JP2023502674A - 細菌および真菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験のための組成物および方法 - Google Patents
細菌および真菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験のための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、抗菌剤感受性(AST)について迅速かつ同時に細菌を同定し、表現型を試験するためのレポーターアッセイとしてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用するための組成物および方法に関する。本発明は、抗菌剤感受性試験のための複数菌サンプルの多重化および取り扱いの能力を示した戦略を使用する。
Description
発明の分野
本開示は、分子診断の分野に関し、より詳細には、生物学的サンプルからの細菌の抗菌剤感受性の同定および決定に関する。
本開示は、分子診断の分野に関し、より詳細には、生物学的サンプルからの細菌の抗菌剤感受性の同定および決定に関する。
発明の背景
感染性疾患の診断および処置の指標とするために、臨床サンプル中の細菌性病原体の抗菌剤感受性の検出、同定および決定のための開発または迅速かつ簡便な方法が緊急に必要とされている。上記方法を必要とする良い例は、血流感染症(BSI)である。BSIは、北米および欧州の死因の上位7位にランク付けされており、米国では年間推定170万件の敗血症事象があり、年間270,000人が死亡し、年間140億ドルの米国における医療費の一因となっている。指向性抗菌療法までの時間を短縮することで、敗血症患者の罹患率および死亡率が改善されることが示されており、その結果、入院期間(LOS)の短縮および病院費用の削減がもたらされる。より速く感受性の結果が出ると、より迅速な抗菌剤の漸減を可能にし、有害作用の減少および薬物耐性への寄与の減少がもたらされる。したがって、臨床医が最も適切な抗菌療法をより迅速に提供し、患者の転帰を改善することを可能にするBSIにおける迅速な表現型抗菌剤感受性結果を提供するアッセイおよび試験システムの開発が依然として必要とされている。
感染性疾患の診断および処置の指標とするために、臨床サンプル中の細菌性病原体の抗菌剤感受性の検出、同定および決定のための開発または迅速かつ簡便な方法が緊急に必要とされている。上記方法を必要とする良い例は、血流感染症(BSI)である。BSIは、北米および欧州の死因の上位7位にランク付けされており、米国では年間推定170万件の敗血症事象があり、年間270,000人が死亡し、年間140億ドルの米国における医療費の一因となっている。指向性抗菌療法までの時間を短縮することで、敗血症患者の罹患率および死亡率が改善されることが示されており、その結果、入院期間(LOS)の短縮および病院費用の削減がもたらされる。より速く感受性の結果が出ると、より迅速な抗菌剤の漸減を可能にし、有害作用の減少および薬物耐性への寄与の減少がもたらされる。したがって、臨床医が最も適切な抗菌療法をより迅速に提供し、患者の転帰を改善することを可能にするBSIにおける迅速な表現型抗菌剤感受性結果を提供するアッセイおよび試験システムの開発が依然として必要とされている。
血液培養物から見出される少なくとも2つの異なる微生物の存在として定義される、複数菌による血流感染症(BSI)がいっそう報告されており、その割合は全BSI発症の6%~32%に及んでいる。複数菌によるBSIを有する入院患者の死亡率は21%~63%の範囲であり、単一菌感染を有する患者の死亡率の約2倍であった。
従来の抗菌剤感受性試験(AST)は、所与の抗菌剤の存在下で所与の細菌を増殖させることによって実施され、これは液体培養と固体寒天培地の両方で実施し得る。ASTの2つの最も一般的な方法は以下のとおりである。1)微量液体希釈法、および2)ディスク拡散法(別名Kirby-Bauer)。微量液体希釈法は、定量的(最小阻害濃度)結果および定性的(感受性、中間および耐性)結果の両方を提供する。ディスク拡散法は定性的な結果のみを提供する。
微量液体希釈法は、複数の濃度の抗菌剤の存在下で所与の細菌をインキュベートすることによって実施される。インキュベーション後、抗菌剤の各濃度で細菌の増殖/増殖なしが観察される。増殖が観察されない最低濃度は最小発育阻止濃度(MIC)であり、μg/mLの単位を有する。確立されたガイドラインは、特定の細菌群または種について実験的に決定されたMIC値が所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性であると解釈される「ブレイクポイント」を提供する。
ディスク拡散法は、固体寒天培地上に所与の細菌の「細菌叢」を作成し、次いで寒天培地上に単一の抗生物質ディスクを配置することによって実施される。ディスク中の抗生物質は培地中に拡散し、インキュベーション後、ディスクの周りに円形の阻害領域が形成される。領域の直径は、細菌種および抗菌剤に関する情報と共に、病原体が所与の抗菌剤に対して感受性であるか、中間であるか、または耐性であるかを決定するために、参照で確立された直径ブレイクポイントと併せて使用される。
一般に、ASTの結果を解釈するために最も一般的に使用される2つのガイドラインは、以下のものからのガイドラインである。1)臨床検査標準協議会(CLSI)、および2)抗菌剤感受性試験における欧州委員会(EUCAST)。米国はCLSIガイドラインを使用し、欧州の国々はEUCASTガイドラインを使用している。CLSIの最新のバージョンはM100 ED30であり、EUCASTの最新のバージョンはバージョン10である。
発明の概要
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースとする迅速な同定および抗菌剤感受性試験(ID/AST)システムに関し、このシステムは、臨床検査室で使用するための陽性血液培養物から直接、細菌の抗菌剤感受性の迅速な同定および/または決定のためにPCR技術を利用する特定のアッセイパネルのための自動ワークフローをサポートする。このシステムはまた、***症および呼吸器感染症などの他のサンプルタイプからのサンプルを利用および分析する能力を有する。PCRをベースとする迅速な高速ID/ASTシステムにより、機器、消耗品、試薬、およびデータ管理の機能を使用して、試薬を用いたサンプル処理から結果解釈までのワークフローが提供される。標的の同定および抗菌剤感受性の結果は、システムからの出力である。
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースとする迅速な同定および抗菌剤感受性試験(ID/AST)システムに関し、このシステムは、臨床検査室で使用するための陽性血液培養物から直接、細菌の抗菌剤感受性の迅速な同定および/または決定のためにPCR技術を利用する特定のアッセイパネルのための自動ワークフローをサポートする。このシステムはまた、***症および呼吸器感染症などの他のサンプルタイプからのサンプルを利用および分析する能力を有する。PCRをベースとする迅速な高速ID/ASTシステムにより、機器、消耗品、試薬、およびデータ管理の機能を使用して、試薬を用いたサンプル処理から結果解釈までのワークフローが提供される。標的の同定および抗菌剤感受性の結果は、システムからの出力である。
本発明はまた、PCRをベースとする迅速なID/AST血流感染(BSI)パネルに関し、選択された細菌または真菌の迅速な同定のためにPCR技術を利用し、PCRをベースとする迅速なID/ASTシステムに対して表現型抗菌剤感受性試験(AST)を実施するインビトロ診断試験である。PCRをベースとする迅速ID/AST BSIアッセイは、陽性血液培養サンプルに対して直接、前陽性血液培養物に対して、または潜在的に患者血清から直接実施し得る。このアッセイは、菌血症を引き起こし得る特定の病原体の抗菌剤感受性の診断および同定の補助として示される。このパネルは、真菌の可能性を有する最も一般的なBSIグラム陰性およびグラム陽性病原体を分析するように設計されている。ID戦略をTaqMan 5’ヌクレアーゼリアルタイムPCRアッセイと組み合わせた構成により、複数菌サンプル、単菌サンプル、および必要に応じた分離株試験のための最小阻害濃度(MIC)および感受性、中間および耐性(SIR)情報を提供する能力が提供されるはずである。
これらの結果は、他の臨床所見および検査所見と併せて使用されるべきである。陽性血液培養物を処理するための標準的な実験プロトコルに従うべきであり、必要に応じて補足試験のための分離株の利用可能性を確保する。
本発明はまた、インビトロ診断試験であるPCRをベースとする迅速ID/AST表現型スクリーニング試験に関し、単一の薬物、薬物のクラスまたは薬物の組み合わせについての標的病原体または病原体の群の迅速な同定および表現型感受性試験のためにPCR技術を利用する。PCRをベースとする迅速ID/ASTスクリーニングアッセイは、臨床サンプルまたは細菌/真菌分離株から直接実施される。これらのアッセイにより、問題のある薬物耐性病原体の存在が示され、患者および病院における安全性に役に立つ。これらの種類の試験の例は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌(CRE)、カンジダ・アウリス、およびMDR淋菌(Neisseria gonorrhoeae)についてである。
本発明はまた、インビトロ診断試験であるPCRをベースとする迅速ID/AST表現型スクリーニング試験に関し、単一の薬物、薬物のクラスまたは薬物の組み合わせについての標的病原体または病原体の群の迅速な同定および表現型感受性試験のためにPCR技術を利用する。PCRをベースとする迅速ID/ASTスクリーニングアッセイは、臨床サンプルまたは細菌/真菌分離株から直接実施される。これらのアッセイにより、問題のある薬物耐性病原体の存在が示され、患者および病院における安全性に役に立つ。これらの種類の試験の例は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌(CRE)、カンジダ・アウリス、およびMDR淋菌(Neisseria gonorrhoeae)についてである。
したがって、本発明の一態様は、少なくとも1つの抗菌剤または1つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する細菌または真菌の群の抗菌剤感受性を同時に同定および決定するためにレポーターとして定量的リアルタイムPCRアッセイを使用する方法に関する。一実施形態では、細菌または真菌の標的群は、血流感染症(BSI)、胃腸感染症、呼吸器感染症、***症、鼻感染症、直腸感染症または創傷感染症に存在する。一実施形態では、細菌または真菌の群の同定は、細菌または真菌の群に特異的なシグナルを検出することによるものである。一実施形態では、特異的なシグナルは、細菌または真菌の群に由来しない標的遺伝子よりも細菌または真菌の群に由来する標的遺伝子により選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを使用することによって検出される。一実施形態では、標的遺伝子は、rplP、ompA、tuf、rpoB、ddl、ddlA、fdnG、sodA、gyrB、O-抗原アセチラーゼ、ecfX、tusA、CPE、sip、およびnucから選択される。
別の実施形態では、細菌または真菌の群は、分類学上の目を表す。一実施形態では、分類学上の目はエンテロバクター目である。別の実施形態では、細菌または真菌の群は、分類学上の科を含む。一実施形態では、分類学上の科は、腸内細菌科、エルシニア科(Yersiniaceae)、モルガネラ科(Morganellaceae)、または前記科の組み合わせから選択される。さらに別の実施形態では、細菌または真菌の群は、分類学上の属を含む。一実施形態では、分類学上の属は、エンテロコッカス(Enterococcus)、カンジダ(Candida)、シュードモナス(Pseudomonas)、アシネトバクター(Acinetobacter)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、エシェリヒア(Escherichia)、クレブシエラ(Klebsiella)、エンテロバクター(Enterobacter)、サルモネラ(Salmonella)、シトロバクター(Citrobacter)、セラチア(Serratia)、エルシニア(Yersinia)、モルガネラ(Morganella)、プロビデンシア(Providencia)、またはプロテウス(Proteus)から選択される。
別の実施形態では、細菌または真菌の群は、分類学上の種を表す。一実施形態では、分類学上の種は、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)(Efs)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)(Efm)、大腸菌(Escherichia coli)(Eco)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)(kpn)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)(Kox)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)(Ecl)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)(Kae)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)(Cfi)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)(Cko)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)(Mmg)、プロビデンシア・スチュアルティ(Providencia stuartii)(Pst)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)(Pms)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)(Pvs)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)(Cal)、カンジダ・アウリス(Candida auris)(Cau)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(Pae)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)(Abi)、アシネトバクター・ピティー(Acinetobacter pittii)(Api)、アシネトバクター・ノソコマリス(Acinetobacter nosocomialis)(Ano)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(Sau)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)(Sep)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)(Sma)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)(Spn)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)(Sag)、またはストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)(Spy)から選択される。
さらに別の実施形態では、本方法は、細菌もしくは真菌の群からのものではない第2の標的遺伝子よりも標的細菌もしくは真菌の群からのものである第2の標的遺伝子により選択的にハイブリダイズする追加のプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを用いて細菌もしくは真菌の群の同定を検証すること、または抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機構を決定すること、または検証工程と決定工程の両方から選択される工程を更に含む。別の実施形態では、本方法は、細菌または真菌の各群が少なくとも1つの抗菌剤または1つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する、細菌または真菌の1つを超える群の抗菌剤感受性を同時に同定および決定することを更に含む。
別の態様では、本発明は、エンテロバクター目の分類学上の目ではない標的遺伝子よりもエンテロバクター目の分類学上の目である標的遺伝子により選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを使用することによって、抗菌剤または抗菌剤のクラスに対する腸内細菌目の細菌の抗菌剤感受性を同時に同定および決定するためにレポーターとして定量的リアルタイムPCRアッセイを使用する方法に関する。一実施形態では、標的遺伝子は、rplP、gyrB、およびrpoBから選択される。一実施形態では、分類学上のエンテロバクター目ではない標的遺伝子よりも分類学上のエンテロバクター目である標的遺伝子に対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドは、配列番号1~16を含むヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、非腸エンテロバクター目のgyrBよりもエンテロバクター目のgyrBに対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドは、配列番号8~10を含むヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本発明は、生物学的サンプル、すなわち複数菌の生物学的サンプルからの複数の細菌株または真菌株の抗菌剤感受性を同時に同定および決定するために、レポーターとして多重化定量的リアルタイムPCRアッセイを使用する方法に関する。一実施形態では、生物学的サンプルは、全血、血漿、血清、赤血球画分、唾液、脳脊髄液、***、便、尿、鼻腔スワブ、創傷スワブ、皮膚スワブ、直腸スワブ、胆汁、リンパ液、痰、洗浄液、またはそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、生物学的サンプルは、全血、血漿、血清またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、生物学的サンプルは、PCRアッセイを実施する前に培養される。別の実施形態では、生物学的サンプルは細菌または真菌の分離株である。別の実施形態では、複数の細菌株または真菌株は、少なくとも1つの抗菌または抗菌クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する細菌または真菌の少なくとも1つの群にグループ化される。一実施形態では、複数の細菌株または真菌株は、細菌または真菌の1つを超える群にグループ化され、細菌または真菌の各群は、少なくとも1つの抗菌剤または1つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する。
別の実施形態では、複数の細菌株の同定は、それぞれ異なる発光波長を有する蛍光色素で標識された複数の株特異的5’ヌクレアーゼ(TaqMan(登録商標))オリゴヌクレオチドプローブを利用する。一実施形態では、複数の細菌株の同定は、TAGS(Temperature Assisted Generation of Signal)技術を利用する。別の実施形態では、本方法は、複数の細菌株または真菌株の同定を検証する工程、または抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機構を決定する工程、または検証および決定工程の両方から選択される工程を更に含む。
別の態様では、本発明は、定量的PCRアッセイを使用して、抗菌剤または抗菌剤のクラスに対する標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の標的群の感受性、中間および耐性(SIR)情報を同時に同定および決定する方法に関し、標的株または標的群の同定およびSIR情報の決定は、PCRデータに関連する1つ以上の数学的関係から導出される。一実施形態では、数学的関係は、閾値サイクル(Ct)、勾配、シグモイド曲線適合の変曲、絶対蛍光強度(AFI)、またはエンドポイント相対強度(ERI)から選択される。別の実施形態では、数学的関係は、種々の抗菌剤濃度または種々の抗菌剤間の相対的表現であり、ΔCt、2^(ΔCt)、ΔInflection、ΔAFI、またはΔERIから選択される。一実施形態では、数学的関係は、閾値サイクル(Ct)、勾配、シグモイド曲線適合の変曲、絶対蛍光強度(AFI)、またはエンドポイント相対強度(ERI)から選択される数学的関係の組み合わせである。さらに別の実施形態では、数学的関係は、種々の抗菌剤濃度または種々の抗菌剤間の相対的表現の組み合わせであり、ΔCt、2^(ΔCt)、ΔInflection、ΔAFI、またはΔERIから選択される。別の実施形態では、本方法は、標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の標的群の同定を検証する工程、または抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機構を決定する工程から選択される工程、または検証および決定工程の両方を更に含む。別の実施形態では、本方法は、1つを超える標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の1つを超える標的群の抗菌剤感受性を同定および決定することを更に含み、各標的株または標的群は、少なくとも1つの抗菌剤または1つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する。
発明の詳細な説明
定義
開示される方法は、1つ以上のプライマー対を使用してサンプルからの核酸分子遺伝子標的の1つ以上の部分を増幅することを含む、少なくとも1つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される「サンプル」または「生物学的サンプル」は、全血、血漿、血清、赤血球画分、唾液、脳脊髄液、***、便、尿、直腸スワブ、胆汁、リンパ液、痰、洗浄液、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないサンプルを指す。本明細書で使用される「プライマー」は、標的細菌遺伝子に特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下で標的細菌遺伝子からDNA合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。検討されるプライマーは各々、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、それぞれの標的核酸分子内またはそれに隣接する標的にアニーリングする。1つ以上の増幅産物は、標的細菌遺伝子核酸の1つ以上がサンプル中に存在し、その結果、標的細菌遺伝子増幅産物の1つ以上の存在がサンプル中のその細菌株の存在を示すことを条件として生成される。増幅産物は、標的細菌遺伝子の1つ以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含むべきである。本明細書で使用される「プローブ」は、標的細菌遺伝子をコードする核酸配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、および検出工程を含み、サンプルは、サンプル中の細菌株の存在または非存在を検出するために1つ以上の検出可能なプローブと接触する。
定義
開示される方法は、1つ以上のプライマー対を使用してサンプルからの核酸分子遺伝子標的の1つ以上の部分を増幅することを含む、少なくとも1つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される「サンプル」または「生物学的サンプル」は、全血、血漿、血清、赤血球画分、唾液、脳脊髄液、***、便、尿、直腸スワブ、胆汁、リンパ液、痰、洗浄液、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないサンプルを指す。本明細書で使用される「プライマー」は、標的細菌遺伝子に特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下で標的細菌遺伝子からDNA合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。検討されるプライマーは各々、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、それぞれの標的核酸分子内またはそれに隣接する標的にアニーリングする。1つ以上の増幅産物は、標的細菌遺伝子核酸の1つ以上がサンプル中に存在し、その結果、標的細菌遺伝子増幅産物の1つ以上の存在がサンプル中のその細菌株の存在を示すことを条件として生成される。増幅産物は、標的細菌遺伝子の1つ以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含むべきである。本明細書で使用される「プローブ」は、標的細菌遺伝子をコードする核酸配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、および検出工程を含み、サンプルは、サンプル中の細菌株の存在または非存在を検出するために1つ以上の検出可能なプローブと接触する。
本明細書で使用される「増幅する」という用語は、鋳型核酸分子の一方または両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、および増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼ酵素(例えば、Platinum(登録商標)Taq)ならびにポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液および/または補因子(例えば、MgCl2および/またはKCl)の存在が必要である。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドだけでなく、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるDNA合成を「プライミング」することができる修飾オリゴヌクレオチド、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの3’末端が遊離3’-OH基を提供し、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される3’~5’ホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性DNAポリメラーゼによって更に「ヌクレオチド」が結合され得ることを指す。したがって、おそらく意図された機能を除いて、「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「プローブ」の間に基本的な違いはない。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への1つ以上のプローブのアニーリングを指す。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
「5’-3’のヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の5’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの3’末端で開始され、鋳型鎖に沿って5’から3’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・フラバス(Thermus flavus)、サーマス・ルーバー(T.ruber、サーマス・サーモフィルス(T.thermophilus)、サーマス・アクアティスク(T.aquaticus)、サーマス・ラクテウス(T.lacteus)、サーマス・ルベンス(T.rubens)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、およびメタノサーマス・ファービダス(Methanothermus fervidus)から単離されている。それにもかかわらず、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをPCRアッセイに使用することもできる。
「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。
核酸に関して使用される場合の「伸長」または「延長」という用語は、追加のヌクレオチド(または他の類似の分子)が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、典型的には核酸の3’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼなどの生体触媒を組み込むヌクレオチドによって必要に応じて伸長される。
2つ以上の核酸配列の状況における「同一」または「パーセント同一性」という用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの1つを使用して、または目視検査によって測定された最大の一致について、比較またはアラインした場合、同一であるか、または同一のヌクレオチド特定のパーセンテージを有する2つ以上の配列または部分配列を指す。パーセント配列同一性およびパーセント配列類似性を決定するのに適した例示的なアルゴリズムは、BLASTプログラムであり、例えばAltschulら(1990)’’Basic local alignment search tool’’J.Mol.Biol.215:403-410,Gishら(1993)’’Identification of protein coding regions by database similarity search’’Nature Genet.3:266-272,Maddenら(1996)’’Applications of network BLAST server’’Meth.Enzymol.266:131-141,Altschulら(1997)’’Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs’’Nucleic Acids Res.25:3389-3402,およびZhangら(1997)’’PowerBLAST:A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation’’Genome Res.7:649-656に開示されている。
オリゴヌクレオチドの文脈における「改変ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置換される変化を指す。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、C5-メチル-dC、C5-エチル-dC、C5-メチル-dU、C5-エチル-dU、2,6-ジアミノプリン、C5-プロピニル-dC、C5-プロピニル-dU、C7-プロピニル-dA、C7-プロピニル-dG、C5-プロパルギルアミノ-dC、C5-プロパルギルアミノ-dU、C7-プロパルギルアミノ-dA、C7-プロパルギルアミノ-dG、7-デアザ-2-デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、擬似dU、ニトロピロール、ニトロインドール、2’-0-メチルリボーU、2’-0-メチルリボーC、N4-エチル-dC、N6-メチル-dAなどが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の改変ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、または当技術分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する修飾されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度(Tm)を修飾する。さらに説明すると、特定の修飾ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅(例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える)を減少させ、意図する標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、米国特許第6,001,611号明細書に開示されている。
「TAGS」 または「Temperature Assisted Generation of Signal」(米国特許出願公開第2018/0073064号明細書に開示されている)は、熱サイクル中に種々の温度で蛍光データを収集することによって、各蛍光チャネル内の複数の個々の標的の測定を可能にする多重化技術である。結果的に、2つまたは3つの温度チャネルを用いたTAGS多重化は、光チャネルあたりの分解可能なターゲットの数を2倍または3倍にし得る。原則として、この技術は、PCRサイクルあたり1つを超える蛍光リードを収集し得る任意の定量的PCR(qPCR)機器に展開し得る。
「抗菌剤」という用語は、通常は微生物を死滅させることによって、またはその増殖を阻害することによって、微生物感染症を処置するために使用される薬剤または薬物を指す。抗菌剤には、細菌感染症を処置するための抗生物質、真菌感染症を処置するための抗真菌剤、原虫感染症を処置するための抗原虫剤、およびウイルス感染症を処置するための抗ウイルス剤が含まれ得る。抗菌剤は、いくつかの異なる様式で分類され(「抗菌クラス」と呼ばれる)、作用機序による分類(例えば、細胞壁合成の阻害、タンパク質または核酸合成の阻害、細胞膜の破壊)、供給源による分類(例えば、天然源または合成物から)、および化学構造による分類(例えば、β-ラクタム、アミノグリコシド、マクロライド、キノロンなど)が挙げられる。
例として、限定されるものではないが、以下が挙げられる:アリルアミン類、アミジノペニシリン類、アミノシクリトール類、アミノグリコシド類、アンフェニコール類、アンサマイシン類、B-3-グルカンシンターゼ阻害剤類、カルバペネム類、セファロスポリン類、クリシルサイクリン類、環状ポリペプチド類、グリコペプチド類、イミダゾール類、リンコサミド類、リポペプチド類、マクロライド類およびケトリド類、モノバクタム類、ニトロフラントイン類、ニトロイミダゾール類、オキサゾリジノン類、ペニシリン類、ホスホン酸誘導体類、プルロムチリン類、ポリエン類、ポリミキシン類、シュードモン酸類、キノロン類、リミノフェナジン類、ステロイド抗菌剤類、ストレプトグラミン類、スルホンアミド類、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤類、および組み合わせ、スルホン類、テトラサイクリン類およびトリアゾール類。
抗菌性の薬物または薬剤の例としては、ナフチフィン、メシリナム、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、リファンピシン、カスポファンギン、メロペネム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタリン、チゲサイクリン、バシトラシン、バンコマイシン、ミコナゾール、クリンダマイシン、ダプトマイシン、エリスロマイシン、テリスロマイシン、アズトレオナム、ニトロフラントイン、メトロニダゾール、リネゾリド、アンピシリン、ホスホマイシン、レタパムリン、アンホテリシン-B、コリスチン、ムピロシン、シプロフロキサシン、クロファジミン、フシジン酸、キヌプリスチン/ダルホプチン、スルファメトキサゾール、トリメトプリム、ダプゾン、クロルテトラサイクリン、およびフルコナゾールが挙げられるが、これらに限定されない。
「最小阻害濃度」または「MIC」という用語は、生物の成長を阻害するために必要な抗菌剤の最低濃度を指す。古典的な培養に基づく試験では、MICは、増殖培地および種々の濃度の抗菌剤を含むウェルに細菌を添加した場合に決定される。抗菌剤の濃度を各連続ウェルで2倍にし、MICを、インキュベーション期間後に目に見える増殖がない最も低い抗菌剤濃度を有するウェルを同定することによって見出す。「ブレイクポイント」という用語は、ある種の細菌が抗菌剤に対して感受性であるか耐性であるかを定義する、選択された抗菌剤の濃度を指す。MICが感受性ブレイクポイント以下である場合、細菌は抗菌剤に感受性であると考えられる。MICがこの値より大きい場合、細菌は、抗菌剤に対して中間または耐性であると考えられる。
ブレイクポイントは、現代の微生物学実験室の実践の不可欠な部分であり、抗菌剤に対する感受性および耐性を定義するために使用される。試験方法に応じて、濃度(mg/リットルまたはμg/ml)またはゾーン直径(mm)のいずれかとして表される。一般に、全ての感受性試験方法は、解釈基準としても知られているブレイクポイントを必要とするので、試験の結果は、感受性、中間または耐性として解釈され、そのように広範囲の臨床医に報告され得る。「臨床的ブレイクポイント」は、処置が成功する可能性が高い株を、処置が失敗する可能性がより高い細菌から分離する濃度(MIC)を指す。それらの最も単純な形態では、これらのブレイクポイントは、感染病原体のMICを転帰と比較する前向きヒト臨床研究から得られる。
感染性病原体の検出および同定
本開示は、感染性病原体、例えば血流感染の原因となる細菌株を検出する方法を提供する。本方法は、株特異的、種特異的、属特異的、科特異的または目特異的プライマー配列を使用してPCRによって標的遺伝子の一部を増幅する工程、および株特異的、種特異的、属特異的、科特異的または目特異的プローブ核酸配列を使用して増幅産物を検出する工程を含む。標的遺伝子の選択は、公開配列データベースのインシリコ検索、ならびに種(例えば、大腸菌)または目(例えばエンテロバクター目)に特異的であり、他の株およびファミリーを区別する核酸配列の文献検索の結果であった。探索の結果、以下の標的遺伝子が同定された。
本開示は、感染性病原体、例えば血流感染の原因となる細菌株を検出する方法を提供する。本方法は、株特異的、種特異的、属特異的、科特異的または目特異的プライマー配列を使用してPCRによって標的遺伝子の一部を増幅する工程、および株特異的、種特異的、属特異的、科特異的または目特異的プローブ核酸配列を使用して増幅産物を検出する工程を含む。標的遺伝子の選択は、公開配列データベースのインシリコ検索、ならびに種(例えば、大腸菌)または目(例えばエンテロバクター目)に特異的であり、他の株およびファミリーを区別する核酸配列の文献検索の結果であった。探索の結果、以下の標的遺伝子が同定された。
エンテロバクター目:rplP、ompA、tuf、gyrB、rpoB
腸内細菌科:rplP、ompA、tuf、gyrB、rpoB
エンテロコッカス属:tuf、rpoB、sodA、ddl、gyrB
シュードモナス属:gyrB、O-抗原アセチラーゼ、rpoB、ecfX、tuf
アシネトバクター属:ompA、tusA、rpoB、gyrB
ステノトロホモナス・マルトフィリア:fdnG、gyrB、tuf
黄色ブドウ球菌:CPE、gyrB、nuc、rpoB、tuf、ddlA
スタフィロコッカス・エピデルミディス:altE、femA
コアグラーゼ-陰性ブドウ球菌:rpoB、tuf、sodA
ストレプトコッカス属:tuf、gyrB、sip、ddlA
肺炎球菌:lytA、SP2020、piaB
プロテウス・ミラビリス:UreR、UreC
カンジダ・アルビカンス:ACT、RPB-1、5.8s リボソームRNA、18s リボシームRNA
腸内細菌科:rplP、ompA、tuf、gyrB、rpoB
エンテロコッカス属:tuf、rpoB、sodA、ddl、gyrB
シュードモナス属:gyrB、O-抗原アセチラーゼ、rpoB、ecfX、tuf
アシネトバクター属:ompA、tusA、rpoB、gyrB
ステノトロホモナス・マルトフィリア:fdnG、gyrB、tuf
黄色ブドウ球菌:CPE、gyrB、nuc、rpoB、tuf、ddlA
スタフィロコッカス・エピデルミディス:altE、femA
コアグラーゼ-陰性ブドウ球菌:rpoB、tuf、sodA
ストレプトコッカス属:tuf、gyrB、sip、ddlA
肺炎球菌:lytA、SP2020、piaB
プロテウス・ミラビリス:UreR、UreC
カンジダ・アルビカンス:ACT、RPB-1、5.8s リボソームRNA、18s リボシームRNA
エンテロバクター目または腸内細菌科に属する細菌の検出のために、リボソームL16タンパク質をコードするrplP遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブが提供される(配列番号1~3、表I)。第2のプローブ(配列番号4、表I)の追加により、セラチア・マルセッセンス株およびプロテウス・ミラビリス株などのエンテロバクター目の他の一般的な病原体を含むように包括性が更に拡張される。本明細書に例示された以外の核酸を使用しても、サンプル中の高度に特異的な病原体グループ化標的遺伝子を検出し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および/または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号1~4から選択される配列を有する核酸、配列番号1~4の1つと少なくとも、例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、もしくは配列番号1~4の相補体およびバリアントを含む。
エンテロバクター目に属する細菌の検出はまた、rplP遺伝子を増幅するための他のプライマーおよびプローブ(配列番号5~7、表II)、ならびにDNAジャイラーゼサブユニットBタンパク質をコードするgyrB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号8~10、表III)、ならびにDNA依存性RNAポリメラーゼをコードするrpoB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号11~16、表IV)を含み得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号5~7、8~10、11~16から選択される配列を有する核酸、配列番号5~7、8~10、11~16の1つと少なくとも、例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号5~7、8~10、11~16の相補体およびバリアントを含む。
アシネトバクター・バウマニ(Abi)種に属する細菌の検出のために、外膜タンパク質AをコードするompA遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブが提供される(表V参照)。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のアシネトバクター属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および/または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号17~19、20~22、29~31から選択される配列を有する核酸、配列番号17~19、20~22、29~31の1つと、少なくとも例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号17~19、20~22、29~31の相補体およびバリアントを含む。
アシネトバクター・バウマニの検出はまた、rpoB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号23~25、表VI)、ならびにgyrB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号26~28、表VII)を含み得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号23~25、26~28から選択される配列を有する核酸、配列番号23~25、26~28の1つと、少なくとも例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号23~25、26~28の相補体およびバリアントを含む。
緑膿菌種(Pae)に属する細菌の検出のために、伸長因子(配列番号32~34、表VIII)をコードするtuf遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号32~34、表VIII)、gyrB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号35~37、表IX)、ならびにrpoB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号38~40、表X)が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のシュードモナス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および/または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号32~34、35~37、38~40から選択される配列を有する核酸、配列番号32~34、35~37、38~40の1つと、少なくとも例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号32~34、35~37、38~40の相補体およびバリアントを含む。
ステノトロホモナス・マルトフィリア種に属する細菌(S.マルトフィリア)の検出のために、fdnG遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号41~43、表XI)、gyrB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号44~46、表XII)、ならびにtuf遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号47~49、表XIII)が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸を使用して、サンプル中のステノトロホモナス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および/または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号41~43、44~46、47~49から選択される配列を有する核酸、配列番号41~43、44~46、47~49の1つと、少なくとも例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号41~43、44~46、47~49の相補体およびバリアントを含む。
エンテロコッカス属に属する細菌の検出のために、tuf遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号50~52、表XIV)、rpoB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号53~55、表XV)、xxxxをコードするddl遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号56~61、表XVI)、ならびにgyrB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号62~66、表XVII)が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のエンテロコッカス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および/または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号50~52、53~55、56~61、62~66から選択される配列を有する核酸、配列番号50~52、53~55、56~61、62~66の1つと、少なくとも例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号50~52、53~55、56~61、62~66の相補体およびバリアントを含む。
黄色ブドウ球菌(S.アウレウス)種に属する細菌の検出のための、莢膜形成に関与するタンパク質をコードするCPE遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号67~69、72、表XVIII)、gyrB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号73~75、表XIX)、ddlA遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号76~78、表XX)。スタフィロコッカス属に属する細菌を検出するために、tuf遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号79~81、表XXII)が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のスタフィロコッカス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および/または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号67~69、72、73~75、76~78、79~81から選択される配列を有する核酸、配列番号67~69、72、73~75、76~78、79~81の1つと、少なくとも例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号67~69、72、73~75、76~78、79~81の相補体およびバリアントを含む。
ストレプトコッカス・アガラクチア(S.アガラクチア)の種に属する細菌の検出のために、gyrB遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号121~123、表XXII)、表面免疫原性タンパク質をコードするsip遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号82~84、表XXIII)、ならびにddlA遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号85~87、表XXIV)が提供される。ストレプトコッカス属に属する細菌の検出のために、tuf遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号100~102、表XXV)が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のストレプトコッカス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および/または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号121~123、82~84、85~87、100~102から選択される配列を有する核酸、配列番号121~123、82~84、85~87、100~102の1つと、少なくとも例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号121~123、82~84、85~87、100~102の相補体およびバリアントを含む。
一般的な真菌病原体:カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・アウリスの検出のために、18sリボソームRNA(18srRNA)遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号88~90、表XXVI)、ならびに5.8sリボソームRNA(5.8srRNA)遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ(配列番号91~93、表XXVII)が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸を使用して、サンプル中のカンジダ属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および/または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける1つ以上の欠失、挿入および/または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号88~90、91~93から選択される配列を有する核酸、配列番号88~90、91~93の1つと、少なくとも例えば80%、90%、もしくは95%の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号88~90、91~93の相補体およびバリアントを含む。
全てのタイプの細菌の検出のために、16sリボソームRNA(16s rRNA)遺伝子中の保存領域を増幅するためのプライマーとプローブの組み合わせ(配列番号94~96、表XXVIII)が提供される。
一実施形態では、上述のプライマーおよびプローブのセットは、感染性細菌株の検出および同定のためだけでなく、抗菌剤感受性試験(AST)アッセイの実行にも使用される。したがって、本発明は、細菌の同定(ID)およびその抗菌剤感受性(AST)の試験が単一のアッセイ設定で同時に決定される定量的リアルタイムPCR反応を実施するための方法および組成物を開示する。
本明細書に開示されるプライマーおよび/またはプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントは、開示される方法においてプライマーおよび/またはプローブを使用することによって同定され得る。本明細書に開示されるプライマーおよび/またはプローブの機能的に活性なバリアントは、開示されるプライマーおよび/またはプローブのそれぞれの配列と比較して、開示の方法またはキットにおいて類似またはより高い特異性および感度を提供するプライマーおよび/またはプローブに関する。
バリアントは、例えば、本明細書に開示されるプライマーおよび/またはプローブのそれぞれの配列の5’末端および/または3’末端における1つ以上のヌクレオチド付加、欠失または置換などの1つ以上のヌクレオチド付加、欠失または置換によって、本明細書に開示されるプライマーおよびプローブの配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマー(および/またはプローブ)は化学的に修飾されていてもよく、すなわち、プライマーおよび/またはプローブは修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、プローブ(またはプライマー)は修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」(または「ヌクレオチド類縁体」)は、いくつかの修飾によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基もしくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖もしくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分もしくはリン酸様部分、またはそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「修飾ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基は、例えば7-デアザプリンで置き換えられてもよく、そのようにしても「修飾ヌクレオチド」が得られる。用語「改変ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類似体」は、本出願において互換的に使用される。「修飾ヌクレオシド」(または「ヌクレオシド類縁体」)は、「修飾ヌクレオチド」(または「ヌクレオチド類縁体」)について上に概説したように、何らかの修飾によって天然のヌクレオシドとは異なる。
標的遺伝子のいずれかをコードする核酸分子を増幅する修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.Cascade、コロラド州)のようなコンピュータプログラムを使用して設計され得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出(例えば、電気泳動によって)を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、および各プライマーの長さ(すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に忠実度が低下するほど長くはない)が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは8~50ヌクレオチド長(例えば、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48または50ヌクレオチド長)である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、40ヌクレオチド長以下である。
プライマーのセットに加えて、本方法は、標的遺伝子の存在または非存在を検出するために1つ以上のプローブを使用し得る。「プローブ」 という用語は、合成的または生物学的に産生された核酸(DNAまたはRNA)を指し、これは、設計または選択により、定義された所定のストリンジェンシーの下で特異的に(すなわち、優先的に)、この場合は標的遺伝子核酸にハイブリダイズすることを可能にする特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。
いくつかの実施形態では、開示される標的遺伝子プローブは、少なくとも1つの蛍光標識で標識され得る。一実施形態では、標的遺伝子プローブは、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、および対応するアクセプター部分、例えばクエンチャーで標識し得る。一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むかまたはそれからなり、核酸配列は本明細書に開示されるプローブ配列を含むかまたはそれからなる。
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブまたは一対のプローブを使用することができる。実施形態に応じて、使用するプローブ(単数または複数)は、少なくとも1種の標識および/または少なくとも1種のクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常同様の融解温度を有し、各プローブの長さは配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に15~40(例えば、16、18、20、21、22、23、24、または25)ヌクレオチド長である。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号、同第4,800,159号および同第4,965,188号には、従来のPCR技術が開示されている。PCRは、典型的には、選択された核酸鋳型(例えば、DNAまたはRNA)に結合する2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーは、開示される標的遺伝子核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、または合成的に産生することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる1つの方法は、加熱によるものである。
米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号、同第4,800,159号および同第4,965,188号には、従来のPCR技術が開示されている。PCRは、典型的には、選択された核酸鋳型(例えば、DNAまたはRNA)に結合する2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーは、開示される標的遺伝子核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、または合成的に産生することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる1つの方法は、加熱によるものである。
鋳型核酸が二本鎖である場合、PCRで鋳型として使用することができるようにする前に、二本鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する1つの方法は、核酸が優位に変性する(例えば、50%、60%、70%、80%、90%、または95%を超える変性)まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、ならびに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸長などの反応の特徴に応じて、約90℃~約105℃の範囲である。変性は、典型的には、約30秒間~4分間(例えば、1分~2分30秒、または1.5分)行われる。
二本鎖鋳型核酸が熱によって変性される場合、反応混合物を、開示される標的遺伝子核酸分子上のその標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却する。アニーリングの温度は、通常、約35℃~約65℃、(例えば、約40℃~約60℃、約45℃~約50℃)である。アニーリング時間は、約10秒~約1分(例えば、約20秒~約50秒、約30秒~約40秒)であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、鋳型核酸に相補的な生成物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長生成物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的な鋳型から伸長生成物を変性させるほど高くすべきではない(例えば、伸長のための温度は、概して、約40℃~約80℃(例えば、約50℃~約70℃、約60℃)の範囲である)。伸長時間は、約10秒~約5分(例えば、約30秒~約4分、約1分~約3分、約1分30秒~約2分)であり得る。
PCRアッセイは、RNAまたはDNA(cDNA)などの核酸を用いることができる。鋳型核酸は精製される必要はなく、ヒト細胞に含まれる核酸などの複合混合物の微量画分であり得る。核酸分子は、Diagnostic Molecular Microbiology:Principles and Applications(Persingら、(編集),1993,American Society for Microbiology,Washington D.C.)に記載されているような通常の技術によって生物学的サンプルから抽出され得る。核酸は、プラスミドなどの任意の数の供給源、または細菌、酵母、原虫ウイルス、細胞小器官、または植物もしくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
オリゴヌクレオチドプライマーを、プライマー伸長を誘導する反応条件下でPCR試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応には、一般に、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、15mM MgCl2、0.001%(w/v)ゼラチン、0.5~1.0μgのプロトタイピングされた鋳型DNA、50pmolの各オリゴヌクレオチドプライマー、2.5UのTaqポリメラーゼおよび10%DMSO)が含まれる。反応物は、通常、それぞれ150~320μMのdATP、dCTP、dTTP、dGTP、またはそれらの1つまたは複数の類似体を含有する。
新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。標的核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖分離、アニーリング、および伸長の工程を必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程(すなわち、変性、アニーリング、および伸長)は、好ましくは少なくとも1回繰り返される。検出での使用では、サイクリング工程の数は、例えば、サンプルの性質に応じる。サンプルが核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となる。一般的に、サイクリング工程は少なくとも約20回繰り返されるが、40、60、または100回繰り返してもよい。
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)
FRET技術(例えば、米国特許第4,996,143号、同第5,565,322号、同大5,849,489号、同第6,162,603号)は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるかまたは他の方法で検出および/または定量することができる、2つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分(例えば、米国特許第7,741,467号を参照)を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
FRET技術(例えば、米国特許第4,996,143号、同第5,565,322号、同大5,849,489号、同第6,162,603号)は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるかまたは他の方法で検出および/または定量することができる、2つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分(例えば、米国特許第7,741,467号を参照)を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で移動されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャーとを含有することができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばTaqポリメラーゼの5’から3’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第5,210,015号、同第5,994,056号、および同第6,171,785号に記載されている。一般的に使用されるドナー-アクセプター対は、FAM-TAMRA対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、DABCYLおよびTAMRAである。一般的に使用されるダーククエンチャーは、BlackHole Quenchers(商標)(BHQ)、(Biosearch Technologies,Inc.、カリフォルニア州ノヴァト)、Iowa Black(商標)(Integrated DNA Tech.,Inc.、アイオワ州コーラルビル)、BlackBerry(商標)Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc、ミシガン州デクスタ)を包含する。
別の例では、それぞれが蛍光部分を含有する2つのオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、FRETシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約10秒間~約1分間、約35℃~約65℃の範囲であり得る。
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム(適切なダイクロイックミラーおよび特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える)、光子計数光電子増倍管システム、または蛍光光度計を使用して行い得る。エネルギー移動を開始するため、または蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀(Hg)アークランプ、光ファイバー光源、または所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。
ドナー部分および対応するアクセプター部分「対応する」に関して本明細書で使用される場合、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分またはダーククエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも100nm大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動を行い得る。
蛍光ドナー部分および対応するアクセプター部分は、一般に、(a)高効率Forsterエネルギー移動、(b)大きな最終ストークスシフト(>100nm)、(c)可能な限り可視スペクトルの赤色部分(>600nm)への発光のシフト;および(d)ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、レーザー線付近のその最大励起波長(例えば、ヘリウム-カドミウム442nmまたはアルゴン488nm)、高い吸光係数、高い量子収率、およびその蛍光発光に対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するドナー蛍光部分を選択することができる。対応するアクセプター蛍光部分は、高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、および可視スペクトルの赤色部分(>600nm)の発光を有するものを選択することができる。
FRET技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、B-フィコエリトリン、9-アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローVS、4-アセトアミド-4’-イソチオ-シアナトスチルベン-2、2’-ジスルホン酸、7-ジエチルアミノ-3-(4’-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリン、スクシンミル1-ピレンブチレート、および4-アセトアミド-4’-イソチオシアナトスチルベン-2,2’-ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンxイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、またはランタニドイオンの他のキレート(例えば、ユウロピウム、またはテルビウム)が挙げられる。ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分は、例えば、Molecular Probes(オレゴン州ジャンクションシティ)またはSigma Chemical Co.(ミズーリ州セントルイス)から得ることができる。
ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすため、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム(Å)の距離であり得る。一般的に、リンカーアームは約10Å~約25Åである。リンカーアームは、国際公開第84/03285号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第84/03285号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、および蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。
LC Red 640などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー(例えば、ABI(カリフォルニア州フォスターシティ)またはGlen Research(バージニア州スターリング)から入手可能なC6-アミノホスホラミダイト)を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、LC Red 640標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー(FITC由来、例えばGlen ResearchまたはChemGene(マサチューセッツ州アッシュランド)製のフルオレセイン-CPG)、アミド-リンカー(BioGenex(カリフォルニア州サンラモン)製のCX-フルオレセイン-CPGなどの、フルオレセイン-NHS-エステル由来)、またはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン-NHS-エステルの結合を必要とする3’-アミノ-CPGが挙げられる。
本明細書に記載されるように、増幅産物は、FRET技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出し得る。1つのFRETフォーマットは、増幅産物の有無、したがって標的遺伝子の有無を検出するためにTaqMan(登録商標)技術を利用する。TaqMan(登録商標)技術は、例えば、1種の蛍光色素および1種のクエンチャーで標識された1種の1本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用し、これは蛍光性であってもよく、蛍光性でなくてもよい。第1の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、FRETの原理に従って第2の蛍光部分またはダーククエンチャーに移動する。第2の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。PCR反応のアニーリングステップ中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的DNA(すなわち、増幅産物)に結合し、その後の伸長段階中に、例えばTaqポリメラーゼの5’から3’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが、互いに空間的に分離した状態となる。結果として、クエンチャーの不在下において第1の蛍光部分を励起すると、第1の蛍光部分からの蛍光発光を検出し得る。例として、ABI PRISM(登録商標)7700配列検出システム(Applied Biosystems)は、TaqMan(登録商標)技術を使用し、サンプル中の標的遺伝子の存在または非存在を検出するための本明細書に開示の方法を実施するのに適している。
FRETと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムPCR法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第1の蛍光部分および第2の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第2の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列(例えば、ヘアピン)を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部分が空間的に近接する。標的核酸(すなわち、増幅産物)へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第1の蛍光部分の発光を検出することができる。
FRET技術の別の共通形式は、2つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般的に、標的DNA分子(例えば、増幅産物)内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、LightCycler(登録商標)機器の光源によって470nmで励起される。FRETの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばLightCycler(登録商標)-Red640(LC Red640)またはLightCycler(登録商標)-Red705(LC Red705)に伝達する。次いで、アクセプター蛍光部分は、より長い波長の光を放出し、これはLightCycler(登録商標)機器の光学検出システムによって検出される。効率的なFRETは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的DNA分子の数(例えば、標的株/ファミリーゲノムの数)と相関させ得る。標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブ対のメンバー間のFRETに基づく検出可能なシグナルをもたらす。
一般に、FRETの存在はサンプル中に標的遺伝子が存在することを示し、FRETの非存在はサンプル中に標的遺伝子が存在しないことを示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、または特定の収集スワブ(アルギン酸カルシウムまたはアルミニウムシャフト)の使用はいずれも、試験結果の成功および/または精度に影響を及ぼし得る条件である。本明細書に開示される方法を使用して、例えば45サイクル工程以内にFRETが検出されると、目的の標的株/科が存在することを示す。
本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的サンプルとしては、限定されないが、呼吸器検体、糞便検体、血液検体、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚および軟部組織感染が挙げられる。生物学的サンプルの収集および保存方法は、当技術分野の当業者に知られている。生物学的サンプルを処理して(例えば、当技術分野で公知の核酸抽出方法および/またはキットによって)標的遺伝子核酸を放出させ得、または一部の場合には、生物学的サンプルをPCR反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させ得る。
融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含め得る追加の工程である。融解曲線分析は、DNA二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度(Tm)と呼ばれる特徴的な温度でDNAが融解するという事実に基づいている。DNAの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、GおよびCヌクレオチドが豊富なDNA分子は、AおよびTヌクレオチドが豊富なDNA分子よりも高いTmを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定し得る。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定し得る。増幅産物からのプローブの融解温度により、サンプル中の目的の標的株/科の存在または非存在を確認し得る。
各サーモサイクラーランの間に、対照サンプルも同様にサイクルし得る。陽性対照サンプルは、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを使用して、(記載された標的遺伝子の増幅産物以外の)標的核酸対照鋳型を増幅し得る。陽性対照サンプルはまた、例えば標的核酸分子を含むプラスミドコンストラクトを増幅し得る。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマーおよびプローブを使用して、内部で(例えば、サンプル内で)または患者のサンプルと並んで実行される別々のサンプルで増幅し得る。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび/またはFRET反応の成功または失敗の指標である。各サーモサイクラー実行はまた、例えば標的鋳型DNAを欠く陰性対照を含み得る。陰性対照は汚染を測定し得る。これにより、システムおよび試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、ならびにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、FRETが発生する能力を容易に決定し得る。
一実施形態では、本方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、ウラシル-DNAグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減または排除するために、米国特許第5,035,996号、同第5,683,896号および同第5,945,313号に記載される。
FRET技術と組み合わせた従来のPCR法を使用して、この方法を実施し得る。一実施形態では、LightCycler(登録商標)機器が使用される。以下の特許出願には、LightCycler(登録商標)技術で使用されるリアルタイムPCRが記載されている。国際公開第97/46707号、同第97/46714号、および同第97/46712号。
LightCycler(登録商標)は、PCワークステーションを使用して動作させることができ、Window NTオペレーティングシステムを利用し得る。サンプルからのシグナルは、機械が光学ユニット上にキャピラリーを順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示し得る。蛍光取得時間は10~100ミリ秒(msec)である。各サイクリングステップの後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、全てのサンプルについて連続的に更新し得る。生成されたデータは、さらなる分析のために保存し得る。
FRETの代替として、蛍光DNA結合色素(例えば、SYBR(登録商標)GreenまたはSYBR(登録商標)Gold(Molecular Probes))等の二本鎖DNA結合色素を用いて、増幅産物を検出し得る。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光DNA結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素等の二本鎖DNA結合色素を用い得る。二本鎖DNA結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
本開示の実施形態は、1つ以上の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
表現型抗菌剤感受性試験(AST)のためのリアルタイムPCR
定量的リアルタイムPCR(qPCRまたはqRT-PCR)は、高い特異性および感度でサンプル中の細菌を同定および定量し得るが、抗菌剤の存在下での細菌の増殖を使用して表現型ベースのASTを実行する際のその信頼性は、一貫性をもって実証されていない。本発明は、PCR増殖曲線から導かれる数学的関係を利用して、試験された細菌株が所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性(SIR)であるかどうかの決定を行う。PCRを使用する表現型AST試験の背後にある原理を図1に示す。抗菌剤が存在しない場合(参照として示される)、細菌はゲノムDNA複製を進行中である。抗菌剤の存在下では、耐性細菌は参照と同様のゲノムコピー数で複製するが、感受性細菌は複製が阻害され、コピー数はより少なくなる。この増殖の差は、qPCRによって決定し得る表現型の読み出しを提供する。
定量的リアルタイムPCR(qPCRまたはqRT-PCR)は、高い特異性および感度でサンプル中の細菌を同定および定量し得るが、抗菌剤の存在下での細菌の増殖を使用して表現型ベースのASTを実行する際のその信頼性は、一貫性をもって実証されていない。本発明は、PCR増殖曲線から導かれる数学的関係を利用して、試験された細菌株が所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性(SIR)であるかどうかの決定を行う。PCRを使用する表現型AST試験の背後にある原理を図1に示す。抗菌剤が存在しない場合(参照として示される)、細菌はゲノムDNA複製を進行中である。抗菌剤の存在下では、耐性細菌は参照と同様のゲノムコピー数で複製するが、感受性細菌は複製が阻害され、コピー数はより少なくなる。この増殖の差は、qPCRによって決定し得る表現型の読み出しを提供する。
耐性細菌株または感受性細菌株のいずれかを図2に示す種々の濃度の抗菌剤と共に4時間インキュベートする仮説的qPCR実験からの生データ。図2Aにおいては、生のqPCRデータは、蛍光(例えば、TaqMan(登録商標)プローブからの蛍光)が各PCRサイクルで測定される増殖曲線として示される。耐性分離株については、増殖曲線は、種々の抗菌剤濃度で4時間のインキュベーションに関係なく同様に観察されるが、感受性分離株では、蛍光強度の用量依存的減少およびシグナルがバックグラウンド(閾値)レベルを交差するのに必要なサイクル数の増加(これは一般にサイクル閾値またはCt値と呼ばれる)が観察される。図2Bにおいては、同じqPCRデータがCt値に基づいて表されており、耐性分離株は抗菌剤濃度の関数としてCt値の変化がほとんどまたは全くないが、感受性分離株はより少数の複製細菌を検出することによってCt値の用量依存的増加を示す。
qPCRデータを使用して、図3に示す種々の数学的関係を調べることによって、株が所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性であるかどうかを決定し得る。図3Aは、生のqPCR増幅曲線の挙動を表す「勾配」、「Ct」、「変曲」、「絶対蛍光強度(AFI)」、および「エンドポイント相対強度(ERI)」などの数学的関係を表す。図3Bに示すように、これらの特徴は、抗菌剤の存在下で得られた数値を抗菌剤の非存在下で得られた数値に関連付けることによって、抗菌剤曝露の関数として更に評価し得る。次いで、ΔCtまたはΔAFIなどのこれらの特徴の相対的変化を使用して、所与の薬物に対する株MICを決定し得、承認されたブレイクポイントを利用して株耐性および感受性の決定が可能になる。
数学的特徴において計算された差から、図4に示すような単純化された分配モデルを使用して、細菌分離株を耐性または感受性として分類した。分割は、ジニ指数を利用して、どの特徴および閾値が2つのクラスの分散を最大化するかが決定される。オーバーフィッティングを防止するために2つの分割のみが利用され、視覚化を容易にするために2次元のグラフィック表示を可能にする。
以下の実施例、表および図は、主題の理解を助けるために提供されており、その主題の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
実施例1 PCRの条件
標的遺伝子のリアルタイムPCR検出は、cobas(登録商標)6800/8800システムプラットフォーム(Roche Molecular Systems,Inc、カリフォルニア州プレザントン)を使用して行った。増幅試薬の最終濃度を以下に示す:
標的遺伝子のリアルタイムPCR検出は、cobas(登録商標)6800/8800システムプラットフォーム(Roche Molecular Systems,Inc、カリフォルニア州プレザントン)を使用して行った。増幅試薬の最終濃度を以下に示す:
以下の表は、PCR増幅反応に使用される典型的な熱プロファイルを示す:
Pre-PCRプログラムは、初期変性およびRNA鋳型の逆転写のための55°C、60°Cおよび65°Cでのインキュベーションを含んでいた。3種の温度でのインキュベーションは、より低い温度ではわずかにミスマッチした標的配列(生物の遺伝的変異体など)も転写されるが、より高い温度ではRNA二次構造の形成が抑制され、したがってより効率的な転写をもたらすという有利な効果を併せ持つ。PCRサイクリングを2つの測定に分け、いずれの測定も1段階の設定を適用する(アニーリングと伸長を組み合わせる)。55℃での最初の5サイクルは、わずかにミスマッチした標的配列を予備増幅することによって包括性の増加を可能にするが、第2の測定の45サイクルは、58℃のアニーリング/伸長温度を使用することによって特異性を高める。
実施例2 エンテロバクター目を検出するためのプライマー/プローブを使用するPCR
実施例1に記載されるPCR条件を使用して、フォワードプライマーRM_ENTF(配列番号1)、リバースプライマーRM_ENTRP(配列番号2)、ならびにrplP遺伝子を標的とする遺伝子を標的とする2つのプローブ、RM_ETP02(配列番号3)およびRM_ETP02B(配列番号4)を使用するPCRアッセイを、エンテロバクター目からの5つの細菌株:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、および非エンテロバクター目からの2つの細菌株:緑膿菌、およびA.バウマニに対して試験した。使用した出発物質の濃度は、DNA(約1e7コピー/μl)を使用したS.マルセッセンスを除いて、全ての株(グリセロールに予め保存された一晩培養物)の培養液について1e8~5e8CFU/mlの範囲であった。培養液のサンプル調製は行わなかった。この実験の結果は、エンテロバクター目ファミリーの5つの株についてのみ増殖曲線が観察されるが、2つの非腸内細菌株については観察されないことを示し、それによりエンテロバクター目を検出するためのプライマーおよびプローブのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。同様の実験を行って、緑膿菌特異的プライマーおよびプローブ(配列番号5~8)、ならびにA・バウマニ特異的プライマーおよびプローブ(配列番号9~11)を試験したところ、これも良好な特異性および排他性を示した(データは示さず)。
実施例1に記載されるPCR条件を使用して、フォワードプライマーRM_ENTF(配列番号1)、リバースプライマーRM_ENTRP(配列番号2)、ならびにrplP遺伝子を標的とする遺伝子を標的とする2つのプローブ、RM_ETP02(配列番号3)およびRM_ETP02B(配列番号4)を使用するPCRアッセイを、エンテロバクター目からの5つの細菌株:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、および非エンテロバクター目からの2つの細菌株:緑膿菌、およびA.バウマニに対して試験した。使用した出発物質の濃度は、DNA(約1e7コピー/μl)を使用したS.マルセッセンスを除いて、全ての株(グリセロールに予め保存された一晩培養物)の培養液について1e8~5e8CFU/mlの範囲であった。培養液のサンプル調製は行わなかった。この実験の結果は、エンテロバクター目ファミリーの5つの株についてのみ増殖曲線が観察されるが、2つの非腸内細菌株については観察されないことを示し、それによりエンテロバクター目を検出するためのプライマーおよびプローブのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。同様の実験を行って、緑膿菌特異的プライマーおよびプローブ(配列番号5~8)、ならびにA・バウマニ特異的プライマーおよびプローブ(配列番号9~11)を試験したところ、これも良好な特異性および排他性を示した(データは示さず)。
gyrB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP1899(配列番号8)、リバースプライマーSEGP1901(配列番号9)およびプローブSEGP2016(配列番号10)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図5に示すように、増殖曲線はエンテロバクター目(大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、およびP.ミラビリスを含む)を構成する種についてのみ観察された。非標的生物(S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティー)について有意な増幅は観察されず、それにより、エンテロバクター目を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
エンテロバクター目のrplP遺伝子を標的とするように設計された他のプライマーおよびプローブの組み合わせについてPCRアッセイを行った。rplP遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2891(配列番号5)、リバースプライマーSEGP2892(配列番号6)およびプローブSEGP2893(配列番号7)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図6に示すように、増殖曲線はエンテロバクター目(大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、およびP.ミラビリスを含む)を構成する種についてのみ観察された。非標的生物(S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティー)について有意な増幅は観察されず、それにより、エンテロバクター目を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
rpoB遺伝子を標的とするプローブSEGP2804(配列番号15)およびSEGP2822(配列番号16)と組み合わせて、フォワードプライマーSEGP2799(配列番号11)、リバースプライマーSEGP2800(配列番号12)、SEGP2802(配列番号13)およびSEGP2821(配列番号14)を使用するPCRアッセイにおいても同様の結果が得られた。図7に示すように、増殖曲線はエンテロバクター目(大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、およびP.ミラビリスを含む)を構成する種についてのみ観察された。非標的生物(S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティー)について有意な増幅は観察されず、それにより、エンテロバクター目を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
実施例3 アシネトバクター属を検出するためのプライマー/プローブを使用するPCR
ompA遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2603(配列番号20)、リバースプライマーSEGP2606(配列番号21)およびプローブSEGP2769(配列番号22)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図8に示すように、増殖曲線は、アシネトバクター属(A.バウマニおよびA.ピティー)に属する優勢な病原体についてのみ観察された。非標的生物(大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、および緑膿菌)について有意な増幅は観察されず、それにより、アシネトバクターを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
ompA遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2603(配列番号20)、リバースプライマーSEGP2606(配列番号21)およびプローブSEGP2769(配列番号22)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図8に示すように、増殖曲線は、アシネトバクター属(A.バウマニおよびA.ピティー)に属する優勢な病原体についてのみ観察された。非標的生物(大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、および緑膿菌)について有意な増幅は観察されず、それにより、アシネトバクターを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
rpoB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2590(配列番号23)、リバースプライマーSEGP2593(配列番号24)およびプローブSEGP2594(配列番号25)を使用するPCRアッセイ(図9に示す)、ならびにgyrB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2626(配列番号26)、リバースプライマーSEGP2628(配列番号27)およびプローブSEGP2629(配列番号28)を使用するPCRアッセイ(図10に示す)においても同様の結果が得られた。これらの実験により、アシネトバクターを検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて、良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。
実施例4 緑膿菌を検出するためのプライマー/プローブを使用するPCR
tuf遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2341(配列番号32)、リバースプライマーSEGP2342(配列番号33)およびプローブSEGP2343(配列番号34)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図11に示すように、増殖曲線はシュードモナス属に属する病原体(緑膿菌)についてのみ、観察された。非標的生物(大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、A.バウマニ、およびA.ピッティー)について有意な増幅は観察されず、それにより、緑膿菌を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
tuf遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2341(配列番号32)、リバースプライマーSEGP2342(配列番号33)およびプローブSEGP2343(配列番号34)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図11に示すように、増殖曲線はシュードモナス属に属する病原体(緑膿菌)についてのみ、観察された。非標的生物(大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、A.バウマニ、およびA.ピッティー)について有意な増幅は観察されず、それにより、緑膿菌を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
gyrB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2630(配列番号35)、リバースプライマーSEGP2631(配列番号36)およびプローブSEGP2632(配列番号37)を使用するPCRアッセイ(図12に示す)、ならびにrpoB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2634(配列番号38)、リバースプライマーSEGP2637(配列番号39)およびプローブSEGP2640(配列番号40)を使用するPCRアッセイ(図13に示す)においても同様の結果が得られた。これらの実験により、緑膿菌を検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。
実施例5 ステノトロホモナス・マルトフィリアを検出するためのプライマー/プローブを使用するPCR
fdnG遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2532(配列番号41)、リバースプライマーSEGP2538(配列番号42)およびプローブSEGP2544(配列番号43)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図14に示すように、増殖曲線は、ストレプトマイセス・マルトフィリア(S.マルトフィリア)についてのみ観察された。非標的生物(大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピッティー)について有意な増幅は観察されず、それにより、S.マルトフィリアを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
fdnG遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2532(配列番号41)、リバースプライマーSEGP2538(配列番号42)およびプローブSEGP2544(配列番号43)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図14に示すように、増殖曲線は、ストレプトマイセス・マルトフィリア(S.マルトフィリア)についてのみ観察された。非標的生物(大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピッティー)について有意な増幅は観察されず、それにより、S.マルトフィリアを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
gyrB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2578(配列番号44)、リバースプライマーSEGP2579(配列番号45)およびプローブSEGP2580(配列番号46)を使用するPCRアッセイ(図15に示す)、ならびにtuf遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2572(配列番号47)、リバースプライマーSEGP2573(配列番号48)およびプローブSEGP2574(配列番号49)を使用するPCRアッセイ(図16に示す)においても同様の結果が得られた。これらの実験により、S.マルトフィリアを検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて、良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。
実施例6 エンテロコッカス属を検出するためのプライマー/プローブを使用するPCR
rpoB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2522(配列番号53)、リバースプライマーSEGP2525(配列番号54)およびプローブSEGP2770(配列番号55)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陽性病原体:S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディスに対して試験した。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図17に示すように、エンテロコッカス属に属する病原体(E.フェシウムおよびE.フェカリス)についてのみ増幅曲線が観察される。非標的生物(S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディス)について有意な増幅は観察されず、それにより、エンテロコッカス属を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
rpoB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2522(配列番号53)、リバースプライマーSEGP2525(配列番号54)およびプローブSEGP2770(配列番号55)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陽性病原体:S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディスに対して試験した。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図17に示すように、エンテロコッカス属に属する病原体(E.フェシウムおよびE.フェカリス)についてのみ増幅曲線が観察される。非標的生物(S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディス)について有意な増幅は観察されず、それにより、エンテロコッカス属を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
ddl遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP1624(配列番号56)およびSEGP1627(配列番号57)、リバースプライマーSEGP1625(配列番号58)およびSEGP1628(配列番号59)、ならびにプローブSEGP1626(配列番号60)およびSEGP1629(配列番号61)を使用するPCRアッセイにおいても同様の結果が得られた(図18に示す)。gyrB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2882(配列番号62)およびSEGP2884(配列番号63)、リバースプライマーSEGP2885(配列番号64)およびSEGP2886(配列番号65)、ならびにプローブSEGP2888(配列番号66)を使用するPCRアッセイにおいても、良好な特異性が観察された(図19に示す)。これらの実験により、エンテロコッカスを検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。
実施例7 黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマー/プローブを使用するPCR
CPE遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP1490(配列番号67)、リバースプライマーSEGP1491(配列番号68)およびプローブSEGP1492(配列番号72)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陽性病原体:S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディスに対して試験した。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図20に示すように、有意な増殖曲線は、黄色ブドウ球菌種に属する病原体についてのみ観察された。非標的生物(S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、およびS.エピデルミディス)について有意な増幅は観察されず、それにより、黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
CPE遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP1490(配列番号67)、リバースプライマーSEGP1491(配列番号68)およびプローブSEGP1492(配列番号72)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陽性病原体:S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディスに対して試験した。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図20に示すように、有意な増殖曲線は、黄色ブドウ球菌種に属する病原体についてのみ観察された。非標的生物(S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、およびS.エピデルミディス)について有意な増幅は観察されず、それにより、黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
gyrB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2792(配列番号73)、リバースプライマーSEGP2793(配列番号74)およびプローブSEGP2794(配列番号75)を使用するPCRアッセイ(図21に示す)、ならびにddlA遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2932(配列番号76)、リバースプライマーSEGP2933(配列番号77)およびプローブSEGP2935(配列番号78)を使用するPCRアッセイ(図22に示す)においても同様の結果が得られた。これらの実験により、黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて、良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。
実施例8 ストレプトコッカス・アガラクチアを検出するためのプライマー/プローブを使用するPCR
gyrB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2921(配列番号121)、リバースプライマーSEGP2922(配列番号122)およびプローブSEGP2923(配列番号123)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陽性病原体:S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディスに対して試験した。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図23に示すように、有意な増殖曲線は、ストレプトコッカス・アガラクチア種に属する病原体についてのみ観察された。非標的生物(肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディス)について有意な増幅は観察されず、それにより、S.アガラクチア属を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
gyrB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2921(配列番号121)、リバースプライマーSEGP2922(配列番号122)およびプローブSEGP2923(配列番号123)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陽性病原体:S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディスに対して試験した。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図23に示すように、有意な増殖曲線は、ストレプトコッカス・アガラクチア種に属する病原体についてのみ観察された。非標的生物(肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディス)について有意な増幅は観察されず、それにより、S.アガラクチア属を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
sip遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2204(配列番号82)、リバースプライマーSEGP2205(配列番号83)およびプローブSEGP2206(配列番号84)を使用するPCRアッセイ(図24に示す)、ならびにddlA遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2947(配列番号85)、リバースプライマーSEGP2949(配列番号86)およびプローブSEGP2951(配列番号87)を使用するPCRアッセイ(図25に示す)においても同様の結果が得られた。これらの実験により、S.アガラクチアを検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて、良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。
実施例9 カンジダ属を検出するためのプライマー/プローブを使用するPCR
RDN18(18s rRNA)を標的とするフォワードプライマーSEGP1712(配列番号88)、リバースプライマーSEGP1713(配列番号89)およびプローブSEGP1716(配列番号90)を使用するPCRアッセイを、一般的な真菌病原体:カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・アウリスに対して試験した。グラム陰性および陽性生物についても試験したが、有意な増幅は示されなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図26に示すように、カンジダ属に属する病原体についてのみ有意な増幅曲線が観察された。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、カンジダを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
RDN18(18s rRNA)を標的とするフォワードプライマーSEGP1712(配列番号88)、リバースプライマーSEGP1713(配列番号89)およびプローブSEGP1716(配列番号90)を使用するPCRアッセイを、一般的な真菌病原体:カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・アウリスに対して試験した。グラム陰性および陽性生物についても試験したが、有意な増幅は示されなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図26に示すように、カンジダ属に属する病原体についてのみ有意な増幅曲線が観察された。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、カンジダを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
RDN58(5.8s rRNA)遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP1718(配列番号91)、リバースプライマーSEGP1719(配列番号92)およびプローブSEGP1722.1(配列番号93)を使用するPCRアッセイを、C.アルビカンスおよびC.アウリスに対して試験した。グラム陰性および陽性生物についても試験したが、有意な増幅は示されなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図27に示すように、カンジダ属に属する病原体についてのみ有意な増幅曲線が観察された。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、カンジダを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
実施例10 一般的なグラム陰性およびグラム陽性病原体を検出するためのPCR
16s遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP1830(配列番号94)、リバースプライマーSEGP1831(配列番号95)およびプローブSEGP1895.1(配列番号96)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図28に示すように、全てのグラム陰性病原体について増幅曲線が観察され、それにより、一般的なグラム陰性病原体を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせが実証された。
16s遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP1830(配列番号94)、リバースプライマーSEGP1831(配列番号95)およびプローブSEGP1895.1(配列番号96)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図28に示すように、全てのグラム陰性病原体について増幅曲線が観察され、それにより、一般的なグラム陰性病原体を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせが実証された。
16s遺伝子を標的とするプライマーおよびプローブの同じ組み合わせも、一般的なグラム陽性病原体:S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディスに対して同一の濃度で試験した。図29に示すように、全てのグラム陽性病原体について増幅曲線が観察され、それにより、一般的なグラム陽性病原体を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせが実証された。
実施例11 ASTの結果の解釈
一般に、抗菌剤感受性試験(AST)の結果を解釈するために最も一般的に使用される2つのガイドラインは、以下のものからのガイドラインである:1)臨床検査標準協議会(CLSI)、および2)抗菌剤感受性試験における欧州委員会(EUCAST)。米国はCLSIガイドラインを使用し、欧州の国々はEUCASTガイドラインを使用している。CLSIからの最新のバージョンは、M100 ED30「抗菌剤感受性試験の性能基準、第30版」であり、URL:clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100で入手可能である。EUCASTからの現在のバージョンは、バージョン10、「抗菌剤感受性についての欧州委員会(The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)、MICおよびゾーン直径の解釈のためのブレイクポイント表、バージョン10.0,2020」であり、URL:www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/ Breakpoint _tables/v_10.0_Breakpoint_Tables.pdfで入手可能である。
図30-1および図30-2において確立された最小発育阻止濃度(MIC)のブレイクポイントは、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30によって決定されるように、多くのグラム陰性細菌生物(エンテロバクター目、緑膿菌、アシネトバクター属、S.マルトフィリア)についてμg/mLとして示される。ブレイクポイントは、抗菌剤感受性試験からのMICの結果を解釈し、生物の「グループ化」を所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。
図31において確立された最小発育阻止濃度(MIC)のブレイクポイントは、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30によって決定されるように、多くのグラム陽性細菌生物(黄色ブドウ球菌およびS.ルグドゥネンシス、S.エピデルミディス、エンテロコッカス属、肺炎球菌、ストレプトコッカス/β-溶血性、ビリダンス・ストレプトコッカス)についてμg/mLとして示されている。ブレイクポイントは、抗菌剤感受性試験からのMICの結果を解釈し、生物の「グループ化」を所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。
図32において確立された最小発育阻止濃度(MIC)の限界点は、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M60 ED1によって求められる真菌生物(カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ブラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・アウリス)についてはμg/mLとして示される。ブレイクポイントは、抗真菌剤感受性試験(AFST)からのMICの結果を解釈し、生物の 「グループ化」 を所与の抗真菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。注意すべきは、カンジダ・アウリスにはAFSTが推奨されているが、CLSIもCDCも現在この種のブレイクポイントを確立していないことである。AFSTは、密接に関連するカンジダ属菌に起因し、専門家の意見を使用し、特定の抗真菌剤に対するカンジダ・アウリス分離株の感受性を決定する。
図32において確立された最小発育阻止濃度(MIC)の限界点は、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M60 ED1によって求められる真菌生物(カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ブラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・アウリス)についてはμg/mLとして示される。ブレイクポイントは、抗真菌剤感受性試験(AFST)からのMICの結果を解釈し、生物の 「グループ化」 を所与の抗真菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。注意すべきは、カンジダ・アウリスにはAFSTが推奨されているが、CLSIもCDCも現在この種のブレイクポイントを確立していないことである。AFSTは、密接に関連するカンジダ属菌に起因し、専門家の意見を使用し、特定の抗真菌剤に対するカンジダ・アウリス分離株の感受性を決定する。
実施例12 PCR ID/ASTアッセイプロトコル
方法および材料
a.抗菌剤(Abx)プレートを事前に準備し、必要になるまで-80℃で保存する
i.希釈剤-陽イオン調整ミューラーヒントンブロス(CAMHB)
ii.最終体積-50μl/ウェル
iii.-80℃から取り出し、使用前に30分/室温で解凍する
方法および材料
a.抗菌剤(Abx)プレートを事前に準備し、必要になるまで-80℃で保存する
i.希釈剤-陽イオン調整ミューラーヒントンブロス(CAMHB)
ii.最終体積-50μl/ウェル
iii.-80℃から取り出し、使用前に30分/室温で解凍する
b.CAMHB中での一晩培養-37℃/16~18時間/500rpm
i.2mLの96ウェルディープウェルプレート中、10μlのグリセロールストック+490μlのCAMHB
c.光学密度(OD)によって培養物を1.00E+06CFU/mLに標準化する
d.50μlの標準化された試験単離物を、概説されるようにAbxプレートの適切なウェルに添加することによって試験プレートを調製する
i.2mLの96ウェルディープウェルプレート中、10μlのグリセロールストック+490μlのCAMHB
c.光学密度(OD)によって培養物を1.00E+06CFU/mLに標準化する
d.50μlの標準化された試験単離物を、概説されるようにAbxプレートの適切なウェルに添加することによって試験プレートを調製する
e.試験プレートを37℃/4時間/振盪なしでインキュベートする
f.表IVに従ってPCR試薬を調製する
g.45μlのマスターミックスをPCRアッセイプレートの各ウェルに添加する
h.インキュベーション後、試験プレートの5μl/ウェルをPCRアッセイプレートにスタンプする
i.最終体積-50μl/ウェル
i.試験プレートについては、37℃/12~16時間/振盪なしでインキュベートを続けて、基準方法の最小発育阻止濃度(MIC)を決定する。
J.PCRアッセイプレートをcobas(登録商標)z480装置に装填し、表IVの条件下で実行する。
k.インキュベーション後、MICの試験プレートを読み取り、表現型感受性あり/中程度/耐性解釈を決定した。
f.表IVに従ってPCR試薬を調製する
g.45μlのマスターミックスをPCRアッセイプレートの各ウェルに添加する
h.インキュベーション後、試験プレートの5μl/ウェルをPCRアッセイプレートにスタンプする
i.最終体積-50μl/ウェル
i.試験プレートについては、37℃/12~16時間/振盪なしでインキュベートを続けて、基準方法の最小発育阻止濃度(MIC)を決定する。
J.PCRアッセイプレートをcobas(登録商標)z480装置に装填し、表IVの条件下で実行する。
k.インキュベーション後、MICの試験プレートを読み取り、表現型感受性あり/中程度/耐性解釈を決定した。
実施例13 エンテロバクター目のリアルタイムPCR IDおよびASTアッセイ
3種の異なる標的遺伝子gyrB、rplP、およびrpoB、ならびに3つのクラスの抗菌剤シプロフロキサシン(フルオロキノロン)、ゲンタマイシン(アミノグリコシド)、およびメロペネム(カルバペネム)を利用するエンテロバクター目の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。gyrBについては、配列番号8(フォワードプライマー)、配列番号9(リバースプライマー)、配列番号10(プローブ);rplPについては、配列番号5(フォワードプライマー)、配列番号6(リバースプライマー)、配列番号7(プローブ);rpoBについては、配列番号11(フォワードプライマー)、配列番号12~14(リバースプライマー)、配列番号15~16(プローブ)。K.ニューモニエ株0143(抗菌剤耐性株)および16565(抗菌剤感受性株)の抗菌剤感受性を、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈して、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間インキュベーションした後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。
3種の異なる標的遺伝子gyrB、rplP、およびrpoB、ならびに3つのクラスの抗菌剤シプロフロキサシン(フルオロキノロン)、ゲンタマイシン(アミノグリコシド)、およびメロペネム(カルバペネム)を利用するエンテロバクター目の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。gyrBについては、配列番号8(フォワードプライマー)、配列番号9(リバースプライマー)、配列番号10(プローブ);rplPについては、配列番号5(フォワードプライマー)、配列番号6(リバースプライマー)、配列番号7(プローブ);rpoBについては、配列番号11(フォワードプライマー)、配列番号12~14(リバースプライマー)、配列番号15~16(プローブ)。K.ニューモニエ株0143(抗菌剤耐性株)および16565(抗菌剤感受性株)の抗菌剤感受性を、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈して、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間インキュベーションした後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。
結果を図33に示す。「倍率変化Abxレベル1」として示されているY軸上のパーセンテージは、計算2^-(Abx_Level_1_Ct-Reference_Ct)または2^-(ΔCt)を使用して決定された。Abxレベルの表示は、使用された実際の濃度には関係せず、どちらかと言えば、Abxレベル1が最低濃度であり、各レベルアップが2倍高い濃度である場合に、どの2倍希釈が参照されているかの表示である(表XXXI参照)。倍率変化がどのように計算されるかの例を挙げると、Reference_Ct値(すなわち、抗菌剤を添加しない場合のCt値)が20であり、Abx_Level_1_Ct値が22である場合、倍率変化=2^-(22-20)=2^-2=1/2×1/2=25%である。これらの計算に基づいて、ΔCt値がより低い抗菌剤に耐性の株は、ΔCt値がより高い抗菌剤に感受性の株よりも高い「倍率変化」値を有し、図33において、Abxレベル1は、耐性株Kpn0143と感受性株Kpn16565との間の最良の分離をもたらし得た。これらのデータは、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、およびメロペネムに対する感受性または耐性を決定する際に、3つ全ての遺伝子標的(gyrB、rplB、rpoB)を利用して両方のKpn株の正しい感受性についての結果が得られることを更に示している。しかしながら、所与の抗菌剤に対する感受性または耐性を決定するために、任意の所与の標的遺伝子が、より良好またはより不良に機能し得る場合があり得る。まとめると、これらの結果は、プライマーおよびプローブが実施例2、図5~図7に示されたようにエンテロバクター目に対する正しい包括性および排他性基準を示し得る限り、種々の標的遺伝子および対立遺伝子がエンテロバクター目の迅速なPCRベースのID/ASTに利用され得ることを示している。
実施例14 緑膿菌のリアルタイムPCR IDおよびASTアッセイ
3つの異なる標的遺伝子、tuf、gyrB、rpoB、および3つのクラスの抗菌剤、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、およびメロペネムを利用する緑膿菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。tufについては、配列番号32(フォワードプライマー)、配列番号33(リバースプライマー)、配列番号34(プローブ);gyrBについては、配列番号35(フォワードプライマー)、配列番号36(リバースプライマー)、配列番号37(プローブ);rpoBについては、配列番号38(フォワードプライマー)、配列番号39(リバースプライマー)、配列番号40(プローブ)。緑膿菌株16657(耐性)および17816(感受性)の抗菌剤感受性を、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈して、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間のインキュベーション後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。図34に示すように、結果は、いくつかの標的対立遺伝子がいくつかの抗菌剤についてより良好に機能するようであるが、2つの緑膿菌株について正しい感受性結果を得るために3つ全ての遺伝子標的を利用できることを示している。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子が緑膿菌の正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なPCRベースのID/ASTに利用し得ることを示している(図11~13を参照されたい)。
3つの異なる標的遺伝子、tuf、gyrB、rpoB、および3つのクラスの抗菌剤、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、およびメロペネムを利用する緑膿菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。tufについては、配列番号32(フォワードプライマー)、配列番号33(リバースプライマー)、配列番号34(プローブ);gyrBについては、配列番号35(フォワードプライマー)、配列番号36(リバースプライマー)、配列番号37(プローブ);rpoBについては、配列番号38(フォワードプライマー)、配列番号39(リバースプライマー)、配列番号40(プローブ)。緑膿菌株16657(耐性)および17816(感受性)の抗菌剤感受性を、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈して、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間のインキュベーション後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。図34に示すように、結果は、いくつかの標的対立遺伝子がいくつかの抗菌剤についてより良好に機能するようであるが、2つの緑膿菌株について正しい感受性結果を得るために3つ全ての遺伝子標的を利用できることを示している。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子が緑膿菌の正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なPCRベースのID/ASTに利用し得ることを示している(図11~13を参照されたい)。
実施例15 アシネトバクター・バウマニのリアルタイムPCR IDおよびASTアッセイ
3つの異なる標的遺伝子、ompA、rpoB、gyrB、および3つのクラスの抗菌剤、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、およびメロペネムを利用するアシネトバクター・バウマニの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。ompAについては、配列番号20(フォワードプライマー)、配列番号21(リバースプライマー)、配列番号22(プローブ);rpoBについては、配列番号23(フォワードプライマー)、配列番号24(リバースプライマー)、配列番号25(プローブ);gyrBについては、配列番号26(フォワードプライマー)、配列番号27(リバースプライマー)、配列番号28(プローブ)。A.バウマニ株17694(耐性)および16421(感受性)の抗菌剤感受性を、ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈し、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間のインキュベーション後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。図35に示すように、結果は、いくつかの標的対立遺伝子がいくつかの抗菌剤についてより良好に機能するようであるが、両方のAbi株について正しい感受性結果を得るために3つ全ての遺伝子標的を利用し得ることを示している。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子がA.バウマニに対する正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なPCRをベースとするID/ASTに利用され得ることを示している(図8~10を参照されたい)。
3つの異なる標的遺伝子、ompA、rpoB、gyrB、および3つのクラスの抗菌剤、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、およびメロペネムを利用するアシネトバクター・バウマニの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。ompAについては、配列番号20(フォワードプライマー)、配列番号21(リバースプライマー)、配列番号22(プローブ);rpoBについては、配列番号23(フォワードプライマー)、配列番号24(リバースプライマー)、配列番号25(プローブ);gyrBについては、配列番号26(フォワードプライマー)、配列番号27(リバースプライマー)、配列番号28(プローブ)。A.バウマニ株17694(耐性)および16421(感受性)の抗菌剤感受性を、ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈し、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間のインキュベーション後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。図35に示すように、結果は、いくつかの標的対立遺伝子がいくつかの抗菌剤についてより良好に機能するようであるが、両方のAbi株について正しい感受性結果を得るために3つ全ての遺伝子標的を利用し得ることを示している。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子がA.バウマニに対する正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なPCRをベースとするID/ASTに利用され得ることを示している(図8~10を参照されたい)。
実施例16 黄色ブドウ球菌のリアルタイムPCR IDおよびASTアッセイ
3つの異なる標的遺伝子(gyrB、ddlA、tuf)、および1つのクラスの抗菌剤:セフォキシチン(セファロスポリン)を利用する黄色ブドウ球菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を実施した。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。gyrBについては、配列番号73(フォワードプライマー)、配列番号74(リバースプライマー)、配列番号75(プローブ);ddlAについては、配列番号76(フォワードプライマー)、配列番号77(リバースプライマー)、配列番号78(プローブ);tufについては、配列番号79(フォワードプライマー)、配列番号80(リバースプライマー)、配列番号81(プローブ)。黄色ブドウ球菌株15509(耐性)および16405(感受性)の抗菌剤感受性を、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈し、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間のインキュベーション後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。結果は、図36に示すように、いくつかの標的対立遺伝子はより良好に機能するようであるが、両方の黄色ブドウ球菌株について正しい感受性結果を得るために、3つ全ての遺伝子標的を利用し得ることを示す。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子が黄色ブドウ球菌に対する正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なPCRベースのID/ASTに利用され得ることを示している(図21~22を参照されたい)。
3つの異なる標的遺伝子(gyrB、ddlA、tuf)、および1つのクラスの抗菌剤:セフォキシチン(セファロスポリン)を利用する黄色ブドウ球菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を実施した。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。gyrBについては、配列番号73(フォワードプライマー)、配列番号74(リバースプライマー)、配列番号75(プローブ);ddlAについては、配列番号76(フォワードプライマー)、配列番号77(リバースプライマー)、配列番号78(プローブ);tufについては、配列番号79(フォワードプライマー)、配列番号80(リバースプライマー)、配列番号81(プローブ)。黄色ブドウ球菌株15509(耐性)および16405(感受性)の抗菌剤感受性を、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈し、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間のインキュベーション後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。結果は、図36に示すように、いくつかの標的対立遺伝子はより良好に機能するようであるが、両方の黄色ブドウ球菌株について正しい感受性結果を得るために、3つ全ての遺伝子標的を利用し得ることを示す。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子が黄色ブドウ球菌に対する正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なPCRベースのID/ASTに利用され得ることを示している(図21~22を参照されたい)。
実施例17 エンテロコッカス・フェシウムのリアルタイムPCR IDおよびASTアッセイ
3つの異なる標的遺伝子(rpoB、ddl、gyrB)、および2つのクラスの抗菌剤、アンピシリン(ベータ-ラクタム)およびバンコマイシン(糖ペプチド)を利用するエンテロコッカス・フェシウムエンテロコッカス・フェシウムの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。rpoBについては、配列番号53(フォワードプライマー)、配列番号54(リバースプライマー)、配列番号55(プローブ);ddlについて、配列番号56~57(フォワードプライマー)、配列番号58~59(リバースプライマー)、配列番号60~61(プローブ);gyrBについては、配列番号62~63(フォワードプライマー)、配列番号64~65(リバースプライマー)、配列番号66(プローブ)。E.フェシウム株18483(耐性)および18446(感受性)の抗菌剤感受性を、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈し、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間のインキュベーション後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。結果は、図37に示すように、いくつかの標的対立遺伝子はより良好に機能するようであるが、両方のE.フェシウム株について正しい感受性結果を得るために、3つ全ての遺伝子標的を利用し得ることを示す。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子がE.フェシウムの正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なPCRベースのID/ASTに利用し得ることを示している(図17~19を参照されたい)。
3つの異なる標的遺伝子(rpoB、ddl、gyrB)、および2つのクラスの抗菌剤、アンピシリン(ベータ-ラクタム)およびバンコマイシン(糖ペプチド)を利用するエンテロコッカス・フェシウムエンテロコッカス・フェシウムの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー/プローブセットは以下のとおりであった。rpoBについては、配列番号53(フォワードプライマー)、配列番号54(リバースプライマー)、配列番号55(プローブ);ddlについて、配列番号56~57(フォワードプライマー)、配列番号58~59(リバースプライマー)、配列番号60~61(プローブ);gyrBについては、配列番号62~63(フォワードプライマー)、配列番号64~65(リバースプライマー)、配列番号66(プローブ)。E.フェシウム株18483(耐性)および18446(感受性)の抗菌剤感受性を、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)の文書M100 ED30に従って解釈し、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、5e5CFU/mLで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、4時間のインキュベーション後、実施例12のプロトコルを使用してPCRをベースとする迅速ID/AST試験に供した。結果は、図37に示すように、いくつかの標的対立遺伝子はより良好に機能するようであるが、両方のE.フェシウム株について正しい感受性結果を得るために、3つ全ての遺伝子標的を利用し得ることを示す。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子がE.フェシウムの正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なPCRベースのID/ASTに利用し得ることを示している(図17~19を参照されたい)。
実施例18 カンジダ属のリアルタイムPCR IDおよびASTアッセイ
図38に示すような、以下のプライマーおよびプローブを使用して、標的遺伝子RDN18(18sリボソームRNA)およびRDN58(5.8sリボソームRNA)を用いて、カンジダの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を実施し得る。RDN18について、配列番号88(フォワードプライマー)、配列番号89(リバースプライマー)、配列番号90(プローブ);RDN58について、配列番号91(フォワードプライマー)、配列番号92(リバースプライマー)、配列番号93(プローブ)。カンジダについての正確な包括性および排他性の基準を図26~27に示す。
図38に示すような、以下のプライマーおよびプローブを使用して、標的遺伝子RDN18(18sリボソームRNA)およびRDN58(5.8sリボソームRNA)を用いて、カンジダの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を実施し得る。RDN18について、配列番号88(フォワードプライマー)、配列番号89(リバースプライマー)、配列番号90(プローブ);RDN58について、配列番号91(フォワードプライマー)、配列番号92(リバースプライマー)、配列番号93(プローブ)。カンジダについての正確な包括性および排他性の基準を図26~27に示す。
実施例19 汎用リアルタイムPCR IDおよびASTアッセイ
広く保存された16sリボソームRNA遺伝子を標的として、配列番号94(フォワードプライマー)、配列番号95(リバースプライマー)および配列番号96(プローブ)である図39に示すプライマーおよびプローブを使用して、任意の所与のグラム陰性菌またはグラム陽性菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を実施し得る。
広く保存された16sリボソームRNA遺伝子を標的として、配列番号94(フォワードプライマー)、配列番号95(リバースプライマー)および配列番号96(プローブ)である図39に示すプライマーおよびプローブを使用して、任意の所与のグラム陰性菌またはグラム陽性菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を実施し得る。
実施例20 ブレイクポイント群を用いたマルチプレックスPCR IDアッセイ
図40Aは、グラム陰性病原体PCRマルチプレックスマスターミックスの包括性および排他性性能を示す。アシネトバクターPCR検出セットは、ompA遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP2603(配列番号20)、リバースプライマーSEGP2606(配列番号21)、およびプローブSEGP2769(配列番号22)を利用したものであり(表V参照)、アッセイ結果はチャンネル1に報告されている。緑膿菌PCR検出セットは、tuf遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP2341(配列番号32)、リバースプライマーSEGP2342(配列番号33)、およびプローブSEGP2343(配列番号34)を利用し(表VIII参照)、アッセイ結果はチャネル2に報告されている。エンテロバクター目PCR検出セットは、gyrB遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP1899(配列番号8)、リバースプライマーSEGP1901(配列番号9)およびプローブSEGP2016(配列番号10)を利用し(表IIIを参照)、アッセイ結果はチャネル3に報告されている。一般的な細菌PCR検出セットは、16srRNA遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP1830(配列番号94)、リバースプライマーSEGP1831(配列番号95)およびプローブSEGP1895.1(配列番号96)を利用し(表XXVIII参照)、アッセイ結果はチャネル4に報告されている。最後に、一般的な内部対照PCR検出セットは、フォワードプライマーSEGP1952(ACAACCGCGCCATACATGTCAAGA<t_BB_dC>;配列番号97)、リバースプライマーSEGP1953(GTCGGGCCGCTTATACAGTACCA<t_BB_dC>;配列番号98)およびプローブSEGP1954(<CY5.5>TGCGCGTCCCG<BHQ_2>TTTTGATACTTCGTAACGGTGC<Phos>;配列番号99)を利用し、アッセイ結果はチャネル5に報告されている。ブレイクポイント群、チャネルおよび色素波長を図40Bに要約する。ゲノムDNAの濃度は、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。マルチプレックス反応を、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーから単離されたゲノムDNAに対して試験した。さらに、一般的なグラム陽性病原体から単離されたゲノムDNAでは有意な増幅は観察されなかった(データは示さず)。設計されたように、増幅曲線が所望の病原体について正しいチャネルで観察され、多重反応が非常に強い包括性および排他性を有することを示している。
図40Aは、グラム陰性病原体PCRマルチプレックスマスターミックスの包括性および排他性性能を示す。アシネトバクターPCR検出セットは、ompA遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP2603(配列番号20)、リバースプライマーSEGP2606(配列番号21)、およびプローブSEGP2769(配列番号22)を利用したものであり(表V参照)、アッセイ結果はチャンネル1に報告されている。緑膿菌PCR検出セットは、tuf遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP2341(配列番号32)、リバースプライマーSEGP2342(配列番号33)、およびプローブSEGP2343(配列番号34)を利用し(表VIII参照)、アッセイ結果はチャネル2に報告されている。エンテロバクター目PCR検出セットは、gyrB遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP1899(配列番号8)、リバースプライマーSEGP1901(配列番号9)およびプローブSEGP2016(配列番号10)を利用し(表IIIを参照)、アッセイ結果はチャネル3に報告されている。一般的な細菌PCR検出セットは、16srRNA遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP1830(配列番号94)、リバースプライマーSEGP1831(配列番号95)およびプローブSEGP1895.1(配列番号96)を利用し(表XXVIII参照)、アッセイ結果はチャネル4に報告されている。最後に、一般的な内部対照PCR検出セットは、フォワードプライマーSEGP1952(ACAACCGCGCCATACATGTCAAGA<t_BB_dC>;配列番号97)、リバースプライマーSEGP1953(GTCGGGCCGCTTATACAGTACCA<t_BB_dC>;配列番号98)およびプローブSEGP1954(<CY5.5>TGCGCGTCCCG<BHQ_2>TTTTGATACTTCGTAACGGTGC<Phos>;配列番号99)を利用し、アッセイ結果はチャネル5に報告されている。ブレイクポイント群、チャネルおよび色素波長を図40Bに要約する。ゲノムDNAの濃度は、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。マルチプレックス反応を、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーから単離されたゲノムDNAに対して試験した。さらに、一般的なグラム陽性病原体から単離されたゲノムDNAでは有意な増幅は観察されなかった(データは示さず)。設計されたように、増幅曲線が所望の病原体について正しいチャネルで観察され、多重反応が非常に強い包括性および排他性を有することを示している。
図41Aは、グラム陽性病原体PCRマルチプレックスマスターミックスの包括性および排他性性能を示す。ストレプトコッカスPCR検出セットは、tuf遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP1705(配列番号100)、リバースプライマーSEGP1706(配列番号101)、およびプローブSEGP1709.1(配列番号102)を利用し(表XXV参照)、アッセイ結果はチャネル1に報告されている。スタフィロコッカスPCR検出セットは、tuf遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP1835(配列番号79)、リバースプライマーSEGP1836(配列番号80)、およびプローブSEGP1838(配列番号81)を利用し(表XXI参照)、アッセイ結果はチャネル2に報告されている。エンテロコッカスPCR検出セットは、rpoB遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP2522(配列番号53)、リバースプライマーSEGP2525(配列番号54)、およびプローブSEGP2770(配列番号55)を利用し(表XV参照)、アッセイ結果はチャネル3に報告すされている。一般的な細菌PCR検出セットは、16srRNA遺伝子を標的とする、フォワードプライマーSEGP1830(配列番号94)、リバースプライマーSEGP1831(配列番号95)、およびプローブSEGP1895.1(配列番号96)を利用し(表XXVIII参照)、アッセイ結果はチャネル4に報告されている。最後に、一般的な内部対照PCR検出セットは、フォワードプライマーSEGP1952(配列番号97)、リバースプライマーSEGP1953(配列番号98)およびプローブSEGP1954(配列番号99)を利用し、アッセイ結果はチャネル5に報告されている。ブレイクポイント群、チャネルおよび色素波長を図41Bに要約する。ゲノムDNAの濃度は、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。マルチプレックス反応を、一般的なグラム陽性病原体:S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディス由来の精製ゲノムDNAに対して試験した。さらに、一般的なグラム陰性病原体から単離されたゲノムDNAでは有意な増幅は観察されなかった(データは示さず)。設計されたように、増幅曲線が所望の病原体について正しいチャネルで観察され、多重反応が非常に強い包括性および排他性を有することを示している。
実施例21 PCR-ASTアッセイの分析
図42は、図4に概説されるように、異なるチャネルに分離され、集団の統計的分離を使用して解釈される複数の病原体群の感受性分離株と耐性分離株を区別するために使用し得る種々の閾値を示す、多様なグラム陰性株に対する一連のPCR-ASTアッセイからのグラフを含む。シプロフロキサシン感受性に関連する閾値は、
A)ompA遺伝子を標的とする配列番号17~19のプライマー/プローブを使用するアシネトバクター・バウマニ(Abi)、B)rplP遺伝子を標的とする配列番号1~3のプライマー/プローブを使用したエンテロバクター目(Entero)、およびC)O-アセチラーゼ遺伝子を標的とする、表XXXIIIに示されるようなプライマー/プローブを使用する緑膿菌(Pae)について示されており、シプロフロキサシンなしの対照(ΔCt)に対する2μg/mLのシプロフロキサシンでのCt値の変化、0.5μRFIg/mLのシプロフロキサシンおよび1μg/mLのシプロフロキサシンでのΔCt、および0.5μg/mLのシプロフロキサシンでのCt蛍光値の前の傾き(傾き)および1μg/mLのシプロフロキサシンでのΔCtに基づく。
図42は、図4に概説されるように、異なるチャネルに分離され、集団の統計的分離を使用して解釈される複数の病原体群の感受性分離株と耐性分離株を区別するために使用し得る種々の閾値を示す、多様なグラム陰性株に対する一連のPCR-ASTアッセイからのグラフを含む。シプロフロキサシン感受性に関連する閾値は、
A)ompA遺伝子を標的とする配列番号17~19のプライマー/プローブを使用するアシネトバクター・バウマニ(Abi)、B)rplP遺伝子を標的とする配列番号1~3のプライマー/プローブを使用したエンテロバクター目(Entero)、およびC)O-アセチラーゼ遺伝子を標的とする、表XXXIIIに示されるようなプライマー/プローブを使用する緑膿菌(Pae)について示されており、シプロフロキサシンなしの対照(ΔCt)に対する2μg/mLのシプロフロキサシンでのCt値の変化、0.5μRFIg/mLのシプロフロキサシンおよび1μg/mLのシプロフロキサシンでのΔCt、および0.5μg/mLのシプロフロキサシンでのCt蛍光値の前の傾き(傾き)および1μg/mLのシプロフロキサシンでのΔCtに基づく。
図43A)は、Abi、Pae、および菌株E.クロアカ(Ecl)、大腸菌(Eco)、K.アエロゲネス(Kae)、およびK.ニューモニエ(Kpn)に細分されたエンテロバクター目について試験した耐性および感受性分離株の分布を示す。図42の閾値を使用した種間でのシプロフロキサシンの感受性、特異性およびカテゴリー一致を図43B)に示す。感受性は、全陽性/(全陽性+偽陰性)として定義され:特異性は、総陰性/(総陰性+偽陽性)として定義され;カテゴリー一致は、(全陽性+全陰性)/(全陽性+偽陰性+全陰性+偽陽性)として定義される。
図44は、ゲンタマイシン感受性に関連する閾値が、それぞれのプライマー/プローブセットを使用するA)Abi、B)Entero、およびC)Paeについて示される第2のPCR-ASTアッセイからのグラフを含み、1μg/mLのゲンタマイシンでの注入サイクル、1μg/mLのゲンタマイシンおよび8μg/mLのゲンタマイシンでの絶対蛍光強度(ΔAFI)の変化、ならびに16μg/mLのゲンタマイシンおよび4μg/mLのゲンタマイシンでのΔAFIでの生蛍光データに適合する曲線の適合度に基づいている。図45A)は、Abi、Pae、および菌株エンテロバクター.クロアカ(Ecl)、大腸菌(Eco)、クレブシエラ.アエロゲネス(Kae)、およびクレブシエラ.ニューモニエ(Kpn)に細分されたエンテロバクター目について試験した耐性および感受性分離株の分布を示す。図44の閾値を使用した種間にわたるゲンタマイシンの感受性、特異性およびカテゴリー一致を図45B)に示す。
図46は、それぞれのプライマー/プローブセットを使用する、A)Abi、B)Entero、およびC)Paeについて、メロペネム感受性に関連する閾値が示される第3のPCR-ASTアッセイからのグラフを含み、メロペネムなしの対照(ΔCt)に対する4μg/mLのメロペネムでのCt値の変化、0.25μg/mLでの最低メロペネム濃度(ΔAbx-Ct)および0.25μg/mLメロペネムでの絶対Ct値(Ct)に対する4μg/mLのメロペネムでのCt値の変化、ならびに1μg/mLのメロペネムでの絶対蛍光強度(AFI)および4μg/mLメロペネムでのΔCtに基づく。図47A)は、Abi、Paeおよびエンテロバクター目Ecl、Eco、KaeおよびKpnについて試験した耐性および感受性分離株の分布を示す。図46の閾値を使用した種間にわたるゲンタマイシンの感受性、特異性およびカテゴリー一致を図47B)に示す。
図48A)は、一定濃度の細菌を全血に添加し、赤血球を分離し、細菌を含む血漿を市販の血液培養ボトルに接種し、一晩インキュベートし、次いでゲンタマイシンに耐性または感受性であることが知られている分離株を試験するための実施例12に記載されているPCR-ASTアッセイプロトコルに従うことによって作成された、陽性血液培養サンプルから直接細菌分離株を試験するためのワークフローを記載する。図48B)は、Ct値(ΔCt)の変化を使用して耐性分離株を感受性分離株と区別する本実験の結果を示し、表現型の結果が陽性血液培養物から細菌上で直接得られ得ることを示す。
実施例22 複数菌サンプルの多重ID-AST PCRアッセイ
A.Kpn/AbiマルチプレックスPCR ID-ASTアッセイを、異なる感受性の組み合わせを有する2つのグラム陰性生物、クレブシエラ・ニューモニエ(Kpn)およびアシネトバクター・バウマニ(Abi)を1:1の比で用いて、種々の濃度の3つの異なる抗生物質、シプロフラキソシン、ゲンタマイシンおよびメロペネムの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Kpnシグナルの検出はATTO標識プローブからのものであり、Abiシグナルの検出はHEX標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表XXXIVに示し、結果を図49に示す。それぞれの種は、感受性(感受性)株および耐性株を分離するデルタCT閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、それにより、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。
A.Kpn/AbiマルチプレックスPCR ID-ASTアッセイを、異なる感受性の組み合わせを有する2つのグラム陰性生物、クレブシエラ・ニューモニエ(Kpn)およびアシネトバクター・バウマニ(Abi)を1:1の比で用いて、種々の濃度の3つの異なる抗生物質、シプロフラキソシン、ゲンタマイシンおよびメロペネムの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Kpnシグナルの検出はATTO標識プローブからのものであり、Abiシグナルの検出はHEX標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表XXXIVに示し、結果を図49に示す。それぞれの種は、感受性(感受性)株および耐性株を分離するデルタCT閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、それにより、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。
B.Kpn/SarマルチプレックスPCR ID-ASTアッセイを、異なる感受性の組み合わせを有する1つのグラム陰性生物クレブシエラ・ニューモニエ(Kpn)および1つのグラム陽性菌黄色ブドウ球菌(Sar)を、1:1の比で用いて、種々の濃度の3つの異なる抗生物質、シプロフロキサシン、セフォキシチンおよびメロペネムの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Kpnシグナルの検出はHEX標識プローブからのものであり、Sarシグナルの検出はFAM標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表XXXVに示し、結果を図50に示す。N/Aは、対応する細菌-薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。それぞれの種は、感受性(感受性)株および耐性株を分離するデルタCT閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、それにより、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。
C.Kpn/CalマルチプレックスPCR ID-ASTアッセイを、1つのグラム陰性生物、クレブシエラ・ニューモニエ(Kpn)、および異なる感受性の組み合わせを有する1つの真菌生物、カンジダ・アルビカンス(Cal)を1:1の比で用いて、種々の濃度の2つの異なる抗生物質、シプロフロキサシンおよびメロペネムの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Kpnシグナルの検出はHEX標識プローブからのものであり、Calシグナルの検出はFAM標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表XXXVIに示し、結果を図51に示す。N/Aは、対応する生物-薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。フルコナゾールのCal感受性を示す。Kpn株は、感受性分離株および耐性分離株を分離するデルタ-Ct閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、正確な抗菌剤感受性結果を提供した。
D.Efs/SarマルチプレックスPCR ID-ASTアッセイを、2つのグラム陽性生物、エンテロコッカス・ファエカリス(Efs)および黄色ブドウ球菌(Sar)を1:1の比で用い、異なる感受性の組み合わせを、種々の濃度のバンコマイシンの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Efsシグナルの検出はHEX標識プローブからのものであり、Sarシグナルの検出はFAM標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表XXXVIIに示し、結果を図52に示す。2つの種はいずれも、感受性分離株と耐性分離株とを分離するデルタ-Ct閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、この複数菌の状況に対する正確な抗菌剤感受性結果を提供した。
E.Sar/CalマルチプレックスPCR ID-ASTアッセイを、異なる感受性の組み合わせを有する1つのグラム陽性生物、黄色ブドウ球菌(Sar)および1つの真菌生物、カンジダ・アルビカンス(Cal)を1:1の比で用い、種々の濃度のセフォキシチンの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Sarシグナルの検出はFAM標識プローブからのものであり、Calシグナルの検出はHEX標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表XXXVIIIに示し、結果を図53に示す。N/Aは、対応する生物-薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。フルコナゾールのCal感受性を示す。Sar株は、感受性分離株と耐性分離株を分離するデルタ-Ct閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、正確な抗菌剤感受性結果を提供した。
実施例23 カルバペネム耐性の機構を決定するためのPCRアッセイ
blaKPC、blaVIM、blaNDMおよびblaOXA-48遺伝子を標的とするPCRアッセイを、カルバペネム耐性の既知の機構を有するグラム陰性病原体:K.ニューモニエ、E.クロアカ、緑膿菌、A.バウマニ、大腸菌およびK.アエロゲネスに対して試験した。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表XXXIXに示す。ゲノムDNAの濃度は、鋳型なし対照以外の全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。この実験の結果を図54に示す。図において陽性(Pos)として示す増殖曲線は、標的化された耐性機構についてのみ観察された。非標的耐性機構について有意な増幅は観察されず、それにより、カルバペネム耐性の共通の機構を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
blaKPC、blaVIM、blaNDMおよびblaOXA-48遺伝子を標的とするPCRアッセイを、カルバペネム耐性の既知の機構を有するグラム陰性病原体:K.ニューモニエ、E.クロアカ、緑膿菌、A.バウマニ、大腸菌およびK.アエロゲネスに対して試験した。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表XXXIXに示す。ゲノムDNAの濃度は、鋳型なし対照以外の全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。この実験の結果を図54に示す。図において陽性(Pos)として示す増殖曲線は、標的化された耐性機構についてのみ観察された。非標的耐性機構について有意な増幅は観察されず、それにより、カルバペネム耐性の共通の機構を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。
実施例24 種特異的PCR ID-ASTアッセイ
P.スチュアルティのcitC遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2164(配列番号115)、リバースプライマーSEGP2166(配列番号116)およびプローブSEGP2167(配列番号117)、ならびにサルモネラのinvA遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2119(配列番号118)、リバースプライマーSEGP2121(配列番号119)およびプローブSEGP2120(配列番号120)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、C.フロインデイ、P.スチュアルティ、P.レットゲリ、S.エンテリカ、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。配列を、以下の表XLに示す。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図55に示すように、有意な増幅曲線は種特異的であった。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、それぞれのグラム陰性標的種を検出するためのプライマーとプローブの4つの組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。これらの結果は、エンテロバクター目に属するいくつかの特定の種に対するブレイクポイントに基づくAST呼び出しの改善を可能にする種特異的検出セットの非限定的な例を表す。CLSIガイドラインは、ここに示されているものなどの一部のエンテロバクター目の種が特定のアミノグリコシド薬に耐性であるが、エンテロバクター目の種の大部分は耐性ではないことを示している。
P.スチュアルティのcitC遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2164(配列番号115)、リバースプライマーSEGP2166(配列番号116)およびプローブSEGP2167(配列番号117)、ならびにサルモネラのinvA遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2119(配列番号118)、リバースプライマーSEGP2121(配列番号119)およびプローブSEGP2120(配列番号120)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陰性病原体:大腸菌、K.ニューモニエ、E.クロアカ、K.オキシトカ、K.アエロゲネス、S.マルセッセンス、P.ミラビリス、C.フロインデイ、P.スチュアルティ、P.レットゲリ、S.エンテリカ、S.マルトフィリア、緑膿菌、A.バウマニ、およびA.ピティーに対して試験した。配列を、以下の表XLに示す。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図55に示すように、有意な増幅曲線は種特異的であった。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、それぞれのグラム陰性標的種を検出するためのプライマーとプローブの4つの組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。これらの結果は、エンテロバクター目に属するいくつかの特定の種に対するブレイクポイントに基づくAST呼び出しの改善を可能にする種特異的検出セットの非限定的な例を表す。CLSIガイドラインは、ここに示されているものなどの一部のエンテロバクター目の種が特定のアミノグリコシド薬に耐性であるが、エンテロバクター目の種の大部分は耐性ではないことを示している。
S.アガラクチアのgyrB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2921(配列番号121)、リバースプライマーSEGP2922(配列番号122)およびプローブSEGP2923(配列番号123)、S.アガラクチアのddlA遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2947(配列番号85)、リバースプライマーSEGP2949(配列番号86)およびプローブSEGP2951(配列番号87)、肺炎球菌のtuf遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2777(配列番号124)、リバースプライマーSEGP2778(配列番号125)およびプローブSEGP2779(配列番号126)、ならびにS.ピオゲネスのspeB遺伝子を標的とするフォワードプライマーSEGP2113(配列番号127)、リバースプライマーSEGP2114(配列番号128)およびプローブSEGP2115(配列番号129)を使用するPCRアッセイを、一般的なグラム陽性病原体:S.アガラクチア、肺炎球菌、S.ピオゲネス、E.フェシウム、E.フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびS.エピデルミディス由来の精製ゲノムDNAに対して試験した。配列を、以下の表XLIに示す。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった(データは示さず)。ゲノムDNAの濃度は、0ng/μLであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約2~10ng/μLであった。図56に示すように、有意な増幅曲線は種特異的であった。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、それぞれのグラム陽性標的種を検出するためのプライマーとプローブの4つの組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。これらの結果は、スタフィロコッカス属およびストレプトコッカス属(図31のCLSIブレイクポイント・テーブルを参照)に属するいくつかの特定の種に対する改善されたブレイクポイントに基づくAST呼び出しを可能にする種特異的検出セットの非限定的な例を表し、これらのIDウェルを有することにより、図41に示すようなより一般的なID/AST検出セットを利用し得る。
PCR ID-ASTアッセイにおいて正確なコールを行う際に種特異的プライマー/プローブセットを使用することの影響を図57に示し得る。左側のパネルでは、非種特異的プライマーおよびプローブの使用は、感受性株と耐性株とを区別し得ないことになる。対照的に、右側のパネルでは、同定を提供する種特異的プライマー/プローブセットの使用により、個々の種ごとに別々の解釈が可能になり、CLSIブレイクポイントガイドラインに対する改善されたカテゴリー一致がもたらされる。
実施例25 PCR ID-ASTアッセイデータの解釈
図58は、シグモイド関数を生のPCR曲線データに当てはめ、次いで曲線パラメータおよび特徴を計算する、PCR ID-ASTアッセイデータ解釈戦略のワークフローを示す。次いで、種々の抗生物質濃度の存在と非抗生物質基準との間で特徴を比較して、相対的な特徴変化を導出する。特徴量および抗生物質の全体のレベルにわたる変化の回帰モデリングもまた、特徴量-反応関係に対応する追加の特徴を生成するために使用され、通常の最小二乗、リッジ回帰、ラッソ(Lasso)、Elastic Net、ベイズ回帰、またはロジスティック回帰モデルの使用を含み得る。次いで、ニューラルネットワーク、樹形モデル、サポートベクターマシン、または近傍法を含み得る予測モデルを訓練するために、特徴をデータフレームにアセンブルし、グラウンドトゥルースMIC、またはグラウンドトゥルースS/I/Rと共に別々の機械学習アルゴリズムに入力される。訓練は、データを訓練セットおよびホールドアウト試験セットに分割し、続いて訓練セットを交差検証を用いてk倍に分割して、分類器のタイプごとに適切なハイパーパラメータ空間を探索することからなる。次いで、平均交差検証スコアおよび保持された試験セットの性能に基づいてモデルを選択する。次いで、訓練されたモデルは、アンサンブルとして参加して最終予測MICを返し、これは、重み付けされていない投票、重み付けされた投票、平均確率、重み付けされた確率に基づくか、または前述の分類器タイプの下流の分類器によって解釈され得る。
図58は、シグモイド関数を生のPCR曲線データに当てはめ、次いで曲線パラメータおよび特徴を計算する、PCR ID-ASTアッセイデータ解釈戦略のワークフローを示す。次いで、種々の抗生物質濃度の存在と非抗生物質基準との間で特徴を比較して、相対的な特徴変化を導出する。特徴量および抗生物質の全体のレベルにわたる変化の回帰モデリングもまた、特徴量-反応関係に対応する追加の特徴を生成するために使用され、通常の最小二乗、リッジ回帰、ラッソ(Lasso)、Elastic Net、ベイズ回帰、またはロジスティック回帰モデルの使用を含み得る。次いで、ニューラルネットワーク、樹形モデル、サポートベクターマシン、または近傍法を含み得る予測モデルを訓練するために、特徴をデータフレームにアセンブルし、グラウンドトゥルースMIC、またはグラウンドトゥルースS/I/Rと共に別々の機械学習アルゴリズムに入力される。訓練は、データを訓練セットおよびホールドアウト試験セットに分割し、続いて訓練セットを交差検証を用いてk倍に分割して、分類器のタイプごとに適切なハイパーパラメータ空間を探索することからなる。次いで、平均交差検証スコアおよび保持された試験セットの性能に基づいてモデルを選択する。次いで、訓練されたモデルは、アンサンブルとして参加して最終予測MICを返し、これは、重み付けされていない投票、重み付けされた投票、平均確率、重み付けされた確率に基づくか、または前述の分類器タイプの下流の分類器によって解釈され得る。
図59は、どのようにして種ID、抗菌剤感受性試験、耐性機構検出、およびユニバーサル16s rRNA表現型情報を組み合わせて結果を返すかを示す図を示し、種IDを使用してMIC予測のための適切なアルゴリズムを選択し、その後、規制機関からの適切なブレイクポイントと比較して、感受性情報を決定する。それ故、試験された抗生物質に関連する耐性機構の検出は、その存在が予測されたMICと一致するかどうかに応じて返される感受性結果に影響を及ぼし得る。種IDが存在しない場合、16s rRNA表現型情報を使用して、感受性結果のない一般的なMICを返し得、これは、質量分析などの代替方法で決定される種IDと組み合わせて使用し得る。
アルゴリズム要素を使用してブレイクポイントベースのAST呼び出しを改善する具体例がある。一例は、表現型結果呼び出しを調整するための耐性機構検出の使用である。各耐性機構は、事前に知られているその活性に関連する1種以上の抗生物質基質を有し得る。これらの機構はまた、それらの活性を検出し得る種々の期間を有し得る。これらの耐性機構には、4時間以内に強い活性を有さず、はるかに長いインキュベーション時間(12~24時間)の後に表現型的にのみ検出し得るものもある。これらの耐性機構について、生物は、単に耐性機構が4時間の期間内で十分に現れていないという理由で、所与の薬物に感受性であると同定され得る。別々のPCRウェルを介したこれらのタイプの耐性機構を検出することで、不一致表現型結果の補正が可能になる。具体的な例は、セラチア・マルセッセンスであり、これは誘導可能であるが4時間の期間内では誘導されないことのある、SMEカルバペネマーゼ耐性機構をコードする。したがって、これらの耐性S.マルセッセンス株は、メロペネムに対して表現型的に感受性であるように見えるが、SME遺伝子を検出することで、メロペネム耐性である正しい表現型の予測が可能になる。別の例は、他の抗生物質の感受性を予測するための1つ以上の抗生物質からの表現型感受性の使用である。耐性機構は重複する基質特異性を有することが多いので、このことは、いくつかの抗生物質に対する感受性が他の抗生物質に対する感受性と直接相関することを意味する。同様に、いくつかの抗生物質に対する耐性は、他の抗生物質に対する耐性と直接相関している。これは、多くのAST製品の製造業者が使用するExpert Rulesシステムと同様であるが、本発明のPCR ID-ASTアッセイから収集されたデータは、表現型結果解釈の他の方法の補助として使用される。具体的な例は、カルバペネマーゼの性質およびエルタペネムの分解に対する基質特異性が常に高いために、抗生物質エルタペネムに感受性の株が常に抗生物質メロペネムに感受性であることであろう。同様に、メロペネムに耐性の株は、同じ理由でエルタペネムにも耐性である。
前述の発明を明確化および理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、形態および詳細の様々な変更を行うことができることが当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術および装置を、様々な組合せで使用することができる。
Claims (36)
- 少なくとも1つの濃度の少なくとも1つの抗菌剤または抗菌剤クラスの存在下で、レポーターとして単一の定量的リアルタイムPCRアッセイを実施して、少なくとも1つの抗菌剤または1つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する細菌または真菌の標的群の抗菌剤感受性を同時に同定および判定することを含む、方法。
- 前記細菌または真菌の標的群の前記同定が、前記細菌または真菌の標的群に特異的なシグナルを検出することによるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記特異的なシグナルが、前記細菌または真菌の標的群に由来しない標的遺伝子と比較して、前記細菌または真菌の標的群に由来する標的遺伝子に対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを使用することによって検出される、請求項2に記載の方法。
- 前記標的遺伝子が、rplP、ompA、tuf、rpoB、ddl、ddlA、fdnG、sodA、gyrB、O抗原アセチル化酵素、ecfX、tusA、CPE、sip、およびnucから選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記細菌または真菌の標的群が分類学上の目を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分類学上の目がエンテロバクター目である、請求項5に記載の方法。
- 前記細菌または真菌の標的群が分類学上の科を表す、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分類学上の科が、腸内細菌科、エルシニア科(Yersiniaceae)、モルガネラ科(Morganellaceae)、または前記科の組み合わせから選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記細菌または真菌の標的群が分類学上の属を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分類学上の属が、エンテロコッカス(Enterococcus)、カンジダ(Candida)、シュードモナス(Pseudomonas)、アシネトバクター(Acinetobacter)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)、ストレプトコッカス(Streptococcus)およびエシェリヒア(Escherichia)、クレブシエラ(Klebsiella)、エンテロバクター(Enterobacter)、サルモネラ(Salmonella)、シトロバクター(Citrobacter)、セラチア(Serratia)、シゲラ(Shigella)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ミクロコッカス(Micrococcus)、バチルス(Bacillus)、ヘモフィルス(Haemophilus)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、バクテロイデス(Bacteroides)、クロストリジウム(Clostridium)、ペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)、フソバクテリウム(Fusobacterium)、パスツレラ(Pasteurella)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、アエロコッカス(Aerococcus)、プレボテラ(Prevotella)、ブルクホルデリア(Burkholderia)、モラクセラ(Moraxella)、ビブリオ(Vibrio)、リステリア(Listeria)、プレジオモナス(Plesiomonas)、エルシニア(Yersinia)、モルガネラ(Morganella)、プロビデンシア(Providencia)、またはプロテウス(Proteus)から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記細菌または真菌の標的群が分類学上の種を表す、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分類学上の種が、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、大腸菌(Escherichia coli)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、シトロバクター・フロインデイ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、モルガネラ・モルガニー(Morganella morganii)、プロビデンシア・スチュアルティ(Providencia stuartii)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・アウリス(Candida auris)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクター・ピティー(Acinetobacter pittii)、アシネトバクター・ノソコマリス(Acinetobacter nosocomialis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、またはストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、腸炎ビブリオ菌(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、コレラ菌(Vibrio cholerae)から選択される、請求項11に記載の方法。
- - 前記細菌または真菌の標的群に由来しない第2の標的遺伝子と比較して、標的細菌または真菌の標的群に由来する第2の標的遺伝子に対してより選択的にハイブリダイズする追加のプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを用いて、前記細菌または真菌の標的群の同定を検証する工程;または
- 抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機序を決定する工程;または
検証する工程、および決定する工程の両方
から選択される工程を更に含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。 - 細菌または真菌の2つ以上の標的群の抗菌剤感受性を同時に同定および判定することを更に含み、細菌または真菌の各標的群が、少なくとも1つの抗菌剤または1つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌または真菌の標的群が、血流感染症(BSI)、胃腸感染症、呼吸器感染症、***症、鼻感染症、直腸感染症または創傷感染症に存在する、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子がrplP、gyrB、およびrpoBから選択される、請求項6に記載の方法。
- 分類学上のエンテロバクター目にない標的遺伝子よりも、分類学上のエンテロバクター目にある標的遺伝子に対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドが、配列番号1~16を含むヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 非エンテロバクター目のgyrBよりも、エンテロバクター目のgyrBに対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドが、配列番号8~10を含むヌクレオチド配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 少なくとも1つの濃度の少なくとも1つの抗菌剤または抗菌剤クラスの存在下で、レポーターとして単一の多重化定量的リアルタイムPCRアッセイを実施して、生物学的サンプルから複数の細菌株または真菌株の抗菌剤感受性を同時に同定および判定することを含む、方法。
- 前記生物学的サンプルが、全血、血漿、血清、赤血球画分、唾液、脳脊髄液、***、尿、便、直腸スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、皮膚スワブ、胆汁、リンパ液、痰、洗浄液、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血液、血漿、血清、またはそれらの組み合わせである、請求項20に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、前記PCRアッセイを実施する前に培養される、請求項20または21に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、細菌分離株または真菌分離株である、請求項19~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細菌株または真菌株が、少なくとも一つの抗菌剤または抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する細菌または真菌の少なくとも一つの群にグループ化される、請求項19~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細菌株または真菌株が、細菌または真菌の2つ以上の群にグループ化され、細菌または真菌の各群が、少なくとも一つの抗菌剤または一つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する、請求項24に記載の方法。
- 前記複数の細菌株または真菌株の前記同定が、複数の菌株特異的5’ヌクレアーゼ(TaqMan)オリゴヌクレオチドプローブを利用し、各プローブが蛍光色素で標識され、各蛍光色素が別の蛍光色素とは異なる発光波長を有する、請求項19~25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細菌株または真菌株の前記同定が、TAGS(Temperature Assisted Generation of Signal)技術を利用する、請求項19~26のいずれか一項に記載の方法。
- - 前記複数の細菌株または真菌株の前記同定を検証する工程;または
- 抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機序を決定する工程;または
検証する工程、および決定する工程の両方
から選択される工程を更に含む、請求項19~27のいずれか一項に記載の方法。 - 少なくとも1つの濃度の少なくとも1つの抗菌剤または抗菌剤のクラスの存在下で、単一の定量的リアルタイムPCRアッセイを実行して、前記抗菌剤もしくは抗菌剤のクラスに対する標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の標的群の感受性、中間および耐性(SIR)情報を同時に同定および決定することを含み、前記標的株または標的群の前記同定およびSIR情報の前記決定が、PCRデータに関連する1つ以上の数学的関係から導出される、方法。
- 前記数学的関係が、閾値サイクル(Ct)、勾配、シグモイド曲線適合の変曲、絶対蛍光強度(AFI)、またはエンドポイント相対強度(ERI)から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記数学的関係が、異なる抗菌剤濃度または異なる抗菌剤間の相対的表現であり、ΔCt、2^(ΔCt)、Δ変曲、ΔAFI、もしくはΔERI、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記数学的関係が、閾値サイクル(Ct)、勾配、シグモイド曲線適合の変曲、絶対蛍光強度(AFI)、もしくはエンドポイント相対強度(ERI)、またはそれらの組み合わせである、請求項30に記載の方法。
- 前記数学的関係が、異なる抗菌剤濃度または異なる抗菌剤間の相対的表現の組み合わせであり、ΔCt、2^(ΔCt)、Δ変曲、ΔAFI、もしくはΔERI、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項31に記載の方法。
- - 前記標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の標的群の前記同定を検証する工程;または
- 抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機序を決定する工程;または
検証する工程、および決定する工程の両方
から選択される工程を更に含む、請求項29~33のいずれか一項に記載の方法。 - 2つ以上の標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の2つ以上の標的群の抗菌剤感受性を同定および判定することを更に含み、各標的株または標的群は、少なくとも一つの抗菌剤または一つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する、請求項29~34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRアッセイがリアルタイムPCRアッセイである、請求項29~35のいずれか一項に記載の方法。
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