CN115529817A - 疫苗及其诱导针对sars-cov2的免疫应答的用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒载体，其包含编码一种或多种SARS‑CoV2蛋白、肽或其片段的异源核酸***物，所述异源核酸***物可操作地连接到与痘病毒表达***相容的启动子，所述痘病毒表达***在表达时能够诱导保护性免疫。组合物可以用于初次疫苗接种策略或初次/加强疫苗接种策略中以提供对SARS‑CoV2及其变体的免疫性。

Description

疫苗及其诱导针对SARS-COV2的免疫应答的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月14日提交的美国临时申请号62/976,913、 2020年2月16日提交的美国临时申请号62/977,402、2020年3月20日提交的美国临时申请号62/992,710和2020年5月18日提交的美国临时申请号63/026,580的权益和优先权，将其各自通过援引整体并入本文。
发明领域
本发明提供用于在宿主中诱导针对严重急性呼吸综合征-冠状病毒2 (SARS-CoV2)的免疫应答的组合物，以及使用和制备这样的组合物的方法。特别地，本文描述的组合物是编码一种或多种SARS-CoV2抗原的重组修饰的安卡拉痘苗(modified vacciniaAnkara，MVA)病毒构建体。所述组合物可用于初次疫苗接种策略或初次/加强疫苗接种策略，以提供对广泛范围的SARS-CoV2变体的免疫性。
通过援引并入
将2021年2月12日创建且大小为540KB的名称为“19101-002WO1_Seq_Listing_02_11_21_ST25.txt”的文本文件的内容通过引用整体并入本文。
发明背景
冠状病毒(CoV)(巢病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科 (Coronaviridae)，冠状病毒亚科(Coronavirinae))是具有正义单链 RNA基因组的包膜病毒。相比而言，COV具有RNA病毒的大基因组，长度范围为26至32千碱基(kb)。CoV基因组编码四种主要的结构蛋白：刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白，所有这些都是产生结构完整的病毒颗粒所必需的。参见，例如PS Masters,The molecular biology ofcoronavirus.Adv.Virus Res. 2014:101:105-12。每种主要的CoV结构蛋白在病毒颗粒的结构中起作用，并且可能参与复制周期的其他方面。基于遗传和抗原标准，CoV已被分成三组：α-CoV、β-CoV和γ-CoV(van Regenmortel et al.,editors.Virus taxonomy:Classification and nomenclature of viruses Seventh report of theInternational Committee on Taxonomy of Viruses.San Diego:Academic Press；2000.p.835-49.ISBN 0123702003)。
冠状病毒主要感染鸟类和哺乳动物，但也可以感染人类(参见，例如Bande etal.,Progress and challenges toward the development of vaccines against avianinfectious bronchitis.J Immunol Res.2015；2015；van der Hoek L.Humancoronaviruses:What do they cause？Antiviral Therapy.2007；12(4 Pt B):651)。人类冠状病毒感染的严重程度不同，从类似普通感冒的上呼吸道感染到下呼吸道感染，如支气管炎、肺炎，甚至严重急性呼吸综合征(SARS)。
一些CoV最初被发现是地方性感染，仅限于其天然动物宿主，但已经跨越动物-人类物种屏障，并在人类中发展为产生人畜共患疾病。参见，例如Lau et al.,Severe acuterespiratory syndrome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats.PNAS2005；102(39):14040-5；Rest et al.,SARS associated coronavirus has arecombinant polymerase and coronaviruses have a history of host-shifting.Infect Genet Evol.2003；3(3):219–25。跨物种屏障跳跃使得CoV如SARS CoV和中东呼吸综合征CoV(MERS) 表现为有毒性的人类病毒。Schoeman和Fielding,Coronavirusenvelope protein:current knowledge.Virology 2019；16:69。例如，2003年SARS冠状病毒导致8096例确诊病例，全世界报告774例死亡，死亡率为9.6％。世界卫生组织WHO。从2002年11月1日至2003年7月31日发病的可能SARS病例的概述。可获自： http://www.who.int/csr/sars/country/table2004_04_21/en/index.html。自 2012年4月以来，已经报告了2229例MERS确诊病例，其中792例相关死亡，导致死亡率为35.5％。世界卫生组织WHO。WHOMERS-CoV 全球概述和风险评估，2018年8月(WHO/MERS/RA/August18)。可获自： http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/risk-assessment-augu st-2018.pdf？ua＝1。
最近，一种新型冠状病毒SARS-CoV2与疫情有关。参见关于新型冠状病毒(SARS-CoV2)爆发的国际卫生条例(2005)紧急委员会第二次会议的声明，世界卫生组织，2020年1月30日。自2020年1月31 日开始存档，可从 https://www.who.int/news-room/detail/30-01-2020-statement-on-the-second- meeting-of-the-international-health-regulations-(2005) -emergency-committee-regarding-the-outbreak-of-novel-coronavirus- (SARS-CoV2)获得。许多早期病例大型海鲜和动物市场有关，该病毒被认为具有人畜共患疾病来源。Perlman,Another Decade,Another Coronavirus.NEJM(24January 2020)；doi:10.1056/NEJMe200112610；C Wu,Joseph et al.,The Lancet(31January 2020)；doi:10.1016/S0140-6736 (20)30260-9。对该病毒和其它病毒样品的基因序列的比较显示与 SARS-CoV(79.5％)和蝙蝠冠状病毒(96％)具有相似性(Zhou,etal.,A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable batorigin,Nature(Feb.3,2020；1-4；doi:10.1038/s41586-020-2012-7)，并且 SARS-CoV2与β冠状病毒成簇，与两种蝙蝠来源的SARS样菌株一起形成沙贝病毒(Sarbecovirus)亚属的谱系B中的不同进化枝。该病毒的起源尚不清楚。与SARS-CoV类似，最新研究证实血管紧张素转化酶2 (ACE 2)，一种膜外肽酶，是SARS-CoV2用于进入人类细胞使用的受体。
为了控制爆发扩散，已经在全世界各地实施了隔离和旅行限制。尽管如此，截至2021年2月，全世界已经报告了超过1.07亿个个体病例，并且超过230万例死亡，估计该病毒的死亡率为约0.7％。
产生用于人类冠状病毒的治疗性疫苗的历史说明了该问题的复杂性和挑战性。尽管分别在2012年和2003年发现了该病毒，但是仍然没有针对MERS-CoV和SARS-CoV的商业疫苗。实现安全性、耐受性和必需的免疫原性持续时间的期望结果的框架和抗原组分的选择是困难的，并且可能涉及多次失败。
正在开发许多疫苗以减少或预防SARS-CoV2感染。在2020年12 月11日，美国食品药品监督管理局(FDA)颁布了对Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗(BNT162b2)在16岁及以上人员中预防COVID-19的紧急使用授权(EUA)。在2020年12月18日，美国食品和药物管理局颁布了对第二种疫苗的紧急使用授权(EUA)，以预防由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的冠状病毒疾病2019 (COVID-19)。紧急使用授权允许ModernatX公司的COVID-19疫苗 (mRNA-1272)在美国销售，用于18岁及以上的个体。Pfizer和Modema 疫苗都是仅编码SARS-CoV2刺突蛋白的mRNA疫苗。
与其他SARS相关冠状病毒一样，SARS-CoV2已显示高突变率，这种突变率驱使SARS-CoV2进化和基因组变异性，从而潜在地使 SARS-CoV2逃避宿主免疫和目前疫苗提供的免疫。自从最初报告 SARS-CoV2基因组序列以来，已经鉴定了大量SARS-CoV2变体，这些变体可能潜在地影响各种疫苗接种策略的治疗功效。例如，最近在结构刺突蛋白中鉴定的大量突变已经引起了疫苗策略可能由于突变逃逸而变得无效的担忧。最近对刺突蛋白的突变已经引起了对目前疫苗有效性的重大关注。例如，在小型临床试验中，Oxford-AstraZeneca疫苗显示对南非变体501Y.V2的效力降低。令人担心的是，501Y.V2变体中的E484K突变可使得目前疫苗不太有效，产生潜在的逃逸突变体。
SARS-CoV2的高死亡率，以及传播的容易性和传播速度与突变率，突显了开发有效的SARS-CoV2疫苗的必要性。
因此，本发明的一个目的是提供一种针对SARS-CoV2的治疗性疫苗、及相关质粒和构建体，以及其赋予处于感染风险中的人类以免疫原性的用途。
发明概述
本文提供了重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码一种或多种SARS-CoV2蛋白、肽或其片段的异源核酸***物，所述异源核酸***物可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，所述痘病毒表达***在表达时能够诱导保护性免疫。本文所述的组合物可用于初次疫苗接种策略或初次/加强疫苗接种策略，以提供对广泛范围的SARS-CoV2变体(包括潜在的逃逸突变体)的免疫。在一个方面，rMVA 病毒载体被设计成在受体宿主细胞中表达以病毒样颗粒(VLP)的形式的SARS-CoV2抗原(例如刺突(S)、膜(M)和包膜(E)蛋白)(参见例如图20)，其中由于潜在免疫显性表位的增强展示，VLP的表达和形成足以提供针对突变体谱系的保护性免疫。通过表达更广泛范围的在表达后显示为VLP的SARS-CoV2抗原，可以跨多种抗原产生更强的体液和细胞应答，从而降低SARS-CoV2变体逃避突变免疫的风险。例如，通过表达包括S、M和E蛋白的冠状病毒VLP，与仅针对S蛋白的疫苗相比，可以产生更强的免疫应答，从而降低病毒通过突变进行免疫逃逸的可能性，所述突变包括例如S蛋白受体结合结构域(RBD)内的氨基酸取代，包括例如K417T、K417N、E484K和/或N501Y的那些。在一些实施方案中，rMVA表达SARS-CoV2抗原，从而产生两个不同的VLP 群体。在一些实施方案中，rMVA表达一种或多种与非冠状病毒糖蛋白呈融合蛋白形式的SARS-CoV2抗原，并且分别表达病毒基质蛋白，其中SARS-CoV2多肽抗原-糖蛋白融合物和基质蛋白能够形成VLP。
在一些实施方案中，提供了rMVA病毒载体，其含有编码 SARS-CoV2的膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白和刺突(S)蛋白的一个或多个核酸序列，其中，在表达M、E和S蛋白时，形成VLP(参见，例如，图20)。在一些实施方案中，rMVA含有编码全长S蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列，例如，如图1A中所示例。在一些实施方案中， rMVA编码包含SEQ ID NO:1、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO:3、42和45的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO:46、47或156的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA含有编码全长S蛋白的核酸序列，其进一步包含在K417T、E484K和N501Y处的取代。在一些实施方案中，rMVA 编码包含SEQ ID NO：6，40和43的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了rMVA病毒载体，其含有编码 SARS-CoV2的膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白和刺突(S)蛋白的一个或多个核酸序列，其中，在表达M、E和S蛋白时，形成VLP，并且其中所述S蛋白包含一个或多个氨基酸脯氨酸取代，所述取代稳定化融合前构象的S蛋白三聚体。在一些实施方案中，S蛋白在S胞外域三聚体的启动子的七肽重复1(HR1)和中心螺旋之间的边界处或附近含有一个或多个脯氨酸取代。在一些实施方案中，脯氨酸取代出现在三聚体中启动子的氨基酸残基970至990之间。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且在氨基酸K986和V987处含有两个脯氨酸取代，例如，如图2A中所示例。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO:8、 40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO:10、42和45的核酸序列。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有取代K986P、V987P，以及K417T、E484K和N501Y中的一个或多个。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有取代K986P、V987P、K417T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，S蛋白表达为包含SEQ ID NO:11的氨基酸。在一些实施方案中，S蛋白由包含SEQ ID NO：12的核酸编码。在一些实施方案中，rMVA编码包含 SEQ ID NO：11、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA 包含含有SEQ ID NO：12、42和45的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO：157的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA 包含含有SEQ ID NO：159的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO：50的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO：160的核酸序列。
在上述可替代的实施方案中，rMVA病毒载体含有编码膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白和刺突(S)蛋白的线性表位的一个或多个核酸序列，其中在M、E和S蛋白的线性表位表达时，形成VLP。在一个特定实施方案中，由rMVA编码的S蛋白的线性表位是SARS-CoV2 S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在一些实施方案中，所编码的线性S表位包含 S蛋白的氨基酸331至524(RBD aa 331-524)，如图3A中所示例。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：21的线性表位。在一些实施方案中，编码的线性表位包含S蛋白的氨基酸327至524(RBD aa 327至524)，如图3D中所示例。在一些实施方案中，rMVA表达包含 SEQ ID NO：20的线性表位。在一些实施方案中，RBD肽包含取代 K417T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：33的线性表位。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO： 32的线性表位。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：20、 40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO： 24、42和45的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码SEQ IDNO： 21、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO：25、42和45的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码SEQ ID NO：32、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含 SEQ ID NO：33、40和43的氨基酸序列。
在一些实施方案中，核酸***物编码线性S表位，其进一步包含衍生自S蛋白的信号肽和跨膜肽，例如，如图3G和图3H中所示例。S蛋白信号肽可以包含或来源于例如SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸1-13 (MFVFLVLLPLVSS)(SEQ ID NO：55)。S蛋白跨膜结构域(其还可以包括胞质尾区)可以包含或来源于例如氨基酸1214-1273(SEQ ID NO：57)。在一些实施方案中，所编码的S蛋白包含RBD共有序列，如图5A中所示例。在一些实施方案中，RBD共有序列还包含例如来源于SEQ ID NO：55的S蛋白信号肽和例如来源于SEQ ID NO：57的S 蛋白跨膜肽，例如，如图5B中所示例。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：61的线性表位。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：62的线性表位。在一些实施方案中，RBD肽包含取代 K417T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：67的线性表位。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：68的线性表位。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：61、 40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO：65、42和45的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码SEQ ID NO： 62、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO：66、42和45的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码氨基酸 SEQ ID NO：67、40和43的序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQID NO：68、40和43的氨基酸序列。
在一些实施方案中，核酸***物编码线性S表位，其进一步包含信号肽、E蛋白和M蛋白(参见例如图3Q、图3R、图3S、图3T)。S 蛋白信号肽可包含或来源于例如SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸1-13 (MFVFLVLLPLVSS)(SEQ ID NO:55)。在一些实施方案中，编码的 S蛋白包含RBD共有序列。在一些实施方案中，RBD共有序列进一步包含S蛋白信号肽，例如来源于SEQID NO：55。在一些实施方案中， rMVA表达包含氨基酸327-524的线性RBD表位。在一些实施方案中， rMVA表达包含SEQ ID NO：55和20的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA表达包含氨基酸331-524的线性RBD表位。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：55和21的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA表达包含氨基酸327-598的线性RBD表位。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：55和161的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA表达包含氨基酸331-598的线性RBD表位。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：55和162的氨基酸序列。在一些实施方案中，RBD肽包含取代K417T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：55和32的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ IDNO：55和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：55和163的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：55和164的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：55、20、40 和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码SEQ ID NO：55、 21、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码SEQ ID NO：55、32、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含 SEQ ID NO：55、33、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA 编码包含SEQ ID NO:55、161、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO:55、162、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO:55、163、40和43的氨基酸序列。在某些情况下在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO:164、33、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含 SEQ ID NO:158。
在一些实施方案中，rMVA病毒载体含有编码S蛋白的两个或更多个线性表位的核酸序列，其中所述两个或更多个线性表位由间隔基(例如GPGPG间隔基多肽)隔开，并且其中所述rMVA病毒载体还含有一个或多个编码SARS-CoV2包膜(E)和膜(M)蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，***到rMVA病毒载体中的序列编码由间隔基分开的S 蛋白线性表位，其中所述线性表位包括不同的S蛋白RBD肽序列，例如(RBD SEQ.1-间隔基-RBD SEQ.2)，其中RBD SEQ.1是第一S蛋白 RBD肽，并且RBD Seq.2是第二S蛋白RBD肽。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的序列编码串联重复序列，例如(RBD Seq.1- 间隔基-RBD Seq.2-间隔基)x，其中x＝2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些实施方案中，核酸序列编码串联重复序列，其侧接有在NH末端的S肽信号肽(例如来源于SEQ ID NO:55)和在羧基末端的S蛋白跨膜结构域(例如来源于SEQ ID NO:57)。在一些实施方案中，所述RBD 肽选自来源于SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸331至524或可替代地氨基酸327至524的一个或多个肽。在一些实施方案中，由rMVA中的核酸序列编码的线性表位选自SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，由rMVA中的核酸序列编码的线性表位是SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的序列编码含有串联重复序列((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)x的S蛋白RBD肽，其中x＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，例如，如图4A所示。在一些实施方案中，x＝3-7。在一些实施方案中，x＝5。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的序列编码含有串联重复序列 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)X的S蛋白RBD肽，其中 x＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，并且其中串联重复在NH末端侧接有 S蛋白信号肽(例如来源于SEQ ID NO:55)和在羧基末端侧接有S蛋白跨膜结构域(例如衍生自SEQ ID NO:57)，例如，如图4F中所示例。在一些实施方案中，x＝3-7。在一些实施方案中，x＝5。在一些实施方案中，AA473-490RBD肽包含E484K。
在上述可替代的实施方案中，rMVA病毒载体含有一个或多个编码 SARS-CoV2膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白和缺少S蛋白羧基末端的修饰的刺突(S)蛋白的核酸序列。修饰的S蛋白包含截短的S1+S2，其中在M、E和截短的S蛋白表达时，形成VLP。在一个特定的实施方案中，由rMVA编码的修饰的S蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸 (1-1213)，例如，如图6A中所示例。可替代地，rMVA病毒载体含有一个或多个编码SARS-CoV2膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白和具有一个或多个脯氨酸取代的S1+S2截短的蛋白片段的核酸序列，其中在M、E 和截短的S蛋白表达时，形成VLP。在一个特定的实施方案中，由rMVA 编码的修饰的S蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸(1-1213)，其中 S1+S2截短的片段在氨基酸K986和V987处含有两个脯氨酸取代(S1+S2 截短的+K986P和V987P)，例如，如图6H中所示例。在一些实施方案中，S1+S2肽进一步包含取代K417T、E484K及N501Y。
在一个可替代的方面，本文提供一种设计为将一种或多种 SARS-CoV2S蛋白抗原性肽表达为融合蛋白的rMVA病毒载体，其中所述融合蛋白包含包膜糖蛋白的信号肽(GPS)、SARS-CoV2 S蛋白或蛋白片段和包膜糖蛋白的跨膜结构域(GPTM)，其中所述包膜糖蛋白不是来源于冠状病毒。构建rMVA病毒载体以进一步表达SARS-CoV2的膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白，以及来源于与包膜糖蛋白相同病毒的基质蛋白。通过表达M蛋白和E蛋白两者、与GP融合的S蛋白片段和基质蛋白，可以形成两种不同的VLP：第一种含有SARS-CoV2 M蛋白和E蛋白，第二种含有与GP和基质蛋白一致的S蛋白片段。通过提供两种VLP，增强的表位呈递是可能的。用于本发明的合适的糖蛋白包括，但不限于来源于以下的那些：丝状病毒科(Filoviridae)，例如马尔堡病毒(Marburg virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)或苏丹病毒(Sudan virus)；逆转录病毒科(Retroviridae)，例如人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)；沙粒病毒科(Arenaviridaea)，例如拉沙病毒(Lassa virus)；黄病毒科 (Flaviviridae)，例如登革热病毒(Dengue virus)和寨卡病毒(Zika virus)。在特定的实施方案中，糖蛋白来源于马尔堡病毒(MARV)。在特定实施方案中，糖蛋白来源于MARV GP蛋白(GenBank登录号AFV31202.1)。在特定实施方案中，MARV GPS结构域包含糖蛋白的氨基酸1至19(MWTTCFFISLILIQGIKTL)(SEQ ID NO：88)，并且 GPTM结构域包含糖蛋白的氨基酸序列644-681 (WWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG)(SEQ ID NO：90)。在一些实施方案中，S蛋白或蛋白片段-GP融合蛋白包含S 蛋白受体结合结构域(RBD)，例如如图7A中所示例。在一些实施方案中，RBD肽来源于S蛋白的氨基酸331至524。在一些实施方案中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸331至524，例如，如图7B中所示例。在一些实施方案中，RBD肽来源于S蛋白的氨基酸327至524。在一些实施方案中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸327至524，例如，如图 7G中所示例。在一些实施方案中，线性S表位包含冠状病毒共有序列。在一些实施方案中，RBD肽包含取代K417T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：95、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO：97、42和45的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：96、40和 43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO：98、 42和45的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO： 99、40和43的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：99、40和43的氨基酸序列。
在一些实施方案中，rMVA含有一个或多个核酸序列，其编码E蛋白、M蛋白和与病毒糖蛋白(例如MARV GP)融合的S蛋白的两个或更多个线性表位，其中所述两个或更多个线性表位由间隔基(例如 GPGPG间隔基多肽)分开，并且其中GPS侧接两个或更多个线性表位的NH末端，GPTM侧接其羧基末端，以及来源于与糖蛋白相同的病毒的基质蛋白，例如MARVVP40基质蛋白。在一些实施方案中，S蛋白的两个或更多个线性表位与MARV GP融合，其中所述线性表位包括不同的S蛋白RBD肽，例如(RBD SEQ.1-间隔基-RBD SEQ.2)，其中 RBDSeq.1是第一S蛋白RBD肽，并且RBD Seq.2是第二S蛋白RBD 肽。在一些实施方案中，S蛋白的两个或更多个线性表位与MARV GP 融合，其中所述表位包含在串联重复序列中，例如(RBDSeq..1-间隔基 -RBD Seq.2-间隔基)X，其中x＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于 10。在一些实施方案中，所述RBD肽选自来源于SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸331至524或氨基酸327至524的一个或多个肽。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位选自SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504 至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，由所述串联重复编码的线性表位是SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473至 490。在一些实施方案中，串联重复序列编码 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)x，其中x＝2、3、4、5、6、 7、8、9、10或大于10。在一些实施方案中，x＝3至7。在一些实施方案中，x＝5，例如，如图8A中所示例。当使用串联重复时，MARV GPS 肽侧接NH末端上的串联重复，并且MARV GPTM肽侧接在羧基末端上的串联重复。在一些实施方案中，aa473-490RBD肽包含E484K。
在一些实施方案中，rMVA与E蛋白和M蛋白一起编码修饰的S 蛋白，其包含与病毒糖蛋白融合的S1+S2截短蛋白，例如MARV GP，其中GPS侧接S1+S2截短的S蛋白的NH末端，并且GPTM侧接其羧基末端，以及来源于与糖蛋白相同的病毒的基质蛋白，例如MARV VP40 基质蛋白。在一个特定实施方案中，由rMVA编码的修饰的S1+S2截短蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸1-1213，例如，如图9A中所示例。在一些实施方案中，仅由rMVA编码的S蛋白片段包含修饰的S蛋白，其包含含有一个或多个脯氨酸取代，例如在K986P和V987P处的脯氨酸取代的S1+S2截短蛋白，例如如图9B所示例。在一些实施方案中， S1+S2肽进一步包含取代K417T、E484K和N501Y。
在一个可替代的方面，本文提供一种设计为将一种或多种 SARS-CoV2S蛋白抗原性肽表达为融合蛋白的rMVA病毒载体，其中所述融合蛋白包含包膜糖蛋白的信号肽(GPS)、SARS-CoV2 S蛋白片段和包膜糖蛋白的跨膜结构域(GPTM)，其中所述包膜糖蛋白不是来源于冠状病毒，并且其中所述rMVA病毒载体进一步表达来自与所述糖蛋白相同的病毒的基质蛋白。SARS-CoV2肽-GP融合蛋白被设计为允许与基质蛋白结合形成VLP，其展示SARS-CoV2抗原肽。用于本发明的合适的糖蛋白结构域和基质蛋白包括，但不限于来源于以下的那些：丝状病毒科，例如马尔堡病毒、埃博拉病毒或苏丹病毒；逆转录病毒科，例如人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)；沙粒病毒科，例如拉沙病毒；黄病毒科，例如登革热病毒和寨卡病毒。在特定实施方案中，GP和基质蛋白来源于马尔堡病毒(MARV)。在特定实施方案中，糖蛋白来源于MARV GP蛋白(GenBank登录号AFV31202.1)。在特定实施方案中， MARV GPS结构域包含糖蛋白的氨基酸1至19 (MWTTCFFISLILIQGIKTL)(SEQ ID NO:88)，GPTM结构域包含糖蛋白的氨基酸序列644-681 (WWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCIC RIFTKYIG)(SEQ ID NO:90)。在一些实施方案中，糖蛋白-S蛋白融合物和病毒基质蛋白作为***不同位置的核酸包含在rMVA中。在一些实施方案中，糖蛋白-s 蛋白或蛋白片段融合物和病毒基质蛋白作为***相同位置的双顺反子核酸包含在rMVA中。在一些实施方案中，与糖蛋白融合的SARS-CoV2 蛋白是S蛋白或其片段。在一些实施方案中，S蛋白是包含含有S1+S2 截短的蛋白的修饰的S蛋白的片段。在一些实施方案中，由rMVA编码的修饰的S蛋白片段包含SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸2至1213，例如，如图10A和10C中所示例。在一些实施方案中，由rMVA编码的修饰的S蛋白片段包含含有一个或多个脯氨酸取代(例如，在K986P和V987P 处)的SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸2至1213，例如，如图10F和10D 中所示例。在一些实施方案中，S1+S2肽进一步包含取代K417T、E484K 和N501Y。在一些实施方案中，融合的S蛋白是S蛋白的线性表位。在一个特定实施方案中，S蛋白的线性表位是SARS-CoV2S蛋白的受体结合结构域(RBD)，例如如图11A和图11H中所示例。在一些实施方案中，线性S表位包含来源于S蛋白的氨基酸331至524的RBD肽。在一些实施方案中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸331至524，例如，如图11B和图11I中所示例。在一些实施方案中，线性S表位包含来源于S蛋白的氨基酸327至524的RBD肽。在一些实施方案中，线性S 表位包含S蛋白的氨基酸327至524，例如如图11E和图11N中所示例。在一些实施方案中，RBD肽进一步包含取代K417T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，线性S表位包含冠状病毒共有序列。在一些实施方案中，S蛋白的两个或更多个线性表位与MARVGP融合，其中所述两个或更多个线性表位由间隔基(例如GPGPG间隔基多肽)分开。在一些实施方案中，线性表位包括不同的S蛋白RBD肽，例如(RBD Seq.1- 间隔基-RBD Seq.2)，其中RBD Seq.1是第一S蛋白RBD肽，并且RBD Seq.2是第二S蛋白RBD肽。在一些实施方案中，融合的S蛋白包含S 蛋白的两个或更多个线性表位，其中所述表位包含在串联重复序列中，例如(RBD Seq.1-间隔基-RBD Seq.2-间隔基)X，其中x＝2、3、4、5、 6、7、8、9、10或大于10。在一些实施方案中，RBD肽选自一个或多个来源于SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸331至524的肽。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位选自SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504 至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，由串联重复编码的线性表位是SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，串联重复序列编码 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)x，其中x＝2、3、4、5、6、 7、8、9、10或大于10。在一些实施方案中，x＝3至7。在一些实施方案中，x＝5。当S蛋白片段以串联重复提供时，GPS侧接串联重复的NH- 末端，并且GPTM侧接串联重复的羧基末端，如例如图12A和12B中所示例。在一些实施方案中，RBD肽进一步包含取代E484K。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO:92和95的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO:93或94和97的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO:92和96的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含含有SEQ ID NO:93或94和98的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO:92和99的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO:92和100的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列。
在本发明的一个可替代方面，本文提供编码全长S蛋白的重组MVA 病毒载体，例如，如图13A中所示例。在一些实施方案中，S蛋白是全长稳定化蛋白，其中已经在S胞外域三聚体的启动子的七肽重复1(HR1) 和中心螺旋之间的边界处或附近进行了一个或多个脯氨酸取代。在一些实施方案中，脯氨酸取代发生在所述三聚体中启动子的残基970至990 之间。在一些实施方案中，S蛋白是稳定化的并且表达为全长蛋白，并且在氨基酸K986和V987处含有两个脯氨酸取代，例如，如图14A中所示例。在一些实施方案中，S蛋白表达为包含S蛋白的S1+S2结构域并且缺少S蛋白的羧基末端的截短的S蛋白。在一些实施方案中，截短的S蛋白包含S蛋白的氨基酸1-1213，如图15A中所示例。在一些实施方案中，截短的S蛋白包括在氨基酸K986和V987处的两个脯氨酸取代，如图15F中所示例。在一些实施方案中，S肽进一步包含一个或多个选自K417N、K417T、E484K和N501Y的取代。在一些实施方案中，S肽进一步包含取代K417T、E484K和N501Y。
在一些方面，本文提供一种减少或预防受试者(例如人)的 SARS-CoV2感染的方法，其包括施用本文所述的rMVA病毒载体。在一些实施方案中，rMVA病毒载体作为初次疫苗预防性施用至先前未感染SARS-CoV2的受试者。在一些实施方案中，将rMVA病毒载体作为加强疫苗施用至先前已感染SARS-CoV2的受试者。在一些实施方案中，将rMVA病毒载体作为加强疫苗施用给先前已经施用SARS-CoV2疫苗的受试者。在一些实施方案中，先前施用的SARS-CoV2疫苗是本文所述的rMVA病毒载体。在一些实施方案中，先前施用的疫苗是非MVA病毒载体疫苗。在一些实施方案中，疫苗是基于mRNA的疫苗、腺病毒疫苗、非复制型疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗、基于植物的佐剂疫苗、基于多表位肽的疫苗、灭活病毒、肽疫苗。在一些实施方案中，先前施用的疫苗选自下述的一种或多种：mRNA-1273(MODERNA COVID-19VACCINE；Moderna,Inc.)、AZD-1222(COVIDSHIELD；AstraZeneca 和University ofOxford)、BNT162(COMIRNATY；Pfizer和BioNTech)、 Sputnik V(Gamaleya ResearchInstitute,Acellena Contract Drug Research and Development)、CoronaVac(Sinovac)、NVX-CoV 2372(NovoVax)、 SCB-2019(Sanofi和GSK)、ZyCoV-D(Zydus Cadila)、BBIBP-CorV (Beijing Institute of Biological Products；China NationalPharmaceutical Group(Sinopharm))、EpiVacCorona(Federal Budgetary ResearchInstitution State Research Center of Virology and Biotechnology)、 Convidicea(CanSino Biologics)、Covid-19疫苗(Wuhan Institute of Biological Products；ChinaNational Pharmaceutical Group(Sinopharm)、 JNJ-78436735(Johnson&Johnson),ZF2001(Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical,Institute of Microbiology ofthe Chinese Academy of Sciences)、CVnCoV(CureVac；GSK)、INO-4800(InovioPharmaceuticals)、 VIR-7831(Medicago；GSK；Dynavax)、Covid-19基于腺病毒的疫苗(ImmunityBio；NantKwest)、UB-612(COVAXX)或CoVaxin(Bharat Biotech)。
在一些方面，在使用除本文所述的rMVA之外的一种或多种另外的疫苗接种剂的免疫接种方案中，将本文所述的rMVA病毒载体施用于受试者，例如人类。
本文还提供穿梭载体，其包含待***到如本文所述的MVA中的核酸序列，以及包含本文所述的核酸序列***物的分离的核酸序列。本文进一步提供包含如本文所述的rMVA的细胞，例如鸡胚成纤维细胞或 DF1细胞。
附图简述
图1A提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含含有在例如MVA基因A5R和A6L之间编码全长S、E和 M蛋白的核酸的***物。如所示例的，mH5启动子(pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码全长SARS-CoV2 S蛋白的核酸。***物可以包括在S蛋白序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak 序列。另外，可以在终止密码子之前，在S蛋白的3'末端包括编码标签 (例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，与S蛋白相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，以从左到右的方向，其可操作地连接至例如p11 启动子。与S蛋白类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前编码在所述编码序列的3' 末端处的标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M 蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的， M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前编码在所述编码序列的3'末端处的标签的核酸序列。
图1B-1C-1D是编码全长SARS-CoV2 S、M和E蛋白的SEQ ID NO:46的示例性rMVA核酸***物。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5 启动子、疫苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和C-标签序列。
图1E-1F-1G是编码全长SARS-CoV2 S、M和E蛋白的SEQ ID NO:47的示例性rMVA核酸***物。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5 启动子、疫苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列、SmaI限制性位点和C-标签序列。
图1H-1I-1J是编码全长SARS-CoV2 S、M和E蛋白的SEQ ID NO:156的示例性rMVA核酸***物。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5 启动子、疫苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列、SmaI限制性位点和C-标签序列。
图2A提供示例性的重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含编码在例如MVA基因A5R和A6L之间的稳定化的S 蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸的***物。如所示例的，mH5启动子 (pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码稳定化的全长 SARS-CoV2S蛋白的核酸。***物可以包括在S稳定化的蛋白序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。另外，可以在终止密码子之前，在S稳定化的蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与S稳定化的蛋白相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。与S稳定化的蛋白类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前编码在所述编码序列的3'末端处的标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至pmH5启动子。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前编码在所述编码序列的3'末端处的标签的核酸序列。
图2B-2C-2D是SEQ ID NO:48的示例性rMVA核酸***物，其编码包含氨基酸取代K986P和V987P的全长稳定化的SARS-CoV2 S、M 和E蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、疫苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图2E-2F-2G是SEQ ID NO:49的示例性rMVA核酸***物，其编码包含氨基酸取代K986P和V987P的全长稳定化的SARS-CoV2 S、M和 E蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、 SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图2H-2I-2J是SEQ ID NO:50的示例性rMVA核酸***物，其编码包含氨基酸取代K986P、V987P、K417T、E484K和N501Y的全长稳定化的SARS-CoV2 S、M和E蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5 启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图2K-2L-2M是SEQ ID NO:157的示例性rMVA核酸***物，其编码包含氨基酸取代K986P和V987P的全长稳定化的SARS-CoV2 S、M 和E蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图2N-2O-2P是SEQ ID NO:159的示例性rMVA核酸***物，其编码包含氨基酸取代K986P、V987P、K417T、E484K和N501Y的全长稳定化的SARS2-CoV2 S、M和E蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗 mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak 调节序列和c-标签序列。
图2Q-2R-2S是SEQ ID NO:160的示例性rMVA核酸***物，其编码包含氨基酸取代K986P、V987P、K417T、E484K和N501Y的全长稳定化的SARS-CoV2 S、M和E蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5 启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子和Kozak调节序列。
图3A提供示例性的重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白的RBD(aa 331-524)区域、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的， mH5启动子(pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码S蛋白的氨基酸331至524的核酸。***物可以包括在***到S RBD(aa 331-524) 蛋白序列的5'的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在S RBD(aa331-524)蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与S RBD(aa 331-524)蛋白相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如PI1启动子。与S RBD(aa 331-524)蛋白类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak 序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图3B是SEQ ID NO：53的示例性rMVA核酸***物，其编码S蛋白的RBD(aa 331-524)区域、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗p11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图3C是SEQ ID NO:54的示例性rMVA核酸***物，其编码S蛋白的RBD(aa 331-524)区域、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗p11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图3D提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，其包含***在例如MVAA5R和A6L之间的编码S蛋白的RBD(aa 327-524) 区域、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5) 以从左到右的方向可操作地连接至编码S蛋白的氨基酸327至524的核酸。***物可以包括在***到S RBD(aa 327-524)蛋白序列的5'的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在S RBD(aa 327-524)蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列，。如所示例的，以从左到右的方向，与S RBD(aa 327-524)蛋白相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。与S RBD(aa 327-524)蛋白类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M 蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M 蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图3E是SEQ ID NO:51的示例性rMVA核酸***物，其编码S蛋白的RBD(aa 327-524)区域、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗p11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图3F是SEQ ID NO:52的示例性rMVA核酸***物，其编码S蛋白的RBD(aa 327-524)区域、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗p11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、 Kozak调节序列和c-标签序列。
图3G提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA A5R和A6L之间的编码S蛋白信号肽 (SP)-S蛋白RBD(aa 331-524)-S蛋白跨膜结构域(STM)融合蛋白、 E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，融合蛋白包括来源于S蛋白(SP)的氨基酸1-13的S蛋白信号肽、S蛋白RBD(aa 331-524)肽和来源于S蛋白(STM)的氨基酸1214-1273的跨膜结构域。起始密码子提供在SP-S RBD(aa 331-524)-STM融合编码核酸的5’。***物可以包括在信号肽编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在SP-S RBD(aa 331-524)-STM融合物的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与SP-S RBD(aa 331-524) -STM融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的， M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图3H提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 327-524)-S蛋白跨膜结构域(STM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5) 可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，融合蛋白包括来源于S蛋白(SP)的氨基酸1-13的S蛋白信号肽、S蛋白RBD (aa 327-524)肽和来源于S蛋白(STM)的氨基酸1214-1273的跨膜结构域。起始密码子提供在SP-S RBD(aa 327-524)-STM融合编码核酸的5’。***物可以包括在信号肽编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在SP-S RBD (aa 327-524)-STM融合物的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签) 的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与SP-S RBD(aa327-524) -STM融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3’端与M蛋白编码序列的3’端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图3I-3J是SEQ ID NO:69的示例性rMVA核酸***物，其编码S 蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 327-524)-S蛋白跨膜结构域(STM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图3K-3L是SEQ ID NO:70的示例性rMVA核酸***物，其编码S 蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 327-524)-S蛋白跨膜结构域(STM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图3M-3N是SEQ ID NO:71的示例性rMVA核酸***物，其编码S 蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 331-524)-S蛋白跨膜结构域(STM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图3O-3P是SEQ ID NO:72的示例性rMVA核酸***物，其编码S 蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 331-524)-S蛋白跨膜结构域(STM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图3Q提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 327-524)融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，融合蛋白包括来源于S蛋白(SP) 的氨基酸1-13的S蛋白信号肽和S蛋白RBD(aa 327-524)肽。起始密码子提供在SP-S RBD(aa 327-524)融合编码核酸的5’。***物可以包括在信号肽编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在SP-S RBD(aa 327-524)的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与SP-S RBD(aa 327-524)-融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至 mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图3R提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 331-524)融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来源于S蛋白 (SP)的氨基酸1-13的S蛋白信号肽和S蛋白RBD(aa 331-524)肽。起始密码子提供在SP-S RBD(aa 331-524)融合物编码核酸的5’。***物可以包括在信号肽编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在SP-S RBD(aa 331-524) 的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与SP-S RBD(aa 331-524)融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的， M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3’端与 M蛋白编码序列的3’端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图3S提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 327-598)融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，融合蛋白包括来源于S蛋白(SP) 的氨基酸1-13的S蛋白信号肽和S蛋白RBD(aa 327-598)肽。起始密码子提供在SP-S RBD(aa 327-598)融合编码核酸的5’。***物可以包括在信号肽编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在SP-S RBD(aa 327-598)的3’末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与SP-S RBD(aa 327-598)融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3’端与M 蛋白编码序列的3’端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图3T提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 331-598)融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，融合蛋白包括来源于S蛋白(SP) 的氨基酸1-13的S蛋白信号肽和S蛋白RBD(aa 331-598)肽。起始密码子提供在SP-S RBD(aa 331-598)融合编码核酸的5’。***物可以包括在信号肽编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在SP-S RBD(aa 331-598)的3’末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与SP-S RBD(aa 331-598)融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至 mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图3U-3V是SEQ ID NO:158的示例性rMVA核酸***物，其编码S 蛋白信号肽(SP)-S蛋白RBD(aa 331-524)-S蛋白跨膜结构域(STM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图4A提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白RBD 来源的氨基酸、E蛋白和M蛋白的串联重复的核酸序列。如所示例的， mH5启动子(pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码S RBD串联重复((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)5的核酸。起始密码子提供在S RBD串联重复的5’。***物可以包括在S RBD串联重复序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在S RBD串联重复蛋白的3'末端处包括编码标签(例如 C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与S RBD 串联重复蛋白相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。与S RBD串联重复类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3’端与M蛋白编码序列的3’端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至pmH5启动子。 M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图4B-4C是编码S蛋白RBD来源的氨基酸的串联重复、E蛋白和 M蛋白的SEQ ID NO：73的示例性rMVA核酸***物。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak 调节序列、连接子序列和c-标签序列。
图4D-4E是编码S蛋白RBD来源的氨基酸的串联重复、E蛋白和 M蛋白的SEQ ID NO：74的示例性rMVA核酸***物。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列、连接子序列和c-标签序列。
图4F提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白氨基酸1-13的信号肽(SP)-S蛋白RBD串联重复-S蛋白跨膜结构域(STM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右方向，所述融合蛋白包括来源于S蛋白的氨基酸1-13的信号肽(SP)、S蛋白 RBD串联重复肽和来源于S蛋白的氨基酸1214-1273的跨膜结构域 (STM)。起始密码子提供在SP-S RBD串联重复-STM融合物编码核酸的5’。***物可以包括在信号肽编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在SP-S RBD 串联重复STM融合物的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与SP-S RBD串联重复-STM 融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E 蛋白编码序列的3’端与M蛋白编码序列的3’端相邻。如所示例的，M 蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图4G-4H是SEQ ID NO:81的示例性rMVA核酸***物，其编码S 蛋白氨基酸1-13的信号肽(SP)-S蛋白RBD串联重复-S蛋白跨膜结构域(STM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗p11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图4I-4J是SEQ ID NO:82的示例性rMVA核酸***物，其编码S 蛋白氨基酸1-13的信号肽(SP)-S蛋白RBD串联重复-S蛋白跨膜结构域(STM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗 mH5启动子、痘苗p11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图5A提供示例性的重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白 RBD共有序列、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码S RBD共有蛋白的核酸。起始密码子提供在S RBD共有物编码核酸的5’。***物可以包括在S RBD共有蛋白编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如 Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在S RBD共有蛋白的3’末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与S RBD共有蛋白编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。与S RBD共有蛋白类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，所述***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中所述E蛋白编码序列的3’末端与所述M蛋白编码序列的3’末端相邻。如所示例的，所述M蛋白编码序列可操作地连接mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图5B提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码S蛋白氨基酸1-13信号肽(SP)-S蛋白RBD共有物-S蛋白跨膜结构域(STM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来源于S蛋白(SP)的氨基酸1-13的信号肽、S 蛋白RBD共有肽和来源于S蛋白(STM)的氨基酸1214-1273的跨膜结构域。起始密码子提供在SP-S RBD共有-STM融合物编码核酸的5'。***物可以包括在信号肽编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在SP-S RBD共有物-STM 融合物的3’末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与SP-S RBD共有物STM融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。 E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所例示的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3' 端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前编码在所述编码序列的3'末端处的标签的核酸序列。
图6A提供示例性的重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码来源于S 蛋白的截短的氨基酸1-1213(S1+S2截短的)、E蛋白和M蛋白的核酸。如所示例的，mH5启动子(pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码来源于S蛋白的截短的氨基酸1-1213(S1+S2截短的)的核酸。***物可以包括在S(S1+S2截短的)蛋白序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在S蛋白 (S1+S2截短的)的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与S蛋白(S1+S2截短的)相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。与S蛋白(S1+S2截短的)类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，所述***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中所述E蛋白编码序列的3’端与所述M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图6B-6C-6D是SEQ ID NO：83的示例性rMVA核酸***物，其编码来源于S蛋白的截短的氨基酸1-1213(S1+S2截短的)、E蛋白和M 蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图6E-6F-6G是SEQ ID NO：84的示例性rMVA核酸***物，其编码来源于S蛋白的截短的氨基酸1-1213(截短的S1+S2)、E蛋白和M 蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、 SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图6H提供示例性的重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码在氨基酸981和982处具有两个脯氨酸取代的来源于S蛋白的截短的氨基酸 1-1213(S1+S2截短的)、E蛋白和M蛋白的核酸。如所示例的，mH5 启动子(pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码来源于S蛋白的截短的氨基酸1-1213(S1+S2截短的+K986P和V987P)的核酸。***物可以包括在S(S1+S2截短的+K986P和V987P)蛋白序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在S蛋白(S1+S2截短的+K986P和V987P)的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与S蛋白(S1+S2截短的+K986P和V987P)相邻的是编码全长 E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。与S蛋白(S1+S2 截短的+K986P和V987P)类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3’端与M蛋白编码序列的3’端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。 M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图6I-6J-6K是SEQ ID NO：85的示例性rMVA核酸***物，其编码在氨基酸981和982处具有两个脯氨酸取代的来源于S蛋白的截短的氨基酸1-1213(S1+S2截短的)、E蛋白和M蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图6L-6M-6N是SEQ ID NO：86的示例性rMVA核酸***物，其编码在氨基酸981和982处具有两个脯氨酸取代的来源于S蛋白的截短的氨基酸1-1213(S1+S2截短的)、E蛋白和M蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图7A提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A5R和A6L之间的编码信号糖蛋白 (Signal GP)-S蛋白RBD共有物-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子 (pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右方向，所述融合蛋白包括来源于非冠状病毒信号糖蛋白(Signal GP)的信号肽 (SP)、S蛋白RBD共有肽和所述糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal SP-S RBD共有物-GP TM融合编码核酸的5'。***物可以包括在信号肽编码序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在Signal GP-S RBD 共有物-GP TM融合物的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与Signal GP-S RBD共有物-GP TM融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3' 末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长 M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40) 的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如mH5启动子(pmH5)。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图7B提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A5R和A6L之间的编码信号糖蛋白 (Signal GP)-S蛋白RBD(aa 331 524)共有物-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的， mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒信号糖蛋白(Signal GP)的信号肽、S蛋白RBD(aa 331-524)共有肽和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP-S RBD(aa 331-524)共有物-GP TM融合编码核酸的5'。***物可以在信号肽编码序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在Signal GP-S RBD(aa 331-524)共有物-GP TM融合物的 3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与Signal GP-S RBD(aa 331-524)共有物-GP TM 融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。所述E蛋白核酸序列也可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中 E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M 蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如mH5启动子(pmH5)。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图7C-7D是SEQ ID NO:103的示例性rMVA核酸***物，其编码信号糖蛋白(SignalGP)-S蛋白RBD(aa 331-524)共有物-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图7E-7F是SEQ ID NO：104的示例性rMVA核酸***物，其编码信号糖蛋白(SignalGP)-S蛋白RBD(aa 331-524)共有物-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图7G提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码信号糖蛋白(Signal GP)-S蛋白RBD(aa 327-524)共有物-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，融合蛋白包括来源于非冠状病毒信号糖蛋白(Signal GP) 的信号肽、S蛋白RBD(aa 327-524)共有肽和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP-S RBD(aa 327-524)共有物-GP TM 融合编码核酸的5'。***物可以在信号肽编码序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在Signal GP-S RBD(aa 327-524)共有物-GP TM融合物的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与Signal GP-S RBD(aa 327-524)-共有物-GP TM融合编码序列相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如mH5启动子(pmH5)。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图7H-7I是SEQ ID NO：101的示例性rMVA核酸***物，其编码信号糖蛋白(SignalGP)-S蛋白RBD(aa 327-524)共有物-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图7J-7K是SEQ ID NO：102的示例性rMVA核酸***物，其编码信号糖蛋白(SignalGP)-S蛋白RBD(aa 327-524)共有物-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图8A提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白 (Signal GP MARV)-S蛋白RBD衍生的氨基酸的串联重复-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽 (Signal GP MARV)、S RBD串联重复 ((aa504-524)-GPGPG-(a473-490)GPGPG)5和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP MARV-S RBD串联重复-GP TM融合编码序列的5’。***物可以在Signal GPMARV-S RBD串联重复-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所例示的，以从左到右的方向，与所述融合蛋白相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。与融合蛋白类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。 M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白 VP40)的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如mH5启动子(pmH5)。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如 Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图8B-8C是SEQ ID NO:111的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD衍生的氨基酸的串联重复-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak 调节序列、连接子序列和c-标签序列。
图8D-8E是SEQ ID NO:112的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD衍生的氨基酸的串联重复-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列、连接子序列和c-标签序列。
图9A提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白 (Signal GP MARV)-来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213(S1+S2截短的)-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、S蛋白(S1+S2截短的)和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP MARV-S 蛋白截短的(S1+S2截短的)-GP TM融合编码序列的5’。***物可以在Signal GP MARV-S蛋白(S1+S2截短的)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与所述融合蛋白相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。与融合蛋白类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E 蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如mH5启动子(pmH5)。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图9B-9C-9D是SEQ ID NO：119的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(SignalGP MARV)-来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213 (S1+S2截短的)-糖蛋白的跨膜结构域(GPTM)融合蛋白、E蛋白和 M蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图9E-9F-9G是SEQ ID NO：120的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(SignalGP MARV)-来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213 (S1+S2截短的)-糖蛋白的跨膜结构域(GPTM)融合蛋白、E蛋白和 M蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图9H提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白 (Signal GP MARV)-来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213(S1+S2截短的+K986P和V987P)-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白、E 蛋白和M蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GPMARV)、S蛋白(S1+S2 截短的+K986P和V987P)和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP MARV-S蛋白截短的(S1+S2截短的+K986P和 V987P)-GP TM融合编码序列的5’。***物可以在Signal GP MARV-S 蛋白(S1+S2截短的+K986P和V987P)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签) 的核酸序列。如所示例的，以从左到右的方向，与所述融合蛋白相邻的是编码全长E蛋白的核酸序列，其可操作地连接至例如p11启动子。与融合蛋白类似，E蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，***物进一步包括编码全长M蛋白的核酸序列。如所示例的，M蛋白编码序列以从右到左的方向定向，其中E蛋白编码序列的3'端与M蛋白编码序列的3'端相邻。如所示例的，M蛋白编码序列可操作地连接至mH5启动子(pmH5)。M蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如mH5启动子(pmH5)。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图9I-9J-9K是SEQ ID NO：121的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(SignalGP MARV)-来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213 (S1+S2截短的+K986P和V987P)-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图9L-9M-9N是SEQ ID NO：122的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(SignalGP MARV)-来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213 (S1+S2截短的+K986P和V987P)-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM) 融合蛋白、E蛋白和M蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图10A提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白(Signal GP MARV)-S蛋白截短的S1+S2-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白的核酸序列，以及***在例如MVA基因A50R和B1R之间的编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5) 可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213(S1+S2截短的)和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP MARV-S蛋白(S1+S2截短的)-GP TM融合编码核酸(以从左到右的方向)的5’。***物可以在Signal GP MARV-S蛋白(S1+S2截短的)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签) 的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R 之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5启动子。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图10B-10C是SEQ ID NO：123的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白截短的S1+S2-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图10D-10E是SEQ ID NO:124的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白截短的S1+S2-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c- 标签序列。
图10F提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白(Signal GP MARV)-S蛋白S1+S2截短的+K986P和V987P-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白的核酸序列，以及***在MVA基因A50R和 B1R之间的编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213(S1+S2截短的)加在氨基酸981和982的两个脯氨酸取代和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP MARV-S蛋白(截短的S1+S2)-GP TM融合编码核酸的5’(以从左到右的方向)。***物可以在Signal GP MARV-S 蛋白(S1+S2截短的+K986P和V987P)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签) 的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R 之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5启动子。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图10G-10H是SEQ ID NO：125的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白S1+S2截短的+K986P和V987P- 糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c- 标签序列。
图10I-10J是SEQ ID NO：126的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白S1+S2截短的+K986P和V987P- 糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图10K提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白 (Signal GP MARV)-S蛋白截短的S1+S2-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白的核酸序列，以及编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213 (S1+S2截短的)和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP MARV-S蛋白(S1+S2截短的)-GP TM融合编码核酸的 5'(以从左到右的方向)。***物可以在Signal GP MARV-S蛋白(S1+S2 截短的)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列也作为例如双顺反子序列***。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5启动子，并且以从3'到5'的方向定向。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图10L-10M-10N是SEQ ID NO：127的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GP MARV)-S蛋白截短的S1+S2-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白和MARCVP40蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图10O-10P-10Q是SEQ ID NO：128的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GP MARV)-S蛋白截短的S1+S2-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白和MARCVP40蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图10R提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白 (Signal GP MARV)-S蛋白截短的S1+S2加在氨基酸981和982处的两个脯氨酸取代-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白的核酸序列，以及编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子 (pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、来源于S蛋白的截短的氨基酸2-1213(S1+S2截短的+K986P 和V987P)和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP MARV-S蛋白(S1+S2截短的+K986P和V987P)-GP TM融合编码核酸的5'(以从左到右的方向)。***物可以在Signal GP MARV-S 蛋白(S1+S2截短的+K986P和V987P)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签) 的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列也作为例如双顺反子序列***。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5启动子，并且以从3'到 5'的方向定向。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图10S-10T-10U是SEQ ID NO：129的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GP MARV)-S蛋白截短的S1+S2加在氨基酸981 和982处的两个脯氨酸取代-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM982融合蛋白和MARC VP40蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗 P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图10V-10W-10X是SEQ ID NO：130的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GP MARV)-S蛋白截短的S1+S2加在氨基酸981 和982处的两个脯氨酸取代-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白和 MARC VP40蛋白。在序列中还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗 P11启动子、SmaI限制性位点、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图11A提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白(Signal GP MARV)-S蛋白RDB-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白的核酸序列，以及***到MVA基因A5R和A6L之间的编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GPMARV)、S蛋白RBD区和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在糖蛋白-S RBD融合编码核酸的5’(以从左到右的方向)。***物可以在Signal GP MARV-S RBD-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如 Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5启动子。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图11B提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A50R和B1R之间的编码信号糖蛋白 (Signal GP MARV)-S蛋白RBD(331-524)-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白的核酸序列，以及***在MVA基因A50R和B1R之间的编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子 (pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、S蛋白RBD(331-524)区域和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在糖蛋白-S RBD(331-524)融合编码核酸的5’(以从左到右的方向)。***物可以在Signal GP MARV-S RBD(331-524)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列***在MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如 pmH5启动子。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图11C是SEQ ID NO：133的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD(aa 331-524)-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图11D是SEQ ID NO：134的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD(aa 331-524)-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列、SmaI限制性位点和c-标签序列。
图11E提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A50R和B1R之间的编码糖蛋白(Signal GP MARV)-S蛋白RBD(327-524)-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM) 融合蛋白的核酸序列，以及***在MVA基因A50R和B1R之间的编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5) 可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、S蛋白RBD(327-524)区域和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在糖蛋白-S RBD(327-524)融合编码核酸的5’。***物可以在 Signal GP MARV-S RBD(327-524)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40)的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5启动子。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak 序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图11F是SEQ ID NO：131的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD(327-524)-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图11G是SEQ ID NO：132的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD(327-524)-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列、SmaI限制性位点和c- 标签序列。
图11H提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白 (Signal GP MARV)-S蛋白RDB-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白的双顺反子核酸序列，以及编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、S蛋白RBD区和糖蛋白的跨膜结构域 (GP TM)。起始密码子提供在糖蛋白-S RBD融合编码核酸的5'(以从左到右的方向)。***物可以在Signal GP MARV-S RBD-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如 C-亲和标签)的核酸序列。另外，双顺反子核酸序列也编码非冠状病毒基质蛋白，例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5启动子。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图11I提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白 (Signal GP MARV)-S蛋白RBD(aa 331-524)-糖蛋白的跨膜结构域 (GP TM)融合蛋白的双顺反子核酸序列，以及编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GPMARV)、S蛋白RBD(aa 331-524) 区域和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在糖蛋白-S RBD 融合编码核酸的5’(以从左到右的方向)。***物可以在Signal GP MARV-SRBD(aa 331-524)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例另外C-亲和标签)的核酸序列。另外，双顺反子核酸序列还编码非冠状病毒基质蛋白，例如马尔堡病毒基质蛋白VP40。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5 启动子。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3' 末端处编码标签的核酸序列。
图11J-11K是SEQ ID NO：137的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD(aa 331-524)共有物-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白和MARVVP40蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、 Kozak调节序列和c-标签序列。
图11L-11M是SEQ ID NO：138的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD(aa 331-524)-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白和MARV VP40蛋白的。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak 调节序列、SmaI限制性位点和c-标签序列。
图11N提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白 (Signal GP MARV)-S蛋白RBD(aa 327-524)-糖蛋白的跨膜结构域 (GP TM)融合蛋白的双顺反子核酸序列，以及编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GPMARV)、S蛋白RBD(aa 327-524) 区域和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在糖蛋白-S RBD 融合编码核酸的5'(以从左到右的方向)。***物可以在Signal GP MARV-SRBD(aa 327-524)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例另外C-亲和标签)的核酸序列。另外，双顺反子核酸序列还编码非冠状病毒基质蛋白，例如马尔堡病毒基质蛋白VP40。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5 启动子。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3' 末端处编码标签的核酸序列。
图11O-11P是SEQ ID NO：135的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD(aa 327-524)-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白和MARV VP40蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak 调节序列和c-标签序列。
图11Q-11R是SEQ ID NO：136的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD(aa 327-524)-糖蛋白的跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白和MARV VP40蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak 调节序列、SmaI限制性位点和c-标签序列。
图12A提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白(Signal GP MARV)-S蛋白RBD衍生的氨基酸的串联重复-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白的核酸序列，以及***在MVA基因A50R和B1R之间的编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子 (pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、S RBD串联重复((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)GPGPG)5和糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)。起始密码子提供在Signal GP MARV-S RBD串联重复-GP TM融合编码序列的5'。***物可以在Signal GP MARV-S RBD串联重复-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签)的核酸序列。如所示例的，将编码非冠状病毒基质蛋白(例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40) 的核酸序列***在例如MVA基因A50R和B1R之间。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如mH5启动子(pmH5)。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图12B是SEQ ID NO:139的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD衍生的氨基酸的串联重复-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5 启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图12C是SEQ ID NO:140的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD衍生的氨基酸的串联重复-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5 启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列、SmaI限制性位点和c-标签序列。
图12D提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码糖蛋白 (Signal GP MARV)-S蛋白RBD串联重复((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)5)-糖蛋白的跨膜结构域(GP TM)融合蛋白的双顺反子核酸序列，以及编码非冠状病毒基质蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)可操作地连接至编码融合蛋白的核酸，其中以从左到右的方向，所述融合蛋白包括来自非冠状病毒糖蛋白的信号肽(Signal GP MARV)、S蛋白RBD串联重复 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)GPGPG)5)区域和糖蛋白的跨膜结构域 (GP TM)。起始密码子提供在糖蛋白-S RBD融合编码的5'(以从左到右的方向)。***物可以在Signal GP MARV-S蛋白RBD-串联重复 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)5)-GP TM融合序列的起始密码子之前，包括翻译起始序列，例如Kozak序列。此外，可以在终止密码子之前，在所述融合蛋白的3'末端处包括编码标签(例如C-亲和标签) 的核酸序列。另外，双顺反子核酸序列也编码非冠状病毒基质蛋白，例如，马尔堡病毒基质蛋白VP40。编码基质蛋白的核酸序列可操作地连接至例如pmH5启动子。与融合蛋白类似，基质蛋白核酸序列还可以包括合适的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图12E-12F是SEQ ID NO：141的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD串联重复 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)5)-糖蛋白跨膜结构域序列(GP TM)融合蛋白和MARV VP40蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5 启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图12G-12H是SEQ ID NO：142的示例性rMVA核酸***物，其编码糖蛋白(Signal GPMARV)-S蛋白RBD串联重复 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)5)-糖蛋白的跨膜结构域序列 (GP TM)融合蛋白和MARV VP40蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列、SmaI 限制性位点和c-标签序列。
图13A提供示例性重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A5R和A6L之间的编码全长S蛋白的核酸序列。如所示例的，mH5启动子(pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码全长SARS-CoV2 S蛋白的核酸。***物可以包括在S 蛋白序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图13B-13C是SEQ ID NO:143的示例性rMVA核酸***物，其编码全长S蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗MH5启动子、痘苗P11 启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图13D-13E是SEQ ID NO：144的示例性rMVA核酸***物，其编码全长S蛋白。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11 启动子、起始密码子、Kozak调节序列、SmaI限制性位点和c-标签序列。
图14A提供示例性的重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在MVA基因A5R和A6L之间的编码稳定化的S 蛋白的核酸的***物。如所示例的，mH5启动子(pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码全长SARS-CoV2 S稳定化的蛋白的核酸。***物可以包括在S稳定化的蛋白序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3’末端处编码标签的核酸序列。
图14B-14C是SEQ ID NO：145的示例性rMVA核酸***物，其编码全长稳定化的S蛋白加在氨基酸981和982处的两个脯氨酸取代。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图14D-14E是SEQ ID NO：146的示例性rMVA核酸***物，其编码全长稳定化的S蛋白加在氨基酸981和982处的两个脯氨酸取代。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列、SmaI限制性位点和c-标签序列。
图15A提供示例性的重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码氨基酸的1-1213截短的S蛋白(S1+S2截短的)的核酸序列。如所示例的， mH5启动子(pmH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码全长 SARS-CoV2 S(S1+S2截短的)蛋白的核酸序列。***物可以包括在S (S1+S2截短的)蛋白序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如 Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图15B-15C是SEQ ID NO：147的示例性rMVA核酸***物，其编码氨基酸1-1213截短的S蛋白(S1+S2截短的)。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图15D-15E是SEQ ID NO：148的示例性rMVA核酸***物，其编码氨基酸1-1213截短的S蛋白(S1+S2截短的)。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、疫苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列、 SmaI限制性位点和c-标签序列。
图15F提供示例性的重组MVA病毒载体的示例性线性示意图，所述病毒载体包含***在例如MVA基因A5R和A6L之间的编码氨基酸的1-1213截短的S蛋白(S1+S2截短的+K986P和V987P)的核酸序列。如所示例的，MH5启动子(PMH5)以从左到右的方向可操作地连接至编码全长SARS-COV2 S(S1+S2截短的+K986P和V987P)蛋白的核酸序列。***物可以包括在S(S1+S2截短的+K986P和V987P) 蛋白序列的起始密码子之前的翻译起始序列，例如Kozak序列，以及在终止密码子之前在所述编码序列的3'末端处编码标签的核酸序列。
图15G-15H是SEQ ID NO：149的示例性rMVA核酸***物，其编码氨基酸1-1213截短的S蛋白(S1+S2截短的)加在K986P和V987P 处的两个脯氨酸取代。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列和c-标签序列。
图15I-15J是SEQ ID NO：150的示例性rMVA核酸***物，其编码氨基酸1-1213截短的S蛋白(S1+S2截短的)加在K986P和V987P 处的两个脯氨酸取代。在序列内还示例和鉴定了痘苗mH5启动子、痘苗P11启动子、起始密码子、Kozak调节序列、SmaI限制性位点和c- 标签序列。
图16是CEF细胞的免疫细胞化学测定的图像，所述CEF细胞用表达S、M和E VLP的重组MVA构建体GEO-CM01感染，暴露于一级小鼠抗SARS-CoV-2刺突抗体和二级抗小鼠HRP抗体，并用AEC过氧化物酶底物进行显影。箭头指示对于S蛋白表达染色阳性的斑块。
图17是显示S蛋白抗原***物扩增的PCR凝胶。GEO-CM01代表表达S、M和E VLP的重组MVA构建体GEO-CM01；使用50ng来自用于产生GEO-CM01的穿梭质粒(阳性对照)的DNA产生阳性对照；以及阴性对照代表MVA亲本株。
图18是显示S蛋白抗原***物扩增的PCR凝胶。CM01病毒DNA 代表表达S、M和E VLP的重组MVA构建体GEO-CM01；Cmol质粒代表使用来自50ng用于产生GEO-CM01的穿梭质粒的DNA产生的阳性对照；CM02病毒DNA代表表达稳定化的S、M和E VLP的重组MVA 构建体GEO-CM02；CM02质粒代表使用50ng来自用于产生GEO-CM02 的穿梭质粒的DNA产生的阳性对照；CM03病毒DNA代表表达S蛋白的RBD、M和E VLP的重组MVA构建体GEO-CM03；CM03质粒代表使用50ng来自用于产生GEO-CM03的穿梭质粒的DNA产生的阳性对照；和空MVA DNA代表作为阴性对照的MVA亲本株。
图19是用重组MVA构建体GEO-CMO1(COVID M01)、 GEO-CMO2(COVID M02)和GEO-CMO3(COVID M03)感染的DF1 细胞的细胞裂解物和上清液中S蛋白抗原表达的蛋白质印迹，表明病毒样颗粒的形成。
图20是GEO-CM01感染的DF1细胞中病毒样颗粒形成的电子显微镜图像。
图21是SARS-CoV2中和测定法的示意图。对来自免疫接种动物的血清测试中和活SARS-CoV-2的能力。将系列稀释的血清与SARS-CoV-2 一起孵育，然后，通过噬斑测定法测定中和水平。
图22是在免疫接种金仓鼠之后，对重组刺突-膜融合体、刺突和S 蛋白的受体结合结构域(RBD)的抗体检测特异性的ELISA的示意图。
图23是在金仓鼠中初次/加强(GEO-CM01)与对照试验中， SARS-CoV2攻击后的体重和健康评分随时间推移的示意图。P＝0.0003 Friendman检验，接着Dunn多重比较检验。
图24是pAd-L/S-ME的穿梭载体图谱。
图25是pAd-1/sS-Me的穿梭载体图谱。
图26是pAd-1/pUC57的穿梭载体图谱。
图27是显示S蛋白抗原***物扩增的PCR凝胶。GEO-CM02代表表达稳定化的S、M和EVLP的重组MVA构建体GEO-CM02；使用50ng 来自用于产生GEO-CM02的穿梭质粒(阳性对照)的DNA产生阳性对照；和阴性对照代表MVA亲本株。
图28是显示RBD抗原***物扩增的PCR凝胶。GEO-CM03代表表达稳定化的RBD、M和EVLP的重组MVA构建体GEO-CM03；使用50ng来自用于产生GEO-CM03的穿梭质粒(阳性对照)的DNA产生阳性对照；和阴性对照代表MVA亲本株。使用来自GEO-CM01的扩增产物作为比较。
图29是显示RBD抗原***物扩增的PCR凝胶。GEO-CM03b代表表达RBD的重组MVA构建体GEO-CM03b；使用50ng来自用于产生 GEO-CM03b的穿梭质粒的DNA产生阳性对照(P＝阳性对照)；和阴性对照代表MVA亲本株(M)。M＝MVA亲本；P＝pGeo-MTRBD质粒 DNA；Cl.1＝MVA-RBDVP40克隆#4/01；Cl.2＝MVA-RBDVP40克隆 #4/02。预期的PCR片段如下：p53/p54：MVA亲本(M)＝647bp； MVA-RBDVP40/GFP–2544bp(上部箭头)；MVA-RBDVP40–1558bp (中上箭头)；pGEO-MTRBD–2544bp.P55/p54＝MVA亲本(M)＝ 377bp(下部箭头)；MVA-RBDVP40/GFP–1288bp(中下箭头)； MVA-RBDVP40–1288bp(中下箭头)；pGEO-MTRBD–1288bp(中下箭头)。
详细说明
本文提供疫苗组合物，其包含能够表达一种或多种SARS-CoV2 (2019-新型冠状病毒)抗原、其片段、其变体或其组合的重组MVA病毒载体。所述疫苗可用于抵抗SARS-CoV2，从而治疗、预防和/或抵抗基于SARS-CoV2的病理学。所述疫苗可以显著诱导施用该疫苗的受试者的免疫应答，从而抵抗和治疗SARS-CoV2感染。
本发明的组合物和方法可以以治疗有效量使用，以预防未暴露 SARS-CoV2的人的感染或治疗暴露于SARS-CoV2的受试者的疾病，从而减轻疾病的严重程度。
在一些实施方案中，所述组合物和方法可用作加强疫苗，以增加或调节或改变先前SARS-CoV2疫苗诱导的免疫应答；例如RNA疫苗或 DNA疫苗或病毒载体疫苗，例如腺病毒疫苗载体，或基于蛋白质的疫苗或包含SARS-CoV2的死或灭活制剂(含有或不含有佐剂)的疫苗，或减毒SARS-CoV2的疫苗。在一些实施方案中，这些组合物和方法可以用作在感染SARS-CoV2并从SARS-CoV2中恢复后的加强疫苗。
理想的免疫原性组合物或疫苗具有安全性、功效、保护范围和长寿的特征。具有少于所有这些特征的组合物仍然可用于预防SARS-CoV2 感染或限制在症状发展之前已治疗的暴露受试者的症状或疾病进展。在一个实施方案中，本发明提供在单次免疫接种之后允许至少部分(如果不是完全)保护的疫苗。
疫苗可在施用疫苗的受试者中诱导体液免疫应答。所诱导的体液免疫应答可以对以下的一个或多个具有特异性：rMVA表达的SARS-CoV2 抗原表位或区域，其对SARS-CoV2具有特异性，或其他冠状病毒中也存在的保守表位或区段。所诱导的体液免疫应答可以与一种或多种表达的SARS-CoV2抗原反应。
由疫苗诱导的体液免疫应答可包括与未施用疫苗的受试者相比，与施用所述疫苗的受试者相关的中和抗体的增加水平。此外，由疫苗诱导的体液应答可包括先前已感染SARS-CoV2的患者的中和抗体的增加水平，其中本发明的rMVA充当加强剂起作用。由疫苗诱导的体液应答可包括先前施用不同SARS-CoV2疫苗的那些人的中和抗体的水平增加，其中本发明的rMVA充当加强剂起作用。中和抗体可以对由rMVA病毒载体表达的SARS-CoV2抗原或其片段具有特异性。中和抗体可以与 SARS-CoV2抗原反应。中和抗体可以在施用疫苗的受试者中提供针对SARS-CoV2感染及其相关病变的保护和/或治疗SARS-CoV2感染及其相关病理学。
与未施用疫苗的受试者相比，由疫苗诱导的体液免疫应答可包括与施用疫苗的受试者相关的IgG抗体的增加水平。这些IgG抗体可以对至少一种SARS-CoV2抗原具有特异性。
疫苗可以在施用疫苗的受试者中诱导细胞免疫应答。所诱导的细胞免疫应答可以对SARS-CoV2抗原具有特异性。所诱导的细胞免疫应答可以与SARS-CoV2抗原反应。所诱导的细胞免疫应答可包括引发 CD8+T细胞应答。所引发的CD8+T细胞应答可以与SARS-CoV2特异性的SARS-CoV2抗原表位或区域或其他冠状病毒中也存在的保守表位或区段反应。
引发的CD8+T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8+T细胞应答，其中CD8+T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)或IFN-γ和TNF-α的组合。
所诱导的细胞免疫应答可包括与未施用疫苗的受试者相比，与施用疫苗的受试者相关的增加的CD8+T细胞应答增加。所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ的CD3+CD8+T细胞的增加频率。所诱导的细胞免疫应答可包括产生TNF-α的CD3+CD8+T细胞的增加频率。所诱导的细胞免疫应答可包括产生IL-2的CD3+CD8+T细胞的增加频率。所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ和TNF-α两者的CD3+CD8+T细胞的增加频率。
由疫苗诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4+T细胞应答。所引发的CD4+T细胞应答可以与SARS-CoV2抗原反应。所引发的CD4+T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4+T细胞应答，其中CD4+T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2或IFN-γ和TNF-α的组合。
所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ的CD3+CD4+T细胞的增加频率。所诱导的细胞免疫应答可包括产生TNF-α的CD3+CD4+T细胞的增加频率。所诱导的细胞免疫应答可包括产生IL-2的CD3+CD4+T细胞的增加频率。所诱导的细胞免疫应答可包括产生IFN-γ和TNF-α两者的CD3+CD4+T细胞的增加频率。
在一些实施方案中，由所述疫苗诱导的上述这些增加的细胞免疫应答是在先前已感染SARS-CoV2的受试者中，其中本发明的rMVA充当加强剂起作用。在一些实施方案中，由疫苗诱导的上述这些增加的细胞免疫应答是在先前已经施用不同的SARS-CoV2疫苗的受试者中，其中本发明的rMVA充当加强剂起作用。
定义
当术语以单数形式提供时，本发明人还考虑了由该术语的复数形式描述的本发明的方面。如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，例如“一种肽”包括多种肽。因此，例如，提及“一种方法”包括一种或多种方法和/或本文所述类型的步骤，和/或在阅读本公开内容后对于本领域技术人员将变得显而易见的方法和/或步骤。
如本文使用的术语“佐剂”指加入到本文所述的疫苗中以增强组合物的免疫原性的任何分子。
术语“抗原”指能够诱导免疫应答的物质或分子，例如蛋白质或其片段。
如本文使用的“编码序列”或“编码核酸”或“编码的核酸序列”等指包含编码蛋白质或其片段的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。
术语“保守氨基酸取代”指用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对该位置处的氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性几乎没有或没有影响，并且不会导致显著改变的免疫原性。例如，这些可以是以下组之内的取代：缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。对多肽序列的保守氨基酸修饰(以及对编码核苷酸的相应修饰)可以产生具有与亲本多肽相似的功能和化学特征的多肽。
在多肽或蛋白质的上下文中，术语“缺失”指从多肽或蛋白质序列中去除一个或多个氨基酸残基的密码子，其中任一侧的区域连接在一起。在核酸的情形中，术语缺失指从核酸序列中去除一个或多个碱基，其中任一侧的区域连接在一起。
在蛋白质试剂的情形中，术语“片段”指包含肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列的至少2个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少 10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少 50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少 100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。在一个实施方案中，片段构成参考多肽全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％或90％。在一个实施方案中，全长蛋白的片段保留全长蛋白质的活性。在另一个实施方案中，全长蛋白的片段不保留全长蛋白的活性。
在核酸情形中，术语“片段”指包含编码肽、多肽或蛋白质的核酸序列的至少2个连续核苷酸、至少5个连续核苷酸、至少10个连续核苷酸、至少15个连续核苷酸、至少20个连续核苷酸、至少25个连续核苷酸、至少30个连续核苷酸、至少35个连续核苷酸、至少40个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少60个连续核苷酸、至少70个连续核苷酸、至少80个连续核苷酸、至少90个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸、至少125个连续核苷酸、至少150个连续核苷酸、至少175个连续核苷酸、至少200个连续核苷酸、至少250个连续核苷酸、至少300个连续核苷酸、至少350个连续核苷酸、或至少380个连续核苷酸的核酸序列的核酸。在一个实施方案中，片段构成参考核酸序列全长的至少30％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一个优选的实施方案中，核酸片段编码保留全长蛋白的活性的肽或多肽。在另一个实施方案中，片段编码不保留全长蛋白的活性的全长蛋白质的肽或多肽。
如本文使用的短语“异源序列”指在自然界中通常不与另一种目标核酸或蛋白质、多肽或肽序列相关的任何核酸、蛋白质、多肽或肽序列。
如本文使用的短语“异源核酸***物”指已经或将要***本文所述的重组载体中的任何核酸序列。异源核酸***物可以仅指基因产物编码序列，或者可以指包含启动子、基因产物编码序列(例如膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白、刺突(S)蛋白)和与其相关联或可操作地连接的任何调节序列的序列。
术语“均聚物节段(stretch)”是指包含至少四个不被任何其他核苷酸中断的相同核苷酸的序列，例如GGGG或TTTTTTT。
术语“诱导免疫应答”指在已经施用rMVA的受试者中引发针对 rMVA表达的一种或多种SARS-CoV2蛋白或其片段的体液应答(例如，抗体的产生)或细胞应答(例如，T细胞的活化)。
术语“修饰的安卡拉痘苗”或“MVA”是指由Anton Mayr博士通过在鸡胚成纤维细胞上连续传代开发的高度减毒的痘苗病毒株；或其变体或衍生物。MVA在Mayr，A.等人在1975Infection 3：6-14中综述。
如本文使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖基本上相同的核酸及其互补物。单链提供在严格杂交条件下可以与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA，基因组和cDNA两者，RNA或杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
如本文使用的“可操作地连接”指基因的表达在与其空间连接的启动子的控制下。启动子可以位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与该启动子与其控制的启动子来源于其的基因中的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的，该距离的变化可以在不丧失启动子功能的情况下调节。
如本文使用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以指氨基酸的连接的序列，并且可以是天然的、合成的、或天然的和合成的修饰或组合。
如本文使用的“启动子”指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然衍生的分子。启动子可包含一个或多个特异性转录调节序列，以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或抑制子元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对处。
术语“预防”和“防止”是指由于施用疗法或施用疗法组合而在受试者中抑制病症(例如，SARS-CoV2感染)的发展或发作，或者预防病症的一种或多种症状的复发、发作或发展。
术语“预防有效量”指组合物(例如，重组MVA载体或药物组合物) 的量，其足以导致预防病症或其症状(例如，SARS-CoV2感染)或与其相关的症状的发展、复发或发作或增强或改善另一种疗法的预防效果。
关于病毒载体而言，术语“重组”指已经例如使用重组核酸技术进行体外操作以表达异源病毒核酸序列的载体(例如病毒基因组)。
术语“调节序列”和“多个调节序列”共同指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起点、内部核糖体进入位点 (“IRES”)、增强子等，其共同提供编码序列的转录和翻译。并非所有这些控制序列都需要总是存在，只要所选择的基因能够被转录和翻译。
术语“穿梭载体”指可用于将遗传物质从一种宿主***转移到另一种宿主***中的遗传载体(例如，DNA质粒)。穿梭载体可以在至少一种宿主(例如大肠杆菌)中单独复制(不存在任何其他载体)。在MVA 载体构建的上下文中，穿梭载体通常是DNA质粒，其可以在大肠杆菌中操作，然后引入用MVA载体感染的培养细胞中，从而导致产生新的重组MVA载体。
术语“沉默突变”指核苷酸序列中的变化，其不会引起由核苷酸序列编码的蛋白质的一级结构变化，例如，从AAA(编码赖氨酸)到AAG (也编码赖氨酸)的变化。
术语“受试者”指任何哺乳动物，包括但不限于人类、家养动物和家畜，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛、大鼠、小鼠、豚鼠等。可以根据诊断测试或受试者或健康护理提供者的意见(例如，基因测试、酶或蛋白质标志物、标志物历史等)进行任何客观或主观判定来确定“处于风险中”的那些受试者。
术语“同义密码子”指使用具有不同核酸序列的密码子来编码相同的氨基酸，例如AAA和AAG(两者都编码赖氨酸)。密码子优化将蛋白质的密码子改变为载体或宿主细胞最常使用的同义密码子。
术语“治疗有效量”指当施用于哺乳动物用于预防或治疗病毒时，足以实现病毒的这样的预防或治疗的组合物(例如，重组MVA载体或药物组合物)的量。
术语“治疗”或“处理”指通过施用一种或多种疗法来根除或控制 SARS-CoV2感染，减少或改善由病毒引起的病症或一种或多种症状的进展、严重程度和/或持续时间。
术语“疫苗”指用于在向受试者施用材料之后引起免疫应答和赋予免疫性的材料。这样的免疫可以包括在施用疫苗之后当受试者暴露于免疫原时出现的细胞或体液免疫应答。
术语“疫苗***物”指当***到重组载体中时可操作地连接至表达用启动子的编码异源序列的核酸序列。异源序列可以编码本文所述的糖蛋白或基质蛋白。
术语“病毒样颗粒”或“VLP”指类似于病毒但因为其不含病毒遗传物质而不具有传染性的结构。
对于本文中数值范围的叙述，明确涵盖了具有相同精度的其间的每个介于其间的数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
SARS-CoV2抗原
本文提供重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码一种或多种SARS-CoV2蛋白、肽或其片段的异源核酸***物，所述异源核酸***物可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，所述痘病毒表达***在表达时能够诱导保护性免疫而不会诱导与先前MVA相关的冠状病毒疫苗接种策略相关的免疫病理学。
冠状病毒属于属于巢病毒目(Nidovirales)中的冠状病毒科 (Coronaviridae)，是单链包膜RNA病毒的一个大家族。它们可以分为四个属：α冠状病毒(Alphacoronavirus)、β冠状病毒(Betacoronavirus)、γ冠状病毒(Gammacoronavirus)和δ冠状病毒(Deltacoronavirus) (Perlman&Netland，Coronaviruses post-SARS：update onreplication and pathogenesis.Nature Reviews Microbiology 2009；7:439-450)。SARS-CoV2 属于β冠状病毒属，其还包括SARS-CoV、MERS-CoV、蝙蝠冠状病毒 HKU4、小鼠肝炎冠状病毒(MHV)、牛冠状病毒(BCoV)和人冠状病毒OC43。
在所有RNA病毒中，冠状病毒具有最大的基因组，通常范围为27 至32kb。基因组被包装在由核衣壳蛋白(N)形成的螺旋衣壳内，并且进一步被包膜包围。与病毒包膜相关的是至少三种结构蛋白：膜蛋白(M) 和包膜蛋白(E)参与病毒组装，而刺突蛋白(S)介导病毒进入宿主细胞。在这些结构蛋白中，刺突从病毒表面形成大的突起，赋予冠状病毒具有冠状物的外观(因此它们的名称：拉丁文中的冠意指冠状物)。除了介导病毒进入之外，刺突是病毒宿主范围和组织向性的关键决定因素，并且是宿主免疫应答的主要诱导物。
SARS-CoV2的完整基因组已经得到测序，并且已经指定GenBank 登录号MN908947.3。其由29,903个碱基对的单链RNA序列组成。迄今为止，已经鉴定了10个开放阅读框(ORF)，包括编码结构膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白和刺突(S)蛋白的基因。
刺突(S)蛋白
包膜锚定的刺突蛋白通过首先结合宿主受体，然后融合病毒和宿主膜来介导冠状病毒进入宿主细胞(Li F.2016.Structure,Function,and Evolution of CoronavirusSpike Proteins.Annu Rev Virol 3:237-261)。 SARS-CoV刺突的确定的受体结合结构域(RBD)特异性识别其宿主受体血管紧张素转化酶2(ACE2)(Li et al.,2003.Angiotensin-converting enzyme 2is a functional receptor for the SARS coronavirus.Nature426:450-454)。SARS-CoV2刺突和SARS-CoV刺突之间的总体序列相似性对于整个蛋白约为76％-78％，对于RBD约为73％-76％，对于受体结合基序(RBM)约为50％-53％，两种S蛋白之间的相似性表明ACE2 是SARS-CoV2受体的可能性。参见Wan et al.,J.Virol. doi:10.1128/JVI.00127-20。
冠状病毒刺突包含三个区段：大的胞外域、单通道跨膜锚和短的细胞内尾部。胞外域由受体结合亚基SI和膜融合亚基S2组成。电子显微镜研究显示刺突是三叶草形三聚体，具有三个S1头部和三聚的S2柄。参见，例如，Kirchdoerfer et al.,Pre-fusion structureof a human coronavirus spike protein.Nature.2016Mar 3；531(7592):118-21。在病毒进入期间，S1 结合宿主细胞表面上的受体用于病毒附着，S2融合宿主和病毒膜，允许病毒基因组进入宿主细胞。受体结合和膜融合是冠状病毒感染周期的最初和关键步骤。
SARS-CoV2刺突(S)蛋白的氨基酸序列长度为1273个氨基酸。S 蛋白已经在GenBank登录号QHD43416中报道，并且以SEQ ID NO：1 复制在表1中，其相应的核酸序列(SEQ ID NO:2)已经在GenBank登录号MN908947.3中报道，并且位于SARS-CoV2基因组的核酸 21563-25384。在一些实施方案中，rMVA包含编码SEQ ID NO：1的核酸序列，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的全长S蛋白的核酸已被如下所述优化，并且例如如SEQ ID NO:3或与其80％、85％、90％、95％、 98％或99％同源的核酸序列提供的。在某些实施方案中，编码标签的另外的核酸序列可以包括在待***到rMVA中的核酸序列中，使得标签在蛋白的C末端处表达。在一些实施方案中，核酸序列 (GAGCCAGAGGCT)(SEQ ID NO：4)编码具有氨基酸序列EPEA (SEQ IDNO：5)的高亲和力C-标签。
表1：SARS-CoV2刺突蛋白
Figure GDA0003957520830000631
Figure GDA0003957520830000641
Figure GDA0003957520830000651
Figure GDA0003957520830000661
Figure GDA0003957520830000671
Figure GDA0003957520830000681
Figure GDA0003957520830000691
Figure GDA0003957520830000701
Figure GDA0003957520830000711
在某些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白并含有一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有一个或多个选自SEQ ID NO：1的K417T、E484K或N501Y的取代。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白并且含有以下取代：SEQ ID NO：1 的K417T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，取代是K417N。在一些实施方案中，S蛋白表达为SEQ ID NO：6的全长蛋白，或与其80％、 85％、90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中， S蛋白表达为全长蛋白，并且具有SEQ ID NO：1的一个或多个刺突蛋白氨基酸H69、V70或Y144或其组合的缺失。在一些实施方案中，S 蛋白表达为全长蛋白，并且含有一个或多个选自SEQ ID NO：1的 D614G、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、K417N或K417T、 D215G、A701V、L18F、R246I、Y453F、I692V、M1229I、N439K、A222V、 S477N或A376T或其组合的取代。在一些实施方案中，变异菌株是在 SEQ ID NO：1的氨基酸242-244处具有刺突蛋白缺失的SARS-CoV2病毒。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有以下缺失和取代：SEQ ID NO：1的氨基酸69-70的缺失、氨基酸Y144的缺失、氨基酸取代N501Y、氨基酸取代A570D、氨基酸取代D614G、氨基酸取代P681H、氨基酸取代T716I、氨基酸取代S982A和氨基酸取代D1118H。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有以下缺失和取代： SEQ ID NO：1的N501Y、K417N或K417T、E484K、D80A、A701V、 L18F，以及氨基酸242-244处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有一个或多个以下取代：SEQ ID NO：1的 D614G；D936Y；P1263L；L5F；N439K；R21I；D839Y；L54F；A879S；L18F；F1121L；R847K；T478I；A829T；Q675H；S477N；H49Y；T29I； G769V；G1124V；V1176F；K1073N；P479S；S1252P；Y145缺失；E583D； R214L；A1020V；Q1208H；D215G；H146Y；S98F；T95I；G1219C； A846V；I197V；R102I；V367F；T572I；A1078S；A831V；P1162L； T73I；A845S；G1219V；H245Y；L8V；Q675R；S254F；V483A；Q677H； D138H；D80Y；M1237T；D1146H；E654D；H655Y；S50L；S939F； S943P；G485R；Q613H；T76I；V341I；M153I；S221L；T859I；W258L；L242F；P681L；V289I；A520S；V1104L；V1228L；L176F；M1237I；T307I；T716I；L141；M1229I；A1087S；P26S；P330S；P384L；R765L； S940F；T323I；V826L；E1202Q；L1203F；L611F；V615I；A262S； A522V；A688V；A706V；A892S；E554D；Q836H；T1027I；T22I； A222V；A27S；A626V；C1247F；K1191N；M731I；P26L；S1147L； S1252F；S255F；V1264L；V308L；D80A；I670L；P251L；P631S；*1274Q； A344S；A771S；A879T；D1084Y；D253G；H1101Y；L1200F；Q14H； Q239K；A623V；D215Y；E1150D；G476S；K77M；M177I；P812S； S704L；T51I；T547I；T791I；V1122L；Y145H；D574Y；G142D；G181V； I834T；N370S；P812L；S12F；T791P；V90F；W152L；A292S；A570V；A647S；A845V；D1163Y；G181R；L84I；L938F；P1143L；P809S； R78M；T1160I；V1133F；V213L；V615F；A831V；D839Y；D839N； D839E；S943P；P1263L；或V622F；及其组合。
表2∶SARS-CoV2刺突蛋白突变体
Figure GDA0003957520830000731
Figure GDA0003957520830000741
在某些方面，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有一个或多个氨基酸脯氨酸取代，其稳定融合前构象中的S蛋白三聚体。在一些实施方案中， S蛋白表达为全长蛋白，并且在S胞外域三聚体的启动子的七肽重复1 (HR1)与中心螺旋之间的边界处或附近含有一个或多个脯氨酸取代。在一些实施方案中，脯氨酸取代出现在三聚体中启动子的氨基酸残基 970至990(GAISSVLNDILSRLDKVEAE)(SEQ ID NO：7)之间。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白质，并且在SEQ ID NO：1的氨基酸K986和V987处含有两个脯氨酸取代，如下表3中的SEQID NO： 8中所提供的，其中K986P和V987P取代是加粗的和下划线的，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：9，其提供编码来源于天然SARS-CoV2 序列的SARS-CoV2全长S蛋白的核酸序列，具有编码P986和P987的核酸取代，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO:10，其提供编码双脯氨酸取代的和稳定化的SARS-CoV2 S蛋白的优化的核酸序列，其中所述核酸已经如下所述进行了优化，或与其80％、85％、90％、95％、98％或 99％同源的核酸序列。在某些实施方案中，编码标签的另外的核酸序列可以包括在待***到rMVA中的核酸序列中，使得标签在蛋白的C末端处表达。在一些实施方案中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT)(SEQ ID NO：4)编码具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO：5)的高亲和力C- 标签。
表3：示例性的稳定化的SARS-CoV2全长S蛋白
Figure GDA0003957520830000751
Figure GDA0003957520830000761
Figure GDA0003957520830000771
Figure GDA0003957520830000781
Figure GDA0003957520830000791
Figure GDA0003957520830000801
Figure GDA0003957520830000811
Figure GDA0003957520830000821
Figure GDA0003957520830000831
Figure GDA0003957520830000841
在某些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有一个或多个选自SEQ ID NO：8的K417T、E484K或N501Y的取代。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有以下取代：SEQID NO：8的K417T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，S蛋白表达为 SEQ ID NO：11的全长蛋白或与其89％、85％、90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：12，其提供编码具有K417T、E484K和N501Y取代的双脯氨酸取代的和稳定化的SARS-CoV2 S蛋白的优化的核酸序列，其中所述核酸已经如下所述进行了优化，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，突变是K417N。
在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且具有SEQ ID NO： 8的一个或多个刺突蛋白氨基酸H69、V70或Y144或其组合的缺失。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有一个或多个选自SEQ ID NO：8的D614G、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、K417N、 K417T、D215G、A701V、L18F、R246I、Y453F、I692V、M1229I、N439K、 A222V、S477N或A376T或其组合的取代。在一些实施方案中，刺突蛋白包括在SEQ ID NO：8的氨基酸242-244处的缺失。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有以下缺失和取代：SEQ IDNO：8 的氨基酸69-70的缺失、氨基酸Y144的缺失、氨基酸取代N501Y、氨基酸取代A570D、氨基酸取代D614G、氨基酸取代P681H、氨基酸取代 T716I、氨基酸取代S982A和氨基酸取代D1118H。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有以下缺失和取代：SEQ ID NO：8的 N501Y、K417N或K417T、E484K、D80A、A701V、L18F，以及氨基酸242-244处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且含有一个或多个以下取代：SEQ ID NO：8的D614G；D936Y； P1263L；L5F；N439K；R21I；D839Y；L54F；A879S；L18F；F1121L； R847K；T478I；A829T；Q675H；S477N；H49Y；T29I；G769V；G1124V； V1176F；K1073N；P479S；S1252P；Y145取代；E583D；R214L；A1020V； Q1208H；D215G；H146Y；S98F；T95I；G1219C；A846V；I197V；R102I；V367F；T572I；A1078S；A831V；P1162L；T73I；A845S；G1219V； H245Y；L8V；Q675R；S254F；V483A；Q677H；D138H；D80Y；M1237T； D1146H；E654D；H655Y；S50L；S939F；S943P；G485R；Q613H； T76I；V341I；M153I；S221L；T859I；W258L；L242F；P681L；V289I； A520S；V1104L；V1228L；L176F；M1237I；T307I；T716I；L141； M1229I；A1087S；P26S；P330S；P384L；R765L；S940F；T323I；V826L； E1202Q；L1203F；L611F；V615I；A262S；A522V；A688V；A706V； A892S；E554D；Q836H；T1027I；T22I；A222V；A27S；A626V；C1247F； K1191N；M731I；P26L；S1147L；S1252F；S255F；V1264L；V308L； D80A；I670L；P251L；P631S；*1274Q；A344S；A771S；A879T；D1084Y； D253G；H1101Y；L1200F；Q14H；Q239K；A623V；D215Y；E1150D； G476S；K77M；M177I；P812S；S704L；T51I；T547I；T791I；V1122L； Y145H；D574Y；G142D；G181V；I834T；N370S；P812L；S12F；T791P； V90F；W152L；A292S；A570V；A647S；A845V；D1163Y；G181R； L84I；L938F；P1143L；P809S；R78M；T1160I；V1133F；V213L；V615F； A831V；D839Y；D839N；D839E；S943P；P1263L；或V622F；及其组合。
在一些实施方案中，编码稳定化的S蛋白的核酸序列是SEQ ID NO： 12，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的核酸序列。SEQ ID NO:12提供了优化的核酸序列，其编码双脯氨酸取代的和稳定化的 SARS-CoV2 S蛋白，进一步包含K417T、E484K和N501T氨基酸取代，其中所述核酸已经如下所述优化。在某些实施方案中，编码标签的另外的核酸序列可以包括在待***到rMVA中的核酸序列中，使得标签在蛋白质的C末端处表达。在一些实施方案中，核酸序列 (GAGCCAGAGGCT)(SEQ ID NO:4)编码具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO：5)的高亲和力C-标签。
表4：示例性的SARS-CoV2全长S蛋白—稳定化的突变体
Figure GDA0003957520830000861
Figure GDA0003957520830000871
Figure GDA0003957520830000881
Figure GDA0003957520830000891
Figure GDA0003957520830000901
Figure GDA0003957520830000911
在某些方面，由rMVA表达的SARS-CoV2抗原是修饰的刺突(S) 蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少该蛋白羧基端的S1+S2截短的蛋白。在一些实施方案中，S1+S2截短的蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸 1至1213(SEQ ID NO：13)，如表5所提供的，或与其80％、85％、 90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA 包含SEQ IDNO：15，其提供编码来源于天然SARS-CoV2序列的S1+S2 截短的蛋白的核酸序列，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ IDNO：16，其提供编码S1+S2截短的蛋白的优化的核酸序列，或与其80％、85％、90％、 95％、98％或99％同源的核酸序列。在一些实施方式中，S1+S2截短的蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸1至1213以及氨基酸986和987 (SEQ ID NO：14)处的两个脯氨酸取代，如表5所提供的，或与其80％、 85％、90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：17，其提供编码S1+S2截短的蛋白+K986P和 V987P的优化的核酸序列，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的核酸序列。在某些实施方案中，编码标签的另外的核酸序列可以包括在待***到rMVA中的核酸序列中，使得标签在蛋白质的C末端处表达。在一些实施方案中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT)(SEQ ID NO： 4)编码具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO：5)的高亲和力C-标签。
表5：截短的S1+S2 SARS-CoV2蛋白
Figure GDA0003957520830000912
Figure GDA0003957520830000921
Figure GDA0003957520830000931
Figure GDA0003957520830000941
Figure GDA0003957520830000951
Figure GDA0003957520830000961
Figure GDA0003957520830000971
Figure GDA0003957520830000981
Figure GDA0003957520830000991
Figure GDA0003957520830001001
Figure GDA0003957520830001011
Figure GDA0003957520830001021
Figure GDA0003957520830001031
Figure GDA0003957520830001041
在某些方面，由rMVA表达的SARS-CoV2抗原是修饰的刺突(S) 蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白羧基末端的S1+S2截短的蛋白，并且进一步包含一个或多个氨基酸取代或缺失。在一些实施方案中， S1+S2截短的蛋白包含具有K417T、E484K和N501Y取代的SARS-CoV2S蛋白的氨基酸1至1213(SEQ ID NO：18)，如表6中提供的，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，S1+S2截短的蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸 1至1213、氨基酸986和987处的两个脯氨酸取代以及氨基酸取代 K417T、E484K和N501Y(SEQ ID NO：19)，如表6提供的，或与其 80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列。
在一些实施方案中，由rMVA表达的S蛋白是修饰的刺突(S)蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白羧基末端的S1+S2截短的蛋白，并且进一步包含一个或多个选自SEQ ID NO：13或14或与其80％、85％、 90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列的K417T、E484K或N501Y 的取代。在一些实施方案中，突变是K417N。
在一些实施方案中，由rMVA表达的S蛋白是修饰的刺突(S)蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白羧基末端的S1+S2截短的蛋白，并且进一步包含SEQ ID NO：13或14或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％同源的氨基酸序列的一个或多个刺突蛋白氨基酸H69、V70或 Y144或其组合的缺失。在一些实施方案中，由rMVA表达的S蛋白是修饰的刺突(S)蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白质羧基末端的 S1+S2截短的蛋白，并且进一步包含选自以下的一个或多个取代：SEQ ID NO:13或14的D614G、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、K417N、K417T、D215G、A701V、L18F、R246I、Y453F、I692V、M1229I、 N439K、A222V、S477N或A376T，或其组合。在一些实施方案中，由 rMVA表达的S蛋白是修饰的刺突(S)蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白羧基末端的S1+S2截短的蛋白，并且进一步包含SEQ ID NO： 13或14的氨基酸242-244处的缺失。在一些实施方案中，由rMVA表达的S蛋白是修饰的刺突(S)蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白羧基末端的S1+S2截短的蛋白，并且进一步包含以下缺失和取代：SEQ ID NO：13或14的氨基酸69-70的缺失、氨基酸Y144的缺失、氨基酸取代N501Y、氨基酸取代A570D、氨基酸取代D614G、氨基酸取代 P681H、氨基酸取代T716I、氨基酸取代S982A和氨基酸取代D1118H。在一些实施方案中，由rMVA表达的S蛋白是修饰的刺突(S)蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白羧基末端的S1+S2截短的蛋白，并且进一步包含以下缺失和取代：SEQ ID NO：13或14的N501Y、K417N或 K417T、E484K、D80A、A701V、L18F，以及氨基酸242-244处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，由rMVA表达的S蛋白是修饰的刺突(S)蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白羧基末端的S1+S2截短的蛋白，并且进一步包含一个或多个以下取代：SEQ ID NO：13或14的D614G； D936Y；P1263L；L5F；N439K；R21I；D839Y；L54F；A879S；L18F； F1121L；R847K；T478I；A829T；Q675H；S477N；H49Y；T29I；G769V；G1124V；V1176F；K1073N；P479S；Y145缺失；E583D；R214L；A1020V； Q1208H；D215G；H146Y；S98F；T95I；G1219C；A846V；I197V；R102I； V367F；T572I；A1078S；A831V；P1162L；T73I；A845S；H245Y；L8V； Q675R；S254F；V483A；Q677H；D138H；D80Y；D1146H；E654D； H655Y；S50L；S939F；S943P；G485R；Q613H；T76I；V341I；M153I； S221L；T859I；W258L；L242F；P681L；V289I；A520S；V1104L；L176F； T307I；T716I；L141；A1087S；P26S；P330S；P384L；R765L；S940F； T323I；V826L；E1202Q；L1203F；L611F；V615I；A262S；A522V； A688V；A706V；A892S；E554D；Q836H；T1027I；T22I；A222V； A27S；A626V；K1191N；M731I；P26L；S1147L；S255F；V308L；D80A； I670L；P251L；P631S；A344S；A771S；A879T；D1084Y；D253G； H1101Y；L1200F；Q14H；Q239K；A623V；D215Y；E1150D；G476S； K77M；M177I；P812S；S704L；T51I；T547I；T791I；V1122L；Y145H； D574Y；G142D；G181V；I834T；N370S；P812L；S12F；T791P；V90F； W152L；A292S；A570V；A647S；A845V；D1163Y；G181R；L84I； L938F；P1143L；P809S；R78M；T1160I；V1133F；V213L；V615F； A831V；D839Y；D839N；D839E；S943P；或V622F；及其组合。
在某些实施方案中，编码标签的另外的核酸序列可以包括在待***到rMVA中的核酸序列中，使得标签在蛋白的C末端处表达。在一些实施方案中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT)(SEQ ID NO：4)编码具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO：5)的高亲和力C-标签。
表6：截短的S1+S2 SARS-CoV2蛋白，其具有
Figure GDA0003957520830001071
Figure GDA0003957520830001081
Figure GDA0003957520830001091
在某些方面，SARS-CoV2抗原是S蛋白的线性表位。在一个特定实施方案中，S蛋白的线性表位是SARS-CoV2 S蛋白的受体结合结构域 (RBD)。在一些实施方式中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸327至 524(SEQ ID NO：20)，如下表7中提供的，或与其80％、85％、90％、 95％、95％或99％异源的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含 SEQ ID NO：22，其提供编码来源于SARS-CoV2天然序列的S蛋白的氨基酸327至524的线性S表位的核酸序列，或与其80％、85％、90％、 95％、95％或99％异源的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：24，其提供编码S蛋白的氨基酸327至524的线性S表位的优化的核酸序列，或与其80％、85％、90％、95％、95％或99％异源的核酸序列。在一些实施方案中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸331至524 (SEQ ID NO：21)，如下表7中提供的，或与其80％、85％、90％、 95％、95％或99％异源的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含 SEQ ID NO：23，其提供编码来源于SARS-CoV2天然序列的S蛋白的氨基酸331至524的线性S表位的核酸序列，或与其80％、85％、90％、 95％、95％或99％异源的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：24，其提供编码S蛋白的氨基酸331至524的线性S表位的优化的核酸序列，或与其80％、85％、90％、95％、95％或99％异源的核酸序列。在一些实施方案中，线性S表位包含SARS-CoV2 S蛋白的RBD 区域的氨基酸504至524(SEQ ID NO：26)，或与其80％、85％、90％、 95％、95％或99％异源的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：27，其提供编码来源于SARS-CoV2天然序列的氨基酸504 至524的线性S表位的核酸序列，或与其80％、85％、90％、95％、95％或99％异源的核酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQID NO： 28，其提供编码SARS-CoV2 S蛋白RBD区域的氨基酸504至524的线性S表位的优化的核酸序列，或与其80％、85％、90％、95％、95％或 99％异源的核酸序列。在一些实施方案中，线性S表位包含SARS-CoV2 S蛋白RBD区域的氨基酸473至490(SEQ ID NO：29)，或与其80％、 85％、90％、95％、95％或99％异源的氨基酸序列。在一些实施方案中， rMVA编码SEQID NO：30，其提供编码来源于SARS-CoV2天然序列的氨基酸473至490的线性S表位的核酸序列，或与其80％、85％、90％、 95％、95％或99％异源的氨基酸序列。在一些实施方案中，rMVA包含 SEQ ID NO：31，其提供编码SARS-CoV2 S蛋白的RBD区域的氨基酸 473至490的线性S表位的优化的核酸序列，或与其80％、85％、90％、 95％、95％或99％异源的核酸序列。
在一些实施方案中，S蛋白的线性表位是受体结合结构域(RBD) 共有序列。
在某些实施方案中，编码标签的另外的核酸序列可以包括在待***到rMVA中的核酸序列中，使得标签在蛋白的C末端处表达。在一些实施方案中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT)(SEQ ID NO：4)编码具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO：5)的高亲和力C-标签。
在一些实施方案中，S蛋白RBD线性表位包括在由核酸序列ATG 编码的NH末端处的氨基酸甲硫氨酸。
表7：示例性SARS-CoV2线性S蛋白RBD表位
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Figure GDA0003957520830001141
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在一些实施方案中，S蛋白的线性表位是包含一个或多个突变或缺失的SARS-CoV2S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在一些实施方案中，线性S表位包含S蛋白(的氨基酸327至524SEQ ID NO：32)，如下表8中提供的，或与其80％、85％、90％、95％、95％或99％异源的氨基酸序列。在一些实施方式中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸331 至524(SEQ ID NO：33)，如下表8中提供的，或与其80％、85％、 90％、95％、95％或99％异源的氨基酸序列。
在一些实施方案中，SARS-CoV2 S蛋白的受体结合结构域(RBD) 包含一个或多个选自K417T、K417N、E484K或N501Y取代的突变或缺失。
在一些实施方案中，由rMVA表达的S蛋白是SARS-CoV2 S蛋白的受体结合结构域(RBD)，其包含一个或多个选自SEQ ID NO：20 或21或与其80％、85％、90％、95％、95％或99％异源的氨基酸序列的 K417N、K417T、Y453F、N439K、S477N或A376T或其组合的取代。在一些实施方案中，由rMVA表达的S蛋白是SARS-CoV2 S蛋白的受体结合结构域(RBD)，其包含一个或多个以下取代：SEQ ID NO:20 或21或与其80％、85％、90％、95％、95％或99％异源的氨基酸序列的 N439K；T478I；S477N；P479S；V367F；V341I；P330S；P384L；A522V；及其组合。
在某些实施方案中，编码标签的另外的核酸序列可以包括在待***到rMVA中的核酸序列中，使得标签在蛋白的C末端处表达。在一些实施方案中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT)(SEQ ID NO：4)编码具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO：5)的高亲和力C-标签。
在一些实施方案中，S蛋白RBD线性表位包括由核酸序列ATG编码的NH末端的氨基酸甲硫氨酸。
表8：具有K417T、E484K和501Y突变的示例性SARS-CoV2线性S蛋白RBD表位
Figure GDA0003957520830001161
在某些方面，S蛋白的两个或更多个线性表位由rMVA编码，其中两个或更多个线性表位由间隔基(例如GPGPG间隔基多肽)分开。在一些实施方案中，***到rMVA病毒载体中的序列编码由间隔基分开的线性表位，其中线性表位包括不同的S蛋白RBD肽，例如(RBDSeq.1- 间隔基-RBD Seq.2)，其中RBD Seq.1是第一S蛋白RBD肽，并且RBD Seq.2是第二S蛋白RBD肽。在一些实施方案中，***到rMVA病毒载体中的序列编码串联重复序列，例如(RBD-间隔基-RBD-间隔基)x或 (RBD Seq.1-间隔基-RBD Seq.2-间隔基)x，其中x＝2、3、4、5、6、7、 8、9、10。在一些实施方案中，RBD肽选自一种或多种来源于SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸331至524的肽。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位选自SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473至 490。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位是SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的序列编码含有串联重复序列((aa504-524)-间隔基-(aa473-490)-间隔基)x的S蛋白RBD肽，其中x＝2、3、4、5、6、 7、8、9、10。在一些实施方案中，x＝3-7。在一些实施方案中，x＝5。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的序列编码含有串联重复序列((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)x的S蛋白RBD肽，其中x＝2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些实施方案中，x＝3-7。在一些实施方案中，x＝5。
在一些实施方案中，MVA包含编码下表9中提供的SEQ ID NO： 34的氨基酸序列的核酸序列，其提供编码串联重复序列 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)x中的S蛋白RBD肽的示例性氨基酸序列。在一些实施方案中，MVA包含SEQ ID NO：35的核酸序列，其提供编码来源于天然SARS-CoV2基因组序列的串联重复序列 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)x的核酸序列，所述核酸序列编码氨基酸504-524和氨基酸473-490，并且包括编码接头氨基酸序列 GPGPG的核酸序列。在一些实施方案中，MVA包含编码SEQ ID NO： 36的氨基酸序列的核酸序列，其提供串联重复序列 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)x中的S蛋白RBD肽的氨基酸序列，其中x＝5，并且SEQ ID NO：37提供已经优化的编码其的核酸序列。在一些实施方案中，MVA包含编码下表9中提供的SEQ ID NO： 38的氨基酸序列的核酸序列，其提供编码串联重复序列 ((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)x中的S蛋白RBD肽的示例性氨基酸序列，并且进一步包含取代E484K。在一些实施方案中，MVA包含编码SEQ ID NO：39的氨基酸序列的核酸序列，其提供串联重复序列((aa504-524)-GPGPG-(aa473-490)-GPGPG)x中的S蛋白RBD肽的氨基酸序列，其中x＝5，并且进一步包含取代E484K。在一些实施方案中，S 蛋白RBD串联重复序列包括在由核酸序列ATG编码的NH末端处的氨基酸甲硫氨酸。
表9：SARS-CoV2SARS-CoV2 S蛋白RBD串联重复序列
Figure GDA0003957520830001181
Figure GDA0003957520830001191
Figure GDA0003957520830001201
包膜(E)蛋白
E蛋白是最小的主要结构蛋白。在例如SARS的复制周期中，E在感染细胞内大量表达，但只有一小部分掺入病毒体包膜中。 Venkatagopalan et al.,Coronavirus envelope(E)protein remains at the site of assembly.Virology.2015；478:75–85。例如，SARS感染中的大部分蛋白质位于细胞内转运位点，即ER、高尔基体和ERGIC，其中其参与CoV 组装和出芽。Nieto-Torres et al.,Subcellular location and topology of severeacute respiratory syndrome coronavirus envelope protein.Virology. 2011；415(2):69–82。
SARS-CoV2包膜(E)蛋白的氨基酸序列长度为75个氨基酸。E 蛋白已经在GenBank登录号QHD43418中报道，并且复制在表10中 (SEQ ID NO：40)及其相应的核酸序列(SEQ IDNO：41)中，所述核酸序列已经在GenBank登录号MN908947.3中报道，并且位于 SARS-CoV2基因组的核酸26245至26472。在一些实施方案中，***到 MVA病毒载体中的核酸编码SEQ IDNO：40的氨基酸，或与其80％、 85％、90％、95％、98％或99％异源的氨基酸。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的核酸是SEQ ID NO：41，或与其80％、85％、90％、 95％、98％或99％异源的核酸。在一些实施方案中，编码***到MVA 病毒载体中的E蛋白的核酸序列已经被优化，例如，如SEQ ID NO：42 中所提供的，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％异源的核酸。
在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的核酸编码SEQ ID NO：40的氨基酸，其具有一个或多个选自S68F、L73F、P71L、S55F、 R69I、T9I、V24M、D72H、T30I、S68C、V75L、V58F、V75F或L21F 及其组合的取代，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％异源的氨基酸。
在某些实施方案中，编码标签的另外的核酸序列可以包括在待***到rMVA中的核酸序列中，使得标签在蛋白的C末端处表达。在一些实施方案中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT)(SEQ ID NO：4)编码具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO：5)的高亲和力C-标签。
表10：SARS-CoV2包膜(E)蛋白
Figure GDA0003957520830001211
膜(M)蛋白
冠状病毒M蛋白是最丰富的结构蛋白，决定了病毒包膜的形状。Neuman et al.,Astructural analysis of M protein in coronavirus assembly and morphology.JStruct Biol.2011；174(1):11–22。其也被认为是CoV组装的主要组织者，与所有其他主要的冠状病毒结构蛋白相互作用。Masters PS.The molecular biology ofcoronaviruses.Adv Virus Res. 2006；66:193–292。例如，SARS M蛋白之间的同型相互作用是病毒粒子包膜形成的主要驱动力，但单独不足以形成病毒粒子。Neuman et al.,JStruct Biol.2011；174(1):11–22；de Haan et al.,Assembly of the coronavirusenvelope:homotypic interactions between the M proteins.J Virol. 2000；74(11):4967–78。关于例如SARS、M和E构成病毒包膜，并且它们的相互作用足以产生和释放VLP。Mortola&Roy.Efficient assembly and release of SARS coronavirus-like particlesby a heterologous expression system.FEBS Lett.2004；576(1–2):174–8。
SARS-CoV2膜(M)蛋白的氨基酸序列长度为222个氨基酸。M蛋白已经在GenBank登录号QHD43419中报道，以SEQ ID NO：43复制在下表11中，并且其位于SARS-CoV2基因组的核酸26523至27191的核酸序列已在GenBank登录号MN908947.3中报道，并且以SEQ ID NO： 44复制在下文中。
在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的核酸序列编码SEQ ID NO：43的氨基酸，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％异源的氨基酸。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的核酸序列是 SEQ ID NO：44，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％异源的核酸。在一些实施方案中，编码***到MVA病毒载体中的M蛋白的核酸序列已经被优化，例如，如SEQ ID NO：45中所提供的，或与其80％、 85％、90％、95％、98％或99％异源的核酸。
在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的核酸序列编码SEQ ID NO：43的氨基酸，进一步包含一个或多个选自T175M、D3G、V23L、 W31C、A2V、V70F、W75L、M109I、I52T、L46F、V70I、D3Y、K162N、 H125Y、K15R、D209Y、R146H、R158C、L87F、A2S、A69S、S214I、 T208I、L124F或S4F及其组合的取代，或与其80％、85％、90％、95％、98％或99％异源的氨基酸。
在某些实施方案中，编码标签的另外的核酸序列可以包括在待***到rMVA中的核酸序列中，使得标签在蛋白的C末端处表达。在一些实施方案中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT)(SEQ ID NO：4)编码具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO：5)的高亲和力C-标签。
表11：SARS-CoV2 M蛋白
Figure GDA0003957520830001231
Figure GDA0003957520830001241
修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒载体
如本文所提供的，将编码一种或多种SARS-CoV2抗原或其抗原性片段的核酸序列***到痘苗病毒株修饰的安卡拉痘苗(MVA)中，当施用于受试者时，其能够在受试者的细胞中表达一种或多种SARS-CoV2 抗原或抗原性片段。术语“修饰的安卡拉痘苗”或“MVA”指由Anton Mayr 博士通过在鸡胚成纤维细胞上连续传代开发的高度减毒的痘苗病毒株；或其变体或衍生物。MVA综述于(Mayr，A.et al.1975Infection 3：6-14；瑞士专利号568,392)中。MVA的完整基因组序列可以以GenBank登录号U94848获得。
通过在鸡胚成纤维细胞上长期连续传代痘苗病毒的安卡拉株 (CVA)，产生了修饰的安卡拉痘苗(MVA)(综述参见Mayr，A.et al.， 1975Infection 3：6-14；瑞士专利号568,392)。MVA病毒可以从美国典型培养物保藏中心以ATCC No.VR-1508公开获得。MVA的独特在于其极大的减毒，如通过减弱的毒力和降低的在灵长类动物细胞中复制的能力，同时保持良好的免疫原性。已经分析了MVA病毒以确定相对于亲本CVA株的基因组改变。已经鉴定了基因组DNA的六个主要缺失(缺失I、II、III、IV、V和VI)，总共31,000个碱基对(Meyer，H.etal.， 1991J Gen Virol 72：1031-1038)。得到的MVA病毒的宿主细胞限于禽类细胞。
已经发现人细胞中的MVA复制在感染后期被阻断，从而阻止组装成成熟的感染性病毒粒子。然而，即使在非允许细胞中，MVA也能够以高水平表达病毒和重组异源基因(Sutter,G.and Moss,B.1992PNAS USA 89:10847-10851)。重组MVA可以如下文所述制备。通常，可以将含有编码一个或多个侧接有MVA DNA序列(邻近预定的***位点 (如下进一步描述的))的SARS-CoV2(异源)多肽的DNA序列的构建体引入感染MVA的细胞(例如鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞)中，以允许同源重组。一旦已经将DNA构建体引入真核细胞中，并且外源DNA已经与病毒DNA重组，就可能分离期望的重组MVA。待***的 DNA构建体可以是线性的或环状的。质粒或聚合酶链反应产物是优选的。制备重组MVA载体的这类方法描述在例如美国专利号9,453,239中，其通过引用并入本文。
对于异源DNA序列或基因的表达而言，DNA上必须存在基因转录所需的调节序列如启动子。因为MVA是细胞质病毒，所以合适的启动子包括来源于天然存在的痘病毒启动子的那些启动子。根据它们在痘病毒感染期间的表达时间，将痘病毒基因、启动子和转录因子分为早期、中间和晚期类别。参见例如Assarsson et al.,Kinetic analysis of a completepoxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.PNAS 2008；105(6):2140–2145.Yang Zet al.,Genome-wide analysis of the 5′and 3′ends ofvaccinia virus early mRNAs delineates regulatory sequences of annotated andanomalous transcripts.J Virol.2011；85(12):5897–5909。在大多数哺乳动物细胞(非允许细胞)中的MVA复制在所有表达阶段发生后的子代病毒粒子组装期间停止。这支持所有启动子类别(包括晚期启动子)用于控制转基因表达的效用。Sancho et al.,The block inassembly of modified vaccinia virus Ankara in HeLa cells reveals new insightsinto vaccinia virus morphogenesis.J Virol.2002；76(16):8318–8334； Geiben-Lynnet al.,Kinetics of recombinant adenovirus type 5,vaccinia virus,modifiedvaccinia ankara virus,and DNA antigen expression in vivo and the induction ofmemory T-lymphocyte responses.Clin Vaccine Immunol.2008；15(4):691–696。一些痘病毒启动子具有早期和晚期元件两者，允许它们的开放阅读框(ORF)或重组抗原分别在病毒感染早期和病毒基因组复制之后的晚期表达。Broyles SS,Vaccinia virustranscription. J Gen Virol.2003；84(Pt 9):2293–2303。痘病毒启动子可用于交叉菌株。参见Prideaux et al.,Comparative analysis of vaccinia virus promoteractivity in fowlpox and vaccinia virus recombinants.Virus Res.1990；16(1):43–57； Tripathy et al.,Regulation of foreign gene in fowlpox virus by a vacciniavirus promoter.Avian Dis.1990；34(1):218–220。这样的调节序列是本领域技术人员已知的，并且包括例如p11启动子，其驱动由F17R ORF编码的11K蛋白的表达(Wittek et al.,Mapping of a gene coding for a major late structural polypeptide on thevaccinia virus genome.J Virol. 1984；49(2):371–378)；p7.5启动子(Cochran et al.,In vitro mutagenesis of the promoter region for a vaccinia virus gene:evidence for tandem early and late regulatory signals.J Virol.1985；54(1):30–37)；pI1L启动子(Schmitt et al.,Sequence and transcriptional analysis of thevaccinia virus HindIII I fragment.J Virol.1988；62(6):1889–1897)；pTK启动子(Weir and Moss, Determination of the promoter region of an early vacciniavirus gene encoding thymidine kinase.Virology.1987；158(1):206–210)；pF7L启动子(Coupar et al.,Effect of in vitro mutations in a vaccinia virus earlypromoter region monitored by herpes simplex virus thymidine kinase expressionin recombinant vaccinia virus.J Gen Virol.1987；68(Pt 9):2299–2309)；pH5启动子(Perkus et al.,Cloning and expression of foreign genes in vaccinia virus,using a host range selection system.J Virol. 1989；63(9):3829–3836)；短的合成启动子pSyn(Chakrabarti et al.,Compact, synthetic,vaccinia virus early/latepromoter for protein expression. Biotechniques.1997；23(6):1094–1097；Hammondet al.,A synthetic vaccinia virus promoter with enhanced early and lateactivity.J Virol Methods.1997；66(1):135–1380)；pH5启动子(Wyatt et al.,Development of a replication-deficient recombinant vaccinia virus vaccineeffective against parainfluenza virus 3infection in an animal model.Vaccine.1996；14(15):1451–1458)；pmH5启动子(Wyatt et al.,Development of a replication-deficient recombinant vaccinia virus vaccine effective against parainfluenzavirus 3infection in an animal model.Vaccine. 1996；14(15):1451–1458)；pHyb启动子(Sancho et al.,The block in assembly of modified vaccinia virus Ankara inHeLa cells reveals new insights into vaccinia virus morphogenesis.J Virol.2002；76(16):8318–8334)；LEO启动子(Wyatt et al.,Correlation of immunogenicitiesand in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus AnkaraHIV vaccines.Vaccine.2008；26(4):486–493)；pB8 启动子(Orubu et al.,Expressionand cellular immunogenicity of a transgenic antigen driven by endogenouspoxviral early promoters at their authentic loci in MVA.PLoS One.2012；7(6):e40167)；pF11启动子(Orubu et al.,Expression and cellular immunogenicity of atransgenic antigen driven by endogenous poxviral early promoters at theirauthentic loci in MVA. PLoS One.2012；7(6):e40167)。
在一些实施方案中，启动子是pmH5启动子。在一些实施方案中，启动子包含SEQ IDNO：154 (AAAAATTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAA)。
在一些实施方案中，启动子是p11启动子。在一些实施方案中，启动子包含SEQ IDNO：155(TTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAA)。
可以通过转染将DNA构建体引入MVA感染的细胞，例如利用磷酸钙沉淀(Graham etal.1973Virol 52:456-467；Wigler et al.1979Cell 16:777-785)、利用电穿孔(Neumannet al.1982EMBO J.1:841-845)、通过显微注射(Graessmann et al.1983Meth Enzymol101:482-492)、利用脂质体(Straubinger et al.1983Meth Enzymol 101:512-527)、利用球形体(Schaffher 1980PNAS USA 77:2163-2167)或通过本领域技术人员已知的其它方法。
本发明的MVA载体设计和制备方法可用于生产有效的MVA疫苗载体，用于引发针对SARS-CoV2的有效T细胞和抗体免疫应答。在一些实施方案中，本文所述的MVA疫苗载体能够在单次同源初次加强后引发有效的免疫应答和抗体产生。
在一些实施方案中，本发明提供重组病毒载体(例如，MVA载体)，其包含一个或多个编码SARS-CoV2蛋白或其免疫原性片段的核酸序列。可以使用本领域技术人员已知的常规技术构建病毒载体(例如，MVA 载体)。所述一个或多个异源SARS-CoV2基因***物编码具有期望的免疫原性的多肽，即通过施用其可在体内诱导免疫反应、细胞免疫和/ 或体液免疫的多肽。在引入编码具有免疫原性的多肽的基因时，可以将合适的启动子可操作地连接至编码具有期望的免疫原性的多肽的基因的上游。
可以优化一个或多个核酸序列以用于MVA载体中。优化包括密码子优化，其采用沉默突变将所选密码子从天然序列改变成由宿主-载体***最佳表达的同义密码子。其他类型的优化包括使用沉默突变来中断均聚物节段或转录终止子基序。这些优化策略中的每一种都可以改善基因的稳定性，改善转录物的稳定性，或改善来自序列的蛋白质表达水平。在示例性实施方案中，将减少异源DNA***序列中均聚物节段的数量以稳定化构建体。可以为与痘苗终止信号相似的任何事物提供沉默突变。
在示例性实施方案中，序列经密码子优化以在MVA中表达；具有＞5个脱氧鸟苷、＞5个脱氧胞苷、＞5个脱氧腺苷和＞5个脱氧胸苷的系列(runs)的序列通过沉默突变而被中断，以使由于移码突变引起的表达损失最小化。
特别地，可以通过密码子优化原始DNA序列来优化用于***的核酸。例如，“Invitrogen GeneArt Gene Software”可用于密码子优化DNA 序列。为了完全优化基因序列，均聚物序列(富含G/C或T/A的区域) 经由沉默突变而被中断。在核酸***序列中存在的程度上，MVA转录终止子(T5NT(UUUUUNU))经由沉默突变而被中断。进一步的优化可包括，例如，添加Kozak序列(GCCACC/ATG)，添加第二终止密码子，和添加痘苗病毒转录终止子，特别是“TTTTTAT”，或其变体和 /或组合。
编码一种或多种SARS-CoV2蛋白或其片段的DNA***物可以在任何合适的位置***到MVA基因组中，例如天然缺失位点、修饰的天然缺失位点、在非必需MVA基因中(例如MVA胸苷激酶基因座)、或者在必需或非必需MVA基因之间的基因间区域中。合适的***位点已经描述在例如以下中：U.S.Pat.No.6,998,252,U.S.Pat.No.9,133,478, Ober et al.,Immunogenicity and safety of defective vaccinia virus lister: comparison withmodified vaccinia virus Ankara.J.Virol.,Aug.2002(pg. 7713-7723),U.S.Pat No.9,133,480,U.S.Pat.No.8,288,125，将其各自通过引用并入本文中。
在一些实施方案中，将SARS-CoV2肽编码序列***到以下中：天然缺失位点，例如选自天然缺失位点I、II、III、IV、V或VI的缺失位点，修饰的天然缺失位点，例如MVA基因A50R和B1R之间(参见例如U.S.9，133，480)、非必需MVA基因之间、必需MVA基因之间重构和修饰的缺失III位点，例如I8R和GIL或A5R和A6L或其他合适的***位点、在非必需基因座(例如MVA TK基因座)或其组合中。
重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)疫苗构建体
本文提供重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒载体，其包含编码一种或多种SARS-CoV2蛋白、肽或其片段的异源核酸***物，所述异源核酸***物可操作地连接到与痘病毒表达***相容的启动子，所述痘病毒表达***在表达时能够诱导保护性免疫，而不会诱导与先前rMVA相关的冠状病毒疫苗接种策略相关的免疫病理学。
SARS-CoV2 S-E-M VLP
在一个方面，重组MVA疫苗表达SARS-CoV2的M蛋白和E蛋白，以及SARS-CoV2 S蛋白，或其片段或变体，如下文进一步提供的。在宿主细胞中表达时，SARS-CoV2能够形成非感染性病毒样颗粒(VLP)，增强表位展示，并诱导有效的抗病毒免疫应答。
在一些实施方案中，提供了rMVA病毒载体，其编码SARS-COV2 的刺突(S)蛋白(或其片段)、包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白，其中，在S、E和M蛋白表达时，形成VLP。在一些实施方案中，排列核酸使得S、E和M编码序列线性相邻。编码适于在表达时形成VLP的S、E 和M蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图1A中。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，例如，如SEQ ID NO：1中提供的，E 蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其包含编码SEQ ID NO：1、40和43的核酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，例如，如SEQ ID NO：6 中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其包含编码SEQ ID NO： 6、40和43的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或 95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：2、41和44，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码全长S、 E和M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：3、42和45中所提供的。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，例如适于在测定法中检测表达的蛋白的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或本领域已知的任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在每种蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'末端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA，或其组合或多个。此外，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列还可以包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。包含全长S、E和M蛋白的相邻编码序列的示例性核酸序列在下文以SEQ ID NO：46、47或156提供。在一些实施方案中，rMVA包含 SEQ ID NO：46的核酸序列(图1B-1C-1D)，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA 包含SEQ ID NO：47的核酸序列(图1E-1F-1G)，或与其至少70％、 75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中， rMVA包含SEQ ID NO：156的核酸序列(图1H-1I-1J)，或与其至少 70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
可替代地，提供了rMVA病毒载体，其编码SARS-CoV2的刺突(S) 蛋白、包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白，其中S蛋白已经通过一个或多个稳定化S蛋白三聚体呈融合前构象的氨基酸脯氨酸取代所稳定化，并且，其中在表达时，蛋白形成VLP。在一些实施方案中，排列核酸使得稳定化的S、E和M编码序列线性相邻。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且在七肽重复1(HR1)和S胞外域三聚体的启动子的中心螺旋之间的边界处或附近含有一个或多个脯氨酸取代。在一些实施方案中，脯氨酸取代发生在三聚体中启动子的氨基酸残基970至990 之间。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且在氨基酸K986 和V987处含有两个脯氨酸取代。编码适于在表达时形成VLP的稳定化的S、E和M蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图2A中。在一些实施方案中，S蛋白表达为在S蛋白的氨基酸986和987处包含两个脯氨酸取代的全长蛋白，例如，如SEQ ID NO：8中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少75％、80％、 85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码S和Q ID NO：8、40和43的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，S蛋白表达为在S蛋白的氨基酸986和987处包含两个脯氨酸取代的全长蛋白，例如，如SEQ ID NO：11中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如S和Q ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：11、40和43 的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：9、41和44，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码全长脯氨酸取代的S蛋白、 E蛋白和M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：10、42和45中所提供的，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码全长脯氨酸取代的S蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：12、42和45 中所提供的，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如 C-末端标签，如EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA、或其组合或多个。此外，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码全长稳定化的S蛋白、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列在下文以SEQ ID NO：48、49、50或156提供。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：48的核酸序列(图2B-2C-2D)，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA包含 SEQ IDNO：49的核酸序列(图2E-2F-2G)，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA 包含SEQ ID NO：50的核酸序列(2H-2I-2J)，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA 包含SEQ ID NO：157的核酸序列(2K-2L-2M)，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA 包含SEQ ID NO：159的核酸序列(2N-2O-2P)，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：160的核酸序列(2Q-2R-2S)，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
可替代地，提供了rMVA病毒载体，其编码SARS-CoV2的部分刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白，其中部分S蛋白是SARS-CoV2 S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在一些实施方案中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸327至524，并且任选地进一步包含在NH末端处的起始甲硫氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，RBD序列是冠状病毒共有序列。在一些实施方案中，排列核酸使得S RBD、E和M编码序列线性相邻。编码适于在表达时形成VLP的部分S蛋白编码氨基酸327至 524、E蛋白和M蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图3D中。在一些实施方案中，部分S蛋白表达为如SEQ ID NO：20中所提供的， E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：22、40和43 的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：24、41和44，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码部分S蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：24、42和45中所提供的，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，部分S蛋白表达为如SEQ ID NO：32中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO： 43中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如适用于测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如来源于pmH5、p11、pSyn、pHyb 的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA、或其组合或多个。进一步，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码S蛋白RBD区、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：51或52。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：51的核酸序列(图3E)，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：52的核酸序列(图3F)，或与其至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％或99％同源的序列。
可替代地，在一些实施方案中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸331 至524，并且任选地还包含在RBD的NH末端处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，排列核酸使得S RBD(aa331-524)、E和M编码序列线性相邻。编码适于在表达时形成VLP的部分S蛋白编码氨基酸331至524、 E蛋白和M蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图3A中。在一些实施方案中，部分S蛋白表达为如SEQ ID NO：20中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：23、40和43 的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ IDNO：25、41和44，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码部分S蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：25、42和45中所提供的，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，部分S蛋白表达为如SEQ ID NO：33中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如适合在测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、 pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak 共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或 TGA、或其组合或多个。进一步，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码S蛋白RBD(aa 331-524)区域、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列提供为SEQ IDNO：53或54。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：53的核酸序列(图3B)，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ IDNO：54的核酸序(图3C)列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
在一些实施方案中，提供了rMVA病毒载体，其编码SARS-CoV2 的部分刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白，其中部分S蛋白是SARS-CoV2 S蛋白的受体结合结构域(RBD)，并且其中RBD结合蛋白在其NH端侧接有来源于S蛋白的氨基酸1至13的S蛋白信号肽，并且在其羧基端侧接有来源于氨基酸1214至1273的S蛋白跨膜结构域，或其片段。侧接S蛋白信号肽(SP)在下表12中提供为SEQ ID NO：55，并且其核酸序列提供为SEQ ID NO：56。SP的优化核酸序列提供在SEQ ID NO：59中。S蛋白跨膜结构域(STM)在下表8中提供为SEQ IDNO：57，并且其核酸序列提供为SEQ ID NO：58，并且优化的核酸序列提供为SEQ ID NO：60。在一些实施方案中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸327至524，侧接有SP和STM。SP-RBD(aa327-524) -STM肽提供在SEQ ID NO：61中。在一些实施方案中，线性S表位包含S蛋白的氨基酸331至524，侧接有SP和STM。SP-RBD(aa 331-524) -StM肽提供在SEQ ID NO：62中。在一些实施方案中，排列核酸使得S SP-RBD-TM、E和M编码序列线性相邻。编码适于在表达时形成VLP 的部分S蛋白编码氨基酸1-13(SP)、331至524(RBD)和1214-1273 (STM)，E蛋白和M蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图3G 中。编码适于在表达时形成VLP的部分S蛋白编码氨基酸1-13(SP)、 327至524(RBD)和1214-1273(STM)，E蛋白和M蛋白的单个MVA ***物的线性表示提供在图3H中。在一些实施方案中，部分S蛋白 SP-RBD(aa 327 524)-STM表达为如SEQ ID NO：61中所提供的，E 蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，部分S蛋白 SP-RBD(aa 331-524)-STM表达为如SEQ ID NO：62中所提供的，E 蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：61或62、40 和43的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列的核酸序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或 MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：67或68、40和43的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ IDNO：63 或64、41和44，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码部分S蛋白、E蛋白和 M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：65或66、42和45中所提供的，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如适合在测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA，或其组合或多个。进一步，核酸序列可以在每种所编码的蛋白质的最后一个终止密码子的3’包括痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码S蛋白 SP-RBD(327-524)-STM区域、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：69或70。用于***的编码S蛋白SP-RBD(331-524) -STM区域、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：71 或72。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：69(图3I-3J)、 70(图3K-3L)、71(图3M-3N)或72(图3O-3P)的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
在一个可替代的实施方案中，核酸***物编码线性S表位，其进一步包含信号肽、E蛋白和M蛋白(参见，例如图3Q、图3R、图3S、图 3T)。S蛋白信号肽可包含或来源于例如SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸 1-13(MFVFLVLLPLVSS)(SEQ ID NO：55)。在一些实施方案中，编码的S蛋白包含RBD共有序列。在一些实施方案中，RBD共有序列进一步包含S蛋白信号肽，例如来源于SEQ ID NO：55。在一些实施方案中，rMVA表达包含氨基酸327-524的线性RBD表位。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：55和20的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中， rMVA表达包含氨基酸331-524的线性RBD表位。在一些实施方案中， rMVA表达包含SEQ ID NO：55和21的氨基酸序列，或与其至少70％、 75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA 表达包含氨基酸327-598的线性RBD表位。在一些实施方案中，rMVA 表达包含SEQ ID NO：55和161的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列的氨基酸序列。在一些实施方案中， rMVA表达包含氨基酸331-598的线性RBD表位。在一些实施方案中， rMVA表达包含SEQ ID NO：55和162的氨基酸序列，或与其至少70％、 75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，RBD 肽包含取代K417T、E484K和N501Y。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：55和32的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA表达氨基酸包含SEQ ID NO：55和33的序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、 90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO：55和163的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA表达包含SEQ ID NO： 55和164的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或 95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：55、 20、40和43的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA编码SEQ ID NO：55、 21、40和43的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA编码SEQ ID NO：55、 32、40和43的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO： 55、33、40和43的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、 90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：55、161、40和43的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：55、162、40和43的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：55、163、40和43的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA编码包含SEQ ID NO：164、33、40和43的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，例如适于在测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于衍生自pmH5、PI1、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA，或其组合或多个。此外，核酸序列可以在每个编码蛋白的最后一个终止密码子的3'包括痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列还可以包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：158(图3U-3V)，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、 95％或99％同源的序列。
表12：SP肽、TM肽、SP-RBD-STM肽序列
Figure GDA0003957520830001401
Figure GDA0003957520830001411
Figure GDA0003957520830001421
Figure GDA0003957520830001431
Figure GDA0003957520830001441
Figure GDA0003957520830001451
Figure GDA0003957520830001461
Figure GDA0003957520830001471
可替代地，提供了rMVA病毒载体，其编码SARS-CoV2的串联重复序列、包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白，其中串联重复序列来源于S 蛋白RBD结构域的线性表位。在一些实施方案中，串联重复是例如 (RBD-间隔基-RBD-间隔基)X或(RBD Seq.1-间隔区-RBD Seq.2-间隔区)X，其中RBD是任何S蛋白RBD肽，RBD Seq.1是第一S蛋白RBD 肽，并且RBD Seq.2是第二S蛋白RBD肽，并且其中x＝2、3、4、5、 6、7、8、9或10。在一些实施方案中，串联重复任选地在NH末端处包含甲硫氨酸氨基酸。在一些实施方案中，RBD肽选自来源于SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸331至524或SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸327-524的一种或多种肽。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位选自 SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位是SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504 至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的序列编码含有串联重复序列((aa504-524)-间隔基-(aa473-490)-间隔基)x的S蛋白RBD肽，其中x＝2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，x＝3-7。在一些实施方案中，x＝5。
在一些实施方案中，排列核酸使得串联重复序列、E和M编码序列线性相邻。编码适于在表达时形成VLP的串联重复、E蛋白和M蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图4A中。在一些实施方案中，串联重复表达为如SEQ ID NO:34中所提供，其进一步任选地包含在NH 末端处的甲硫氨酸，其中x为2-10，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO:40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO:43中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：34(其中x为2-10或大于10)、SEQ ID NO：40和 SEQ ID NO：43的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA 病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：38(其中x为2-10或大于10)、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:43的核酸序列，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：39(其中x为 2-10或大于10)、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：43的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：35(其中x 为2-10或大于10)、SEQ ID NO：41和SEQ IDNO：44，或与其至少 70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：41 和SEQ ID NO：44，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码串联重复、E蛋白和M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：37、42和45中所提供的，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，例如适于在测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA、或其组合或多个。进一步，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码串联重复、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：73或 74。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：73的核酸序列(图 4B-4C)，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA包含SEQ ID NO：74的核酸序列(图 4D-4E)，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
可替代地，提供了rMVA病毒载体，其编码SARS-CoV2的串联重复序列、包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白，其中串联重复序列来源于S 蛋白RBD结构域的线性表位，并且在其NH末端处侧接有SP肽，例如 SEQ ID NO：55，并且在其羧基端处侧接有STM，例如SEQ ID NO：57。在一些实施方案中，串联重复是例如(RBD-间隔基-RBD-间隔基)X或 (RBD Seq.1-间隔区-RBDSeq.2-间隔区)X，其中RBD是任何S蛋白 RBD肽，RBD Seq.1是第一S蛋白RBD肽，并且RBDSeq.2是第二S 蛋白RBD肽，并且其中x＝2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，RBD肽选自来源于SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸331至524或来源于SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸327至524的一种或多种肽。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位选自SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位是SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473 至490。在一些实施方案中，***到MVA病毒载体中的序列编码含有串联重复序列((aa504-524)-间隔基-(aa473-490)-间隔基)x的S蛋白RBD 肽，其中x＝2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，x＝3-7。在一些实施方案中，x＝5。
在一些实施方案中，排列核酸使得SP-串联重复-TM、E和M编码序列线性相邻。编码适于在表达时形成VLP的SP-串联重复-TM、E蛋白和M蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图4F中。在一些实施方案中，SP-串联重复-TM表达为如SEQ ID NO：75中所提供的，其中x为2-10，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO： 77、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：43的核酸序列，或与其至少70％、 75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供包含SEQ ID NO：76(其中x为2-10)、SEQ IDNO：41和SEQ ID NO： 44的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：44，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。一些实施方案中，本文提供了编码SP-串联重复-TM、E蛋白和M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：76或78、42和45中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
在一些实施方案中，SP-串联重复-TM表达为如SEQ ID NO：79(其中x为2-10)中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40 中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：80、SEQID NO：40和SEQ ID NO：43的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如适合在测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、 pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak 共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA、或其组合或多个。进一步，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码串联重复、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：81或82。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：81的核酸序列(图4G-4H)，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA 包含选自SEQ ID NO：82的核酸序列(图4I-4J)，或与其至少70％、 75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
表13-SP-RBD串联重复-TM
Figure GDA0003957520830001511
Figure GDA0003957520830001521
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可替代地，提供了rMVA病毒载体，其编码SARS-CoV2的刺突(S) 蛋白、包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白的修饰的、截短的形式，其中截短的S蛋白包含S1+S2区域，并缺少羧基末端，并且其中在表达时，蛋白形成VLP。在一些实施方案中，排列核酸使得截短的S、E和M编码序列线性相邻。在一些实施方案中，截短的S蛋白包含氨基酸1至1213 (SEQ ID NO：13)。编码适于在表达时形成VLP的截短的S、E和M 蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图6A中。在一些实施方案中，截短的S蛋白在氨基酸986和987处含有两个脯氨酸取代，例如，如图6H中所示例的。在一些实施方案中，截短的S蛋白表达为如SEQ ID NO：13或14或18或19中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，并且M蛋白表达为全长蛋白，如SEQID NO： 43中所提供的，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：13或14或18或19、40和43的核酸序列，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其含有SEQ ID NO：15或17、41和44，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码截短的S蛋白、E蛋白和M蛋白的核酸，其中核酸已优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：16或17、 42和45中提供的，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA、或其组合或多个。进一步，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码截短的S蛋白、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列在下文提供为SEQ ID NO：83或84。用于***的编码截短的S蛋白+K986P和V986P、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列在下文中提供为SEQ ID NO：85或86。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：83(图6B-6C-6D)、 84(图6E-6F-6G)、85(图6I-6J-6K)或86(图6L-6M-6N)的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
S片段-GP融合VLP
在一个可替代的方面，本文提供了rMVA病毒载体，其被设计为表达呈框内融合蛋白的一种或多种SARS-CoV2 S蛋白抗原性肽，其中融合蛋白包含包膜糖蛋白的信号序列(GPS)、SARS-CoV2 S蛋白或蛋白片段、包膜糖蛋白(GPTM)的跨膜结构域，以及任选地，包膜糖蛋白的胞质结构域(GPCD)，其中包膜糖蛋白不是来源于冠状病毒。rMVA 病毒载体被进一步设计为表达来自与包膜糖蛋白所来源相同的病毒的基质蛋白。通过提供SARS-CoV2 S蛋白片段与GP蛋白的融合物，S蛋白片段-GP融合物可以与rMVA表达的基质蛋白形成VLP。在一些实施方案中，rMVA病毒载体进一步表达SARS-CoV2的膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白，当表达时，其能够形成单独的VLP。因此，从单个rMVA 病毒载体，能够产生两种展示SARS-CoV2的抗原性表位的VLP。
用于本发明的合适的糖蛋白和基质蛋白包括，但不限于来源于以下的那些：丝状病毒科，例如马尔堡病毒、埃博拉病毒或苏丹病毒；逆转录病毒科，例如人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)；沙粒病毒科，例如拉沙病毒；黄病毒科，例如登革热病毒和寨卡病毒。
在特定实施方案中，糖蛋白和基质蛋白来源于马尔堡病毒 (MARV)。在特定实施方案中，糖蛋白来源于MARV GP蛋白(GenBank 登录号AFV31202.1)。MARV GP蛋白的氨基酸序列在下表14中提供为SEQ ID NO：87。在特定实施方案中，MARV GPS结构域包含糖蛋白的氨基酸1至19(MWTTCFFISLILIQGIKTL)(SEQ ID NO：88，其可以由例如SEQ ID NO：89的MVA优化的核酸序列编码)，GPTM结构域包含糖蛋白的氨基酸序列644-673 (WWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG)(SEQ ID NO：90，其可以由例如SEQ ID NO：91的MVA优化的核酸序列编码)。
MARV VP40氨基酸序列是以GenBank登录号JX458834可获得的，并且在下表14中提供为SEQ ID NO：92，其可以由例如SEQ ID NO： 93的MVA优化的核酸序列编码。在一些实施方案中，***到rMVA中的核酸是Seq.ID.No.94，或与其70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高同源的核酸序列。
表14：用于S蛋白融合构建体的MARY糖蛋白结构域
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Figure GDA0003957520830001591
在一个可替代的方案中，提供了rMVA病毒载体，其编码与GP蛋白融合的S蛋白或蛋白片段、来自SARS-CoV2的E蛋白、来自 SARS-CoV2的M蛋白和基质蛋白。在一些实施方案中，将S蛋白或蛋白质片段-GP融合物、E和M蛋白的编码核酸序列***rMVA中的单个***位点，并且将MARV VP40编码核酸序列***分开的***位点处。在一些实施方案中，将S蛋白或蛋白片段-GP融合物、E和M蛋白以及 MARV VP40编码核酸序列***rMVA中的单个***位点。
在一些实施方案中，S蛋白片段-GP融合蛋白包含S蛋白受体结合结构域(RBD)。在一些实施方案中，RBD肽来源于S蛋白的氨基酸 327至524。在一些实施方案中，RBD肽来源于S蛋白的氨基酸331至 524。在一些实施方案中，RBD是共有冠状病毒序列。RBD肽在其NH 末端侧侧接有来源于MARV糖蛋白的氨基酸1-19的信号肽(SEQ ID NO：88)，并且在其羧基末端侧侧接有MARV糖蛋白的跨膜结构域(SEQ ID NO：90)。所表达的GPS-RBD(aa 327-524)-GPTM肽在下表15 中的SEQ ID NO：95中提供，其可以由例如MVA优化的核酸序列(例如在SEQ IDNO：97中提供的)编码。表达的GPS-RBD(aa 331-524) -GPTM肽在下表15中的SEQ ID NO：96中提供，其可以由例如MVA 优化的核酸序列(例如在SEQ ID NO：98中提供的)编码。在一些实施方案中，排列核酸使得GPS-RBD-GPTM、E和M编码序列线性相邻。包含MARV VP40***物和适于在表达时形成VLP的编码 GPS-RBD-TM、E蛋白和M蛋白的单独的单个MVA***物的rMVA的线性表示提供在图7A中。包含MARV VP 40***物和适于在表达时形成VLP的编码GPS-RBD(aa 331-524)-TM、E蛋白和M蛋白的单独的单个MVA***物的rMVA的线性表示提供在图7B中。包含MARV VP 40***物和适于在表达时形成VLP的编码GPS-RBD(aa327-524)-TM、 E蛋白和M蛋白的单独的单个MVA***物的rMVA的线性表示提供在图7G中。在一些实施方案中，GPS-RBD-GPTM表达为SEQ ID NO：95 (RBD aa 327-524)或SEQ ID NO：96(RBD aa331-524)或SEQ ID NO:99(RBDaa 327-524,E484K)或SEQ ID NO：100(RBD aa 331-524；E484K)中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的，M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO:43中所提供的，并且 MARV VP蛋白表达为如SEQ ID NO：92中所提供的，或与其至少70％、 75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：95或96 或99或100、40、43和92的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：97或98、41和44，或与其至少70％、 75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码GPS-RBD-GPTM、E蛋白和M蛋白的核酸，其中所述核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ IDNO：97或98、 42和45中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如适用于测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、 p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如 Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、 TAG或TGA、或其组合或多个。进一步，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码GPS-RBD-GPTM、E蛋白和M 蛋白的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：101、102、103和104。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：101(图7H-7I)、102 (图7J-7K)、103(图7C-7D)或104(图7E-7F)的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA进一步包含SEQ ID NO：93或94的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
表15：GPS-RBD-GPTM融合物
Figure GDA0003957520830001611
Figure GDA0003957520830001621
Figure GDA0003957520830001631
Figure GDA0003957520830001641
在一个可替代的方案中，提供了rMVA病毒载体，其编码与GP蛋白融合的S蛋白肽、来自SARS-CoV2的E蛋白、来自SARS-CoV2的 M蛋白和基质蛋白，其中S蛋白片段-GP融合蛋白包含S蛋白串联重复序列。S蛋白串联重复序列在其NH末端侧侧接有来源于MARV糖蛋白的氨基酸1-19(SEQ ID NO：88)的信号肽，并且在其羧基末端侧侧接有MARV糖蛋白的跨膜结构域(SEQ ID NO：90)。在一些实施方案中，串联重复为例如(RBD-间隔基-RBD-间隔基)x或(RBDSeq.1-间隔基 -RBD Seq.2-间隔基)x，其中RBD是任何S蛋白RBD肽，RBD Seq.1 是第一S蛋白RBD肽，并且RBD Seq.2是第二S蛋白RBD肽，并且其中x＝2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些实施方案中，RBD肽选自一个或多个来源于SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸331至524。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位选自SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524或氨基酸473至490。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位选自SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473 至490。在一些实施方案中，在一些实施方案中，串联重复序列为((aa 504-524)-间隔基-(aa 473-490)-间隔基)x，其中x＝2、3、4、5、6、7、8、 9或10。在一些实施方案中，x＝3-7。在一些实施方案中，x＝5。包含GPS- 串联重复-GPTM的示例性氨基酸序列在表16中提供为SEQ ID NO： 105，其可以由SEQ ID NO：106的MVA优化的核酸序列编码。包含GPS-串联重复-GPTM的示例性氨基酸序列(其中串联重复的x＝5)在表 16中提供为SEQ IDNO：107，其可由SEQ ID NO：108的MVA优化的核酸序列编码。
在一些实施方案中，排列核酸使得GPS-串联重复-GPTM肽、E和 M编码序列线性相邻。包含MARV VP40***物和编码适合于在表达时形成VLP的GPS-串联重复-GPTM肽、E蛋白和M蛋白的单独的单个 MVA***物的rMVA的线性表示提供在图8A中。在一些实施方案中，GPS-串联重复-GPTM肽表达为如SEQ ID NO：105或107或109或110 中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：40中所提供的， M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，并且MARV VP 蛋白表达为如SEQ ID NO：92中提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：105或107或109或 110、40和43和92的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、 90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：106或108、41和44，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码GPS-串联重复-GPTM肽、E蛋白和M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：106或108、42和45中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，例如适于在测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如 TAA、TAG或TGA、或其组合或多个。进一步，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码GPS-串联重复-GPTM 肽、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：111和112。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：111(图8B-8C)或 112(图8D-8E)的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、 95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA进一步包含SEQ ID NO：93或94的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
表16：GPS-RBD-串联重复-GPTM
Figure GDA0003957520830001661
Figure GDA0003957520830001671
Figure GDA0003957520830001681
Figure GDA0003957520830001691
在一个可替代的方案中，提供了rMVA病毒载体，其编码与GP蛋白融合的修饰的S蛋白肽、来自SARS-CoV2的E蛋白、来自SARS-CoV2 的M蛋白和基质蛋白，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白羧基末端的S1+S2截短的蛋白。在一些实施方案中，S1+S2截短的蛋白包含S蛋白的氨基酸2至1213。在一些实施方案中，S1+S2截短的蛋白包含S蛋白的氨基酸2至1213，以及在氨基酸986和/或987处的脯氨酸取代(S1+S2 截短的+K986P和V987P)。在一些实施方案中，将截短的S蛋白-GP 融合物、E和M蛋白编码核酸序列***rMVA中的单个***位点，并且将MARV VP40编码核酸序列***在分开的***位点处。
在一些实施方案中，截短的S蛋白-GP融合蛋白包含S蛋白的氨基酸2-1213。截短的S蛋白在其NH末端侧侧接有来源于MARV糖蛋白的氨基酸1-19的信号肽(SEQ ID NO:88)，并且在其N末端处侧接有 MARV糖蛋白的跨膜结构域(SEQ ID NO:90)。所表达的GPS-截短的 S蛋白-GPTM肽提供在下表17中的SEQ ID NO：113中，其可以由例如MVA优化的核酸序列编码，例如在SEQ ID NO：115中提供的。所表达的GPS-截短的S蛋白+K986P和V987P)-GPTM肽提供在下表17 中的SEQ ID NO：114中，其可以由例如MVA优化的核酸序列编码，例如在SEQ IDNO：116中提供的。所表达的GPS-截短的S蛋白-GPTM 肽提供在下表17中的SEQ ID NO：117中，其进一步包括取代K417T、 E484K和N501Y。所表达的GPS-截短的S蛋白+K986P、V987P、K417T、 E484K和N501Y)-GPTM肽提供在下表17中的SEQ ID NO：118中。在一些实施方案中，排列核酸使得GPS-截短的S-GPTM、E和M编码序列线性相邻。包含MARV VP40***物和编码适合于在表达时形成 VLP的GPS-截短的S-TM、E蛋白和M蛋白的单独的单个MVA***物的rMVA的线性表示提供在图9A中。在一些实施方案中，排列核酸使得GPS-截短的S+K986P和V987P-GPTM、E和M编码序列线性相邻。包含MARV VP40***物和编码GPS-截短的S+K986P和V987P-TM、E 蛋白和适于在表达时形成VLP的M蛋白的单独的单个MVA***物的 rMVA的线性表示提供在图9H中。在一些实施方案中，GPS-截短的 S-GPTM表达为如SEQ ID NO：113或SEQ IDNO：114或SEQ ID NO： 117或SEQ ID NO：118中所提供的，E蛋白表达为全长蛋白，如SEQ IDNO：40中所提供的，M蛋白表达为全长蛋白，如SEQ ID NO：43中所提供的，并且MARV VP蛋白表达为如SEQ ID NO：92中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：113或或114或117或118、40、43和92的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：115或116、41和44，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码GPS-截短的S-GPTM、E蛋白和M蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：115或116、42和45中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如适用于测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA、或其组合或多个。进一步，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码GPS-截短的 S-GPTM或GPS-截短的S+K986P和V987P)、E蛋白和M蛋白的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：119、120、121或122。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：119(图9B-9C-9D)、120(图9E-9F-9G)、121(图9I-9J-9K)或122(图9L-9M-9N)的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA进一步包含SEQ ID NO：93或94的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
表17：GPS-截短的S-GPTM
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在一个可替代的方面，本文提供了rMVA病毒载体，其被设计为表达呈框内融合蛋白的一种或多种SARS-CoV2 S蛋白抗原性肽，其中融合蛋白包含包膜糖蛋白的信号序列(GPS)、SARS-CoV2 S蛋白或蛋白片段、包膜糖蛋白的跨膜结构域(GPTM)，以包膜糖蛋白的胞质结构域(GPCD)，其中包膜糖蛋白不是来源于冠状病毒。rMVA病毒载体被进一步设计为表达来自与包膜糖蛋白来源相同的病毒的基质蛋白。通过提供SARS-CoV2 S蛋白片段与GP蛋白的融合物，S蛋白片段-GP融合物可以与rMVA表达的基质蛋白形成VLP。
用于本发明的合适的糖蛋白和基质蛋白包括，但不限于来源于以下的那些：丝状病毒科，例如马尔堡病毒、埃博拉病毒或苏丹病毒；逆转录病毒科，例如人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)；沙粒病毒科，例如拉沙病毒；黄病毒科，例如登革热病毒和寨卡病毒。在特定实施方案中，糖蛋白和基质蛋白来源于马尔堡病毒(MAV)。在特定实施方案中，糖蛋白源自于MARV GP蛋白(GenBank登录号AFV31202.1)。MARV GP 蛋白的氨基酸序列提供在表14中的SEQ ID NO：87中。在特定实施方案中，MARV GPS结构域包含糖蛋白的氨基酸1至19(MWTTCFFISLILIQGIKTL)(SEQ ID NO：88，其可以由例如SEQ ID NO：89的MVA优化的核酸序列编码)，GPTM结构域包含糖蛋白的氨基酸序列644-673 (WWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG)(SEQ ID NO：90，其可以由例如SEQ ID NO：91的MVA优化的核酸序列编码)。
MARV VP40氨基酸序列可以以GenBank登录号JX458834获得，并且提供在表14中的SEQ ID NO：92中，其可以由例如SEQ ID NO： 93的MVA优化的核酸序列编码。在一些实施方案中，编码病毒基质蛋白的核酸序列可以包含作为具有GPS-S蛋白或蛋白片段-GPTM核酸序列的双顺反子序列，或包含在***在MVA基因组中的单独位置处的单独核酸序列上。
在一个可替代的方案中，提供了rMVA病毒载体，其编码与GP蛋白融合的修饰的S蛋白肽，其中修饰的S蛋白包含缺少蛋白羧基末端的 S1+S2截短的蛋白，并且还编码基质蛋白，例如MARV VP40蛋白。在一些实施方案中，S1+S2截短的蛋白包含S蛋白的氨基酸2至1213。在一些实施方案中，S1+S2截短的蛋白包含S蛋白的氨基酸2至1213和一个或多个脯氨酸取代，例如K986P和/或V987P。在一些实施方案中，将截短的S蛋白-GP融合物和MARV VP40编码核酸序列***在单个***位点处。在一些实施方案中，将截短的S蛋白-GP融合物和MARV VP40的编码核酸序列作为双顺反子序列***MVA基因组。
在一些实施方案中，截短的S蛋白-GP融合蛋白包含S蛋白的氨基酸2-1213。截短的S蛋白在其NH末端侧侧接有来源于MARV糖蛋白的氨基酸1-19的信号肽(SEQ ID NO：88)，并且在其羧基末端侧侧接有MARV糖蛋白的跨膜结构域(SEQ ID NO：90)。所表达的GPS-截短的S蛋白-GPTM肽提供在表17中的SEQ ID NO：113或114中，其可以由例如MVA优化的核酸序列编码，例如提供在SEQ ID NO：115 或116中。可替代地，所表达的GPS-截短的S蛋白-GPTM肽提供在表 17中的SEQ ID NO：117或118中。包含MARV VP 40***物和编码 GPS截短的S-TM的单个MVA***物的RMVA的线性表示提供在图 10A中。包含MARV VP 40***物和编码GPS截短的S+K986P和V987P-TM的单个MVA***物的rMVA的线性表示提供在图10F中。在一些实施方案中，GPS-截短的S-GPTM表达为如SEQ ID NO：113或 114或117或118中所提供的，并且MARV VP蛋白表达为如SEQ ID NO： 92中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：113或114或117或118和92的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ IDNO：70A或70B，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码GPS-截短的S-GPTM的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：115或116 中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如适合在测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、 pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak 共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或 TGA、或其组合或多个。进一步，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码GPS-截短的S-GPTM的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：123、124、125或126.在一些实施方案中，rMVA 包含选自SEQ ID NO：123(图10B-10C)、124(图10D-10E)、125 (图10G-10H)或126(图10I-10J)的核酸序列，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA 进一步包含SEQ ID NO：93或94的核酸序列，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。
在一些实施方案中，截短的S蛋白-GP融合物和MARV VP40的编码核酸序列作为双顺反子序列***MVA基因组。包含MARV VP40***物和GPS-截短的S-TM作为双顺反子核酸的rMVA的线性表示提供在图10K中。包含MARV VP40***物GPS-截短的S+K986P和V987P-TM 作为双顺反子核酸的rMVA的线性表示提供在图10R中。用于***的编码GPS-截短的S或截短的S+K986P和V987P-GPTM/VP40的示例性的核酸序列提供为SEQ ID NO：127、128、129或130。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：127(图10L-10M-10N)、128(图 10O-10P-10Q)、129(图10S-10T-10U)或130(图10V-10W-10X)的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
在一个可替代的方案中，提供了rMVA病毒载体，其编码与GP蛋白融合的S蛋白受体结合结构域(RBD)肽，并且还编码基质蛋白，例如MARV VP40蛋白。在一些实施方案中，将RBD-GP融合物和MARV VP40的编码核酸序列***在分开的***位点处，如图11A所示。在一些实施方案中，将RBD GP融合物作为双顺反子序列***MVA基因组，如图11H所示。
在一些实施方案中，RBD肽来源于S蛋白的氨基酸327至524。在一些实施方案中，RBD肽来源于S蛋白的氨基酸331至524。在一些实施方案中，RBD是共有冠状病毒序列。RBD肽在其NH末端侧侧接有来源于MARV糖蛋白的氨基酸1-19的信号肽(SEQ ID NO：88)，并且在其羧基末端侧侧接有MARV糖蛋白的跨膜结构域(SEQ ID NO： 90)。所表达的GPS-RBD(aa 327-524)-GPTM肽提供在下表15中的 SEQ ID NO：95中，其可以由例如MVA优化的核酸序列(例如在SEQ ID NO：97中提供的)编码。所表达的GPS-RBD(aa 331-524)-GPTM 肽提供在下表15中的SEQ ID NO：96中，其可以由例如MVA优化的核酸序列(例如在SEQ ID NO：98中提供的)编码。可替代地，所表达的GPS-RBD(aa327-524)-GPTM肽提供在SEQ ID NO：99中。可替代地，所表达的GPS-RBD(aa327-524)-GPTM肽提供在SEQ ID NO：100中。包含MARV VP 40***物和适于在表达时形成VLP的单独的 GPS-RBD-TM***物的rMVA的线性表示提供在图11a中。包含MARV VP 40***物和适于在表达时形成VLP的单独的GPS-RBD(aa 33L-524) -TM***物的rMVA的线性表示提供在图11b中。包含MARV VP 40 ***物和适于在表达时形成VLP的单独的GPS-RBD(aa 327-524)-TM ***物的rMVA的线性表示提供在图11E中。在一些实施方案中， GPS-RBD-GPTM表达为如SEQ ID NO：95或99(RBD(aa 327-524) 或96或100(RBD(aa331-524)中所提供的，并且MARV VP蛋白表达为如SEQ ID NO：92中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、 80％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或 MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：95或96或99或100和92 的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、80％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：97或98，或与其至少70％、75％、80％、85％、80％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码GPS-RBD-GPTM的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO： 97或108中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，例如适于在测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于 pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白质或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括适当的终止密码子，例如 TAA、TAG或TGA、或其组合或多个。此外，核酸序列可以包括在每种所编码的蛋白的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码GPS-RBD-GPTM的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：131、132、133或134。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：131(图11F)、132(图11G)、133(图11C)或134(图11D)的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA进一步包含SEQ ID NO：93或94的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、 85％、90％或95％同源的序列。
在一些实施方案中，RBD-GP融合物和MARV VP40的编码核酸序列作为双顺反子序列***MVA基因组。包含MARV VP40***物和 GPS-RBD(aa 33L-325)-TM作为双顺反子核酸的rMVA的线性表示提供在图11I中。包含MARV VP 40***物和GPS-RBD(aa 327-325)-TM 作为双顺反子核酸的rMVA的线性表示提供在图11N中。用于***的编码GPS-RBD-GPTM-VP40的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：135(图 11O-11P)和136(图11Q-11R)(RBD(aa 327-524))或137(图11J-11K) 和138(图11L-11M)(RBD(aa331-524))。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：135、136、137或138的核酸序列，或与其至少 70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
在一个可替代的方案中，提供了rMVA病毒载体，其编码与GP蛋白融合的S蛋白肽，并且也编码病毒基质蛋白，例如MARV VP40蛋白。在一些实施方案中，S蛋白串联重复序列在其NH末端侧侧接有来源于 MARV糖蛋白的氨基酸1-19的信号肽(SEQ ID NO：88)，并且在其羧基末端侧侧接有MARV糖蛋白的跨膜结构域(SEQ ID NO：90)。在一些实施方案中，串联重复为例如(RBD-间隔基-RBD-间隔基)x或(RBD Seq.1-间隔基-RBD Seq.2-间隔基)x，其中RBD是任何S蛋白RBD肽， RBD Seq.1是第一S蛋白RBD肽，并且RBD SEQ.ID.NO.2是第二S蛋白RBD肽，其中x＝2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些实施方案中， RBD肽选自一个或多个来源于SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸331至524 或327至524。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位选自 SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，由rMVA编码的线性表位是SARS-CoV2 S蛋白的氨基酸504 至524和氨基酸473至490。在一些实施方案中，串联重复序列是((aa504-524)-间隔基-(aa473-490)-间隔基)x，其中x＝2、3、4、5、6、7、 8、9或10。在一些实施方案中，x＝3-7。在一些实施方案中，x＝5。包含 GPS-串联重复-GPTM的示例性氨基酸序列提供在表16中的SEQ ID NO：105中，其可以由SEQ ID NO：106的MVA优化的核酸序列编码。可替代地，包含GPS-串联重复-GPTM的示例性氨基酸序列提供在表16 中的SEQ ID NO：109中。包含GPS-串联重复-GPTM的示例性氨基酸序列(其中串联重复的x＝5)提供在表16中的SEQ ID NO：107中，其可以由SEQ ID NO：108的MVA优化的核酸序列编码。包含GPS-串联重复-GPTM的示例性氨基酸序列(其中串联重复的x＝5)提供在表16中的SEQ ID NO：110中。
包含MARV VP40***物和编码适合于在表达时形成VLP的GPS- 串联重复-GPTM肽的单独的单个MVA***物的线性表示提供在图12A 中。在一些实施方案中，GPS-串联重复-GPTM肽表达为如SEQ ID NO： 64或66中所提供的，并且MARV VP蛋白表达为如SEQ ID NO：59所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：105或106或109或110和92的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或105％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：106或108，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码GPS-串联重复-GPTM肽的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：106或108或109或45中所提供的，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如适合在测定法检测期间使用的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于 pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如 TAA、TAG或TGA，或其组合或多个。进一步，核酸序列可以在每种所编码的蛋白质的最后一个终止密码子的3’包括痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***编码GPS-串联重复-GPTM肽的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：139和140。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：139(图12B)或140(图12C)的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。在一些实施方案中，rMVA进一步包含SEQ ID NO：93或94的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
在一些实施方案中，将GPS-串联重复-GPTM和MARV VP40编码核酸序列作为双顺反子序列***MVA基因组。包含MARV VP40***物和GPS-串联重复-GPTM作为双顺反子核酸的rMVA的线性表示提供在图12D中。用于***的编码GPS-串联重复-GPTM-VP40的示例性核酸序列提供为SEQ ID NO：141和142。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：141(图12E-12F)或142(图12G-12H)的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
在一些实施方案中，提供了仅编码刺突(S)蛋白(或其片段)的 rMVA病毒载体。编码S蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图 13A中。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，例如，如SEQ ID NO：1或6所提供的，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA 病毒载体，其包含编码SEQ ID NO：1的核酸序列，或与其至少70％、 75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其包含编码SEQ ID NO：6的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码全长S蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQID NO:3中所提供的。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，例如适于在测定法中检测表达蛋白的EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、 pSyn、pHyb的那些启动子序列，或本领域已知的任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在每种蛋白或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA，或其组合或多个。进一步，核酸序列可以在每种所编码的蛋白质的最后一个终止密码子的3’包括痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制性酶位点，以便于抗原性序列的***。包含全长S蛋白的相邻编码序列的示例性核酸序列在下文提供为SEQ ID NO：143(图13B-13C)和144 (图13D-13E)。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ IDNO：143 或144的核酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。
可替代地，提供了编码刺突(S)蛋白的rMVA病毒载体，其中S 蛋白已经用一个或多个稳定化S蛋白三聚体呈融合前构象的氨基酸脯氨酸取代。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且在S胞外域三聚体的启动子的七肽重复1(HR1)和中心螺旋之间的边界处或附近含有一个或多个脯氨酸取代。在一些实施方案中，脯氨酸取代发生在三聚体中启动子的氨基酸残基970至990之间。在一些实施方案中，S蛋白表达为全长蛋白，并且在氨基酸K986和V987处含有两个脯氨酸取代。编码稳定化的S蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图14A中。在一些实施方案中，S蛋白表达为在S蛋白的氨基酸986和987处包含两个脯氨酸取代的全长蛋白，例如，如SEQ ID NO：8或11中所提供的，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：8或11的核酸序列，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：9，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码全长脯氨酸取代的S蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO： 10或12中所提供的，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak共有序列。此外，核酸序列可以在蛋白或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG或TGA，或其组合或多个。进一步，核酸序列可包括在每种所编码的蛋白质的最后一个终止密码子的3'的痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制性酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码全长稳定化的S蛋白的示例性核酸序列在下文提供为SEQ ID NO：145 和146。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ ID NO：145(图 14B-14C)或146(图14D-14E)的核酸序列，或与其至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
可替代地，提供了rMVA病毒载体，其编码刺突(S)蛋白的修饰的、截短的形式，其中截短的S蛋白包含S1+S2区域并且缺少羧基末端。在一些实施方案中，截短的S蛋白包含氨基酸1至1213(SEQ ID NO： 13或SEQ ID NO：18)。在一些实施方案中，截短的S蛋白在氨基酸986和987处含有两个脯氨酸取代(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：19)。编码截短的S蛋白的单个MVA***物的线性表示提供在图15A中。编码截短的S蛋白+K986P和V987P的单个MVA***物的线性表示提供在图15F中。在一些实施方案中，截短的S蛋白表达为如SEQ ID NO： 13、14、18或19所提供的，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种质粒或MVA病毒载体，其含有编码SEQ ID NO：13、14、18或19的核酸序列，或与其至少75％、80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是一种核酸序列，其包含SEQ ID NO：15，或与其至少75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，本文提供的是编码截短的S蛋白的核酸，其中核酸已被优化用于在MVA病毒载体中表达，例如如SEQ ID NO：16或17中所提供的，或与其至少75％、 80％、85％、90％或95％同源的序列。在一些实施方案中，核酸序列编码另外的氨基酸序列，例如标签，例如C-末端标签，如EPEA。核酸序列可以进一步包含合适的启动子序列，例如但不限于来源于pmH5、p11、 pSyn、pHyb的那些启动子序列，或任何其他合适的启动子序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括合适的翻译起始序列，例如Kozak 共有序列。此外，核酸序列可以在每种蛋白或标签的最后一个氨基酸序列之后的核酸序列的3'端处包括合适的终止密码子，例如TAA、TAG 或TGA，或其组合或多个。进一步，核酸序列可以在每种所编码的蛋白质的最后一个终止密码子的3'包括痘苗病毒终止序列。此外，用于***的核酸序列可以进一步包括用于产生穿梭载体的限制性酶位点，以便于抗原性序列的***。用于***的编码截短的S蛋白的示例性核酸序列在下文提供为SEQ ID NO：147(图15B-15C)、148(图15D-15E)、149 (图15G-15H)或150(图15I-15J)。在一些实施方案中，rMVA包含选自SEQ IDNO：147、148、149或150的核酸序列，或与其至少70％、 75％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
药物组合物
本发明的重组病毒载体易于配制为供兽医或人类使用的药物组合物，单独或组合。药物组合物可包含可药用稀释剂、赋形剂、运载体或佐剂。
在一个实施方案中，本发明是有效防止和/或治疗SARS-CoV2感染的疫苗，其包含表达至少一种SARS-CoV2抗原性多肽或其免疫原性片段的重组MVA载体。疫苗组合物可包含一种或多种另外的治疗剂。
药物组合物可以包含1、2、3、4或多于4种不同的重组MVA载体。
如本文使用的短语“可药用运载体”涵盖任何标准药物运载体，例如适合于肠胃外施用的那些，例如通过肌内、关节内(在关节中)、静脉内、皮内、腹膜内和皮下途径。这样的制剂的实例包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。一种示例性的可药用运载体是生理盐水。
其他生理学上可接受的稀释剂、赋形剂、运载体或佐剂及其制剂是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，佐剂用作免疫应答增强剂。在多个实施方案中，免疫应答增强剂选自基于明矾的佐剂、基于油的佐剂、Specol、RIBI、Titermax、Montanide ISA50或Montanide ISA 720、GM-CSF、基于非离子嵌段共聚物的佐剂、基于二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂 AS-1、AS-2、基于Ribi佐剂***的佐剂、QS21、Quil A、SAF(微流化形式的Syntex佐剂(SAF-M)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)、基于人补体的佐剂m.vaccae、ISCOMS、MF-59、SBAS-2、SBAS-4、
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RC-529、AGPs、MPL-SE、QS7、七叶皂苷；洋地黄皂苷；满天星；和藜属藜麦皂苷(Chenopodium quinoa saponins)。
本文所述方法中使用的组合物可以通过选自例如肠胃外、肌内、动脉内、血管内、静脉内、腹膜内、皮下、皮肤、透皮、眼部、吸入、口腔、舌下、舌周、鼻、局部施用和口服施用的途径施用。优选的施用方法可以根据各种因素(例如，所施用的组合物的组分和所治疗的病症的严重程度)而变化。适于口服施用的制剂可以由液体溶液(例如溶解在稀释剂(例如水、盐水或PEG-400)中的有效量的组合物)、胶囊、小袋或片剂组成，各自含有预定量的疫苗。药物组合物还可以是用于吸入例如至支气管通道的气溶胶制剂。气溶胶制剂可以与加压的可药用推进剂(例如，二氯二氟甲烷、丙烷或氮气)混合。
出于本发明的目的，适于递送治疗剂或生物活性剂的药物组合物可以包括，例如片剂、胶囊片(gelcaps)、胶囊、丸剂、粉末、颗粒、悬浮液、乳液、溶液、凝胶、水凝胶、口服凝胶、糊剂、滴眼剂、软膏、乳膏、硬膏剂、浸液、递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂或气溶胶。这些制剂中的任一种可以通过本领域公知且可接受的方法制备。参见，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第 21版.)，ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2005，和 Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology，ed.J.Swarbrick，Informa Healthcare,2006，将其各自通过引用并入本文中。
如果本发明的组合物与免疫刺激剂或佐剂共同施用，则可以显著改善组合物(例如疫苗)的免疫原性。本领域技术人员熟知的合适的佐剂包括例如磷酸铝、氢氧化铝、QS21、Quil A(及其衍生物和组分)、磷酸钙、氢氧化钙、氢氧化锌、糖脂类似物、氨基酸的十八烷基酯、胞壁酰二肽、聚磷腈、脂蛋白、ISCOM-基质、DC-Choi、DDA、细胞因子和其他佐剂及其衍生物。
适于口服施用的制剂可以由以下组成：(a)液体溶液，例如溶解在稀释剂(例如水、盐水或PEG 400)中的有效量的疫苗；(b)胶囊、小袋或片剂，各自含有预定量的液体、固体、颗粒或明胶形式的疫苗；(c) 在适当液体中的悬浮液；(d)合适的乳液；和(e)多糖聚合物，例如几丁质。单独或与其他合适组分组合的疫苗也可以制成气溶胶制剂，以经由吸入施用至例如支气管通道。可以将气溶胶制剂置于加压的可接受的推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
用于直肠施用的合适制剂包括例如栓剂，其由疫苗与栓剂基质组成。合适的栓剂基质包括天然或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，还可以使用明胶直肠胶囊，其由疫苗与基质的组合组成，所述基质包括例如液体甘油三酯、聚乙二醇和石蜡烃。本发明的疫苗还可以与细胞因子共同施用，以进一步增强免疫原性。细胞因子可以通过本领域技术人员已知的方法施用，例如作为质粒形式的核酸分子或作为蛋白或融合蛋白。
本发明还提供包含本发明疫苗的试剂盒。例如，包含疫苗和使用说明书的试剂盒在本发明的范围内。
使用方法
本发明的组合物可用作疫苗，用于诱导对SARS-CoV2的免疫应答。
在示例性实施方案中，本发明提供一种预防需要其的受试者(例如，未暴露的受试者)的SARS-CoV2感染的方法，所述方法包括向受试者施用预防有效量的本发明的组合物。所述方法的结果是受试者针对病毒得到部分或完全免疫。
在示例性实施方案中，本发明提供一种治疗需要其的受试者(例如，暴露的受试者，例如最近已经暴露但尚未有症状的受试者，或最近已经暴露但仅有轻微症状的受试者)的SARS-CoV2感染的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的组合物。治疗的结果是受试者具有改善的治疗状况。
待根据本文描述的方法治疗的受试者(例如，感染SARS-CoV2的受试者)可以是已经被医师诊断为患有这种病症的受试者。可以通过任何合适的手段进行诊断。预防感染发展的受试者可能已经或可能没有接受这样的诊断。本领域技术人员将理解，根据本发明治疗的受试者可能已经使用标准试验进行鉴定，或者可能已经在未经检查的情况下鉴定为由于存在一种或多种风险因素(例如，暴露于SARS-CoV2等)而处于高风险中的受试者。
预防性治疗可以例如施用于尚未暴露于SARS-CoV2或未感染 SARS-CoV2但对SARS-CoV2敏感或者有暴露或感染SARS-CoV2风险的受试者。
治疗性处理可以施用于，例如，已经暴露于SARS-CoV2或被 SARS-CoV2感染、尚未患病、或显示症状或感染、患有病症的受试者，以改善或稳定受试者的状况(例如，已经感染SARS-CoV2的患者)。结果是改善的治疗状况。在一些情况下，与等同的未治疗的对照相比，治疗可以将病症或其症状缓解例如5％、10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％、95％或100％，如通过任何标准技术测量的。在一些情况下，治疗可导致对病毒复制的抑制、病毒滴度或病毒载量的降低、病毒的根除或清除。在其他实施方案中，治疗可以导致对感染的一种或多种症状的缓解，包括上文鉴别的任何症状。根据该实施方案，可以通过检测症状的改善或不存在来评估治疗的确认。
在其它实施方案中，治疗可导致受试者将感染传播给另一个未感染受试者的能力降低或消除。根据该实施方案的治疗的确认通常使用用于确定病症缓解的相同方法来评估，但是预防传播所需的病毒滴度或病毒载量的降低可能不同于缓解病症所需的病毒滴度或病毒载量的降低。
在一个实施方案中，本发明是一种在受试者(例如，人)中诱导免疫应答的方法，其通过向受试者施用编码来自SARS-CoV2的至少一种基因的重组病毒载体。免疫应答可以是细胞免疫应答或体液免疫应答或其组合。
在一个特定实施方案中，本发明是一种在受试者(例如，人)中诱导免疫应答的方法，其通过向受试者施用编码来自SARS-CoV2的至少一种基因的重组病毒载体。免疫应答可以是细胞免疫应答或体液免疫应答或其组合。
在一个实施方案中，免疫应答是广泛中和抗体应答。
在一个特定实施方案中，本发明是一种在受试者(例如，人)中诱导免疫应答的方法，其通过向受试者施用编码来自SARS-CoV2的至少一种基因的重组病毒载体。在某些实施方式中，重组病毒载体编码来自 SARS-CoV2的至少两种基因。免疫应答可以是细胞免疫应答或体液免疫应答或其组合。
在另一个实施方案中，本发明的特征在于一种治疗受试者(例如，人)的SARS-CoV2感染的方法，其通过向受试者施用编码来自 SARS-CoV2的至少一种基因的重组病毒载体。所治疗的受试者可能未患有SARS-CoV2感染，但有发展SARS-CoV2感染的风险。
组合物可以例如通过注射(例如，肌内、动脉内、血管内、静脉内、腹膜内或皮下)施用。
应当理解，可以同时或顺序(例如加强)使用多于一种施用本发明疫苗的途径。此外，本发明的疫苗可以与传统免疫接种方法(例如使用蛋白抗原、痘苗病毒和灭活病毒作为疫苗)组合使用。因此，在一个实施方案中，将本发明的疫苗施用于受试者(受试者用本发明的疫苗“初次”免疫)，然后施用不同的疫苗(受试者用不同的疫苗“加强”)。在另一个实施方案中，首先向受试者施用不同的疫苗，然后施用本发明的疫苗。在另一个实施方案中，共同施用不同的疫苗和本发明的疫苗。在一些实施方案中，不同的疫苗是mRNA-1273(Moderna，Inc.)、AZD-1222 (AstraZeneca和University of Oxford)、BNT162(Pfizer和Biontech)、Coronavac(Sinovac)、NVX-CoV 2372(Novovax)、SCB-2019(Sanofi 和GSK)、Zycov-D(ZydusCadila)或Covaxin(Bharat Biotech)。
虽然不受任何特定机制的束缚，但是据信在接种如本文所述的药物组合物时，宿主的免疫***通过产生对SARS-CoV2蛋白特异性的分泌型和血清型抗体；以及通过产生对SARS-CoV2具有特异性的细胞介导的免疫应答来对疫苗进行应答。作为疫苗接种的结果，宿主至少部分或完全免疫SARS-CoV2感染，或抵抗由SARS-CoV2感染引起的中度或重度疾病的发展。
在一个方面，本发明提供减轻与SARS-CoV2感染相关的一种或多种症状(例如，发热、重度头痛、肌肉疼痛、不适、极度虚弱、结膜炎、常见皮疹、吞咽困难、恶心、呕吐、出血性腹泻随后弥漫性出血、谵妄、休克、黄疸、血小板减少症、淋巴细胞减少症、嗜中性粒细胞增多症、各种器官(例如肾和肝)中的局灶性坏死和急性呼吸窘迫)、降低其严重性或减少其发生的方法，所述方法包括施用有效量的包含重组MVA 病毒载体的药物组合物，所述重组MVA病毒载体包含SARS-CoV2蛋白或其片段。
在一个实施方案中，施用重复至少两次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次或超过8次。
在一个实施方案中，施用重复两次。
在一个实施方案中，提供约2-8、约4-8或约6-8次施用。
在一个实施方案中，在施用之间提供约1-4周、2-4周、3-4周、1 周、2周、3周、4周或超过4周的间隔。
在一个特定实施方案中，在2次施用之间使用4周间隔。
本发明包括预防和治疗SARS-CoV2感染的方法，包括耐药性和多重耐药性形式的病毒以及病毒感染的相关疾病状态、病况或并发症，包括肺炎，如2019新型冠状病毒感染的肺炎(NCIP)、急性肺损伤(ALI) 和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。另外的非限制性并发症包括低氧性呼吸衰竭、急性呼吸衰竭(ARF)、急性肝损伤、急性心脏损伤、急性肾损伤、脓毒性休克、弥散性血管内凝血、血凝块、多***炎性综合征、慢性疲劳、横纹肌溶解和细胞因子风暴。
在另一个可替代的实施方案中，提供一种预防传播的方法，其包括向人施用有效量的一种或多种本文所述的rMVA病毒载体，以诱导预防 SARS-CoV2的传播的足够的免疫应答。
本发明涉及一治疗SARS-CoV2感染的方法，包括耐药性和多重耐药性形式的病毒以及病毒感染的相关疾病状态、病况或并发症，包括肺炎，如2019新型冠状病毒感染的肺炎(NCIP)、急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。另外的非限制性并发症包括低氧性呼吸衰竭、急性呼吸衰竭(ARF)、急性肝损伤、急性心脏损伤、急性肾损伤、脓毒性休克、弥散性血管内凝血、血凝块、多***炎性综合征、慢性疲劳、横纹肌溶解和细胞因子风暴。
在一个实施方案中，施用本文所述的rMVA导致进行性呼吸功能不全(PRI)的发生率降低，如通过使用如下所述6级分层水平的呼吸支持方法，维持令人满意的氧合(SpO2>93％)所需的呼吸支持方法中大于或等于1级或甚至2级或更多级增加所测量的，其中受试者已经获得 SARS-CoV2感染，但是先前已经或将要施用本文所述的rMVA病毒载体。
增加呼吸支持水平的量表包括：
水平1：在室内空气中正常氧合(SpO2>93％)，不需要补充O2
水平2：在室内空气中持续低氧血症(SpO2>93)，需要通过鼻套管或面罩低水平补充O2(高达2L/min)，以维持SpO2>93
水平3：需要通过鼻套管或面罩进行更高水平的被动补充O2(高达 2L/min)，以维持SpO2>93
水平4：需要通过正压装置进行氧合，例如持续气道正压通气(CPAP)或双水平气道正压通气(BiPAP)或其他非侵入性正压呼吸支持方法，以维持令人满意的氧合和/或通气
水平5：需要侵入性呼吸支持(插管机械通气或ECMO)
水平6：死亡
在一个实施方案中，PRI的降低是与未经免疫的受试者相比，从水平5增加至水平3、从水平5增加至水平2或从水平5增加至水平1。在一个实施方案中，PRI的降低是与未经免疫的受试者相比，从水平4增加至水平2或从水平4增加至水平1。
在一个实施方案中，施用本文所述的rMVA病毒载体将临床恢复的中值时间(NIAID临床状态量表中的状态6、7或8，使用适应的国家过敏和传染病研究所(NIAID)临床状态顺序量表)减少至少3、4、5或更多天。在一个实施方案中，本文所述的rMVA病毒载体的施用导致改善，如在发展SARS-CoV2感染的受试者中通过临床状态的适应顺序量表测量。
从最严重的疾病到逐渐不太严重的疾病，总体临床状态的适应序数量表的阶段定义如下：
1.死亡
2.住院，侵入性机械通气或ECMO
3.住院，采用非侵入性通气或高流量氧气装置
4.住院，需要补充氧气
5.住院，不需要补充氧气-需要持续医疗护理(与COVID-19相关或其他相关)
6.住院，不需要补充氧气；不再需要COVID-19的密切医疗护理
7.未住院，但活动受到限制，并且需要对COVID-19表现的密切门诊护理
8.未住院，不限制活动，不需要持续的密切医疗护理
在一个实施方案中，与未免疫的受试者相比，施用本文所述的rMVA 病毒载体将临床恢复的中值时间(NIAID临床状态量表中的状态6、7 或8，使用适应的国家过敏和传染病研究所(NIAID)临床状态顺序量表)减少至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天或至少 10天。
在一个实施方案中，与未免疫的受试者相比，施用本文所述的rMVA 病毒载体减少了感染SARS-CoV-2病毒的患者的住院持续时间。
在一个实施方案中，与未免疫的受试者相比，施用本文所述的rMVA 病毒载体减少了感染SARS-CoV-2病毒的患者的鼻和/或咽喉中持续检测不到SARS-CoV-2病毒的时间。
在一个实施方案中，与未免疫的受试者相比，施用本文所述的rMVA 病毒载体减少了呼吸衰竭或死亡。
剂量
疫苗以与剂量制剂相容的方式施用，并且以治疗有效、免疫原性和保护性的量施用。待施用的量取决于待治疗的受试者，包括例如个体的免疫***合成抗体以及(如果需要)产生细胞介导的免疫应答的能力。需要施用的活性成分的精确量取决于执业医师的判断，并且可以在逐个患者的基础上进行监测。然而，合适的剂量范围可由本领域技术人员容易地确定，并且通常在约5.0χ106TCID50至约5.0χ109TCID50的范围内。剂量还可以取决于但不限于施用途径、患者的健康状况和体重以及制剂的性质。
本发明的药物组合物以针对埃博拉病毒的致病物种治疗有效、免疫原性和/或保护性抗的量施用。施用的剂量取决于待治疗的受试者(例如，施用方式和待治疗的受试者的年龄、体重、免疫***能力和一般健康状况)。组合物以提供引发免疫应答而没有过度的不良生理作用的足够表达水平的量施用。优选地，本发明的组合物是异源病毒载体，其包括SARS-CoV2的一种或多种多肽或编码SARS-CoV2的一个或多个基因的核酸分子，并且以以下剂量施用，例如在1.0χ104至9.9χ1012TCID50之间的病毒载体，优选地在1.0χ105TCID50至1.0χ1011TCID50pfu之间，更优选地在1.0χ106至1.0χ1010TCID50pfu之间，或者最优选地在5.0χ106至5.0χ109TCID50之间。组合物可以包括，例如至少5.0χ106TCID50的病毒载体(例如，1.0χ108TCID50的病毒载体)。医师或研究人员可以决定合适的量和剂量方案。
方法的组合物可以包括，例如在1.0χ104至9.9χ1012TCID50之间的病毒载体，优选地在1.0χ105TCID50至1.0χ1011TCID50pfu之间，更优选地在1.0χ106至1.0χ1010TCID50pfu之间，或者最优选地在5.0χ106至5.0χ109TCID50之间。组合物可以包括，例如至少5.0χ106TCID50的病毒载体(例如，1.0χ108TCID50的病毒载体)。方法可以包括例如向受试者施用组合物两次或更多次。
本发明的特征还在于一种在受试者(例如，人)中诱导针对 SARS-CoV2的免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的编码来自 SARS-CoV2的至少一种基因的重组病毒载体。所治疗的受试者可未患有沙粒病毒感染，但有发展沙粒病毒感染的风险。可替代地，受试者可能已经感染了SARS-CoV2。组合物可以例如通过注射(例如，肌内、动脉内、血管内、静脉内、腹膜内或皮下)施用。
术语“有效量”指以临床相关方式施用以改善、抑制或缓解受试者的病况或病症的症状(例如，改善、抑制或缓解沙粒病毒感染，或提供对 SARS-CoV2感染的有效免疫应答)的组合物的量。受试者的任何改善被认为足以实现治疗。优选地，足以治疗的量是预防SARS-CoV2的一种或多种症状发生的量，或者是降低受试者患有SARS-CoV2感染的一种或多种症状的严重程度或其持续时间长度的量(例如，相对于未用本发明的组合物治疗的对照受试者，降低至少10％、20％或30％，更优选地至少50％、60％或70％，且最优选地至少80％、90％、95％、99％或更多)。用于实施本文所述方法(例如，治疗SARS-CoV2感染)的药物组合物的足够量根据施用方式和待治疗受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，处方医师或研究人员将决定合适的量和剂量。
在某些情况下，可能期望将本发明的免疫原性SARS-CoV2组合物与诱导对其他因素(特别是其他病毒)的保护性应答的免疫原性组合物相组合。例如，本发明的疫苗组合物可以与其它基因免疫接种疫苗同时、分别或顺序施用，所述其它基因免疫接种疫苗例如针对：流感(Ulmer,J. B.et al.,Science 259:1745-1749(1993)；Raz,E.et al.,PNAS(USA)91:9519-9523(1994))、疟疾(Doolan,D.L.et al.,J.Exp.Med. 183:1739-1746(1996)；Sedegah,M.et al.,PNAS(USA)91:9866-9870 (1994))和肺结核(Tascon,R.C.et al.,Nat.Med.2:888-892(1996))。
施用
如本文使用的术语“施用”指向受试者给予一定剂量的本发明的药物组合物的方法。本文所述方法中使用的组合物可以通过选自例如肠胃外、皮肤、透皮、眼部、吸入、口腔、舌下、舌周(perilingual)、鼻、直肠、局部施用和口服施用的途径施用。肠胃外施用包括静脉内、腹膜内、皮下、动脉内、血管内和肌内施用。优选的施用方法可以根据各种因素(例如，所施用的组合物的组分和所治疗的病症的严重程度)而变化。
本发明的药物组合物(例如疫苗)的施用可以通过本领域技术人员已知的任何途径进行。施用可以通过例如肌内注射进行。本文所述方法中使用的组合物还可以通过选自例如肠胃外、皮肤、透皮、眼部、吸入、口腔、舌下、舌周、鼻、直肠、局部施用和口服施用的途径施用。肠胃外施用包括静脉内、腹膜内、皮下和肌内施用。优选的施用方法可以根据各种因素而变化，例如施用的组合物的组分和治疗的病况的严重程度。
此外，可以向受试者给予本发明的组合物的单次或多次施用。例如，对SARS-CoV2感染特别敏感的受试者可能需要多次治疗来建立和/或维持针对病毒的保护。由本文所述的药物组合物提供的诱导免疫的水平可以通过例如测量中和分泌抗体和血清抗体的量来监测。然后，可以根据需要调整或重复的剂量以维持针对病毒感染的期望保护水平。
组合
本文所述的rMVA疫苗可以在除了目前针对患有SARS-CoV2患者的护理标准之外施用，或者与医疗保健提供者认为对患者有益的任何其他化合物或疗法相组合或交替施用，如下文更详细描述的。组合和/或交替疗法可以是预防性的、治疗性的、辅助性的或姑息性的。
方法还包括向需要其的宿主(通常是人)施用有效量的本文所述的 rMVA，任选地与至少一种另外的生物活性剂(例如，另外的抗病毒剂) 相组合，进一步任选地与可药用载体添加剂和/或赋形剂相组合。
在一些实施方案中，本文所述的rMVA可以与另外的SARS-CoV2 疫苗接种相组合或交替施用。在一些实施方案中，另外的疫苗接种可以选自基于mRNA的疫苗、腺病毒疫苗、非复制型疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗、基于植物的佐剂疫苗、基于多表位肽的疫苗、灭活病毒和肽疫苗或其组合。适用于本文所述的rMVA病毒载体和方法的另外的疫苗包括，但不限于mRNA-1273(MODERNA COVID-19VACCINE； Moderna,Inc.)、AZD-1222(COVIDSHIELD；AstraZeneca和University of Oxford)、BNT162(COMIRNATY；Pfizer和BioNTech)、SputnikV (Gamaleya Research Institute,Acellena Contract Drug Research andDevelopment)、CoronaVac(Sinovac)、NVX-CoV 2372(NovoVax), SCB-2019(Sanofi和GSK),ZyCoV-D(Zydus Cadila)、BBIBP-CorV (Beijing Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group(Sinopharm))、EpiVacCorona(FederalBudgetary Research Institution State Research Center of Virology andBiotechnology)、Convidicea (CanSino Biologics)、Covid-19疫苗(Wuhan Institute ofBiological Products；China National Pharmaceutical Group(Sinopharm)、JNJ-78436735 (Johnson&Johnson)、ZF2001(Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical,Institute of Microbiology of the Chinese Academy of Sciences)、CVnCoV(CureVac；GSK)、INO-4800(Inovio Pharmaceuticals)、VIR-7831 (Medicago；GSK；Dynavax)、Covid-19腺病毒基疫苗(ImmunityBio； NantKwest)、UB-612(COVAXX),orCoVaxin(Bharat Biotech)或其组合。
本文所述的rMVA病毒载体可以在COVID患者的当前护理标准上施用，或者与医疗保健提供者认为对患者有益的任何其他化合物或疗法相组合或交替施用，组合和/或交替疗法可以是治疗性的、辅助性的或姑息性的。
在一些实施方案中，rMVA病毒载体与抗感染剂一起施用，例如 NS5B抑制剂，包括但不限于瑞德西韦，也可以施用蛋白酶抑制剂(例如，先前批准用于HIV的洛匹那韦或利托那韦)。在一些实施方案中，抗感染剂选自法匹拉韦、芬戈莫德(Gilenya)、甲泼尼龙、贝伐单抗 (Avastin)、Actemra(托珠单抗)、乌米那韦(umifenovir)、氯沙坦以及REGN3048和REGN3051的单克隆抗体组合、利巴韦林、AT-527 (Atea Pharmaceuticals，描述在美国专利号10,519,186中，通过引用并入本文)或AT-511(Atea Pharmaceuticals，描述在美国专利号10,519,186 中，通过引用并入本文)。这些药物或疫苗中的任一种可以与本文提供的rMVA相组合或交替使用，以治疗或预防对此敏感的SARS-CoV2病毒感染。
实施方案
本文提供至少以下实施方案：
1.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码来源于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2(SARS-CoV2)的刺突(S)蛋白、其肽片段或变体，膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，所述S蛋白、其肽片段或变体，M蛋白和E 蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
2.实施方案1的rMVA，其中所述异源核酸序列编码全长S蛋白。
3.实施方案1或2的rMVA，其中所述全长S蛋白包含SEQ ID NO： 1的氨基酸序列或与其至少95％同源的序列。
4.实施方案3的rMVA，其中所述全长S蛋白包含SEQ ID NO：1 的氨基酸序列。
5.实施方案1-2的rMVA，其中编码所述S蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：3，或与其至少95％同源的序列。
6.实施方案5的rMVA，其中编码所述全长S蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：3。
7.实施方案1或2的rMVA，其中所述全长S蛋白包含SEQ ID NO： 6的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
8.实施方案7的rMVA，其中所述全长S蛋白包含SEQ ID NO：6 的氨基酸序列。
9.实施方案1-8的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40 的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
10.实施方案9的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
11.实施方案1-10的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：42，或与其至少95％同源的序列。
12.实施方案11的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：42。
13.实施方案1-12的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO： 43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
14.实施方案13的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43 的氨基酸序列。
15.实施方案1-14的rMVA，其中编码所述M蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：45，或与其至少95％同源的序列。
16.实施方案15的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45。
17.实施方案1的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：1、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
18.实施方案17的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：1、40和43的氨基酸序列。
19.实施方案1的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO： 3、42和45，或与其至少95％同源的序列。
20.实施方案19的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：3、42和45。
21.实施方案1的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：6、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
22.实施方案21的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：6、40和43的氨基酸序列。
23.实施方案1-22的rMVA，其中所述S蛋白包含一个或多个选自 K986P、V987P、K417T、K417N、E484K或N501Y的氨基酸取代。
24.实施方案23的rMVA，其中所述S蛋白包含氨基酸取代K417T、 E484K和N501Y。
25.实施方案1-24的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和M蛋白的所述异源核酸序列可操作连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5 启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
26.实施方案25的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
27.实施方案26的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
28.实施方案26的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
29.实施方案27的rMVA，其中所述启动子为SEQ ID NO：154。
30.实施方案28的rMVA，其中所述启动子为SEQ ID NO：155。
31.实施方案1的rMVA，其中所述rMVA异源核酸序列包含选自 SEQ ID NO：46、47、156的核酸序列。
32.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码来源于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2(SARS-CoV2)的稳定化的刺突(S) 蛋白、其肽片段或变体，膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，所述稳定化的S蛋白、其肽片段或变体，M蛋白和E蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
33.实施方案32的rMVA，其中所述异源核酸序列编码全长稳定化的S蛋白。
34.实施方案32或33的rMVA，其中所述全长稳定化的S蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
35.实施方案34的rMVA，其中所述全长稳定化的S蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
36.实施方案32-33的rMVA，其中编码所述稳定化的S蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：10，或与其至少95％同源的序列。
37.实施方案36的rMVA，其中编码所述全长稳定化的S蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：10。
38.实施方案32或33的rMVA，其中所述全长稳定化的S蛋白包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
39.实施方案38的rMVA，其中所述全长稳定化的S蛋白包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
40.实施方案32-39的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO： 40的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
41.实施方案40的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40 的氨基酸序列。
42.实施方案32-41的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：42，或与其至少95％同源的序列。
43.实施方案42的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：42。
44.实施方案32-43的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO： 43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
45.实施方案4的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43 的氨基酸序列。
46.实施方案32-45的rMVA，其中编码所述M蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：45，或与其至少95％同源的序列。
47.实施方案46的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45。
48.实施方案32的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：8、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
49.实施方案48的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：8、40和43的氨基酸序列。
50.实施方案32的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO： 10、42和45，或与其至少95％同源的序列。
51.实施方案50的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO： 10、42和45。
52.实施方案32的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：11、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
53.实施方案52的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：11、40和43的氨基酸序列。
54.实施方案32的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO： 12、42和45，或与其至少95％同源的序列。
55.实施方案54的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO： 12、42和45。
56.实施方案32-55的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和M 蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
57.实施方案56的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
58.实施方案56的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
59.实施方案56的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
60.实施方案58的rMVA，其中所述启动子为SEQ ID NO：154。
61.实施方案59的rMVA，其中所述启动子为SEQ ID NO：155。
62.实施方案32的rMVA，其中所述rMVA异源核酸序列选自包含 SEQ ID NO：48、49、50、157、159、160的核酸序列，或与其至少95％同源的核酸序列。
63.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码来源于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2(SARS-CoV2)的刺突(S)蛋白受体结合结构域(RBD)的线性表位、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，所述线性表位、M蛋白和 E蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
64.实施方案63的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白 RBD结构域的氨基酸331-524。
65.实施方案63或64的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
66.实施方案65的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 21的氨基酸序列。
67.实施方案63-66的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQID NO：24，或与其至少95％同源的序列。
68.实施方案67的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：24。
69.实施方案63的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白 RBD结构域的氨基酸327-524。
70.实施方案63或69的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
71.实施方案70的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 20的氨基酸序列。
72.实施方案63或69-71的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：25，或与其至少95％同源的序列。
73.实施方案72的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：25。
74.实施方案63的rMVA，其中所述RBD结构域包含一个或多个选自K417N、K417T、E484K或N501Y的取代。
75.实施方案74的rMVA，其中所述RBD结构域包含取代K417T、 E484K和N501Y。
76.实施方案63的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 33的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
77.实施方案77的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 33的氨基酸序列。
78.实施方案63的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 32的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
79.实施方案78的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 32的氨基酸序列。
80.实施方案63-79的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO： 40的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
81.实施方案80的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40 的氨基酸序列。
82.实施方案63-81的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：42，或与其至少95％同源的序列。
83.实施方案82的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：82。
84.实施方案62-83的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO： 43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
85.实施方案84的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43 的氨基酸序列。
86.实施方案63-85的rMVA，其中编码所述M蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：45，或与其至少95％同源的序列。
87.实施方案86的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45。
88.实施方案63的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：20、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
89.实施方案88的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：20、40和43的氨基酸序列。
90.实施方案63的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO： 24、42和45，或与其至少95％同源的序列。
91.实施方案90的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：24、42和45。
92.实施方案63的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：21、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
93.实施方案92的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：21、40和43的氨基酸序列。
94.实施方案63的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO： 25、42和45，或与其至少95％同源的序列。
95.实施方案63的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO： 25、42和45。
96.实施方案63-95的rMVA，其中所述S RBD结构域进一步包含来源于S蛋白的信号肽和跨膜肽。
97.实施方案96的rMVA，其中所述S信号肽包含SEQ ID NO：55。
98.实施方案96或97的rMVA，其中所述S跨膜肽包含SEQ ID NO： 57。
99.实施方案63-98的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和M 蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、 pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
100.实施方案99的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
101.实施方案99的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
102.实施方案99的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
103.实施方案101的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：154。
104.实施方案102的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：155。
105.实施方案63的rMVA，其中所述rMVA异源核酸序列选自包含SEQ ID NO：51、52、53或54的序列，或与其至少95％同源的核酸序列。
106.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码来源于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2(SARS-CoV2)的刺突(S)蛋白受体结合结构域(RBD)的线性表位、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，所述线性S表位RBD结构域进一步包含来源于所述S蛋白的信号肽和跨膜肽，其中，在宿主细胞中表达时，所述线性S表位RBD结构域、M蛋白和E蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
107.实施方案106的rMVA，其中所述S信号肽包含SEQ ID NO： 55。
108.实施方案106或107的rMVA，其中所述S跨膜肽包含SEQ ID NO：57。
109.实施方案106-108的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述 S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
110.实施方案106-109的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
111.实施方案110的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 61的氨基酸序列。
112.实施方案106-110的rMVA，其中所述S蛋白RBD由包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列编码。
113.实施方案112的rMVA，其中所述S蛋白RBD由包含SEQ ID NO：65的核酸编码。
114.实施方案106-108的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述 S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
115.实施方案106-108和114的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
116.实施方案115的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 62的氨基酸序列。
117.实施方案114-117的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：66，或与其至少95％同源的序列。
118.实施方案117的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQID NO：66。
119.实施方案106的rMVA，其中所述RBD结构域包含一个或多个选自K417N、K417T、E484K或N501Y的取代。
120.实施方案119的rMVA，其中所述RBD结构域包含取代 K417T、E484K和N501Y。
121.实施方案106的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 67的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
122.实施方案106的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 67的氨基酸序列。
123.实施方案106的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 68的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
124.实施方案123的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO： 68的氨基酸序列。
125.实施方案106-124的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO： 40的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
126.实施方案125的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40 的氨基酸序列。
127.实施方案106-126的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQID NO：42，或与其至少95％同源的序列。
128.实施方案127的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：42。
129.实施方案106-128的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO： 43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
130.实施方案129的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO： 43的氨基酸序列。
131.实施方案106-130的rMVA，其中编码所述M蛋白的所述异源核酸序列包含SEQID NO：45，或与其至少95％同源的序列。
132.实施方案131的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：45。
133.实施方案106的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：61、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
134.实施方案133的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：61、40和43的氨基酸序列。
135.实施方案106的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：65、42和45，或与其至少95％同源的序列。
136.实施方案135的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：65、42和45。
137.实施方案106的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：62、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
138.实施方案137的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：62、40和43的氨基酸序列。
139.实施方案106的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：66、42和45，或与其至少95％同源的序列。
140.实施方案139的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：66、42和45。
141.实施方案106的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：67、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
142.实施方案141的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：67、40和43的氨基酸序列。
143.实施方案106的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：68、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
144.实施方案144的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：68、40和43的氨基酸序列。
145.实施方案106-144的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和 M蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
146.实施方案145的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
147.实施方案145的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
148.实施方案145的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
149.实施方案147的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：154。
150.实施方案148的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：155。
151.实施方案106的rMBA，其中所述rMVA异源核酸序列选自包含SEQ ID NO：69、70、71或72的序列，或与其至少95％同源的核酸序列。
152.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含一个或多个编码以下的异源核酸序列：i)来源于SARS-CoV2的RBD结构域的刺突(S)蛋白受体结合结构域(RBD)结构域RBD融合肽的线性表位，其中所述融合肽包含a)马尔堡病毒的包膜糖蛋白信号肽，b))RBD结构域的线性表位，和c)包膜糖蛋白跨膜结构域，和ii))马尔堡病毒基质蛋白，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，RBD融合肽和基质蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
153.实施方案152的rMVA，其中糖蛋白信号肽包含SEQ ID NO： 88的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
154.实施方案152或153的rMVA，其中所述糖蛋白跨膜结构域包含SEQ ID NO：90，或与其至少95％同源的序列。
155.实施方案152-154的rMVA，其中所述基质蛋白是VP40蛋白。
156.实施方案155的rMVA，其中所述VP40蛋白包含SEQ ID NO： 92的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
157.实施方案156的rMVA，其中所述VP40蛋白由包含SEQ ID NO：93的核酸，或与其至少95％同源的序列编码。
158.实施方案152-157的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述 S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
159.实施方案158的rMVA，其中所述RBD融合肽由包含SEQ ID NO：97的核酸编码。
160.实施方案152-157的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述 S蛋白RBD结构域的氨基酸331-524。
161.实施方案160的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
162.实施方案161的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列。
163.实施方案160-162的rMVA，其中编码所述RBD融合肽的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：98，或与其至少95％同源的序列。
164.实施方案163的rMVA，其中编码所述RBD融合肽的所述异源核酸序列包含SEQID NO：98。
165.实施方案152-157的rMVA，其中所述RBD结构域包含一个或多个选自K417N、K417T、E484K或N501Y的取代。
166.实施方案165的rMVA，其中所述RBD结构域包含取代 K417T、E484K和N501Y。
167.实施方案152-157的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
168.实施方案167的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列。
169.实施方案152-157的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
170.实施方案169的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列。
171.实施方案152-173的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和 M蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
172.实施方案171的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
173.实施方案171的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
174.实施方案171的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
175.实施方案173的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：154。
176.实施方案174的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：155。
177.实施方案152-176的rMBA，其中所述rMVA异源核酸序列选自包含SEQ ID NO：131、132、133、134、135、136、137或138的序列，或与其至少95％同源的核酸序列。
178.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含一个或多个编码以下的异源核酸序列：i)来源于SARS-CoV2的RBD结构域的刺突(S)蛋白受体结合结构域(RBD)融合肽的线性表位，其中所述融合肽包含a)所述S蛋白的信号肽和所述RBD结构域的线性表位，和c)包膜糖蛋白跨膜结构域，ii))SARS-CoV2的M蛋白，和iii) SARS-CoV2的E蛋白，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，所述RBD融合肽、 E和M蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
179.实施方案178的rMVA，其中信号肽包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
180.实施方案178-179的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述 S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
181.实施方案180的rMVA，其中所述RBD融合肽包含含有SEQ ID NO:55和20的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
182.实施方案178-179的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述 S蛋白RBD结构域的氨基酸331-524。
183.实施方案182的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和21的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
184.实施方案161的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和21的氨基酸序列。
185.实施方案178-179的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述 S蛋白RBD结构域的氨基酸327-598。
186.实施方案185的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和161的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
187.实施方案186的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和161的氨基酸序列。
188.实施方案178-179的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸331-598。
189.实施方案185的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和162的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
190.实施方案189的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和162的氨基酸序列。
191.实施方案178-190的rMVA，其中所述RBD结构域包含一个或多个选自K417N、K417T、E484K或N501Y的取代。
192.实施方案191的rMVA，其中所述RBD结构域包含取代 K417T、E484K和N501Y。
193.实施方案192的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
194.实施方案193的rMVA，其中所述RBD融合肽包含含有SEQ ID NO：55和32的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
195.实施方案191的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸331-524。
196.实施方案195的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和33的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
197.实施方案196的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和33的氨基酸序列。
198.实施方案191的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-598。
199.实施方案198的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和163的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
200.实施方案199的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和163的氨基酸序列。
201.实施方案191的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸331-598。
202.实施方案201的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和164的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
203.实施方案202的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和164的氨基酸序列。
204.实施方案179-203的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和 M蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
205.实施方案204的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
206.实施方案204的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
207.实施方案204的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
208.实施方案206的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：154。
209.实施方案207的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：155。
210.实施方案179-209的rMVA，其中所述rMVA异源核酸核酸序列包含SEQ ID NO：158，或与其至少95％同源的核酸序列。
211.一种在人类中减少或预防SARS-CoV2感染的方法，其包括施用有效量的实施方案1-181中任一项的rMVA病毒载体。
212.实施方案211的方法，其中所述rMVA作为预防性初次疫苗接种施用。
213.实施方案211的方法，其中所述rMVA作为加强疫苗接种施用。
214.实施方案213的方法，其中所述人先前已经施用SARS-CoV2 疫苗。
215.实施方案214的方法，其中所述先前疫苗选自基于mRNA的疫苗、腺病毒疫苗、非复制型疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗、基于植物的佐剂疫苗、基于多表位肽的疫苗、灭活病毒、肽疫苗。
216.实施方案214的方法，其中所述先前疫苗选自mRNA-1273 (MODERNA COVID-19VACCINE；Moderna,Inc.)、AZD-1222 (COVIDSHIELD；AstraZeneca and University ofOxford)、BNT162 (COMIRNATY；Pfizer和BioNTech)、Sputnik V(Gamaleya ResearchInstitute、Acellena Contract Drug Research and Development)、CoronaVac(Sinovac)、NVX-CoV 2372(NovoVax)、SCB-2019(Sanofi和GSK)、ZyCoV-D(Zydus Cadila)、BBIBP-CorV(Beijing Institute of Biological Products；China NationalPharmaceutical Group(Sinopharm))、 EpiVacCorona(Federal Budgetary ResearchInstitution State Research Center of Virology and Biotechnology)、Convidicea(CanSino Biologics)、 Covid-19疫苗(Wuhan Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group(Sinopharm)、JNJ-78436735(Johnson&Johnson)、ZF2001(Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical、Institute of Microbiology ofthe Chinese Academy of Sciences)、CVnCoV(CureVac； GSK)、INO-4800(InovioPharmaceuticals)、VIR-7831(Medicago；GSK； Dynavax)、Covid-19腺病毒基疫苗(ImmunityBio；NantKwest)、UB-612 (COVAXX)或CoVaxin(Bharat Biotech)。
217.实施方案213的方法，其中所述人先前已经感染SARS-CoV2。
218.实施方案211的方法，其中所述rMVA作为初次疫苗和加强疫苗两者施用。
219.实施方案213-216的方法，其中所述rMVA作为加强疫苗施用 2次或更多次。
219.实施方案216的方法，其中所述rMVA加强在所述初次疫苗接种之后4周或更多周施用。
通过以下非限制性实施例进一步描述要求保护的发明。鉴于上述公开内容和以下通过说明而非限制性方式包括的实验性例证，并且参考附图，本发明的其他方面和实施方案对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。
实施例
实施例1:S蛋白-E-M rMVA病毒载体GEO-CM01的构建
使用来自COVID-19肺炎病毒(GenBank登录号MT039888.1)的S、 M和E蛋白构建重组MVA疫苗候选物(Geo-Cmol)。将SEQ ID NO： 156***亲本减毒株修饰的安卡拉痘苗，MVA1974/NIH克隆1(ATCC #_PTA-5095)中，所述减毒株由国家过敏和传染病研究所(NIAID)，病毒疾病实验室(LVD)的Bernard Moss博士开发，使用pAD-1/S-ME 穿梭载体(图24)***在两个痘苗基因A5R和A6L之间。pAd-1/S-Me 穿梭载体来源于pAd-1/pUC57穿梭载体(图26)。将***的序列针对 MVA进行密码子优化。引入沉默突变以中断均聚物序列(>4G/C和 >4A/T)，这减少了可能导致移框的RNA聚合酶错误。针对痘苗特异性终止子编辑序列以去除可能导致过早终止的基序。使用修饰的H5早期/ 晚期启动子来驱动S和M***物的转录，而使用p11启动子来驱动E ***物的转录。通过同源重组和连续噬斑纯化在鸡胚成纤维细胞中制备rMVA。简而言之，将pAd-L/S-Me转染到用亲本MVA感染的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞中。从上清液和裂解物获得重组病毒，然后使用报告基因筛选进行多轮噬斑纯化。
为了检验SEQ ID NO:156***到亲本菌株中，进行表达S蛋白的核酸序列的PCR扩增。使用50ng来自用于产生GEO-CM01的穿梭质粒 pAd-1/S-Me(阳性对照)、GEO-CM01、MVA亲本(阴性对照)的DNA，在具有10mM引物：正向引物p55 (5'-AGATCGGAGATGACTGCGATG-3')(SEQ ID NO：151)和反向引物p54(5'-CGATGGTAGGTCAGATTGTCC-3')(SEQ ID NO：152) 的25ul反应中，扩增抗原***物。通过将10uL PCR反应物加载到用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上使反应显影。如图17和图18所示， GEO-CM01 rMVA的PCR产生适当的信号(5384个碱基对)。
为了检验SME VLP的表达，用GEO-CM01感染CEF细胞，48小时后通过免疫细胞化学进行分析。简而言之，将细胞用1：1的甲醇：丙酮固定，用一级小鼠抗SARS-CoV-2刺突抗体(GeneTex #_GTX632604)和二级抗小鼠HRP染色，并用AEC过氧化物酶底物(其介导噬斑的比色读数)显色。鉴定阳性染色斑块(参见图16)。
为了进一步确认在GEO-CM01中的抗原表达，进行GEO-CM01抗原表达的蛋白质印迹分析。以低感染m.o.i.(0.5)用GEO-CM01或MVA 亲本感染DF1细胞。在感染两天之后，收获细胞裂解物和上清液，并对等体积进行SDS-PAGE，转移到PVDF膜上，并用抗SARS-CoV-2刺突/RBD(兔)抗体(Sino Biologicals，#40592-T62)和二级抗兔IgG进行探测(图19)。在Odyssey红外扫描仪上观察膜。如图19所示，DF1 细胞裂解物和GEO-CM01感染的上清液显示刺突蛋白的表达。
获取已经用GEO-CM01感染的DF1细胞中的病毒样颗粒形成的电子显微镜(EM)图像(图20)。
实施例2-使用GEO-CM01的动物保护挑战
使用仓鼠模型确定GEO-CM01的初始临床前功效。严格按照国家研究委员会的实验动物护理和使用指南(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals ofthe National Research Council)中描述的建议进行研究。进行所有努力以使动物痛苦最小化，并且涉及潜在疼痛的所有程序均用合适的麻醉剂或镇痛剂进行。基于病毒学和免疫结果的统计分析，科学地调整使用的仓鼠的数量。
在免疫和血液收集之前，用5％异氟烷麻醉7周龄的金色叙利亚雌性仓鼠(Envigo)，并且在SARS-CoV-2攻击之前用***/甲苯噻嗪麻醉。以每只动物108TCID50的剂量，经由肌内途径(递送100μl，按每只后腿50μl)，以29天的间隔，用MVA-SME疫苗(GEO-CM01)对仓鼠(每组N＝10只)进行疫苗接种，而对照组接受盐水。在第一次免疫前4天和免疫后27天(第27天和第56天)，进行腔静脉血液收集。在第59天，将疫苗接种的动物和对照动物鼻内暴露于目标剂量为105 PFU的第5代分离株SARS-CoV-2USA-WAL/2020。每天监测动物的体重减轻和疾病体征。在攻击后3天，通过过量的可注射麻醉剂(*** /甲苯噻嗪)对每组中的五只动物实施安乐死，以用于病毒载量测定。在感染后14天，通过过量的***/甲苯噻嗪对剩余的动物实施安乐死。
对从动物收集的血清测试针对SARS-CoV-2的中和能力。简而言之，将血清样品热灭活(在56℃下，30分钟)。将10倍稀释的血清以2倍连续方式进一步稀释，并将60μL每种血清稀释液与60μl的 SARS-CoV-2-MNG(200PFU)混合。在37℃下，孵育血清/病毒混合物 1hr。然后，将100μl的血清/病毒混合物转移至黑色平底96孔板中的Vero E6细胞单层，并且在37℃下孵育2天。用Cytation Hybrid Multi-Mode读数器在488nm处(Biotek Instruments)测量病毒荧光。 GEO-CM01诱导中和的能力的结果显示在图21和图22中。结果显示 SARS-CoV-2噬斑形成减少50％时的稀释度(图21)。接受初次/加强剂量的GEO-CM01的动物中的一半产生中和SARS-CoV-2的抗体，表明 GEO-CM01在金仓鼠模型中引发针对SARS-CoV-2的中和抗体的能力。
通过ELISA对来自GEO-CM01免疫的动物的血清分析对以下具有特异性的抗体的水平：重组刺突-膜(S-M)融合物、刺突(S)和受体结合结构域(RBD)蛋白(图22)。在单剂量免疫(第27天)之后，观察到针对S-M、S和RBD的可检测水平的抗体。在初次-加强疫苗接种之后，观察到抗体与这些蛋白质结合的水平的进一步增加，表明 GEO-CM01在金仓鼠模型中诱导针对刺突蛋白(包括RBD)和膜蛋白的稳健抗体。
以单剂量或初次-加强方案对动物进行疫苗接种，用SARS-CoV-2 攻击，然后监测发病率。在攻击后每天记录体重和健康评分(图23)。单剂量免疫适度保护动物免于临床疾病和体重减轻，而初次-加强免疫提供了对临床疾病的完全保护，并在SARS-CoV-2攻击之后显著减少体重减轻，表明在金仓鼠模型中，疫苗接种GEO-CM01显著降低了发病率，在SARS-CoV-2攻击之后保护动物免于疾病。
实施例3-稳定化的S蛋白-E-M rMVA病毒载体GEO-CM02的构建
使用来自COVID-19肺炎病毒(GenBank登录号MT039888.1)的稳定化的S蛋白和M蛋白和E蛋白构建重组MVA疫苗候选物 (GEO-CMO2)。将SEQ ID NO：157***亲本减毒株修饰的安卡拉痘苗，MVA 1974/NIH克隆1(ATCC#PTA-5095)中，所述减毒株由国家过敏和传染病研究所(NIAID)病毒疾病实验室(LVD)的Bernard Moss 博士开发，使用pAd-1/SS-ME穿梭载体(图25)***在两个痘苗基因 A5R和A6L之间。pAd-1/SS-ME穿梭载体来源于pAD-1/pUC57穿梭载体(图26)。针对MVA对***的序列进行密码子优化。引入沉默突变以中断均聚物序列(>4G/C和>4A/T)，这减少了可能导致移框的RNA 聚合酶错误。针对痘苗特异性终止子编辑序列以去除可能导致过早终止的基序。使用修饰的H5早期/晚期启动子来驱动S和M***物的转录，而使用p11启动子来驱动E***物的转录。通过同源重组和在鸡胚成纤维细胞中连续噬斑纯化来制备rMVA。简而言之，将pAd-1/SS-Me转染到用亲本MVA感染的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中。从上清液和裂解物获得重组病毒，然后使用报告基因筛选进行多轮噬斑纯化。
为了检验SEQ ID NO:157***亲本菌株中，进行表达稳定化的S蛋白的核酸序列的PCR扩增。使用50ng来自用于产生GEO-CM02的穿梭质粒pAd-1/S-Me(阳性对照)、GEO-CM02、MVA亲本(阴性对照) 的DNA，在具有10mM引物：正向引物p55 (5'-AGATCGGAGATGACTGCGATG-3')(SEQ ID NO：151)和反向引物p54(5'-CGATGGTAGGTCAGATTGTCC-3')(SEQ ID NO：152)的25ul反应中，扩增抗原***物。通过将10uL PCR反应物加载到用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上使反应显影。如图18和31所示， GEO-CM02 rMVA的PCR产生适当的信号(5384个碱基对)。
为了进一步证实GEO-CM02中的抗原表达，进行GEO-CM02抗原表达的蛋白质印迹分析。以低m.o.i.(0.5)用GEO-CM02或MVA亲本感染DF1细胞。在感染两天之后，收获细胞裂解物和上清液，并对等体积进行SDS-PAGE，转移到PVDF膜上，并用抗SARS-CoV-2刺突/RBD(兔)抗体(Sino Biologicals，#40592-T62)和二级抗兔IgG进行探测 (图20)。
实施例4-使用GeO-CMO2的动物保护挑战
使用仓鼠模型测定GEO-CMO2的初始临床前功效。
在第0天和第29天(初次/加强组)或仅在第29天(初次免疫组)，使用108PFU的GEO-CMO2对仓鼠进行初始肌内注射免疫。将在第59 天对仓鼠鼻内施用SARS-CoV-2。一组仓鼠将在攻击后第3天(第62天) 处死，并且一组仓鼠将在攻击后第14天(第73天)处死。
将通过ELISA分析SARS-CoV2抗体，并测定抗体的中和能力。将收获肺用于组织病理学和病毒载量的检查。
实施例5-SP-RBD-E/M rMVA病毒载体的构建
使用来自CoVTD-19肺炎病毒(GenBank登录号MT039888.1)的S 蛋白的RBD序列(aa327-527)、M和E蛋白构建重组MVA疫苗候选物(GEO-CM03)。RBD序列在其N-末端处侧接有S蛋白的信号肽，并且在其羧基末端处侧接有S蛋白的跨膜区，从而允许在表达时形成在 VLP表面上展示RBD的VLP。将SEQ ID NO：158***到亲本减毒株修饰的安卡拉痘苗，MVA RBD974/NIH克隆1(ATCC#PTA-5095)中，所述减毒株由国家过敏和传染病研究所(NIAID)病毒疾病实验室(LVD) 的Bernard Moss博士开发，使用pAD-1/SP-RBD-TM/E/M穿梭载体***在两个痘苗基因A5R和A6L之间。pAd-1/SP-RBD/E/M穿梭载体来源于 pAD-RBD/pUC57穿梭载体(图26)。针对MVA对***的序列进行密码子优化。引入沉默突变以中断均聚物序列(>4G/C和>4A/T)，这减少了可能导致移框的RNA聚合酶错误。针对痘苗特异性终止子编辑序列以去除可能导致过早终止的基序。使用修饰的H5早期/晚期启动子来驱动SP-RBD融合物和M***物的转录，而使用p11启动子来驱动E ***物的转录。通过同源重组和在鸡胚成纤维细胞中连续噬斑纯化来制备rMVA。简而言之，将pAd-1/SP-RBD-E/M转染到用亲本MVA感染的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中。从上清液和裂解物获得重组病毒，然后使用报告基因筛选进行多轮噬斑纯化。
为了检验SEQ ID NO:158***亲本菌株中，进行表达RBD***物的核酸序列的PCR扩增。使用50ng来自用于产生GEO-CM03的穿梭质粒(阳性对照)、GEO-CM03、MVA亲本(阴性对照)的DNA，在具有10mM引物：正向引物p55(5'-AGATCGGAGATGACTGCGATG-3') (SEQ ID NO：151)和反向引物p54 (5'-CGATGGTAGGTCAGATTGTCC-3')(SEQ ID NO:152)的25ul 反应中，扩增抗原***物。通过将10uL PCR反应物加载到用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上使反应显影。如图18和31所示，GEO-CM03 rMVA的PCR产生适当的信号(2422个碱基对)。
为了进一步证实GEO-CM03中的抗原表达，进行GEO-CM03抗原表达的蛋白质印迹分析。以低m.o.i.(0.5)用GEO-CM03或MVA亲本感染DF1细胞。在感染两天之后，收获细胞裂解物和上清液，并对等体积进行SDS-PAGE，转移到PVDF膜上，并用抗SARS-CoV-2刺突/RBD(兔)抗体(Sino Biologicals，#40592-T62)和二级抗兔IgG进行探测 (图20)。
实施例6-使用GEO-CM03的动物保护挑战
使用仓鼠模型测定GEO-CM03的初始临床前功效。
在第0天和第29天(初次/加强组)或仅在第29天(初次免疫组)，使用108PFU的GEO-CMO2对仓鼠进行初始肌内注射免疫。将在第59 天对仓鼠鼻内施用SARS-CoV-2。一组仓鼠将在攻击后第3天(第62天) 处死，并且一组仓鼠将在攻击后第14天(第73天)处死。
将通过ELISA分析SARS-CoV2抗体，并测定抗体的中和能力。将收获肺用于组织病理学和病毒载量的检查。
实施例7-MARVGP-RBD和MARV VP40rMVA病毒载体的构建
使用来自COVID-19肺炎病毒(登录号MT039888.1)和马尔堡病毒(MARV)分离株MARV/H.sapiens-tc/COD/2000/24DRC，登录号 JX458834)的序列构建重组MVA疫苗候选物(GEO-CM03b)。将SEQ ID NO：134***亲本减毒株修饰的安卡拉痘苗，MVA 1974/NIH克隆1(ATCC#PTA-5095)中，所述减毒株由国家过敏和传染病研究所 (NIAID)病毒疾病实验室(LVD)的Bernard Moss博士开发。
将COVID-19刺突基因受体结合结构域融合在氨基端为马尔堡病毒糖蛋白的信号序列与羧基端为马尔堡病毒糖蛋白的跨膜结构域和胞质尾区之间(SignalMARV-RBDCOVTD-TMMARV)。将 SignalMARV-RBDCOVID-TmMARV亚克隆到pLW76穿梭载体中，用于***在两个必需痘苗基因A5R和A6L之间。将MARV基质蛋白(SEQ ID NO：92)VP40亚克隆到pAD2/67穿梭载体中，用于***在两个必需痘苗基因A50R和B1R之间。针对MVA对***的序列进行密码子优化(SEQ ID NO:94)。引入沉默突变以中断均聚物序列(>4G/C和>4A/T)，这减少了可能导致移框的RNA聚合酶错误。针对痘苗特异性终止子编辑序列以去除可能导致过早终止的基序。使用修饰的H5早期/晚期启动子来驱动S和M***物的转录。通过同源重组和连续噬斑纯化制备重组体。简而言之，将重组质粒转染到已经用亲本MVA感染的原代鸡胚成纤维细胞中。从上清液和裂解物获得重组病毒，然后使用报告基因筛选进行多轮噬斑纯化。
为了检验SEQ ID NO：134***亲本菌株中，进行表达RBD***物的核酸序列的PCR扩增。使用50ng来自用于产生GEO-CM03b的穿梭质粒MTRDB(阳性对照)、GEO-CM03b、MVA亲本(阴性对照) 的DNA，在具有10mM引物：正向引物p55 (5'-AGATCGGAGATGACTGCGATG-3')(SEQID NO：151)和反向引物p54(5'-CGATGGTAGGTCAGATTGTCC-3')(SEQ ID NO：152) 的25ul反应中，扩增抗原***物。通过将10uL PCR反应物加载到用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上使反应显影。如图28所示，GEO-CM03b rMVA的PCR产生合适的信号(p54/p55-1288个碱基对，p54/p53-1558 个碱基对-参见中间的两个箭头)。
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Claims (220)

1.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码来源于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2(SARS-CoV2)的刺突(S)蛋白、其肽片段或变体，膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，所述S蛋白、其肽片段或变体，M蛋白和E蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
2.权利要求1的rMVA，其中所述异源核酸序列编码全长S蛋白。
3.权利要求1或2的rMVA，其中所述全长S蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
4.权利要求3的rMVA，其中所述全长S蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
5.权利要求1-2的rMVA，其中编码所述S蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：3，或与其至少95％同源的序列。
6.权利要求5的rMVA，其中编码所述全长S蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：3。
7.权利要求1或2的rMVA，其中所述全长S蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
8.权利要求7的rMVA，其中所述全长S蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
9.权利要求1-8的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
10.权利要求9的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
11.权利要求1-10的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：42，或与其至少95％同源的序列。
12.权利要求11的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：42。
13.权利要求1-12的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
14.权利要求13的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列。
15.权利要求1-14的rMVA，其中编码所述M蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45，或与其至少95％同源的序列。
16.权利要求15的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45。
17.权利要求1的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：1、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
18.权利要求17的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：1、40和43的氨基酸序列。
19.权利要求1的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：3、42和45，或与其至少95％同源的序列。
20.权利要求19的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：3、42和45。
21.权利要求1的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：6、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
22.权利要求21的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：6、40和43的氨基酸序列。
23.权利要求1-22的rMVA，其中所述S蛋白包含一个或多个选自K986P、V987P、K417T、K417N、E484K或N501Y的氨基酸取代。
24.权利要求23的rMVA，其中所述S蛋白包含氨基酸取代K417T、E484K和N501Y。
25.权利要求1-24的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和M蛋白的所述异源核酸序列可操作连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
26.权利要求25的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
27.权利要求26的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
28.权利要求26的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
29.权利要求27的rMVA，其中所述启动子为SEQ ID NO：154。
30.权利要求28的rMVA，其中所述启动子为SEQ ID NO：155。
31.权利要求1的rMVA，其中所述rMVA异源核酸序列包含选自SEQ ID NO：46、47、156的核酸序列。
32.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码来源于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2(SARS-CoV2)的稳定化的刺突(S)蛋白、其肽片段或变体，膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，所述稳定化的S蛋白、其肽片段或变体，M蛋白和E蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
33.权利要求32的rMVA，其中所述异源核酸序列编码全长稳定化的S蛋白。
34.权利要求32或33的rMVA，其中所述全长稳定化的S蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
35.权利要求34的rMVA，其中所述全长稳定化的S蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
36.权利要求32-33的rMVA，其中编码所述稳定化的S蛋白的所述异源核酸序列包含SEQID NO：10，或与其至少95％同源的序列。
37.权利要求36的rMVA，其中编码所述全长稳定化的S蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：10。
38.权利要求32或33的rMVA，其中所述全长稳定化的S蛋白包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
39.权利要求38的rMVA，其中所述全长稳定化的S蛋白包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
40.权利要求32-39的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
41.权利要求40的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
42.权利要求32-41的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：42，或与其至少95％同源的序列。
43.权利要求42的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：42。
44.权利要求32-43的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
45.权利要求44的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列。
46.权利要求32-45的rMVA，其中编码所述M蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45，或与其至少95％同源的序列。
47.权利要求46的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45。
48.权利要求32的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：8、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
49.权利要求48的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：8、40和43的氨基酸序列。
50.权利要求32的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：10、42和45，或与其至少95％同源的序列。
51.权利要求50的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：10、42和45。
52.权利要求32的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：11、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
53.权利要求52的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：11、40和43的氨基酸序列。
54.权利要求32的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：12、42和45，或与其至少95％同源的序列。
55.权利要求54的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：12、42和45。
56.权利要求32-55的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和M蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
57.权利要求56的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
58.权利要求56的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
59.权利要求56的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
60.权利要求58的rMVA，其中所述启动子为SEQ ID NO:154。
61.权利要求59的rMVA，其中所述启动子为SEQ ID NO:155。
62.权利要求32的rMVA，其中所述rMVA异源核酸序列选自包含SEQ ID NO：48、49、50、157、159、160的核酸序列，或与其至少95％同源的核酸序列。
63.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码来源于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2(SARS-CoV2)的刺突(S)蛋白受体结合结构域(RBD)的线性表位、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，所述线性表位、M蛋白和E蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
64.权利要求63的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸331-524。
65.权利要求63或64的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
66.权利要求65的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
67.权利要求63-66的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：24，或与其至少95％同源的序列。
68.权利要求67的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：24。
69.权利要求63的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
70.权利要求63或69的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
71.权利要求70的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
72.权利要求63或69-71的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQID NO：25，或与其至少95％同源的序列。
73.权利要求72的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：25。
74.权利要求63的rMVA，其中所述RBD结构域包含一个或多个选自K417N、K417T、E484K或N501Y的取代。
75.权利要求74的rMVA，其中所述RBD结构域包含取代K417T、E484K和N501Y。
76.权利要求63的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
77.权利要求77的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
78.权利要求63的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
79.权利要求78的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
80.权利要求63-79的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
81.权利要求80的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
82.权利要求63-81的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：42，或与其至少95％同源的序列。
83.权利要求82的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：42。
84.权利要求62-83的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
85.权利要求84的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列。
86.权利要求63-85的rMVA，其中编码所述M蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45，或与其至少95％同源的序列。
87.权利要求86的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45。
88.权利要求63的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：20、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
89.权利要求88的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：20、40和43的氨基酸序列。
90.权利要求63的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：24、42和45，或与其至少95％同源的序列。
91.权利要求90的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：24、42和45。
92.权利要求63的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：21、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
93.权利要求92的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：21、40和43的氨基酸序列。
94.权利要求63的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：25、42和45，或与其至少95％同源的序列。
95.权利要求63的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：25、42和45。
96.权利要求63-95的rMVA，其中所述S RBD结构域进一步包含来源于所述S蛋白的信号肽和跨膜肽。
97.权利要求96的rMVA，其中所述S信号肽包含SEQ ID NO：55。
98.权利要求96或97的rMVA，其中所述S跨膜肽包含SEQ ID NO：57。
99.权利要求63-98的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和M蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
100.权利要求99的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
101.权利要求99的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
102.权利要求99的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
103.权利要求101的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：154。
104.权利要求102的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：155。
105.权利要求63的rMVA，其中所述rMVA异源核酸序列选自包含SEQ ID NO：51、52、53或54的序列，或与其至少95％同源的核酸序列。
106.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含编码来源于严重急性呼吸综合征-冠状病毒2(SARS-CoV2)的刺突(S)蛋白受体结合结构域(RBD)的线性表位、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，所述线性S表位RBD结构域进一步包含来源于所述S蛋白的信号肽和跨膜肽，其中，在宿主细胞中表达时，所述线性S表位RBD结构域、M蛋白和E蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
107.权利要求106的rMVA，其中所述S信号肽包含SEQ ID NO：55。
108.权利要求106或107的rMVA，其中所述S跨膜肽包含SEQ ID NO：57。
109.权利要求106-108的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
110.权利要求106-109的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
111.权利要求110的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列。
112.权利要求106-110的rMVA，其中所述S蛋白RBD由包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列编码。
113.权利要求112的rMVA，其中所述S蛋白RBD由包含SEQ ID NO：65的核酸编码。
114.权利要求106-108的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
115.权利要求106-108和114的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
116.权利要求115的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列。
117.权利要求114-117的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQID NO：66，或与其至少95％同源的序列。
118.权利要求117的rMVA，其中编码所述S蛋白RBD的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：66。
119.权利要求106的rMVA，其中所述RBD结构域包含一个或多个选自K417N、K417T、E484K或N501Y的取代。
120.权利要求119的rMVA，其中所述RBD结构域包含取代K417T、E484K和N501Y。
121.权利要求106的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
122.权利要求106的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
123.权利要求106的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
124.权利要求123的rMVA，其中所述S蛋白RBD包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。
125.权利要求106-124的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
126.权利要求125的rMVA，其中所述E蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
127.权利要求106-126的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：42，或与其至少95％同源的序列。
128.权利要求127的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：42。
129.权利要求106-128的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
130.权利要求129的rMVA，其中所述M蛋白包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列。
131.权利要求106-130的rMVA，其中编码所述M蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：45，或与其至少95％同源的序列。
132.权利要求131的rMVA，其中编码所述E蛋白的所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：45。
133.权利要求106的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：61、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
134.权利要求133的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：61、40和43的氨基酸序列。
135.权利要求106的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：65、42和45，或与其至少95％同源的序列。
136.权利要求135的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：65、42和45。
137.权利要求106的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：62、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
138.权利要求137的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：62、40和43的氨基酸序列。
139.权利要求106的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：66、42和45，或与其至少95％同源的序列。
140.权利要求139的rMVA，其中所述异源核酸序列包含SEQ ID NO：66、42和45。
141.权利要求106的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：67、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
142.权利要求141的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：67、40和43的氨基酸序列。
143.权利要求106的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：68、40和43的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
144.权利要求144的rMVA，其中所述异源核酸序列编码包含SEQ ID NO：68、40和43的氨基酸序列。
145.权利要求106-144的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和M蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
146.权利要求145的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
147.权利要求145的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
148.权利要求145的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
149.权利要求147的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：154。
150.权利要求148的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：155。
151.权利要求106的rMBA，其中所述rMVA异源核酸序列选自包含SEQ ID NO：69、70、71或72的序列，或与其至少95％同源的核酸序列。
152.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含一个或多个编码以下的异源核酸序列：i)来源于SARS-CoV2的RBD结构域的刺突(S)蛋白受体结合结构域(RBD)融合肽的线性表位，其中所述融合肽包含a)马尔堡病毒的包膜糖蛋白信号肽，b))RBD结构域的线性表位，和c)包膜糖蛋白跨膜结构域，以及ii)马尔堡病毒基质蛋白，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，所述RBD融合肽和基质蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
153.权利要求152的rMVA，其中糖蛋白信号肽包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
154.权利要求152或153的rMVA，其中所述糖蛋白跨膜结构域包含SEQ ID NO：90，或与其至少95％同源的序列。
155.权利要求152-154的rMVA，其中所述基质蛋白是VP40蛋白。
156.权利要求155的rMVA，其中所述VP40蛋白包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
157.权利要求156的rMVA，其中所述VP40蛋白由包含SEQ ID NO：93的核酸，或与其至少95％同源的序列编码。
158.权利要求152-157的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
159.权利要求158的rMVA，其中所述RBD融合肽由包含SEQ ID NO：97的核酸编码。
160.权利要求152-157的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸331-524。
161.权利要求160的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
162.权利要求161的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列。
163.权利要求160-162的rMVA，其中编码所述RBD融合肽的所述异源核酸序列包含SEQID NO：98，或与其至少95％同源的序列。
164.权利要求163的rMVA，其中编码所述RBD融合肽的所述异源核酸序列包含SEQ IDNO：98。
165.权利要求152-157的rMVA，其中所述RBD结构域包含一个或多个选自K417N、K417T、E484K或N501Y的取代。
166.权利要求165的rMVA，其中所述RBD结构域包含取代K417T、E484K和N501Y。
167.权利要求152-157的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
168.权利要求167的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列。
169.权利要求152-157的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
170.权利要求169的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列。
171.权利要求152-173的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和M蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
172.权利要求171的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
173.权利要求171的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
174.权利要求171的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
175.权利要求173的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：154。
176.权利要求174的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：155。
177.权利要求152-176的rMBA，其中所述rMVA异源核酸序列选自包含SEQ ID NO：131、132、133、134、135、136、137或138的序列，或与其至少95％同源的核酸序列。
178.一种重组修饰的安卡拉痘苗(rMVA)病毒载体，其包含一个或多个编码以下的异源核酸序列：i)来源于SARS-CoV2的RBD结构域的刺突(S)蛋白受体结合结构域(RBD)融合肽的线性表位，其中所述融合肽包含a)所述S蛋白的信号肽和所述RBD结构域的线性表位，和c)包膜糖蛋白跨膜结构域，ii)SARS-CoV2的M蛋白，和iii)SARS-CoV2的E蛋白，所述异源核酸序列可操作地连接至与痘病毒表达***相容的启动子，其中，在宿主细胞中表达时，所述RBD融合肽、E和M蛋白能够一起形成病毒样颗粒。
179.权利要求178的rMVA，其中信号肽包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
180.权利要求178-179的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
181.权利要求180的rMVA，其中所述RBD融合肽包含含有SEQ ID NO:55和20的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
182.权利要求178-179的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸331-524。
183.权利要求182的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和21的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
184.权利要求161的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和21的氨基酸序列。
185.权利要求178-179的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-598。
186.权利要求185的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和161的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
187.权利要求186的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和161的氨基酸序列。
188.权利要求178-179的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸331-598。
189.权利要求185的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和162的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
190.权利要求189的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和162的氨基酸序列。
191.权利要求178-190的rMVA，其中所述RBD结构域包含一个或多个选自K417N、K417T、E484K或N501Y的取代。
192.权利要求191的rMVA，其中所述RBD结构域包含取代K417T、E484K和N501Y。
193.权利要求192的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-524。
194.权利要求193的rMVA，其中所述RBD融合肽包含含有SEQ ID NO：55和32的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
195.权利要求191的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸331-524。
196.权利要求195的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和33的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
197.权利要求196的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和33的氨基酸序列。
198.权利要求191的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸327-598。
199.权利要求198的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和163的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
200.权利要求199的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和163的氨基酸序列。
201.权利要求191的rMVA，其中所述异源核酸序列编码所述S蛋白RBD结构域的氨基酸331-598。
202.权利要求201的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和164的氨基酸序列，或与其至少95％同源的序列。
203.权利要求202的rMVA，其中所述RBD融合肽包含SEQ ID NO：55和164的氨基酸序列。
204.权利要求179-203的rMVA，其中编码所述S蛋白、E蛋白和M蛋白的所述异源核酸序列可操作地连接至一个或多个选自p11启动子、pmH5启动子、pH5启动子、p7.5启动子、pSyn和pHyb的与痘病毒表达***相容的启动子。
205.权利要求204的rMVA，其中所述启动子为p7.5启动子。
206.权利要求204的rMVA，其中所述启动子为pmH5启动子。
207.权利要求204的rMVA，其中所述启动子为p11启动子。
208.权利要求206的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：154。
209.权利要求207的rMVA，其中所述启动子包含SEQ ID NO：155。
210.权利要求179-209的rMVA，其中所述rMVA异源核酸核酸序列包含SEQ ID NO：158，或与其至少95％同源的核酸序列。
211.一种在人类中减少或预防SARS-CoV2感染的方法，其包括施用有效量的权利要求1-181中任一项的rMVA病毒载体。
212.权利要求211的方法，其中所述rMVA作为预防性初次疫苗接种施用。
213.权利要求211的方法，其中所述rMVA作为加强疫苗接种施用。
214.权利要求213的方法，其中所述人先前已经施用SARS-CoV2疫苗。
215.权利要求214的方法，其中所述先前疫苗选自基于mRNA的疫苗、腺病毒疫苗、非复制型疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗、基于植物的佐剂疫苗、基于多表位肽的疫苗、灭活病毒、肽疫苗。
216.权利要求214的方法，其中所述先前疫苗选自mRNA-1273(MODERNA COVID-19VACCINE；Moderna,Inc.)、AZD-1222(COVIDSHIELD；AstraZeneca和University ofOxford)、BNT162(COMIRNATY；Pfizer和BioNTech)、Sputnik V(Gamaleya ResearchInstitute、Acellena Contract Drug Research and Development)、CoronaVac(Sinovac)、NVX-CoV 2372(NovoVax)、SCB-2019(Sanofi和GSK)、ZyCoV-D(Zydus Cadila)、BBIBP-CorV(Beijing Institute of Biological Products；China NationalPharmaceutical Group(Sinopharm))、EpiVacCorona(Federal Budgetary ResearchInstitution State Research Center of Virology and Biotechnology)、Convidicea(CanSino Biologics)、Covid-19疫苗(Wuhan Institute of Biological Products；ChinaNational Pharmaceutical Group(Sinopharm)、JNJ-78436735(Johnson&Johnson)、ZF2001(Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical、Institute of Microbiology of theChinese Academy of Sciences)、CVnCoV(CureVac；GSK)、INO-4800(InovioPharmaceuticals)、VIR-7831(Medicago；GSK；Dynavax)、Covid-19腺病毒基疫苗(ImmunityBio；NantKwest)、UB-612(COVAXX)或CoVaxin(Bharat Biotech)。
217.权利要求213的方法，其中所述人先前已经感染SARS-CoV2。
218.权利要求211的方法，其中所述rMVA作为初次疫苗和加强疫苗两者施用。
219.权利要求213-216的方法，其中所述rMVA作为加强疫苗施用2次或更多次。
220.权利要求216的方法，其中所述rMVA加强在所述初次疫苗接种之后4周或更多周施用。
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