JP2023504620A - 抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体構築物 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つの、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位と、１つの、ＣＤ３を特異的に認識する結合部位とを含む抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体であって、ｓｃＦｖが２つの重ＩｇＧ鎖のうち１つのみに融合されるＩｇＧ、Ｆａｂアームの１つが二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）に置き換えられているＩｇＧ、又はＦａｂアームがともに、異なる結合特異性を有するｓｃＦｖに置き換えられているＩｇＧである、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体、及び過剰増殖性疾患の治療における、具体的には、癌の治療におけるその使用について言及する。

Description

本発明は、少なくとも１つの、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位と、１つの、ＣＤ３を特異的に認識する結合部位とを含む抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体であって、ｓｃＦｖが２つの重ＩｇＧ鎖のうち１つのみに融合されるＩｇＧ、Ｆａｂアームの１つが二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）に置き換えられているＩｇＧ、又はＦａｂアームがともに、異なる結合特異性を有するｓｃＦｖに置き換えられているＩｇＧである、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体、及び過剰増殖性疾患の治療における、具体的には、癌の治療におけるその使用について言及する。

サイトカインマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、早くも１９６６年には記載されている（Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ｒ．，１９６６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５６，７２－７７；Ｂｌｏｏｍ Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔ，Ｂ．，１９６６，Ｓｃｉｅｎｃｅ １５３，８０－８２）。しかしながら、ＭＩＦは、構成的に発現され、細胞質に貯蔵され、健常な対象の循環中に存在するため、他のサイトカイン及びケモカインとは著しく異なる。このタンパク質の遍在性に起因して、ＭＩＦは、治療的介入には不適切な標的と考えられうる。しかしながら、ＭＩＦは、還元型ＭＩＦ（ｒｅｄＭＩＦ）及び酸化型ＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）と称される２つの免疫学的に別個の立体構造的なアイソフォームで存在する（Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５；１９５：２３４３－２３５２）。ＲｅｄＭＩＦは、細胞質において、及び任意の対象の循環中に見出されうるＭＩＦの大量に発現されるアイソフォームであることがわかった。ｒｅｄＭＩＦは、潜在型の非活性貯蔵形態を表すようである（Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１８ Ｍａｒ ６；５７（９）：１５２３－１５３２）。

対比して、ｏｘＭＩＦは、腫瘍組織において、具体的には結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌及び肺癌を有する患者由来の腫瘍組織において検出されうる生理学的に関係のある疾患関連のアイソフォームであるようである（Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｎｏｖ ８；７（４５）：７３４８６－７３４９６）。

上述のｏｘＭＩＦの陽性表示のような癌を治療するための首尾よい薬物標的の数は限られている。例えば、３００個を超える潜在的な免疫腫瘍学の標的が記載されているが、多くの臨床研究は、抗ＰＤ１抗体及び抗ＰＤＬ１抗体を重視している（Ｔａｎｇ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１８ Ｊａｎ １；２９（１）：８４－９１）。したがって、科学界及び医学界は、予後が乏しい癌患者にとって治療選択肢を増やすための腫瘍特異的抗原を標的とする創薬を切望している。

ｏｘＭＩＦは、高度に腫瘍特異的であるようであり、ｏｘＭＩＦを標的とする抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、及び動物研究において有効性を示す（Ｈｕｓｓａｉｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１３ Ｊｕｌ；１２（７）：１２２３－３４；Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｎｏｖ ８；７（４５）：７３４８６－７３４９６）。ｏｘＭＩＦ特異的抗体は、許容可能な安全性プロフィール、申し分のない組織浸透及び第１相臨床試験における抗腫瘍活性の適応を示した（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＡＳＣＯ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＩＤ２５１８；Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，８６（９），１８３６－１８４８）。しかしながら、抗ｏｘＭＩＦ抗体の作用機序は、単にｏｘＭＩＦの生物活性の中和に基づくようである。抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）等のいかなるバイスタンダー効果も示さなかった（Ｈｕｓｓａｉｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１３ Ｊｕｌ；１２（７）：１２２３－３４）。

Ｄｅｌ Ｂａｎｏ Ｊ．らは、癌免疫療法における使用のための二重特異性抗体に関する概説を提供する（ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．５，ｎｏ．１，２０１５，ＰＡＧＥ １）。

国際公開第２００９／０８６９２０ Ａ１号において、抗ＭＩＦ抗体が記載されている。

国際公開第２０１６／１５６４８９ Ａ１号は、抗ＭＩＦ抗体の投薬レジメンについて言及している。

国際公開第２０１６／１８４８８６ Ａ１号は、突然変異ＴＰ５３及び突然変異ＲＡＳを含有する腫瘍の治療における抗ＭＩＦ抗体について記載している。

ＫＥＲＳＣＨＢＡＵＭＥＲ Ｒ．Ｊ．らは、完全ヒト抗体によるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の中和について報告している（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２８７，ｎｏ．１０，２０１２，ｐａｇｅｓ ７４４６－７４５５）。

Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ Ｐ．らは、癌の動物モデルにおいて化学療法剤と相乗作用を付与する酸化型マクロファージ遊走阻止因子（ｏｘＭＩＦ）に特異的なヒト抗体を開示している（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，７４（１９ Ｓｕｐｐｌ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ２６５４）。

Ｂｅｎｏｎｉｓｓｏｎ Ｈ．らは、ＣＤ３／ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５及びＣＤ３／ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０二重特異性抗体について報告している（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１８（２），２０１９，３１２－３２２）。

２０２０年５月５日に公開された国際公開第２０１９／２３４２４１ Ａ１号は、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体について記載している。

Ｋｌｅｉｎ Ｃ．らは、ヘテロ二量体抗体の開発における鎖結合の課題について言及している（ＭＡＢＳ，４（６），２０１２，ｐｐ．６５３－６６３）。

特異性及び有効性が高められた免疫細胞媒介性療法を開発する方法に関する問題を解決することが必要に迫られている。具体的には、腫瘍学における抗ｏｘＭＩＦ抗体等の治療用抗体の限界を克服することに対して、需要はまだ満たされていない。

本発明の目的は、改善された生物活性を有するｏｘＭＩＦ及びＣＤ３に対して誘導される二重特異性抗体を提供することである。
この目的は、特許請求される主題によって解決される。

本発明によれば、
－ ｓｃＦｖが２つの重鎖のうち１つのみに融合されるＩｇＧ、
－ Ｆａｂアームの１つが二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）に置き換えられ、Ｆａｂアームの１つがＩｇＧ Ｆａｂアームであり、前記ＢｉＴＥ及びＩｇＧ Ｆａｂアームが、ヒンジ領域を介してＦｃ部分に連結されているＩｇＧ、及び
－ Ｆａｂアームが、異なる特異性を有するｓｃＦｖに置き換えられているＩｇＧ
からなる群から選択され、少なくとも１つの、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位と、１つの、ＣＤ３を特異的に認識する結合部位とを含む抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が提供される。

本発明の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、ｏｘＭＩＦへの単一抗体結合と比較して、好適な特性を有する。具体的には、本発明の抗体の二重特異性形成は、腫瘍細胞とＴ細胞を近接させて、Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させるのを可能にし、それにより、腫瘍及び転移負荷を著しく低減させる能力を有する。

特定の実施形態によれば、上記抗体は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を、抗ｏｘＭＩＦ抗体及び抗ＣＤ３抗体の組合せよりも高度に誘導する。かかる増加は、例えばＴ細胞媒介性腫瘍細胞溶解アッセイであるが、これに限定されない当該技術分野で既知の任意のアッセイによって決定することができる。抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞媒介性細胞傷害はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで癌細胞において、具体的には固形腫瘍細胞において、具体的に結腸直腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、及び肺癌細胞において決定されうる。

具体的には、２つの重鎖のうち１つのみに融合されるｓｃＦｖを有する本明細書中に記載する抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、
－ 単一の抗ＣＤ３結合部位に起因したより平衡したＴ細胞活性化、
－ ２つの抗ｏｘＭＩＦ結合部位に起因した標的に対するより高い結合アビディティ、及び
－ そのＦｃ部分に起因した正常なＩｇＧに相当する血清半減期
の利点を提供する。

具体的には、Ｆａｂアームの１つが二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）に置き換えられ、Ｆａｂアームの１つがＩｇＧ Ｆａｂアームであり、ともに、ヒンジ領域を介してＦｃ部分に連結されている、本明細書中に記載する抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、
－ 単一の抗ＣＤ３結合部位に起因したより平衡したＴ細胞活性化、
－ ２つの抗ｏｘＭＩＦ結合部位に起因した標的細胞に対するより高い結合アビディティ、及び
－ ＢｉＴＥと比較したそのＦｃ部分に起因した正常なＩｇＧに相当する血清半減期
の利点を提供する。

本発明によれば、ｏｘＭＩＦ結合部位は、酸化型ＭＩＦに特異的であり、還元型ＭＩＦには結合しない。

ある実施形態によれば、本明細書中に記載する抗体又はその抗原結合断片の結合部位は、少なくとも１つの、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位と、１つの、ＣＤ３を特異的に認識する結合部位とを含み、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位は、
（ａ）配列番号１～配列番号６の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号１～配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
（ｂ）配列番号７～配列番号１２の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号７～配列番号１２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
（ｃ）配列番号１３～配列番号１８の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号１３～配列番号１８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
（ｄ）配列番号１９～配列番号２４の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号１９～配列番号２４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
（ｅ）配列番号２６、配列番号２７、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２３、及び配列番号２４の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号２６、配列番号２７、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２３、及び配列番号２４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
（ｆ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号１３８、配列番号２５、及び配列番号１５３の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号１３８、配列番号２５、及び配列番号１５３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ
を含む。

特定の実施形態によれば、ＣＤＲ配列は、０個、１個、又は２個の点突然変異を含む。

更なる実施形態において、ＣＤ３を特異的に認識する、本明細書中に記載する抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体の結合部位は、
配列番号７７、配列番号７８、配列番号１４９、配列番号８３、配列番号８４及び配列番号１５１、又は
配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８２、又は
配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５、又は
配列番号７７、配列番号１５４、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５、又は
配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０及び配列番号９１、又は
配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７、又は
配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号１７９、及び配列番号１８０、又は
配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１８１、配列番号１８２及び配列番号１８３
のＣＤＲ配列それぞれにおいて、０個、１個、又は２個の点突然変異を含む可変領域を含む。

特定の実施形態によれば、本明細書中に記載する抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号１７９及び配列番号１８０の配列において、０個又は１個の点突然変異を含む。

更なる実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号７７、配列番号７８、配列番号１４９、配列番号８３、配列番号８４、及び配列番号１５１の配列を含む。

特定の実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体のＩｇＧ部分は、ｏｘＭＩＦを認識し、重鎖の１つに融合される前記ｓｃＦｖは、ＣＤ３を認識し、抗ＣＤ３可変軽（ＶＬ）及び可変重（ＶＨ）鎖を結合するペプチドリンカーを更に含む。

更なる特定の実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体のＩｇＧ Ｆａｂアームは、ｏｘＭＩＦを認識し、第２のＦａｂ－アームを置き換える二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３を認識する。上記抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー部分のＶＬ鎖及びＶＨ鎖を結合するペプチドリンカーを更に含んでおり、即ち、二重特異性エンゲージャー部分のＶＬ鎖をＶＨ鎖と連結させる。

更なる特定の実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体のＦａｂアームは、ｓｃＦＶに置き換えられ、一方のｓｃＦＶは、ｏｘＭＩＦを標的とし、他方のｓｃＦｖは、ＣＤ３を標的とし、上記抗体は、ＶＬ鎖及びＶＨ鎖を結合するペプチドリンカーを更に含む。

ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位が、配列番号１５８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１３４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％配列、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む、本明細書中に記載する抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体が、本明細書中で更に提供される。

更なる実施形態において、ＣＤ３を特異的に認識する結合部位が、配列番号１３５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１３６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、本明細書中に記載する抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体が提供される。

更なる実施形態によれば、本明細書中に記載する抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、配列番号１５９、配列番号１３７、配列番号１４０、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、若しくは配列番号１９７のアミノ酸配列、又は配列番号１５９、配列番号１３７、配列番号１４０、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、若しくは配列番号１９７のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態によれば、本発明は具体的には、ＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈ配列の組合せ、又はＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－Ｌ配列の組合せのいずれかを含む単一可変ドメイン、又はかかる可変ドメイン対、例えば、ＶＨ、ＶＨＨ若しくはＶＨ／ＶＬドメイン対を含む構築物を包含する、重鎖可変領域の配列ＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈ及び／又は軽鎖可変領域の配列ＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－Ｌに由来するｏｘＭＩＦ結合部位を含む任意の抗体の使用を意図する。

特定の実施形態によれば、本発明は具体的には、ＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈ配列の組合せ、又はＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－Ｌ配列の組合せのいずれかを含む単一可変ドメイン、又はかかる可変ドメイン対、例えば、ＶＨ、ＶＨＨ若しくはＶＨ／ＶＬドメイン対を含む構築物を包含する、重鎖可変領域の配列ＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈ及び／又は軽鎖可変領域の配列ＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－Ｌに由来するＣＤ３結合部位を含む任意の抗体の使用を意図する。

更に特定の実施形態は、相当する可変重鎖領域（ＶＨ）及び相当する可変軽鎖領域（ＶＬ）領域が、Ｎ末端からＣ末端へ、具体的にはＶＬ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）、ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）、ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）、ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ＣＤ３）、ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）、ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）、ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）、又はＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ＣＤ３）の順で配置される、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体について言及する。

更なる実施形態によれば、抗体は、ヒト起源を有するか、又はヒト以外の哺乳動物起源のキメラ抗体ドメイン若しくはヒト化抗体ドメインであり、好ましくはヒト化起源、マウス起源又はラクダ科起源を有する少なくとも１つの抗体ドメインを含む。

更なる実施形態によれば、本明細書中に記載するような抗体は、ｏｘＭＩＦを特異的に結合する一価又は二価結合部分、及びＣＤ３を特異的に結合する一価結合部分を含む。

本発明の更なる実施形態によれば、本明細書中に記載する抗体のＦｃドメイン、具体的にはＣＨ３ドメインは、当該技術分野で既知のノブ・イントゥ・ホール突然変異を含む（Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９６，６１７－６２１）か、又はＳＥＥＤ技術によって産生される（ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ，Ｄａｖｉｓ Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２０１０，２３（４），１９５－２０２）。

更なる実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物もまた、本明細書中で提供される。

具体的には、本明細書中に記載する抗体又は医薬組成物は、過剰増殖性障害、具体的には、任意の組織又は臓器に関与する癌の治療における、具体的には、頭部癌、頸部癌、乳癌、肝臓癌、皮膚癌、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、食道癌、婦人科癌、気管支癌、鼻咽頭癌、甲状腺癌、前立腺癌、直腸結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、及び線維肉腫の治療における使用のために提供される。

具体的には、本明細書中に記載する抗体は、薬剤として使用されうる。

具体的には、治療上有効な量の本明細書中に記載する医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患、具体的には癌の治療方法が提供される。

本発明の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体型式をコードする単離核酸分子が、更に提供される。

更なる実施形態において、本明細書中に記載する核酸分子を含む発現ベクターが提供される。

更なる実施形態は、上記ベクターを含む宿主細胞について言及する。

上記抗体をコードする核酸を宿主細胞において発現させる工程を含む、本発明の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体を産生する方法が、本明細書中で更に提供される。

特定の実施形態によれば、ｏｘＭＩＦの細胞発現を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法が提供され、該方法は、試験されるべきヒト細胞を含む生物学的試料を、本発明の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体と接触させる工程と、上記抗体の結合を検出する工程とを含み、上記抗体の結合が、細胞表面上のｏｘＭＩＦの存在を示し、それにより、細胞がｏｘＭＩＦを発現するかどうかを検出する。

具体的には、生物学的試料は、無傷のヒト細胞、バイオプシー、切除物、組織試料、又は試験されるべき細胞の膜画分を含む。

より具体的には、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、及び生物発光標識からなる群から選択される検出可能な標識で標識される。

別の態様によれば、検出可能な標識にコンジュゲートされた抗体は、対象の細胞がｏｘＭＩＦを発現している癌等の過剰増殖性疾患を診断する際に使用することができる。

Ｔ細胞を腫瘍細胞に近接近させるｏｘＭＩＦ及びＣＤ３の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の模式図である。 実施例で使用される抗体型式の模式図である。図は、ｓｃＦｖが２つの重鎖のうち１つのみに融合されるＩｇＧ（Ｃ００８６で例示されるＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、Ｆａｂアームの１つが二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーに置き換えられているＩｇＧ（Ｆａｂ－ＢｉＴＥ－Ｆｃ、Ｃ００６１で例示される）、及びＦａｂアームがともに、異なる結合特異性を有するｓｃＦｖに置き換えられているＩｇＧ（（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ又はｓｃＦｖ（ｏｘＭＩＦ）－ｓｃＦｖ（ＣＤ３）－Ｆｃ；Ｃ００６２で例示される）を示す。 抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１及びＣ００６２の、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３への同時結合の図である。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を陰性対照として使用する。 ＥＬＩＳＡにおける抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１及びＣ００６２の、固定化されたｏｘＭＩＦへの結合の図である。抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３単一特異性抗体Ｃ０００８を陽性対照として使用する。 抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１及びＣ００６２によるＴ細胞の活性化の図である。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を陰性対照として使用する。 抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１及びＣ００６２を使用したＨＣＴ１１６結腸癌細胞のＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞死滅の図である。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を陰性対照として使用する。 抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００８６及びＣ０１０７の、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３への同時結合の図である。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を陰性対照として使用した。 ＥＬＩＳＡにおける抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００８６及びＣ０１０７の、固定化されたｏｘＭＩＦへの結合の図である。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を陽性対照として使用した。 抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体（Ａ）Ｃ００６１、Ｃ００６２、Ｃ００８６、及び（Ｂ）Ｃ０１０７の、ｏｘＭＩＦ対ｒｅｄＭＩＦへの差次的結合の図である。Ｉｍａｌｕｍａｂ（Ｃ０００８）を参照抗体として、非特異的アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した。 抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体の、ＣＤ３陽性ジャーカットＴ細胞上で発現される自然ＣＤ３に対する特異的結合の図である。一方で、バックグラウンド染色のみが、ＣＤ３陰性ジャーカットＴ細胞上で決定された。単一特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を陰性対照として使用した。 ヒトＨＣＴ１１６癌標的細胞の存在下又は非存在下のいずれかでの抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１（Ａ）又は単一特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体０００８（Ｂ、陰性対照）によって誘導される活性化されたヒトＴ細胞のＩＬ－２分泌の図である。 抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体を使用した、ｏｘＭＩＦを呈する結腸癌細胞ＨＣＴ１１６（Ａ）及びｏｘＭＩＦを呈するヒト卵巣癌細胞Ａ２７３０（Ｂ）のＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞死滅の図である。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を陰性対照として使用した。 静脈内注射後のＮＳＧマウスの循環中のＣ００６１の薬物動態（ＰＫ）の図である。 皮下ＣＡＬＵ－６腫瘍を保有するマウスの赤外線ｉｎ ｖｉｔｒｏ画像処理によるＣ００６１の腫瘍浸透及び蓄積の図である。写真は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷで標識した抗体の注射の１時間後、６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後及び１６８時間後に撮影した。Ａ：ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００６１（５ｍｇ／ｋｇ）を与えたマウス；Ｂ：処置していない対照マウス；スケールバーは、Ａ及びＢに関して同じである。

「を含む」、「を含有する」、「を有する」及び「を包含する」という用語は、本明細書中で使用する場合、同義的に使用することができ、広い定義として理解されるべきであり、更なる成員又は部品又は要素を可能にする。「からなる」は、構成している定義特性の更なる要素を伴わない最も閉じた定義と解釈される。したがって、「を含んでいる」はより広義であり、「からなる」の定義を含有する。

「約」という用語は、本明細書中で使用する場合、同じ値又は所与の値の＋／－５％異なる値を指す。

本発明の抗体は、少なくとも１つの、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位と、１つの、ＣＤ３を特異的に認識する結合部位とを含む。

ｏｘＭＩＦ結合部位は、ＭＩＦの酸化形態に、具体的にはヒトＭＩＦに特異的であるが、還元型ＭＩＦの実質的な交差反応性を示さない。ｏｘＭＩＦは、炎症性疾患を有する対象の循環において、また癌患者の腫瘍組織において、特異的に且つ優勢に検出されうるＭＩＦの疾患関連の構造アイソフォームである。

本発明の抗体は、ＣＤ３のエピトープ、具体的には、細胞表面上に存在するＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤε（イプシロン）鎖を包含するヒトＣＤ３のエピトープを特異的に認識する１つの結合部位を更に含む。例えば固定化された抗ＣＤ３抗体による、Ｔ細胞上でのＣＤ３のクラスター形成は、Ｔ細胞受容体の会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に類似しているが、そのクローン定型の特異性に依存しないＴ細胞活性化をもたらす。ある特定の実施形態において、本明細書中に記載する抗体のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３とＣＤ３結合親和性を示すだけでなく、各々のカニクイザルＣＤ３タンパク質と優れた交差反応性も示す。場合によっては、抗体のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザル由来のＣＤ３と交差反応性である。より低い親和性でＣＤ３に結合する抗体又はその断片は、Ｔ細胞活性化及び細胞傷害性を効率的に誘発することができる。このことは、腫瘍細胞へのそれらの優先的な局在化のため治療的価値を増しうる。一実施形態において、抗ＣＤ３結合部位は、本明細書中に記載する抗ＣＤ３結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域、及び／又は本明細書中に記載する抗ＣＤ３結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域を含み、例えば、抗ＣＤ３結合ドメインは、１つ又は複数の、例えば３つ全てのＬＣ ＣＤＲと、１つ又は複数の、例えば、３つ全てのＨＣ ＣＤＲとを含む。

本明細書中の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、リンカー配列を有するか、又は有さない免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメイン及び／又は可変ドメインとして理解される抗体ドメインからなるか、若しくはそれらを含むポリペプチド又はタンパク質を包含する。上記用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体等の多特異性抗体、及び抗体断片（それらが、所望の抗原結合活性を示す限り）、即ちｏｘＭＩＦエピトープ及びＣＤ３エピトープに結合する抗体断片を含むがこれらに限定されない各種抗体構造を包含する。

抗体ドメインは、自然構造を有しうるか、又は例えば、抗原結合特性、或いはＦｃＲｎ及び／又はＦｃ－ガンマ受容体等のＦｃ受容体への結合のような安定性又は機能特性等の任意の他の特性を修飾するために、突然変異誘発又は誘導体化によって修飾されうる。ポリペプチド配列は、ループ配列によって結合された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ－バレル構造を含む場合に、抗体ドメインであるとみなされる。

「抗体」という用語は、抗原結合誘導体及びその断片を包含することが理解されよう。誘導体は、本発明の１つ又は複数の抗体又は抗体ドメインの任意の組合せ及び／又は本発明の抗体の任意のドメインが、他の抗体又は抗体型式、例えば、ＣＤＲループ、受容体ポリペプチド、更にはリガンド、スキャフォールドタンパク質、酵素、標識、毒素等を含む結合構造等の１つ又は複数の他のタンパク質の任意の位置で融合されうる融合タンパク質である。

「抗体及びその抗原結合断片」という用語は特に、二重特異性結合特性を示すポリペプチド又はタンパク質、即ち、標的抗原ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３を指す。

「抗体断片」は、無傷の抗体が結合する抗原を結合する無傷の抗体の一部を含む無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ融合体、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）_２－融合体、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＳｃＦｖＦｃ、二特異性抗体、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。更に、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴を有する、即ち、ＶＬドメインと一緒に集合することが可能であるか、又はＶＬドメインの特徴を有する、即ち、機能性抗原結合部位に対してＶＨドメインと一緒に集合することが可能であり、それにより、完全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。本明細書中で言及される抗体断片はまた、Ｆｃａｂ（商標）等の抗原結合領域を含有する１つ又は複数の構造ループ領域を含むＦｃドメイン、又はＦｃ領域が、第２の別個の抗原結合部位を含有するＦｃａｂによって置き換えられたＩｇＧ構造を有する完全長抗体型式を包含する。

本明細書中で使用する場合、「Ｆａｂ断片又はＦａｂ」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖、並びに重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。

本明細書中で使用する場合、「Ｆａｂアーム」は、ヒンジ領域によってＦｃ部分又はＦｃドメインに連結されたＦａｂ断片を指す。

「Ｎ末端」という用語は、Ｎ－末端の最終アミノ酸を意味する。

「Ｃ末端」という用語は、Ｃ末端の最終アミノ酸を意味する。

「二重特異性Ｔ細胞誘導体（ｅｎｇａｇｅｒ）」の「ＢｉＴＥ」は、約５０キロダルトンの単一ペプチド鎖上の、異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）、又は４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である人工モノクローナル抗体を指す。ｓｃＦｖの一方は、ＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方は、ｏｘＭＩＦを介して腫瘍細胞に結合する。

特定の実施形態において、Ｆａｂ－ＢｉＴＥ－Ｆｃという用語は、Ｆａｂアームの１つが二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）に置き換えられているＩｇＧである抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体を指し、それと同時に第２のＩｇＧアームが保存されている。特定の実施形態において、Ｆａｂ－ＢｉＴＥ－Ｆｃは具体的には、配列番号１３７の配列又は配列番号１３７と少なくとも７０％、具体的には７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む：

具体的には、ＦａＢ－ＢｉＴＥは、配列番号１３７、配列番号１５９及び配列番号１４０を含み、具体的には配列番号１３７、配列番号１５９及び配列番号１４０の配列又は配列番号１３７、配列番号１５９及び配列番号１４０と少なくとも７０％、具体的には７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。

これは、既知のＢｉＴＥと比較してより長い半減期をもたらす。

「ＩｇＧ－ｓｃＦｖ」という用語は、ｓｃＦｖの１つを、単一特異性免疫グロブリン（ＩｇＧ）に融合させることによって二重特異性に関して操作された二重特異性抗体の一種を指す。ＩｇＧの特異性は、ｏｘＭＩＦに関するものであってもよく、ｓｃＦｖの特異性は、ＣＤ３に関するものであってもよく、或いはその逆でもよい。更に、軽鎖若しくは重鎖の１つのアミノ末端又はＣ末端のいずれかに、ｓｃＦｖを付加させることができ、これが、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の多様なタイプ：（ｉ）ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、完全長ＩｇＧ ＨＣの１つのＣ末端に連結されたｓｃＦｖ、（ｉｉ）ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖと同じようであるが、但し、ｓｃＦｖがＨＣ Ｎ末端に連結されることを除くｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、（ｉｉｉ）ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ又は（ｉｖ）ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ：それぞれＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧを形成するＩｇＧ軽鎖のＣ若しくはＮ末端に結合されたｓｃＦｖの産生を引き起こす。具体的には、ＩｇＧ－ｓｃＦｖは、１６５ｋＤａから１８５ｋＤａの範囲であり、具体的にＩｇＧ－ｓｃＦｖは、約１７５ｋＤａである。

特定の実施形態において、本発明のＩｇＧ－ＳｃＦｖ（抗ｏｘＭＩＦ ＩｇＧ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖ融合タンパク質）は、配列番号１３９及び／又は配列番号１４０の配列又は配列番号１３９及び／又は配列番号１４０と少なくとも７０％、具体的には７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む：

具体的に、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ（抗ｏｘＭＩＦ ＩｇＧ×抗ＣＤ３ｓｃＦｖ融合タンパク質）は、配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１６３を含み、具体的には配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１６３の配列又は配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１６３と少なくとも７０％、具体的には７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。

別の特定の実施形態において、（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃという用語は、一方のＦａｂアームが抗ｏｘＭＩＦ ｓｃＦｖに置き換えられており、他方のＦａｂが抗ＣＤ３ ｓｃＦｖで置き換えられているＩｇＧを指す。特定の実施形態において、（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃは、配列番号１５６若しくは配列番号１５７の配列又は配列番号１５６若しくは配列番号１５７と少なくとも７０％、具体的には７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む：

特定の実施形態によれば、本明細書中に記載する抗体は、例えば、親和性タグ、溶解度増強タグ及びモニタリングタグであるが、これらに限定されない、精製及び／又は検出用の１つ又は複数のタグを含みうる。

具体的には、親和性タグは、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、抗体用のペプチド基質、キチン結合ドメイン、ＲＮＡ分解酵素Ｓペプチド、プロテインＡ、β－ガラクトシダーゼ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、ＨＡタグ、及びｃ－Ｍｙｃタグからなる群から選択され、具体的には、タグは、１つ又は複数のＨを含むＨｉｓタグであり、より具体的には、それは、ヘキサヒスチジンタグである。

親和性タグは、本明細書中に記載する抗体の任意のドメインに、具体的にはＦｃ部分に、より具体的にはＣＨ３ドメイン又はＦａｂドメインに、具体的にはＶＬに結合されうる。

「融合される」又は「結合される」とは、構成成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。

「リンカー」という用語は、本明細書中で使用する場合、ペプチドリンカーを指し、具体的には１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個又はそれよりも多いアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましく、具体的にはリンカーは、５個のアミノ残基又は５アミノ残基の繰り返し単位からなる。個々のドメインを結合するように設計されたペプチドは好ましくは、結合されたドメインのフォールディングを妨害しない。具体的には、リンカー配列は、グリシン及び／又はセリン残基を含み、より具体的にはリンカーは、（ＧＧＳ）_ｎ、又は（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１６６）（式中、ｎは、１、２、３であるか、又はそれよりも大きい）である。

上記ペプチドリンカーは、具体的には本明細書中に記載する抗体又は抗原結合部分のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を結合しうる。ペプチドリンカーはまた、ＣＤ３ ＶＨ及びｏｘＭＩＦ ＶＨ等の種々の結合部位の２つのＶＨ配列を結合しうる。

具体的には、ＩｇＧがｏｘＭＩＦを認識し、ｓｃＦｖがＣＤ３を認識する場合、抗ＣＤ３可変軽（ＶＬ）及び可変重（ＶＨ）を結合するペプチドリンカーは、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１６４）若しくはＧＧＳ又はそれらの繰り返し配列、具体的には（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（式中、ｎは、１、２、３であるか、又はそれよりも大きく、具体的にはｎは３である）又は（ＧＧＳ）_ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５であるか、又はそれよりも大きく、具体的にはｎは５である）を含む。

代替的な実施形態において、ＩｇＧ ＦａｂアームがｏｘＭＩＦを認識し、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーがｏｘＭＩＦ及びＣＤ３を認識する場合、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３結合領域のＶＬドメイン及びＶＨドメインを結合するペプチドリンカーは、配列（ＧＧＧＳ）_ｎ若しくは（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、又はそれらの任意の組合せ（式中、ｎは、１、２、３、４、５であるか、又はそれよりも大きい）を有する。ペプチドリンカーはまた、ｏｘＭＩＦ ＶＨ及びＣＤ３ ＶＨを結合するために存在する可能性があり、具体的には配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１６５）、（ＧＧＳ）_ｎ又は（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（式中、ｎは、１、２、３、５であるか、又はそれよりも大きい）を含む。

更なる実施形態において、ＦａｂアームがともにｓｃＦｖに置き置き換えられており、一方のｓｃＦｖがｏｘＭＩＦを標的とし、他方のｓｃＦｖがＣＤ３を標的とする場合、抗ＣＤ３ ＶＬ鎖及びＶＨ鎖を結合するペプチドリンカーは、具体的には、配列（ＧＧＳ）_ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５であり、具体的にはｎは５である）を有しうる。ペプチドリンカーはまた、Ｆｃアームを抗ＣＤ３ ＶＨと結合することができ、具体的には配列（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（式中、ｎは、１、２、３であるか、又はそれよりも大きく、具体的にはｎは３である）を含む。

「免疫グロブリン」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィドで結合されている２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。重鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、軽鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結される本質的に２つのＦａｂ分子（Ｆａｂアーム）及びＦｃドメインからなる。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの１つに帰属させてもよく、それらのいくつかは、サブタイプ、例えば、γ_１（ＩｇＧ_１）、γ_２（ＩｇＧ_２）、γ_３（ＩｇＧ_３）、γ_４（ＩｇＧ_４）、α_１（ＩｇＡ_１）及びα_２（ＩｇＡ_２）に更に分類されうる。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの１つに帰属されうる。

「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来するのに対して、重鎖及び／又は軽鎖の残部が、異なる供給源又は種に由来する、通常は組換えＤＮＡ技法によって調製される抗体を指す。キメラ抗体は、ウサギ又はマウスの可変領域と、ヒト定常領域とを含みうる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む発現免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を産生する方法は、従来の組換えＤＮＡに関与し、遺伝子トランスフェクション技法が当該技術分野で周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１（１９８４）６８５１－６８５５）。

「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される抗体、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト供給源に由来する抗体、又は他のヒト抗体コード配列のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を保有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、具体的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。キメラ抗体及びヒト化抗体に関するように、「ヒト抗体」という用語はまた、本明細書中で使用する場合、例えば、「クラススイッチング」、即ちＦｃ部分の変化又は突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への変化、及び／又はＩＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、定常領域において修飾されるかかる抗体を含む。

「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用する場合、ＨＥＫ細胞、ＮＳ０若しくはＣＨＯ細胞等の宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離される抗体、或いは宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体等の、組換え手段によって調製、発現、創出又は単離されるヒト抗体全てを包含すると意図される。組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し、且つそれらに関連する一方で、天然ではｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に存在しない可能性がある配列である。

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。概して、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来である。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３に記載されるようなサブグループである。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）由来のアミノ酸残基とを含む、ヒト化を受けたキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、実質的に全ての、少なくとも１つの、通常は２つの可変ドメインを含み、ここで、全て又は実質的に全てのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体のＨＶＲに相当し、全て又は実質的に全てのＦＲは、ヒト抗体のＦＲに相当する。ヒト化抗体は、任意選択により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含みうる。本発明によって包含されるヒト化抗体の他の形態は、例えばＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、新たな特性を発するように、定常領域が元の抗体の定常領域から更に修飾又は変更されている抗体である。

本発明による「二重特異性抗体（Ｂｓａｂ）」は、２つの異なる結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３に特異的である。二重特異性抗体という用語は本明細書中で使用する場合、ｏｘＭＩＦに対する１つ又は２つの結合部位及びＣＤ３に対する１つの結合部位を有する抗体又はその誘導体若しくは断片を表す。二重特性抗体の型式の例は、Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６７，９５－１０６及びＢｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．，２０１７，ＭＡＢＳ，９，２，１８２－２１２に記載されるような二重特異性ＩｇＧ（ＢｓＩｇＧ）、更なる結合部位部分が付加されたＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質、ＢｓＡｂコンジュゲート、ハイブリッドＢｓＩｇＧ、可変ドメインのみの二重特性抗体分子、ＣＨ１／ＣＬ融合タンパク質、Ｆａｂ融合タンパク質、修飾Ｆｃ及びＣＨ３融合タンパク質、付加されたＩｇＧ－ＨＣ融合体、付加されたＩｇＧ－ＬＣ融合体、付加されたＩｇＧ－ＨＣ＆ＬＣ融合体、Ｆｃ融合体、ＣＨ３融合体、ＩｇＥ／ＩｇＭ ＣＨ２融合体、Ｆ（ａｂ’）_２融合体、ＣＨ１／ＣＬ、修飾ＩｇＧ、非免疫グロブリン融合タンパク質、Ｆｃ修飾されたＩｇＧ、二特異性抗体等でありうるが、これらに限定されない。

Ｆｃ部分は、ヘテロ二量体化のためにＣＨ３を操作するようにノブ・イントゥ・ホール突然変異を含むように修飾されうる。ノブは、ＣＨ３ドメイン間の界面にある小さなアミノ側鎖を、より大きなもので置き換えることによって創出され、ホールは、大きな側鎖を、より小さなもので置き換えることによって構築される。具体的には、ＥＵ付番スキームに従って、一方のＦｃアームは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含むことができ、他方のＦｃアームは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むことができる。代替手段として、Ｆｃアームを修飾するのに鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）技術を使用して、非対称性の二重特異性抗体様分子を生成することができる。当該技術は、保存されるＣＨ３ドメイン内の免疫グロブリンの構造的に関連した配列の交換に基づく。ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインにおけるヒトＩｇＡ及びＩｇＧ由来の交互配列は、ＡＧ及びＧＡと呼ばれる２つの非対称性であるが、相補的なドメインを生成することができる。ＳＥＥＤ設計により、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成が可能である一方で、ＡＧ及びＧＡ ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を支持しない（Ｍｕｄａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２４（５），４４７－５４）。

「抗原」という用語は、本明細書中で用語「標的」又は「標的抗原」と交換可能に使用される場合、抗体結合部位によって認識される全標的分子又はかかる分子の断片を指す。具体的には、抗原の下部構造、一般的に、免疫学的に関連性のある「エピトープ」、例えばＢ－細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープと称される抗原、例えば、ポリペプチド又は炭水化物構造は、かかる結合部位によって認識されうる。

「エピトープ」という用語は、本明細書中で使用する場合、特に、特異的な結合パートナーを完全に構成するか、又は本発明の抗体型式の結合部位に対する特異的な結合パートナーの一部でありうる分子構造を指す。エピトープは、炭水化物、ペプチド構造、脂肪酸、有機物質、生化学物質若しくは無機物質又はそれらの誘導体及びそれらの任意の組合せで構成されうる。エピトープが、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質等のペプチド構造に含まれる場合、エピトープは通常、少なくとも３アミノ酸、好ましくは５～４０アミノ酸、具体的には約１０未満のアミノ酸、具体的には４～１０アミノ酸を含む。エピトープは、線状エピトープ又は立体構造的エピトープのいずれかでありうる。線状エピトープは、ポリペプチド又は炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントで構成される。線状エピトープは、近接しうるか、又は重複しうる。立体構造的エピトープは、ポリペプチドをフォールディングして、三次構造を形成することによって一緒にまとめられたアミノ酸又は炭水化物で構成され、アミノ酸は、線状配列において、必ずしも互いに隣接するとは限らない。かかるｏｘＭＩＦエピトープは、ｏｘＭＩＦの中心領域内に位置する配列ＥＰＣＡＬＣＳ（配列番号１４５）でありうる。しかしながら、エピトープはまた、ｏｘＭＩＦのＣ末端上にも存在しうる。

「抗原結合ドメイン」又は「結合ドメイン」又は「結合部位」という用語は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、また抗原の一部又は全てに相補的な区域を含む抗原結合部分の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分にのみ結合する場合があり、その特定の部分は、エピトープと称される。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。

「結合部位」という用語は、本発明の抗体に関して本明細書中で使用する場合、抗原と結合相互作用が可能な分子構造を指す。通常、結合部位は、各種抗原に結合機能を付与する様々な構造を有する特異的な領域である、本明細書中で「ＣＤＲ結合部位」とも称される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置する。様々な構造は、抗体の天然レパートリー、例えば、マウス又はヒトレパートリーに由来しうるか、或いは例えば突然変異誘発によって、具体的には無作為化技法によって、組換え的に又は合成的に産生されうる。これらには、突然変異誘発されたＣＤＲ領域、可変抗体ドメインのループ領域、特に、抗体のＣＤＲループ、例えばＶＬ及び／又はＶＨ抗体ドメインのいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ループが包含される。本明細書により使用される場合の抗体型式は通常、それぞれが抗原に特異的な１つ又は複数のＣＤＲ結合部位を含む。

「認識する」、「標的とする」又は「結合する」という用語は、本明細書中で交換可能に使用することができる。

「特異的な」又は「二重特異性」という用語は、本明細書中で使用する場合、分子の異種集団において目的の同族リガンドを決定する結合反応を指す。

本明細書中では、結合反応は、少なくともＣＤ３抗原及びｏｘＭＩＦ抗原との反応である。したがって、指定条件、例えば、イムノアッセイ条件下で、特定の標的に特異的に結合する抗体は、試料中に存在する他の分子に、著しい量では結合せず、具体的には、その抗体は、特異的な結合部位が通常、他の標的と交差反応しない、還元型ＭＩＦＡへの検出可能な結合を示さない。依然として、特異的な結合部位は、標的の１つ又は複数のエピトープ、アイソフォーム又は変異体に特異的に結合しうるか、又は他の関連標的抗原、例えば、相同体若しくは類似体に対して交差反応でありうる。

特異的な結合は、結合が、選択に応じて、標的同一性、高、中若しくは低の親和性又はアビディティに関して選択されることを意味する。選択的な結合は通常、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３等の標的抗原に対する結合定数又は結合動態が、標的抗原ではない抗原に対する結合定数又は結合動態と比較して、少なくとも１０倍異なり、好ましくは、その差が少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍である場合に達成される。

本発明の二重特異性抗体は、具体的には特異的結合特性を有する２つ又は３つの部位を含み、ここで、２つの異なる標的抗原、ＣＤ３及びｏｘＭＩＦは、抗体によって認識される。したがって、例示的な二重特異性抗体型式は、結合部位がそれぞれ、異なる抗原、ＣＤ３及びｏｘＭＩＦを特異的に結合することが可能である２つの結合部位、又は２つの結合部位がｏｘＭＩＦに、１つの結合部位がＣＤ３に結合する３つの結合部位を含みうる。

「価」という用語は、本出願内で使用する場合、抗体分子における指定数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗体分子における、それぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を表す。

本発明による二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」でありうる。

「一価」という用語は、抗体の結合部位に関して本明細書中で使用する場合、標的抗原に対して向けられた唯一の結合部位を含む分子を指す。

具体的には、本発明の抗体は、ｏｘＭＩＦに関して一価又は二価であり、ＣＤ３に関して一価であり、したがって、全部で二価又は三価のいずれかであることが理解されよう。

更なる実施形態によれば、抗体は、エフェクターＴ細胞上で発現される１つ又は複数の抗原、具体的には、ＡＤＡＭ１７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２ａ、ＣＤ４０、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７４、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ１３７、ＣＤ１７７、ＣＥＡＥＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＨＬＡ－Ｄｒａ ｃａｈｉｎ、ＫＩＲ、ＬＳＥＣｔｉｎ又はＳＬＣ４４Ａ２の１つ又は複数を特異的に認識する１つ又は複数の更なる結合部位を含みうる。

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列において超可変性であり、及び／又は構造的に規定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域それぞれを指す。概して、自然四鎖抗体は、ＶＨにおける３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬにおける３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは概して、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域部分に関連して、本明細書中で交換可能に使用される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて様々である。抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかどうかを、当業者は日常的に決定することができる。

Ｋａｂａｔは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列に対する付番システムを規定した。当業者は、「Ｋａｂａｔ付番」のこのシステムを、配列自体を超えるいかなる実験データに頼らずに、任意の可変領域配列に一義的に帰属させることができる。本明細書中で使用する場合、「Ｋａｂａｔ付番」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」によって記載される付番システムを指す。別記しない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基位置の付番への言及は、Ｋａｂａｔ付番システムに従う。特定の実施形態において、定常領域の付番は、ＥＵ付番指標に従う。

ＣＤＲはまた、「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含み、これらは、抗原と接触する残基である。ＳＤＲは、簡易ＣＤＲ、又はａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。別記されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書中では上述のＫａｂａｔらに従って付番される。

特定の実施形態において、抗ＣＤ３結合部位は、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、フォラルマブ、ソリトマブ、ブリナツモマブ、パソツキシズマブ、シビサタマブＳＰ３４、Ｘ３５、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１及びＷＴ－３１並びに適用可能であれば、それらの任意のヒト化誘導体からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

本発明の抗体は、具体的には、以下に記載するような配列の１つ又は複数を含む。

抗ｏｘＭＩＦ抗体の可変重鎖配列は、下記の通りでありうる：

抗ｏｘＭＩＦ抗体の可変軽鎖配列は、下記の通りでありうる：

抗ＣＤ３抗体の可変重鎖配列は、下記の通りでありうる：

抗ＣＤ３抗体の可変軽鎖配列は、下記の通りでありうる：

抗ＣＤ３抗体の可変重鎖配列はまた、下記の通りでありうる：

抗ＣＤ３抗体の可変軽鎖配列は更に、下記の通りでありうる：

更なる代替的な実施形態において、抗ＣＤ３抗体の可変重鎖配列はまた、下記の通りでありうる：

更なる代替的な実施形態において、抗ＣＤ３抗体の可変軽鎖配列はまた、下記の通りでありうる：

具体的には、ＣＤ３のε鎖は、配列

を含みうる。

具体的には、ＣＤ３のδ鎖は、配列

を含みうる。

具体的には、ＣＤ３のγ鎖は、配列

を含みうる。

特定の実施形態によれば、ｏｘＭＩＦ結合部位によって特異的に認識されるｘＭＩＦのドメインは、配列

を含む。

具体的には、配列番号１３４～配列番号１４４及び配列番号１５８のいずれか１つが、１個、２個、３個、又は４個の点突然変異を含みうる。

「点突然変異」は、種々のアミノ酸に関して１つ又は複数の単一アミノ酸或いは二重アミノ酸の置換又は交換、欠失又は挿入における、操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として特に認識される。好ましい点突然変異は、同じ極性及び／又は電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関して、アミノ酸は、６１個のトリプレットコドンによってコードされる２０個の天然に存在するアミノ酸を指す。これら２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を有するアミノ酸に分割することができる：

「中性」アミノ酸を、各々の３文字コード及び１文字コード並びに極性と併せて、以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）無極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）無極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）無極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）無極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）無極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）無極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）無極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）無極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
スレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）無極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）無極性、中性；及び
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、正（１０％）中性（９０％）。
「正に」帯電したアミノ酸は、
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、正；及び
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、正
である。
「負に」帯電したアミノ酸は、
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、負；及び
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、負
である。

本明細書中で同定されるポリペプチド配列に関する「パーセント（％）の配列同一性」は、最大のパーセントの配列同一性を達成するように、必要に応じて、配列を整列させて、ギャップを導入した後の、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして定義され、配列同一性の一部として、いかなる保存的置換も考慮しない。当業者は、比較される配列の完全長にわたる最大の整列を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

本発明によれば、ＣＤＲ又はフレームワーク領域配列の配列同一性は、本明細書中に記載する各々の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％である。

「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物として、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、個体又は対象は、ヒトである。

「単離核酸」は、その天然環境の構成成分と分離された核酸分子を指す。単離核酸は、核酸分子を通常含有する細胞中に含有される核酸分子を包含するが、核酸分子は、染色体外で、又はその天然染色***置とは異なる染色***置で存在する。

「抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体をコードする単離核酸」は、単一ベクター又は別々のベクター中にかかる核酸分子を包含する、抗体重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子、及び宿主細胞における１つ又は複数の位置で存在するかかる核酸分子を指す。

「実質的な交差反応なし」は、分子（例えば、抗体）が、特に当該標的抗原と比較した場合に、分子（例えば、標的抗原に密接に関連した抗原）の実際の標的抗原とは異なる抗原、具体的には還元型ＭＩＦを認識しないか、又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体は、実際の標的抗原とは異なる抗原に、約１０％未満～約５％未満結合しうるか、又は約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満、好ましくは約２％、１％、又は０．５％未満、最も好ましくは約０．２％又は０．１％未満の実際の標的抗原とは異なる抗原からなる量で、実際の標的抗原とは異なる抗原を結合しうる。結合は、例えばＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴であるが、これらに限定されない当該技術分野で既知の方法によって決定されうる。

本発明の抗体の組換え産生は、好ましくは、例えば、抗体型式をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物又はベクターを包含する発現系を含む。

「発現系」という用語は、動作可能な連結で所望のコード配列及び制御配列を含有する核酸分子を指し、その結果、これらの配列で形質転換又はトランスフェクトされた宿主は、コードされるタンパク質を産生することが可能である。形質転換を達成するためには、発現系は、ベクター上に含まれうるが、続いて、関連ＤＮＡは、宿主染色体に組み込まれうる。或いは、発現系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳に使用することができる。

本明細書中で使用する「発現ベクター」は、適切な宿主生物におけるクローニングされる組換えヌクレオチド配列の、即ち組換え遺伝子の転写、及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義される。発現ベクターは、発現カセットを含み、更に、宿主細胞における自己複製のための起源又はゲノム組み込み部位、１つ又は複数の選択可能マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子又はゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８又はハイグロマイシン等の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列及び転写終結因子を通常含み、これらの構成成分は、動作可能に一緒に連結される。「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、本明細書中で使用する場合、自己複製ヌクレオチド配列及びゲノム組み込みヌクレオチド配列を包含する。

具体的には、上記用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）、例えば本発明の抗体型式をコードするヌクレオチド配列が、宿主を形質転換するように宿主細胞に導入され、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進うるビヒクルを指す。プラスミドは、本発明の好ましいベクターである。

ベクターは通常、外来遺伝子が挿入される伝播性物質のＤＮＡを含む。ＤＮＡの一方のセグメントを、ＤＮＡの別のセグメントに挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（ヌクレオチドの特定の基）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を包含する。

「カセット」は、規定の制限部位でベクターに挿入されうる発現産物をコードするＤＮＡのＤＮＡコード配列又はセグメントを指す。カセット制限部位は、適正なリーディングフレームにおけるカセットの挿入を保証するよう設計されている。概して、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ又は複数の制限部位で挿入され、続いて、ベクターによって伝播性ベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞へ運搬される。発現ベクター等のＤＮＡが挿入又は付加されたＤＮＡのセグメント又は配列はまた、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれうる。ベクターの一般的なタイプはプラスミドであり、これは概して、更なる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二重鎖ＤＮＡの自己完結式分子であり、適切な宿主細胞に容易に導入されうる。本発明のベクターは多くの場合、コードＤＮＡ及び発現制御配列、例えば、プロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡを挿入するのに適した１つ又は複数の制限部位を有する。コードＤＮＡは、本発明の抗体型式等の特定のポリペプチド又はタンパク質に関する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、調節するか、又は他の場合には媒介するか、若しくは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であってもよく、又は異なる遺伝子由来であってもよく、同じか、又は異なる生物由来であってもよい。本発明の組換えクローニングベクターは多くの場合、クローニング若しくは発現用の１つ又は複数の複製系、宿主における選択用の１つ又は複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、及び１つ又は複数の発現カセットを包含する。

例えば、本発明の要素を提供又コードするＤＮＡ配列、及び／又は目的のタンパク質、プロモーター、終結因子及び更なる配列をそれぞれライゲーションして、組み込み又は宿主複製に必要な情報を含有する適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者に周知であり、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される。

宿主細胞は、具体的には、本発明によるベクター等の発現構築物でトランスフェクトされた細胞、組換え細胞又は細胞株と理解される。

「宿主細胞株」という用語は、本明細書中で使用する場合、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の樹立されたクローンを指す。宿主細胞株という用語は、本発明の組換え抗体型式等のポリペプチドを産生するように内因性又は組換え遺伝子を発現するのに使用される場合の細胞株を指す。

「産生宿主細胞」又は「産生細胞」は、産生プロセスの産物である本発明の組換え抗体型式を得るように、バイオリアクターにおける培養のための使用準備済の細胞の細胞株又は培養物であると一般的に理解される。本発明による宿主細胞型は、任意の原核細胞又は真核細胞でありうる。

「組換え」という用語は、本明細書中で使用する場合、例えば、具体的には組換えベクター又は組換え宿主細胞において取り込まれた異種配列を用いた「遺伝子操作によって調製されること」又は「遺伝子操作の結果」を意味する。

本発明の二重特異性抗体は、任意の既知の十分に樹立された発現系及び組換え細胞培養偽術を使用して、例えば、細菌宿主（原核生物系）又は酵母、真菌、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞等の真核生物系における発現によって産生されうる。本発明の抗体分子は、ヤギ、植物又はヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を有し、且つマウス抗体産生を欠損している操作されたマウス株であるトランスジェニックマウス等のトランスジェニック生物において産生されうる。抗体はまた、化学合成によって産生されてもよい。

特定の実施形態によれば、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ６、ＣＡＰ、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ハイブリドーマ及びジャーカットからなる群から選択される細胞の産生細胞株である。より具体的には、宿主細胞はＣＨＯ細胞から得られる。

本発明の宿主細胞は、具体的には、例えば、血清に代わるものとして、血漿タンパク質、ホルモン及び成長因子等の他の構成成分を含む無血清培養物中で培養又は維持される。

宿主細胞は、樹立されて、適応されて、無血清下で、任意選択により、動物起源のいかなるタンパク質／ペプチドも含まない培地中で完全に培養される場合に最も好ましい。

抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して、培養培地から回収することができる。

「医薬製剤」という用語は、調製物中に含有される有効成分の生物活性が有効であるのを可能にするような形態で存在し、製剤が投与される対象にとって受け入れられないほど毒性である更なる構成成分を含有しない調製物を指す。

「薬学的に許容可能な担体」は、対象にとって無毒性である有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにそれらの組合せである。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、又は塩化ナトリウムを包含することが好適である。薬学的に許容可能な物質の更なる例は、湿潤剤、又は少量の、湿潤剤若しくは乳化剤、防腐剤又は緩衝液等の補助物質であり、これらは、抗体の寿命又は有効性を高める。

本明細書中で使用する場合、「治療」、「治療する」又は「治療すること」は、治療される個体の自然経過を変更しようとする臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の経過中に実施されうる。治療の所望の効果として、疾患の発症又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的若しくは間接的な病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行の速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の向上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるのに、又は疾患の進行を減速させるのに使用される。

本発明の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体及びそれを含む医薬組成物は、１つ又は複数の他の治療剤、診断剤又は予防剤と組み合わせて投与されうる。更なる治療剤として、治療されるべき疾患に応じて、他の抗癌剤、抗腫瘍剤、抗血管新生剤、化学療法剤、ステロイド、又はチェックポイント阻害剤が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液体溶液（例えば、注射可能な溶液及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸剤、粉剤、リポソーム及び坐剤等の液体、半固形及び固形の投薬形態で存在しうる。好ましい形態は、対象とする投与様式及び治療用途に応じる。典型的な好ましい組成物は、ヒトの受動免疫に使用されるものに類似した組成物等の注射可能な溶液又は注入可能な溶液の形態で存在する。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。好ましい実施形態において、抗体は、静脈内注入又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、抗体は、筋内注射又は皮下注射によって投与される。当業者によって理解されるように、投与経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて様々なである。

抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、１回投与されてもよいが、より好ましくは、複数回投与される。例えば、抗体は、１日３回～６カ月又はそれより長い期間毎に１回、投与されてもよい。投与は、１日３回、１日２回、１日１回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週に１回、２週毎に１回、１カ月毎に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回及び６カ月毎に１回等のスケジュールで行われうる。

「癌」という用語は、本明細書中で使用する場合、増殖性疾患、具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、黒色腫、扁平上皮癌（ＳＣＣ）（例えば、頭頸部癌、食道癌、及び口腔癌）、肝細胞癌、結腸直腸腺癌、腎臓癌、甲状腺髄様癌、星細胞腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、及び悪性セミノーマ（上記癌の任意の難治性バーションを含む）、或いは上記癌の１つ又は複数の組合せを指す。

ｏｘＭＩＦの細胞発現の検出は、本明細書中に記載する抗体を用いて実施することができ、上記抗体は、ｏｘＭＩＦの特定の発現が検出されうるように標識される。抗体標識は、当該技術分野で周知の方法に従って実施されうる。かかる標識として、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、及び生物発光標識でありうるが、これらに限定されない。

本発明は、下記の項目を更に包含する：
１．ｓｃＦｖが２つの重鎖のうち１つのみに融合されるＩｇＧ、
Ｆａｂアームの１つが二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）に置き換えられているＩｇＧ、及び
Ｆａｂアームがともに、異なる結合特異性を有するｓｃＦｖに置き換えられているＩｇＧ
からなる群から選択され、少なくとも１つの、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位と、１つの、ＣＤ３を特異的に認識する結合部位とを含む抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位が、
（ａ）配列番号１、配列番号７、配列番号１３、配列番号１９及び配列番号２６からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ１－Ｈ１、及び
配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０及び配列番号２７からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ２－Ｈ１配列、及び
配列番号３、配列番号９、配列番号１５及び配列番号２１からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ３－Ｈ１配列
を含む重鎖可変領域、並びに
（ｂ）配列番号４、配列番号１０、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８及び配列番号１３８からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ１－Ｌ１配列、及び
配列番号５、配列番号１１、配列番号１７、配列番号２３及び配列番号２５からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ２－Ｌ１配列、及び
配列番号６、配列番号１２、配列番号１８及び配列番号２４からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ３－Ｌ１配列
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
２．前記ＩｇＧが、ｏｘＭＩＦを認識し、前記ｓｃＦｖが、ＣＤ３を認識し、前記ＣＤ３可変軽（ＶＬ）及び可変重（ＶＨ）鎖を結合するペプチドリンカーを更に含む、項目１の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
３．前記ＩｇＧ Ｆａｂアームが、ｏｘＭＩＦを認識し、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーが、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３を認識し、ＶＬ鎖及びＶＨ鎖を結合するペプチドリンカーを更に含む、項目１の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
４．Ｆａｂアームがともに、ｓｃＦｖで置き換えられ、一方のｓｃＦｖが、ｏｘＭＩＦを標的とし、他方のｓｃＦｖが、ＣＤ３を標的とし、ＶＬ鎖及びＶＨ鎖を結合するペプチドリンカーを更に含む、項目１の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
５．配列番号１、配列番号７、配列番号１３、配列番号１９及び配列番号２６からなる群から選択されるＣＤＲ１－Ｈ１配列、及び
配列番号２、配列番号８、配列番号１４、配列番号２０及び配列番号２７からなる群から選択されるＣＤＲ２－Ｈ１配列、及び
配列番号３、配列番号９、配列番号１５及び配列番号２１からなる群から選択されるＣＤＲ３－Ｈ１配列、及び
配列番号４、配列番号１０、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、及び配列番号１３８からなる群から選択されるＣＤＲ１－Ｌ１配列、及び
配列番号５、配列番号１１、配列番号１７、配列番号２３及び配列番号２５からなる群から選択されるＣＤＲ２－Ｌ１配列、及び
配列番号６、配列番号１２、配列番号１８、配列番号２４、及び配列番号１５３からなる群から選択されるＣＤＲ３－Ｌ１配列
である前記ＣＤＲ配列それぞれにおいて、０個、１個、又は２個の点突然変異を含む、項目１～４のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
６．前記ＣＤ３を特異的に認識する結合部位が、
（ａ）配列番号７７、配列番号８６及び配列番号９２からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ１－Ｈ２配列、及び
配列番号７８、配列番号８７、及び配列番号９３からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ２－Ｈ２、及び
配列番号７９、配列番号８８、配列番号９４、及び配列番号１４９からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ３－Ｈ２
を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号８０、配列番号８３、配列番号８９及び配列番号９５からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ１－Ｌ２、及び
配列番号８１、配列番号８４、配列番号９０及び配列番号９６からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ２－Ｌ２、及び
配列番号８２、配列番号８５、配列番号９１、配列番号９７、及び配列番号１５１からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲ３－Ｌ２
を含む軽鎖と
を含む、項目１～４のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
７．配列番号７７、配列番号８６及び配列番号９２からなる群から選択されるＣＤＲ１－Ｈ２配列、及び
配列番号７８、配列番号８７、及び配列番号９３からなる群から選択されるＣＤＲ２－Ｈ２配列、及び
配列番号７９、配列番号８８、配列番号９４、及び配列番号１４９からなる群から選択されるＣＤＲ３－Ｈ２配列、及び
配列番号８０、配列番号８３、配列番号８９及び配列番号９５からなる群から選択されるＣＤＲ１－Ｌ２配列、及び
配列番号８１、配列番号８４、配列番号９０及び配列番号９６からなる群から選択されるＣＤＲ２－Ｌ２配列、及び
配列番号８２、配列番号８５、配列番号９１、配列番号９７、及び配列番号１５１からなる群から選択されるＣＤＲ３－Ｌ２配列
である前記ＣＤＲ配列それぞれにおいて、０個、１個、又は２個の点突然変異を含む、項目１～６のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
８．配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号７７、配列番号７８、配列番号１４９、配列番号８３、配列番号８４、及び配列番号１５１の配列を含む、項目１～７のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
９．前記ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位が、配列番号１５８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号１３４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９．５％の同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、項目１～８のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
１０．前記ＣＤ３を特異的に認識する結合部位が、配列番号１３５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号１３６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、項目１～９のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
１１．配列番号１５９、配列番号１３７、配列番号１４０、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３のアミノ酸配列、又は配列番号１５９、配列番号１３７、配列番号１４０、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～１０のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
１２．項目１～１１の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
１３．癌の治療における、具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌の治療における使用のための、項目１～１１のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体又は項目１２の医薬組成物。
１４．薬剤としての使用のための、項目１～１１のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
１５．項目１～１１のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体をコードする単離核酸分子。
１６．項目１５の核酸分子を含む発現ベクター。
１７．項目１６記載のベクターを含む宿主細胞。
１８．項目１～１１のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体を産生する方法であって、宿主細胞において該抗体をコードする核酸を発現することを含む、方法。
１９．ｏｘＭＩＦの細胞発現を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、試験されるべきヒト細胞を含む生物学的試料を、項目１～１１のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体と接触させることと、
前記抗体の結合を検出することと
を含み、前記抗体の結合が、該細胞上のｏｘＭＩＦの存在を示し、それにより、該細胞がｏｘＭＩＦを発現するかどうかを検出する、方法。
２０．前記生物学的試料が、無傷のヒト細胞、組織、バイオプシープローブ、又は目的の細胞の膜画分を含む、項目１９のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
２１．抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体が、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、及び生物発光標識からなる群から選択される検出可能な標識で標識される、項目１９又は２０のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
２２．対象においてｏｘＭＩＦを発現する癌を診断する際の使用のための、項目１～１１の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体であって、検出可能な標識にコンジュゲートされている、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。

上述の説明は、下記の実施例を参照して、より完全に理解されるであろう。しかしながら、かかる実施例は、本発明の１つ又は複数の実施形態を実行する方法を単に表すに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例１：
二重特異性抗体の生化学的特徴
抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体を、以下に記載するように試験して、品質及び機能性を保証した。
１）同一性：方法：エレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）
２）分子完全性：方法：ＳＥＣ多角度光散乱法（ＳＥＣ ＭＡＬＳ）
３）純度：方法：ＳＤＳ ＰＡＧＥ
４）結合及び親和性：方法：以下に記載するようなＥＬＩＳＡ、ビアコア、ＦＡＣＳ

Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５；１９５：２３４３－２３５２に従うＥＬＩＳＡ：ｏｘＭＩＦ特異性の決定に関して、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体を、マイクロプレートにコーティングして、組換えＭＩＦ（対照）、ｏｘＭＩＦ、ＤＴＴで還元したｏｘＭＩＦ（対照）とともにインキュベートする。捕捉されたＭＩＦ又はｏｘＭＩＦを、ウサギ抗ＭＩＦ Ａｂ及びヤギ抗ウサギ－ＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートで検出する。プレートを３，３’，５，５’－テトラメチルベンジンで染色する。ＣＤ３特異性の決定に関して、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体をマイクロプレートにコーティングして、組換えヒトＣＤ３イプシロンタンパク質とともにインキュベートする。捕捉されたＣＤ３を、ウサギ抗ＣＤ３ Ａｂ及びヤギ抗ウサギ－ＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートで検出する。プレートを３，３’，５，５’－テトラメチルベンジンで染色する。

Ｈｏｅｌｌｒｉｅｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１８ Ｆｅｂ ５；８２０：２０６－２１６に従うＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）：抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３（抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３）二重特異性抗体の結合親和性及び速度定数は、抗体捕捉方式（センサチップ上に捕捉された抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性ａｂ）又は抗原捕捉方式（センサチップ上に捕捉された組換えＭＩＦ又は組換えＣＤ３（イプシロン、デルタ又はガンマ鎖））のいずれかを使用して、表面プラズモン共鳴によって決定する。測定は、Ｔ２００ Ｂｉａｃｏｒｅ機器で実施する。

具体的には、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体又は非結合対照抗体を、標準的なアミンカップリング条件を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５光センサチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）に固定化する。組換えＭＩＦを、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）中で、プロクリン３００（活性構成成分５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン；Ｓｉｇｍａ社）の存在下で５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ又は１５０ｎＭの濃度に希釈して、ＭＩＦを、ｏｘＭＩＦ代替物に変換する（Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５；１９５：２３４３－２３５２）。プロクリン３００で処理したＭＩＦを、固定化された抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体に適用して、親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で測定する。一連の濃度の動態を、各結合曲線の、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によって提供される質量輸送の埋め合わせを有する反復性ラングミュア１：１相互作用モデルへの局所的な同時結合／解離フィッティングによって分析する。

ＦＡＣＳ：ｏｘＭＩＦ陽性癌細胞（例えば、ＰＣ３又はＡ２７８０）を、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性ａｂ又は対照とともにインキュベートする。非標識Ａｂは、Ｒ－ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂ（Ｓｉｇｍａ社から）によって検出される。データは、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で獲得される。

実施例２：
生体内分布及びＰＫ研究
抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体の生体内分布及び薬物動態（ＰＫ）を、ＰＥＴ画像処理によって決定する。二重特異性抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体を標識して、腫瘍、循環及び主要臓器におけるタンパク質の薬物動態を、皮下ＳＫＯＶ－３腫瘍及び別の適正な細胞株を保有するＳＣＩＤマウスにおいて決定する。

探索ＰＤ研究
１）異種移植片ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ＳＫＯＶ－３モデル：抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の用量応答曲線を、ヒトリンパ球を適用する卵巣癌に関するＮＯＤ／ＳＣＩＤ ＳＫＯＶ－３異種移植片マウスモデルにおいて決定する（Ｘｉｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１７）１０，７８０－７８５）。

簡潔に述べると、新鮮な培養ＳＫＯＶ－３細胞（１×１０^６個）を、２００μｌ容量で新鮮な単離ヒトＰＢＭＣ（５×１０^６個）とともに混合し、５週齢の雄ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下的に同時移植する。腫瘍細胞注入の２時間後、マウスを、腹腔内注射によって３日毎に抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体で処理する。抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は６回用量で、各々の対照二重特異性抗体は最も高い用量で適用される。マウスを秤量して、腫瘍成長を、キャリパーを使用して１週に２回測定する。腫瘍容積を１／２（長さ×幅^２）として算出する。

代替法として、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体のＰＤを、生物発光によってモニタリングする。簡潔に述べると、３５週齢のＮＳＧマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）それぞれに、０日目に１×１０^６個のＩＧＲＯＶ１－ｆｆｌｕｃを腹腔内に（ｉ．ｐ．）付与する。２日目に、動物に、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬストック溶液、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）をｉ．ｐ．注射して、平均生物発光によってそれぞれ６匹の動物の５つの群に分割する。６日目に、各動物（非処理コホートは除く）に、１×１０^７個の健常なドナーＰＢＭＣから展開させた初代Ｔ細胞をｉ．ｐ．注射して、１時間後、４つの異なる用量の抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３又はｐＢＳ単独をｉ．ｐ．注射した。これを毎日総計１０回（６日目から１５日目まで）のｉ．ｐ．注射を繰り返した。３日～４日毎に、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリンによるｉ．ｐ．注射の５分後に、生物発光画像処理によって、腫瘍成長をモニタリングする。マウスの重量を、１日～４日毎に測定する。

２）原発卵巣ヒト異種移植片モデル：本質的にＳｃｈｌｅｒｅｔ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５（７）：２８８２－９に記載されるように、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を試験する。

簡潔に述べると、組織学的に証明された卵巣癌患者の腹膜転移の外科的切除後に、原発腫瘍検体を５０ｃｍ^３～１００ｃｍ^３の立方体に切断して、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植する。動物を抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体型式又は対照抗体でｉ．ｖ．処理する。抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は３回用量で、各々の対照は最も高い用量で適用される。２つの垂直寸法でキャリパーを用いて１週に２回、腫瘍サイズを測定して、腫瘍容積＝［（幅^２×長さ）／２］に従って、腫瘍容積を算出する。

代替法として、健常なドナーのヘパリン処理した新鮮な全血から単離した１×１０^６個のヒトＰＢＭＣを、２００μｌの最終容量で５×１０^５個の原発腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）とともに混合する。ＰＢＭＣエフェクター細胞：標的細胞混合物（Ｅ：Ｔ ２：１）を、各ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右側腹部にｓ．ｃ．注射する。３つの異なる用量による接種の２時間後に開始して、マウスを、抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３抗体又はＰＢＳ対照ビヒクルで静脈内処理する。

抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３抗体による処理によるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける樹立された腫瘍の排除に関して、５×１０^６個のＴＩＣ及び１×１０^７個のヒトＰＢＭＣの混合物を、１群当たり５匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに接種して、固形腫瘍形成を可能にする。４日目の腫瘍樹立後、マウスに、３つの異なる用量の抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３抗体で、又はビヒクル対照で、ＰＢＭＣの存在下で１４日間ｉ．ｖ．処理する。

実施例３：
実施例で使用する抗体に関する概要。各々の型式を図２に図式的に表す。

Ｃ００６１（Ｆｃに融合された抗ｏｘＭＩＦ Ｆａｂ及び抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ；Ｆａｂ－ＢｉＴＥ－Ｆｃ）：

ポリペプチド１：

ポリペプチド２：

ポリペプチド３：

Ｃ００６２（Ｆｃに融合された抗ｏｘＭＩＦ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ（ｏｘＭＩＦ）－ｓｃＦｖ（ＣＤ３）－Ｆｃ；（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ）：

ポリペプチド１：

ポリペプチド２：

Ｃ００８６（重鎖に融合された１つの単一抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する完全抗ｏｘＭＩＦ ＩｇＧ）

ポリペプチド１：

ポリペプチド２：

ポリペプチド３：

Ｃ０１０７（Ｆｃに融合された抗ｏｘＭＩＦ Ｆａｂ及び抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ；Ｆａｂ－ＢｉＴＥ－Ｆｃ）：

ポリペプチド１：

ポリペプチド２：

ポリペプチド３：

Ｃ０１１１（Ｆｃに融合された抗ｏｘＭＩＦ Ｆａｂ及び抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ；Ｆａｂ－ＢｉＴＥ－Ｆｃ）：

ポリペプチド１：

ポリペプチド２：

ポリペプチド３：

実施例４：ｏｘＭＩＦ－ＣＤ３ブリッジングＥＬＩＳＡ
組換えヒトＭＩＦを、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌでマイクロウェルプレートに固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５；１９５：２３４３－２３５２に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、二重特異性抗体を、４μｇ／ｍｌの濃度でプレートに添加した。ＦＬＡＧでタグ付けしたＣＤ３－ε－δ－Ｆｃ融合タンパク質の一連の希釈物を添加して、結合されたＣＤ３を、モノクローナルマウス抗ＦＬＡＧタグ－ＨＲＰコンジュゲートを使用して検出した。ＯＤを４５０ｎＭで測定した。

二重特異性抗体Ｃ００６１及びＣ００６２の、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３への同時結合を図３に示す。

図３は、抗ｏｘＭＩＦ二重特異性抗体Ｃ００６１及びＣ００６２の、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３への同時結合を示す。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を陰性対照として使用した。

実施例５：ｏｘＭＩＦへの結合（ＥＬＩＳＡ）
ＰＢＳ中に希釈した組換えヒトＭＩＦ（１μｇ／ｍｌ）を、マイクロウェルプレートに固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５；１９５：２３４３－２３５２に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、二重特異性抗体を、種々の濃度でプレートに添加した。結合された二重特異性抗体を、プロテインＬ－ＨＲＰコンジュゲートを使用して検出した。プレートを、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加することによって発色させて、発色反応をＨ_２ＳＯ_４で停止させた。ＯＤを４５０ｎＭで測定した。

ＥＬＩＳＡにおいて固定化されたＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）に対する抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１及びＣ００６２結合の結合曲線を図４に表す。単一特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、ｏｘＭＩＦ結合に関する陽性対照として使用した。大まかなＫＤ推定値を反映する結合曲線のＥＣ５０値は、４－パラメーターフィットによって算出した。実験は三重反復で行い、平均ＥＣ５０値を表５に示す。

実施例６：Ｃ００６１及びＣ００６２によるＴ細胞の活性化
製品Ｊ１６２１に関するＰｒｏｍｅｇａ社の技術マニュアルに従って、ＮＦＡＴ応答要素によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する、遺伝子操作されたジャーカットＴ細胞（エフェクター細胞）を使用することによって、Ｔ細胞活性化バイオアッセイを実施した。

抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１及びＣ００６２によるＴ細胞の活性化を図５に示す。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を、対照として使用した。

実施例７：ＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞死滅
ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で染色したＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸癌細胞を、９６ウェル平底プレートに播種した。ＰＢＭＣを、健常なヒトドナーの血液から単離した。抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体の段階希釈物を、ＰＢＭＣとともに腫瘍細胞に添加して、２２時間インキュベートした（エフェクター対標的細胞比：２．５：１）。培地（ＰＢＭＣを含有）を除去した。接着細胞をトリプシン処理して、死滅細胞染色試薬（Ｓｙｔｏｘ（商標））で染色して、フローサイトメトリーで分析して、染色された癌細胞の比死滅の算出を可能にした。

抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性構築物Ｃ００６１及びＣ００６２の存在下でのＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞のＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞死滅を図６に示す。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を、対照として使用した。実験は、５つの異なるドナー由来のＰＢＭＣを使用して繰り返し、比細胞死滅の平均値及び標準偏差（総癌細胞のパーセントとして）を算出して、抗体の濃度に対してプロットした。

実施例８：Ｃ００８６及びＣ０１０７のｏｘＭＩＦ－ＣＤ３ブリッジングＥＬＩＳＡ
二重特異性抗体Ｃ００８７及びＣ０１０７の、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３への同時結合を、図７に示されるようなＦＬＡＧでタグ付けしたＣＤ３ε／δ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度を用いて、実施例４に記載するように決定した。

結果：両分子００８６及びＣ０１０７は、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３に同時に結合することが可能であったことは図７から明白である。

図７は、抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００８６及びＣ０１０７の、ｏｘＭＩＦ及びＣＤ３への同時結合を示す。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を、陰性対照として使用した。

実施例９：固定化されたｏｘＭＩＦへの結合（ＥＬＩＳＡ）
固定化されたＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）に対する抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００８６及びＣ０１０７結合を、実施例５に記載するようにＥＬＩＳＡによって決定した。単一特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、ｏｘＭＩＦ結合に関する陽性対照として使用し、この抗体の最も高い濃度で得られるシグナルを１００％に設定して、種々の実験からのデータセットを正規化した。

結果：抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００８６及びＣ０１０７はともに、抗体濃度の範囲全体にわたって類似した結合曲線が得られたため、ｏｘＭＩＦに対して匹敵する結合を示したことが図８から明白である。

図８は、ＥＬＩＳＡにおける抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００８６及びＣ０１０７の、固定化されたｏｘＭＩＦへの同時結合を示す。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を、陽性対照として使用した。

実施例１０：抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１、Ｃ００６２、Ｃ００８６及びＣ０１０７の、ｏｘＭＩＦ対ｒｅｄＭＩＦへの差次的結合
ｏｘＭＩＦ及びアイソタイプ対照抗体に関して二価である抗体を、１５ｎＭの濃度で４℃にて一晩、マイクロプレートに固定化させた。ｏｘＭＩＦに関して一価である分子を、３０ｎＭの濃度で固定化した。ブロッキングした後、ウェルを５０ｎｇ／ｍｌのｒｅｄＭＩＦ又はｏｘＭＩＦ代替ＮＴＢ－ＭＩＦのいずれかとともにインキュベートした（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。捕捉されたｏｘＭＩＦを、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗ＭＩＦ抗体及びストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲート（図９Ａ）又は非ビオチン化ポリクローナルウサギ抗ＭＩＦ抗体及びヤギ抗ウサギ－ＨＲＰコンジュゲート（図９Ｂ）のいずれかで検出した。プレートをテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で染色して、発色反応を３０％Ｈ_２ＳＯ_４の添加によって停止させた。ＯＤを４５０ｎＭで測定した。

結果：結果により、抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１、Ｃ００６２、Ｃ００８６及びＣ０１０７はｏｘＭＩＦに結合するが、ｒｅｄＭＩＦに対する結合は検出されないことが明らかに示された。したがって、抗体は、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦとの間を識別するそれらの能力を保持した（図９Ａ及び図９Ｂ）。２つ又は３つの独立した実験の平均値を示す。

図９は、抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体（Ａ）Ｃ００６１、Ｃ００６２、Ｃ００８６及び（Ｂ）Ｃ０１０７の、ｏｘＭＩＦ対ｒｅｄＭＩＦへの差次的結合を示す。Ｉｍａｌｕｍａｂ（Ｃ０００８）を参照抗体として、非特異的アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した。

実施例１１：二重特異性抗体の、ジャーカットＴ細胞上で発現される自然ＣＤ３への結合
機能性ＣＤ３を発現するＣＤ３陽性（ＣＤ３＋）ジャーカットＴ細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－１５２）及びＣＤ３の発現を欠如しているＣＤ３陰性（ＣＤ３－）ジャーカットＴ細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－１５３）を、３３μＭの濃度で二重特異性抗体若しくはＣ０００８（抗ｏｘＭＩＦ単一特異性対照抗体）とともに、又は二次抗体のみ（対照）とともにインキュベートした。結合された抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート（二次抗体）によって検出した。Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０を使用して、死滅細胞を排除して、試料をＦＡＣＳによって分析した。データを、ＦｌｏｗＪｏｗソフトウェアを使用して分析して、生存可能な染色細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

結果：図１０は、抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体が、生存可能なジャーカットＴ細胞上で発現される自然ＣＤ３に特異的に結合したのに対して、バックグラウンド染色のみは、ＣＤ３の発現を欠如するジャーカットＴ細胞上で検出されたことを明らかに示している。バックグラウンド染色は、二次ａｂのみで染色した細胞を測定することによって決定された。結合は更に、単一特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体（Ｃ０００８）を用いた場合に観察されなかった。

図１０は、抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体の、ＣＤ３陽性ジャーカットＴ細胞上で発現される自然ＣＤ３への特異的結合を示すのに対して、バックグラウンド染色のみは、ＣＤ３陰性ジャーカットＴ細胞上で決定された。単一特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８は、陰性対照として使用した。

実施例１２：標的細胞の存在下での抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体によって活性化されるヒトＴ細胞のＩＬ－２分泌
健常なドナーから単離されたヒトＰＢＭＣをｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１又は単一特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８で、０．０１ｎＭ～１０ｎＭの範囲の濃度で、ＨＣＴ１１６癌細胞の存在下又は非存在下のいずれかで処置した（エフェクター対標的細胞比：２．５：１）。３７℃で２４時間のインキュベーション後、上清を収集して、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘビーズベースのイムノアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を使用して、インターロイキン－２（ＩＬ－２）濃度を評価した。

結果：ＩＬ－２は、腫瘍細胞会合時にＴ細胞活性化を示すＴ細胞から分泌される。図１１Ａは、Ｔ細胞が、Ｃ００６１によるＨＣＴ１１６腫瘍細胞との架橋によって活性化されて、細胞培養上清へのＩＬ－２の著しい放出をもたらしたことを実証している。癌細胞の非存在下でＣ００６１とインキュベートしたＴ細胞は、ほぼ１０倍低減されたＩＬ－２分泌を示した。陰性対照として使用した抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８は、癌細胞の非存在下でも存在下でも、Ｔ細胞からのいかなるＩＬ－２分泌も誘導しなかった（図１１Ｂ）。データを、４つの異なるＰＢＭＣドナーの平均値＋／－ＳＥＭとして示す。

図１１は、ヒトＨＣＴ１１６標的細胞の存在下又は非存在下のいずれかでの抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１による活性化されたヒトＴ細胞のＩＬ－２分泌を示す。

実施例１３：ｏｘＭＩＦの細胞表面提示の増加を伴うＨＣＴ１１６及びＡ２７８０癌細胞のＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞死滅
Ａ２７８０及びＨＣＴ１１６細胞を、ＨａｌｏＴａｇ－ＨｉＢｉＴプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社 ＃ＣＳ１９５６Ｂ１７）でトランスフェクトして、ブラストサイジンで選択して、細胞プールとして選別した。次に、安定なＨｉＢｉＴ発現細胞株を、ＭＩＦ－ｐＤｉｓｐｌａｙプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でトランスフェクトして、ジェネティシンで選択して、選別して、細胞内ＨｉＢｉＴ及び膜にアンカーされた単量体ｏｘＭＩＦを安定に発現する細胞株（Ａ２７８０－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ及びＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ）を生成し、即ち、ＭＩＦは、エピトープを抗ｏｘＭＩＦ抗体に到達可能にさせる非自然単量体状態で表示されている（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８）。これらの細胞株は、細胞表面でｏｘＭＩＦの増加された提示を示し、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析にとってより感受性の高いツールである。

Ａ２７８０－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ又はＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ細胞を、９６ウェルプレートに播種して、一晩接着させた。健常なドナー（ｎ＝３）から単離されたＰＢＭＣを、エフェクター対標的細胞比：２．５：１（Ａ２７８０）又は１０：１（ＨＣＴ１１６）で、抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体又は単一特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の存在下又は非存在下で、０．００１～１００ｎＭの範囲の濃度で添加した。２４時間のインキュベーション後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ細胞外検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社 ＃Ｎ２４２１）を添加して、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで発光シグナルを測定した。

結果：図１２は、標的細胞としてヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６（図１２Ａ）及びヒト卵巣癌細胞Ａ２７８０（図１２Ｂ）を表示するｏｘＭＩＦを使用して抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１、Ｃ００６２、Ｃ００８６及びＣ０１０７によって誘導されるＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞死滅を示す。単一特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、非特異的ＰＢＭＣ媒介性癌細胞溶解を決定するための対照として使用した。癌細胞のＰＢＭＣ媒介性溶解を、平均値＋／－ＳＥＭ（総癌細胞のパーセントとして）として提示し、抗体の濃度に対してプロットした。

図１２：抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体によって誘導される結腸癌細胞ＨＣＴ１１６（Ａ）及び卵巣癌細胞Ａ２７８０（Ｂ）を表示するｏｘＭＩＦのＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞死滅。抗ｏｘＭＩＦ単一特異性抗体Ｃ０００８を、陰性対照として使用した。

実施例１４：ＮＳＧマウスの循環中のＣ００６１の薬物動態（ＰＫ）
静脈内注射後のＣ００６１の薬物動態をＮＳＧマウスにおいて検討した。ＮＳＧマウスに、それぞれ、２０、１０又は３ｍｇ／ｋｇの単一静脈内用量のＣ００６１を付与した。４、１０、２４、４８及び７２時間後、Ｋ３－ＥＤＴＡでコーティングされたＭｉｎｉｖｅｔｔｅ（登録商標）を使用して尾静脈穿刺によって血液２０μｌを収集して、ＰＢＳ ６０μｌを含有するＫ３－ＥＤＴＡでコーティングされたバイアルに移した。遠心分離後、上清（＝１：４で希釈された血漿）を使用して、ＥＬＩＳＡによってＣ００６１濃度を決定した。簡潔に述べると、１μｇ／ｍｌのＰＢＳ中に希釈された組換えヒトＭＩＦを、ＥＬＩＳＡプレートに４℃にて一晩固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに形質転換する）。２％魚ゼラチン／ＴＢＳＴでブロックした後、希釈したマウス血漿（１：１００～１：１０，０００）をプレートに添加した。Ｃ００６１の段階希釈物（０．０５～１００ｎｇ／ｍｌ）をプレートに添加することによって、標準曲線を得た。最終的に、ヤギ抗ヒトＦｃ－ＨＲＰコンジュゲート及び基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して、結合されたＣ００６１を検出した。発色反応を３Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させて、ＯＤを４５０ｎＭで測定した。マウス血漿中のＣ００６１の濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して双曲線の曲線フィットを使用した非線形回帰によってＣ００６１の標準曲線から算出した。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて二重指数関数的減衰を表す等式にフィットさせて、ＮＳＧマウスにおけるＣ００６１の初期半減期及び末期半減期を決定した。

結果：Ｃ００６１の薬物動態プロファイルにより、初期半減期３時間及び末期半減期３０時間と予測されるように二重指数関数的減衰が実証された（図１３）。更に、Ｃ００６１の測定した血漿濃度は、抗体血清ともに直線的に増加した。

図１３は、静脈内注射後のＮＳＧマウスの循環におけるＣ００６１の薬物動態（ＰＫ）を示す。

実施例１５：ＣＡＬＵ－６肺癌を保有するＮＳＧマウスにおける抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１の生体内分布
抗ｏｘＭＩＦ／ＣＤ３二重特異性抗体Ｃ００６１の生体内分布を、ヒト肺癌細胞株ＣＡＬＵ－６の皮下腫瘍を有するＮＳＧマウスの異種移植片モデルにおいて検討した。雌ＮＳＧマウスに、ＰＢＳ（１００μｌ／動物）中の５×１０^６個のＣＡＬＵ－６細胞の一側性皮下注射を付与した。個々の腫瘍体積１５０～３００ｍｍ^３に達したら、マウスを処置群に割り当てて、５ｍｇ／ｋｇのＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００６１の単一静脈内用量を付与した。２匹の未処置マウスを、「シグナルなし」の対照として使用した。

Ｃ００６１を、製造業者の説明書に従ってＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社からのＩＲＤｙｅ ８００ＣＷタンパク質標識キット－高ＭＷを使用してＩＲＤｙｅ ８００Ｗで標識した。標識プロセス後、マウスへの標識抗体の注射前に、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷで標識した抗体のタンパク質濃度及び標識効率を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ技術を使用して決定し、マウスに、標識後のタンパク質濃度に基づいて投薬した。ＬＩ－ＣＯＲ Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｔｒｉｌｏｇｙイメージングデバイスにおいて、標識抗体の投与時に、投薬後の下記の時点：１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間でｉｎ ｖｉｖｏイメージングを実施した。

結果：２４時間でのピークシグナル及び最大７日の腫瘍保持を伴って、静脈内投与した８００ＣＷ標識したＣ００６１の明らかな腫瘍内分布（図１４Ａ）が決定された。このことにより、ＣＤ３結合部分によって腫瘍への細胞傷害性Ｔ細胞の動員に必須条件である腫瘍におけるＣ００６１の蓄積及び保持が明らかに実証される。未処置の対照マウスでは、シグナルは検出されなかった（図１４Ｂ）。

図１４は、皮下ＣＡＬＵ－６腫瘍を保有するマウスの赤外線ｉｎ ｖｉｖｏイメージングによるＣ００６１の腫瘍浸潤及び蓄積を示す。写真は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識抗体の注射の１時間後、６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後及び１６８時間後に撮影した。Ａ：ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００６１（５ｍｇ／ｋｇ）を受容したマウス、Ｂ：未処置の対照マウス；スケールバーは、Ａ及びＢに関して同じである。

Claims (22)

1. （ｉ）ｓｃＦｖが２つの重鎖のうち１つのみに融合されるＩｇＧ、
   （ｉｉ）Ｆａｂアームの１つが二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）に置き換えられ、Ｆａｂアームの１つがＩｇＧ Ｆａｂアームであり、前記ＢｉＴＥ及びＩｇＧ Ｆａｂアームが、ヒンジ領域を介してＦｃ部分に連結されているＩｇＧ、及び
   （ｉｉｉ）Ｆａｂアームがともに、異なる特異性を有するｓｃＦｖに置き換えられているＩｇＧ
   からなる群から選択され、
   ｏｘＭＩＦを特異的に認識する少なくとも１つの結合部位と、ＣＤ３を特異的に認識する１つの結合部位とを含む抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体であって、
   ｏｘＭＩＦを特異的に認識する部位が、
   （ａ）配列番号１～配列番号６の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号１～配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
   （ｂ）配列番号７～配列番号１２の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号７～配列番号１２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
   （ｃ）配列番号１３～配列番号１８の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号１３～配列番号１８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
   （ｄ）配列番号１９～配列番号２４の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号１９～配列番号２４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
   （ｅ）配列番号２６、配列番号２７、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２３、及び配列番号２４の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号２６、配列番号２７、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ、又は
   （ｆ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号１３８、配列番号２５、及び配列番号１５３の配列を含む可変ＣＤＲ、若しくは配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号１３８、配列番号２５、及び配列番号１５３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する可変ＣＤＲ
   を含む、前記抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
2. 前記ＣＤＲ配列それぞれにおいて、０個、１個、又は２個の点突然変異を含む、請求項１に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
3. 前記ＣＤ３を特異的に認識する結合部位が、
   配列番号７７、配列番号７８、配列番号１４９、配列番号８３、配列番号８４及び配列番号１５１、又は
   配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８２、又は
   配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５、又は
   配列番号７７、配列番号１５４、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５、又は
   配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０及び配列番号９１、又は
   配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７、又は
   配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号１７９、及び配列番号１８０、又は
   配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１８１、配列番号１８２及び配列番号１８３
   のＣＤＲ配列それぞれにおいて、０個、１個、又は２個の点突然変異を含む可変領域を含む、請求項１又は２に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
4. 配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号１７９及び配列番号１８０の配列において、０個又は１個の点突然変異を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
5. 配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号７７、配列番号７８、配列番号１４９、配列番号８３、配列番号８４、及び配列番号１５１の配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
6. 前記ＩｇＧがｏｘＭＩＦを認識し、前記重鎖の１つに融合される前記ｓｃＦｖがＣＤ３を認識し、前記抗ＣＤ３可変軽（ＶＬ）及び可変重（ＶＨ）鎖を結合するペプチドリンカーを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
7. 前記ＩｇＧ ＦａｂアームがｏｘＭＩＦを認識し、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）がｏｘＭＩＦ及びＣＤｒ３を認識し、前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーのＶＬ鎖及びＶＨ鎖を結合するペプチドリンカーを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
8. ＦａｂアームがともにｓｃＦｖで置き換えられ、一方のｓｃＦＶがｏｘＭＩＦを認識し、他方のｓｃＦｖがＣＤ３を認識し、ｓｃＦｖのＶＬ鎖及びＶＨ鎖を結合するペプチドリンカーを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
9. 前記ｏｘＭＩＦを特異的に認識する結合部位が、配列番号１５８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号１３４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
10. 前記ＣＤ３を特異的に認識する結合部位が、配列番号１３５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号１３６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
11. 配列番号１５９、配列番号１３７、配列番号１４０、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、若しくは配列番号１９７のアミノ酸配列、又は配列番号１５９、配列番号１３７、配列番号１４０、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、若しくは配列番号１９７のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
13. 癌の治療における、具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌の治療における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体又は請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 薬剤としての使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
15. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体をコードする単離核酸分子。
16. 請求項１５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
17. 請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
18. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体を産生する方法であって、前記抗体をコードする核酸を宿主細胞において発現させる工程を含む、前記方法。
19. ｏｘＭＩＦの細胞発現を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、試験されるべきヒト細胞を含む生物学的試料を請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体と接触させる工程と、前記抗体の結合を検出する工程とを含み、前記抗体の結合が、細胞上でのｏｘＭＩＦの存在を示し、それにより細胞がｏｘＭＩＦを発現するかどうかを検出する、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
20. 前記生物学的試料が、無傷のヒト細胞、組織、バイオプシープローブ、又は目的の細胞の膜画分を含む、請求項１９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
21. 前記抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体が、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、及び生物発光標識からなる群から選択される検出可能な標識で標識される、請求項１９又は２０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
22. 対象においてｏｘＭＩＦを発現する癌細胞を診断することにおける使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体であって、前記抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートされている、前記抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体。
    

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