JP2023502725A - Ｔｉｅ－２に対する抗体および使用方法 - Google Patents

Ｔｉｅ－２に対する抗体および使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗Ｔｉｅ２抗体およびそれらを使用する方法に関する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２１日に出願された米国仮出願第６２／９３８，８１６号の優先権の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、抗Ｔｉｅ２抗体およびそれらを使用する方法に関する。
発明の背景
Ｔｉｅ２は、主に内皮細胞の表面上に発現される受容体チロシンキナーゼであり、血管の安定性、生存および成熟において中心的な役割を果たす（Ｓｕｒｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１，ａ Ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＴＩＥ２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｄｕｒｉｎｇ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ ８７（７）：１１７１－８０（非特許文献１））、Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｌｅａｋａｇｅ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（５４４９）：２５１１－１４．（非特許文献２）、Ｓａｈａｒｉｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｈｏｗ Ｄｏ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ Ｔｉｅ ｗｉｔｈ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ？Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（非特許文献３）、Ａｕｇｕｓｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－Ｔｉｅ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（３）：１６５－７７（非特許文献４）、Ｍｉｌａｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｔｈｅ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－Ｔｉｅ２ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｘｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｌｅａｋａｇｅ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ３（１－２）（非特許文献５））。Ｔｉｅ２活性は、アンジオポエチン１～４として知られる少なくとも４つの可溶性タンパク質因子によって厳密に調節される。アンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）およびアンジオポエチン－２（Ａｎｇ２）は、主要なＴｉｅ２機能調節因子であると考えられている。正常な生理学的条件下では、高いＡｎｇ１レベルおよび低いＡｎｇ２レベルは、Ｔｉｅ２シグナル伝達軸の構成的な活性化を維持する。具体的には、Ａｎｇ１アゴニストリガンドはＴｉｅ２受容体に直接結合し、ＰＩ３キナーゼ／ＡｋｔおよびＭＡＰＫ経路の活性化を含むＴｉｅ２クラスタリング、自己リン酸化、および下流シグナル伝達事象をもたらす。
遺伝子標的化実験は、Ａｎｇ／Ｔｉｅシグナル伝達系が、胎仔、出生後および成体マウスにおけるリンパ管および血管の生理学的および病理学的リモデリングに必要であることを示している（Ｅｋｌｕｎｄ Ｌ，Ｋａｎｇａｓ Ｊ，Ｓａｈａｒｉｎｅｎ Ｐ．Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－Ｔｉｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）２０１７；１３１：８７－１０３（非特許文献６））。ヒトにおいて、アンジオポエチンの改変された発現は、多くの血管疾患に関与している（Ｓａｈａｒｉｎｅｎ Ｐ，Ｅｋｌｕｎｄ Ｌ，Ａｌｉｔａｌｏ Ｋ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ＴＩＥ ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１７；１６：６３５－６１（非特許文献７））。
改善された特性を有する抗Ｔｉｅ２抗体、ならびにその治療用途および診断用途に対する必要性が依然として存在する。
Ｓｕｒｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１，ａ Ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＴＩＥ２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｄｕｒｉｎｇ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ ８７（７）：１１７１－８０ Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｌｅａｋａｇｅ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（５４４９）：２５１１－１４． Ｓａｈａｒｉｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｈｏｗ Ｄｏ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ Ｔｉｅ ｗｉｔｈ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ？Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｕｇｕｓｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－Ｔｉｅ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（３）：１６５－７７ Ｍｉｌａｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｔｈｅ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－Ｔｉｅ２ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｘｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｌｅａｋａｇｅ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ３（１－２） Ｅｋｌｕｎｄ Ｌ，Ｋａｎｇａｓ Ｊ，Ｓａｈａｒｉｎｅｎ Ｐ．Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－Ｔｉｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）２０１７；１３１：８７－１０３ Ｓａｈａｒｉｎｅｎ Ｐ，Ｅｋｌｕｎｄ Ｌ，Ａｌｉｔａｌｏ Ｋ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ＴＩＥ ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１７；１６：６３５－６１
本発明は、抗Ｔｉｅ２抗体ならびに治療目的および診断目的でそれらを使用する方法を提供する。本発明の抗Ｔｉｅ２抗体は、それらを療法における使用に特に適したものとする独自の特性を示す。
以下のものが、開示される発明の一部として具体的に企図される。
実施形態１．以下のような３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ１～３）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ Ｌ１～３）を含む、単離された抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片：
Figure 2023502725000002
Figure 2023502725000003
。
実施形態２．単離された抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片であって、
配列番号２４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
配列番号２６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、もしくは
配列番号２７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン
を含む、単離された抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片。
実施形態３．単離された抗Ｔｉｅ２抗体であって、
抗体が、ヒトＴｉｅ２細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合し、
当該エピトープが、
架橋質量分析によって測定される、Ｋａｂａｔ付番などのＥＵ付番によるアミノ酸残基Ｋ３１２、Ｓ３１６、Ｃ３３２、Ｈ３５８、Ｋ３８７、およびＴ３９１
を含む、単離された抗Ｔｉｅ２抗体。
実施形態４．抗体が、Ｔｉｅ２のアロステリック活性化剤である、実施形態１～３に記載の抗体。
実施形態５．抗体が、Ｔｉｅ２の非リガンド競合結合剤である、実施形態１～４に記載の抗体。
実施形態６．抗体が、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルのＴｉｅ２に対して交差反応性である、実施形態３～５に記載の抗体。
実施形態７．当該抗体が、完全ヒト、ヒト化、モノクローナル、またはキメラである、実施形態１～６に記載の抗体。
実施形態８．当該抗体が、単一特異性である、実施形態１～７に記載の抗体。
実施形態９．当該抗体が、多重特異性である、実施形態１～７に記載の抗体。
実施形態１０．多重特異性抗体が、二重特異性である、実施形態９に記載の抗体。
実施形態１１．二重特異性抗体が、
実施形態８に記載のヒトＴｉｅ－２と特異的に結合する１つの結合アームと、
ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦバリアント、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２、Ａｎｇ－３、Ａｎｇ－４、ＰＤＧＦ－β、インターロイキン－１β、ＶＥ－ＰＴＰ、補体因子Ｃ３、インテグリンα５β１、アミロイドベータ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４と特異的に結合する第２の結合アームと
を含む、実施形態１０に記載の抗体。
実施形態１２．多重特異性抗体が、二重パラトピック抗体である、実施形態９に記載の抗体。
実施形態１３．二重パラトピック抗体が、
ヒトＴｉｅ２のＥＣＤ上の第１のエピトープと特異的に結合する一方の結合アームと、
ヒトＴｉｅ２のＥＣＤ上の第２のエピトープに特異的に結合する他方の結合アームと
を含む、実施形態１２に記載の抗体。
実施形態１４．多重特異性抗体が、三価、四価、五価、六価抗体であり、
三価、四価、五価、または六価抗体が、
実施形態８に記載のヒトＴｉｅ２と特異的に結合する少なくとも１つの結合アームと、
ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦバリアント、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２、Ａｎｇ－３、Ａｎｇ－４、ＰＤＧＦ－β、インターロイキン－１β、ＶＥ－ＰＴＰ、補体因子Ｃ３、インテグリンα５β１、アミロイドベータ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４と特異的に結合する他の残りの結合アームと
を含む、実施形態９に記載の抗体。
実施形態１５．当該抗体が、ヒトＴｉｅ２と特異的に結合する抗体断片である、実施形態１～１４に記載の抗体。
実施形態１６．抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片である、実施形態１５に記載の抗体。
実施形態１７．多重特異性抗体が、ポリペプチドリンカーによってともに連結されたｓｃＦｖ抗体断片から構成される、実施形態１６に記載の抗体。
実施形態１８．抗体が、低減されたエフェクター機能を保有する、実施形態１～１７に記載の抗体。
実施形態１９．抗体が、Ｋａｂａｔ付番などのＥＵ付番によるアミノ酸残基Ｎ２９７、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３２９、Ｄ２６５、およびＥ４３０における少なくとも１つの置換変異を含む、実施形態１８に記載の抗体。
実施形態２０．少なくとも１つの置換変異が、Ｋａｂａｔ付番などのＥＵ付番によるアミノ酸残基Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｄ２６５Ａ、およびＥ４３０Ｇからなる群から選択される、実施形態１９に記載の抗体。
実施形態２１．抗体が、残基Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇにおける置換変異を含む、実施形態２０に記載の抗体。
実施形態２２．抗体が、残基Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇにおける置換変異を含む、実施形態２０に記載の抗体。
実施形態２３．抗体が、残基Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇにおける置換変異を含む、実施形態２０に記載の抗体。
実施形態２４．抗体が、残基Ｅ４３０Ｇにおける置換変異をさらに含む、実施形態２１に記載の抗体。
実施形態２５．抗体が、残基Ｅ４３０Ｇにおける置換変異をさらに含む、実施形態２２に記載の抗体。
実施形態２６．抗体が、残基Ｅ４３０Ｇにおける置換変異をさらに含む、実施形態２３に記載の抗体。
実施形態２７．抗体が、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態２５に記載の抗体。
実施形態２８．
配列番号２７６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２７７のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号２７８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２７９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号２８０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２８１のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号２８２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２８３のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号２８６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２８７のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
配列番号２８８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２８９のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施形態２２に記載の抗体。
実施形態２９．
配列番号２８４のアミノ酸配列、または
配列番号２８５のアミノ酸配列
を含む、実施形態１０に記載の抗体。
実施形態３０．実施形態１～２９に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
実施形態３１．実施形態３０に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
実施形態３２．実施形態３１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
実施形態３３．実施形態１～２９に記載の抗体を産生する方法であって、
実施形態３２に記載の宿主細胞を培養培地中で培養することと、
得られた抗体を単離することと
を含む、方法。
実施形態３４．実施形態１～２９に記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
実施形態３５．実施形態１～２９に記載の抗体を含む、融合ポリペプチド。
実施形態３６．実施形態１～２９に記載の抗体、実施形態３４に記載のイムノコンジュゲート、または実施形態３５に記載の融合ポリペプチドを含む、薬学的組成物。
実施形態３７．抗体、イムノコンジュゲート、または融合ポリペプチドが、抗ＶＥＧＦ抗体もしくはＶＥＧＦ細胞外トラップ（ｔｒａｐ）タンパク質と共製剤化された、実施形態３６に記載の薬学的組成物。
実施形態３８．Ｔｉｅ２調節不全疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に実施形態３６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
実施形態３９．Ｔｉｅ２調節不全疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に実施形態３７に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
実施形態４０．抗ＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦ細胞外トラップタンパク質を含む薬学的組成物を対象に共投与することをさらに含む、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４１．Ｔｉｅ２調節不全疾患が、感染症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血性傷害、眼障害、放射線傷害、がん、全身性硬化症、外傷性脳傷害、神経炎症、放射線傷害、創傷治癒、心筋梗塞、血液脳関門損傷、脳海綿状奇形、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはクラークソン病を含む、実施形態３８～４０に記載の方法。
実施形態４２．Ｔｉｅ２調節不全感染症が、敗血症、デングウイルス感染、結核、またはインフルエンザを含む、実施形態３８～４０に記載の方法。
実施形態４３．Ｔｉｅ２調節不全虚血性傷害が、糖尿病性腎症、急性腎傷害、慢性腎臓病、臓器移植、重症下肢虚血、外傷性脳傷害または脳卒中を含む、実施形態３８～４０に記載の方法。
実施形態４４．Ｔｉｅ２調節不全眼障害が、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、または緑内障を含む、実施形態３８～４０に記載の方法。
実施形態４５．実施形態４１～４４に記載のＴｉｅ２調節不全疾患の治療における使用のための、実施形態１～２９に記載の単離された抗Ｔｉｅ２抗体、または実施形態３４に記載のイムノコンジュゲート、または実施形態３５に記載の融合ポリペプチド。
実施形態４６．実施形態１～２９に記載の単離された抗Ｔｉｅ２抗体、または実施形態３４に記載のイムノコンジュゲート、または実施形態３５に記載の融合ポリペプチドの、実施形態４１～４４に記載のＴｉｅ２調節不全疾患を治療するための薬剤の製造のための使用。
図１Ａ～図１Ｃ：抗Ｔｉｅ２抗体は、ウエスタンブロッティングによって決定される、ホスホ－Ｔｉｅ２（ｐＴｉｅ２）、ならびにホスホ－Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）およびホスホ－ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルを増加させる。ＨＵＶＥＣ細胞を血清飢餓状態にし、次いで、ＰＢＳ、Ａｎｇ１（１２ｎＭ）、対照ｈＩｇＧ１（１２ｎＭ）、またはヒト抗Ｔｉｅ２抗体＃１、＃２および＃３、または野生型（ＷＴ）ニワトリ抗Ｔｉｅ２抗体（１２ｎＭ）のいずれかで２０分間処理し、続いて細胞溶解を行った。図１Ａは、抗Ｔｉｅ２抗体を使用してＴｉｅ２を溶解物から免疫沈降させ、ｐＴｉｅ２のレベルを、抗ホスホ－チロシン抗体を用いたウエスタンブロッティングによって決定したことを示す。ｐＡｋｔおよびｐＥＲＫ分析のために、全細胞溶解物中のｐＡｋｔおよび総Ａｋｔ（図１Ｂ）、またはｐＥＲＫおよび総ＥＲＫ（図１Ｃ）のウエスタンブロットを実行した。実施例３を参照されたい。 図１Ａの説明を参照。 図１Ａの説明を参照。 抗Ｔｉｅ２抗体の機能的効力は、インビトロでＡｎｇ１に匹敵する。ＨＵＶＥＣ細胞を血清飢餓状態にし、様々な濃度（ｎＭ）のＡｎｇ１、ヒト抗Ｔｉｅ２抗体＃１、＃２および＃３、またはＷＴニワトリ抗Ｔｉｅ２抗体で処理し、続いて細胞溶解を行った。ｐＡｋｔ特異的抗体または総Ａｋｔ特異的抗体を使用したウエスタンブロットを実行した。ＬＩ－ＣＯＲ走査蛍光計を使用してｐＡｋｔおよび総Ａｋｔシグナル強度を測定し、Ｇｒａｐｈｐａｄ（商標）Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、総Ａｋｔ（ｐＡｋｔ／Ａｋｔ比）に対して正規化されたｐＡｋｔのレベルをＹ軸にプロットし、これを使用してＥＣ５０値を決定した。実施例４を参照されたい。 内皮バリアの簡略化されたインビトロモデルの概略図を示す。実施例５を参照されたい。 抗Ｔｉｅ２抗体は、内皮バリア漏出のインビトロモデルにおいてＶＥＧＦ誘導細胞透過性を低下させることができる。結果は、Ａｎｇ１活性（ＰＢＳ処理細胞に対して正規化される）の％として表す。統計分析（1元配置ＡＮＯＶＡ試験を使用する）のために、各抗体の効果を非特異的ＩｇＧ１対照抗体の効果と比較した。記号の意味：＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊≦０．０００１。実施例５を参照されたい。 図５Ａ～図５Ｆ：飽和量のＡｎｇ２と組み合わせた抗Ｔｉｅ２抗体は、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＴｉｅ２下流シグナル伝達に対して付加的な効果を有する。ＨＵＶＥＣ細胞を血清飢餓状態にし、減少量のＡｎｇ２で処理し、溶解させ、ｐＥＲＫおよび総ＥＲＫのレベルについて分析した。正規化された値をＹ軸にプロットし、Ａｎｇ２の濃度をＸ軸にプロットする（図５Ａ）。画像をＬＩ－ＣＯＲ走査蛍光計を使用して定量し、ｐＥＲＫレベルを総ＥＲＫに対して正規化した。血清飢餓状態にしたＨＵＶＥＣ細胞を、４３ｎＭのＡｎｇ２および１２ｎＭの抗Ｔｉｅ２抗体で２０分間処理した。溶解物をウエスタンブロッティングに供し、画像を、それぞれ、ｐＥＲＫおよびＥＲＫ（図５Ｃ）、ならびにｐＡＫＴおよびＡＫＴ（図５Ｅ）について定量した。ｐＥＲＫ（図５Ｄ）およびｐＡＫＴ（図５Ｆ）のレベルを、それぞれ、総ＥＲＫおよびＡｋｔレベルに対して正規化して、同等のタンパク質負荷のために調整した。実施例６を参照されたい。 図５Ａの説明を参照。 図５Ａの説明を参照。 図５Ａの説明を参照。 図５Ａの説明を参照。 図５Ａの説明を参照。 図６Ａおよび図６Ｂ：抗Ｔｉｅ２抗体は、Ｔｉｅ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合に関して、Ａｎｇ１（図６Ａ）ともＡｎｇ２（図６Ｂ）とも競合しない。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いた代表的な競合結合データを示す。左側パネルは、矢印（１）で示される曝露の開始とともに捕捉バイオセンサー（Ｎｉ－ＮＴＡ）上にＨｉｓタグ付きＴｉｅ２ ＥＣＤタンパク質（１００ｎＭ）を負荷し、続いて矢印（２）で示されるように個々の抗Ｔｉｅ２抗体（１００ｎＭ）を含有する溶液に曝露し、続いて矢印（３）で示されるようにＡｎｇ１（図６Ａ）またはＡｎｇ２リガンド（図６Ｂ）（いずれも１００ｎＭ）を含有する溶液に曝露することを示す。Ｙ軸は、バイオセンサーへの結合の大きさを示し、ｘ軸は経過時間である。実施例７を参照されたい。 抗Ｔｉｅ２抗体は、ＢＬＩ結合評価によるエピトープ認識の多様性を示す。組換えヒトＴｉｅ２ ＥＣＤタンパク質を各バイオセンサーに負荷し、その後、抗Ｔｉｅ２抗体（ｙ軸）を含有する溶液に曝露し、続いて第２の抗Ｔｉｅ２抗体（ｘ軸）に曝露した。第２の抗体への曝露後の全波長シフト（ｎｍ）が、各ボックスに白い数字で注釈されている。黒いボックスは、第２の抗体の結合が欠如している（値＜０．２ｎｍ）ことを示す。結合の欠如は同じ抗体ペアでのみ観察された。これは、このパネルで試験したすべての抗体が、Ｔｉｅ２ ＥＣＤ上に見られる異なるエピトープに結合することを示している。実施例９を参照されたい。 図８Ａおよび図８Ｂ：抗Ｔｉｅ２抗体の全身投与は、血管新生（ＮＶ）を低減するようには見えなかったが（図８Ａ）、酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）モデルにおける血管消失（ｖａｓｏ－ｏｂｌｉｔｅｒａｔｉｏｎ）（ＶＯ）を低減する（図８Ｂ）。各データ点は、一匹の仔（ｐｕｐ）からの平均２つの眼を表す。バーは、平均＋／－ＳＥＭ、Ｎ＝７～８の1元配置ＡＮＯＶＡ、テューキー事後｜＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を表す。実施例１０を参照されたい。 図９Ａおよび図９Ｂ：抗Ｔｉｅ２抗体は、マウスモデルにおけるレーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する。病変部における血管新生および網膜における血管密度の定量を、Ｉｍａｇｅ Ｊによって実施した。Ｐ値をスチューデントｔ検定によって評価した（有意な変化、ｐ＜０．０５）。実施例１１を参照されたい。 図９Ａの説明を参照。 図１０Ａおよび図１０Ｂ：本発明のＴｉｅ２／ＶＥＧＦ二重特異性構築物の概略図。図１０Ａは、２つのＶＥＧＦ ｓｃＦｖ抗体断片にポリペプチドリンカーを介して連結された、抗Ｔｉｅ２抗体の概略図を示す。例示的な構築物は、抗体クローン＃５７および抗体クローン＃５８に具現化される。図１０Ｂは、Ｒ１－Ｄ２およびＲ３－Ｄ３から構成される２つのＶＥＧＦ－トラップタンパク質に連結された、２つの抗Ｔｉｅ２ ｓｃＦｖ抗体断片の概略図を示す。例示的な構築物は、抗体クローン＃５５および＃５６に具体化される。実施例１３を参照されたい。 図１０Ａの説明を参照。 Ｔｉｅ２／ＶＥＧＦ二重特異性構築物のＴｉｅ２アゴニズムをウエスタンブロットによって評価した。使用した対照は、未処理であり、抗Ａｎｇ１抗体（Ａｎｇ１）であった。陽性対照は、抗Ｔｉｅ２抗体クローン＃３または非特異的抗体（ＮＳ）であった。試験二重特異性抗体は、抗Ｔｉｅ２／ＶＥＧＦ二重特異性（抗体クローン＃５４）、または非特異性抗体／ＶＥＧＦ二重特異性（ＮＳ／ＶＥＧＦ）、またはＶＥＧＦ－トラップ／ａＴｉｅ２（抗体クローン＃５５）、またはＶＥＧＦ－トラップ単独であった。実施例３および１４を参照されたい。 図１２Ａ～図１２Ｃ：Ｔｉｅ２に対する価数を増加させるか、または複数のＴｉｅ２エピトープを架橋させるための、本発明の四価および二重パラトピック抗Ｔｉｅ２抗体構築物の概略図。ＩｇＧ重鎖のＣ末端（図１２Ａ）または重鎖のＮ末端（図１２Ｂ）上の抗Ｔｉｅ２ ｓｃＦｖ配列にポリペプチドリンカーを介して連結された、抗Ｔｉｅ２抗体の重鎖および軽鎖の配列を有する、例示的な四価の抗Ｔｉｅ２構築物。第２の異なる抗Ｔｉｅ２抗体クローン（ａＴｉｅ２ Ｆａｂ Ａ）のＩｇＧ重鎖のＣ末端にポリペプチドリンカーを介して連結された、１つの抗体クローン（ａＴｉｅ２ ｓｃＦｖ Ｂ）からの２つの抗Ｔｉｅ２ ｓｃＦｖの配列を有する、例示的な二重パラトピック抗Ｔｉｅ２抗体構築物（図１２Ｃ）。すべての場合において、Ｔｉｅ２結合部位は、ハッチングされたボックスによって示される。実施例１５を参照されたい。 図１２－１の説明を参照。 オリゴマー化を増強し、それによってＴｉｅ２のアゴニズムを増加させるための、本発明の六量体化抗Ｔｉｅ２抗体構築物の概略図。Ｅ４３０ＧのＦｃ変異を保有する抗Ｔｉｅ２抗体の重鎖および軽鎖の配列を有する例示的な六量体化抗Ｔｉｅ２構築物を示す。実施例１５を参照されたい。 本発明の種々の抗Ｔｉｅ２抗体構築物のＴｉｅ２アゴニズムを、ｐＡＫＴ／ｐＥＲＫウエスタンブロットによってすべて評価した。使用した対照は、未処理、抗Ａｎｇ１抗体（Ａｎｇ１）、抗Ｔｉｅ２抗体クローン＃３（ａＴｉｅ２）、または非特異的抗体（ＮＳ）であった。試験抗体構築物は、Ｅ４３０Ｇ Ｆｃ変異を有する六量体化抗Ｔｉｅ２抗体（抗体クローン＃５０）およびその対照、非特異的六量体化抗体（ＮＳ Ｅ４３０Ｇ）、２つの四価抗Ｔｉｅ２抗体構築物（抗体クローン＃５１および＃５２）、ならびに二価抗Ｔｉｅ２抗体クローン＃２であった。実施例３、１４、および１５を参照されたい。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「Ｔｉｅ２」は、アンジオポエチン－１受容体、またはＴＥＫ受容体チロシンキナーゼ、またはＣＤ２０２Ｂ（分化クラスター２０２Ｂ）としても知られており、ヒトにおいてＴＥＫ遺伝子によってコードされるタンパク質である（Ｐａｒｔａｎｅｎ Ｊｅｔ ａｌ．，（Ａｐｒｉｌ １９９２）．Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１２（４）：１６９８－７０７）。この受容体は、３つの免疫グロブリン様ループ、３つの表皮増殖因子様リピート、および３つのフィブロネクチンＩＩＩ型様リピートを含有する独自の細胞外ドメインを保有する（Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ：Ａ Ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：５５２－５８、Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｉｅ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２－Ｔｉｅ２ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３，ｐｐ５２４－５３２（２００６）を参照されたい）。アンジオポエチン－１およびアンジオポエチン－２の接触残基は、Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２複合体の結晶構造の分析によって示唆されるように、Ｔｉｅ－２受容体上でほとんど重複しており、主に第２のＩｇ様ループ内に位置している（Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒ Ｂｉｏｌ ２００６）。他の研究は、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の結合ドメインが類似または同一であるという概念を支持している（Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１ ａｎｄ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２ ｓｈａｒｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｉｅ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ Ｉｇ－ｌｉｋｅ ｌｏｏｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｒｅｐｅａｔｓ．ＪＢＣ．Ｖｏｌ．２７８（３）：１７２１－７（２００３））。例示的なヒトＴｉｅ２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０２７６３（配列番号２４１）に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当該技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」を伴う値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および説明する）。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されるヒト免疫グロブリンフレームワークもしくはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークもしくはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含み得るか、またはアミノ酸配列変化を含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。
本発明の抗体の文脈における「活性な」または「活性」または「生物学的活性」は、例えば、インビトロおよび／もしくはインビボで、その標的の生物学的活性をアゴナイズする（部分的もしくは完全に活性化する）能力である。抗体の生物活性の一例は、その標的に関連する障害の状態、例えば病理において、測定可能な改善を達成する能力である。例えば、抗Ｔｉｅ２抗体に関して、障害は、例えば、ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮）などのＴｉｅ２関連障害であり得る。抗Ｔｉｅ２抗体の活性は、関連する動物モデルまたはヒト臨床試験を用いて、結合アッセイ、活性アッセイ（例えば、ＦＲＥＴベースの活性アッセイ（例えば、Ｈ２－Ｏｐｔ基質を用いて）、または質量分析ベースの活性アッセイもしくはシグナル伝達アッセイ）を含む、インビトロまたはインビボ試験で決定することができる。本発明の抗Ｔｉｅ２抗体の活性は、関連する動物モデルまたはヒト臨床試験を用いて、結合アッセイ、代替経路溶血アッセイ（例えば、代替経路補体活性もしくは活性化の阻害を測定するアッセイ）を含む、インビトロまたはインビボ試験において決定することができる。
用語「Ｔｉｅ２の活性部位」は、Ｔｉｅ２の細胞外ドメインのＩｇ２様ドメイン内にあることが知られている、Ｔｉｅ２上のＡｎｇ１／Ａｎｇ２結合ドメインとして定義される。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で知られる一般的な方法によって測定することができる。
「親和性成熟」抗体は、１つ以上の超可変領域（ＣＤＲ）および／またはフレームワーク領域（ＦＲ）における１つ以上の改変を保有しない親抗体と比較して、そのような改変を有する抗体を指し、そのような改変により、抗原に対する抗体の親和性が改善される。
「Ｔｉｅ２のアロステリック活性化」は、記載されるリガンド結合または活性部位以外でＴｉｅ２の領域と特異的に相互作用するアゴニスト抗Ｔｉｅ２抗体によるＴｉｅ２の活性化であり、その結果、結合によってＴｉｅ２立体構造またはクラスタリングが変化し、受容体の活性が増強される。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、それらが望ましい抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、無傷抗体が結合する抗原と結合する、無傷抗体の一部分を含む無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である残りの「Ｆｃ」断片と、を産生する。Ｆａｂ断片は、重（Ｈ）鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とともに、軽（Ｌ）鎖全体と、からなる。抗体のペプシン処理により、二価抗原結合活性を有する２つのジスルフィド連結Ｆａｂ断片に概ね対応し、かつ依然として抗原を架橋連結することができる単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなるいくつかの残基を有することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の、本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、ヒンジシステインを間に有するＦａｂ’断片のペアとして産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。用語は、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。本明細書で特に指定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されるような、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番システムに従うものである。
「Ｆｖ」は、密接な非共有性会合状態にある１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖それぞれから３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識しそれと結合する能力を有しているが、多くの場合、結合部位全体よりも親和性が低い。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み得る。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
「ダイアボディ」という用語は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間対合が達成されるように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間の短いリンカー（約５～１０残基）でｓＦｖ断片（前段落を参照されたい）を構築することによって調製され、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片をもたらす小抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８，１９９３を参照されたい。
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するか、または低減するものである。特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的または完全に阻害する。
「アゴニスト」または「活性化」抗体は、それが結合する抗原の生物学的またはシグナル伝達活性を活性化させるか、刺激するか、または増加させる抗体である。いくつかの状況では、アゴニスト抗体は、リガンドがその同族受容体と係合し、それを活性化させる方法と同様に作用可能であることが企図される。他の状況では、実施例３に記載されるように、細胞内リン酸化Ｔｉｅ２（ｐＴｉｅ２）、および／またはリン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）、および／またはリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のうちの１つ以上のレベルの増加によって決定されるように、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体がＴｉｅ２シグナル伝達を誘導する場合、それらはアゴニストであることが企図される。さらに、実施例６および７に記載されるように、本発明のアゴニストＴｉｅ２抗体は、内因性活性化（すなわち、Ａｎｇ１）または阻害性（すなわち、Ａｎｇ２）リガンドの存在または不在下で、その標的抗原の下流シグナル伝達を活性化させることもできることがさらに企図される。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、参照抗体と比較して、抗原のアミノ酸残基の重複したセットに接触するか、または競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を５０％以上遮断する抗体を指す。抗原と接触する抗体のアミノ酸残基は、例えば、抗原との複合体中の抗体の結晶構造を決定することによって、または水素／重水素交換を実行することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、抗原から５オングストローム内にある抗体の残基は、抗原と接触すると考えられる。いくつかの実施形態では、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する。本明細書では、例示的な競合アッセイが提供される。
本明細書で使用される「二重パラトピック」という用語は、第１の抗原結合部分および第２の抗原結合部分が同じ抗原上の異なるエピトープに結合する二重特異性抗体を指す。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残部が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、ならびにこれらの一部は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
「補体因子」とは、免疫系の一部である補体カスケードを構成する種々のタンパク質および糖タンパク質を意味し、これは、抗体および食細胞が、微生物および損傷細胞を生物から排除し、炎症を促進し、病原体の細胞膜を攻撃する能力を増強する（補完する）。それは、先天性免疫系の一部である。本明細書で企図される補体因子としては、例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９が挙げられる。
「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
「フレームワーク」または「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＣＤＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。
「全長抗体」、「無傷抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「融合ポリペプチド」という用語は、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域に融合された本発明の抗Ｔｉｅ２抗体を包含する。Ｆｃ領域は、例えば、免疫グロブリンのＣＨ３ドメインを含み得、これは、天然に存在し得るか、または何らかの方法で修飾され得る。かかるＦｃ融合ポリペプチドは、融合されていない対応物よりも高いインビボでの半減期を示すことができる。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。企図されるように、Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であってもよく、または例えば、治療的品質、循環時間、凝集問題の低減などの特定の品質を改善するために改変されてもよい。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、例えば、Ａｎｇ１などのリガンドに融合して融合ポリペプチドのアゴニスト活性を増強する抗Ｔｉｅ２抗体断片を企図する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、例えば、サイトカインに融合して他の所望の生物学を誘発する抗Ｔｉｅ２抗体断片を企図する。
本明細書で使用される場合、「六量体化抗体」は、Ｆｃ領域におけるＥ４３０Ｇ変異の導入が、細胞表面における膜結合抗原への結合時の分子間Ｆｃ－Ｆｃ相互作用の増加による抗体六量体形成の自然プロセスを促進するものである（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４、ｄｅ Ｊｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２０１６）。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３におけるようなサブグループである。一実施形態では、ＶＬについて、サブグループは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．におけるようなサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨについて、サブグループは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．におけるようなサブグループＩＩＩである。
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する配列を最小限に含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基は、所望の抗体特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられる。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含む可能性がある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに向上させるためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むであろう。詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントが抗体間で配列が大きく異なるという事実を指す。可変ドメインまたは「Ｖ」ドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は可変ドメインのスパンにわたって均一には分布していない。その代わり、Ｖ領域は、それぞれが９～１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極可変性のより短い領域によって隔てられている１５～３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸長部からなる。本明細書で使用される場合、「超可変領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、例えば、ＶＬにおいて、およそ（ａｒｏｕｎｄ ａｂｏｕｔ）残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて、およそ残基２６～３５（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）（一実施形態では、Ｈ１は、およそ残基３１～３５である）からのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、かつ／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬにおいて、残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、および９１～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３））（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含む。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲを含み、これらは主にベータシート構成を採用し、ベータシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって近接して一緒に保持され、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。したがって、ＣＤＲおよびＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）における以下の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４内にある。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を示す。
「Ｋａｂａｔ付番などの残基付番」、「Ｋａｂａｔアミノ酸残基」、または「Ｋａｂａｔ付番などのアミノ酸位置付番」という用語、およびこれらの変形例は、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．における抗体のコンパイルの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される付番システムを指す。この付番システムを使用して、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮またはそれへの挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸インサート（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従った残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。Ｋａｂａｔの残基付番は、抗体の配列の、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列との相同性の領域でのアラインメントによって、所与の抗体について決定され得る。
Ｋａｂａｔ付番システムは、一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の残基１～１０７および重鎖の残基１～１１３）について言及する場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。「ＥＵ付番システム」または「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基について言及する場合に使用される（例えば、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に報告されているＥＵインデックス）。「Ｋａｂａｔ付番などのＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基付番を指す。本明細書に別段の記載がない限り、抗体の可変ドメインにおける残基番号についての言及は、Ｋａｂａｔ付番システムによる残基付番を意味する。本明細書に別段の記載がない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号についての言及は、ＥＵ付番システムによる残基付番を意味する。特に示されない限り、ＣＤＲ残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って付番される。
「イムノコンジュゲート」は、小分子薬物（阻害剤もしくは活性化剤）、または細胞傷害剤、例えば、化学療法剤もしくは薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体を含むがこれらに限定されない、細胞死滅または細胞改変活性を送達する１つ以上の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
本明細書に開示される様々な抗体を説明するために使用される場合、「単離された抗体」という用語は、それが発現された細胞もしくは細胞培養物から同定および分離および／または回収された抗体を意味する。その自然環境の汚染成分は、典型的には、ポリペプチドの診断または治療用途を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む可能性がある。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）アプローチによって決定される際、９５％または９９％を超える純度に精製される。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。ある特定の実施形態では、抗体は、（１）スピニングカップ配列決定装置を使用してＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルーまたは銀染色を使用した、非還元もしくは還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質になるまで、精製されるであろう。単離された抗体は、ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内のインサイチュでの抗体を含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、例えば、自然発生の変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、可能なバリアント抗体を除いて、同一であり、かつ／または同じエピトープと結合し、かかるバリアントは一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向性が異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向性である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のうちのすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作製されてもよく、かかる方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法が本明細書に記載される。
「多重特異性抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、ポリエピトープ特異性を有する抗体または抗体断片（すなわち、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープ、または異なる生物学的分子上のそれぞれのエピトープに、結合することができる）を包含する。そのような多重特異性抗体には、全長抗体、２つ以上のＶＬおよびＶＨドメインを有する抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディおよびトリアボディ、共有結合的または非共有結合的に連結された抗体断片が含まれるが、これらに限定されない。「多重エピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「二重の特異性（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」または「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」は、同じまたは異なる標的上の２つの異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。しかしながら、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）とは対照的に、二重の特異性抗体（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、アミノ酸配列が同一である２つの抗原結合アームを有し、各Ｆａｂアームは、２つの抗原を認識することができる。二重の特異性（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は、抗体が単一のＦａｂまたはＩｇＧ分子として２つの異なる抗原と高い親和性で相互作用することを可能にする。一実施形態によれば、ＩｇＧ１形態の多重特異性抗体は、５μＭ～０．００１ｐＭ、３μＭ～０．００１ｐＭ、１μＭ～０．００１ｐＭ、０．５μＭ～０．００１ｐＭ、または０．１μＭ～０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合する。「単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」は、特定の抗原上の１つのエピトープのみに結合する能力を有する抗体を指す。
標的分子への抗体の結合に関して、特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」、または特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」もしくは「に対して特異的である」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と類似の対照分子、例えば、過剰な非標識標的との競合によって決定することができる。この場合、特異的結合は、標識された標的のプローブへの結合が過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合に示される。本明細書で使用される場合、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」、または特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」もしくは「に対して特異的である」という用語は、例えば、１０－４Ｍ以下、代替的に１０－５Ｍ以下、代替的に１０－６Ｍ以下、代替的に１０－７Ｍ以下、代替的に１０－８Ｍ以下、代替的に１０－９Ｍ以下、代替的に１０－１０Ｍ以下、代替的に１０－１１Ｍ以下、代替的に１０－１２Ｍ以下の標的に対するＫＤ、または１０－４Ｍ～１０－６Ｍ、もしくは１０－６Ｍ～１０－１０Ｍ、もしくは１０－７Ｍ～１０－９Ｍの範囲のＫＤを有する分子によって示され得る。当業者によって理解されるように、親和性およびＫＤ値は、逆関係にある。抗原に対する高い親和性は、低いＫＤ値によって測定される。一実施形態において、「特異的結合」という用語は、本発明の抗体などの分子が、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。
「非リガンド競合結合剤」という用語は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ２のいずれかとＴｉｅ２の活性部位について競合せず、一方で、依然としてＡｎｇ１またはＡｎｇ２のいずれかが活性部位で結合することを可能にする、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体である。
「抗体をコードする核酸」は、抗体重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター中のこのような核酸分子を含み、このような核酸分子は、宿主細胞内の１つ以上の位置に存在する。いくつかの実施形態では、核酸は、抗Ｔｉｅ２抗体をコードする。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、連結される別の核酸を増加させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される核酸の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これは、初代形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量において親細胞と完全に同一ではない場合があり得るが、変異を含み得る。当初形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が本明細書に含まれる。
参照ポリペプチド配列に関しての「アミノ酸配列同一性のパーセント（％）」は、最大パーセントの配列同一性を達成するために、必要に応じて、配列をアラインメントし、ギャップを導入した後に、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。
抗体を含むタンパク質は、本質的に無傷の立体構造および生物活性を保持する場合、「安定」であると言われる。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０において概説されている。「改善された安定性」を有する抗体バリアントは、出発参照抗体と比較して、より安定である抗体バリアントを指す。改善された安定性を有する抗体バリアントは、天然抗体の物理的安定性、および／もしくは化学的安定性、および／または生物学的活性を改善する、ならびに／あるいは免疫原性を低下させる目的で特定のアミノ酸残基が改変されている、参照（野生型）抗体のバリアントである。
ある特定の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、Ｔｉｅ２活性が関与する疾患または状態を標的とし、それに干渉する治療剤として使用することができる。また、抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイに供してもよい。そのようなアッセイは、当該技術分野で既知であり、標的抗原および抗体に対する意図される用途に依存する。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ、腫瘍細胞成長阻害アッセイ（例えば、ＷＯ８９／０６６９２に記載されているような）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）、ならびにアゴニスト活性または造血アッセイ（ＷＯ９５／２７０６２を参照されたい）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「三重特異性」という用語は、３つの抗原認識および結合部位を保有する抗体のタイプを指し、そのうちの一部は、Ｔｉｅ２に結合し得る。別の場合では、少なくとも１つの結合アームは、Ｔｉｅ２と特異的に結合し、他の結合部位は、Ｔｉｅ２または目的の別の抗原のいずれかに結合し得る（「二重特異性抗体」に列挙される）。一態様では、そのような三重特異性抗体は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体）を含む。非限定的な例として、本発明の３つの抗体結合断片は、少なくとも１つの抗体結合断片がＴｉｅ２と結合し、残りの抗体結合断片が、例えば、ＶＥＧＦなどの別の抗原と結合するように、三重特異性抗体に組み立てられ得る。Ｒｕｎｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｒｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ － ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｂｉｇ ｔｈｉｎｇ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２４，（５０）（２０１８）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「四重特異性」という用語は、４つの抗原認識および結合部位を保有する抗体のタイプを指し、そのうちの一部は、Ｔｉｅ２に結合し得る。別の場合では、少なくとも１つの結合アームは、Ｔｉｅ２と特異的に結合し、他の結合部位は、Ｔｉｅ２または目的の別の抗原のいずれかに結合し得る（「二重特異性抗体」に列挙される）。一態様では、そのような四重特異性抗体は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体）を含む。非限定的な例として、本発明の４つの抗体結合断片は、２つの抗体結合断片がＴｉｅ２と結合し、他の２つの抗体結合断片が、例えば、ＶＥＧＦなどの別の抗原と結合するように、四重特異性抗体に組み立てられ得る。
本明細書で使用される場合、「五重特異性」という用語は、５つの抗原認識および結合部位を保有する抗体のタイプを指し、そのうちの一部は、Ｔｉｅ２に結合し得る。別の場合では、少なくとも１つの結合アームは、Ｔｉｅ２と特異的に結合し、他の結合部位は、Ｔｉｅ２または目的の別の抗原のいずれかに結合し得る（「二重特異性抗体」に列挙される）。一態様では、そのような五重特異性抗体は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体）を含む。非限定的な例として、本発明の５つの抗体結合断片は、少なくとも１つの抗体結合断片がＴｉｅ２と結合し、他の抗体結合断片が、例えば、ＶＥＧＦなどの別の抗原と結合するように、五重特異性抗体に組み立てられ得る。
本明細書で使用される場合、「六重特異性」という用語は、６つの抗原認識および結合部位を保有する抗体のタイプを指し、そのうちの一部は、Ｔｉｅ２に結合し得る。別の場合では、少なくとも１つの結合アームは、Ｔｉｅ２と特異的に結合し、他の結合部位は、Ｔｉｅ２または目的の別の抗原のいずれかに結合し得る（「二重特異性抗体」に列挙される）。一態様では、そのような六重特異性抗体は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体）を含む。非限定的な例として、本発明の６つの抗体結合断片は、少なくとも１つの抗体結合断片がＴｉｅ２と結合し、他の抗体結合断片が、例えば、ＶＥＧＦなどの別の抗原と結合するように、六重特異性抗体に組み立てられ得る。
本明細書で使用される「ポリペプチドリンカー」は、２つのポリペプチド（例えば、ＶＨドメインとＶＬドメイン、２つのｓｃＦｖ抗体断片、または可変ドメインと細胞外トラップタンパク質、またはｓｃＦｖ抗体断片と細胞外トラップタンパク質）を連結するために使用される、ペプチド結合によって接合される２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。リンカーは、可撓性であっても、硬質／非可撓性であってもよい。かかるリンカーポリペプチドの例は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．９０：６４４４－６４４８（１９９３）、Ｐｏｌｊａｋ ＲＪ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３（１９９４）を参照されたい）。好適な非免疫原性リンカーペプチドの非限定的な例は、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎもしくはＧ４（ＳＧ４）ｎの可撓性ペプチドリンカー、または硬質／非可撓性リンカー（ＥＡＡＡＫ）ｎもしくは（ＸＰ）ｎ（いずれの場合も、「ｎ」は、１～１０、または１～４の数である）、および、かかるリンカーのオリゴマーである。
「Ｔｉｅ２調節不全疾患」は、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体での治療から利益を受けるであろう任意の状態である。本明細書で治療される疾患の非限定的な例としては、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２、Ａｎｇ－３、またはＡｎｇ－４とＴｉｅ２との相互作用の不均衡または破壊に起因する、任意の疾患または障害が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例は、例えば、感染症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血性傷害、眼障害、放射線傷害、がん、全身性硬化症、外傷性脳傷害、放射線傷害、創傷治癒、心筋梗塞、血液脳関門損傷（すなわち、アルツハイマー病もしくは他の神経変性疾患）、神経炎症、脳海綿状奇形、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはクラークソン病を包含し得る。一実施形態では、Ｔｉｅ２調節不全感染症は、敗血症、デングウイルス感染、結核、またはインフルエンザを含む。別の実施形態では、Ｔｉｅ２調節不全疾患は、例えば、糖尿病性腎症、急性腎傷害、慢性腎臓病、腎臓もしくは他の臓器移植、重症下肢虚血、外傷性脳傷害または脳卒中などの虚血性傷害を包含し得る。別の実施形態において、Ｔｉｅ２調節不全眼障害は、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、または緑内障を含み得る。
本明細書で使用される場合、「投与すること」とは、治療薬（例えば、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体をコードする核酸）または組成物（例えば、薬学的組成物、例えば、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体を含む薬学的組成物）の投薬量を、それを必要とする対象に投与する方法を意味する。本明細書に記載の方法で利用される組成物は、例えば、硝子体内（例えば、硝子体内注射によって）、眼内（ｏｃｕｌａｒｌｙ）（例えば、眼内注射（ｏｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって）、眼内（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒｌｙ）（例えば、眼内注射（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって）、皮下または静脈内に投与され得る。本明細書に記載の方法で利用される組成物はまた、全身または局所的に投与され得る。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物または組成物、および治療される状態、疾患、または障害の重症度）に応じて変化し得る。
本明細書で使用される場合、「共投与」は、２つ以上の別個の治療薬（例えば、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体および抗ＶＥＧＦ抗体治療薬もしくは組換えＶＥＧＦ融合タンパク質治療薬）または組成物（例えば、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体薬学的組成物および抗ＶＥＧＦ抗体組成物もしくは組換えＶＥＧＦ融合タンパク質組成物）を、それを必要とする対象に同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）または同時に（ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ）投与することを意味する。
本明細書で使用される場合、「共製剤化」は、必要としている対象に投与される、単一の製剤として組み合わされる、２つ以上の別個の治療薬（例えば、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体および抗ＶＥＧＦ抗体治療薬もしくは組換えＶＥＧＦ融合タンパク質治療薬）または組成物（例えば、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体薬学的組成物および抗ＶＥＧＦ抗体組成物もしくは組換えＶＥＧＦ融合タンパク質組成物）を意味する。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。「対象」は、「患者」であってもよい。
本明細書で使用される場合、「治療」（および「治療する」または「治療すること」）は、治療される個体の自然経過を改変する試みにおける臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過の間に実行され得る。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患または障害の再発の予防、症状の緩和、疾患もしくは障害の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の減少、疾患の進行速度の低減、疾患もしくは障害の状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれる。一部の実施形態では、本発明の抗体は、疾患もしくは障害の発症を遅延させるために、または疾患もしくは障害の進行を遅らせるために使用される。
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は互換的に使用され、すべてのそのような名称は子孫を含む。よって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、移入の数に関係なく、由来する初代対象細胞および培養物を含む。意図的または偶発的な変異のために、すべての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一ではない場合があることも理解される。当初形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。別個の指定が意図される場合、文脈から明らかであろう。
「変異」は、野生型配列などの参照ヌクレオチド配列に対する、ヌクレオチドの欠失、挿入、または置換である。
出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド（例えば、参照抗体もしくはその可変ドメイン／ＣＤＲ）の「バリアント」または「変異体」は、（１）出発または参照ポリペプチドのものとは異なるアミノ酸配列を有し、（２）天然のもしくは人工（人造）変異誘発のいずれかを通じて出発または参照ポリペプチドに由来したポリペプチドである。そのようなバリアントとしては、例えば、本明細書で「アミノ酸残基改変」と呼ばれる、目的のポリペプチドのアミノ酸配列内からの残基の欠失、および／または残基の挿入、および／または残基の置換が挙げられる。したがって、バリアントＣＤＲは、出発または参照ポリペプチド配列（供給源抗体または抗原結合断片のものなど）に関するバリアント配列を含むＣＤＲを指す。アミノ酸残基の改変は、この文脈では、出発または参照ポリペプチド配列（例えば、参照抗体またはその断片の配列）における対応する位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸を指す。最終構築物が所望の機能的特徴を保有することを条件として、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って、最終バリアントまたは変異体構築物に到達し得る。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、ポリペプチドの翻訳後プロセスを改変し得る。
本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ細胞外トラップタンパク質」または「ＶＥＧＦ－トラップ」は、別名アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ－Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ，ＵＳ）として知られている。これは、ＩｇＧ１のＦｃ部分に融合した、ＶＥＧＦ受容体１および２の細胞外成分から得られるリガンド結合要素からなる。これは、高親和性でＶＥＧＦ－ＡならびにＶＥＧＦ－Ｂおよび胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）のすべてのアイソフォームと結合し、本質的に、ＶＥＧＦ－ＡおよびＰｌＧＦリガンドが細胞受容体と結合してそれを活性化させることができなくなるようにする。
「野生型（ＷＴ）」または「参照」配列、つまり参照抗体のＣＤＲもしくは可変ドメインなどの「野生型」または「参照」タンパク質／ポリペプチドの配列は、変異の導入を通じてバリアントポリペプチドが由来する参照配列であってもよい。一般に、所与のタンパク質についての「野生型」配列は、天然において最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、天然に最も一般的に見られるその遺伝子の配列である。変異は、天然プロセスを通じて、または人間が誘導する手段を通じて、「野生型」遺伝子（および故に、該遺伝子がコードするタンパク質）に導入され得る。このようなプロセスの生成物は、元の「野生型」タンパク質もしくは遺伝子の「バリアント」または「変異体」形態である。
「参照抗体」は、本明細書で使用される場合、その抗原結合配列が、本明細書に記載される基準に従って多様化が実行される鋳型配列として機能する抗体またはその断片を指す。抗原結合配列は、一般に、フレームワーク領域を含む、抗体可変領域、少なくとも１個のＣＤＲを含む。
組成物および方法
本発明は、Ｔｉｅ２に結合する新規の抗体、ならびに例えば治療的および診断的用途のためにそれらを作製および使用する方法を提供する。本発明の抗体は、例えば、本明細書に記載されるＴｉｅ２調節不全疾患を含む様々な障害の診断または治療に有用である。
本明細書に記載または参照される技法および手順は、一般によく理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Μ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ，，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）に記載されている広く利用されている方法論など、当業者による従来の方法論を使用して一般的に使用される。
本明細書に記載される本発明の抗Ｔｉｅ２抗体、および本明細書に記載される方法における使用のための任意の抗体は、本明細書に記載される特質のうちのいずれかを単独でまたは組み合わせて有し得る。
ある特定の実施形態において、本明細書で提供する抗Ｔｉｅ２抗体は、約１μＭ、約１００ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０１ｎＭ、または約０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。例えば、いくつかの場合では、本発明で提供する抗体は、約１０ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＴｉｅ２（ｈｕＴｉｅ２）と結合する。いくつかの場合において、本明細書で提供する抗体は、約５ｎＭ以下のＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの場合において、本明細書で提供する抗体は、約２ｎＭ以下のＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。例えば、いくつかの事例では、本抗体は、約２５ｐＭ～約２ｎＭ（例えば、約２５ｐＭ、約５０ｐＭ、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ、約６２５ｐＭ、約６５０ｐＭ、約６７５ｐＭ、約７００ｐＭ、約７２５ｐＭ、約７５０ｐＭ、約７７５ｐＭ、約８００ｐＭ、約８２５ｐＭ、約８５０ｐＭ、約８７５ｐＭ、約９００ｐＭ、約９２５ｐＭ、約９５０ｐＭ、約９７５ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、または約２ｎＭ）のＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、本抗体は、約７５ｐＭ～約６００ｐＭ（例えば、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ）のＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭ～約５００ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭ～約４００ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭ～約３００ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭ～約２００ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭ～約１５０ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭ～約１２５ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約７５ｐＭ～約１００ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約８０ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約６０ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。いくつかの事例では、抗体は、約４０ｐＭのＫＤで、ｈｕＴｉｅ２と結合する。
一実施形態では、ＫＤは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施形態では、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョンとその抗原とで実行される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の段階用量シリーズの存在下で、Ｆａｂを、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化させ、次いで、抗Ｆａｂ抗体でコーティングされたプレートで結合抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９））。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、続いて、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで、室温（約２３℃）で２～５時間ブロッキングする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）において、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの連続希釈液と混合する（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３－４５９９（１９９７）を参照されたい）。次いで、対象となるＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションは、平衡に達することを確実にするために、より長期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温でインキュベートする（例えば、１時間）。次いで、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））で８回洗浄した。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加して、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で１０分間カウントする。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度は、競合結合アッセイにおける使用のために選択される。
別の実施形態によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを用いて測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用するアッセイは、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて実行される。一実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。抗原を、ｐＨ４．８の１０ｍＭの酢酸ナトリウムで５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流量で注入して、カップリングタンパク質の約１０応答単位（ＲＵ）を達成する。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基をブロッキングする。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、約２５μｌ／分の流速で、２５℃で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標）－２０）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオンレートが１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、オンレートは、攪拌キュベットを有するストップフロー搭載分光計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される増加濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する蛍光クエンチング技術を用いて決定することができる。ＫＤはまた、当該技術分野で知られているＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲアッセイを使用して測定されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、ＷＯ９３／１６１８５、および米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ， Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい）。
抗体断片は、本明細書に記載されるように、無傷抗体のタンパク質分解消化、および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない、種々の技法によって作製することができる。
いくつかの場合において、本明細書で提供される本発明の抗Ｔｉｅ２抗体は、Ｆａｂである。
いくつかの事例では、Ｆａｂは、Ｔｉｅ２に結合し、（ａ）配列番号１～４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号４１～８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号８１～１２０のうちのいうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号１２１～１６０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１６１～２００のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号２０１～２４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＣＤＲ、または、上記ＣＤＲのうちの１つ以上と、配列番号１～２４０のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性）を有する１つ以上のそのバリアントとの組み合わせを含んでもよい。
いくつかの事例では、Ｆａｂは、Ｔｉｅ２に結合し、以下の抗体クローンとしての、配列番号のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３を含む。
Figure 2023502725000004
Figure 2023502725000005
いくつかの事例では、Ｆａｂは、Ｔｉｅ２に結合し、（ａ）配列番号２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、もしくは２７２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有するか、またはその配列を１００％有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号２４２、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、もしくは２７３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有するか、またはその配列を１００％有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、を含む。
いくつかの事例では、Ｆａｂは、Ｔｉｅ２に結合し、以下の組み合わせでアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。
Figure 2023502725000006
ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）を参照されたい。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変ドメイン）およびヒト定常ドメインを含む。さらなる実施例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するようにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むであろう。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復させるかまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体およびそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）で概説されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号および同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを説明する）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ」を説明する）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を説明する）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「ガイド付き選択」アプローチについて説明する）に記載されている。
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、「最良適合」方法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）、およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、概して、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４ （２００１）、およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有する。そのようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、概して不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号、ＨＵＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ－Ｍマウス（商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号、およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号、ならびにＯｍｎｉＣｈｉｃｋｅｎ（商標）技術を記載する米国特許第９，８０９，６４２号および同第９，３８０，７６９号も参照されたい）。かかる動物によって生成された無傷抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに修飾されてもよい。
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒト異種骨髄腫の細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）を参照されたい。追加の方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を説明する）およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを説明する）に記載されている方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ， Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）、およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。そのような可変ドメイン配列は、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
本発明の抗体は、所望の活性を有する抗体について組み合わせライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特徴を保有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００１）に概説され、さらに、例えば、ｔｈｅ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）、Ｌｅｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）に記載されている。
特定のファージディスプレイ方法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングされ、ファージライブラリ内でランダムに組換えられ、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されるような抗原結合ファージについてスクリーニングされる。ファージは典型的には、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫化された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。代替的に、天然のレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）に記載されるように、免疫化することなく、広範囲の非自己抗原および自己抗原に対する単一の抗体供給源を提供することができる。最後に、天然のライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞から再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、非常に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を達成することによって合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリを記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号および同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体は、例えば、いくつかの例を挙げると、二重特異性抗体、二重パラトピック抗体、三重特異性抗体、四価抗体、五価抗体、六価抗体などの多重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、Ｔｉｅ２の２つ以上の異なるエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態において、結合特異性のうちの１つはＴｉｅ２に対するものであり、他方は、例えば、ＶＥＧＦなどの任意の他の抗原に対するものである。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製することができる。本明細書に記載される抗Ｔｉｅ２抗体のうちのいずれも、多重特異性抗体を操作するために使用され得る。
いくつかの事例では、本発明の多重特異性抗Ｔｉｅ２抗体は、一方のアームがＴｉｅ２と結合し、他方のアームがＶＥＧＦと結合する二重特異性抗体である。他の実施形態において、本発明のかかる二重特異性抗Ｔｉｅ２抗体はまた、本明細書に記載されるＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを阻止する（ａｂｒｏｇａｔｅ）Ｆｃ変異を有する。このような本発明の二重特異性抗体は、以下の組み合わせでアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む。
Figure 2023502725000007
他の事例において、本発明の多重特異性抗Ｔｉｅ２抗体は、ＶＥＧＦ細胞外トラップタンパク質と融合されている。さらに他の例では、そのような多重特異性抗Ｔｉｅ２抗体融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを阻止するＦｃ変異も有する。かかる多重特異性抗体融合タンパク質の非限定的な例は、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2023502725000008
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ，Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、ならびに「ノブ・イン・ホール」工学（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照されたい）、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、および、例えばＴｕｔｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって、作製されてもよい。
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
本明細書における抗体または断片はまた、Ｔｉｅ２と、別の異なる抗原と、に結合する抗原結合部位を含む、「二重に作用するＦＡｂ」または「ＤＡＦ」を含む（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照されたい）。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアント（例えば、１つ以上のアミノ酸残基改変を含む抗体バリアント）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製されてもよい。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または残基の挿入、および／または残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を保有することを条件として、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達することができる。
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発のための目的の部位としては、ＣＤＲおよびＦＲが挙げられる。保存的置換が企図され、そのような置換は、当該技術分野で周知である。
他のアミノ酸置換は、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下に記載される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、生成物、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、低減された免疫原性、または改善もしくは低減されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングしてもよい。アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従ってグループ化され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
置換バリアントの１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体もしくはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基および／またはＦＲ残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される、結果として生じるバリアントは、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、増加した安定性、増加した発現、改変されたｐＩ、および／もしくは低下した免疫原性）を有することになり、かつ／または親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持していることになる。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して好都合に生成され得る。簡潔に述べると、１つ以上のＣＤＲ残基が変異し、変異型抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
改変（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するためにＣＤＲ中で行われ得る。かかる改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）、および／または抗原に接触する残基において行われてもよく、得られるバリアントＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリの構築および再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性が、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のうちのいずれかによって成熟のために選択される可変遺伝子に導入される。次に、二次ライブラリが作製される。次いで、ライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）がランダム化される、ＣＤＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３を標的とすることが多い。
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗体の抗原結合能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＣＤＲ内で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）は、ＣＤＲにおいて行われ得る。そのような改変は、例えば、ＣＤＲ内の抗原接触残基以外で行われてもよい。上記に提供されるバリアントＶＨおよびＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＣＤＲは、改変されないか、または１つ、２つもしくは３つ以下のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗体の抗原結合能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＦＲ内で生じてもよい。そのような改変は、例えば、抗体親和性および／または安定性を改善し得る（例えば、融解温度の上昇によって評価される）。
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによってＦｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置でのアミノ酸残基改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。特定の実施形態では、本発明は、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途の望ましい候補となる、すべてではないが一部のエフェクター機能を保有する抗体バリアントを企図する。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認するために、インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。
目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）、およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．、およびＣＹＴＯＴＯＸ９６（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を参照されたい）。かかるアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価してもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑと結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実行してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５－１０５２（２００３）、およびＣｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，１０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期決定は、当該技術分野で既知の方法を使用して実行することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照されたい）。
本発明の抗体は、ヒトＦｃｙＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩおよび／またはＣｌｑ結合に対する低減された親和性により、低減されたエフェクター機能（例えば、低減された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ））で操作され得る。いくつかの事例では、そのような低減されたエフェクター機能は、Ｋａｂａｔ付番などのＥＵ付番による以下のＦｃ領域残基：Ｎ２９７、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５およびＰ３２９のうちの１つ以上のアミノ酸置換によって達成される。Ｕ．Ｓ．６，７３７，０５６、Ｕ．Ｓ．７，３３２，５８１およびＷＯ２０１２／１３０８３１を参照されたい。いくつかの実施形態において、置換変異は、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、および／またはＰ３２９Ｇのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、置換変異は、Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇ置換変異である。いくつかの実施形態において、置換変異は、残基Ｄ２６５およびＮ２９７をアラニンに置換したいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。いくつかの実施形態において、置換変異は、Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇとして置換された残基を有するいわゆる「ＤＡＮＧ」変異を含む。いくつかの実施形態では、置換変異は、残基Ｌ２３４およびＬ２３５をアラニンに置換した「ＬＡＬＡ」Ｆｃ変異体を含む（Ｌｕｎｄ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９，５３－５９、およびＴａｍｍ，Ａ．ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｅ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６，５７－８５を参照されたい）。他の実施形態では、置換変異は、残基Ｌ２３４およびＬ２３５をアラニンに、Ｐ３２９をグリシンに置換した「ＬＡＬＡ－ＰＧ」Ｆｃ変異体を含む（Ｂｒｕｎｋｅｒ， Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒを参照されたい）。
ＦｃＲへの結合が改善または減少したある特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、置換変異は、本明細書に記載の六量体化抗体をもたらすＦｃ領域内で行われる。いくつかの実施形態では、そのような置換変異は、Ｅ４３０Ｇである。他の実施形態では、Ｅ４３０Ｇ変異は、ＣＤＣ機能および／またはＡＤＣＣエフェクター機能を阻止するために、上述した低減されたエフェクター機能変異のうちのいずれかと組み合わせてもよい。一実施形態において、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体は、以下の組み合わせでＥ４３０Ｇ変異およびＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ変異を有するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む。
Figure 2023502725000009
半減期が延長され、母体ＩｇＧの胎児への移入に関与する、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃバリアントとしては、以下のＦｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４（米国特許第７，３７１，８２６号）の置換を有するものが挙げられる。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
本発明はまた、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体などの、１つ以上の細胞傷害剤にコンジュゲートされた本明細書の抗Ｔｉｅ２抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施形態では、イムノコンジュゲートは、抗体が、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号および欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照されたい）、モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号および同第５，７８０，５８８号、および同第７，４９８，２９８号を参照されたい）、ドラスタチン、カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、および同第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）、およびＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８））、ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）、および米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）、メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセルおよびオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、ならびにＣＣ１０６５を含むが、これらに限定されない１つ以上の薬物にコンジュゲートされる抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含むが、これらに限定されない、酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた、本明細書に記載されるような抗体を含む。
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされてラジオコンジュゲートを形成する、本明細書に記載されるような抗体を含む。ラジオコンジュゲートの産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。ラジオコンジュゲートを検出に使用する場合、ラジオコンジュゲートは、シンチグラフィ検査のための放射性原子（例えば、Ｔｃ９９ｍもしくは１１２３）、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像診断（磁気共鳴画像診断、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識（再びヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄など）を含んでよい。
別の実施形態において、イムノコンジュゲートは、非細胞傷害剤、例えば、アルツセナート（ａｒｔｕｓｅｎａｔｅ）などのアルテミシニン、またはカンナビノイド、またはナルトレキソン、またはアスピリン、またはスタチン、またはメトホルミンなどの代謝剤、ドキシサイクリン、および駆虫薬にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体を含む。
抗体および細胞傷害剤または非細胞傷害剤のコンジュゲートは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチル、ＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（トルエン２，６－イソシアネートなど）、およびビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）を参照されたい。炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内の細胞傷害薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Ｃｈａｒｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）。
本明細書におけるイムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、架橋試薬で調製されるかかるコンジュゲートを明示的に企図するが、限定されない。架橋試薬としては、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＴＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびに市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）ＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）が挙げられるが、これらに限定されない。
一態様において、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体は、生物学的試料中のＴｉｅ２の存在の検出に有用である。本明細書で使用される場合、「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含む。ある特定の実施形態において、そのような組織は、他の組織と比較して高いレベルでＴｉｅ２を発現する正常組織および／またはがん組織を含む。
一実施形態において、診断または検出の方法における使用のための抗Ｔｉｅ２抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中のＴｉｅ２の存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、抗Ｔｉｅ２抗体のＴｉｅ２への結合を許容する条件下で、生体試料を、本明細書に記載される抗Ｔｉｅ２抗体と接触させることと、複合体が抗Ｔｉｅ２抗体とＴｉｅ２との間に形成されるかどうかを検出することと、を含む。かかる方法は、インビトロまたはインビボ法であってよい。一実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、抗Ｔｉｅ２抗体による療法の対象となる対象を選択するために使用され、例えば、Ｔｉｅ２は、患者の選択のためのバイオマーカーである。
本明細書に記載の抗体（例えば、抗Ｔｉｅ２抗体）のうちのいずれかは、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように、組換え方法および組成物を用いて産生され得る。一実施形態では、本明細書に記載の抗Ｔｉｅ２抗体をコードする、単離された核酸が提供される。かかる核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてよい。さらなる実施形態では、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態では、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする第２のベクターを含む（例えば、それで形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球様細胞（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗Ｔｉｅ２抗体を作製する方法が提供され、本方法は、上記で提供した抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意選択的に、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することと、を含む。
抗Ｔｉｅ２抗体の組換え産生のために、例えば、上述のように、抗体をコードする核酸を単離し、１つ以上のベクターに挿入して、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現を行う。かかる核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定することができる。
抗体コードベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載される原核または真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌において産生され得る。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、および同第５，８４０，５２３号を参照されたい。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体断片の発現について記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５－２５４を参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製されることができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌および酵母株を含む抗体コードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。特にツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞へのトランスフェクションのために、昆虫細胞と併用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物は、宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、および同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する）を参照されたい。
脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ， Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるような２９３もしくは２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるようなＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））、ならびにＹＯ、ＮＳＯおよびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。
本明細書に提供される抗Ｔｉｅ２抗体は、当該技術分野で既知であり、実施例においておよび本明細書を通じて本明細書に記載される様々なアッセイによって、同定され得、それらの物理的／化学的特性および／もしくは生物学的活性についてスクリーニングするか、または特徴付けることができる。
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））などの既知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
一態様では、抗原結合活性（例えば、ＫＤによって示されるように）は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用するアッセイは、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて実行される。一実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。抗原を、ｐＨ４．８の１０ｍＭの酢酸ナトリウムで５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流量で注入して、カップリングタンパク質の約１０応答単位（ＲＵ）を達成する。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基をブロッキングする。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、約２５μｌ／分の流速で、２５℃で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標）－２０）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオンレートが１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、オンレートは、攪拌キュベットを有するストップフロー搭載分光計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される増加濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭの抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する蛍光クエンチング技術を用いて決定することができる。ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲアッセイを用いて測定してもよい。
別の態様では、競合アッセイを使用して、Ｔｉｅ２への結合に関して本明細書に記載されるような抗体と競合する抗体を同定し得る。ある特定の実施形態において、かかる競合抗体は、本明細書に記載されるような抗体によって結合される同じエピトープ（例えば、直鎖状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）”Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）に提供される。
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＴｉｅ２は、Ｔｉｅ２に結合する第１の標識抗体と、Ｔｉｅ２への結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗体と、を含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化されたＴｉｅ２は、第１の標識された抗体を含むが、第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体のＴｉｅ２への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の非結合抗体を除去し、固定化されたＴｉｅ２に会合する標識の量を測定する。固定化されたＴｉｅ２に会合する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第２の抗体がＴｉｅ２への結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
一態様では、生物活性を有するその抗Ｔｉｅ２抗体を同定するためのアッセイが提供される。実施例のセクションを参照されたい。生物学的活性としては、例えば、Ｔｉｅ２の１つ以上の生物学的活性を活性化させ、アゴナイズし、増加させ、増強させることが挙げられ得る。そのような生物学的活性をインビボおよび／またはインビトロで有する抗体もまた提供される。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、そのような生物活性について試験される。特定の実施形態では、抗Ｔｉｅ２抗体は、Ｔｉｅ２に結合し、例えば、当該技術分野で既知のＨ２－Ｏｐｔ基質、α－カゼイン、β－カゼイン、もしくはＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬカゼイン基質、または任意の他の好適なＴｉｅ２基質を含む、１つ以上のＴｉｅ２基質に対する、そのセリンプロテアーゼ活性を低減または阻害する。ある特定の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、１つ以上のＴｉｅ２基質について、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、８００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、またはそれ以下のＩＣ５０で、Ｔｉｅ２活性を阻害する。
ある特定の実施形態において、標識された抗Ｔｉｅ２抗体が提供される。標識としては、直接検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、電子高密度標識、化学発光標識、および放射性標識）、ならびに例えば、酵素反応もしくは分子相互作用を通じて間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な標識には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ、蛍光体、例えば、レアアースキレートもしくはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅｓ）、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環式オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ（ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼもしくはマイクロペルオキシダーゼなどの、過酸化水素を使用して色素前駆体を酸化させる酵素とカップリングされている）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離基などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の別の実施形態では、抗体は標識される必要はなく、抗体の存在は、例えば、当該技術分野で周知である抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗体などの抗体に結合する標識された抗体を使用して検出することができる。
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの任意の既知のアッセイ方法に使用され得る。Ｚｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７－１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照されたい。
競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合について被験試料分析物質と競合する標識された標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ）の能力に依存する。試験試料中の抗原の量は、抗体に結合するようになる標準物質の量に反比例する。結合することになる標準物質の量を決定するのを容易にするために、抗体は、一般に、競合の前または後に不溶化され、その結果、抗体に結合される標準物質および分析物質（ａｎａｌｙｚｅ）は、依然として結合されていない状態の標準物質および分析物質から好都合に分離することができる。
サンドイッチアッセイは、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープにそれぞれ結合することができる２つの抗体の使用を伴う。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物は、固体支持体上に固定化される第１の抗体によって結合され、その後、第２の抗体が分析物に結合し、したがって、不溶性の三元複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第２の抗体自体は、検出可能な部分で標識されてもよい（直接サンドイッチアッセイ）し、検出可能な部分で標識されている抗免疫グロブリン抗体を使用して測定されてもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合、検出可能な部分は、酵素である。
免疫組織化学のために、試料は、新鮮であっても凍結されていてもよく、あるいはパラフィンに埋め込まれ、例えば、ホルマリン等の保存剤で固定されていてもよい。
薬学的製剤
本発明の抗Ｔｉｅ２抗体もしくは抗体断片またはそのバリアント、または本発明のイムノコンジュゲート、あるいは本明細書に提供されるような抗ＶＥＧＦ抗体もしくは組換えＶＥＧＦ融合タンパク質とのそれらの組み合わせを含む、本発明の融合ポリペプチドの治療用製剤は、所望の純度を有するポリペプチドを、任意選択的な「薬学的に許容される」担体、賦形剤、もしくは安定剤（これらのすべては、「賦形剤」と呼ばれる）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液として保管するために調製され得る。例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、および他の様々な添加剤である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓｏｌ，Ｅｄ．（１９８０）を参照されたい。そのような添加剤は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒でなければならない。
治療的方法および組成物
本発明の抗Ｔｉｅ２抗体および抗体断片、もしくは本発明のイムノコンジュゲート、または本明細書で提供されるような抗ＶＥＧＦ抗体または組換えＶＥＧＦ融合タンパク質とのそれらの組み合わせを含む、本発明の融合ポリペプチドは、本明細書で定義される任意のＴｉｅ２調節不全疾患を含む様々な疾患を治療、予防、および／または緩和するための治療方法で使用され得る。
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上記の一般的な説明を考慮すると、他の様々な実施形態を実施できることが理解される。
実施例１：完全ヒト抗Ｔｉｅ２抗体を単離するためのトランスジェニックニワトリの免疫化
ヒトおよびニワトリＴｉｅ２オーソログの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、マウスとヒトＴｉｅ２オーソログとの間で観察される９０％の同一性とは対照的に、６２％のみ同一であるため、ニワトリを使用してＴｉｅ２抗体を生成することは、抗体がアクセスできるエピトープ範囲を大幅に拡大するであろう。
抗体は、独自のトランスジェニックニワトリであるＯｍｎｉＣｈｉｃｋｅｎ（登録商標）（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を、組換え産生され精製されたヒトＴｉｅ２のＥＣＤで免疫化することによって生成した。ニワトリゲノムからの内因性免疫グロブリンコード遺伝子の欠失およびヒト免疫グロブリンコード遺伝子によるそれらの置き換えを通じて、ＯｍｎｉＣｈｉｃｋｅｎを「ヒト化」し、完全ヒト抗体を産生することができる（米国特許第９，８０９，６４２号および同第９，３８０，７６９号を参照されたい）。
次に、高スループット単一Ｂ細胞スクリーニングおよびクローニングアプローチ、ゲル封入微小環境（ＧＥＭ）技術（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を使用して、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体について数百万個のＢ細胞を迅速にスクリーニングした（米国特許第８，４１５，１７３号および同第８，０３０，０９５号を参照されたい）。ＧＥＭは、１つまたは複数の粒子状レポーターを含有するゲル微小液滴内において、免疫化された動物に由来する、単一抗体を分泌するＢリンパ球を共局在させることを伴う（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ ｅｔ．ａｌ．２０１６）。使用したレポーターは、Ｔｉｅ２抗原（ヒトまたはマウスＴｉｅ２組換えタンパク質のＥＣＤ）でコーティングしたポリスチレンビーズ、および／またはヒトＴｉｅ２を発現する細胞であった。Ｔｉｅ２抗体産生Ｂ細胞をＧＥＭに組み込んだ場合、抗原コーティングされたビーズまたはＴｉｅ２発現細胞への結合を、赤色蛍光二次抗体を使用して検出した。単一Ｂ細胞クローニング技術の使用を通じて、多くの適切に対合された重鎖および軽鎖可変ドメインが見出された。これらの配列を、抗体発現ベクターにクローニングした。特異性の確認および下流アッセイにおける機能活性の評価のために、合計２３６個の組換え抗体を、一過性トランスフェクションを介して発現させた。
実施例２：一次抗体スクリーニング
実施例１で上述したように生成された２３６個の抗体すべてを、ＥＬＩＳＡ法を使用して、組換えヒトＴｉｅ２ ＥＣＤタンパク質への結合について試験した。スクリーニングした抗体の大部分は、ＥＬＩＳＡによって強力な結合剤であることが見出され、多くは低ｐＭ範囲でのＥＣ５０値を有していた。
組換えマウスＴｉｅ２ ＥＣＤタンパク質への結合によるマウスＴｉｅ２への交差反応性を一次スクリーニングとして使用した。これらの結合研究は、生成された抗Ｔｉｅ２抗体の約９０％がマウスとヒトのＴｉｅ２タンパク質間で交差反応性であり、それらが、確立された動物モデルにおけるインビボ試験に好適である可能性があることを実証した。
次に、生細胞の形質膜上のその天然の立体構造において発現されたヒト全長Ｔｉｅ２の認識およびそれへの結合について、スクリーニングを実行した。これらの実験のために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をドナーから入手した。フローサイトメトリーを使用して、ＥＬＩＳＡによってヒトＴｉｅ２ ＥＣＤタンパク質に結合した抗体の約７０％が、細胞上に発現した天然Ｔｉｅ２に結合することもまた実証した［データは示さず］。
実施例３：機能性スクリーニングによって同定されたアゴニスト抗体
次に、上記の実施例２に記載されるようなＨＵＶＥＣ細胞と結合したすべてのＴｉｅ２抗体を、抗体誘導性のリン酸化（活性化）ＥＲＫ（ｐＥＲＫまたはｐ４２／ｐ４４）およびリン酸化（活性）Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）の細胞内レベルを検出するように設計された均質な免疫アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商標））スクリーニングプラットフォームを使用して、アゴニスト特性について試験した。これらはいずれも、Ｔｉｅ２の下流シグナル伝達エフェクターとして知られている。
このスクリーニング方法では、ＨＵＶＥＣ細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、３時間血清飢餓状態にし、次いで１８０ｎＭの濃度でＡｎｇ１（陽性対照）、ｈＩｇＧ１（非特異的ヒトＩｇＧ１陰性対照抗体）または抗Ｔｉｅ２抗体で処理した。２０分間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、ｐＥＲＫおよび総ＥＲＫ、ならびにｐＡｋｔおよび総Ａｋｔの存在について、特異的なＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって、溶解物を分析した。「活性アゴニスト抗Ｔｉｅ２抗体」として指定するためには、抗体クローンは、細胞内ｐＡｋｔおよびｐＥＲＫ（それぞれ総Ａｋｔおよび総ＥＲＫに対して正規化）のレベルの増加によって決定されるように、Ｔｉｅ２シグナル伝達を誘導することが必要であった。ｐＥＲＫおよびｐＡｋｔのレベルの増加を誘導することができた抗体は、Ａｎｇ１処理によって誘導されたｐＥＲＫおよびｐＡｋｔのレベルと比較して、それらの活性に基づいてランク付けした。ｐＥＲＫおよびｐＡｋｔレベルを、Ａｎｇ１処置後に見られたものより７５％以上増加させることができる抗体は、Ａｎｇ１に匹敵するとみなし、さらなる試験のために繰り越した。
一次機能スクリーニングでヒットを同定した後、最も活性の高い抗Ｔｉｅ２抗体からの可変ドメインを、より治療的使用に適した、異なるヒトＩｇＧ骨格上に再フォーマットした。具体的には、すべてのリード候補の可変ドメインを、アミノ酸位置２９７（Ｎ２９７Ａ）にアスパラギンからアラニンへの変異を含む、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃドメインを含有する発現プラスミドにクローニングした。これらの再フォーマットされた抗体のＴｉｅ２アゴニスト活性は、抗体誘導性のホスホ－Ｔｉｅ２（ｐＴｉｅ２）の増加についてのウエスタンブロット分析（図１Ａ）、および前述のｐＥＲＫおよびｐＡｋｔ（図１Ｂおよび１Ｃ）によって確認した。
したがって、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体は、近位および遠位のＴｉｅ２シグナル伝達事象の両方を活性化させることが見出され、さらなる研究に進められた。
実施例４：インビトロでの抗体効力の決定
効力に基づいて本発明の抗Ｔｉｅ２抗体のランク付けを可能にするために、抗体ＥＣ５０値を決定するための高い精度を有するアッセイを開発した。
このアッセイでは、ＨＵＶＥＣ細胞を３時間飢餓状態にし、次いで細胞溶解の前に２０分間、増加濃度のＡｎｇ１、抗Ｔｉｅ２抗体、または陰性対照ｈＩｇＧ１で処理した。次いで、細胞溶解物をウエスタンブロッティングおよび定量的蛍光イメージングに供して、総Ａｋｔに対するｐＡｋｔのレベルを決定し、以下のように分析して、それぞれのＥＣ５０値を決定した。Ａｎｇ１＝０．５４ｎＭ、Ａｂ ＃１＝０．９１ｎＭ、Ａｂ ＃２＝０．４８ｎＭ、Ａｂ ＃３＝０．４５ｎＭ、およびＷＴ＝１．３３ｎＭ。図２を参照されたい。
ＥＣ５０値の分析により、ほとんどの抗体が、同じアッセイにおいてＡｎｇ１の効力に匹敵するナノモル以下の濃度で強力なＴｉｅ２活性化を示したことが明らかになった。総合すると、機能アッセイでは、Ａｎｇ１で見られるレベルに匹敵するレベルまで、Ｔｉｅ２シグナル伝達を誘導する能力を持つ同定された抗Ｔｉｅ２抗体を利用した。
実施例５：抗Ｔｉｅ２抗体は、内皮バリアのインビトロモデルにおいて流体漏出を減少させる
透過性を制御する細胞能力に対する抗Ｔｉｅ２抗体の潜在的な生理学的効果を調査するために、内皮バリアの簡略化されたインビトロモデルを確立した。このモデルは、微小環境におけるＶＥＧＦのレベルの増加によって誘導される生理学的透過性を増強および／または保護するそれらの能力に基づいて、抗体のさらなる特徴付けを可能にした。モデル設定の概略図については、図３を参照されたい。
ＨＵＶＥＣ細胞の無傷のコンフルエント単層を半透膜上で培養して、密着接合部を有する接着構造を形成した。細胞を、Ａｎｇ１または抗Ｔｉｅ２抗体の有無にかかわらず、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで処理した。透過性は、細胞単層を通って膜下の受容（ｒｅｃｅｉｖｅｒ）ウェルに浸透したフルオレセインコンジュゲートデキストランの量を測定することによって、６時間の異なる時点でアッセイした。漏出速度を、受容（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）ウェル内に蓄積したフルオレセイン単位の数として経時的に測定した。ＰＢＳ（陰性対照）とＡｎｇ１（陽性対照）との間の内皮バリア漏出の差を決定した。内皮バリア漏出を減少させる抗Ｔｉｅ２抗体の能力は、同じアッセイにおける効果Ａｎｇ１処置に対して正規化された（％Ａｎｇ１活性）。図４を参照されたい。
統計解析により、抗Ｔｉｅ２抗体は、この初代内皮細胞のマトリックスを介したＶＥＧＦ誘導性流体漏出を有意に低減したが、一方でヒトＩｇＧ１陰性対照は低減しなかったことが明らかになった。したがって、抗Ｔｉｅ２抗体は、生化学アッセイにおいて下流のＴｉｅ２シグナル伝達をいずれも刺激することができ、直交性のインビトロ生理学的アッセイにおいて漏出を低減することもできた。
実施例６：抗Ｔｉｅ２アゴニスト抗体は、高レベルのＡｎｇ２の存在下でＴｉｅ２を活性化させる
糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）に罹患している患者は、Ａｎｇ２の全身および硝子体内レベルの顕著な増加を示す（Ｌｏｕｋｏｖａａｒａ ｅｔ．ａｌ．２０１３ｂ、Ｒｅｇｕｌａ ｅｔ．ａｌ．２０１７）。高レベルのＡｎｇ２が、Ｔｉｅ２上で同様の結合部位を共有することにより抗Ｔｉｅ２抗体活性を妨げる可能性を考慮して、または抗体の結合が、Ｔｉｅ２構造に対するＡｎｇ２のアロステリック効果によって影響を受けるかどうか、飽和濃度のＡｎｇ２の存在下での抗Ｔｉｅ２抗体の機能的特性を決定した。Ａｎｇ２は、Ａｎｇ１の不在下で、インビトロアッセイでシグナル伝達を誘導することができる弱いＴｉｅ２アゴニストとして機能するが、Ａｎｇ１によって達成されることができるよりも低いレベルである（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．２００９）。以下に記載されるインビトロ実験は、これらの発見を裏付けるものであった。
インビトロモデル系におけるＴｉｅ２シグナル伝達時のＡｎｇ２の飽和レベルを決定するために、ＨＵＶＥＣ細胞を３時間飢餓状態にし、増加濃度のＡｎｇ２で処理し、続いて溶解およびウエスタンブロット法によるｐＥＲＫ／Ｅｒｋレベルの分析を行った。図４Ａを参照されたい。定量的蛍光イメージングを使用してブロットを分析し、正規化されたｐＥＲＫのレベルをＡｎｇ２濃度の関数としてプロットした。Ｔｉｅ２シグナル伝達を飽和させるＡｎｇ２の最小濃度は、２．５ｕｇ／ｍＬであると判断された。図５Ｂを参照されたい。その後の実験では、ＨＵＶＥＣ細胞を、細胞溶解ならびにｐＥｒｋ／Ｅｒｋ（図５Ｃおよび５Ｄ）およびｐＡｋｔ／Ａｋｔ（図５Ｅおよび５Ｆ）レベルの分析の前に、２．５ｕｇ／ｍＬ（４３ｎＭ）の濃度のＡｎｇ２および１２ｎＭの濃度の抗Ｔｉｅ２抗体で２０分間共処理した。
これらの実験の結果は、抗Ｔｉｅ２抗体が、高いＡｎｇ２濃度の存在下でも強力なＴｉｅ２経路活性化剤であることを実証した。驚くべきことに、抗Ｔｉｅ２抗体およびＡｎｇ２の両方に曝露された細胞におけるＴｉｅ２活性は、いずれかの処置単独で見られた活性よりも高かった。
実施例７：抗Ｔｉｅ２抗体は、非リガンド競合結合機構を利用する
抗Ｔｉｅ２抗体と、Ｔｉｅ２受容体レベルでのアンジオポエチンとの相互作用をさらに調べるために、組換えタンパク質、および生体分子相互作用を測定するための無標識技術であるバイオレイヤー干渉法技術（ＢＬＩ）を使用して、競合結合アッセイを確立した。
これらの実験では、Ｈｉｓタグ付き組換えＴｉｅ２ ＥＣＤをＮｉ－ＮＴＡバイオセンサー上に捕捉し、続いて、特異的な抗Ｔｉｅ２抗体、次いでＡｎｇ１またはＡｎｇ２に順次曝露して、潜在的な結合競合を評価した。これらの実験では、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２は、抗Ｔｉｅ２抗体と事前複合体化されたＴｉｅ２受容体に結合することができた。図６Ａ～Ｂを参照されたい。したがって、本発明の抗Ｔｉｅ２アゴニスト抗体は、非Ａｎｇ１およびＡｎｇ２リガンド競合様式でＴｉｅ２に結合し、抗Ｔｉｅ２抗体単独よりも高いレベルまで、Ａｎｇ２の存在下でＴｉｅ２シグナル伝達を増強することが見出された。
上記のＴｉｅ２経路シグナル伝達結果と合わせて考慮すると、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体の結合機構を特徴付けるデータは、アンジオポエチンレベルから完全に独立した作用機序を示す。
実施例８：抗Ｔｉｅ２アゴニスト抗体は、他の動物種によって発現されるＴｉｅ２バリアントに対して交差反応性である
マウス、ラット、ウサギ、ブタ、およびカニクイザルのＴｉｅ２オーソログを過剰発現する遺伝子操作細胞株を使用して、前臨床動物モデル種によって発現されるＴｉｅ２オーソログに対する抗Ｔｉｅ２抗体の交差反応性プロファイルを調査した。
簡潔に述べると、各種の完全長Ｔｉｅ２コード配列を含む発現プラスミドを使用して、初代ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ならびにヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞にトランスフェクションした。２週間にわたってトランスフェクタントをピューロマイシン抗生物質で処理することによって安定した細胞集団を選択し、蛍光活性化細胞選別を用いて単一細胞クローンを生成した。これらのＴｉｅ２バリアントの細胞表面発現の確認時に、細胞株を使用して、種々のＴｉｅ２タンパク質上の抗Ｔｉｅ２抗体の見かけのＫｄ（ＥＣ５０）値を決定した。このデータを得るために、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体の交差反応性プロファイルを決定した。細胞を、減少濃度の抗Ｔｉｅ２抗体＃１、＃２、および＃３（１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、および０．１６ｕｇ／ｍＬ）または非特異的ｈＩｇＧ１抗体（１０ｕｇ／ｍＬ）で標識し、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光体（２０ｕｇ／ｍＬ）にコンジュゲートしたウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体で標識した。ＥＣ５０値は、ＦｏｒｅＣｙｔ（商標）ソフトウェアを使用して生成した。表１および２を参照されたい。
Figure 2023502725000010
Figure 2023502725000011
これらの実験は、ヒトおよび前臨床種にわたる抗Ｔｉｅ２抗体の相互反応性結合を実証する。
実施例９：抗Ｔｉｅ２抗体は、ヒトＴｉｅ２上の別個のエピトープを認識する
Ｔｉｅ２抗体パネルのエピトープ範囲の多様性を理解するために、抗Ｔｉｅ２抗体を、ＢＬＩ技術を使用して交差競合について評価した。
組換えヒトＴｉｅ２ ＥＣＤをバイオセンサーに負荷し、次いで抗Ｔｉｅ２抗体（Ｍ１＝マウス抗Ｔｉｅ２ ｍＡｂ、Ａｂ ＃１、Ａｂ ＃３、Ｍ２＝マウス抗Ｔｉｅ２、Ａｂ ＃２、ＷＴ）に曝露して、初期結合を評価する。次に、プローブを第２の抗Ｔｉｅ２抗体に曝露して、第２の結合事象を評価する。正の波長シフトは、第２の抗体が、以前に形成されたＴｉｅ２抗体複合体に結合できることを示し、これらの抗体が異なるエピトープと結合し、Ｔｉｅ２タンパク質への結合について競合しないことを示している。２つの抗Ｔｉｅ２抗体の共結合を示す正の波長シフトは、灰色およびライトグレーで示され、シフト値（ｎｍ）は各セルに埋め込まれている。予想通り、Ｔｉｅ２に予め結合していた抗体は、複合体への同じ抗体の結合を阻止した（黒く陰影の付いた領域）。図７を参照されたい。
これらの実験は、６つの抗Ｔｉｅ２アゴニスト抗体のパネルにわたって、Ｔｉｅ２への結合に関する交差競合が存在しないことを実証し、各候補が受容体上の異なるエピトープを認識することを示した。
実施例１０：酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）マウスモデル
この研究では、４０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ仔を、出生後７日目（Ｐ７）に高酸素チャンバー（７５％Ｏ２）内に５日間収容することにより（ケージごとにｎ＝１０）、網膜の中心部の血管退縮をもたらした。ＣＤ－１養育母体を、チャンバーに入る前および入ってから２～３日後に交代させた。Ｐ１２において、仔を室内空気に戻し、そこでは、相対的な低酸素により異常な血管新生が誘発された。次いでエンドトキシンを含まない１×ＰＢＳビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇ、ＨｕＩｇＧアイソタイプ対照、または１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｔｉｅ２クローン＃３を腹腔内投与した。Ｐ１７において、ナイーブＯＩＲマウスを含むすべての群を安楽死させた。眼を取り出し、４％パラホルムアルデヒドに１時間固定した。
網膜を解剖し、バンデイラエア・シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）（グリフォニア・シンプリシフォリア（（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ））からのローダミン標識レクチン（１：１００）とともに、ＰＢＳ中の１ｍＭ ＣａＣｌ２中で一晩インキュベートして、血管消失（ＶＯ）領域または血管新生（ＮＶ）領域を可視化した。染色された網膜を、スライド上に平らに取り付け、Ｚｅｉｓｓ（登録商標）ＡｘｉｏＳｃａｎ上で画像化した。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ（登録商標）上で画像を分析して、全網膜の％ＶＯまたは％ＮＶを決定した。
図８Ｂに示すように、アイソタイプ対照ｍＡｂまたはビヒクルではなく、抗Ｔｉｅ２ ｍＡｂは、血管消失領域（すなわち、無血管）に有意な正の影響を及ぼすことが見出されたが、ＮＶを減少させるようには見えなかった（図８Ａ）。健全な血管系の再成長の促進は、眼疾患を有する患者における地図状萎縮または毛細血管の欠落などの慢性的な抗ＶＥＧＦ療法の有害な結果を軽減するために有益であり得る。Ｋｉｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．５ Ｆｅｂ １３（２０１９）、Ｍ．Ｙｏｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ３４，１３０８－１３１５（２０１４）、Ｔ．Ｋｕｒｉｈａｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２２，４２１３－４２１７（２０１２）を参照されたい。
実施例１１：レーザー誘導脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）マウスモデル
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週間）を、レーザー処置の前にケタミン／キシラジンカクテルで麻酔した。ＣＮＶ病変は、ダイオードレーザー（ＩＲＩＤＥＸ（登録商標）、Ｏｃｕｌｉｇｈｔ（登録商標）ＧＬ）およびスリットランプ（Ｚｅｉｓｓ（登録商標））を使用したレーザー光凝固によって誘導され、スポットサイズは５０ｕｍ、電力は１８０ｍＷ、曝露時間は１００ｍｓであった。４つのレーザー熱傷は、典型的には、３、６、９、および１２時の位置で、各眼の視神経盤の周りに誘導された。Ｔｉｅ２特異的抗体（クローン＃３）またはアイソタイプ対照抗体または抗マウスＶＥＧＦ対照抗体（Ｂ２０）を、レーザー誘導の１日前に腹腔内注射し（１０ｍｇ／ｋｇ）、３日ごとに合計３回注射した。レーザー誘導の９日後、マウスに、尾静脈を介してＦＩＴＣ－レクチンまたはＴＲＩＴＣ－デキストランを灌流させた。灌流の５分後、眼を取り出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定した。
脈絡膜－強膜複合体および網膜を分離し、抗ＣＤ３１免疫蛍光（ＩＦ）を実行して、網膜および脈絡膜組織の両方の全マウント染色によって血管系を明らかにした。ＣＤ３１ ＩＦについて、ラット抗マウス抗体ＢＤ５５０２７４を１：１００で希釈し、４℃で一晩インキュベートした。二次抗ラット抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１００６）との４時間のインキュベーション後、全マウントを４８８ｎｍで撮像した。図９Ａを参照されたい。病変部における血管新生および網膜における血管密度の定量を、Ｉｍａｇｅ Ｊによって実施した。Ｐ値をスチューデントｔ検定によって評価した（有意な変化、ｐ＜０．０５）。図９Ｂを参照されたい。
図９Ａおよび９Ｂに示されるように、アイソタイプ対照ｍＡｂではなく、抗Ｔｉｅ２抗体は、レーザー損傷後の脈絡膜血管新生病変のサイズを有意に阻害した。この結果は、抗Ｔｉｅ２ ｍＡｂの投与後のＴｉｅ２の活性化が、ＡＭＤまたは糖尿病性網膜症などの眼科障害に罹患しているヒトに顕著な臨床的利益をもたらす可能性を有することを示す。
実施例１２：ストレプトゾトシン誘導（ＳＴＺ）糖尿病マウスモデル
本発明のアゴニストＴｉｅ２抗体の投与は、糖尿病性網膜症、ならびに腎症などの糖尿病に関連する他の病的状態の治療に対する有用性を有し得る。潜在的な治療上の利点を探究するために、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体の影響は、疾患関連エンドポイント、例えば、眼における血管からの漏出、網膜電図によって評価されるような視覚機能、例えば、ＩＬ－１ｂなどの、ヒト疾患に関与すると考えられるサイトカインの産生、および腹腔内経路を介してｍＡｂを投与されたストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウスモデルにおけるタンパク尿によって測定される腎臓機能などについて試験されるであろう。
６～７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの重量を測定し、それらのベースライン血糖を測定することができる（Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｋ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）。マウスに、５日間連続して、ＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を５５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射することができる。齢数が一致している対照には、緩衝剤のみを注入できる。最後のＳＴＺ注射の１週間後に再度血糖を測定することができ、非絶食性血糖が１７ｍＭ（３００ｍｇ／ｄＬ）よりも高い場合、マウスは糖尿病であるとみなされる。次に、ＳＴＺで処理された糖尿病のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスには、ＳＴＺ投与の少なくとも８週間後に、適切な量の本発明の抗Ｔｉｅ２抗体、対照抗体、ビヒクル、または比較抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体または組換えＶＥＧＦ融合タンパク質を、硝子体内（ＩＶＴ）注射することができる。
網膜電位図（ＥＲＧ）は、ＵＴＡＳ－Ｅ視覚電気診断試験システムを使用して網膜細胞の全般的な機能を評価する。一晩暗順応させた後、処理したマウスを、滅菌水中のケタミンおよびキシラジンを含有するカクテルのＢＷの皮下注射で麻酔する。片眼をプロプトーズし（ｐｒｏｐｔｏｓｅｄ）、瞳孔をトロピカミドおよびフェニルエフリンＨＣＬで拡張させる。眼をＧｅｎｔｅａｌ（登録商標）目薬で湿らせ、深部体温を、加熱パッドを使用して維持する。ＥＲＧは、超低インピーダンス銀／ナイロンＤＴＬプラス電極を使用して記録することができる。針電極は、額の中央および尾の基部に配置することができる。金のコンタクトレンズ電極を、ＥＲＧ応答を記録するために使用する。刺激は、例えば、ログステップで電子的に５０ミリ秒点滅することで構成され得る。反応は、閾値未満から飽和までの範囲の刺激から記録される。分析は、ａ波およびｂ波の最大振幅および閾値を含み得る。
視運動追跡（ＯＫＴ）も以下のように記録できる。マウスを、垂直の黒と白の格子（１４°）を表示する同期されたモニター群で囲まれたターンテーブル上に固定することができる。１Ｈｚおよび１０°／秒での周囲スクリーンの正弦波振動を適用して、ＯＫＴを誘導する。右眼の動きを、ＡＮＡ赤外線ＬＥＤ４７による照明下、赤外線感知ＣＣＤカメラで監視する。画像を２００Ｈｚでサンプリングし、瞳孔の中心を計算して、ＭｏｒｉｔａのＧｅｔｅｙｅソフトウェアプログラムを使用して眼の位置を推定する。ＯＫＴは、約３０秒間隔で３０秒間、３回記録することができる。
網膜血管透過性は、以下のように測定することができる。マウスを麻酔し、生理食塩水に溶解されたエバンスブルー色素を尾静脈注射する。尾静脈注射の２時間後、マウスをケタミンおよびキシラジンで麻酔し、生理食塩水を使用して左心室を通して灌流させることができる。灌流後、網膜を解剖し、重量を測定し、７０℃で１８時間ホルムアミド中に置き、エバンスブルー色素を抽出する。翌日、網膜を４５分間遠心分離し、ホルムアミドから取り出す。エバンスブルーの血管外漏出を、Ａ６２０でプレートリーダーを用いて測定する。標準曲線を使用して、ｎｇエバンスブルー／湿潤組織重量の単位に換算する。
標的化トランスクリプトームのための組織収集は、以下のように実行することができる。マウスを麻酔下で屠殺し、両眼を取り出す。次いで、網膜を解剖し、ＲＮＡｌａｔｅｒ内に配置し、処理して、ｑＲＴ－ＰＣＲにより分析する。
実施例１３：二重特異性生物製剤構築物
Ｔｉｅ２およびＶＥＧＦＲ誘導性シグナル伝達経路の両方に同時に影響を与えることは、いずれかの経路を単独で調節することと比較して増強された利益を有する可能性がある。これを達成するために、Ｔｉｅ２およびＶＥＧＦＲの両方に影響を与えるように設計された二重特異性構築物を設計し、発現させ、活性について試験した。図１０Ａは、Ｔｉｅ２結合可変ドメインおよびＶＥＧＦ結合可変ドメインの両方を有する本発明の二重特異性抗体の例示的な概略図を示す。抗体クローン＃５４は、標準的なクローニング技術を利用して設計され、かつ生成され、配列番号２８２および２８３の配列を有する。ＶＥＧＦＲ Ｒ１Ｄ２およびＲ３Ｄ３（ＶＥＧＦトラップタンパク質）およびＴｉｅ２結合ドメインからなる二重特異性構築物も生成され（抗体クローン＃５５）、この構築物は配列番号２８４の配列を有する。上記の実施例３に記載されるように、続いて、抗体誘導性のｐＥＲＫおよびｐＡｋｔの細胞内レベルを検出するように設計されたＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商標）スクリーニングプラットフォームを使用して、ＨＵＶＥＣ細胞内で、それぞれを２０ｎＭ使用して、２つの例示的なａＴｉｅ２／ＶＥＧＦ二重特異性構築物（抗体クローン＃５４および＃５５）についてＴｉｅ２アゴニズムを評価した。
試験したａＴｉｅ２／ＶＥＧＦ二重特異性構築物は、インビトロでＴｉｅ２シグナル伝達を誘導する能力を有することが見出された（図１１）。これらの二重特異性分子は、眼疾患を有する患者に単一の薬物を投与し、ＶＥＧＦ阻害またはＴｉｅ２活性化単剤療法よりも実質的に高い有効性を提供することを可能にし得る。二重特異性分子のＴｉｅ２アゴニスト成分によって提供される健全な血管系の再成長を促進することはまた、分子の抗ＶＥＧＦ成分の潜在的な有害な結果（すなわち、眼疾患を有する患者における地図状萎縮または毛細血管の欠落）を軽減するのに有益であり得る。
実施例１４：価数が増加した抗Ｔｉｅ２抗体および二重パラトピック抗Ｔｉｅ２抗体
３つ以上のＴｉｅ２結合部分を有する抗体、またはＴｉｅ２細胞外ドメイン上の複数のエピトープと結合し得る抗体は、二価の抗Ｔｉｅ２抗体によって可能なよりも大きい程度にインビボでのＴｉｅ２経路の活性化を増強する手段を提供し得る。重鎖のＣ末端（抗体クローン＃５１）または重鎖のＮ末端（抗体クローン＃５２）にポリペプチドリンカーおよびＢ１２ ｓｃＦｖ配列を添加した、抗Ｔｉｅ２抗体クローン＃３の重鎖および軽鎖の配列を有する例示的な四価の抗Ｔｉｅ２構築物を、標準技術を使用して生成した。例示的な概略図については、図１２Ａ～Ｃを参照されたい。
実施例３に記載されるように、四価抗体クローン＃５１および＃５２を、ｐＡｋｔの測定を通じてシグナル伝達を誘導するそれらの能力について評価した。図１４に示すように、クローン＃５１および＃５２の両方は、二価抗Ｔｉｅ２構築物（ａＴｉｅ２）と比較して、またはアンジオポエチン１（Ａｎｇ１）と比較して、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＴｉｅ２シグナル伝達を活性化する能力の向上を示す。したがって、追加のＴｉｅ２結合部分を有する抗Ｔｉｅ２バリアントは、細胞表面上のＴｉｅ２のより高次のオリゴマー化を誘導する手段を提供し得、二価の抗Ｔｉｅ２抗体または天然のアゴニストリガンドＡｎｇ１によって媒介されるアゴニズムのレベルが疾患組織における血管恒常性を回復させるのに適切でない状況下で、治療上の利益を潜在的に提供し得る。
実施例１５：細胞表面上で六量体化する能力を促進するＦｃ変異を有する抗Ｔｉｅ２抗体
重鎖のＦｃドメインに特異的な変異を含有する抗体（すなわち、Ｅ４３０Ｇ）は、細胞表面上に六量体を形成するそれらの能力を増強することが実証されている（Ｍ．Ｏｖｅｒｄｉｊｋ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０２０；１９：２１２６－３８）。Ｅ４３０Ｇ変異を有するＦｃドメインを含む抗Ｔｉｅ２抗体を合成し、４３０位に天然グルタミン酸（Ｅ）を含む、匹敵するＦｃを有する同じ抗Ｔｉｅ２抗体と比較した。そのような六量体化抗Ｔｉｅ２抗体の概略図については、図１３を参照されたい。
実施例３に記載されるように、ｐＡＫＴ／ｐＥＲＫウエスタンブロットを使用して、Ｔｉｅ２アゴニズムを評価した。図１４に示すように、抗Ｔｉｅ２ Ｅ４３０Ｇ構築物（抗体クローン＃５０）は、Ｅ４３０構築物と比較して、ＨＵＶＥＣ細胞においてＴｉｅ２シグナル伝達を誘導する能力の向上を実証した。したがって、細胞表面で六量体化する可能性を増大させる変異を有するＢ１２バリアントは、細胞表面上のＴｉｅ２のより高次のオリゴマー化を誘導する手段となり得、抗Ｔｉｅ２抗体または天然のアゴニストリガンドＡｎｇ１によって媒介されるアゴニズムのレベルが疾患組織における血管恒常性を回復させるのに適切でない状況下で、治療上の利益を潜在的に提供し得る。
実施例１６：ＳＰＲによる抗Ｔｉｅ２抗体のＦａｂ結合親和性の決定
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）は、約１０応答単位（ＲＵ）でカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５）上で固定化されたヒト、ラットまたはマウスＴｉｅ２ ＥＣＤ抗原で、２５℃で行われた。ＣＭ５チップを、供給業者の指示に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させた。すべてのＴｉｅ２ ＥＣＤ抗原を、ｐＨ４．８の１０ｍＭの酢酸ナトリウムで５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流速で注入して、約１０ＲＵのカップリングタンパク質を得た。各Ｔｉｅ２ ＥＣＤを注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングした。動態測定のために、抗体クローン＃３のＦａｂの２倍連続希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、約２５μｌ／分の流速で、２５℃で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標）－２０）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に注入した。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて計算した。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。
以下の表は、試験した各Ｔｉｅ２ ＥＣＤ抗原に対する抗体クローン＃３のＦａｂ結合親和性を示す。
Figure 2023502725000012
前述の本発明は、理解を明確にする目的のために、例示および実施例によって、ある程度詳細に記載されているが、本発明の範囲を限定するものとして、本発明の説明および実施例を解釈すべきではない。本明細書で引用されるすべての特許および科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

Claims (46)

  1. 以下のような３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ１～３）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ Ｌ１～３）を含む、単離された抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片：
    Figure 2023502725000013
    Figure 2023502725000014
    。
  2. 配列番号２４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、
    配列番号２６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、もしくは
    配列番号２７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、および配列番号２７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン
    を含む、単離された抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片。
  3. 単離された抗Ｔｉｅ２抗体であって、
    前記抗体が、ヒトＴｉｅ２細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合し、
    前記エピトープが、
    架橋質量分析によって測定される、Ｋａｂａｔ付番などのＥＵ付番によるアミノ酸残基Ｋ３１２、Ｓ３１６、Ｃ３３２、Ｈ３５８、Ｋ３８７、およびＴ３９１
    を含む、単離された抗Ｔｉｅ２抗体。
  4. Ｔｉｅ２のアロステリック活性化剤である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. Ｔｉｅ２の非リガンド競合結合剤である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルのＴｉｅ２に対して交差反応性である、請求項３～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 完全ヒト、ヒト化、モノクローナル、またはキメラである、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 単一特異性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 多重特異性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記多重特異性抗体が、二重特異性である、請求項９に記載の抗体。
  11. 前記二重特異性抗体が、
    請求項８に記載のヒトＴｉｅ－２と特異的に結合する１つの結合アームと、
    ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦバリアント、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２、Ａｎｇ－３、Ａｎｇ－４、ＰＤＧＦ－β、インターロイキン－１β、ＶＥ－ＰＴＰ、補体因子Ｃ３、インテグリンα５β１、アミロイドベータ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４と特異的に結合する第２の結合アームと
    を含む、請求項１０に記載の抗体。
  12. 前記多重特異性抗体が、二重パラトピック（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）抗体である、請求項９に記載の抗体。
  13. 前記二重パラトピック抗体が、
    ヒトＴｉｅ２のＥＣＤ上の第１のエピトープと特異的に結合する一方の結合アームと、
    ヒトＴｉｅ２の前記ＥＣＤ上の第２のエピトープに特異的に結合する他方の結合アームと
    を含む、請求項１２に記載の抗体。
  14. 前記多重特異性抗体が、三価、四価、五価、六価抗体であり、
    前記三価、四価、五価、または六価抗体が、
    請求項８に記載のヒトＴｉｅ２と特異的に結合する少なくとも１つの結合アームと、
    ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦバリアント、Ａｎｇ－１、Ａｎｇ－２、Ａｎｇ－３、Ａｎｇ－４、ＰＤＧＦ－β、インターロイキン－１β、ＶＥ－ＰＴＰ、補体因子Ｃ３、インテグリンα５β１、アミロイドベータ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４と特異的に結合する他の残りの結合アームと
    を含む、請求項９に記載の抗体。
  15. ヒトＴｉｅ２と特異的に結合する抗体断片である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体。
  16. 前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片である、請求項１５に記載の抗体。
  17. 前記多重特異性抗体が、ポリペプチドリンカーによってともに連結されたｓｃＦｖ抗体断片から構成される、請求項１６に記載の抗体。
  18. 低減されたエフェクター機能を保有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体。
  19. Ｋａｂａｔ付番などのＥＵ付番によるアミノ酸残基Ｎ２９７、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３２９、Ｄ２６５、およびＥ４３０における少なくとも１つの置換変異を含む、請求項１８に記載の抗体。
  20. 前記少なくとも１つの置換変異が、Ｋａｂａｔ付番などのＥＵ付番によるアミノ酸残基Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｄ２６５Ａ、およびＥ４３０Ｇからなる群から選択される、請求項１９に記載の抗体。
  21. 残基Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇにおける前記置換変異を含む、請求項２０に記載の抗体。
  22. 残基Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇにおける前記置換変異を含む、請求項２０に記載の抗体。
  23. 残基Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇにおける前記置換変異を含む、請求項２０に記載の抗体。
  24. 残基Ｅ４３０Ｇにおける前記置換変異をさらに含む、請求項２１に記載の抗体。
  25. 残基Ｅ４３０Ｇにおける前記置換変異をさらに含む、請求項２２に記載の抗体。
  26. 残基Ｅ４３０Ｇにおける前記置換変異をさらに含む、請求項２３に記載の抗体。
  27. 配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２５に記載の抗体。
  28. 配列番号２７６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２７７のアミノ酸配列を含む軽鎖、
    配列番号２７８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２７９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
    配列番号２８０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２８１のアミノ酸配列を含む軽鎖、
    配列番号２８２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２８３のアミノ酸配列を含む軽鎖、
    配列番号２８６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２８７のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
    配列番号２８８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２８９のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項２２に記載の抗体。
  29. 配列番号２８４のアミノ酸配列、または
    配列番号２８５のアミノ酸配列
    を含む、請求項１０に記載の抗体。
  30. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
  31. 請求項３０に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
  32. 請求項３１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  33. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、
    請求項３２に記載の宿主細胞を培養培地中で培養することと、
    得られた抗体を単離することと
    を含む、方法。
  34. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
  35. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の抗体を含む、融合ポリペプチド。
  36. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の抗体、請求項３４に記載のイムノコンジュゲート、または請求項３５に記載の融合ポリペプチドを含む、薬学的組成物。
  37. 前記抗体、前記イムノコンジュゲート、または前記融合ポリペプチドが、抗ＶＥＧＦ抗体もしくはＶＥＧＦ細胞外トラップ（ｔｒａｐ）タンパク質と共製剤化された、請求項３６に記載の薬学的組成物。
  38. Ｔｉｅ２調節不全疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に請求項３６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  39. Ｔｉｅ２調節不全疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に請求項３７に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  40. 抗ＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦ細胞外トラップタンパク質を含む薬学的組成物を前記対象に共投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記Ｔｉｅ２調節不全疾患が、感染症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血性傷害、眼障害、放射線傷害、がん、全身性硬化症、外傷性脳傷害、神経炎症、放射線傷害、創傷治癒、心筋梗塞、血液脳関門損傷、脳海綿状奇形、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはクラークソン病を含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. Ｔｉｅ２調節不全感染症が、敗血症、デングウイルス感染、結核、またはインフルエンザを含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. Ｔｉｅ２調節不全虚血性傷害が、糖尿病性腎症、急性腎傷害、慢性腎臓病、臓器移植、重症下肢虚血、外傷性脳傷害または脳卒中を含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  44. Ｔｉｅ２調節不全眼障害が、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、または緑内障を含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  45. 請求項４１～４４のいずれか一項に記載のＴｉｅ２調節不全疾患の前記治療における使用のための、請求項１～２９のいずれか一項に記載の単離された抗Ｔｉｅ２抗体、または実施形態３４に記載のイムノコンジュゲート、または請求項３５に記載の融合ポリペプチド。
  46. 請求項４１～４４のいずれか一項に記載のＴｉｅ２調節不全疾患を治療するための薬剤の製造のための、請求項１～２９のいずれか一項に記載の単離された抗Ｔｉｅ２抗体、または請求項３４に記載のイムノコンジュゲート、または請求項３５に記載の融合ポリペプチドの、使用。
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