６と同じ配列を有する。配列決定される場合、ＣＣ_１６及びＮ_１６（図３Ｇ）を含む二本鎖セクションは、制限酵素切断のための基材を提供する。

切断及び変性後、各第２の捕捉プライマ２４は、追加の処理の前に除去される必要があるその末端に３’リン酸を有してもよい。３’リン酸は、第２の捕捉プライマ２４を脱保護するキナーゼを導入することによって除去され、（図３Ｇを参照して記載されるように）配列決定プライマとしての使用に好適な場合がある。

図３Ｇは、セクションＣＣ_１６及びＣＣ_１４を含むプローブテンプレート４８の配列決定を示し、後者は、少なくとも１つのプローブ識別セクションである。

示されている例では、プローブテンプレート４８を配列決定することは、配列決定プライマとして第２の捕捉プライマ２４を使用することと、プローブテンプレート４８に沿って塩基伸長反応（一度に１塩基）を実施することとを伴う。

別の例では、セクションＣ_２４及び第２の捕捉プライマ２４が変性されてもよく、別個の配列決定プライマ（溶液中にある）が添加されてもよい。別個の配列決定プライマは、セクションＣ_２４にハイブリダイズしてもよく、塩基伸長反応（一度に１塩基）は、プローブテンプレート４８に沿って行われる。

配列決定の基礎となる化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリメラーゼベースのプロセスにおいて、第２の捕捉プライマ２４に添加したヌクレオチドの順序及び種類の検出を実行することができるように、蛍光標識化ヌクレオチドを、テンプレート依存形式で、第２の捕捉プライマ２４に添加する。これにより、プローブ識別セクションの配列、例えばセクションＣＣ_１４を決定することができ、これは、元のプローブ配列１４をデコードするために使用することができる。

第１の配列決定サイクルを開始するために、１つ以上の標識化ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、フローセル２０などの中に／中を通して送達してもよく、配列決定プライマの伸長によって、標識化ヌクレオチドはプローブテンプレート４８に組み込まれる。この組込みは、画像化事象によって検出することができる。画像化事象中、照明システムが、フローセル２０に励起光を提供してもよい。

いくつかの例では、蛍光標識化ヌクレオチドは、ヌクレオチドがテンプレート４８に添加されると更なるプライマ伸長を停止させる可逆的停止特性を更に含むことができる。例えば、可逆的ターミネータ部分を有するヌクレオチド類似体は、その部分を除去するためにブロック解除剤が送達されるまで、その後の伸長が起こり得ないように、テンプレート４８に添加され得る。したがって、可逆的停止を使用する例では、ブロック解除試薬を、フローセル２０などに送達することができる（検出が行われた後）。

洗浄（複数可）は、様々な流体送達工程の間で行ってもよい。次いで、配列決定サイクルをｎ回繰り返して、ｎ個のヌクレオチドによってテンプレート４８を伸長して、新生セクションＮ_１６（セクションＣＣ_１６に相補的である）及び新生セクションＮ_１４（セクションＣＣ_１４に相補的である）を含む、新生鎖を生成することができる。

セクションＣＣ_１４の配列決定は新生鎖セクションＮ_１４を提供し、これは、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０の元のプローブ配列１４をデコードするために使用され得る。この情報により、ユーザは、特定のくぼみ３８内で分析される、標的遺伝子型決定遺伝子座を識別することができる（くぼみ３８のテンプレート４８の全てが、同じプローブ識別セクション、例えばＣＣ_１４を有するため）。

セクションＣＣ_１６の配列決定は、新生鎖セクションＮ_１６を提供する。このようにして、この配列決定の例はまた、ＣＣ_１６及びＮ_１６の両方を含む二本鎖セクションを生成し、これは、制限酵素切断のための基材を提供する。

プローブ識別セクション（複数可）を配列決定した後、本方法は、少なくともそれぞれの新生鎖（セクションＮ_１４及びＮ_１６を含む）を、プローブテンプレート４８から除去することであって、それによって、プローブテンプレート４８の末端にある３’ＯＨ基が曝露される、除去することを更に含む。この例では、除去は、新生鎖Ｎ_１４及びＮ_１６の除去よりも多くを伴う。この例では、除去は、制限エンドヌクレアーゼ部位、例えばセクションＣＣ_１６及びＮ_１６を消化することと、セクションＮ_１４を含む残りの新生鎖をプローブテンプレート４８から変性させることとを伴う。

プローブテンプレート４８はセクションＣＣ_１６（制限エンドヌクレアーゼ部位１６と同じ配列を有する）を含み、新生鎖は、セクションＮ_１６（制限エンドヌクレアーゼ部位１６に相補的である）を含む。この二本鎖部分（セクションＣＣ_１６及びＮ_１６）は、適切な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）の基材を作製する。このようにして、制限エンドヌクレアーゼの導入により、制限エンドヌクレアーゼ部位、この実施例においてはセクションＣＣ_１６及びセクションＮ_１６は、消化することができる。本明細書で上述したように、制限酵素は、４塩基カッター制限エンドヌクレアーゼ、５塩基カッター制限エンドヌクレアーゼ、又は６塩基カッター制限エンドヌクレアーゼなどであってもよい。制限酵素は、特定のヌクレオチドにおいてセクションＣＣ_１６、Ｎ_１６を切断し、これは、図３Ｇの星印によって概略的に識別される。この例では、制限エンドヌクレアーゼ部位消化は、第２の捕捉プライマ２４、及びそれに付着したセクションＣＣ_１４を有する第１の捕捉プライマ２２を残し、新生鎖Ｎ_１４は、セクションＣＣ_１４にハイブリダイズする。新生鎖Ｎ_１４は、次いで、セクションＣＣ_１４から変性される。消化及び変性により、セクションＣＣ_１６、及び新生鎖Ｎ_１４、Ｎ_１６を、例えば洗浄工程を介して、くぼみ３８及びフローセル２０から除去することが可能になる。

消化及び変性は、プローブテンプレート４８の残りの末端に３’ＯＨを曝露させる。残りのプローブテンプレートは図３Ｈの参照番号５２に示されている。残りのプローブテンプレート５２は、第１の捕捉プライマ２２及びセクションＣＣ_１４を含み、これは、元のプローブ配列１４と同じであり、したがって、この例では、標的遺伝子型決定遺伝子座５４を有するＤＮＡ試料に相補的である。

標的遺伝子型決定遺伝子座５４を含む変性ＤＮＡ断片の試料は、フローセル２０に導入される。標的遺伝子型決定遺伝子座５４は、複数の標的遺伝子型決定遺伝子座を含むライブラリ流体に含まれてもよく、その少なくともいくつかは、遺伝子型決定される異なる遺伝子座を有する。標的遺伝子型決定遺伝子座は、任意の遺伝子型決定ライブラリ調製技術を用いて、より大きなＤＮＡ試料から調製してもよい。いくつかの遺伝子型決定ライブラリ調製技術は、増幅及び断片化を伴う。他は、断片化なしの増幅を伴う（その例は本明細書で以下に記載される）。このようにして、標的遺伝子型決定遺伝子座５４の任意の１つの種類のいくつかのコピーが、ライブラリ流体中に存在してもよい。

フローセル２０に導入されると、標的遺伝子型決定遺伝子座５４は、くぼみ３８内の残りのプローブテンプレート５２のそれぞれの相補的セクションＣＣ_１４にハイブリダイズする。

次いで、遺伝子型決定反応を行ってもよい。この反応において、残りのプローブテンプレート５２は、本明細書に記載されるような配列決定の１つのサイクルを実行するため、配列決定プライマとして使用される。図３Ｈに示されるように、標的遺伝子型決定遺伝子座５４上の目的の核酸塩基に相補的である、１つの標識化ヌクレオチド５７は、残りのプローブテンプレート５２に組み込まれる。

本明細書の説明は１つのくぼみ３８を対象とし、したがって１つの標的遺伝子型決定遺伝子座５４を遺伝子型決定することを対象とするが、各くぼみ３８は異なるセクションＣＣ_１４を有する異なるプローブテンプレート５２を含むことを理解されたい。このようにして、この方法では、数百～数千～数百万（フローセル２０のくぼみの数に応じる）の異なる遺伝子座を、同時に遺伝子型決定することができる。

図４Ａ～図４Ｈは、一緒に、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’を伴う方法の別の例を示す。

図４Ａは、それに付着した第１及び第２の捕捉プライマ２２、２４’を有する高分子ヒドロゲル４２を含む、フローセル２０の１つのくぼみ３８を示す。本明細書に記載されるように、第２の捕捉プライマ２４’は、第２の制限エンドヌクレアーゼ部位４６’を含む。

図４Ｂでは、遺伝子型決定プローブ流体（図示せず）が、フローセル２０中に（例えば、各フローチャネル３２内に）導入される。この例では、遺伝子型決定プローブ流体は、液体キャリア、及び液体キャリア中の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’を含む。液体キャリアは、本明細書に開示される実施例のいずれかであってもよい。いくつかの例では、遺伝子型決定プローブ流体は、複数の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’を含み、各遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’は、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’ごとに異なるプローブ配列１４を含む。この流体では、異なる遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’（固有のプローブ配列１４を各々有する）は、異なるくぼみ３８に送達され得る。

図４Ｂに示すように、１つの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’は、くぼみ３８内に播種される。より具体的には、１つの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’の第２のプライマ配列１８’及び制限エンドヌクレアーゼ部位１６’は、それぞれ、くぼみ３８の第２の捕捉プライマ２４’及びその制限エンドヌクレアーゼ部位４６’のうち１つにハイブリダイズする。

１つの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’が播種された場合、クラスタ生成が直ちに開始されてもよい。他の例では、別個のハイブリダイゼーション（播種）及びクラスタ生成を行ってもよい。クラスタ生成に関与するプロセスを、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、及び図４Ｅに示す。

図４Ｂ中に矢印で表されるように、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いた３’伸長によって、ハイブリダイズしたプライマからコピーされる。これは、第２の捕捉プライマ２４’を介してフローセル表面に付着した増幅産物４４Ｃを生成する。増幅産物４４ＣのＣ_１４、Ｃ_２８、Ｃ_２６、及びＣ_１２の標識化セクションは、それぞれ、プローブ配列１４、プライミング部位部分２８、インデックス配列部分２６、及び第１のプライマ配列１２の相補的コピーである。

元の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’が変性されることで、第２の捕捉プライマ２４’及び第２の制限エンドヌクレアーゼ部位４６’を介して、くぼみ３８に固定化された増幅産物４４Ｃが残る。一本鎖増幅産物４４Ｃは、例えば、隣接する相補的な第１の捕捉プライマ２２への第１のプライマ配列コピーＣ_１２のハイブリダイゼーションによって、反転して架橋を形成する。これを図４Ｃに示す。

図４Ｃ中に矢印で表されるように、ハイブリダイズしたプライマは、次いで、ポリメラーゼ（複数可）によって伸長されて、別の増幅産物４４Ｄを形成する。増幅産物４４ＤのセクションＣＣ_１４、ＣＣ_２６、ＣＣ_２８は、セクションＣ_１４、Ｃ_２６、Ｃ_２８の相補的コピーであり、したがって、それぞれ元のプローブ配列１４、インデックス配列部分２６、及びプライミング部位部分２８と同じ配列を有する。増幅産物４４ＤのセクションＣ_４６’は、第２の制限エンドヌクレアーゼ部位４６’の相補的コピーであり、したがって、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’の制限エンドヌクレアーゼ部位１６’と同じ配列を有する。増幅産物４４ＤのセクションＣ_２４は、第２の捕捉プライマ２４’の相補的コピーであり、したがって、第２のプライマ配列１８’の同じ配列を有する。図４Ｃに示すように、増幅産物４４Ｄの形成は、フローセル２０に共有結合した増幅産物４４Ｃ及び４４Ｄを含む、二本鎖架橋を生成する。

二本鎖架橋は、次いで、図４Ｄに示すように変性される。これにより、フローセル２０に共有結合している２つのコピー（増幅産物４４Ｃ及び４４Ｄ）が得られる。等温架橋増幅又は他の何らかの他の形態の増幅は、固定化されたコピーを増幅する。例えば、コピーされたテンプレートはループオーバして、隣接する相補的な捕捉プライマ２２、２４’にハイブリダイズし、ポリメラーゼはコピーされたテンプレートをコピーして二本鎖架橋を形成し、これは変性して２本の一本鎖を形成する。これら２本の鎖は、ループオーバして隣接する相補的な捕捉プライマ２２、２４’にハイブリダイズし、再度伸長して、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって各テンプレートコピーに対して繰り返して、二本鎖架橋の密集したクローンクラスタを作り出す。２つの二本鎖架橋を含む、簡略化されたクラスタを図４Ｅに示す。

それぞれのくぼみ３８におけるそれぞれの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’の播種、及びそれぞれのくぼみ３８におけるそのような遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’の増幅は、増幅速度が播種速度を超える条件下において行われ得ることを理解されたい。このようにして、１つの遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’が播種されたくぼみ３８内でコピー（増幅産物４４Ｃ、４４Ｄ）を作製する、比較的急速な速度は、増幅のためのそのくぼみ３８内における播種から、第２の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’を効果的に除外する。このようにして、異なる遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’（固有のプローブ配列１４を有する）は、くぼみ３８の各々において捕捉及び増幅され得、これは、複数の異なる標的遺伝子型決定遺伝子座を、フローセル２０上で同時に分析することを可能にする。

この例では、増幅は、制限エンドヌクレアーゼ部位１６’、及び第２の制限エンドヌクレアーゼ部位４６’の相補的コピーＣ_４６’を保護するために、メチル化ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）を用いて実行されてもよい。この修飾は、増幅産物４４Ｃ、４４Ｄを完全にメチル化し、捕捉プライマ２２、２４’（第２の制限エンドヌクレアーゼ部位４６’を含む）をヘミメチル化したままにする。

二本鎖架橋が、次いで、直線化される。直線化は、図４Ｅ及び図４Ｆを参照して説明される。この例示的な方法における架橋増幅産物４４Ｃ、４４Ｄの直線化は、増幅産物４４Ｃ、４４Ｄの制限エンドヌクレアーゼ部分５６を消化して、くぼみ３８内に第２の捕捉プライマ２４’を残すことと、増幅産物４４Ｃ、４４Ｄの残りの部分を変性させて、くぼみ３８内の第１の捕捉プライマ２２及び少なくとも１つのプローブ識別セクションを含む一本鎖プローブテンプレート４９を産生することと、によって実施されてもよい。直線化プロセスの結果を図４Ｆに示す。

この例では、第２の捕捉プライマ２４’の各々が、第２の制限エンドヌクレアーゼ部位４６’を更に含み、この第２の制限エンドヌクレアーゼ部位４６’は、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０’の制限エンドヌクレアーゼ部位１６’に相補的であり、したがってまた、セクションＣ_４６’に相補的である。図４Ｅに示すように、二本鎖架橋は、ハイブリダイズしたセクション４６’、Ｃ_４６’を含み、これは、制限酵素切断のためのそれぞれの基材を提供する。より具体的には、架橋した増幅産物４４Ｃ、４４ＤのハイブリダイズしたセクションＣ_４６’及び４６’は、ＩＩＳ型制限酵素によって認識可能である、制限エンドヌクレアーゼ部分５６を構成する。この例では、制限エンドヌクレアーゼ部分５６の消化は、ＩＩＳ型制限酵素の導入によって達成される。ＩＩＳ型制限酵素は、メチル感受性であってもよく、又はメチル感受性でなくてもよい。メチル化プロトコルは、プローブ配列コピーＣ_１４、ＣＣ_１４の内側の部位を保護し、及び／又は対称的な切断を保護してもよい。ＩＩＳ型制限酵素は、部分５６の非対称ＤＮＡ配列を認識し、部分５６の外側の規定の距離（例えば、１ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド）で切断する。消化は、フローセル２０に付着した第２の捕捉プライマ２４’を残し、また、遺伝子型決定の望ましい位置において増幅産物４４Ｃを切断する。

次いで、増幅産物４４Ｃ、４４Ｄの残りの部分を変性させてもよく、これは、フローセル２０に付着した一本鎖プローブテンプレート４９を残す。図４Ｆに示すように、一本鎖プローブテンプレート４９は、第１の捕捉プライマ２２及び少なくとも１つのプローブ識別セクションを含み、この実施例では、セクションＣＣ_１４、並びにセクションＣＣ_２８及びＣＣ_２６の一部又は全部を含む。

本方法は、第１の一本鎖プローブテンプレート４９の各々の少なくとも１つのプローブ識別セクションに沿って配列決定する前に、第２の捕捉プライマ２４’をブロックすることを更に含んでもよい。これらのプライマ２４’における望ましくない伸長を防止するために第２の捕捉プライマ２４’の曝露した３’末端に付着した、ブロッキング基（例えば、３’リン酸）を添加してもよい。

ここで図４Ｆを参照すると、一本鎖プローブテンプレート４９の少なくとも１つのプローブ識別セクションの配列決定が示されている。この例では、少なくとも１つのプローブ識別セクションはセクションＣＣ_２６であり、これは、インデックス配列決定部分２６と同一である。

少なくとも１つのプローブ識別セクションの配列決定は、セクションＣＣ_２８にハイブリダイズする配列決定プライマ５０を導入することを伴い、これは、プライミング部位部分２８と同一である。この配列決定プライマ５０は、一本鎖プローブテンプレート４９の少なくとも１つのプローブ識別セクション、例えば、ＣＣ_２６を、配列決定の準備に供する。塩基伸長反応を、次いで、セクションＣＣ_２６に沿って行う。

配列決定の基礎となる化学プロセスは、図３Ｇを参照して本明細書に記載されるような、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であり得る。

第１の配列決定サイクルを開始するために、１つ以上の標識化ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、フローセル２０などの中に／中を通して送達してもよく、配列決定プライマの伸長によって、標識化ヌクレオチドは、一本鎖プローブテンプレート４９のセクションＣＣ_２６に沿って形成さる新生鎖Ｎ_２６に組み込まれる。この組込みは、画像化事象によって検出することができる。

いくつかの例では、蛍光標識化ヌクレオチドは、ヌクレオチドが新生鎖Ｎ_２６に添加されると更なるプライマ伸長を停止させる可逆的停止特性を、更に含むことができる。したがって、可逆的停止を使用する例では、ブロック解除試薬を、フローセル２０などに送達することができる（検出が行われた後）。

洗浄（複数可）は、様々な流体送達工程の間で行ってもよい。次いで、配列決定サイクルをｎ回繰り返して、ｎ個のヌクレオチドによって一本鎖プローブテンプレート４９を伸長して、新生セクションＮ_２６（セクションＣＣ_２６に相補的であり、これは、インデックス配列決定部分２６と同じ配列を有する）を含む、新生鎖を生成することができる。

新生鎖Ｎ_２６の配列決定を使用してセクションＣＣ_２６を識別し、したがって、プローブ配列１４（及び、その相補的コピーＣ_１４）に固有である元のインデックス配列決定部分２６を識別することができる。この情報により、ユーザは、特定のくぼみ３８内で分析される、標的遺伝子型決定遺伝子座を識別することができる（くぼみ３８内のテンプレート４９の全てが、同じプローブ識別セクション、例えばＣＣ_２６、及びプローブ配列セクション、例えばＣＣ_１４を有するため）。

プローブ識別セクション（複数可）を配列決定した後、本方法は、少なくともそれぞれの新生鎖（セクションＮ_２６を含む）を一本鎖プローブテンプレート４９から除去することを更に含む。この例では、除去は、配列決定プライマ５０及び新生鎖Ｎ_２６を変性させることを伴う。

標的遺伝子型決定遺伝子座５４を含む一本鎖ＤＮＡ断片の試料は、図４Ｈに示されるように、フローセル２０に導入される。標的遺伝子型決定遺伝子座５４は、複数の標的遺伝子型決定遺伝子座を含むライブラリ流体に含まれてもよく、その少なくともいくつかは、遺伝子型決定される異なる遺伝子座を有する。標的遺伝子型決定遺伝子座は、任意の遺伝子型決定ライブラリ調製技術を用いて、より大きなＤＮＡ試料から調製してもよい。いくつかの遺伝子型決定ライブラリ調製技術は、増幅及び断片化を伴う。他は、本明細書で以下に記載される、断片化なしの増幅を伴う。このようにして、標的遺伝子型決定遺伝子座５４の任意の１つの種類のいくつかのコピーが、ライブラリ流体中に存在してもよい。

フローセル２０に導入されると、標的遺伝子型決定遺伝子座５４は、くぼみ３８内の一本鎖プローブテンプレート４９のそれぞれの相補的セクションＣＣ_１４にハイブリダイズする。

次いで、遺伝子型決定反応を行ってもよい。この反応において、一本鎖プローブテンプレート４９は、本明細書に記載されるような配列決定の１つのサイクルを実行するため、配列決定プライマとして使用される。図４Ｈに示されるように、標的遺伝子型決定遺伝子座５４上の目的の核酸塩基に相補的である、１つの標識化ヌクレオチド５７は、一本鎖プローブテンプレート４９に組み込まれる。

本明細書の説明は１つのくぼみ３８を対象とし、したがって１つの標的遺伝子型決定遺伝子座５４を遺伝子型決定することを対象とするが、各くぼみ３８は、異なるセクションＣＣ_１４を有する異なる一本鎖プローブテンプレート４９を含むことを理解されたい。このようにして、この方法では、数百～数千～数百万（フローセル２０のくぼみの数に応じる）の異なる遺伝子座を、同時に遺伝子型決定することができる。

本明細書に開示される実施例では、配列決定及び／又は遺伝子型決定中に第２の捕捉プライマ２４又は２４’をブロックする代わりに、これらのプライマ２４又は２４’は、遺伝子型決定されるテンプレート４８又は４９に悪影響を及ぼさない切断プロセスを用いて、デコーディング反応に従って切断することができた。

遺伝子型決定ライブラリ調製技術

任意の好適な遺伝子型決定ライブラリ調製技術を使用して、標的遺伝子型決定遺伝子座５４を調製してもよい。

標的遺伝子型決定遺伝子座５４は、ゲノムＤＮＡから調製されてもよい。ゲノムＤＮＡは、１つ以上の細胞、体液、又は組織から単離され得る。任意の好適な方法を使用して、体液（例えば、血液、汗、涙、リンパ液、尿、唾液、***、脳脊髄液、糞便、又は羊水）を得ることができる。いくつかの特定の例としては、口腔スワブ（buccal swab）、マウスウォッシュ、外科的切除、又は吸引生検などが挙げられる。ゲノムＤＮＡはまた、初代培養、増殖された細胞株、固定された保存用試料、法医学試料、又は考古学的試料における１つ以上の細胞又は組織から得ることができる。

ｇＤＮＡは、ＤＮＡを含有する細胞を溶解することによって調製することができる。細胞は、細胞のｇＤＮＡの完全性を実質的に保存する条件下において溶解してもよい。特定の一例では、熱溶解を使用して、細胞を溶解してもよい。別の特定の例では、細胞のアルカリ性ｐＨへの曝露を使用して、ｇＤＮＡへの損傷を比較的わずかにしながら細胞を溶解することができる。例えば水酸化カリウム及び水酸化ナトリウムなどを含む、様々な塩基性化合物のいずれかを、溶解に使用することができる。加えて、比較的損傷していないｇＤＮＡは、細胞壁を分解する酵素によって溶解された細胞から得ることができる。天然又は酵素的除去に起因するかのいずれかである細胞壁を欠く細胞もまた、浸透ストレスへの曝露によって溶解することができる。細胞を溶解するために使用することができる他の条件としては、洗剤への曝露、機械的破壊、超音波処理熱、フレンチプレス装置などの圧力差、又はダウンス型ホモジナイゼーション（Dounce homogenization）が挙げられる。ｇＤＮＡを安定化する剤は、例えば、ヌクレアーゼ阻害剤、キレート剤、塩、及び緩衝剤などを含む、細胞溶解物又は単離されたｇＤＮＡ試料に含まれ得る。

いくつかの例では、ｇＤＮＡを含有する粗細胞溶解物は、ｇＤＮＡを更に単離することなく直接増幅され得る。例えば、血液試料は熱溶解に曝露されてもよく、次いで、粗細胞溶解物は、本明細書に記載の方法を含む任意の好適な方法を用いて増幅されてもよい。あるいは、ｇＤＮＡは、増幅前に、他の細胞構成要素から更に単離され得る。したがって、増幅は、精製又は部分的に精製されたｇＤＮＡ上で行うことができる。ゲノムＤＮＡは、例えば、液相抽出、沈殿、固相抽出、及びクロマトグラフィなどを含む、既知の方法を用いて単離され得る。

増幅された代表的なゲノム断片の集団（標的遺伝子型決定遺伝子座５４）は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）テンプレートを複製して、各コピーされた配列の相対的割合が元のｇＤＮＡにおけるその割合と実質的に同じである、１つ以上のコピーを産生する条件下において、未処理のゲノムを増幅することによって得ることができる。配列非依存性の形式でゲノムＤＮＡを複製する様々な方法のいずれかを使用して、標的遺伝子型決定遺伝子座５４を調製することができる。本明細書に開示される実施例では、二本鎖ゲノムＤＮＡを変性させて、増幅プロセスで使用することができる一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートを生成してもよい。

特定の一例では、増幅方法は、一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートを、低処理能力ポリメラーゼ、複数のプライマ、及び遊離ヌクレオチドと接触させ、それによって、一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートの相補性断片を生成することと、一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートから相補性断片を置き換え、それによって、それぞれの試料のうち少なくともいくつかを生成することと、を伴う。

低処理能力ポリメラーゼは、鎖全体が複製される前に、それらが一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートから自然脱落するため、短鎖を合成することができる。低処理能力ポリメラーゼのいくつかの例は、重合事象あたり１００塩基未満を合成することができる。より短い断片は、増幅条件下において、重合事象あたり５０、４０、３０、２０、１０、又は５塩基未満を合成するポリメラーゼを用いることによって、得ることができる。低処理能力ポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの断片）、Ｋｌｅｎｏｗ断片（大腸菌（Escherichia coli）ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片）、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及び操作されたポリメラーゼからなる群から選択される。この例示的な方法では、「操作されたポリメラーゼ」という用語は、重合事象あたり１００塩基未満を合成するように設計された、任意の合成ポリメラーゼである。他の好適な低処理能力ポリメラーゼとしては、モノマー大腸菌（E. coli）Ｐｏｌ ＩＩＩ（βサブユニットを欠く）又は大腸菌（E. coli）Ｐｏｌ Ｉが挙げられる。

いくつかのポリメラーゼの処理能力は、使用される処理条件によって変化し得る。例えば、処理能力は、反応の温度、反応中の塩（例えば、Ｍｇ^２＋）レベル（例えば、イオン強度）、ｐＨ、緩衝液組成（例えば、クレアチンキナーゼ若しくはｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸））、又はそれらの組合せによって変化し得る。一つの例として、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼは、３７℃未満の温度で低処理能力を有し、また、高いイオン強度、例えば約１００ｍＭを超えるＮａＣｌでも低処理能力を有するが、そうでなければ、高い処理能力を有する。別の例として、Ｔａｑポリメラーゼは、１０倍モル過剰のＤＮＡ試料及びランダムプライマと反応した場合、約７０℃の温度で高い処理能力を有する。別の例では、Ｋｌｅｎｏｗ断片の大腸菌（Escherichia coli）ＤＮＡポリメラーゼ重合は、ｐＨをｐＨ６．２未満に下げることによって遅延させることができる。更に別の例では、ＡファミリＤＮＡポリメラーゼであるＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＳＴポリメラーゼ）の効率は、Ｍｇ＋＋及びＣｄ＋＋などの金属共因子の置換を通じて数倍操作され得る。

プライマは、ランダムプライマであってもよい。ランダムプライマの集団は、アデニン（Ａ）及びチミジン（Ｔ）ヌクレオチドと比較して、より高い含有量のグアニン（Ｇ）及び／又はシトシン（Ｃ）ヌクレオチドを含むように合成することができる。得られたランダムプライマ集団は、ＧＣリッチであり、したがって、ヒトゲノムの遺伝子コード領域などのゲノムの高ＧＣ領域にハイブリダイズする確率がより高く、これは、典型的には、非コードｇＤＮＡ領域よりも高いＧＣ含有量を有する。ランダムプライマの集団におけるプライマはまた、ユニバーサルな尾部などの同一の配列の領域を有し得る。ユニバーサルな尾部は、増幅のためのユニバーサルなプライミング部位を含むことができる。

この例示的な方法では、遊離ヌクレオチドは、デデオキシアデニン三リン酸、デオキシチミン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、及びデオキシシトシン三リン酸などの、任意の天然ヌクレオチドを含んでもよい。

一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートを、低処理能力ポリメラーゼ、複数のプライマ、及び遊離ヌクレオチドと接触させることは、様々な構成要素を一緒に混合することと、使用される低処理能力ポリメラーゼに好適な増幅条件にそれらを曝露することと、を伴ってもよい。増幅中、プライマは、一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートの異なる部分に付着し、低処理能力ポリメラーゼは、テンプレート鎖の配列に従って、相補的な遊離ヌクレオチドをテンプレート鎖に導入する。低処理能力ポリメラーゼは、通常、１００塩基以下が複製された後に、テンプレート鎖から自然脱落する。複製された相補性断片は、例えば、変性を用いて置き換えることができる。本方法は、所定のサイクル数の接触及び置き換えの両方を繰り返して、所定のサイクル数の各々において追加の相補性断片を生成することを含んでもよい。

以下は、この方法のいくつかの例である。

Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、約５０ｍＭのＮ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、約５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、又は約５０ｍＭのグリシネート（ｐＨ９．７）における、一本鎖又は変性ｇＤＮＡの増幅に使用することができる。例示的な反応混合物はまた、約５０ｍＭのＫＣｌ、約５ｍＭのＭｇＣｌ_２、約５ｍＭのジチオスレイトール（dithiothreitol：ＤＴＴ）、約４０μｇ／ｍＬのｇＤＮＡ、約０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、約５０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（bovine serum albumin：ＢＳＡ）、約１００μＭのランダムプライマ（ｎ＝６）、及び３７℃で少なくとも１時間インキュベートした約１０単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを含んでもよい。温度サイクルを使用して、複数回の増幅のために複製鎖を置き換えてもよい。

Ｔａｑポリメラーゼは７０℃未満の温度で低処理能力を有する。したがって、ｇＤＮＡの小さな断片は、低温でＴａｑポリメラーゼを用いることによって、又はＴａｑが低処理能力を有する別の条件において、得ることができる。別の例では、ＴａｑポリメラーゼのＮ末端２８９アミノ酸残基を欠き、７０℃で低処理能力を有するＳｔｏｆｆｅｌ断片を使用して、比較的小さなｇＤＮＡ断片を生成することができる。Ｔａｑ又はＳｔｏｆｆｅｌ断片を使用して、一本鎖又は変性ＤＮＡテンプレートを増幅することができ、温度サイクルを使用して、複数回の増幅のために複製鎖を置き換えることができる。

Ｋｌｅｎｏｗ断片は、例えば約５℃～３７℃の温度でインキュベートされた低塩（Ｉ＝０．０８５）反応において、小さなゲノムＤＮＡ断片を産生するために、ゲノムの等温増幅に使用することができる。Ｋｌｅｎｏｗ断片によりｇＤＮＡを増幅するために使用することができる例示的な緩衝液及びｐＨ条件としては、例えば、約５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、約５ｍＭのＭｇＣｌ_２、約５０ｍＭのＮａＣｌ、約５０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、約０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、約２μｇのランダムプライマ（ｎ＝６）、約１０ｎｇのｇＤＮＡテンプレート、及び３７℃で約１６時間インキュベートした約５単位のＫｌｅｎｏｗ断片が挙げられる。１つ以上の反応成分が省略又は置換されている場合、同様の反応を実施することができる。例えば、緩衝液は、約５０ｍＭのリン酸（ｐＨ７．４）で置き換えてもよく、又は他のｐＨ値が、約７．０～７．８の範囲で使用されてもよい。別の例では、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いる増幅のための条件としては、例えば、約１０ｎｇのｇＤＮＡテンプレート、約２ｍＭのｄＮＴＰ、約１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、約０．５Ｕ／μＬ（マイクロリットル）のポリメラーゼ、約５０ｕＭ（マイクロモル）のランダムプライマ（ｎ＝６）、及び３７℃で１６時間の等温インキュベーションを挙げることができる。

本明細書に開示される増幅方法の別の例は、一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートを、ポリメラーゼ、複数のプライマ、並びに天然ヌクレオチド及びジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）を含む遊離ヌクレオチドの混合物と接触させ、それによって、一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートのトランケートされた相補性断片を生成することと、一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートからトランケートされた相補性断片を置き換え、それによってそれぞれの試料のうち少なくともいくつかを生成することと、を伴う。

この例では、任意の好適なポリメラーゼを使用してもよい。ｄｄＴＴＰはトランケート剤として作用し、したがって、高処理能力ポリメラーゼを使用してもよい。本明細書に記載されるポリメラーゼのいずれかは、ポリメラーゼがより高い処理能力（例えば、重合事象あたり１００塩基超を合成することができる）を呈するように変更され得る限り、この実施例の方法において使用されてもよい。一例では、高処理能力ポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及び操作されたポリメラーゼからなる群から選択される。この例示的な方法では、「操作されたポリメラーゼ」という用語は、重合事象あたり１００塩基超を合成するように設計された、任意の合成ポリメラーゼである。高処理能力ポリメラーゼは、１０ｋｂ（キロベース）～２０ｋｂの長さである断片を産生することができる。他の好適な高処理能力ポリメラーゼとしては、Φ２９ポリメラーゼが挙げられる。

この例では、本明細書に記載のランダムプライマのいずれかを使用してもよい。

この例示的な方法では、混合物中の遊離ヌクレオチドは、天然ヌクレオチド及びジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）を含む。ジデオキシチミジン三リン酸は、合成停止ヌクレオチド又はトランケート剤として機能する。一例では、天然ヌクレオチドは、デオキシアデニン三リン酸、デオキシチミン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、及びデオキシシトシン三リン酸を含む。一例では、遊離ヌクレオチドの混合物は、約１０：５～約１０：０．０１の範囲のデオキシチミン三リン酸（ｄＴＴＰ）とジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）との比を含む。この範囲内の比は、ジデオキシチミン三リン酸が増幅をトランケートする前に、所望の数のデオキシチミジン三リン酸が、生成された断片に組み込まれることを確実にするのに役立つ。特定の一例では、ｄＴＴＰとｄｄＴＴＰとの比は、約１０：１である。

一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートを、ポリメラーゼ、複数のプライマ、及び遊離ヌクレオチド混合物と接触させることは、様々な構成要素を一緒に混合することと、使用されるポリメラーゼの好適な増幅条件にそれらをエクソージング（exosing）することと、を伴ってもよい。増幅中、プライマは、一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートの異なる部分に付着し、ポリメラーゼは、テンプレート鎖の配列に従って、相補的な天然ヌクレオチドをテンプレート鎖に導入する。デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の代わりにジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）を導入した場合、特定の鎖の増幅が停止する。このようにして、ｄｄＴＴＰは、複製されたＤＮＡ断片をトランケートする。混合物中のｄＴＴＰとｄｄＴＴＰとの比は、生成された断片がその後の分析のために充分に長いことを確実にするのに役立つ。

複製されたトランケート相補性断片は、例えば、変性を用いて置き換えることができる。本方法は、所定のサイクル数の接触及び置き換えの両方を繰り返して、所定のサイクル数の各々において追加のトランケートされた相補性断片を生成することを含んでもよい。

緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ、トリス－ＨＣｌ、グリシネートなど）、塩（例えば、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２など）、レドックス試薬（例えば、ジチオスレイトール）、及び／又は安定化剤（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））のいずれかを、この例示的な方法において、高処理能力のために好適な量で使用してもよい。

特定の一例では、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼは、以下の反応条件において高い処理能力を有する：約４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、約１５ｍＭのＭｇＣｌ_２、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約５ｍＭのＤＴＴ、約０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、約０．０００２５ｍＭ～約０．１２５ｍＭのｄｄＴＴＰ、５０μｇ／ｍＬの一本鎖ｇＤＮＡ、約１００μＭのランダムプライマ（ｎ＝６）、約０．５～約１単位のＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、３７℃を超える反応温度。

別の特定の例では、Ｔａｑポリメラーゼは、１０倍モル過剰のＤＮＡ試料及びランダムプライマ（ｎ＝６）と反応した場合、約７０℃の温度で高い処理性を有する。これらの条件下において実行される増幅反応は、約２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（約７のｐＨ）、約１ｍＭ～２ｍＭのＭｇＣｌ_２、約０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、及び約０．０００２ｍＭ～約０．１ｍＭのｄｄＴＴＰなどの緩衝液を更に含み得る。加えて、グリセロール、ゼラチン、ＢＳＡ、又は非イオン性洗剤などの安定化剤を添加することができる。

更に別の特定の例では、Ｋｌｅｎｏｗ断片は、以下の反応条件において高い処理能力を有する：約１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、約１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、約５０ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭのＤＴＴ、及び約１００ｇ／モルのＢＳＡ。

更に別の特定の例では、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、以下の反応条件において高い処理能力を有する：約２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、約１０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、約１０ｍＭのＫＣｌ、約２ｍＭのＭｇＳＯ_４、及び約０．１％の非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ－１００）。

本明細書に開示される増幅プロセスはどちらも、断片化プロセスを使用する必要なく、複数のｇＤＮＡ断片を生成する。一本鎖ｇＤＮＡは、いくつかの標的遺伝子型決定遺伝子座５４のテンプレートとして機能し、各標的遺伝子型決定遺伝子座５４のいくつかの増幅産物が生成される。遺伝子型決定されるテンプレート４８又は４９をフローセル２０上に導入した場合、増幅されたｇＤＮＡ断片（標的遺伝子型決定遺伝子座５４）は、遺伝子型決定されるテンプレート４８又は４９のそれぞれの相補的セクションにハイブリダイズする。

キット

遺伝子型決定ヌクレオチド１０又は１０’及びフローセル２０は、遺伝子型決定キットの一部であってもよい。

一つの例では、キットは、フローセル２０と遺伝子型決定プローブ流体とを含み、フローセル２０が、隙間領域４０によって分離されたくぼみ３８、並びにくぼみ３８の各々の内に付着している第１及び第２の捕捉プライマ２２、２４又は２２、２４’を有する基材３０、３０’を含み、遺伝子型決定プローブ流体が、液体キャリア及び液体キャリア中の遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０又は１０’を含み、遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０又は１０’が、第１のプライマ配列１２、標的遺伝子型決定遺伝子座５４を代表するプローブ配列１４、制限エンドヌクレアーゼ部位１６、１６’、及び第２の捕捉プライマ２４、２４’に少なくとも部分的に相補的である第２のプライマ配列１８、１８’を含む。

キットはまた、全ゲノム試料、ポリメラーゼ（本明細書に定義される低処理能力ポリメラーゼであってもよい）、複数のプライマ、及び遊離ヌクレオチド（天然ヌクレオチドを含むいくつかの例における、及び天然ヌクレオチドとジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）との混合物を含む他の例における）などの、遺伝子型決定ライブラリ調製構成要素を含んでもよい。

遺伝子型決定オリゴヌクレオチド１０又は１０’の任意の例をキットに使用してもよく、フローセル２０の任意の例をキットに使用してもよい。

あるいは、キットは、フローチャネルの表面全体にわたってプライマを有する非パターン化フローセルを含んでもよい。

追記事項

以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念の全ての組み合わせが、（かかる概念が相互に矛盾しない限り）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。

いくつかの実施例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを理解すべきである。したがって、これまでの説明は非限定的なものであると考えるべきである。

Claims (26)

1. フローセルと遺伝子型決定プローブ流体とを含むキットであって、
   前記フローセルが、
   基材、並びに
   前記基材に付着した第１の捕捉プライマ及び第２の捕捉プライマを含み、
   前記遺伝子型決定プローブ流体が、
   液体キャリア、及び
   前記液体キャリア中の遺伝子型決定オリゴヌクレオチドを含み、前記遺伝子型決定オリゴヌクレオチドが、
   第１のプライマ配列、
   標的遺伝子型決定遺伝子座を代表するプローブ配列、
   制限エンドヌクレアーゼ部位、及び
   前記第２の捕捉プライマに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマ配列を含む、キット。
2. 前記遺伝子型決定プローブ流体が、複数の遺伝子型決定オリゴヌクレオチドを含み、各遺伝子型決定オリゴヌクレオチドが、遺伝子型決定オリゴヌクレオチドごとに異なるプローブ配列を含む、請求項１に記載のキット。
3. 前記第２の捕捉プライマが、切断部位を含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載のキット。
4. 前記制限エンドヌクレアーゼ部位が、４塩基カッター（base cutter）制限エンドヌクレアーゼ、５塩基カッター制限エンドヌクレアーゼ、及び６塩基カッター制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、制限エンドヌクレアーゼに感受性である、請求項３に記載のキット。
5. 前記第２の捕捉プライマが、第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を更に含み、前記第２の制限エンドヌクレアーゼ部位が、前記遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの前記制限エンドヌクレアーゼ部位に相補的である、請求項１又は２に記載のキット。
6. 前記制限エンドヌクレアーゼ部位及び前記第２の制限エンドヌクレアーゼ部位が、ＩＩＳ型メチル感受性制限エンドヌクレアーゼに感受性である、請求項５に記載のキット。
7. 前記遺伝子型決定オリゴヌクレオチドが、前記第１のプライマ配列と前記プローブ配列との間にインデックス配列部分、及びプライミング部位部分（priming site portion）を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のキット。
8. 前記基材が、隙間領域によって分離されたくぼみを有し、
   前記第１及び前記第２の捕捉プライマが、前記くぼみの各々の内に付着している、請求項１～７のいずれか一項に記載のキット。
9. 方法であって、
   複数の遺伝子型決定オリゴヌクレオチドを含む遺伝子型決定プローブ流体を、第１の捕捉プライマ及び第２の捕捉プライマを含むフローセルに導入することであって、前記遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの各々が、
   第１のプライマ配列、
   標的遺伝子型決定遺伝子座をそれぞれ代表するプローブ配列、
   制限エンドヌクレアーゼ部位、及び
   前記第２の捕捉プライマに少なくとも部分的に相補的である第２のプライマ配列を含み、
   これによって、それぞれの遺伝子型決定オリゴヌクレオチドが反応して、それぞれの遺伝子型決定オリゴヌクレオチドから、増幅産物のそれぞれのクローン集団を産生する、導入することと、
   前記増幅産物を直線化してプローブテンプレートを産生することと、
   前記プローブテンプレートの少なくとも１つのプローブ識別セクションを配列決定して、前記プローブ配列の各々を識別することと、
   前記プローブテンプレートから少なくともそれぞれの新生鎖を除去することであって、これによって、前記プローブテンプレートの末端にある３’ＯＨ基が曝露される、除去することと、それぞれの試料を前記プローブテンプレートにハイブリダイズすることと、
   前記曝露した３’ＯＨ基で前記試料のそれぞれの遺伝子型決定反応を実行することと、を含む、方法。
10. 前記増幅産物を直線化することが、
    前記第２の捕捉プライマのそれぞれの切断部位で、前記第２の捕捉プライマに付着した前記増幅産物を切断することと、
    前記第２の捕捉プライマに付着した前記増幅産物の切断部分を変性させて、前記プローブテンプレートを産生することと、を伴う、請求項９に記載の方法。
11. 前記プローブテンプレートの前記少なくとも１つのプローブ識別セクションを配列決定することが、配列決定プライマとして前記第２の捕捉プライマを用いて、前記少なくとも１つのプローブ識別セクションに沿って塩基伸長反応を行うことを伴う、請求項１０に記載の方法。
12. 前記プローブテンプレートから少なくともそれぞれの新生鎖を除去することが、
    前記制限エンドヌクレアーゼ部位を消化することと、
    前記プローブテンプレートから残りの新生鎖を変性させることと、を伴う、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第２の捕捉プライマの各々が、第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を更に含み、前記第２の制限エンドヌクレアーゼ部位が、前記遺伝子型決定オリゴヌクレオチドの前記制限エンドヌクレアーゼ部位に相補的であり、前記増幅産物を直線化することが、
    前記増幅産物の制限エンドヌクレアーゼ部分を消化して、第２の捕捉プライマを残すことと、
    前記増幅産物の残りの部分を変性させて、前記第１の捕捉プライマ及び前記少なくとも１つのプローブ識別セクションを含む一本鎖プローブテンプレートを産生することと、を伴う、請求項９に記載の方法。
14. 前記一本鎖プローブテンプレートの前記少なくとも１つのプローブ識別セクション部分を配列決定することが、
    配列決定プライマを導入することと、
    前記一本鎖プローブテンプレートの各々の前記少なくとも１つのプローブ識別セクションに沿って、塩基伸長反応を行うことと、を伴う、請求項１３に記載の方法。
15. 前記一本鎖プローブテンプレートから少なくともそれぞれの新生鎖を除去することが、
    前記少なくとも１つのプローブ識別セクションから前記新生鎖を変性させることと、を伴う、請求項１４に記載の方法。
16. 前記一本鎖プローブテンプレートの各々の前記少なくとも１つのプローブ識別セクションに沿って配列決定する前に、前記第２の捕捉プライマをブロックすることを更に含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 各識別されたプローブ配列を増幅産物のそれぞれのクローン集団と相関させることを更に含む、請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記それぞれの試料を前記プローブテンプレートにハイブリダイズする前に、前記方法が、
    一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートを、低処理能力ポリメラーゼ、複数のプライマ、及び遊離ヌクレオチドと接触させ、それによって前記一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートの相補性断片を生成することと、
    前記一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートから前記相補性断片を置き換え、それによって前記それぞれの試料のうちの少なくともいくつかを生成することと、により、前記それぞれの試料を調製することを更に含む、請求項９～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 二本鎖ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を変性させ、それによって前記一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートを生成することを更に含む、請求項１８に記載の方法。
20. 所定のサイクル数の前記接触及び前記置き換えの両方を繰り返して、前記所定のサイクル数の各々において追加の相補性断片を生成することを更に含む、請求項１８に記載の方法。
21. 前記低処理能力ポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及び操作されたポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
22. 前記それぞれの試料を前記プローブテンプレートにハイブリダイズする前に、前記方法が、
    一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートを、ポリメラーゼ、複数のプライマ、並びに天然ヌクレオチド及びジデオキシチミジン三リン酸を含む遊離ヌクレオチドの混合物と接触させ、それによって前記一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートのトランケートされた相補性断片を生成することと、
    前記一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートから前記トランケートされた相補性断片を置き換え、それによって前記それぞれの試料のうちの少なくともいくつかを生成することと、による、前記それぞれの試料を調製することを更に含む、請求項９～１７のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記天然ヌクレオチドが、デオキシアデニン三リン酸、デオキシチミン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、及びデオキシシトシン三リン酸を含み、前記遊離ヌクレオチドの混合物が、約１０：５～約１０：０．０１の範囲の比のデオキシチミン三リン酸対ジデオキシチミジン三リン酸の比を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 二本鎖ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を変性させ、それによって前記一本鎖ゲノムＤＮＡテンプレートを生成することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
25. 所定のサイクル数の前記接触及び前記置き換えの両方を繰り返して、前記所定のサイクル数の各々において追加のトランケートされた相補性断片を生成することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
26. 前記ポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及び操作されたポリメラーゼからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。

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