JP2023513611A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ２に対する免疫応答を誘導するためのワクチン及びその利用 - Google Patents
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Abstract
組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質、ペプチド、又はそのフラグメントをコードする異種核酸インサートを含み、発現させると、保護免疫を誘導することができる、ｒＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２及びその変異体に対する免疫を提供するために、プライミングワクチン接種戦略において、又はプライム／ブーストワクチン接種戦略において使用され得る。
Description
［関連出願の相互参照］
本願は、２０２０年２月１４日付で出願された米国仮出願第６２／９７６，９１３号、２０２０年２月１６日付で出願された米国仮出願第６２／９７７，４０２号、２０２０年３月２０日付で出願された米国仮出願第６２／９９２，７１０号及び２０２０年５月１８日付で出願された米国仮出願第６３／０２６，５８０号の優先権の利益を主張し、それぞれの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
本願は、２０２０年２月１４日付で出願された米国仮出願第６２／９７６，９１３号、２０２０年２月１６日付で出願された米国仮出願第６２／９７７，４０２号、２０２０年３月２０日付で出願された米国仮出願第６２／９９２，７１０号及び２０２０年５月１８日付で出願された米国仮出願第６３／０２６，５８０号の優先権の利益を主張し、それぞれの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
本発明は、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に対する宿主における免疫応答を誘導するための組成物、並びにかかる組成物の使用及び製造方法を提供する。特に、本明細書に記載の組成物は、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原をコードする組換え改変ワクシニア・アンカラ（vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）ウイルスコンストラクトである。該組成物を、広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２変異体に対する免疫を提供するために、プライミングワクチン接種戦略又はプライム／ブーストワクチン接種戦略において使用することができる。
［参照による援用］
「１９１０１－００２ＷＯ１＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿０２＿１１＿２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名前が付けられ、２０２１年２月１２日に作成され、サイズ５４０ＫＢであるテキストファイルの内容は、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす。
「１９１０１－００２ＷＯ１＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿０２＿１１＿２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名前が付けられ、２０２１年２月１２日に作成され、サイズ５４０ＫＢであるテキストファイルの内容は、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす。
コロナウイルス（ＣｏＶ）（ニドウイルス目、コロナウイルス科、コロナウイルス亜科）は、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。比較すると、ＣｏＶはＲＮＡウイルスにしては大きなゲノムを有し、長さは２６キロベース（ｋｂ）～３２ｋｂのサイズの範囲である。ＣｏＶゲノムは、スパイク（Ｓ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質の４つの主要な構造タンパク質をコードしており、これらは全て構造的に完全なウイルス粒子を製造するために必要である。例えば、非特許文献１を参照されたい。各主要なＣｏＶ構造タンパク質は、ウイルス粒子の構造において役割を果たし、複製サイクルの他の側面において関与し得る。遺伝的及び抗原的基準に基づいて、ＣｏＶは３つのグループ：α－ＣｏＶ、β－ＣｏＶ、及びγ－ＣｏＶに編成されている（非特許文献２）。
コロナウイルスは主に鳥類及び哺乳類に感染するが、ヒトにも感染する可能性がある（例えば、非特許文献３、非特許文献４を参照されたい）。ヒトにおけるコロナウイルス感染症は、一般的な風邪に似た上気道感染症から、気管支炎、肺炎、更には重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）等の下気道感染症まで、重症度が様々である。
幾つかのＣｏＶは当初は、天然の動物宿主のみに限定される家畜地方病性感染症（enzootic infections）として見出されたが、動物とヒトの種の障壁を越えて、ヒトにおける人獣共通感染症を確立した。例えば、非特許文献５、非特許文献６を参照されたい。異種間の障壁を乗り越えることで、ＳＡＲＳ ＣｏＶ及び中東呼吸器症候群ＣｏＶ（ＭＥＲＳ）等のＣｏＶが毒性のあるヒトウイルスとして現れるようになった（非特許文献７）。例えば、２００３年のＳＡＲＳ ＣｏＶでは、８０９６人の確定症例がもたらされ、世界中で７７４人の死亡が報告され、致死率は９．６％であった（非特許文献８、http://www.who.int/csr/sars/country/table2004_04_21/en/index.html.から入手可能）。２０１２年４月以降、ＭＥＲＳの確定症例は２２２９例報告され、関連死亡者は７９２例で、致死率は３５．５％となっている（非特許文献９、http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/risk-assessment-august-2018.pdf?ua=1.から入手可能）。
最近、中国の武漢で始まったアウトブレイクには新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）が関係しているとされている。２０２０年１月３０日の世界保健機関の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）のアウトブレイクに関する国際保健規則（２００５年）緊急委員会の第２回会合に関する声明を参照されたい。２０２０年１月３１日時点のオリジナルからのアーカイブは、https://www.who.int/news-room/detail/30-01-2020-statement-on-the-second-meeting-of-the-international-health-regulations-(2005)-emergency-committee-regarding-the-outbreak-of-novel-coronavirus-(SARS-CoV2)にて入手可能である。初期の症例の多くは、中国武漢市の大規模な魚介類及び動物の市場に関連しており、このウイルスは人獣共通感染症の起源であると考えられている（非特許文献１０、非特許文献１１）。このウイルスサンプルと他のウイルスサンプルとの遺伝子配列の比較は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（７９．５％）及びコウモリコロナウイルス（９６％）に対する類似性を示し（非特許文献１２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２はベータコロナウイルスとクラスターを形成して、サルベコウイルス亜属の系統Ｂでは２つのコウモリ由来ＳＡＲＳ様株と共に別個のクレードを形成する。ウイルスの起源はまだ明らかではない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、最近の研究では、膜エキソペプチダーゼであるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２がヒト細胞への侵入に使用する受容体であることを確認した。
アウトブレイクの拡大を制御する試みにおいて、検疫及び渡航制限が世界中で実施されている。それにもかかわらず、２０２１年２月現在、世界中で１億７００万人以上の個人症例が報告され、２３０万人を超える死者が出ており、ウイルスの推定致死率は約０．７％である。
ヒトコロナウイルスに対する治療用ワクチンの開発の歴史は、問題の複雑さ及び課題を示している。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する市販のワクチンは、これらのウイルスがそれぞれ２０１２年及び２００３年に発見されたという事実にもかかわらず、まだない。安全性、忍容性、及び必要な長さの免疫原性の所望の結果を達成するフレームワーク及び抗原性成分の選択は困難であり、数々の失敗を伴う可能性がある。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を軽減又は予防するために、多くのワクチンが開発中である。２０２０年１２月１１日、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防のために１６歳以上の人を対象にPfizer-BioNTechのＣＯＶＩＤ－１９ワクチン（ＢＮＴ１６２ｂ２）の緊急使用許可（ＥＵＡ）を発行した。２０２０年１２月１８日、米国食品医薬品局は、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされるコロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防のための２番目のワクチンの緊急使用許可（ＥＵＡ）を発行した。緊急使用許可により、１８歳以上の個人に使用するためにModernaTX, Inc.のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン（ｍＲＮＡ－１２７２）を米国で配布することが可能になる。PfizerとModernaの両ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質のみをコードするｍＲＮＡワクチンである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は、他のＳＡＲＳ関連コロナウイルスと同様に高い変異率を示しており、この変異率はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の進化及びゲノム変異性を駆動し、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２が宿主免疫及び現在のワクチンによって提供される免疫から逃れることを可能にする可能性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ゲノム配列の原報以来、多数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２変異体が同定されており、これは様々なワクチン接種戦略の治療有効性に潜在的に影響を及ぼす可能性がある。例えば、構造スパイクタンパク質において最近同定された多数の変異は、変異による逃避のためにワクチン戦略が無効になるかもしれないという懸念を提起している。スパイクタンパク質への最近の変異は、現在のワクチンの有効性について重大な懸念を提起している。例えば、小規模な臨床試験では、Oxford-AstraZenecaワクチンは南アフリカの変異株５０１Ｙ．Ｖ２に対する有効性を低下させることが示された。５０１Ｙ．Ｖ２変異体に存在するＥ４８４Ｋ変異は、現在のワクチンの有効性を低下させ、潜在的なエスケープ突然変異体をもたらす可能性があることが懸念される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の高い死亡率は、その伝播の容易さと速度、及び変異率と共に、有効なＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンの開発の必要性を強調している。
したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する治療用ワクチン、並びに関連するプラスミド及びコンストラクト、また感染のリスクがあるヒトに免疫原性を付与するためのそれらの使用を提供することが本発明の目的である。
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組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質、ペプチド、又はそのフラグメントをコードする異種核酸インサートを含み、発現させると、保護免疫を誘導することができる、ｒＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。本明細書に記載の組成物は、プライミングワクチン接種戦略又はプライム／ブーストワクチン接種戦略において、潜在的なエスケープ突然変異体を含む広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２変異体に対する免疫を提供するために使用することができる。
一態様では、ｒＭＶＡウイルスベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原、例えばスパイク（Ｓ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質を、レシピエント宿主細胞においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態で発現するように設計されており（例えば、図２０を参照されたい）、ＶＬＰの発現及び形成は、潜在的な免疫学的に優勢なエピトープの増強された提示に起因する変異系統に対する保護免疫を提供するのに十分である。発現に続いてＶＬＰとして提示されるより広い範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原を発現させることにより、複数の抗原にわたってより堅牢な液性及び細胞性の応答を生成することができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２変異体による変異免疫逃避のリスクを低減することができる。例えば、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質を含むコロナウイルスＶＬＰを発現させることにより、Ｓタンパク質のみを対象としたワクチンと比較して、より堅牢な免疫応答を生成することができ、したがって、例えばＳタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のアミノ酸置換（例えばＫ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ及び／又はＮ５０１Ｙのものを含む）を含む変異によりウイルスによる免疫逃避の可能性を低減する。
幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、ＶＬＰの２つの異なる集団が産生されるようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原を発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原を非コロナウイルスウイルス性糖タンパク質との融合タンパク質として発現し、ウイルスマトリックスタンパク質を別々に発現し、ここで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ポリペプチド抗原－糖タンパク質融合体及びマトリックスタンパク質は、ＶＬＰを形成することができる。
幾つかの実施の形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及びスパイク（Ｓ）タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列を含むｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質、及びＳタンパク質を発現させると、ＶＬＰが形成される（例えば、図２０を参照されたい）。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、例えば、図１Ａに例示されるように、全長Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸配列を含有する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１、配列番号４０及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号３、配列番号４２、及び配列番号４５を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号４６、配列番号４７、又は配列番号１５６を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを更に含む全長Ｓタンパク質をコードする核酸配列を含有する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施の形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及びスパイク（Ｓ）タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列を含むｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質、及びＳタンパク質を発現させると、ＶＬＰが形成され、Ｓタンパク質は、融合前立体構造においてＳタンパク質三量体を安定化する１つ以上のアミノ酸プロリン置換を含む。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）とＳエクトドメイン三量体のプロモーターの中心らせんとの間の境界又はその近傍において、１つ以上のプロリン置換を含有する。幾つかの実施の形態において、プロリン置換は、三量体中のプロモーターのアミノ酸残基９７０から９９０の間で起こる。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、例えば、図２Ａに例示されるように、アミノ酸Ｋ９８６及びＶ９８７における２つのプロリン置換を含有する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１０、配列番号４２、及び配列番号４５を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、Ｋ９８６Ｐと、Ｖ９８７Ｐと、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙのうちの１つ以上の置換とを含有する。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙの置換を含有する。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は、配列番号１１を含むアミノ酸として発現される。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は、配列番号１２を含む核酸によってコードされる。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号４５を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１５７を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１５９を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５０を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１６０を含む核酸配列を含む。
上記の代替の実施の形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターは、膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及びスパイク（Ｓ）タンパク質の直鎖状エピトープをコードする１つ以上の核酸配列を含有し、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質、及びＳタンパク質の直鎖状エピトープを発現させると、ＶＬＰが形成される。特定の実施の形態において、ｒＭＶＡによってコードされるＳタンパク質の直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。幾つかの実施の形態において、コードされる直鎖状Ｓエピトープは、図３Ａに例示されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４（ＲＢＤ ａａ３３１～５２４）を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２１を含む直鎖状エピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、コードされる直鎖状Ｓエピトープは、図３Ｄに例示されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４（ＲＢＤ ａａ３２７～５２４）を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２０を含む直鎖状エピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号３３を含む直鎖状エピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号３２を含む直鎖状エピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２０、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２４、配列番号４２、及び配列番号４５を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２１、配列番号４０、及び配列番号４３のアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２５、配列番号４２、及び配列番号４５を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号３２、配列番号４０、及び配列番号４３のアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号３３、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施の形態において、核酸インサートは、例えば、図３Ｇ及び図３Ｈに例示されるように、Ｓタンパク質に由来するシグナルペプチド及び膜貫通ペプチドを更に含む直鎖状Ｓエピトープをコードする。Ｓタンパク質シグナルペプチドは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸１～１３（ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ）（配列番号５５）を含むか、又はこれに由来し得る。Ｓタンパク質膜貫通ドメインは、細胞質尾部を含むこともでき、例えばアミノ酸１２１４～１２７３（配列番号５７）を含むことができ、又はこれに由来し得る。幾つかの実施の形態において、コードされるＳタンパク質は、図５Ａに例示されるように、ＲＢＤコンセンサス配列を含む。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤコンセンサス配列は、例えば図５Ｂに例示されるように、例えば配列番号５５に由来するＳタンパク質シグナルペプチド、及び例えば配列番号５７に由来するＳタンパク質膜貫通ペプチドを更に含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６１を含む直鎖状エピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６２を含む直鎖状エピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６７を含む直鎖状エピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６８を含む直鎖状エピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６５、配列番号４２、及び配列番号４５を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６２、配列番号４０、及び配列番号４３のアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６６、配列番号４２、及び配列番号４５を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６７、配列番号４０、及び配列番号４３のアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施の形態において、核酸インサートは、シグナルペプチド、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質を更に含む直鎖状Ｓエピトープをコードする（例えば、図３Ｑ、図３Ｒ、図３Ｓ、図３Ｔを参照されたい）。Ｓタンパク質シグナルペプチドは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸１～１３（ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ）（配列番号５５）を含むか、又はそれに由来し得る。幾つかの実施の形態において、コードされるＳタンパク質は、ＲＢＤコンセンサス配列を含む。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤコンセンサス配列は、例えば配列番号５５に由来するＳタンパク質シグナルペプチドを更に含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、アミノ酸３２７～５２４を含む直鎖状ＲＢＤエピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号２０を含むアミノ酸配列を発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、アミノ酸３３１～５２４を含む直鎖状ＲＢＤエピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号２１を含むアミノ酸配列を発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、アミノ酸３２７～５９８を含む直鎖状ＲＢＤエピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号１６１を含むアミノ酸配列を発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、アミノ酸３３１～５９８を含む直鎖状ＲＢＤエピトープを発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号１６２を含むアミノ酸配列を発現する。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号３２を含むアミノ酸配列を発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号３３を含むアミノ酸配列を発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号１６３を含むアミノ酸配列を発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号１６４を含むアミノ酸配列を発現する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号２０、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号２１、配列番号４０、及び配列番号４３のアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号３２、配列番号４０、及び配列番号４３のアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号３３、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号１６１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号１６２、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号１６３、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１６４、配列番号３３、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１５８を含む。
幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターは、Ｓタンパク質の２つ以上の直鎖状エピトープをコードする核酸配列を含有し、２つ以上の直鎖状エピトープは、スペーサー、例えばＧＰＧＰＧスペーサーポリペプチドによって分離され、ｒＭＶＡウイルスベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２エンベロープ（Ｅ）タンパク質及び膜（Ｍ）タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列も含有する。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターに挿入された配列は、スペーサーによって分離されたＳタンパク質直鎖状エピトープをコードし、直鎖状エピトープは、異なるＳタンパク質ＲＢＤペプチド配列、例えば（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２）を含み、ここでＲＢＤ Ｓｅｑ．１は、第１のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．２は、第２のＳタンパク質ＲＢＤペプチドである。幾つかの実施の形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入された配列は、タンデムリピート配列、例えば（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２－ｓｐａｃｅｒ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０）をコードする。幾つかの実施の形態において、タンデムリピート配列をコードする核酸配列は、ＮＨ末端上の、例えば配列番号５５に由来するＳペプチドシグナルペプチドと、カルボキシ末端上の、例えば配列番号５７に由来するＳタンパク質膜貫通ドメインとに隣接する。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４、或いはアミノ酸３２７～５２４に由来する１つ以上のペプチドから選択される。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡ中の核酸配列によってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０から選択される。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡ中の核酸配列によってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０である。幾つかの実施の形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入された配列は、例えば、図４Ａに例示されるように、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を含むＳタンパク質ＲＢＤペプチドをコードする。幾つかの実施の形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施の形態において、ｘ＝５である。幾つかの実施の形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入された配列は、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を含むＳタンパク質ＲＢＤペプチドをコードし、タンデムリピートは、例えば図４Ｆに例示されるように、ＮＨ末端上の、例えば配列番号５５に由来するＳタンパク質シグナルペプチドと、カルボキシ末端上の、例えば配列番号５７に由来するＳタンパク質膜貫通ドメインとに隣接する。幾つかの実施の形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施の形態において、ｘ＝５である。幾つかの実施の形態において、ａａ４７３～４９０ ＲＢＤペプチドは、Ｅ４８４Ｋを含む。
上記の代替の実施の形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及びＳタンパク質のカルボキシ末端を欠く改変スパイク（Ｓ）タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列を含有する。改変Ｓタンパク質は、切断型のＳ１＋Ｓ２を含み、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質、及び切断型Ｓタンパク質を発現させると、ＶＬＰが形成される。特定の実施の形態において、ｒＭＶＡによってコードされる改変Ｓタンパク質は、例えば、図６Ａに例示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸（１～１２１３）を含む。或いは、ｒＭＶＡウイルスベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及び１つ以上のプロリン置換を有するＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質フラグメントをコードする１つ以上の核酸配列を含有し、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質、及び切断型Ｓタンパク質を発現させると、ＶＬＰが形成される。特定の実施の形態において、ｒＭＶＡによってコードされる改変Ｓタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸（１～１２１３）を含み、Ｓ１＋Ｓ２切断型フラグメントは、例えば、図６Ｈに例示されるように、アミノ酸Ｋ９８６及びＶ９８７における２つのプロリン置換を含有する（Ｓ１＋Ｓ２切断型＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ）。幾つかの実施の形態において、Ｓ１＋Ｓ２ペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを更に含む。
代替の態様では、融合タンパク質として１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質抗原ペプチドを発現するように設計されたｒＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供され、融合タンパク質は、エンベロープ糖タンパク質シグナルペプチド（ＧＰＳ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質又はタンパク質フラグメント、及びエンベロープ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（ＧＰＴＭ）を含み、エンベロープ糖タンパク質はコロナウイルスに由来しない。ｒＭＶＡウイルスベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の膜（Ｍ）タンパク質及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質と、エンベロープ糖タンパク質と同じウイルス由来のマトリックスタンパク質とを更に発現するように構築される。Ｍタンパク質及びＥタンパク質の両方と、ＧＰと融合したＳタンパク質フラグメントと、マトリックスタンパク質とを発現させることにより、２つの別個のＶＬＰを形成することができる（第１のものはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｍタンパク質及びＥタンパク質を含有し、第２のものはＧＰ及びマトリックスタンパク質と協調してＳタンパク質フラグメントを含有する）。２つのＶＬＰを提供することにより、増強されたエピトープ提示が可能となり得る。本発明における使用に適した糖タンパク質としては、限定されるものではないが、フィロウイルス科、例えばマールブルグウイルス、エボラウイルス、又はスーダンウイルス；レトロウイルス科、例えばヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）；アレナウイルス科、例えばラッサウイルス；フラビウイルス科、例えばデングウイルス及びジカウイルスに由来するものが挙げられる。特定の実施の形態において、糖タンパク質はマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）に由来する。特定の実施の形態において、糖タンパク質は、ＭＡＲＶ ＧＰタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＶ３１２０２．１）に由来する。特定の実施の形態において、ＭＡＲＶ ＧＰＳドメインは、糖タンパク質のアミノ酸１～１９（ＭＷＴＴＣＦＦＩＳＬＩＬＩＱＧＩＫＴＬ）（配列番号８８）を含み、ＧＰＴＭドメインは、糖タンパク質のアミノ酸配列６４４～６８１（ＷＷＴＳＤＷＧＶＬＴＮＬＧＩＬＬＬＬＳＩＡＶＬＩＡＬＳＣＩＣＲＩＦＴＫＹＩＧ）（配列番号９０）を含む。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質又はタンパク質フラグメント－ＧＰ融合タンパク質は、例えば図７Ａに例示されるように、Ｓタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４に由来する。幾つかの実施の形態において、直鎖状Ｓエピトープは、例えば、図７Ｂに例示されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４を含む。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４に由来する。幾つかの実施の形態において、直鎖状Ｓエピトープは、例えば、図７Ｇに例示されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４を含む。幾つかの実施の形態において、直鎖状Ｓエピトープは、コロナウイルスコンセンサス配列を含む。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９５、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９７、配列番号４２、及び配列番号４５を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９６、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９８、配列番号４２、及び配列番号４５を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９９、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９９、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、Ｅタンパク質、Ｍタンパク質、及びウイルス糖タンパク質、例えばＭＡＲＶ ＧＰと融合したＳタンパク質の２つ以上の直鎖状エピトープをコードする１つ以上の核酸配列を含有し、２つ以上の直鎖状エピトープは、スペーサー、例えばＧＰＧＰＧスペーサーポリペプチドによって分離され、ＧＰＳは、２つ以上の直鎖状エピトープのＮＨ末端に隣接し、ＧＰＴＭは、そのカルボキシ末端に隣接し、マトリックスタンパク質は、糖タンパク質と同じウイルスに由来する（例えばＭＡＲＶ ＶＰ４０マトリックスタンパク質）。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質の２つ以上の直鎖状エピトープがＭＡＲＶ ＧＰと融合され、直鎖状エピトープは、異なるＳタンパク質ＲＢＤペプチド、例えば（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２）を含み、ここで、ＲＢＤ Ｓｅｑ．１は第１のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．２は第２のＳタンパク質ＲＢＤペプチドである。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質の２つ以上の直鎖状エピトープがＭＡＲＶ ＧＰと融合され、エピトープは、タンデムリピート配列、例えば（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２－ｓｐａｃｅｒ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超）に含まれる。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４、又はアミノ酸３２７～５２４に由来する１つ以上のペプチドから選択される。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０から選択される。幾つかの実施の形態において、タンデムリピートによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０である。幾つかの実施の形態において、タンデムリピート配列は、（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超）をコードする。幾つかの実施の形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施の形態において、例えば、図８Ａに例示されるようにｘ＝５である。タンデムリピートが利用される場合、ＭＡＲＶ ＧＰＳペプチドはＮＨ末端上のタンデムリピートに隣接し、ＭＡＲＶ ＧＰＴＭペプチドはカルボキシ末端上のタンデムリピートに隣接する。幾つかの実施の形態において、ａａ４７３～４９０ ＲＢＤペプチドは、Ｅ４８４Ｋを含む。
幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、Ｅタンパク質及びＭタンパク質と共に、ウイルス糖タンパク質、例えばＭＡＲＶ ＧＰと融合したＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含む改変Ｓタンパク質をコードし、ＧＰＳはＳ１＋Ｓ２切断型Ｓタンパク質のＮＨ末端に隣接し、ＧＰＴＭはそのカルボキシ末端に隣接し、マトリックスタンパク質は糖タンパク質と同じウイルスに由来する（例えば、ＭＡＲＶ ＶＰ４０マトリックスタンパク質）。特定の実施の形態において、ｒＭＶＡによってコードされる改変Ｓ１＋Ｓ２切断型Ｓタンパク質は、例えば、図９Ａに例示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸１～１２１３を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡによってコードされるＳタンパク質フラグメントは、例えば図９Ｂに例示されるように、１つ以上のプロリン置換、例えばＫ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐのプロリン置換を含むＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含む改変Ｓタンパク質を含む。幾つかの実施の形態において、Ｓ１＋Ｓ２ペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを更に含む。
代替の態様では、融合タンパク質として１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原ペプチドを発現するように設計されたｒＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供され、融合タンパク質は、エンベロープ糖タンパク質のシグナルペプチド（ＧＰＳ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質フラグメント、及びエンベロープ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（ＧＰＴＭ）を含み、エンベロープ糖タンパク質はコロナウイルスに由来しておらず、ｒＭＶＡウイルスベクターは、糖タンパク質と同じウイルスに由来するマトリックスタンパク質を更に発現する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ペプチド－ＧＰ融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原ペプチドを提示するマトリックスタンパク質と複合化してＶＬＰの形成を可能にするように設計される。本発明における使用に適した糖タンパク質ドメイン及びマトリックスタンパク質としては、限定されるものではないが、フィロウイルス科、例えばマールブルグウイルス、エボラウイルス、又はスーダンウイルス；レトロウイルス科、例えばヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）；アレナウイルス科、例えばラッサウイルス；フラビウイルス科、例えばデングウイルス及びジカウイルスに由来するものが挙げられる。特定の実施の形態において、ＧＰ及びマトリックスタンパク質は、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）に由来する。特定の実施の形態において、糖タンパク質は、ＭＡＲＶ ＧＰタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＶ３１２０２．１）に由来する。特定の実施の形態において、ＭＡＲＶ ＧＰＳドメインは、糖タンパク質のアミノ酸１～１９（ＭＷＴＴＣＦＦＩＳＬＩＬＩＱＧＩＫＴＬ）（配列番号８８）を含み、ＧＰＴＭドメインは、糖タンパク質のアミノ酸配列６４４～６８１（ＷＷＴＳＤＷＧＶＬＴＮＬＧＩＬＬＬＬＳＩＡＶＬＩＡＬＳＣＩＣ ＲＩＦＴＫＹＩＧ）（配列番号９０）を含む。幾つかの実施の形態において、糖タンパク質－Ｓタンパク質融合体及びウイルスマトリックスタンパク質は、異なる位置に挿入された核酸としてｒＭＶＡに含まれる。幾つかの実施の形態において、糖タンパク質－ｓタンパク質又はタンパク質フラグメント融合体及びウイルスマトリックスタンパク質は、同じ位置に挿入されたバイシストロニック核酸としてｒＭＶＡに含まれる。幾つかの実施の形態において、糖タンパク質に融合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質は、Ｓタンパク質又はそのフラグメントである。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含む改変Ｓタンパク質を含むフラグメントである。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡによってコードされる改変Ｓタンパク質フラグメントは、例えば、図１０Ａ及び図１０Ｃに例示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸２～１２１３を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡによってコードされる改変Ｓタンパク質フラグメントは、例えば、図１０Ｆ及び図１０Ｄに例示されるように、例えばＫ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐのうちの１つ以上のプロリン置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸２～１２１３を含む。幾つかの実施の形態において、Ｓ１＋Ｓ２ペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを更に含む。幾つかの実施の形態において、融合Ｓタンパク質は、Ｓタンパク質の直鎖状エピトープである。特定の実施の形態において、Ｓタンパク質の直鎖状エピトープは、例えば図１１Ａ及び図１１Ｈに例示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。幾つかの実施の形態において、直鎖状Ｓエピトープは、Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４に由来するＲＢＤペプチドを含む。幾つかの実施の形態において、直鎖状Ｓエピトープは、例えば、図１１Ｂ及び図１１Ｉに例示されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４を含む。幾つかの実施の形態において、直鎖状Ｓエピトープは、Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４に由来するＲＢＤペプチドを含む。幾つかの実施の形態において、直鎖状Ｓエピトープは、例えば、図１１Ｅ及び図１１Ｎに例示されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４を含む。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを更に含む。幾つかの実施の形態において、直鎖状Ｓエピトープは、コロナウイルスコンセンサス配列を含む。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質の２つ以上の直鎖状エピトープがＭＡＲＶ ＧＰと融合され、２つ以上の直鎖状エピトープは、スペーサー、例えばＧＰＧＰＧスペーサーポリペプチドによって分離される。幾つかの実施の形態において、直鎖状エピトープは、異なるＳタンパク質ＲＢＤペプチド、例えば（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２）を含み、ＲＢＤ Ｓｅｑ．１は、第１のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．２は、第２のＳタンパク質ＲＢＤペプチドである。幾つかの実施の形態において、融合Ｓタンパク質は、Ｓタンパク質の２つ以上の直鎖状エピトープを含み、エピトープは、タンデムリピート配列、例えば（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２－ｓｐａｃｅｒ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超）に含まれる。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４に由来する１つ以上のペプチドから選択される。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０から選択される。幾つかの実施の形態において、タンデムリピートによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０である。幾つかの実施の形態において、タンデムリピート配列は、（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超）をコードする。幾つかの実施の形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施の形態において、ｘ＝５である。Ｓタンパク質フラグメントがタンデムリピートとして提供される場合、例えば図１２Ａ及び図１２Ｂに例示されるように、ＧＰＳはタンデムリピートのＮＨ末端に隣接し、ＧＰＴＭはタンデムリピートのカルボキシ末端に隣接する。幾つかの実施の形態において、ＲＢＤペプチドは、置換Ｅ４８４Ｋを更に含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９２及び配列番号９５を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９３又は配列番号９４、及び配列番号９７を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９２及び配列番号９６を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９３又は配列番号９４、及び配列番号９８を含む核酸配列を含む。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９２及び配列番号９９を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９２及び配列番号１００を含むアミノ酸配列をコードする。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１３４を含むアミノ酸配列をコードする。
本発明の代替の態様では、例えば、図１３Ａに例示されるような全長Ｓタンパク質をコードする組換えＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は、全長安定化タンパク質であり、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）とＳエクトドメイン三量体のプロモーターの中心らせんとの間の境界又はその近傍において１つ以上のプロリン置換が行われている。幾つかの実施の形態において、プロリン置換は、三量体中のプロモーターの残基９７０から９９０の間で起こる。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は安定化され、全長タンパク質として発現され、例えば、図１４Ａに例示されるように、アミノ酸Ｋ９８６及びＶ９８７における２つのプロリン置換を含む。幾つかの実施の形態において、Ｓタンパク質は、Ｓタンパク質のＳ１＋Ｓ２ドメインを含み、かつＳタンパク質のカルボキシ末端を欠く切断型Ｓタンパク質として発現される。幾つかの実施の形態において、切断型Ｓタンパク質は、図１５Ａに例示されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸１～１２１３を含む。幾つかの実施の形態において、切断型Ｓタンパク質は、図１５Ｆに例示されるように、アミノ酸Ｋ９８６及びＶ９８７における２つのプロリン置換を含む。幾つかの実施の形態において、Ｓペプチドは、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を更に含む。幾つかの実施の形態において、Ｓペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを更に含む。
幾つかの態様では、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターを投与することを含む、被験体、例えばヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を低減又は予防する方法が本明細書で提供される。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターは、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したことがない被験体にプライムワクチンとして予防的に投与される。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターは、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したことがある被験体にブーストワクチンとして投与される。幾つかの実施の形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターは、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンを投与されたことがある被験体においてブーストワクチンとして投与される。幾つかの実施の形態において、以前に投与されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンは、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターである。幾つかの実施の形態において、以前に投与されたワクチンは、非ＭＶＡウイルスベクターワクチンである。幾つかの実施の形態において、ワクチンは、ｍＲＮＡベースのワクチン、アデノウイルスワクチン、非複製ワクチン、ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチン、植物ベースのアジュバントワクチン、マルチエピトープペプチドベースのワクチン、不活化ウイルス、ペプチドワクチンである。幾つかの実施の形態において、以前に投与されたワクチンは、ｍＲＮＡ－１２７３（ＭＯＤＥＲＮＡ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン；Moderna, Inc.）、ＡＺＤ－１２２２（ＣＯＶＩＤＳＨＩＥＬＤ；AstraZeneca及びオックスフォード大学）、ＢＮＴ１６２（ＣＯＭＩＲＮＡＴＹ；Pfizer及びBioNTech）、Ｓｐｕｔｎｉｋ Ｖ（Gamaleya Research Institute、Acellena Contract Drug Research and Development）、ＣｏｒｏｎａＶａｃ（Sinovac）、ＮＶＸ－ＣｏＶ ２３７２（NovoVax）、ＳＣＢ－２０１９（Sanofi及びGSK）、ＺｙＣｏＶ－Ｄ（Zydus Cadila）、ＢＢＩＢＰ－ＣｏｒＶ（Beijing Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group（Sinopharm））、ＥｐｉＶａｃＣｏｒｏｎａ（Federal Budgetary Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology）、Ｃｏｎｖｉｄｉｃｅａ（CanSino Biologics）、Ｃｏｖｉｄ－１９ワクチン（Wuhan Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group （Sinopharm））、ＪＮＪ－７８４３６７３５（Johnson & Johnson）、ＺＦ２００１（Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical, Institute of Microbiology of the Chinese Academy of Sciences）、ＣＶｎＣｏＶ（CureVac；GSK）、ＩＮＯ－４８００（Inovio Pharmaceuticals）、ＶＩＲ－７８３１（Medicago；GSK；Dynavax）、Ｃｏｖｉｄ－１９アデノウイルスベースワクチン（ImmunityBio；NantKwest）、ＵＢ－６１２（COVAXX）、又はＣｏＶａｘｉｎ（Bharat Biotech）のうちの１つ以上から選択される。
幾つかの態様では、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターは、本明細書に記載のｒＭＶＡ以外の１つ以上の追加のワクチン接種剤を用いた免疫化プロトコルにおいて、被験体、例えばヒトに投与される。
また、本明細書に記載されるＭＶＡに挿入される核酸配列を含むシャトルベクター、及び本明細書に記載される核酸配列インサートを含む単離された核酸配列が本明細書で提供される。本明細書では、本明細書に記載されるｒＭＶＡを含むニワトリ胚線維芽細胞又はＤＦ１細胞等の細胞が更に提供される。
１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（２０１９－新型コロナウイルス）抗原を発現することができる組換えＭＶＡウイルスベクター、そのフラグメント、その変異体、又はそれらの組合せを含むワクチン組成物が本明細書で提供される。このワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する防御に使用することができ、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に基づく病状に対して治療、予防、及び／又は防御を行うことができる。ワクチンは、ワクチンを投与された被験体の免疫応答を有意に誘導することができ、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に対して防御及び治療を行うことができる。
本発明の組成物及び方法を、非曝露者において感染を予防するために、又は疾患の重症度を軽減するためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に曝露された被験体において疾患を治療するために、治療有効量で使用することができる。
幾つかの実施形態において、組成物及び方法を、ブースターワクチンとして使用して、（アジュバントの有無にかかわらず）ＲＮＡワクチン、若しくはＤＮＡワクチン、若しくはアデノウイルスワクチンベクター等のウイルスベクターワクチン、若しくはタンパク質ベースのワクチン、若しくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の死滅若しくは不活化製剤で構成されるワクチン等の以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン、又は弱毒化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２によって誘導される免疫応答を増加又は修正又は変更することができる。幾つかの実施形態において、組成物及び方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の感染及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からの回復後のブースターワクチンとして使用することができる。
理想的な免疫原性組成物又はワクチンは、安全性、有効性、保護の範囲及び寿命の特徴を有する。これらの特徴の全てよりも少ない特徴を有する組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を予防するか、又は症状の発生前に治療された曝露被験体における症状若しくは疾患進行を制限するのに依然として有用であり得る。一実施形態において、本発明は、完全ではないにしても、１回の免疫化後に少なくとも部分的に保護を可能にするワクチンを提供する。
ワクチンは、ワクチンを投与された被験体において体液性免疫応答を誘導することができる。誘導された体液性免疫応答は、ｒＭＶＡが発現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原性エピトープ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に特異的な領域、又は他のコロナウイルスにも存在する保存されたエピトープ若しくはセグメントの１つ以上に対して特異的であり得る。誘導された体液性免疫応答は、１つ以上の発現されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原と反応性であり得る。
ワクチンによって誘導される体液性免疫応答は、ワクチンを投与されていない被験体と比較した、ワクチンを投与された被験体に関連する中和抗体のレベルの増加を含み得る。さらに、ワクチンによって誘導される体液性応答は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したことがある人々について中和抗体のレベルの増加を含むことができ、ここで、本発明のｒＭＶＡはブースターとして作用する。ワクチンによって誘導される体液性応答は、以前に異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンを投与されたことがある人々について中和抗体のレベルの増加を含むことができ、ここで、本発明のｒＭＶＡはブースターとして作用する。中和抗体は、ｒＭＶＡウイルスベクターによって発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原又はそのフラグメントに特異的であり得る。中和抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原と反応性であり得る。中和抗体は、ワクチンを投与された被験体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染及びその関連する病状に対する防御及び／又は治療を提供することができる。
ワクチンによって誘導される体液性免疫応答は、ワクチンを投与されていない被験体と比較した、ワクチンを投与された被験体に関連するＩｇＧ抗体レベルの増加を含み得る。これらのＩｇＧ抗体は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原に特異的であり得る。
ワクチンは、ワクチンを投与された被験体において細胞性免疫応答を誘導することができる。誘導された細胞性免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原に特異的であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原に反応性であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起することを含み得る。惹起されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原性エピトープ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に特異的な領域、又は他のコロナウイルスにも存在する保存されたエピトープ若しくはセグメントと反応性であり得る。
惹起されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、多機能であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、又はＩＦＮ－γとＴＮＦ－αとの組合せを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起することを含み得る。
誘導された細胞性免疫応答は、ワクチンを投与されていない被験体と比較した、ワクチンを投与された被験体に関連するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加を含み得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ－γを産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加を含み得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＴＮＦ－αを産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加を含み得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＩＬ－２を産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加を含み得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ－γとＴＮＦ－αの両方を産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加を含み得る。
ワクチンによって誘導される細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を惹起することを含み得る。惹起されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原と反応性であり得る。惹起されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、多機能であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、又はＩＦＮ－γとＴＮＦ－αとの組合せを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を惹起することを含み得る。
誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ－γを産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含み得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＴＮＦ－αを産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含み得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＩＬ－２を産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含み得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ－γとＴＮＦ－αの両方を産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含み得る。
幾つかの実施形態において、ワクチンによって誘導される上述のこれらの細胞性免疫応答の増加は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したことがある被験体におけるものであり、ここでは、本発明のｒＭＶＡはブースターとして作用する。幾つかの実施形態において、ワクチンによって誘導される上述のこれらの細胞性免疫応答の増加は、以前に異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンを投与されたことがある被験体におけるものであり、ここでは、本発明のｒＭＶＡはブースターとして作用する。
定義
用語が単数形で提供される場合、本発明者らは、その用語の複数形によって記述される本発明の態様も企図する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の対象を含み、例えば、「ペプチド（a peptide）」は複数のペプチドを含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載されるタイプの１つ以上の方法、及び／又は工程を含み、及び／又はこれは、本開示を読むことによって当業者に明らかになるであろう。
用語が単数形で提供される場合、本発明者らは、その用語の複数形によって記述される本発明の態様も企図する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の対象を含み、例えば、「ペプチド（a peptide）」は複数のペプチドを含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載されるタイプの１つ以上の方法、及び／又は工程を含み、及び／又はこれは、本開示を読むことによって当業者に明らかになるであろう。
本明細書において使用される場合、「アジュバント」という用語は、組成物の免疫原性を増強するために本明細書に記載のワクチンに添加される任意の分子を意味する。
「抗原」という用語は、免疫応答を誘導することができる、タンパク質等の物質若しくは分子又はそれらのフラグメントを指す。
本明細書において使用される場合、「コード配列」又は「コードする核酸」又は「コードする核酸配列」等は、タンパク質又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される個体又は哺乳動物の細胞における発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始及び終了シグナルを更に含むことができる。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、その位置におけるアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性、又は親水性にほとんど又は全く影響を及ぼさず、実質的に変化した免疫原性を生じることのない、非天然アミノ酸残基による天然アミノ酸残基の置換を指す。例えば、これらは、以下のグループ内の置換であり得る：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。ポリペプチドの配列に対する保存的アミノ酸改変（及びコードヌクレオチドに対する対応する改変）は、親ポリペプチドのものと同様の機能的及び化学的特徴を有するポリペプチドを産生し得る。
ポリペプチド又はタンパク質に関連して「欠失」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基に対するコドンの除去を指し、両側の領域は共に結合される。核酸に関連して欠失という用語は、核酸配列からの１つ以上の塩基の除去を指し、両側の領域は共に結合される。
タンパク質性物質に関連して「フラグメント」という用語は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも２個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。一実施形態において、フラグメントは、参照ポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を構成する。一実施形態において、全長タンパク質のフラグメントは、全長タンパク質の活性を保持する。別の実施形態において、全長タンパク質のフラグメントは、全長タンパク質の活性を保持しない。
核酸に関連して、「フラグメント」という用語は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも２個の連続するヌクレオチド、少なくとも５個の連続するヌクレオチド、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、少なくとも２５個の連続するヌクレオチド、少なくとも３０個の連続するヌクレオチド、少なくとも３５個の連続するヌクレオチド、少なくとも４０個の連続するヌクレオチド、少なくとも５０個の連続するヌクレオチド、少なくとも６０個の連続するヌクレオチド、少なくとも７０個の連続するヌクレオチド、少なくとも連続する８０ヌクレオチド、少なくとも９０個の連続するヌクレオチド、少なくとも１００個の連続するヌクレオチド、少なくとも１２５個の連続するヌクレオチド、少なくとも１５０個の連続するヌクレオチド、少なくとも１７５個の連続するヌクレオチド、少なくとも２００個の連続するヌクレオチド、少なくとも２５０個の連続するヌクレオチド、少なくとも３００個の連続するヌクレオチド、少なくとも３５０個の連続するヌクレオチド、又は少なくとも３８０個の連続するヌクレオチドの核酸配列を含む核酸を指す。一実施形態において、フラグメントは、参照核酸配列の全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を構成する。好ましい実施形態において、核酸のフラグメントは、全長タンパク質の活性を保持するペプチド又はポリペプチドをコードする。別の実施形態において、フラグメントは、全長タンパク質のものが全長タンパク質の活性を保持しないペプチド又はポリペプチドをコードする。
本明細書において使用される場合、「異種配列」という語句は、関心のある別の核酸又はタンパク質、ポリペプチド又はペプチド配列と自然界で通常会合していない任意の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド配列を指す。
本明細書において使用される場合、「異種核酸インサート」という語句は、本明細書に記載の組換えベクターに挿入されている、又は挿入される予定の任意の核酸配列を指す。異種核酸インサートは、遺伝子産物をコードする配列のみを指す場合もあり、又はプロモーターを含む配列、遺伝子産物をコードする配列（例えば、膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、スパイク（Ｓ）タンパク質）、及びそれに会合した若しくは作動可能に連結された任意の調節配列を指す場合もある。
「ホモポリマーストレッチ」という用語は、任意の他のヌクレオチドによって中断されない少なくとも４つの同じヌクレオチド、例えば、ＧＧＧＧ又はＴＴＴＴＴＴＴを含む配列を指す。
「免疫応答を誘導する」という用語は、ｒＭＶＡが投与された被験体においてｒＭＶＡによって発現される１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質又はそのフラグメントに対する体液性応答（例えば、抗体の産生）又は細胞性応答（例えば、Ｔ細胞の活性化）を惹起することを意味する。
「改変ワクシニア・アンカラ（"modified vaccinia Ankara," "modified vaccinia Ankara," "Modified Vaccinia Ankara,"）」、すなわち「ＭＶＡ」という用語は、Anton Mayr博士によってヒヨコ胚線維芽細胞での連続継代によって開発された高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株、又はその変異体若しくは誘導体を指す。ＭＶＡはMayr, A. et al. 1975 Infection 3:6-14で概説される。
本明細書において使用される場合、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合で連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を規定する。したがって、核酸は、描写される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体は、所与の核酸と同じ目的のために使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
核酸は、一本鎖若しくは二本鎖であることができ、又は二本鎖配列及び一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。核酸は、ＤＮＡ（ゲノム及びｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、又はハイブリッドであってもよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組合せを含み得る。核酸は、化学合成法又は組換え法により得ることができる。
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に配置することができる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子においてそのプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく調整することができる。
本明細書において使用される場合、「ペプチド」、「タンパク質」、又は「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結配列を意味し得て、天然、合成若しくは改変、又は天然と合成との組合せであり得る。
本明細書において使用される場合、「プロモーター」は、細胞内で核酸の発現を付与、活性化又は増強することができる合成又は天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現を更に増強し、及び／又はその空間的発現及び／又は時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含むことができ、これは転写の開始部位から数千塩基対も位置することができる。
「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、或る病態（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染）の発生若しくは発症の阻害、又は治療法の適用若しくは治療法の併用の適用から生じる被験体における病態の１つ以上の症状の再発、発症、又は発生の予防を指す。
「予防有効量」という用語は、組成物（例えば、組換えＭＶＡベクター又は医薬組成物）の量を指し、これは、或る病態若しくはその症状（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染）若しくはそれに関連する症状の発生、再発若しくは発症の予防をもたらすか、又は別の治療法の予防効果（複数の場合もある）を増強若しくは改善するのに十分である。
ウイルスベクターに関連して「組換え」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作されたベクター（例えば、ウイルスゲノム）を意味し、例えば、組換え核酸技術を用いて異種ウイルス核酸配列を発現させる。
「調節配列（"regulatory sequence" and "regulatory sequences"）」という用語は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー等を総称するものであり、これらはコード配列の転写及び翻訳を集合的に提供する。選択された遺伝子が転写及び翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。
「シャトルベクター」という用語は、或る宿主系から別の宿主系に遺伝物質を移すのに有用である遺伝的ベクター（例えば、ＤＮＡプラスミド）を指す。シャトルベクターは、少なくとも１つの宿主（例えば、大腸菌（E. coli））において単独で（他のどのベクターの存在もなしに）複製することができる。ＭＶＡベクターの構築に関連して、シャトルベクターは、通常、大腸菌内で操作することができ、次いでＭＶＡベクターに感染した培養細胞に導入することができるＤＮＡプラスミドであり、その結果、新たな組換えＭＶＡベクターの生成をもたらす。
「サイレント変異」という用語は、ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の一次構造の変化を引き起こさないヌクレオチド配列の変化、例えば、ＡＡＡ（リジンをコードする）からＡＡＧ（同じくリジンをコードする）への変化を意味する。
「被験体」という用語は、限定するものではないが、ヒト、飼育動物及び家畜、並びに動物園の動物、スポーツ動物、又はペット動物（イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、マウス、モルモット等）を含む任意の哺乳動物を意味する。それらの「リスクがある」被験体の判定は、被験体又は医療提供者の診断試験又は意見（例えば、遺伝子検査、酵素又はタンパク質マーカー、マーカー歴等）による任意の客観的又は主観的な判定によって行うことができる。
「同義コドン」という用語は、同じアミノ酸をコードする異なる核酸配列、例えばＡＡＡ及びＡＡＧ（いずれもリジンをコードする）を有するコドンの使用を指す。コドン最適化は、タンパク質のコドンを、ベクター又は宿主細胞によって最も頻繁に使用される同義コドンに変更する。
「治療有効量」という用語は、組成物（例えば、組換えＭＶＡベクター又は医薬組成物）がウイルスを予防又は治療するために哺乳動物に投与された場合、かかるウイルスの予防又は治療に影響を及ぼすのに十分な組成物の量を意味する。
「治療すること」又は「治療する」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の根絶又は制御、１つ以上の治療法の適用に起因するウイルスによって引き起こされる病態又は１つ以上の症状の進行、重症度、及び／又は持続時間の減少又は改善を指す。
「ワクチン」という用語は、免疫応答を誘発し、物質を対象に投与した後に免疫を付与するために使用される物質を意味する。かかる免疫は、被験体がワクチン投与後に免疫原に曝露されたときに生じる細胞性又は体液性の免疫応答を含み得る。
「ワクチンインサート」という用語は、組換えベクターに挿入されたときに発現のためにプロモーターに作動可能に連結される異種配列をコードする核酸配列を指す。異種配列は、本明細書に記載の糖タンパク質又はマトリックスタンパク質をコードし得る。
「ウイルス様粒子」すなわち「ＶＬＰ」という用語は、ウイルスに似ているが、ウイルス遺伝物質を含まないため感染性ではない構造物を指す。
本明細書における数値範囲の列挙に関しては、その間に介在する各数値が同程度の精度で明示的に企図される。例えば、６～９の範囲の場合、６及び９に加えて数値７及び８が企図され、６．０～７．０の範囲の場合、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原
本明細書において、組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質、ペプチド、又はそのフラグメントをコードする異種核酸インサートを含み、発現時に、以前のＭＶＡ関連コロナウイルスワクチン接種戦略に関連する免疫病理を誘導することなく防御免疫を誘導することができる、ｒＭＶＡウイルスベクターが提供される。
本明細書において、組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質、ペプチド、又はそのフラグメントをコードする異種核酸インサートを含み、発現時に、以前のＭＶＡ関連コロナウイルスワクチン接種戦略に関連する免疫病理を誘導することなく防御免疫を誘導することができる、ｒＭＶＡウイルスベクターが提供される。
コロナウイルスは、ニドウイルス目のコロナウイルス科に属し、一本鎖エンベロープＲＮＡウイルスの大ファミリーである。コロナウイルスは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルスの４つの属に分類され得る（Perlman & Netland, Coronaviruses post-SARS: update on replication and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology 2009; 7:439-450）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２はベータコロナウイルス属に属し、これにはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、コウモリコロナウイルスＨＫＵ４、マウス肝炎コロナウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）、及びヒトコロナウイルスＯＣ４３も含まれる。
コロナウイルスは、全てのＲＮＡウイルスの中で最大のゲノムを有し、典型的には２７ｋｂ～３２ｋｂの範囲である。ゲノムは、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）によって形成されたらせん状のカプシドの内部に詰め込まれ、更にエンベロープに囲まれている。ウイルスエンベロープに関連するのは、少なくとも３つの構造タンパク質であり、膜タンパク質（Ｍ）及びエンベロープタンパク質（Ｅ）はウイルスの集合に関与し、スパイクタンパク質（Ｓ）は宿主細胞へのウイルス侵入を媒介する。これらの構造タンパク質の中で、スパイクはウイルス表面から大きな突起を形成し、コロナウイルスにクラウンを有する外観を与える（したがって、その名称であるコロナはラテン語のクラウンを意味する）。ウイルス侵入を媒介することに加えて、スパイクはウイルス宿主の範囲及び組織指向性の重要な決定因子であり、宿主免疫応答の主要な誘導因子である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の全ゲノムは配列決定されており、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７．３が付与されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は、２９９０３塩基対の一本鎖ＲＮＡ配列からなる。これまでに、構造膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及びスパイク（Ｓ）タンパク質をコードする遺伝子を含む１０のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定されている。
スパイク（Ｓ）タンパク質
エンベロープアンカースパイクタンパク質は、最初に宿主受容体に結合し、次いでウイルス膜と宿主膜とを融合することによって宿主細胞内へのコロナウイルスの侵入を媒介する（Li F. 2016. Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. Annu Rev Virol 3:237-261）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクの明らかにされた受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、その宿主受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を特異的に認識する（Li et al., 2003. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 426:450-454）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクとＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクとの全体的な配列類似性は、タンパク質全体で約７６％～７８％、ＲＢＤで約７３％～７６％、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）で５０％～５３％であり、２つのＳタンパク質間の類似性はＡＣＥ２がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の受容体である可能性を示している。Wan et al., Receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan: An analysis based on decade-long structural studies of SARS, J. Virol. doi:10.1128/JVI.00127-20を参照されたい。
エンベロープアンカースパイクタンパク質は、最初に宿主受容体に結合し、次いでウイルス膜と宿主膜とを融合することによって宿主細胞内へのコロナウイルスの侵入を媒介する（Li F. 2016. Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. Annu Rev Virol 3:237-261）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクの明らかにされた受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、その宿主受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を特異的に認識する（Li et al., 2003. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 426:450-454）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクとＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクとの全体的な配列類似性は、タンパク質全体で約７６％～７８％、ＲＢＤで約７３％～７６％、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）で５０％～５３％であり、２つのＳタンパク質間の類似性はＡＣＥ２がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の受容体である可能性を示している。Wan et al., Receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan: An analysis based on decade-long structural studies of SARS, J. Virol. doi:10.1128/JVI.00127-20を参照されたい。
コロナウイルスのスパイクは、大きなエクトドメイン、シングルパス膜貫通アンカー、及び短い細胞内テイルの３つのセグメントを含む。エクトドメインは、受容体結合サブユニットＳ１及び膜融合サブユニットＳ２からなる。電子顕微鏡調査は、スパイクは３つのＳ１ヘッドと三量体Ｓ２ストークを持つクローブ状の三量体であることを明らかにした。例えば、Kirchdoerfer et al., Pre-fusion structure of a human coronavirus spike protein. Nature. 2016 Mar 3; 531(7592):118-21を参照されたい。ウイルスの侵入中、Ｓ１は宿主細胞表面の受容体に結合してウイルスを付着させ、Ｓ２は宿主とウイルスの膜を融合させ、ウイルスゲノムが宿主細胞に入ることを可能にする。受容体結合及び膜融合は、コロナウイルス感染サイクルの初期の重要な工程である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク（Ｓ）タンパク質のアミノ酸配列は、１２７３アミノ酸長である。このＳタンパク質はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＱＨＤ４３４１６で報告され、その対応する核酸配列（配列番号２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７．３で報告され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ゲノムの核酸２１５６３～２５３８４に位置する）と共に配列番号１として表１に再現される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１をコードする核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同なアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入された全長Ｓタンパク質に対する核酸は、以下に記載されるように、及び例えば配列番号３に提供されるように最適化されており、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同な核酸配列を有する。或る特定の実施形態において、タグをコードする追加の核酸配列が、ｒＭＶＡに挿入される核酸配列に含まれ得るため、タグはタンパク質のＣ末端で発現される。幾つかの実施形態において、核酸配列（ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴ）（配列番号４）は、アミノ酸配列ＥＰＥＡ（配列番号５）を有する高親和性Ｃタグをコードする。
或る特定の実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、１つ以上のアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、配列番号１のＫ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、配列番号１のＫ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙの置換を含む。幾つかの実施形態において、置換はＫ４１７Ｎである。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、配列番号６の全長タンパク質として、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％と相同なアミノ酸配列として発現される。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、配列番号１の１つ以上のスパイクタンパク質アミノ酸Ｈ６９、Ｖ７０、若しくはＹ１４４、又はそれらの組合せの欠失を有する。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、配列番号１のＤ６１４Ｇ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｋ４１７Ｎ若しくはＫ４１７Ｔ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｎ４３９Ｋ、Ａ２２２Ｖ、Ｓ４７７Ｎ若しくはＡ３７６Ｔ、又はこれらの組合せから選択される１つ以上の置換を含む。幾つかの実施形態において、変異株は、配列番号１のアミノ酸２４２～２４４においてスパイクタンパク質欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスである。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、以下の欠失及び置換を含む：配列番号１のアミノ酸６９～７０の欠失、アミノ酸Ｙ１４４の欠失、アミノ酸置換Ｎ５０１Ｙ、アミノ酸置換Ａ５７０Ｄ、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、アミノ酸置換Ｐ６８１Ｈ、アミノ酸置換Ｔ７１６Ｉ、アミノ酸置換Ｓ９８２Ａ、及びアミノ酸置換Ｄ１１１８Ｈ。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、以下の欠失及び置換を含む：配列番号１のＮ５０１Ｙ、Ｋ４１７Ｎ、又はＫ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｄ８０Ａ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、及びアミノ酸２４２～２４４におけるアミノ酸欠失。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、以下の１つ以上の置換を含む：配列番号１のＤ６１４Ｇ；Ｄ９３６Ｙ；Ｐ１２６３Ｌ；Ｌ５Ｆ；Ｎ４３９Ｋ；Ｒ２１Ｉ；Ｄ８３９Ｙ；Ｌ５４Ｆ；Ａ８７９Ｓ；Ｌ１８Ｆ；Ｆ１１２１Ｌ；Ｒ８４７Ｋ；Ｔ４７８Ｉ；Ａ８２９Ｔ；Ｑ６７５Ｈ；Ｓ４７７Ｎ；Ｈ４９Ｙ；Ｔ２９Ｉ；Ｇ７６９Ｖ；Ｇ１１２４Ｖ；Ｖ１１７６Ｆ；Ｋ１０７３Ｎ；Ｐ４７９Ｓ；Ｓ１２５２Ｐ；Ｙ１４５欠失；Ｅ５８３Ｄ；Ｒ２１４Ｌ；Ａ１０２０Ｖ；Ｑ１２０８Ｈ；Ｄ２１５Ｇ；Ｈ１４６Ｙ；Ｓ９８Ｆ；Ｔ９５Ｉ；Ｇ１２１９Ｃ；Ａ８４６Ｖ；Ｉ１９７Ｖ；Ｒ１０２Ｉ；Ｖ３６７Ｆ；Ｔ５７２Ｉ；Ａ１０７８Ｓ；Ａ８３１Ｖ；Ｐ１１６２Ｌ；Ｔ７３Ｉ；Ａ８４５Ｓ；Ｇ１２１９Ｖ；Ｈ２４５Ｙ；Ｌ８Ｖ；Ｑ６７５Ｒ；Ｓ２５４Ｆ；Ｖ４８３Ａ；Ｑ６７７Ｈ；Ｄ１３８Ｈ；Ｄ８０Ｙ；Ｍ１２３７Ｔ；Ｄ１１４６Ｈ；Ｅ６５４Ｄ；Ｈ６５５Ｙ；Ｓ５０Ｌ；Ｓ９３９Ｆ；Ｓ９４３Ｐ；Ｇ４８５Ｒ；Ｑ６１３Ｈ；Ｔ７６Ｉ；Ｖ３４１Ｉ；Ｍ１５３Ｉ；Ｓ２２１Ｌ；Ｔ８５９Ｉ；Ｗ２５８Ｌ；Ｌ２４２Ｆ；Ｐ６８１Ｌ；Ｖ２８９Ｉ；Ａ５２０Ｓ；Ｖ１１０４Ｌ；Ｖ１２２８Ｌ；Ｌ１７６Ｆ；Ｍ１２３７Ｉ；Ｔ３０７Ｉ；Ｔ７１６Ｉ；Ｌ１４１；Ｍ１２２９Ｉ；Ａ１０８７Ｓ；Ｐ２６Ｓ；Ｐ３３０Ｓ；Ｐ３８４Ｌ；Ｒ７６５Ｌ；Ｓ９４０Ｆ；Ｔ３２３Ｉ；Ｖ８２６Ｌ；Ｅ１２０２Ｑ；Ｌ１２０３Ｆ；Ｌ６１１Ｆ；Ｖ６１５Ｉ；Ａ２６２Ｓ；Ａ５２２Ｖ；Ａ６８８Ｖ；Ａ７０６Ｖ；Ａ８９２Ｓ；Ｅ５５４Ｄ；Ｑ８３６Ｈ；Ｔ１０２７Ｉ；Ｔ２２Ｉ；Ａ２２２Ｖ；Ａ２７Ｓ；Ａ６２６Ｖ；Ｃ１２４７Ｆ；Ｋ１１９１Ｎ；Ｍ７３１Ｉ；Ｐ２６Ｌ；Ｓ１１４７Ｌ；Ｓ１２５２Ｆ；Ｓ２５５Ｆ；Ｖ１２６４Ｌ；Ｖ３０８Ｌ；Ｄ８０Ａ；Ｉ６７０Ｌ；Ｐ２５１Ｌ；Ｐ６３１Ｓ；＊１２７４Ｑ；Ａ３４４Ｓ；Ａ７７１Ｓ；Ａ８７９Ｔ；Ｄ１０８４Ｙ；Ｄ２５３Ｇ；Ｈ１１０１Ｙ；Ｌ１２００Ｆ；Ｑ１４Ｈ；Ｑ２３９Ｋ；Ａ６２３Ｖ；Ｄ２１５Ｙ；Ｅ１１５０Ｄ；Ｇ４７６Ｓ；Ｋ７７Ｍ；Ｍ１７７Ｉ；Ｐ８１２Ｓ；Ｓ７０４Ｌ；Ｔ５１Ｉ；Ｔ５４７Ｉ；Ｔ７９１Ｉ；Ｖ１１２２Ｌ；Ｙ１４５Ｈ；Ｄ５７４Ｙ；Ｇ１４２Ｄ；Ｇ１８１Ｖ；Ｉ８３４Ｔ；Ｎ３７０Ｓ；Ｐ８１２Ｌ；Ｓ１２Ｆ；Ｔ７９１Ｐ；Ｖ９０Ｆ；Ｗ１５２Ｌ；Ａ２９２Ｓ；Ａ５７０Ｖ；Ａ６４７Ｓ；Ａ８４５Ｖ；Ｄ１１６３Ｙ；Ｇ１８１Ｒ；Ｌ８４Ｉ；Ｌ９３８Ｆ；Ｐ１１４３Ｌ；Ｐ８０９Ｓ；Ｒ７８Ｍ；Ｔ１１６０Ｉ；Ｖ１１３３Ｆ；Ｖ２１３Ｌ；Ｖ６１５Ｆ；Ａ８３１Ｖ；Ｄ８３９Ｙ；Ｄ８３９Ｎ；Ｄ８３９Ｅ；Ｓ９４３Ｐ；Ｐ１２６３Ｌ；又はＶ６２２Ｆ；及びそれらの組合せ。
特定の態様では、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、融合前立体構造におけるＳタンパク質三量体を安定化させる１つ以上のアミノ酸プロリン置換を含む。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）とＳエクトドメイン三量体のプロモーターの中心らせんとの間の境界又はその近傍において、１つ以上のプロリン置換を含む。幾つかの実施形態において、プロリン置換は、三量体中のプロモーターのアミノ酸残基９７０から９９０（ＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥ）（配列番号７）の間で起こる。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、以下の表３の配列番号８（Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ置換は、太字及び下線で示される）に提供されるように、配列番号１のアミノ酸Ｋ９８６及びＶ９８７における２つのプロリン置換を含むか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同なアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９を含み、これは、Ｐ９８６及びＰ９８７をコードする核酸置換を有する天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２配列に由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の全長Ｓタンパク質をコードする核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同な核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１０を含み、これは二重プロリン置換及び安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質をコードする最適化された核酸配列を提供し、該核酸は以下に記載されるように最適化されているか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同な核酸配列を有する。或る特定の実施形態において、タグをコードする追加の核酸配列が、ｒＭＶＡに挿入される核酸配列に含まれ得るため、タグはタンパク質のＣ末端で発現される。幾つかの実施形態において、核酸配列（ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴ）（配列番号４）は、アミノ酸配列ＥＰＥＡ（配列番号５）を有する高親和性Ｃタグをコードする。
或る特定の実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、１つ以上のアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、配列番号８のＫ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、配列番号８のＫ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙの置換を含む。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、配列番号１１の全長タンパク質として、又はこれと８９％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同なアミノ酸配列として発現される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１２を含み、これは、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙ置換を有する二重プロリン置換及び安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質をコードする最適化された核酸配列を提供し、該核酸は、以下に記載されるように最適化されているか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同な核酸配列を有する。幾つかの実施形態において、変異はＫ４１７Ｎである。
幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、配列番号８の１つ以上のスパイクタンパク質アミノ酸Ｈ６９、Ｖ７０若しくはＹ１４４、又はこれらの組合せの欠失を有する。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、配列番号８のＤ６１４Ｇ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｎ４３９Ｋ、Ａ２２２Ｖ、Ｓ４７７Ｎ若しくはＡ３７６Ｔ、又はこれらの組合せから選択される１つ以上の置換を含む。幾つかの実施形態において、スパイクタンパク質は、配列番号８のアミノ酸２４２～２４４において欠失を有する。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、以下の欠失及び置換を含む：配列番号８のアミノ酸６９～７０の欠失、アミノ酸Ｙ１４４の欠失、アミノ酸置換Ｎ５０１Ｙ、アミノ酸置換Ａ５７０Ｄ、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、アミノ酸置換Ｐ６８１Ｈ、アミノ酸置換Ｔ７１６Ｉ、アミノ酸置換Ｓ９８２Ａ、及びアミノ酸置換Ｄ１１１８Ｈ。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、以下の欠失及び置換を含む：配列番号８のＮ５０１Ｙ、Ｋ４１７Ｎ、又はＫ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｄ８０Ａ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、及びアミノ酸２４２～２４４におけるアミノ酸欠失。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、以下の１つ以上の置換を含む：配列番号８のＤ６１４Ｇ；Ｄ９３６Ｙ；Ｐ１２６３Ｌ；Ｌ５Ｆ；Ｎ４３９Ｋ；Ｒ２１Ｉ；Ｄ８３９Ｙ；Ｌ５４Ｆ；Ａ８７９Ｓ；Ｌ１８Ｆ；Ｆ１１２１Ｌ；Ｒ８４７Ｋ；Ｔ４７８Ｉ；Ａ８２９Ｔ；Ｑ６７５Ｈ；Ｓ４７７Ｎ；Ｈ４９Ｙ；Ｔ２９Ｉ；Ｇ７６９Ｖ；Ｇ１１２４Ｖ；Ｖ１１７６Ｆ；Ｋ１０７３Ｎ；Ｐ４７９Ｓ；Ｓ１２５２Ｐ；Ｙ１４５欠失；Ｅ５８３Ｄ；Ｒ２１４Ｌ；Ａ１０２０Ｖ；Ｑ１２０８Ｈ；Ｄ２１５Ｇ；Ｈ１４６Ｙ；Ｓ９８Ｆ；Ｔ９５Ｉ；Ｇ１２１９Ｃ；Ａ８４６Ｖ；Ｉ１９７Ｖ；Ｒ１０２Ｉ；Ｖ３６７Ｆ；Ｔ５７２Ｉ；Ａ１０７８Ｓ；Ａ８３１Ｖ；Ｐ１１６２Ｌ；Ｔ７３Ｉ；Ａ８４５Ｓ；Ｇ１２１９Ｖ；Ｈ２４５Ｙ；Ｌ８Ｖ；Ｑ６７５Ｒ；Ｓ２５４Ｆ；Ｖ４８３Ａ；Ｑ６７７Ｈ；Ｄ１３８Ｈ；Ｄ８０Ｙ；Ｍ１２３７Ｔ；Ｄ１１４６Ｈ；Ｅ６５４Ｄ；Ｈ６５５Ｙ；Ｓ５０Ｌ；Ｓ９３９Ｆ；Ｓ９４３Ｐ；Ｇ４８５Ｒ；Ｑ６１３Ｈ；Ｔ７６Ｉ；Ｖ３４１Ｉ；Ｍ１５３Ｉ；Ｓ２２１Ｌ；Ｔ８５９Ｉ；Ｗ２５８Ｌ；Ｌ２４２Ｆ；Ｐ６８１Ｌ；Ｖ２８９Ｉ；Ａ５２０Ｓ；Ｖ１１０４Ｌ；Ｖ１２２８Ｌ；Ｌ１７６Ｆ；Ｍ１２３７Ｉ；Ｔ３０７Ｉ；Ｔ７１６Ｉ；Ｌ１４１；Ｍ１２２９Ｉ；Ａ１０８７Ｓ；Ｐ２６Ｓ；Ｐ３３０Ｓ；Ｐ３８４Ｌ；Ｒ７６５Ｌ；Ｓ９４０Ｆ；Ｔ３２３Ｉ；Ｖ８２６Ｌ；Ｅ１２０２Ｑ；Ｌ１２０３Ｆ；Ｌ６１１Ｆ；Ｖ６１５Ｉ；Ａ２６２Ｓ；Ａ５２２Ｖ；Ａ６８８Ｖ；Ａ７０６Ｖ；Ａ８９２Ｓ；Ｅ５５４Ｄ；Ｑ８３６Ｈ；Ｔ１０２７Ｉ；Ｔ２２Ｉ；Ａ２２２Ｖ；Ａ２７Ｓ；Ａ６２６Ｖ；Ｃ１２４７Ｆ；Ｋ１１９１Ｎ；Ｍ７３１Ｉ；Ｐ２６Ｌ；Ｓ１１４７Ｌ；Ｓ１２５２Ｆ；Ｓ２５５Ｆ；Ｖ１２６４Ｌ；Ｖ３０８Ｌ；Ｄ８０Ａ；Ｉ６７０Ｌ；Ｐ２５１Ｌ；Ｐ６３１Ｓ；＊１２７４Ｑ；Ａ３４４Ｓ；Ａ７７１Ｓ；Ａ８７９Ｔ；Ｄ１０８４Ｙ；Ｄ２５３Ｇ；Ｈ１１０１Ｙ；Ｌ１２００Ｆ；Ｑ１４Ｈ；Ｑ２３９Ｋ；Ａ６２３Ｖ；Ｄ２１５Ｙ；Ｅ１１５０Ｄ；Ｇ４７６Ｓ；Ｋ７７Ｍ；Ｍ１７７Ｉ；Ｐ８１２Ｓ；Ｓ７０４Ｌ；Ｔ５１Ｉ；Ｔ５４７Ｉ；Ｔ７９１Ｉ；Ｖ１１２２Ｌ；Ｙ１４５Ｈ；Ｄ５７４Ｙ；Ｇ１４２Ｄ；Ｇ１８１Ｖ；Ｉ８３４Ｔ；Ｎ３７０Ｓ；Ｐ８１２Ｌ；Ｓ１２Ｆ；Ｔ７９１Ｐ；Ｖ９０Ｆ；Ｗ１５２Ｌ；Ａ２９２Ｓ；Ａ５７０Ｖ；Ａ６４７Ｓ；Ａ８４５Ｖ；Ｄ１１６３Ｙ；Ｇ１８１Ｒ；Ｌ８４Ｉ；Ｌ９３８Ｆ；Ｐ１１４３Ｌ；Ｐ８０９Ｓ；Ｒ７８Ｍ；Ｔ１１６０Ｉ；Ｖ１１３３Ｆ；Ｖ２１３Ｌ；Ｖ６１５Ｆ；Ａ８３１Ｖ；Ｄ８３９Ｙ；Ｄ８３９Ｎ；Ｄ８３９Ｅ；Ｓ９４３Ｐ；Ｐ１２６３Ｌ；又はＶ６２２Ｆ；及びそれらの組合せ。
幾つかの実施形態において、安定化Ｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１２、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同な核酸配列である。配列番号１２は、二重プロリン置換及び安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質をコードする最適化された核酸配列を提供し、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｔアミノ酸置換を更に含み、該核酸は以下に記載されるように最適化されている。或る特定の実施形態において、タグをコードする追加の核酸配列が、ｒＭＶＡに挿入される核酸配列に含まれ得るため、タグはタンパク質のＣ末端で発現される。幾つかの実施形態において、核酸配列（ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴ）（配列番号４）は、アミノ酸配列ＥＰＥＡ（配列番号５）を有する高親和性Ｃタグをコードする。
或る特定の態様では、ｒＭＶＡによって発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原は、改変スパイク（Ｓ）タンパク質であり、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質は、表５に提供されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸１～１２１３（配列番号１３）、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同なアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１５を含み、これは、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２配列に由来するＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質をコードする核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同な核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１６を含み、これは、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質をコードする最適化された核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同な核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質は、表５に提供されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸１～１２１３とアミノ酸９８６及び９８７における２つのプロリン置換とを含む（配列番号１４）か、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同なアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１７を含み、これは、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐをコードする最適化された核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同な核酸配列を提供する。或る特定の実施形態において、タグをコードする追加の核酸配列が、ｒＭＶＡに挿入される核酸配列に含まれ得るため、タグはタンパク質のＣ末端で発現される。幾つかの実施形態において、核酸配列（ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴ）（配列番号４）は、アミノ酸配列ＥＰＥＡ（配列番号５）を有する高親和性Ｃタグをコードする。
或る特定の態様では、ｒＭＶＡによって発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原は、改変スパイク（Ｓ）タンパク質であり、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含み、１つ以上のアミノ酸置換又は欠失を更に含む。幾つかの実施形態において、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質は、表６に提供されるように、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙの置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸１～１２１３（配列番号１８）を含むか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％相同なアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質は、表６に提供されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸１～１２１３とアミノ酸９８６及び９８７における２つのプロリン置換と、アミノ酸置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙとを含む（配列番号１９）か、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同なアミノ酸配列を有する。
幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによって発現されるＳタンパク質は、改変スパイク（Ｓ）タンパク質であり、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含み、配列番号１３若しくは配列番号１４のＫ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ若しくはＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を更に含むか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同なアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、変異はＫ４１７Ｎである。
幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによって発現されるＳタンパク質は、改変スパイク（Ｓ）タンパク質であり、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含み、配列番号１３若しくは配列番号１４の１つ以上のスパイクタンパク質アミノ酸Ｈ６９、Ｖ７０、若しくはＹ１４４、又はそれらの組合せの欠失を更に含むか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％相同なアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによって発現されるＳタンパク質は、改変スパイク（Ｓ）タンパク質であり、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含み、配列番号１３若しくは配列番号１４のＤ６１４Ｇ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｎ４３９Ｋ、Ａ２２２Ｖ、Ｓ４７７Ｎ若しくはＡ３７６Ｔ、又はこれらの組合せから選択される１つ以上の置換を更に含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによって発現されるＳタンパク質は、改変スパイク（Ｓ）タンパク質であり、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含み、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸２４２～２４４における欠失を更に含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによって発現されるＳタンパク質は、改変スパイク（Ｓ）タンパク質であり、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含み、配列番号１３又は配列番号１４の以下の欠失及び置換：アミノ酸６９～７０の欠失、アミノ酸Ｙ１４４の欠失、アミノ酸置換Ｎ５０１Ｙ、アミノ酸置換Ａ５７０Ｄ、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、アミノ酸置換Ｐ６８１Ｈ、アミノ酸置換Ｔ７１６Ｉ、アミノ酸置換Ｓ９８２Ａ、及びアミノ酸置換Ｄ１１１８Ｈを更に含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによって発現されるＳタンパク質は、改変スパイク（Ｓ）タンパク質であり、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含み、配列番号１３又は配列番号１４の以下の欠失及び置換：Ｎ５０１Ｙ、Ｋ４１７Ｎ又はＫ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｄ８０Ａ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、及びアミノ酸２４２～２４４におけるアミノ酸欠失を更に含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによって発現されるＳタンパク質は、改変スパイク（Ｓ）タンパク質であり、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含み、配列番号１３又は配列番号１４の以下の１つ以上の置換：Ｄ６１４Ｇ；Ｄ９３６Ｙ；Ｐ１２６３Ｌ；Ｌ５Ｆ；Ｎ４３９Ｋ；Ｒ２１Ｉ；Ｄ８３９Ｙ；Ｌ５４Ｆ；Ａ８７９Ｓ；Ｌ１８Ｆ；Ｆ１１２１Ｌ；Ｒ８４７Ｋ；Ｔ４７８Ｉ；Ａ８２９Ｔ；Ｑ６７５Ｈ；Ｓ４７７Ｎ；Ｈ４９Ｙ；Ｔ２９Ｉ；Ｇ７６９Ｖ；Ｇ１１２４Ｖ；Ｖ１１７６Ｆ；Ｋ１０７３Ｎ；Ｐ４７９Ｓ；Ｙ１４５欠失；Ｅ５８３Ｄ；Ｒ２１４Ｌ；Ａ１０２０Ｖ；Ｑ１２０８Ｈ；Ｄ２１５Ｇ；Ｈ１４６Ｙ；Ｓ９８Ｆ；Ｔ９５Ｉ；Ｇ１２１９Ｃ；Ａ８４６Ｖ；Ｉ１９７Ｖ；Ｒ１０２Ｉ；Ｖ３６７Ｆ；Ｔ５７２Ｉ；Ａ１０７８Ｓ；Ａ８３１Ｖ；Ｐ１１６２Ｌ；Ｔ７３Ｉ；Ａ８４５Ｓ；Ｈ２４５Ｙ；Ｌ８Ｖ；Ｑ６７５Ｒ；Ｓ２５４Ｆ；Ｖ４８３Ａ；Ｑ６７７Ｈ；Ｄ１３８Ｈ；Ｄ８０Ｙ；Ｄ１１４６Ｈ；Ｅ６５４Ｄ；Ｈ６５５Ｙ；Ｓ５０Ｌ；Ｓ９３９Ｆ；Ｓ９４３Ｐ；Ｇ４８５Ｒ；Ｑ６１３Ｈ；Ｔ７６Ｉ；Ｖ３４１Ｉ；Ｍ１５３Ｉ；Ｓ２２１Ｌ；Ｔ８５９Ｉ；Ｗ２５８Ｌ；Ｌ２４２Ｆ；Ｐ６８１Ｌ；Ｖ２８９Ｉ；Ａ５２０Ｓ；Ｖ１１０４Ｌ；Ｌ１７６Ｆ；Ｔ３０７Ｉ；Ｔ７１６Ｉ；Ｌ１４１；Ａ１０８７Ｓ；Ｐ２６Ｓ；Ｐ３３０Ｓ；Ｐ３８４Ｌ；Ｒ７６５Ｌ；Ｓ９４０Ｆ；Ｔ３２３Ｉ；Ｖ８２６Ｌ；Ｅ１２０２Ｑ；Ｌ１２０３Ｆ；Ｌ６１１Ｆ；Ｖ６１５Ｉ；Ａ２６２Ｓ；Ａ５２２Ｖ；Ａ６８８Ｖ；Ａ７０６Ｖ；Ａ８９２Ｓ；Ｅ５５４Ｄ；Ｑ８３６Ｈ；Ｔ１０２７Ｉ；Ｔ２２Ｉ；Ａ２２２Ｖ；Ａ２７Ｓ；Ａ６２６Ｖ；Ｋ１１９１Ｎ；Ｍ７３１Ｉ；Ｐ２６Ｌ；Ｓ１１４７Ｌ；Ｓ２５５Ｆ；Ｖ３０８Ｌ；Ｄ８０Ａ；Ｉ６７０Ｌ；Ｐ２５１Ｌ；Ｐ６３１Ｓ；Ａ３４４Ｓ；Ａ７７１Ｓ；Ａ８７９Ｔ；Ｄ１０８４Ｙ；Ｄ２５３Ｇ；Ｈ１１０１Ｙ；Ｌ１２００Ｆ；Ｑ１４Ｈ；Ｑ２３９Ｋ；Ａ６２３Ｖ；Ｄ２１５Ｙ；Ｅ１１５０Ｄ；Ｇ４７６Ｓ；Ｋ７７Ｍ；Ｍ１７７Ｉ；Ｐ８１２Ｓ；Ｓ７０４Ｌ；Ｔ５１Ｉ；Ｔ５４７Ｉ；Ｔ７９１Ｉ；Ｖ１１２２Ｌ；Ｙ１４５Ｈ；Ｄ５７４Ｙ；Ｇ１４２Ｄ；Ｇ１８１Ｖ；Ｉ８３４Ｔ；Ｎ３７０Ｓ；Ｐ８１２Ｌ；Ｓ１２Ｆ；Ｔ７９１Ｐ；Ｖ９０Ｆ；Ｗ１５２Ｌ；Ａ２９２Ｓ；Ａ５７０Ｖ；Ａ６４７Ｓ；Ａ８４５Ｖ；Ｄ１１６３Ｙ；Ｇ１８１Ｒ；Ｌ８４Ｉ；Ｌ９３８Ｆ；Ｐ１１４３Ｌ；Ｐ８０９Ｓ；Ｒ７８Ｍ；Ｔ１１６０Ｉ；Ｖ１１３３Ｆ；Ｖ２１３Ｌ；Ｖ６１５Ｆ；Ａ８３１Ｖ；Ｄ８３９Ｙ；Ｄ８３９Ｎ；Ｄ８３９Ｅ；Ｓ９４３Ｐ；又はＶ６２２Ｆ；及びそれらの組合せを更に含む。
或る特定の実施形態において、タグをコードする追加の核酸配列が、ｒＭＶＡに挿入される核酸配列に含まれ得るため、タグはタンパク質のＣ末端で発現される。幾つかの実施形態において、核酸配列（ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴ）（配列番号４）は、アミノ酸配列ＥＰＥＡ（配列番号５）を有する高親和性Ｃタグをコードする。
或る特定の態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原は、Ｓタンパク質の直鎖状エピトープである。特定の実施形態において、Ｓタンパク質の直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、以下の表７に提供されるＳタンパク質のアミノ酸３２７～５２４（配列番号２０）、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２２を含み、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の天然配列に由来するＳタンパク質のアミノ酸３２７～５２４の直鎖状Ｓエピトープをコードする核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種の核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２４を含み、これは、Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４の直鎖状Ｓエピトープをコードする最適化された核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種の核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、以下の表７に提供されるＳタンパク質のアミノ酸３３１～５２４（配列番号２１）、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種のアミノ酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２３を含み、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の天然配列に由来するＳタンパク質のアミノ酸３３１～５２４の直鎖状Ｓエピトープをコードする核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種の核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２４を含み、これは、Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４の直鎖状Ｓエピトープをコードする最適化された核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種の核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のＲＢＤ領域のアミノ酸５０４～５２４（配列番号２６）、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２７を含み、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の天然配列に由来するアミノ酸５０４～５２４の直鎖状Ｓエピトープをコードする核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種の核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号２８を含み、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のＲＢＤ領域のアミノ酸５０４～５２４の直鎖状Ｓエピトープをコードする最適化された核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種の核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のＲＢＤ領域のアミノ酸４７３～４９０（配列番号２９）、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号３０をコードし、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の天然配列に由来するアミノ酸４７３～４９０の直鎖状Ｓエピトープをコードする核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種のアミノ酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号３１を含み、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のＲＢＤ領域のアミノ酸４７３～４９０の直鎖状Ｓエピトープをコードする最適化された核酸配列、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種の核酸配列を提供する。
幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質の直鎖状エピトープは、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）コンセンサス配列である。
或る特定の実施形態において、タグをコードする追加の核酸配列が、ｒＭＶＡに挿入される核酸配列に含まれ得るため、タグはタンパク質のＣ末端で発現される。幾つかの実施形態において、核酸配列（ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴ）（配列番号４）は、アミノ酸配列ＥＰＥＡ（配列番号５）を有する高親和性Ｃタグをコードする。
幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質ＲＢＤ直鎖状エピトープは、核酸配列ＡＴＧによってコードされるＮＨ末端のアミノ酸メチオニンを含む。
幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質の直鎖状エピトープは、１つ以上の変異又は欠失を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、以下の表８に提供されるＳタンパク質のアミノ酸３２７～５２４（配列番号３２）、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、以下の表８に提供されるＳタンパク質のアミノ酸３３１～５２４（配列番号３３）、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種のアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙの置換から選択される１つ以上の変異又は欠失を含む。
幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによって発現されるＳタンパク質は、配列番号２０若しくは配列番号２１のＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｙ４５３Ｆ、Ｎ４３９Ｋ、Ｓ４７７Ｎ、若しくはＡ３７６Ｔ、又はそれらの組合せから選択される１つ以上の置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）であるか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種のアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによって発現されるＳタンパク質は、配列番号２０若しくは配列番号２１の以下の１つ以上の置換：Ｎ４３９Ｋ；Ｔ４７８Ｉ；Ｓ４７７Ｎ；Ｐ４７９Ｓ；Ｖ３６７Ｆ；Ｖ３４１Ｉ；Ｐ３３０Ｓ；Ｐ３８４Ｌ；Ａ５２２Ｖ；及びそれらの組合せを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）であるか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９５％若しくは９９％異種のアミノ酸配列を有する。
或る特定の実施形態において、タグをコードする追加の核酸配列が、ｒＭＶＡに挿入される核酸配列に含まれ得るため、タグはタンパク質のＣ末端で発現される。幾つかの実施形態において、核酸配列（ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴ）（配列番号４）は、アミノ酸配列ＥＰＥＡ（配列番号５）を有する高親和性Ｃタグをコードする。
幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質ＲＢＤ直鎖状エピトープは、核酸配列ＡＴＧによってコードされるＮＨ末端のアミノ酸メチオニンを含む。
或る特定の態様では、Ｓタンパク質の２つ以上の直鎖状エピトープはｒＭＶＡによってコードされ、該２つ以上の直鎖状エピトープは、スペーサー、例えばＧＰＧＰＧスペーサーポリペプチドによって分離される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターに挿入される配列は、スペーサーによって分離された直鎖状エピトープをコードし、直鎖状エピトープは、異なるＳタンパク質ＲＢＤペプチド、例えば（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２）を含み、ここでＲＢＤ Ｓｅｑ．１は、第１のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．２は、第２のＳタンパク質ＲＢＤペプチドである。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターに挿入される配列は、タンデムリピート配列、例えば（ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ）ｘ又は（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２－ｓｐａｃｅｒ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０）をコードする。幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４に由来する１つ以上のペプチドから選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０から選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０である。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入される配列は、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ｓｐａｃｅｒ－（ａａ４７３～４９０）－ｓｐａｃｅｒ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を含むＳタンパク質ＲＢＤペプチドをコードする。幾つかの実施形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施形態において、ｘ＝５である。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入される配列は、タンデムリピート復配列（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を含むＳタンパク質ＲＢＤペプチドをコードする。幾つかの実施形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施形態において、ｘ＝５である。
幾つかの実施形態において、ＭＶＡは、以下の表９に提供される配列番号３４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、これは、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘにおいてＳタンパク質ＲＢＤペプチドをコードする例示的なアミノ酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ＭＶＡは、配列番号３５の核酸配列を含み、これは、アミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０をコードする天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ゲノム配列に由来し、リンカーアミノ酸配列ＧＰＧＰＧをコードする核酸配列を含む、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘをコードする核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ＭＶＡは、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、これは、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘ（式中、ｘ＝５）においてＳタンパク質ＲＢＤペプチドのアミノ酸配列を提供し、配列番号３７は最適化されたこれをコードする核酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ＭＶＡは、以下の表９に提供される配列番号３８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、これは、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘにおけるＳタンパク質ＲＢＤペプチドをコードし、置換Ｅ４８４Ｋを更に含む、例示的なアミノ酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、ＭＶＡは、配列番号３９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、これは、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ＧＰＧＰＧ－（ａａ４７３～４９０）－ＧＰＧＰＧ）ｘ（式中、ｘ＝５）におけるＳタンパク質ＲＢＤペプチドのアミノ酸配列であって、置換Ｅ４８４Ｋを更に含むアミノ酸配列を提供する。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質ＲＢＤタンデムリピートは、核酸配列ＡＴＧによってコードされるＮＨ末端のアミノ酸メチオニンを含む。
エンベロープ（Ｅ）タンパク質
Ｅタンパク質は、主要な構造タンパク質の中で最も小さい。例えばＳＡＲＳの複製サイクルの間、Ｅは感染細胞内で豊富に発現されるが、ビリオンエンベロープに取り込まれるのはごく一部である（Venkatagopalan et al., Coronavirus envelope (E) protein remains at the site of assembly. Virology. 2015;478:75-85）。例えば、ＳＡＲＳ感染においてタンパク質の大部分は、細胞内トラフィッキングの部位、すなわちＥＲ、ゴルジ、及びＥＲＧＩＣに局在し、そこでＣｏＶの集合及び出芽に関与する（Nieto-Torres et al., Subcellular location and topology of severe acute respiratory syndrome coronavirus envelope protein. Virology. 2011;415(2):69-82）。
Ｅタンパク質は、主要な構造タンパク質の中で最も小さい。例えばＳＡＲＳの複製サイクルの間、Ｅは感染細胞内で豊富に発現されるが、ビリオンエンベロープに取り込まれるのはごく一部である（Venkatagopalan et al., Coronavirus envelope (E) protein remains at the site of assembly. Virology. 2015;478:75-85）。例えば、ＳＡＲＳ感染においてタンパク質の大部分は、細胞内トラフィッキングの部位、すなわちＥＲ、ゴルジ、及びＥＲＧＩＣに局在し、そこでＣｏＶの集合及び出芽に関与する（Nieto-Torres et al., Subcellular location and topology of severe acute respiratory syndrome coronavirus envelope protein. Virology. 2011;415(2):69-82）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２エンベロープ（Ｅ）タンパク質のアミノ酸配列は、７５アミノ酸長である。Ｅタンパク質はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＱＨＤ４３４１８で報告されており、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７．３で報告され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ゲノムの核酸２６２４５～２６４７２に位置する対応する核酸配列（配列番号４１）と共に表１０（配列番号４０）に再現される。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入された核酸は、配列番号４０のアミノ酸、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％異種のアミノ酸をコードする。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入される核酸は、配列番号４１、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％異種の核酸である。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入されたＥタンパク質をコードする核酸配列は、例えば、配列番号４２に提供されるように最適化されているか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％異種の核酸である。
幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入される核酸は、Ｓ６８Ｆ、Ｌ７３Ｆ、Ｐ７１Ｌ、Ｓ５５Ｆ、Ｒ６９Ｉ、Ｔ９Ｉ、Ｖ２４Ｍ、Ｄ７２Ｈ、Ｔ３０Ｉ、Ｓ６８Ｃ、Ｖ７５Ｌ、Ｖ５８Ｆ、Ｖ７５Ｆ、若しくはＬ２１Ｆ、及びそれらの組合せから選択される１つ以上の置換を有する配列番号４０のアミノ酸、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％異種のアミノ酸をコードする。
或る特定の実施形態において、タグをコードする追加の核酸配列が、ｒＭＶＡに挿入される核酸配列に含まれ得るため、タグはタンパク質のＣ末端で発現される。幾つかの実施形態において、核酸配列（ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴ）（配列番号４）は、アミノ酸配列ＥＰＥＡ（配列番号５）を有する高親和性Ｃタグをコードする。
膜（Ｍ）タンパク質
コロナウイルスＭタンパク質は、最も豊富な構造タンパク質であり、ウイルスエンベロープの形状を規定する（Neuman et al., A structural analysis of M protein in coronavirus assembly and morphology. J Struct Biol. 2011;174(1):11-22）。Ｍタンパク質はまた、ＣｏＶ集合の中心的なオーガナイザーとみなされ、他の全ての主要なコロナウイルス構造タンパク質と相互作用する（Masters PS. The molecular biology of coronaviruses. Adv Virus Res. 2006;66:193-292）。例えば、ＳＡＲＳ Ｍタンパク質間のホモタイプ相互作用は、ビリオンエンベロープ形成の背後にある主要な駆動力であるが、単独ではビリオン形成には十分ではない（Neuman et al., J Struct Biol. 2011;174(1):11-22、de Haan et al., Assembly of the coronavirus envelope: homotypic interactions between the M proteins. J Virol. 2000;74(11):4967-78）。例えばＳＡＲＳに関しては、Ｍ及びＥがウイルスエンベロープを構成し、それらの相互作用はＶＬＰの産生及び放出に十分である（Mortola & Roy. Efficient assembly and release of SARS coronavirus-like particles by a heterologous expression system. FEBS Lett. 2004;576(1-2):174-8）。
コロナウイルスＭタンパク質は、最も豊富な構造タンパク質であり、ウイルスエンベロープの形状を規定する（Neuman et al., A structural analysis of M protein in coronavirus assembly and morphology. J Struct Biol. 2011;174(1):11-22）。Ｍタンパク質はまた、ＣｏＶ集合の中心的なオーガナイザーとみなされ、他の全ての主要なコロナウイルス構造タンパク質と相互作用する（Masters PS. The molecular biology of coronaviruses. Adv Virus Res. 2006;66:193-292）。例えば、ＳＡＲＳ Ｍタンパク質間のホモタイプ相互作用は、ビリオンエンベロープ形成の背後にある主要な駆動力であるが、単独ではビリオン形成には十分ではない（Neuman et al., J Struct Biol. 2011;174(1):11-22、de Haan et al., Assembly of the coronavirus envelope: homotypic interactions between the M proteins. J Virol. 2000;74(11):4967-78）。例えばＳＡＲＳに関しては、Ｍ及びＥがウイルスエンベロープを構成し、それらの相互作用はＶＬＰの産生及び放出に十分である（Mortola & Roy. Efficient assembly and release of SARS coronavirus-like particles by a heterologous expression system. FEBS Lett. 2004;576(1-2):174-8）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２膜（Ｍ）タンパク質のアミノ酸配列は、２２２アミノ酸長である。Ｍタンパク質はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＱＨＤ４３４１９で報告されており、配列番号４３として下記表１１に再現され、その核酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ゲノムの核酸２６５２３～２７１９１に位置し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７．３で報告されており、配列番号４４として以下に再現される。
幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入される核酸配列は、配列番号４３のアミノ酸、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％異種のアミノ酸をコードする。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入される核酸配列は、配列番号４４、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％異種の核酸である。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入されるＭタンパク質をコードする核酸配列は、例えば、配列番号４５に提供されるように最適化されているか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％異種の核酸である。
幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入される核酸配列は、配列番号４３のアミノ酸をコードし、Ｔ１７５Ｍ、Ｄ３Ｇ、Ｖ２３Ｌ、Ｗ３１Ｃ、Ａ２Ｖ、Ｖ７０Ｆ、Ｗ７５Ｌ、Ｍ１０９Ｉ、Ｉ５２Ｔ、Ｌ４６Ｆ、Ｖ７０Ｉ、Ｄ３Ｙ、Ｋ１６２Ｎ、Ｈ１２５Ｙ、Ｋ１５Ｒ、Ｄ２０９Ｙ、Ｒ１４６Ｈ、Ｒ１５８Ｃ、Ｌ８７Ｆ、Ａ２Ｓ、Ａ６９Ｓ、Ｓ２１４Ｉ、Ｔ２０８Ｉ、Ｌ１２４Ｆ、若しくはＳ４Ｆ、及びそれらの組合せから選択される１つ以上の置換を更に含むか、又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％異種のアミノ酸をコードする。
或る特定の実施形態において、タグをコードする追加の核酸配列が、ｒＭＶＡに挿入される核酸配列に含まれ得るため、タグはタンパク質のＣ末端で発現される。幾つかの実施形態において、核酸配列（ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴ）（配列番号４）は、アミノ酸配列ＥＰＥＡ（配列番号５）を有する高親和性Ｃタグをコードする。
改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）ウイルスベクター
本明細書で提供されるように、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原又はその抗原性フラグメントをコードする核酸配列は、ワクシニアウイルス株改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）に挿入され、これは、被験体に投与された場合に、被験体の細胞において１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原又はその抗原性フラグメントを発現させることができる。「改変ワクシニア・アンカラ（"modified vaccinia Ankara," "modified vaccinia ankara," "Modified Vaccinia Ankara,"）」、すなわち「ＭＶＡ」という用語は、Anton Mayr博士によってヒヨコ胚線維芽細胞での連続継代によって開発された高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株、又はその変異体若しくは誘導体を指す。ＭＶＡは（Mayr, A. et al. 1975 Infection 3:6-14、スイス特許第５６８，３９２号）で概説される。ＭＶＡの完全なゲノム配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ９４８４８として入手可能である。
本明細書で提供されるように、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原又はその抗原性フラグメントをコードする核酸配列は、ワクシニアウイルス株改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）に挿入され、これは、被験体に投与された場合に、被験体の細胞において１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原又はその抗原性フラグメントを発現させることができる。「改変ワクシニア・アンカラ（"modified vaccinia Ankara," "modified vaccinia ankara," "Modified Vaccinia Ankara,"）」、すなわち「ＭＶＡ」という用語は、Anton Mayr博士によってヒヨコ胚線維芽細胞での連続継代によって開発された高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株、又はその変異体若しくは誘導体を指す。ＭＶＡは（Mayr, A. et al. 1975 Infection 3:6-14、スイス特許第５６８，３９２号）で概説される。ＭＶＡの完全なゲノム配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ９４８４８として入手可能である。
改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）は、ニワトリ胚線維芽細胞に対するワクシニアウイルス（ＣＶＡ）のアンカラ株の長期連続継代によって生成されてきた（総説についてはMayr, A. et al. 1975 Infection 3:6-14、スイス特許第５６８，３９２号を参照されたい）。ＭＶＡウイルスは、アメリカンタイプカルチャーコレクションからＡＴＣＣ番号ＶＲ－１５０８として公的に入手可能である。ＭＶＡは、良好な免疫原性を維持しながら、霊長類細胞における病原性の低下及び複製能力の低下によって実証されるように、その大幅な弱毒化によって区別される。ＭＶＡウイルスは、親ＣＶＡ株に対するゲノムの変化を決定するために分析されている。ゲノムＤＮＡの６つの主要な欠失（欠失Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩ）が合計３１０００塩基対で同定されている（Meyer, H. et al. 1991 J Gen Virol 72:1031-1038）。得られたＭＶＡウイルスは、鳥類細胞に宿主細胞が限定される宿主細胞である。
ヒト細胞におけるＭＶＡ複製は、感染の後期に遮断されて成熟した感染性ビリオンへ集合を妨げることがわかっている。それにもかかわらず、ＭＶＡは、非許容細胞においてもウイルス及び組換え異種遺伝子を高レベルで発現することができる（Sutter, G. and Moss, B. 1992 PNAS USA 89:10847-10851）。組換えＭＶＡは、以下に記載するように調製することができる。一般に、所定の挿入部位（以下に更に記載される）に隣接するＭＶＡ ＤＮＡ配列に挟まれた１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（異種）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトを、ＭＶＡに感染した細胞（例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞）に導入して、相同組換えを可能にすることができる。ＤＮＡコンストラクトが真核細胞に導入され、外来ＤＮＡがウイルスＤＮＡと再結合すると、所望の組換えＭＶＡを単離することができる。挿入されるＤＮＡコンストラクトは、直鎖状又は環状であり得る。プラスミド又はポリメラーゼ連鎖反応産物が好ましい。組換えＭＶＡベクターを作製するかかる方法は、例えば米国特許第９，４５３，２３９号に記載されており、これは引用することにより本明細書の一部をなす。
異種ＤＮＡ配列又は遺伝子の発現のためには、遺伝子の転写に必要なプロモーター等の調節配列がＤＮＡ上に存在する必要がある。ＭＶＡは細胞質ウイルスであるため、適切なプロモーターとしては、天然に存在するポックスウイルスプロモーターに由来するものが挙げられる。ポックスウイルスの遺伝子、プロモーター、及び転写因子は、ポックスウイルス感染中のそれらの発現タイミングに応じて、初期、中間、及び後期のクラスに分けられる。例えば、Assarsson et al., Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. PNAS 2008;105(6):2140-2145、Yang Zet al., Genome-wide analysis of the 5' and 3' ends of vaccinia virus early mRNAs delineates regulatory sequences of annotated and anomalous transcripts. J Virol. 2011;85(12):5897-5909を参照されたい。ほとんどの哺乳動物細胞(非許容細胞)におけるＭＶＡ複製は、発現の全ての段階が起こった後、子孫ビリオンの集合中に停止する。これは、導入遺伝子発現を制御するための後期プロモーターを含む全てのプロモータークラスの有用性を支持する（Sancho et al., The block in assembly of modified vaccinia virus Ankara in HeLa cells reveals new insights into vaccinia virus morphogenesis. J Virol. 2002;76(16):8318-8334、Geiben-Lynn et al., Kinetics of recombinant adenovirus type 5, vaccinia virus, modified vaccinia ankara virus, and DNA antigen expression in vivo and the induction of memory T-lymphocyte responses. Clin Vaccine Immunol. 2008;15(4):691-696）。幾つかのポックスウイルスプロモーターは、初期及び後期の両方のエレメントを有し、それらのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は組換え抗原を、それぞれウイルス感染の初期及びウイルスゲノム複製後の後期に発現させることを可能にする（Broyles SS, Vaccinia virus transcription. J Gen Virol. 2003;84(Pt 9):2293-2303）。ポックスウイルスプロモーターは、交差株を利用することができる。Prideaux et al., Comparative analysis of vaccinia virus promoter activity in fowlpox and vaccinia virus recombinants. Virus Res. 1990;16(1):43-57、Tripathy et al., Regulation of foreign gene in fowlpox virus by a vaccinia virus promoter. Avian Dis. 1990;34(1):218-220を参照されたい。かかる調節配列は当業者に知られており、例えばＦ１７Ｒ ＯＲＦによってコードされる１１ｋタンパク質の発現を駆動するｐ１１プロモーター（Wittek et al., Mapping of a gene coding for a major late structural polypeptide on the vaccinia virus genome. J Virol. 1984;49(2):371-378）；ｐ７．５プロモーター（Cochran et al., In vitro mutagenesis of the promoter region for a vaccinia virus gene: evidence for tandem early and late regulatory signals. J Virol. 1985;54(1):30-37）；ｐＩ１Ｌプロモーター（Schmitt et al., Sequence and transcriptional analysis of the vaccinia virus HindIII I fragment. J Virol. 1988;62(6):1889-1897）；ｐＴＫプロモーター（Weir and Moss, Determination of the promoter region of an early vaccinia virus gene encoding thymidine kinase. Virology. 1987;158(1):206-210）；ｐＦ７Ｌプロモーター（Coupar et al., Effect of in vitro mutations in a vaccinia virus early promoter region monitored by herpes simplex virus thymidine kinase expression in recombinant vaccinia virus. J Gen Virol. 1987;68(Pt 9):2299-2309）；ｐＨ５プロモーター（Perkus et al., Cloning and expression of foreign genes in vaccinia virus, using a host range selection system. J Virol. 1989;63(9):3829-3836）；短い合成プロモーターｐＳｙｎ（Chakrabarti et al., Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. Biotechniques. 1997;23(6):1094-1097、Hammond et al., A synthetic vaccinia virus promoter with enhanced early and late activity. J Virol Methods. 1997;66(1):135-1380）；ｐＨ５プロモーター（Wyatt et al., Development of a replication-deficient recombinant vaccinia virus vaccine effective against parainfluenza virus 3 infection in an animal model. Vaccine. 1996;14(15):1451-1458）；ｐｍＨ５プロモーター（Wyatt et al., Development of a replication-deficient recombinant vaccinia virus vaccine effective against parainfluenza virus 3 infection in an animal model. Vaccine. 1996;14(15):1451-1458）；ｐＨｙｂプロモーター（Sancho et al., The block in assembly of modified vaccinia virus Ankara in HeLa cells reveals new insights into vaccinia virus morphogenesis. J Virol. 2002;76(16):8318-8334）；ＬＥＯプロモーター（Wyatt et al., Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ankara HIV vaccines. Vaccine. 2008;26(4):486-493）；ｐＢ８プロモーター（Orubu et al., Expression and cellular immunogenicity of a transgenic antigen driven by endogenous poxviral early promoters at their authentic loci in MVA. PLoS One. 2012;7(6):e40167）；ｐＦ１１プロモーター（Orubu et al., Expression and cellular immunogenicity of a transgenic antigen driven by endogenous poxviral early promoters at their authentic loci in MVA. PLoS One. 2012;7(6):e40167）が挙げられる。
幾つかの実施形態において、プロモーターはｐｍＨ５プロモーターである。幾つかの実施形態において、プロモーターは、配列番号１５４（ＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡ）を含む。
幾つかの実施形態において、プロモーターはｐ１１プロモーターである。幾つかの実施形態において、プロモーターは、配列番号１５５（ＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＡＡ）を含む。
ＤＮＡコンストラクトを、トランスフェクションによって、例えばリン酸カルシウム沈殿によって（Graham et al. 1973 Virol 52:456-467、Wigler et al. 1979 Cell 16:777-785）、エレクトロポレーションによって（Neumann et al. 1982 EMBO J. 1 :841-845）、マイクロインジェクションによって（Graessmann et al. 1983 Meth Enzymol 101:482-492）、リポソームを用いて（Straubinger et al. 1983 Meth Enzymol 101:512-527）、スフェロプラストによって（Schaffher 1980 PNAS USA 77:2163-2167）、又は当業者に知られている他の方法によってＭＶＡ感染細胞に導入することができる。
本発明のＭＶＡベクターの設計及び製造方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する有効なＴ細胞及び抗体免疫応答を惹起するための有効なＭＶＡワクチンベクターを製造するのに有用である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載のＭＶＡワクチンベクターは、単一の相同プライムブースト後に有効な免疫応答及び抗体産生を惹起することができる。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする１つ以上の核酸配列を含む組換えウイルスベクター（例えば、ＭＶＡベクター）を提供する。ウイルスベクター（例えば、ＭＶＡベクター）は、当業者に知られている従来の技術を用いて構築され得る。１つ以上の異種ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２遺伝子インサートは、所望の免疫原性を有するポリペプチド、すなわち、それらの投与によってｉｎ ｖｉｖｏで免疫反応、細胞性免疫及び／又は体液性免疫を誘導することができるポリペプチドをコードする。免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の導入において、所望の免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の上流に適切なプロモーターが作動可能に連結され得る。
１つ以上の核酸配列は、ＭＶＡベクターでの使用のために最適化され得る。最適化はコドン最適化を含み、これはサイレント変異を使用して、天然配列から選択されたコドンを宿主ベクター系によって最適に発現される同義コドンに変更する。他のタイプの最適化は、ホモポリマーストレッチ又は転写ターミネーターモチーフを中断するためのサイレント変異の使用を含む。これらの最適化戦略の各々は、遺伝子の安定性を改善するか、転写産物の安定性を改善するか、又は配列からのタンパク質発現のレベルを改善することができる。例示的な実施形態において、異種ＤＮＡインサート配列におけるホモポリマーストレッチの数が減少することで、コンストラクトは安定化するであろう。サイレント変異は、ワクシニア終止シグナルに類似したものに対して提供され得る。
例示的な実施形態において、配列は、ＭＶＡにおける発現のために最適化されたコドンであり、５を超えるデオキシグアノシン、５を超えるデオキシシチジン、５を超えるデオキシアデノシン、及び５を超えるデオキシチミジンのランを有する配列は、フレームシフト変異による発現損失を最小限に抑えるために、サイレント変異によって中断される。
特に、挿入用の核酸は、元のＤＮＡ配列をコドン最適化することにより最適化することができる。例えば、「Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」は、ＤＮＡ配列をコドン最適化するために使用することができる。遺伝子配列を完全に最適化するために、ホモポリマー配列（Ｇ／Ｃ又はＴ／Ａリッチ領域）はサイレント変異（複数の場合もある）によって中断される。核酸インサート配列中に存在する程度において、ＭＶＡ転写ターミネーター（Ｔ５ＮＴ（ＵＵＵＵＵＮＵ））は、サイレント変異（複数の場合もある）を介して中断される。更なる最適化は、例えば、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ／ＡＴＧ）の付加、第２の終止コドンの付加、及びワクシニアウイルス転写ターミネーター、具体的には「ＴＴＴＴＴＡＴ」、又はそれらのバリエーション及び／又は組合せの付加を含み得る。
１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質又はそのフラグメントをコードするＤＮＡインサートは、任意の適切な位置、例えば、天然欠失部位、改変天然欠失部位、非必須ＭＶＡ遺伝子、例えばＭＶＡチミジンキナーゼ遺伝子座、又は必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間の遺伝子間領域において、ＭＶＡゲノムに挿入することができる。適切な挿入部位は、例えば、米国特許第６，９９８，２５２号、米国特許第９，１３３，４７８号、Ober et al., Immunogenicity and safety of defective vaccinia virus lister: comparison with modified vaccinia virus Ankara. J. Virol., Aug. 2002 (pg.7713-7723)、米国特許第９，１３３，４８０号、米国特許第８，２８８，１２５号に記載されており、それぞれが引用することにより本明細書の一部をなす。
幾つかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ペプチドコード配列は、天然欠失部位（例えば、天然欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩから選択される欠失部位）、改変天然欠失部位（例えばＭＶＡ遺伝子Ａ５０ＲとＢ１Ｒとの間の再構成及び改変された欠失ＩＩＩ部位（例えば、米国特許第９，１３３，４８０号を参照されたい））、非必須ＭＶＡ遺伝子間、必須ＭＶＡ遺伝子間（例えば、Ｉ８ＲとＧ１Ｌ、又はＡ５ＲとＡ６Ｌ又は他の適切な挿入部位）、非必須遺伝子座（例えばＭＶＡ ＴＫ遺伝子座）内、又はそれらの組合せに挿入される。
組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ワクチンコンストラクト
本明細書では、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質、ペプチド、又はそのフラグメントをコードする異種核酸インサートを含む組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、発現時に、以前のｒＭＶＡ関連コロナウイルスワクチン接種戦略に関連する免疫病理を誘導することなく防御免疫を誘導することができる、ｒＭＶＡウイルスベクターが提供される。
本明細書では、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質、ペプチド、又はそのフラグメントをコードする異種核酸インサートを含む組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、発現時に、以前のｒＭＶＡ関連コロナウイルスワクチン接種戦略に関連する免疫病理を誘導することなく防御免疫を誘導することができる、ｒＭＶＡウイルスベクターが提供される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓ－Ｅ－Ｍ ＶＬＰ
一態様では、組換えＭＶＡワクチンは、更に以下に提供されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＭタンパク質及びＥタンパク質、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質、又はそのフラグメント若しくは変異体を発現する。宿主細胞で発現させると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成し、エピトープディスプレイを増強し、強力な抗ウイルス免疫応答を誘導することができる。
一態様では、組換えＭＶＡワクチンは、更に以下に提供されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＭタンパク質及びＥタンパク質、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質、又はそのフラグメント若しくは変異体を発現する。宿主細胞で発現させると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成し、エピトープディスプレイを増強し、強力な抗ウイルス免疫応答を誘導することができる。
幾つかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイク（Ｓ）タンパク質（又はそのフラグメント）、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及び膜（Ｍ）タンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質の発現時には、ＶＬＰが形成される。幾つかの実施形態において、核酸は、Ｓ、Ｅ、及びＭをコードする配列が直線的に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適したＳタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現が図１Ａに提供される。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、例えば、配列番号１に提供されるように、全長タンパク質として発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現されるか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号１、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、例えば、配列番号６に提供されるように、全長タンパク質として発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号６、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号２、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、全長Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号３、配列番号４２、及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されている。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイにおける発現タンパク質の検出に適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は当該技術分野で知られている任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、各タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンのワクシニアウイルス終止配列３’を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。全長Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質の隣接するコード配列を含む例示的な核酸配列は、配列番号４６、配列番号４７、又は配列番号１５６として以下に提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号４６の核酸配列（図１Ｂ－図１Ｃ－図１Ｄ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号４７の核酸配列（図１Ｅ－図１Ｆ－図１Ｇ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１５６の核酸配列（図１Ｈ－図１Ｉ－図１Ｊ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
或いは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及び膜（Ｍ）タンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該Ｓタンパク質は、融合前立体構造においてＳタンパク質三量体を安定化する１つ以上のアミノ酸プロリン置換により安定化されており、発現時に、タンパク質はＶＬＰを形成する。幾つかの実施形態において、核酸は、安定化されたＳ、Ｅ、及びＭをコードする配列が直鎖状に隣接するように配置される。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）とＳエクトドメイン三量体のプロモーターの中心らせんとの間の境界又はその近傍において、１つ以上のプロリン置換を含む。幾つかの実施形態において、プロリン置換は、三量体内のプロモーターのアミノ酸残基９７０から９９０の間で起こる。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、アミノ酸Ｋ９８６及びＶ９８７における２つのプロリン置換を含む。発現時にＶＬＰを形成するのに適した安定化Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現が図２Ａに提供される。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、例えば、配列番号８に提供されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸９８６及び９８７に２つのプロリン置換を含む全長タンパク質として発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現される、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号８、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、例えば、配列番号１１に提供されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸９８６及び９８７に２つのプロリン置換を含む全長タンパク質として発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現される、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号１１、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号９、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、全長プロリン置換Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号１０、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されている、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、全長プロリン置換Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号１２、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されている、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、タグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。全長安定化Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号１５６として以下に提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号４８の核酸配列（図２Ｂ－図２Ｃ－図２Ｄ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号４９の核酸配列（図２Ｅ－図２Ｆ－図２Ｇ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５０の核酸配列（図２Ｈ－図２Ｉ－図２Ｊ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１５７の核酸配列（図２Ｋ－図２Ｌ－図２Ｍ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１５９の核酸配列（図２Ｎ－図２Ｏ－図２Ｐ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１６０の核酸配列（図２Ｑ－図２Ｒ－図２Ｓ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
或いは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の部分スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及び膜（Ｍ）タンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該部分Ｓタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４を含み、任意に、ＮＨ末端に初期メチオニンアミノ酸残基を更に含む。幾つかの実施形態において、ＲＢＤ配列は、コロナウイルスコンセンサス配列である。幾つかの実施形態において、核酸は、Ｓ ＲＢＤ、Ｅ、及びＭをコードする配列が直線的に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、アミノ酸３２７～５２４をコードする部分Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図３Ｄに提供する。幾つかの実施形態において、部分Ｓタンパク質は配列番号２０に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号２２、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号２４、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、部分Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号２４、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、部分Ｓタンパク質は配列番号３２に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現される、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。
幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。Ｓタンパク質ＲＢＤ領域、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号５１又は配列番号５２として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５１の核酸配列（図３Ｅ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５２の核酸配列（図３Ｆ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
或いは、幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４を含み、任意に、ＲＢＤのＮＨ末端にメチオニンを更に含む。幾つかの実施形態において、核酸は、Ｓ ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４）、Ｅ、及びＭをコードする配列が直線的に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、アミノ酸３３１～５２４をコードする部分Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図３Ａに提供する。幾つかの実施形態において、部分Ｓタンパク質は配列番号２１に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号２３、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号２５、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、部分Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号２５、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、部分Ｓタンパク質は配列番号３３に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現されるか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。
幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。Ｓタンパク質ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４）領域、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号５３又は配列番号５４として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５３の核酸配列（図３Ｂ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５４の核酸配列（図３Ｃ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
幾つかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の部分スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及び膜（Ｍ）タンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該部分Ｓタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）であり、ＲＢＤ結合タンパク質は、Ｓタンパク質のアミノ酸１～１３に由来するＳタンパク質シグナルペプチドにそのＮＨ末端で隣接し、アミノ酸１２１４～１２７３に由来するＳタンパク質膜貫通ドメインにそのカルボキシ末端で隣接し、又はそのフラグメントである。隣接するＳタンパク質シグナルペプチド（ＳＰ）を下記表１２に配列番号５５として提供し、その核酸配列を配列番号５６として提供する。ＳＰの最適化された核酸配列は、配列番号５９に提供される。Ｓタンパク質膜貫通ドメイン（ＳＴＭ）を下記表８に配列番号５７として提供し、その核酸配列を配列番号５８として提供し、最適化された核酸配列を配列番号６０として提供する。幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、ＳＰ及びＳＴＭに隣接するＳタンパク質のアミノ酸３２７～５２４を含む。ＳＰ－ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４）－ＳＴＭペプチドは、配列番号６１に提供される。幾つかの実施形態において、直鎖状Ｓエピトープは、ＳＰ及びＳＴＭに隣接するＳタンパク質のアミノ酸３３１～５２４を含む。ＳＰ－ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４）－ＳＴＭペプチドは、配列番号６２に提供される。幾つかの実施形態において、核酸は、Ｓ ＳＰ－ＲＢＤ－ＴＭ、Ｅ、及びＭをコードする配列が直線的に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、アミノ酸１～１３（ＳＰ）、３３１～５２４（ＲＢＤ）、及び１２１４～１２７３（ＳＴＭ）をコードする部分Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図３Ｇに提供する。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、アミノ酸１～１３（ＳＰ）、３２７～５２４（ＲＢＤ）、及び１２１４～１２７３（ＳＴＭ）をコードする部分Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図３Ｈに提供する。幾つかの実施形態において、部分Ｓタンパク質ＳＰ－ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４）－ＳＴＭは配列番号６１に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、部分Ｓタンパク質ＳＰ－ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４）－ＳＴＭは配列番号６２に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号６１若しくは配列番号６２、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号６７若しくは配列番号６８、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号６３若しくは配列番号６４、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、部分Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号６５若しくは配列番号６６、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。Ｓタンパク質ＳＰ－ＲＢＤ（３２７～５２４）－ＳＴＭ領域、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号６９又は配列番号７０として提供される。Ｓタンパク質ＳＰ－ＲＢＤ（３３１～５２４）－ＳＴＭ領域、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号７１又は配列番号７２として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号６９（図３Ｉ－図３Ｊ）、配列番号７０（図３Ｋ－図３Ｌ）、配列番号７１（図３Ｍ－図３Ｎ）、又は配列番号７２（図３Ｏ－図３Ｐ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
代替の実施形態において、核酸インサートは、シグナルペプチドを更に含む直鎖状Ｓエピトープ、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする（例えば、図３Ｑ、図３Ｒ、図３Ｓ、図３Ｔを参照されたい）。Ｓタンパク質シグナルペプチドは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸１～１３（ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ）（配列番号５５）を含み得るか、又はそれに由来し得る。幾つかの実施形態において、コードされるＳタンパク質は、ＲＢＤコンセンサス配列を含む。幾つかの実施形態において、ＲＢＤコンセンサス配列は、例えば配列番号５５に由来するＳタンパク質シグナルペプチドを更に含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、アミノ酸３２７～５２４を含む直鎖状ＲＢＤエピトープを発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号２０を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、アミノ酸３３１～５２４を含む直鎖状ＲＢＤエピトープを発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号２１を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、アミノ酸３２７～５９８を含む直鎖状ＲＢＤエピトープを発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号１６１を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、アミノ酸３３１～５９８を含む直鎖状ＲＢＤエピトープを発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号１６２を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を発現する。幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号３２を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号３３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号１６３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５及び配列番号１６４を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を発現する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号２０、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列をコードする。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号２１、配列番号４０、及び配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列をコードする。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号３２、配列番号４０、及び配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列をコードする。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号３３、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列をコードする。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号１６１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列をコードする。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号１６２、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列をコードする。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号５５、配列番号１６３、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列をコードする。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１６４、配列番号３３、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列をコードする。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１５８（図３Ｕ－図３Ｖ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
或いは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のタンデムリピート配列、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及び膜（Ｍ）タンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該タンデムリピート配列は、Ｓタンパク質ＲＢＤドメインの直鎖状エピトープに由来する。幾つかの実施形態において、タンデムリピートは、例えば（ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ）ｘ又は（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２－ｓｐａｃｅｒ）ｘであり、式中、ＲＢＤは任意のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．１は第１のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．２は第２のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。幾つかの実施形態において、タンデムリピートは、任意に、ＮＨ末端にメチオニンアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４に由来する１つ以上のペプチドから選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０から選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０である。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入される配列は、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ｓｐａｃｅｒ－（ａａ４７３～４９０）－ｓｐａｃｅｒ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）を含むＳタンパク質ＲＢＤペプチドをコードする。幾つかの実施形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施形態において、ｘ＝５である。
幾つかの実施形態において、核酸は、タンデムリピート配列、Ｅ及びＭコード配列が直線的に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、タンデムリピート、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現が、図４Ａに提供される。幾つかの実施形態において、任意にＮＨ末端にメチオニンを更に含むタンデムリピートは配列番号３４（ｘは２～１０である）に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号３４（ｘは２～１０、又は１０超である）、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号３８（ｘは２～１０、又は１０超である）、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号３９（ｘは２～１０、又は１０超である）、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号３５（ｘは２～１０、又は１０超である）、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号３６、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態においてタンデムリピート、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号３７、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。タンデムリピート、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列を、配列番号７３又は配列番号７４として提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号７３の核酸配列（図４Ｂ－図４Ｃ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号７４の核酸配列（図４Ｄ－図４Ｅ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
或いは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のタンデムリピート配列、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及び膜（Ｍ）タンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該タンデムリピート配列は、Ｓタンパク質ＲＢＤドメインの直鎖状エピトープに由来し、そのＮＨ末端でＳＰペプチド（例えば配列番号５５）に隣接し、そのカルボキシ末端でＳＴＭ（例えば配列番号５７）に隣接する。幾つかの実施形態において、タンデムリピートは、例えば（ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ）ｘ又は（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２－ｓｐａｃｅｒ）ｘであり、式中、ＲＢＤは任意のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．１は第１のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．２は第２のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４に由来するか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４に由来する１つ以上のペプチドから選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０から選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０である。幾つかの実施形態において、ＭＶＡウイルスベクターに挿入される配列は、タンデムリピート配列（（ａａ５０４～５２４）－ｓｐａｃｅｒ－（ａａ４７３～４９０）－ｓｐａｃｅｒ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）を含むＳタンパク質ＲＢＤペプチドをコードする。幾つかの実施形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施形態において、ｘ＝５である。
幾つかの実施形態において、核酸は、ＳＰ－タンデムリピート－ＴＭ、Ｅ及びＭをコードする配列が直線的に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＳＰ－タンデムリピート－ＴＭ、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図４Ｆに提供する。幾つかの実施形態において、ＳＰ－タンデムリピート－ＴＭは配列番号７５（ｘは２～１０である）に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号７７、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号７６（ｘは２～１０である）、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号７８、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態においてＳＰ－タンデムリピート－ＴＭ、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号７６若しくは配列番号７８、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。
幾つかの実施形態において、ＳＰ－タンデムリピート－ＴＭは配列番号７９（ｘは２～１０である）に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号８０、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。
幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。タンデムリピート、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列を、配列番号８１又は配列番号８２として提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号８１（図４Ｇ－図４Ｈ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号８２（図４Ｉ－図４Ｊ）、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列から選択される核酸配列を含む。
或いは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及び膜（Ｍ）タンパク質の改変された切断型をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該切断型Ｓタンパク質はＳ１＋Ｓ２領域を含み、カルボキシ末端を欠き、発現時に、タンパク質はＶＬＰを形成する。幾つかの実施形態において、核酸は、切断型Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする配列が直鎖状に隣接するように配置される。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質は、アミノ酸１～１２１３（配列番号１３）を含む。発現時にＶＬＰを形成するのに適した切断型Ｓ、Ｅ、及びＭタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図６Ａに提供する。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質は、例えば、図６Ｈに例示されるように、アミノ酸９８６及び９８７における２つのプロリン置換を含む。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質は配列番号１３若しくは配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号１９に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号１３若しくは配列番号１４若しくは配列番号１８若しくは配列番号１９、配列番号４０及び配列番号４３をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号１５若しくは配列番号１７、配列番号４１及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号１６若しくは配列番号１７、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、タグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。切断型Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号８３又は配列番号８４として以下に提供される。切断型Ｓタンパク質＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ、Ｅタンパク質、並びにＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列を、配列番号８５又は配列番号８６として以下に提供する。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号８３（図６Ｂ－図６Ｃ－図６Ｄ）、配列番号８４（図６Ｅ－図６Ｆ－図６Ｇ）、配列番号８５（図６Ｉ－図６Ｊ－図６Ｋ）若しくは配列番号８６（図６Ｌ－図６Ｍ－図６Ｎ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
Ｓフラグメント－ＧＰ融合体ＶＬＰ
別の態様では、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質抗原ペプチドをインフレーム融合タンパク質として発現するように設計されたｒＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供され、該融合タンパク質は、エンベロープ糖タンパク質（ＧＰＳ）のシグナル配列、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質又はタンパク質フラグメント、エンベロープ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（ＧＰＴＭ）、及び、任意にエンベロープ糖タンパク質の細胞質ゾルドメイン（ＧＰＣＤ）を含み、エンベロープ糖タンパク質はコロナウイルスに由来しない。ｒＭＶＡウイルスベクターはさらに、エンベロープ糖タンパク質が由来したのと同じウイルス由来のマトリックスタンパク質を発現するように設計される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質フラグメントをＧＰタンパク質との融合体として提供することにより、Ｓタンパク質フラグメント－ＧＰ融合体は、ｒＭＶＡ発現マトリックスタンパク質とＶＬＰを形成することができる。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の膜（Ｍ）タンパク質及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質を更に発現し、発現されると、別個のＶＬＰを形成することができる。したがって、単一のｒＭＶＡウイルスベクターから、２つのＶＬＰが産生され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の抗原エピトープを提示することができる。
別の態様では、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質抗原ペプチドをインフレーム融合タンパク質として発現するように設計されたｒＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供され、該融合タンパク質は、エンベロープ糖タンパク質（ＧＰＳ）のシグナル配列、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質又はタンパク質フラグメント、エンベロープ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（ＧＰＴＭ）、及び、任意にエンベロープ糖タンパク質の細胞質ゾルドメイン（ＧＰＣＤ）を含み、エンベロープ糖タンパク質はコロナウイルスに由来しない。ｒＭＶＡウイルスベクターはさらに、エンベロープ糖タンパク質が由来したのと同じウイルス由来のマトリックスタンパク質を発現するように設計される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質フラグメントをＧＰタンパク質との融合体として提供することにより、Ｓタンパク質フラグメント－ＧＰ融合体は、ｒＭＶＡ発現マトリックスタンパク質とＶＬＰを形成することができる。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の膜（Ｍ）タンパク質及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質を更に発現し、発現されると、別個のＶＬＰを形成することができる。したがって、単一のｒＭＶＡウイルスベクターから、２つのＶＬＰが産生され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の抗原エピトープを提示することができる。
本発明において使用するのに好適な糖タンパク質及びマトリックスタンパク質としては、限定されるものではないが、以下に由来するものが挙げられる：フィロウイルス科、例えばマールブルグウイルス、エボラウイルス、又はスーダンウイルス；レトロウイルス科、例えばヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）；アレナウイルス科、例えばラッサウイルス；フラビウイルス科、例えばデングウイルス及びジカウイルス。
特定の実施形態において、糖タンパク質及びマトリックスタンパク質は、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）に由来する。特定の実施形態において、糖タンパク質は、ＭＡＲＶ ＧＰタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＶ３１２０２．１）に由来する。ＭＡＲＶ ＧＰタンパク質のアミノ酸配列は、以下の表１４に配列番号８７として提供される。特定の実施形態において、ＭＡＲＶ ＧＰＳドメインは、糖タンパク質のアミノ酸１～１９（ＭＷＴＴＣＦＦＩＳＬＩＬＩＱＧＩＫＴＬ）（配列番号８８、これは例えば配列番号８９のＭＶＡ最適化核酸配列によりコードされ得る）を含み、ＧＰＴＭドメインは、糖タンパク質のアミノ酸配列６４４～６７３（ＷＷＴＳＤＷＧＶＬＴＮＬＧＩＬＬＬＬＳＩＡＶＬＩＡＬＳＣＩＣＲＩＦＴＫＹＩＧ）（配列番号９０、これは例えば配列番号９１のＭＶＡ最適化核酸配列によりコードされ得る）を含む。
ＭＡＲＶ ＶＰ４０アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＸ４５８８３４で入手可能であり、配列番号９２として下記表１４に提供され、これは、例えば配列番号９３のＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡに挿入される核酸は、配列番号９４、又はこれと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくはそれ以上相同な核酸配列である。
１つの代替において、ＧＰタンパク質と融合したＳタンパク質又はタンパク質フラグメント、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２由来のＥタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２由来のＭタンパク質、及びマトリックスタンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供される。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質又はタンパク質フラグメント－ＧＰ融合体、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸配列がｒＭＶＡ内の単一の挿入部位に挿入され、そしてＭＡＲＶ ＶＰ４０をコードする核酸配列が別々の挿入部位に挿入される。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質又はタンパク質フラグメント－ＧＰ融合体、Ｅタンパク質及びＭタンパク質、並びにＭＡＲＶ ＶＰ４０をコードする核酸配列が、ｒＭＶＡ内の単一の挿入部位に挿入される。
幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質フラグメント－ＧＰ融合タンパク質は、Ｓタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４に由来する。幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４に由来する。幾つかの実施形態において、ＲＢＤは、コンセンサスコロナウイルス配列である。ＲＢＤペプチドは、そのＮＨ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質のアミノ酸１～１９に由来するシグナルペプチド（配列番号８８）に隣接し、そのカルボキシ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（配列番号９０）に隣接する。発現されるＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４）－ＧＰＴＭペプチドは、以下の表１５の配列番号９５に提供され、例えばこれは、例えば配列番号９７に提供されるＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。発現されるＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４）－ＧＰＴＭペプチドは、以下の表１５の配列番号９６に提供され、例えばこれは、例えば配列番号９８に提供されるＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。幾つかの実施形態において、核酸は、ＧＰＳ－ＲＢＤ－ＧＰＴＭ、Ｅ、及びＭをコードする配列が直鎖状に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、ＧＰＳ－ＲＢＤ－ＴＭ、Ｅタンパク質及びＭタンパク質をコードする別個の単一のＭＶＡインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図７Ａに提供する。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、ＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４）－ＴＭ、Ｅタンパク質及びＭタンパク質をコードする別個の単一のＭＶＡインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図７Ｂに提供する。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、ＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４）－ＴＭ、Ｅタンパク質及びＭタンパク質をコードする別個の単一のＭＶＡインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図７Ｇに提供する。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－ＲＢＤ－ＧＰＴＭは、配列番号９５（ＲＢＤ ａａ３２７～５２４）又は配列番号９６（ＲＢＤ ａａ３３１～５２４）又は配列番号９９（ＲＢＤ ａａ３２７～５２４、Ｅ４８４Ｋ）又は配列番号１００（ＲＢＤ ａａ３３１～５２４；Ｅ４８４Ｋ）に提供されるように発現され、該Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように、全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように、全長タンパク質として発現され、ＭＡＲＶ ＶＰタンパク質は、配列番号９２に提供されるように発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号９５若しくは配列番号９６若しくは配列番号９９若しくは配列番号１００、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号９２をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号９７若しくは配列番号９８、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－ＲＢＤ－ＧＰＴＭ、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号９７若しくは配列番号９８、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。ＧＰＳ－ＲＢＤ－ＧＰＴＭ、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、及び配列番号１０４として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１０１（図７Ｈ－図７Ｉ）、配列番号１０２（図７Ｊ－図７Ｋ）、配列番号１０３（図７Ｃ－図７Ｄ）若しくは配列番号１０４（図７Ｅ－図７Ｆ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９３若しくは配列番号９４の核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を更に含む。
１つの代替では、ＧＰタンパク質と融合したＳタンパク質ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２由来のＥタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２由来のＭタンパク質、及びマトリックスタンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該Ｓタンパク質フラグメント－ＧＰ融合タンパク質は、Ｓタンパク質タンデムリピート配列を含む。Ｓタンパク質タンデムリピート配列は、そのＮＨ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質のアミノ酸１～１９に由来するシグナルペプチド（配列番号８８）に隣接し、そのカルボキシ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（配列番号９０）に隣接する。幾つかの実施形態において、タンデムリピートは、例えば（ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ）ｘ又は（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２－ｓｐａｃｅｒ）ｘであり、式中、ＲＢＤは任意のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．１は第１のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．２は第２のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４に由来する１つ以上のペプチドから選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０から選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０である。幾つかの実施形態において、タンデムリピート配列は、（（ａａ５０４～５２４）－ｓｐａｃｅｒ－（ａａ４７３～４９０）－ｓｐａｃｅｒ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）である。幾つかの実施形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施形態において、ｘ＝５である。ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭを含む例示的なアミノ酸配列は、配列番号１０５として表１６に提供され、これは配列番号１０６のＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭ（タンデムリピートについてｘ＝５）を含む例示的なアミノ酸配列は、配列番号１０７として表１６に提供され、これは配列番号１０８のＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。
幾つかの実施形態において、核酸は、ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭペプチド、Ｅ及びＭをコードする配列が直線的に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭペプチド、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする別個の単一ＭＶＡインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図８Ａに提供する。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭペプチドは配列番号１０５若しくは配列番号１０７若しくは配列番号１０９若しくは配列番号１１０に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０に提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、ＭＡＲＶ ＶＰタンパク質は、配列番号９２に提供されるように発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号１０５若しくは配列番号１０７若しくは配列番号１０９若しくは配列番号１１０、配列番号４０及び配列番号４３及び配列番号９２をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号１０６若しくは配列番号１０８、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態においてＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭペプチド、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号１０６若しくは配列番号１０８、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭペプチド、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１１１及び配列番号１１２として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１１１（図８Ｂ－図８Ｃ）若しくは配列番号１１２（図８Ｄ－図８Ｅ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９３若しくは配列番号９４の核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を更に含む。
１つの代替において、ＧＰタンパク質と融合した改変Ｓタンパク質ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からのＥタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からのＭタンパク質、及びマトリックスタンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質は、Ｓタンパク質のアミノ酸２～１２１３を含む。幾つかの実施形態において、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質は、Ｓタンパク質のアミノ酸２～１２１３と、アミノ酸９８６及び／又は９８７でのプロリン置換（Ｓ１＋Ｓ２切断型＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ）とを含む。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質－ＧＰ融合体、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸配列がｒＭＶＡ内の単一の挿入部位に挿入され、ＭＡＲＶ ＶＰ４０をコードする核酸配列が別個の挿入部位に挿入される。
幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質－ＧＰ融合タンパク質は、Ｓタンパク質のアミノ酸２～１２１３を含む。切断型Ｓタンパク質は、そのＮＨ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質のアミノ酸１～１９に由来するシグナルペプチド（配列番号８８）に隣接し、そのカルボキシ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（配列番号９０）に隣接する。発現されるＧＰＳ－切断型Ｓタンパク質－ＧＰＴＭペプチドは、以下の表１７の配列番号１１３に提供され、例えばこれは、例えば配列番号１１５に提供されるＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。発現されるＧＰＳ－切断型Ｓタンパク質＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ）－ＧＰＴＭペプチドは、以下の表１７の配列番号１１４に提供され、例えばこれは、例えば配列番号１１６に提供されるＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。発現されるＧＰＳ－切断型Ｓタンパク質－ＧＰＴＭペプチドは、以下の表１７の配列番号１１７に提供され、これは置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを更に含む。発現されるＧＰＳ－切断型Ｓタンパク質＋Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙ）－ＧＰＴＭペプチドは、以下の表１７の配列番号１１８に提供される。幾つかの実施形態において、核酸は、ＧＰＳ－切断型Ｓ－ＧＰＴＭ、Ｅ、及びＭをコードする配列が直線的に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、ＧＰＳ－切断型Ｓ－ＴＭ、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする別個の単一のＭＶＡインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図９Ａに提供する。幾つかの実施形態において、核酸は、ＧＰＳ－切断型Ｓ＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ－ＧＰＴＭ、Ｅ、及びＭをコードする配列が直線的に隣接するように配置される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、ＧＰＳ－切断型Ｓ＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ－ＴＭ、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする別個の単一のＭＶＡインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図９Ｈに提供する。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－切断型Ｓ－ＧＰＴＭは、配列番号１１３若しくは配列番号１１４若しくは配列番号１１７若しくは配列番号１１８に提供されるように発現され、Ｅタンパク質は、配列番号４０において提供されるように全長タンパク質として発現され、Ｍタンパク質は、配列番号４３に提供されるように全長タンパク質として発現され、ＭＡＲＶ ＶＰタンパク質は、配列番号９２に提供されるように発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号１１３若しくは配列番号１１４若しくは配列番号１１７若しくは配列番号１１８、配列番号４０及び配列番号４３及び配列番号９２をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号１１５若しくは配列番号１１６、配列番号４１、及び配列番号４４を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－切断型Ｓ－ＧＰＴＭ、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号１１５若しくは配列番号１１６、配列番号４２及び配列番号４５に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。ＧＰＳ－切断型Ｓ－ＧＰＴＭ又はＧＰＳ－切断型Ｓ＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ）、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、又は配列番号１２２として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１１９（図９Ｂ－図９Ｃ－図９Ｄ）、配列番号１２０（図９Ｅ－図９Ｆ－図９Ｇ）、配列番号１２１（図９Ｉ－図９Ｊ－図９Ｋ）、若しくは配列番号１２２（図９Ｌ－図９Ｍ－図９Ｎ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９３若しくは配列番号９４の核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を更に含む。
代替の態様では、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質抗原ペプチドをインフレーム融合タンパク質として発現するように設計されたｒＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供され、該融合タンパク質は、エンベロープ糖タンパク質（ＧＰＳ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質フラグメント、エンベロープ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（ＧＰＴＭ）、及びエンベロープ糖タンパク質の細胞質ゾルドメイン（ＧＰＣＤ）のシグナル配列を含み、エンベロープ糖タンパク質はコロナウイルスに由来しない。ｒＭＶＡウイルスベクターはさらに、エンベロープ糖タンパク質が由来したのと同じウイルス由来のマトリックスタンパク質を発現するように設計される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質フラグメントをＧＰタンパク質との融合体として提供することにより、Ｓタンパク質フラグメント－ＧＰ融合体は、ｒＭＶＡ発現マトリックスタンパク質とＶＬＰを形成することができる。
本発明において使用するのに好適な糖タンパク質及びマトリックスタンパク質としては、限定されるものではないが、以下に由来するものが挙げられる：フィロウイルス科、例えばマールブルグウイルス、エボラウイルス、又はスーダンウイルス；レトロウイルス科、例えばヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）；アレナウイルス科、例えばラッサウイルス；フラビウイルス科、例えばデングウイルス及びジカウイルス。特定の実施形態において、糖タンパク質及びマトリックスタンパク質は、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）に由来する。特定の実施形態において、糖タンパク質は、ＭＡＲＶ ＧＰタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＶ３１２０２．１）に由来する。ＭＡＲＶ ＧＰタンパク質のアミノ酸配列は、表１４に配列番号８７として提供される。特定の実施形態において、ＭＡＲＶ ＧＰＳドメインは、糖タンパク質のアミノ酸１～１９（ＭＷＴＴＣＦＦＩＳＬＩＬＩＱＧＩＫＴＬ）（配列番号８８、これは例えば配列番号８９のＭＶＡ最適化核酸配列によりコードされ得る）を含み、ＧＰＴＭドメインは、糖タンパク質のアミノ酸配列６４４～６７３（ＷＷＴＳＤＷＧＶＬＴＮＬＧＩＬＬＬＬＳＩＡＶＬＩＡＬＳＣＩＣＲＩＦＴＫＹＩＧ）（配列番号９０、これは例えば配列番号９１のＭＶＡ最適化核酸配列によりコードされ得る）を含む。
ＭＡＲＶ ＶＰ４０アミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＸ４５８８３４で入手可能であり、配列番号９２として表１４に提供され、これは、例えば配列番号９３のＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。幾つかの実施形態において、ウイルスマトリックスタンパク質をコードする核酸配列は、ＧＰＳ－Ｓタンパク質又はタンパク質フラグメント－ＧＰＴＭ核酸配列を有するバイシストロニック配列として含まれ得るか、又はＭＶＡゲノム内の別々の位置に挿入された別個の核酸配列上に含まれ得る。
１つの代替において、ＧＰタンパク質と融合した改変Ｓタンパク質ペプチドをコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該改変Ｓタンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端を欠くＳ１＋Ｓ２切断型タンパク質を含み、またマトリックスタンパク質、例えばＭＡＲＶ ＶＰ４０タンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質は、Ｓタンパク質のアミノ酸２～１２１３を含む。幾つかの実施形態において、Ｓ１＋Ｓ２切断型タンパク質は、Ｓタンパク質のアミノ酸２～１２１３及び１つ以上のプロリン置換、例えば、Ｋ９８６Ｐ及び／又はＶ９８７Ｐを含む。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質－ＧＰ融合体とＭＡＲＶ ＶＰ４０コード核酸配列とは、別個の挿入部位に挿入される。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質－ＧＰ融合体とＭＡＲＶ ＶＰ４０コード核酸配列とは、ＭＶＡゲノム中にバイシストロニック配列として挿入される。
幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質－ＧＰ融合タンパク質は、Ｓタンパク質のアミノ酸２～１２１３を含む。切断型Ｓタンパク質は、そのＮＨ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質のアミノ酸１～１９に由来するシグナルペプチド（配列番号８８）に隣接し、そのカルボキシ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（配列番号９０）に隣接する。発現されるＧＰＳ－切断型Ｓタンパク質－ＧＰＴＭペプチドは、表１７の配列番号１１３又は配列番号１１４に提供され、例えばこれは、例えば配列番号１１５又は配列番号１１６に提供されるＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。或いは、発現されるＧＰＳ－切断型Ｓタンパク質－ＧＰＴＭペプチドは、表１７の配列番号１１７又は配列番号１１８に提供される。ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、ＧＰＳ－切断型Ｓ－ＴＭをコードする別個の単一のＭＶＡインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図１０Ａに提供する。ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、ＧＰＳ－切断型Ｓ＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ－ＴＭをコードする別個の単一ＭＶＡインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図１０Ｆに提供する。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－切断型Ｓ－ＧＰＴＭは、配列番号１１３若しくは配列番号１１４若しくは配列番号１１７若しくは配列番号１１８に提供されるように発現され、ＭＡＲＶ ＶＰタンパク質は、配列番号９２に提供され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号１１３若しくは配列番号１１４若しくは配列番号１１７若しくは配列番号１１８、及び配列番号９２をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号７０Ａ若しくは配列番号７０Ｂを含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－切断型Ｓ－ＧＰＴＭをコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号１１５若しくは配列番号１１６に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。ＧＰＳ－切断型Ｓ－ＧＰＴＭをコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、又は配列番号１２６として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１２３（図１０Ｂ－図１０Ｃ）、配列番号１２４（図１０Ｄ－図１０Ｅ）、配列番号１２５（図１０Ｇ－図１０Ｈ）若しくは配列番号１２６（図１０Ｉ－図１０Ｊ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９３若しくは配列番号９４の核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を更に含む。
幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質－ＧＰ融合体とＭＡＲＶ ＶＰ４０コード核酸配列とは、ＭＶＡゲノム中にバイシストロニック配列として挿入される。バイシストロニック核酸としてのＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートとＧＰＳ－切断型Ｓ－ＴＭとを含むｒＭＶＡの線形表現を図１０Ｋに提供する。バイシストロニック核酸としてのＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートＧＰＳ－切断型Ｓ＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ－ＴＭを含むｒＭＶＡの線形表現を図１０Ｒに提供する。ＧＰＳ－切断型Ｓ又は切断型Ｓ＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ－ＧＰＴＭ／ＶＰ４０をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、又は配列番号１３０として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１２７（図１０Ｌ－図１０Ｍ－図１０Ｎ）、配列番号１２８（図１０Ｏ－図１０Ｐ－図１０Ｑ）、配列番号１２９（図１０Ｓ－図１０Ｔ－図１０Ｕ）若しくは配列番号１３０（図１０Ｖ－図１０Ｗ－図１０Ｘ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
１つの代替において、ＧＰタンパク質と融合したＳタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチドをコードし、またマトリックスタンパク質、例えばＭＡＲＶ ＶＰ４０タンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供される。幾つかの実施形態において、ＲＢＤ－ＧＰ融合体とＭＡＲＶ ＶＰ４０コード核酸配列とは、図１１Ａに例示されるように、別個の挿入部位に挿入される。幾つかの実施形態において、ＲＢＤ ＧＰ融合体は、図１１Ｈに例示されるようにＭＶＡゲノム中にバイシストロニック配列として挿入される。
幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、Ｓタンパク質のアミノ酸３２７～５２４に由来する。幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４に由来する。幾つかの実施形態において、ＲＢＤは、コンセンサスコロナウイルス配列である。ＲＢＤペプチドは、そのＮＨ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質のアミノ酸１～１９に由来するシグナルペプチド（配列番号８８）に隣接し、そのカルボキシ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（配列番号９０）に隣接する。発現されるＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４）－ＧＰＴＭペプチドは、表１５の配列番号９５に提供され、例えばこれは、例えば配列番号９７に提供されるＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。発現されるＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４）－ＧＰＴＭペプチドは、表１５の配列番号９６に提供され、例えばこれは、例えば配列番号９８に提供されるＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。或いは、発現されるＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４）－ＧＰＴＭペプチドは配列番号９９に提供される。或いは、発現されるＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４）－ＧＰＴＭペプチドは配列番号１００に提供される。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、別個のＧＰＳ－ＲＢＤ－ＴＭインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図１１ａに提供する。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、別個のＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４）－ＴＭインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図１１ｂに提供する。発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、別個のＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４）－ＴＭインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現を図１１Ｅに提供する。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－ＲＢＤ－ＧＰＴＭは、配列番号９５若しくは配列番号９９（ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４））若しくは配列番号９６若しくは配列番号１００（ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４））に提供されるように発現され、ＭＡＲＶ ＶＰタンパク質は配列番号９２に提供されるように発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列番号として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号９５若しくは配列番号９６若しくは配列番号９９若しくは配列番号１００及び配列番号９２をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号９７若しくは配列番号９８を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－ＲＢＤ－ＧＰＴＭをコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号９７若しくは配列番号９８に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。ＧＰＳ－ＲＢＤ－ＧＰＴＭをコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、又は配列番号１３４として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１３１（図１１Ｆ）、配列番号１３２（図１１Ｇ）、配列番号１３３（図１１Ｃ）若しくは配列番号１３４（図１１Ｄ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９３若しくは配列番号９４の核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を更に含む。
幾つかの実施形態において、ＲＢＤ－ＧＰ融合体とＭＡＲＶ ＶＰ４０コード核酸配列とは、ＭＶＡゲノム中にバイシストロニック配列として挿入される。バイシストロニック核酸としてのＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートとＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３３１－３２５）－ＴＭとを含むｒＭＶＡの線形表現を図１１Ｉに提供する。バイシストロニック核酸としてのＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートとＧＰＳ－ＲＢＤ（ａａ３２７－３２５）－ＴＭをと含むｒＭＶＡの線形表現を図１１Ｎに提供する。ＧＰＳ－ＲＢＤ－ＧＰＴＭ－ＶＰ４０をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１３５（図１１Ｏ－図１１Ｐ）及び配列番号１３６（図１１Ｑ－図１１Ｒ）（ＲＢＤ（ａａ３２７～５２４））、又は配列番号１３７（図１１Ｊ－図１１Ｋ）及び配列番号１３８（図１１Ｌ－図１１Ｍ）（ＲＢＤ（ａａ３３１～５２４））として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７若しくは配列番号１３８から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
１つの代替において、ＧＰタンパク質と融合したＳタンパク質ペプチドをコードし、またウイルスマトリックスタンパク質、例えばＭＡＲＶ ＶＰ４０タンパク質もコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供される。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質タンデムリピート配列は、そのＮＨ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質のアミノ酸１～１９に由来するシグナルペプチド（配列番号８８）に隣接し、そのカルボキシ末端側でＭＡＲＶ糖タンパク質の膜貫通ドメイン（配列番号９０）に隣接する。幾つかの実施形態において、タンデムリピートは、例えば（ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ－ｓｐａｃｅｒ）ｘ又は（ＲＢＤ Ｓｅｑ．１－ｓｐａｃｅｒ－ＲＢＤ Ｓｅｑ．２－ｓｐａｃｅｒ）ｘであり、式中、ＲＢＤは任意のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．１は第１のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ＲＢＤ Ｓｅｑ．２は第２のＳタンパク質ＲＢＤペプチドであり、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。幾つかの実施形態において、ＲＢＤペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸３３１～５２４又はアミノ酸３２７～５２４に由来する１つ以上のペプチドから選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０から選択される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡによってコードされる直鎖状エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質のアミノ酸５０４～５２４及びアミノ酸４７３～４９０である。幾つかの実施形態において、タンデムリピート配列は、（（ａａ５０４～５２４）－ｓｐａｃｅｒ－（ａａ４７３～４９０）－ｓｐａｃｅｒ）ｘ（式中、ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）である。幾つかの実施形態において、ｘ＝３～７である。幾つかの実施形態において、ｘ＝５である。ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭを含む例示的なアミノ酸配列は、配列番号１０５として表１６に提供され、これは配列番号１０６のＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。或いは、ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭを含む例示的なアミノ酸配列が、配列番号１０９として表１６に提供される。ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭ（タンデムリピートについてｘ＝５）を含む例示的なアミノ酸配列は、配列番号１０７として表１６に提供され、これは配列番号１０８のＭＶＡ最適化核酸配列によってコードされ得る。ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭ（タンデムリピートについてｘ＝５）を含む代替の例示的なアミノ酸配列は、配列番号１１０として表１６に提供される。
発現時にＶＬＰを形成するのに適した、ＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートと、ＧＰＳ－タンデム反復－ＧＰＴＭペプチドをコードする別個の単一ＭＶＡインサートとを含むｒＭＶＡの線形表現が図１２Ａに提供される。幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭペプチドは、配列番号６４若しくは配列番号６６に提供されるように発現され、ＭＡＲＶ ＶＰタンパク質は、配列番号５９に提供されるように発現され、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号１０５若しくは配列番号１０６若しくは配列番号１０９若しくは配列番号１１０、及び配列番号９２をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号１０６若しくは配列番号１０８を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態においてＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭペプチドをコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号１０６若しくは配列番号１０８若しくは配列番号１０９若しくは配列番号１１０に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイ検出中に使用するのに適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭペプチドをコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１３９及び配列番号１４０として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１３９（図１２Ｂ）若しくは配列番号１４０（図１２Ｃ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号９３若しくは配列番号９４の核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を更に含む。
幾つかの実施形態において、ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭとＭＡＲＶ ＶＰ４０コード核酸配列とは、ＭＶＡゲノム中にバイシストロニック配列として挿入される。バイシストロニック核酸としてのＭＡＲＶ ＶＰ４０インサートとＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭとを含むｒＭＶＡの線形表現を図１２Ｄに提供する。ＧＰＳ－タンデムリピート－ＧＰＴＭ－ＶＰ４０をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１４１及び配列番号１４２として提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１４１（図１２Ｅ－図１２Ｆ）若しくは配列番号１４２（図１２Ｇ－図１２Ｈ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含む。
幾つかの実施形態において、スパイク（Ｓ）タンパク質（又はそのフラグメント）のみをコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供される。Ｓタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図１３Ａに提供する。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、例えば配列番号１若しくは配列番号６に提供される全長タンパク質として、又は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号１をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号６をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、全長Ｓタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号３に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のため最適化されている。幾つかの実施形態において、核酸配列は、アッセイにおける発現タンパク質の検出に適したタグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は当該技術分野で知られている任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、各タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。全長Ｓタンパク質の隣接するコード配列を含む例示的な核酸配列は、配列番号１４３（図１３Ｂ－図１３Ｃ）及び配列番号１４４（図１３Ｄ－図１３Ｅ）として以下に提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１４３若しくは配列番号１４４から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含む。
或いは、スパイク（Ｓ）タンパク質をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該Ｓタンパク質は、融合前立体構造においてＳタンパク質三量体を安定化する１つ以上のアミノ酸プロリン置換で安定化されている。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）とＳエクトドメイン三量体のプロモーターの中心らせんとの間の境界又はその近傍において、１つ以上のプロリン置換を含む。幾つかの実施形態において、プロリン置換は、三量体中のプロモーターのアミノ酸残基９７０から９９０の間で起こる。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、全長タンパク質として発現され、アミノ酸Ｋ９８６及びＶ９８７における２つのプロリン置換を含む。安定化Ｓタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図１４Ａに提供する。幾つかの実施形態において、Ｓタンパク質は、例えば、配列番号８若しくは配列番号１１に提供されるように、Ｓタンパク質のアミノ酸９８６及び９８７における２つのプロリン置換を含む全長タンパク質、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号８若しくは配列番号１１をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号９を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、全長プロリン置換Ｓタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号１０若しくは配列番号１２に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、タグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。全長安定化Ｓタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１４５及び配列番号１４６として以下に提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１４５（図１４Ｂ－図１４Ｃ）若しくは配列番号１４６（図１４Ｄ－図１４Ｅ）から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％相同な配列を含む。
或いは、スパイク（Ｓ）タンパク質の改変された切断型をコードするｒＭＶＡウイルスベクターが提供され、該切断型Ｓタンパク質は、Ｓ１＋Ｓ２領域を含み、カルボキシ末端を欠く。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質は、アミノ酸１～１２１３（配列番号１３又は配列番号１８）を含む。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質は、アミノ酸９８６及び９８７における２つのプロリン置換（配列番号１４又は配列番号１９）を含む。切断型Ｓタンパク質をコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図１５Ａに提供する。切断型Ｓタンパク質＋Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐをコードする単一のＭＶＡインサートの線形表現を図１５Ｆに提供する。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質は、配列番号１３、列番号１４、列番号１８若しくは列番号１９に提供されるように発現されるか、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列として発現される。幾つかの実施形態において、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８若しくは配列番号１９をコードする核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を含むプラスミド又はＭＶＡウイルスベクターが本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、配列番号１５を含む核酸配列、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列が本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、切断型Ｓタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供され、該核酸は、例えば配列番号１６若しくは配列番号１７に提供されるように、ＭＶＡウイルスベクターにおける発現のために最適化されているか、又はこれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％相同な配列を有する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、タグ、例えばＥＰＥＡ等のＣ末端タグ等の追加のアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、例えば限定されるものではないが、ｐｍＨ５、ｐ１１、ｐＳｙｎ、ｐＨｙｂ、又は任意の他の適切なプロモーター配列に由来するもの等の適切なプロモーター配列を更に含み得る。さらに、挿入のための核酸配列は、適切な翻訳開始配列、例えばＫｏｚａｋコンセンサス配列等を更に含み得る。さらに、核酸配列は、適切な終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はそれらの組合せ若しくはそれらのうち複数を、タンパク質又はタグの最後のアミノ酸配列に続く核酸配列の３’末端に含むことができる。さらに、核酸配列は、コードされる各タンパク質の最後の終止コドンの３’にワクシニアウイルス終止配列を含むことができる。さらに、挿入のための核酸配列は、抗原配列の挿入を容易にするためのシャトルベクターを生成するのに有用な制限酵素部位を更に含んでもよい。切断型Ｓタンパク質をコードする挿入のための例示的な核酸配列は、配列番号１４７（図１５Ｂ－図１５Ｃ）、配列番号１４８（図１５Ｄ－図１５Ｅ）、配列番号１４９（図１５Ｇ－図１５Ｈ）、又は配列番号１５０（図１５Ｉ－図１５Ｊ）として以下に提供される。幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡは、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９若しくは配列番号１５０から選択される核酸配列、又はこれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同な配列を含む。
医薬組成物
本発明の組換えウイルスベクターは、単独で又は組み合わせて、獣医学的又はヒト使用のための医薬組成物として容易に製剤化される。医薬組成物は、薬学的に許容され得る希釈剤、賦形剤、担体、又はアジュバントを含んでもよい。
本発明の組換えウイルスベクターは、単独で又は組み合わせて、獣医学的又はヒト使用のための医薬組成物として容易に製剤化される。医薬組成物は、薬学的に許容され得る希釈剤、賦形剤、担体、又はアジュバントを含んでもよい。
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原ポリペプチド又はその免疫原性フラグメントを発現する組換えＭＶＡベクターを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に対する防御及び／又は治療に有効なワクチンである。ワクチン組成物は、１つ以上の追加の治療剤を含んでもよい。
医薬組成物は、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ以上の異なる組換えＭＶＡベクターを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という語句は、標準的な薬学的担体のいずれか、例えば、非経口投与に適したもの、例えば、筋肉内、関節内（関節において）、静脈内、皮内、腹腔内、及び皮下の経路によるものを包含する。かかる製剤の例としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含む水性及び非水性の等張性滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。１つの例示的な薬学的に許容され得る担体は、生理食塩水である。
他の生理学的に許容される希釈剤、賦形剤、担体、又はアジュバント及びそれらの製剤が、当業者に知られている。
幾つかの実施形態において、アジュバントは、免疫応答増強剤として使用される。様々な実施形態において、免疫応答増強剤は、アルミニウム系（alum-based）アジュバント、油性アジュバント、Ｓｐｅｃｏｌ、ＲＩＢＩ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５０又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０、ＧＭ－ＣＳＦ、ノニオン性ブロックコポリマー系アジュバント、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）系アジュバントＡＳ－１、ＡＳ－２、Ｒｉｂｉアジュバント系アジュバント、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ、ＳＡＦ（微小流動形態のＳｙｎｔｅｘアジュバント（ＳＡＦ－ｍ））、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、ヒト補体系アジュバントマイコバクテリウム・バッカエ（m. vaccae）、ＩＳＣＯＭＳ、ＭＦ－５９、ＳＢＡＳ－２、ＳＢＡＳ－４、Ｅｎｈａｎｚｙｎ（商標）、ＲＣ－５２９、ＡＧＰ、ＭＰＬ－ＳＥ、ＱＳ７、Ｅｓｃｉｎ；Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ；Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ；及びケノポジウム・キノアサポニン（Chenopodium quinoa）からなる群から選択される。
本明細書に記載の方法において利用される組成物は、例えば、非経口、筋肉内、動脈内、血管内、静脈内、腹腔内、皮下、皮膚、経皮、眼、吸入、頬側、舌下、舌周囲、鼻腔内、局所投与、及び経口投与から選択される経路によって投与することができる。好ましい投与方法は、様々な要因（例えば、投与される組成物の成分、及び治療される病態の重症度）に応じて変化し得る。経口投与に適した製剤は、液体溶液、例えば有効量の組成物を希釈剤（例えば、水、生理食塩水、又はＰＥＧ－４００）に溶解したもの、カプセル剤、サッシェ又は錠剤からなることができ、それぞれ所定量のワクチンを含む。医薬組成物はまた、例えば、気管支通路への吸入のためのエアロゾル製剤であってもよい。エアロゾル製剤は、加圧された、薬学的に許容され得る噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、又は窒素）と混合され得る。
本発明の目的のため、治療剤又は生物学的に活性な薬剤を送達するのに適した医薬組成物は、例えば、錠剤、ゲルキャップ、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、経口ゲル剤、ペースト剤、点眼剤、軟膏剤、クリーム剤、硬膏剤、ドレンチ剤、送達装置、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント剤、スプレー剤、又はエアゾル剤を含むことができる。これらの製剤のいずれも、当該技術分野でよく知られており、受け入れられた方法によって調製することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21 st ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2005、及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, ed. J. Swarbrick, Informa Healthcare, 2006を参照されたい（これらはそれぞれ引用することにより本明細書の一部をなす）。
組成物（例えば、ワクチン）の免疫原性は、本発明の組成物が免疫賦活剤又はアジュバントと同時投与される場合に有意に改善され得る。当業者に既知の適切なアジュバントとしては、例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ（並びにそれらの誘導体及び成分）、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクトデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、リポタンパク質、ＩＳＣＯＭ－Ｍａｔｒｉｘ、ＤＣ－Ｃｈｏｉ、ＤＤＡ、サイトカイン及び他のアジュバント、並びにそれらの誘導体が挙げられる。
経口投与に適した製剤は、（ａ）液体溶液、例えば有効量のワクチンを希釈剤、例えば水、生理食塩水又はＰＥＧ４００に溶解したもの；（ｂ）カプセル剤、サッシェ又は錠剤（それぞれ所定量のワクチンを、液体、固体、顆粒又はゼラチンとして含む）；（ｃ）適切な液体中の懸濁液；（ｄ）適切なエマルジョン；及び（ｅ）キチン等の多糖類ポリマーからなり得る。ワクチンは、単独で、又は他の適切な成分と組み合わせて、吸入を介して、例えば気管支通路に投与されるエアロゾル製剤にすることもできる。エアロゾル製剤は、加圧された許容可能な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等に入れることができる。
直腸投与に好適な製剤は、例えば、坐剤を含み、これは、坐剤基剤を含むワクチンからなる。適切な坐剤基剤としては、天然又は合成のトリグリセリド又はパラフィン炭化水素が挙げられる。さらに、例えば、ワクチンと、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、及びパラフィン炭化水素を含む基剤との組合せからなるゼラチン直腸カプセルを使用することもできる。本発明のワクチンはまた、免疫原性を更に増強するためにサイトカインと同時投与され得る。サイトカインは、当業者に既知の方法により、例えば、プラスミド形態の核酸分子として、又はタンパク質若しくは融合タンパク質として投与され得る。
本発明はまた、本発明のワクチンを備えるキットを提供する。例えば、ワクチン及び使用説明書を備えるキットは、本発明の範囲内である。
使用方法
本発明の組成物を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして使用することができる。
本発明の組成物を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして使用することができる。
例示的な実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の予防を必要とする被験体（例えば、非曝露被験体）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を予防する方法を提供し、該方法は、予防有効量の本発明の組成物を被験体に投与することを含む。該方法の結果は、被験体がウイルスに対して部分的又は完全に免疫化されるということである。
例示的な実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の治療を必要とする被験体（例えば、最近曝露されたが、まだ症候性ではない被験体、又は最近曝露されたが軽度の症候性のみである被験体等の曝露被験体）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量の本発明の組成物を被験体に投与することを含む。治療の結果は、改善された治療プロファイルを有する被験体である。
本明細書に記載の方法に従って治療される被験体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染した被験体）は、かかる病態を有するものとして医療従事者によって診断された者であってもよい。診断は、任意の適切な手段によって行われ得る。感染の発生が予防されている被験体は、かかる診断を受けていても受けていなくてもよい。当業者は、本発明に従って治療される被験体が、標準的な試験を用いて同定された場合もあれば、検査なしで、１つ以上の危険因子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２への曝露等）の存在により高リスクの被験体として同定された場合もあることを理解するであろう。
予防的処置は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２にまだ曝露されていないか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染していないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に曝露されやすい若しくは感染しやすい、又はそうでなければ曝露若しくは感染のリスクがある被験体に適用され得る。
治療的処置は、例えば、被験体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に既に感染している患者）の病態を改善又は安定化させるために、まだ病気ではない、又は症状若しくは感染を示す、障害に苦しんでいる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に既に曝露されているか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染している被験体に適用され得る。その結果、治療プロファイルが改善される。幾つかの例において、同等の未治療対照と比較して、治療は、障害又はその症状を、例えば、任意の標準的な技術によって測定した場合に５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％改善し得る。幾つかの例では、治療は、ウイルス複製の阻害、ウイルス力価又はウイルス量の減少、ウイルスの根絶又は除去をもたらすことができる。他の実施形態において、治療は、上記で同定された任意の症状を含む感染の１つ以上の症状の改善をもたらし得る。この実施形態によれば、症状の改善又は不在を検出することにより治療の確認を評定することができる。
他の実施形態において、治療は、被験体が感染を別の非感染被験体に伝播する能力の低下又は排除をもたらし得る。この実施形態による治療の確認は、一般に、障害の改善を決定するために使用されるのと同じ方法を用いて評定されるが、伝播を防止するために必要なウイルス力価又はウイルス量の減少は、障害を改善するために必要なウイルス力価又はウイルス量の減少とは異なる可能性がある。
一実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からの少なくとも１つの遺伝子をコードする組換えウイルスベクターを被験体に投与することによって被験体（例えば、ヒト）における免疫応答を誘導する方法である。免疫応答は、細胞性免疫応答若しくは体液性免疫応答、又はそれらの組合せであり得る。
特定の実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からの少なくとも１つの遺伝子をコードする組換えウイルスベクターを被験体に投与することによって被験体（例えば、ヒト）における免疫応答を誘導する方法である。免疫応答は、細胞性免疫応答若しくは体液性免疫応答、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、免疫応答は、広義には中和抗体応答である。
特定の実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からの少なくとも１つの遺伝子をコードする組換えウイルスベクターを被験体に投与することによって被験体（例えば、ヒト）における免疫応答を誘導する方法である。或る特定の実施形態において、組換えウイルスベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からの少なくとも２つの遺伝子をコードする。免疫応答は、細胞性免疫応答若しくは体液性免疫応答、又はそれらの組合せであり得る。
別の実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からの少なくとも１つの遺伝子をコードする組換えウイルスベクターを被験体に投与することによって被験体（例えば、ヒト）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を治療する方法を特徴とする。治療されている被験体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２による感染を有していない場合もあるが、発症のリスクがある。
組成物は、例えば、注射（例えば、筋肉内、動脈内、血管内、静脈内、腹腔内、又は皮下）によって投与され得る。
本発明のワクチンを投与する２以上の経路が、同時に又は逐次的に（例えば、ブースティング）採用され得ることが理解されるであろう。さらに、本発明のワクチンは、ワクチンとしてタンパク質抗原、ワクシニアウイルス及び不活化ウイルスを採用する等の従来の免疫手法と組み合わせて採用することができる。したがって、一実施形態において、本発明のワクチンは、被験体に投与され（被験体は、本発明のワクチンで「プライミング」される）、次いで、異なるワクチンが投与される（被験体は、異なるワクチンで「ブースト」される）。別の実施形態において、異なるワクチンが最初に被験体に投与され、続いて本発明のワクチンが投与される。更に別の実施形態において、異なるワクチンと本発明のワクチンとが同時投与される。幾つかの実施形態において、異なるワクチンは、ｍＲＮＡ－１２７３（Moderna, Inc.）、ＡＺＤ－１２２２（AstraZeneca及びオックスフォード大学）、ＢＮＴ１６２（Pfizer及びBioNTech）、ＣｏｒｏｎａＶａｃ（Sinovac）、ＮＶＸ－ＣｏＶ ２３７２（NovoVax）、ＳＣＢ－２０１９（Sanofi及びGSK）、ＺｙＣｏＶ－Ｄ（Zydus Cadila）、又はＣｏＶａｘｉｎ（Bharat Biotech）である。
いかなる特定のメカニズムにも拘束されるべきではないが、本明細書に記載される医薬組成物を接種すると、宿主の免疫系は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質に特異的な分泌型抗体及び血清抗体の両方を産生することによって、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に特異的な細胞媒介性免疫応答を産生することによってワクチンに応答すると考えられる。ワクチン接種の結果として、宿主は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に対して少なくとも部分的若しくは完全に免疫を持つか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染によって引き起こされる中等度若しくは重度の疾患の発生を抑えることになる。
一態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関連する１つ以上の症状（例えば、発熱、重度の頭痛、筋肉痛、倦怠感、極度の無力症、結膜炎、一般的な発疹、嚥下障害、吐き気、嘔吐、血性下痢に続くびまん性出血、せん妄、ショック、黄疸、血小板減少症、リンパ球減少症、好中球増加症、様々な器官における局所壊死（例えば、腎臓及び肝臓）、及び急性呼吸窮迫）を緩和する、その重症度を低減する、又はその発生を減少させるために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２タンパク質又はそのフラグメントを含む組換えＭＶＡウイルスベクターを含む医薬組成物を有効量投与することを含む方法が提供される。
一実施形態において、投与は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、又は９回以上繰り返される。
一実施形態において、投与は２回繰り返される。
一実施形態において、約２回～８回、約４回～８回、又は約６回～８回の投与が提供される。
一実施形態において、約１週間～４週間、２週間～４週間、３週間～４週間、１週間、２週間、３週間、４週間又は４週間を越える間隔が投与間に設けられる。
具体的な一実施形態において、２回の投与の間に４週間の間隔が用いられる。
本発明は、２０１９年の新型コロナウイルス感染肺炎（ＮＣＩＰ：novel coronavirus-infected pneumonia）、急性肺損傷（ＡＬＩ：acute lung injury）、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ：acute respiratory distress syndrome）等の肺炎を含む、ウイルスの薬物耐性及び多剤耐性形態、並びにウイルス感染の関連する病状、病態、又は合併症を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の予防及び治療の方法を含む。追加の非限定的な合併症としては、低酸素呼吸不全、急性呼吸不全（ＡＲＦ：acute respiratory failure）、急性肝損傷、急性心臓損傷、急性腎損傷、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群、血栓、多系統炎症性症候群、慢性疲労、横紋筋融解症、及びサイトカインストームが挙げられる。
別の代替の実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の伝播を防止するのに十分な免疫応答を誘導するために、有効量の本明細書に記載の１つ以上のｒＭＶＡウイルスベクターをヒトに投与することを含む、伝播を予防する方法が提供される。
本発明は、２０１９年の新型コロナウイルス感染肺炎（ＮＣＩＰ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等の肺炎を含む、ウイルスの薬物耐性及び多剤耐性形態、並びにウイルス感染の関連する病状、病態、又は合併症を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を治療する方法に関する。追加の非限定的な合併症としては、低酸素呼吸不全、急性呼吸不全（ＡＲＦ）、急性肝損傷、急性心臓損傷、急性腎損傷、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群、血栓、多系統炎症性症候群、慢性疲労、横紋筋融解症、及びサイトカインストームが挙げられる。
一実施形態において、本明細書に記載のｒＭＶＡの投与は、以下に記載する６層の階層レベルの呼吸支援方法を用いて、満足のいく酸素取り込み（ＳｐＯ２＞９３％）を維持するために必要な呼吸支援方法において、１層以上、又は更には２層以上の増加によって測定される進行性呼吸不全（ＰＲＩ）の発生率の低下をもたらし、ここで、被験体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を獲得したが、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターを以前に投与されたことがある、又は投与される予定である。
呼吸支援レベルの増加のスケールは以下を含む：
レベル１：室内空気での通常の酸素取り込み（ＳｐＯ２＞９３％）、Ｏ２補給の必要なし
レベル２：ＳｐＯ２＞９３を維持するため鼻腔カニューレ又はマスクによる低レベルのＯ２補給（最大２Ｌ／分）が必要な、室内空気での持続的な低酸素血症（ＳｐＯ２＞９３）
レベル３：ＳｐＯ２＞９３を維持するため鼻腔カニューレ又はマスクによるより高いレベルの受動的Ｏ２補給（最大２Ｌ／分）が必要
レベル４：満足のいく酸素取り込み及び／又は換気を維持するための陽圧装置、例えば、持続的気道陽圧（ＣＰＡＰ）若しくは二相性気道陽圧（ＢｉＰＡＰ）、又は他の非侵襲的陽圧呼吸支援方法による酸素取り込みが必要
レベル５：侵襲的な呼吸サポート（挿管式機械換気又はＥＣＭＯ）が必要
レベル６：死亡
レベル１：室内空気での通常の酸素取り込み（ＳｐＯ２＞９３％）、Ｏ２補給の必要なし
レベル２：ＳｐＯ２＞９３を維持するため鼻腔カニューレ又はマスクによる低レベルのＯ２補給（最大２Ｌ／分）が必要な、室内空気での持続的な低酸素血症（ＳｐＯ２＞９３）
レベル３：ＳｐＯ２＞９３を維持するため鼻腔カニューレ又はマスクによるより高いレベルの受動的Ｏ２補給（最大２Ｌ／分）が必要
レベル４：満足のいく酸素取り込み及び／又は換気を維持するための陽圧装置、例えば、持続的気道陽圧（ＣＰＡＰ）若しくは二相性気道陽圧（ＢｉＰＡＰ）、又は他の非侵襲的陽圧呼吸支援方法による酸素取り込みが必要
レベル５：侵襲的な呼吸サポート（挿管式機械換気又はＥＣＭＯ）が必要
レベル６：死亡
一実施形態において、ＰＲＩの減少は、非免疫被験体と比較して、レベル５からレベル３、レベル５からレベル２、又はレベル５からレベル１への増加である。一実施形態において、ＰＲＩの減少は、非免疫被験体と比較して、レベル４からレベル２、又はレベル４からレベル１への増加である。一実施形態において、ＰＲＩの減少は、非免疫被験体と比較して、レベル３からレベル１への増加である。
一実施形態において、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターの投与は、臨床回復（適応された国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）の臨床状態の序数尺度を用いてＮＩＡＩＤ臨床状態尺度におけるステータス６、７、又は８）までの期間の中央値時間を少なくとも３日間、４日間、５日間、又はそれよりも長い日数、短縮する。一実施形態において、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターの投与は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を発生する被験体における臨床状態の適応序数尺度によって測定される改善をもたらす。
最も重篤な疾患から漸進的に重症度の低い疾患まで、全体的な臨床状態の適応序数尺度の段階は以下のように定義される：
１．死亡
２．入院、侵襲的な機械換気又はＥＣＭＯ
３．入院、非侵襲的換気又は高流量酸素装置
４．入院、酸素補給が必要
５．入院、酸素補給不要－継続的な医療が必要（ＣＯＶＩＤ－１９関連又はその他）
６．入院、酸素補給不要、ＣＯＶＩＤ－１９のための密接な医療を必要としなくなった
７．入院はしていないが、活動が制限されており、ＣＯＶＩＤ－１９症状の密接な外来診療が必要
８．入院していない、活動に制限がない、継続的な密接な医療の必要がない
１．死亡
２．入院、侵襲的な機械換気又はＥＣＭＯ
３．入院、非侵襲的換気又は高流量酸素装置
４．入院、酸素補給が必要
５．入院、酸素補給不要－継続的な医療が必要（ＣＯＶＩＤ－１９関連又はその他）
６．入院、酸素補給不要、ＣＯＶＩＤ－１９のための密接な医療を必要としなくなった
７．入院はしていないが、活動が制限されており、ＣＯＶＩＤ－１９症状の密接な外来診療が必要
８．入院していない、活動に制限がない、継続的な密接な医療の必要がない
一実施形態において、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターの投与は、臨床回復（適応された国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）の臨床状態の序数尺度を用いてＮＩＡＩＤ臨床状態尺度におけるステータス６、７、又は８）までの期間の中央値時間を、非免疫被験体と比較して、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、又は少なくとも１０日間短縮する。
一実施形態において、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターの投与は、非免疫被験体と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した患者の入院期間を短縮する。
一実施形態において、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターの投与は、非免疫被験体と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した患者の鼻及び／又は喉における検出可能でないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが持続するまでの時間を短縮する。
一実施形態において、本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターの投与は、非免疫被験体と比較して呼吸不全又は死亡を減少させる。
投与量
ワクチンは、投与製剤に適合する様式で、治療的に有効で、免疫原性及び防御的であるような量で投与される。投与される量は、治療される被験体に依存し、例えば、抗体を合成する個体の免疫系の能力、及び必要に応じて、細胞媒介性免疫応答を産生する能力を含む。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、患者ごとに監視され得る。しかしながら、適切な用量範囲は、当業者によって容易に決定可能であり、一般に、約５．０×１０６ ＴＣＩＤ５０～５．０×１０９ ＴＣＩＤ５０の範囲である。投与量はまた、限定されるものではないが、投与経路、患者の健康状態及び体重、並びに製剤の性質に依存し得る。
ワクチンは、投与製剤に適合する様式で、治療的に有効で、免疫原性及び防御的であるような量で投与される。投与される量は、治療される被験体に依存し、例えば、抗体を合成する個体の免疫系の能力、及び必要に応じて、細胞媒介性免疫応答を産生する能力を含む。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、患者ごとに監視され得る。しかしながら、適切な用量範囲は、当業者によって容易に決定可能であり、一般に、約５．０×１０６ ＴＣＩＤ５０～５．０×１０９ ＴＣＩＤ５０の範囲である。投与量はまた、限定されるものではないが、投与経路、患者の健康状態及び体重、並びに製剤の性質に依存し得る。
本発明の医薬組成物は、エボラウイルスの病原性種に対して治療的に有効、免疫原性、及び／又は保護的となるような量で投与される。投与される投与量は、治療される被験体（例えば、投与様式及び年齢、体重、免疫系の能力、並びに治療される被験体の一般的な健康状態）に依存する。組成物は、過度の有害な生理学的効果を伴わずに免疫応答を惹起する十分なレベルの発現を提供する量で投与される。好ましくは、本発明の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の１つ以上のポリペプチド又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の１つ以上の遺伝子をコードする核酸分子を含む異種ウイルスベクターであり、例えば、１．０×１０４～９．９×１０１２ ＴＣＩＤ５０のウイルスベクター、好ましくは１．０×１０５ ＴＣＩＤ５０～１．０×１０１１ ＴＣＩＤ５０ｐｆｕ、より好ましくは１．０×１０６～１．０×１０１０ ＴＣＩＤ５０ｐｆｕ、又は最も好ましくは５．０×１０６～５．０×１０９ ＴＣＩＤ５０の投与量で投与される。組成物は、例えば、少なくとも５．０×１０６ ＴＣＩＤ５０のウイルスベクター（例えば、１．０×１０８ ＴＣＩＤ５０のウイルスベクター）を含み得る。医師又は研究者は、適切な量及び投与レジメンを決定することができる。
上記方法の組成物は、例えば、１．０×１０４～９．９×１０１２ ＴＣＩＤ５０のウイルスベクター、好ましくは１．０×１０５～１．０×１０１１ ＴＣＩＤ５０ｐｆｕ、より好ましくは１．０×１０６～１．０×１０１０ ＴＣＩＤ５０ｐｆｕ、又は最も好ましくは５．０×１０６～５．０×１０９ ＴＣＩＤ５０を含み得る。組成物は、例えば、少なくとも５．０×１０６ ＴＣＩＤ５０のウイルスベクター（例えば、１．０×１０８ ＴＣＩＤ５０のウイルスベクター）を含み得る。この方法は、例えば、組成物を被験体に２回以上投与することを含み得る。
本発明はまた、被験体（例えば、ヒト）においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する免疫応答を誘導する方法を特徴とし、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２由来の少なくとも１つの遺伝子をコードする有効量の組換えウイルスベクターを被験体に投与することを含む。治療されている被験体は、アレナウイルスによる感染を有していない場合もあるが、発症のリスクがある。或いは、被験体は、既にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染している場合もある。組成物は、例えば、注射（例えば、筋肉内、動脈内、血管内、静脈内、腹腔内、又は皮下）によって投与され得る。
「有効量」という用語は、臨床的に関連する様式で被験体の病態、又は障害の症状を改善、阻害又は回復させる（例えば、アレナウイルスによる感染を改善、阻害若しくは回復させるか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２による感染に有効な免疫応答を提供する）ために投与される組成物の量を意味する。被験体におけるいかなる改善も、治療を達成するのに十分であると考えられる。好ましくは、治療するのに十分な量は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の発生若しくは１つ以上の症状を予防する量であるか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の１つ以上の症状の重症度若しくは被験体がそれに苦しむ期間の長さを（例えば、本発明の組成物で治療されていない対照被験体に対して、少なくとも１０％、２０％、又は３０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上）低減する量である。本明細書に記載の方法（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の治療）を実施するために使用される医薬組成物の十分な量は、投与様式、並びに治療される被験体の年齢、体重及び全身の健康状態に応じて変化する。最終的に、処方者又は研究者が適切な量及び投与量を決定する。
幾つかの例では、本発明の免疫原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２組成物を、他の作用物質、特に他のウイルスに対する防御応答を誘導する免疫原性組成物と組み合わせることが望ましい場合がある。例えば、本発明のワクチン組成物は、インフルエンザ（Ulmer, J. B. et al., Science 259:1745-1749 (1993)、Raz, E. et al., PNAS (USA) 91 :9519-9523 (1994)）、マラリア（Doolan, D. L. et al., J. Exp. Med. 183:1739-1746 (1996)、Sedegah, M. et al., PNAS (USA) 91 :9866-9870 (1994)）、及び結核（Tascon, R. C. et al., Nat.Med.2:888-892 (1996)）用のもの等の他の遺伝子免疫ワクチンと同時に、別々に、又は逐次的に投与することができる。
投与
本明細書で使用される場合、「投与する（こと）」という用語は、本発明の医薬組成物の投与量を被験体に与える方法を指す。本明細書に記載の方法において利用される組成物は、例えば、非経口、皮膚、経皮、眼、吸入、頬側、舌下、舌周囲、鼻腔、直腸、局所投与、及び経口投与から選択される経路によって投与することができる。非経口投与は、静脈内、腹腔内、皮下、動脈内、血管内、及び筋肉内の投与を含む。好ましい投与方法は、様々な要因（例えば、投与される組成物の成分、及び治療される病態の重症度）に応じて変化し得る。
本明細書で使用される場合、「投与する（こと）」という用語は、本発明の医薬組成物の投与量を被験体に与える方法を指す。本明細書に記載の方法において利用される組成物は、例えば、非経口、皮膚、経皮、眼、吸入、頬側、舌下、舌周囲、鼻腔、直腸、局所投与、及び経口投与から選択される経路によって投与することができる。非経口投与は、静脈内、腹腔内、皮下、動脈内、血管内、及び筋肉内の投与を含む。好ましい投与方法は、様々な要因（例えば、投与される組成物の成分、及び治療される病態の重症度）に応じて変化し得る。
本発明の医薬組成物（例えば、ワクチン）の投与は、当業者に知られている任意の経路によって行うことができる。投与は、例えば筋肉内注射による場合がある。本明細書に記載の方法において利用される組成物はまた、例えば、非経口、皮膚、経皮、眼、吸入、頬側、舌下、舌周囲、鼻腔、直腸、局所の投与、及び経口投与から選択される経路によって投与することができる。非経口投与は、静脈内、腹腔内、皮下、及び筋肉内の投与を含む。好ましい投与方法は、様々な要因、例えば、投与される組成物の成分、及び治療される病態の重症度に応じて変化し得る。
さらに、本発明の組成物の単回又は複数回の投与が被験体に与えられてもよい。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に特に罹りやすい被験体は、ウイルスに対する防御を確立及び／又は維持するために複数の治療を必要とする可能性がある。本明細書に記載の医薬組成物によって提供される誘導免疫のレベルは、例えば、中和分泌型抗体及び中和血清抗体の量を測定することによってモニターすることができる。投与量は、次いで、ウイルス感染に対する防御の所望のレベルを維持するために、必要に応じて調整又は反復され得る。
組合せ
本明細書に記載のｒＭＶＡワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に罹患している患者に対する現在の標準治療に加えて、又は以下でより詳細に記載されるように、医療提供者が患者にとって有益であると考える任意の他の化合物若しくは治療法と組み合わせて若しくはそれと交互に投与することができる。併用療法及び／又は交互療法（alternation therapy）は、予防的、治療的、補助的、又は緩和的であり得る。
本明細書に記載のｒＭＶＡワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に罹患している患者に対する現在の標準治療に加えて、又は以下でより詳細に記載されるように、医療提供者が患者にとって有益であると考える任意の他の化合物若しくは治療法と組み合わせて若しくはそれと交互に投与することができる。併用療法及び／又は交互療法（alternation therapy）は、予防的、治療的、補助的、又は緩和的であり得る。
この方法はまた、それを必要とする宿主、典型的にはヒトに、任意に、有効量の本明細書に記載のｒＭＶＡを、少なくとも１つの追加の生理活性剤、例えば、追加の抗ウイルス剤、更に任意に薬学的に許容され得る担体添加剤及び／又は賦形剤と組み合わせて投与することを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載のｒＭＶＡは、追加のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン接種と組み合わせて、又はそれと交互に投与することができる。幾つかの実施形態において、追加のワクチン接種は、ｍＲＮＡベースのワクチン、アデノウイルスワクチン、非複製ワクチン、ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチン、植物ベースのアジュバントワクチン、マルチエピトープペプチドベースのワクチン、不活化ウイルス、及びペプチドワクチン、又はそれらの組合せから選択することができる。本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクター及び方法との使用に適した追加のワクチンとしては、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ－１２７３（ＭＯＤＥＲＮＡ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン；Moderna, Inc.）、ＡＺＤ－１２２２（ＣＯＶＩＤＳＨＩＥＬＤ；AstraZeneca及びオックスフォード大学）、ＢＮＴ１６２（ＣＯＭＩＲＮＡＴＹ；Pfizer及びBioNTech）、Ｓｐｕｔｎｉｋ Ｖ（Gamaleya Research Institute、Acellena Contract Drug Research and Development）、ＣｏｒｏｎａＶａｃ（Sinovac）、ＮＶＸ－ＣｏＶ ２３７２（NovoVax）、ＳＣＢ－２０１９（Sanofi及びGSK）、ＺｙＣｏＶ－Ｄ（Zydus Cadila）、ＢＢＩＢＰ－ＣｏｒＶ（Beijing Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group（Sinopharm））、ＥｐｉＶａｃＣｏｒｏｎａ（Federal Budgetary Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology）、Ｃｏｎｖｉｄｉｃｅａ（CanSino Biologics）、Ｃｏｖｉｄ－１９ワクチン（Wuhan Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group （Sinopharm））、ＪＮＪ－７８４３６７３５（Johnson & Johnson）、ＺＦ２００１（Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical, Institute of Microbiology of the Chinese Academy of Sciences）、ＣＶｎＣｏＶ（CureVac；GSK）、ＩＮＯ－４８００（Inovio Pharmaceuticals）、ＶＩＲ－７８３１（Medicago；GSK；Dynavax）、Ｃｏｖｉｄ－１９アデノウイルスベースワクチン（ImmunityBio；NantKwest）、ＵＢ－６１２（COVAXX）、又はＣｏＶａｘｉｎ（Bharat Biotech）、又はそれらの組合せが挙げられる。
本明細書に記載のｒＭＶＡウイルスベクターは、ＣＯＶＩＤ患者に対する現在の標準治療の上に、又は医療提供者が患者にとって有益であると考える任意の他の化合物若しくは療法と組み合わせて若しくは交互に投与することができる。併用療法及び／又は交互療法は、治療的、補助的、又は緩和的であり得る。
幾つかの実施形態において、ｒＭＶＡウイルスベクターは、抗感染症剤、例えばレムデシビルを含むがこれに限定されないＮＳ５Ｂ阻害剤と共に投与され、ＨＩＶに対して以前に承認されたロピナビル又はリトナビル等のプロテアーゼ阻害剤も投与することができる。幾つかの実施形態において、抗感染症薬は、ファビピラビル、フィンゴリモド（ジレニア）、メチルプレドニゾロン、ベバシズマブ（アバスチン）、アクテムラ（トシリズマブ）、ウミフェノビル、ロサルタン、及びＲＥＧＮ３０４８とＲＥＧＮ３０５１のモノクローナル抗体の組合せ、リバビリン、ＡＴ－５２７（Atea Pharmaceuticals、米国特許第１０，５１９，１８６号に記載され、引用することにより本明細書の一部をなす）、又はＡＴ－５１１（Atea Pharmaceuticals、米国特許第１０，５１９，１８６号に記載され、引用することにより本明細書の一部をなす）から選択される。これらの薬物又はワクチンのいずれかを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス感染に罹患しやすい者の治療又は予防のために本明細書で提供されるｒＭＶＡと組み合わせて又は交互に使用することができる。
実施形態
少なくとも以下の実施形態が本明細書で提供される：
少なくとも以下の実施形態が本明細書で提供される：
１． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来するスパイク（Ｓ）タンパク質と、ペプチドフラグメント又はその変異体、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記Ｓタンパク質、ペプチドフラグメント又はその変異体、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
２． 前記異種核酸配列が全長Ｓタンパク質をコードする、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
３． 前記全長Ｓタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１又は２に記載のｒＭＶＡ。
４． 前記全長Ｓタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載のｒＭＶＡ。
５． 前記Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号３、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１又は２に記載のｒＭＶＡ。
６． 前記全長Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号３を含む、実施形態５に記載のｒＭＶＡ。
７． 前記全長Ｓタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１又は２に記載のｒＭＶＡ。
８． 前記全長Ｓタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載のｒＭＶＡ。
９． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１～８に記載のｒＭＶＡ。
１０． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載のｒＭＶＡ。
１１． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１～１０に記載のｒＭＶＡ。
１２． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、実施形態１１に記載のｒＭＶＡ。
１３． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１～１２に記載のｒＭＶＡ。
１４． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載のｒＭＶＡ。
１５． 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１～１４に記載のｒＭＶＡ。
１６． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、実施形態１５に記載のｒＭＶＡ。
１７． 前記異種核酸配列が配列番号１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
１８． 前記異種核酸配列が配列番号１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１７に記載のｒＭＶＡ。
１９． 前記異種核酸配列が配列番号３、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
２０． 前記異種核酸配列が配列番号３、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態１９に記載のｒＭＶＡ。
２１． 前記異種核酸配列が配列番号６、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
２２． 前記異種核酸配列が配列番号６、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態２１に記載のｒＭＶＡ。
２３． 前記Ｓタンパク質が、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１～２２に記載のｒＭＶＡ。
２４． 前記Ｓタンパク質がアミノ酸置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態２３に記載のｒＭＶＡ。
２５． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１～２４に記載のｒＭＶＡ。
２６． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態２５に記載のｒＭＶＡ。
２７． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態２６に記載のｒＭＶＡ。
２８． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態２６に記載のｒＭＶＡ。
２９． 前記プロモーターが配列番号１５４である、実施形態２７に記載のｒＭＶＡ。
３０． 前記プロモーターが配列番号１５５である、実施形態２８に記載のｒＭＶＡ。
３１． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が配列番号４６、配列番号４７、配列番号１５６から選択される核酸配列を含む、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
３２． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来する安定化スパイク（Ｓ）タンパク質と、ペプチドフラグメント又はその変異体、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記安定化Ｓタンパク質、ペプチドフラグメント又はその変異体、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
３３． 前記異種核酸配列が全長安定化Ｓタンパク質をコードする、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
３４． 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号８のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２又は３３に記載のｒＭＶＡ。
３５． 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態３４に記載のｒＭＶＡ。
３６． 前記安定化Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号１０、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２又は３３に記載のｒＭＶＡ。
３７． 前記全長安定化Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号１０を含む、実施形態３６に記載のｒＭＶＡ。
３８． 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号１１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２又は３３に記載のｒＭＶＡ。
３９． 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態３８に記載のｒＭＶＡ。
４０． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２～３９に記載のｒＭＶＡ。
４１． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、実施形態４０に記載のｒＭＶＡ。
４２． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２～４１に記載のｒＭＶＡ。
４３． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、実施形態４２に記載のｒＭＶＡ。
４４． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２～４３に記載のｒＭＶＡ。
４５． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載のｒＭＶＡ。
４６． 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２～４５に記載のｒＭＶＡ。
４７． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、実施形態４６に記載のｒＭＶＡ。
４８． 前記異種核酸配列が配列番号８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
４９． 前記異種核酸配列が配列番号８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態４８に記載のｒＭＶＡ。
５０． 前記異種核酸配列が配列番号１０、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
５１． 前記異種核酸配列が配列番号１０、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態５０に記載のｒＭＶＡ。
５２． 前記異種核酸配列が配列番号１１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
５３． 前記異種核酸配列が配列番号１１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態５２に記載のｒＭＶＡ。
５４． 前記異種核酸配列が配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
５５． 前記異種核酸配列が配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態５４に記載のｒＭＶＡ。
５６． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態３２～５５に記載のｒＭＶＡ。
５７． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態５６に記載のｒＭＶＡ。
５８． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態５６に記載のｒＭＶＡ。
５９． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態５６に記載のｒＭＶＡ。
６０． 前記プロモーターが配列番号１５４である、実施形態５８に記載のｒＭＶＡ。
６１． 前記プロモーターが配列番号１５５である、実施形態５９に記載のｒＭＶＡ。
６２． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列を含む核酸配列から選択される、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
６３． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来するスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の直鎖状エピトープ、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記直鎖状エピトープ、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
６４． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
６５． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３又は６４に記載のｒＭＶＡ。
６６． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施形態６５に記載のｒＭＶＡ。
６７． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２４、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３～６６に記載のｒＭＶＡ。
６８． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２４を含む、実施形態６７に記載のｒＭＶＡ。
６９． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
７０． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３又は６９に記載のｒＭＶＡ。
７１． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態７０に記載のｒＭＶＡ。
７２． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３又は６９～７１に記載のｒＭＶＡ。
７３． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２５を含む、実施形態７２に記載のｒＭＶＡ。
７４． 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
７５． 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態７４に記載のｒＭＶＡ。
７６． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
７７． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３３のアミノ酸配列を含む、実施形態７７に記載のｒＭＶＡ。
７８． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
７９． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３２のアミノ酸配列を含む、実施形態７８に記載のｒＭＶＡ。
８０． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３～７９に記載のｒＭＶＡ。
８１． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、実施形態８０に記載のｒＭＶＡ。
８２． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３～８１に記載のｒＭＶＡ。
８３． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、実施形態８２に記載のｒＭＶＡ。
８４． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６２～８３に記載のｒＭＶＡ。
８５． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態８４に記載のｒＭＶＡ。
８６． 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３～８５に記載のｒＭＶＡ。
８７． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、実施形態８６に記載のｒＭＶＡ。
８８． 前記異種核酸配列が配列番号２０、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
８９． 前記異種核酸配列が配列番号２０、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態８８に記載のｒＭＶＡ。
９０． 前記異種核酸配列が配列番号２４、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
９１． 前記異種核酸配列が配列番号２４、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態９０に記載のｒＭＶＡ。
９２． 前記異種核酸配列が配列番号２１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
９３． 前記異種核酸配列が配列番号２１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態９２に記載のｒＭＶＡ。
９４． 前記異種核酸配列が配列番号２５、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
９５． 前記異種核酸配列が配列番号２５、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
９６． 前記Ｓ ＲＢＤドメインが前記Ｓタンパク質に由来するシグナルペプチド及び膜貫通ペプチドを更に含む、実施形態６３～９５に記載のｒＭＶＡ。
９７． 前記Ｓシグナルペプチドが配列番号５５を含む、実施形態９６に記載のｒＭＶＡ。
９８． 前記Ｓ膜貫通ペプチドが配列番号５７を含む、実施形態９６又は９７に記載のｒＭＶＡ。
９９． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態６３～９８に記載のｒＭＶＡ。
１００． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態９９に記載のｒＭＶＡ。
１０１． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態９９に記載のｒＭＶＡ。
１０２． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態９９に記載のｒＭＶＡ。
１０３． 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、実施形態１０１に記載のｒＭＶＡ。
１０４． 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、実施形態１０２に記載のｒＭＶＡ。
１０５． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、若しくは配列番号５４を含む配列、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列から選択される、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
１０６． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来するスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の直鎖状エピトープ、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、前記直鎖状ＳエピトープＲＢＤドメインが、前記Ｓタンパク質に由来するシグナルペプチド及び膜貫通ペプチドを更に含み、宿主細胞内で発現させると、前記直鎖状ＳエピトープＲＢＤドメイン、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
１０７． 前記Ｓシグナルペプチドが配列番号５５を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１０８． 前記Ｓ膜貫通ペプチドが配列番号５７を含む、実施形態１０６又は１０７に記載のｒＭＶＡ。
１０９． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１０６～１０８に記載のｒＭＶＡ。
１１０． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１０９に記載のｒＭＶＡ。
１１１． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６１のアミノ酸配列を含む、実施形態１１０に記載のｒＭＶＡ。
１１２． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６５を含む核酸、又はこれと少なくとも９５％相同な配列によってコードされる、実施形態１０６～１１０に記載のｒＭＶＡ。
１１３． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６５を含む核酸によってコードされる、実施形態１１２に記載のｒＭＶＡ。
１１４． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１０６～１０８に記載のｒＭＶＡ。
１１５． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１０８、及び１１４に記載のｒＭＶＡ。
１１６． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６２のアミノ酸配列を含む、実施形態１１５に記載のｒＭＶＡ。
１１７． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号６６、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１１４～１１７に記載のｒＭＶＡ。
１１８． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号６６を含む、実施形態１１７に記載のｒＭＶＡ。
１１９． 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１２０． 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態１１９に記載のｒＭＶＡ。
１２１． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６７のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１２２． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６７のアミノ酸配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１２３． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６８のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１２４． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６８のアミノ酸配列を含む、実施形態１２３に記載のｒＭＶＡ。
１２５． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１２４に記載のｒＭＶＡ。
１２６． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、実施形態１２５に記載のｒＭＶＡ。
１２７． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１２６に記載のｒＭＶＡ。
１２８． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、実施形態１２７に記載のｒＭＶＡ。
１２９． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１２８に記載のｒＭＶＡ。
１３０． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態１２９に記載のｒＭＶＡ。
１３１． 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１３０に記載のｒＭＶＡ。
１３２． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、実施形態１３１に記載のｒＭＶＡ。
１３３． 前記異種核酸配列が配列番号６１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１３４． 前記異種核酸配列が配列番号６１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１３３に記載のｒＭＶＡ。
１３５． 前記異種核酸配列が配列番号６５、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１３６． 前記異種核酸配列が配列番号６５、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態１３５に記載のｒＭＶＡ。
１３７． 前記異種核酸配列が配列番号６２、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１３８． 前記異種核酸配列が配列番号６２、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１３７に記載のｒＭＶＡ。
１３９． 前記異種核酸配列が配列番号６６、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１４０． 前記異種核酸配列が配列番号６６、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態１３９に記載のｒＭＶＡ。
１４１． 前記異種核酸配列が配列番号６７、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１４２． 前記異種核酸配列が配列番号６７、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１４１に記載のｒＭＶＡ。
１４３． 前記異種核酸配列が配列番号６８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１４４． 前記異種核酸配列が配列番号６８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１４４に記載のｒＭＶＡ。
１４５． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１０６～１４４に記載のｒＭＶＡ。
１４６． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態１４５に記載のｒＭＶＡ。
１４７． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態１４５に記載のｒＭＶＡ。
１４８． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態１４５に記載のｒＭＶＡ。
１４９． 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、実施形態１４７に記載のｒＭＶＡ。
１５０． 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、実施形態１４８に記載のｒＭＶＡ。
１５１． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、若しくは配列番号７２を含む配列、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列から選択される、実施形態１０６に記載のｒＭＢＡ。
１５２． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤドメイン由来のスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）融合ペプチドの直鎖状エピトープであって、前記融合ペプチドが、ａ）マールブルグウイルスのエンベロープ糖タンパク質シグナルペプチドと、ｂ）前記ＲＢＤドメインの直鎖状エピトープと、ｃ）エンベロープ糖タンパク質膜貫通ドメインとを含む、直鎖状エピトープ、及びｉｉ）マールブルグウイルスマトリックスタンパク質をコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記ＲＢＤ融合ペプチド及びマトリックスタンパク質が、共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
１５３． 糖タンパク質シグナルペプチドが配列番号８８のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５２に記載のｒＭＶＡ。
１５４． 前記糖タンパク質膜貫通ドメインが、配列番号９０、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５２又は１５３に記載のｒＭＶＡ。
１５５． 前記マトリックスタンパク質がＶＰ４０タンパク質である、実施形態１５２～１５４に記載のｒＭＶＡ。
１５６． 前記ＶＰ４０タンパク質が配列番号９２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５５に記載のｒＭＶＡ。
１５７． 前記ＶＰ４０タンパク質が、配列番号９３を含む核酸、又はこれと少なくとも９５％相同な配列によってコードされる、実施形態１５６に記載のｒＭＶＡ。
１５８． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１５９． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９７を含む核酸によってコードされる、実施形態１５８に記載のｒＭＶＡ。
１６０． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１６１． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号９６のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１６０に記載のｒＭＶＡ。
１６２． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９６のアミノ酸配列を含む、実施形態１６１に記載のｒＭＶＡ。
１６３． 前記ＲＢＤ融合ペプチドをコードする異種核酸配列が配列番号９８、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１６０～１６２に記載のｒＭＶＡ。
１６４． 前記ＲＢＤ融合ペプチドをコードする異種核酸配列が配列番号９８を含む、実施形態１６３に記載のｒＭＶＡ。
１６５． 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１６６． 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態１６５に記載のｒＭＶＡ。
１６７． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号９９のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１６８． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９９のアミノ酸配列を含む、実施形態１６７に記載のｒＭＶＡ。
１６９． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号１００のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１７０． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９９のアミノ酸配列を含む、実施形態１６９に記載のｒＭＶＡ。
１７１． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１５２～１７３に記載のｒＭＶＡ。
１７２． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態１７１に記載のｒＭＶＡ。
１７３． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態１７１に記載のｒＭＶＡ。
１７４． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態１７１に記載のｒＭＶＡ。
１７５． 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、実施形態１７３に記載のｒＭＶＡ。
１７６． 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、実施形態１７４に記載のｒＭＶＡ。
１７７． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、若しくは配列番号１３８を含む配列、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列から選択される、実施形態１５２～１７６に記載のｒＭＶＡ。
１７８． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤドメイン由来のスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）融合ペプチドの直鎖状エピトープであって、前記融合ペプチドが、ａ）前記Ｓタンパク質シグナルペプチドと、前記ＲＢＤドメインの直鎖状エピトープと、ｃ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通ドメインとを含む、直鎖状エピトープ、ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＭタンパク質、及びｉｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＥタンパク質をコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記ＲＢＤ融合ペプチド、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
１７９． シグナルペプチドが配列番号５５のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１７８に記載のｒＭＶＡ。
１８０． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
１８１． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号２０を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１８０に記載のｒＭＶＡ。
１８２． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、実施形態１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
１８３． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号２１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１８２に記載のｒＭＶＡ。
１８４． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施形態１６１に記載のｒＭＶＡ。
１８５． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５９８をコードする、実施形態１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
１８６． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１８５に記載のｒＭＶＡ。
１８７． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む、実施形態１８６に記載のｒＭＶＡ。
１８８． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５９８をコードする、実施形態１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
１８９． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１８５に記載のｒＭＶＡ。
１９０． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６２のアミノ酸配列を含む、実施形態１８９に記載のｒＭＶＡ。
１９１． 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１７８～１９０に記載のｒＭＶＡ。
１９２． 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態１９１に記載のｒＭＶＡ。
１９３． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１９２に記載のｒＭＶＡ。
１９４． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号３２を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１９３に記載のｒＭＶＡ。
１９５． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、実施形態１９１に記載のｒＭＶＡ。
１９６． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号３３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１９５に記載のｒＭＶＡ。
１９７． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む、実施形態１９６に記載のｒＭＶＡ。
１９８． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５９８をコードする、実施形態１９１に記載のｒＭＶＡ。
１９９． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１９８に記載のｒＭＶＡ。
２００． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６３のアミノ酸配列を含む、実施形態１９９に記載のｒＭＶＡ。
２０１． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５９８をコードする、実施形態１９１に記載のｒＭＶＡ。
２０２． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６４のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態２０１に記載のｒＭＶＡ。
２０３． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６４のアミノ酸配列を含む、実施形態２０２に記載のｒＭＶＡ。
２０４． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１７９～２０３に記載のｒＭＶＡ。
２０５． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態２０４に記載のｒＭＶＡ。
２０６． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態２０４に記載のｒＭＶＡ。
２０７． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態２０４に記載のｒＭＶＡ。
２０８． 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、実施形態２０６に記載のｒＭＶＡ。
２０９． 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、実施形態２０７に記載のｒＭＶＡ。
２１０． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が配列番号１５８、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列を含む、実施形態１７９～２０９に記載のｒＭＶＡ。
２１１． ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を低減又は予防する方法であって、有効量の実施形態１～１８１のいずれかに記載のｒＭＶＡウイルスベクターを投与することを含む、方法。
２１２． 前記ｒＭＶＡが予防的一次ワクチン接種として投与される、実施形態２１１に記載の方法。
２１３． 前記ｒＭＶＡがブーストワクチン接種として投与される、実施形態２１１に記載の方法。
２１４． 前記ヒトにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンを以前に投与したことがある、実施形態２１３に記載の方法。
２１５． 前記以前に投与されたワクチンが、ｍＲＮＡベースのワクチン、アデノウイルスワクチン、非複製ワクチン、ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチン、植物ベースのアジュバントワクチン、マルチエピトープペプチドベースのワクチン、不活化ウイルス、ペプチドワクチンから選択される、実施形態２１４に記載の方法。
２１６． 前記以前に投与されたワクチンが、ｍＲＮＡ－１２７３（ＭＯＤＥＲＮＡ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン；Moderna, Inc.）、ＡＺＤ－１２２２（ＣＯＶＩＤＳＨＩＥＬＤ；AstraZeneca及びオックスフォード大学）、ＢＮＴ１６２（ＣＯＭＩＲＮＡＴＹ；Pfizer及びBioNTech）、Ｓｐｕｔｎｉｋ Ｖ（Gamaleya Research Institute、Acellena Contract Drug Research and Development）、ＣｏｒｏｎａＶａｃ（Sinovac）、ＮＶＸ－ＣｏＶ ２３７２（NovoVax）、ＳＣＢ－２０１９（Sanofi及びGSK）、ＺｙＣｏＶ－Ｄ（Zydus Cadila）、ＢＢＩＢＰ－ＣｏｒＶ（Beijing Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group（Sinopharm））、ＥｐｉＶａｃＣｏｒｏｎａ（Federal Budgetary Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology）、Ｃｏｎｖｉｄｉｃｅａ（CanSino Biologics）、Ｃｏｖｉｄ－１９ワクチン（Wuhan Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group （Sinopharm））、ＪＮＪ－７８４３６７３５（Johnson & Johnson）、ＺＦ２００１（Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical, Institute of Microbiology of the Chinese Academy of Sciences）、ＣＶｎＣｏＶ（CureVac；GSK）、ＩＮＯ－４８００（Inovio Pharmaceuticals）、ＶＩＲ－７８３１（Medicago；GSK；Dynavax）、Ｃｏｖｉｄ－１９アデノウイルスベースワクチン（ImmunityBio；NantKwest）、ＵＢ－６１２（COVAXX）、又はＣｏＶａｘｉｎ（Bharat Biotech）から選択される、実施形態２１４に記載の方法。
２１７． 前記ヒトが以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したことがある、実施形態２１３に記載の方法。
２１８． 前記ｒＭＶＡがプライムワクチン及びブーストワクチンの両方として投与される、実施形態２１１に記載の方法。
２１９． 前記ｒＭＶＡがブーストワクチンとして２回以上投与される、実施形態２１３～２１６に記載の方法。
２２０． 前記ｒＭＶＡブーストが、前記プライムワクチン接種の４週間以上後に投与される、実施形態２１６に記載の方法。
２． 前記異種核酸配列が全長Ｓタンパク質をコードする、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
３． 前記全長Ｓタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１又は２に記載のｒＭＶＡ。
４． 前記全長Ｓタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載のｒＭＶＡ。
５． 前記Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号３、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１又は２に記載のｒＭＶＡ。
６． 前記全長Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号３を含む、実施形態５に記載のｒＭＶＡ。
７． 前記全長Ｓタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１又は２に記載のｒＭＶＡ。
８． 前記全長Ｓタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載のｒＭＶＡ。
９． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１～８に記載のｒＭＶＡ。
１０． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載のｒＭＶＡ。
１１． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１～１０に記載のｒＭＶＡ。
１２． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、実施形態１１に記載のｒＭＶＡ。
１３． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１～１２に記載のｒＭＶＡ。
１４． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載のｒＭＶＡ。
１５． 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１～１４に記載のｒＭＶＡ。
１６． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、実施形態１５に記載のｒＭＶＡ。
１７． 前記異種核酸配列が配列番号１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
１８． 前記異種核酸配列が配列番号１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１７に記載のｒＭＶＡ。
１９． 前記異種核酸配列が配列番号３、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
２０． 前記異種核酸配列が配列番号３、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態１９に記載のｒＭＶＡ。
２１． 前記異種核酸配列が配列番号６、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
２２． 前記異種核酸配列が配列番号６、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態２１に記載のｒＭＶＡ。
２３． 前記Ｓタンパク質が、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１～２２に記載のｒＭＶＡ。
２４． 前記Ｓタンパク質がアミノ酸置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態２３に記載のｒＭＶＡ。
２５． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１～２４に記載のｒＭＶＡ。
２６． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態２５に記載のｒＭＶＡ。
２７． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態２６に記載のｒＭＶＡ。
２８． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態２６に記載のｒＭＶＡ。
２９． 前記プロモーターが配列番号１５４である、実施形態２７に記載のｒＭＶＡ。
３０． 前記プロモーターが配列番号１５５である、実施形態２８に記載のｒＭＶＡ。
３１． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が配列番号４６、配列番号４７、配列番号１５６から選択される核酸配列を含む、実施形態１に記載のｒＭＶＡ。
３２． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来する安定化スパイク（Ｓ）タンパク質と、ペプチドフラグメント又はその変異体、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記安定化Ｓタンパク質、ペプチドフラグメント又はその変異体、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
３３． 前記異種核酸配列が全長安定化Ｓタンパク質をコードする、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
３４． 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号８のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２又は３３に記載のｒＭＶＡ。
３５． 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態３４に記載のｒＭＶＡ。
３６． 前記安定化Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号１０、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２又は３３に記載のｒＭＶＡ。
３７． 前記全長安定化Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号１０を含む、実施形態３６に記載のｒＭＶＡ。
３８． 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号１１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２又は３３に記載のｒＭＶＡ。
３９． 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態３８に記載のｒＭＶＡ。
４０． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２～３９に記載のｒＭＶＡ。
４１． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、実施形態４０に記載のｒＭＶＡ。
４２． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２～４１に記載のｒＭＶＡ。
４３． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、実施形態４２に記載のｒＭＶＡ。
４４． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２～４３に記載のｒＭＶＡ。
４５． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載のｒＭＶＡ。
４６． 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２～４５に記載のｒＭＶＡ。
４７． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、実施形態４６に記載のｒＭＶＡ。
４８． 前記異種核酸配列が配列番号８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
４９． 前記異種核酸配列が配列番号８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態４８に記載のｒＭＶＡ。
５０． 前記異種核酸配列が配列番号１０、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
５１． 前記異種核酸配列が配列番号１０、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態５０に記載のｒＭＶＡ。
５２． 前記異種核酸配列が配列番号１１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
５３． 前記異種核酸配列が配列番号１１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態５２に記載のｒＭＶＡ。
５４． 前記異種核酸配列が配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
５５． 前記異種核酸配列が配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態５４に記載のｒＭＶＡ。
５６． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態３２～５５に記載のｒＭＶＡ。
５７． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態５６に記載のｒＭＶＡ。
５８． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態５６に記載のｒＭＶＡ。
５９． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態５６に記載のｒＭＶＡ。
６０． 前記プロモーターが配列番号１５４である、実施形態５８に記載のｒＭＶＡ。
６１． 前記プロモーターが配列番号１５５である、実施形態５９に記載のｒＭＶＡ。
６２． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列を含む核酸配列から選択される、実施形態３２に記載のｒＭＶＡ。
６３． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来するスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の直鎖状エピトープ、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記直鎖状エピトープ、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
６４． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
６５． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３又は６４に記載のｒＭＶＡ。
６６． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施形態６５に記載のｒＭＶＡ。
６７． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２４、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３～６６に記載のｒＭＶＡ。
６８． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２４を含む、実施形態６７に記載のｒＭＶＡ。
６９． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
７０． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３又は６９に記載のｒＭＶＡ。
７１． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態７０に記載のｒＭＶＡ。
７２． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３又は６９～７１に記載のｒＭＶＡ。
７３． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２５を含む、実施形態７２に記載のｒＭＶＡ。
７４． 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
７５． 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態７４に記載のｒＭＶＡ。
７６． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
７７． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３３のアミノ酸配列を含む、実施形態７７に記載のｒＭＶＡ。
７８． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
７９． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３２のアミノ酸配列を含む、実施形態７８に記載のｒＭＶＡ。
８０． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３～７９に記載のｒＭＶＡ。
８１． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、実施形態８０に記載のｒＭＶＡ。
８２． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３～８１に記載のｒＭＶＡ。
８３． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、実施形態８２に記載のｒＭＶＡ。
８４． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６２～８３に記載のｒＭＶＡ。
８５． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態８４に記載のｒＭＶＡ。
８６． 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３～８５に記載のｒＭＶＡ。
８７． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、実施形態８６に記載のｒＭＶＡ。
８８． 前記異種核酸配列が配列番号２０、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
８９． 前記異種核酸配列が配列番号２０、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態８８に記載のｒＭＶＡ。
９０． 前記異種核酸配列が配列番号２４、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
９１． 前記異種核酸配列が配列番号２４、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態９０に記載のｒＭＶＡ。
９２． 前記異種核酸配列が配列番号２１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
９３． 前記異種核酸配列が配列番号２１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態９２に記載のｒＭＶＡ。
９４． 前記異種核酸配列が配列番号２５、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
９５． 前記異種核酸配列が配列番号２５、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
９６． 前記Ｓ ＲＢＤドメインが前記Ｓタンパク質に由来するシグナルペプチド及び膜貫通ペプチドを更に含む、実施形態６３～９５に記載のｒＭＶＡ。
９７． 前記Ｓシグナルペプチドが配列番号５５を含む、実施形態９６に記載のｒＭＶＡ。
９８． 前記Ｓ膜貫通ペプチドが配列番号５７を含む、実施形態９６又は９７に記載のｒＭＶＡ。
９９． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態６３～９８に記載のｒＭＶＡ。
１００． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態９９に記載のｒＭＶＡ。
１０１． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態９９に記載のｒＭＶＡ。
１０２． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態９９に記載のｒＭＶＡ。
１０３． 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、実施形態１０１に記載のｒＭＶＡ。
１０４． 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、実施形態１０２に記載のｒＭＶＡ。
１０５． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、若しくは配列番号５４を含む配列、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列から選択される、実施形態６３に記載のｒＭＶＡ。
１０６． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来するスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の直鎖状エピトープ、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、前記直鎖状ＳエピトープＲＢＤドメインが、前記Ｓタンパク質に由来するシグナルペプチド及び膜貫通ペプチドを更に含み、宿主細胞内で発現させると、前記直鎖状ＳエピトープＲＢＤドメイン、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
１０７． 前記Ｓシグナルペプチドが配列番号５５を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１０８． 前記Ｓ膜貫通ペプチドが配列番号５７を含む、実施形態１０６又は１０７に記載のｒＭＶＡ。
１０９． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１０６～１０８に記載のｒＭＶＡ。
１１０． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１０９に記載のｒＭＶＡ。
１１１． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６１のアミノ酸配列を含む、実施形態１１０に記載のｒＭＶＡ。
１１２． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６５を含む核酸、又はこれと少なくとも９５％相同な配列によってコードされる、実施形態１０６～１１０に記載のｒＭＶＡ。
１１３． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６５を含む核酸によってコードされる、実施形態１１２に記載のｒＭＶＡ。
１１４． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１０６～１０８に記載のｒＭＶＡ。
１１５． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１０８、及び１１４に記載のｒＭＶＡ。
１１６． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６２のアミノ酸配列を含む、実施形態１１５に記載のｒＭＶＡ。
１１７． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号６６、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１１４～１１７に記載のｒＭＶＡ。
１１８． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号６６を含む、実施形態１１７に記載のｒＭＶＡ。
１１９． 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１２０． 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態１１９に記載のｒＭＶＡ。
１２１． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６７のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１２２． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６７のアミノ酸配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１２３． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６８のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１２４． 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６８のアミノ酸配列を含む、実施形態１２３に記載のｒＭＶＡ。
１２５． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１２４に記載のｒＭＶＡ。
１２６． 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、実施形態１２５に記載のｒＭＶＡ。
１２７． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１２６に記載のｒＭＶＡ。
１２８． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、実施形態１２７に記載のｒＭＶＡ。
１２９． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１２８に記載のｒＭＶＡ。
１３０． 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態１２９に記載のｒＭＶＡ。
１３１． 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６～１３０に記載のｒＭＶＡ。
１３２． 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、実施形態１３１に記載のｒＭＶＡ。
１３３． 前記異種核酸配列が配列番号６１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１３４． 前記異種核酸配列が配列番号６１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１３３に記載のｒＭＶＡ。
１３５． 前記異種核酸配列が配列番号６５、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１３６． 前記異種核酸配列が配列番号６５、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態１３５に記載のｒＭＶＡ。
１３７． 前記異種核酸配列が配列番号６２、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１３８． 前記異種核酸配列が配列番号６２、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１３７に記載のｒＭＶＡ。
１３９． 前記異種核酸配列が配列番号６６、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１４０． 前記異種核酸配列が配列番号６６、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、実施形態１３９に記載のｒＭＶＡ。
１４１． 前記異種核酸配列が配列番号６７、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１４２． 前記異種核酸配列が配列番号６７、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１４１に記載のｒＭＶＡ。
１４３． 前記異種核酸配列が配列番号６８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、実施形態１０６に記載のｒＭＶＡ。
１４４． 前記異種核酸配列が配列番号６８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、実施形態１４４に記載のｒＭＶＡ。
１４５． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１０６～１４４に記載のｒＭＶＡ。
１４６． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態１４５に記載のｒＭＶＡ。
１４７． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態１４５に記載のｒＭＶＡ。
１４８． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態１４５に記載のｒＭＶＡ。
１４９． 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、実施形態１４７に記載のｒＭＶＡ。
１５０． 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、実施形態１４８に記載のｒＭＶＡ。
１５１． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、若しくは配列番号７２を含む配列、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列から選択される、実施形態１０６に記載のｒＭＢＡ。
１５２． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤドメイン由来のスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）融合ペプチドの直鎖状エピトープであって、前記融合ペプチドが、ａ）マールブルグウイルスのエンベロープ糖タンパク質シグナルペプチドと、ｂ）前記ＲＢＤドメインの直鎖状エピトープと、ｃ）エンベロープ糖タンパク質膜貫通ドメインとを含む、直鎖状エピトープ、及びｉｉ）マールブルグウイルスマトリックスタンパク質をコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記ＲＢＤ融合ペプチド及びマトリックスタンパク質が、共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
１５３． 糖タンパク質シグナルペプチドが配列番号８８のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５２に記載のｒＭＶＡ。
１５４． 前記糖タンパク質膜貫通ドメインが、配列番号９０、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５２又は１５３に記載のｒＭＶＡ。
１５５． 前記マトリックスタンパク質がＶＰ４０タンパク質である、実施形態１５２～１５４に記載のｒＭＶＡ。
１５６． 前記ＶＰ４０タンパク質が配列番号９２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５５に記載のｒＭＶＡ。
１５７． 前記ＶＰ４０タンパク質が、配列番号９３を含む核酸、又はこれと少なくとも９５％相同な配列によってコードされる、実施形態１５６に記載のｒＭＶＡ。
１５８． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１５９． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９７を含む核酸によってコードされる、実施形態１５８に記載のｒＭＶＡ。
１６０． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１６１． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号９６のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１６０に記載のｒＭＶＡ。
１６２． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９６のアミノ酸配列を含む、実施形態１６１に記載のｒＭＶＡ。
１６３． 前記ＲＢＤ融合ペプチドをコードする異種核酸配列が配列番号９８、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１６０～１６２に記載のｒＭＶＡ。
１６４． 前記ＲＢＤ融合ペプチドをコードする異種核酸配列が配列番号９８を含む、実施形態１６３に記載のｒＭＶＡ。
１６５． 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１６６． 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態１６５に記載のｒＭＶＡ。
１６７． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号９９のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１６８． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９９のアミノ酸配列を含む、実施形態１６７に記載のｒＭＶＡ。
１６９． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号１００のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
１７０． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９９のアミノ酸配列を含む、実施形態１６９に記載のｒＭＶＡ。
１７１． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１５２～１７３に記載のｒＭＶＡ。
１７２． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態１７１に記載のｒＭＶＡ。
１７３． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態１７１に記載のｒＭＶＡ。
１７４． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態１７１に記載のｒＭＶＡ。
１７５． 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、実施形態１７３に記載のｒＭＶＡ。
１７６． 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、実施形態１７４に記載のｒＭＶＡ。
１７７． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、若しくは配列番号１３８を含む配列、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列から選択される、実施形態１５２～１７６に記載のｒＭＶＡ。
１７８． 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤドメイン由来のスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）融合ペプチドの直鎖状エピトープであって、前記融合ペプチドが、ａ）前記Ｓタンパク質シグナルペプチドと、前記ＲＢＤドメインの直鎖状エピトープと、ｃ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通ドメインとを含む、直鎖状エピトープ、ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＭタンパク質、及びｉｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＥタンパク質をコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記ＲＢＤ融合ペプチド、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
１７９． シグナルペプチドが配列番号５５のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１７８に記載のｒＭＶＡ。
１８０． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
１８１． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号２０を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１８０に記載のｒＭＶＡ。
１８２． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、実施形態１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
１８３． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号２１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１８２に記載のｒＭＶＡ。
１８４． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施形態１６１に記載のｒＭＶＡ。
１８５． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５９８をコードする、実施形態１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
１８６． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１８５に記載のｒＭＶＡ。
１８７． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む、実施形態１８６に記載のｒＭＶＡ。
１８８． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５９８をコードする、実施形態１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
１８９． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１８５に記載のｒＭＶＡ。
１９０． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６２のアミノ酸配列を含む、実施形態１８９に記載のｒＭＶＡ。
１９１． 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、実施形態１７８～１９０に記載のｒＭＶＡ。
１９２． 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、実施形態１９１に記載のｒＭＶＡ。
１９３． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、実施形態１９２に記載のｒＭＶＡ。
１９４． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号３２を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１９３に記載のｒＭＶＡ。
１９５． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、実施形態１９１に記載のｒＭＶＡ。
１９６． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号３３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１９５に記載のｒＭＶＡ。
１９７． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む、実施形態１９６に記載のｒＭＶＡ。
１９８． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５９８をコードする、実施形態１９１に記載のｒＭＶＡ。
１９９． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態１９８に記載のｒＭＶＡ。
２００． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６３のアミノ酸配列を含む、実施形態１９９に記載のｒＭＶＡ。
２０１． 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５９８をコードする、実施形態１９１に記載のｒＭＶＡ。
２０２． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６４のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、実施形態２０１に記載のｒＭＶＡ。
２０３． 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６４のアミノ酸配列を含む、実施形態２０２に記載のｒＭＶＡ。
２０４． 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１７９～２０３に記載のｒＭＶＡ。
２０５． 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、実施形態２０４に記載のｒＭＶＡ。
２０６． 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、実施形態２０４に記載のｒＭＶＡ。
２０７． 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、実施形態２０４に記載のｒＭＶＡ。
２０８． 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、実施形態２０６に記載のｒＭＶＡ。
２０９． 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、実施形態２０７に記載のｒＭＶＡ。
２１０． 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が配列番号１５８、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列を含む、実施形態１７９～２０９に記載のｒＭＶＡ。
２１１． ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を低減又は予防する方法であって、有効量の実施形態１～１８１のいずれかに記載のｒＭＶＡウイルスベクターを投与することを含む、方法。
２１２． 前記ｒＭＶＡが予防的一次ワクチン接種として投与される、実施形態２１１に記載の方法。
２１３． 前記ｒＭＶＡがブーストワクチン接種として投与される、実施形態２１１に記載の方法。
２１４． 前記ヒトにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンを以前に投与したことがある、実施形態２１３に記載の方法。
２１５． 前記以前に投与されたワクチンが、ｍＲＮＡベースのワクチン、アデノウイルスワクチン、非複製ワクチン、ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチン、植物ベースのアジュバントワクチン、マルチエピトープペプチドベースのワクチン、不活化ウイルス、ペプチドワクチンから選択される、実施形態２１４に記載の方法。
２１６． 前記以前に投与されたワクチンが、ｍＲＮＡ－１２７３（ＭＯＤＥＲＮＡ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン；Moderna, Inc.）、ＡＺＤ－１２２２（ＣＯＶＩＤＳＨＩＥＬＤ；AstraZeneca及びオックスフォード大学）、ＢＮＴ１６２（ＣＯＭＩＲＮＡＴＹ；Pfizer及びBioNTech）、Ｓｐｕｔｎｉｋ Ｖ（Gamaleya Research Institute、Acellena Contract Drug Research and Development）、ＣｏｒｏｎａＶａｃ（Sinovac）、ＮＶＸ－ＣｏＶ ２３７２（NovoVax）、ＳＣＢ－２０１９（Sanofi及びGSK）、ＺｙＣｏＶ－Ｄ（Zydus Cadila）、ＢＢＩＢＰ－ＣｏｒＶ（Beijing Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group（Sinopharm））、ＥｐｉＶａｃＣｏｒｏｎａ（Federal Budgetary Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology）、Ｃｏｎｖｉｄｉｃｅａ（CanSino Biologics）、Ｃｏｖｉｄ－１９ワクチン（Wuhan Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group （Sinopharm））、ＪＮＪ－７８４３６７３５（Johnson & Johnson）、ＺＦ２００１（Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical, Institute of Microbiology of the Chinese Academy of Sciences）、ＣＶｎＣｏＶ（CureVac；GSK）、ＩＮＯ－４８００（Inovio Pharmaceuticals）、ＶＩＲ－７８３１（Medicago；GSK；Dynavax）、Ｃｏｖｉｄ－１９アデノウイルスベースワクチン（ImmunityBio；NantKwest）、ＵＢ－６１２（COVAXX）、又はＣｏＶａｘｉｎ（Bharat Biotech）から選択される、実施形態２１４に記載の方法。
２１７． 前記ヒトが以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したことがある、実施形態２１３に記載の方法。
２１８． 前記ｒＭＶＡがプライムワクチン及びブーストワクチンの両方として投与される、実施形態２１１に記載の方法。
２１９． 前記ｒＭＶＡがブーストワクチンとして２回以上投与される、実施形態２１３～２１６に記載の方法。
２２０． 前記ｒＭＶＡブーストが、前記プライムワクチン接種の４週間以上後に投与される、実施形態２１６に記載の方法。
特許請求の範囲の発明は、以下の非限定的な実施例によって更に説明される。上記の開示及び限定ではなく説明のために含まれる以下の実験的例示に鑑み、また添付の図を参照すれば、本発明の更なる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。
実施例１：Ｓタンパク質－Ｅ－Ｍ ｒＭＶＡウイルスベクターＧＥＯ－ＣＭ０１の構築
組換えＭＶＡワクチン候補（ＧＥＯ－ＣＭ０１）は、ＣＯＶＩＤ－１９武漢海鮮市場肺炎ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＴ０３９８８８．１）からのＳタンパク質、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質を使用して構築した。２つのワクシニア遺伝子Ａ５ＲとＡ６Ｌとの間の挿入のためｐＡＤ－１／Ｓ－ＭＥシャトルベクター（図２４）を用いて、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ：National Institute of Allergy and Infectious Diseases）、ウイルス疾患研究室（ＬＶＤ）のBernard Moss博士によって開発された親弱毒株改変ワクシニア・アンカラ、ＭＶＡ１９７４／ＮＩＨクローン１（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ－５０９５）に配列番号１５６を挿入した。ｐＡＤ－１／Ｓ－ＭＥシャトルベクターは、ｐＡＤ－１／ｐＵＣ５７シャトルベクター（図２６）から導出された。挿入された配列はＭＶＡ用に最適化されたコドンであった。ホモポリマー配列（＞４Ｇ／Ｃ及び＞４Ａ／Ｔ）を中断するためにサイレント変異が導入され、これはフレームシフトにつながる可能性のあるＲＮＡポリメラーゼエラーを減少させる。ワクシニア特異的ターミネーターについて配列を編集し、未成熟終止につながる可能性のあるモチーフを除去した。Ｓインサート及びＭインサートの転写を駆動するために改変Ｈ５初期／後期プロモーターを使用し、Ｅインサートの転写を駆動するためにｐ１１プロモーターを使用した。ｒＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞における相同組換え及び連続プラーク精製によって作製した。簡潔には、ｐＡＤ－１／Ｓ－ＭＥを、親ＭＶＡに感染した初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞にトランスフェクトした。組換えウイルスを上清及び溶解液から取得し、次いで、レポーター遺伝子スクリーニングを用いて複数回のプラーク精製に供した。
組換えＭＶＡワクチン候補（ＧＥＯ－ＣＭ０１）は、ＣＯＶＩＤ－１９武漢海鮮市場肺炎ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＴ０３９８８８．１）からのＳタンパク質、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質を使用して構築した。２つのワクシニア遺伝子Ａ５ＲとＡ６Ｌとの間の挿入のためｐＡＤ－１／Ｓ－ＭＥシャトルベクター（図２４）を用いて、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ：National Institute of Allergy and Infectious Diseases）、ウイルス疾患研究室（ＬＶＤ）のBernard Moss博士によって開発された親弱毒株改変ワクシニア・アンカラ、ＭＶＡ１９７４／ＮＩＨクローン１（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ－５０９５）に配列番号１５６を挿入した。ｐＡＤ－１／Ｓ－ＭＥシャトルベクターは、ｐＡＤ－１／ｐＵＣ５７シャトルベクター（図２６）から導出された。挿入された配列はＭＶＡ用に最適化されたコドンであった。ホモポリマー配列（＞４Ｇ／Ｃ及び＞４Ａ／Ｔ）を中断するためにサイレント変異が導入され、これはフレームシフトにつながる可能性のあるＲＮＡポリメラーゼエラーを減少させる。ワクシニア特異的ターミネーターについて配列を編集し、未成熟終止につながる可能性のあるモチーフを除去した。Ｓインサート及びＭインサートの転写を駆動するために改変Ｈ５初期／後期プロモーターを使用し、Ｅインサートの転写を駆動するためにｐ１１プロモーターを使用した。ｒＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞における相同組換え及び連続プラーク精製によって作製した。簡潔には、ｐＡＤ－１／Ｓ－ＭＥを、親ＭＶＡに感染した初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞にトランスフェクトした。組換えウイルスを上清及び溶解液から取得し、次いで、レポーター遺伝子スクリーニングを用いて複数回のプラーク精製に供した。
親株への配列番号１５６の挿入を検証するために、Ｓタンパク質を発現する核酸配列のＰＣＲ増幅を行った。１０ｍＭのプライマー：フォワードプライマーｐ５５（５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＧＣＧＡＴＧ－３’）（配列番号１５１）及びリバースプライマーｐ５４（５’－ＣＧＡＴＧＧＴＡＧＧＴＣＡＧＡＴＴＧＴＣＣ－３’）（配列番号１５２）を含む２５μｌの反応液中で、ＧＥＯ－ＣＭ０１（陽性対照）、ＧＥＯ－ＣＭ０１、ＭＶＡ親（陰性対照）の生成に使用したシャトルプラスミドｐＡＤ－１／Ｓ－ＭＥからの５０ｎｇのＤＮＡを用いて、抗原インサートを増幅した。エチジウムブロマイドで染色した１％アガロースゲル上に１０μｌのＰＣＲ反応物をロードすることによって反応を可視化した。図１７及び図１８に示すように、ＧＥＯ－ＣＭ０１ ｒＭＶＡのＰＣＲによって、適切なシグナル（５３８４塩基対）が発生した。
ＳＭＥ ＶＬＰの発現を検証するために、ＣＥＦ細胞をＧＥＯ－ＣＭ０１に感染させ、４８時間後に免疫細胞化学によって分析した。簡潔には、細胞を１：１メタノール：アセトンで固定し、一次マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体（GeneTex ＃ＧＴＸ６３２６０４）及び二次抗マウスＨＲＰで染色し、プラークの比色読み出しを媒介するＡＥＣペルオキシダーゼ基質で発色させた。陽性染色プラークが同定された（図１６を参照されたい）。
ＧＥＯ－ＣＭ０１における抗原発現を更に確認するため、ＧＥＯ－ＣＭ０１抗原発現のウェスタンブロット分析を行った。ＤＦ１細胞にＧＥＯ－ＣＭ０１又はＭＶＡ親を低ｍ．ｏ．ｉ．（０．５）で感染させた。感染の２日後、細胞溶解液及び上清を採取し、等量をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク／ＲＢＤ（ウサギ）抗体（Sino Biologicals、＃４０５９２－Ｔ６２）及び二次抗ウサギＩｇＧでプローブした（図１９）。膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナーで可視化した。図１９に示すように、ＧＥＯ－ＣＭ０１感染のＤＦ１細胞溶解液及び上清はスパイクタンパク質の発現を示す。
ＧＥＯ－ＣＭ０１に感染していたＤＦ１細胞におけるウイルス様粒子形成の電子顕微鏡（ＥＭ）画像を撮影した（図２０）。
実施例２－ＧＥＯ－ＣＭ０１を使用した動物保護チャレンジ
ハムスターモデルを用いてＧＥＯ－ＣＭ０１の初期の前臨床有効性を決定した。研究は、国立研究評議会の実験動物の世話及び使用のためのガイド（the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Research Council）に記載されている勧告に厳密に従って実施された。動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が行われ、潜在的な痛みを伴う全ての処置を適切な麻酔薬又は鎮痛薬を用いて行った。使用されたハムスターの数は、ウイルス学的及び免疫学的転帰の統計的分析に基づいて科学的に正当化された。
ハムスターモデルを用いてＧＥＯ－ＣＭ０１の初期の前臨床有効性を決定した。研究は、国立研究評議会の実験動物の世話及び使用のためのガイド（the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Research Council）に記載されている勧告に厳密に従って実施された。動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が行われ、潜在的な痛みを伴う全ての処置を適切な麻酔薬又は鎮痛薬を用いて行った。使用されたハムスターの数は、ウイルス学的及び免疫学的転帰の統計的分析に基づいて科学的に正当化された。
生後７週間の雌性ゴールデンシリアンハムスター（Envigo）を、免疫と採血の前に５％イソフルランで麻酔し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの前にケタミン／キシラジンで麻酔をかけた。ハムスター（１群あたりＮ＝１０）に、ＭＶＡ－ＳＭＥワクチン（ＧＥＯ－ＣＭ０１）を２９日間隔で１回又は２回、筋肉内経路（後肢あたり５０μｌとして１００μｌ送達）を介して動物あたり１０８ＴＣＩＤ５０の用量でワクチン接種し、一方、対照群には生理食塩水を与えた。大静脈採血は、最初の免疫の４日前及び免疫後２７日目（２７日目及び５６日目）に行った。５９日目に、ワクチン接種した動物及び対照動物を、目標用量１０５ＰＦＵの５継代目の分離株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０に鼻腔内曝露した。動物を、体重減少及び疾患の徴候について毎日モニターした。各群の５匹の動物を、ウイルス量を決定するため、チャレンジの３日後に注射用麻酔薬（ケタミン／キシラジン）の過剰摂取によって安楽死させた。残りの動物は、ケタミン／キシラジンの過剰摂取により感染後１４日目に安楽死させた。
動物から採取した血清を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和能について試験した。簡潔には、血清試料を熱不活化（５６℃で３０分）した。１０倍希釈した血清を更に２倍段階希釈し、６０μｌの各血清希釈液を６０μｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｍＮＧ（２００ＰＦＵ）と混合した。血清／ウイルス混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、１００μｌの血清／ウイルス混合物を、黒色の平底９６ウェルプレート内のＶｅｒｏ Ｅ６細胞単層に移し、３７℃で２日間インキュベートした。ウイルス蛍光を、４８８ｎｍでＣｙｔａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅリーダー（Biotek Instruments）で測定した。中和を誘導するＧＥＯ－ＣＭ０１の能力の結果を図２１及び図２２に示す。結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プラーク形成の５０％の減少があった希釈を実証する（図２１）。プライム／ブースト用量のＧＥＯ－ＣＭ０１を与えた動物の半数は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する抗体を生成し、ゴールデンハムスターモデルにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を惹起するＧＥＯ－ＣＭ０１の能力を示した。
ＧＥＯ－ＣＭ０１免疫動物からの血清を、組換えスパイク－膜（Ｓ－Ｍ）融合タンパク質、スパイク（Ｓ）タンパク質及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）タンパク質に特異的な抗体のレベルについてＥＬＩＳＡによって分析した（図２２）。単回投与免疫（２７日目）に続いて、Ｓ－Ｍ、Ｓ及びＲＢＤに対する検出可能なレベルの抗体が観察される。プライム－ブーストワクチン接種後に、これらのタンパク質への結合抗体レベルの更なる増加が観察され、ＧＥＯ－ＣＭ０１がゴールデンハムスターモデルにおいてスパイクタンパク質（ＲＢＤを含む）及び膜タンパク質に対して堅牢な抗体を誘導することを示している。
動物を単回投与レジメン又はプライム－ブーストレジメンでワクチン接種し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジし、次いで罹患率についてモニターした。体重及び健康スコアは、チャレンジ後に毎日記録した（図２３）。単回投与免疫は、臨床疾患及び体重減少から動物を僅かに保護するのに対し、プライム－ブースト免疫は、臨床疾患からの完全な保護を提供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後の体重減少を有意に減少させ、ＧＥＯ－ＣＭ０１によるワクチン接種は罹患率を大幅に低下させ、ゴールデンハムスターモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後の疾患から動物を保護することを示す。
実施例３－安定化Ｓタンパク質－Ｅ－Ｍ ｒＭＶＡウイルスベクターＧＥＯ－ＣＭ０２の構築
組換えＭＶＡワクチン候補（ＧＥＯ－ＣＭ０２）は、ＣＯＶＩＤ－１９武漢海鮮市場肺炎ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＴ０３９８８８．１）からの安定化Ｓタンパク質及びＭタンパク質及びＥタンパク質を使用して構築した。２つのワクシニア遺伝子Ａ５ＲとＡ６Ｌとの間の挿入のためｐＡＤ－１／ｓＳ－ＭＥシャトルベクター（図２５）を用いて、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、ウイルス疾患研究室（ＬＶＤ）のBernard Moss博士によって開発された親弱毒株改変ワクシニア・アンカラ、ＭＶＡ１９７４／ＮＩＨクローン１（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ－５０９５）に配列番号１５７を挿入した。ｐＡＤ－１／ｓＳ－ＭＥシャトルベクターは、ｐＡＤ－１／ｐＵＣ５７シャトルベクター（図２６）から導出された。挿入された配列はＭＶＡ用に最適化されたコドンであった。ホモポリマー配列（＞４Ｇ／Ｃ及び＞４Ａ／Ｔ）を中断するためにサイレント変異が導入され、これはフレームシフトにつながる可能性のあるＲＮＡポリメラーゼエラーを減少させる。ワクシニア特異的ターミネーターについて配列を編集し、未成熟終止につながる可能性のあるモチーフを除去した。Ｓインサート及びＭインサートの転写を駆動するために改変Ｈ５初期／後期プロモーターを使用し、Ｅインサートの転写を駆動するためにｐ１１プロモーターを使用した。ｒＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞における相同組換え及び連続プラーク精製によって作製した。簡潔には、ｐＡＤ－１／ｓＳ－ＭＥを、親ＭＶＡに感染した初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞にトランスフェクトした。組換えウイルスを上清及び溶解液から取得し、次いで、レポーター遺伝子スクリーニングを用いて複数回のプラーク精製に供した。
組換えＭＶＡワクチン候補（ＧＥＯ－ＣＭ０２）は、ＣＯＶＩＤ－１９武漢海鮮市場肺炎ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＴ０３９８８８．１）からの安定化Ｓタンパク質及びＭタンパク質及びＥタンパク質を使用して構築した。２つのワクシニア遺伝子Ａ５ＲとＡ６Ｌとの間の挿入のためｐＡＤ－１／ｓＳ－ＭＥシャトルベクター（図２５）を用いて、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、ウイルス疾患研究室（ＬＶＤ）のBernard Moss博士によって開発された親弱毒株改変ワクシニア・アンカラ、ＭＶＡ１９７４／ＮＩＨクローン１（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ－５０９５）に配列番号１５７を挿入した。ｐＡＤ－１／ｓＳ－ＭＥシャトルベクターは、ｐＡＤ－１／ｐＵＣ５７シャトルベクター（図２６）から導出された。挿入された配列はＭＶＡ用に最適化されたコドンであった。ホモポリマー配列（＞４Ｇ／Ｃ及び＞４Ａ／Ｔ）を中断するためにサイレント変異が導入され、これはフレームシフトにつながる可能性のあるＲＮＡポリメラーゼエラーを減少させる。ワクシニア特異的ターミネーターについて配列を編集し、未成熟終止につながる可能性のあるモチーフを除去した。Ｓインサート及びＭインサートの転写を駆動するために改変Ｈ５初期／後期プロモーターを使用し、Ｅインサートの転写を駆動するためにｐ１１プロモーターを使用した。ｒＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞における相同組換え及び連続プラーク精製によって作製した。簡潔には、ｐＡＤ－１／ｓＳ－ＭＥを、親ＭＶＡに感染した初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞にトランスフェクトした。組換えウイルスを上清及び溶解液から取得し、次いで、レポーター遺伝子スクリーニングを用いて複数回のプラーク精製に供した。
親株への配列番号１５７の挿入を検証するために、安定化Ｓタンパク質を発現する核酸配列のＰＣＲ増幅を行った。１０ｍＭのプライマー：フォワードプライマーｐ５５（５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＧＣＧＡＴＧ－３’）（配列番号１５１）及びリバースプライマーｐ５４（５’－ＣＧＡＴＧＧＴＡＧＧＴＣＡＧＡＴＴＧＴＣＣ－３’）（配列番号１５２）を含む２５μｌの反応液中で、ＧＥＯ－ＣＭ０２（陽性対照）、ＧＥＯ－ＣＭ０２、ＭＶＡ親（陰性対照）の生成に使用したシャトルプラスミドｐＡＤ－１／ｓＳ－ＭＥからの５０ｎｇのＤＮＡを用いて、抗原インサートを増幅した。エチジウムブロマイドで染色した１％アガロースゲル上に１０μｌのＰＣＲ反応物をロードすることによって反応を可視化した。図１８及び図３１に示すように、ＧＥＯ－ＣＭ０２ ｒＭＶＡのＰＣＲによって、適切なシグナル（５３８４塩基対）が発生した。
ＧＥＯ－ＣＭ０２における抗原発現を更に確認するため、ＧＥＯ－ＣＭ０２抗原発現のウェスタンブロット分析を行った。ＤＦ１細胞にＧＥＯ－ＣＭ０２又はＭＶＡ親を低ｍ．ｏ．ｉ．（０．５）で感染させた。感染の２日後、細胞溶解液及び上清を採取し、等量をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク／ＲＢＤ（ウサギ）抗体（Sino Biologicals、＃４０５９２－Ｔ６２）及び二次抗ウサギＩｇＧでプローブした（図２０）。
実施例４－ＧＥＯ－ＣＭ０２を使用した動物保護チャレンジ
ハムスターモデルを用いてＧＥＯ－ＣＭ０２の初期の前臨床有効性を決定する。
ハムスターモデルを用いてＧＥＯ－ＣＭ０２の初期の前臨床有効性を決定する。
０日目及び２９日目（プライム／ブースト群）又は２９日目のみ（プライム群）に１０８ＰＦＵのＧＥＯ－ＣＭ０２を用いて、ハムスターに筋肉内免疫を最初に行った。５９日目に、ハムスターにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内投与する。１つのハムスターの群をチャレンジ後３日目（６２日目）に屠殺し、１つの群をチャレンジ後１４日目（７３日目）に屠殺する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体をＥＬＩＳＡで分析し、抗体の中和能を決定する。組織病理学及びウイルス量の検査用に肺を採取する。
実施例５－ＳＰ－ＲＢＤ－Ｅ／Ｍ ｒＭＶＡウイルスベクターの構築
組換えＭＶＡワクチン候補（ＧＥＯ－ＣＭ０３）は、ＣＯＶＩＤ－１９武漢海鮮市場肺炎ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＴ０３９８８８．１）からのＳタンパク質のＲＢＤ配列（ａａ３２７～５２７）、Ｍタンパク質及びＥタンパク質を使用して構築した。ＲＢＤ配列は、そのＮ末端でＳタンパク質のシグナルペプチドに隣接し、そのカルボキシ末端でＳタンパク質の膜貫通領域に隣接するため、発現時に、ＶＬＰ表面にＲＢＤを提示するＶＬＰの形成を可能にした。２つのワクシニア遺伝子Ａ５ＲとＡ６Ｌとの間の挿入のためｐＡＤ－１／ＳＰ－ＲＢＤ－ＴＭ／Ｅ／Ｍシャトルベクターを用いて、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、ウイルス疾患研究室（ＬＶＤ）のBernard Moss博士によって開発された親弱毒株改変ワクシニア・アンカラ、ＭＶＡ１９７４／ＮＩＨクローン１（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ－５０９５）に配列番号１５８を挿入した。ｐＡＤ－１／ＳＰ－ＲＢＤ／Ｅ／Ｍシャトルベクターは、ｐＡＤ－１／ｐＵＣ５７シャトルベクター（図２６）から導出された。挿入された配列はＭＶＡ用に最適化されたコドンであった。ホモポリマー配列（＞４Ｇ／Ｃ及び＞４Ａ／Ｔ）を中断するためにサイレント変異が導入され、これはフレームシフトにつながる可能性のあるＲＮＡポリメラーゼエラーを減少させる。ワクシニア特異的ターミネーターについて配列を編集し、未成熟終止につながる可能性のあるモチーフを除去した。ＳＰ－ＲＢＤ融合インサート及びＭインサートの転写を駆動するために改変Ｈ５初期／後期プロモーターを使用し、Ｅインサートの転写を駆動するためにｐ１１プロモーターを使用した。ｒＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞における相同組換え及び連続プラーク精製によって作製した。簡潔には、ｐＡＤ－１／ＳＰ－ＲＢＤ－Ｅ／Ｍを、親ＭＶＡに感染した初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞にトランスフェクトした。組換えウイルスを上清及び溶解液から取得し、次いで、レポーター遺伝子スクリーニングを用いて複数回のプラーク精製に供した。
組換えＭＶＡワクチン候補（ＧＥＯ－ＣＭ０３）は、ＣＯＶＩＤ－１９武漢海鮮市場肺炎ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＴ０３９８８８．１）からのＳタンパク質のＲＢＤ配列（ａａ３２７～５２７）、Ｍタンパク質及びＥタンパク質を使用して構築した。ＲＢＤ配列は、そのＮ末端でＳタンパク質のシグナルペプチドに隣接し、そのカルボキシ末端でＳタンパク質の膜貫通領域に隣接するため、発現時に、ＶＬＰ表面にＲＢＤを提示するＶＬＰの形成を可能にした。２つのワクシニア遺伝子Ａ５ＲとＡ６Ｌとの間の挿入のためｐＡＤ－１／ＳＰ－ＲＢＤ－ＴＭ／Ｅ／Ｍシャトルベクターを用いて、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、ウイルス疾患研究室（ＬＶＤ）のBernard Moss博士によって開発された親弱毒株改変ワクシニア・アンカラ、ＭＶＡ１９７４／ＮＩＨクローン１（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ－５０９５）に配列番号１５８を挿入した。ｐＡＤ－１／ＳＰ－ＲＢＤ／Ｅ／Ｍシャトルベクターは、ｐＡＤ－１／ｐＵＣ５７シャトルベクター（図２６）から導出された。挿入された配列はＭＶＡ用に最適化されたコドンであった。ホモポリマー配列（＞４Ｇ／Ｃ及び＞４Ａ／Ｔ）を中断するためにサイレント変異が導入され、これはフレームシフトにつながる可能性のあるＲＮＡポリメラーゼエラーを減少させる。ワクシニア特異的ターミネーターについて配列を編集し、未成熟終止につながる可能性のあるモチーフを除去した。ＳＰ－ＲＢＤ融合インサート及びＭインサートの転写を駆動するために改変Ｈ５初期／後期プロモーターを使用し、Ｅインサートの転写を駆動するためにｐ１１プロモーターを使用した。ｒＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞における相同組換え及び連続プラーク精製によって作製した。簡潔には、ｐＡＤ－１／ＳＰ－ＲＢＤ－Ｅ／Ｍを、親ＭＶＡに感染した初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞にトランスフェクトした。組換えウイルスを上清及び溶解液から取得し、次いで、レポーター遺伝子スクリーニングを用いて複数回のプラーク精製に供した。
親株への配列番号１５８の挿入を検証するために、ＲＢＤインサートを発現する核酸配列のＰＣＲ増幅を行った。１０ｍＭのプライマー：フォワードプライマーｐ５５（５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＧＣＧＡＴＧ－３’）（配列番号１５１）及びリバースプライマーｐ５４（５’－ＣＧＡＴＧＧＴＡＧＧＴＣＡＧＡＴＴＧＴＣＣ－３’）（配列番号１５２）を含む２５μｌの反応液中で、ＧＥＯ－ＣＭ０３（陽性対照）、ＧＥＯ－ＣＭ０３、ＭＶＡ親（陰性対照）の生成に使用したシャトルプラスミドからの５０ｎｇのＤＮＡを用いて、抗原インサートを増幅した。エチジウムブロマイドで染色した１％アガロースゲル上に１０μｌのＰＣＲ反応物をロードすることによって反応を可視化した。図１８及び図３１に示すように、ＧＥＯ－ＣＭ０３ ｒＭＶＡのＰＣＲは、適切なシグナル（２４２２塩基対）を生成した。
ＧＥＯ－ＣＭ０３における抗原発現を更に確認するため、ＧＥＯ－ＣＭ０３抗原発現のウェスタンブロット分析を行った。ＤＦ１細胞にＧＥＯ－ＣＭ０３又はＭＶＡ親を低ｍ．ｏ．ｉ．（０．５）で感染させた。感染の２日後、細胞溶解液及び上清を採取し、等量をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク／ＲＢＤ（ウサギ）抗体（Sino Biologicals、＃４０５９２－Ｔ６２）及び二次抗ウサギＩｇＧでプローブした（図２０）。
実施例６－ＧＥＯ－ＣＭ０３を使用した動物保護チャレンジ
ハムスターモデルを用いてＧＥＯ－ＣＭ０３の初期の前臨床有効性を決定する。
ハムスターモデルを用いてＧＥＯ－ＣＭ０３の初期の前臨床有効性を決定する。
０日目及び２９日目（プライム／ブースト群）又は２９日目のみ（プライム群）に１０８ＰＦＵのＧＥＯ－ＣＭ０２を用いて、ハムスターに筋肉内免疫を最初に行った。５９日目に、ハムスターにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内投与した。１つのハムスターの群をチャレンジ後３日目（６２日目）に屠殺し、１つの群をチャレンジ後１４日目（７３日目）に屠殺する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体をＥＬＩＳＡで分析し、抗体の中和能を決定する。組織病理学及びウイルス量の検査用に肺を採取する。
実施例７－ＭａｒｖＧＰ－ＲＢＤ及びＭＡＲＶ ＶＰ４０ ｒＭＶＡウイルスベクターの構築
組換えＭＶＡワクチン候補（ＧＥＯ－ＣＭ０３ｂ）は、ＣＯＶＩＤ－１９武漢海鮮市場肺炎ウイルス（アクセッション番号ＭＴ０３９８８８．１）及びマールブルクウイルス（ＭＡＲＶ）（マールブルグウイルス分離株ＭＡＲＶ／Ｈ．サピエンス－ｔｃ／ＣＯＤ／２０００／２４ ＤＲＣ（アクセッションＪＸ４５８８３４））からの配列を用いて構築した。国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、ウイルス疾患研究室（ＬＶＤ）のBernard Moss博士によって開発された親弱毒株改変ワクシニア・アンカラ、ＭＶＡ１９７４／ＮＩＨクローン１（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ－５０９５）に配列番号１３４を挿入した。
組換えＭＶＡワクチン候補（ＧＥＯ－ＣＭ０３ｂ）は、ＣＯＶＩＤ－１９武漢海鮮市場肺炎ウイルス（アクセッション番号ＭＴ０３９８８８．１）及びマールブルクウイルス（ＭＡＲＶ）（マールブルグウイルス分離株ＭＡＲＶ／Ｈ．サピエンス－ｔｃ／ＣＯＤ／２０００／２４ ＤＲＣ（アクセッションＪＸ４５８８３４））からの配列を用いて構築した。国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、ウイルス疾患研究室（ＬＶＤ）のBernard Moss博士によって開発された親弱毒株改変ワクシニア・アンカラ、ＭＶＡ１９７４／ＮＩＨクローン１（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ－５０９５）に配列番号１３４を挿入した。
ＣＯＶＩＤ－１９スパイク遺伝子受容体結合ドメインを、アミノ末端のマールブルグウイルス糖タンパク質のシグナル配列とカルボキシ末端のマールブルグウイルス糖タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部との間で融合させた（ＳｉｇｎａｌＭＡＲＶ－ＲＢＤＣＯＶＩＤ－ＴＭＭＡＲＶ）。２つの必須ワクシニア遺伝子Ａ５ＲとＡ６Ｌとの間に挿入するため、ＳｉｇｎａｌＭＡＲＶ－ＲＢＤＣＯＶＩＤ－ＴＭＭＡＲＶをｐＬＷ７６シャトルベクターにサブクローニングした。２つの必須ワクシニア遺伝子Ａ５０ＲとＢ１Ｒとの間に挿入するため、ＭＡＲＶマトリックスタンパク質（配列番号９２）であるＶＰ４０をｐＡＤ２／６７シャトルベクターにサブクローニングした。挿入された配列はＭＶＡ用に最適化されたコドンであった（配列番号９４）。ホモポリマー配列（＞４Ｇ／Ｃ及び＞４Ａ／Ｔ）を中断するためにサイレント変異が導入され、これはフレームシフトにつながる可能性のあるＲＮＡポリメラーゼエラーを減少させる。ワクシニア特異的ターミネーターについて配列を編集し、未成熟終止につながる可能性のあるモチーフを除去した。改変されたＨ５早期／後期プロモーターを、遺伝子インサートの転写を駆動するために使用した。組換え体は、相同組換え及び連続プラーク精製によって作製した。簡潔には、組換えプラスミドを、親ＭＶＡに感染した初代ニワトリ胚線維芽細胞にトランスフェクトした。組換えウイルスを上清及び溶解液から取得し、次いで、レポーター遺伝子スクリーニングを用いて複数回のプラーク精製に供した。
親株への配列番号１３４の挿入を検証するために、ＲＢＤインサートを発現する核酸配列のＰＣＲ増幅を行った。１０ｍＭのプライマー：フォワードプライマーｐ５５（５’－ＡＧＡＴＣＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＧＣＧＡＴＧ－３’）（配列番号１５１）及びリバースプライマーｐ５４（５’－ＣＧＡＴＧＧＴＡＧＧＴＣＡＧＡＴＴＧＴＣＣ－３’）（配列番号１５２）又はフォワードプライマーｐ５３（５’－ＣＡＧＡＡＧＴＴＡＡＴＡＡＧＣＧＴＡＴＡＧＣＣＡＴＣ－３’）（配列番号１５３）及びリバースプライマーｐ５４を含む２５μｌの反応液中で、ＧＥＯ－ＣＭ０３ｂ（陽性対照）、ＧＥＯ－ＣＭ０３ｂ、ＭＶＡ親（陰性対照）の生成に使用したシャトルプラスミドＭＴＲＤＢからの５０ｎｇのＤＮＡを用いて、抗原インサートを増幅した。エチジウムブロマイドで染色した１％アガロースゲル上に１０μｌのＰＣＲ反応物をロードすることによって反応を可視化した。図２８に示すように、ＧＥＯ－ＣＭ０３ｂ ｒＭＶＡのＰＣＲによって適切なシグナルが発生した（ｐ５４／ｐ５５－１２８８塩基対；ｐ５４／ｐ５３－１５５８塩基対－中央の２つの矢印を参照されたい）。
Claims (220)
- 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来するスパイク（Ｓ）タンパク質、ペプチドフラグメント又はその変異体、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記Ｓタンパク質、ペプチドフラグメント又はその変異体、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
- 前記異種核酸配列が全長Ｓタンパク質をコードする、請求項１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長Ｓタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１又は２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長Ｓタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号３、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１又は２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号３を含む、請求項５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長Ｓタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１又は２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長Ｓタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１～８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１～１０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、請求項１１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１～１２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１～１４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、請求項１５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号３、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号３、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、請求項１９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項２１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質が、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～２２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質がアミノ酸置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、請求項２３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～２４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、請求項２５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、請求項２６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、請求項２６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５４である、請求項２７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５５である、請求項２８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が配列番号４６、配列番号４７、配列番号１５６から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載のｒＭＶＡ。
- 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来する安定化スパイク（Ｓ）タンパク質、ペプチドフラグメント又はその変異体、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記安定化Ｓタンパク質、ペプチドフラグメント又はその変異体、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
- 前記異種核酸配列が全長安定化Ｓタンパク質をコードする、請求項３２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号８のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項３２又は３３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記安定化Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号１０、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項３２又は３３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長安定化Ｓタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号１０を含む、請求項３６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号１１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項３２又は３３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記全長安定化Ｓタンパク質が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項３２～３９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項３２～４１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、請求項４２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項３２～４３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項３２～４５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、請求項４６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項３２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項４８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号１０、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項３２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号１０、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、請求項５０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号１１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項３２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号１１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項５２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項３２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、請求項５４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３２～５５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、請求項５６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、請求項５６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、請求項５６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５４である、請求項５８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５５である、請求項５９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６０、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列を含む核酸配列から選択される、請求項３２に記載のｒＭＶＡ。
- 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来するスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の直鎖状エピトープ、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記直鎖状エピトープ、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３又は６４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２４、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３～６６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２４を含む、請求項６７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３又は６９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３又は６９～７１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号２５を含む、請求項７２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、請求項７４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３～７９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３～８１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、請求項８２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６２～８３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３～８５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、請求項８６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号２０、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号２０、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項８８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号２４、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号２４、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、請求項９０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号２１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号２１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項９２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号２５、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号２５、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓ ＲＢＤドメインが前記Ｓタンパク質に由来するシグナルペプチド及び膜貫通ペプチドを更に含む、請求項６３～９５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓシグナルペプチドが配列番号５５を含む、請求項９６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓ膜貫通ペプチドが配列番号５７を含む、請求項９６又は９７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項６３～９８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、請求項９９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、請求項９９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、請求項９９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、請求項１０１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、請求項１０２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、若しくは配列番号５４を含む配列、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列から選択される、請求項６３に記載のｒＭＶＡ。
- 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に由来するスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の直鎖状エピトープ、膜（Ｍ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含み、前記直鎖状ＳエピトープＲＢＤドメインが、前記Ｓタンパク質に由来するシグナルペプチド及び膜貫通ペプチドを更に含み、宿主細胞内で発現させると、前記直鎖状ＳエピトープＲＢＤドメイン、Ｍタンパク質、及びＥタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
- 前記Ｓシグナルペプチドが配列番号５５を含む、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓ膜貫通ペプチドが配列番号５７を含む、請求項１０６又は１０７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、請求項１０６～１０８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６～１０９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６１のアミノ酸配列を含む、請求項１１０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６５を含む核酸、又はこれと少なくとも９５％相同な配列によってコードされる、請求項１０６～１１０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６５を含む核酸によってコードされる、請求項１１２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、請求項１０６～１０８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６～１０８、及び１１４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６２のアミノ酸配列を含む、請求項１１５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号６６、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１１４～１１７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤをコードする異種核酸配列が配列番号６６を含む、請求項１１７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、請求項１１９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６７のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６７のアミノ酸配列を含む、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが、配列番号６８のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質ＲＢＤが配列番号６８のアミノ酸配列を含む、請求項１２３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６～１２４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６～１２６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４２を含む、請求項１２７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６～１２８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項１２９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｍタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６～１３０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｅタンパク質をコードする異種核酸配列が配列番号４５を含む、請求項１３１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６１、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１３３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６５、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６５、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、請求項１３５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６２、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６２、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１３７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６６、配列番号４２、及び配列番号４５、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６６、配列番号４２、及び配列番号４５を含む、請求項１３９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６７、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６７、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１４１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列をコードする、請求項１０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が配列番号６８、配列番号４０、及び配列番号４３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１４４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１０６～１４４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、請求項１４５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、請求項１４５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、請求項１４５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、請求項１４７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、請求項１４８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、若しくは配列番号７２を含む配列、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列から選択される、請求項１０６に記載のｒＭＢＡ。
- 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤドメイン由来のスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）融合ペプチドの直鎖状エピトープであって、前記融合ペプチドが、ａ）マールブルグウイルスのエンベロープ糖タンパク質シグナルペプチドと、ｂ）前記ＲＢＤドメインの直鎖状エピトープと、ｃ）エンベロープ糖タンパク質膜貫通ドメインとを含む、直鎖状エピトープ、及びｉｉ）マールブルグウイルスマトリックスタンパク質をコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記ＲＢＤ融合ペプチド及びマトリックスタンパク質が、共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
- 糖タンパク質シグナルペプチドが配列番号８８のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１５２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記糖タンパク質膜貫通ドメインが、配列番号９０、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１５２又は１５３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記マトリックスタンパク質がＶＰ４０タンパク質である、請求項１５２～１５４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＶＰ４０タンパク質が配列番号９２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１５５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＶＰ４０タンパク質が、配列番号９３を含む核酸、又はこれと少なくとも９５％相同な配列によってコードされる、請求項１５６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、請求項１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９７を含む核酸によってコードされる、請求項１５８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、請求項１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号９６のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１６０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９６のアミノ酸配列を含む、請求項１６１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドをコードする異種核酸配列が配列番号９８、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１６０～１６２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドをコードする異種核酸配列が配列番号９８を含む、請求項１６３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、請求項１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、請求項１６５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号９９のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９９のアミノ酸配列を含む、請求項１６７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号１００のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１５２～１５７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号９９のアミノ酸配列を含む、請求項１６９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１５２～１７３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、請求項１７１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、請求項１７１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、請求項１７１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、請求項１７３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、請求項１７４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、若しくは配列番号１３８を含む配列、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列から選択される、請求項１５２～１７６に記載のｒＭＶＡ。
- 組換え改変ワクシニア・アンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスベクターであって、ポックスウイルス発現系に適合性のプロモーターに作動可能に連結された、ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤドメイン由来のスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）融合ペプチドの直鎖状エピトープであって、前記融合ペプチドが、ａ）前記Ｓタンパク質シグナルペプチドと、前記ＲＢＤドメインの直鎖状エピトープと、ｃ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通ドメインとを含む、直鎖状エピトープ、ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＭタンパク質、及びｉｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＥタンパク質をコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、宿主細胞内で発現させると、前記ＲＢＤ融合ペプチド、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質が共にウイルス様粒子を形成することができる、ｒＭＶＡウイルスベクター。
- シグナルペプチドが配列番号５５のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１７８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、請求項１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号２０を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１８０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、請求項１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号２１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１８２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１６１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５９８をコードする、請求項１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６１のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１８５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む、請求項１８６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５９８をコードする、請求項１７８又は１７９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１８５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６２のアミノ酸配列を含む、請求項１８９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤドメインがＫ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、又はＮ５０１Ｙから選択される１つ以上の置換を含む、請求項１７８～１９０に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤドメインが、前記置換Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを含む、請求項１９１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５２４をコードする、請求項１９２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号３２を含むアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１９３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５２４をコードする、請求項１９１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号３３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１９５に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項１９６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３２７～５９８をコードする、請求項１９１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６３のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項１９８に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６３のアミノ酸配列を含む、請求項１９９に記載のｒＭＶＡ。
- 前記異種核酸配列が前記Ｓタンパク質ＲＢＤドメインのアミノ酸３３１～５９８をコードする、請求項１９１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが、配列番号５５及び配列番号１６４のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％相同な配列を含む、請求項２０１に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ＲＢＤ融合ペプチドが配列番号５５及び配列番号１６４のアミノ酸配列を含む、請求項２０２に記載のｒＭＶＡ。
- 前記Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、及びＭタンパク質をコードする異種核酸配列が、ｐ１１プロモーター、ｐｍＨ５プロモーター、ｐＨ５プロモーター、ｐ７．５プロモーター、ｐＳｙｎ、及びｐＨｙｂから選択されるポックスウイルス発現系に適合性の１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１７９～２０３に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ７．５プロモーターである、請求項２０４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐｍＨ５プロモーターである、請求項２０４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターがｐ１１プロモーターである、請求項２０４に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５４を含む、請求項２０６に記載のｒＭＶＡ。
- 前記プロモーターが配列番号１５５を含む、請求項２０７に記載のｒＭＶＡ。
- 前記ｒＭＶＡ異種核酸配列が配列番号１５８、又はこれと少なくとも９５％相同な核酸配列を含む、請求項１７９～２０９に記載のｒＭＶＡ。
- ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を低減又は予防する方法であって、有効量の請求項１～１８１のいずれか一項に記載のｒＭＶＡウイルスベクターを投与することを含む、方法。
- 前記ｒＭＶＡが予防的一次ワクチン接種として投与される、請求項２１１に記載の方法。
- 前記ｒＭＶＡがブーストワクチン接種として投与される、請求項２１１に記載の方法。
- 前記ヒトにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチンを以前に投与したことがある、請求項２１３に記載の方法。
- 前記以前に投与されたワクチンが、ｍＲＮＡベースのワクチン、アデノウイルスワクチン、非複製ワクチン、ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチン、植物ベースのアジュバントワクチン、マルチエピトープペプチドベースのワクチン、不活化ウイルス、ペプチドワクチンから選択される、請求項２１４に記載の方法。
- 前記以前に投与されたワクチンが、ｍＲＮＡ－１２７３（ＭＯＤＥＲＮＡ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン；Moderna, Inc.）、ＡＺＤ－１２２２（ＣＯＶＩＤＳＨＩＥＬＤ；AstraZeneca及びオックスフォード大学）、ＢＮＴ１６２（ＣＯＭＩＲＮＡＴＹ；Pfizer及びBioNTech）、Ｓｐｕｔｎｉｋ Ｖ（Gamaleya Research Institute、Acellena Contract Drug Research and Development）、ＣｏｒｏｎａＶａｃ（Sinovac）、ＮＶＸ－ＣｏＶ ２３７２（NovoVax）、ＳＣＢ－２０１９（Sanofi及びGSK）、ＺｙＣｏＶ－Ｄ（Zydus Cadila）、ＢＢＩＢＰ－ＣｏｒＶ（Beijing Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group（Sinopharm））、ＥｐｉＶａｃＣｏｒｏｎａ（Federal Budgetary Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology）、Ｃｏｎｖｉｄｉｃｅａ（CanSino Biologics）、Ｃｏｖｉｄ－１９ワクチン（Wuhan Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group （Sinopharm））、ＪＮＪ－７８４３６７３５（Johnson & Johnson）、ＺＦ２００１（Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical, Institute of Microbiology of the Chinese Academy of Sciences）、ＣＶｎＣｏＶ（CureVac；GSK）、ＩＮＯ－４８００（Inovio Pharmaceuticals）、ＶＩＲ－７８３１（Medicago；GSK；Dynavax）、Ｃｏｖｉｄ－１９アデノウイルスベースワクチン（ImmunityBio；NantKwest）、ＵＢ－６１２（COVAXX）、又はＣｏＶａｘｉｎ（Bharat Biotech）から選択される、請求項２１４に記載の方法。
- 前記ヒトが以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したことがある、請求項２１３に記載の方法。
- 前記ｒＭＶＡがプライムワクチン及びブーストワクチンの両方として投与される、請求項２１１に記載の方法。
- 前記ｒＭＶＡがブーストワクチンとして２回以上投与される、請求項２１３～２１６に記載の方法。
- 前記ｒＭＶＡブーストが、前記プライムワクチン接種の４週間以上後に投与される、請求項２１６に記載の方法。
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