CN117344039A - 一种细菌域高覆盖率的引物、探针、其设计方法及应用 - Google Patents
一种细菌域高覆盖率的引物、探针、其设计方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117344039A CN117344039A CN202311575326.2A CN202311575326A CN117344039A CN 117344039 A CN117344039 A CN 117344039A CN 202311575326 A CN202311575326 A CN 202311575326A CN 117344039 A CN117344039 A CN 117344039A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- probe
- coverage rate
- bacterial
- primers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 98
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000013461 design Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims abstract 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 claims description 4
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 claims description 4
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 13
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 6
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 5
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000013332 literature search Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种细菌域高覆盖率的引物、探针、其设计方法及应用。属于无菌检测技术、核酸扩增技术、细胞制品及微生物安全性质量评价领域。引物包括上游引物及下游引物，上游引物的序列如SEQ_No.1所示，下游引物的序列如SEQ_No.2所示，探针的序列如SEQ_No.3所示；发明设计出一组覆盖率高、特异性强的靶向16S rRNA基因的通用型qPCR引物及探针，用于检测细胞制品的细菌污染，有效提高了细胞类制品基于核酸扩增技术的微生物安全性质量评价技术的可靠性及效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌域高覆盖率的引物、探针、其设计方法及应用，属于无菌检测技术、核酸扩增技术、细胞制品及微生物安全性质量评价领域。
背景技术
与传统的无菌生物制品相比，细胞类制品对生产工艺的无菌保障和过程控制及成品快速放行要求更高，微生物的污染检查是其安全性质控的重要指标。传统的无菌检测法依赖于微生物在培养基上的自然生长，耗时较长、需要至少14天的培养来观察微生物生长情况[1]，根本无法满足细胞类制品的过程控制和成品快速放行需求。
随着微生物学及分子生物学的高速发展，制药领域引入了多种快速微生物检测方法，包括美国药典通则1223、欧洲药典通则5.1.6、及中国药典通则9201中介绍的核酸扩增技术。其中，基于探针的荧光定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)技术灵敏度高、特异性强、检测时间短，是对细胞制品进行快速微生物检测的有效手段。
利用探针法qPCR技术，来扩增原核生物的16S rRNA基因序列的保守区，进而对细胞制品的细菌污染进行检测，已被应用于细胞制品的过程控制和成品快速放行中。但其在药品质量控制方面的应用历史较短，在检测的广谱性方面积累的数据有限，因此应用前需对检测方法的广谱性进行充分的评估。
目前已开发出了多种靶向原核生物16S rRNA基因的通用引物及探针序列，其方法学的广谱性质量评价通常通过检测多种细菌的代表物种来确认。但细菌的种类是巨大的，实验验证所能涉及的微生物种类十分有限。因此无法证明那些被认为通用的16S rRNA基因检测引物对是否真正涵盖了整个原核生物谱。例如，一些证据表明，即使是针对16S rRNA基因高度保守区域的著名引物对“27F”和“1492R”[2]，也不是完全通用的[3,4]。目前靶向16SrRNA基因的qPCR引物及探针的通用性尚未得到充分评估。
因此，本领域亟需一种靶向16S rRNA基因的细菌域高覆盖率的qPCR引物及探针以提升检测方法的广谱性。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术中靶向16S rRNA基因的qPCR引物及探针覆盖率较低的问题。
为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种细菌域高覆盖率的引物、探针、其设计方法及应用。
本发明的第一方面，提供了一种细菌域高覆盖率的引物及探针，引物包括上游引物及下游引物，上游引物的序列如SEQ_No.1所示，下游引物的序列如SEQ_No.2所示，探针的序列如SEQ_No.3所示；
SEQ_No.1：CCTACGGGWGGCWGCAG；
SEQ_No.2：GGACTACCRGGGTMTCTAATC；
SEQ_No.3：FAM-CAGCAGCCGCGGTA-MGB；
其中，W代表简并碱基A/T，R代表简并碱基A/G，M代表简并碱基A/C；FAM为荧光基团，MGB为荧光淬灭基团。
本发明的第二方面，提供了一种细菌域高覆盖率的引物及探针设计方法，包括以下步骤：
步骤1：建立细菌域高覆盖率引物及探针的评估标准：
根据已有的文献及检测方法，测定现有的通用型引物及探针对细菌域中常见微生物类群的覆盖率；其中，细菌域中常见微生物类群包括变形菌门、放线菌门、厚壁菌门及拟杆菌门；
细菌域高覆盖率引物在细菌域及细菌域中常见微生物类群的覆盖率均应达到78％以上，同时，细菌域高覆盖率探针在细菌域及细菌域中常见微生物类群的覆盖率均应达到85％以上；
步骤2：在NCBI(National Center for Biotechnology Information)中检索多种细菌的16S rRNA基因序列，利用Clustal Omega对其进行同源性分析，获得细菌的高保守区序列；
步骤3：遵循qPCR引物及探针设计基本原则[5]，设计引物及探针序列扩增16SrRNA基因部分保守区；
步骤4：利用OligoCalc在线计算器计算引物的退火温度并评估引物及探针的扩增性能；
步骤5：利用NCBI的Primer-blast功能评估引物的特异性；
步骤6：采用步骤1中的标准，对步骤3、步骤4、步骤5设计出的引物及探针进行覆盖率评估，若在步骤1规定的覆盖率范围中，即设计完成，否则重新进行步骤3、步骤4及步骤5，再次进行覆盖率评估，直至落入步骤1规定的覆盖率范围中。
本发明的第三方面，提供了一种细菌域高覆盖率的引物及探针在细胞制品无菌快检中的应用，在进行无菌快速检测前须先评估所用通用型qPCR引物及探针的覆盖率，判别其是否真正具备广谱性。
优选地，所述的引物及探针为上述的细菌域高覆盖率的引物及探针。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明设计出一组覆盖率高、特异性强的靶向16S rRNA基因的通用型qPCR引物及探针用以检测细胞制品的细菌污染，有效提高了细胞类制品基于核酸扩增技术的微生物安全性质量评价技术的可靠性及效率。
附图说明
图1为本发明中引物及探针在16S rRNA基因中分布图；
图2为本发明中上游引物扩增性能评估图；
图3为本发明中下游引物扩增性能评估图；
图4为本发明中探针扩增性能评估图；
图1中，绿色模块表示16S rRNA基因的10个保守区C1-C10，蓝色模块表示16S rRNA基因的9个可变区。本申请所设计上游引物位于大肠杆菌16S rRNA基因C3保守区，下游引物位于大肠杆菌16S rRNA基因C5保守区，探针位于大肠杆菌16S rRNA基因C4保守区。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
对比例1、对常用引物及探针的细菌域覆盖率进行评估。
经过文献检索与筛选，将通过资格标准的16S rRNA qPCR引物及探针序列纳入通用性分析，获得其对细菌域的覆盖率评估，
文献检索与筛选步骤为：
步骤1：文献检索，在英文在线数据库中检索，设置检索字段为“所有字段”，使用的检索词有“bacteria qPCR”、“microbe qPCR”、“16S rRNA qPCR”，使用布尔运算符(Booleanoperator)AND,OR和NOT扩大和缩小检索范围；
步骤2：文献筛选，分为标题摘要筛选(初筛)和全文筛选(复筛)；
其中，标题摘要筛选方法为：将文献检索过程中检索得到的所有文献的作者、出版时间、标题和摘要导入文献管理软件中，逐一阅读导入文献的标题和摘要，保留符合主题，即包含利用探针法qPCR技术检测细菌的文献，经过标题摘要筛选得到的文献进行全文筛选；
全文筛选方法为：下载并阅读经过标题摘要筛选得到的潜在文献的全文及其补充材料，查询其中靶向16S rRNA基因的引物及探针序列，根据资格标准评估确定是否纳入分析；
步骤3：资格标准筛选：
3.1只有靶向16S rRNA基因的引物及探针序列被纳入研究；
3.2只有探针法qPCR技术所用的引物及探针序列被纳入研究，不考虑无探针的染料法qPCR所用引物对；
3.3只有靶向16S rRNA基因的广谱引物及探针序列被纳入研究，不考虑细菌域的种属特异性引物及探针序列；
3.4只有位于大肠杆菌16S rRNA基因序列45～1430bp(Silva数据库可比对范围)之间的引物及探针序列被纳入研究；
3.5仅考虑扩增片段小于500bp的引物序列；
3.6高引文献的引物及探针序列优先被纳入研究。
细菌域的覆盖率评估方法为：
利用Silva数据库Search功能中的TestPrime模块和TestProbe模块分别对通过资格标准的引物及探针序列进行覆盖率评估，所用数据库选择SSU r138.1，所用数据库类型选择RefNR；要求引物及探针序列与数据库序列完全匹配，即“0mis match”，以此获得引物及探针序列的完全匹配覆盖率，并研究细胞常见细菌污染涉及的微生物分类，包括变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门中引物及探针的覆盖范围。
文献检索与筛选及细菌域的覆盖率评估结果如表1所示：
表1引物及探针序列对细菌域的覆盖率
注：1.序列位置指引物及探针序列在大肠杆菌16S rRNA基因中的位置。
2.覆盖率指序列与16S rRNA基因100％匹配时，上下游引物在细菌域的覆盖率，其中，括号中的数据表示探针序列在细菌域的覆盖率。
由表1可知，被广泛使用的靶向16S rRNA基因的通用型qPCR引物覆盖率介于76.2％～7.6％之间，探针覆盖率介于89.1％～2.5％之间，这表明目前所使用的广谱细菌域引物及探针并不能完全覆盖所有已知的细菌分类群。其中，Corless CE等人[10]设计的引物对常被当作靶向16S rRNA基因的通用引物使用，但其真实的基因覆盖率极低，不到10％。这表明评估引物的通用性，仅靠检测部分细菌分类群的代表物种来确认是远远不够的。特别是在细胞制品的无菌检测中，所用核酸检测技术的引物的细菌域覆盖率直接影响到细胞类制品的质量评估和放行，若不使用经过准确评估的高通用型引物进行无菌检测，极有可能造成问题制品被放行的严重后果。
此外，尽管Klaschik S等人[6]设计的引物对覆盖率较高，但其所搭配的探针序列对16S rRNA基因的覆盖率极低，仅有2.5％，这将直接拉低qPCR检测的整体可靠性。这表明对于qPCR检测效率的评估，仅仅探索上下游引物的覆盖率是不可行的，必须搭配所用探针覆盖率的检测，以综合评价qPCR技术靶向16SrRNA基因的能力。
对比例2、对常用引物及探针在各个微生物分类群的覆盖率进行评估
细胞制品常见细菌污染包括原辅料来源污染及环境污染，其中细菌主要分布于细菌域的变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门。对通过资格标准的16SrRNA基因的qPCR引物及探针序列在常见微生物分类群的覆盖率进行评估，获得表2。
表2引物及探针序列对常见微生物分类群的覆盖率
注：覆盖率指序列与16S rRNA基因100％匹配时，上下游引物在各个微生物分类群的覆盖率，其中，括号中的数据表示探针序列在各个微生物分类群的覆盖率。
由表2可知，各引物对及探针对不同微生物分类群的覆盖率并不一致，如Yang S等人[9]设计的引物，对厚壁菌门的覆盖率达50.8％，但在放线菌门，其覆盖率仅有0.4％。这就会造成微生物检测时，对放线菌门微生物的遗漏。因此，在进行引物及探针的通用性评估时，不仅要考虑其对于细菌域整体的覆盖率，还应考虑其在各个微生物分类群的覆盖率。对于细胞制品的快速无菌检测，更应评估其在常见细胞污染微生物分类群中的覆盖率，使其更广泛、更均匀的检测到细胞常见污染微生物，以提高检测手段的准确性和可靠性。
总的来说，高效的、有价值的细胞制品无菌检测方案，其所使用的引物及探针，不仅覆盖率高、通用性强，还应能较为广泛地、均匀地检测出各个常见污染细菌分类群。
实施例1、细菌域高覆盖率引物及探针设计及其扩增性能评估
在NCBI中检索多种细菌的16S rRNA基因序列，利用Clustal Omega对其进行同源性分析，获得细菌16S rRNA基因的高保守区序列，基于引物及探针设计基本原则，设计获得引物及探针序列(见表3)。
表3细菌域高覆盖率引物及探针序列
注：序列位置指引物及探针序列在大肠杆菌16S rRNA基因中的位置。
其中，为提高引物的广谱性，结合引物与微生物各分类群的序列匹配情况，特设计简并碱基以增强引物的覆盖率。如图1所示，所设计上游引物位于大肠杆菌16S rRNA基因C3保守区，下游引物位于大肠杆菌16S rRNA基因C5保守区，探针序列位于大肠杆菌16S rRNA基因C4保守区。该引物对扩增片段长度约为466bp。上下游引物退火温度相近，均接近60℃。探针退火温度约高于引物退火温度5～10℃，符合探针法qPCR引物设计一般原则。此外，OligoCalc在线计算器计算表明上下游引物及探针序列均不存在潜在发夹结构及3`端互补(如图2-图4所示)，引物扩增效率有所保证。
实施例2、细菌域高覆盖率引物及探针特异性和覆盖率评估
利用NCBI的primer-blast功能对本发明所设计的引物及探针序列与人源基因组、真菌基因组、病毒基因组序列进行同源性评估，以检测所设计引物及探针序列的特异性。由表4可知，该引物组无法扩增出人源基因、真菌基因及病毒基因。这表明本发明设计的引物及探针序列具备高特异性，十分适宜细胞制品无菌检测中的细菌检测，这对提高引物扩增效率，降低假阳性结果具有重要意义。
表4细菌域高覆盖率引物及探针特异性评估
同时评估了引物及探针序列靶向16S rRNA基因的广谱性，其在细菌域及各个微生物分类群的覆盖率如表5所示。本发明所设计引物及探针序列对细菌域的覆盖率分别为78.5％和92.8％，较表1中所示通用型引物及探针的覆盖率均明显升高。且在各个常见微生物分类群中，该组引物及探针的覆盖率整体上显著提升，能更广泛、更均匀地检测到各个微生物分类群。这表明其不仅对细菌域整体具有较高的广谱性，同时对细胞常见微生物污染涉及的各个分类群也具有较好的靶向性，是良好的通用型细胞制品无菌快检引物及探针。
表5细菌域高覆盖率引物及探针覆盖率评估
以上所述，仅为本发明的较佳实施例并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
参考文献
1.厉高慜,潘伟婧,陈鑫,邵泓,陈钢:呼吸信号检测的快速微生物方法应用于细胞制品无菌检查的研究.中国现代应用药学2020,37(21):2594-2598.
2.Weisburg WG,Barns SM,Pelletier DA,Lane DJ:16S ribosomal DNAamplification for phylogenetic study.J Bacteriol 1991,173(2):697-703.
3.Vergin KL,Urbach E,Stein JL,DeLong EF,Lanoil BD,Giovannoni SJ:Screening of a fosmid library of marine environmental genomic DNAfragmentsreveals four clones related to members of the orderPlanctomycetales.Appl EnvironMicrobiol 1998,64(8):3075-3078.
4.Derakshani M,Lukow T,Liesack W:Novel bacterial lineages at the(sub)division level as detected by signature nucleotide-targeted recovery of 16SrRNAgenes from bulk soil and rice roots of flooded rice microcosms.ApplEnvironMicrobiol 2001,67(2):623-631.
5.Thornton B,Basu C:Rapid and simple method of qPCR primerdesign.Methods Mol Biol 2015,1275:173-179.
6.Klaschik S,Lehmann LE,Raadts A,Book M,Hoeft A,Stuber F:Real-timePCRfor detection and differentiation of gram-positive and gram-negativebacteria.JClin Microbiol 2002,40(11):4304-4307.
7.Takai K,Horikoshi K:Rapid detection and quantification of membersof thearchaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes.ApplEnvironMicrobiol 2000,66(11):5066-5072.
8.Nadkarni MA,Martin FE,Jacques NA,Hunter N:Determination ofbacterialload by real-time PCR using a broad-range(universal)probe andprimers set.Microbiology(Reading)2002,148(Pt 1):257-266.
9.Yang S,Lin S,Kelen GD,Quinn TC,Dick JD,Gaydos CA,Rothman RE:Quantitative multiprobe PCR assay for simultaneous detection andidentification tospecies level of bacterial pathogens.J Clin Microbiol 2002,40(9):3449-3454.
10.Corless CE,Guiver M,Borrow R,Edwards-Jones V,Kaczmarski EB,Fox AJ:Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rRNAPCR.J ClinMicrobiol 2000,38(5):1747-1752.
Claims (4)
1.一种细菌域高覆盖率的引物及探针，其特征在于，引物包括上游引物及下游引物，上游引物的序列如SEQ_No.1所示，下游引物的序列如SEQ_No.2所示，探针的序列如SEQ_No.3所示。
2.一种细菌域高覆盖率的引物及探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：建立细菌域高覆盖率引物及探针的评估标准：
根据已有的文献及检测方法，测定现有的通用型引物及探针对细菌域及细菌域中常见微生物分类群的覆盖率；其中，细菌域中常见微生物分类群包括变形菌门、放线菌门、厚壁菌门及拟杆菌门；
细菌域高覆盖率引物在细菌域及细菌域中常见微生物分类群的覆盖率均应达到78％以上，同时，细菌域高覆盖率探针在细菌域及细菌域中常见微生物分类群的覆盖率均应达到85％以上；
步骤2：在NCBI中检索多种细菌的16S rRNA基因序列，利用Clustal Omega对其进行同源性分析，获得细菌的高保守区序列；
步骤3：遵循qPCR引物及探针设计基本原则，设计引物及探针序列扩增16SrRNA基因部分保守区；
步骤4：利用OligoCalc在线计算器计算引物的退火温度并评估引物及探针的扩增性能；
步骤5：利用NCBI的Primer-blast功能评估引物的特异性；
步骤6：采用步骤1中的标准，对步骤3、步骤4、步骤5设计出的引物及探针进行覆盖率评估，若在步骤1规定的覆盖率范围中，即设计完成，否则重新进行步骤3、步骤4及步骤5，再次覆盖率评估，直至落入步骤1规定的覆盖率范围中。
3.一种细菌域高覆盖率的引物及探针在细胞制品无菌快检中的应用，其特征在于，在进行细胞制品无菌快速检测前须先评估所用通用型qPCR引物及探针的覆盖率，判别其是否真正具备广谱性。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的引物及探针为如权利要求1所述的细菌域高覆盖率的检测细胞制品中细菌污染的引物及探针。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311575326.2A CN117344039A (zh) | 2023-11-23 | 2023-11-23 | 一种细菌域高覆盖率的引物、探针、其设计方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311575326.2A CN117344039A (zh) | 2023-11-23 | 2023-11-23 | 一种细菌域高覆盖率的引物、探针、其设计方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117344039A true CN117344039A (zh) | 2024-01-05 |
Family
ID=89367738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311575326.2A Pending CN117344039A (zh) | 2023-11-23 | 2023-11-23 | 一种细菌域高覆盖率的引物、探针、其设计方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117344039A (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060172330A1 (en) * | 2005-01-14 | 2006-08-03 | Idaho Research Foundation And Procter & Gamble | Categorization of microbial communities |
| CN104372072A (zh) * | 2014-07-29 | 2015-02-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量pcr方法 |
| WO2015103710A1 (en) * | 2014-01-13 | 2015-07-16 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Methods, reagents and kits for the assessment of bacterial infection |
| US20180002745A1 (en) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Northern Arizona University | Quantitative substrate utilization in microbial ecology using stable isotope probing |
| CN107937407A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-20 | 上海丽坤生物科技股份有限公司 | 特异性人源基因片段及检测其的引物、探针和应用 |
| US20210113671A1 (en) * | 2018-04-13 | 2021-04-22 | Imperial College Of Science, Technology And Medicine | Clostridioides difficile |
| CN114480596A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-05-13 | 宁波市中心血站 | 一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法 |
| CN114729398A (zh) * | 2019-11-20 | 2022-07-08 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于细菌和真菌的快速鉴定及表型抗微生物药物敏感性试验的组合物和方法 |
-
2023
- 2023-11-23 CN CN202311575326.2A patent/CN117344039A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060172330A1 (en) * | 2005-01-14 | 2006-08-03 | Idaho Research Foundation And Procter & Gamble | Categorization of microbial communities |
| WO2015103710A1 (en) * | 2014-01-13 | 2015-07-16 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Methods, reagents and kits for the assessment of bacterial infection |
| CN104372072A (zh) * | 2014-07-29 | 2015-02-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量pcr方法 |
| US20180002745A1 (en) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Northern Arizona University | Quantitative substrate utilization in microbial ecology using stable isotope probing |
| CN107937407A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-20 | 上海丽坤生物科技股份有限公司 | 特异性人源基因片段及检测其的引物、探针和应用 |
| US20210113671A1 (en) * | 2018-04-13 | 2021-04-22 | Imperial College Of Science, Technology And Medicine | Clostridioides difficile |
| CN114729398A (zh) * | 2019-11-20 | 2022-07-08 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于细菌和真菌的快速鉴定及表型抗微生物药物敏感性试验的组合物和方法 |
| CN114480596A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-05-13 | 宁波市中心血站 | 一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LIU, C.M.等: "BactQuant: An enhanced broad-coverage bacterial quantitative real-time PCR assay", 《BMC MICROBIOL》, vol. 12, no. 56, 17 April 2012 (2012-04-17), pages 1 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dunbar et al. | Phylogenetic specificity and reproducibility and new method for analysis of terminal restriction fragment profiles of 16S rRNA genes from bacterial communities | |
| Gibson et al. | Use of an amplified-fragment length polymorphism technique to fingerprint and differentiate isolates of Helicobacter pylori | |
| US5574145A (en) | Isolated nucleic acid molecules targeted to the region intermidiate to the 16S and 23S rRNA genes useful as probes for determining bacteria | |
| Fegan et al. | Sensitive and specific detection of Clavibacter xyli subsp. xyli, causal agent of ratoon stunting disease of sugarcane, with a polymerase chain reaction‐based assay | |
| Barney et al. | Riboprinting and 16S rRNA gene sequencing for identification of brewery Pediococcus isolates | |
| Jackson et al. | Comparative study of Cronobacter identification according to phenotyping methods | |
| Kommedal et al. | Analysis of mixed sequencing chromatograms and its application in direct 16S rRNA gene sequencing of polymicrobial samples | |
| CN101285090A (zh) | 食源性致病菌的检测方法 | |
| CN109680079A (zh) | 检测副溶血性弧菌的rpa引物、探针、试剂盒和方法 | |
| CN108588251A (zh) | 用于检测沙门氏菌的rpa引物、探针及检测方法 | |
| Šimenc et al. | Rapid differentiation of bacterial species by high resolution melting curve analysis | |
| CN111154900B (zh) | 铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 | |
| CN114350825A (zh) | 一种用于细胞培养中检测支原体污染的pcr试剂盒及其应用 | |
| Noll et al. | Development of a real‐time PCR assay for detection and differentiation of Mycoplasma ovipneumoniae and a novel respiratory‐associated Mycoplasma species in domestic sheep and goats | |
| Elgaml et al. | Analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of Gram negative pathogenic bacteria isolated from urinary tract infections | |
| Tao et al. | Mining of novel species-specific primers for PCR detection of Listeria monocytogenes based on genomic approach | |
| CN117344039A (zh) | 一种细菌域高覆盖率的引物、探针、其设计方法及应用 | |
| Li et al. | Development and application of reverse transcription loop‐mediated isothermal amplification for detecting live Shewanella putrefaciens in preserved fish sample | |
| CN116287344A (zh) | 一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对、试剂盒和方法 | |
| CN108004334B (zh) | 检测饮用水中四种致病菌的四重荧光pcr引物组、探针组、试剂盒及方法 | |
| CN116121408A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用 | |
| CN116004863A (zh) | 一种用于检测鉴定水稻白叶枯病菌的引物对及其应用 | |
| Flint et al. | Choice of DNA extraction method affects detection of bacterial taxa from retail chicken breast | |
| Pearce et al. | Using the polymerase chain reaction coupled with denaturing gradient gel electrophoresis to investigate the association between bacterial translocation and systemic inflammatory response syndrome in predicted acute severe pancreatitis | |
| WO2019187240A1 (ja) | 不完全なマッチプローブを用いたカンジダ菌の迅速同定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |