ES2960746T3 - Kits de genotipado - Google Patents

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Abstract

Un ejemplo de kit incluye una celda de flujo y un fluido de sonda de genotipado. La celda de flujo incluye un sustrato y un primer y segundo cebadores de captura unidos al sustrato. El fluido de la sonda de genotipado incluye un vehículo líquido y un oligonucleótido de genotipado en el vehículo líquido. El oligonucleótido de genotipado incluye una primera secuencia cebadora; una secuencia de sonda que es representativa de un locus de genotipado objetivo; un sitio de endonucleasa de restricción; y una segunda secuencia de cebador que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Kits de genotipado
ANTECEDENTES
La detección de ácidos nucleicos específicos puede usarse para medicina de diagnóstico e investigación de biología molecular. Los ensayos de sondas génicas pueden ser útiles, por ejemplo, para identificar organismos infecciosos, tales como bacterias y virus, para sondear la expresión de genes normales y mutantes e identificar genes mutantes, tales como oncogenes; para tipificar tejido para compatibilidad que precede al trasplante de tejido; para emparejar muestras de tejido o sangre para medicina forense; y para explorar la homología entre genes de diferentes especies. Hopmans et al. Nucleic Acids Res 2014 Jun; 42 (10): e88 y Myllykangas et al. Nat Biotechnol 23 de octubre de 2011;29 (11): 1024-7 divulga enfoques de secuenciación selectiva de oligonucleótidos, en los que los cebadores unidos a la superficie se extienden usando plantillas de oligonucleótidos específicas de diana, para proporcionar captura específica de diana, y donde los ácidos nucleicos capturados se amplifican en una celda de flujo y luego se secuencian. WO2018/161019 revela un método para seleccionar un parámetro crítico para la secuenciación dirigida directa que incluye hibridar sondas en una biblioteca de sondas de captura con oligonucleótidos unidos a la superficie. Por último, WO2016 / 162309 divulga la modificación de una celda de flujo mediante la introducción de oligonucleótidos de código de barras que están flanqueados por sitios de cebado que coinciden con cebadores de captura, incluyendo el oligonucleótido un sitio de restricción.
SUMARIO
La presente innovación serefiere a un kit y método de genotipado de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. Aquí se revelan oligonucleótidos de genotipado que incluyen secciones de secuencia de nucleótidos específicas diseñadas para tener una función designada en la formación de agrupaciones, linealización, identificación de locus diana y / o secuenciación. Los oligonucleótidos de genotipado permiten que el genotipado tenga lugar en células de flujo sin patrón o con patrón, y no implican componentes de inmovilización adicionales.
Un primer aspecto revelado en el presente documento es un kit que comprende: una celda de flujo, que incluye: un sustrato; y cebadores de captura primero y segundo unidos al sustrato; y un fluido de sonda de genotipado, que incluye: un vehículo líquido; y un oligonucleótido de genotipado en el vehículo líquido, incluyendo el oligonucleótido de genotipado: una primera secuencia de cebador; una secuencia de sonda representativa de un locus de genotipado diana; un sitio de endonucleasa de restricción; y una segunda secuencia de cebador que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura.
Se entiende que cualquier característica del kit revelado aquí puede combinarse entre sí de cualquier manera y/o configuración deseable para lograr los beneficios descritos en esta divulgación, que incluyen, por ejemplo, lograr el genotipado en una celda de flujo.
Un segundo aspecto divulgado en el presente documento es un método que comprende: introducir un fluido de sonda de genotipado en una celda de flujo que incluye un primer y un segundo cebadores de captura, incluyendo el fluido de sonda de genotipado una pluralidad de oligonucleótidos de genotipado, incluyendo cada uno de los oligonucleótidos de genotipado: una primera secuencia de cebador; una secuencia de sonda representativa de un locus de genotipado diana respectivo; un sitio de endonucleasa de restricción; y una segunda secuencia de cebador que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura; donde un oligonucleótido de genotipado respectivo reacciona para producir poblaciones clonales respectivas.de amplicones del oligonucleótido de genotipado respectivo; linealizar los amplicones para producir plantillas de sonda; secuenciar al menos una sección de identificación de sonda de las plantillas de sonda para identificar cada una de las secuencias de sonda; eliminar al menos las cadenas nacientes respectivas de las plantillas de sonda, por lo que se expone un grupo OH 3' en un extremo de las plantillas de sonda; hibridar muestras respectivas con las plantillas de sonda; y realizar reacciones de genotipado respectivas de las muestras en los grupos OH 3' expuestos.
Se entiende que cualquier característica del método puede combinarse entre sí de cualquier manera deseable. Además, se entiende que cualquier combinación de características del método y/o del kit puede usarse juntas, y / o combinadas con cualquiera de los ejemplos revelados aquí para lograr los beneficios descritos en este revelado, que incluyen, por ejemplo, lograr el genotipado en una celda de flujo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las características de los ejemplos de la presente revelación se harán evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos, en los que números de referencia similares corresponden a componentes similares, aunque quizás no idénticos. En aras de la brevedad, los números de referencia o las características que tienen una función descrita anteriormente pueden describirse o no en relación con otros dibujos en los que aparecen.
La Fig. 1A es una ilustración esquemática de un ejemplo del oligonucleótido de genotipado revelado aquí;
La Fig. 1B es una ilustración esquemática de otro ejemplo del oligonucleótido de genotipado revelado aquí;
Fig. 2A es una vista superior de un ejemplo de una celda de flujo;
Fig. 2B es una vista ampliada y parcialmente recortada de un ejemplo de un canal de flujo de la celda de flujo que incluye depresiones formadas a lo largo del canal de flujo;
Las Figs. 3A a 3H representan esquemáticamente un ejemplo de un método revelado aquí; y
Las Figs. 4A a 4H representan esquemáticamente otro ejemplo de un método revelado aquí.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Aquí se revelarán oligonucleótidos de genotipado que incluyen secciones de secuencia de nucleótidos específicas. Cada sección de secuencia de nucleótidos del oligonucleótido de genotipado está diseñada para tener una función designada en la formación de agrupaciones, linealización, identificación de locus diana y / o secuenciación.[0017]Los oligonucleótidos de genotipado se pueden usar en una celda de flujo sin patrón que tiene cebadores de captura en una superficie de la misma, o en una celda de flujo con patrón que incluye depresiones que tienen cebadores de captura en la misma. En diferentes áreas de la superficie de la celda de flujo sin patrón o dentro de las depresiones respectivas de la celda de flujo con patrón, se pueden generar poblaciones monoclonales (agrupaciones) de amplicones a partir de oligonucleótidos de genotipado respectivos. Los amplicones en un área o depresión particular pueden ser diferentes de los amplicones en cada una de las otras áreas o depresiones y, por lo tanto, cada población monoclonal de amplicones puede representar un locus diana único para el genotipado.
Los oligonucleótidos de genotipado revelados aquí permiten que el genotipado tenga lugar en células de flujo sin patrón o en células de flujo con patrón, y no implican componentes de inmovilización adicionales, tales como perlas en fase sólida. Adicionalmente, los oligonucleótidos de genotipado revelados aquí pueden ser adecuados para su uso con cualquier superficie de celda de flujo que utilice agrupaciones amplificadas clonalmente.
También se desvelan en el presente documento métodos para preparar un locus de genotipado diana, que puede usarse con los oligonucleótidos de genotipado. Estos métodos son métodos de amplificación que generan fragmentos de ADN genómico (ADNg) sin tener que introducir un sitio de escisión y realizar la fragmentación.
Definiciones
Se entenderá que los términos usados aquí adquieren su significado ordinario en la técnica relevante a menos que se especifique lo contrario. A continuación se exponen varios términos usados aquí y sus significados.
Como se usan aquí, las formas singulares "un", " una " y "el" se refieren tanto al singular como al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "que comprende", como se usa en el presente documento, es sinónimo de "que incluye", "que contiene" o "caracterizado por", y es inclusivo o abierto y no excluye elementos o etapas de método adicionales no citados.
La referencia a lo largo de la especificación a "un ejemplo", "otro ejemplo", "un ejemplo", etc., significa que un elemento particular (por ejemplo, característica, estructura, composición, configuración y/o característica) descrito en relación con el ejemplo se incluye en al menos un ejemplo descrito aquí, y puede estar presente o no en otros ejemplos. Además, se entiende que los elementos descritos para cualquier ejemplo pueden combinarse de cualquier manera adecuada en los diversos ejemplos a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Los términos "sustancialmente" y "aproximadamente" utilizados a lo largo de esta divulgación, incluidas las reivindicaciones, se utilizan para describir y tener en cuenta pequeñas fluctuaciones, como las debidas a variaciones en el procesamiento. Por ejemplo, estos términos pueden referirse a menos de o igual a ±10% de un valor establecido, tal como menos de o igual a ±5% de un valor establecido, tal como menos de o igual a ±2% de un valor establecido, tal como menos de o igual a ±1% de un valor establecido, tal como menos de o igual a ±0,5% de un valor establecido, tal como menos de o igual a ±0,2% de un valor establecido, tal como menos de o igual a ±0,1% de un valor establecido, tal como menos de o igual a ±0,05% a partir de un valor establecido.
Además, se entiende que los intervalos proporcionados aquí incluyen el intervalo establecido y cualquier valor o subintervalo dentro del intervalo establecido, como si se mencionaran explícitamente. Por ejemplo, un intervalo representado por aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm, debe interpretarse que incluye no solo los límites mencionados explícitamente de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm, sino que también incluye valores individuales, tales como aproximadamente 15 mm, 22,5 mm, 245 mm, etc., y subintervalos, tales como de aproximadamente 20 mm a aproximadamente 225 mm, etc.
Unido: El estado de dos cosas unidas, sujetas, adheridas, conectadas o unidas entre sí, ya sea directa o indirectamente. Por ejemplo, un ácido nucleico puede unirse a un polímero funcionalizado mediante un enlace covalente o no covalente. Un enlace covalente se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Un enlace no covalente es un enlace físico que no implica el intercambio de pares de electrones y puede incluir, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals, interacciones hidrófilas e interacciones hidrófobas. Cuando dos cosas están vinculadas directamente, no hay un componente intermedio. Por ejemplo, el primer cebador de captura y la secuencia de sonda en algunos ejemplos del oligonucleótido de genotipado están unidos covalentemente directamente entre sí. Cuando dos cosas están unidas indirectamente, hay algún componente intermedio. Por ejemplo, el primer cebador de captura y la secuencia de sonda en algunos ejemplos del oligonucleótido de genotipado se unen indirectamente entre sí a través de una porción de secuencia índice y una porción de sitio de cebado.
Deposición:Cualquier técnica de aplicación adecuada, que puede ser manual o automatizada, y, en algunos casos, da como resultado la modificación de las propiedades de la superficie. En general, la deposición se puede realizar usando técnicas de deposición de vapor, técnicas de recubrimiento, técnicas de injerto o similares. Algunos ejemplos específicos incluyen deposición química en fase de vapor (CVD), revestimiento por pulverización (por ejemplo, revestimiento por pulverización ultrasónica), revestimiento por centrifugación, revestimiento por inmersión o inmersión, revestimiento con cuchilla rascadora, dispensación de charcos, revestimiento de flujo continuo, impresión en aerosol, serigrafía, impresión por microcontacto, impresión por inyección de tinta o similares.
Depresión:Una característica cóncava discreta en un sustrato o una resina con patrón que tiene una abertura superficial que está rodeada al menos parcialmente por una o más regiones intersticiales del sustrato o la resina con patrón. Las depresiones pueden tener cualquiera de una variedad de formas en su abertura en una superficie que incluye, como ejemplos, redonda, elíptica, cuadrada, poligonal, en forma de estrella (con cualquier número de vértices), etc. La sección transversal de una depresión tomada ortogonalmente con la superficie puede ser curva, cuadrada, poligonal, hiperbólica, cónica, angular, etc. Como ejemplos, la depresión puede ser un pocillo o dos pocillos interconectados. La depresión también puede tener arquitecturas más complejas, tales como crestas, escalones, etc.
Cada Uno:Cuando se usa en referencia a una colección de artículos, cada uno identifica un artículo individual en la colección, pero no necesariamente se refiere a cada artículo en la colección. Pueden ocurrir excepciones si la revelación explícita o el contexto dictan claramente lo contrario.
Celda de Flujo:Un recipiente que tiene una cámara (por ejemplo, un canal de flujo) donde se puede llevar a cabo una reacción, una entrada para suministrar reactivo (s) a la cámara y una salida para retirar reactivo(s) de la cámara. En algunos ejemplos, la cámara permite la detección de la reacción que se produce en la cámara. Por ejemplo, la cámara puede incluir una o más superficies transparentes que permiten la detección óptica de matrices, moléculas marcadas ópticamente o similares.
ADN GENÓMICO (ADNg):Una o más moléculas de desoxirribonucleótidos poliméricos cromosómicos que se producen de forma natural en el núcleo de una célula eucariota o en un procariota, virus, mitocondria o cloroplasto y que contienen secuencias que se transcriben de forma natural en ARN, así como secuencias que no se transcriben de forma natural en ARN por la célula. Un ADNg de una célula eucariota contiene al menos un centrómero, dos telómeros, un origen de replicación y una secuencia que no se transcribe en ARN por la célula eucariota que incluye, por ejemplo, un intrón o promotor de la transcripción. Un ADNg de una célula procariota contiene al menos un origen de replicación y una secuencia que no se transcribe en ARN por la célula procariota que incluye, por ejemplo, un promotor de la transcripción. Un ADN genómico eucariótico se puede distinguir del ADN genómico procariótico, viral u organelar, por ejemplo, de acuerdo con la presencia de intrones en el ADN genómico eucariótico y la ausencia de intrones en el ADNg de los demás.
Oligonucleótido de genotipado:Una secuencia de ácido desoxirribonucleico monocatenario que incluye secciones de secuencia de nucleótidos específicas, una de las cuales es una secuencia de sonda que representa un locus diana para genotipado. El oligonucleótido de genotipado puede servir como plantilla para la generación de agrupaciones.
Porción de Secuencia Índice:Una cadena corta, que varía de 10 a 30 nucleobases, que identifica la secuencia de la sonda en algunos ejemplos del oligonucleótido de genotipado.
Locus o Loci:Una ubicación específica de secuencia en una muestra de ácido nucleico. El término puede incluir secuencias de ácido nucleico predeterminadas o predichas que se espera que estén presentes en moléculas de ácido nucleico aisladas. Estas secuencias de ácido nucleico predeterminadas o predichas pueden denominarse en el presente documento "locus de genotipado diana", y pueden ser regiones de interés para el análisis. El término pretende abarcar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), mutaciones, número variable de repeticiones en tándem (VNTR) y repeticiones en tándem individuales (STR), otros polimorfismos, inserciones, deleciones, variantes de corte y empalme o cualquier otro marcador genético conocido.
Ácido nucleico:Una forma oligomérica o polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, y puede incluir desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos o mezclas de los mismos. El término puede referirse a oligonucleótidos o polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios.
Nucleótido:Una base heterocíclica que contiene nitrógeno (una nucleobase), un azúcar y uno o más grupos fosfato. Los nucleótidos son unidades monoméricas de una secuencia de ácido nucleico. En los ribonucleótidos (ARN), el azúcar es una ribosa, y en los desoxirribonucleótidos (ADN), el azúcar es una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la posición 2' en la ribosa. La base heterocíclica que contiene nitrógeno (es decir, nucleobase) puede ser una base de purina o una base de pirimidina. Las bases de purina incluyen adenina (A) y guanina( G), y derivados modificados o análogos de las mismas. Las bases de pirimidina incluyen citosina (C), timina (T) y uracilo (II), y derivados modificados o análogos de los mismos. El átomo C -1 de desoxirribosa está unido a N-1 de una pirimidina o N-9 de una purina. Los nucleótidos de origen natural generalmente tienen una cadena principal que contiene enlaces fosfodiéster. Un análogo de ácido nucleico puede tener cualquiera de la cadena principal de fosfato, el azúcar o la nucleobase alterada. Los ejemplos de análogos de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, bases universales o análogos de cadena principal de fosfato-azúcar, tales como ácido nucleico peptídico (<p>N<a>).
Sección de secuencia de nucleótidos:Una porción del oligonucleótido de genotipado. Cada porción del oligonucleótido de genotipado puede diseñarse de modo que esté involucrado en un proceso o procesos específicos en el método o métodos revelados aquí.
Cebador.Una secuencia de ácido desoxirribonucleico monocatenario que puede hibridar con una secuencia específica. Un ejemplo de un cebador es un "cebador de captura".” Un cebador de captura puede estar presente en depresiones de una celda de flujo y puede hibridarse con una secuencia de cebador de un oligonucleótido de genotipado o un amplicón del mismo. El cebador de captura puede servir como punto de partida para la amplificación y la generación de agrupaciones. Otro ejemplo de un cebador es un " cebador de secuenciación.” Un cebador de secuenciación puede hibridar con una porción de una plantilla de sonda monocatenaria para cebar la síntesis de al menos una porción de la plantilla de sonda monocatenaria. Se pueden usar otros cebadores, tales como cebadores aleatorios, en una reacción de amplificación de cebadores aleatorios para generar fragmentos de ADNg, tales como el locus de genotipado diana. Cualquier cebador puede incluir cualquier combinación de nucleótidos o análogos de los mismos. La longitud del cebador puede tener cualquier número de bases de longitud y puede incluir una variedad de nucleótidos no naturales. En un ejemplo, el cebador de captura o el cebador de secuenciación es una cadena corta, que varía de 10 a 60 nucleobases, o de 20 a 40 nucleobases.
Porción de Secuencia de Cebado: Un sitio de cebado para la secuenciación de una porción de secuencia índice, ambos incluidos en algunos ejemplos del oligonucleótido de genotipado.
Secuencia de Sonda:Una sección específica del oligonucleótido de genotipado que incluye una secuencia de nucleótidos que representa un locus diana para el genotipado. La secuencia de sonda, o un amplicón de la misma, incluye de 25 a 50 nucleobases que tienen un orden específico que es complementario a y, por lo tanto, puede hibridar con la secuencia del locus diana.
Plantilla de Sonda Monocatenaria:Una secuencia de ácido desoxirribonucleico monocatenario que se genera durante la agrupación. El oligonucleótido de genotipado sirve como plantilla para la generación de agrupaciones y, por lo tanto, las plantillas de sonda monocatenarios son amplicones o porciones de amplicones del oligonucleótido de genotipado.
Oligonucleótidos de Genotipado
La Fig. 1A y la Fig. 1B representan esquemáticamente dos ejemplos diferentes de los oligonucleótidos de genotipado 10, 10'. Cada uno de los oligonucleótidos de genotipado 10, 10' incluye secciones de secuencia de nucleótidos específicas, que incluyen una primera secuencia de cebador 12, una secuencia de sonda 14, un sitio de endonucleasa de restricción 16 o 16' y una segunda secuencia de cebador 18 o 18'.
El oligonucleótido de genotipado 10 de ejemplo mostrado en la Fig. 1A incluye la primera secuencia de cebador 12 unida directa y covalentemente a la secuencia de sonda 14, que está unida directa y covalentemente al sitio de endonucleasa de restricción 16, que está unida directa y covalentemente a la segunda secuencia de cebador 18. Un ejemplo del método que implica estos oligonucleótidos de genotipado 10 se muestra y describe con referencia a la Fig. 3A a la Fig. 3H.
La primera secuencia de cebador 12 del oligonucleótido de genotipado 10 puede tener la misma polaridad y la misma secuencia que un primer cebador de captura 22 (véase la Fig. 2B) que está presente en la superficie de una celda de flujo 20 (véase la Fig. 2A y la Fig. 2B). Como tal, el número, orden y tipo de nucleobases en al menos una porción de la secuencia del primer cebador 12 depende del número, orden y tipo de nucleobases en el primer cebador de captura 22. Durante la agrupación, se generan amplicones de los oligonucleótidos de genotipado 10 que incluyen una secuencia complementaria a la secuencia del primer cebador 12 (por ejemplo, P5'). Esta porción complementaria (mostrada como C12 en la Fig. 3B) puede hibridar con el primer cebador de captura 22.
En un ejemplo, el primer cebador de captura 22 tiene una secuencia universal para fines de captura y/o amplificación. Un ejemplo del primer cebador de captura 22 incluye cebadores P5, ejemplos de los cuales se usan en la superficie de celdas de flujo comerciales vendidas por Illumina Inc. para la secuenciación, por ejemplo, en HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, ISEQ™, GENOME ANALYZER™ y otras plataformas de instrumentos. En otro ejemplo, el primer cebador de captura 22 incluye lo siguiente:
Primer cebador de captura: 5' - 3'
AATGATACGGCGACCACCGA (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA NÚMERO 1)
La primera secuencia de cebador 12 puede tener la misma secuencia que el primer cebador de captura 22. Aunque se ha proporcionado un ejemplo, se entiende que pueden usarse otras secuencias para la primera secuencia de cebador 12 y para el primer cebador de captura 22. La primera secuencia de cebador 12 también puede ser al menos parcialmente la misma que la del primer cebador de captura 22. Por "al menos parcialmente iguales", se entiende que un número suficiente de nucleobases en la primera secuencia de cebadores 12 y en el primer cebador de captura 22 son iguales para que pueda producirse la hibridación entre los dos 12, 22. La primera secuencia de cebador 12 del oligonucleótido de genotipado 10 está unida directamente a la secuencia de sonda 14. La secuencia de sonda 14 es representativa de un locus de genotipado diana. Por lo tanto, la secuencia de sonda 14 es capaz de hibridar con la secuencia del locus diana durante el genotipado.
El sitio de endonucleasa de restricción 16 del oligonucleótido de genotipado 10 está unido directamente a la secuencia de sonda 14. Este sitio de endonucleasa de restricción 16 proporciona al oligonucleótido de genotipado 10 un sitio de digestión. En un ejemplo, el sitio de endonucleasa de restricción 16 es sensible a una enzima de restricción seleccionada del grupo que consiste en una endonucleasa de restricción de corte de 4 bases, una endonucleasa de restricción de corte de 5 bases, una endonucleasa de restricción de corte de 6 bases. Algunos cortadores de base del ejemplo 4 incluyen Dpnll, Fatl, MluCI, BfuCI, Mbol, Sau3AI, Bfal, Bstlll, Pmll, Kasl y otros que están disponibles comercialmente, por ejemplo, de New England BioLabs Inc., Termofisher científico, etc. Algunos cortadores de base del ejemplo 5 incluyen BssKI, StyD41, Maelll, PspGI, Ddel, Fmul, PspGI, Tfil y otros que están disponibles comercialmente, por ejemplo, de New England BioLabs Inc., Termofisher Scientific, etc. Algunos cortadores de base del ejemplo 6 incluyen AclI, Afel, Nspl, Haell, Tati y otros que están disponibles comercialmente, por ejemplo, de New England BioLabs Inc., Termofisher Scientific, etc. El sitio de endonucleasa de restricción 16 se coloca de tal manera que después de la escisión/digestión con una enzima de restricción, la última base de la secuencia de sonda 14 es el OH 3' final que se expone para la reacción de secuenciación/genotipado.
La segunda secuencia de cebador 18 del oligonucleótido de genotipado 10 es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura 24 (véase la Fig. 2B) que está presente en la superficie de una celda de flujo 20. Por "al menos parcialmente complementario", se entiende que un número suficiente de nucleobases en la segunda secuencia de cebadores 18 y en el segundo cebador de captura 24 son complementarias para que pueda producirse la hibridación entre las dos 18, 24. Como tal, el número, orden y tipo de nucleobases en la segunda secuencia de cebadores 18 depende del número, orden y tipo de nucleobases en el segundo cebador de captura 24.
En un ejemplo, el segundo cebador de captura 24 tiene una secuencia universal para fines de captura y / o amplificación. Un ejemplo del segundo cebador de captura 24 incluye cebadores P7, ejemplos de los cuales se usan en la superficie de celdas de flujo comerciales vendidas por Illumina Inc. para la secuenciación, por ejemplo, en HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, ISEQ™, GENOME ANALYZER™ y otras plataformas de instrumentos. En otro ejemplo, el segundo cebador de captura 24 incluye lo siguiente:
Segundo cebador de captura: 5' - 3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGA (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA NÚMERO 2)
La segunda secuencia de cebador 18 es al menos parcialmente complementaria a la secuencia del segundo cebador de captura 24. En este ejemplo, la segunda secuencia de cebadores 18 puede incluir lo siguiente:
Segunda secuencia de cebador: 5 '— 3'
GTTCGTCTTCTGCCGTATGCT (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA NÚMERO 3)
Aunque se ha proporcionado un ejemplo, se entiende que otras secuencias pueden usarse para la segunda secuencia de cebador 18 y para el segundo cebador de captura 24.
El segundo cebador de captura 24 en la celda de flujo 20 también incluye un sitio de escisión (véase el número de referencia 46 en la Fig. 3A). El sitio de escisión puede usarse para linealizar plantillas de sonda puenteadas después de la formación de grupos (descrito más en referencia a la Fig. 3E). La química del sitio de escisión del segundo cebador de captura 24 puede ser diferente de la química del sitio de endonucleasa de restricción 16 del nucleótido de genotipado 10 de modo que no tenga lugar la digestión prematura del sitio de endonucleasa de restricción 16. El sitio de escisión y el sitio de endonucleasa de restricción 16 tienen reacciones de escisión separadas y específicas. Estas reacciones pueden considerarse ortogonales, ya que una reacción no inicia, afecta o interfiere de otro modo con la otra reacción. Los ejemplos de sitios de escisión adecuados para el segundo cebador de captura 24 incluyen nucleobases escindibles enzimáticamente o nucleobases escindibles químicamente, nucleobases modificadas o enlazadores (por ejemplo, unidos entre nucleobases). La nucleobase escindible enzimáticamente puede ser susceptible de escisión por reacción con una glucosilasa y una endonucleasa, o con una exonucleasa. Un ejemplo específico de la nucleobase escindible es el desoxiuracilo (dll), que puede ser dirigido por la enzima USER. En un ejemplo, la base de uracilo puede incorporarse en la séptima posición de la base desde el extremo 3 ' del segundo cebador de captura 24. También se pueden usar otros sitios abásicos. Los ejemplos de nucleobases, nucleobases modificadas o enlazadores químicamente escindibles incluyen 8-oxoguanina, un diol vecinal, un disulfuro, un silano, un azobenceno, un grupo fotoescindible, alil T (un análogo de nucleótido de timina que tiene una funcionalidad alilo), éteres de alilo o un éter con funcionalidad azido.[0052]Con referencia ahora a la Fig. 1B, se representa esquemáticamente otro ejemplo del oligonucleótido de genotipado 10'. El oligonucleótido de genotipado 10' de ejemplo mostrado en la Fig. 1B incluye más secciones de secuencia de nucleótidos que el oligonucleótido de genotipado 10 mostrado en la Fig. 1A. Específicamente, el oligonucleótido de genotipado 10 ' comprende además una porción de secuencia índice 26 y una porción de sitio de cebado 28. En este ejemplo, el oligonucleótido de genotipado 10 'incluye la primera secuencia cebadora 12 unida directa y covalentemente a la porción de secuencia índice 26, que está unida directa y covalentemente a la porción de sitio de cebado 28, que está unida directa y covalentemente a la secuencia de sonda 14, que está unida a la segunda secuencia cebadora 18'. En este ejemplo, el sitio de endonucleasa de restricción 16' puede colocarse entre la secuencia de sonda 14 y la segunda secuencia de cebador 18', o puede integrarse en la segunda secuencia de cebador 18'. Un ejemplo del método que implica estos oligonucleótidos de genotipado 10 ' se muestra y describe con referencia a la Fig. 4Aa la Fig. 4H.
La primera secuencia cebadora 12 del oligonucleótido de genotipado 10' puede ser cualquier ejemplo expuesto aquí para el oligonucleótido de genotipado 10.
La primera secuencia cebadora 12 del oligonucleótido de genotipado 10 ' está unida directamente a la porción de secuencia índice 26. La porción de secuencia índice 26 es única para la secuencia de sonda 14 en el oligonucleótido de genotipado 10'. Como tal, la porción de secuencia índice 26 proporciona un identificador o código de barras distinto que puede usarse para identificar la secuencia de locus diana representada por la secuencia de sonda 14.
La porción de secuencia índice 26 está unida directamente a la porción de sitio de cebado 28. La porción de sitio de cebado 28 puede hibridar con un cebador de secuenciación que inicia la introducción de nucleótidos a lo largo de la porción de secuencia índice 26 de una manera dependiente de la plantilla, una nucleobase a la vez.
La porción de sitio de cebado 28 del oligonucleótido de genotipado 10 ' está unida directamente a la secuencia de sonda 14. Como se describe aquí, la secuencia de sonda 14 es capaz de hibridar con la secuencia del locus diana durante el genotipado.
En el oligonucleótido de genotipado 10', la secuencia de sonda 14 está unida a la segunda secuencia de cebador 18'. En algunos ejemplos, la secuencia de sonda 14 se une indirectamente a la segunda secuencia de cebador 18', y el sitio de endonucleasa de restricción 16 'se coloca entre las dos secciones 14, 18'. En otros ejemplos, la secuencia de sonda 14 se une directamente a la segunda secuencia de cebador 18', y el sitio de endonucleasa de restricción 16'se integra en la segunda secuencia de cebador 18'. En cualquiera de estos ejemplos, el sitio de endonucleasa de restricción 16 ' puede ser sensible a una enzima de restricción de tipo IIS. The Type IIS restriction enzyme may be methyl sensitive or may not be methyl sensitive. Las enzimas de restricción de tipo IIS son un grupo específico de enzimas que reconocen secuencias de ADN asimétricas (por ejemplo, el sitio de endonucleasa de restricción 16') y escinden a una distancia definida (por ejemplo, de 1 nucleótido a aproximadamente 20 nucleótidos) fuera de la secuencia de reconocimiento. Algunos ejemplos de enzimas de restricción de tipo IIS que no son sensibles a metilo se seleccionan del grupo que consiste en Bbvl (BseXI), Bmrl, Bvel (BspMI), etc. Algunas enzimas de restricción de tipo IIS que son sensibles a metilo se seleccionan del grupo que consiste en SfaNI, FoKI, HGAI, etc. Aunque se han proporcionado algunos ejemplos, se puede usar cualquier enzima de restricción de tipo IIS adecuada, dependiendo de la secuencia de reconocimiento del sitio de endonucleasa de restricción 16'. Las enzimas sensibles a metilo y no sensibles a metilo están disponibles comercialmente, por ejemplo, de New England BioLabs Inc., Termofisher Scientific, etc.
Cuando el sitio de endonucleasa de restricción 16' está unido al extremo de la segunda secuencia de cebadores 18', se puede usar cualquier ejemplo de la segunda secuencia de cebadores 18. Cuando el sitio 16 'de endonucleasa de restricción está integrado en la segunda secuencia 18 'de cebador, el sitio 16' de endonucleasa de restricción puede introducirse en cualquier posición deseable a lo largo de la longitud de la segunda secuencia 18'de cebador. La posición puede depender de la posición de un segundo sitio de endonucleasa de restricción a lo largo del segundo cebador de captura 24', la distancia de escisión definida de la enzima de restricción de tipo IIS que se va a usar, así como de dónde se desea la escisión a lo largo del oligonucleótido de genotipado 10' (o un amplicón del mismo). Esta escisión tiene lugar antes de una reacción de genotipado (durante la linealización como se analiza adicionalmente aquí), y hace que el oligonucleótido de genotipado 10' o un amplicón del mismo esté listo para el análisis de un locus de genotipado diana en una nucleobase de interés. Como ejemplo, durante una reacción de genotipado, una muestra de ADN monocatenario, por ejemplo, el locus de genotipado diana, se hibrida, por ejemplo, con el amplicón, y se realiza una única reacción de secuenciación por síntesis para identificar la nucleobase de interés. Para que se produzca este análisis, el amplicón debe escindirse en una posición definida, donde la siguiente nucleobase a secuenciar es complementaria a la nucleobase de interés. Como tal, el sitio de endonucleasa de restricción 16 'se coloca de tal manera que después de la escisión/digestión con una enzima de restricción, la última base de la secuencia de sonda 14 es el OH 3' final que se expone para la reacción de secuenciación/genotipado. En un ejemplo, el sitio de endonucleasa de restricción 16' puede integrarse en cualquier lugar desde la séptima posición base a la decimoquinta posición de la base desde el extremo 3 'de la segunda secuencia de cebadores 18'.
Con el oligonucleótido de genotipado 10' , la segunda secuencia de cebador 18' es complementaria al segundo cebador de captura 24 ' (véase la Fig. 2B) que está presente en la superficie de una celda de flujo 20. Como tal, el oligonucleótido de genotipado 10 'puede hibridar con el segundo cebador de captura 24' en la celda de flujo 20.
El segundo cebador de captura 24 'también puede incluir el segundo sitio de endonucleasa de restricción (véase el número de referencia 46' en la Fig. 4A), en el que el segundo sitio de endonucleasa de restricción es complementario al sitio de endonucleasa de restricción 16' del oligonucleótido de genotipado 10'. Las secuencias asimétricas pueden ser sensibles a las endonucleasas de restricción de tipo IIS. La escisión dentro de una cierta distancia predefinida de los sitios de endonucleasa de restricción hibridados 16', 46 ' se realiza durante la linealización (como se mencionó anteriormente y se describió adicionalmente con referencia a la Fig. 4F). Esto elimina las hebras que no se van a genotipar. La posición del segundo sitio de endonucleasa de restricción 46' puede estar al final de, o integrada en el segundo cebador de captura 24', siempre que los dos sitios de endonucleasa de restricción 16', 46' puedan hibridar y formar el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción de tipo IIS.
Cualquier ejemplo del oligonucleótido de genotipado 10, 10 ' se puede preparar usando procesos de síntesis de oligonucleótidos.
Celdas de Flujo
Los oligonucleótidos de genotipado 10, 10' pueden usarse con cualquier celda de flujo con patrón 20. Aunque no se muestra, se entiende que otras celdas de flujo sin patrón (por ejemplo, que no incluyen depresiones) que utilizan la química de agrupamiento descrita aquí pueden usarse alternativamente en los ejemplos revelados aquí. Con celdas de flujo sin patrón, los grupos pueden identificarse usando software.
Un ejemplo de una celda de flujo con patrón 20 se representa en la Fig. 2A, y un ejemplo de la arquitectura modelada dentro de la celda de flujo 20 se muestra en la Fig. 2B. La celda de flujo 20 incluye un sustrato 30 que define al menos parcialmente un carril o canal de flujo 32.
El sustrato 30 puede ser de una sola capa/material. Los ejemplos de sustratos de una sola capa adecuados incluyen epoxi siloxano, vidrio, vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (tal como TEFLON® de Chemours), olefinas cíclicas/polímeros de cicloolefina (COP) (tal como ZEONOR® de Zeon), poliimidas, etc.), nailon (poliamidas), cerámicas/ceramic cerámicos, sílice, sílice fundida o materiales a base de sílice, silicato de aluminio, silicio y silicio modificado (por ejemplo, silicio p+ dopado con boro), nitruro de silicio (Si3N4), óxido de silicio (SiO2), pentóxido de tantalio (Ta205) u otro(s) óxido (s) de tantalio (TaOx), óxido de hafnio (HfO2), carbono, metales, vidrios inorgánicos o similares.
Cuando el sustrato 30 es una sola capa, las depresiones 38 (véase la Fig. 2B) se definen en la capa única.
Como se muestra en la Fig. 2B, el sustrato 30 también puede ser un sustrato multicapa 30'. Algunos ejemplos del sustrato multicapa 30 ' incluyen vidrio o silicio, con una capa de revestimiento de óxido de tantalio u otro óxido cerámico en la superficie. Otros ejemplos del sustrato multicapa 30 ' pueden incluir un sustrato de silicio sobre aislante (SOI). En el ejemplo mostrado en la Fig. 2B, el sustrato multicapa 30 ' incluye un soporte subyacente 34 (por ejemplo, vidrio o silicio) y un material modelado 36 colocado en el soporte 34.
El material modelado 36 define las depresiones 38, que están separadas por regiones intersticiales 40. Las depresiones 38 están ubicadas dentro de cada uno de los canales de flujo 32.
Se entiende que cualquier material que pueda depositarse selectivamente, o depositarse y modelarse para formar las depresiones 38 y las regiones intersticiales 40 puede usarse para el material modelado 36.
Como ejemplo, se puede aplicar selectivamente un óxido inorgánico al soporte 34 mediante deposición de vapor, impresión en aerosol o impresión por inyección de tinta.
Los ejemplos de óxidos inorgánicos adecuados incluyen óxido de tantalio (por ejemplo, Ta205), óxido de aluminio (por ejemplo, AI2O3), óxido de silicio (por ejemplo, SiO2), óxido de hafnio (por ejemplo, HfO2), etc.
Como otro ejemplo, se puede aplicar una resina al soporte 34 y luego modelar. Las técnicas de deposición adecuadas incluyen deposición química en fase de vapor, recubrimiento por inmersión, revestimiento sumergido, recubrimiento por centrifugación, recubrimiento por pulverización, dispensación de charcos, recubrimiento por pulverización ultrasónica, recubrimiento con cuchilla rascadora, impresión en aerosol, serigrafía, impresión por microcontacto, etc. Las técnicas de modelado adecuadas incluyen fotolitografía, litografía por nanoimpresión (NIL), técnicas de estampado, técnicas de gofrado, técnicas de moldeo, técnicas de micrograbado, técnicas de impresión,etc. Algunos ejemplos de resinas adecuadas incluyen una resina a base de silsesquioxano oligomérico poliédrico (por ejemplo, POSS® de Hybrid Plastics), una resina epoxi de silsesquioxano oligomérico no poliédrico, una resina de poli (etilenglicol), una resina de poliéter (por ejemplo, epoxis de anillo abierto), una resina acrílica, una resina de acrilato, una resina de metacrilato, una resina de fluoropolímero amorfo (por ejemplo, CYTOP®de Bellex) y combinaciones de las mismas.
Como se usa en el presente documento, el término "silsesquioxano oligomérico poliédrico" se refiere a una composición química que es un intermedio híbrido (por ejemplo, RSiO1. 5) entre el de sílice (SiO2) y silicona (R2SiO). Un ejemplo de silsesquioxano oligomérico poliédrico puede ser el descrito en Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), págs. 776-778. En un ejemplo, la composición es un compuesto de organosilicio con la fórmula química [RSiO3/2]n, en la que los grupos R pueden ser iguales o diferentes. Los grupos R de ejemplo para silsesquioxano oligomérico poliédrico incluyen epoxi, azida / azido, un tiol, un poli(etilenglicol), un norborneno, una tetrazina, acrilatos y/o metacrilatos, o adicionalmente, por ejemplo, grupos alquilo, arilo, alcoxi y/o haloalquilo.La composición de la resina revelada aquí puede comprender una o más estructuras de jaula o núcleo diferentes como unidades monoméricas.
En un ejemplo, el sustrato 30, 30' puede fabricarse usando una oblea redonda que tiene un diámetro que varía de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm, o a partir de una lámina o panel rectangular que tiene su dimensión más grande hasta aproximadamente 10 pies (~ 3 metros). En un ejemplo, el sustrato 30, 30 ' se fabrica usando una oblea redonda que tiene un diámetro que varía de aproximadamente 200 mm a aproximadamente 300 mm. En otro ejemplo, se puede usar un panel que es un soporte rectangular, que tiene un área de superficie mayor que una oblea redonda de 300 mm. Las obleas, paneles y otros materiales de sustrato grandes pueden cortarse en cubitos en los sustratos de celda de flujo individuales 30, 30'. En otro ejemplo, el sustrato 30, 30 ' es una matriz que tiene una anchura que varía de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm. Aunque se han proporcionado dimensiones de ejemplo, se debe entender que se puede usar un material de sustrato con cualquier dimensión adecuada para fabricar el sustrato 30, 30'.
La celda de flujo 20 también incluye canales de flujo 32. Aunque se muestran varios canales de flujo 32 en la Fig. 2A, se entiende que se puede incluir cualquier número de canales 32 en la celda de flujo 20 (por ejemplo, un solo canal 32, cuatro canales 32, etc.). Cada canal de flujo 32 es un área definida entre dos componentes unidos (por ejemplo, el sustrato 30, 30' y una tapa o dos sustratos 30, 30'), que pueden tener fluidos introducidos en el mismo y retirados del mismo. Cada canal de flujo 32 puede estar aislado de cada otro canal de flujo 32 de modo que el fluido introducido en cualquier canal de flujo 32 particular no fluya hacia ningún canal de flujo 32 adyacente. Algunos ejemplos de los fluidos introducidos en los canales de flujo 32 pueden introducir componentes de reacción (por ejemplo, fragmentos de biblioteca de locus de genotipado diana, polimerasas, etc.), soluciones de lavado, etc.
Como se ha mencionado, el canal de flujo 32 se define entre el sustrato 30, 30' y una tapa (no mostrada) o entre el sustrato 30, 30' y otro sustrato (no mostrado, pero similar al sustrato 30, 30').
En un ejemplo, la tapa o sustrato adicional puede estar unido a al menos una parte del sustrato 30, 30', por ejemplo, en algunas de las regiones intersticiales 40. La unión que se forma entre la tapa o el sustrato adicional y el sustrato 30, 30 ' puede ser una unión química o una unión mecánica (por ejemplo, usando un anclaje,etc.).
La tapa puede ser cualquier material que sea transparente a una luz de excitación que se dirige hacia el sustrato 30, 30'. Como ejemplos, la tapa puede ser de vidrio (por ejemplo, borosilicato, sílice fundida, etc.), plástico, o similares. Un ejemplo comercialmente disponible de un vidrio de borosilicato adecuado es D 263®, disponible en Schott North America, Inc. Ejemplos comercialmente disponibles de materiales plásticos adecuados, a saber, polímeros de ciclo olefina, son los productos ZEONOR® disponibles de Zeon Chemicals L. P
La tapa o sustrato adicional se puede unir al sustrato 30, 30 ' usando cualquier técnica adecuada, tal como unión por láser, unión por difusión, unión anódica, unión eutéctica, unión por activación por plasma, frita de vidrio u otros métodos conocidos en la técnica. En un ejemplo, se puede usar una capa espaciadora para unir la tapa o el sustrato adicional al sustrato 30, 30'. La capa espaciadora puede ser cualquier material que selle al menos parte del sustrato 30, 30' y la tapa o sustrato adicional entre sí. En algunos ejemplos, la capa espaciadora puede ser un material absorbente de radiación que ayude en la unión.
En un ejemplo, el canal de flujo 32 tiene una configuración rectangular. La longitud y la anchura del canal de flujo 32 pueden ser menores, respectivamente, que la longitud y la anchura del sustrato 30, 30', de modo que una parte de la superficie del sustrato que rodea el canal de flujo 32 esté disponible para su fijación a una tapa (no mostrada) u otro sustrato 30, 30'. En algunos casos, el ancho de cada canal de flujo 32 puede ser de al menos aproximadamente 1 mm, al menos aproximadamente 2,5 mm, al menos aproximadamente 5 mm, al menos aproximadamente 7 mm, al menos aproximadamente 10 mm o más. En algunos casos, la longitud de cada carril/canal de flujo 32 puede ser de al menos aproximadamente 10 mm, al menos aproximadamente 25 mm, al menos aproximadamente 50 mm, al menos aproximadamente 100 mm o más. La anchura y/o longitud de cada canal de flujo 32 puede ser mayor que, menor que o entre los valores especificados anteriormente.En otro ejemplo, el canal de flujo 32 es cuadrado(por ejemplo, 10 mm x 10 mm).
La profundidad de cada canal de flujo 32 puede ser tan pequeña como un grosor de monocapa, por ejemplo, cuando se usa impresión por microcontacto, aerosol o inyección de tinta para depositar la capa espaciadora que define las paredes del canal de flujo. La profundidad del canal de flujo 32 puede ser mayor, por ejemplo, cuando el canal de flujo 32 está parcialmente definido en el sustrato 30, 30' (por ejemplo, mediante grabado, litografía, etc.) de manera que una porción del sustrato y la capa espaciadora definen las paredes del canal de flujo. Para otros ejemplos, la profundidad de cada canal de flujo 32 puede ser de aproximadamente 1 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 50 pm, aproximadamente 100 pm o más. En un ejemplo, la profundidad puede variar de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 100 pm. En otro ejemplo, la profundidad puede variar de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 30 pm. En otro ejemplo más, la profundidad es de aproximadamente 5 pm o menos. Se entiende que la profundidad de cada canal de flujo 32 puede ser mayor que, menor que o entre los valores especificados anteriormente.
Con referencia específica ahora a la Fig. 2B, se representa un ejemplo de la arquitectura dentro de uno de los canales de flujo 32 de la celda de flujo 20.
Como se muestra en la Fig. 2B, el material modelado 36 incluye las depresiones 38 definidas en el mismo, y las regiones intersticiales 40 que separan las depresiones adyacentes 38. Se pueden prever muchas disposiciones diferentes de las depresiones 38, incluyendo patrones regulares, repetitivos y no regulares. En un ejemplo, las depresiones 38 están dispuestas en una rejilla hexagonal para un empaquetamiento cerrado y una densidad mejorada. Otros diseños pueden incluir, por ejemplo, diseños rectangulares, diseños triangulares,etc. En algunos ejemplos, el diseño o patrón puede ser un formato x-y de depresiones 38 que están en filas y columnas. En algunos otros ejemplos, la disposición o patrón puede ser una disposición repetitiva de depresiones 38 y/o regiones intersticiales 40. En otros ejemplos más, la disposición o patrón puede ser una disposición aleatoria de depresiones 38 y/o regiones intersticiales 40. El patrón puede incluir rayas, remolinos, líneas, triángulos, rectángulos, círculos, arcos, cuadros, diagonales, flechas, cuadrados y / o rayas cruzadas.
La disposición o patrón de las depresiones 38 puede caracterizarse con respecto a la densidad de las depresiones 38 (número de depresiones 38) en un área definida. Por ejemplo, las depresiones 38 pueden estar presentes a una densidad de aproximadamente 2 millones por mm.2 La densidad puede ajustarse a diferentes densidades que incluyen, por ejemplo, una densidad de aproximadamente 100 por mm2, cerca de 1.000 por mm2, cerca de 0,1 millones por mm2, cerca de 1 millón por mm2, cerca de 2 millones por mm2, cerca de 5 millones por mm2, cerca de 10 millones por mm2, cerca de 50 millones por el mm2, o más, o menos. Se entiende además que la densidad de las depresiones 38 en el material modelado 36 puede estar entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados de los intervalos anteriores. Como ejemplos, una matriz de alta densidad puede caracterizarse por tener depresiones 38 separadas por menos de aproximadamente 100 nm, una matriz de densidad media puede caracterizarse por tener depresiones 38 separadas por aproximadamente 400 nm a aproximadamente 1 pm, y una matriz de baja densidad puede caracterizarse por tener depresiones 38 separadas por más de aproximadamente 1 pm. Aunque se han proporcionado densidades de ejemplo, se entiende que se puede usar cualquier densidad adecuada. La densidad de las depresiones 38 puede depender, en parte, de la profundidad de las depresiones 38. En algunos casos, puede ser deseable que la separación entre las depresiones 38 sea incluso mayor que los ejemplos enumerados aquí.
La disposición o patrón de las depresiones 38 también o alternativamente puede caracterizarse en términos del campo promedio, o la separación desde el centro de la depresión 38 hasta el centro de una depresión adyacente 38 (separación de centro a centro) o desde el borde izquierdo de una depresión 38 hasta el borde derecho de una depresión adyacente 38 (separación de borde a borde). El patrón puede ser regular, de manera que el coeficiente de variación alrededor del campo promedio es pequeño, o el patrón puede ser no regular, en cuyo caso el coeficiente de variación puede ser relativamente grande. En cualquier caso, el tono promedio puede ser, por ejemplo, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 0,1 pm, aproximadamente 0,5 pm, aproximadamente 1 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 100 pm, o más o menos. El campo promedio para un patrón particular de depresiones 38 puede estar entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados de los intervalos anteriores. En un ejemplo, las depresiones 38 tienen un campo (separación de centro a centro)de aproximadamente 1,5 pm. Aunque se han proporcionado valores de campo promedio de ejemplo, se entiende que pueden usarse otros valores de campo promedio.
El tamaño de cada depresión 38 puede caracterizarse por su volumen, área de abertura, profundidad y / o diámetro.
Cada depresión 38 puede tener cualquier volumen que sea capaz de confinar un fluido. El volumen mínimo o máximo se puede seleccionar, por ejemplo, para acomodar el rendimiento (por ejemplo, multiplexidad), la resolución, los nucleótidos o la reactividad del analito esperados para usos "aguas abajo" de la celda de flujo 20. Por ejemplo, el volumen puede ser de al menos aproximadamente 1x10 pm, al menos aproximadamente 1x10 pm,-2 pm3, al menos aproximadamente 0.1 pm3, al menos aproximadamente 1 pm3, al menos aproximadamente 10 pm3, al menos aproximadamente 100 pm3, o más. Alternativa o adicionalmente, el volumen puede ser como máximo de aproximadamente 1x104um3, como máximo de aproximadamente 1x103um3, como máximo de aproximadamente 100 pm3, como máximo de aproximadamente 10 pm3, como máximo de aproximadamente 1 pm3, como máximo de aproximadamente 0.1 pm3, o menos.
El área ocupada por cada abertura de depresión puede seleccionarse basándose en criterios similares a los marcados anteriormente para el volumen. Por ejemplo, el área para cada abertura de depresión puede ser de al menos aproximadamente 1x10-3 pm2, al menos de aproximadamente 1 x10-2 pm2, al menos de aproximadamente 0.1 pm2, al menos de aproximadamente pm2, al menos de aproximadamente 10 pm2, al menos de aproximadamente 100 pm2, o más. Alternativa o adicionalmente, el área puede ser como máximo de aproximadamente 1x103 pm2, como máximo de aproximadamente 100 pm2, como máximo de aproximadamente 10 pm2, como máximo de aproximadamente 1 pm2, como máximo de aproximadamente 0.1 pm2, como máximo de aproximadamente 1x102 pm2, o menos. El área ocupada por cada abertura de depresión puede ser mayor, menor o estar entre los valores especificados anteriormente.
La profundidad de cada depresión 38 puede ser lo suficientemente grande como para alojar parte de un hidrogel polimérico 42. En un ejemplo, la profundidad puede ser de al menos aproximadamente 0,1 pm, al menos aproximadamente 0,5 pm, al menos aproximadamente 1 pm, al menos aproximadamente 10 pm, al menos aproximadamente 100 pm o más. Alternativa o adicionalmente, la profundidad puede ser como máximo de aproximadamente 1x103 pm, como máximo de aproximadamente 100 pm, como máximo de aproximadamente 10 pm o menos. En algunos ejemplos, la profundidad es de aproximadamente 0,4 pm. La profundidad de cada depresión 38 puede ser mayor, menor o estar entre los valores especificados anteriormente.
En algunos casos, el diámetro o la longitud y el ancho de cada depresión 38 pueden ser de al menos aproximadamente 50 nm, al menos aproximadamente 0,1 pm, al menos aproximadamente 0,5 pm, al menos aproximadamente 1 pm, al menos aproximadamente 10 pm, al menos aproximadamente 100 pm o más. Alternativa o adicionalmente, el diámetro o la longitud y el ancho pueden ser como máximo de aproximadamente 1X103 pm, como máximo de aproximadamente 100 pm, como máximo de aproximadamente 10 pm, como máximo de aproximadamente 1 pm, como máximo de aproximadamente 0,5 pm, como máximo de aproximadamente 0,1 pm o menos (por ejemplo, aproximadamente 50 nm). En algunos ejemplos, el diámetro o longitud y anchura es de aproximadamente 0,4 pm. El diámetro o la longitud y la anchura de cada depresión 38 pueden ser mayores, menores o estar entre los valores especificados anteriormente.
En el ejemplo mostrado en la Fig. 2B, un hidrogel polimérico 42 está colocado dentro de cada una de las depresiones 38. Un ejemplo del hidrogel polimérico 42 incluye un copolímero de acrilamida, tal como poli (N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida, PAZAM. El PAZAM y algunas otras formas del copolímero de acrilamida están representadas por la siguiente estructura (I):
en donde:
RA se selecciona del grupo que consiste en azido, amino opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquino opcionalmente sustituido, halógeno, hidrazona opcionalmente sustituida, hidrazina opcionalmente sustituida, carboxilo, hidroxi, tetrazol opcionalmente sustituido, tetrazina opcionalmente sustituida, óxido de nitrilo, nitrona, sulfato y tiol;
RB es H o alquilo opcionalmente sustituido;
Rc, RD, y RE se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de H y alquilo opcionalmente sustituido;cada uno de los -(CH2)p - puede estar opcionalmente sustituido;
p es un número entero en el intervalo de 1 a 50;
n es un número entero en el intervalo de 1 a 50.000; y m es un número entero en el intervalo de 1 a 100.000.
Un experto en la técnica reconocerá que la disposición de las características recurrentes "n" y "m" en la estructura (I) son representativas, y las subunidades monoméricas pueden estar presentes en cualquier orden en la estructura polimérica (por ejemplo, aleatoria, en bloque, con patrón o una combinación de las mismas).
El peso molecular de PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida puede variar de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 1500 kDa o de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 1000 kDa, o puede ser, en un ejemplo específico, de aproximadamente 312 kDa.
En algunos ejemplos, el PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida son polímeros lineales. En algunos otros ejemplos, el Pa z A m y otras formas del copolímero de acrilamida son polímeros ligeramente reticulados.
En otros ejemplos, el hidrogel polimérico 42 puede ser una variación de la estructura (I). En un ejemplo, la unidad de acrilamida se puede reemplazar porEn un ejemplo, la unidad de acrilamida se puede reemplazar con N, N
lugar de H como es el caso con la acrilamida). En este ejemplo, puede ser un número entero en el intervalo de 1 a 100.000. En otro ejemplo,la N, N - dimetilacrilamida se puede usar además de la unidad de acrilamida. En este ejemplo, la estructura rH
(I) puede incluir rd rf además de las características recurrentes "n" y "m", donde RD, RE, y RF son cada uno H o un C1-C6 alquilo, y RG y RH son cada uno un alquilo C1-C6. En este ejemplo, q puede ser un número entero en el intervalo de 1 a 100.000.
Como otro ejemplo del hidrogel polimérico 42, la característica "n" recurrente en la estructura (I) puede reemplazarse con un monómero que incluye un grupo azido heterocíclico que tiene la estructura (II).:
en la que R1 es H o un alquilo C1-C6; R2 es H o un alquilo C1-C6; L es un enlazador que incluye una cadena lineal con 2 a 20 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, oxígeno y nitrógeno y 10 sustituyentes opcionales en el carbono y cualquier átomo de nitrógeno en la cadena; E es una cadena lineal que incluye de 1 a 4 átomos seleccionado del grupo que consiste en carbono, oxígeno y nitrógeno, y sustituyentes opcionales en el carbono y cualquier átomo de nitrógeno en la cadena; A es una amida sustituida en N con un H o un alquilo C1-C4 unido al N; y Z es un heterociclo que contiene nitrógeno. Los ejemplos de Z incluyen de 5 a 10 miembros de anillo presentes como una única estructura cíclica o una estructura fusionada. Algunos ejemplos específicos de Z incluyen pirrolidinilo, piridinilo o pirimidinilo.
Como otro ejemplo más, el hidrogel polimérico 42 puede incluir una unidad recurrente de cada una de las estructuras (III) y (IV).:
en el que cada uno de R1a, R2a, R1b y R2b se selecciona independientemente de hidrógeno, un alquilo opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido; cada uno de R3a y R3b se selecciona independientemente de hidrógeno, un alquilo opcionalmente sustituido, un fenilo opcionalmente sustituido o un aralquilo C7-C14 opcionalmente sustituido; y cada L1 y L2 se selecciona independientemente de un enlazador de alquileno opcionalmente sustituido o un enlazador de heteroalquileno opcionalmente sustituido.
Se entiende que pueden usarse otras moléculas para formar el hidrogel polimérico 42, siempre que estén funcionalizadas para injertar los cebadores de captura 22, 24 o 22, 24' en el mismo. Otros ejemplos de capas poliméricas adecuadas incluyen las que tienen una estructura coloidal, tal como agarosa; o una estructura de malla polimérica, tal como gelatina; o una estructura polimérica reticulada, tal como polímeros y copolímeros de poliacrilamida, acrilamida sin silano (SFA), o una versión azidolizada de SFA. Ejemplos de polímeros de poliacrilamida adecuados pueden sintetizarse a partir de acrilamida y un ácido acrílico o un ácido acrílico que contiene un grupo vinilo, o a partir de monómeros que forman [2+2] foto reacciones de cicloadición. Otros ejemplos más de hidrogeles poliméricos 42 adecuados incluyen copolímeros mixtos de acrilamidas y acrilatos. Una variedad de arquitecturas poliméricas que contienen monómeros acrílicos (por ejemplo, acrilamidas, acrilatos, etc.) en los ejemplos descritos en la presente memoria, tales como polímeros ramificados, incluyendo polímeros en estrella, polímeros en forma de estrella o en bloque de estrella, dendrímeros y similares. Por ejemplo, los monómeros (por ejemplo, acrilamida, etc.) pueden incorporarse, aleatoriamente o en bloque, en las ramas (brazos) de un polímero en forma de estrella.
Para introducir el hidrogel polimérico 42 en el canal de flujo 32, se puede generar una mezcla del hidrogel polimérico 42 y luego aplicarla al sustrato 30, 30' (incluidas las depresiones 38). En un ejemplo, el hidrogel polimérico 42 puede estar presente en una mezcla (por ejemplo, con agua o con etanol y agua). La mezcla se puede aplicar entonces a las superficies del sustrato (incluyendo en las depresiones 38) usando recubrimiento por centrifugación, o recubrimiento por inmersión, recubrimiento por pulverización o flujo del material a presión positiva o negativa, u otra técnica adecuada. Estos tipos de técnicas depositan de forma transparente el hidrogel polimérico 42 sobre el sustrato 30, 30' (por ejemplo, en las depresiones 38 y en las regiones intersticiales 40 que rodean las depresiones 38). Otras técnicas de deposición selectiva (por ejemplo, que implican una máscara, técnicas de impresión controladas, etc.) pueden usarse para depositar específicamente el hidrogel polimérico 42 en las depresiones 38 y no en las regiones intersticiales 40.
En algunos ejemplos, la superficie del sustrato (incluida la porción que está expuesta en las depresiones 38) puede activarse, y luego la mezcla (incluido el hidrogel polimérico 42) puede aplicarse a la misma. En un ejemplo, un silano o derivado de silano (por ejemplo, norborneno silano) puede depositarse sobre la superficie del sustrato usando deposición en fase de vapor, recubrimiento por centrifugación u otros métodos de deposición. En otro ejemplo, la superficie del sustrato puede exponerse a cenizas de plasma para generar agente(s) activador (es) de superficie (por ejemplo, grupos-OH) que pueden adherirse al hidrogel polimérico 42.
Dependiendo del hidrogel polimérico 42, la mezcla aplicada puede exponerse a un proceso de curado. En un ejemplo, el curado puede tener lugar a una temperatura que varía de temperatura ambiente (por ejemplo, de aproximadamente 18°C a aproximadamente 25°C) a aproximadamente 95°C durante un tiempo que varía de aproximadamente 1 milisegundo a aproximadamente varios días.
En algunos ejemplos, se puede realizar un pulido para eliminar el hidrogel polimérico 42 de las regiones intersticiales 40 en el perímetro de las depresiones 38, mientras se deja el hidrogel polimérico 42 en la superficie en las depresiones 38 al menos sustancialmente intacto.
La celda de flujo 20 también incluye los cebadores de captura primero y segundo 22, 24 o 22, 24'. Se puede usar cualquier ejemplo de los cebadores de captura 22, 24 o 22, 24 ' marcados aquí. El conjunto de cebadores de captura 22, 24 o 22, 24' que se selecciona para una celda de flujo 20 particular puede depender, en parte, de qué oligonucleótido de genotipado 10, 10' se va a usar con el mismo.
Se puede realizar un proceso de injerto para injertar los cebadores de captura primero y segundo 22, 24 o 22, 24 en el hidrogel polimérico 42 en las depresiones 38. En un ejemplo, los cebadores de captura primero y segundo 22, 24 o 22, 24 'pueden inmovilizarse en el hidrogel polimérico 42 mediante unión covalente de un solo punto en o cerca de los extremos 5' de cada uno de los cebadores de captura primero y segundo 22, 24 o 22, 24'. Esta unión deja i) una porción específica de secuencia de cebador de los cebadores de captura 22, 24 o 22, 24 'libre para hibridar con su secuencia de cebador afín 12 o secuencia de cebador copiada Cis, Ci8', y ii) un grupo hidroxilo (OH) 3' libre para la extensión del cebador de captura. Se puede usar cualquier unión covalente adecuada para la unión del primer y segundo cebadores de captura 22, 24 o 22, 24 ' al hidrogel polimérico 42.
Los ejemplos de cebadores terminados que pueden usarse incluyen cebadores terminados en alquino, que pueden unirse a un resto azida del hidrogel polimérico 42. Como se ha mencionado, los ejemplos específicos de cebadores de captura adecuados 22, 24 incluyen los cebadores P5 y P7, y un ejemplo específico de un cebador de captura adecuado 24 ' es modificado en P7 para incluir el segundo sitio de endonucleasa de restricción.
En un ejemplo, el injerto puede implicar flujo a través de la deposición(por ejemplo, usando una tapa unida temporalmente o unida permanentemente o un sustrato adicional), revestimiento sumergido, revestimiento por pulverización, dispensación de charcos o mediante otro método adecuado que unirá los cebadores de captura 22, 24 o 22, 24' al hidrogel polimérico 42. Cada una de estas técnicas de ejemplo puede utilizar una solución o mezcla de cebador, que puede incluir el cebador o cebadores de captura 22, 24 o 22, 24', agua, un tampón y un catalizador. Con cualquiera de los métodos de injerto, el cebador o cebadores de captura 22, 24 o 22, 24 ' reaccionan con grupos reactivos de hidrogel polimérico 42 en las depresiones 38 y no tienen afinidad por las regiones intersticiales circundantes 40. Como tal, el cebador o cebadores de captura 22, 24 o 22, 24 ' se injertan selectivamente en el hidrogel polimérico 42 en las depresiones 38.
Métodos que Implican los O ligonucleótidos de Genotipado
Los ejemplos del método divulgado en el presente documento generalmente incluyen la introducción de un fluido de sonda de genotipado en una celda de flujo 20 que incluye depresiones individuales 38 y cebadores de captura primero y segundo 22, 24 o 22, 24' en cada una de las depresiones individuales 38, el fluido de sonda de genotipado que incluye una pluralidad de oligonucleótidos de genotipado 10 o 10', por lo que un oligonucleótido de genotipado respectivo 10 o 10' reacciona en al menos algunas de las depresiones individuales 38 para producir poblaciones clonales respectivas de amplicones a partir de una célula de flujo 20.el oligonucleótido de genotipado respectivo 10 o 10'; linealizar los amplicones para producir plantillas de sonda; secuenciar al menos una sección de identificación de sonda de las plantillas de sonda para identificar cada una de las secuencias de sonda; eliminar al menos las cadenas nacientes respectivas de las plantillas de sonda, por lo que se expone un grupo OH 3' en un extremo de las plantillas de sonda; hibridar muestras respectivas con las plantillas de sonda; y realizar reacciones de genotipado respectivas de las muestras en los grupos OH 3' expuestos.
En ejemplos del método, la celda de flujo 20 puede introducirse en un sistema (no mostrado), donde está en comunicación fluida con un sistema de control fluido (por ejemplo, bombas, válvulas y similares) y está en comunicación óptica con un sistema de iluminación y un sistema de detección.
De la fig. 3A a la Fig. 3H ilustran conjuntamente un ejemplo del método que implica el oligonucleótido de genotipado 10.
La fig. 3A representa una depresión 38 de la celda de flujo 20, que incluye el hidrogel polimérico 42 que tiene el primer y segundo cebadores de captura 22, 24 unidos al mismo. Como se describe aquí, el segundo cebador de captura 24 incluye un sitio de escisión 46.
En La Fig. 3B, se introduce un fluido de sonda de genotipado (no mostrado) en la celda de flujo 20 (por ejemplo, en cada canal de flujo 32). En este ejemplo, el fluido de sonda de genotipado incluye un vehículo líquido y el oligonucleótido de genotipado 10 en el vehículo líquido. El vehículo líquido del fluido de sonda de genotipado puede ser cualquier tampón de hibridación adecuado, tal como tampón Tris-HCL o tampón de citrato sódico (SSC) salino 0,5 x. En algunos ejemplos, el fluido de sonda de genotipado incluye una pluralidad de oligonucleótidos de genotipado 10, donde cada oligonucleótido de genotipado 10 incluye una secuencia de sonda 14 diferente de cada uno de los oligonucleótidos de genotipado 10. Con este fluido, se pueden administrar diferentes oligonucleótidos de genotipado 10 (cada uno con una secuencia de sonda única 14) a diferentes depresiones 38.
Como se muestra en la Fig. 3B, un oligonucleótido de genotipado 10 está semillado (seeding) dentro de la depresión 38. Más específicamente, la segunda secuencia cebadora 18 de un oligonucleótido de genotipado 10 hibrida con uno de los segundos cebadores de captura 24 en la depresión 38.
Cuando se semilla (seeding) un oligonucleótido de genotipado 10, la generación de agrupaciones puede iniciarse inmediatamente. En otros ejemplos, se pueden realizar hibridación (seeding) y generación de agrupaciones por separado. Los procesos implicados en la generación de agrupaciones se muestran en la Fig. 3B, Fig. 3C, Fig. 3D, y la Fig. 3E.
Como se representa por la flecha en la Fig. 3B, el oligonucleótido de genotipado 10 se copia de los cebadores hibridados mediante extensión 3 ' usando una ADN polimerasa. Esto genera el amplicón 44A, que está unido a la superficie de la celda de flujo a través del segundo cebador de captura 24. Las secciones marcadas Ci6, C14, Ci2 del amplicón 44A son copias complementarias del sitio de endonucleasa de restricción 16, la secuencia de sonda 14 y la primera secuencia de cebador 12, respectivamente.
El oligonucleótido de genotipado original 10 se desnaturaliza, dejando el amplicón 44A inmovilizado en la depresión 38 a través del segundo cebador de captura 24. El amplicón monocatenario 44A se voltea y forma un puente, por ejemplo, mediante la hibridación de la copia de secuencia del primer cebador Ci2 a un primer cebador de captura complementario adyacente 22. Esto se muestra en la Fig. 3C. Como se representa por la flecha en la Fig. 3C, el cebador hibridado (primer cebador de captura 22) se extiende luego por polimerasa(s) para formar otro amplicón 44B. Las secciones CC16, CC14 del amplicón 44B son copias complementarias de las secciones Cie, C14 y, por lo tanto, tienen las mismas secuencias que el sitio 16 de endonucleasa de restricción original y la secuencia 14 de sonda, respectivamente. La sección C24 del amplicón 44B es una copia complementaria del segundo cebador de captura 24 y, por lo tanto, tiene la misma secuencia que la secuencia del segundo cebador 18. Como se representa en la Fig. 3C, la formación del amplicón 44B genera un puente bicatenario que incluye los amplicones 44A y 44B.
El puente bicatenario se desnaturaliza a continuación, como se muestra en la Fig. 3D. Esto da como resultado dos copias (amplicones 44A y 44B) que están unidas covalentemente a la celda de flujo 20. La amplificación en puente isotérmico o alguna otra forma de amplificación amplifica las copias inmovilizadas. Por ejemplo, las plantillas copiadas forman un bucle para hibridarse con un cebador de captura complementario adyacente 22, 24, y una polimerasa copia los moldes copiados para formar puentes bicatenarios, que se desnaturalizan para formar dos hebras monocatenarias. Estas dos hebras se enlazan e hibridan con cebadores de captura complementarios adyacentes 22, 24 y se extienden de nuevo para formar dos nuevos bucles bicatenarios. El proceso se repite en cada copia de plantilla mediante ciclos de desnaturalización isotérmica y amplificación para crear densas agrupaciones clonales de puentes bicatenarios. Un agrupamiento simplificado, que incluye dos puentes bicatenarios, se muestra en la Fig. 3E.
Se entiende que el seeding de los oligonucleótidos de genotipado respectivos 10 en las depresiones respectivas 38 y la amplificación de dichos oligonucleótidos de genotipado 10 en las depresiones respectivas 38 puede tener lugar en condiciones en las que la velocidad de amplificación excede la velocidad del seeding. Como tal, la velocidad relativamente rápida a la que se hacen copias (amplicones 44A, 44B) dentro de la depresión 38 que se ha semillado (seeding) con un oligonucleótido de genotipado 10 excluirá eficazmente un segundo oligonucleótido de genotipado 10 del seeding dentro de esa depresión 38 para la amplificación. Como tal, un oligonucleótido de genotipado diferente 10 (con una secuencia de sonda única 14) puede capturarse y amplificarse en cada una de las depresiones 38, lo que permite analizar simultáneamente una pluralidad de loci de genotipado diana diferentes en la celda de flujo 20.
La linealización de los amplicones puenteados 44A, 44B se puede realizar escindiendo los amplicones unidos a los segundos cebadores de captura (por ejemplo, los amplicones 44A) en los respectivos sitios de escisión 46 de los segundos cebadores de captura 24; y desnaturalizando las porciones escindidas de los amplicones (por ejemplo, los amplicones 44A) unidos a los segundos cebadores de captura 24 para producir las plantillas de sonda 48 (Fig. 3F).
Para iniciar la escisión, se puede introducir un agente de escisión en la celda de flujo 20, por ejemplo, a través de un puerto de entrada (no mostrado). El agente de escisión que se selecciona dependerá del sitio de escisión 46 del segundo cebador de captura 24. El agente de escisión puede ser un agente de escisión químico o un agente de escisión enzimático dependiendo del sitio de escisión 46. La escisión en el sitio de escisión 46 corta los amplicones 44A entre los segundos cebadores de captura 24 y el resto de la secuencia del amplicón (que incluye las secciones Cie, C14 y Ci2o las secciones Cie, C14 y C22 (que es una copia complementaria del cebador de captura 22)).
Como resultado de la escisión, las secciones C16, C14 y C12 y las secciones C16, C14 y C22 ya no están unidas a la superficie de la celda de flujo a través de un cebador 24 y, por lo tanto, pueden eliminarse mediante desnaturalización. La desnaturalización puede tener lugar usando cualquier condición adecuada. La eliminación de las secciones C16, C14 y C12 y las secciones C16, C14 y C22 deja los amplicones 44B unidos a la superficie de la celda de flujo a través del primer cebador de captura 22 e hibridados con los segundos cebadores de captura 24 (a través de la sección C24). En este ejemplo, la porción monocatenaria expuesta de los amplicones 44B, específicamente las secciones CC16 y CC14, forman la plantilla de sonda 48. La sección CC14 es una copia complementaria de la sección C14, y por lo tanto tiene la misma secuencia que la secuencia de sonda 14. Secuenciación esta sección CCu permite identificar / decodificar la secuencia de sonda original 14. En algunos casos, una parte de la sección CC14 puede secuenciarse para identificar o descodificar la secuencia de sonda original. La sección cc16 es una copia complementaria de la sección Cie y, por lo tanto, tiene la misma secuencia que el sitio de enzima de restricción 16. Cuando se secuencia, la sección bicatenaria que incluye CCw y N16 (Fig. 3G) proporciona un sustrato para la escisión con enzimas de restricción.
Después de la escisión y desnaturalización, cada segundo cebador de captura 24 puede tener un fosfato 3 ' en su extremo que debe eliminarse antes del procesamiento adicional. El fosfato 3 ' puede eliminarse mediante la introducción de una quinasa, que desprotege el segundo cebador de captura 24, haciéndolo adecuado para su uso como cebador de secuenciación (como se describe en referencia a la Fig. 3G).
La fig. 3G ilustra la secuenciación de la plantilla de sonda 48, que incluye las secciones CC16 y CCu, la última de las cuales es la al menos una sección de identificación de sonda.
En el ejemplo mostrado, la secuenciación de la plantilla de sonda 48 implica usar el segundo cebador de captura 24 como cebador de secuenciación, y realizar una reacción de extensión de bases (una base cada vez) a lo largo de la plantilla de sonda 48. [00123] En otro ejemplo, la sección C24 y el segundo cebador de captura 24 pueden desnaturalizarse, y puede añadirse un cebador de secuenciación separado (que está en solución). El cebador de secuenciación separado puede hibridar con la sección C24, y se realizaría una reacción de extensión de bases (una base cada vez) a lo largo de la plantilla de sonda 48.
El proceso químico subyacente para la secuenciación puede ser polimerización (por ejemplo, catalizada por una enzima polimerasa). En un proceso particular basado en polimerasa, se añaden nucleótidos marcados con fluorescencia al segundo cebador de captura 24 de una manera dependiente de la plantilla, de modo que se puede realizar la detección del orden y tipo de nucleótidos añadidos al segundo cebador de captura 24. Esto permite determinar la secuencia de la sección de identificación de sonda, por ejemplo, la sección CC14, que se puede usar para descodificar la secuencia de sonda original 14.
Para iniciar un primer ciclo de secuenciación, uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc., puede suministrarse a/a través de la celda de flujo 20, etc., donde la extensión del cebador de secuenciación hace que se incorpore un nucleótido marcado a la plantilla de sonda 48. Esta incorporación se puede detectar a través de un proceso de formación de imágenes. Durante un proceso de formación de imágenes, un sistema de iluminación puede proporcionar una luz de excitación a la celda de flujo 20.
En algunos ejemplos, los nucleótidos marcados fluorescentemente pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que termina la extensión adicional del cebador una vez que se ha agregado un nucleótido a la plantilla 48. Por ejemplo, un análogo de nucleótido que tiene un resto terminador reversible se puede añadir a la plantilla 48 de tal manera que la extensión posterior no pueda ocurrir hasta que se administre un agente de desbloqueo para eliminar el resto. Por lo tanto, para ejemplos que usan terminación reversible, se puede suministrar un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo 20, etc. (después de que se produzca la detección).
El lavado o los lavados pueden tener lugar entre las diversas etapas de suministro de fluido. El ciclo de secuenciación puede repetirse entonces n veces para extender la plantilla 48 en n nucleótidos para generar una hebra naciente que incluye la sección naciente Nw (que es complementaria a la sección CCw) y la sección naciente N14 (que es complementaria a la sección CCu).
La secuenciación de la sección CC14 proporciona la sección de hebra naciente N14, que se puede usar para descodificar la secuencia de sonda original 14 del oligonucleótido de genotipado 10. Esta información permite al usuario identificar el locus de genotipado diana que se analizará en una depresión 38 particular (ya que todas las plantillas 48 en una depresión 38 tienen la misma sección de identificación de sonda, por ejemplo, CC14).
La secuenciación de la sección CCw proporciona la sección de hebra naciente N16. Como tal, este ejemplo de secuenciación también genera la sección bicatenaria, que incluye tanto CC16 como Nw, que proporciona un sustrato para la escisión con enzimas de restricción.
Después de secuenciar la sección o secciones de identificación de sonda, el método incluye además eliminar al menos las hebras nacientes respectivas (que incluyen las secciones N14 y Nw) de las plantillas de sonda 48, por lo que se expone un grupo OH 3' en un extremo de las plantillas de sonda 48. En este ejemplo, la eliminación implica más que la eliminación de las hebras nacientes N14 y Nw. En este ejemplo, la eliminación implica digerir los sitios de endonucleasa de restricción, por ejemplo, las secciones CC16 y N16; y desnaturalizar la hebra naciente restante, incluida la sección N14, de las plantillas de sonda 48.
La plantilla de sonda 48 incluye la sección CCw (que tiene la misma secuencia que el sitio de endonucleasa de restricción 16) y la hebra naciente incluye la sección N16 (que es complementaria al sitio de endonucleasa de restricción 16). Esta porción bicatenaria (secciones CC16 y N16) crea un sustrato para una endonucleasa de restricción apropiada (enzima de restricción). Como tal, mediante la introducción de la endonucleasa de restricción, se pueden digerir los sitios de endonucleasa de restricción, en este ejemplo, sección CCw y sección Nw. Como se menciona aquí, la enzima de restricción puede ser una endonucleasa de restricción cortadora de 4 bases, una endonucleasa de restricción cortadora de 5 bases, una endonucleasa de restricción cortadora de 6 bases, o similares. La enzima de restricción escinde las secciones CCW, nucleótidos específicos de Nwat, que se identifican esquemáticamente por las estrellas en la Fig. 3G. En este ejemplo, la digestión del sitio de endonucleasa de restricción deja el segundo cebador de captura 24, y el primer cebador de captura 22 que tiene la sección CC14 unida al mismo, y la hebra naciente N14 hibridada con la sección CC14. La hebra naciente Nu se desnaturaliza a continuación de la sección CC14. La digestión y la desnaturalización permiten que la sección CCw y las hebras nacientes N14, N16 se eliminen de la depresión 38 y la celda de flujo 20, por ejemplo, mediante una etapa de lavado.
La digestión y desnaturalización expone un OH 3' en un extremo de lo que queda de la plantilla de sonda 48. La plantilla de sonda restante se muestra con el número de referencia 52 en la Fig. 3H. La plantilla de sonda restante 52 incluye el primer cebador de captura 22 y la sección CC14, que es la misma que la secuencia de sonda original 14 y, por lo tanto, en este ejemplo, es complementaria a una muestra de ADN que tiene el locus de genotipado diana 54.
[00133] Una muestra de fragmentos de ADN desnaturalizados, incluyendo el locus de genotipado diana 54, se introduce en la celda de flujo 20. El locus de genotipado diana 54 puede incluirse en un fluido de biblioteca que incluye una pluralidad de
Una muestra de fragmentos de ADN desnaturalizados, incluyendo el locus de genotipado diana 54, se introduce en la celda de flujo 20. El locus de genotipado diana 54 puede incluirse en un fluido de biblioteca que incluye una pluralidad de loci de genotipado diana, de los cuales al menos algunos tienen loci diferentes a ser genotipados. Los loci de genotipado diana se pueden preparar a partir de la muestra de ADN más grande usando cualquier técnica de preparación de biblioteca de genotipado. Algunas técnicas de preparación de bibliotecas de genotipado implican amplificación y fragmentación. Otros implican amplificación sin fragmentación(ejemplos de los cuales se describen aquí más abajo). Como tal, varias copias de cualquier tipo de locus de genotipado diana 54 pueden estar presentes en el fluido de la biblioteca.
Una vez introducidos en la celda de flujo 20, los loci de genotipado diana 54 hibridan con las secciones complementarias respectivas CC14 de las plantillas de sonda restantes 52 en la depresión 38.
A continuación, se puede realizar la reacción de genotipado. En esta reacción, la plantilla de sonda restante 52 se usa como cebador de secuenciación para realizar un ciclo de secuenciación como se describe aquí. Como se muestra en la Fig. 3H, un nucleótido marcado 57, que es complementario a la nucleobase de interés en el locus de genotipado diana 54, se incorpora en la plantilla de sonda restante 52.
Aunque la descripción aquí descrita se dirige a una depresión 38 y, por lo tanto, al genotipado de un locus de genotipado diana 54, se entiende que cada depresión 38 incluye diferentes plantillas de sonda 52 con diferentes secciones CC14. Como tal, con este método, se pueden genotipar simultáneamente de cientos a miles a millones (dependiendo del número de depresiones en la celda de flujo 20) de diferentes loci.
La fig. 4A a la Fig. 4H ilustran conjuntamente otro ejemplo del método que implica el oligonucleótido de genotipado 10'.
La fig. 4A representa una depresión 38 de la celda de flujo 20, que incluye el hidrogel polimérico 42 que tiene el primer y segundo cebadores de captura 22, 24' unidos al mismo. Como se describe aquí, el segundo cebador de captura 24 'incluye el segundo sitio de endonucleasa de restricción 46'.
En La Fig. 4B, se introduce un fluido de sonda de genotipado (no mostrado) en la celda de flujo 20 (por ejemplo, en cada canal de flujo 32). En este ejemplo, el fluido de sonda de genotipado incluye un vehículo líquido y el oligonucleótido de genotipado 10 ' en el vehículo líquido. El vehículo líquido puede ser cualquiera de los ejemplos revelados aquí. En algunos ejemplos, el fluido de sonda de genotipado incluye una pluralidad de oligonucleótidos de genotipado 10', donde cada oligonucleótido de genotipado 10' incluye una secuencia de sonda 14 diferente de cada uno de los oligonucleótidos de genotipado 10'. Con este fluido, se pueden administrar diferentes oligonucleótidos de genotipado 10' (cada uno con una secuencia de sonda única 14) a diferentes depresiones 38.
Como se muestra en la Fig. 4B, un oligonucleótido de genotipificación 10 ' es semillado (seeding) dentro de la depresión 38. Más específicamente, la segunda secuencia cebadora 18 'y el sitio de endonucleasa de restricción 16 'de un oligonucleótido de genotipificación 10' hibridan respectivamente con uno de los segundos cebadores de captura 24 'y su sitio de endonucleasa de restricción 46' en la depresión 38.
Cuando un oligonucleótido de genotipificación 10' está semillado (seeding), la generación de agrupaciones puede iniciarse inmediatamente. En otros ejemplos, se pueden realizar hibridación (seeding) y generación de agrupaciones por separado. Los procesos implicados en la generación de agrupaciones se muestran en la Fig. 4B, Fig. 4C, Fig. 4D, y la Fig. 4E.
Como se representa por la flecha en la Fig. 4B, el oligonucleótido de genotipado 10 'se copia de los cebadores hibridados mediante extensión 3' usando una ADN polimerasa de alta fidelidad. Esto genera el amplicón 44C, que está unido a la superficie de la celda de flujo a través del segundo cebador de captura 24'. Las secciones marcadas C14, C28, C26 y C12 del amplicón 44C son copias complementarias de la secuencia de sonda 14, la porción de sitio de cebado 28, la porción de secuencia índice 26 y la primera secuencia de cebador 12, respectivamente.
El oligonucleótido de genotipado original 10' se desnaturaliza, dejando el amplicón 44C inmovilizado en la depresión 38 a través del segundo cebador de captura 24'y el segundo sitio de endonucleasa de restricción 46'. El único amplicón 44C trenzado se voltea y forma un puente, por ejemplo, mediante la hibridación de la copia de secuencia del primer cebador C12 a un primer cebador de captura complementario adyacente 22. Esto se muestra en la figura 4C.
Como se representa por la flecha en la Fig. 4C, el cebador hibridado se extiende luego por polimerasa (s)para formar otro amplicón 44d . Las secciones CC14, CC26, CC28 del amplicón 44D son copias complementarias de las secciones C14, C26, C28 y, por lo tanto, tienen las mismas secuencias que la secuencia de sonda original 14, la porción de secuencia índice 26 y la porción de sitio de cebado 28, respectivamente. La sección C46 del amplicón 44D es una copia complementaria del segundo sitio de endonucleasa de restricción 46' y, por lo tanto, tiene la misma secuencia que el sitio de endonucleasa de restricción 16' del oligonucleótido de genotipado 10'. La sección C24 del amplicón 44D es una copia complementaria del segundo cebador de captura 24' y, por lo tanto, tiene la misma secuencia de la segunda secuencia de cebador 18'. Como se representa en la Fig. 4C, la formación del amplicón 44D genera un puente bicatenario que incluye los amplicones 44C y 44D unidos covalentemente a la celda de flujo 20.
El puente bicatenario se desnaturaliza a continuación, como se muestra en la Fig. 4D. Esto da como resultado dos copias (amplicones 44C y 44D) que se unen covalentemente a la celda de flujo 20. La amplificación en puente isotérmico o alguna otra forma de amplificación amplifica las copias inmovilizadas. Por ejemplo, las plantillas copiadas forman un bucle para hibridarse con un cebador de captura complementario adyacente 22, 24', y una polimerasa copia las plantillas copiadas para formar puentes bicatenarios, que se desnaturalizan para formar dos cadenas monocatenarias. Estas dos hebras se enlazan e hibridan con cebadores de captura complementarios adyacentes 22, 24' y se extienden de nuevo para formar dos nuevos bucles bicatenarios. El proceso se repite en cada copia de plantilla mediante ciclos de desnaturalización isotérmica y amplificación para crear densas agrupaciones clonales de puentes bicatenarios. Un agrupamiento simplificado, que incluye dos puentes bicatenarios, se muestra en la Fig. 4E.
Se entiende que el seeding de los oligonucleótidos de genotipado respectivos 10' en las depresiones respectivas 38 y la amplificación de dichos oligonucleótidos de genotipado 10' en las depresiones respectivas 38 puede tener lugar en condiciones en las que la velocidad de amplificación excede la velocidad de seeding. Como tal, la velocidad relativamente rápida a la que se hacen copias (amplicones 44C, 44D) dentro de la depresión 38 que ha sido semillada (seeding) con un oligonucleótido de genotipado 10' excluirá eficazmente un segundo oligonucleótido de genotipado 10' del seeding dentro de esa depresión 38 para la amplificación. Como tal, un oligonucleótido de genotipado diferente 10' (con una secuencia de sonda única 14) puede capturarse y amplificarse en cada una de las depresiones 38, lo que permite analizar simultáneamente una pluralidad de loci de genotipado diana diferentes en la celda de flujo 20.
En este ejemplo, la amplificación puede realizarse usando dCTP metilado (trifosfato de desoxicitidina) para proteger el sitio de endonucleasa de restricción 16' y las copias complementarias C46 del segundo sitio de endonucleasa de restricción 46'. Esta modificación metilará completamente los amplicones 44C, 44D y dejará los cebadores de captura 22, 24' (incluido el segundo sitio de endonucleasa de restricción 46') hemi-metilados.
Los puentes bicatenarios se linealizan entonces. La linealización se describe con referencia a la Fig. 4E y la Fig. 4F. La linealización de los amplicones puenteados 44C, 44D en este método de ejemplo puede ser realizada digiriendo la porción de endonucleasa de restricción 56 de los amplicones 44C, 44D para dejar los segundos cebadores de captura 24 ' en las depresiones 38; y desnaturalizando una porción restante de los amplicones 44C, 44D para producir plantillas de sonda monocatenarias 49 que incluyen los primeros cebadores de captura 22 y la al menos una sección de identificación de sonda en las depresiones 38. El resultado del proceso de linealización se muestra en la Fig. 4F.
En este ejemplo, cada uno de los segundos cebadores de captura 24 'incluye además el segundo sitio de endonucleasa de restricción 46', en el que el segundo sitio de endonucleasa de restricción 46 'es complementario al sitio de endonucleasa de restricción 16' del oligonucleótido de genotipado 10 'y, por lo tanto, también es complementario a la sección C46'. Como se muestra en la Fig. 4E, los puentes bicatenarios incluyen las secciones hibridadas 46', C461, que proporcionan sustratos respectivos para la escisión con enzimas de restricción. Más específicamente, las secciones hibridadas C46 y 46' de los amplicones puenteados 44C, 44D constituyen la porción de endonucleasa de restricción 56, que es reconocible por una enzima de restricción de tipo IIS. En este ejemplo, la digestión de la porción de endonucleasa de restricción 56 se lleva a cabo mediante la introducción de la enzima de restricción de tipo IIS. La enzima de restricción de tipo IIS puede ser sensible a metilo o puede no ser sensible a metilo. Los protocolos metilados protegerán sitios internos a las copias de secuencia de sonda C14, CC14 y / o pueden proteger cortes simétricos. La enzima de restricción de tipo IIS reconocerá las secuencias de ADN asimétricas de la porción 56 y escindirá a una distancia definida (por ejemplo, de 1 nucleótido a aproximadamente 20 nucleótidos) fuera de la porción 56. La digestión deja los segundos cebadores de captura 24' unidos a la celda de flujo 20, y también escinde el amplicón 44C en una posición deseable para el genotipado.
Las porciones restantes de los amplicones 44C, 44D pueden desnaturalizarse entonces, lo que deja las plantillas de sonda monocatenarias 49 unidas a la celda de flujo 20. Como se muestra en la Fig. 4F, las plantillas de sonda monocatenarias 49 incluyen los primeros cebadores de captura 22 y la (al menos una) sección de identificación de sonda, que en este ejemplo incluye parte o la totalidad de la sección CC14, así como las secciones CC28 y CC26.
El método puede comprender además bloquear los segundos cebadores de captura 24 ' antes de la secuenciación a lo largo de la (al menos una) sección de identificación de sonda de cada una de las primeras plantillas de sonda monocatenarias 49. Se puede añadir un grupo de bloqueo (por ejemplo, un fosfato 3') que se une a los extremos expuestos 3' de los segundos cebadores de captura 24' para evitar la extensión no deseada en estos cebadores 24'.
Con referencia ahora a la Fig. 4F, se representa la secuenciación de al menos una sección de identificación de sonda de las plantillas de sonda monocatenarias 49. En este ejemplo, la (al menos una) sección de identificación de sonda es la sección CC26, que es idéntica a la porción de secuenciación de índice 26.
Secuenciar la (al menos una) sección de identificación de sonda implica introducir un cebador de secuenciación 50, que hibrida con la sección CC28, que es idéntica a la porción de sitio de cebado 28. Este cebador de secuenciación 50 hace que la (al menos una) sección de identificación de sonda, por ejemplo, CC26, de la plantilla de sonda monocatenaria 49 esté lista para la secuenciación. A continuación, se realiza una reacción de extensión de base a lo largo de la sección CC26.
El proceso químico subyacente para la secuenciación puede ser la polimerización (por ejemplo, catalizada por una enzima polimerasa) como se describe aquí con referencia a la Fig. 3G.
Para iniciar un primer ciclo de secuenciación, uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc., pueden suministrarse a/a través de la celda de flujo 20, etc., donde la extensión del cebador de secuenciación hace que un nucleótido marcado se incorpore en una hebra naciente N26 formada a lo largo de la sección cc26 de la plantilla de sonda monocatenaria 49. Esta incorporación se puede detectar a través de un evento de formación de imágenes.
En algunos ejemplos, los nucleótidos marcados fluorescentemente pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que termina la extensión adicional del cebador una vez que se ha agregado un nucleótido a la hebra naciente N26.
Por lo tanto, para ejemplos que usan terminación reversible, se puede suministrar un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo 20, etc. (después de que ocurra la detección).
El lavado o los lavados pueden tener lugar entre las diversas etapas de suministro de fluido. El ciclo de secuenciación puede repetirse entonces n veces para extender la plantilla de sonda monocatenaria 49 en n nucleótidos para generar una hebra naciente que incluye la sección naciente N26 (que es complementaria a la sección CC26, que tiene la misma secuencia que la porción de secuenciación de índice 26).
La secuenciación de la hebra naciente N26 se puede usar para identificar la sección CC26 y, por lo tanto, la porción de secuenciación de índice original 26, que es única para la secuencia de sonda 14 (y su copia complementaria C14). Esta información permite al usuario identificar el locus de genotipado diana que se analizará en una depresión 38 particular (dado que todas las plantillas 49 en una depresión 38 tienen la misma sección de identificación de sonda, por ejemplo, CC26, y sección de secuencia de sonda, por ejemplo, CC14).
Después de secuenciar la sección o secciones de identificación de sonda, el método incluye además eliminar al menos las hebras nacientes respectivas (que incluyen la sección N26) de las plantillas de sonda monocatenarias 49. En este ejemplo, la eliminación implica desnaturalizar el cebador de secuenciación 50 y la hebra naciente N26.
Una muestra de fragmentos de ADN monocatenario, que incluye el locus de genotipado diana 54, se introduce en la celda de flujo 20, como se muestra en la Fig. 4H. El locus de genotipado diana 54 puede incluirse en un fluido de biblioteca que incluye una pluralidad de loci de genotipado diana, al menos algunos de los cuales tienen diferentes loci a genotipar. Los loci de genotipado diana se pueden preparar a partir de la muestra de ADN más grande usando cualquier técnica de preparación de biblioteca de genotipado. Algunas técnicasde preparación de bibliotecas de genotipado implican amplificación y fragmentación. Otros implican amplificación sin fragmentación, como se describe aquí más abajo. Como tal, varias copias de cualquier tipo de locus de genotipado diana 54 pueden estar presentes en el fluido de la biblioteca.
Una vez introducidos en la celda de flujo 20, los loci de genotipado diana 54 hibridan con secciones complementarias CC14 respectivas de las plantillas de sonda monocatenarias 49 en la depresión 38.
La reacción de genotipado puede ser realizada entonces. En esta reacción, la plantilla de sonda monocatenaria 49 se usa como cebador de secuenciación para realizar un ciclo de secuenciación como se describe aquí. Como se muestra en la Fig. 4H, un nucleótido marcado 57, que es complementario a la nucleobase de interés en el locus de genotipificación diana 54, se incorpora en la plantilla de sonda monocatenaria 49.
Aunque la descripción en el presente documento se dirige a una depresión 38 y, por lo tanto, al genotipado de un locus de genotipado diana 54, se entiende que cada depresión 38 incluye diferentes plantillas de sonda monocatenarias 49 con diferentes secciones CC14. Como tal, con este método, se pueden genotipar simultáneamente de cientos a miles a millones (dependiendo del número de depresiones en la celda de flujo 20) de diferentes loci.
En los ejemplos revelados aquí, en lugar de bloquear los segundos cebadores de captura 24 o 24' durante la secuenciación y/o el genotipado, estos cebadores 24 o 24 ' podrían escindirse después de las reacciones de descodificación usando un proceso de escisión que no afectará de manera perjudicial a las plantillas 48 o 49 a genotipar.
Técnica de Preparación de B ibliotecas de Genotipado
Se puede usar cualquier técnica de preparación de biblioteca de genotipado adecuada para preparar el locus de genotipado diana 54.
El locus de genotipificación diana 54 puede prepararse a partir de ADN genómico. El ADN genómico puede aislarse de una o más células, fluidos corporales o tejidos. Se puede usar cualquier método adecuado para obtener un fluido corporal (por ejemplo, sangre, sudor, lágrimas, linfa, orina, saliva, semen, líquido cefalorraquídeo, heces o líquido amniótico). Algunos ejemplos específicos incluyen un hisopo bucal, enjuague bucal, extirpación quirúrgica, aspiración de biopsia o similares. El ADN genómico también se puede obtener de una o más células o tejidos en cultivo primario, en una línea celular propagada, una muestra de archivo fija, una muestra forense o una muestra arqueológica.
El ADNg se puede preparar lisando una célula que contiene el ADN. La célula puede lisarse en condiciones que conserven sustancialmente la integridad del ADNg de la célula. En un ejemplo particular, se puede usar lisis térmica para lisar una célula. En otro ejemplo particular, la exposición de una célula a pH alcalino puede usarse para lisar una célula causando relativamente poco daño al ADNg. Se puede usar cualquiera de una variedad de compuestos básicos para la lisis que incluyen, por ejemplo, hidróxido de potasio, hidróxido de sodio y similares. Adicionalmente, se puede obtener ADNg relativamente no dañado de una célula lisada por una enzima que degrada la pared celular. Las células que carecen de una pared celular, ya sea de forma natural o debido a la eliminación enzimática, también pueden lisarse mediante exposición a estrés osmótico. Otras condiciones que se pueden usar para lisar una célula incluyen exposición a detergentes, interrupción mecánica, calor de sonicación, diferencial de presión tal como en un dispositivo de prensa francesa u homogeneización de Dounce. Los agentes que estabilizan el ADNg se pueden incluir en un lisado celular o muestra de ADNg aislada que incluye, por ejemplo, inhibidores de nucleasas, agentes quelantes, sales, tampones y similares.
En algunos ejemplos, un lisado celular crudo que contiene ADNg puede amplificarse directamente sin aislamiento adicional del ADNg. Por ejemplo, una muestra de sangre puede exponerse a lisis térmica, y luego el lisado celular crudo puede amplificarse usando cualquier método adecuado, incluidos los descritos en el presente documento. Alternativamente, el ADNg puede aislarse adicionalmente de otros componentes celulares antes de la amplificación. Por consiguiente, la amplificación se puede llevar a cabo en ADNg purificado o parcialmente purificado. El ADN genómico se puede aislar usando métodos conocidos que incluyen, por ejemplo, extracción en fase líquida, precipitación, extracción en fase sólida, cromatografía y similares.
Se puede proporcionar una población representativa amplificada de fragmentos de genoma (loci de genotipado diana 54) amplificando un genoma nativo bajo condiciones que replican la plantilla de ADN genómico (ADNg) para producir una o más copias en las que la proporción relativa de cada secuencia copiada es sustancialmente la misma que su proporción en el ADNg original. Se puede usar cualquiera de una variedad de métodos que replican ADN genómico de una manera independiente de la secuencia para preparar los loci de genotipado diana 54. En los ejemplos revelados aquí, el ADN genómico bicatenario puede desnaturalizarse para generar plantillas de ADN genómico monocatenario que pueden usarse en los procesos de amplificación.
En un ejemplo específico, el método de amplificación implica poner en contacto una plantilla de ADN genómico monocatenario con una polimerasa de baja procesividad, una pluralidad de cebadores y nucleótidos libres, generando de este modo fragmentos complementarios de la plantilla de ADN genómico monocatenario; y desplazar los fragmentos complementarios de la plantilla de ADN genómico monocatenario, generando de este modo al menos algunas de las muestras respectivas.
La polimerasa de baja procesividad puede sintetizar hebras cortas porque se desprenden naturalmente de la plantilla de ADN genómico monocatenario antes de que se replique la hebra completa. Algunos ejemplos de polimerasa de baja procesividad pueden sintetizar menos de 100 bases por evento de polimerización. Se pueden obtener fragmentos más cortos usando una polimerasa que sintetiza menos de 50, 40, 30, 20, 10 o 5 bases por evento de polimerización en las condiciones de amplificación. La polimerasa de baja procesividad se selecciona del grupo que consiste en ADN polimerasa T4, ADN polimerasa T7, polimerasa Taq, fragmento Stoffel(fragmento de ADN polimerasa Taq), fragmento Klenow (el fragmento grande de ADN polimerasa I de Escherichia coli), ADN polimerasa Bsu, ADN polimerasa Bst y una polimerasa modificada genéticamente. En este método de ejemplo, el término "polimerasa modificada por ingeniería genética" es cualquier polimerasa sintética que está diseñada para sintetizar menos de 100 bases por evento de polimerización. Otras polimerasas de baja procesividad adecuadas incluyenE. coliPol III monomérica (que carece de la subunidad beta) oE. coliPol I.
La procesividad de algunas polimerasas puede alterarse por las condiciones de procesamiento que se usan. Por ejemplo, la procesividad puede alterarse por la temperatura de la reacción, el nivel de sal (por ejemplo, Mg2+) en la reacción (por ejemplo, fuerza iónica), el pH, la composición del tampón (por ejemplo, creatina quinasa o AMPc (monofosfato de adenosina cíclico)), o combinaciones de los mismos.
Como ejemplo, una ADN polimerasa T7 tiene baja procesividad a temperaturas por debajo de 37 ° C, y también a altas fuerzas iónicas, por ejemplo, NaCl superior a aproximadamente 100 mM; pero por lo demás tiene alta procesividad. Como otro ejemplo, una polimerasa Taq tiene alta procesabilidad a temperaturas de alrededor de 70 ° C cuando reacciona con un exceso molar de 10 veces de las muestras de ADN y los cebadores aleatorios. En otro ejemplo, la polimerización del fragmento Klenow de la ADN polimerasa de Escherichia coli puede ralentizarse disminuyendo el pH por debajo de pH 6,2. En otro ejemplo más, la eficacia de la ADN polimerasa de BST (BST pol), un pol de ADN de la familia A, puede manipularse varias veces mediante la sustitución de cofactores metálicos tales como Mg++ y Cd++.
Los cebadores pueden ser cebadores aleatorios. Se puede sintetizar una población de cebadores aleatorios para incluir un mayor contenido de nucleótidos de guanina (G) y/o citosina (C) en comparación con los nucleótidos de adenina (A) y timidina (T). La población de cebadores aleatorios resultante será rica en<g>O y, por lo tanto, tendrá una mayor probabilidad de hibridarse con regiones GO altas de un genoma, tales como regiones codificantes de genes de un genoma humano que normalmente tienen un contenido de GO más alto que las regiones de ADNg no codificantes. Los cebadores en una población de cebadores aleatorios también pueden tener una región de secuencia idéntica, tal como una cola universal. Una cola universal puede incluir un sitio de cebado universal para amplificación.
En este método de ejemplo, los nucleótidos libres pueden incluir cualquier nucleótido natural, tal como trifosfato de desoxiadenina, trifosfato de desoxitimina, trifosfato de desoxiguanina y trifosfato de desoxicitosina.
Poner en contacto la plantilla de ADN genómico monocatenario con la polimerasa de baja procesividad, la pluralidad de cebadores y los nucleótidos libres puede implicar mezclar los diversos componentes entre sí y exponerlos a condiciones de amplificación adecuadas para la polimerasa de baja procesividad que se usa. Durante la amplificación, los cebadores se unen a diferentes porciones de la plantilla de ADN genómico monocatenaria, y la polimerasa de baja procesividad introduce nucleótidos libres complementarios en la cadena plantilla de acuerdo con la secuencia de la hebra plantilla. La polimerasa de baja procesividad se desprende naturalmente de la hebra de plantilla, generalmente después de que 100 bases o menos hayan sido replicadas. Los fragmentos complementarios replicados se pueden desplazar usando, por ejemplo, desnaturalización. El método puede incluir repetir tanto el contacto como el desplazamiento de un número predeterminado de ciclos para generar fragmentos complementarios adicionales en cada uno del número predeterminado de ciclos.El método puede incluir repetir tanto el contacto como el desplazamiento de un número predeterminado de ciclos para generar fragmentos complementarios adicionales en cada uno del número predeterminado de ciclos.
Los siguientes son algunos ejemplos de este método.
La ADN polimerasa de T4 se puede usar para la amplificación de ADNg monocatenario o desnaturalizado, por ejemplo, en ácido N-(2 - Hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES) aproximadamente 50 mM (pH 7,5), Tris-HCL aproximadamente 50 mM (pH 8,6) o glicinato aproximadamente 50 mM (pH 9,7). Las mezclas de reacción de ejemplo también pueden incluir KCL aproximadamente 50 mM, MgCh aproximadamente 5 mM, ditiotreitol (DTT) aproximadamente 5 mM, ADNg aproximadamente 40 pg/ml, aproximadamente 0,2 mM de cada dNTP, aproximadamente 50 pg/ml de albúmina de suero bovino (BSA), cebador aleatorio aproximadamente 100 pM (n=6) y aproximadamente 10 unidades de ADN polimerasa T4 incubadas a 37°C durante al menos una hora. Los ciclos de temperatura se pueden usar para desplazar hebras replicadas para múltiples rondas de amplificación.
La polimerasa Taq tiene baja procesividad a temperaturas por debajo de 70°C. Por consiguiente, se pueden obtener pequeños fragmentos de ADNg usando polimerasa Taq a baja temperatura, o en otra condición en la que Taq tiene baja procesividad. En otro ejemplo, el Fragmento de Stoffel, que carece de los 289 residuos de aminoácidos N-terminales de la polimerasa Taq y tiene baja procesividad a 70° C, puede usarse para generar fragmentos de ADNg relativamente pequeños. El fragmento Taq o Stoffel se puede usar para amplificar plantillas de ADN monocatenario o desnaturalizado, y se pueden usar ciclos de temperatura para desplazar hebras replicadas para múltiples rondas de amplificación.
El fragmento de Klenow se puede usar para la amplificación isotérmica de un genoma para producir pequeños fragmentos de ADN genómico, por ejemplo, en una reacción con bajo contenido de sal (1=0,085) incubada a una temperatura entre aproximadamente 5 ° C y 37°C. Ejemplos de tampones y condiciones de pH que se pueden usar para amplificar ADNg con el fragmento de Klenow incluyen, por ejemplo, aproximadamente 50 mM de Tris HCL (pH 7 .5), aproximadamente 5 mM de MgCh, aproximadamente 50 mM de NaCl, albúmina de suero bovino (BSA) aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 0,2 mM de cada dNTP, aproximadamente 2 pg de cebador aleatorio (n=6), aproximadamente 10 ng de plantilla de ADNg y aproximadamente 5 unidades de fragmento de Klenow incubado a 37°C durante aproximadamente 16 horas. Se pueden realizar reacciones similares en las que se omiten o sustituyen uno o más componentes de reacción. Por ejemplo, el tampón se puede reemplazar con aproximadamente 50 mM de fosfato (pH 7,4) o se pueden usar otros valores de pH en el intervalo de aproximadamente 7,0 a 7,8. En otro ejemplo, las condiciones para la amplificación usando el fragmento de Klenow pueden incluir, por ejemplo, aproximadamente 10 ng de plantilla de ADNg, aproximadamente 2 mm de dNTP, aproximadamente 10 mM de MgCh, aproximadamente 0,5 U/pl (microlitro) de polimerasa, aproximadamente 50 uM (micromolar) de cebador aleatorio (n=6) e incubación isotérmica a 37°C durante 16 horas.
Otro ejemplo del método de amplificación divulgado en el presente documento implica poner en contacto una plantilla de ADN genómico monocatenario con una polimerasa, una pluralidad de cebadores y una mezcla de nucleótidos libres que incluyen nucleótidos naturales y trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP), generando de este modo fragmentos complementarios truncados de la plantilla de ADN genómico monocatenario; y desplazar los fragmentos complementarios truncados de la plantilla de ADN genómico monocatenario, generando de este modo al menos algunas de las muestras respectivas.
En este ejemplo, se puede usar cualquier polimerasa adecuada. El ddTTP actúa como agente truncante y, por lo tanto, se puede usar una polimerasa de alta procesividad. Cualquiera de las polimerasas marcadas aquí puede usarse en este método de ejemplo, siempre que las condiciones de procesamiento puedan alterarse de modo que la polimerasa muestre una mayor procesabilidad (por ejemplo, pueda sintetizar más de 100 bases por evento de polimerización). En un ejemplo, la polimerasa de alta procesividad se selecciona del grupo que consiste en ADN polimerasa T4, ADN polimerasa T7, polimerasa Taq, Fragmento Stoffel, Fragmento Klenow, ADN polimerasa Bsu, ADN polimerasa Bst y una polimerasa modificada genéticamente. En este método de ejemplo, el término "polimerasa modificada por ingeniería genética" es cualquier polimerasa sintética que está diseñada para sintetizar más de 100 bases por evento de polimerización. Las polimerasas de alta procesividad pueden producir fragmentos de 10 kb (kilobases) a 20 kb de longitud. Otras polimerasas de alta procesividad adecuadas incluyen la polimerasa 29.
En este ejemplo, se puede usar cualquiera de los cebadores aleatorios descritos aquí.
En este método de ejemplo, los nucleótidos libres en la mezcla incluyen nucleótidos naturales y trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP). El trifosfato de didesoxitimidina sirve como nucleótido de terminación de síntesis o agente truncador. En un ejemplo, los nucleótidos naturales incluyen trifosfato de desoxiadenina, trifosfato de desoxitimina, trifosfato de desoxiguanina y trifosfato de desoxicitosina. En un ejemplo, la mezcla de nucleótidos libres incluye una relación de trifosfato de desoxitimina (dTTP) a trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) que varía de aproximadamente 10:5 a aproximadamente 10:0,01. Una relación dentro de este intervalo ayuda a asegurar que se incorpora un número deseado de trifosfato de desoxitimina en los fragmentos generados antes de que el trifosfato de didesoxitimidina trunque la amplificación. En un ejemplo específico, la relación de dTTP a ddTTP es de aproximadamente 10: 1.
Poner en contacto la plantilla de ADN genómico monocatenario con la polimerasa, una pluralidad de cebadores y la mezcla de nucleótidos libres puede implicar mezclar los diversos componentes entre sí y exosarlos en condiciones de amplificación adecuadas para la polimerasa que se usa. Durante la amplificación, los cebadores se unen a diferentes porciones de la plantilla de ADN genómico monocatenario, y la polimerasa introduce nucleótidos naturales complementarios en la hebra plantilla de acuerdo con la secuencia de la hebra molde. Cuando se introduce trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) en lugar de trifosfato de desoxitimidina (dTTP), se termina la amplificación de la hebra particular. Como tal, el ddTTP trunca el fragmento de ADN replicado. La relación de dTTP a ddTTP en la mezcla ayuda a asegurar que los fragmentos generados son suficientemente largos para el análisis posterior.
Los fragmentos complementarios truncados replicados se pueden desplazar usando, por ejemplo, desnaturalización. El método puede incluir repetir tanto el contacto como el desplazamiento de un número predeterminado de ciclos para generar fragmentos complementarios truncados adicionales en cada uno del número predeterminado de ciclos.
Cualquiera de los tampones (por ejemplo, HEPES, Tris-HCL, glicinato, etc.), sales (por ejemplo, KCL, MgCk, etc.), reactivos redox (por ejemplo, ditiotreitol) y / o estabilizadores (por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA)) se pueden usar en este método de ejemplo en cantidades adecuadas para una alta procesividad.
En un ejemplo específico, la ADN polimerasa de T7 tiene alta procesividad en las siguientes condiciones de reacción: aproximadamente 40 mM de Tris-HCL. pH 7,5., aproximadamente 15 mM de MgCh , aproximadamente 25 mM de NaCl, aproximadamente 5 mM de DTT, aproximadamente 0,25 mM de cada dNTP, de aproximadamente 0,00025 mM a aproximadamente 0,125 mM de ddTTP, ADNg monocatenario de 50 pg/ml, cebador aleatorio de aproximadamente 100 pM (n=6), de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 unidad de a Dn polimerasa T7, temperatura de reacción superior a 37°C.
En otro ejemplo específico, la polimerasa Taq es altamente procesadora a temperaturas de alrededor de 70 ° C cuando reacciona con un exceso molar de 10 veces de la muestra de ADN y los cebadores aleatorios (n=6). Una reacción de amplificación realizada en estas condiciones puede incluir además un tampón, tal como Tris-HCL a aproximadamente 20 mM, pH de aproximadamente 7, MgCh de aproximadamente 1 mM a 2 mM, aproximadamente 0,2 mM de cada dNTP y de aproximadamente 0,0002 mM a aproximadamente 0,1 mM de ddTTP.
Adicionalmente, se puede añadir un agente estabilizante, tal como glicerol, gelatina, BSA o un detergente no iónico.
En otro ejemplo específico más, el fragmento de Klenow tiene una alta procesividad en las siguientes condiciones de reacción: aproximadamente 10 mM de Tris-HCL , pH 7,9, aproximadamente 10 mM de MgCh , aproximadamente 50 mM de NaCl, aproximadamente 1 mM de DTT y aproximadamente 100 g/mol de BSA
En otro ejemplo específico más, la ADN polimerasa Bst tiene una alta procesividad en las siguientes condiciones de reacción: aproximadamente 20 mM de Tris-HCL , pH 8,8, aproximadamente 10 mM de (NH4)2SO4, aproximadamente 10 mM de KCL, aproximadamente 2 mM de MgSO4 y aproximadamente el 0,1% de un tensioactivo no iónico (por ejemplo, TRITON™ X-100 de Dow Chemical Co.).
Ambos procesos de amplificación revelados aquí generan una pluralidad de fragmentos de ADNg sin tener que usar un proceso de fragmentación. El ADNg monocatenario sirve como plantilla para varios loci de genotipado diana 54, y se generan varios amplicones de cada locus de genotipado diana 54. Cuando se introduce en una celda de flujo 20 con las plantillas 48 o 49
seccones compemen aras respec vas e as pan as o para ser geno pa os.
Kits
Los nucleótidos de genotipado 10 o 10' y la celda de flujo 20 pueden ser parte de un kit de genotipado.
En un ejemplo, un kit comprende: una celda de flujo 20 que incluye un sustrato 30, 30' que tiene depresiones 38 separadas por regiones intersticiales 40 y cebadores de captura primero y segundo 22, 24 o 22, 24' unidos dentro de cada una de las depresiones 38; y un fluido de sonda de genotipado que incluye un vehículo líquido y un oligonucleótido de genotipado 10 o 10' en el vehículo líquido, el oligonucleótido de genotipado 10 o 10' que incluye una primera secuencia de cebador 12, una secuencia de sonda 14 representativa de un locus de genotipado diana 54, un sitio de endonucleasa de restricción 16, 16' y una segunda secuencia de cebador 18, 18' que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura 24, 24'.
El kit también puede incluir componentes de preparación de biblioteca de genotipado, tales como una muestra de genoma completo, una polimerasa (que puede ser una polimerasa de baja procesividad como se define aquí), una pluralidad de cebadores y nucleótidos libres (en algunos ejemplos que incluyen nucleótidos naturales, y en otros ejemplos que incluyen una mezcla de nucleótidos naturales y trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP)).
Se puede usar cualquier ejemplo del oligonucleótido de genotipado 10 o 10' en el kit y se puede usar cualquier ejemplo de la celda de flujo 20 en el kit. [00198] El kit puede incluir alternativamente una celda de flujo sin patrón con cebadores a través de toda la superficie de un canal de flujo

Claims (20)

1. Un kit, que comprende:
una celda de flujo (20), que incluye:
un sustrato (30, 30'); y
cebadores de captura primero (22) y segundo (24, 24') unidos al sustrato (30, 30'); y un fluido de sonda de genotipado, que incluye:
un vehículo líquido; y
un oligonucleótido de genotipado (10, 10') en el vehículo líquido, incluyendo el oligonucleótido de genotipado (10, 10'):
una primera secuencia de cebador (12);
una secuencia de sonda (14) representativa de un locus de genotipado diana (54); un sitio de endonucleasa de restricción (16, 16'); y
una segunda secuencia de cebador (18, 18') que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura (24, 24').
2. El kit como se define en la reivindicación 1, en el que el fluido de sonda de genotipado incluye una pluralidad de oligonucleótidos de genotipado (10, 10'), y en el que cada oligonucleótido de genotipado (10, 10') incluye una secuencia de sonda (14) diferente de cada otro oligonucleótido de genotipado (10, 10').
3. El kit como se define en una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el segundo cebador de captura (24, 24') incluye un sitio de escisión (46).;
preferiblemente, en el que el sitio de endonucleasa de restricción (16, 16') es sensible a una endonucleasa de restricción seleccionada del grupo que consiste en una endonucleasa de restricción de corte de 4 bases, una endonucleasa de restricción de corte de 5 bases y una endonucleasa de restricción de corte de 6 bases.
4. El kit como se define en una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el segundo cebador de captura (24, 24') incluye además un segundo sitio de endonucleasa de restricción (46'), en el que el segundo sitio de endonucleasa de restricción (46') es complementario al sitio de endonucleasa de restricción (16, 16' ) del oligonucleótido de genotipado (10, 10').;
preferiblemente, en el que el sitio de endonucleasa de restricción (16, 16') y el segundo sitio de endonucleasa de restricción (46') son sensibles a una endonucleasa de restricción sensible a metilo de tipo IIS.
5. El kit como se define en una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el oligonucleótido de genotipado (10, 10') comprende además una porción de secuencia índice (26) y una porción de sitio de cebado (28) entre la primera secuencia de cebador (12) y la secuencia de sonda (14).
6. El kit como se define en una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que: el sustrato (30, 30') tiene depresiones (38) separadas por regiones intersticiales (40).;
y
los cebadores de captura primero (22) y segundo (24, 24') están unidos dentro de cada una de las depresiones (38).
7. Un método, que comprende:
introducir un fluido de sonda de genotipado en una celda de flujo (20) que incluye un primer (22) y un segundo cebadores de captura (24, 24'), incluyendo el fluido de sonda de genotipado una pluralidad de oligonucleótidos de genotipado (10, 10'), incluyendo cada uno de los oligonucleótidos de genotipado (10, 10')
una primera secuencia de cebador (12);
una secuencia de sonda (14) representativa de un locus de genotipado diana respectivo (54); un sitio de endonucleasa de restricción (16, 16'); y
una segunda secuencia de cebador (18, 18') que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura (24,24');
por lo que un oligonucleótido de genotipado respectivo (10, 10') reacciona para producir poblaciones clonales respectivas de amplicones (44a , 44B, 44C, 44D) a partir del oligonucleótido de genotipado respectivo (10, 10');
linealizar los amplicones (44A, 44B, 44C, 44D) para producir plantillas de sonda (48, 49); secuenciar al menos una sección de identificación de sonda de las plantillas de sonda (48, 49) para identificar cada una de las secuencias de sonda (14);
retirar al menos las hebras nacientes respectivas de las plantillas de sonda (48, 49), por lo que se expone un grupo OH 3' en un extremo de las plantillas de sonda (48, 49).;
hibridar muestras respectivas (54) con las plantillas de sonda (48, 49); y realizar reacciones de genotipado respectivas de las muestras (54) en los grupos OH 3' expuestos.
8. El método como se define en la reivindicación 7, en el que la linealización de los amplicones (44A, 44B) implica:
escindir los amplicones (44A, 44B) unidos a los segundos cebadores de captura (24, 24') en los respectivos sitios de escisión (46) de los segundos cebadores de captura (24, 24'); y
e capura , para pro ucr as pan as e son a .
9. El método como se define en la reivindicación 8, en el que la secuenciación de la al menos una sección de identificación de sonda de las plantillas de sonda (48) implica realizar una reacción de extensión de bases a lo largo de la (al menos una) sección de identificación de sonda usando el segundo cebador de captura (24, 24') como cebador de secuenciación (50).;
preferiblemente, en el que la eliminación de al menos las respectivas hebras nacientes de las plantillas de sonda (48) implica:
digerir los sitios de endonucleasa de restricción; y
desnaturalizar una hebra naciente restante de las plantillas de sonda (48).
10. El método como se define en la reivindicación 7, en el que cada uno de los segundos cebadores de captura (24, 24') incluye además un segundo sitio de endonucleasa de restricción (46'), en el que el segundo sitio de endonucleasa de restricción (46') es complementario al sitio de endonucleasa de restricción (16, 16') del oligonucleótido de genotipado (10, 10'), y en el que la linealización de los amplicones (44C, 44D) implica:
digerir una porción de endonucleasa de restricción (56) de los amplicones (44C, 44D) para dejar los segundos cebadores de captura (24, 24'); y
desnaturalizar una porción restante de los amplicones (44C, 44D) para producir plantillas de sonda monocatenarias (49) que incluyen los primeros cebadores de captura (22) y la (al menos una) sección de identificación de sonda.
11. El método como se define en la reivindicación 10, en el que la secuenciación de la al menos una porción de sección de identificación de sonda de las plantillas de sonda monocatenarias (49) implica:
introducir un cebador de secuenciación (50); y
realizar una reacción de extensión de bases a lo largo de la (al menos una) sección de identificación de sonda de cada uno de las plantillas de sonda monocatenarios (49).
12. El método como se define en la reivindicación 11, en el que la eliminación de al menos las cadenas nacientes respectivas de las plantillas de sonda monocatenarias (49) implica
desnaturalizar las hebras nacientes de la (al menos una) sección de identificación de sonda.
13. El método como se define en una de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende además bloquear los segundos cebadores de captura (24, 24') antes de la secuenciación a lo largo de la (al menos una) sección de identificación de sonda de cada uno de las plantillas de sonda monocatenarios (49).
14. El método como se define en una de las reivindicaciones 7 a 13, que comprende además correlacionar cada secuencia de sonda identificada (14) con una población clonal respectiva de amplicones (44A, 44B, 44C, 44D).
15. El método como se define en una de las reivindicaciones 7 a 14, en el que antes de hibridar las muestras respectivas con las plantillas de sonda (48, 49), el método comprende además preparar las muestras respectivas (54) mediante: poner en contacto una plantilla de ADN genómico monocatenario con una polimerasa de baja procesividad, una pluralidad de cebadores y nucleótidos libres, generando así fragmentos complementarios de la plantilla de ADN genómico monocatenario; y desplazar los fragmentos complementarios de la plantilla de ADN genómico monocatenario, generando así al menos algunas de las muestras respectivas (54).;
preferiblemente, en el que el método comprende además:
repetir tanto el contacto como el desplazamiento de un número predeterminado de ciclos para generar fragmentos complementarios adicionales en cada uno del número predeterminado de ciclos.
16. El método como se define en la reivindicación 15, que comprende además desnaturalizar un ácido desoxirribonucleico genómico bicatenario (ADN), generando así la plantilla de ADN genómico monocatenario.
17. El método como se define en la reivindicación 15, en el que la polimerasa de baja procesividad se selecciona del grupo que consiste en ADN polimerasa T4, ADN polimerasa T7, polimerasa Taq, Fragmento Stoffel, Fragmento Klenow, ADN polimerasa Bsu, ADN polimerasa Bst y una polimerasa modificada genéticamente.
18. El método como se define en una de las reivindicaciones 7 a 14, en el que antes de hibridar las muestras respectivas (54) con las plantillas de sonda (48, 49), el método comprende además preparar las muestras respectivas (54) mediante:
poner en contacto una plantilla de ADN genómico monocatenario con una polimerasa, una pluralidad de cebadores y una mezcla de nucleótidos libres que incluyen nucleótidos naturales y trifosfato de didesoxitimidina, generando de este modo fragmentos complementarios truncados de la plantilla de ADN genómico monocatenario; y desplazar los fragmentos complementarios truncados de la plantilla de ADN genómico monocatenario, generando de este modo al menos algunas de las muestras respectivas (54);
repe r an o e conaco como e espazamen o e un n mero pre e ermna o e ccos para generar fragmentos complementarios truncados adicionales en cada uno del número predeterminado de ciclos.
19. El método como se define en la reivindicación 18, en el que los nucleótidos naturales incluyen trifosfato de desoxiadenina, trifosfato de desoxitimina, trifosfato de desoxiguanina y trifosfato de desoxicitosina, y en el que la mezcla de nucleótidos libres incluye una proporción de trifosfato de desoxitimina a trifosfato de didesoxitimidina que varía de aproximadamente 10: 5 a aproximadamente 10: 0,01.
20. El método como se define en la reivindicación 18, que comprende además desnaturalizar un ácido desoxirribonucleico genómico bicatenario (ADN), generando así la plantilla de ADN genómico monocatenario; y/o en el que la polimerasa se selecciona del grupo que consiste en ADN polimerasa T4, ADN polimerasa T7, polimerasa Taq, Fragmento Stoffel, Fragmento Klenow, ADN polimerasa Bsu, ADN polimerasa Bst y una polimerasa modificada genéticamente.
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