JP2023504853A - 炎症応答性を有する抗炎症性ハイドロゲル - Google Patents
炎症応答性を有する抗炎症性ハイドロゲル Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023504853A JP2023504853A JP2022534151A JP2022534151A JP2023504853A JP 2023504853 A JP2023504853 A JP 2023504853A JP 2022534151 A JP2022534151 A JP 2022534151A JP 2022534151 A JP2022534151 A JP 2022534151A JP 2023504853 A JP2023504853 A JP 2023504853A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protease
- drug
- cleavable
- peptide
- peg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 208
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 title description 5
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 title description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 165
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 165
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 164
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims abstract description 50
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 225
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 219
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 125
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 113
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 76
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 76
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 claims description 66
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 66
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 claims description 64
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 59
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 58
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 55
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 55
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 44
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 29
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 29
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 28
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 28
- -1 poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 claims description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 22
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 20
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 12
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 11
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 11
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004459 Small interfering RNA Chemical class 0.000 claims description 5
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 5
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002502 liposome Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 claims description 4
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 4
- 239000002924 silencing RNA Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 4
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 claims description 2
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000625 Cathepsin K Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004171 Cathepsin K Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000613 Cathepsin S Proteins 0.000 claims description 2
- 102100035654 Cathepsin S Human genes 0.000 claims description 2
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 claims description 2
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims description 2
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 claims 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 claims 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 claims 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 claims 1
- 102100027998 Macrophage metalloelastase Human genes 0.000 claims 1
- 101710187853 Macrophage metalloelastase Proteins 0.000 claims 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 claims 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 claims 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 abstract description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 59
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 56
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 25
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 25
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 23
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 description 22
- 102000052502 human ELANE Human genes 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 19
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 18
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 11
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 11
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 9
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 8
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 7
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 7
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 6
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 6
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 6
- 230000016446 peptide cross-linking Effects 0.000 description 6
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 6
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 6
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- IQUCNXSZNHPPML-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[(4-chlorophenyl)-phenylmethyl]acetamide Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1C(NC(=O)CCl)C1=CC=CC=C1 IQUCNXSZNHPPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 5
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 5
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical group SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 4
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 101000915480 Streptococcus pneumoniae serotype 4 (strain ATCC BAA-334 / TIGR4) Zinc metalloprotease ZmpC Proteins 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical group C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 3
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 150000007944 thiolates Chemical class 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001142 back Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 2
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 2
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000010952 in-situ formation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-carboxyphenyl)phenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(O)=O)C=C1 FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 6alpha-methylprednisolone Chemical compound C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)CO)CC[C@H]21 VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 0.000 description 1
- 101710197241 Accessory gland-specific peptide 70A Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010056340 Diabetic ulcer Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 201000004176 Gelatinous drop-like corneal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010031264 Osteonecrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010039793 Seborrhoeic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000001790 Welch's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000010398 acute inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N celecoxib Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=CC(C(F)(F)F)=NN1C1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000590 celecoxib Drugs 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010485 coping Effects 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 229920005570 flexible polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002011 fludrocortisone Drugs 0.000 description 1
- AAXVEMMRQDVLJB-BULBTXNYSA-N fludrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AAXVEMMRQDVLJB-BULBTXNYSA-N 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N ketoprofen Chemical compound OC(=O)C(C)C1=CC=CC(C(=O)C=2C=CC=CC=2)=C1 DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000991 ketoprofen Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 239000008204 material by function Substances 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229960002702 piroxicam Drugs 0.000 description 1
- QYSPLQLAKJAUJT-UHFFFAOYSA-N piroxicam Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 QYSPLQLAKJAUJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 1
- 239000005076 polymer ester Substances 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000010282 redox signaling Effects 0.000 description 1
- 108010004093 retinal S antigen peptide M Proteins 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012776 robust process Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 208000008742 seborrheic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000037075 skin appearance Effects 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000002294 steroidal antiinflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001174 sulfone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 238000001521 two-tailed test Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6903—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being semi-solid, e.g. an ointment, a gel, a hydrogel or a solidifying gel
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
- A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
- A61K9/7023—Transdermal patches and similar drug-containing composite devices, e.g. cataplasms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
- A61L26/0009—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form containing macromolecular materials
- A61L26/0023—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
- A61L26/0061—Use of materials characterised by their function or physical properties
- A61L26/0066—Medicaments; Biocides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本発明は、全体として、プロテアーゼ応答性薬物送達ハイドロゲル、その使用、およびその製造に関連する方法の分野に関する。より詳細には、炎症関連プロテアーゼとの反応により抗炎症剤を放出するハイドロゲルに関する。【選択図】図19
Description
本発明は、全体として、プロテアーゼ応答性薬物送達ハイドロゲル、その使用、およびその製造に関連する方法の分野に関する。より詳細には、炎症関連プロテアーゼとの反応により抗炎症剤を放出するハイドロゲルに関する。
炎症は、有害な刺激を取り除いて損傷した組織を損傷前の状態に戻すために、宿主の免疫系によって行われる一連の生物学的反応である[Serhan, C. N. et al. Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, (2010)]。急性の炎症反応は、有害な刺激を排除し、組織損傷後に細胞の恒常性を回復させるために不可欠である[Serhan, C. N. et al. Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, (2010)]。一方、白血球の活性状態が必要以上に持続すると、過剰な炎症に伴い、慢性的な組織障害が生じる[Serhan, C. N. et al. Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, (2010)]。このような慢性的な状態は、関節リウマチ、慢性糖尿病性潰瘍、炎症性腸疾患(IBD)、慢性閉塞性肺疾患などの多くの病態でよく見られる[Serhan, C. N. et al. Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, (2010)]。
慢性疾患における過剰な炎症を抑制する治療法として、抗炎症剤の全身投与が臨床的に認容されている。関節リウマチやIBDの患者には、臨床症状に基づいて非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)やステロイド性免疫抑制剤などの低分子薬剤が経験的に処方されている。しかし、これらの薬剤の全身投与は、薬物の放出制御が行われないために過剰投薬となることがあり、それに伴ってよく知られた副作用が生じることもある。例えば、NSAIDを全身投与した場合、心筋梗塞、脳血管障害、胃潰瘍などのリスクが高くなる。また、副腎皮質ステロイドは、長期にわたって処方されると、骨壊死、緑内障、日和見感染症などの重篤な薬物誘発性合併症を起こす可能性がある。
薬物放出動態の時空間的制御を改善し、全身毒性を最小限に抑えることを目的として、これまでに抗炎症治療薬を投与するための薬物送達プラットフォームがいくつか設計されている[Hamalainen, M. et al. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 112(5) 296-301 (2013)]。例えば、グルココルチコイドを小胞システムに封入することで、薬物の半減期を延長し、治療薬の緩やかな放出を実現したものが報告されている[Maestrelli, F. et al. Journal of Drug Delivery Science and Technology 32 192-205 (2016)]。また、低分子のNSAIDをナノサイズのポリマーフィルムに共有結合させることで、治療ペイロードを大幅に増やし、薬剤-ポリマーエステル結合の加水分解により長期にわたって徐放させる方法も報告されている[Hsu, B. B. Proceedings of the National Academy of Sciences 111(33) 12175 (2014)]。しかし、これらのシステムでは、抗炎症治療薬の投与を必要とする炎症特性を有する疾患組織の特異的な病態が考慮されていない。薬物の放出は、主にポリマー組成や薬物担持量など、送達プラットフォームの物理化学的特性により決定づけられているため、これらのシステムの薬物放出プロファイルは生物学的要件に合ったものではない。
疾患組織における生体微小環境の炎症特性を利用することで、免疫学的シグナルにより作動するスマートな薬物送達システムを設計することができると考えられる。特に、複数の研究結果により、慢性炎症でプロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼとマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の発現が上昇することが示されており、これらが炎症カスケードを調節するための治療薬投与の生化学的シグナルとなる可能性が示唆されている[Pham, C. T. N. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 40(6) 1317-1333 (2008)]。プロテアーゼは、pH、温度、酸化還元などといった他の刺激と比べると、より特異的な生物学的シグナルであるが、これは、プロテアーゼの調節異常と病態とが密接に関連していることが主な理由である。さらに、他の刺激は、環境条件による影響を受ける可能性がある。例えば、体温は病気の状態でなくても、湿度の高い気象条件では急激に上昇することがある。このように、プロテアーゼは生物学的シグナルとして優位性があるにもかかわらず、生物学的要因で作動する炎症調節用薬物送達システムの免疫学的シグナルとしてのプロテアーゼの可能性はほとんど検討されていないのが実情である。最近、Joshiらは、両親媒性低分子化合物であるトリグリセロールモノステアレート(TG-18)の自己組織性を利用して、ハイドロゲルプラットフォームにコルチコステロイドを物理的に内包し、関節炎の活動性の再上昇に応じてこの薬剤を放出するよう誘導することに成功した[Joshi, N. et al. Nature Communications 9(1) 1275 (2018)]。しかし、報告されたこの薬物担持ハイドロゲルは、設計上の枠組みが一般化可能なものではないため、別の生物学的要因を利用するために変更できる構成要素には制限がある。具体的には、このプラットフォームからの薬物放出は、主にエステラーゼ、具体的には、炎症性関節炎で発現が上昇する複数種のエステラーゼ[Ravaud, P. et al. Rheumatology 41(7) 815-818 (2002)]によりTG-18骨格のエステル結合が切断されることを利用するものであるが、他の炎症性疾患では、これらのエステラーゼが重要な生物学的シグナルにならない可能性もある。また、炎症状態に伴う低pH環境[Bellocq, A., et al. Journal of Biological Chemistry 273(9) 5086-5092 (1998); Riemann, A. et al. Molecular Basis of Disease 1862(1) 72-81 (2016)]では、このエステル結合の非酵素的加水分解が起こり、望ましくない非特異的な薬物放出が生じる可能性もある。
したがって、既存の送達システムの限界に対処することを目指した、(1)モジュール式の設計で、(2)免疫適合性があり、(3)室温で注射投与と外用投与のいずれにも対応できる汎用性を備えたプロテアーゼ誘導性の薬物送達プラットフォームは、未だ満たされていないニーズである。まず、リポソーム微粒子やポリマー微粒子のような粒子ドメインに薬物を物理的に内包し、これをプロテアーゼ誘導性の送達システムに組み込むと、拡散による薬物の基礎放出が生じると考えられる。このような基礎放出は、感染症の発症や関節炎の再燃によって病状が急に悪化したときに、プロテアーゼ誘導性の投薬増量を要する慢性炎症疾患の管理には望ましいと思われるが、すべての炎症関連病態に望ましいというわけではなく、特に免疫不全患者や免疫抑制剤投与中の患者、あるいは正常な治癒のためにある程度の炎症が必要とされる急性傷害の管理にはそぐわない。急性創傷部位での細菌感染症の突然の発症や脂漏性皮膚炎の再燃など、薬剤投与部位が薬剤を必要としない生理的状態から炎症性の強い病的状態に移行するような病態には、薬物の基礎放出が排除または最小限に抑制されている別の設計のプロテアーゼ誘導性の送達システムが望ましい。
また、炎症関連病態の管理において、薬物放出を誘導する生化学的刺激として1種類のプロテアーゼを利用することで、疾患の炎症状態に合わせて投薬量を調整できる場合もあるが、病的な炎症状態では、複数種のプロテアーゼの発現が上昇している可能性がある。したがって、1種類のプロテアーゼではなく、複数種のプロテアーゼを利用することで、プロテアーゼ活性と各疾患の状態との特異的な関連性を高めることができれば、目的とする炎症関連疾患に合わせて特異的に調整された薬物放出動態を実現できると考えられる。よって、特異性の向上を目指した、2種類以上のプロテアーゼ刺激(または複数種のプロテアーゼに対する応答性)により薬物を放出する薬物送達システムの開発にも依然として大きなニーズがある。
本発明は、炎症応答性の薬物送達プラットフォームであって、
(1) 薬物の基礎放出プロファイルが調整されている薬物担持ドメイン(抗炎症剤が封入された粒子もしくは抗炎症剤との結合体)、および/または
(2) プロテアーゼ切断性ハイドロゲルドメイン
を含む炎症応答性の薬物送達プラットフォームを提供する。
本発明は、炎症性疾患に対処するためにカスタマイズすることができる薬物送達プラットフォームであって、薬物担持ドメインの構成の変更、および/または、プロテアーゼ応答性ドメインにおける複数種のプロテアーゼに対する感受性の調節により、対象疾患に合わせて応答性と特異性を調整することができる薬物送達プラットフォームを提供する。
(1) 薬物の基礎放出プロファイルが調整されている薬物担持ドメイン(抗炎症剤が封入された粒子もしくは抗炎症剤との結合体)、および/または
(2) プロテアーゼ切断性ハイドロゲルドメイン
を含む炎症応答性の薬物送達プラットフォームを提供する。
本発明は、炎症性疾患に対処するためにカスタマイズすることができる薬物送達プラットフォームであって、薬物担持ドメインの構成の変更、および/または、プロテアーゼ応答性ドメインにおける複数種のプロテアーゼに対する感受性の調節により、対象疾患に合わせて応答性と特異性を調整することができる薬物送達プラットフォームを提供する。
本発明の第1の態様により、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルであって、
a) 粒子に封入された薬物;
b) 官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含む2つのスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤
を含み、
b) のポリマービルディングブロックが、c) のプロテアーゼ切断性架橋剤の存在下でゲルを形成し、a) の粒子が該ゲルに内包されることを特徴とする、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルが提供される。
a) 粒子に封入された薬物;
b) 官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含む2つのスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤
を含み、
b) のポリマービルディングブロックが、c) のプロテアーゼ切断性架橋剤の存在下でゲルを形成し、a) の粒子が該ゲルに内包されることを特徴とする、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルが提供される。
いくつかの実施形態において、前記プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルは、
a) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む第2の二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤を少なくとも1つ;および/または
b) プロテアーゼ耐性基質を含む二官能性プロテアーゼ耐性架橋剤を少なくとも1つ
さらに含み、
a) のプロテアーゼ切断性基質は、前記c) の架橋剤が感受性を示すプロテアーゼとは異なるプロテアーゼに感受性を示すことを特徴とする。
a) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む第2の二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤を少なくとも1つ;および/または
b) プロテアーゼ耐性基質を含む二官能性プロテアーゼ耐性架橋剤を少なくとも1つ
さらに含み、
a) のプロテアーゼ切断性基質は、前記c) の架橋剤が感受性を示すプロテアーゼとは異なるプロテアーゼに感受性を示すことを特徴とする。
前記粒子は、薬物(低分子、治療用ペプチド、タンパク質、mRNAなど)を担持・放出することができ、前記ポリマービルディングブロックと前記架橋剤によって形成されるゲルに内包される材料で構成されていればよい。前記粒子は、例えば、シリカ、リポソーム、siRNA複合体、またはポリマー材料であってもよい。前記粒子は、エマルジョン法、エレクトロスプレー法、静電的複合体形成法、フローフォーカシング法などの周知の先行技術の方法を用いて製造することができる[Abdelaziza, Hadeer M. et al., Journal of Controlled Release 269 374-392 (2018)]。
いくつかの実施形態において、前記薬物は、ポリカプロラクトン、ポリ(メタクリル酸)、ポリ乳酸、ポリビニルピロリドン、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、およびゼラチンを含む群から選択されるポリマー材料を含む粒子に封入されている。この粒子は、好ましくは、マイクロ粒子および/またはナノ粒子であり、粒子の直径は、好ましくは、約10nm~約100μmの範囲である。
いくつかの実施形態において、前記ポリマービルディングブロックは、マルチアームPEG-ビニルスルホン、マルチアームPEG-マレイミド、マルチアームPEG-アジド、またはマルチアームPEG-アルキンを含む。スルホン基は、前記架橋剤のアーム上のシステイン基と相互作用するため有利である。
また、本発明は、薬物を粒子に封入して、前記プロテアーゼにより放出されるまで封じ込めておく必要のない、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルを具体化したものも含む。
本発明の第2の態様により、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルであって、
a) 官能基を有するプロテアーゼ切断性ペプチドアンカーに共有結合している薬物;
b) 少なくとも1つの官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたペプチド基質を含む二官能性架橋剤
を含み、
前記ペプチドアンカーの官能基により、前記薬物と前記マルチアームPEGポリマーのアームが共有結合し、前記ポリマービルディングブロックの官能基と前記二官能性架橋剤の官能基が共有結合することにより、ゲルが形成されることを特徴とする、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルが提供される。
a) 官能基を有するプロテアーゼ切断性ペプチドアンカーに共有結合している薬物;
b) 少なくとも1つの官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたペプチド基質を含む二官能性架橋剤
を含み、
前記ペプチドアンカーの官能基により、前記薬物と前記マルチアームPEGポリマーのアームが共有結合し、前記ポリマービルディングブロックの官能基と前記二官能性架橋剤の官能基が共有結合することにより、ゲルが形成されることを特徴とする、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルが提供される。
ペプチドアンカーと架橋剤の配置により、薬物担持ハイドロゲルの放出プロファイルは柔軟性と可変性を兼ね備えることができ、それにより単種または複数種の異なるプロテアーゼに感受性を示す薬物の放出を実現することができる。
本態様の薬物結合ドメインにより薬物の基礎放出が最小限に抑えられるため有利である。
いくつかの実施形態において、前記プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルは、
a) 前記架橋剤がプロテアーゼによる切断性を有していないこと;もしくは
b) 前記ペプチドアンカーがプロテアーゼによる切断性を有し、前記架橋剤が、前記ペプチドアンカーを切断する前記プロテアーゼと同一もしくは異なるプロテアーゼによる切断性を有すること;および/または
c) 前記薬物担持ハイドロゲルが、複数種の架橋剤を含み、その1種以上がそれぞれ異なるプロテアーゼによる切断性を有すること
を特徴とする。
a) 前記架橋剤がプロテアーゼによる切断性を有していないこと;もしくは
b) 前記ペプチドアンカーがプロテアーゼによる切断性を有し、前記架橋剤が、前記ペプチドアンカーを切断する前記プロテアーゼと同一もしくは異なるプロテアーゼによる切断性を有すること;および/または
c) 前記薬物担持ハイドロゲルが、複数種の架橋剤を含み、その1種以上がそれぞれ異なるプロテアーゼによる切断性を有すること
を特徴とする。
所望のペプチドアンカーは、官能基を含むプロテアーゼ切断性スペーサー配列からなり、該スペーサー配列が少なくとも4個のアミノ酸を含むものであれば有利である。
前記架橋剤は、官能基を含むスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質の配列からなり、各スペーサー配列が少なくとも4個のアミノ酸を含むものであれば有利である。
前記非切断性架橋剤は、ゲルネットワーク内へのプロテアーゼの拡散を制御するために使用され、放出プロファイルを調整する上で有用である。
いくつかの実施形態において、前記薬物は、低分子、siRNA、アプタマー、または治療用ペプチドもしくはタンパク質であってもよい。
プロテアーゼ応答性ドメインの主要構成要素であるペプチド配列を複数種組み合わせて用いた場合、速やかに水性ゲルが形成され、複数種の疾患特異的プロテアーゼとの接触による誘導放出の特異性が向上するため有利である。
いくつかの実施形態において、前記ポリマービルディングブロックは、マルチアームPEG-ビニルマレイミドを含む。前記プロテアーゼ応答性ハイドロゲルに担持される薬物の量は、使用するマルチアームPEGポリマーの量または濃度によって調整することができる。
いくつかの実施形態において、前記プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルの重量比は、約2w/v%~約12w/v%、好ましくは、約3w/v%~約10w/v%である。前記ハイドロゲルは、好ましくは、マルチアームPEG-ビニルスルホン、マルチアームPEG-ビニルマレイミド、マルチアームPEG-アルキン、またはマルチアームPEG-アジドである。
前記マルチアームPEGポリマーのアームの数が、結合可能な薬物の量に影響を与えるとともに、架橋度とゲル形成にも影響を与えることは理解できるであろう。
本発明のいずれかの態様におけるプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルのいくつかの実施形態において、前記マルチアームPEGポリマーは、3~8本のアームを有する。
本発明のいずれかの態様におけるプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルのいくつかの実施形態において、前記薬物は抗炎症剤である。
本発明のいずれかの態様におけるプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルのいくつかの実施形態において、前記プロテアーゼは、炎症時に発現が上昇するプロテアーゼであり、マトリックスメタロプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼを含む群から選択される。
本発明のいずれかの態様におけるプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルのいくつかの実施形態において、前記薬物は、ステロイド性抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)、またはそれらの誘導体である。前記薬物は、デキサメタゾン、フルドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ハイドロコルチゾン、またはこれらの誘導体などのステロイド性抗炎症剤であってもよい。グルココルチコイドは、酸化させることでカルボキシル官能基を付加することができ、このように変換することで、本発明のペプチドアンカーに結合させることができる。前記薬物は、好ましくは、NSAIDであり、例えば、イブプロフェン、ケトプロフェン、ジクロロフェナク、サンリンダック、ピロキシカム、セレコキシブ、またはこれらの誘導体などである。
本発明のいずれかの態様におけるプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルのいくつかの実施形態において、前記基質を挟むスペーサー配列は、少なくとも1つのシステイン残基、少なくとも1つのリシン残基、および/または少なくとも1つのアジド含有非天然アミノ酸もしくはアルキン含有非天然アミノ酸を含む。これらは、前記架橋剤と前記マルチアームPEGの官能基とが反応してゲルを形成するために必要である。前記スペーサーは、1~6個のアミノ酸を有していてもよい。残りの残基は、任意のアミノ酸であればよく、好ましくは、荷電側鎖を有するアミノ酸である。具体的には、システインのチオール基の近くに正電荷のアミノ酸(例えば、アルギニン、R)がある場合は架橋速度が上昇し、負電荷のアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、D)がある場合は架橋反応が減速する。前記スペーサーは、1~6個のアミノ酸を有していてもよい。いくつかの実施形態において、前記基質を挟むスペーサー配列(「SPACER」)は、式GX1X2X3(配列番号33)で表される配列であってよく、かつ/またはその逆配列であってもよい。なお、X1、X2、およびX3は、それぞれ独立してグリシン、システイン、アスパラギン酸、またはアルギニンである。いくつかの実施形態において、前記基質を挟むスペーサー配列は、GRCR(配列番号1)、GCRG(配列番号2)、GRCD(配列番号3)、GCDR(配列番号4)、GCDG(配列番号5)、GDCD(配列番号6)、GCDD(配列番号7)、GCRD(配列番号8)、およびGCRR(配列番号9)を含む群から選択される。
第1および第2のスペーサーをペプチド基質の両端に1つずつ使用する場合、第2のスペーサー配列は第1のスペーサー配列の逆配列であってもよく、式X3X2X1G(配列番号34)で表される配列であってもよい。この逆配列のスペーサー配列は、以下「RECAPS」と呼ぶ場合もあるが、例えば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、および配列番号9を含む群から選択されるスペーサーの逆配列であってもよい。
本発明のいずれかの態様におけるプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルのいくつかの実施形態において、前記プロテアーゼ切断性基質は、メタロプロテアーゼ-9(MMP-9)、MMP-2、MMP-7、MMP-12などのマトリックスメタロプロテアーゼ、カテプシンK、カテプシンB、カテプシンSなどのカテプシン、ヒト好中球エラスターゼ(HNE)、カスパーゼ、およびウロキナーゼを含む群から選択されるプロテアーゼに対して感受性を示す。
いくつかの実施形態において、前記プロテアーゼ切断性基質は、KGPRSLSGK(配列番号30)、GPRSLSG(配列番号10)、LGRMGLPGK(配列番号11)、AVRWLLTA(配列番号12)、またはGPQGIWGQ(配列番号13)で表されるアミノ酸配列を含むMMP-9基質、APEEIMDRQ(配列番号14)またはPMAVVQSVP(配列番号15)を含むHNE基質、GRRGLG(配列番号16)またはDGFLGDD(配列番号17)を含むカテプシンB基質、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される。
本発明の第3の態様により、注射用または外用投与用に製剤化された、本発明のいずれかの態様のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルを含む組成物が提供される。
本発明のいずれかの態様の炎症応答性の薬物担持ハイドロゲルは、ポリマー被覆材に組み込むことにより、創傷管理用の複合被覆材を形成することができる。
本発明の第4の態様により、本発明のいずれかの態様のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルを含む被覆材が提供される。
本発明の第5の態様により、本発明のいずれかの態様のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルまたは本発明の組成物が、それを必要とする対象を治療するための注射剤または外用被覆材として提供される。
本発明の第6の態様により、本発明のいずれかの態様のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルまたは本発明の組成物の有効量を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む治療方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記投与は、前記対象への注射または外用適用による投与である。いくつかの実施形態において、前記治療は、慢性創傷、炎症性腸疾患、関節炎、潜在感染関連病態などの、炎症管理が望まれる炎症関連疾患の治療である。
本発明の第7の態様により、
a) 粒子に封入された薬物;
b) 官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含む2つのスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤
を含み、
a)~c)が、前述のいずれかの態様で定義されたものと同じであることを特徴とするキット、または
a) 官能基を有するプロテアーゼ切断性ペプチドアンカーに共有結合している薬物;
b) 少なくとも1つの官能基を有するマルチアームPEGポリマーを含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたペプチド基質を含む二官能性架橋剤
を含み、
a)~c)が、前述のいずれかの態様で定義されたものと同じであることを特徴とするキット
が提供される。
a) 粒子に封入された薬物;
b) 官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含む2つのスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤
を含み、
a)~c)が、前述のいずれかの態様で定義されたものと同じであることを特徴とするキット、または
a) 官能基を有するプロテアーゼ切断性ペプチドアンカーに共有結合している薬物;
b) 少なくとも1つの官能基を有するマルチアームPEGポリマーを含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたペプチド基質を含む二官能性架橋剤
を含み、
a)~c)が、前述のいずれかの態様で定義されたものと同じであることを特徴とするキット
が提供される。
いくつかの実施形態において、前記キットは、本発明のいずれかの態様のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルまたは本発明のいずれかの態様の組成物を含む。
本発明の第8の態様により、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルの製造方法であって、
a) 官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロックと薬物担持粒子を混合する工程;
b) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤と薬物担持ポリマー粒子を混合する工程;および
c) a) の混合物とb) の混合物を混合することにより、a) のポリマービルディングブロックが、b) のプロテアーゼ切断性架橋剤の存在下でゲルを形成し、前記薬物担持粒子が該ゲルに内包される工程
を含む製造方法が提供される。
a) 官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロックと薬物担持粒子を混合する工程;
b) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤と薬物担持ポリマー粒子を混合する工程;および
c) a) の混合物とb) の混合物を混合することにより、a) のポリマービルディングブロックが、b) のプロテアーゼ切断性架橋剤の存在下でゲルを形成し、前記薬物担持粒子が該ゲルに内包される工程
を含む製造方法が提供される。
前記粒子は、薬物(低分子、治療用ペプチド、タンパク質、mRNAなど)を担持・放出することができ、前記ポリマービルディングブロックと前記架橋剤によって形成されるゲルに内包される材料で構成されていればよい。前記粒子は、例えば、シリカ、リポソーム、siRNA複合体、またはポリマー材料であってもよい。前記粒子は、エマルジョン法、エレクトロスプレー法、静電的複合体形成法、フローフォーカシング法などの周知の先行技術の方法を用いて製造することができる[Abdelaziza, Hadeer M. et al., Journal of Controlled Release 269 374-392 (2018)]。
いくつかの実施形態において、前記薬物は、ポリカプロラクトン、ポリ(メタクリル酸)、ポリ乳酸、ポリビニルピロリドン、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、およびゼラチンを含む群から選択されるポリマー材料を含む粒子に封入されている。この粒子は、好ましくは、マイクロ粒子および/またはナノ粒子であり、粒子の直径は、好ましくは、約10nm~約100μmの範囲である。
本発明の第9の態様により、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルの製造方法であって、
a) 官能基を有するペプチドアンカーに共有結合している薬物と、少なくとも1つの官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含むポリマービルディングブロックとを混合することにより、該ペプチドアンカーと該マルチアームPEGポリマーのそれぞれの官能基が共有結合して、該薬物が該マルチアームPEGポリマーのアームに結合される工程;および
b) a) の薬物-ポリマー結合体を、官能基を含むスペーサー配列に挟まれたペプチド基質を含む二官能性架橋剤と混合することにより、前記ポリマービルディングブロックの官能基と、該二官能性架橋剤の官能基とが共有結合して、ゲルが形成される工程
を含む製造方法が提供される。
a) 官能基を有するペプチドアンカーに共有結合している薬物と、少なくとも1つの官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含むポリマービルディングブロックとを混合することにより、該ペプチドアンカーと該マルチアームPEGポリマーのそれぞれの官能基が共有結合して、該薬物が該マルチアームPEGポリマーのアームに結合される工程;および
b) a) の薬物-ポリマー結合体を、官能基を含むスペーサー配列に挟まれたペプチド基質を含む二官能性架橋剤と混合することにより、前記ポリマービルディングブロックの官能基と、該二官能性架橋剤の官能基とが共有結合して、ゲルが形成される工程
を含む製造方法が提供される。
本発明の第9の態様のいくつかの実施形態において、前記方法は、
a) 前記ペプチドアンカーがプロテアーゼによる切断性を有し、前記架橋剤がプロテアーゼによる切断性を有していないこと;もしくは
b) 前記ペプチドアンカーがプロテアーゼによる切断性を有し、前記架橋剤が、前記ペプチドアンカーを切断する前記プロテアーゼと同一もしくは異なるプロテアーゼによる切断性を有すること;および/または
c) 前記薬物担持ハイドロゲルが、複数種の架橋剤を含み、その1種以上がそれぞれ異なるプロテアーゼによる切断性を有すること
を特徴とする。
a) 前記ペプチドアンカーがプロテアーゼによる切断性を有し、前記架橋剤がプロテアーゼによる切断性を有していないこと;もしくは
b) 前記ペプチドアンカーがプロテアーゼによる切断性を有し、前記架橋剤が、前記ペプチドアンカーを切断する前記プロテアーゼと同一もしくは異なるプロテアーゼによる切断性を有すること;および/または
c) 前記薬物担持ハイドロゲルが、複数種の架橋剤を含み、その1種以上がそれぞれ異なるプロテアーゼによる切断性を有すること
を特徴とする。
いくつかの実施形態において、前記薬物、前記粒子、前記架橋剤、前記切断性アンカー、および/または前記ポリマービルディングブロックは、本発明のいずれかの態様で定義されたものと同じである。
本発明の第10の態様により、本発明のいずれかの態様のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルを含む複合被覆材の製造方法であって、
a) 粒子に封入された薬物と、官能基を含む2つのスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤との混合物を調製する工程;
b) 粒子に封入された薬物と、官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロックとの混合物を調製する工程;および
c) a) の混合物とb) の混合物を混合し、この混合物を被覆材に付着させて、ゲル化させる工程
を含む製造方法が提供される。
a) 粒子に封入された薬物と、官能基を含む2つのスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤との混合物を調製する工程;
b) 粒子に封入された薬物と、官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロックとの混合物を調製する工程;および
c) a) の混合物とb) の混合物を混合し、この混合物を被覆材に付着させて、ゲル化させる工程
を含む製造方法が提供される。
いくつかの実施形態において、前記被覆材は、アルギン酸塩の創傷被覆材である。
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記複合被覆材を液体窒素中で瞬間凍結させ、凍結乾燥させる工程d) をさらに含む。
前記製造方法のいくつかの実施形態において、前記薬物は、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)であり;前記粒子は、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)を含み;前記架橋剤および/または前記アンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼならびにこれらの組み合わせを含む群から選択されるプロテアーゼによる切断性を有し;前記ポリマービルディングブロックは、4アームもしくは8アームのPEG-ビニルスルホン、4アームもしくは8アームのPEG-ビニルマレイミド、4アームもしくは8アームのPEG-アジド、または4アームもしくは8アームのPEG-アルキンを含む。
このように設計上の枠組みが一般化可能なものであることから、その構造的および機能的な完全性を維持しながら、薬物の選択と薬物担持量を変更することができるため有利である。
また、この送達プラットフォームは、免疫適合性材料を使用することでin vivoで投与した際の有害な宿主反応が最小限に抑えられるように設計されているため有利である。
さらに、このプラットフォームは、室温で注射投与と外用投与のいずれにも対応できる汎用性を備えているため有利である。
便宜上、本明細書に記載の引用文献を一覧にして、実施例の末尾に記載している。このような参考文献の内容は、その全体が参考により本明細書に援用される。
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項において使用される特定の用語を以下にまとめた。
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項において使用される特定の用語を以下にまとめた。
本明細書および添付の請求項において、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈上明らかに別段の解釈がなされる場合を除き、複数についての言及も含むことに留意されたい。
本明細書において、範囲は、「約」の付いたある特定の値から、かつ/または「約」の付いた別の特定の値までとして表すことができる。このような範囲を表す場合、別の実施形態には、ある特定の値から、かつ/または別の特定の値までの範囲が含まれる。同様に、先行詞である「約」の使用により、値が概数として表される場合、その特定の値が別の実施形態を形成することは理解できるであろう。範囲のそれぞれの端点は、もう一方の端点との関係において意味があるとともに、もう一方の端点とは独立で意味があることもさらに理解できるであろう。また、本明細書において、複数の値が開示されているが、それぞれの値において、その値だけでなく、その特定の値に「約」が付いた値も開示されていることは理解できるであろう。例えば、「10」という値が開示されている場合、「約10」という値も開示されていることになる。また、当業者であれば適切に理解できる内容であると思われるが、ある値が開示されている場合、「その値以下」、「その値以上」、およびそれらの値の間の可能な範囲も開示されていることは理解できるであろう。例えば、「10」という値が開示されている場合、「10以下」だけでなく、「10以上」も開示されていることになる。また、2つの特定のユニットの間にある各ユニットも開示されていることは理解できるであろう。例えば、3と10が開示されている場合、4、5、6、7、8、9も開示されていることになる。
本明細書において、「アミノ酸」または「アミノ酸配列」という用語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、またはこれらの断片を表し、天然の分子または合成の分子を表す。本明細書において、「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を意味している場合、「アミノ酸配列」などの用語が表すものは、記載のタンパク質分子に関連する完全な天然アミノ酸配列に限定されない。
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」という用語は、複数のアミノ酸で構成された1つ以上の鎖を表し、各鎖の複数のアミノ酸は、ペプチド結合により共有結合している。該ポリペプチドまたは該ペプチドは、非共有結合および/またはペプチド結合により共有結合した複数の鎖を含むこともあり、天然タンパク質の配列、すなわち、天然の細胞、具体的には非組換え細胞、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞によって産生されるタンパク質の配列を有する。また、該ポリペプチドまたは該ペプチドは、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子を含むこともあれば、天然配列の1個以上のアミノ酸の欠失、付加、および/もしくは置換を有する分子を含むこともある。「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」は、1つのアミノ酸鎖を含む(「モノマー」と称する)こともあれば、複数のアミノ酸鎖を含む(「マルチマー」と称する)こともある。
本明細書において、「粒子」という用語は、薬物を封入する材料を広く示しており、粒子は、薬物(低分子、治療用ペプチド、タンパク質、mRNAなど)を担持・放出することができ、前記ポリマービルディングブロックと前記架橋剤によって形成されるゲルに内包される材料で構成されていればよい。前記粒子は、例えば、シリカ、リポソーム、siRNA複合体、またはポリマー材料であってもよい。前記粒子は、エマルジョン法、エレクトロスプレー法、静電的複合体形成法、フローフォーカシング法などの周知の先行技術の方法を用いて製造することができる[Abdelaziza, Hadeer M. et al., Journal of Controlled Release 269 374-392 (2018)]。ポリマー粒子は、図15に示すように、一般に球状である。本発明で使用される好ましい粒子サイズは、nmまたはμmの範囲の直径を有する、マイクロ粒子および/またはナノ粒子である。粒子の直径は、好ましくは、10nm~100μmの範囲である。
「ポリマー」または「バイオポリマー」という用語は、繰り返しの分子単位が重合した物質と定義される。前記ポリマーは、多糖類(例えば、アガロース、デキストラン)、ポリホスファゼン、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ(アルキレンオキシダーゼ)、ポリ(酢酸ビニル)、ポリビニルピロリドン(PVP)、これらの誘導体、ならびにこれらのコポリマーおよびポリマーブレンドを含む群から選択される生体適合性ポリマーであってもよい。薬物封入ポリマー粒子に用いる場合、前記ポリマーは、ポリカプロラクトン、ポリ(メタクリル酸)、ポリ乳酸、ポリビニルピロリドン、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、およびゼラチンを含む群から選択されるものであってもよい。前記ポリマーは、機械的および構造的な安定性を有する、注射、移植またはインプラント(例えば、皮下移植または皮下インプラント)に適した柔軟性ポリマーであってもよい。前記ポリマーは、生分解性であってもよく、生分解性でなくてもよい。本発明のポリマービルディングブロックは、一般に、架橋剤の官能基と相互作用してゲルを形成することができる官能基を有する複数のアームを含む。好ましいマルチアームビルディングブロックとしては、マルチアームPEG-ビニルスルホン、マルチアームPEG-ビニルマレイミド、マルチアームPEG-アジド、およびマルチアームPEG-アルキンが挙げられ、特に4アームまたは8アームを有するものが挙げられる。
本明細書において、「対象」は脊椎動物として定義され、特に哺乳動物、さらに言えば、特にヒトを指す。特に研究を目的とする場合、対象は、少なくとも1種の動物モデル(たとえばマウスやラットなど)であってもよい。特に、炎症性疾患などの疾患の治療または予防を目的とする場合、対象はヒトであってもよい。
本発明の文脈において使用される「治療」という用語は、予防的処置、緩和的処置、治療的処置または治癒的処置を指す。
本明細書において、「含む(comprising)」または「含む(including)」という用語は、これらの用語によって示される本明細書に記載の特徴、整数、工程または要素の存在を明記するものであると解釈されるが、1つ以上の特徴、整数、工程もしくは要素またはこれらの群の存在または付加を除外するものではない。また、本開示の文脈において、「含む(comprising)」または「含む(including)」という用語は、「からなる(consisting of)」という意味も包含する。したがって、「comprise」や「comprises」などの「含む(comprising)」という用語のバリエーション、および「include」や「includes」などの「含む(including)」という用語のバリエーションも同様に広い意味を有する。
本発明の態様について、本明細書で提供される実施形態に沿って説明するが、本発明がこれらの実施形態に限定されるものではないことは理解できるであろう。一方で、本発明には、本明細書に記載された実施形態の代替物、変更物および等価物も包含される。これらは添付の請求項によって定義される本発明の範囲に含まれる。さらに、以下の詳細な説明では、本発明を十分に理解できるように、具体的な詳細事項を記載する。しかし、具体的な詳細事項がなくても、かつ/または、個々の実施形態の特徴を組み合わせることで得られる複数の詳細事項から、本発明を実施できることは、当該技術分野で通常の技能を有する者、すなわち、当業者であれば理解できるであろう。多くの例において、本発明の実施形態の特徴が不必要に不明瞭にならないように、公知のシステム、方法、手順、および要素についての詳細な説明は割愛する。
当業者であれば、本明細書に示された方法に従って、過度な実験を行うことなく本発明の実施が可能であることは理解できるであろう。本明細書に示されている方法、手法、および化学物質は、記載した参考文献、または標準的な生物工学や分子生物学の教科書のプロトコルに記載されている通りである。本明細書において具体的な記載のない、当技術分野で公知の標準的な分子生物学的手法は、概ね、A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (2001)に記載された方法に従ったものである。
実施例1
プロテアーゼ応答性を有する薬物封入粒子含有ハイブリッドハイドロゲルを作製するための材料および方法
1.1 PLGA粒子の作製および性状分析
イブプロフェン含有粒子またはイブプロフェン不含粒子を、Lactel社(アラバマ州ペラム)のポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)50/50(固有粘度:0.95~1.20dl/g)を用いて油中水型エマルジョン法で作製した[Dang, T. T. et al. Biomaterials 34 (23), 5792-5801 (2013)]。典型的な例を挙げると、PLGAとイブプロフェンをそれぞれ40mg/mLと6mg/mLの濃度になるようにジクロロメタンに溶解した溶液5mLを、1% (w/v) ポリビニルアルコール(Sigma Aldrich社、ミズーリ州セントルイス、米国)溶液25mLに速やかに加え、様々な速度で60秒間均質化した(L5M-A、Silverson社)。得られた懸濁液を75mLの脱イオン水に速やかにデカンテーションし、60秒間攪拌した後、15分間ロータリーエバポレーションを行った。この懸濁液を3000rpm、30秒間の遠心分離を行って3回洗浄した。得られた粒子を回収し、液体窒素中で瞬間凍結し、凍結乾燥させた。粒子の粒度分布と形態を走査型電子顕微鏡(JSM 6390LA、日本電子)で調べた。2mgの粒子を1mLのアセトニトリルに溶解して240nmのUV吸光度を測定し、測定値と、既知濃度のイブプロフェンを溶解したアセトニトリル溶液の標準曲線とを比較して、各粒子製剤のイブプロフェン担持量を求めた。また、異なるサイズのibu-PLGA粒子の薬物担持サブドメインからの放出動態を調べた(表1、図15、および図16)。GEL-iPの作製には、薬物担持粒子からのバースト放出を抑制するために、平均直径14μm、実験時の薬物担持量が約6wt%の粒子を選択した。
プロテアーゼ応答性を有する薬物封入粒子含有ハイブリッドハイドロゲルを作製するための材料および方法
1.1 PLGA粒子の作製および性状分析
イブプロフェン含有粒子またはイブプロフェン不含粒子を、Lactel社(アラバマ州ペラム)のポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)50/50(固有粘度:0.95~1.20dl/g)を用いて油中水型エマルジョン法で作製した[Dang, T. T. et al. Biomaterials 34 (23), 5792-5801 (2013)]。典型的な例を挙げると、PLGAとイブプロフェンをそれぞれ40mg/mLと6mg/mLの濃度になるようにジクロロメタンに溶解した溶液5mLを、1% (w/v) ポリビニルアルコール(Sigma Aldrich社、ミズーリ州セントルイス、米国)溶液25mLに速やかに加え、様々な速度で60秒間均質化した(L5M-A、Silverson社)。得られた懸濁液を75mLの脱イオン水に速やかにデカンテーションし、60秒間攪拌した後、15分間ロータリーエバポレーションを行った。この懸濁液を3000rpm、30秒間の遠心分離を行って3回洗浄した。得られた粒子を回収し、液体窒素中で瞬間凍結し、凍結乾燥させた。粒子の粒度分布と形態を走査型電子顕微鏡(JSM 6390LA、日本電子)で調べた。2mgの粒子を1mLのアセトニトリルに溶解して240nmのUV吸光度を測定し、測定値と、既知濃度のイブプロフェンを溶解したアセトニトリル溶液の標準曲線とを比較して、各粒子製剤のイブプロフェン担持量を求めた。また、異なるサイズのibu-PLGA粒子の薬物担持サブドメインからの放出動態を調べた(表1、図15、および図16)。GEL-iPの作製には、薬物担持粒子からのバースト放出を抑制するために、平均直径14μm、実験時の薬物担持量が約6wt%の粒子を選択した。
1.2 薬物封入粒子含有ハイブリッドハイドロゲルの作製
我々は、プロテアーゼ切断性ハイドロゲルに薬物担持ポリマー粒子を埋め込んだモジュール式薬物送達プラットフォームを開発した(図1)。このハイドロゲルマトリックスは、プロテアーゼ活性によるタンパク質分解によって分解され、それにより、埋め込まれていた粒子が遊離し、その結果、所望の治療ペイロードを送達することができた。このプラットフォームはモジュール式であるため、薬物担持サブドメインとプロテアーゼ切断性サブドメインをそれぞれ独立で最適化することができ、その結果、所望のペイロード放出を達成することができた。具体的には、プロテアーゼ切断性サブドメインと薬物担持サブドメインの主要ポリマー成分として、ポリエチレングリコール(PEG)とポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)をそれぞれ選択した。これらは、いずれも臨床承認された医療製品に使用されているものである。PLGAは、その生分解性と細胞適合性から、薬物やタンパク質などの治療薬の封入に広く用いられている合成ポリマーである[Han, F. Y. et al. Frontiers in pharmacology 7, 185-185 (2016)]。また、PEGは、膵島を免疫保護するためのコンフォーマルコーティング剤[Tomei, A. A. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 111 (29), 10514 (2014)]として、あるいは外科用シーラントの成分[Zoia, C. et al. Journal of Applied Biomaterials & Functional Materials 13 (4), 372-375 (2015)]として使用されている。また、PEGは合成ポリマーであり、多様なマルチアーム構成と官能基を有する幅広い分子量のものが入手可能であるため、全身、外用から注射の用途に至るまで、様々な薬物送達プラットフォームに利用されている[Li, J. and Mooney, D. J. Nature Reviews Materials 1, 16071 (2016)]。また最近では、PEG系ハイドロゲルが、複数種の薬物や細胞ベースの治療薬を刺激応答により送達するための細胞適合性プラットフォームとして汎用性を有することも実証されている[Badeau, B. A. Nature Chemistry 10, 251 (2018)]。
我々は、プロテアーゼ切断性ハイドロゲルに薬物担持ポリマー粒子を埋め込んだモジュール式薬物送達プラットフォームを開発した(図1)。このハイドロゲルマトリックスは、プロテアーゼ活性によるタンパク質分解によって分解され、それにより、埋め込まれていた粒子が遊離し、その結果、所望の治療ペイロードを送達することができた。このプラットフォームはモジュール式であるため、薬物担持サブドメインとプロテアーゼ切断性サブドメインをそれぞれ独立で最適化することができ、その結果、所望のペイロード放出を達成することができた。具体的には、プロテアーゼ切断性サブドメインと薬物担持サブドメインの主要ポリマー成分として、ポリエチレングリコール(PEG)とポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)をそれぞれ選択した。これらは、いずれも臨床承認された医療製品に使用されているものである。PLGAは、その生分解性と細胞適合性から、薬物やタンパク質などの治療薬の封入に広く用いられている合成ポリマーである[Han, F. Y. et al. Frontiers in pharmacology 7, 185-185 (2016)]。また、PEGは、膵島を免疫保護するためのコンフォーマルコーティング剤[Tomei, A. A. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 111 (29), 10514 (2014)]として、あるいは外科用シーラントの成分[Zoia, C. et al. Journal of Applied Biomaterials & Functional Materials 13 (4), 372-375 (2015)]として使用されている。また、PEGは合成ポリマーであり、多様なマルチアーム構成と官能基を有する幅広い分子量のものが入手可能であるため、全身、外用から注射の用途に至るまで、様々な薬物送達プラットフォームに利用されている[Li, J. and Mooney, D. J. Nature Reviews Materials 1, 16071 (2016)]。また最近では、PEG系ハイドロゲルが、複数種の薬物や細胞ベースの治療薬を刺激応答により送達するための細胞適合性プラットフォームとして汎用性を有することも実証されている[Badeau, B. A. Nature Chemistry 10, 251 (2018)]。
ペプチド架橋ハイドロゲルは、4アームポリ(エチレングリコール)-ビニルスルホン(PEG-VS)(20kDa、Sigma Aldrich社、ミズーリ州セントルイス、米国)とビスシステインペプチド(Genscript社、香港)を化学量論比で反応させて調製した。各前駆体を、トリエタノールアミン(TEOA)バッファー(0.3M)またはPBS/NaOHバッファー(pH=10)に溶解した。典型的な例として、PEG含量4.2% (w/v) のペプチド架橋ハイドロゲル117μLを調製するために、5mgのPEG-VSをガラスバイアルに入れて、100μLのバッファー溶液に溶解し、これと、同じバッファー溶液17μLに化学量論量のペプチド架橋剤を溶解したものとを混合した。ペプチド架橋剤の予備スクリーニングでは、PEG含量4.2% (w/v) のハイドロゲルで評価を行った。その後のin vitroおよびin vivoの実験では、すべてPEG含量1.7% (w/v) のハイドロゲルを使用した。また、ペプチド架橋ハイドロゲルにPLGA粒子(イブプロフェン含有または不含)が埋め込まれたハイブリッドハイドロゲルを形成するために、前述の前駆体をそれぞれ別々に、PLGA粒子の濃度が5% (w/v) になるように懸濁したバッファー溶液に溶解した。PEG-VSとペプチド架橋剤とPLGA粒子の液状混合物が入ったガラスバイアルを一定時間ごとに倒立させ、この液状混合物が重力を受けても下方に流れなくなった時点でゲル化したと判断した。ペプチドスペーサー配列、ペプチド基質配列、およびプロテアーゼ感受性の例を表2に示す。
1.3 最適なゲル化とタンパク質分解による切断を達成するためのペプチド架橋剤のスクリーニング
本試験では、PEG-VSとハイドロゲルを形成することができ、MMP-9の活性による切断性を保持することができるペプチド架橋剤を得ることを最終的な目標として、ペプチド架橋剤を設計した。本発明のハイブリッドハイドロゲルはモジュール式構造であるため、MMP-9の切断性を決定するサブドメインの重要な構成要素であるペプチド架橋剤を独立で設計することができる。典型的な例を挙げると、所望のペプチド架橋剤には、MMP-9切断性基質配列の両側に、それぞれ4個のアミノ酸からなるシステイン含有スペーサー配列が配置されている。この基質は、MMP-9検出用バイオセンサーのMMP-9感受性成分として、あるいは化学療法用薬物担持ナノキャリアのMMP-9切断性リンカーとして利用されているペプチド配列[Biela, A. et al. Biosensors and Bioelectronics 68, 660-667 (2015); Samuelson, L. E. et al. Molecular Pharmaceutics 10 (8), 3164-3174 (2013)]から選択した。末端の各スペーサーのシステインのチオール基は脱プロトン化されてチオラートとなり[Friedman, M. et al. Journal of American Chemical Society 87 (16), 3672-3682 (1965)]、これがマイケル付加反応によってPEG-VSのビニルスルホン基と反応することでゲル化が起こる[Lutolf, M. P. and Hubbell., J. A. Biomacromolecules 4 (3), 713-722 (2003)]。
本試験では、PEG-VSとハイドロゲルを形成することができ、MMP-9の活性による切断性を保持することができるペプチド架橋剤を得ることを最終的な目標として、ペプチド架橋剤を設計した。本発明のハイブリッドハイドロゲルはモジュール式構造であるため、MMP-9の切断性を決定するサブドメインの重要な構成要素であるペプチド架橋剤を独立で設計することができる。典型的な例を挙げると、所望のペプチド架橋剤には、MMP-9切断性基質配列の両側に、それぞれ4個のアミノ酸からなるシステイン含有スペーサー配列が配置されている。この基質は、MMP-9検出用バイオセンサーのMMP-9感受性成分として、あるいは化学療法用薬物担持ナノキャリアのMMP-9切断性リンカーとして利用されているペプチド配列[Biela, A. et al. Biosensors and Bioelectronics 68, 660-667 (2015); Samuelson, L. E. et al. Molecular Pharmaceutics 10 (8), 3164-3174 (2013)]から選択した。末端の各スペーサーのシステインのチオール基は脱プロトン化されてチオラートとなり[Friedman, M. et al. Journal of American Chemical Society 87 (16), 3672-3682 (1965)]、これがマイケル付加反応によってPEG-VSのビニルスルホン基と反応することでゲル化が起こる[Lutolf, M. P. and Hubbell., J. A. Biomacromolecules 4 (3), 713-722 (2003)]。
GEL-iPに最適なペプチド架橋剤を同定するため、8種類のペプチド配列(表3および図14)について、基質とスペーサーの選択がハイブリッドハイドロゲルのゲル化および切断性に与える影響を評価する定性的スクリーニングを実施した。また、ゲル化反応におけるバッファー環境のpHがチオールの脱プロトン化、ひいては架橋過程に影響を与える可能性があるため、ゲル化させる際のバッファーについても検討した。基質とスペーサーとバッファーとの各組み合わせにおいて、チューブ倒立法によりゲル化の可否を目視で確認した。PEG-VS溶液とibu-PLGA粒子の懸濁液の混合物を入れたガラスバイアルに、化学量論量のペプチド架橋剤を加えた。この実験では、同じ混合組成で、対象のペプチド架橋剤を含まない別のバイアルも用意し、コントロールとして使用した。2つのバイアルを一定時間ごとに倒立させ、片方のバイアル内の混合物が重力を受けても流れなくなりゲル化したと判断されるまで、この操作を繰り返した。典型的なハイブリッドハイドロゲルのゲル化した例を撮影したものが、ガラスバイアルA1とA2の写真である(図2)。ペプチド架橋剤の存在下では、白色のハイブリッドハイドロゲルがガラスバイアルA1の底部に形成され、重力を受けても下方に流れないことから、架橋が形成されたことが確認された。この白色の固形物の外観は、白色のibu-PLGA粒子に由来する。ペプチド架橋剤が存在しないコントロールバイアルA2内の前駆体混合物は自由流動性を保ったままであり、ゲル化せずと判断された。
各ハイブリッドハイドロゲル20μLを500μLのエッペンドルフチューブに入れ、3μg/mL MMP-9(83kDa、Merck社)を含むPBSバッファー(DPBS/改変、カルシウム不含、マグネシウム不含、HyCloneTM)を加えて、37℃でインキュベートした。コントロール実験として、同じ組成のハイブリッドハイドロゲルを、MMP-9不含のPBSバッファーに浸漬させた。20時間インキュベートした後、ハイブリッドハイドロゲルの周囲の媒体をカバースリップに採取し、光学顕微鏡(Olympus CKX53SF、日本)で観察して、放出粒子の有無を調べた。
MMP-9の濃度は、関節リウマチや変形性関節症の患者の臨床創傷液や滑液に含まれるMMP-9の発現量[Ladwig, G. P. et al. Wound Repair and Regeneration 10(1) 26-37 (2002); Li, Z. et al. Journal of Diabetes and its Complications 27(4) 380-382 (2013)]の範囲とした。MMP-9で切断された典型的な例である図2のバイアルB1とB2の写真は、バイアルA1と同じ組成のハイブリッドハイドロゲルを、それぞれMMP-9含有バッファーとMMP-9不含バッファーに長時間接触させた後の外観を示したものである。MMP-9の存在下では、バイアルA1で見られていた白色の架橋ハイブリッドハイドロゲルは消失し、バイアルB1では均質に白濁した懸濁液のみが観察された。光学顕微鏡画像C1から、バイアルB1の液状混合物中にibu-PLGA粒子の存在が確認され、このハイブリッドハイドロゲルがMMP-9によって首尾よく分解されることが確認された。一方、ゲル化後に加えたMMP-9不含PBSバッファーは、バイアルB2では透明な液相として観察された。また、光学顕微鏡画像C2から、バイアルB2内には放出されたibu-PLGA粒子は存在しないことが確認された。
図14は、架橋剤候補物質の定性的スクリーニングの結果をまとめたものである。図14の (A) 列と (B) 列のスクリーニングデータから、ペプチド架橋剤のアミノ酸の組み合わせがペプチド配列の特性を決定付け、結果としてゲル化速度に影響を与えることが分かった。スクリーニングに使用した基質のほとんどが5~30分以内にゲル化した。驚くべきことに、ペプチド (3)(配列番号24)とペプチド (8)(配列番号28)のそれぞれの構成要素である基質AVRWLLTA(配列番号12)を用いた場合のみ、対応するペプチド架橋剤とPEG-VSとの反応性に関して、所望の結果は得られなかった。具体的には、ペプチド (3) はPBS/NaOH中ではPEG-VSとの架橋によりゲル化可能であったが、TEOAバッファー中ではゲル化できなかった。TEOAが界面活性剤として作用し、水溶液中のペプチド (3) の立体構造または立体配座を変化させた[Jones, B. H. et al. Soft Matter 11 (18), 3572-3580 (2015)]ことが原因でゲル化が阻害されたものと推察される。また、興味深いことに、PEG-VSを加える前、ペプチド (8) をPBS/NaOHバッファーに溶解すると、ペプチド (8) は自己組織化してゲル状になり、TEOAバッファーに溶解すると、ペプチドが自己組織化したことを示すと考えられる乳状の溶液になった[Zhou, Q. et al. Progress in Natural Science 19 (11), 1529-1536 (2009)]。この挙動が,このペプチドのシステインのチオールとPEG-VSのビニルスルホンとのその後の反応を阻害し,ゲル化を妨げたと考えられる。
基質の選択に加えて、スペーサーの設計(GCRR(配列番号9)またはGCRD(配列番号8))も、架橋過程で重要な役割を果たす。例えば、スペーサーGCRR(配列番号9)を用いて設計されたペプチド (2) は、同じ基質と異なるスペーサーGCRD(配列番号8)を用いて設計されたペプチド (6) よりもPEG-VSとの架橋速度がいずれのバッファー中でも顕著に早かった。同様に、スペーサーGCRR(配列番号9)を含むペプチド (4) は、スペーサーGCRD(配列番号8)を含むペプチド (5) よりビニルスルホンとの反応速度がPBS/NaOH中では速かった。このデータは、システインのチオール基の近くに正電荷(例えば、アルギニン、R)がある場合は架橋速度が上昇し、負電荷(例えば、アスパラギン酸、D)がある場合は架橋反応が減速するという報告をした文献[Lutolf, M. P. et al. Bioconjugate Chemistry 12 (6), 1051-1056 (2001)]の内容と一致するものであった。これは、前者により中間体であるチオラートが安定化されたためと考えられる[Roos, G. et al. Antioxidants & Redox Signaling 18 (1), 94-127 (2012)]。
環境のpHがチオールの脱プロトン化に影響し、中間体チオラートの濃度を変化させるため[Lutolf, M. P. and Hubbell, J.A. Biomacromolecules 4 (3), 713-722 (2003)]、バッファーの選択も架橋速度に影響を与える可能性がある。TEOAバッファーは、マイケル付加によく使われる強塩基性バッファーの1つであるが、細胞毒性も懸念されるため、我々は、それに代わる細胞適合性の高いPBS/NaOHバッファーを検討した。図14に示すように、基質AVRWLLTA(配列番号12)を含む配列を除くすべてのペプチドは、それぞれ反応速度は異なるが、いずれのバッファー中でもPEG-VSと架橋することができた。興味深いことに、ペプチド (5) では、PBS/NaOHバッファーの方がTEOAバッファーよりも架橋速度が遅かった。弱塩基性バッファーであるPBS/NaOHはTEOAバッファーよりもチオールの脱プロトン化効率が悪く、そのためゲル化速度が低下したものと推察される。ゲル化速度に関して得られたデータから、同じ架橋剤を用いた設計であっても、反応バッファーの適切な選択がハイドロゲル形成の成功に重要であることが示唆された。
次に、図14の(C)列に示す結果は、架橋に成功した各ハイブリッドハイドロゲルのMMP-9溶液中での切断性についてまとめたものである。具体的には、ペプチド (1)、(4)、(5) および (7) で架橋されたハイブリッドハイドロゲルは、MMP-9含有バッファーに浸漬すると、周囲の媒体へのPLGA粒子の放出が認められたことから、MMP-9により分解可能であることが確認された。興味深いことに、ペプチド (2)、(3) または (6) を用いて形成されたハイドロゲルは、MMP-9の存在下および非存在下のいずれの場合も、ハイブリッドハイドロゲルから放出された粒子の数が同様に無視できる程度であった(図示せず)ことから、MMP-9に接触させても切断されないことが確認された。これら3つの配列を有する基質が、抗腫瘍薬のプロテアーゼ活性化ナノキャリア[Samuelson, L. E. et al. Molecular Pharmaceutics 10 (8), 3164-3174 (2013)]または電気化学インピーダンスセンサ[Biela, A. et al. Biosensors and Bioelectronics 68, 660-667 (2015)]のMMP-9感受性部位として報告されていたことを考えると、この結果は驚くべきものであった。これは、基質を挟むスペーサーにより、ペプチド配列の立体構造が変化して、立体障害が生じ、それにより、プロテアーゼの基質の切断部位へのアクセスが妨げられたためではないかと考えられる。
効果的なプロテアーゼ誘導性薬物送達プラットフォームを設計するための最適なペプチド架橋剤は、速やかにゲル形成を誘導し、プロテアーゼによる切断性を保持するものでなければならない。スクリーニングに使用した8種類のペプチドのうち、3種類の配列(ペプチド (1)、(4) および (7);図14)は、試験に用いたいずれのバッファー中でも、MMP-9による速やかなゲル化とハイドロゲルの切断が確認された。我々は、17個のアミノ酸を含む配列GCRR-KGPRSLSGK-RRCG(配列番号18)を有するペプチド (1) とPBS/NaOHバッファーの組み合わせを選択して所望のハイブリッドハイドロゲルGEL-iPを調製し、その後の検討に使用した。
1.4 in vitroにおける薬物封入粒子含有ハイブリッドハイドロゲルの薬物放出動態に関する試験
このin vitro放出試験において、2種類のハイブリッドハイドロゲルの比較を行った。GEL-iPは、切断性ペプチド (1) GCRR-KGPRSLSGK-RRCG(配列番号18)で架橋されたハイドロゲルに、イブプロフェン担持PLGA粒子(ibu-PLGA粒子)が埋め込まれたものである。ScrGEL-iPは、非切断性スクランブルペプチドGCRR-KSSRGGPLK-RRCG(配列番号29)で架橋されたハイドロゲルに、ibu-PLGA粒子が埋め込まれたものである。簡単に説明すると、40μLのGEL-iPを1.5mLのチューブに入れて、3μg/mLのMMP-9含有またはMMP-9不含のPBS溶液500μLに浸漬し、40μLのscrGEL-iPをMMP-9含有PBS溶液のみに接触させた。GEL-iPを用いたコントロール実験として、MMP-9とともにMMP-9阻害剤I(Merck社)を加えたものを準備した。各チューブを、温度37℃、振とう速度30rpmに設定したMulti Bio RS-24ローテーター(BioSan社)にセットした。所定時間ごとに各チューブから10μLずつ液状混合物を採取し、90μLのアセトニトリルに加えた。得られたサンプルを0.22μmのシリンジフィルターに通し、4℃で保存した。各チューブに、3μg/mLのMMP-9含有またはMMP-9不含の新鮮なPBS溶液を10μLずつ加え、採取した量の補充を行った。24時間後、各ハイブリッドハイドロゲルと残りの液状混合物をアセトニトリルに完全に溶解させた。採取したすべてのサンプルにおいて、RP-HPLCによりイブプロフェンの濃度を定量した。各時点での薬物放出率は、各時点で採取された薬物の累積量を各チューブに含まれていた初めの薬物量で標準化することによって計算した[Dang, T. T. et al. Biomaterials 32 (19), 4464-4470 (2011)]。各ハイブリッドハイドロゲルの放出速度は、4回の反復実験の平均から得られたものである。
このin vitro放出試験において、2種類のハイブリッドハイドロゲルの比較を行った。GEL-iPは、切断性ペプチド (1) GCRR-KGPRSLSGK-RRCG(配列番号18)で架橋されたハイドロゲルに、イブプロフェン担持PLGA粒子(ibu-PLGA粒子)が埋め込まれたものである。ScrGEL-iPは、非切断性スクランブルペプチドGCRR-KSSRGGPLK-RRCG(配列番号29)で架橋されたハイドロゲルに、ibu-PLGA粒子が埋め込まれたものである。簡単に説明すると、40μLのGEL-iPを1.5mLのチューブに入れて、3μg/mLのMMP-9含有またはMMP-9不含のPBS溶液500μLに浸漬し、40μLのscrGEL-iPをMMP-9含有PBS溶液のみに接触させた。GEL-iPを用いたコントロール実験として、MMP-9とともにMMP-9阻害剤I(Merck社)を加えたものを準備した。各チューブを、温度37℃、振とう速度30rpmに設定したMulti Bio RS-24ローテーター(BioSan社)にセットした。所定時間ごとに各チューブから10μLずつ液状混合物を採取し、90μLのアセトニトリルに加えた。得られたサンプルを0.22μmのシリンジフィルターに通し、4℃で保存した。各チューブに、3μg/mLのMMP-9含有またはMMP-9不含の新鮮なPBS溶液を10μLずつ加え、採取した量の補充を行った。24時間後、各ハイブリッドハイドロゲルと残りの液状混合物をアセトニトリルに完全に溶解させた。採取したすべてのサンプルにおいて、RP-HPLCによりイブプロフェンの濃度を定量した。各時点での薬物放出率は、各時点で採取された薬物の累積量を各チューブに含まれていた初めの薬物量で標準化することによって計算した[Dang, T. T. et al. Biomaterials 32 (19), 4464-4470 (2011)]。各ハイブリッドハイドロゲルの放出速度は、4回の反復実験の平均から得られたものである。
図3に示すように、GEL-iPをMMP-9に4時間接触させると、MMP-9非存在下では薬物放出率がわずか25%であったのに対し、100%と有意に増加した。また、MMP-9とMMP-9阻害剤を併用すると、イブプロフェンの放出量が有意に抑制された。これは、MMP-9のタンパク質分解活性が、この低分子阻害剤によって選択的に阻害されたためである。よって、MMP-9は、ペプチド架橋剤を切断してハイドロゲルマトリックスを分解することができず、イブプロフェンの誘導放出が阻止された。さらに、GEL-iPはMMP-9の存在下、最初の4時間で完全に分解され、イブプロフェンが100%放出されたが、スクランブルペプチドで架橋されたハイブリッドハイドロゲル(scrGEL-iP)では同じ条件下でも40%しか放出されなかった。MMP-9存在下において、GEL-iPからのイブプロフェンの放出量がscrGEL-iPからの放出量よりも多かったことから、MMP-9によるGEL-iPの分解により薬物放出が誘導されるという切断性ペプチド (1) の機能が確認された。以上より、イブプロフェンの誘導放出は、MMP-9がその関連ペプチド基質を切断する活性によるものであることが図3のデータによって証明された。
薬物封入粒子含有ハイブリッドハイドロゲルのマクロファージに対するin vitro阻害作用の評価
MMP-9の作用によりGEL-iPから放出された薬物を、マウスマクロファージRAW264.7の増殖に対するin vitro阻害効果に基づいて評価した。これまでの研究から、動脈硬化や肥満による脂肪組織の炎症などの炎症関連疾患では、単球の動員よりもむしろ局所的なマクロファージの増殖が、細胞の病巣蓄積の中心をなしていることが明らかになっている[Amano, S. U. et al. (2014)]。そのため、マクロファージの自己複製は、炎症を治療的に調節するための標的として有望視されている。
MMP-9の作用によりGEL-iPから放出された薬物を、マウスマクロファージRAW264.7の増殖に対するin vitro阻害効果に基づいて評価した。これまでの研究から、動脈硬化や肥満による脂肪組織の炎症などの炎症関連疾患では、単球の動員よりもむしろ局所的なマクロファージの増殖が、細胞の病巣蓄積の中心をなしていることが明らかになっている[Amano, S. U. et al. (2014)]。そのため、マクロファージの自己複製は、炎症を治療的に調節するための標的として有望視されている。
マウスマクロファージRAW264.7を、10%FBS(Gibco Laboratories社)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco Laboratories社)を含む高グルコースDMEM(Gibco Laboratories社)で、37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。継代数20~30のマクロファージRAW264.7を96ウェルプレート(Corning(登録商標))に初期播種密度2×104個/ウェルで播種し、37℃で24時間インキュベートした。1.7% (w/v) のPEGと5% (w/v) のイブプロフェン担持PLGA微粒子で作製したハイブリッドハイドロゲル(GEL-iPおよびscrGEL-iP)100μLを、500μLのフェノールレッド不含DMEM(Gibco Laboratories社)培地中、3μg/mLのMMP-9の存在下または非存在下で2時間インキュベートした(図4A)。また、コントロールのハイブリッドハイドロゲルとして、イブプロフェン不含PLGA粒子を埋め込んだMMP-9切断性ハイドロゲル(GEL-P)も用意した。GEL-iPサンプルの1群において、インキュベーションの際にMMP-9とともにMMP-9阻害剤Iを添加した。インキュベーション後、各ハイブリッドハイドロゲル処方物から200μLの培養液を溶出液として採取し、播種したマクロファージRAW264.7にこの溶出液を加えて72時間処理を行った。また、ネガティブコントロールとして200μLの新鮮な培地を用いてマクロファージを処理し、ポジティブコントロールとして0.6mg/mLの遊離イブプロフェン溶液を用いてマクロファージを処理した。この遊離イブプロフェン溶液の投与量は、各ハイブリッドハイドロゲルに担持された薬物量で標準化した。その後、処理したマクロファージから溶出液を除去し、処理後の細胞のin vitro代謝活性をWST-1細胞増殖アッセイ(Abcam社)を用いてメーカーのプロトコルに従って評価した。具体的には、培地にWST-1試薬を10:1の体積比で加えたものを各ウェルに200μLずつ加え、37℃で3時間インキュベートした。この培養液の100μLを新しい96ウェルプレートに移し、450nmと690nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(SpectraMax M5)で記録した。相対代謝活性を計算するため、450nmの吸光度値から基準波長である690nmの吸光度値とバックグラウンドの吸光度値を差し引き、補正後の吸光度値を求めた。相対代謝活性は、以下の式により計算した。
相対的代謝活性=ATest/AControl×100%
ここで、ATestとAControlは、溶出液で処理した細胞と新鮮な培地で処理した細胞からそれぞれ採取した液の補正後の吸光度値である。
相対的代謝活性=ATest/AControl×100%
ここで、ATestとAControlは、溶出液で処理した細胞と新鮮な培地で処理した細胞からそれぞれ採取した液の補正後の吸光度値である。
図4Bに示すように、GEL-iPをMMP-9で分解して得られた溶出液はマクロファージの増殖を完全に阻害した(約0%)が、MMP-9非存在下のGEL-iPから得られた溶出液で処理した細胞の代謝活性はそれより高かった(約40%)。このデータから、GEL-iPを3μg/mLの濃度のMMP-9(慢性疾患における炎症の増大によるプロテアーゼ発現上昇を模したもの[Ladwig, G. P. et al. Wound Repair and Regeneration 10(1) 26-37 (2002); Li, Z. et al. (2013)])で刺激することにより、イブプロフェンの放出量が増え、マクロファージの増殖がより強く抑制されたことが示唆される。さらに、MMP-9非存在下でGEL-iPから得られた溶出液で処理したマクロファージの代謝活性(約40%)は、同量の遊離薬物の溶液で処理した場合(全身投与による非制御の薬物送達を模したもの)のマクロファージの代謝活性(約0%)よりも有意に高かった。このように、非炎症の生理的条件を再現したMMP-9非存在下[Roomi, M. W. et al. (2009)]では、GEL-iPが放出できるイブプロフェンの量は、遊離イブプロフェン溶液に含まれる薬物量よりも少なく、マクロファージに対する薬物の作用は最小限に抑えられていた。GEL-iPのこの特徴は、薬物を全身投与した際に放出速度が制御されていないことで起こる過剰投薬[Youssef, J. et al. Rheumatic diseases clinics of North America 42(1) 157-176 (2016)]を軽減し、非炎症性疾患における薬物誘発性副作用を緩和できる可能性を示唆するものである。
また、MMP-9阻害剤を一緒に加えた場合、マクロファージの代謝活性は、MMP-9阻害剤非存在下で見られた完全に阻害されたレベル(約0%)から20%まで回復したことから、溶出液のマクロファージに対する望ましい阻害効果を得るためには、活性状態のMMP-9が必須であることが証明された。MMP-9の存在下では、GEL-iPから放出されたイブプロフェンによりマクロファージの増殖は完全に阻害されたが、非切断性scrGEL-iPからの溶出液で処理したマクロファージでは55%の代謝活性が残っていた。MMP-9阻害剤とscrGEL-iPを用いたコントロール実験から得られた結果から、GEL-iPからイブプロフェンを放出させてマクロファージの増殖を調節する上で、活性状態のMMP-9とそれに関連する切断性ペプチドの両方が重要な役割を担っていることがわかった。以上のことから、GEL-iPは、プロテアーゼ活性に応答して抗炎症剤を放出し、免疫細胞の活性を調節することができる有望な薬物送達プラットフォームであると言える。
我々の主たる目的は、プロテアーゼ活性のみに応答して薬物を放出し、この刺激がない場合には放出量が最小限に抑えられる送達プラットフォームの開発であったが、MMP-9非存在下でのGEL-iPからのイブプロフェンの基礎放出量について、いくつかの懸念が残されていることは否めない。これはibu-PLGA微粒子の表面からの受動的な薬物拡散によるものと考えられ、MMP-9もMMP-9阻害剤も存在しない条件下でGEL-iPからの溶出液で処理したマクロファージが部分的(約40%)に阻害されたという結果によって説明される。しかし、抗炎症剤の投与が必要とされる実際の臨床現場では、ある程度の炎症が存在している場合が多い。したがって、この薬物の基礎放出は、低レベルの炎症および痛みや腫れなどの関連症状の管理に有用であり[Steinmeyer, J. (2000)]、それにより炎症反応の増悪を最小限に抑えることができる[Sutherland, E. R. et al. (2003)]と考えられる。関節炎の再燃や慢性創傷の感染症のように、炎症が急に悪化してMMP-9活性が上昇した場合は、GEL-iPからのイブプロフェンの放出量が増えるため、重症化した炎症に対処することができる。
実施例2
プロテアーゼ応答性を有する薬物封入粒子含有ハイブリッドハイドロゲルのin vivo評価
2.1 免疫適格性SKH-1マウスの管理
GEL-iPの皮下注射用薬物送達プラットフォームとしての適用可能性をさらに評価するため、GEL-iPおよびその構成材料のin vivoにおける免疫適合性を評価した。免疫適格性マウスモデルSKH-1Eを用いて、GEL-iPの構成材料が皮下の宿主反応に及ぼす影響を最大5日間にわたって調べた(図5)。この試験は、シンガポールの南洋理工大学(NTU)の「動物の管理と使用に関する委員会(IACUC)」で承認された動物実験プロトコル(プロトコル番号A0343)に従って実施した。すべての動物実験は、国立衛生研究所(NIH)による「実験動物の管理と使用に関する指針(NIH公報第8023号、1978改定)」に準拠した「実験動物を用いた研究に関する国立諮問委員会(NACLAR)」に従って実施した。Charles River Laboratories社(マサチューセッツ州ウィルミントン、米国)から繁殖用マウスを購入し、NTUの施設内で10週齢の雌性SKH-1Eマウス(F1)を飼育した。マウスの飼育は、NTUのリーコンチェン医学部の動物施設において、12時間の明暗サイクルの標準的な条件下で行った。水と餌は自由摂取とした。
プロテアーゼ応答性を有する薬物封入粒子含有ハイブリッドハイドロゲルのin vivo評価
2.1 免疫適格性SKH-1マウスの管理
GEL-iPの皮下注射用薬物送達プラットフォームとしての適用可能性をさらに評価するため、GEL-iPおよびその構成材料のin vivoにおける免疫適合性を評価した。免疫適格性マウスモデルSKH-1Eを用いて、GEL-iPの構成材料が皮下の宿主反応に及ぼす影響を最大5日間にわたって調べた(図5)。この試験は、シンガポールの南洋理工大学(NTU)の「動物の管理と使用に関する委員会(IACUC)」で承認された動物実験プロトコル(プロトコル番号A0343)に従って実施した。すべての動物実験は、国立衛生研究所(NIH)による「実験動物の管理と使用に関する指針(NIH公報第8023号、1978改定)」に準拠した「実験動物を用いた研究に関する国立諮問委員会(NACLAR)」に従って実施した。Charles River Laboratories社(マサチューセッツ州ウィルミントン、米国)から繁殖用マウスを購入し、NTUの施設内で10週齢の雌性SKH-1Eマウス(F1)を飼育した。マウスの飼育は、NTUのリーコンチェン医学部の動物施設において、12時間の明暗サイクルの標準的な条件下で行った。水と餌は自由摂取とした。
2.2 ポリマー微粒子の皮下注射
マウスに材料を皮下注射する前に、3%イソフルラン含有酸素を吸入させて麻酔状態を維持した。6種類の材料処方物を、各マウスの背側にアレイ状に皮下注射した。具体的には、ibu-PLGA粒子(50mg/mL)、イブプロフェン不含の空のPLGA粒子(50mg/mL)、または1% (w/v) アルギン酸塩ハイドロゲル(PRONOVATM SLG20、FMC BioPolymer社)をそれぞれ含むPBSバッファー50μLを注射した。また、GEL-iP、GEL-P、またはPLGA粒子不含の、ペプチド (1)(GCRR-KGPRSLSGK-RRCG;配列番号18)で架橋されたPEGハイドロゲル(PEGゲル)などの各ハイドロゲル処方物に関しては、それぞれ前駆体を含む溶液50μLを注射した。例えば、PEG-VS、ペプチド架橋剤、およびibu-PLGA粒子を含むPBS/NaOHバッファー50μLをマウス背部に皮下投与することにより、GEL-iPのin situでの形成を誘導した。
マウスに材料を皮下注射する前に、3%イソフルラン含有酸素を吸入させて麻酔状態を維持した。6種類の材料処方物を、各マウスの背側にアレイ状に皮下注射した。具体的には、ibu-PLGA粒子(50mg/mL)、イブプロフェン不含の空のPLGA粒子(50mg/mL)、または1% (w/v) アルギン酸塩ハイドロゲル(PRONOVATM SLG20、FMC BioPolymer社)をそれぞれ含むPBSバッファー50μLを注射した。また、GEL-iP、GEL-P、またはPLGA粒子不含の、ペプチド (1)(GCRR-KGPRSLSGK-RRCG;配列番号18)で架橋されたPEGハイドロゲル(PEGゲル)などの各ハイドロゲル処方物に関しては、それぞれ前駆体を含む溶液50μLを注射した。例えば、PEG-VS、ペプチド架橋剤、およびibu-PLGA粒子を含むPBS/NaOHバッファー50μLをマウス背部に皮下投与することにより、GEL-iPのin situでの形成を誘導した。
2.3 SKH-1Eマウスの非侵襲生物発光イメージング
活性酸素種(ROS)活性は、他の研究で報告されている方法と同様にして、ROSにより酸化され生物発光シグナルを発するルミノールを用いて定量化した[Liu, W. F. et al. Biomaterials 32 (7), 1796-1801 (2011)]。簡単に説明すると、イメージング前に、100μLのPBSに溶解した5mgのルミノールナトリウム(Sigma Aldrich社、ミズーリ州セントルイス、米国)をマウスの腹腔内に注射した。注射から20分後に、IVIS Spectrum CTシステム(Caliper Life Sciences社)で180秒間露光してマウスの撮影を行った。Living Image 3.1 ソフトウェアを使用して、注射部位の周囲の関心領域(ROI)(cm2)の全放射束(光子/秒)を測定した。
活性酸素種(ROS)活性は、他の研究で報告されている方法と同様にして、ROSにより酸化され生物発光シグナルを発するルミノールを用いて定量化した[Liu, W. F. et al. Biomaterials 32 (7), 1796-1801 (2011)]。簡単に説明すると、イメージング前に、100μLのPBSに溶解した5mgのルミノールナトリウム(Sigma Aldrich社、ミズーリ州セントルイス、米国)をマウスの腹腔内に注射した。注射から20分後に、IVIS Spectrum CTシステム(Caliper Life Sciences社)で180秒間露光してマウスの撮影を行った。Living Image 3.1 ソフトウェアを使用して、注射部位の周囲の関心領域(ROI)(cm2)の全放射束(光子/秒)を測定した。
これとは別の予備実験において、注射から15分後に切除した皮膚の皮下腔に架橋ハイドロゲルが存在した(図17)ことから、in situでゲルが形成されることが確認された。また、GEL-iPの構成材料の影響を評価するために、ibu-PLGA粒子およびイブプロフェン不含PLGA粒子についても検討を行った。さらに、マウスでの皮下免疫適合性が既に報告されている、カルシウムで架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲル(アルギン酸塩ゲル)[Liu, W. F. et al. Biomaterials 32 (7), 1796-1801 (2011)]をネガティブコントロールとして使用した。
in vitroおよびin vivoの複数の研究において、材料による宿主応答の特性を明らかにするために、活性化した食細胞から産生される活性酸素種(ROS)の活性の定量が行われている[Dang, T. T. et al. Biomaterials 34 (23), 5792-5801 (2013); Dang, T. T. et al. Biomaterials 2011, 32 (19), 4464-4470 (2011)]。我々は、この実験において、非侵襲イメージング技術を用い、材料の注射後1、3、5日目に、材料注射部位におけるROSによるルミノールイメージングプローブの酸化により放出される生物発光シグナルを定量化した(図5A)[Dang, T. T. et al. Biomaterials 34 (23), 5792-5801 (2013); Dang, T. T. et al. Biomaterials 32 (19), 4464-4470 (2011); Liu, W. F. et al. Biomaterials 32 (7), 1796-1801 (2011)]。図5Bは、3日目の代表的なマウスの生物発光画像、図5Cは、5日間にわたり各種材料処方物により誘導されたROS活性の定量結果である。PLGA粒子不含のペプチド架橋PEGゲルにより誘導されたROS活性は、1日目においてアルギン酸塩ゲルと同程度であったことから、PEGゲルの皮下腔における免疫親和性が確認された。このデータから、PEGゲルの調製において、前駆体溶液のバッファーとしてPBS/NaOHを選択しても、免疫細胞によるROS産生に悪影響がないことが確認された。さらに、5日目には、切除した皮膚の皮下腔にあった架橋PEGゲルが消失していたことから、PEGゲルは完全に分解されたことが示唆される(図18)。興味深いことに、PLGA含有処方物により発生したROSは、いずれの場合も、PLGA不含のPEGゲルやアルギン酸塩ゲルより高いレベルであった。PLGAは薬物送達用途における使用がFDAによっていくつか承認されているが[Han, F. Y. et al. Frontiers in pharmacology 7, 185-185 (2016)]、この実験で観察されたように、PLGAが有する疎水性が急性炎症[Seong, S.-Y. and Matzinger, P. (2004)]およびそれに関連するROS活性の増大[Dang, T. T. et al. Biomaterials 34 (23), 5792-5801 (2013)]を招いた可能性がある。しかし、このPLGAに関連したROS活性は1日目に見られたが、5日目には最終的にコントロールの皮膚と同じバックグラウンドレベルまで低下した。このことから、PLGAによるROS活性の上昇は一過性であることが示唆された。したがって、PLGAも、SKH-1Eマウスの皮下腔において免疫適合性を有すると考えられる。以上のことから、GEL-iPの構成材料であるPEGハイドロゲルとPLGA粒子は、ハイブリッドハイドロゲルの設計において適切な免疫適合性材料であることが示唆された。さらに、我々が選択した生物オルトゴナル反応を利用した化学ゲル化戦略とバッファーによる有害なROS活性の増大は確認されなかった。
実施例3
マルチ応答性を有するプロテアーゼ切断性の粒子含有ハイドロゲル
我々は、マルチ応答性を有するプロテアーゼ切断性の粒子含有プハイドロゲルが、複数種の疾患特異的プロテアーゼの共存下において最も速く分解され、炎症性疾患に対して高い標的特異性を示すことを明らかにした。典型的な例を挙げると、HNEペプチド基質(H2)とMMP-9ペプチド基質(M2)の組み合わせ(表4)で架橋されたH2-M2組み合わせハイドロゲルは、1種類のプロテアーゼのみ、すなわちHNEのみまたはMMP-9のみに接触させても、分解されないままであったが、両方のプロテアーゼを加えると、完全に分解された(図6A)。また、上清中のPLGA粒子の平均数を求め、一元配置分散分析を行った結果からも、1種類のプロテアーゼの存在下とコントロール条件下のハイドロゲルより、2種類のプロテアーゼの存在下のハイドロゲルから放出された粒子数が有意に多い(p<0.001)ことが示された(図6B)。さらに、H2ペプチド基質は、HNEプロテアーゼによって優先的に切断され、M2ペプチド基質は、MMP-9プロテアーゼによって優先的に切断されることも示された。
マルチ応答性を有するプロテアーゼ切断性の粒子含有ハイドロゲル
我々は、マルチ応答性を有するプロテアーゼ切断性の粒子含有プハイドロゲルが、複数種の疾患特異的プロテアーゼの共存下において最も速く分解され、炎症性疾患に対して高い標的特異性を示すことを明らかにした。典型的な例を挙げると、HNEペプチド基質(H2)とMMP-9ペプチド基質(M2)の組み合わせ(表4)で架橋されたH2-M2組み合わせハイドロゲルは、1種類のプロテアーゼのみ、すなわちHNEのみまたはMMP-9のみに接触させても、分解されないままであったが、両方のプロテアーゼを加えると、完全に分解された(図6A)。また、上清中のPLGA粒子の平均数を求め、一元配置分散分析を行った結果からも、1種類のプロテアーゼの存在下とコントロール条件下のハイドロゲルより、2種類のプロテアーゼの存在下のハイドロゲルから放出された粒子数が有意に多い(p<0.001)ことが示された(図6B)。さらに、H2ペプチド基質は、HNEプロテアーゼによって優先的に切断され、M2ペプチド基質は、MMP-9プロテアーゼによって優先的に切断されることも示された。
実施例4
プロテアーゼ応答性を有する薬物封入粒子含有ハイブリッドハイドロゲルを含む複合被覆材の作製
3.1 in vitroにおける複合被覆材の薬物放出動態に関する試験
この薬物送達プラットフォームの外用適用への汎用性を示すために、ハイブリッドハイドロゲルGEL-iPをカルトスタット(登録商標)創傷被覆材に組み込んだ複合被覆材を作製した(図7A)。この複合被覆材は、慢性創傷の滲出液のMMP-9レベルの上昇[Ladwig, G. P. et al. Wound Repair and Regeneration 10(1) 26-37 (2002); Li, Z. et al. Journal of Diabetes and its Complications 27(4) 380-382 (2013)]によりイブプロフェンの放出を誘導させて(図7B)、炎症および疼痛の管理を行うことを最終的な目的とするものである。複合被覆材を作製するために、まず、ペプチド (1)(GCRR-KGPRSLSGK-RRCG;配列番号18)とPEG-VSをそれぞれ別々に、5% (w/v) のibu-PLGA粒子を懸濁したPBS/NaOHバッファーに溶解した。これら2つの前駆体を混合し、20μLの前駆体混合物を、アルギン酸塩創傷被覆材カルトスタット(登録商標)の直径6mmの円形状シートに速やかに付着させた(図7A)。ゲル化後、得られた複合被覆材を液体窒素中で瞬間凍結し、凍結乾燥させた。2種類の複合被覆材をin vitro放出試験で比較した。簡単に説明すると、20μLのGEL-iPを含む複合被覆材を1.5mLのチューブに入れて、3μg/mLのMMP-9含有PBS溶液500μLに浸漬し、もう一つの被覆材をMMP-9不含PBS溶液に接触させた。
プロテアーゼ応答性を有する薬物封入粒子含有ハイブリッドハイドロゲルを含む複合被覆材の作製
3.1 in vitroにおける複合被覆材の薬物放出動態に関する試験
この薬物送達プラットフォームの外用適用への汎用性を示すために、ハイブリッドハイドロゲルGEL-iPをカルトスタット(登録商標)創傷被覆材に組み込んだ複合被覆材を作製した(図7A)。この複合被覆材は、慢性創傷の滲出液のMMP-9レベルの上昇[Ladwig, G. P. et al. Wound Repair and Regeneration 10(1) 26-37 (2002); Li, Z. et al. Journal of Diabetes and its Complications 27(4) 380-382 (2013)]によりイブプロフェンの放出を誘導させて(図7B)、炎症および疼痛の管理を行うことを最終的な目的とするものである。複合被覆材を作製するために、まず、ペプチド (1)(GCRR-KGPRSLSGK-RRCG;配列番号18)とPEG-VSをそれぞれ別々に、5% (w/v) のibu-PLGA粒子を懸濁したPBS/NaOHバッファーに溶解した。これら2つの前駆体を混合し、20μLの前駆体混合物を、アルギン酸塩創傷被覆材カルトスタット(登録商標)の直径6mmの円形状シートに速やかに付着させた(図7A)。ゲル化後、得られた複合被覆材を液体窒素中で瞬間凍結し、凍結乾燥させた。2種類の複合被覆材をin vitro放出試験で比較した。簡単に説明すると、20μLのGEL-iPを含む複合被覆材を1.5mLのチューブに入れて、3μg/mLのMMP-9含有PBS溶液500μLに浸漬し、もう一つの被覆材をMMP-9不含PBS溶液に接触させた。
形成直後の複合被覆材は、前駆体混合物に由来する水分で飽和していたため、それ以上液体を吸収する能力は著しく低かった。そこで、この複合被覆材を凍結乾燥させ、吸収性を回復させた。この被覆材をMMP-9含有またはMMP-9不含のバッファー溶液に24時間浸漬してMMP-9に接触させたときのイブプロフェン放出能について調べた。24時間のインキュベーションにより、複合被覆材は急速にバッファーを吸収し、MMP-9存在下では担持したイブプロフェンをほぼ100%放出したのに対し、MMP-9非存在下での放出率は56%どまりであった(図7C)。このことから、ハイブリッドハイドロゲルGEL-iPは、注射剤(図5)だけでなく、外用(図7)にも適用可能性のある、汎用的な誘導型薬物放出プラットフォームであることが分かった。
実施例5
単種または複数種のプロテアーゼに対して応答性を有するモジュール式結合体型ハイドロゲル
5.1 薬物とプロテアーゼ感受性ペプチドアンカーとの結合
我々は、新たなイブプロフェン-ペプチド結合体の合成と精製のための堅牢なプロセスを開発した。このプロセスのフローチャートを図8Aに示す。方法を簡単に説明すると以下の通りである。
単種または複数種のプロテアーゼに対して応答性を有するモジュール式結合体型ハイドロゲル
5.1 薬物とプロテアーゼ感受性ペプチドアンカーとの結合
我々は、新たなイブプロフェン-ペプチド結合体の合成と精製のための堅牢なプロセスを開発した。このプロセスのフローチャートを図8Aに示す。方法を簡単に説明すると以下の通りである。
第1に、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)であるイブプロフェンを、固相ペプチド合成(SPPS)により、ペプチド配列GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)のN末端に結合させてibu-GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)を調製した。具体的には以下の通りである。Fmocで保護されたペプチドを、Rinkアミド樹脂上に、0.3mmol/gのスケールで、標準的な固相ペプチド合成法により手動で合成した。このペプチドをイブプロフェンと結合させる前に、20%ピペリジンを用いて、Fmoc保護基を除去した。次に、Fmocを除去した樹脂50mgをイブプロフェン9.28mgとともに500μLのDMFに分散させた。この樹脂分散液に、DMFに溶解した1M PyBOP溶液34.2μLとDIPEA 6μLを加えて、反応を開始させた。18時間後、樹脂をDMFで洗浄した後、ジクロロメタン(DCM)で数回洗浄した。次に、樹脂を、95%トリフルオロ酢酸、2.5%水、および2.5%トリイソプロピルシラン(TIPS)を含む切断用カクテルを用いて室温で60分間処理し、ibu-GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)を樹脂から切断した。生成物を冷却したエーテルで沈殿させた後、真空下で乾燥させた。このペプチドと薬物の結合体の同一性はMSで確認した(MS m/z:731.35 [M+2H]2+)。LC-MSデータから、ibu-GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)の実測分子量がChemDraw(登録商標)による理論予測値と一致した(図8B)ため、目的の薬物がペプチド配列GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)のN末端に正常に結合されたことが確認された。
第2に、ibu-GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)を、以下の手順でハイドロゲルに結合させた。4アームポリ(エチレングリコール)-マレイミド(4-PEG-Mal)(20kDa、Sigma Aldrich社、ミズーリ州セントルイス、米国)をまずibu-GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)とモル比1/1で反応させた。次に、(4-PEG-Malのマレイミド基の一部はibu-GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)と結合しているが)4-PEG-Malに対して化学量論比のビスシステインペプチド(Genscript社、香港)を反応混合物に添加した。各前駆体はPBSバッファーに溶解して使用した。典型的な例を挙げると、PEG含量4.2% (w/v) のペプチド架橋ハイドロゲル117μLを調製するために、5mgの4-PEG-Malを、0.40mgのibu-GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)とともにガラスバイアルに入れて、100μLのPBSに溶解した。次に、この溶液に、17μLのPBSに溶解した化学量論量のペプチド架橋剤を加えた。
図8Cの模式図に示すように、ビスシステインMMP-9感受性ペプチド架橋剤(GCRDGPQGIWGQDRCG;配列番号22)を、4アームPEG-マレイミドとibu-GPQGIWGQ-DRCG(配列番号19)の混合物を含むバッファー溶液に添加することにより、架橋ハイドロゲルが形成された。この架橋ハイドロゲルは、重力を受けても下方に流れなかった。
図9は、イブプロフェン結合PEGハイドロゲルを、1μg/mLという臨床的に関連のある濃度のプロテアーゼに接触させることにより、プロテアーゼ感受性の薬物放出を実現できるという仮説を裏付けるものである。図9Aは、3日後に架橋ハイドロゲルが完全に分解されたことを示している。LC-MS分析により、ハイドロゲルをMMP-9溶液に2日間接触させた後に採取した上清中に、遊離したイブプロフェン担持フラグメント(ibu-GPQG、溶出時間14.6分のLCピーク、m/z=546.20のMSピーク)が存在することが確認された(図9B)。一方、ハイドロゲルをMMP-9不含のコントロールバッファーに接触させた後に採取した上清には同様のピークは見られなかった。ヒト創傷液中の活性状態のMMP-9の濃度は0.3~4.8μg/mLである[29-31]ことから、図10Aのデータは臨床的に関連のあるプロテアーゼ濃度で薬物放出が可能であることを裏付けるものである。さらに、図10Bに示すように、スペーサーとしてのペプチド配列GPRSLSGRRCG(配列番号20)は、カテプシンBやヒト好中球エラスターゼ(HNE)よりもMMP-9に対して高い特異性を有している。
第3に、チオールを含むペプチドを用いて、4-PEG-Malにマイケル付加を行うことにより、複数種のプロテアーゼに対して切断性を有するハイドロゲルを調製した。具体的には、5mgの4-PEG-Malを100μLのPBSバッファーに溶解し、この溶液を17μLのペプチド配列の組み合わせ、例えば、0.005mgのGRCR-PMAVVQSVP-RCRG(配列番号31)と0.0045mgのGRCR-GPRSLSG-RCRG(配列番号32)と反応させて、4.2% (w/v) 4-PEG-Mal含有ゲル117μLを調製した。
5.2 in vitroにおける結合体型ハイドロゲルからの薬物放出の調整可能性
図11Aおよび11Bに示す高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で測定した定量的データから、ビスシステイン架橋剤またはアンカーの選択を変更することにより、薬物結合ハイドロゲルからの薬物放出を調整できる可能性が示唆された。具体的には、図11Aを見ると、同じアンカーHを用いた場合、架橋剤をペプチドxM(GCRR-GPRSLSG-RRCG、配列番号21)からペプチドxH(GCRD-GPQGIWGQ-DRCG、配列番号22)に変更すると累積薬物放出率が低下していることがわかる。また、図11Bを見ると、同じ架橋剤xH(GCRD-GPQGIWGQ-DRCG、配列番号22)を用いた場合、アンカーをペプチドH(GPQGIWGQ-DRCG、配列番号19)からペプチドM(GPRSLSG-RRCG、配列番号20)に変更すると累積薬物放出率が低下していることがわかる。図11Cに示すように、ハイドロゲルの重量比を3w/v%から10w/v%まで漸増させると、担持量が増加し、総担持量を調整できることが確認された。また、8アームPEG-マレイミドは、4アームPEG-マレイミドよりも多くのイブプロフェンを担持できることもわかった。
図11Aおよび11Bに示す高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で測定した定量的データから、ビスシステイン架橋剤またはアンカーの選択を変更することにより、薬物結合ハイドロゲルからの薬物放出を調整できる可能性が示唆された。具体的には、図11Aを見ると、同じアンカーHを用いた場合、架橋剤をペプチドxM(GCRR-GPRSLSG-RRCG、配列番号21)からペプチドxH(GCRD-GPQGIWGQ-DRCG、配列番号22)に変更すると累積薬物放出率が低下していることがわかる。また、図11Bを見ると、同じ架橋剤xH(GCRD-GPQGIWGQ-DRCG、配列番号22)を用いた場合、アンカーをペプチドH(GPQGIWGQ-DRCG、配列番号19)からペプチドM(GPRSLSG-RRCG、配列番号20)に変更すると累積薬物放出率が低下していることがわかる。図11Cに示すように、ハイドロゲルの重量比を3w/v%から10w/v%まで漸増させると、担持量が増加し、総担持量を調整できることが確認された。また、8アームPEG-マレイミドは、4アームPEG-マレイミドよりも多くのイブプロフェンを担持できることもわかった。
5.3 in vivoにおいて炎症により誘導される結合体型ハイドロゲルからの薬物放出
我々は、この薬物結合プラットフォームからの薬物放出が、in vivoでの炎症の増大に応じて、高用量の薬物を放出できるものであることを示唆する予備データも得た。我々は、MMPの発現を上昇させることができる刺激剤として、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)を用いて、皮膚炎症マウスモデルを作製した(図12A)。MMPの上昇は、MMPSenseプローブを用いて検出した。PMA注射から24時間後の注射部位では、赤い部分が認められ、この赤い部分の程度とPMAの注射量の増加には関連があった(図12B)。具体的には、4μgのPMAでは0.4μgのPMAの場合よりも大きく鮮明な赤みが生じ、PMA不含のPBSバッファーの場合は皮膚外観に変化は見られなかった。PMA注射から24時間後のMMP活性をモニターし、蛍光シグナルを定量したところ、0.4μgのPMAで誘導されたMMP活性と、4μgのPMAで誘導されたMMP活性とでは1.9倍の差があり、4μgのPMAで誘導されたMMP活性が有意に高いことがわかった(図12Cおよび12D)。また、PMA不含のPBSバッファーの注射部位の蛍光シグナルは最も低く、MMP量のベース値が確認された。このように、皮下注射したPMAの量が多いほど、蛍光強度が増大し、さらに重要なことに、このシグナル強度の増大と、マウスの背側の赤い部分の程度には相関が見られた。また、タンパク質の発現を調べるために、PMA注射部位の皮膚組織を採取し、ELISAキットを用いてMMP-9の定量を行った(図12E)。MMP-9の発現上昇傾向は、異なる濃度のPMAを注射して誘導された炎症の重症度と相関していることが確認された。具体的には、4μgのPMAと、0.4μg、0μgのPMAとでは、誘導されるMMP-9の分泌量にそれぞれ5倍、10倍の差があり、4μgのPMAにより誘導されたMMP-9の分泌量は有意に多かった。以上のことから、PMAの皮下注射量が多いほど、誘導される皮下炎症が重症化し、MMP-9の分泌量が多くなることがわかった。
我々は、この薬物結合プラットフォームからの薬物放出が、in vivoでの炎症の増大に応じて、高用量の薬物を放出できるものであることを示唆する予備データも得た。我々は、MMPの発現を上昇させることができる刺激剤として、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)を用いて、皮膚炎症マウスモデルを作製した(図12A)。MMPの上昇は、MMPSenseプローブを用いて検出した。PMA注射から24時間後の注射部位では、赤い部分が認められ、この赤い部分の程度とPMAの注射量の増加には関連があった(図12B)。具体的には、4μgのPMAでは0.4μgのPMAの場合よりも大きく鮮明な赤みが生じ、PMA不含のPBSバッファーの場合は皮膚外観に変化は見られなかった。PMA注射から24時間後のMMP活性をモニターし、蛍光シグナルを定量したところ、0.4μgのPMAで誘導されたMMP活性と、4μgのPMAで誘導されたMMP活性とでは1.9倍の差があり、4μgのPMAで誘導されたMMP活性が有意に高いことがわかった(図12Cおよび12D)。また、PMA不含のPBSバッファーの注射部位の蛍光シグナルは最も低く、MMP量のベース値が確認された。このように、皮下注射したPMAの量が多いほど、蛍光強度が増大し、さらに重要なことに、このシグナル強度の増大と、マウスの背側の赤い部分の程度には相関が見られた。また、タンパク質の発現を調べるために、PMA注射部位の皮膚組織を採取し、ELISAキットを用いてMMP-9の定量を行った(図12E)。MMP-9の発現上昇傾向は、異なる濃度のPMAを注射して誘導された炎症の重症度と相関していることが確認された。具体的には、4μgのPMAと、0.4μg、0μgのPMAとでは、誘導されるMMP-9の分泌量にそれぞれ5倍、10倍の差があり、4μgのPMAにより誘導されたMMP-9の分泌量は有意に多かった。以上のことから、PMAの皮下注射量が多いほど、誘導される皮下炎症が重症化し、MMP-9の分泌量が多くなることがわかった。
in vivoにおいて炎症により誘導されるイブプロフェン結合PEGハイドロゲルからの薬物放出を調べるために、SKH-1Eマウス背側の炎症部位の皮下腔に、当該ハイドロゲルの前駆体溶液を注射してibu-M_xMハイドロゲルをin situで形成させた(図13A)。前日に誘発させた3段階の炎症のいずれかによって薬物放出を誘導し、ハイドロゲル注射から12時間後のゲル塊内のibu-Mfの残存量から薬物放出率を算出した。図13Bでは、PMAを使用していない注射部位のハイドロゲルが無色透明であるのに対し、4μgのPMAの注射部位では境界が不明瞭で黄色く見える。図13Cは、0.4μgのPMAとPMA不含のPBSバッファーに接触させたゲルからは、それぞれ薬物の60%と45%が放出されたのに対し、4μgのPMAに接触させたゲルからはibu-Mfの70%が放出されたことを示している。このように、ibu-Mfの放出量は炎症の重症度と正の相関があり、in vivoにおけるプロテアーゼ誘導性の放出メカニズムが確認された。さらに、PMA不含でも薬物の45%が放出されたのは、PMAとハイドロゲル投与時の注射操作により、MMP-9分泌量の増加を伴う軽度の炎症が誘導されたため、結果としてibu-Mfの放出が起こったものと考えられる。このように、このハイドロゲルの構成は、軽度の炎症に対しても感受性を示すことがわかった。このハイドロゲルのプロテアーゼ感受性は、ペプチドアンカーおよび/または架橋剤を変更することで調節可能であると考えられる。以上のことから、薬物結合PEGハイドロゲルは、炎症の重症度が高いほど多くの量の薬物を放出することができるものであり、炎症の重症度の違いに対処できる可能性が示唆された。
統計解析
すべての統計解析とグラフ作成は、OriginPro 2017を用いて行った。2つの実験群間の比較はすべて、Welchのt検定(両側検定)で行い、2群より多い群間の比較は、一元配置分散分析と、Fisher LSD法による事後検定で行った。P値が0.05未満の場合は有意性ありと判断した。
すべての統計解析とグラフ作成は、OriginPro 2017を用いて行った。2つの実験群間の比較はすべて、Welchのt検定(両側検定)で行い、2群より多い群間の比較は、一元配置分散分析と、Fisher LSD法による事後検定で行った。P値が0.05未満の場合は有意性ありと判断した。
実施例6
in vitroにおいて複数種のプロテアーゼの作用により誘導されるモジュール式結合体型ハイドロゲルからの薬物放出
典型的な例として、以下の手順で20μLのデュアルプロテアーゼ応答性のモジュール式結合体型ハイドロゲルを調製した。まず、10mgの8アームPEG-マレイミド(8-PEG-MAL、40kDa)を0.5mLのエッペンドルフチューブに入れて、98.33μLのPBSバッファー溶液に溶解した。0.17mgのMMP-9感受性ペプチド(GPRSLSG-RRCG;配列番号20)を連結したイブプロフェン(Mibu、1332.7mmol/mg)を1.67μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、この溶液を8-PEG-MAL溶液と1:2の化学量論比で混合した。その後、1.62mgのMMP-9分解性ペプチド架橋剤(GCRR-GPRSLSG-RRCG;配列番号21)と1.87mgのHNE分解性ペプチド架橋剤(GRCR-PMAVVQSVP-RCRG;配列番号31)をそれぞれ別々に17μLのPBSバッファー溶液に溶解して、これらを1:1の化学量論比で混合した。そして、8-PEG-MALとMibuの混合物を2種類のペプチド架橋剤の混合物と4:1の化学量論比で反応させて、PEG-ペプチドハイドロゲルを調製した。最終的に得られたハイドロゲル溶液をボルテックスと遠心分離を3秒ずつ行って均質化した。架橋時間は、混合開始時間から自由流動性のある溶液が観察されなくなるまでの時間として計測した。また、ハイドロゲルをはじいて、室内光の下で観察した。ハイドロゲルの入ったチューブを強くはじいたときに、透明のハイドロゲルが崩壊せずにチューブの底に付着したままで、内部に気泡が生じていなければ、ハイドロゲルが形成されたと判断した。このハイドロゲルを、その後のすべてのin vitroでのゲル分解実験および薬物放出実験に使用した。
in vitroにおいて複数種のプロテアーゼの作用により誘導されるモジュール式結合体型ハイドロゲルからの薬物放出
典型的な例として、以下の手順で20μLのデュアルプロテアーゼ応答性のモジュール式結合体型ハイドロゲルを調製した。まず、10mgの8アームPEG-マレイミド(8-PEG-MAL、40kDa)を0.5mLのエッペンドルフチューブに入れて、98.33μLのPBSバッファー溶液に溶解した。0.17mgのMMP-9感受性ペプチド(GPRSLSG-RRCG;配列番号20)を連結したイブプロフェン(Mibu、1332.7mmol/mg)を1.67μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、この溶液を8-PEG-MAL溶液と1:2の化学量論比で混合した。その後、1.62mgのMMP-9分解性ペプチド架橋剤(GCRR-GPRSLSG-RRCG;配列番号21)と1.87mgのHNE分解性ペプチド架橋剤(GRCR-PMAVVQSVP-RCRG;配列番号31)をそれぞれ別々に17μLのPBSバッファー溶液に溶解して、これらを1:1の化学量論比で混合した。そして、8-PEG-MALとMibuの混合物を2種類のペプチド架橋剤の混合物と4:1の化学量論比で反応させて、PEG-ペプチドハイドロゲルを調製した。最終的に得られたハイドロゲル溶液をボルテックスと遠心分離を3秒ずつ行って均質化した。架橋時間は、混合開始時間から自由流動性のある溶液が観察されなくなるまでの時間として計測した。また、ハイドロゲルをはじいて、室内光の下で観察した。ハイドロゲルの入ったチューブを強くはじいたときに、透明のハイドロゲルが崩壊せずにチューブの底に付着したままで、内部に気泡が生じていなければ、ハイドロゲルが形成されたと判断した。このハイドロゲルを、その後のすべてのin vitroでのゲル分解実験および薬物放出実験に使用した。
簡単に説明すると、20μLのPEG-ペプチドハイドロゲルを1.5mLのチューブに入れて、MMP-9(2μg/mL)とHNE(1μg/mL)の酵素混合物を含むPBS溶液200μLまたはこの酵素混合物を含まないPBS溶液200μLに浸漬し、これとは別に、20μLのPEG-ペプチドハイドロゲルをMMP-9含有HEPES溶液(2μg/mL)またはHNE含有HEPES溶液(1μg/mL)に接触させた。各チューブを37℃でインキュベートした。所定時間ごと(4、8、12、24、36、48時間)に、各チューブから液状サンプルを5μLずつ採取し、これを2mLのガラスバイアルに入れて、15μLのバッファー溶液で4倍に希釈した。各チューブに、対応するバッファー溶液を5μLずつ加え、採取した量の補充を行った。採取した全サンプルにおいて、サンプル中に含まれる、分解されたペプチドフラグメントの濃度をHPLCで定量した。HPLCによる分析は、室温で行った。HPLCでは、超純水とアセトニトリルの体積比35/65の混合液に0.1%トリフルオロ酢酸を加えたものを移動相として1.0mL/minの流速で使用した。検出されたスペクトルを薬物濃度に換算し、所定時間ごとの累積薬物放出率を計算した。累積放出率は、累積薬物放出量(測定時点における薬物放出量とそれ以前の時点までの薬物消失量の合計)を、各ハイドロゲルに使用したペプチドの初期量で除して計算した。放出プロファイルは、放出時間に対して累積薬物放出率をプロットして作成した。各時点のデータは、3回の反復実験の平均と標準偏差から得られたものである。
in vitroにおいて、MMP-9、HNE、またはMMP-9とHNEの混合物を含む酵素溶液の存在下におけるハイドロゲルからの抗炎症剤の放出速度を調べた。コントロール実験は、酵素不含の純粋なバッファー溶液を用いて行った。所定の時点(酵素溶液との接触開始から4時間後、8時間後、12時間後、24時間後、36時間後、48時間後)における累積放出率をプロットして、図19に示すような放出プロファイルを作成した。図19に示すように、GEP-ペプチドハイドロゲルをMMP-9とHNEを含むバッファー溶液に48時間接触させた場合の累積薬物放出率が最も高く、最大で80%となり、酵素不含の新鮮なバッファー溶液における累積放出率(7%)よりもはるかに高かった。MMP-9という1種類の酵素を含むバッファー溶液にハイドロゲルを接触させた場合の最終的な累積放出率は71%であり、MMP-9とHNEを混合した場合の累積薬物放出率の最大値よりは低かったがこれに近い値であった。プロテアーゼ不含のHEPESバッファーにゲルを接触させた場合の48時間後の最大薬物放出率は9%で、MN酵素混合物溶液における最終的な放出率より低かった。これは、分解されないハイドロゲルシステムでは、ハイドロゲルからの拡散現象に抗力が働いて十分な拡散が行われず、一部の薬物分子がハイドロゲルマトリックス内に残留したためと考えられる。また、ハイドロゲルを酵素HNEに接触させた場合にも同様の問題が生じた。この場合の最大累積薬物放出率は24%であり、MMP-9酵素溶液における放出率を大幅に下回った。これは、酵素HNEが酵素MMP-9とは異なり、薬物結合体を切断できないことが主な理由である。しかし、薬物放出プロファイルを見ると、少量ではあるものの、薬物分子がハイドロゲルから切断され、拡散していることがわかった。これは主に、水性環境下でのハイドロゲルの膨潤によりハイドロゲルの構造が変化し、ハイドロゲルの分解を伴わずにペプチド架橋剤が切断されたためである。
要約
抗炎症治療薬の投与において、薬物放出動態の時空間的制御を改善するために、薬物を物理的にカプセルに封入したり、薬物をポリマー骨格に永久的に結合させるなど、複数の戦略が試みられてきた[14-17]。しかし、これまでのシステムの放出動態は、炎症性疾患の重症度の変化に対応することができなかった。Joshiらは、トリグリセロールモノステアレート(TG-18)の自己組織性を利用して、ハイドロゲルプラットフォームにコルチコステロイドを物理的に内包し、関節炎再燃時に発現が上昇する酵素を薬物放出を活性化させる生物学的シグナルとして利用した[20]。しかし、このプラットフォームからの薬物放出は、主にエステラーゼによりTG-18骨格のエステル結合が切断されることを利用するものである。また、炎症状態に伴う低pH環境[24-26]では、このエステル結合の非酵素的加水分解が起こり、望ましくない非特異的な薬物放出が生じる可能性もある。
抗炎症治療薬の投与において、薬物放出動態の時空間的制御を改善するために、薬物を物理的にカプセルに封入したり、薬物をポリマー骨格に永久的に結合させるなど、複数の戦略が試みられてきた[14-17]。しかし、これまでのシステムの放出動態は、炎症性疾患の重症度の変化に対応することができなかった。Joshiらは、トリグリセロールモノステアレート(TG-18)の自己組織性を利用して、ハイドロゲルプラットフォームにコルチコステロイドを物理的に内包し、関節炎再燃時に発現が上昇する酵素を薬物放出を活性化させる生物学的シグナルとして利用した[20]。しかし、このプラットフォームからの薬物放出は、主にエステラーゼによりTG-18骨格のエステル結合が切断されることを利用するものである。また、炎症状態に伴う低pH環境[24-26]では、このエステル結合の非酵素的加水分解が起こり、望ましくない非特異的な薬物放出が生じる可能性もある。
本発明においては、基礎放出速度の制御を向上させ、かつ炎症関連病態に対する選択性および特異性を高めた、より性能の高い薬物送達プラットフォームを設計することに焦点を当てた。そして、設計したプラットフォームが以下の有利な特性を有することを実証することができた。
(1) 複数の組み込みサブドメインからなるモジュール式システム設計である。各サブドメインは、それぞれ異なる機能を持ち、構成材料の化学組成を変更することで、特定の炎症関連病態/疾患に合わせて薬物担持および薬物放出動態を調整できるように、個別に作製および置換することができる。
(2) 基礎放出速度を調整することができる。具体的には、炎症応答性ハイドロゲルに薬物/修飾薬物をプロテアーゼ切断性ペプチドを介して共有結合させることにより薬物の基礎放出を有意に最小限に抑えるか、薬物含有ドメインとして薬物担持ポリマー粒子を用いて基礎放出を適度に維持することができる。
(3) 1種類以上の疾患特異的プロテアーゼとの接触によりプラットフォームから担持物質が放出されるようにペプチド配列を組み合せることができる。このように組み合わせることで、疾患の炎症の重症度に相関した投薬量が調整されて放出されるようにプラットフォームの特異性を高めることができる。
これらの利点は、以下のいくつかの例により確認されている。
(1) 複数の組み込みサブドメインからなるモジュール式システム設計である。各サブドメインは、それぞれ異なる機能を持ち、構成材料の化学組成を変更することで、特定の炎症関連病態/疾患に合わせて薬物担持および薬物放出動態を調整できるように、個別に作製および置換することができる。
(2) 基礎放出速度を調整することができる。具体的には、炎症応答性ハイドロゲルに薬物/修飾薬物をプロテアーゼ切断性ペプチドを介して共有結合させることにより薬物の基礎放出を有意に最小限に抑えるか、薬物含有ドメインとして薬物担持ポリマー粒子を用いて基礎放出を適度に維持することができる。
(3) 1種類以上の疾患特異的プロテアーゼとの接触によりプラットフォームから担持物質が放出されるようにペプチド配列を組み合せることができる。このように組み合わせることで、疾患の炎症の重症度に相関した投薬量が調整されて放出されるようにプラットフォームの特異性を高めることができる。
これらの利点は、以下のいくつかの例により確認されている。
単種または複数種のプロテアーゼに対して応答性を有するモジュール式微粒子含有ハイドロゲル
我々は、炎症性疾患に伴うプロテアーゼ活性の上昇により、抗炎症剤の放出が誘導されるモジュール式ハイブリッドハイドロゲルを開発した。このハイドロゲルマトリックスは、プロテアーゼ活性によるタンパク質分解によって分解され、それにより、埋め込まれていた粒子が遊離し、その結果、所望の治療ペイロードを送達することができた。このハイブリッドハイドロゲルはモジュール式であるため、プロテアーゼ切断性サブドメインと薬物担持サブドメインをそれぞれ独立で、ハイドロゲルの形成およびマトリックスメタロプロテアーゼ-9(MMP-9)による切断が促進されるように最適化することができ、その結果、最終的に所望のペイロードを調整可能な放出速度で送達することができた。in vitroの試験では、プロテアーゼの作用によりハイブリッドハイドロゲルシステムからの薬物放出が促進され、炎症性マクロファージによるTNF-α産生が効果的に抑制されることが確認され、薬物誘発性細胞毒性を緩和できる可能性が示唆された。また、我々は、生体材料で誘導される宿主応答における活性酸素種の活性をモニターするために、非侵襲イメージングを用いて、免疫適格性マウスに皮下投与したハイブリッドハイドロゲルおよびその構成材料が、皮下投与から5日後の時点で有害な免疫応答を誘導していないことを確認した。その後、このハイブリッドハイドロゲルを市販の創傷被覆材に組み込み、MMP-9との接触により薬物が放出されることを確認した。これらの結果から、このハイブリッドハイドロゲルは、慢性疾患における炎症の調節を目的とした、注射または外用適用によるオンデマンド型薬物送達のための汎用的なプラットフォームであることが示唆された。
我々は、炎症性疾患に伴うプロテアーゼ活性の上昇により、抗炎症剤の放出が誘導されるモジュール式ハイブリッドハイドロゲルを開発した。このハイドロゲルマトリックスは、プロテアーゼ活性によるタンパク質分解によって分解され、それにより、埋め込まれていた粒子が遊離し、その結果、所望の治療ペイロードを送達することができた。このハイブリッドハイドロゲルはモジュール式であるため、プロテアーゼ切断性サブドメインと薬物担持サブドメインをそれぞれ独立で、ハイドロゲルの形成およびマトリックスメタロプロテアーゼ-9(MMP-9)による切断が促進されるように最適化することができ、その結果、最終的に所望のペイロードを調整可能な放出速度で送達することができた。in vitroの試験では、プロテアーゼの作用によりハイブリッドハイドロゲルシステムからの薬物放出が促進され、炎症性マクロファージによるTNF-α産生が効果的に抑制されることが確認され、薬物誘発性細胞毒性を緩和できる可能性が示唆された。また、我々は、生体材料で誘導される宿主応答における活性酸素種の活性をモニターするために、非侵襲イメージングを用いて、免疫適格性マウスに皮下投与したハイブリッドハイドロゲルおよびその構成材料が、皮下投与から5日後の時点で有害な免疫応答を誘導していないことを確認した。その後、このハイブリッドハイドロゲルを市販の創傷被覆材に組み込み、MMP-9との接触により薬物が放出されることを確認した。これらの結果から、このハイブリッドハイドロゲルは、慢性疾患における炎症の調節を目的とした、注射または外用適用によるオンデマンド型薬物送達のための汎用的なプラットフォームであることが示唆された。
単種または複数種のプロテアーゼに対して応答性を有するモジュール式結合体型ハイドロゲル
また、抗炎症剤を結合させたモジュール式ハイドロゲルシステムも開発した。我々は、このハイドロゲルシステムにおいて、1種類または2種類のプロテアーゼ刺激により治療薬の放出が誘導されることを確認した。いくつかの実施形態において、薬物結合ハイドロゲルシステムの薬物担持量は、ハイドロゲル骨格であるポリエチレングリコールの構成を変更することによって増加させることができた。また、薬物放出速度は、プロテアーゼ切断性アンカーおよび架橋剤を変更することによって調整することができた。さらに、化学的に誘発した重症度の異なる皮下炎症モデルを用いて、in vivoでのプロテアーゼの作用により誘導される薬物放出も確認した。
また、抗炎症剤を結合させたモジュール式ハイドロゲルシステムも開発した。我々は、このハイドロゲルシステムにおいて、1種類または2種類のプロテアーゼ刺激により治療薬の放出が誘導されることを確認した。いくつかの実施形態において、薬物結合ハイドロゲルシステムの薬物担持量は、ハイドロゲル骨格であるポリエチレングリコールの構成を変更することによって増加させることができた。また、薬物放出速度は、プロテアーゼ切断性アンカーおよび架橋剤を変更することによって調整することができた。さらに、化学的に誘発した重症度の異なる皮下炎症モデルを用いて、in vivoでのプロテアーゼの作用により誘導される薬物放出も確認した。
参考文献
本明細書で引用された既に出版されている一連の文献およびこれらに記載の考察は、当技術分野の技術水準や技術常識の一部を構成するものであると認識する必要は必ずしもない。
Abdelaziza, Hadeer M. et al., Inhalable particulate drug delivery systems for lung cancer therapy: Nanoparticles, microparticles, nanocomposites and nanoaggregates. Journal of Controlled Release 269 (2018) 374-392.
Amano, S. U.; Cohen, J. L.; Vangala, P.; Tencerova, M.; Nicoloro, S. M.; Yawe, J. C.; Shen, Y.; Czech, M. P.; Aouadi, M., Local proliferation of macrophages contributes to obesity-associated adipose tissue inflammation. Cell metabolism 2014, 19 (1), 162-171.
Badeau, B. A.; Comerford, M. P.; Arakawa, C. K.; Shadish, J. A.; DeForest, C. A., Engineered modular biomaterial logic gates for environmentally triggered therapeutic delivery. Nature Chemistry 2018, 10, 251.
Bellocq A., Suberville S., Philippe C., Bertrand F., J. Perez, B. Fouqueray, G. Cherqui, L. Baud, Low Environmental pH Is Responsible for the Induction of Nitric-oxide Synthase in Macrophages: EVIDENCE FOR INVOLVEMENT OF NUCLEAR FACTOR-κB ACTIVATION, Journal of Biological Chemistry 273(9) (1998) 5086-5092 10.1074/jbc.273.9.5086.
Biela, A.; Watkinson, M.; Meier, U. C.; Baker, D.; Giovannoni, G.; Becer, C. R.; Krause, S., Disposable MMP-9 sensor based on the degradation of peptide cross-linked hydrogel films using electrochemical impedance spectroscopy. Biosensors and Bioelectronics 2015, 68, 660-667.
Caley M. P., Martins V. L. C., O'Toole E. A., Metalloproteinases and Wound Healing, Adv Wound Care (New Rochelle) 4(4) (2015) 225-234 http://doi.org/10.1089/wound.2014.0581.
Dang, T. T.; Bratlie, K. M.; Bogatyrev, S. R.; Chen, X. Y.; Langer, R.; Anderson, D. G., Spatiotemporal effects of a controlled-release anti-inflammatory drug on the cellular dynamics of host response. Biomaterials 2011, 32 (19), 4464-4470.
Dang, T. T.; Thai, A. V.; Cohen, J.; Slosberg, J. E.; Siniakowicz, K.; Doloff, J. C.; Ma, M.; Hollister-Lock, J.; Tang, K. M.; Gu, Z.; Cheng, H.; Weir, G. C.; Langer, R.; Anderson, D. G., Enhanced function of immuno-isolated islets in diabetes therapy by co-encapsulation with an anti-inflammatory drug. Biomaterials 2013, 34 (23), 5792-5801.
Friedman, M.; Cavins, J. F.; Wall, J. S., Relative Nucleophilic Reactivities of Amino Groups and Mercaptide Ions in Addition Reactions with α,β-Unsaturated Compounds1,2. Journal of the American Chemical Society 1965, 87 (16), 3672-3682.
Han, F. Y.; Thurecht, K. J.; Whittaker, A. K.; Smith, M. T., Bioerodable PLGA-Based Microparticles for Producing Sustained-Release Drug Formulations and Strategies for Improving Drug Loading. Frontiers in pharmacology 2016, 7, 185-185.
Hamalainen M., Nieminen R., Uurto I., Salenius J.-P., Kellomaki M., Mikkonen J., Kotsar A., Isotalo T., Lj T. T., Talja M., Moilanen E., Dexamethasone-eluting Vascular Stents, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 112(5) (2013) 296-301 http://doi.org/10.1111/bcpt.12056.
Hsu B. B., Park M.-H., Hagerman S. R., Hammond P. T., Multimonth controlled small molecule release from biodegradable thin films, Proceedings of the National Academy of Sciences 111(33) (2014) 12175 https://doi.org/10.1073/pnas.1323829111.
Jones, B. H.; Martinez, A. M.; Wheeler, J. S.; Spoerke, E. D., Surfactant-induced assembly of enzymatically-stable peptide hydrogels. Soft Matter 2015, 11 (18), 3572-3580.
Joshi N., Yan J., Levy S., Bhagchandani S., Slaughter K. V., Sherman N. E., Amirault J., Wang Y., Riegel L., He X., Rui T. S., Valic M., Vemula P. K., Miranda O. R., Levy O., Gravallese E. M., Aliprantis A. O., Ermann J., Karp J. M., Towards an arthritis flare-responsive drug delivery system, Nature Communications 9(1) (2018) 1275 http://doi.org/10.1038/s41467-018-03691-1.
Ladwig G. P., Robson M. C., Liu R. A. N., Kuhn M. A., Muir D. F., Schultz G. S., Ratios of activated matrix metalloproteinase-9 to tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in wound fluids are inversely correlated with healing of pressure ulcers, Wound Repair and Regeneration 10(1) (2002) 26-37 http://doi.org/10.1046/j.1524-475X.2002.10903.x.
Li, J.; Mooney, D. J., Designing hydrogels for controlled drug delivery. Nature Reviews Materials 2016, 1, 16071.
Liu, W. F.; Ma, M.; Bratlie, K. M.; Dang, T. T.; Langer, R.; Anderson, D. G., Real-time in vivo detection of biomaterial-induced reactive oxygen species. Biomaterials 2011, 32 (7), 1796-1801.
Lutolf, M. P.; Tirelli, N.; Cerritelli, S.; Cavalli, L.; Hubbell, J. A., Systematic Modulation of Michael-Type Reactivity of Thiols through the Use of Charged Amino Acids. Bioconjugate Chemistry 2001, 12 (6), 1051-1056.
Lutolf, M. P.; Hubbell, J. A., Synthesis and Physicochemical Characterization of End-Linked Poly(ethylene glycol)-co-peptide Hydrogels Formed by Michael-Type Addition. Biomacromolecules 2003, 4 (3), 713-722.
Pham C. T. N., Neutrophil serine proteases fine-tune the inflammatory response, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 40(6) (2008) 1317-1333 https://doi.org/10.1016/j.biocel.2007.11.008.
Roomi, M. W.; Monterrey, J. C.; Kalinovsky, T.; Rath, M.; Niedzwiecki, A., Distinct patterns of matrix metalloproteinase-2 and -9 expression in normal human cell lines. Oncology reports 2009, 21 (3), 821-6.
Roos, G.; Foloppe, N.; Messens, J., Understanding the pKa of Redox Cysteines: The Key Role of Hydrogen Bonding. Antioxidants & Redox Signaling 2012, 18 (1), 94-127.
Samuelson, L. E.; Scherer, R. L.; Matrisian, L. M.; McIntyre, J. O.; Bornhop, D. J., Synthesis and In Vitro Efficacy of MMP9-Activated NanoDendrons. Molecular Pharmaceutics 2013, 10 (8), 3164-3174.
Seong, S.-Y.; Matzinger, P., Hydrophobicity: an ancient damage-associated molecular pattern that initiates innate immune responses. Nature Reviews Immunology 2004, 4, 469.
Serhan C. A., Ward P. A., Gilroy D. W., Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, 2010.
Steinmeyer, J., Pharmacological basis for the therapy of pain and inflammation with nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Arthritis Research & Therapy 2000, 2 (5), 379.
Sutherland, E. R.; Allmers, H.; Ayas, N. T.; Venn, A. J.; Martin, R. J., Inhaled corticosteroids reduce the progression of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease: a meta-analysis. Thorax 2003, 58 (11), 937-941.
Tomei, A. A.; Manzoli, V.; Fraker, C. A.; Giraldo, J.; Velluto, D.; Najjar, M.; Pileggi, A.; Molano, R. D.; Ricordi, C.; Stabler, C. L.; Hubbell, J. A., Device design and materials optimization of conformal coating for islets of Langerhans. Proceedings of the National Academy of Sciences 2014, 111 (29), 10514.
Youssef J., Novosad S. A., Winthrop K. L., Infection Risk and Safety of Corticosteroid Use, Rheumatic diseases clinics of North America 42(1) (2016) 157-176 http://doi.org/10.1016/j.rdc.2015.08.004.
Zhou, Q.; Lin, J.; Wang, J.; Li, F.; Tang, F.; Zhao, X., A designed amphiphilic peptide containing the silk fibroin motif as a potential carrier of hydrophobic drugs. Progress in Natural Science 2009, 19 (11), 1529-1536.
Zoia, C.; Bongetta, D.; Lombardi, F.; Custodi, V. M.; Pugliese, R.; Gaetani, P., First Impressions about Adherus, a New Dural Sealant. Journal of Applied Biomaterials & Functional Materials 2015, 13 (4), 372-375.
本明細書で引用された既に出版されている一連の文献およびこれらに記載の考察は、当技術分野の技術水準や技術常識の一部を構成するものであると認識する必要は必ずしもない。
Abdelaziza, Hadeer M. et al., Inhalable particulate drug delivery systems for lung cancer therapy: Nanoparticles, microparticles, nanocomposites and nanoaggregates. Journal of Controlled Release 269 (2018) 374-392.
Amano, S. U.; Cohen, J. L.; Vangala, P.; Tencerova, M.; Nicoloro, S. M.; Yawe, J. C.; Shen, Y.; Czech, M. P.; Aouadi, M., Local proliferation of macrophages contributes to obesity-associated adipose tissue inflammation. Cell metabolism 2014, 19 (1), 162-171.
Badeau, B. A.; Comerford, M. P.; Arakawa, C. K.; Shadish, J. A.; DeForest, C. A., Engineered modular biomaterial logic gates for environmentally triggered therapeutic delivery. Nature Chemistry 2018, 10, 251.
Bellocq A., Suberville S., Philippe C., Bertrand F., J. Perez, B. Fouqueray, G. Cherqui, L. Baud, Low Environmental pH Is Responsible for the Induction of Nitric-oxide Synthase in Macrophages: EVIDENCE FOR INVOLVEMENT OF NUCLEAR FACTOR-κB ACTIVATION, Journal of Biological Chemistry 273(9) (1998) 5086-5092 10.1074/jbc.273.9.5086.
Biela, A.; Watkinson, M.; Meier, U. C.; Baker, D.; Giovannoni, G.; Becer, C. R.; Krause, S., Disposable MMP-9 sensor based on the degradation of peptide cross-linked hydrogel films using electrochemical impedance spectroscopy. Biosensors and Bioelectronics 2015, 68, 660-667.
Caley M. P., Martins V. L. C., O'Toole E. A., Metalloproteinases and Wound Healing, Adv Wound Care (New Rochelle) 4(4) (2015) 225-234 http://doi.org/10.1089/wound.2014.0581.
Dang, T. T.; Bratlie, K. M.; Bogatyrev, S. R.; Chen, X. Y.; Langer, R.; Anderson, D. G., Spatiotemporal effects of a controlled-release anti-inflammatory drug on the cellular dynamics of host response. Biomaterials 2011, 32 (19), 4464-4470.
Dang, T. T.; Thai, A. V.; Cohen, J.; Slosberg, J. E.; Siniakowicz, K.; Doloff, J. C.; Ma, M.; Hollister-Lock, J.; Tang, K. M.; Gu, Z.; Cheng, H.; Weir, G. C.; Langer, R.; Anderson, D. G., Enhanced function of immuno-isolated islets in diabetes therapy by co-encapsulation with an anti-inflammatory drug. Biomaterials 2013, 34 (23), 5792-5801.
Friedman, M.; Cavins, J. F.; Wall, J. S., Relative Nucleophilic Reactivities of Amino Groups and Mercaptide Ions in Addition Reactions with α,β-Unsaturated Compounds1,2. Journal of the American Chemical Society 1965, 87 (16), 3672-3682.
Han, F. Y.; Thurecht, K. J.; Whittaker, A. K.; Smith, M. T., Bioerodable PLGA-Based Microparticles for Producing Sustained-Release Drug Formulations and Strategies for Improving Drug Loading. Frontiers in pharmacology 2016, 7, 185-185.
Hamalainen M., Nieminen R., Uurto I., Salenius J.-P., Kellomaki M., Mikkonen J., Kotsar A., Isotalo T., Lj T. T., Talja M., Moilanen E., Dexamethasone-eluting Vascular Stents, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 112(5) (2013) 296-301 http://doi.org/10.1111/bcpt.12056.
Hsu B. B., Park M.-H., Hagerman S. R., Hammond P. T., Multimonth controlled small molecule release from biodegradable thin films, Proceedings of the National Academy of Sciences 111(33) (2014) 12175 https://doi.org/10.1073/pnas.1323829111.
Jones, B. H.; Martinez, A. M.; Wheeler, J. S.; Spoerke, E. D., Surfactant-induced assembly of enzymatically-stable peptide hydrogels. Soft Matter 2015, 11 (18), 3572-3580.
Joshi N., Yan J., Levy S., Bhagchandani S., Slaughter K. V., Sherman N. E., Amirault J., Wang Y., Riegel L., He X., Rui T. S., Valic M., Vemula P. K., Miranda O. R., Levy O., Gravallese E. M., Aliprantis A. O., Ermann J., Karp J. M., Towards an arthritis flare-responsive drug delivery system, Nature Communications 9(1) (2018) 1275 http://doi.org/10.1038/s41467-018-03691-1.
Ladwig G. P., Robson M. C., Liu R. A. N., Kuhn M. A., Muir D. F., Schultz G. S., Ratios of activated matrix metalloproteinase-9 to tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in wound fluids are inversely correlated with healing of pressure ulcers, Wound Repair and Regeneration 10(1) (2002) 26-37 http://doi.org/10.1046/j.1524-475X.2002.10903.x.
Li, J.; Mooney, D. J., Designing hydrogels for controlled drug delivery. Nature Reviews Materials 2016, 1, 16071.
Liu, W. F.; Ma, M.; Bratlie, K. M.; Dang, T. T.; Langer, R.; Anderson, D. G., Real-time in vivo detection of biomaterial-induced reactive oxygen species. Biomaterials 2011, 32 (7), 1796-1801.
Lutolf, M. P.; Tirelli, N.; Cerritelli, S.; Cavalli, L.; Hubbell, J. A., Systematic Modulation of Michael-Type Reactivity of Thiols through the Use of Charged Amino Acids. Bioconjugate Chemistry 2001, 12 (6), 1051-1056.
Lutolf, M. P.; Hubbell, J. A., Synthesis and Physicochemical Characterization of End-Linked Poly(ethylene glycol)-co-peptide Hydrogels Formed by Michael-Type Addition. Biomacromolecules 2003, 4 (3), 713-722.
Pham C. T. N., Neutrophil serine proteases fine-tune the inflammatory response, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 40(6) (2008) 1317-1333 https://doi.org/10.1016/j.biocel.2007.11.008.
Roomi, M. W.; Monterrey, J. C.; Kalinovsky, T.; Rath, M.; Niedzwiecki, A., Distinct patterns of matrix metalloproteinase-2 and -9 expression in normal human cell lines. Oncology reports 2009, 21 (3), 821-6.
Roos, G.; Foloppe, N.; Messens, J., Understanding the pKa of Redox Cysteines: The Key Role of Hydrogen Bonding. Antioxidants & Redox Signaling 2012, 18 (1), 94-127.
Samuelson, L. E.; Scherer, R. L.; Matrisian, L. M.; McIntyre, J. O.; Bornhop, D. J., Synthesis and In Vitro Efficacy of MMP9-Activated NanoDendrons. Molecular Pharmaceutics 2013, 10 (8), 3164-3174.
Seong, S.-Y.; Matzinger, P., Hydrophobicity: an ancient damage-associated molecular pattern that initiates innate immune responses. Nature Reviews Immunology 2004, 4, 469.
Serhan C. A., Ward P. A., Gilroy D. W., Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, Cambridge, 2010.
Steinmeyer, J., Pharmacological basis for the therapy of pain and inflammation with nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Arthritis Research & Therapy 2000, 2 (5), 379.
Sutherland, E. R.; Allmers, H.; Ayas, N. T.; Venn, A. J.; Martin, R. J., Inhaled corticosteroids reduce the progression of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease: a meta-analysis. Thorax 2003, 58 (11), 937-941.
Tomei, A. A.; Manzoli, V.; Fraker, C. A.; Giraldo, J.; Velluto, D.; Najjar, M.; Pileggi, A.; Molano, R. D.; Ricordi, C.; Stabler, C. L.; Hubbell, J. A., Device design and materials optimization of conformal coating for islets of Langerhans. Proceedings of the National Academy of Sciences 2014, 111 (29), 10514.
Youssef J., Novosad S. A., Winthrop K. L., Infection Risk and Safety of Corticosteroid Use, Rheumatic diseases clinics of North America 42(1) (2016) 157-176 http://doi.org/10.1016/j.rdc.2015.08.004.
Zhou, Q.; Lin, J.; Wang, J.; Li, F.; Tang, F.; Zhao, X., A designed amphiphilic peptide containing the silk fibroin motif as a potential carrier of hydrophobic drugs. Progress in Natural Science 2009, 19 (11), 1529-1536.
Zoia, C.; Bongetta, D.; Lombardi, F.; Custodi, V. M.; Pugliese, R.; Gaetani, P., First Impressions about Adherus, a New Dural Sealant. Journal of Applied Biomaterials & Functional Materials 2015, 13 (4), 372-375.
Claims (29)
- プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルであって、
a) 粒子に封入された薬物;
b) 官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含む2つのスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤
を含み、
b) のポリマービルディングブロックが、c) のプロテアーゼ切断性架橋剤の存在下でゲルを形成し、a) の粒子が該ゲルに内包されることを特徴とする、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。 - a) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む第2の二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤を少なくとも1つ;および/または
b) プロテアーゼ耐性基質を含む二官能性プロテアーゼ耐性架橋剤を少なくとも1つ
さらに含み、
a) のプロテアーゼ切断性基質が、前記c) の架橋剤が感受性を示すプロテアーゼとは異なるプロテアーゼに感受性を示すことを特徴とする、請求項1に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。 - 前記薬物が、シリカ、リポソーム、siRNA複合体、ならびにポリカプロラクトン、ポリ(メタクリル酸)、ポリ乳酸、ポリビニルピロリドン、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、およびゼラチンなどのポリマー材料を含む群から選択される材料を含む粒子に封入されている、請求項1または2に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 前記ポリマービルディングブロックが、マルチアームPEG-ビニルスルホン、マルチアームPEG-マレイミド、マルチアームPEG-アジド、またはマルチアームPEG-アルキンを含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルであって、
a) 官能基を有するプロテアーゼ切断性ペプチドアンカーに共有結合している薬物;
b) 少なくとも1つの官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたペプチド基質を含む二官能性架橋剤
を含み、
前記ペプチドアンカーの官能基により、前記薬物と前記マルチアームPEGポリマーのアームが共有結合し、前記ポリマービルディングブロックの官能基と前記二官能性架橋剤の官能基が共有結合することにより、ゲルが形成されることを特徴とする、プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。 - a) 前記架橋剤がプロテアーゼによる切断性を有していないこと;もしくは
b) 前記ペプチドアンカーがプロテアーゼによる切断性を有し、前記架橋剤が、前記ペプチドアンカーを切断する前記プロテアーゼと同一もしくは異なるプロテアーゼによる切断性を有すること;および/または
c) 前記薬物担持ハイドロゲルが、複数種の架橋剤を含み、その1種以上がそれぞれ異なるプロテアーゼによる切断性を有すること
を特徴とする、請求項5に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。 - 前記ポリマービルディングブロックが、マルチアームPEG-ビニルスルホン、マルチアームPEG-ビニルマレイミド、マルチアームPEG-アジド、またはマルチアームPEG-アルキンを含む、請求項5または6に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 2~12wt%のマルチアームPEG-ビニルマレイミドを含む、請求項7に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 前記マルチアームPEGポリマーが3~8本のアームを有する、請求項1~8のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 前記薬物が抗炎症剤である、請求項1~9のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 前記薬物が非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)である、請求項10に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 前記プロテアーゼが、炎症時に発現が上昇するプロテアーゼであり、マトリックスメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびアスパラギン酸プロテアーゼを含む群から選択される、請求項10または11に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 前記基質を挟むスペーサー配列が、少なくとも1つのシステイン残基、少なくとも1つのリシン残基、および/または少なくとも1つのアジド含有非天然アミノ酸もしくはアルキン含有非天然アミノ酸を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 前記基質を挟むスペーサー配列が、1~6個のアミノ酸からなる配列を含む、請求項13に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 前記プロテアーゼ切断性基質が、メタロプロテアーゼ-9(MMP-9)、MMP-2、MMP-7、MMP-12などのマトリックスメタロプロテアーゼ、カテプシンK、カテプシンB、カテプシンSなどのカテプシン、ヒト好中球エラスターゼ(HNE)、カスパーゼ、およびウロキナーゼを含む群から選択されるプロテアーゼに対して感受性を示す、請求項1~14のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 前記プロテアーゼ切断性基質が、KGPRSLSGK(配列番号30)、GPRSLSG(配列番号10)、LGRMGLPGK(配列番号11)、AVRWLLTA(配列番号12)、またはGPQGIWGQ(配列番号13)で表されるアミノ酸配列を含むMMP-9基質、APEEIMDRQ(配列番号14)またはPMAVVQSVP(配列番号15)を含むHNE基質、GRRGLG(配列番号16)またはDGFLGDD(配列番号17)を含むカテプシンB基質、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項15に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲル。
- 注射用または外用投与用に製剤化された、請求項1~16のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルを含む組成物。
- 請求項1~16のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルを含む被覆材。
- 請求項1~16のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルまたは請求項17に記載の組成物の、それを必要とする対象を治療するための注射剤または外用被覆材としての使用。
- 請求項1~16のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルまたは請求項17に記載の組成物の有効量を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む治療方法。
- a) 粒子に封入された薬物;
b) 官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含む2つのスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤
を含み、
a)~c)が、先行するいずれかの請求項で定義されたものと同じであることを特徴とするキット、または
a) 官能基を有するプロテアーゼ切断性ペプチドアンカーに共有結合している薬物;
b) 少なくとも1つの官能基を有するマルチアームPEGポリマーを含むポリマービルディングブロック;および
c) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたペプチド基質を含む二官能性架橋剤
を含み、
a)~c)が、先行するいずれかの請求項で定義されたものと同じであることを特徴とするキット。 - プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルの製造方法であって、
a) 官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロックと薬物担持粒子を混合する工程;
b) 官能基を含むスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤と薬物担持粒子を混合する工程;および
c) a) の混合物とb) の混合物を混合することにより、a) のポリマービルディングブロックが、b) のプロテアーゼ切断性架橋剤の存在下でゲルを形成し、前記薬物担持粒子が該ゲルに内包される工程
を含む製造方法。 - プロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルの製造方法であって、
a) 官能基を有するペプチドアンカーに共有結合している薬物と、少なくとも1つの官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを含むポリマービルディングブロックとを混合することにより、該ペプチドアンカーと該マルチアームPEGポリマーのそれぞれの官能基が共有結合して、該薬物が該マルチアームPEGポリマーのアームに結合される工程;および
b) a) の薬物-ポリマー結合体を、官能基を含むスペーサー配列に挟まれたペプチド基質を含む二官能性架橋剤と混合することにより、前記ポリマービルディングブロックの官能基と、該二官能性架橋剤の官能基とが共有結合して、ゲルが形成される工程
を含む製造方法。 - a) 前記ペプチドアンカーがプロテアーゼによる切断性を有し、前記架橋剤がプロテアーゼによる切断性を有していないこと;もしくは
b) 前記ペプチドアンカーがプロテアーゼによる切断性を有し、前記架橋剤が、前記ペプチドアンカーを切断する前記プロテアーゼと同一もしくは異なるプロテアーゼによる切断性を有すること;および/または
c) 前記薬物担持ハイドロゲルが、複数種の架橋剤を含み、その1種以上がそれぞれ異なるプロテアーゼによる切断性を有すること
を特徴とする、請求項23に記載の方法。 - 前記薬物、前記ポリマー粒子、前記架橋剤、前記切断性アンカー、および/または前記ポリマービルディングブロックが、請求項1~16のいずれか1項で定義されたものと同じであることを特徴とする、請求項22~24のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1~16のいずれか1項に記載のプロテアーゼ応答性の薬物担持ハイドロゲルを含む複合被覆材の製造方法であって、
a) 粒子に封入された薬物と、官能基を含む2つのスペーサー配列に挟まれたプロテアーゼ切断性基質を含む二官能性プロテアーゼ感受性架橋剤との混合物を調製する工程;
b) 粒子に封入された薬物と、官能基を有するマルチアームポリエチレングリコール(PEG)を含むポリマービルディングブロックとの混合物を調製する工程;および
c) a) の混合物とb) の混合物を混合し、この混合物を被覆材に付着させて、ゲル化させる工程
を含む製造方法。 - 前記被覆材が、アルギン酸塩の創傷被覆材である、請求項26に記載の方法。
- 前記複合被覆材を液体窒素中で瞬間凍結させ、凍結乾燥させる工程d) をさらに含む、請求項26または27に記載の方法。
- 前記薬物が、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)であり;前記粒子が、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)を含み;前記架橋剤および/または前記アンカーが、マトリックスメタロプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼならびにこれらの組み合わせを含む群から選択されるプロテアーゼによる切断性を有し;前記ポリマービルディングブロックが、4アームもしくは8アームのPEG-ビニルスルホン、4アームもしくは8アームのPEG-ビニルマレイミド、4アームもしくは8アームのPEG-アジド、または4アームもしくは8アームのPEG-アルキンを含む、請求項22~28のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SG10201911767R | 2019-12-06 | ||
SG10201911767R | 2019-12-06 | ||
PCT/SG2020/050723 WO2021112772A1 (en) | 2019-12-06 | 2020-12-07 | Inflammation-responsive anti-inflammatory hydrogels |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023504853A true JP2023504853A (ja) | 2023-02-07 |
Family
ID=76222726
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022534151A Pending JP2023504853A (ja) | 2019-12-06 | 2020-12-07 | 炎症応答性を有する抗炎症性ハイドロゲル |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230039279A1 (ja) |
EP (1) | EP4069310A4 (ja) |
JP (1) | JP2023504853A (ja) |
KR (1) | KR20220140700A (ja) |
CN (1) | CN115038465A (ja) |
AU (1) | AU2020396482A1 (ja) |
WO (1) | WO2021112772A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11246879B2 (en) | 2016-02-09 | 2022-02-15 | Tulai Therapeutics, Inc. | Methods, agents, and devices for local neuromodulation of autonomic nerves |
AU2017290353B2 (en) | 2016-06-29 | 2023-05-18 | Tulavi Therapeutics, Inc. | Treatment of sepsis and related inflammatory conditions by local neuromodulation of the autonomic nervous system |
CA3105343A1 (en) | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Corinne Bright | Methods and devices for in situ formed nerve cap |
CN117120033A (zh) * | 2021-03-30 | 2023-11-24 | 图拉维治疗股份有限公司 | 用于神经消融的方法和组合物 |
CN113648455B (zh) * | 2021-08-10 | 2022-09-06 | 太原理工大学 | 一种半互穿网络包载双层微球的双缓释载药水凝胶敷料及其制备方法和应用 |
CN113633785B (zh) * | 2021-08-27 | 2023-10-27 | 中国药科大学 | 一种智能响应性壳-核式聚电解质纳米凝胶的制备方法与应用 |
CN113730639B (zh) * | 2021-09-15 | 2022-05-06 | 上海大学 | 一种磁性敷料及其制备方法和应用 |
WO2024081793A1 (en) * | 2022-10-12 | 2024-04-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Ingestible in vivo-assembling drug release formulations and methods |
CN116077618A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-05-09 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种抗菌水凝胶及其制备方法和应用 |
CN115806736B (zh) * | 2022-12-29 | 2024-03-26 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种mmp酶响应的可注射聚氨基酸水凝胶及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008133918A1 (en) * | 2007-04-24 | 2008-11-06 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Dressing compositions and methods |
WO2013033717A1 (en) * | 2011-09-02 | 2013-03-07 | The Regents Of The University Of California | Enzyme responsive nanocapsules for protein delivery |
NL2010040C2 (en) * | 2012-12-21 | 2014-06-24 | Internat Inst For Diagnostic And Analitical Affairs B V | Cleavable coating material having microbial functionality. |
WO2015021044A1 (en) * | 2013-08-05 | 2015-02-12 | University Of Rochester | Compositions and methods for stimuli-responsive release of a therapeutic agent |
US20190151455A1 (en) * | 2017-10-13 | 2019-05-23 | Brown University | Aspartic protease-triggered antifungal hydrogels |
CN107596379B (zh) * | 2017-10-25 | 2021-04-27 | 武汉大学 | 一种mmp-8响应性智能牙周药物控释水凝胶材料及其用途 |
CN109517162B (zh) * | 2018-11-20 | 2020-11-10 | 南京工业大学 | 可注射水凝胶及制备方法 |
-
2020
- 2020-12-07 US US17/782,908 patent/US20230039279A1/en active Pending
- 2020-12-07 CN CN202080095367.XA patent/CN115038465A/zh active Pending
- 2020-12-07 WO PCT/SG2020/050723 patent/WO2021112772A1/en unknown
- 2020-12-07 AU AU2020396482A patent/AU2020396482A1/en active Pending
- 2020-12-07 KR KR1020227023093A patent/KR20220140700A/ko unknown
- 2020-12-07 EP EP20897433.7A patent/EP4069310A4/en active Pending
- 2020-12-07 JP JP2022534151A patent/JP2023504853A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20220140700A (ko) | 2022-10-18 |
US20230039279A1 (en) | 2023-02-09 |
WO2021112772A1 (en) | 2021-06-10 |
EP4069310A4 (en) | 2023-12-13 |
AU2020396482A1 (en) | 2022-07-28 |
CN115038465A (zh) | 2022-09-09 |
EP4069310A1 (en) | 2022-10-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2023504853A (ja) | 炎症応答性を有する抗炎症性ハイドロゲル | |
Tauro et al. | Matrix metalloprotease triggered delivery of cancer chemotherapeutics from hydrogel matrixes | |
Lee et al. | An injectable hyaluronic acid–tyramine hydrogel system for protein delivery | |
Koshy et al. | Injectable nanocomposite cryogels for versatile protein drug delivery | |
Hao et al. | Visible light cured thiol-vinyl hydrogels with tunable degradation for 3D cell culture | |
Yu et al. | In situ covalently cross-linked PEG hydrogel for ocular drug delivery applications | |
Kashyap et al. | Hydrogels for pharmaceutical and biomedical applications | |
KR100387428B1 (ko) | 초분자구조의생체내분해성의약고분자집합체 | |
Dadsetan et al. | A stimuli-responsive hydrogel for doxorubicin delivery | |
US11969517B2 (en) | Compositions and methods for macrophage conversion | |
Iglesias et al. | Biodegradable double cross-linked chitosan hydrogels for drug delivery: Impact of chemistry on rheological and pharmacological performance | |
Zhang et al. | Polymer–antibiotic conjugates as antibacterial additives in dental resins | |
Ross et al. | Effects of molecular weight and loading on matrix metalloproteinase-2 mediated release from poly (ethylene glycol) diacrylate hydrogels | |
US7943569B2 (en) | Composition and method for providing localized delivery of a therapeutic agent | |
Piras et al. | Chitosan nanoparticles for the linear release of model cationic peptide | |
US10172938B2 (en) | Multimode degradable hydrogels for controlled release of cargo substances | |
ES2311818T3 (es) | Apositos terapeuticos sensibles al dolor. | |
Najafi et al. | Conversion of an injectable MMP-degradable hydrogel into core-cross-linked micelles | |
Tauro et al. | Matrix metalloprotease selective peptide substrates cleavage within hydrogel matrices for cancer chemotherapy activation | |
Wang et al. | HClO/ClO–-Indicative Interpenetrating Polymer Network Hydrogels as Intelligent Bioactive Materials for Wound Healing | |
Nguyen et al. | Modular design of a hybrid hydrogel for protease-triggered enhancement of drug delivery to regulate TNF-α production by pro-inflammatory macrophages | |
WO2007012876A1 (en) | Hydrogel particle | |
JP2004534103A (ja) | ゲル組成物 | |
JPH11322941A (ja) | 温度応答型生体内分解性高分子 | |
Dadou et al. | An overview of chitosan-xanthan gum matrices as controlled release drug carriers |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220701 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231130 |