JP2020518622A - Ox40およびctla−4に対する二重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、OX40に特異的に結合することができる第1の結合ドメインと、CTLA−4に特異的に結合することができる第2の結合ドメインとを含む、二重特異性抗体などの二重特異性ポリペプチドを提供する。本発明はさらに、当該二重特異性ポリペプチドの組成物、ならびにその方法および使用を提供する。
Description
本発明は、OX40およびCTLA−4、特にヒトOX40およびヒトCTLA−4に特異的に結合する二重特異性ポリペプチドに関する。
癌は、先進国において早死の主な原因である。癌の免疫療法の目的は、腫瘍細胞に対して効果的な免疫応答を仕掛けることである。これは、例えば、腫瘍抗原に対する寛容性を破壊すること、抗腫瘍免疫応答を増強すること、および腫瘍部位における局所的なサイトカイン応答を刺激することによって達成され得る。長期にわたる抗腫瘍免疫応答の主要なエフェクター細胞は、活性化された腫瘍特異的エフェクターT細胞である。活性化エフェクターT細胞の強力な拡張は、免疫応答を腫瘍に対して再指向することができる。これに関連して、制御性T細胞(Treg)は、抗腫瘍免疫を阻害する役割を果たす。したがって、Tregを枯渇させるか、阻害するか、元に戻すか、または不活性化することは、抗腫瘍効果を提供し、腫瘍微小環境における免疫抑制を元に戻すことができる。さらに、例えば樹状細胞によるエフェクターT細胞の不完全な活性化はT細胞アネルギーを引き起こす可能性があり、それは不十分な抗腫瘍応答をもたらすのに対し、樹状細胞による適切な誘導は活性化エフェクターT細胞の強力な拡張を生じて、免疫応答を腫瘍に対して再指向することができる。加えて、ナチュラルキラー(NK)細胞は、下方制御されたヒト白血球抗原(HLA)を発現して腫瘍細胞を攻撃することによって、および抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導することによって、腫瘍免疫学的に重要な役割を果たす。したがって、NK細胞を刺激することにより、腫瘍の成長をも低下させ得る。
OX40(別名CD134またはTNFRSF4として知られている)は、主に活性化T細胞(主にCD4+エフェクターT細胞だけでなく、CD8+エフェクターT細胞および制御性T細胞(Treg))上に発現するTNFRファミリーのメンバーである。マウスでは、発現はTreg上では構成的であるが、ヒトでは構成的ではない。OX40の発現は、典型的には、活性化(T細胞受容体の関与)の24時間以内に起こり、48〜72時間後にピークに達する。OX40刺激は、活性化T細胞の生存および増殖にとって重要である。OX40の唯一の既知のリガンドはOX40Lであり、これは、主に樹状細胞およびB細胞などの抗原提示細胞上に発現し、典型的にはそれらの活性化後に発現する。OX40を介したT細胞活性化の正味の結果は、TH1エフェクターT細胞活性化プロファイルの誘導、ならびに例えばADCCまたはADCPを介したTreg細胞の活性および/または数の減少である。全体として、これらの効果は抗腫瘍免疫に寄与する可能性がある。OX40は、黒色腫、肺癌、および腎癌などの多くの固形腫瘍の制御性T細胞に過剰発現する。
マウスにおける腫瘍モデルのOX40アゴニスト治療は、黒色腫、神経膠腫、肉腫、前立腺癌、結腸癌、および腎癌を含む、いくつかの異なる癌形態の抗腫瘍効果および治癒をもたらすことが示されている。データは、CD40アゴニスト治療で見られる効果と同様に、CD4+およびCD8+T細胞の両方が関与する腫瘍特異的T細胞応答と一致している。IL−12および他のサイトカインの追加、ならびに他の免疫調節剤および化学療法/放射線療法との組み合わせは、OX40アゴニスト治療の治療効果を改善することが示されている。前臨床モデルからの証拠は、抗OX40抗体の効果がFcγRの活性化に依存していることを示唆している。Providence Cancer Centreでは、他の全ての治療に失敗した後期患者においてマウス抗ヒトOX40クローン9B12を試験する第I相臨床研究が実施された。抗体は耐性が良好であった。腫瘍の縮小ならびにCD4+およびCD8+T細胞増殖の増加が観察された。低毒性は、半減期の短さおよび抗薬物抗体(抗体はマウス抗体であった)によって引き起こされ得るが、非活性化T細胞でのOX40の比較的低い発現レベルによっても引き起こされた可能性がある。この抗体による抗腫瘍効果はわずかであった。
OX40を標的とする既存の抗体は、一般に、それぞれの受容体を発現する細胞への強いシグナル伝達を誘導するために、例えば他の細胞上のFcγ受容体を介した架橋に依存する。したがって、そのような架橋が提供されていないとき、それらは効率的にシグナルを伝達しない。加えて、TNF受容体ファミリーメンバーを通じた持続的かつ継続的な活性化は、免疫の枯渇につながる可能性がある。
T細胞受容体CTLA−4は、T細胞活性化の負の制御因子として機能し、最初の活性化に続いてT細胞表面上で上方制御される。抗原提示細胞によって発現されるCTLA−4受容体のリガンドはB7タンパク質である。T細胞活性化の上方制御を担う対応するリガンド受容体対は、CD28−B7である。CD28を介したシグナル伝達は共刺激経路を構成し、続いてMHC複合体によって提示される抗原ペプチドを認識するT細胞受容体を通じてT細胞を活性化する。B7−1および、またはB7−2リガンドとのCTLA−4の相互作用を遮断することにより、免疫応答の正常なチェックポイントのうちの1つを除去することができる。正味の結果として、抗腫瘍免疫に寄与し得るエフェクターT細胞の活性を向上する。OX40と同様に、これは、エフェクターT細胞の直接活性化に起因し得るが、例えばADCCまたはADCPを介したTreg細胞の活性および/または数の低下にも起因し得る。臨床研究では、CTLA−4の遮断が抗腫瘍効果を生み出すが、抗CTLA−4抗体の投与は有害な副作用に関連していることが実証されている。CTLA−4は、黒色腫肺癌および腎癌などの多くの固形腫瘍の制御性T細胞で過剰発現する。
Furness et al.,2014 Trends Immunol 35(7):290−8
Walker,2014,Nature Reviews 11(12):852−63
例えば、1つのT細胞関連タンパク質(OX40またはCTLA−4など)のみを標的とする既存の単一特異性薬物の代替として、腫瘍細胞付近の宿主免疫細胞を活性化することができる改善された治療剤が必要である。
本発明の第1の態様は、OX40に特異的に結合することができるB1と称される第1の結合ドメインと、CTLA−4に特異的に結合することができるB2と称される第2の結合ドメインとを含む、二重特異性ポリペプチドを提供する。
2つのT細胞標的、CTLA−4およびOX40を標的とする二重特異性ポリペプチド、例えば抗体は、両方の標的が過剰発現している位置で免疫系の特異的活性化を誘導する可能性を有する。注目すべきことに、CTLA−4およびOX40の両方が、腫瘍微小環境の制御性T細胞(Treg)上に過剰発現しているが、エフェクターT細胞上での共発現は低くなっている。したがって、本発明の二重特異性ポリペプチドは、腫瘍微小環境において制御性T細胞を選択的に標的とする可能性を有する。
本発明の二重特異性ポリペプチドを用いて腫瘍微小環境におけるTreg細胞を標的とすることで、Tregの免疫抑制機能を枯渇または逆転させる可能性も有する。この効果は、本発明の二重特異性抗体のFc部分を介したADCCもしくはADCP誘導によって(例えば、Furness et al.,2014 Trends Immunol 35(7):290−8を参照されたい;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)、またはOX40および/もしくはCTLA−4を介して誘導されるシグナル伝達によって、および/またはCTLA−4シグナル伝達経路の遮断によって媒介され得る(例えば、Walker,2014,Nature Reviews 11(12):852−63を参照されたい;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。一方、エフェクターT細胞では、本発明の二重特異性ポリペプチドは、OX40刺激およびCTLA−4チェックポイント遮断の両方を通じて活性化および機能増加を誘導する可能性を有する。
したがって、OX40およびCTLA−4を標的とする二重特異性ポリペプチドの正味の効果は次の通りである。
1.単一特異性ポリペプチドと比較した、より高度な免疫活性化。免疫活性化は、単一特異性ポリペプチドの組み合わせにより誘導される活性化よりも高く、すなわち相乗的活性化が達成される。
1.単一特異性ポリペプチドと比較した、より高度な免疫活性化。免疫活性化は、単一特異性ポリペプチドの組み合わせにより誘導される活性化よりも高く、すなわち相乗的活性化が達成される。
2.組み合わせた単一特異性ポリペプチドと比較した、ADCCのより高度な誘導。
3.より指向された/局在する免疫活性化。免疫活性化は、CTLA−4発現およびOX40発現の両方が高い環境(例えば、組織)でのみ発生する。腫瘍微小環境は、そのような環境である。これは、身体の他の組織/領域の活性化に伴う有害な副作用なしに、腫瘍部位で免疫活性化を増加させる可能性を有する。したがって、治療域が増加することになる。
「ポリペプチド」とは、2つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチド模倣物の化合物を指すために、本明細書においてその最も広い意味で使用される。したがって、「ポリペプチド」という用語は、短いペプチド配列、ならびにより長いポリペプチドおよびタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、DまたはL光学異性体の両方を含む天然および/または非天然もしくは合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物のいずれかを指す。
本明細書で使用される「二重特異性」という用語は、ポリペプチドが少なくとも2つの標的要素に特異的に結合することができることを意味する。
一実施形態では、第1および/または第2の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されてもよい。
例えば、本発明の二重特異性ポリペプチドは以下を含み得る:
i)抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかもしくはそれからなる第1の結合ドメイン、および抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかもしくはそれからなる第2の結合ドメイン、または
ii)抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかもしくはそれからなる第1の結合ドメイン、および抗体可変ドメインもしくはその一部ではない第2の結合ドメイン。
i)抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかもしくはそれからなる第1の結合ドメイン、および抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかもしくはそれからなる第2の結合ドメイン、または
ii)抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかもしくはそれからなる第1の結合ドメイン、および抗体可変ドメインもしくはその一部ではない第2の結合ドメイン。
したがって、一実施形態では、ポリペプチドは二重特異性抗体である。
本明細書中で使用される場合、「抗体」または「抗体(複数)」という用語は、抗原結合部位を含有する分子、例えば、免疫グロブリン分子、および抗原結合部位を含有する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片を指す。免疫グロブリン分子は、任意の種類(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。抗体としては、合成抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、組換え生成された抗体、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、scFv(例えば、単一特異的および二重特異性などを含む)、Fab断片、F(ab’)断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記のもののうちのいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。
「指向された」抗体または「再指向された」抗体という用語は、本明細書では互換的に使用され、ある特定の標的/マーカー/エピトープ/抗原にその結合特異性(複数可)を指向するように構成された抗体、すなわち標的/マーカー/エピトープ/抗原に免疫特異的に結合する抗体を指す。また、ある特定の標的/マーカー/エピトープに「選択的」な抗体という表現は、「指向された」または「再指向された」と同じ定義を有するように使用され得る。2つの異なる標的/マーカー/エピトープ/抗原に指向された(それに対して選択的である)二重特異性抗体は、両方の標的/マーカー/エピトープ/抗原に免疫特異的に結合する。抗体がOX40などのある特定の標的抗原に指向される場合、当該抗体は、当該標的抗原構造上に存在する任意の好適なエピトープに指向され得ると考えられる。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFvなどの抗体の一部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、インタクトな抗体によって認識されるのと同じ抗原に結合する。例えば、抗OX40抗体断片はOX40に結合する。「抗体断片」という用語はまた、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片などの可変領域からなる単離された断片、ならびに軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結している組換え一本鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)を含む。本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、Fc断片または単一アミノ酸残基などの、抗原結合活性を有さない抗体の部分を含まない。
ScFvは、本発明の二重特異性ポリペプチドに含めるのに特に好ましい。
したがって、本発明の二重特異性ポリペプチドの例示的な実施形態では、
a)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2は、インタクトなIgG抗体であり(もしくは一緒にインタクトなIgG抗体を形成し)、
b)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2は、Fv断片(例えばscFv)であり、
c)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2は、Fab断片であり、かつ/または
d)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2は、単一ドメイン抗体(例えばドメイン抗体およびナノボディ)である。
a)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2は、インタクトなIgG抗体であり(もしくは一緒にインタクトなIgG抗体を形成し)、
b)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2は、Fv断片(例えばscFv)であり、
c)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2は、Fab断片であり、かつ/または
d)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2は、単一ドメイン抗体(例えばドメイン抗体およびナノボディ)である。
本発明の二重特異性ポリペプチドがいくつかの異なる構造フォーマットのものであってもよいことは、当業者には理解されよう(例えば、Chan&Carter,2016,Nature Reviews Immunology 10,301−316を参照されたい。その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。
例示的な実施形態では、ポリペプチドは、以下からなる群から選択される二重特異性抗体である:
a)IgG−scFv二重特異性抗体などの二価の二重特異性抗体(例えば、B1が、インタクトなIgGであり、B2が、IgGの軽鎖のN末端および/もしくはC末端において、かつ/またはIgGの重鎖のN末端および/もしくはC末端においてB1に結合したscFvであるか、あるいはその逆であるもの)、
b)DuoBody(登録商標)(Genmab AS、コペンハーゲン、デンマーク)などの一価の二重特異性抗体、または「ノブ・イン・ホール」二重特異性抗体(例えば、scFv−KIH、scFv−KIHr、BiTE−KIH、またはBiTE−KIHr(Xu et al.,2015,mAbs 7(1):231−242参照)、
c)scFv2−Fc二重特異性抗体(Aptevo Therapeutics Inc,USからのADAPTIR(商標)二重特異性抗体など)、
d)BiTE/scFv2二重特異性抗体、
e)DVD−Ig二重特異性抗体、
f)DART系二重特異性抗体(例えば、DART−Fc、DART2−Fc、またはDART)、
g)DNL−Fab3二重特異性抗体、ならびに
h)scFv−HSA−scFv二重特異性抗体からなる群から選択される。
a)IgG−scFv二重特異性抗体などの二価の二重特異性抗体(例えば、B1が、インタクトなIgGであり、B2が、IgGの軽鎖のN末端および/もしくはC末端において、かつ/またはIgGの重鎖のN末端および/もしくはC末端においてB1に結合したscFvであるか、あるいはその逆であるもの)、
b)DuoBody(登録商標)(Genmab AS、コペンハーゲン、デンマーク)などの一価の二重特異性抗体、または「ノブ・イン・ホール」二重特異性抗体(例えば、scFv−KIH、scFv−KIHr、BiTE−KIH、またはBiTE−KIHr(Xu et al.,2015,mAbs 7(1):231−242参照)、
c)scFv2−Fc二重特異性抗体(Aptevo Therapeutics Inc,USからのADAPTIR(商標)二重特異性抗体など)、
d)BiTE/scFv2二重特異性抗体、
e)DVD−Ig二重特異性抗体、
f)DART系二重特異性抗体(例えば、DART−Fc、DART2−Fc、またはDART)、
g)DNL−Fab3二重特異性抗体、ならびに
h)scFv−HSA−scFv二重特異性抗体からなる群から選択される。
本発明は、結合ドメインのうちの1つが非免疫グロブリン結合ドメイン(CTLA−4に結合することができるCD86ポリペプチドなど)である、上記に列挙されたものと同等のフォーマットも包含することが当業者には理解されるであろう。
例えば、二重特異性ポリペプチドはIgG−scFv抗体であり得る。IgG−scFv抗体は、VH−VLまたはVL−VHのいずれかの配向であり得る。一実施形態では、scFvは、VHとVLとの間のS−S架橋によって安定化され得る。
あるいは、二重特異性ポリペプチドは、CD86ポリペプチドに結合した抗OX40IgG(またはscFvなどのその抗原結合断片)であってもよい。
一実施形態では、結合ドメインB1および結合ドメインB2は、相互に直接融合している。
代替的な実施形態では、結合ドメインB1および結合ドメインB2は、ポリペプチドリンカーを介して接合している。例えば、ポリペプチドリンカーは、約10〜約25アミノ酸の短いリンカーペプチドであってもよい。このリンカーは通常、可撓性のためのグリシン、ならびに可溶性のためのセリンまたはスレオニンに富んでおり、VHのN末端をVLのC末端と接続すること、またはその逆のいずれかを行うことができる。例示的なリンカーとしては、配列番号47〜50、または144のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列のペプチドが挙げられる。
本発明の二重特異性ポリペプチドは、当該技術分野において使用されている任意の既知の好適な方法によって製造され得る。本発明の二重特異性抗体を調製する方法としては、BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、FcabおよびMab2(F−star)、Fc改変IgGl(Xencor)、またはDuoBody(Fabアーム交換に基づく、Genmab)が挙げられる。二重特異性抗体を調製するのに有用な他のプラットフォームの例としては、WO2008/119353(Genmab)、WO2011/131746(Genmab)に記載され、van der Neut−Kolfschotenらによって報告されたもの(2007年、Science 317(5844):1554−7)が挙げられるが、これに限定されない。ハイブリッドハイブリドーマおよび化学的共役法(MarvinおよびZhu(2005年)Acta Pharmacol Sin 26:649)などの従来の方法もまた使用することができる。異なる重鎖および軽鎖からなる2つの抗体の宿主細胞中での共発現は、所望の二重特異性抗体に加えて可能性のある抗体生成物の混合物を生じ、これは次いで例えば親和性クロマトグラフィまたは同様の方法によって単離することができる。
二重特異性ポリペプチドが、ヒトFc領域または当該領域の変異型を含み得、この領域が、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4領域、好ましくはIgG1またはIgG4領域であることは、当業者には理解されよう。
抗体の定常(Fc)領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1の成分(Clq)を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。Fc領域は、好ましくはヒトFc領域、または当該領域の変異型である。Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4領域、好ましくはIgG1またはIgG4領域であり得る。Fc領域の変異型は、典型的には、親和性が変更されたFcガンマRおよび/または新生児Fc受容体(FcRn)などのFc受容体に結合し、ポリペプチドの機能および/または半減期の改善を提供する。生物学的機能および/または半減期は、天然Fc領域を含むポリペプチドの半減期と比較して、延長するかまたは減少するかのいずれかであり得る。変異型Fc領域の存在によって調節され得るそのような生物学的機能の例としては、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)、および/またはアポトーシスが挙げられる。
(完全な重鎖を形成するために)本明細書に開示の任意のVH領域配列と組み合わせられ得る例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列は、以下に再現されるIgG1重鎖定常領域配列である。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(配列番号135)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(配列番号135)
他の重鎖定常領域配列は、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示の任意のVH領域と組み合わせることもできる。例えば、好ましい定常領域は、以下に再現されるものなどの修飾IgG4定常領域である。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSLGK
(配列番号137)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSLGK
(配列番号137)
この修飾IgG4配列は、FcRn結合の低下を呈し、したがって野生型IgG4と比較して血清半減期の低下をもたらす。加えて、IgG4のコアヒンジの安定化を呈し、IgG4をより安定にし、Fabアーム交換を妨げる。
別の好ましい定常領域は、以下に再現されるものなどの修飾IgG4定常領域である。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(配列番号139)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(配列番号139)
この修飾IgG4配列は、IgG4のコアヒンジの安定化をもたらし、IgG4をより安定にし、Fabアーム交換を妨げる。
以下に再現されるものなどの野生型IgG4定常領域もまた好ましい。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(配列番号138)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(配列番号138)
(完全な軽鎖を形成するために)本明細書に開示の任意のVL領域配列と組み合わせられ得る例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列は、以下に再現されるカッパ鎖定常領域配列である。
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(配列番号136)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(配列番号136)
他の軽鎖定常領域配列は、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示の任意のVL領域と組み合わせることもできる。
抗体またはその抗原結合断片は、以下により詳細に説明される、ある特定の好ましい結合特徴および機能的効果を有する。当該抗体またはその抗原結合断片は、本発明の二重特異性ポリペプチドの一部として組み込まれているとき、好ましくは、これらの結合特徴および機能的効果を保持する。
一実施形態では、抗原結合断片は、Fv断片(一本鎖Fv断片、またはジスルフィド結合Fv断片など)、Fab様断片(Fab断片、Fab’断片、またはF(ab)2断片など)、およびドメイン抗体からなる群から選択され得る。
一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、カッパ鎖のC末端部分に融合した非免疫グロブリンポリペプチド(CTLA−4結合ドメイン、例えばCD86、または配列番号17などのその突然変異形態など;以下参照)を有するIgG1抗体であり得る。
一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、重鎖ガンマ1のC末端に融合したscFv断片を有するIgG1抗体であり得る。
一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、2つの異なる標的への2〜4のscFv結合を含み得る。
T細胞標的であるCTLA−4およびOX40が細胞の表面に局在し得ることが、当業者には理解されるであろう。「細胞の表面に局在する」とは、T細胞標的の1つ以上の領域が細胞表面の外面に存在するように、T細胞標的が細胞と会合していることを意味する。例えば、T細胞標的は、細胞外表面上に存在する1つ以上の領域で、細胞原形質膜に挿入され得る(すなわち、膜貫通タンパク質として配向される)。これは、細胞によるT細胞標的の発現の過程で起こり得る。したがって、一実施形態では、「細胞の表面に局在する」とは、「細胞の表面に発現する」ことを意味し得る。あるいは、T細胞標的は、共有結合性相互作用および/またはイオン性相互作用で細胞の外側に存在して、細胞表面の特定の領域または複数の領域に局在し得る。
本発明の二重特異性抗体が、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)、および/またはアポトーシスを誘導することができる場合があることが、当業者には理解されるであろう。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは腫瘍免疫を誘導することができる。これは、例えば、IL−2およびIFNγの産生を測定することによって、インビトロでのT細胞活性化アッセイで試験することができる。エフェクターT細胞の活性化は、腫瘍特異性T細胞応答がインビボで達成され得ることを意味するであろう。さらに、マウスモデルなどのインビボモデルにおける抗腫瘍応答は、腫瘍に対する成功裏の免疫応答が達成されたことを暗示する。
抗体は、T細胞標的(CTLA−4またはOX40)を発現する細胞の活性を調節する場合があり、当該調節は、細胞の活性の増加または減少である。細胞は、典型的にはT細胞である。抗体は、CD4+もしくはCD8+エフェクター細胞の活性を増加させるか、または制御性T細胞(Treg)の活性を減少させることができる。いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターT細胞、特にCD4+エフェクターT細胞の活性の増加である。エフェクターT細胞の活性の変化を決定するための方法は周知であり、例えば、対照の存在下でのT細胞IL−2産生および/またはT細胞増殖のレベルと比較した、抗体の存在下でのT細胞IL−2産生のレベルの増加、またはT細胞増殖の増加についての測定が挙げられる。細胞増殖および/またはIL−2産生についてのアッセイは周知であり、実施例に例示されている。
例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA、およびフローサイトメトリー分析を含む、標的に対するリガンドの結合能力を評価するための標準アッセイが、当該技術分野において周知である。ポリペプチドの結合速度(例えば結合親和性)もまた、当該技術分野で既知の標準アッセイによって、例えば表面プラズモン共鳴分析(SPR)などによって評価することができる。
「結合活性」および「結合親和性」という用語は、ポリペプチド分子が標的に結合するかまたは結合しない傾向を指すよう意図される。結合親和性は、ポリペプチドおよびその標的の解離定数(Kd)を決定することによって定量化され得る。より低いKdは、標的に対する親和性がより高いことを示す。同様に、ポリペプチドのその標的に対する結合の特異性は、ポリペプチドおよび別の非標的分子に関する解離定数と比較した、ポリペプチドのその標的に対する比較解離定数(Kd)の観点で定義され得る。
この解離定数の値は、周知の方法によって直接決定することができ、複雑な混合物についてでさえ、例えば、Caceci et al.(Byte 9:340−362,1984;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものなどの方法によって算出することができる。例えば、Wong&Lohman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5428−5432,1993)に開示されるものなどの二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して、Kdを確立することができる。例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA、およびフローサイトメトリー分析を含む、標的に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価するための他の標準アッセイが、当該技術分野で既知である。抗体の結合速度(例えば結合親和性)もまた、当該技術分野において知られる標準アッセイによって、例えばBiacore(商標)システム分析などによって評価することができる。
標的に対する抗体の結合が、その標的の別の既知のリガンド、例えば別の抗体などによる標的の結合と比較される、競合結合アッセイを実施してもよい。50%の阻害が生じる濃度は、Kiとして知られている。理想的な条件下では、KiはKdと等価である。Ki値は、Kd未満になることは決してないため、好都合なことに、Kiの測定値を代入してKdの上限を求めることができる。
結合親和性の代替的な尺度としては、EC50またはIC50が挙げられる。この文脈において、EC50は、ポリペプチドが一定量の標的に対するその最大結合の50%を達成する濃度を示す。IC50は、ポリペプチドが、一定量の標的に対する一定量の競合相手の最大結合の50%を阻害する濃度を示す。両方の場合において、より低いレベルのEC50またはIC50は、標的に対する親和性がより高いことを示す。リガンドのその標的に対するEC50値およびIC50値は、両方とも、周知の方法、例えばELISAによって決定することができる。ポリペプチドのEC50およびIC50を評価するための好適なアッセイは、実施例に記載される。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、その標的に対して、別の非標的分子に結合するその親和性よりも少なくとも2倍、10倍、50倍、100倍、またはそれ以上である親和性で結合することができる。
本発明のポリペプチドは、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、ポリペプチドの全てまたは一部は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む細胞によって融合タンパク質として発現され得る。
あるいは、部分B1およびB2を別々に産生し、次いで続いて一緒に接合してもよい。接合は、任意の好適な手段によって、例えば上に概説した化学的共役法およびリンカーを使用して達成され得る。部分B1およびB2の別々の産生は、任意の好適な手段によって達成され得る。例えば、以下により詳細に説明されるように、任意選択的に別々の細胞中の別々のヌクレオチドからの発現による。
変異型
本明細書に記載の二重特異性ポリペプチドまたはその構成要素結合ドメイン(OX40またはCTLA−4結合ドメインなど)は、ポリペプチドまたは結合ドメインが標的への結合を保持することを条件に、本明細書に列挙されている特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。一実施形態では、抗体または抗原結合断片の変異型は、本明細書に列挙されている配列のCDR配列を保持し得る。例えば、抗OX40抗体は、抗体がその標的への結合を保持することを条件に、表Bに列挙されている特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。そのような変異型または断片は、典型的には表Bの当該配列のCDR配列を保持し得る。CTLA−4結合ドメインは、結合ドメインがその標的への結合を保持することを条件に、表Cの配列のうちのいずれかの変異型を含み得る。
本明細書に記載の二重特異性ポリペプチドまたはその構成要素結合ドメイン(OX40またはCTLA−4結合ドメインなど)は、ポリペプチドまたは結合ドメインが標的への結合を保持することを条件に、本明細書に列挙されている特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。一実施形態では、抗体または抗原結合断片の変異型は、本明細書に列挙されている配列のCDR配列を保持し得る。例えば、抗OX40抗体は、抗体がその標的への結合を保持することを条件に、表Bに列挙されている特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。そのような変異型または断片は、典型的には表Bの当該配列のCDR配列を保持し得る。CTLA−4結合ドメインは、結合ドメインがその標的への結合を保持することを条件に、表Cの配列のうちのいずれかの変異型を含み得る。
本明細書中に列挙されている重鎖または軽鎖アミノ酸配列のうちのいずれか1つの断片は、当該アミノ酸配列からの少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも15個、少なくとも18個、少なくとも20個、または少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、または少なくとも100個の連続アミノ酸を含み得る。
本明細書に列挙される重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のうちのいずれか1つの変異型は、当該配列の置換、欠失、または付加変異型であり得る。変異型は、当該配列からの1個、2個、3個、4個、5個、最大10個、最大20個、最大30個、またはそれ以上のアミノ酸置換および/または欠失を含んでもよい。「欠失」変異型は、個々のアミノ酸の欠失、アミノ酸の小群、例えば2個、3個、4個、もしくは5個のアミノ酸の欠失、またはより大きなアミノ酸領域の欠失、例えば特定のアミノ酸ドメインもしくは他の特徴の欠失を含んでもよい。「置換」変異型は、好ましくは、1個以上のアミノ酸を同数のアミノ酸に置き換え、保存的なアミノ酸置換を行うことを伴う。例えば、アミノ酸は、類似の特性を有する代替的なアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、または別の脂肪族アミノ酸で置換されてもよい。好適な置換基を選択するために使用することのできる20種の主なアミノ酸のいくつかの特性は、以下の通りである。
本明細書におけるアミノ酸は、正式名、3文字表記、または1文字表記によって称され得る。
好ましい「誘導体」または「変異型」としては、天然に存在するアミノ酸の代わりに、配列内に現れるアミノ酸がその構造的類似体であるものが挙げられる。配列内で使用されるアミノ酸は、抗体の機能が著しく悪影響を受けない限り、誘導体化または修飾、例えば標識されてもよい。
上述の誘導体および変異型は、抗体の合成中に、もしくは産生後の修飾によって調製されてもよく、または抗体が組換え型である場合は、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または核酸の酵素的切断および/もしくは連結反応の既知の技術を使用して調製されてもよい。
好ましくは、変異型は、本明細書に開示の配列に示されるような配列に対して、60%超、または70%超、例えば75もしくは80%、好ましくは85%超、例えば90もしくは95%超のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する。アミノ酸同一性のこのレベルは、関連した配列番号の配列の全長にわたって、または全長ポリペプチドのサイズに応じて、20、30、50、75、100、150、200、もしくはそれ以上のアミノ酸にわたるなど、配列の一部にわたって見られ得る。
アミノ酸配列との関連で、「配列同一性」は、ClustalW(Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Res.22(22):4673−80;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)を使用し、以下のパラメータを用いて評価した場合に、記載される値を有する配列を指す。
ペアワイズアラインメントパラメータ−方法:正確、マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティ:10.00、ギャップエクステンションペナルティ:0.10、
多重配列アラインメントパラメータ −マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティ:10.00、遅延の同一性%(% identity for delay):30、エンドギャップへのペナルティ(Penalize end gaps):オン、ギャップ分離距離:0、ネガティブマトリックス:なし、ギャップ伸長ペナルティ:0.20、残基特異的(Residue−specific)ギャップペナルティ:オン、親水性ギャップペナルティ:オン、親水性残基:GPSNDQEKR。特定の残基における配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むよう意図される。
ペアワイズアラインメントパラメータ−方法:正確、マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティ:10.00、ギャップエクステンションペナルティ:0.10、
多重配列アラインメントパラメータ −マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティ:10.00、遅延の同一性%(% identity for delay):30、エンドギャップへのペナルティ(Penalize end gaps):オン、ギャップ分離距離:0、ネガティブマトリックス:なし、ギャップ伸長ペナルティ:0.20、残基特異的(Residue−specific)ギャップペナルティ:オン、親水性ギャップペナルティ:オン、親水性残基:GPSNDQEKR。特定の残基における配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むよう意図される。
ポリヌクレオチド、ベクター、および細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のポリペプチド、またはB1の全てもしくは一部、またはB2の全てもしくは一部をコードしてもよい。「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかを問わず、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーRNA(mRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、何らかの周囲媒体からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離があり得ることを意味する。本ポリヌクレオチドは、それらの意図される用途を妨げない担体または希釈剤と混合されても、実質的に単離されていると見なされ得る。
本発明はまた、本発明のポリペプチドの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のポリペプチド、またはB1の全てもしくは一部、またはB2の全てもしくは一部をコードしてもよい。「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかを問わず、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーRNA(mRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、何らかの周囲媒体からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離があり得ることを意味する。本ポリヌクレオチドは、それらの意図される用途を妨げない担体または希釈剤と混合されても、実質的に単離されていると見なされ得る。
選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な制御配列の制御下に置かれると、インビボで転写され(DNAの場合)、ポリペプチドに翻訳される(mRNAの場合)核酸分子である。コード配列の境界は、5’(アミノ)末端における開始コドンと、3’(カルボキシ)末端における翻訳終止コドンとによって決定される。本明細書では、そのような核酸配列は、ウイルス、原核生物、または真核生物のmRNAに由来するcDNA、ウイルスまたは原核生物のDNAまたはRNAに由来するゲノム配列、およびさらには合成DNA配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の3’側に位置していてもよい。
抗体の重鎖または軽鎖アミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、本明細書に開示のヌクレオチド配列のうちのいずれか1つ、例えば表Bに記載の配列を含み得るかまたはそれからなり得る。表Dに示されるポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Dにも示されている対応するヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得る(イントロン配列は小文字で示されている)。CTLA−4結合ドメインの例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Eに示されるような配列番号25〜43のうちのいずれか1つを含み得るかまたはそれからなり得る。
あるいは、好適なポリヌクレオチド配列は、これらの特定のポリヌクレオチド配列のうちの1つの変異型であり得る。例えば、変異型は、上記の核酸配列のいずれかの置換、欠失、または付加変異型であり得る。変異型ポリヌクレオチドは、配列表に示される配列からの1個、2個、3個、4個、5個、最大10個、最大20個、最大30個、最大40個、最大50個、最大75個、またはそれ以上の核酸置換および/または欠失を含んでもよい。
好適な変異型は、本明細書において開示される核酸配列のうちのいずれか1つのポリヌクレオチドと少なくとも70%相同、好ましくはそれと少なくとも80または90%、より好ましくは少なくとも95%、97%、または99%相同であり得る。好ましくは、これらのレベルでの相同性および同一性は、少なくともポリヌクレオチドのコード領域に関して存在する。相同性を測定する方法は当該技術分野において周知であり、この文脈において、相同性が核酸同一性に基づいて計算されることは、当業者には理解されよう。かかる相同性は、少なくとも15個、好ましくは少なくとも30個、例えば少なくとも40個、60個、100個、200個、またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって存在し得る。かかる相同性は、未修飾のポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在してもよい。
ポリヌクレオチドの相同性または同一性を測定する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために使用することができるBESTFITプログラムを提供する(例えば、そのデフォルト設定で使用される)(Devereuxら、1984年、Nucleic Acids Research 12:387−395;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
例えば、Altschul,1993,J Mol Evol 36:290−300、Altschul et al,1990,J Mol Biol 215:403−10(それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるように、PILEUPおよびBLASTアルゴリズムを使用して、相同性の計算または配列の整列を(典型的にはそれらのデフォルト設定で)行うこともできる。
BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに、何らかの正の値の閾値スコアTに一致するかまたはそれを満たすかのいずれかの検索配列中の長さWの短いワードを同定することによって、高スコアの配列対(HSP)をまず同定することを含む。Tは、近傍ワードスコア閾値(neighbourhood word score threshold)と称される(Altschulら、上記)。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むHSPを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積的アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。各方向でのワードヒットのための拡張は、次の場合に停止される:残基アラインメントの1つ以上の負のスコア累積に起因して累積的アラインメントスコアがゼロ以下になる;またはいずれかの配列の末端に達する。BLASTアルゴリズムパラメータであるW、T、およびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、11のワード長(W)、50のBLOSUM62スコアリングマトリックスアラインメント(B)(Henikoff&Henikoff,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915−10919を参照されたい;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)、10の期待値(E)、M=5、N=4、および両方のストランドの比較を使用する。
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計分析を行う(例えば、Karlin&Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5787を参照されたい;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、最小和確率(smallest sum probability)(P(N))であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、配列は、第1の配列を第2の配列と比較した最小和確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合に、別の配列と類似していると見なされる。
相同体は、関連したポリヌクレオチド内の配列から、3個未満、5個、10個、15個、20個、またはそれ以上の変異だけ異なり得る(変異のそれぞれは、置換、欠失、または挿入であり得る)。これらの変異は、相同体の、少なくとも30個、例えば少なくとも40個、60個、または100個それ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって測定され得る。
一実施形態では、変異型配列は、遺伝コードの重複性により、配列表に記載の特定の配列とは異なり得る。DNAコードは、4つの主な核酸残基(A、T、C、およびG)を有し、これらを使用して、生物の遺伝子内でタンパク質がコードしたアミノ酸を表す3文字のコドンを「綴る」。DNA分子に沿ったコドンの線状配列は、それらの遺伝子によってコードされるタンパク質(複数可)内のアミノ酸の線状配列へと翻訳される。コードは高度に縮重しており、61個のコドンが20種の天然アミノ酸をコードし、3個のコドンが「終止」シグナルを表す。したがって、ほとんどのアミノ酸は、2個以上のコドンによってコードされ、実際、いくつかは、4個以上の異なるコドンによってコードされている。したがって、本発明の変異型ポリヌクレオチドは、本発明の別のポリヌクレオチドと同じポリペプチド配列をコードし得るが、同じアミノ酸をコードするために異なるコドンを使用することから異なる核酸配列を有する場合がある。
したがって、本発明のポリペプチドは、それをコードし、発現することができるポリヌクレオチドの形態から産生され得るか、またはその形態で送達され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、Green&Sambrook(2012,Molecular Cloning−a laboratory manual,4th edition;Cold Spring Harbor Press;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)に例として記載されるように、当該技術分野において周知の方法によって合成することができる。
本発明の核酸分子は、挿入された配列に作動可能に連結している制御配列を含む発現カセットの形態で提供され得、したがってインビボで本発明のポリペプチドの発現を可能にする。これらの発現カセットは、同様に、典型的には、ベクター(例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター)内で提供される。かかる発現カセットは、宿主対象に直接投与され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが宿主対象に投与されてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して調製および/または投与される。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を保有すること、および本発明のポリペプチドの発現を可能にすることのできる、任意のベクターであり得る。
したがって、本発明は、かかるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。かかる発現ベクターは、分子生物学の技術分野で日常的に構築されており、例えば、プラスミドDNAおよび適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、および他のエレメント、例えば、本発明のペプチドの発現を可能にするために必要であり得、かつ正しい配向に位置付けられた、ポリアデニル化シグナルなどの使用を伴う場合がある。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう(Green&Sambrook、上記参照)。
本発明は、本発明のポリペプチドを発現するように修飾されている細胞も含む。かかる細胞は、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞などの、一過性もしくは好ましくは安定な高等真核細胞株、酵母などの下等真核細胞、または細菌細胞などの原核細胞を含む。本発明のポリペプチドをコードするベクターまたは発現カセットの挿入によって修飾され得る細胞の特定の例としては、哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、NS0、およびCOS細胞が挙げられる。好ましくは、選択される細胞株は、安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化および細胞表面発現も可能にするものである。
本発明のそのような細胞株は、本発明のポリペプチドを産生するために一般的な方法を使用して培養されてもよいか、または本発明の抗体を対象に送達するために治療的または予防的に使用されてもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクターは、エクスビボで対象由来の細胞に投与され、次いでその細胞を対象の身体に戻してもよい。
医薬製剤、治療的使用および患者群
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体、二重特異性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および細胞などの、本発明の分子を含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の1つ以上の抗体および/または二重特異性ポリペプチドなどの本発明の1つ以上の分子と、少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体、二重特異性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および細胞などの、本発明の分子を含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の1つ以上の抗体および/または二重特異性ポリペプチドなどの本発明の1つ以上の分子と、少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を提供する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」とは、生理学的に適合する、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などを含み得る。好ましくは、担体は、非経口投与、例えば静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与(例えば注射または点滴による)に好適である。投与経路に応じて、ポリペプチドを不活性化または変性させ得る酸および他の自然条件の作用からポリペプチドを保護するための材料で、ポリペプチドをコーティングしてもよい。
好ましい薬学的に許容される担体は、水性担体または希釈剤を含む。本発明の組成物に用いられ得る好適な水性担体の例としては、水、緩衝水、および生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
本発明の組成物はまた、薬学的に許容可能な抗酸化剤を含み得る。これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順(上記を参照)、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなどの包含の両方によって確実にされ得る。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことも望ましい場合がある。加えて、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、注射用剤型の長期吸収をもたらすことができる。
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の規則的な構造として製剤化され得る。
無菌注射用溶液は、必要に応じて上に挙げた成分のうちの1つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に必要量の活性剤(例えばポリペプチド)を組み込み、続いて無菌精密濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性薬剤を、基本的な分散媒および上に挙げたものから必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性剤およびその予め滅菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分の粉末を得る、真空乾燥および冷凍乾燥(凍結乾燥)である。
特に好ましい組成物は、全身投与用または局所投与用に調合される。局所投与は、腫瘍の部位または腫瘍流入領域リンパ節へ行われてもよい。組成物は、好ましくは一定期間にわたって持続放出するように調合されてもよい。したがって、組成物は、持続放出を促進するマトリックス中にまたはマトリックスの一部として提供されてもよい。好ましい持続放出マトリックスは、モンタニドまたはγ−ポリグルタミン酸(PGA)のナノ粒子を含み得る。本発明のポリペプチドの局所的放出は、任意選択的に持続期間にわたり、CTLA−4アンタゴニストの投与に関連した潜在的な自己免疫副作用を低下し得る。
本発明の組成物は、追加の活性成分、ならびに本発明のポリペプチドを含み得る。上記のように、本発明の組成物は、本発明の1つ以上のポリペプチドを含み得る。それらはまた、追加の治療剤または予防剤を含み得る。
本発明のポリペプチドまたは他の組成物および使用説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。本キットは、上述の追加の治療剤または予防剤などの1つ以上の追加の試薬をさらに含んでもよい。
本発明に従ったポリペプチドは、治療または予防に使用してもよい。治療用途では、ポリペプチドまたは組成物は、すでに障害または状態を患っている対象に、その病態またはその症状のうちの1つ以上を治癒、軽減、または部分的に抑えるのに十分な量で投与される。かかる治療処置は、疾患症状の重症度の減少、または無症状期間の頻度もしくは持続期間の増加をもたらし得る。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。予防用途では、ポリペプチドまたは組成物は、障害または病態の症状をまだ示していない対象に、症状の発症を防止するか、または遅延させるのに十分な量で投与される。そのような量は、「予防有効量」と定義される。対象は、任意の好適な手段によって、疾患または病態を発症するリスクがあるものと特定されていてもよい。
特に、本発明の抗体および二重特異性ポリペプチドは、癌の治療または予防に有用であり得る。したがって、本発明は、癌の治療または予防に使用するための本発明の抗体または二重特異性ポリペプチドを提供する。本発明はまた、個体に本発明のポリペプチドを投与することを含む、癌を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、癌の治療または予防用の医薬品の製造に使用するための、本発明の抗体または二重特異性ポリペプチドを提供する。
癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頚部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫、または膠芽腫であり得る。
本発明の抗体もしくは二重特異性ポリペプチド、または当該抗体もしくは当該ポリペプチドを含む組成物は、当該技術分野において既知の種々の方法のうちの1つ以上を使用して、1つ以上の投与経路を介して投与され得る。当業者には理解されるであろうように、投与経路および/または方式は、所望の結果に応じて異なるであろう。全身投与または局所投与が好ましい。局所投与は、腫瘍の部位または腫瘍流入領域リンパ節へ行われてもよい。本発明のポリペプチドまたは組成物に好ましい投与方式としては、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与方式が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与方式を意味する。あるいは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、局所投与方式、表皮投与方式、または粘膜投与方式などの非経腸(non−parenteral)投与方式を介して投与することができる。
本発明の抗体またはポリペプチドの好適な投与量は、熟練した医療施術者によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成、および投与方式に対して所望の治療応答を達成するのに有効である、患者に対して有害でない活性成分の量を得るように異なり得る。選択される投与量レベルは、用いられる特定のポリペプチドの活性、投与経路、投与時間、ポリペプチドの***速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および/または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態および以前の病歴、ならびに医薬技術分野で周知の同様の要因を含む、種々の薬物動態学的要因に依存するであろう。
本発明の抗体またはポリペプチドの好適な用量は、例えば、治療される患者の体重の約0.1μg/kg〜約100mg/kgの範囲であり得る。例えば、好適な用量は、1日当たり体重の約1μg/kg〜約10mg/kg、または1日当たり体重の約10g/kg〜約5mg/kgであり得る。
投与計画は、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するように調整してもよい。例えば、単回ボーラスを投与してもよいか、数回に分けた用量を経時的に投与してもよいか、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に低下または増加してもよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で調合することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象用の単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
抗体またはポリペプチドは、単回用量または複数回用量で投与してもよい。複数回用量は、同じかまたは異なる経路を介して、同じかまたは異なる位置に投与してもよい。あるいは、抗体またはポリペプチドは、上述のように徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期、および所望の治療期間に応じて異なり得る。投与量および投与の頻度もまた、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて異なり得る。予防的用途では、比較的低い投与量を比較的不定期な間隔で、長期間にわたって投与してもよい。治療的用途では、例えば患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的高い投与量を投与してもよい。
2つ以上の薬剤の併用投与は、多数の異なる方法で達成され得る。一実施形態では、抗体またはポリペプチドおよび他の薬剤を、単一の組成物中で一緒に投与してもよい。別の実施形態では、抗体またはポリペプチドおよび他の薬剤を、併用療法の一部として別々の組成物中で投与してもよい。例えば、モジュレータは、他の薬剤の前、後、または同時に投与してもよい。
本発明の抗体、ポリペプチド、または組成物はまた、第1および第2のT細胞標的を発現する細胞集団の活性化を増加させる方法において使用され得、方法は、当該細胞と本発明のポリペプチドとの間の相互作用を可能にするのに好適な条件下で、本発明のポリペプチドまたは組成物を当該細胞集団に投与することを含む。細胞集団は、典型的には、第1のT細胞標的、典型的にはT細胞を発現する少なくともいくつかの細胞と、第2のT細胞標的を発現する少なくともいくつかの細胞とを含む。方法は、典型的にはエクスビボで実行される。
例えば、本発明の抗体、ポリペプチド、または組成物は、上述のような方法である、ヒトOX40およびヒトCTLA−4を発現する細胞集団の活性化を増加させる方法においても使用され得る。
CTLA−4に対する結合ドメイン
本発明の二重特異性ポリペプチドは、CTLA−4に特異的な結合ドメインを含む。
本発明の二重特異性ポリペプチドは、CTLA−4に特異的な結合ドメインを含む。
CD86およびCD80は、本明細書においてB7タンパク質(それぞれB7−2およびB7−1)と称され得る。これらのタンパク質は、抗原提示細胞の表面上に発現され、T細胞受容体CD28およびCTLA−4と相互作用する。CD28へのB7分子の結合はT細胞活性化を促進する一方で、CTLA−4へのB7分子の結合はT細胞の活性化を止める。B7タンパク質とCD28および/またはCTLA−4との間の相互作用は、免疫活性化および調節において重要な役割を果たす共刺激シグナル伝達経路を構成する。したがって、B7分子は、経路の一部であり、免疫阻害を切り離すための操作を受けやすく、それによって患者の免疫を向上する。
CD86タンパク質は単量体であり、2つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインからなる。CD86の受容体結合ドメインは、典型的なIgVセット構造を有するのに対し、膜近位ドメインは、C1セット様構造を有する。CD80およびCD86の構造は、それ自体で、またはCTLA−4との複合体で決定されている。CD80およびCD86分子上の接触残基は、可溶性細胞外ドメインにあり、大部分はベータシート中に位置し、(CDR様)ループ中には位置しない。
配列番号3は、ヒト野生型CD86の単量体可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列である。この野生型配列は、任意選択的に、N末端、すなわち24位および25位にアラニンおよびプロリンを欠いていてもよい。これらのアミノ酸は、本明細書においてそれぞれA24およびP25と称され得る。
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ポリペプチド結合ドメインとして、CTLA−4に特異的なドメイン、「CTLA−4結合ドメイン」を有する。そのような結合ドメインの好適な例は、WO2014/207063に開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。CTLA−4に特異的な結合ドメインはまた、CD28にも結合し得る。本明細書で使用されるCTLA−4という用語は、典型的には、ヒトCTLA−4を指し、本明細書で使用されるCD28という用語は、典型的にはヒトCD28を指す。ヒトCTLA−4およびヒトCD28の配列は、それぞれ配列番号1および2に記載されている。本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインは、他の哺乳類、例えば霊長類またはマウスのCTLA−4またはCD28からのCTLA−4またはCD28に対していくらかの結合親和性を有し得る。
CTLA−4結合ドメインは、その天然の状態でCTLA−4に、特に細胞の表面に局在するCTLA−4に結合する能力を有する。
「細胞の表面に局在する」は、上記に定義した通りである。
本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメイン部分は、
(i)配列番号3のアミノ酸配列、または
(ii)当該結合ドメインが野生型ヒトCD86よりも高い親和性でヒトCTLA−4に結合することを条件に、配列番号3のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも1つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含み得るかまたはそれからなり得る。
(i)配列番号3のアミノ酸配列、または
(ii)当該結合ドメインが野生型ヒトCD86よりも高い親和性でヒトCTLA−4に結合することを条件に、配列番号3のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも1つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含み得るかまたはそれからなり得る。
言い換えれば、CTLA−4結合ドメインは、(i)ヒト野生型CD86の単量体可溶性細胞外ドメイン、または(ii)当該ポリペプチド変異型が野生型ヒトCD86よりも高い親和性でヒトCTLA−4に結合することを条件に、当該可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異型、を含むかまたはそれからなる、ヒトCTLA−4に特異的なポリペプチド結合ドメインである。
したがって、本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインは、ヒト野生型CD86と同じ標的結合特性を有し得るか、またはヒト野生型CD86の標的結合特性と比較して異なる標的結合特性を有し得る。そのような特性を比較する目的のために、「ヒト野生型CD86」は、典型的には、前段落に記載されているようなヒト野生型CD86の単量体可溶性細胞外ドメインを指す。
ヒト野生型CD86は、CTLA−4およびCD28の2つの標的に特異的に結合する。したがって、本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインの結合特性は、ポリペプチドがこれらの標的の各々に結合する能力の個々の尺度として表すことができる。例えば、ヒト野生型CD86の単量体細胞外ドメインのポリペプチド変異型は、好ましくは、CTLA−4に対する野生型ヒトCD86のものよりも高い結合親和性でCTLA−4に結合する。そのようなポリペプチドはまた、任意選択的に、CD28に対する野生型ヒトCD86のものよりも低い結合親和性でCD28にも結合し得る。
本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインは、CTLA−4に特異的なポリペプチド結合ドメインである。これは、好ましくは、別の分子に結合するよりも大きな結合親和性でCTLA−4に結合することを意味する。CTLA−4結合ドメインは、好ましくは、CTLA−4に対する野生型ヒトCD86のものと同じかまたはより高い親和性で、CTLA−4に結合する。
好ましくは、ヒトCTLA−4に対する本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインのKdは、ヒトCTLA−4に対する野生型ヒトCD86のKdの、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも4.5倍、少なくとも5倍、少なくとも5.5倍、少なくとも8倍、または少なくとも10倍未満であろう。最も好ましくは、ヒトCTLA−4に対するCTLA−4結合ドメインのKdは、ヒトCTLA−4に対する野生型ヒトCD86のKdの、少なくとも5倍、または少なくとも10倍未満であろう。CTLA−4に対するポリペプチドのKdを決定するための好ましい方法は、例えばBiacore(商標)システムを用いたSPR分析である。ポリペプチドのSPR分析に好適なプロトコルは、実施例に記載されている。
好ましくは、ヒトCTLA−4に対する本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインのEC50は、同じ条件下でのヒトCTLA−4に対する野生型ヒトCD86のEC50の、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも12倍、少なくとも14倍、少なくとも15倍、少なくとも17倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、または少なくとも50倍未満であろう。最も好ましくは、ヒトCTLA−4に対するCTLA−4結合ドメインのEC50は、同じ条件下でのヒトCTLA−4に対する野生型ヒトCD86のEC50の、少なくとも10倍、または少なくとも25倍未満であろう。CTLA−4に対するポリペプチドのEC50を決定するための好ましい方法は、ELISAを介したものである。ポリペプチドのEC50の評価に使用するのに好適なELISAアッセイは、実施例に記載されている。
好ましくは、ヒトCTLA−4への結合について野生型ヒトCD86に競合するとき、本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインのIC50は、同じ条件下での野生型ヒトCD86のIC50の、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも13倍、少なくとも15倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、または少なくとも300倍未満であろう。最も好ましくは、CTLA−4結合ドメインのIC50は、同じ条件下での野生型ヒトCD86のIC50の、少なくとも10倍、または少なくとも300倍未満であろう。本発明のポリペプチドのIC50を決定するための好ましい方法は、ELISAを介したものである。本発明のポリペプチドのIC50の評価への使用に好適なELISAアッセイは、実施例に記載されている。
本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインはまた、CD28に特異的に結合し得る。すなわち、CTLA−4結合ドメインは、CTLA−4を除いて、それが別の分子に結合する場合よりも大きな結合親和性でCD28に結合し得る。CTLA−4結合ドメインは、ヒトCD28に対する野生型ヒトCD86のものよりも低い親和性でヒトCD28に結合し得る。好ましくは、ヒトCD28に対するCTLA−4結合ドメインのKdは、ヒトCD28に対する野生型ヒトCD86のKdよりも、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍高いであろう。
本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインの結合特性はまた、ポリペプチドが2つの標的、CTLA−4およびCD28に結合する能力の相対的な尺度として表すこともできる。すなわち、CTLA−4結合ドメインの結合特性は、ポリペプチドの、CTLA−4に結合する能力対CD28に結合する能力の、相対的な尺度として表すことができる。好ましくは、ヒト野生型CD86の、CTLA−4に結合する能力対CD28に結合する能力の対応する相対的な能力と比較すると、CTLA−4結合ドメインは、相対的に増加した、CTLA−4に結合する能力対CD28に結合する能力を有する。
CTLA−4およびCD28の両方に対するポリペプチドの結合親和性が同じパラメータ(例えば、Kd、EC50)を使用して評価される場合、各標的に対するポリペプチドの相対的結合能力は、各標的に対するパラメータの値の単純な比として表すことができる。この比は、ポリペプチドの結合比または結合強度比と称され得る。結合親和性を評価するために使用される多くのパラメータ(例えば、Kd、EC50)では、より低い値は、より高い親和性を示す。これにあたるとき、CTLA−4に対する結合親和性対CD28に対する結合親和性の比は、好ましくは、以下の式:
結合比=[CD28に対する結合親和性]÷[CTLA−4に対する結合親和性]、に従って計算された単一の数値として表される。
結合比=[CD28に対する結合親和性]÷[CTLA−4に対する結合親和性]、に従って計算された単一の数値として表される。
あるいは、より高い値がより高い親和性を示すパラメータを使用して結合親和性が評価される場合、上記の式の逆が好ましい。いずれの状況においても、本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインは、好ましくはヒト野生型CD86よりも高い結合比を有する。所与のポリペプチドの結合比対別のポリペプチドの結合比を直接比較するには、典型的には、同じパラメータを使用して、結合親和性を評価し、両方のポリペプチドの結合比を計算することが必要であることが理解されるであろう。
好ましくは、ポリペプチドの結合比は、各標的に対するポリペプチドのKdを決定し、次いで式[CD28に対するKd]÷[CTLA−4に対するKd]に従って比を計算することによって計算される。この比は、ポリペプチドのKd結合比と称され得る。標的に対するポリペプチドのKdを決定するための好ましい方法は、例えばBiacore(商標)システムを用いたSPR分析である。本発明のポリペプチドのSPR分析のための好適なプロトコルは、実施例に記載されている。この方法に従って計算された本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインの結合比は、好ましくは、同じ方法に従って計算された野生型ヒトCD86の結合比よりも、少なくとも2倍、または少なくとも4倍高い。
あるいは、ポリペプチドの結合比は、各標的に対するポリペプチドのEC50を決定し、次いで式[OX40に対するEC50]÷[CTLA−4に対するEC50]に従ってその比を計算することによって計算することができる。この比は、ポリペプチドのEC50結合比と称され得る。標的に対するポリペプチドのEC50を決定するための好ましい方法は、ELISAを介したものである。本発明のポリペプチドのEC50の評価への使用に好適なELISAアッセイは、実施例に記載されている。この方法に従って計算された本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインの結合比は、同じ方法に従って計算された野生型ヒトCD86の結合比よりも、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍高い。
本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインは、CTLA−4への結合について別のポリペプチドと交差競合(cross−compete)する能力を有し得る。例えば、CTLA−4結合ドメインは、CTLA−4への結合について、配列番号6〜24のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと交差競合し得る。そのような交差競合性ポリペプチドは、標準的な結合アッセイで同定することができる。例えば、(例えばBiacore(商標)システムを用いた)SPR分析、ELISAアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用して交差競合を実証することができる。
上記の機能的特徴に加えて、本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインは、ある特定の好ましい構造的特徴を有する。CTLA−4結合ドメインは、(i)ヒト野生型CD86の単量体可溶性細胞外ドメイン、または(ii)当該ポリペプチド変異型が野生型ヒトCD86よりも高い親和性でヒトCTLA−4に結合することを条件に、当該可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異型、のいずれかを含むかまたはそれからなる。
ヒト野生型CD86の単量体可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異型は、ヒト野生型CD86のものに由来するアミノ酸配列、具体的には任意選択的にA24およびP25を欠いている、ヒト野生型CD86(配列番号3)の可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。特に、変異型は、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較すると、少なくとも1つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を含む。「変化している」とは、少なくとも1つのアミノ酸が、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、欠失、挿入または置換されていることを意味する。「欠失している」とは、アミノ酸配列が1つのアミノ酸だけ短くなるように、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)中に存在する少なくとも1つのアミノ酸が除去されていることを意味する。「挿入されている」とは、アミノ酸配列が1つのアミノ酸だけ長くなるように、少なくとも1つの追加のアミノ酸が配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)に導入されていることを意味する。「置換されている」とは、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)中の少なくとも1つのアミノ酸が、代替的なアミノ酸で置き換えられていることを意味する。
典型的には、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較すると、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、または9つのアミノ酸が、変化している。典型的には、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較すると、10個、9つ、8つ、7つ、6つ、5つ、4つ、2つ、または1つ以下のアミノ酸が、変化している。これらの下限のうちのいずれかをこれらの上限のうちのいずれかと組み合わせて、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、許容可能な変化の数の範囲を定義することができることが理解されるであろう。したがって、例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、許容可能なアミノ酸の変化の数が、2〜3、2〜4、2〜5、2〜6、2〜7、2〜8、2〜9、2〜10、3〜4、3〜5、3〜6などの範囲内であるアミノ酸配列を含み得る。
配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較すると、少なくとも2つのアミノ酸が変化していることが特に好ましい。好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、許容可能なアミノ酸の変化の数は、2〜9、2〜8または2〜7の範囲である。
上記の数および範囲は、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、欠失、挿入、または置換の任意の組み合わせで達成してもよい。例えば、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、欠失のみ、挿入のみ、もしくは置換のみ、または欠失、挿入、もしくは置換の任意の混合があり得る。好ましくは、変異型は、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、変化の全てが置換であるアミノ酸配列を含む。すなわち、配列番号3の配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、アミノ酸が欠失または挿入されていない配列である。好ましい変異型のアミノ酸配列において、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24を欠いている当該配列)と比較すると、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つのアミノ酸が置換されており、配列番号3の配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、アミノ酸が欠失または挿入されていない。
好ましくは、配列番号3の配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、変化は、配列番号3のFGループ領域(114〜121位)および/またはベータシート領域にある。ベータシート領域のストランドは、以下の位置、配列番号3:A:27〜31、B:36〜37、C:54〜58、C’:64〜69、C’’:72〜74、D:86〜88、E:95〜97、F:107〜113、G:122〜133を有する。
最も好ましくは、配列番号3の配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、変化は、32、48、49、54、74、77、79、103、107、111、118、120、121、122、125、127、または134から選択された1つ以上の位置にある。本明細書におけるアミノ酸の位置の全ての番号付けは、配列番号4のアミノ酸をN末端から始めて数えたものに基づく。したがって、配列番号3のN末端の最初の位置は、24と番号付けされている(図4の概略図参照)。
特に好ましい挿入としては、116位と117位との間に挿入された単一の追加のアミノ酸、および/または118位と119位との間に挿入された単一の追加のアミノ酸が挙げられる。挿入されるアミノ酸は、好ましくはチロシン(Y)、セリン(S)、グリシン(G)、ロイシン(L)、またはアスパラギン酸(D)である。
特に好ましい置換は、122位であり、これはアルギニン(R)である。配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも122位が置換されているアミノ酸配列を含む。122位での最も好ましい置換は、アルギニン(R)を、優先順にリシン(K)またはアスパラギン(N)で置き換えることである。この置換は、R122K/Nと称され得る。
他の好ましい置換は、107位、121位、および125位にあり、それぞれロイシン(L)、イソロイシン(I)、およびグルタミン酸(Q)である。122位での置換に加えて、本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列(またはA24およびP25を欠いている当該配列)と比較して、107位、121位、および125位のアミノ酸のうちの少なくとも1つもまた置換されている、アミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列はまた、32位、48位、49位、54位、64位、74位、77位、79位、103位、111位、118位、120位、127位、および134位のうちの1つ以上で置換されていてもよい。
107位での最も好ましい置換は、ロイシン(L)を、優先順にイソロイシン(I)、フェニルアラニン(F)、またはアルギニン(R)で置き換えることである。この置換は、L107I/F/Rと称され得る。本明細書に記載の他の置換についても、同様の表記法が使用される。121位での最も好ましい置換は、イソロイシン(I)をバリン(V)で置き換えることである。この置換は、I121Vと称され得る。
125位での最も好ましい置換は、グルタミン(Q)をグルタミン酸(E)で置き換えることである。この置換は、Q125Eと称され得る。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に好ましい場合のある他の置換としては、F32I、Q48L、S49T、V54I、V64I、K74I/R、S77A、H79D/S/A、K103E、I111V、T118S、M120L、N127S/D、およびA134Tが挙げられる。
ヒト野生型CD86の当該可溶性細胞外ドメインの特に好ましい変異型は、表Cに示されている配列番号6〜24のアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含むかまたはそれからなる。
配列番号6〜14に示されているアミノ酸配列は、任意選択的に、N末端に追加の残基APを含み得る。配列番号15〜24に示されているアミノ酸配列は、任意選択的に、N末端に残基APを欠いていてもよい。いずれの場合も、これらの残基は、配列番号3のA24およびP25に対応する。
本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインは、ヒト野生型CD86の当該可溶性細胞外ドメインの上述の変異型のうちのいずれかを含み得るかまたはそれからなり得る。すなわち、本発明のポリペプチドのCTLA−4結合ドメインは、表Cに示されている配列番号6〜24のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。
結合ドメインは、例えばT細胞などのCTLA−4を発現する細胞に投与すると、CTLA−4からのシグナル伝達を調節し得る。好ましくは、結合ドメインは、当該シグナル伝達を低下させる、すなわち阻害または遮断し、それによって当該細胞の活性化を増加する。試験剤(結合ドメインなど)の投与の結果としてのCTLA−4シグナル伝達および細胞活性化の変化は、任意の好適な方法によって決定され得る。好適な方法としては、試験剤の存在下または好適な対照の存在下にあるとき、T細胞の表面に発現されたCTLA−4を通じて膜結合CD86(例えばRaji細胞上の)が結合しシグナル伝達する能力をアッセイすることが挙げられる。対照の存在下でのT細胞IL−2産生および/またはT細胞増殖のレベルと比較した、試験剤の存在下でのT細胞IL−2産生レベルの増加またはT細胞増殖の増加は、CTLA−4を通じたシグナル伝達の低下および細胞活性化の増加を示す。この種類の典型的なアッセイは、US2008/0233122の実施例9に開示されている。
OX40に対する結合ドメイン
本発明の二重特異的結合分子は、結合ドメインとして(例えば、B1として)任意のOX40結合ドメイン、例えば抗OX40抗体を組み込むことができる。
本発明の二重特異的結合分子は、結合ドメインとして(例えば、B1として)任意のOX40結合ドメイン、例えば抗OX40抗体を組み込むことができる。
OX40に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、以下により詳細に説明される、ある特定の好ましい結合特徴および機能的効果を有する。当該抗体またはその抗原結合断片は、本発明の二重特異性抗体の一部として組み込まれているとき、好ましくは、これらの結合特徴および機能的効果を保持する。この結合ドメインは、本発明の二重特異性分子とは独立して提供されてもよい。
抗体は、好ましくは、OX40に特異的に結合する、すなわち、OX40には結合するが、他の分子には結合しないか、またはより低い親和性で結合する。本明細書で使用される用語OX40は、典型的には、ヒトOX40を指す。ヒトOX40の配列は、配列番号51(GenBank:NP_003318.1に対応)に記載されている。抗体は、非ヒト霊長類(例えば、Macaca fascicularis(カニクイザル)、Macaca mulatta)のOX40など、他の哺乳類からのOX40に対してある程度の結合親和性を有し得る。抗体は、好ましくは、マウスOX40に結合せず、かつ/または他のヒトTNFRスーパーファミリーメンバー、例えばヒトCD137もしくはCD40に結合しない。
抗体は、その天然の状態でOX40に、特に細胞の表面に局在するOX40に結合する能力を有する。好ましくは、抗体はOX40に特異的に結合するであろう。すなわち、本発明の抗体は、好ましくは、別の分子に結合する結合親和性よりも高い結合親和性でOX40に結合するであろう。
「細胞の表面に局在する」は、上記に定義した通りである。
抗体は、上記に定義したように、OX40を発現する細胞の活性を調節することができ、当該調節は、当該細胞の活性の増加または減少である。細胞は、典型的にはT細胞である。抗体は、上述のように、CD4+もしくはCD8+エフェクター細胞の活性を増加するか、または制御性T細胞(Treg)の活性を減少することができる。
いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターT細胞、特にCD4+エフェクターT細胞の活性の増加である。エフェクターT細胞の活性の変化を決定するための方法は、周知であり、先に記載されている。
抗体は、好ましくは、50×10−10M未満、または25×10−10M未満、より好ましくは10、9、8、7、または6×10−10M未満、最も好ましくは5×10−10M未満であるKd値でヒトOX40に結合する。
例えば、抗体は、好ましくは、マウスOX40、またはCD137もしくはCD40などの任意の他のTNFRスーパーファミリーメンバーに結合しない。したがって、典型的には、ヒトOX40に対する抗体のKdは、マウスOX40、他のTNFRスーパーファミリーメンバー、または任意の他の無関係な物質もしくは環境中の付随する物質などの他の非標的分子に対するKdの2倍、好ましくは5倍、より好ましくは10倍未満であろう。より好ましくは、Kdは、50倍未満、さらにより好ましくは100倍未満、およびさらにより好ましくは200倍未満であろう。
この解離定数の値は、上述のように、周知の方法によって直接決定することができる。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、その標的に対して、別の非標的分子に結合するその親和性よりも少なくとも2倍、10倍、50倍、100倍、またはそれ以上である親和性で結合することができる。
したがって、要約すると、抗体は、好ましくは以下の機能的特徴のうちの少なくとも1つを呈する:
I.10×10−10M未満のKD値でヒトOX40に結合する、
II.マウスOX40に結合しない、
III.他のヒトTNFRスーパーファミリーメンバー、例えばヒトCD137またはCD40には結合しない。
I.10×10−10M未満のKD値でヒトOX40に結合する、
II.マウスOX40に結合しない、
III.他のヒトTNFRスーパーファミリーメンバー、例えばヒトCD137またはCD40には結合しない。
抗体は、OX40、典型的にはヒトOX40に特異的であり、以下のうちのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ全てを含み得る:
(a)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「G、F、T、F、G/Y/S、G/Y/S、Y/S、Y/S/A」を含む重鎖CDR1配列、
(b)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「I、G/Y/S/T、G/S/Y、S/Y、G/S/Y、G/S/Y、G/S/Y、T」を含む重鎖CDR2配列、
(c)9〜17アミノ酸長であり、コンセンサス配列「A、R、G/Y/S/H、G/Y/F/V/D、G/Y/P/F、−/H/S、−/N/D/H、−/Y/G、−/Y、−/Y、−/W/A/V、−/A/Y、−/D/A/Y/G/H/N、Y/S/W/A/T、L/M/I/F、D、Y」を含む重鎖CDR3配列。この定義内の好ましい重鎖CDR3配列には、コンセンサス配列「A、R、Y/H、D、Y、A/Y/G、S/W/A、M/L、D、Y」を含む10アミノ酸長のCDR3配列、またはコンセンサス配列「A、R、G/Y、V/F/Y、P、H、G/Y/H、Y、F/I、D、Y」を含む11アミノ酸長のCDR3配列が含まれる。
(d)配列「Q、S、I、S、S、Y」からなる軽鎖CDR1配列、
(e)配列「A、A、S」からなる軽鎖CDR2配列、
(f)8〜10アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Q、Q、S/Y/G、−/Y/H/G、−/S/Y/G/D/W、S/Y/G/D、S/Y/G/T、P/L、Y/S/H/L/F、T」を含む軽鎖CDR3配列。この定義内の軽鎖CDR3配列の好ましい例は、配列「Q、Q、S、Y、S、T、P、Y、T」からなる。
抗体は、少なくとも(c)で定義される重鎖CDR3および/または(f)で定義される軽鎖CDR3を含み得る。抗体は、(a)、(b)、および(c)の3つ全ての重鎖CDR配列および/または(d)、(e)、および(f)の3つ全ての軽鎖CDR配列を含み得る。
(a)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「G、F、T、F、G/Y/S、G/Y/S、Y/S、Y/S/A」を含む重鎖CDR1配列、
(b)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「I、G/Y/S/T、G/S/Y、S/Y、G/S/Y、G/S/Y、G/S/Y、T」を含む重鎖CDR2配列、
(c)9〜17アミノ酸長であり、コンセンサス配列「A、R、G/Y/S/H、G/Y/F/V/D、G/Y/P/F、−/H/S、−/N/D/H、−/Y/G、−/Y、−/Y、−/W/A/V、−/A/Y、−/D/A/Y/G/H/N、Y/S/W/A/T、L/M/I/F、D、Y」を含む重鎖CDR3配列。この定義内の好ましい重鎖CDR3配列には、コンセンサス配列「A、R、Y/H、D、Y、A/Y/G、S/W/A、M/L、D、Y」を含む10アミノ酸長のCDR3配列、またはコンセンサス配列「A、R、G/Y、V/F/Y、P、H、G/Y/H、Y、F/I、D、Y」を含む11アミノ酸長のCDR3配列が含まれる。
(d)配列「Q、S、I、S、S、Y」からなる軽鎖CDR1配列、
(e)配列「A、A、S」からなる軽鎖CDR2配列、
(f)8〜10アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Q、Q、S/Y/G、−/Y/H/G、−/S/Y/G/D/W、S/Y/G/D、S/Y/G/T、P/L、Y/S/H/L/F、T」を含む軽鎖CDR3配列。この定義内の軽鎖CDR3配列の好ましい例は、配列「Q、Q、S、Y、S、T、P、Y、T」からなる。
抗体は、少なくとも(c)で定義される重鎖CDR3および/または(f)で定義される軽鎖CDR3を含み得る。抗体は、(a)、(b)、および(c)の3つ全ての重鎖CDR配列および/または(d)、(e)、および(f)の3つ全ての軽鎖CDR配列を含み得る。
例示的なCDR配列は、表A(1)およびA(2)、配列番号52〜88に列挙されている。
好ましい抗OX40抗体は、表A(1)の任意の個々の行に定義されるような少なくとも1つの重鎖CDR3、および/または表A(2)の任意の個々の行に定義されるような軽鎖CDR3を含み得る。抗体は、表A(1)の個々の行に示される3つ全ての重鎖CDR配列(すなわち、所与の「VH数」の3つ全ての重鎖CDR)、および/または表A(2)の個々の行に示される3つ全ての軽鎖CDR配列(すなわち、所与の「VL番号」の3つ全ての軽鎖CDR)を含み得る。
完全な重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列の例を、表Bに示す。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列も示す。表Bの当該VHおよびVL領域の番号付けは、表A(1)および(2)で使用されている番号付けシステムに対応する。したがって、例えば、「1167、軽鎖VL」のアミノ酸配列は、表A(2)に示されるVL番号1167の3つ全てのCDRを含む完全なVL領域配列の例であり、「1166、重鎖VH」のアミノ酸配列は、表A(1)に示されるVH番号1166の3つ全てのCDRを含む完全なVH領域配列の例である。
本発明の好ましい抗OX40抗体は、特定のVH番号の3つ全てのCDRを含むVH領域、および特定のVL番号の3つ全てのCDRを含むVL領域を含む。例えば、
−抗体は、VH番号1166の3つ全てのCDR、およびVL番号1167の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1166/1167と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号91および89)に示されるように、1166および1167の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1170の3つ全てのCDR、およびVL番号1171の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1170/1171と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号95および93)に示されるように、1170および1171の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1164の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1164/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号99および97)に示されるように、1164および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1168の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1168/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号101および97)に示されるように、1168および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1482の3つ全てのCDR、およびVL番号1483の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1482/1483と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号105および103)に示されるように、1482および1483の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1490の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1490/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号107および97)に示されるように、1490および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1514の3つ全てのCDR、およびVL番号1515の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1514/1515と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号111および109)に示されるように、1514および1515の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1520の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1520/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号113および97)に示されるように、1520および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1524の3つ全てのCDR、およびVL番号1525の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1524/1525と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号117および115)に示されるように、1524および1525の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1526の3つ全てのCDR、およびVL番号1527の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1526/1527と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号121および119)に示されるように、1526および1527の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1542の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1542/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号123および97)に示されるように、1542および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1166の3つ全てのCDR、およびVL番号1167の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1166/1167と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号91および89)に示されるように、1166および1167の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1170の3つ全てのCDR、およびVL番号1171の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1170/1171と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号95および93)に示されるように、1170および1171の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1164の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1164/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号99および97)に示されるように、1164および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1168の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1168/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号101および97)に示されるように、1168および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1482の3つ全てのCDR、およびVL番号1483の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1482/1483と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号105および103)に示されるように、1482および1483の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1490の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1490/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号107および97)に示されるように、1490および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1514の3つ全てのCDR、およびVL番号1515の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1514/1515と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号111および109)に示されるように、1514および1515の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1520の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1520/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号113および97)に示されるように、1520および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1524の3つ全てのCDR、およびVL番号1525の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1524/1525と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号117および115)に示されるように、1524および1525の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1526の3つ全てのCDR、およびVL番号1527の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1526/1527と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号121および119)に示されるように、1526および1527の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
−抗体は、VH番号1542の3つ全てのCDR、およびVL番号1135の3つ全てのCDRを含み得る。そのような抗体は、1542/1135と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表B(配列番号123および97)に示されるように、1542および1135の対応する完全なVHおよびVL配列を含み得る。
抗体は、抗体がヒトOX40に結合し、機能的特徴I〜IIIのうちの少なくとも1つを呈することを条件に、表Bに列挙される特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。そのような変異型または断片は、典型的には、表Bの当該配列のCDR配列を保持し得る。
表Bに示される重鎖または軽鎖アミノ酸配列のうちのいずれか1つの断片は、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも15個、少なくとも18個、少なくとも20個、または少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、または少なくとも100個の、当該アミノ酸配列からの連続アミノ酸を含み得る。
表Bに示される重鎖または軽鎖アミノ酸配列のうちのいずれか1つの変異型は、上記に定義したように、当該配列の置換、欠失、または付加変異型であり得る。
抗体は、本明細書に記載の特定の抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合し得る。好ましくは、1166/1167、1170/1171、1164/1135、1168/1135、1482/1483、1490/1135、1514/1515、1520/1135、1524/1525、1526/1527、および1542/1135と称される抗体のうちのいずれか1つと同じエピトープに結合する。
IgG1重鎖定常領域配列など、本明細書に開示の任意のVH領域配列(完全な重鎖を形成する)と組み合わせることができる例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列は、先に記載されている。
カッパ鎖定常領域配列など、本明細書に開示の任意のVL領域配列(完全な軽鎖を形成する)と組み合わせることができる例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列は、先に記載されている。
本発明の二重特異性ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、OX40およびCTLA−4に特異的な結合ドメインを含み、すなわち、B1はOX40に特異的であり、B2はCTLA−4に特異的である。
本発明のポリペプチドは、OX40およびCTLA−4に特異的な結合ドメインを含み、すなわち、B1はOX40に特異的であり、B2はCTLA−4に特異的である。
例えば、二重特異性ポリペプチドは、配列番号125のCD86ドメインに融合したIgG軽鎖と、配列番号91のVH領域を含むIgG重鎖とを含む抗体「1166/1261」であり得る。あるいは、二重特異性ポリペプチドは、例えば配列番号125および/もしくは91と少なくとも70%の配列同一性、例えば配列番号125および/または91、配列番号125および/または9と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する当該配列の変異型を含み得る。
実施形態の二重特異性ポリペプチドは、免疫系の細胞の活性を、OX40もしくはCTLA−4単独の個々のアゴニストよりも、またはそのような個々のアゴニストの組み合わせよりも、大幅に調節することができる。特に、二重特異性ポリペプチドの投与により、より高いレベルのエフェクターT細胞活性、特にCD4+エフェクターT細胞活性がもたらされる。二重特異性ポリペプチドは、CTLA−4およびOX40が両方ともより高度に発現される微小環境においてのみ最大の効果を発揮するので、エフェクターT細胞活性の増加はまた、個々のOX40またはCTLA−4アゴニスト単独(またはそれらの組み合わせ)の投与から生じるものよりも、局在する。腫瘍は、そのような微小環境である。腫瘍浸潤制御性T細胞(Treg)は、高レベルのCTLA−4およびOX40を発現し、エフェクターT細胞(CD4およびCD8の両方)よりも高く発現する。
エフェクターT細胞活性の増加は、OX40経路の活性化を介した、もしくはCTLA−4阻害経路の遮断を介したエフェクターT細胞の刺激から直接生じ得るか、またはTregの枯渇または下方制御から間接的に生じて得、それによってそれらの免疫抑制効果を低下させる。Tregsの枯渇/下方制御は、抗体依存性細胞貪食(ADCP)または抗体依存性細胞傷害(ADCC)のメカニズムによって媒介される場合がある。エフェクターT細胞と比較した、Treg上でのCTLA−4およびOX40の両方の高発現は、単一特異性抗体と比較して、Tregの著しく高い死滅を誘導する可能性がある。CTLA−4およびOX40の発現が低いエフェクターT細胞は、このメカニズムによって枯渇しないであろう。全体として、殺腫瘍活性を直ちに生じるために、非常に強力な、局所化された免疫活性化を結果としてもたらすであろう。
免疫系の細胞での本発明の二重特異性ポリペプチドの効果の測定は、任意の好適なアッセイで達成され得る。例えば、エフェクターT細胞の活性の増加は、二重特異性ポリペプチドの個々の構成要素B1およびB2に関して上述のようなアッセイによって測定され得、二重特異性ポリペプチドの存在下で対照と比較した、CD4+および/またはCD8+T細胞による増殖またはIL−2産生の測定が挙げられる。対照と比較した増殖またはIL−2産生の増加は、細胞活性化の増加を示す。この種類の典型的なアッセイは、US2008/0233122の実施例9に開示されている。細胞増殖および/またはIL−2産生についてのアッセイは周知知であり、実施例にも例示されている。同じアッセイで評価した場合、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターT細胞の活性の増加よりも、少なくとも1.5倍高い、または少なくとも2倍高い、より好ましくは3倍高い、最も好ましくは5倍高いエフェクターT細胞の活性の増加を誘導するであろう。
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ヒトCTLA−4およびヒトOX40の両方に特異的に結合することができ、上記に定義したようなB1およびB2を含む。
「CTLA−4およびOX40の両方に特異的に結合することができる」とは、上記の各部分に提供される定義に従って、部分B1がOX40に特異的に結合し、部分B2がCTLA−4に特異的に結合することを意味する。好ましくは、それぞれの標的に対する部分B1およびB2の結合特徴は、別々の要素として存在する場合の部分B1およびB2の当該特徴と比較すると、本発明のポリペプチドの一部として存在する場合には、変化しないか、または実質的に変化しない。
典型的には、これは、二重特異性分子が、単独で存在するときにB1のOX40に対するKd値と好ましくは実質的に同じであるOX40に対するKdを有することを意味する。あるいは、二重特異性分子が単独で存在するときのB1のOX40に対するKdと比較して、増加したOX40に対するKdを有する場合、その増加は10倍以下、好ましくは、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、または2倍以下である。二重特異性分子は、好ましくは、50×10−10M未満、より好ましくは25×10−10M未満、最も好ましくは20×10−10MであるKd値でヒトOX40に結合する。加えて、二重特異性分子は、単独で存在する場合、B2のCTLA4に対するKd値と好ましくは実質的に同じであるCTLA−4に対するKdを独立して有するであろう。あるいは、二重特異性分子が単独で存在する場合のB2のCTLA−4のKdと比較して増加するCTLA−4のKdを有する場合、増加は3倍以下、好ましくは2倍以下である。二重特異性分子は、好ましくは、60×10−9M未満、より好ましくは25×10−9M未満、最も好ましくは10×10−9M未満のKd値でヒトCTLA−4に結合する。
言い換えれば、二重特異性分子は、50×10−10M、25×10−10M、または20×10−10M未満のOX40のKdを有する場合があり、独立して60×10−9M未満、25×10−9M未満、または10×10−9M未満のCTLA−4のKdを有し得る。OX40について列挙されたKd値のうちのいずれかをCTLA−4について列挙されたKd値のうちのいずれかと独立して組み合わせて、所与の二重特異性分子の結合特徴を説明することができることが理解されよう。同様に、OX40結合の列挙された倍数変化のうちのいずれかを、CTLA−4結合の列挙された倍数変化のうちのいずれかと独立して組み合わせて、所与の二重特異性分子の結合特徴を説明することができる。
本発明のポリペプチドの一部として存在する場合、部分B1およびB2の結合特徴は、任意の好適なアッセイにより評価され得る。特に、各別々の部分について上記に記載のアッセイは、それらが本発明のポリペプチドの一部として存在する場合、B1およびB2にも適用され得る。本発明の二重特異性ポリペプチドの結合特徴を評価するための好適なアッセイも、実施例に記載されている。
二重特異性分子は、OX40およびCTLA−4の両方が高度に発現されている微小環境にあるとき、免疫系を強力に活性化する。典型的には、二重特異性分子は、CD4+またはCD8+エフェクター細胞の活性を増加するか、または制御性T細胞(Treg)の活性を減少することができる。いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターT細胞、特にCD4+エフェクターT細胞の活性の増加である。同じアッセイで評価した場合、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターT細胞の活性の増加よりも、少なくとも1.5倍高い、または少なくとも1.7倍高い、より好ましくは4.5倍高い、最も好ましくは7倍高いエフェクターT細胞の活性の増加を誘導するであろう。
エフェクターT細胞の活性の変化を決定するための方法は、周知であり、先に記載された通りである。細胞増殖および/またはIL−2産生についてのアッセイは周知であり、実施例に例示されている。
例えば、ポリペプチドは、CTLA−4およびOX40の両方に特異的に結合することができ得、B1は、OX40に特異的な抗体またはその抗原結合断片であり得、B2は、CTLA−4に特異的なポリペプチド結合ドメインであり得、これは、
i)配列番号3のアミノ酸配列、または
ii)当該結合ドメインが野生型ヒトCD86よりも高い親和性でヒトCTLA−4に結合することを条件に、配列番号3のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも1つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含むかまたはそれからなる。
ii)当該結合ドメインが野生型ヒトCD86よりも高い親和性でヒトCTLA−4に結合することを条件に、配列番号3のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも1つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含むかまたはそれからなる。
ポリペプチドによって特異的に結合されているCTLA−4は、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのCTLA−4であり得、および/またはポリペプチドによって特異的に結合されているOX40は、霊長類、好ましくはヒトのOX40であり得る。
本発明の二重特異性ポリペプチドは、任意の好適なフォーマットで一緒に配置されるOX40結合ドメインおよびCTLA−4結合ドメインを含み得る。任意の所与の二重特異性フォーマットにおいて、OX40結合ドメインおよびCTLA−4結合ドメインは、それぞれ独立して、抗体全体またはその抗原結合部分であり得ることが理解されよう。使用される特定の二重特異性フォーマットとは関係なく、本明細書に記載の二重特異性ポリペプチドおよび抗体は、典型的には、OX40結合ドメイン(結合ドメイン1と称され得る)の組成およびCTLA−4結合ドメイン(結合ドメイン2と称され得る)の組成に基づく番号付けスキームによって称され得る。したがって、番号付けスキームは、典型的には、OX40結合ドメイン(結合ドメイン1)の場合はVH1/VL1、CTLA−4結合ドメイン(結合ドメイン2)の場合はVH2/VL2の形態で、VH1/VL1−VH2/VL2として一緒に記述される。この番号付けスキームは、二重特異性ポリペプチドまたは抗体中に存在する結合ドメインの総数も、二重特異性ポリペプチドまたは抗体中の定常領域の有無も反映せず、どちらも使用される二重特異性抗体の特定のフォーマットによって決定されることが理解されよう。結合ドメインの総数および定常領域の有無は、当該技術分野で知られている任意の好適な二重特異性抗体フォーマットに従ってもよい。
二重特異性ポリペプチドまたは抗体の多くの好適なフォーマットが当該技術分野で知られており、本発明の二重特異性ポリペプチドは、これらのフォーマットのうちのいずれかであり得る。適切なフォーマットには、図1および14に記載されているものが含まれる(その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Kontermann&Brinkmann,2015,Drug Discov Today.838−847も参照されたい)。
図14において、定常領域は、薄灰色で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域VH1は、白黒の格子柄として示されており、可変軽鎖領域VL1は、白で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域VH2は、黒で塗りつぶされて示されており、可変軽鎖領域VL2は、白地に斜線で示されている。したがって、OX40結合ドメイン(結合ドメイン1と称される)は、典型的には、格子柄の白黒ドメインと塗りつぶされた白色ドメインとの対として表され、CTLA−4結合ドメイン(結合ドメイン2と称される)は、典型的には、塗りつぶされた黒色ドメインと斜線のある白色ドメインとの対として表される。しかしながら、示されているフォーマットの全てにおいて、結合ドメイン1および2が交換され得ることは理解されよう。すなわち、OX40結合ドメインは、CTLA−4ドメインについて図14に示される任意の位置で発生する可能性があり、その逆も同様である。
二重特異性ポリペプチドの好ましいフォーマットは、図14の2行目に最初に示されているkihまたは「ノブ・イン・ホール」配列である。この配置において、各抗体の重鎖のCH3ドメインは、抗OX40抗体からの重鎖と抗CTLA−4抗体からの重鎖との間のヘテロ二量体化を可能にするように突然変異している。各重鎖は、対応する軽鎖と会合して、1つの完全なOX40結合ドメインと、1つの完全なCTLA−4結合ドメインとを形成する。正しい軽鎖との会合を促進するために、重鎖CH1領域に修飾を加えることができる。kihフォーマットの二重特異性抗体は、当該技術分野で周知である。例えば、Ridgway et al 1996;Protein Eng 9:617−621を参照されたい;その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の二重特異性抗体の別の好ましいフォーマットは、scFv2−Fcフォーマットであり、これは図14の2行目に示されている2番目のものである。この配置では、各標的に特異的な1つのscFvが定常免疫グロブリンドメインに融合する。単鎖は重鎖のFc領域に融合し得、一方の特異性がFc領域のN末端に融合し、他方の特異性がFc領域のC末端に融合する(Park et al.,2000,Mol Immunol 37(18):1123−30;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
本発明の二重特異性ポリペプチドの別の好ましいフォーマットは、BITE/scFv2フォーマットであり、これは図14の2行目に示されている3番目のフォーマットである。この配置では、一方がOX40に特異的なscFvであり、他方がCTLA−4に特異的なscFvである2つのscFvが、リンカーと一緒に融合している(Brischwein et al.,2007,J Immunother 30(8):798−807;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。リンカーは、任意選択的に、図14の4行目に示されているように、ヒト血清アルブミン(HSA)などの溶解性および血清半減期を増加させ、scFv−HSA−scFv二重特異性抗体を作成するタンパク質を含み得る。
本発明の二重特異性ポリペプチドに対する別の好ましいフォーマットは、二重可変ドメイン(DVD)免疫グロブリンであり、これは図14の2行目に示されている4番目のフォーマットである。この配置では、第2の可変ドメイン(VL2)は第1の可変軽鎖(VL1)に融合し、第2の可変重鎖(VH2)はIgG分子の第1の可変重鎖(VH1)に融合する。VH1およびVL1は結合部位1を形成し、VH2およびVL2は結合部位2を形成し、したがって二重特異性抗体を作成する(Wu,2007,Nat Biotechnol 25(11):1290−7;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
本発明の二重特異性ポリペプチドの別の好ましいフォーマットは、VH1がVL2に融合し、VH2がVL1に融合し、短いペプチドリンカーでVH1/VL1およびVH2/VL2結合部位を形成させる二重親和性再標的化(DART)フォーマットである。この構築物は、結合部位間にジスルフィド架橋を形成することにより安定化する可能性がある。DARTフォーマットをIgG Fcドメインに融合して、一価の二重特異性抗体(DART−Fc)または二価の二重特異性抗体(DART2−Fc)を作成することができる(Moore et al.,2011,Blood 117(17):4542−51)。DART、DART−Fc、およびDART2−Fcフォーマットを図14の3行目に示す。
本発明の二重特異性ポリペプチドの別の好ましいフォーマットは、ドック−アンド−ロック技術(DNL)により生成される二重特異性抗体である。cAMP依存性タンパク質キナーゼAおよびAキナーゼアンカータンパク質は、各標的の抗体、Fab断片、またはscFvに融合し、それにより多価の二重特異性抗体、例えばDNL−Fab3を生成することができる(図14の4行目に示される、Chang et al.,2007,Clin Cancer Res 13(18Pt 2):5586s−5591s;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
本発明の二重特異性ポリペプチドに対する特に好ましいフォーマットは、scFv−IgGフォーマットである。このフォーマットの4つの異なる可能な配置を図14の一番上の行に示す。図14に示されるように、scFv−IgGフォーマットでは、抗OX40抗体はIgG分子全体であり、抗CTLA−4抗体は、一般的な4つの位置(重鎖定常領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域)のうちのいずれか1つで抗OX40抗体に接続されたscFv抗体である。。いずれの場合も、逆の配置も想定されている。すなわち、IgG全体としての抗CTLA−4抗体およびscFvとしての抗OX40抗体は、4つの一般的な位置のうちのいずれかで抗CTLA−4抗体に接続されている。scFv−IgGフォーマットでは、IgG分子全体をscFvに直接接合することも、リンカーを介して間接的に接合することもできる。例示的なリンカーとしては、配列番号47〜50、または144のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列のペプチドが挙げられる。
図14に示される最初のscFv−IgG配置(図の左上)では、二重特異性抗体は、重鎖可変配列VH2(黒で塗りつぶされた)および軽鎖可変配列VL2(斜線付きの白)からなるscFv配列に連結された(任意選択的にリンカーを介して)重鎖定常配列(Hc、灰色に塗りつぶされた)に連結された重鎖可変配列VH1(格子柄の白黒)を含むポリペプチド鎖の2つのコピーを含む。この鎖は、VH1−Hc−VH2/VL2(規則的なN末端−C末端)と称され得る。二重特異性抗体は、VL1−Lc(規則的なN末端−C末端)と称され得る軽鎖定常配列(Lc、灰色に塗りつぶされた)に連結された軽鎖可変配列VL1(白に塗りつぶされた)を含む、より小さな鎖の2つのコピーも含む。図14に示される代替的なscFv−IgG配列は、2つの異なる鎖のそれぞれ2つのコピーも含み、これらは同様の様式で記載され得る。したがって、図22の一番上の行を左から右に読むと、2番目の配列は、2つのVH1−Hc鎖と、2つのVL1−Lc−VH2/VL2鎖とを含む。第3の配置は、2つのVH1/VH2−VH1−Hc鎖と、2つのVL1−Lc鎖とを含む。第4の配置は、2つのVH1−Hc鎖と、2つのVH1/VH2−VL1−Lc鎖とを含む。
一実施形態では、本発明の二重特異性ポリペプチドは、図14(図の左上)に示される最初のscFv−IgG配置を有する。
本発明は、単独で、または好ましくは単一特異性もしくは二重特異性抗体の一部として、表A〜Eに記載のアミノ酸配列のうちのいずれかを含むかまたはそれからなるポリペプチドを提供する。表A〜Eに示される配列のうちの全てにおいて、重鎖または軽鎖定常領域に対応する配列は例示であり、任意の他の好適な重鎖または軽鎖定常領域配列で置き換えることができる。好ましい重鎖および軽鎖定常領域配列は、配列番号135、136、137、138、および139の配列である。
本発明はまた、非抗体ポリペプチドが結合ドメインとして使用される同等の二重特異性ポリペプチドを包含することが理解されるであろう。本発明の実施形態では、本発明のポリペプチドの部分B1は、抗体またはその抗原結合断片であり、これは、典型的には、少なくとも1つの重鎖(H)および/または少なくとも1つの軽鎖(L)を含む。本発明のポリペプチドの部分B2は、B1の任意の部分に結合し得るが、典型的には、当該少なくとも1つの重鎖(H)または少なくとも1つの軽鎖(L)に、好ましくはN末端またはC末端のいずれかで結合し得る。本発明のポリペプチドの部分B2は、直接的にまたは任意の好適な連結分子(リンカー)を介して間接的にかのいずれかでそのように結合されてもよい。
部分B1は、好ましくは少なくとも1つの重鎖(H)および少なくとも1つの軽鎖(L)を含み、部分B2は、好ましくは当該重鎖(H)または当該軽鎖(L)のいずれかのN末端またはC末端に結合している。B1の例示的な抗体は、2つの同一の重鎖(H)および2つの同一の軽鎖(L)からなる。そのような抗体は、典型的には2つのアームとして配置され、アームの各々はヘテロ二量体として接合している1つのHおよび1つのLを有し、2つのアームは、H鎖間のジスルフィド結合によって接合している。したがって、抗体は、事実上、2つのH−Lヘテロ二量体で形成されたホモ二量体である。本発明のポリペプチドの部分B2は、そのような抗体の両方のH鎖もしくは両方のL鎖、またはただ1つのH鎖もしくはただ1つのL鎖に結合され得る。
したがって、本発明のポリペプチドは、あるいは、ヒト野生型CD86またはその変異型の単量体可溶性細胞外ドメインを含むかまたはそれからなる、CTLA−4に特異的な少なくとも1つのポリペプチド結合ドメインが結合している抗OX40抗体またはその抗原結合断片として説明され得る。B1およびB2の結合ドメインは、本発明のポリペプチド中の唯一の結合ドメインであり得る。
本発明のポリペプチドは、N−Cの方向に書かれている以下の式:
(A)L−(X)n−B2、
(B)B2−(X)n−L、
(C)B2−(X)n−H、および
(D)H−(X)n−B2、のうちのいずれか1つに従って配置されているポリペプチドを含み得、
式中、Hが抗体(すなわちB1)の重鎖であり、Lが抗体(すなわちB1)の軽鎖であり、Xがリンカーであり、nが0または1である。リンカー(X)がペプチドである場合、リンカーは、典型的には、アミノ酸配列SGGGGSGGGGS(配列番号47)、SGGGGSGGGGSAP(配列番号48)、NFSQP(配列番号49)、KRTVA(配列番号50)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号144)、またはm=1〜7である(SG)mを有する。式(A)〜(D)の略図を、図1に示す。
(A)L−(X)n−B2、
(B)B2−(X)n−L、
(C)B2−(X)n−H、および
(D)H−(X)n−B2、のうちのいずれか1つに従って配置されているポリペプチドを含み得、
式中、Hが抗体(すなわちB1)の重鎖であり、Lが抗体(すなわちB1)の軽鎖であり、Xがリンカーであり、nが0または1である。リンカー(X)がペプチドである場合、リンカーは、典型的には、アミノ酸配列SGGGGSGGGGS(配列番号47)、SGGGGSGGGGSAP(配列番号48)、NFSQP(配列番号49)、KRTVA(配列番号50)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号144)、またはm=1〜7である(SG)mを有する。式(A)〜(D)の略図を、図1に示す。
本発明はまた、式(A)〜(D)のうちのいずれかに従って配置されているポリペプチドからなるポリペプチドを提供する。当該ポリペプチドは、単量体として提供されてもよいか、または抗体などの多量体タンパク質の構成要素として存在してもよい。当該ポリペプチドは、単離されていてもよい。そのようなポリペプチドのアミノ酸配列の例を表Dに示す。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列もまた示す。
部分B2は、任意の好適な手段によって、本発明のポリペプチドの任意の部分に、またはリンカーに結合され得る。例えば、ポリペプチドの様々な部分は、ペプチド結合などの化学的共役によって接合されてもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーによって接合している、B1(またはその構成要素部分)およびB2を含む融合タンパク質を含み得るかまたはそれからなり得る。そのような融合タンパク質では、OX40結合ドメインまたはB1のドメイン、およびCTLA−4結合ドメインまたはB2のドメインが、唯一の結合ドメインであり得る。
分子をポリペプチドに共役するための他の方法は、当該技術分野において既知である。例えば、カルボジイミド共役(Bauminger&Wilchek,1980,Methods Enzymol.70:151−159参照;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)を使用して、ドキソルビシンを含む種々の薬剤を抗体またはペプチドに共役することができる。水溶性カルボジイミド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)は、官能部分を結合部分に共役するのに特に有用である。さらなる例として、共役は、過ヨウ素酸ナトリウム酸化、続いて適切な反応物の還元アルキル化によって、またはグルタルアルデヒド架橋によって達成され得る。しかしながら、どの方法が選択されるかにかかわらず、本発明のポリペプチドの一部として存在するとき、部分B1およびB2がそれらの標的結合特性を保持するかまたは実質的に保持するという決定がなされるべきであることが好ましいと認識されている。
本発明のポリペプチドを別の分子に(直接的にまたは間接的に)連結するために、同じ技術を使用してもよい。他の分子は、治療薬または検出可能な標識であり得る。好適な治療薬としては、細胞傷害性部分または薬物が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、単離された形態、または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、何らかの周囲媒体からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離があり得ることを意味する。ポリペプチドは、それらの意図される用途を妨害しないであろう担体または希釈剤と混合され得、それでもなお実質的に単離されていると見なされる。
本発明の例示的なポリペプチドは、表Dに示されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含むかまたはそれからなり得る。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号125〜134の群内から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、任意選択的に、当該ポリペプチドは、抗体の構成要素部分として提供される。
抗体の重鎖または軽鎖アミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Bに記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか1つを含み得るかまたはそれからなり得る。表Dに示されるポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Dにも示されている対応するヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得る(イントロン配列は小文字で示されている)。部分B2の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Eに示される配列番号25〜43のうちのいずれか1つを含み得るかまたはそれからなり得る。あるいは、好適なポリヌクレオチドは、上記に定義したように、これらの配列のうちのいずれかの変異型であり得る。
本発明の実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、腫瘍細胞に対する宿主免疫系の相乗的活性化を誘導する、すなわち、個々の単一特異性の対応するポリペプチド(CTLA−4結合ドメイン、または個々のOX40単一特異性抗体)の組み合わせ効果と比較して、腫瘍内CD8/Treg比の相乗的増加を誘導することができる。
本発明の実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、腫瘍細胞に対する宿主免疫系の免疫記憶を誘導することができる。
「免疫記憶」とは、以前に遭遇した体内の腫瘍抗原などの抗原を迅速かつ特異的に認識し、対応する免疫応答を開始する免疫系の能力を意味する。
本発明の関連する態様
本発明の第2の態様は、上述のように、個体における疾患または状態を治療または予防するための方法に使用するための、本発明の第1の態様に従った二重特異的ポリペプチドを含む。
本発明の第2の態様は、上述のように、個体における疾患または状態を治療または予防するための方法に使用するための、本発明の第1の態様に従った二重特異的ポリペプチドを含む。
本発明の第3の態様は、上述のように、個体における疾患または状態を治療または予防する方法であって、本発明の第1または第2の態様に従った二重特異性ポリペプチドを個体に投与することを含む方法である。
本発明の第4の態様は、医薬品の製造における本発明の第1の態様に従った二重特異性ポリペプチドの使用である。
本発明の一実施形態は、疾患もしくは状態が癌であり、任意選択的に個体がヒトである本発明の第2の態様に従った二重特異性ポリペプチドもしくは本発明の第3の態様に従った方法であるか、または医薬品が治療用であり、任意選択的に個体がヒトである本発明の第4の態様に従った使用である。
さらなる実施形態では、当該方法は、上述のように、二重特異性抗体を、全身または局所に、例えば腫瘍の部位にもしくは腫瘍流入領域リンパ節に投与することを含む。
癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頚部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫、または膠芽腫であり得る。
本発明の第5の態様は、上述のように、本発明の第1または第2の態様に従った二重特異性ポリペプチドの、少なくとも1つのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドである。
本発明の第6の態様は、本発明の第1または第2の態様に従った二重特異性ポリペプチドと、少なくとも1つの薬学的に許容可能な希釈剤または担体とを含む組成物である。
本発明の一実施形態では、実施形態の第1または第2の態様のいずれかに従ったポリペプチドは、追加の治療的部分に共役している。
薬学的組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「有効量」または「治療上有効な」は、所与の条件および投与レジメンに対して治療効果を提供する量を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルに関連して所望の治療効果をもたらすように計算された、活性材料の所定の量である。さらに、宿主の活性、機能、および応答の臨床的に有意な欠損を低減させ、最も好ましくは防止するために十分な量を意味することが意図される。あるいは、治療有効量は、宿主の臨床的に有意な状態を改善させるために十分である。当業者によって理解されるように、化合物の量は、その特異的活性に応じて変化し得る。好適な投与量は、必要とされる希釈剤に関連して、所望される治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の化合物の製造のための方法および使用において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当該技術分野において周知であるように、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて、通常の技能を有する医療または獣医学従事者によって決定され得る。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位または複数のより小さい用量単位の形態における単回投与によって、または特定の間隔での細分用量の複数回投与によって行われ得る。あるいは、この用量は、長期間にわたる連続注入として提供されてもよい。
特に好ましい組成物は、全身投与用に配合される。
組成物は、好ましくは一定期間にわたって持続放出するように調合されてもよい。したがって、本組成物は、持続放出を促進するマトリックスの一部として提供されてもよい。好ましい持続放出マトリックスは、モンタニドまたはγ−ポリグルタミン酸(PGA)のナノ粒子を含み得る。
抗体ポリペプチドは、使用されるポリペプチドの有効性/毒性に応じて様々な濃度で配合され得る。例えば、製剤は、活性抗体ポリペプチドを、0.1μM〜1mM、より好ましくは1μM〜500μM、500μM〜1mM、300μM〜700μM、1μM〜100μM、100μM〜200μM、200μM〜300μM、300μM〜400μM、400μM〜500μM、500μM〜600μM、600μM〜700μM、800μM〜900μM、または900μM〜1mMの濃度で含み得る。典型的には、製剤は、300μM〜700μMの濃度で活性抗体ポリペプチドを含む。
典型的には、ヒト患者における抗体ポリペプチドの治療用量(治療部分の有無にかかわらず)は、投与あたり100μg〜700mgの範囲である(70kgの体重に基づく)。例えば、最大治療用量は、投与あたり0.1〜10mg/kgの範囲、例えば0.1〜5mg/kgまたは1〜5mg/kgまたは0.1〜2mg/kgであり得る。そのような用量は、腫瘍専門家/医師によって決定される異なる間隔で投与され得ること、例えば、用量は、毎日、週2回、隔週、または毎月投与され得ることが理解されるであろう。
本発明の薬学的組成物は、単独で、または癌の治療において使用される他の治療剤、例えば抗代謝剤、アルキル化剤、アントラサイクリンおよび他の細胞傷害性抗生物質、ビンカアルカロイド、エトポシド、白金化合物、タキサン、トポイソメラーゼI阻害剤、他の細胞***阻害薬、抗増殖免疫抑制剤、コルチコステロイド、性ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、ならびに他の治療抗体(腫瘍関連抗原に対する抗体または免疫チェックポイント調節剤など)と組み合わせて投与され得ることが、当業者には理解されよう。
例えば、本発明の薬学的組成物は、PD−1/PD−L1、CD137、CD40、GITR、LAG3、TIM3、CD27、およびKIRからなる群から選択される標的に結合する免疫療法剤と組み合わせて投与され得る。
したがって、本発明の二重特異性ポリペプチドを含む併用療法を、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する、癌の治療に有効なさらなる免疫療法剤と一緒に包含する。さらなる免疫療法剤の治療効果は、阻害性免疫チェックポイント分子の機能を減衰させること、および/または刺激性免疫チェックポイントまたは共刺激分子の機能を活性化することによって媒介され得ることが理解されよう。
一実施形態では、さらなる免疫療法剤は、
(a)PD−1および/またはPD−L1の機能を阻害する免疫療法剤、
(b)CD137の機能を活性化する免疫療法剤、ならびに
(c)CD40の機能を活性化する免疫療法剤からなる群から選択される。
(a)PD−1および/またはPD−L1の機能を阻害する免疫療法剤、
(b)CD137の機能を活性化する免疫療法剤、ならびに
(c)CD40の機能を活性化する免疫療法剤からなる群から選択される。
したがって、さらなる免疫療法剤は、PD1阻害剤、例えば抗PD1抗体、またはPD1機能を阻害することができるその抗原結合断片であり得る(例えば、Nivolumab、Pembrolizumab、Lambrolizumab、PDR−001、MEDI−0680、およびAMP−224)。あるいは、PD1阻害剤は、PD1機能を阻害することができる抗PD−L1抗体、またはその抗原結合断片を含み得るか、またはそれからなり得る(例えば、Durvalumab、Atezolizumab、Avelumab、およびMDX−1105)を含み得るか、またはそれからなり得る。
さらなる実施形態では、さらなる免疫療法薬は、アゴニスト抗CD137抗体またはその抗原結合部分などのCD137を活性化する。
さらなる実施形態では、さらなる免疫療法薬は、アゴニスト抗CD40抗体またはその抗原結合部分などのCD40を活性化する。
2つの活性剤(上で詳述されるような)の存在が、対象における腫瘍の治療において相乗的利点をもたらし得ることが、当業者には理解されよう。「相乗的」とは、2つの薬剤の組み合わせの治療効果が(例えば、腫瘍の増殖速度またはサイズを参照して決定される)、それら自身に投与される2つの薬剤の付加的な治療効果よりも大きいことを含む。かかる相乗作用は、固形腫瘍の関連細胞株モデルにおいて、活性剤を単独で、また組み合わせて試験することによって特定され得る。
本発明のポリペプチドまたは他の組成物および使用説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。本キットは、上述の追加の治療剤または予防剤などの1つ以上の追加の試薬をさらに含んでもよい。
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照して説明する。
配列の説明
配列番号1は、ヒトCTLA−4のアミノ酸配列(GenBank:AAD00698.1に対応)である。
配列番号1は、ヒトCTLA−4のアミノ酸配列(GenBank:AAD00698.1に対応)である。
配列番号2は、ヒトCD28のアミノ酸配列(GenBank:AAA51944.1に対応)である。
配列番号3は、N末端から23個のアミノ酸シグナル配列を除いた、ヒト野生型CD86の単量体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号4は、N末端シグナル配列を含む、ヒト野生型CD86の単量体細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列である(図4参照)。本明細書におけるアミノ酸の位置の全ての番号付けは、N末端から始まる配列番号4の位置に基づく。したがって、配列番号3のN末端のアラニンは24と番号付けされている。
配列番号5は、Peachら(Journal of Biological Chemistry 1995,vol270(36),21181−21187)に開示の、ヒトCD86の細胞外ドメインの突然変異体形態のアミノ酸配列である。野生型配列の79位のHは、配列番号5の配列の対応する位置でAに置換されている。この変化を、本明細書ではH79Aと称する。本明細書で言及される他のアミノ酸置換については、全体を通して同等の命名法が使用されている。位置の番号付けは、上に概説したように配列番号4に基づく。
配列番号6〜24は、本発明の特定のタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号25〜43はそれぞれ、配列番号6〜24の各々のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号44は、ヒトCD86の全長アミノ酸配列(GenBank:ABK41931.1に対応)である。
配列番号44は、ヒトCD86の全長アミノ酸配列(GenBank:ABK41931.1に対応)である。
配列番号45は、マウスCTLA−4のアミノ酸配列(UniProtKB/Swiss−Prot:P09793.1に対応)である。
配列番号46は、マウスCD28のアミノ酸配列(GenBank:AAA37395.1に対応)である。
配列番号47〜50は、本発明の二重特異性ポリペプチドに使用され得る様々なリンカーである。
配列番号51は、ヒトOX40のアミノ酸配列(GenBank:NP_003318.1に対応)である。
配列番号52〜88は、本明細書に開示の抗OX40抗体の例示的なCDR配列である。
配列番号89から124は、本明細書に開示の抗体の重鎖および軽鎖可変領域の例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列である。
配列番号125〜134は、本明細書に開示の二重特異性ポリペプチドの例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列である。
配列番号135は、例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号136は、例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号137は、ヒンジ領域(位置108)においてSerからProへの、およびCH3領域(位置315)においてHisからArgへの突然変異を有する、例示的な修飾ヒト重鎖IgG4定常領域配列である。突然変異は、血清半減期の低下、およびIgG4をより安定にしFabアーム交換を妨げて、IgG4のコアヒンジの安定化をもたらす。
配列番号138は、例示的な野生型ヒト重鎖IgG4定常領域配列である。それは、配列番号137の突然変異を欠く配列である。
配列番号139は、ヒンジ領域(位置108)においてSerからProへの単一突然変異を有する、例示的な修飾ヒト重鎖IgG4定常領域配列である。突然変異は、IgG4をより安定にしFabアーム交換を妨げて、IgG4のコアヒンジの安定化をもたらす。
配列番号140は、配列番号137のIgG4定常領域をコードする例示的なcDNA配列である(すなわちイントロンを欠く)。
配列番号141は、配列番号137のIgG4定常領域をコードする例示的なゲノムDNA配列である(すなわちイントロンを含む)。
配列番号142は、配列番号138のIgG4定常領域をコードする例示的なcDNA配列である(すなわちイントロンを欠く)。
配列番号143は、配列番号138のIgG4定常領域をコードする例示的なゲノムDNA配列である(すなわちイントロンを含む)。
配列番号144は、本発明の二重特異性ポリペプチドに使用され得るリンカーである。
配列番号145および146はそれぞれ、配列番号135のIgG1定常領域をコードする例示的なcDNAおよびゲノムDNA配列である。
配列番号147は、配列番号136の軽鎖カッパ領域をコードする例示的なDNA配列である。
配列番号148は、配列番号139のIgG4領域をコードする例示的なcDNA配列である(すなわちイントロンを欠く)。
配列番号149は、配列番号139のIgG4領域をコードする例示的なゲノムDNA配列である(すなわちイントロンを含む)。
他の配列
配列番号1(ヒトCTLA−4)
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIAKEKKPSYNRGLCENAPNRARM
配列番号2(ヒトCD28)
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号3
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
配列番号4
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP
配列番号5
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVASKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
配列番号44(ヒトCD86)
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF
配列番号45(マウスCTLA−4)
MACLGLRRYKAQLQLPSRTWPFVALLTLLFIPVFSEAIQVTQPSVVLASSHGVASFPCEYSPSHNTDEVRVTVLRQTNDQMTEVCATTFTEKNTVGFLDYPFCSGTFNESRVNLTIQGLRAVDTGLYLCKVELMYPPPYFVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
配列番号46(マウスCD28)
MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGVNSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQVTTMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP
配列番号51(ヒトOX40)
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号1(ヒトCTLA−4)
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIAKEKKPSYNRGLCENAPNRARM
配列番号2(ヒトCD28)
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号3
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
配列番号4
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP
配列番号5
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVASKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
配列番号44(ヒトCD86)
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF
配列番号45(マウスCTLA−4)
MACLGLRRYKAQLQLPSRTWPFVALLTLLFIPVFSEAIQVTQPSVVLASSHGVASFPCEYSPSHNTDEVRVTVLRQTNDQMTEVCATTFTEKNTVGFLDYPFCSGTFNESRVNLTIQGLRAVDTGLYLCKVELMYPPPYFVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
配列番号46(マウスCD28)
MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGVNSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQVTTMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP
配列番号51(ヒトOX40)
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これはさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての図および全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
実施例1−CTLA−4結合ドメイン
CTLA−4結合ドメインポリペプチドを、WO2014/207063(実施例を参照)に記載されるように選択および発現し、以下に記載されるELISAおよび表面プラズモン共鳴の少なくとも一方によりCTLA−4への結合についてアッセイした。
CTLA−4結合ドメインポリペプチドを、WO2014/207063(実施例を参照)に記載されるように選択および発現し、以下に記載されるELISAおよび表面プラズモン共鳴の少なくとも一方によりCTLA−4への結合についてアッセイした。
結合ELISA
96ウェル平底高結合プレート(Greiner、#655074)を、CTLA4−Fc(Fitzgerald、#30R−CD152)またはCD28−Fc(R&D systems、342−CD)のいずれかで、4℃で一晩インキュベートすることによりコーティングした。プレートを洗浄し(洗浄緩衝液:PBS+0.05%のTween 20(PBST)Medicago、#09−9410−100)、次いで、PBST+3%のBSA(Merck、#1.12018.0100)で遮断した。プレートを再び洗浄し、試料または対照(200〜0.001μg/mlまで1/5に連続希釈)をウェルに加えた。試料を室温で1時間インキュベートした後、洗浄した。検出抗体、ヤギ抗ヒトIgGFcγ−HRP(Jackson、#109−035−098)を加え、続いてSuperSignal Pico化学発光基質(Thermo Scientific、#37069)を使用してプレートを開発し、Envisionリーダー(Perkin Elmer)で検出した。CTLA4およびCD28の両方についてEC50値を計算した。結合比(EC50結合比=[CD28に対するEC50]÷[CTLA−4に対するEC50])を各ポリペプチドについて計算し、表1.1に示す。
96ウェル平底高結合プレート(Greiner、#655074)を、CTLA4−Fc(Fitzgerald、#30R−CD152)またはCD28−Fc(R&D systems、342−CD)のいずれかで、4℃で一晩インキュベートすることによりコーティングした。プレートを洗浄し(洗浄緩衝液:PBS+0.05%のTween 20(PBST)Medicago、#09−9410−100)、次いで、PBST+3%のBSA(Merck、#1.12018.0100)で遮断した。プレートを再び洗浄し、試料または対照(200〜0.001μg/mlまで1/5に連続希釈)をウェルに加えた。試料を室温で1時間インキュベートした後、洗浄した。検出抗体、ヤギ抗ヒトIgGFcγ−HRP(Jackson、#109−035−098)を加え、続いてSuperSignal Pico化学発光基質(Thermo Scientific、#37069)を使用してプレートを開発し、Envisionリーダー(Perkin Elmer)で検出した。CTLA4およびCD28の両方についてEC50値を計算した。結合比(EC50結合比=[CD28に対するEC50]÷[CTLA−4に対するEC50])を各ポリペプチドについて計算し、表1.1に示す。
表面プラズモン共鳴
CTLA4−Fc(Fitzgerald、#30R−CD152)またはCD28−Fc(R&D Systems、342−CD)を、従来のアミンカップリングを使用してBiacore(商標)センサーチップCM5に固定した。CD86突然変異体分子および対照(100〜1.5nMまで1/2に連続希釈)を、30μL/mLの流量でHBS−P(GE、#BR−1003−68)中での結合について分析した。会合を3分間、そして解離を10分間追跡した。5mMのNaOHを30秒間使用して再生を2回行った。BIAevaluation 4.1ソフトウェアを使用して動態パラメータと親和定数を計算した(表1.3)。
CTLA4−Fc(Fitzgerald、#30R−CD152)またはCD28−Fc(R&D Systems、342−CD)を、従来のアミンカップリングを使用してBiacore(商標)センサーチップCM5に固定した。CD86突然変異体分子および対照(100〜1.5nMまで1/2に連続希釈)を、30μL/mLの流量でHBS−P(GE、#BR−1003−68)中での結合について分析した。会合を3分間、そして解離を10分間追跡した。5mMのNaOHを30秒間使用して再生を2回行った。BIAevaluation 4.1ソフトウェアを使用して動態パラメータと親和定数を計算した(表1.3)。
阻害ELISA
96ウェル平底プレート高結合プレート(Greiner、#655074)を、4℃で一晩インキュベートすることにより、野生型CD86−Fc(R&D Systems、#7625−B2)でコーティングした。プレートを洗浄し(洗浄緩衝剤:PBS+0.05%のTween 20(PBST)Medicago、#09−9410−100)、次いで、PBST+3%のBSA(Merck、#1.12018.0100)で遮断した。試料(CD86突然変異体または野生型タンパク質、30000〜0.3ng/mlまで1/4に連続希釈)を、室温で1時間、ビオチン化CTLA4(Fitzgerald、#30R−CD152)でインキュベートし、次いで、混合物をELISAプレート中の遮断されたウェルに加えた。ストレプトアビジン−HRP(Pierce、#21126)で検出を行い、続いてSuperSignal Pico化学発光基質(Thermo Scientific、#37069)を使用してプレートを開発し、Envisionリーダー(Perkin Elmer)で検出した。結果を図2に示す。IC50値を計算し、以下の表に示す。試験した全ての分子が、野生型およびH79Aの両方よりも優れたIC50値を示し、最良の突然変異体CD86分子のICは、野生型と比較して100倍以上改善された。例示的な分子900、901、904、906、907、908、910、915、および938についての結果を表1.1に示す。Kd結合比=[CD28に対するKd]÷[CTLA−4に対するKd]。例示的な分子900、901、904、906、907、908、910、915、および938についての完全なアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号6〜14として提供する。
96ウェル平底プレート高結合プレート(Greiner、#655074)を、4℃で一晩インキュベートすることにより、野生型CD86−Fc(R&D Systems、#7625−B2)でコーティングした。プレートを洗浄し(洗浄緩衝剤:PBS+0.05%のTween 20(PBST)Medicago、#09−9410−100)、次いで、PBST+3%のBSA(Merck、#1.12018.0100)で遮断した。試料(CD86突然変異体または野生型タンパク質、30000〜0.3ng/mlまで1/4に連続希釈)を、室温で1時間、ビオチン化CTLA4(Fitzgerald、#30R−CD152)でインキュベートし、次いで、混合物をELISAプレート中の遮断されたウェルに加えた。ストレプトアビジン−HRP(Pierce、#21126)で検出を行い、続いてSuperSignal Pico化学発光基質(Thermo Scientific、#37069)を使用してプレートを開発し、Envisionリーダー(Perkin Elmer)で検出した。結果を図2に示す。IC50値を計算し、以下の表に示す。試験した全ての分子が、野生型およびH79Aの両方よりも優れたIC50値を示し、最良の突然変異体CD86分子のICは、野生型と比較して100倍以上改善された。例示的な分子900、901、904、906、907、908、910、915、および938についての結果を表1.1に示す。Kd結合比=[CD28に対するKd]÷[CTLA−4に対するKd]。例示的な分子900、901、904、906、907、908、910、915、および938についての完全なアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号6〜14として提供する。
例示的な分子1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、および1047についての結果を、表1.2および1.3、ならびに図2および3に示す。例示的な分子1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、および1047の完全なアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号15〜24として提供する。
実施例2−クローン1040由来の例示的なポリペプチドのマウスCTLA−4に対する交差反応性
阻害ELISA結合アッセイを使用して、例示的な突然変異体CD86分子1040のマウスおよびヒトCTLA−4に対する相対的親和性を調べた。これらの実験で使用した1040分子を、二重特異性分子の一部として抗CD40抗体に共役した。CD86分子のCTLA−4結合特性は、この共役の影響を受けない(データは示されず)。
阻害ELISA結合アッセイを使用して、例示的な突然変異体CD86分子1040のマウスおよびヒトCTLA−4に対する相対的親和性を調べた。これらの実験で使用した1040分子を、二重特異性分子の一部として抗CD40抗体に共役した。CD86分子のCTLA−4結合特性は、この共役の影響を受けない(データは示されず)。
簡潔に言えば、96ウェル平底プレート高結合プレート(Greiner、#655074)を、4℃で一晩インキュベートしたヒトCTLA−4(Fitzgerald)でコーティングした。プレートを洗浄し(洗浄緩衝液:PBS+0.05%のTween 20(PBST)Medicago、#09−9410−100)、次いでPBST+3%のBSA(Merck、#1.12018.0100)で遮断した。
試料(例示的なCD86突然変異体)を、室温で1時間、異なる濃度(30000〜0.3ng/mlまで1/4に連続希釈)の可溶性ビオチン化ヒトCTLA4(Fitzgerald、#30R−CD152)または可溶性マウスCTLA−4(R&D systems)でプレインキュベートした。
次いで、混合物をELISAプレート中の遮断されたウェルに加えた。ストレプトアビジン−HRP(Pierce、#21126)で検出を行い、続いてSuperSignal Pico化学発光基質(Thermo Scientific、#37069)を使用してプレートを開発し、Envisionリーダー(Perkin Elmer)で検出した。結果を図5に示す。マウスおよびヒトCTLA−4で観察された阻害曲線は、CTLA−4の2つの形態に対する例示的なCD86突然変異体(1040)の結合親和性が同様の大きさであることを実証している。実施例1で試験した他のクローンもマウスCTLA−4に結合することがわかった(データは示されず)。
実施例3−OX40抗体の特徴付け
例示的なOX40抗体の特徴を以下の表3.1に要約する。
例示的なOX40抗体の特徴を以下の表3.1に要約する。
これらの研究で比較する目的で、参照抗体として使用するために2つの抗OX40抗体を合成した。本明細書では、それらをそれぞれ「72」または「72/76」、および「74」または「74/78」と称する。
表面プラズモン共鳴による速度定数の測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトOX40(R&D systems、#3358_OX)を、Biacore(商標)センサーチップCM5に固定した。試験した抗体および対照(100〜2nMまで1/3または1/2に連続希釈)を、30μL/mLの流量でHBS−P(GE、#BR−1003−68)中での結合について分析した。会合を3分間、そして解離を20分間追跡した。50mMのNaOHを60秒間使用して再生を2回行った。ベースラインがドリフトする1:1ラングミュアモデルを使用して、動態パラメータおよび親和定数を計算した。試験した抗体は全体的にナノモル以下の範囲で、ナノモル範囲がオンとオフの速度で異なった(図6および表3.1)。ほとんどの抗体の親和性は5nM未満であった。BIAevaluation 4.1ソフトウェアを使用して、動態パラメータおよび親和定数を計算した。
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトOX40(R&D systems、#3358_OX)を、Biacore(商標)センサーチップCM5に固定した。試験した抗体および対照(100〜2nMまで1/3または1/2に連続希釈)を、30μL/mLの流量でHBS−P(GE、#BR−1003−68)中での結合について分析した。会合を3分間、そして解離を20分間追跡した。50mMのNaOHを60秒間使用して再生を2回行った。ベースラインがドリフトする1:1ラングミュアモデルを使用して、動態パラメータおよび親和定数を計算した。試験した抗体は全体的にナノモル以下の範囲で、ナノモル範囲がオンとオフの速度で異なった(図6および表3.1)。ほとんどの抗体の親和性は5nM未満であった。BIAevaluation 4.1ソフトウェアを使用して、動態パラメータおよび親和定数を計算した。
ELISAによるヒトおよびマウスOX40、ならびにCD137およびCD40への結合のELISAによる測定
ELISAプレートを、0.1または0.5μg/mlのヒトOX40(R&D Systems、3388−OX)、CD40(Ancell)、またはCD137(R&D Systems)でコーティングした。ELISAプレートをPBSTで洗浄し、次いでPBST+2%のBSAで室温で1時間遮断し、その後PBSTで再び洗浄した。抗体を希釈系列でELISAプレートに室温で1時間加えた後、PBSTで洗浄した。ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖HRPを使用して、室温で1時間インキュベートした結合を検出した。SuperSignal Pico Luminescentを基質として使用し、Fluostar Optimaを使用して発光を測定した。
ELISAプレートを、0.1または0.5μg/mlのヒトOX40(R&D Systems、3388−OX)、CD40(Ancell)、またはCD137(R&D Systems)でコーティングした。ELISAプレートをPBSTで洗浄し、次いでPBST+2%のBSAで室温で1時間遮断し、その後PBSTで再び洗浄した。抗体を希釈系列でELISAプレートに室温で1時間加えた後、PBSTで洗浄した。ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖HRPを使用して、室温で1時間インキュベートした結合を検出した。SuperSignal Pico Luminescentを基質として使用し、Fluostar Optimaを使用して発光を測定した。
試験した全てのOX40抗体がヒトOX40に結合し、1nM未満のEC50値を示した。抗体は、マウスOX40または試験した他のTNFRスーパーファミリーメンバーには結合しなかった(データは示されず)。
CHO細胞上で過剰発現したヒトOX40への結合の測定
ヒトOX40の細胞外部分を、hCD40の膜貫通および細胞内部分に融合させ、pcDNA3.0にクローニングした。その後、ベクターを、CHO細胞に安定にトランスフェクトした。市販のOX40抗体(huOX40、BD Biosciences)で4℃で30分間インキュベートすることにより、OX40の発現を確認し、次いで4℃で30分間、a−huIgG−PE(Jackson Immunoresearch)で検出した。アッセイのために、トランスフェクトされた細胞を、4℃で30分間、試験抗体および対照でインキュベートし、その後4℃で30分間、a−huIgG−PE(Jackson Immunoresearch)で検出した。FACS Verse(BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
ヒトOX40の細胞外部分を、hCD40の膜貫通および細胞内部分に融合させ、pcDNA3.0にクローニングした。その後、ベクターを、CHO細胞に安定にトランスフェクトした。市販のOX40抗体(huOX40、BD Biosciences)で4℃で30分間インキュベートすることにより、OX40の発現を確認し、次いで4℃で30分間、a−huIgG−PE(Jackson Immunoresearch)で検出した。アッセイのために、トランスフェクトされた細胞を、4℃で30分間、試験抗体および対照でインキュベートし、その後4℃で30分間、a−huIgG−PE(Jackson Immunoresearch)で検出した。FACS Verse(BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
用量依存的にCHO細胞上に過剰発現したhOX40に結合した全てのクローン(図7)。
実施例4−OX40抗体の配列分析
重鎖および軽鎖可変領域の両方のCDR配列を各抗体について分析した。表4.1は、VH CDR3配列に対して実施された分析を例示する。表4.1の位置は、IMGT番号付けシステムに従って定義されている。以下のパターンが特定された。
VH領域は全て、
(a)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「G、F、T、F、G/Y/S、G/Y/S、Y/S、Y/S/A」を含む重鎖CDR1配列、
(b)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「I、G/Y/S/T、G/S/Y、S/Y、G/S/Y、G/S/Y、G/S/Y、T」を含む重鎖CDR2配列、および
(c)9〜17アミノ酸長であり、コンセンサス配列「A、R、G/Y/S/H、G/Y/F/V/D、G/Y/P/F、−/H/S、−/N/D/H、−/Y/G、−/Y、−/Y、−/W/A/V、−/A/Y、−/D/A/Y/G/H/N、Y/S/W/A/T、L/M/I/F、D、Y」を含む重鎖CDR3配列、を含む。
重鎖および軽鎖可変領域の両方のCDR配列を各抗体について分析した。表4.1は、VH CDR3配列に対して実施された分析を例示する。表4.1の位置は、IMGT番号付けシステムに従って定義されている。以下のパターンが特定された。
VH領域は全て、
(a)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「G、F、T、F、G/Y/S、G/Y/S、Y/S、Y/S/A」を含む重鎖CDR1配列、
(b)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「I、G/Y/S/T、G/S/Y、S/Y、G/S/Y、G/S/Y、G/S/Y、T」を含む重鎖CDR2配列、および
(c)9〜17アミノ酸長であり、コンセンサス配列「A、R、G/Y/S/H、G/Y/F/V/D、G/Y/P/F、−/H/S、−/N/D/H、−/Y/G、−/Y、−/Y、−/W/A/V、−/A/Y、−/D/A/Y/G/H/N、Y/S/W/A/T、L/M/I/F、D、Y」を含む重鎖CDR3配列、を含む。
VL領域は全て、
(a)配列「Q、S、I、S、S、Y」からなる軽鎖CDR1配列、
(b)配列「A、A、S」からなる軽鎖CDR2配列、
(c)8〜10アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Q、Q、S/Y/G、−/Y/H/G、−/S/Y/G/D/W、S/Y/G/D、S/Y/G/T、P/L、Y/S/H/L/F、T」を含む軽鎖CDR3配列、を含む。
(a)配列「Q、S、I、S、S、Y」からなる軽鎖CDR1配列、
(b)配列「A、A、S」からなる軽鎖CDR2配列、
(c)8〜10アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Q、Q、S/Y/G、−/Y/H/G、−/S/Y/G/D/W、S/Y/G/D、S/Y/G/T、P/L、Y/S/H/L/F、T」を含む軽鎖CDR3配列、を含む。
重鎖CDR3に対するコンセンサス配列内で、2つのサブファミリーが同定された。第1のサブファミリーの各抗体は、コンセンサス配列「A、R、Y/H、D、Y、A/Y/G、S/W/A、M/L、D、Y」を含む10アミノ酸長のVH CDR3配列を含む。このファミリーの抗体はファミリーZと称され、表4.1でそのように同定されている。第2のサブファミリーの各抗体は、コンセンサス配列「A、R、G/Y、V/F/Y、P、H、G/Y/H、Y、F/I、D、Y」を含む11アミノ酸長のVH CDR3配列を含む。このファミリーの抗体はファミリーPと称され、表4.1でそのように同定される。ファミリーZまたはPの抗体が好ましい。ファミリーP中にVH配列を有する抗体には、典型的には、CDR3配列「Q、Q、S、Y、S、T、P、Y、T」、CDR1配列「Q、S、I、S、S、Y」、およびCDR2配列「A、A、S」とともにVL配列も含まれる。したがって、これらの3つのCDR配列を含むVL領域を有する抗体が好ましい。
実施例5−OX40抗体のドメインマッピング
OX40の細胞外部分は4つのドメインからなり、各ドメインは2つのモジュールに細分され得る。標準的な実験室技術を使用して、OX40ヒト/マウスキメラの遺伝子を合成した。ヒトOX40のドメインまたはモジュールを対応するマウスOX40と交換することにより、異なるキメラを設計した。キメラは、ヒトおよびマウスの配列の評価ならびにヒトOX40の3D調査に基づいて設計された。合成された遺伝子には、プロジェクト固有のID番号が割り当てられた(表5.1を参照)。構築物をpcDNA3.1ベクター(Invitrogen)にクローニングした。
OX40の細胞外部分は4つのドメインからなり、各ドメインは2つのモジュールに細分され得る。標準的な実験室技術を使用して、OX40ヒト/マウスキメラの遺伝子を合成した。ヒトOX40のドメインまたはモジュールを対応するマウスOX40と交換することにより、異なるキメラを設計した。キメラは、ヒトおよびマウスの配列の評価ならびにヒトOX40の3D調査に基づいて設計された。合成された遺伝子には、プロジェクト固有のID番号が割り当てられた(表5.1を参照)。構築物をpcDNA3.1ベクター(Invitrogen)にクローニングした。
マウス/ヒトキメラをFreeStyle293−F細胞(Invitrogen)に一時的にトランスフェクトし、FreeStyle293発現培地(Invitrogen)中に37℃、8%のCO2、135rpmで48時間インキュベートした。トランスフェクトした細胞を、4℃で30分間、ヒトOX40抗体、ヒトOX40L(hOX40L、RnD Systems)、マウスOX40L(mOX40L、RnD Systems)、および対照でインキュベートし、4℃で30分間、a−huIgG−PE(Jackson Immunoresearch)で検出した。細胞をFACS Verse(BD Biosciences)で分析した。異なるキメラ構築物への結合を、アイソタイプ対照の結合と比較した相対(平均蛍光強度)MFIとして計算した。結果を表5.2に示す。
試験したヒトOX40抗体はどれもマウスOX40に結合しない。したがって、所与の抗体が特定のキメラに結合しない場合、これは、抗体がそのキメラのマウスドメインで置き換えられたドメインのうちの1つに特異的であることを示す。
少なくとも4つの別々の結合パターンが特定された。
パターンA:
抗体1170/1171、1524/1525、および1526/1527は、同様の結合パターンを示し、同じドメインの残基が結合に依存している。結合に重要なアミノ酸残基は、おそらくドメイン2のモジュールBおよびドメイン2のモジュールAにある。CDRH3ファミリー「Z」を有する抗体の大部分は、パターンA(1166/1167は例外)に従って結合し、これは、この種のCDRH3を有する抗体がこのエピトープに結合する傾向があることを示す。
抗体1170/1171、1524/1525、および1526/1527は、同様の結合パターンを示し、同じドメインの残基が結合に依存している。結合に重要なアミノ酸残基は、おそらくドメイン2のモジュールBおよびドメイン2のモジュールAにある。CDRH3ファミリー「Z」を有する抗体の大部分は、パターンA(1166/1167は例外)に従って結合し、これは、この種のCDRH3を有する抗体がこのエピトープに結合する傾向があることを示す。
パターンB:
抗体1168/1135、1542/1135、1520/1135、1490/1135、1482/1483、および1164/1135は同様の結合パターンを示し、主にドメイン3にある残基が結合に依存している。CDRH3ファミリー「P」を有する全ての抗体がこのパターンで結合し、これは、CDRH3配列の類似性が共通の結合エピトープを明らかにすることを実証している。
抗体1168/1135、1542/1135、1520/1135、1490/1135、1482/1483、および1164/1135は同様の結合パターンを示し、主にドメイン3にある残基が結合に依存している。CDRH3ファミリー「P」を有する全ての抗体がこのパターンで結合し、これは、CDRH3配列の類似性が共通の結合エピトープを明らかにすることを実証している。
パターンC:
抗体1166/1167は特有の結合パターンを有し、ドメイン2のモジュールAおよびモジュールBにある残基が結合に依存している可能性が高い。しかしながら、結合を無効にするには、両方のモジュールを同時に交換する必要があり、構造的に複雑なエピトープが示唆される。
抗体1166/1167は特有の結合パターンを有し、ドメイン2のモジュールAおよびモジュールBにある残基が結合に依存している可能性が高い。しかしながら、結合を無効にするには、両方のモジュールを同時に交換する必要があり、構造的に複雑なエピトープが示唆される。
パターンD:
抗体1514/1515は特有の結合プロファイルを示し、結合のために主にドメイン2のモジュールBにあるアミノ酸に依存している可能性が高い。
抗体1514/1515は特有の結合プロファイルを示し、結合のために主にドメイン2のモジュールBにあるアミノ酸に依存している可能性が高い。
参照抗体72はパターンBに従って結合する。ヒトOX40リガンドの結合パターンはパターンCと同様である。
実施例6−Macaca mulattaとの交差反応性
Macaca mulatta由来のOX40の細胞外部分を、hCD40の膜貫通細胞内部分に融合させ、pcDNA3.0にクローニングした。その後、ベクターをHEK細胞(macOX40−HEK)に安定的にトランスフェクトした。
Macaca mulatta由来のOX40の細胞外部分を、hCD40の膜貫通細胞内部分に融合させ、pcDNA3.0にクローニングした。その後、ベクターをHEK細胞(macOX40−HEK)に安定的にトランスフェクトした。
市販のOX40抗体(huOX40、BD Biosciences)で4℃で30分間インキュベートすることにより、OX40の発現を確認し、次いで4℃で30分間、a−huIgG−PE(Jackson Immunoresearch)で検出した。アッセイのために、トランスフェクトされた細胞を、4℃で30分間、試験抗体および対照でインキュベートし、その後4℃で30分間、a−huIgG−PE(Jackson Immunoresearch)で検出した。FACS Verse(BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
以下の表6.1に示されるように、試験した抗体は、Macaca mulattaのOX40に結合し、EC50値はヒトOX40で得られた値に匹敵し、Macaca mulattaが毒物学研究において使用するのに好適であることが示唆される。
Macaca mulattaは、遺伝的にMacaca fascicularis(カニクイザル)と非常によく似ており、カニクイザルも毒物学研究に好適な種である可能性が非常に高い。
実施例7−ヒトT細胞アッセイにおけるアゴニスト活性
血液バンク(Lund University Hospital)から入手した白血球フィルターのPBMCのMiltenyiからの負のT細胞選択キットにより、ヒトT細胞を入手した。OX40抗体を96ウェル培養プレート(Corning CostarのU字型プレート(#3799)の表面にコーティングし、3μg/mlの固定化された抗CD3抗体(UCHT1)と5μg/mlの可溶性の抗CD28抗体(CD28.2)との組み合わせで培養した。抗CD3を4℃で一晩プレコートした。翌日、PBSで1回洗浄した後、OX40抗体を37℃で1〜2時間コーティングした。37℃、5%のCO2の湿気室で72時間インキュベートした後、上清中のIL−2レベルを測定した。
血液バンク(Lund University Hospital)から入手した白血球フィルターのPBMCのMiltenyiからの負のT細胞選択キットにより、ヒトT細胞を入手した。OX40抗体を96ウェル培養プレート(Corning CostarのU字型プレート(#3799)の表面にコーティングし、3μg/mlの固定化された抗CD3抗体(UCHT1)と5μg/mlの可溶性の抗CD28抗体(CD28.2)との組み合わせで培養した。抗CD3を4℃で一晩プレコートした。翌日、PBSで1回洗浄した後、OX40抗体を37℃で1〜2時間コーティングした。37℃、5%のCO2の湿気室で72時間インキュベートした後、上清中のIL−2レベルを測定した。
ヒトT細胞を刺激してIL−2を産生する抗体の能力を参照抗体74と比較し、相対活性を図8に示す。抗体の大部分は、参照抗体に匹敵するT細胞活性化レベルを提供した。いくつかの抗体がより高いレベルのT細胞活性化を提供した。
二重特異性分子
以下の実施例では、試験した二重特異性分子は、番号、例えば1164/1141によって称される。これは、分子が表BおよびDに示されるそれぞれのVHおよびVL領域のアミノ酸配列を含むことを意味する。例えば、1164/1141は、表Bに示される重鎖VH領域配列1164(配列番号99)と、表Dに示される二重特異性鎖番号1141(配列番号129)とを含む。所与の分子の指定されたVH領域配列は、典型的には、配列番号135のIgG1重鎖定常領域配列に(単一の連続したポリペプチド鎖の一部として)連結されて提供される。この配列は、典型的には、表Bの指定されたVH領域配列のC末端に存在する。
以下の実施例では、試験した二重特異性分子は、番号、例えば1164/1141によって称される。これは、分子が表BおよびDに示されるそれぞれのVHおよびVL領域のアミノ酸配列を含むことを意味する。例えば、1164/1141は、表Bに示される重鎖VH領域配列1164(配列番号99)と、表Dに示される二重特異性鎖番号1141(配列番号129)とを含む。所与の分子の指定されたVH領域配列は、典型的には、配列番号135のIgG1重鎖定常領域配列に(単一の連続したポリペプチド鎖の一部として)連結されて提供される。この配列は、典型的には、表Bの指定されたVH領域配列のC末端に存在する。
実施例8−単一標的に結合するための例示的な二重特異性分子の親和性
表面プラズモン共鳴による速度定数の測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトOX40(R&D systems、#3358_OX)を、Biacore(商標)センサーチップCM5に固定した。試験した抗体および対照(100〜2nMまで1/3または1/2に連続希釈)を、30μL/mLの流量でHBS−P(GE、#BR−1003−68)中での結合について分析した。会合を3分間、そして解離を20分間追跡した。50mMのNaOHを30秒間使用して再生を2回行った。ベースラインがドリフトする1:1ラングミュアモデルを使用して、動態パラメータおよび親和定数を計算した。試験した分子は、対応する単量体抗体よりも一般的にOX40に対する親和性が低いオンおよびオフ速度を変化させたが、依然としてナノモル範囲であった(表8.1)。
表面プラズモン共鳴による速度定数の測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトOX40(R&D systems、#3358_OX)を、Biacore(商標)センサーチップCM5に固定した。試験した抗体および対照(100〜2nMまで1/3または1/2に連続希釈)を、30μL/mLの流量でHBS−P(GE、#BR−1003−68)中での結合について分析した。会合を3分間、そして解離を20分間追跡した。50mMのNaOHを30秒間使用して再生を2回行った。ベースラインがドリフトする1:1ラングミュアモデルを使用して、動態パラメータおよび親和定数を計算した。試験した分子は、対応する単量体抗体よりも一般的にOX40に対する親和性が低いオンおよびオフ速度を変化させたが、依然としてナノモル範囲であった(表8.1)。
ELISAによる測定
それぞれ0.4または0.5μg/mlのヒトCTLA−4(BMS、Orencia)またはヒトOX40(R&D Systems、3388−OX)で、ELISAプレートをコーティングした。ELISAプレートをPBSTで洗浄し、次いでPBST+2%のBSAで室温で1時間遮断し、その後PBSTで再び洗浄した。二重特異性分子を希釈系列でプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。ELISAプレートを洗浄し、ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖HRPを使用して室温で1時間結合を検出した。SuperSignal Pico Luminescentを基質として使用し、Fluostar Optimaを使用して発光を測定した。
それぞれ0.4または0.5μg/mlのヒトCTLA−4(BMS、Orencia)またはヒトOX40(R&D Systems、3388−OX)で、ELISAプレートをコーティングした。ELISAプレートをPBSTで洗浄し、次いでPBST+2%のBSAで室温で1時間遮断し、その後PBSTで再び洗浄した。二重特異性分子を希釈系列でプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。ELISAプレートを洗浄し、ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖HRPを使用して室温で1時間結合を検出した。SuperSignal Pico Luminescentを基質として使用し、Fluostar Optimaを使用して発光を測定した。
両方の標的に結合した全ての試験した二重特異性分子およびEC50値は、単一特異性抗体としてのそれらの親和性に基づいて予想される範囲内である(図9)。
実施例9−例示的な二重特異性分子の両方の標的への二重結合
表面プラズモン共鳴による測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトOX40(R&D systems、#3358_OX)を、Biacore(商標)センサーチップCM5に固定した。試験した二重特異性分子(0.5μMまたは0.25μM)および対照を、30μl/mlの流量でチップ上で泳動させた。会合を3分間、そして解離を3分間追跡した。次いで、CTLA4−Fc(BMS、Orencia)を注射し、その後3分間会合させ、3分間解離させた。対照として、CTLA4の代わりに空のPBSを注射した。
表面プラズモン共鳴による測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトOX40(R&D systems、#3358_OX)を、Biacore(商標)センサーチップCM5に固定した。試験した二重特異性分子(0.5μMまたは0.25μM)および対照を、30μl/mlの流量でチップ上で泳動させた。会合を3分間、そして解離を3分間追跡した。次いで、CTLA4−Fc(BMS、Orencia)を注射し、その後3分間会合させ、3分間解離させた。対照として、CTLA4の代わりに空のPBSを注射した。
図10に示されるように、試験した全ての二重特異性分子が両方の標的に同時に結合した。
ELISAによる測定
OX40−Fc(R&D systems、#3358_OX)(0.4μg/ml)で4℃で一晩、ELISAプレートをコーティングした。ELISAプレートをPBSTで洗浄し、次いでPBST+2%のBSAで室温で1時間遮断し、その後PBSTで再び洗浄した。二重特異性分子をプレートに希釈して加え、室温で1時間インキュベートした。ELISAプレートを洗浄し、ビオチン化CTLA−4(1μg/ml)を加え、室温でプレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、結合の検出のためにHRP標識ストレプトアビジンを使用した。SuperSignal Pico Luminescentを基質として使用し、Fluostar Optimaを使用して発光を測定した。
OX40−Fc(R&D systems、#3358_OX)(0.4μg/ml)で4℃で一晩、ELISAプレートをコーティングした。ELISAプレートをPBSTで洗浄し、次いでPBST+2%のBSAで室温で1時間遮断し、その後PBSTで再び洗浄した。二重特異性分子をプレートに希釈して加え、室温で1時間インキュベートした。ELISAプレートを洗浄し、ビオチン化CTLA−4(1μg/ml)を加え、室温でプレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、結合の検出のためにHRP標識ストレプトアビジンを使用した。SuperSignal Pico Luminescentを基質として使用し、Fluostar Optimaを使用して発光を測定した。
試験した全ての二重特異性分子について、両方の標的への結合が確認された。図11に示されるように、試験した二重特異性分子は、0.015μg/mlに相当する濃度0.1nMで検出することができる。アッセイにおける相対値は、表面プラズモン共鳴によって測定される親和性によく対応している。
実施例10−ヒトCD4 T細胞アッセイにおける例示的な二重特異性分子のアゴニスト活性
ヒトCD4 T細胞は、血液バンク(Lund University Hospital)から入手した白血球フィルターからのPBMCの負のCD4 T細胞選択(Miltenyi、ヒトCD4+T細胞分離キット130−096−533)により、ヒトCD4 T細胞を単離した。CTLA−4(Orencia、2.5μg/ml)および抗CD3(UCHT−1、1ug/ml)を、4℃で一晩、96ウェル培養プレート(非組織培養処理、U字型の96ウェルプレート(Nunc、VWR#738−0147)の表面にコーティングした。CTLA−4およびCD3の両方でコーティングすることにより、このアッセイは、CTLA−4の過剰発現を伴う腫瘍微小環境の実験モデルを提供する。CTLA−4は、対照として一部のウェルから除外した。
ヒトCD4 T細胞は、血液バンク(Lund University Hospital)から入手した白血球フィルターからのPBMCの負のCD4 T細胞選択(Miltenyi、ヒトCD4+T細胞分離キット130−096−533)により、ヒトCD4 T細胞を単離した。CTLA−4(Orencia、2.5μg/ml)および抗CD3(UCHT−1、1ug/ml)を、4℃で一晩、96ウェル培養プレート(非組織培養処理、U字型の96ウェルプレート(Nunc、VWR#738−0147)の表面にコーティングした。CTLA−4およびCD3の両方でコーティングすることにより、このアッセイは、CTLA−4の過剰発現を伴う腫瘍微小環境の実験モデルを提供する。CTLA−4は、対照として一部のウェルから除外した。
試験する二重特異性分子をウェルに連続希釈で溶解して加え、同じモル濃度で対照と比較した。試験した各二重特異性分子に対して2つの異なる対照を使用した。第1の対照は、1756/1757と称される二重特異性分子である(1040 CTLA4結合領域に融合したアイソタイプ対照抗体=CTLA4に結合するが、OX40には結合しない)。第2の対照は、二重特異性1756/1757対照と単一特異性OX40抗体との混合物であり、これは、試験した二重特異性分子に対応する。37℃、5%のCO2の湿気室で72時間インキュベートした後、上清中のIL−2レベルを測定した。
図12に示されるように、二重特異性分子には用量依存的な効果があり、CTLA−4でコーティングしたプレート中に培養すると、ヒトT細胞活性化の増加(IL−2産生の増加によって測定される)を誘導する。対照は行わない。図13は、CTLA−4の存在下または非存在下で、二重特異性抗体および対照(1.5nM)に対して固定濃度で実施した場合の同じアッセイの結果を示す。T細胞活性化の増加はCTLA−4の非存在下では見られない。対応する単一特異性分子の組み合わせと比較した、各二重特異性分子により誘導されるIL−2レベルの倍率変化を、表10.1に示す。各二重特異性分子または対照について産生されたIL−2の平均値(pg/ml)を表10.2に示す。
このアッセイはCTLA−4の過剰発現を伴う腫瘍微小環境の実験モデルを表しているため、結果は、試験した二重特異性分子がそのような微小環境における単一特異性抗体よりも大きな効果を期待できることを示唆している。
1.5nMでの単一特異性分子の対応する組み合わせと比較した、二重特異性分子によって誘導されるIL−2レベルの倍率変化
実施例11−例示的な二重特異性分子の安定性
抗体の融点を示差走査蛍光分析法(DSF)で分析した。PBS中の抗体試料を、1000倍に希釈されたSYPRO Orangeと混合した。25〜95℃の熱走査を実時間PCRマシンで行い、各程度で測定値を得た。比較のために参照抗体250/251を使用し、基準に対する融解温度Tm(ΔTm)の差を決定した。基準と比較して1.1℃を超えるTmの差は、統計的に有意と見なされる。表11.1に示されるように、試験した全ての二重特異性分子は、65℃以上の値で良好な熱安定性を示した。
抗体の融点を示差走査蛍光分析法(DSF)で分析した。PBS中の抗体試料を、1000倍に希釈されたSYPRO Orangeと混合した。25〜95℃の熱走査を実時間PCRマシンで行い、各程度で測定値を得た。比較のために参照抗体250/251を使用し、基準に対する融解温度Tm(ΔTm)の差を決定した。基準と比較して1.1℃を超えるTmの差は、統計的に有意と見なされる。表11.1に示されるように、試験した全ての二重特異性分子は、65℃以上の値で良好な熱安定性を示した。
実施例12−CTLA4およびOX40を標的とする例示的な二重特異性抗体によるADCCの誘導における相乗作用(単独または組み合わせでの単一特異性抗体の効果と比較)
材料および方法
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)の評価
FcγRIIIa受容体(V158変異型)を安定的に発現するように改変されたジャーカット細胞と、ホタルルシフェラーゼの発現を促進するNFAT応答エレメント(Promega Corporation)とを、ADCCの評価におけるエフェクター細胞として使用した。96ウェルの不透明な発光プレートの複製ウェル中に抗体を滴定し、OX40およびCTLA4の両方を発現するエフェクター細胞および標的細胞を5:1の比率で加えた。37℃、95%のO2加湿インキュベーターで6時間インキュベートした後、ルシフェラーゼアッセイ基質(Promega Corporation)を培地対照ウェル(ブランクサブトラクション用)を含む全てのウェルに加え、FLUOstar Optimaマイクロプレートリーダー(BMG LabTech)上で発光を検出した。倍率誘導ADCCを次のように計算した:(標的溶解−ブランク)/(自然溶解−ブランク)。Prism 6.0(Graphpad、La Jolla、CA、USA)を使用して、対数(アゴニスト)対応答(3つのパラメータ)曲線近似に基づいて最高値を計算した。
材料および方法
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)の評価
FcγRIIIa受容体(V158変異型)を安定的に発現するように改変されたジャーカット細胞と、ホタルルシフェラーゼの発現を促進するNFAT応答エレメント(Promega Corporation)とを、ADCCの評価におけるエフェクター細胞として使用した。96ウェルの不透明な発光プレートの複製ウェル中に抗体を滴定し、OX40およびCTLA4の両方を発現するエフェクター細胞および標的細胞を5:1の比率で加えた。37℃、95%のO2加湿インキュベーターで6時間インキュベートした後、ルシフェラーゼアッセイ基質(Promega Corporation)を培地対照ウェル(ブランクサブトラクション用)を含む全てのウェルに加え、FLUOstar Optimaマイクロプレートリーダー(BMG LabTech)上で発光を検出した。倍率誘導ADCCを次のように計算した:(標的溶解−ブランク)/(自然溶解−ブランク)。Prism 6.0(Graphpad、La Jolla、CA、USA)を使用して、対数(アゴニスト)対応答(3つのパラメータ)曲線近似に基づいて最高値を計算した。
抗体
・「1166/1167」=単一特異性OX40抗体
・「CTLA−4結合部分を有する対照IgG」=IgGタンパク質に融合した単一特異性CTLA4結合ドメイン
・「1166/1261」=OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体(先に記載されている単一特異的結合剤と同一のOX40およびCTLA−4結合部分を含む)。
・「対照IgG」=負のアイソタイプ対照
・「1166/1167」=単一特異性OX40抗体
・「CTLA−4結合部分を有する対照IgG」=IgGタンパク質に融合した単一特異性CTLA4結合ドメイン
・「1166/1261」=OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体(先に記載されている単一特異的結合剤と同一のOX40およびCTLA−4結合部分を含む)。
・「対照IgG」=負のアイソタイプ対照
結果
例示的な二重特異性抗体1166/1261は、ADCCの優れた誘導を呈する
図15に示されるように、ADCCの検出可能なレベルは、試験した全ての成分によって誘導された。負のアイソタイプ対照は、いかなるADCCも誘導しなかった(データは示されず)。最も注目すべきことに、二重特異性1166/1261抗体は、対照と比較して約123倍のADCCを誘導した。単一特異性OX40抗体(1166/1167)は約29倍、単一特異性CTLA−4結合ドメイン(62/376)は約10倍のADCCを誘導したが、2つの単一特異性成分の混合物(1166/1167+62/376))は約31倍のADCCを誘導した。
例示的な二重特異性抗体1166/1261は、ADCCの優れた誘導を呈する
図15に示されるように、ADCCの検出可能なレベルは、試験した全ての成分によって誘導された。負のアイソタイプ対照は、いかなるADCCも誘導しなかった(データは示されず)。最も注目すべきことに、二重特異性1166/1261抗体は、対照と比較して約123倍のADCCを誘導した。単一特異性OX40抗体(1166/1167)は約29倍、単一特異性CTLA−4結合ドメイン(62/376)は約10倍のADCCを誘導したが、2つの単一特異性成分の混合物(1166/1167+62/376))は約31倍のADCCを誘導した。
したがって、OX40およびCTLA−4に結合する二重特異性分子によって得られる予想外の顕著な相乗効果がある。
実施例13−OX40およびCTLA4を標的とする二重特異性抗体−OX40およびCTLA4の両方を発現する細胞への特異的結合
背景技術
この研究の目的は、フローサイトメトリーを使用して、OX40およびCTLA4の両方を発現する細胞に対する1166/1261および対応する単一特異的結合要素の結合効率およびEC50を決定することであった。二重特異性抗体は、OX40およびCTLA4の両方に同時に結合するように設計されている。この目的のために、標的を安定的に発現するトランスフェクトCHO細胞を使用した。CHO P4細胞は、OX40およびCTLA4の両方の発現レベルが高い。
背景技術
この研究の目的は、フローサイトメトリーを使用して、OX40およびCTLA4の両方を発現する細胞に対する1166/1261および対応する単一特異的結合要素の結合効率およびEC50を決定することであった。二重特異性抗体は、OX40およびCTLA4の両方に同時に結合するように設計されている。この目的のために、標的を安定的に発現するトランスフェクトCHO細胞を使用した。CHO P4細胞は、OX40およびCTLA4の両方の発現レベルが高い。
方法と結果
OX40およびCTLA4の両方を発現する二重トランスフェクトCHO細胞は、本来は、FACS(Beckton Dickinson)によって、両方の標的を高レベルで発現する細胞プール(CHO P4と表記)に分類されていた。ジェネティシンおよびゼオシンの選択圧下で細胞を培養することにより、標的発現は安定的に保たれた。非トランスフェクトCHO野生型細胞を対照として使用した。
OX40およびCTLA4の両方を発現する二重トランスフェクトCHO細胞は、本来は、FACS(Beckton Dickinson)によって、両方の標的を高レベルで発現する細胞プール(CHO P4と表記)に分類されていた。ジェネティシンおよびゼオシンの選択圧下で細胞を培養することにより、標的発現は安定的に保たれた。非トランスフェクトCHO野生型細胞を対照として使用した。
低減濃度の1166/1261(OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体)、または2つの単一特異的結合剤1166/1167(OX40特異的モノクローナル抗体)、およびCTLA−4結合部分を有する対照IgG(単一特異性CTLA4結合IgG融合タンパク質)(200nM〜0,0034nM)、続いてPE共役抗ヒトIgGにより、細胞を染色した。FACSverse機器を使用して蛍光を検出し、FlowJoソフトウェアを使用して取得物を分析した。各染色について蛍光強度の中央値(MFI)を決定した。
CHO P4についての結合効率曲線を図16に提示する(3つのうち1つの代表的な実験)。1166/1261は、1166/1167またはCTLA−4結合要素を含む対照IgGよりもOX40およびCTLA4の発現が高い細胞に結合する。これはおそらく、2つの標的を同時に結合することができる1166/1261の相加効果である。
実施例14−OX40およびCTLA4を標的とする二重特異性抗体−フローサイトメトリーによって測定されたOX40およびCTLA4を発現する細胞の二重結合
目的
フローサイトメトリーを使用して凝集細胞の数を測定することにより、細胞上で過剰発現したOX40およびCTLA4の両方に対する1166/1261までの同時結合を測定する。
目的
フローサイトメトリーを使用して凝集細胞の数を測定することにより、細胞上で過剰発現したOX40およびCTLA4の両方に対する1166/1261までの同時結合を測定する。
材料および方法
CHO−OX40細胞およびHEK−CTLA4細胞を、それぞれ細胞内で蛍光色素PKH−67(緑色蛍光色素)およびPKH−26(赤色蛍光色素)(Sigma−Aldrich)で染色した。均一に染色された細胞集団を検証した後、細胞を混合し、1166/1261(OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体)または2つのモノクローナル抗体1166/1167(単一特異性抗OX40抗体)とCTLA4結合ドメインを含む対照IgGとの組み合わせのいずれかでインキュベートした。染色後、細胞を直ちに固定し、凝集した二重陽性細胞の数をFACS−verse(BD biosciences)を使用して定量化した。グラフパッドプリズムv6を使用してデータ分析および非線形回帰を行った。
CHO−OX40細胞およびHEK−CTLA4細胞を、それぞれ細胞内で蛍光色素PKH−67(緑色蛍光色素)およびPKH−26(赤色蛍光色素)(Sigma−Aldrich)で染色した。均一に染色された細胞集団を検証した後、細胞を混合し、1166/1261(OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体)または2つのモノクローナル抗体1166/1167(単一特異性抗OX40抗体)とCTLA4結合ドメインを含む対照IgGとの組み合わせのいずれかでインキュベートした。染色後、細胞を直ちに固定し、凝集した二重陽性細胞の数をFACS−verse(BD biosciences)を使用して定量化した。グラフパッドプリズムv6を使用してデータ分析および非線形回帰を行った。
結果および結論
例示的な二重特異性抗体1166/1261は、濃度の増加とともに凝集細胞の数を増加させる(図17)(2つのうちの1つの代表的な実験)。
例示的な二重特異性抗体1166/1261は、濃度の増加とともに凝集細胞の数を増加させる(図17)(2つのうちの1つの代表的な実験)。
実施例15−OX40およびCTLA4を標的とする二重特異性抗体−マウスの薬物動態
材料および方法
抗体
・1166/1261(OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体)
・1166/1167(OX40を標的とする単一特異性対照抗体)
材料および方法
抗体
・1166/1261(OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体)
・1166/1167(OX40を標的とする単一特異性対照抗体)
インビボでの研究
Taconic’s Denmarkの雌のC57BL/6(7〜8週齢)マウスを実験で使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
Taconic’s Denmarkの雌のC57BL/6(7〜8週齢)マウスを実験で使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
各抗体100μgをマウスに腹腔内注射し、0時間後、1時間後、4時間後、8時間後、24時間後、72時間後、および1週間後に、大伏在静脈または大静脈のいずれか経由でヘパリン処理済みチューブ内に血液を採取した。各時点で3匹のマウスを使用した。2500rpmで30分間血液を回転させ、さらに分析するために血漿を−80℃で凍結した。
血漿中の1166/1261および1166/1167レベルの決定のためのアッセイ
2つの異なるアッセイを使用した。単一標的ELISA(ELISA1)および二重ELISA(ELISA2)。簡潔に言えば、アッセイは以下の工程からなる。白色の高結合平底LIAプレート(Greiner BiO−One、Austria)を、0.8μg/mLのヒトOX40−Fc(RnD Systems、MN、USA)で一晩コーティングした。洗浄緩衝液(0.05%のTween 20を補充したホスファターゼ緩衝生理食塩水(PBST)、Medicago、Sweden)で洗浄した後、2%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBST(Merck、Germany)を使用して周囲の室温(ART)で1時間、振とうしながらウェルを遮断し、再び洗浄して、その後、アッセイ緩衝液(PBST+0.5%のBSA)中で1:200および1:5000に希釈した血漿試料を検量線試料(1166/1261、濃度6〜0.0012μg/mL)と一緒に加えた。ARTで1時間振とうしながらインキュベートし、続いて洗浄した後、二重ELISAの製造元の指示に従って、単一標的ELISA用のヒト抗カッパ抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役(HRP)(AbD Serotec、UK)または1μg/mLのビオチン化ヒトCTLA−4−Fc(Orencia)のいずれかからなる二次試薬、続いてストレプトアビジン−HRP(Thermo Fisher Scientific、MN、USA)を加えた。HRP基質SuperSignal Pico Luminescence(Thermo Fisher Scientific)を使用してシグナルを得た。Flurostar Optima(MBG Labtech、Germany)を使用して、暗所で10分間振とうしながらインキュベートした後、発光測定値を収集した。グラフパッドプリズムプログラムを使用することによってデータを分析した。
2つの異なるアッセイを使用した。単一標的ELISA(ELISA1)および二重ELISA(ELISA2)。簡潔に言えば、アッセイは以下の工程からなる。白色の高結合平底LIAプレート(Greiner BiO−One、Austria)を、0.8μg/mLのヒトOX40−Fc(RnD Systems、MN、USA)で一晩コーティングした。洗浄緩衝液(0.05%のTween 20を補充したホスファターゼ緩衝生理食塩水(PBST)、Medicago、Sweden)で洗浄した後、2%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBST(Merck、Germany)を使用して周囲の室温(ART)で1時間、振とうしながらウェルを遮断し、再び洗浄して、その後、アッセイ緩衝液(PBST+0.5%のBSA)中で1:200および1:5000に希釈した血漿試料を検量線試料(1166/1261、濃度6〜0.0012μg/mL)と一緒に加えた。ARTで1時間振とうしながらインキュベートし、続いて洗浄した後、二重ELISAの製造元の指示に従って、単一標的ELISA用のヒト抗カッパ抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役(HRP)(AbD Serotec、UK)または1μg/mLのビオチン化ヒトCTLA−4−Fc(Orencia)のいずれかからなる二次試薬、続いてストレプトアビジン−HRP(Thermo Fisher Scientific、MN、USA)を加えた。HRP基質SuperSignal Pico Luminescence(Thermo Fisher Scientific)を使用してシグナルを得た。Flurostar Optima(MBG Labtech、Germany)を使用して、暗所で10分間振とうしながらインキュベートした後、発光測定値を収集した。グラフパッドプリズムプログラムを使用することによってデータを分析した。
結果
1166/1261および1166/1167を注射した後、異なる時点で収集した試料を、それぞれ1166/1261および1166/1167の血漿レベルを決定するために、単一標的ELISA単独で、または単一標的および二重ELISAで分析した。結果は、血漿中の1166/1261および1166/1167のレベルが、腹膜注射後最初の4時間程で増加し、その後減少したことを示す(図18の上パネル)。1週間後の血漿中には、検出可能なレベルの1166/1261および1166/1167の両方が存在する(図18の中央パネルおよび下パネル)。
1166/1261および1166/1167を注射した後、異なる時点で収集した試料を、それぞれ1166/1261および1166/1167の血漿レベルを決定するために、単一標的ELISA単独で、または単一標的および二重ELISAで分析した。結果は、血漿中の1166/1261および1166/1167のレベルが、腹膜注射後最初の4時間程で増加し、その後減少したことを示す(図18の上パネル)。1週間後の血漿中には、検出可能なレベルの1166/1261および1166/1167の両方が存在する(図18の中央パネルおよび下パネル)。
血漿中の1166/1261のレベルは、モノクローナル抗体1166/1167について得られたレベルと類似しており、これは、1166/1261が同等の単一特異性抗OX40抗体の半減期に匹敵する、インビボでの良好な半減期を呈することを示す。
参照文献
Hemerle T.,Wulhfard S.,Neri D.,(2012)A critical evaluation of the tumour−targeting properties of bispecific antibodies based on quantitative biodistribution data.Protein Engineering and Design,25,pp851−854.
Hemerle T.,Wulhfard S.,Neri D.,(2012)A critical evaluation of the tumour−targeting properties of bispecific antibodies based on quantitative biodistribution data.Protein Engineering and Design,25,pp851−854.
実施例16−OX40およびCTLA4を標的とする二重特異性抗体−HT−29結腸癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
hPBMCヒト化免疫不全マウスおよびHT−29結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、1166/1261(OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体)の抗腫瘍効果を調べた。
概要
hPBMCヒト化免疫不全マウスおよびHT−29結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、1166/1261(OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体)の抗腫瘍効果を調べた。
1166−1261は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を実証した。
材料および方法
Taconic’s Denmarkの雌SCID−Beigeマウス(6〜9週齢)を実験に使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
Taconic’s Denmarkの雌SCID−Beigeマウス(6〜9週齢)を実験に使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
HT−29結腸癌細胞をATCCから入手し、ATCCの推奨に従って培養した。対数期に成長するHT−29細胞株(0日目(D0)に100〜200μL中に4×106個の細胞)を皮下注射した。白血球濃縮物から単離されたヒトPBMC(200μL中に7×106)を同日に腹腔内注射した。6日目、13日目、および20日目に、腹腔内治療(667pmol)を行った。
白血球濃縮物は、Lund University Hospitalから取得した。
腫瘍の幅、長さ、および高さのキャリパーを用いて腫瘍を測定し、その腫瘍体積を計算した(w/2×l/2×h/2× pi ×(4/3))。腫瘍体積が2cm3に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。
グラフパッドプリズムプログラムを使用したマン・ホイットニー検定によってデータを分析した。レスポンダードナーは、参照抗体1874に応答するドナーと見なされた。指数関数的な腫瘍成長期間中の最小10%の平均腫瘍抑制は、応答と見なされた。
結果
レスポンダードナー(2つの別々の実験から4人のドナー)を移植したマウスからのプールされたデータは、ビヒクルグループ(ZZ)と比較して、1166/1261抗体(p=0.0469〜p=0.0074、マン・ホイットニーノンパラメトリック、2テール)で処理した場合、腫瘍成長の抑制の形態で12〜16日目に統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した。腫瘍体積の抑制の割合は、10日目〜21日目に1166/1261で22〜36%の範囲であった(図19および表31.1を参照)。
レスポンダードナー(2つの別々の実験から4人のドナー)を移植したマウスからのプールされたデータは、ビヒクルグループ(ZZ)と比較して、1166/1261抗体(p=0.0469〜p=0.0074、マン・ホイットニーノンパラメトリック、2テール)で処理した場合、腫瘍成長の抑制の形態で12〜16日目に統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した。腫瘍体積の抑制の割合は、10日目〜21日目に1166/1261で22〜36%の範囲であった(図19および表31.1を参照)。
結論として、hPBMCヒト化免疫不全マウスおよびHT−29結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、1166/1261の抗腫瘍効果を調べた。1166/1261は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を実証した。
実施例17−OX40およびCTLA4を標的とする二重特異性抗体−Rajiリンパ腫モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
hPBMCヒト化免疫不全マウスおよびRaji B細胞リンパ腫の皮下腫瘍モデルを使用して、1166/1261(OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体)の抗腫瘍効果を調べた。
概要
hPBMCヒト化免疫不全マウスおよびRaji B細胞リンパ腫の皮下腫瘍モデルを使用して、1166/1261(OX40およびCTLA4を標的とする例示的な二重特異性抗体)の抗腫瘍効果を調べた。
1166/1261は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を実証した。
材料および方法
Taconic’s Denmarkの雌SCID−Beigeマウス(6〜9w)を実験に使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
Taconic’s Denmarkの雌SCID−Beigeマウス(6〜9w)を実験に使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
Raji B細胞リンパ腫をATCCから取得し、ATCCの推奨に従って培養した。対数期に成長するRaji細胞株を、バフィーコートから単離されたヒトPBMC(200μL中に10×106)と一緒に皮下注射した(10×106個の細胞)。0日目、7日目、および14日目に、腹腔内治療(667pmol)を行った。
バフィーコートはカルマル大学病院から入手した。
腫瘍体積が計算された幅、長さ、および高さのキャリパーで、腫瘍サイズを測定した(w/2×l/2×h/2×pi×(4/3))。腫瘍体積が2cm3に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。
グラフパッドプリズムプログラムを使用したマン・ホイットニー検定によってデータを分析した。応答者ドナーは、参照抗体1874に応答するドナーと見なされた。指数関数的な腫瘍成長期間中の最小10%の平均腫瘍抑制は、応答と見なされた。
結果および結論
応答ドナーを含む実験グループからのプールされたデータである、二重特異性1166/1261抗体は、ビヒクルと比較して、14日目および21日目に統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した(p=0.0068およびp=0,0288、マン・ホイットニー、2テール)(表32.1)。
応答ドナーを含む実験グループからのプールされたデータである、二重特異性1166/1261抗体は、ビヒクルと比較して、14日目および21日目に統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した(p=0.0068およびp=0,0288、マン・ホイットニー、2テール)(表32.1)。
実施例18−MC38結腸癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、OX40−CTLA−4二重特異性抗体1166/1261の抗腫瘍効果を調べた。
概要
ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、OX40−CTLA−4二重特異性抗体1166/1261の抗腫瘍効果を調べた。
1166/1261は、対応するモノクローナル抗体と比較して、CD8/Treg比に対する統計的に有意な効果を実証した。
材料および方法
実験では、ヒトOX40用の雌トランスジェニックマウス(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
実験では、ヒトOX40用の雌トランスジェニックマウス(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
RPMI、10%の熱不活化ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、ヘペス、および2−メルカプトエタノール中に、MC38結腸癌を培養した。対数期に成長するMC38細胞株(0日目(D0)に100μL中に1×106個の細胞)を皮下注射し、10日目、13日目、および16日目に腹腔内治療(1,33mol)を行った。最後の注射の24時間後に、腫瘍および脾臓を採取し、生存マーカー、系統マーカーCD11b、C19、MHCII、NK1.1、CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、Ki−67について染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
結果
MC38結腸癌モデルを使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体の薬力学的効果を調べた。2つの独立した実験からのプールされたデータは、両方の単一特異性の対応する抗体と比較して、二重特異性抗体による腫瘍内CD8/Treg比に対する統計的に有意な効果を実証した(図20)。脾臓では、CD8/Treg比およびTregにおけるKi−67(Ki−67は増殖についてのマーカーである)の発現レベルのいずれに関しても、CD8/Treg比の変化は見られない。これは、1166/1261が、周辺のT細胞に影響を与えることなく、2つの単一特異性対照抗体によって得られる効果の合計よりも大きい腫瘍のTregに対する有意な効果を誘導することを示す。したがって、この効果は腫瘍微小環境に指向され、それはより大きな治療域、すなわち低い全身傷害を伴う高い抗腫瘍効果を提供し得る。異なるT細胞集団の相対的なレベルを図21に概説する。
MC38結腸癌モデルを使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体の薬力学的効果を調べた。2つの独立した実験からのプールされたデータは、両方の単一特異性の対応する抗体と比較して、二重特異性抗体による腫瘍内CD8/Treg比に対する統計的に有意な効果を実証した(図20)。脾臓では、CD8/Treg比およびTregにおけるKi−67(Ki−67は増殖についてのマーカーである)の発現レベルのいずれに関しても、CD8/Treg比の変化は見られない。これは、1166/1261が、周辺のT細胞に影響を与えることなく、2つの単一特異性対照抗体によって得られる効果の合計よりも大きい腫瘍のTregに対する有意な効果を誘導することを示す。したがって、この効果は腫瘍微小環境に指向され、それはより大きな治療域、すなわち低い全身傷害を伴う高い抗腫瘍効果を提供し得る。異なるT細胞集団の相対的なレベルを図21に概説する。
実施例19−MC38結腸癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
ヒトOX40に対するトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、OX40−CTLA−4二重特異性抗体1166/1261の抗腫瘍効果を調べた。
概要
ヒトOX40に対するトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、OX40−CTLA−4二重特異性抗体1166/1261の抗腫瘍効果を調べた。
1166/1261は、腫瘍体積の抑制の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した。
材料および方法
実験では、ヒトOX40(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)の雌トランスジェニックマウスを使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
実験では、ヒトOX40(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)の雌トランスジェニックマウスを使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
MC38結腸癌はスタンフォード大学から入手し、RPMI、10%の熱不活化ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、ヘペス、2−メルカプトエタノール中に培養した。対数期に成長するMC38細胞株(0日目(D0)に100μL中の1×106個の細胞)を皮下注射し、7日目、10日目、および13日目に、腹腔内治療(1,33mol)を行った。
腫瘍の幅、長さ、および高さのキャリパーを用いて腫瘍を測定し、その腫瘍体積を計算した(w/2×l/2×h/2×pi×(4/3))。腫瘍体積が2cm3に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。
グラフパッドプリズムおよびエクセルプログラムを使用して、モノクローナル抗体およびビヒクルと比較した、二重特異性抗体の腫瘍体積の抑制についてのデータを分析した。
結果
3つの独立した実験(n=26〜28)からプールされたデータは、腫瘍体積の抑制および生存率に対する統計的に有意な効果を実証した。
3つの独立した実験(n=26〜28)からプールされたデータは、腫瘍体積の抑制および生存率に対する統計的に有意な効果を実証した。
結論として、ヒトOX40用のトランスジェニックマウスにおいてMC38結腸癌モデルを使用して、二重特異性OX40−CTLA−4抗体の抗腫瘍効果を調べた。二重特異性抗体は、腫瘍体積の抑制および生存率の増加に対する統計的に有意な効果を実証した。抗腫瘍効果は、単一特異性対照抗体よりも生存率および腫瘍成長の抑制の観点で強力であった(図22)。
実施例20−MB49膀胱癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMB49膀胱癌の皮下腫瘍モデルを使用して、OX40−CTLA−4二重特異性抗体1166/1261の抗腫瘍効果を調べた。
概要
ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMB49膀胱癌の皮下腫瘍モデルを使用して、OX40−CTLA−4二重特異性抗体1166/1261の抗腫瘍効果を調べた。
1166/1261は、腫瘍体積の抑制および生存の増加の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果を示した。
材料および方法
実験では、ヒトOX40(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)の雌トランスジェニックマウスを使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
実験では、ヒトOX40(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)の雌トランスジェニックマウスを使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
対数期に成長するMB49細胞株を0日目に皮下注射し(0.25×106個の細胞)、7日目、10日目、および13日目に腹腔内治療(1.33μmol)を行った。
腫腫瘍体積が計算された幅、長さ、および高さのキャリパーを使用して、腫瘍体積を測定した((w/2)×(l/2)×(h/2)×pi×(4/3))。腫瘍体積が2cm3に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、2テール検定を使用して腫瘍体積について統計分析を行い、グラフパッドプリズムを使用して生存カプラン・マイヤーログランクについて統計分析を行った。
結果
MB49膀胱癌モデルを使用して、ヒトOX40用のトランスジェニックマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体1166/1261の抗腫瘍効果を調べた。二重特異性抗体は、腫瘍体積の抑制に対して統計的に有意な効果(図23A、p=0.0003)、および生存率の増加(図23B、p<0.0001)を実証した。
MB49膀胱癌モデルを使用して、ヒトOX40用のトランスジェニックマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体1166/1261の抗腫瘍効果を調べた。二重特異性抗体は、腫瘍体積の抑制に対して統計的に有意な効果(図23A、p=0.0003)、および生存率の増加(図23B、p<0.0001)を実証した。
実施例21−1166/1261により誘導される免疫記憶
概要
免疫調節剤は、免疫記憶を誘導するため、癌に対する長期的な治癒反応を誘導すると考えられている。そのような免疫記憶を実証するために、1166/1261が完全な腫瘍退縮を誘導したマウスを、同じ特定の腫瘍、MB49細胞株、または無関係な腫瘍細胞株PANC02で再挑戦した。
概要
免疫調節剤は、免疫記憶を誘導するため、癌に対する長期的な治癒反応を誘導すると考えられている。そのような免疫記憶を実証するために、1166/1261が完全な腫瘍退縮を誘導したマウスを、同じ特定の腫瘍、MB49細胞株、または無関係な腫瘍細胞株PANC02で再挑戦した。
再挑戦実験により、1166/1261がMB49膀胱癌に対して腫瘍特異的な免疫記憶を生成するが、無関係な腫瘍PANC02に対しては生成しないことが実証された。
材料および方法
1166/1261がMB49膀胱癌から完全な腫瘍退縮を誘導するgenOwayによって生成された、ヒトOX40(hOX40tg)用の雌のノックインマウスを、単一の腫瘍モデルにおける特定の腫瘍として、または双子型腫瘍モデルを使用した無関係な腫瘍PANC02と一緒に、MB49で再挑戦した。未投薬マウスを腫瘍成長対照として使用した。
1166/1261がMB49膀胱癌から完全な腫瘍退縮を誘導するgenOwayによって生成された、ヒトOX40(hOX40tg)用の雌のノックインマウスを、単一の腫瘍モデルにおける特定の腫瘍として、または双子型腫瘍モデルを使用した無関係な腫瘍PANC02と一緒に、MB49で再挑戦した。未投薬マウスを腫瘍成長対照として使用した。
対数期に成長するMB49およびPANC02を、脇腹の各側に1つずつ、単一腫瘍または双子型腫瘍のいずれかとして皮下注射した(0.25×106個の細胞)。腫瘍体積をキャリパーで週3回測定し、式(3/4×π×(幅/2)×(長さ/2)×(高さ/2)を使用して腫瘍体積を計算した。
結果
これらのマウスを特定の腫瘍MB49または無関係な腫瘍で再挑戦することにより、1166/1261治療後に完全な腫瘍退縮を示すマウスにおける免疫記憶を検査した。完全なレスポンダーは、新しい腫瘍が成長しなかったため、特定の腫瘍MB49に対する免疫記憶を実証した(図24A)。未投薬マウスを腫瘍成長についての正の対照として使用した。さらに、MB49および双子型腫瘍モデルにおける無関係な腫瘍PANC02で再挑戦した完全なレスポンダーが、以前に遭遇したMB49腫瘍ではなく無関係な腫瘍のみの成長を実証したため、免疫記憶は腫瘍特異的であることが実証された(図24B)。このデータは、1166/1261が腫瘍特異的な免疫記憶を誘導することを実証している。
これらのマウスを特定の腫瘍MB49または無関係な腫瘍で再挑戦することにより、1166/1261治療後に完全な腫瘍退縮を示すマウスにおける免疫記憶を検査した。完全なレスポンダーは、新しい腫瘍が成長しなかったため、特定の腫瘍MB49に対する免疫記憶を実証した(図24A)。未投薬マウスを腫瘍成長についての正の対照として使用した。さらに、MB49および双子型腫瘍モデルにおける無関係な腫瘍PANC02で再挑戦した完全なレスポンダーが、以前に遭遇したMB49腫瘍ではなく無関係な腫瘍のみの成長を実証したため、免疫記憶は腫瘍特異的であることが実証された(図24B)。このデータは、1166/1261が腫瘍特異的な免疫記憶を誘導することを実証している。
実施例22−腫瘍内CD8/Treg比の評価によるMB49膀胱癌モデルのインビボでの抗腫瘍効果
概要
腫瘍環境において、Tregは、OX40およびCTLA−4の両方を高度に発現する。OX40−CTLA−4二重特異性抗体は、この腫瘍環境でTregの枯渇を誘導すると予想される。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMB49膀胱癌の皮下腫瘍モデルを使用して、腫瘍内Tregの枯渇を誘導する1166/1261の能力を調べた。
概要
腫瘍環境において、Tregは、OX40およびCTLA−4の両方を高度に発現する。OX40−CTLA−4二重特異性抗体は、この腫瘍環境でTregの枯渇を誘導すると予想される。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMB49膀胱癌の皮下腫瘍モデルを使用して、腫瘍内Tregの枯渇を誘導する1166/1261の能力を調べた。
1166/1261は、対応するモノクローナル抗体と比較して、Tregの枯渇、エフェクター細胞の活性化、およびCD8/Treg比の増加に対する統計的に有意な効果を実証した。変更されたCD8/Treg比の形態で脾臓に有意な効果は観察されなかったため、この効果は主に腫瘍環境に局在した。
材料および方法
フランス国のgenOwayによって生成された7〜14週齢のヒトOX40(hOX40tg)用の雌ホモ接合体を実験で使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
フランス国のgenOwayによって生成された7〜14週齢のヒトOX40(hOX40tg)用の雌ホモ接合体を実験で使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
対数期に成長するMB49膀胱癌を0日目に皮下注射し(0.25×106個の細胞)、10日目、13日目、および16日目に腹腔内治療(1.33μmol)を行った。最後の注射の24時間後、腫瘍および脾臓を採取し、CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、ならびに系統マーカー(CD19、NK1.1、MHCII)に対して染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。統計分析は、マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、2テールを使用して、特に明記しない限り、グラフパッドプリズムを使用して行った。
結果
MB49膀胱癌を使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体の薬力学的効果を調べた。実験では、1166/1261が腫瘍内Treg含有量(p=0.0087、2テール)(図25A)、腫瘍におけるCD8数(p=0.047、1テール)(図25B)、およびCD8/Treg比 p=0.0043、2テール)(図25C)に対する統計的に有意な効果を誘導することが実証された。脾臓ではCD8/Treg比の変化は見られず、これは1166/1261の腫瘍局在を示している(図25D)。
MB49膀胱癌を使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体の薬力学的効果を調べた。実験では、1166/1261が腫瘍内Treg含有量(p=0.0087、2テール)(図25A)、腫瘍におけるCD8数(p=0.047、1テール)(図25B)、およびCD8/Treg比 p=0.0043、2テール)(図25C)に対する統計的に有意な効果を誘導することが実証された。脾臓ではCD8/Treg比の変化は見られず、これは1166/1261の腫瘍局在を示している(図25D)。
実施例23−エフェクター細胞活性化の評価によるMC38結腸癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
制御性T細胞の枯渇に加えて、OX40−CTLA−4二重特異性抗体の作用機序の一部は、エフェクターT細胞の活性化と考えられる。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、OX40−CTLA−4二重特異性抗体1166/1261のこれらの抗腫瘍効果を調べた。
概要
制御性T細胞の枯渇に加えて、OX40−CTLA−4二重特異性抗体の作用機序の一部は、エフェクターT細胞の活性化と考えられる。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、OX40−CTLA−4二重特異性抗体1166/1261のこれらの抗腫瘍効果を調べた。
1166/1261は、グランザイムBおよびCD107a発現の増加の形態で、腫瘍微小環境におけるエフェクターCD8活性化に対する統計的に有意な効果を実証した。
材料および方法
実験では、ヒトOX40用の雌トランスジェニックマウス(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
実験では、ヒトOX40用の雌トランスジェニックマウス(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
対数期に成長するMC38結腸癌を0日目に皮下注射し(1×106個の細胞)、10日目、13日目、および16日目に腹腔内治療(1.33μmol)を行った。最後の注射の24時間後、腫瘍および脾臓を採取し、生存マーカー、系統マーカー(CD11b、C19、MHCII、NK1.1)、CD45、CD3、CD4、CD8、グランザイムB、およびCD107aについて染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、2テール検定を使用してデータを分析した。
結果
MC38結腸癌を使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体の薬力学的効果を調べた。実験では、1166/1261がCD107a(図26A、p=0.0079)およびグランザイムB(図26B、p=0.0159)の誘導の形態で腫瘍領域のエフェクターCD8細胞の統計的に有意な活性化を誘導することが実証された。
MC38結腸癌を使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体の薬力学的効果を調べた。実験では、1166/1261がCD107a(図26A、p=0.0079)およびグランザイムB(図26B、p=0.0159)の誘導の形態で腫瘍領域のエフェクターCD8細胞の統計的に有意な活性化を誘導することが実証された。
実施例24−例示的な二重特異性抗体「1166/1261」が腫瘍に局在する
概要
OX40およびCTLA−4は、腫瘍環境におけるT細胞、特にTreg上に高度に発現する。したがって、OX40−CTLA−4二重特異性抗体は、二重標的化により腫瘍局在を誘導すると予想される。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、腫瘍に局在する1166/1261の能力を調べた。1166/1261は、ビヒクルまたはアイソタイプ対照で処理した動物と比較して、統計的に有意な腫瘍の局在を実証した。脾臓には局在は見られなかった。
概要
OX40およびCTLA−4は、腫瘍環境におけるT細胞、特にTreg上に高度に発現する。したがって、OX40−CTLA−4二重特異性抗体は、二重標的化により腫瘍局在を誘導すると予想される。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、腫瘍に局在する1166/1261の能力を調べた。1166/1261は、ビヒクルまたはアイソタイプ対照で処理した動物と比較して、統計的に有意な腫瘍の局在を実証した。脾臓には局在は見られなかった。
材料および方法
実験では、ヒトOX40用の雌トランスジェニックマウス(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
実験では、ヒトOX40用の雌トランスジェニックマウス(GenOwayが開発したホモ接合型ヒトOX40ノックインマウスモデル)を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
対数期に成長するMC38結腸癌を0日目に皮下注射(1×106個の細胞)した。マ17日目に1回の治療をマウスに行った(1.33μmolのAbを腹腔内に投与)。注射の24時間後、腫瘍および脾臓を採取し、生存マーカー、APCEFluor780標識抗CD45およびPE標識抗hIgGで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。生きたCD45+細胞のうちのhIgG+細胞の割合を、異なるグループ間で比較した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、2テール検定を使用してデータを分析した。
結果および結論
MC38結腸癌を使用して、hOX40tgマウスにおいて腫瘍局在を誘導する1166/1261の能力を調べた。実験では、治療後の腫瘍において1166/1261は検出されたが、アイソタイプ対照は検出されなかった(図27A)。1166/1261は脾臓では検出することができず(図27B)、腫瘍への局在が示唆された。
MC38結腸癌を使用して、hOX40tgマウスにおいて腫瘍局在を誘導する1166/1261の能力を調べた。実験では、治療後の腫瘍において1166/1261は検出されたが、アイソタイプ対照は検出されなかった(図27A)。1166/1261は脾臓では検出することができず(図27B)、腫瘍への局在が示唆された。
実施例25−MC38結腸癌モデルにおけるPD−1の組み合わせ効果
概要
PD−1モノクローナル抗体および他の免疫チェックポイント阻害剤を用いた臨床試験の成功により、癌治療の新しい道が開かれた。しかしながら、癌患者の大部分は依然として応答せず、そのため、併用療法の研究が強化されている。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌モデルを使用して、PD−1の組み合わせにおけるOX40−CTLA−4二重特異性抗体を調べた。
概要
PD−1モノクローナル抗体および他の免疫チェックポイント阻害剤を用いた臨床試験の成功により、癌治療の新しい道が開かれた。しかしながら、癌患者の大部分は依然として応答せず、そのため、併用療法の研究が強化されている。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびMC38結腸癌モデルを使用して、PD−1の組み合わせにおけるOX40−CTLA−4二重特異性抗体を調べた。
1166/1261単独で、腫瘍体積の抑制および生存率の増加の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果が実証された。加えて、1166/1261は、PD−1治療の抗腫瘍効果を著しく向上させることができた。これらのデータは、患者において1166/1261とPD−1抗体とを組み合わせることの潜在的な利点を示す。
材料および方法
実験では、フランス国のgenOwayによって生成され、社内で飼育された7〜14週齢のヒトOX40(hOX40tg)の雌ホモ接合体を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
実験では、フランス国のgenOwayによって生成され、社内で飼育された7〜14週齢のヒトOX40(hOX40tg)の雌ホモ接合体を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
対数期に成長するMC38結腸癌を0日目に皮下注射(1×106個の細胞)し、1166/1261(1.33μmol)および/または抗マウスPD−1(250μg、RPM1−14、BioXcell、USA)抗体を、7日目、10日目、および13日目に腹腔内投与した。腫瘍体積をキャリパーで週3回測定し、式(3/4×π×(幅/2)×(長さ/2)×(高さ/2)を使用して腫瘍体積を計算した。倫理的な腫瘍限界でマウスを殺処分した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、2テール検定、および生存カプラン・マイヤー、ログランクを使用して、グラフパッドプリズムを使用して腫瘍体積を分析した。
結果
MC38結腸癌モデルを使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体と抗PD−1との組み合わせ抗腫瘍効果を調べた。実験では、腫瘍体積の抑制および生存率の増加p=0.0124の両方の形態で、1166/1261によって誘導される抗腫瘍効果が実証された(図28AおよびB)。1166/1261とPD−1治療との組み合わせにより、抗腫瘍効果が有意に増加した(p<0.0001)。これらのデータは、1166/1261が診療所でPD−1抗体を用いて得られた抗腫瘍効果を向上させることができることが実証した。
MC38結腸癌モデルを使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体と抗PD−1との組み合わせ抗腫瘍効果を調べた。実験では、腫瘍体積の抑制および生存率の増加p=0.0124の両方の形態で、1166/1261によって誘導される抗腫瘍効果が実証された(図28AおよびB)。1166/1261とPD−1治療との組み合わせにより、抗腫瘍効果が有意に増加した(p<0.0001)。これらのデータは、1166/1261が診療所でPD−1抗体を用いて得られた抗腫瘍効果を向上させることができることが実証した。
実施例26−CT26結腸癌モデルにおけるPD−1の組み合わせ効果
概要
PD−1モノクローナル抗体および他の免疫チェックポイント阻害剤を用いた臨床試験の成功により、癌治療の新しい道が開かれた。しかしながら、癌患者の大部分は依然として応答せず、そのため、併用療法の研究が強化されている。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびCT26結腸癌モデルを使用して、PD−1の組み合わせにおけるOX40−CTLA二重特異性抗体を調べた。
概要
PD−1モノクローナル抗体および他の免疫チェックポイント阻害剤を用いた臨床試験の成功により、癌治療の新しい道が開かれた。しかしながら、癌患者の大部分は依然として応答せず、そのため、併用療法の研究が強化されている。ヒトOX40用のトランスジェニックマウスおよびCT26結腸癌モデルを使用して、PD−1の組み合わせにおけるOX40−CTLA二重特異性抗体を調べた。
1166/1261単独で、腫瘍体積の抑制および生存率の増加の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果が実証された。加えて、1166/1261は、PD−1治療の抗腫瘍効果を著しく向上させることができた。これらのデータは、1166/1261が診療所でPD−1抗体を用いて得られた抗腫瘍効果を向上させることができることを実証した
材料および方法
実験では、フランス国のgenOwayによって生成され、社内で飼育された7〜14週齢のヒトOX40(hOX40tg)の雌ホモ接合体を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
実験では、フランス国のgenOwayによって生成され、社内で飼育された7〜14週齢のヒトOX40(hOX40tg)の雌ホモ接合体を使用した。全ての実験は、Malmo/Lund倫理委員会の許可を得て行った。
対数期に成長するCT26結腸癌を0日目に皮下注射(1×106個の細胞)し、1166/1261(1.33μmol)および/または抗マウスPD−1(250μg、RPM1−14、BioXcell、USA)抗体を、7日目、10日目、および13日目に腹腔内投与した。腫瘍体積をキャリパーで週3回測定し、式(3/4×π×(幅/2)×(長さ/2)×(高さ/2)を使用して腫瘍体積を計算した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、2テール検定、および生存カプラン・マイヤー、ログランクを使用して、グラフパッドプリズムを使用して腫瘍体積を分析した。
結果
CT26結腸癌モデルを使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体と抗PD−1との組み合わせ抗腫瘍効果を調べた。実験では、腫瘍体積の抑制および生存の増加の両方として、1166/1261による統計的に有意な効果が実証されたが、PD−1抗体単独ではいかなる強力な抗腫瘍効果も実証されなかった(図29AおよびB)。PD−1治療に1166/1261を加えると、PD−1抗体の抗腫瘍効果が著しく増加した。これらのデータは、1166/1261が診療所でPD−1抗体を用いて得られた抗腫瘍効果を向上させることができることを実証した。
CT26結腸癌モデルを使用して、hOX40tgマウスにおける二重特異性OX40−CTLA−4抗体と抗PD−1との組み合わせ抗腫瘍効果を調べた。実験では、腫瘍体積の抑制および生存の増加の両方として、1166/1261による統計的に有意な効果が実証されたが、PD−1抗体単独ではいかなる強力な抗腫瘍効果も実証されなかった(図29AおよびB)。PD−1治療に1166/1261を加えると、PD−1抗体の抗腫瘍効果が著しく増加した。これらのデータは、1166/1261が診療所でPD−1抗体を用いて得られた抗腫瘍効果を向上させることができることを実証した。
実施例27−PANC02膵臓癌に対する1166/1261の抗腫瘍効果
概要
膵臓腺癌は侵攻性の癌である。膵臓癌の患者は、典型的には、予後が非常に悪く、癌の種類は、米国で4番目に多い癌による死因である。hOX40用のトランスジェニックマウスを使用して、PANC02膵臓癌に対する1166/1261の抗腫瘍効果を検査した。
概要
膵臓腺癌は侵攻性の癌である。膵臓癌の患者は、典型的には、予後が非常に悪く、癌の種類は、米国で4番目に多い癌による死因である。hOX40用のトランスジェニックマウスを使用して、PANC02膵臓癌に対する1166/1261の抗腫瘍効果を検査した。
1166/1261は、腫瘍体積の抑制および生存の増加の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した。
材料および方法
実験では、genOwayによって生成されたヒトOX40(hOX40tg)の雌ノックインマウスを使用した。全ての実験はマルメ/ルンド倫理委員会によって承認された。
実験では、genOwayによって生成されたヒトOX40(hOX40tg)の雌ノックインマウスを使用した。全ての実験はマルメ/ルンド倫理委員会によって承認された。
対数期に成長するPANC02膵臓癌を0日目に皮下注射し(0.25×106個の細胞)、7日目、10日目、および13日目に1166/1261(1.33μmol)による治療を腹腔内で行った。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、2テール検定、および生存カプラン・マイヤー、ログランクを使用して、グラフパッドプリズムを使用して腫瘍体積を分析した。
結果
hOX40トランスジェニックマウスおよびPANC02膵臓癌を使用して、膵臓癌に対する1166/1261の抗腫瘍効果を検査した。1166/1261は、腫瘍成長の抑制(図30A)および生存率の増加(図30B)の形態で有意な抗腫瘍効果を実証した。
hOX40トランスジェニックマウスおよびPANC02膵臓癌を使用して、膵臓癌に対する1166/1261の抗腫瘍効果を検査した。1166/1261は、腫瘍成長の抑制(図30A)および生存率の増加(図30B)の形態で有意な抗腫瘍効果を実証した。
例28−1166/1261はCTLA−4遮断を通じてT細胞の活性化を回復する
概要
CTLA−4遮断レポーターアッセイで、CTLA−4を遮断し、T細胞の共刺激および活性化を増加させる1166/1261の能力を調べた。1166/1261は、CD80/CD86のCTLA−4への結合を遮断し、CD28を介した共刺激を回復させることができ、T細胞の活性化をもたらした。
概要
CTLA−4遮断レポーターアッセイで、CTLA−4を遮断し、T細胞の共刺激および活性化を増加させる1166/1261の能力を調べた。1166/1261は、CD80/CD86のCTLA−4への結合を遮断し、CD28を介した共刺激を回復させることができ、T細胞の活性化をもたらした。
材料および方法
このアッセイでは、TCRアクチベーターおよびCD80/CD86を発現するRaji細胞を使用して、luc2Pエレメントを有するIL2プロモーターに接続されたTCR、CTLA−4、およびCD28を発現するジャーカットレポーターT細胞を共刺激する。活性化は発光として測定される。CTLA−4抗体が存在しない場合、CD80/CD86はCD28よりも高い親和性でCTLA−4に結合するため、シグナルを遮断する。CTLA−4結合抗体を加えることにより、CTLA−4へのCD80/CD86の結合が遮断され、結果として、CD28を介したT細胞の共刺激が増加し、T細胞の活性化をもたらす。
このアッセイでは、TCRアクチベーターおよびCD80/CD86を発現するRaji細胞を使用して、luc2Pエレメントを有するIL2プロモーターに接続されたTCR、CTLA−4、およびCD28を発現するジャーカットレポーターT細胞を共刺激する。活性化は発光として測定される。CTLA−4抗体が存在しない場合、CD80/CD86はCD28よりも高い親和性でCTLA−4に結合するため、シグナルを遮断する。CTLA−4結合抗体を加えることにより、CTLA−4へのCD80/CD86の結合が遮断され、結果として、CD28を介したT細胞の共刺激が増加し、T細胞の活性化をもたらす。
連続希釈した1166/1261およびアイソタイプ対照をプレートに固定し、一晩インキュベートした後、ジャーカットレポーター細胞およびRaji細胞を加えた。一晩インキュベートした後、T細胞の活性化を発光として測定した。
結果および結論
図31に示されるように、1166/1261はT細胞の活性化を回復することができるが、アイソタイプ対照では効果が見られない。
図31に示されるように、1166/1261はT細胞の活性化を回復することができるが、アイソタイプ対照では効果が見られない。
実施例29−CTLA−4架橋に対する1166/1261により誘導されるT細胞活性化
概要
CTLA−4架橋時の連続アゴニストアッセイで、1166/1261のT細胞を活性化する能力を調べた。1166/1261は、IFN−γ、IL−2の分泌、またはT細胞増殖の増加の形態でアゴニストT細胞活性化を実証した。
概要
CTLA−4架橋時の連続アゴニストアッセイで、1166/1261のT細胞を活性化する能力を調べた。1166/1261は、IFN−γ、IL−2の分泌、またはT細胞増殖の増加の形態でアゴニストT細胞活性化を実証した。
材料および方法
ヒトCD3+またはCD4+T細胞を、負の選択(汎T細胞分離キットまたはCD4+T細胞分離キット、Miltenyi)を使用して、ルンド大学病院の血液バンクの白血球フィルターから取得したPBMCから精製し、連続希釈した1166/1261、単一特異性抗体1166/1167+Iso対照/1261またはアイソタイプ対照の混合物と一緒に培養した。
ヒトCD3+またはCD4+T細胞を、負の選択(汎T細胞分離キットまたはCD4+T細胞分離キット、Miltenyi)を使用して、ルンド大学病院の血液バンクの白血球フィルターから取得したPBMCから精製し、連続希釈した1166/1261、単一特異性抗体1166/1167+Iso対照/1261またはアイソタイプ対照の混合物と一緒に培養した。
CTLA−4(Orencia、5μg/ml)およびαCD3(OKT3、3μg/ml)でプレコートしたプレート中の試験抗体によりT細胞(100,000細胞/ウェル)を培養した後に、CD3+T細胞によるIFN−γ放出を測定した。72時間の期間インキュベートした後、ELISAにより上清中のIFN−γのレベルを測定した。
CTLA−4(800,000個の受容体/細胞)およびαCD3ビーズ(UCHT−1、セル:ビーズ比1:1.1)を安定して発現する照射HEK細胞(30,000個の細胞/ウェル)を含むプレート中に試験抗体によりT細胞(50,000個の細胞/ウェル)を培養することによって、CD4+T細胞によるIL−2の放出を測定した。72時間後、ELISAにより上清中のIL−2のレベルを測定した。
CTLA−4(Orencia、5μg/ml)およびαCD3(UCHT−1、0.1μg/ml)でプレコートしたプレート中に試験化合物によりCD4+T細胞(50,000個の細胞/ウェル)を培養することによって、増殖を決定した。72時間後、CellTitre Glow(Promega)で増殖を測定した。
結果および結論
示差T細胞活性化で、1166/1261のアゴニスト活性を調べた。図32の結果は、IFN−γおよびIL−2の放出ならびに増殖の観点で1166/1261の用量依存的効果を実証しているが、これは、単一特異性OX40とCTLA−4抗体との組み合わせでは見られない。結果は、1166/1261がCTLA−4架橋に対して強力なアゴニスト効果を有することを示す。
示差T細胞活性化で、1166/1261のアゴニスト活性を調べた。図32の結果は、IFN−γおよびIL−2の放出ならびに増殖の観点で1166/1261の用量依存的効果を実証しているが、これは、単一特異性OX40とCTLA−4抗体との組み合わせでは見られない。結果は、1166/1261がCTLA−4架橋に対して強力なアゴニスト効果を有することを示す。
実施例30ーFcγR架橋に対する1166/1261により誘導されるT細胞活性化
概要
FcγR架橋時のアゴニストアッセイで、T細胞を活性化する1166/1261の能力を調べた。1166/1261は、IL−2分泌の形態でアゴニストT細胞活性化を実証した。
概要
FcγR架橋時のアゴニストアッセイで、T細胞を活性化する1166/1261の能力を調べた。1166/1261は、IL−2分泌の形態でアゴニストT細胞活性化を実証した。
材料および方法
CD64(FcγRI)を発現するように安定してトランスフェクトされたCHO細胞に放射線を照射し、プレーティング(100,000個の細胞/ウェル)し、一晩接着させた。連続希釈した1166/1261、単一特異性抗体の組み合わせ(1166/1167+対照IgG/1261)、またはアイソタイプ対照をウェルに加えた。最適以下のT細胞活性化のために、αCD3(OKT3)でコーティングされたビーズを加えた。負の選択(CD4+T細胞分離キット、Miltenyi)を使用して、ルンド大学病院の血液バンクの白血球フィルターから取得したPBMC由来のヒトCD4+T細胞を精製し、ウェル(50,000個の細胞/ウェル)に加えた。72時間の期間インキュベートした後、ELISAによりIL−2分泌を測定した。合計で8人のドナーをアッセイで試験した。
CD64(FcγRI)を発現するように安定してトランスフェクトされたCHO細胞に放射線を照射し、プレーティング(100,000個の細胞/ウェル)し、一晩接着させた。連続希釈した1166/1261、単一特異性抗体の組み合わせ(1166/1167+対照IgG/1261)、またはアイソタイプ対照をウェルに加えた。最適以下のT細胞活性化のために、αCD3(OKT3)でコーティングされたビーズを加えた。負の選択(CD4+T細胞分離キット、Miltenyi)を使用して、ルンド大学病院の血液バンクの白血球フィルターから取得したPBMC由来のヒトCD4+T細胞を精製し、ウェル(50,000個の細胞/ウェル)に加えた。72時間の期間インキュベートした後、ELISAによりIL−2分泌を測定した。合計で8人のドナーをアッセイで試験した。
結果および結論
図33に示されるように、1166/1261の用量依存的な活性化が実証されているが、これは単一特異性OX40とCTLA−4抗体との組み合わせでは見られない。結果は、1166/1261がFcγR架橋に対して強力なアゴニスト効果を有することを示す。
図33に示されるように、1166/1261の用量依存的な活性化が実証されているが、これは単一特異性OX40とCTLA−4抗体との組み合わせでは見られない。結果は、1166/1261がFcγR架橋に対して強力なアゴニスト効果を有することを示す。
例31−1166/1261の主なTregを枯渇させる能力
概要
腫瘍環境では、制御性T細胞は、OX40およびCTLA−4の両方の発現が高い。OX40−CTLA−4二重特異性抗体は、特に腫瘍環境において、標的発現細胞のADCCを誘導すると予想される。ADCCの代理としてヒトFcγRIII(V158)に特異的なADCCレポーターアッセイを使用して、ADCCを誘導する1166/1261の能力を検査した。1166/1261は、エフェクター細胞の有意な活性化を実証し、この誘導は、対応するモノクローナル抗体単独(データは示されず)または組み合わせと比較して、活性が優れていた。
概要
腫瘍環境では、制御性T細胞は、OX40およびCTLA−4の両方の発現が高い。OX40−CTLA−4二重特異性抗体は、特に腫瘍環境において、標的発現細胞のADCCを誘導すると予想される。ADCCの代理としてヒトFcγRIII(V158)に特異的なADCCレポーターアッセイを使用して、ADCCを誘導する1166/1261の能力を検査した。1166/1261は、エフェクター細胞の有意な活性化を実証し、この誘導は、対応するモノクローナル抗体単独(データは示されず)または組み合わせと比較して、活性が優れていた。
材料および方法
FcγRIIIa(V158)ADCCレポーターアッセイ(Promega)を使用して、ADCC誘導を決定した。EasySep(商標)ヒトCD4+CD127低CD25+制御性T細胞分離キット(Stemcell Technologies)を使用した負の選択により、CD4+CD25+CD127低Tregを単離した。αCD3/αCD28 Dynabeads(Gibco)の存在下で、Tregを48時間活性化し、標的発現を上方制御し、標的細胞として使用した。連続希釈した1166/1261、単一特異性抗体(1166/1167+対照IgG/1261)の組み合わせ、またはアイソタイプ対照を、エフェクター細胞および標的細胞(5:1の比率)と一緒に6時間培養した。培養の前後のOX40およびCTLA−4の発現をフローサイトメトリーによって測定した。
FcγRIIIa(V158)ADCCレポーターアッセイ(Promega)を使用して、ADCC誘導を決定した。EasySep(商標)ヒトCD4+CD127低CD25+制御性T細胞分離キット(Stemcell Technologies)を使用した負の選択により、CD4+CD25+CD127低Tregを単離した。αCD3/αCD28 Dynabeads(Gibco)の存在下で、Tregを48時間活性化し、標的発現を上方制御し、標的細胞として使用した。連続希釈した1166/1261、単一特異性抗体(1166/1167+対照IgG/1261)の組み合わせ、またはアイソタイプ対照を、エフェクター細胞および標的細胞(5:1の比率)と一緒に6時間培養した。培養の前後のOX40およびCTLA−4の発現をフローサイトメトリーによって測定した。
結果および結論
1166/1261がインビトロで制御性T細胞の枯渇を誘導する能力を、ADCCレポーターアッセイによって評価した。図34Aに示されるように、1166/1261には、主なヒトTregでADCCを誘導する能力がある。誘導は、対応するモノクローナル抗体単独(データは示されず)またはそれらの混合物よりも著しく高かった。結果は、OX40およびCTLA−4の発現レベルと相関した。新鮮なまたは未刺激のTregは、低レベルのOX40およびCTLA−4を発現したが、αCD3/αCD28による活性化後に、それらのレベルは明らかに上方制御された(図34B)。
1166/1261がインビトロで制御性T細胞の枯渇を誘導する能力を、ADCCレポーターアッセイによって評価した。図34Aに示されるように、1166/1261には、主なヒトTregでADCCを誘導する能力がある。誘導は、対応するモノクローナル抗体単独(データは示されず)またはそれらの混合物よりも著しく高かった。結果は、OX40およびCTLA−4の発現レベルと相関した。新鮮なまたは未刺激のTregは、低レベルのOX40およびCTLA−4を発現したが、αCD3/αCD28による活性化後に、それらのレベルは明らかに上方制御された(図34B)。
例32−1166/1261の主なTregを枯渇させる能力
概要
腫瘍環境では、制御性T細胞は、OX40およびCTLA−4の両方の発現が高い。OX40−CTLA−4二重特異性抗体は、特に腫瘍環境において、標的発現細胞のADCCを誘導すると予想される。エフェクター細胞として同種NK細胞を用いたLDH放出アッセイを使用して、ADCCを誘導する1166/1261の能力を検査した。1166/1261は、NK細胞を介したTregの強力な溶解を誘導した。
概要
腫瘍環境では、制御性T細胞は、OX40およびCTLA−4の両方の発現が高い。OX40−CTLA−4二重特異性抗体は、特に腫瘍環境において、標的発現細胞のADCCを誘導すると予想される。エフェクター細胞として同種NK細胞を用いたLDH放出アッセイを使用して、ADCCを誘導する1166/1261の能力を検査した。1166/1261は、NK細胞を介したTregの強力な溶解を誘導した。
材料および方法
EasySep(商標)ヒトCD4+CD127低CD25+制御性T細胞分離キット(Stemcell Technologies)を使用した負の選択により、CD4+CD25+CD127低Tregを単離した。標的発現を上方制御するために、αCD3/αCD28 Dynabeads(Gibco)の存在下で、Tregを48時間活性化し、その後標的細胞として使用した。エフェクター細胞として、EasySep(商標)ヒトNK細胞分離キット(Stemcell Technologies)を使用した負の選択を使用してPBMCから単離された同種NK細胞を使用した。エフェクター細胞および標的細胞を、連続希釈した1166/1261またはアイソタイプ対照と一緒に15:1の比率で4時間培養した。その後、上清中のLDHのレベルを測定した。
EasySep(商標)ヒトCD4+CD127低CD25+制御性T細胞分離キット(Stemcell Technologies)を使用した負の選択により、CD4+CD25+CD127低Tregを単離した。標的発現を上方制御するために、αCD3/αCD28 Dynabeads(Gibco)の存在下で、Tregを48時間活性化し、その後標的細胞として使用した。エフェクター細胞として、EasySep(商標)ヒトNK細胞分離キット(Stemcell Technologies)を使用した負の選択を使用してPBMCから単離された同種NK細胞を使用した。エフェクター細胞および標的細胞を、連続希釈した1166/1261またはアイソタイプ対照と一緒に15:1の比率で4時間培養した。その後、上清中のLDHのレベルを測定した。
結果および結論
図35に示されるように、1166/1261には、主なヒトTregにおけるADCCを用量依存的に誘導する能力がある。アイソタイプ対照では効果は見られなかった。
図35に示されるように、1166/1261には、主なヒトTregにおけるADCCを用量依存的に誘導する能力がある。アイソタイプ対照では効果は見られなかった。
実施例33−パイロットカニクイザル傷害研究における1166/1621の評価
概要
カニクイザルで単回投与、用量範囲発見研究を実行した。1166/1261の単回投与後に、初期(CD25+)および後期(CD69+)T細胞の数ならびに増殖中枢記憶(CD197+CD45RA−Ki67+)の増加が見られた。
概要
カニクイザルで単回投与、用量範囲発見研究を実行した。1166/1261の単回投与後に、初期(CD25+)および後期(CD69+)T細胞の数ならびに増殖中枢記憶(CD197+CD45RA−Ki67+)の増加が見られた。
材料および方法
カニクイザルで単回投与、用量範囲発見研究を実行した。用量群は、1匹の雄および1匹の雌からなる。全ての動物が2.5歳以上であった。投与群1〜3は、1時間にわたる静脈内注入として、それぞれ、3、10、または30mg/kgの1166/1261を受けた。投与群4は、30mg/kgの皮下注射を受けた。
カニクイザルで単回投与、用量範囲発見研究を実行した。用量群は、1匹の雄および1匹の雌からなる。全ての動物が2.5歳以上であった。投与群1〜3は、1時間にわたる静脈内注入として、それぞれ、3、10、または30mg/kgの1166/1261を受けた。投与群4は、30mg/kgの皮下注射を受けた。
末梢血の免疫表現型検査のために、投与前(2回)および投与後2日目、8日目、15日目、29日目、および43日目に全血試料を採取した。列挙のためにTruecountチューブ(BD Biosciences)を使用し、染色用の抗体はBD BiosciencesまたはBiolegendから購入した。投与後の試料の倍率差を各個体の2つの投与前の試料の平均と計算することにより、細胞集団の差を比較した。
結果および結論
1166/1261の単回投与を受けたカニクイザルにより、初期(CD69+)および後期(CD25+)T細胞(図36B)の数ならびに増殖中枢記憶(CD197+CD45RA−Ki67+)T細胞(図36A)に対する効果の増加が見られることが実証された。4つの用量群の間に顕著な差は見られなかった。
1166/1261の単回投与を受けたカニクイザルにより、初期(CD69+)および後期(CD25+)T細胞(図36B)の数ならびに増殖中枢記憶(CD197+CD45RA−Ki67+)T細胞(図36A)に対する効果の増加が見られることが実証された。4つの用量群の間に顕著な差は見られなかった。
Claims (46)
- OX40に特異的に結合することができるB1と称される第1の結合ドメインと、CTLA−4に特異的に結合することができるB2と称される第2の結合ドメインとを含む、二重特異性ポリペプチド。
- 前記第1および/または第2の結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合断片が、Fv断片(一本鎖Fv断片、またはジスルフィド結合Fv断片など)、Fab様断片(Fab断片、Fab’断片、またはF(ab)2断片など)、およびドメイン抗体からなる群から選択される、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、二重特異性抗体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- (a)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2が、インタクトなIgG抗体であり、
(b)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2が、Fv断片であり、
(c)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2が、Fab断片であり、かつ/または
(d)結合ドメインB1および/もしくは結合ドメインB2が、単一ドメイン抗体である、請求項4に記載のポリペプチド。 - 前記二重特異性ポリペプチドが、
(a)IgG−scFv二重特異性抗体などの二価の二重特異性抗体(例えば、B1が、インタクトなIgGであり、B2が、IgGの軽鎖のN末端および/もしくはC末端において、かつ/またはIgGの重鎖のN末端および/もしくはC末端においてB1に結合したscFvであるか、あるいはその逆であるもの)、
(b)DuoBody(登録商標)または「ノブ・イン・ホール」二重特異性抗体(例えば、scFv−KIH、scFv−KIHr、BiTE−KIH、もしくはBiTE−KIHrなどの一価の二重特異性抗体、
(c)scFv2−Fc二重特異性抗体(例えば、ADAPTIR(商標)二重特異性抗体)、
(d)BiTE/scFv2二重特異性抗体、
(e)用いられる二価またはリンカー/コネクターにかかわらず、DVD−Ig二重特異性抗体または他のIgG−FAb、FAb−IgG二重特異性抗体、
(f)DART系二重特異性抗体(例えば、DART−Fc、DART2−Fc、またはDART)、
(g)DNL−Fab3二重特異性抗体、ならびに、
(h)scFv−HSA−scFv二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - ヒトFc領域または前記領域の変異型を含み、前記領域が、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4領域、好ましくはIgG1またはIgG4領域である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)、および/またはアポトーシスを誘導することができる、請求項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド。
- B1が、OX40に特異的な抗体またはその抗原結合断片であり、
B2が、CTLA−4に特異的なポリペプチド結合ドメインであり、
i)配列番号3のアミノ酸配列、または
ii)当該結合ドメインが野生型ヒトCD86よりも高い親和性でヒトCTLA−4に結合することを条件に、配列番号3のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも1つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含むかまたはそれからなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドによって特異的に結合される前記CTLA−4が、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのCTLA−4であり、かつ/または前記ポリペプチドによって特異的に結合される前記OX40が、霊長類、好ましくはヒトのOX40である、請求項1〜9のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- B1が、少なくとも1つの重鎖(H)および/または少なくとも1つの軽鎖(L)を含み、B2が、前記少なくとも1つの重鎖(H)または少なくとも1つの軽鎖(L)に結合している、請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- B1が、
−少なくとも1つの重鎖(H)および少なくとも1つの軽鎖(L)を含み、B2が、前記重鎖もしくは前記軽鎖のいずれかに結合しているか、または
−2つの同一の重鎖(H)および2つの同一の軽鎖(L)を含み、B2が、両方の重鎖もしくは両方の軽鎖に結合している、請求項11に記載のポリペプチド。 - N−C方向に書かれている以下の式:
(A)L−(X)n−B2、
(B)B2−(X)n−L、
(C)B2−(X)n−H、
(D)H−(X)n−B2、のうちのいずれか1つに従って配置されたポリペプチドを含むかまたはそれからなり、
式中、Xがリンカーであり、nが0または1である、請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - Xが、アミノ酸配列SGGGGSGGGGS(配列番号47)、SGGGGSGGGGSAP(配列番号48)、NFSQP(配列番号49)、KRTVA(配列番号50)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号144)、またはm=1〜7である(SG)mを有するペプチドである、請求項13に記載のポリペプチド。
- 50×10−10M、25×10−10M、もしくは20×10−10M未満のKdでヒトOX40に結合し、かつ/または60×10−9M、25×10−9M、もしくは10×10−9M未満であるKd値でヒトCTLA−4に結合する、請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- エフェクターT細胞、好ましくはCD4+エフェクターT細胞の活性の増加を誘導し、任意選択的に、前記増加が、前記T細胞に別々の分子として投与されたB1とB2との組み合わせによって誘導されるエフェクターT細胞の活性の増加よりも少なくとも1.5倍、4.5倍、または7倍高い、請求項1〜15のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記T細胞活性における増加が、前記T細胞による増殖の増加、および/またはIL−2産生の増加である、請求項16に記載のポリペプチド。
- OX40への結合について抗体1166/1167と競合し、かつ/またはCTLA−4への結合についてCD86突然変異体1040(配列番号17)と競合する、請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- OX40への結合について抗体1166/1261と競合し、かつ/またはCTLA−4への結合について抗体1166/1261と競合する、請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- B2(ii)の前記アミノ酸配列中の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10個のアミノ酸が、前記配列番号3のアミノ酸配列と比較すると置換されており、任意選択的に、前記配列番号3のアミノ酸配列と比較して挿入または欠失が存在しない、請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記第1の結合ドメインの前記アミノ酸配列中の前記アミノ酸置換のうちの少なくとも1つが122位にあり、任意選択的に、前記アミノ酸配列が、107位、121位、および125位のうちの少なくとも1つで置換されてもいる、請求項20に記載のポリペプチド。
- B2の前記アミノ酸配列が、配列番号6〜24(表Cに示される)のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列、または配列番号6〜24のアミノ酸配列に対して60%を超える、もしくは70%を超える、例えば75もしくは80%、好ましくは85%を超える、例えば90もしくは95%を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型を含むかまたはそれからなる、請求項1〜21のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- B2の前記アミノ酸配列が、配列番号17(表Cに示されるCD86突然変異体1040)のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- B1が、B2とは独立して存在する場合、以下の機能的特徴:
I.10×10−10M未満、より好ましくは5×10−10M未満のKD値でヒトOX40に結合すること、
II.マウスOX40に結合しないこと、および
III.他のヒトTNFRスーパーファミリーメンバー、例えばヒトCD137またはCD40に結合しないこと、のうちの少なくとも1つを呈する、請求項1〜23のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - B1が、
(a)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「G、F、T、F、G/Y/S、G/Y/S、Y/S、Y/S/A」を含む重鎖CDR1配列、
(b)8アミノ酸長であり、コンセンサス配列「I、G/Y/S/T、G/S/Y、S/Y、G/S/Y、G/S/Y、G/S/Y、T」を含む重鎖CDR2配列、
(c)9〜17アミノ酸長であり、コンセンサス配列「A、R、G/Y/S/H、G/Y/F/V/D、G/Y/P/F、−/H/S、−/N/D/H、−/Y/G、−/Y、−/Y、−/W/A/V、−/A/Y、−/D/A/Y/G/H/N、Y/S/W/A/T、L/M/I/F、D、Y」を含む重鎖CDR3配列、
(d)配列「Q、S、I、S、S、Y」からなる軽鎖CDR1配列、
(e)配列「A、A、S」からなる軽鎖CDR2配列、
(f)8〜10アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Q、Q、S/Y/G、−/Y/H/G、−/S/Y/G/D/W、S/Y/G/D、S/Y/G/T、P/L、Y/S/H/L/F、T」を含む軽鎖CDR3配列、から独立して選択されるいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ全ての特徴を含み、
(c)の前記重鎖CDR3配列が、好ましくは、コンセンサス配列「A、R、Y/H、D、Y、A/Y/G、S/W/A、M/L、D、Y」を含む10アミノ酸長の配列であり、
(f)の前記軽鎖CDR3配列が、好ましくは、配列「Q、Q、Y、Y、W、Y、G、L、S、T」からなる、請求項1〜24のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - B1が、表A(1)に示されるVH配列の3つ全ての重鎖CDR配列および/もしくは表A(2)に示されるVL配列の3つ全ての軽鎖CDR配列を含むか、またはB1が、表Bに示される重鎖VH配列および/もしくは軽鎖VL配列を含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- B1が、コンセンサス配列「A、R、Y/H、D、Y、A/Y/G、S/W/A、M/L、D、Y」を含む11アミノ酸長の重鎖CDR3配列と、配列番号89(表Bに示される1167)の軽鎖VL配列とを含み、任意選択的に、配列番号89の軽鎖VL配列が、配列番号125(表Dに示される1261)のより長い配列の一部として存在する、請求項1〜26のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 結合ドメインB1が、前記配列番号89(表Bに示される1167)の軽鎖VL配列、および配列番号91(表Bに示される1166)の重鎖VH配列、または配列番号89および/もしくは配列番号91に対して60%を超える、もしくは70%を超える、例えば75もしくは80%、好ましくは85%を超える、例えば90もしくは95%を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型を含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- B1が、ヒトFc領域または前記領域の変異型を含み、前記領域が、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4領域、好ましくはIgG1またはIgG4領域である、請求項1〜28のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 配列番号125〜134のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、任意選択的に、前記ポリペプチドが、抗体、または配列番号125〜134のアミノ酸配列に対して60%を超える、もしくは70%を超える、例えば75もしくは80%、好ましくは85%を超える、例えば90もしくは95%を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型の構成要素部分として提供される、請求項1〜29のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 配列番号125(表Dに示される1261)のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項1〜30のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 配列番号125のアミノ酸配列および/もしくは配列番号91のアミノ酸配列、または配列番号125および/もしくは配列番号91に対して60%を超える、もしくは70%を超える、例えば75もしくは80%、好ましくは85%を超える、例えば90もしくは95%を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型を含むかまたはそれからなる、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 配列番号125(表Dに示される1261)のアミノ酸配列と、配列番号91(表Bに示される1161)のアミノ酸配列とを含むかまたはそれらからなる、請求項1〜32のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記二重特異性ポリペプチドが、個々の単一特異性の対応するポリペプチドの複合効果と比較して、腫瘍内CD8/Treg比の相乗的増加を誘導することができる、請求項1〜33のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 医薬品として使用するための、請求項1〜34のいずれか1項に記載の二重特異性ポリペプチド。
- 医薬品の製造における、請求項1〜34のいずれか1項に記載の二重特異性ポリペプチドの使用。
- 個体における疾患または症状を治療または予防する方法であって、請求項1〜36のいずれか1項に記載の二重特異性ポリペプチドを個体に投与することを含む、方法。
- 前記疾患または状態が癌であり、任意選択的に、前記個体がヒトである、請求項35に記載の二重特異性ポリペプチドまたは請求項36に記載の使用または請求項37に記載の方法。
- 前記方法が、全身または局所に、例えば腫瘍部位にもしくは腫瘍流入領域リンパ節内に、前記二重特異性ポリペプチドを投与することを含むか、あるいは前記二重特異性ポリペプチドが、全身または局所に、例えば腫瘍部位にもしくは腫瘍流入領域リンパ節内に投与するためのものである、請求項38に記載の二重特異性ポリペプチドまたは使用または方法。
- 前記癌が、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫または膠芽腫である、請求項38または39に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法または使用。
- 前記ポリペプチドが、1つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するためのものである、請求項38〜40のいずれか1項に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法または使用。
- 前記1つ以上の追加の治療剤が、PD−1/PD−L1、CD137、CD40、GITR、LAG3、TIM3、CD27、およびKIRからなる群から選択される標的に結合する免疫療法剤である、請求項41に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法または使用。
- 前記1つ以上の追加の治療剤が、抗PD−1抗体または抗PD−L1抗体などのPD−1またはPD−L1に結合する免疫療法剤である、請求項42に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法または使用。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の二重特異性ポリペプチドの少なくとも1つのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の二重特異性ポリペプチドと、少なくとも1つの薬学的に許容可能な希釈剤または担体とを含む、組成物。
- 追加の治療部分に共役された、請求項1〜34のいずれか1項に記載のポリペプチド。
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