JP2023117361A - Cell image analysis method and program - Google Patents
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Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
本発明は、細胞画像解析方法およびプログラムに関する。 The present invention relates to a cell image analysis method and program.
細胞培養では作業者が細胞の様子を観察し、細胞処理のタイミングを主観的に判断して決定することが多い。このことが細胞培養の再現性および安定性を損なう一因となっており、再現性や安定性を担保するためには作業者の主観によらない客観的な判断方法が求められている。接着細胞の場合には、培養容器を継時的に観察し、コンフルエンス（培養容器に占める細胞の面積率）が事前に決めた値を超えた時点で次の細胞処理を行う方法がよく取られる。 In cell culture, an operator often observes the state of the cells and subjectively determines the timing of cell treatment. This is one of the factors that impair the reproducibility and stability of cell culture, and in order to ensure the reproducibility and stability, an objective judgment method that does not depend on the operator's subjectivity is required. In the case of adherent cells, the culture vessel is observed over time, and when the confluence (area ratio of cells occupying the culture vessel) exceeds a predetermined value, the next cell treatment is often performed. .
コンフルエンスで細胞処理のタイミングを決定する方法は、コロニーを形成せず個々の細胞が分離した状態で培養される細胞においては非常に有用である。しかしながら、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のようなコロニーを形成する細胞の場合、個々のコロニーの中で起こる細胞間相互作用が細胞の状態に影響を及ぼしていると考えられる。そのため、培養の再現性や安定性を向上させるためにはコンフルエンスではなく個々のコロニーの状態が変化するタイミング（以下、変化点と呼称する）を客観的に捉えて細胞処理のタイミングを決定することが望ましい。 The method of determining the timing of cell treatment at confluence is very useful for cells that are cultured in a state where individual cells are separated without forming colonies. However, in the case of colony-forming cells such as ES cells and iPS cells, it is believed that intercellular interactions that occur within individual colonies affect the state of the cells. Therefore, in order to improve the reproducibility and stability of the culture, it is necessary to objectively determine the timing of cell treatment by capturing the timing at which the state of individual colonies changes (hereinafter referred to as the change point) rather than at confluence. is desirable.
そこで、特許文献１では、細胞の複層化度合を計算し、複層化度合の時系列変化に基づいて細胞塊の成熟度を判定することが提案されている。ここで、複層化度合は、細胞のテクスチャに係る特徴から計算される指標である。
また、特許文献２では、複数の画像特徴量に基づいてコロニーの分化／未分化を判定し、その時系列変化を捉えることで、コロニーが分化したタイミングを捉えることが提案されている。
Therefore, in
Further, in
しかしながら、コロニーの画像観察においては、観察装置における焦点ぼけや多数の死細胞がコロニーに重畳し写りこむことが頻繁にある。そのため、特許文献１のように、画像のテクスチャに基づいてコロニーの変化点を正確に捉えることは困難な場合があった。
However, in image observation of colonies, defocusing in the observation device and many dead cells are frequently superimposed on the colonies. Therefore, as in
本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、細胞培養におけるコロニーの変化点を正確に捉えることを可能にする細胞画像解析方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above problems. That is, an object of the present invention is to provide a cell image analysis method capable of accurately recognizing changing points of colonies in cell culture.
本発明の一態様に係る細胞画像解析方法は、細胞培養における時系列に沿った細胞画像データを取得するデータ取得工程と、前記細胞画像データから複数のコロニーのそれぞれに対応する複数の細胞領域を抽出する細胞領域抽出工程と、前記複数の細胞領域のそれぞれに対して、前記細胞領域の大きさに関するデータを算出するデータ算出工程と、前記データ算出工程で算出した前記細胞領域の大きさに基づいて、前記コロニーの状態が変化するタイミングである変化点を検出する変化点検出工程と、を有することを特徴とする。 A cell image analysis method according to one aspect of the present invention includes a data acquisition step of acquiring cell image data along a time series in cell culture, and a plurality of cell regions corresponding to each of a plurality of colonies from the cell image data. a cell region extraction step for extracting; a data calculation step for calculating data regarding the size of the cell region for each of the plurality of cell regions; and based on the size of the cell region calculated in the data calculation step and a change point detection step of detecting a change point at which the state of the colony changes.
また、本発明の別の態様に係るプログラムは、上記細胞画像解析方法をコンピュータに実行させるためのプログラムである。 A program according to another aspect of the present invention is a program for causing a computer to execute the cell image analysis method.
本発明によれば、細胞培養におけるコロニーの変化点を正確に捉えることを可能にする細胞画像解析方法が提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a cell image analysis method is provided that enables accurate capture of colony change points in cell culture.
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. In addition, this invention is not limited to the following embodiment.
［第１の実施形態］
本実施形態では、時系列細胞画像から細胞領域の変化点を検出する方法について、細胞コロニー（以下では単にコロニーと記載）を形成する細胞の好適な例として幹細胞を例に用いて説明する。幹細胞としては、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）およびＥＳ細胞（胚性幹細胞）、間葉系幹細胞等を用いることができる。なお、本実施形態におけるコロニーとは、培養容器内で独立して存在する、互いに接触して存在する細胞からなる群集（以下、単に細胞群集という）を指す。すなわち、周囲と接着していない細胞群集を一つのコロニーとして捉える。本発明は、培養容器内全体の細胞群集ではなく、そのように培養容器内で独立して存在する細胞群集のそれぞれを互いに区別して変化点を検出することを特徴としている。
[First embodiment]
In the present embodiment, a method for detecting change points in cell regions from time-series cell images will be described using stem cells as a suitable example of cells that form cell colonies (hereinafter simply referred to as colonies). As stem cells, iPS cells (induced pluripotent stem cells), ES cells (embryonic stem cells), mesenchymal stem cells, and the like can be used. In addition, the colony in the present embodiment refers to a community (hereinafter simply referred to as a cell community) composed of cells that exist independently in a culture vessel and are in contact with each other. That is, a cell cluster that does not adhere to its surroundings is regarded as one colony. The present invention is characterized by detecting a change point by distinguishing each of the cell clusters existing independently in the culture vessel, rather than the entire cell cluster in the culture vessel.
図１に、第１の実施形態に係る細胞画像解析方法のフロー図を示す。
ステップＳ１０１は、細胞培養における時系列に沿った細胞画像データを取得するデータ取得工程である。データ取得工程は、未分化状態を維持した細胞培養における時系列に沿った細胞画像データを取得してもよい。ステップＳ１０１において、細胞培養観察装置で撮影された細胞画像データを取得する。ここで細胞画像データは、一つの培養容器において、一定の期間、所定の時間間隔で撮影された時系列位相差画像のデータである。以降、細胞画像および単に画像と呼称するものは位相差画像を指しているものとする。ここで、細胞画像データは、細胞培養観察装置からリアルタイムに取得するものでも、ＨＤＤやクラウドストレージといった外部の記憶領域から取得したものであってもよい。
FIG. 1 shows a flowchart of the cell image analysis method according to the first embodiment.
Step S101 is a data acquisition step for acquiring cell image data in time series in cell culture. The data acquisition step may acquire time-series cell image data in cell culture maintaining an undifferentiated state. In step S101, cell image data captured by a cell culture observation device is acquired. Here, the cell image data is data of time-series phase-contrast images captured at predetermined time intervals for a certain period of time in one culture vessel. Henceforth, what is called a cell image and simply an image refers to a phase-contrast image. Here, the cell image data may be acquired in real time from the cell culture observation device or may be acquired from an external storage area such as an HDD or cloud storage.
幹細胞の培養において、コロニーの成長の様子を詳細に解析すると、コロニーの成長速度が増加傾向から減少傾向へと変化するタイミング、すなわち細胞領域の面積の変化速度が増加から減少へと変化するタイミング（変化点）が存在する。具体的には、幹細胞は播種から約２日でコロニーが形成され始め、６日前後で成長速度が低下するコロニーが現れてくる。そのため、前述の一定の期間は、培養２日以下から選ばれる時点から７日以上から選ばれる時点までを含む期間であることが好ましい。画像を取得する時間間隔は、例えば、６時間を設定する。なお、本発明において、コロニーの成長速度が増加傾向から減少傾向へと変化するタイミングを指す概念を指して「変化点」と呼称する。変化点は、「成長抑制点」と呼称される場合がある。変化点を示す具体的な指標となる変数については特に限定されない。例えば、変化点を示す具体的な指標となる変数としては、後述するように培養時間や細胞領域の大きさ等を用いることができる。 Detailed analysis of colony growth in stem cell culture reveals the timing at which the growth rate of the colony changes from an increasing trend to a decreasing trend, that is, the timing at which the rate of change in the area of the cell area changes from increasing to decreasing ( point of change) exists. Specifically, stem cells begin to form colonies about two days after seeding, and colonies whose growth rate decreases appear around six days. Therefore, it is preferable that the above-mentioned certain period of time is a period from the time point selected from 2 days or less of culture to the time point selected from 7 days or more. The time interval for acquiring images is set to, for example, 6 hours. In the present invention, the term "change point" refers to the concept of the timing at which the colony growth rate changes from an increasing trend to a decreasing trend. A change point is sometimes referred to as a "growth inhibition point." There are no particular restrictions on the variables that serve as specific indicators that indicate the point of change. For example, as a variable that serves as a specific index indicating a change point, culture time, size of a cell region, and the like can be used as described later.
後述するように、本発明者らは、複数のコロニーが存在する場合、細胞領域の面積の変化速度が増加から減少へと変化するタイミング（変化点）は、個々のコロニー毎に異なることを見出した。そのため、特定のコロニーのみの変化点の検出に基づいてその後の細胞処理（継代等）を行った場合には、細胞の成長が不十分（成長の途上）である場合や、細胞の成長が十分に終わり、成長速度が小さいコロニーを含む場合がある。そこで、コロニー毎の変化点を検出することで、適切なタイミングでコロニー毎の細胞処理をすることが可能になると考えられる。また、培養条件とコロニー毎の変化点の情報に基づいて、より適切な培養条件を設定することも可能になると考えられる。 As will be described later, the present inventors found that when a plurality of colonies exist, the timing (change point) at which the rate of change in the area of the cell region changes from an increase to a decrease differs for each individual colony. Ta. Therefore, when subsequent cell treatment (passage, etc.) is performed based on the detection of change points only in specific colonies, it is possible that the growth of cells is insufficient (in the middle of growth) or that growth of cells is not sufficient. May contain colonies that finish well and have a low growth rate. Therefore, it is considered possible to perform cell processing for each colony at an appropriate timing by detecting the point of change for each colony. In addition, it is considered possible to set more appropriate culture conditions based on information on the culture conditions and the change points for each colony.
ここで、画像を取得する時間間隔は、変化点が生じる可能性がある期間の以前までは長い時間間隔でデータを取得し、以降を短い時間間隔で取得するようにしてもよい。その場合、例えば、培養２日以下から５日までは１２時間間隔、培養５日目以降は４時間間隔のように設定し、画像データを取得してもよい。画像データとしては、例えばＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３といった細胞画像観察装置によって撮影した画像データを使用できる。 Here, as for the time interval for acquiring images, data may be acquired at long time intervals before a period in which a change point may occur, and then at short time intervals. In that case, for example, the image data may be acquired at intervals of 12 hours from 2 days or less to 5 days of culture, and at intervals of 4 hours after 5 days of culture. As the image data, image data captured by a cell image observation device such as Incucyte S3 can be used.
図２に、培養容器２０１における幹細胞の培養において、ステップＳ１０１で取得した細胞画像データの一例を示す。時系列に沿った各細胞画像には、撮影順に０、１、・・・、ｎ、ｎ＋１、・・・、Ｎのようにインデックスが付与されている。さらに、各インデックスに対応する撮影日時が記録されており、任意の画像の撮影日時および培養時間がわかるものとする。
FIG. 2 shows an example of cell image data acquired in step S101 in culturing stem cells in the
ステップＳ１０２は、ステップＳ１０１で取得した細胞画像データから複数のコロニーのそれぞれに対応した複数の細胞領域を抽出する細胞領域抽出工程である。ステップＳ１０２において、ステップＳ１０１で取得した細胞画像データから細胞領域を抽出する。図３は、ステップＳ１０２の処理の流れを示すフロー図である。以降、図３を用いて、細胞領域を抽出する方法を説明する。 Step S102 is a cell area extraction step of extracting a plurality of cell areas corresponding to each of a plurality of colonies from the cell image data acquired in step S101. In step S102, cell regions are extracted from the cell image data acquired in step S101. FIG. 3 is a flowchart showing the flow of processing in step S102. A method for extracting a cell region will be described below with reference to FIG.
ステップＳ３０１において、細胞画像に微分フィルタを適用することで微分画像を生成する。微分画像は、各画素において周辺画素との輝度値の変化量を計算し、画像として表現したものである。微分画像は、細胞画像であれば、細胞領域の輪郭部分や細胞領域内の細胞の輪郭部分において高い輝度値を持つ画像となる。 In step S301, a differential image is generated by applying a differential filter to the cell image. A differential image is an image obtained by calculating the amount of change in luminance value between each pixel and its surrounding pixels. If the differential image is a cell image, the contour portion of the cell region and the contour portion of the cell within the cell region have high luminance values.
ステップＳ３０２において、ステップＳ３０１で生成した微分画像に対して二値化処理をすることにより微分画像において高い輝度値を持つ領域を抽出する。二値化処理では、任意の閾値を設定し、微分画像の各画素の値に対して、閾値以上であれば値を１、閾値未満であれば０と数値を置き換える。 In step S302, the differential image generated in step S301 is subjected to binarization, thereby extracting a region having a high luminance value in the differential image. In the binarization process, an arbitrary threshold value is set, and the value of each pixel of the differential image is replaced with 1 if the value is equal to or greater than the threshold value, and 0 if the value is less than the threshold value.
ここで、二値化処理の方法は、任意の閾値を設定する方法に限定しない。例えば、大津の二値化やＬｉの二値化といった閾値を自動的に決める方法を用いてもよい。任意の閾値を設定する場合、露光時間やフォーカス設定等、装置の撮影条件に応じて閾値を設定する。また、適応的二値化のように画像の画素ごとに閾値を決める方法を用いてもよい。二値化処理により、輝度値の変化の大きい領域の画素値を１、それ以外の画素値を０として表現した二値画像（以降、エッジ画像と呼称する）が作成される。 Here, the method of binarization processing is not limited to the method of setting an arbitrary threshold value. For example, a method of automatically determining a threshold such as Otsu's binarization or Li's binarization may be used. When setting an arbitrary threshold, the threshold is set according to the imaging conditions of the apparatus such as exposure time and focus setting. A method of determining a threshold for each pixel of an image, such as adaptive binarization, may also be used. By the binarization process, a binary image (hereafter referred to as an edge image) is created in which pixel values in areas where luminance values vary greatly are expressed as 1, and pixel values in other areas are expressed as 0.
ステップＳ３０３において、ステップＳ３０２で生成したエッジ画像に基づいて細胞領域のマスク画像を生成する。ここで、マスク画像は細胞領域を画素値１、それ以外の領域を画素値０で表現した二値画像である。マスク画像は、エッジ画像において、画素値１が連結している領域を抽出し、各連結領域の内部の画素値を１で置き換えることで生成する。 In step S303, a mask image of the cell region is generated based on the edge image generated in step S302. Here, the mask image is a binary image in which the cell region is expressed with a pixel value of 1 and the other regions with a pixel value of 0. The mask image is generated by extracting areas where pixel values 1 are connected in the edge image and replacing the pixel values inside each connected area with 1. FIG.
ステップＳ３０４において、ステップＳ３０３で生成したマスク画像に対してラベリング処理を施すことによって、個々の細胞領域を識別したラベル画像を生成する。ラベリング処理では、マスク画像において、画素値１が連結している領域を抽出し、連結領域ごとにその領域の画素をそれぞれ異なる画素値で置き換える操作を行う。 In step S304, label images identifying individual cell regions are generated by labeling the mask image generated in step S303. In the labeling process, regions in which pixel values of 1 are connected are extracted from the mask image, and pixels in the regions are replaced with different pixel values for each connected region.
なお、細胞領域の大きさに対して閾値を設定し、閾値以下のものは除外してもよい。例えば、幹細胞の場合、面積１００００μｍ２を閾値として設定してもよい。マスク画像の各連結成分をラベリングしていく際に、連結領域の面積を算出し、面積が閾値以下であった場合、その連結領域の画素値を０とする。 Note that a threshold may be set for the size of the cell region, and those below the threshold may be excluded. For example, in the case of stem cells, an area of 10000 μm 2 may be set as the threshold. When labeling each connected component of the mask image, the area of the connected region is calculated, and if the area is equal to or less than the threshold, the pixel value of the connected region is set to 0.
以上、ステップＳ３０１からＳ３０４の処理を、時系列に沿った各画像に対して実施することで、それぞれの画像における細胞領域を取得する。
ステップＳ３０１からＳ３０４における微分フィルタに基づく細胞領域抽出処理は、画像中の細胞領域の境界に明暗の差が生じていることを利用している。そのため、位相差観察により取得した画像に限らず、細胞領域の輪郭が明瞭な画像において好適に実施可能である。例えば、位相物体を可視化する方法として、位相差観察の他にも微分干渉観察や変調コントラスト観察といった観察方式があげられる。また、明視野観察においても装置構成や画像処理の工夫により、位相物体を可視化する技術が公知であり、そのような技術によって得られた画像に対して本発明を適用することも可能である。
As described above, the processing of steps S301 to S304 is performed for each image along the time series, thereby acquiring the cell region in each image.
The cell area extraction processing based on the differential filter in steps S301 to S304 utilizes the fact that there is a difference in brightness at the boundaries of the cell areas in the image. Therefore, it is possible to suitably perform not only an image obtained by phase contrast observation but also an image with a clear outline of a cell region. For example, as a method for visualizing a phase object, there are observation methods such as differential interference observation and modulation contrast observation in addition to phase contrast observation. Techniques for visualizing phase objects are also known in bright-field observation by devising device configurations and image processing, and the present invention can be applied to images obtained by such techniques.
図４に細胞画像４０１から細胞領域を抽出した例を示す。マスク画像４０２は、ステップＳ３０３において生成された画像であり、白色が背景領域、黒色が細胞領域を示している。マスク画像に対して、ステップＳ３０４のラベリング処理により、図４に示す細胞領域Ｔ０１、Ｔ０２、およびＴ０３のように孤立した個々の細胞領域が識別され、細胞領域を抽出することができる。
FIG. 4 shows an example of extracting a cell area from a
ここで、細胞領域を抽出する対象となるコロニーが、培養容器および撮像視野の外周から選ばれる少なくともいずれかに接触している場合、それらのコロニーを、細胞領域を抽出する対象から除外することが好ましい。コロニーが培養容器の外周に接触しているか否かは、培養容器を示す輪郭をあらかじめ設定するかハフ変換といった手法により培養容器の輪郭を抽出し、対象のコロニーに対応する細胞領域が輪郭に重なっているかどうかで判定することができる。同様に、コロニーが撮像視野の外周に接触しているか否かは、撮影画像の外周に対象のコロニーに対応する細胞領域が重なっているかどうかを判定すればよい。 Here, if the colonies from which the cell area is to be extracted are in contact with at least one selected from the culture vessel and the periphery of the imaging field, those colonies can be excluded from the target of extracting the cell area. preferable. Whether or not the colony is in contact with the outer circumference of the culture vessel can be determined by setting the outline of the culture vessel in advance or by extracting the outline of the culture vessel using a method such as Hough transform, and then determining whether the cell area corresponding to the target colony overlaps the outline. It can be determined by whether or not Similarly, whether or not a colony is in contact with the periphery of the imaging field may be determined by determining whether or not the cell region corresponding to the target colony overlaps with the periphery of the captured image.
ステップＳ１０２は、培養の過程で２つ以上のコロニー同士が接触して結合し、１つになったコロニーが存在した場合に、そのようなコロニーを細胞領域の抽出の対象から除外することを含んでもよい。 Step S102 includes excluding such a colony from the target of cell area extraction when two or more colonies are brought into contact with each other in the course of culturing to form a single colony. It's okay.
すなわち、ステップＳ１０２は、時系列上の時点Ａで取得した細胞画像データにあるコロニーが、時系列上の時点Ａより前の時点Ｂで取得した細胞画像データにある２つ以上のコロニーが結合して形成されたものであるか否かを判定することを含んでもよい。これにより、時点Ｂの２つ以上のコロニーの結合によって生じた時点Ａのコロニーは、時点Ａの細胞画像データにあるコロニーは時点Ｂの細胞画像データにある２つ以上のコロニーの結合によって形成されたものである、と判定される。そのような場合、ステップＳ１０２はさらに、時点Ａの細胞画像データにある上記結合によって生じたコロニーを、細胞領域を抽出する対象から除外することを含んでもよい。 That is, in step S102, two or more colonies in the cell image data acquired at the time point A on the time series combine with the colonies in the cell image data acquired at the time point B earlier than the time point A on the time series. determining whether it was formed by As a result, colonies at time point A formed by combining two or more colonies at time point B are formed by combining two or more colonies in cell image data at time point B. It is determined that the In such a case, step S102 may further include excluding colonies generated by the above combination in the cell image data at time point A from targets for extracting cell regions.
ステップＳ１０３は、ステップＳ１０２で抽出した複数の細胞領域のそれぞれに対して、細胞領域の大きさに関するデータを算出するデータ算出工程である。細胞領域の大きさとしては、例えば、細胞領域の面積、細胞領域の周囲長、細胞領域の半径、および細胞領域の直径等の数値を用いることができる。以降、細胞領域の大きさとして細胞領域の面積を算出するものとして説明する。 Step S103 is a data calculation step of calculating data regarding the size of the cell regions for each of the plurality of cell regions extracted in step S102. As the size of the cell region, for example, numerical values such as the area of the cell region, the perimeter of the cell region, the radius of the cell region, and the diameter of the cell region can be used. Hereinafter, it is assumed that the area of the cell region is calculated as the size of the cell region.
特定の画像ｎの細胞画像から抽出された任意の細胞領域に対して、次の画像ｎ＋１のどの細胞領域が同一のコロニーの細胞領域であるかは、細胞領域の位置情報を用いて判定することができる。例えば、時系列上の異なる時点で取得した細胞画像データの間における同一のコロニーに対応する細胞領域を、細胞領域の重心位置および前記細胞領域の重なり具合から選ばれる少なくともいずれかに基づいて判定することができる。以降、細胞領域の重心位置の処理に基づいて、時系列に沿った複数の画像において、どの細胞領域が同一のコロニーの細胞領域であるかを判定する方法を説明する。 For any cell area extracted from the cell image of a specific image n, which cell area of the next image n+1 is the cell area of the same colony is determined using the positional information of the cell area. can be done. For example, a cell region corresponding to the same colony among cell image data acquired at different points in time series is determined based on at least one selected from the position of the center of gravity of the cell region and the degree of overlap of the cell regions. be able to. Hereinafter, a method of determining which cell region is the cell region of the same colony in a plurality of time-series images based on the processing of the centroid positions of the cell regions will be described.
図５は、ステップＳ１０２において細胞画像から抽出された細胞領域の一例を示す図である。画像ｎでは細胞領域Ｔ０１からＴ０３が抽出されており、画像ｎ＋１では細胞領域Ｔ１１からＴ１３の細胞領域が抽出されている。
FIG. 5 is a diagram showing an example of cell regions extracted from the cell image in step S102. Cell regions T01 to T03 are extracted from image n, and cell regions T11 to T13 are extracted from
まず、画像ｎの細胞領域Ｔ０１の重心位置に対して、画像ｎ＋１における細胞領域Ｔ１１からＴ１３のそれぞれの重心位置との距離を計算する。続いて、計算した距離のうち最も近い距離の重心位置を持つ細胞領域を細胞領域Ｔ０１に対応する細胞領域と判定する。図５の例の場合、細胞領域Ｔ０１とＴ１１が同一の領域として判定される。 First, the distance between the centroid position of each of the cell regions T11 to T13 in the image n+1 and the centroid position of the cell region T01 in the image n is calculated. Subsequently, the cell area having the closest center-of-gravity position among the calculated distances is determined as the cell area corresponding to the cell area T01. In the example of FIG. 5, cell regions T01 and T11 are determined as the same region.
以上の処理を細胞領域Ｔ０２およびＴ０３について繰り返し実施することにより、特定の画像ｎの細胞画像から抽出された任意の細胞領域に対して、次の画像ｎ＋１のどの細胞領域が同一の細胞領域であるかを判定する。なお、重心位置の距離に対して閾値を設け、一定の距離以上の細胞領域は対応する細胞領域ではないと判定してもよい。 By repeatedly performing the above processing for cell regions T02 and T03, it is possible to determine which cell region of the next image n+1 is the same cell region with respect to an arbitrary cell region extracted from the cell image of a specific image n. determine whether Note that a threshold value may be set for the distance of the center of gravity position, and a cell area with a certain distance or more may be determined as not being the corresponding cell area.
続いて、画像ｎ＋１の細胞領域に対して、次の画像ｎ＋２において同一の細胞領域を判定するといったように、時系列に沿ったすべての画像に対して同様の処理を実施することで、各コロニーの細胞領域の大きさの時系列に沿ったデータを取得することができる。 Subsequently, by performing similar processing on all images along the time series, such as determining the same cell area in the next image n+2 for the cell area in image n+1, each colony It is possible to acquire data along the time series of the size of the cell area of .
図１３に、ステップＳ１０３によって算出された各細胞領域の面積変化の一例を示す。図１３に示すグラフにおいて、横軸は培養時間、縦軸が細胞領域の面積を示している。また、一本の線が一つのコロニーの細胞領域に対するデータを示している。 FIG. 13 shows an example of the area change of each cell region calculated in step S103. In the graph shown in FIG. 13, the horizontal axis indicates the culture time, and the vertical axis indicates the area of the cell region. Also, one line indicates the data for the cell area of one colony.
ここで、コロニー面積の時系列データには、死細胞、泡、ごみなどの付着により正確な面積の計測結果となっていない値（以下、異常値と呼称する）が混在する可能性がある。図１３において面積が滑らかに変化していないデータが、そのような異常値を含むデータに該当する。そういったデータは、面積の時間変化のばらつきを計算することで除外してもよい。具体的には、ステップＳ１０３は次のような処理を含んでもよい。同一のコロニーに対応する細胞領域に対して算出された細胞領域の大きさに関するデータについて、時系列の上のある時点で取得された値が、他の少なくとも１つの時点で取得された値に基づく基準値に対して一定値以上の変化量を有するか否かを判定する。そして、上記のある時点で取得された値が、上記基準値に対して一定値以上の変化量を有していた場合に、上記同一のコロニーに対応する細胞領域に対して算出された細胞領域の大きさに関するデータを除外する。例えば、各コロニーの面積の変化量のＣＶ値を計算して上記基準値とし、ＣＶ値が閾値以上の値をデータから除外してもよい。閾値は、例えば１．５のように設定すればよく、ユーザにより任意の値に設定できてもよい。図６に、閾値１．５と設定した場合に、図１３に示すデータから異常値を除外した結果を示す。 Here, the colony area time-series data may include values (hereinafter referred to as abnormal values) that are not accurate area measurement results due to the adhesion of dead cells, bubbles, dust, and the like. Data in which the area does not change smoothly in FIG. 13 corresponds to data including such an abnormal value. Such data may be excluded by calculating the variability of the area over time. Specifically, step S103 may include the following processing. For data on cell area sizes calculated for cell areas corresponding to the same colony, the value obtained at one time point above the time series is based on the value obtained at at least one other time point. It is determined whether or not there is an amount of change greater than or equal to a certain value with respect to the reference value. Then, the cell area calculated for the cell area corresponding to the same colony when the value obtained at a certain point in time has an amount of change of a certain value or more with respect to the reference value Exclude data on the size of . For example, the CV value of the amount of change in the area of each colony may be calculated and used as the reference value, and CV values equal to or greater than the threshold value may be excluded from the data. The threshold may be set to, for example, 1.5, or may be set to any value by the user. FIG. 6 shows the result of excluding abnormal values from the data shown in FIG. 13 when the threshold is set to 1.5.
ステップＳ１０４は、ステップＳ１０３で算出した細胞領域の大きさに基づいて、コロニーの状態が変化するタイミングである変化点を検出する変化点検出工程である。ステップＳ１０４において、ステップＳ１０３で取得した細胞領域の大きさに関するデータを用いて、細胞領域の変化点を検出する。変化点は、次のようにして得られる近似曲線の極大値を与える点として検出することができる。まず、時間または細胞領域の大きさと、細胞領域の大きさの変化速度との関係を多項式モデルとして近似する。続いて、得られた多項式モデルにおける極大点を求めることで、求めた極大点を変化点として検出することができる。以下、変化点を、細胞領域の大きさと、細胞領域の大きさの変化速度との関係を多項式近似することで得られる近似曲線の極大値を与える点として検出する例について述べる。 Step S104 is a change point detection step of detecting a change point, which is the timing at which the state of the colony changes, based on the size of the cell area calculated in step S103. In step S104, the change point of the cell area is detected using the data on the size of the cell area acquired in step S103. The point of change can be detected as the point that gives the maximum value of the approximated curve obtained as follows. First, the relationship between time or the size of the cell area and the rate of change of the size of the cell area is approximated as a polynomial model. Subsequently, by obtaining the maximum point in the obtained polynomial model, the obtained maximum point can be detected as the change point. An example of detecting a change point as a point giving a maximum value of an approximated curve obtained by polynomial approximation of the relationship between the size of the cell area and the rate of change of the size of the cell area will be described below.
まず、細胞領域の大きさの変化速度の時系列に沿ったデータを取得する。画像ｎにおける変化速度Ｄｎは、下記式（１）によって計算することができる。式（１）中、Ｓｎおよびｔｎは、それぞれ画像ｎにおける細胞領域の大きさおよび培養時間を示している。
続いて、変化速度の時系列に沿ったデータに基づいて、コロニーの変化点を検出する。変化点は、時系列に沿った細胞領域の大きさに関するデータと時系列に沿った変化速度のデータとの関係を多項式近似し、近似曲線の極大値を検出することによって求めることができる。 Subsequently, colony change points are detected based on the time-series data of the rate of change. The point of change can be obtained by polynomial approximation of the relationship between the time-series data on the size of the cell region and the time-series data on the rate of change, and detecting the maximum value of the approximated curve.
まず、変化速度をｙ、領域の大きさをｘとしてデータ間の関係を次の３次多項式モデルとして近似する。式中のa、ｂ、ｃ、およびｄは、近似によって算出される３次多項式のパラメータである。
続いて、近似により得られた３次曲線の極大点を求めることで、変化点を検出する。ここで、変化点に対応する細胞領域の大きさ、変化速度あるいは培養時間のデータを指して変化点データと呼称する。 Subsequently, the point of change is detected by obtaining the maximum point of the cubic curve obtained by the approximation. Here, data on the size of the cell region corresponding to the point of change, the rate of change, or the culture time is referred to as data on the point of change.
以上の操作を各コロニーの細胞領域のデータに対して実施することで、各コロニーの変化点を検出し、それぞれの変化点データを取得することができる。 By performing the above operation on the data of the cell region of each colony, it is possible to detect the change point of each colony and obtain the change point data.
図７は、各コロニーに対して得られた近似曲線７０１および検出した極大点７０２の結果である。横軸は細胞領域の面積、縦軸は変化速度を示しており、コロニーごとの近似曲線７０１および検出した極大点７０２を示している。このように各コロニーの変化点をグラフで出力することにより、作業者は、コロニーの変化点を正確に把握することができる。 FIG. 7 shows the approximate curve 701 obtained for each colony and the detected maximum point 702 . The horizontal axis indicates the area of the cell region, the vertical axis indicates the rate of change, and indicates an approximated curve 701 and detected maximum points 702 for each colony. By outputting the change points of each colony as a graph in this way, the operator can accurately grasp the change points of the colonies.
なお、作業者に変化点データを出力する方法は図７のようなグラフで出力する方法に限定されない。例えば、変化点データをリスト形式で出力してもよい。また、細胞領域の面積の数値を半径、周囲長といった他の指標に変換して出力してもよい。図８に、変化点における細胞領域の面積を半径に変換し、リスト形式で出力した結果の例を示す。 Note that the method of outputting the change point data to the operator is not limited to the method of outputting in the form of a graph as shown in FIG. For example, change point data may be output in list form. Alternatively, the numerical value of the area of the cell region may be converted into another index such as the radius or perimeter and output. FIG. 8 shows an example of the result of converting the area of the cell region at the change point into a radius and outputting it in a list format.
このようにして求まる変化点は、幹細胞の株種、培地量、および播種密度といった培養条件の違いによって変動する。さらには、培養容器内に存在する複数のコロニーそれぞれにおいても変化点が異なる。ここで細胞の株種が異なるとは、原料細胞の由来のドナーや組織が異なることを意味する。 The change point determined in this way varies depending on the culture conditions such as the type of stem cell strain, medium volume, and seeding density. Furthermore, each of the plurality of colonies present in the culture vessel also has different points of change. Here, different cell strains means different donors and different tissues from which source cells are derived.
以降、図１４から図１９を用いて、培養条件の違いによって変化点データの分布が変動する例を示す。なお、以下に示す例において、変化点データとしては、各コロニーの変化点に対応する面積を直径に変換したデータおよび面積の変化速度を用いている。 FIGS. 14 to 19 will be used hereinafter to show examples in which the distribution of change point data fluctuates due to differences in culture conditions. In the examples shown below, data obtained by converting the area corresponding to the change point of each colony into a diameter and the rate of change of the area are used as the change point data.
図１４および図１５は、播種密度および培地交換量の変化に応じた変化点分布の変動の一例を示す図である。ここでは、ｉＰＳ細胞を一般的な６ウェルプレートで培養し、播種密度あるいは２日おきの培地交換量を変えて培養した際のそれぞれの培養における変化点データ分布を箱ひげ図で示している。播種密度については、等倍（１３，０００細胞／ウェル）および４分の１（３，２５０細胞／ウェル）と変え、２日おきの培地交換量については、１．０ｍｌ／ウェル、２．０ｍｌ／ウェル、４．０ｍｌ／ウェルと変えて培養を行った。 14 and 15 are diagrams showing an example of variation in change point distribution according to changes in the seeding density and medium replacement amount. Here, iPS cells are cultured in a general 6-well plate, and the change point data distribution in each culture when the seeding density or the amount of medium exchange every two days is changed is shown in box plots. Seeding densities were varied between 1:1 (13,000 cells/well) and 1/4 (3,250 cells/well), and media changes every 2 days were 1.0 ml/well, 2.0 ml. / well, 4.0 ml / well and cultured.
変化点データのうち、図１４はコロニー直径の分布について、図１５は面積の変化速度の分布についてそれぞれ示している。図１４から、培地交換量が多いほど、あるいは播種密度が小さいほど変化点におけるコロニー直径が大きくなる傾向があることが分かる。 Of the change point data, FIG. 14 shows the distribution of colony diameters, and FIG. 15 shows the distribution of area change speeds. From FIG. 14, it can be seen that the colony diameter at the change point tends to increase as the amount of medium exchange increases or as the seeding density decreases.
図１６および図１７は、コート量の変化に応じた変化点分布の変動の一例を示す図である。コート量は、細胞の接着培養のために培養容器に予め施す表面処理の溶液の量である。ここでは、ｉＰＳ細胞を一般的な１２ウェルプレートで培養し、ｉＭａｔｒｉｘコート量を変えて培養した際のそれぞれの培養における変化点データ分布を箱ひげ図で示している。ｉＭａｔｒｉｘコート量は、３分の１（０．６３μｇ／ウェル）、等倍（１．９μｇ／ウェル）および３倍（５．７μｇ／ウェル）と変えて培養を行った。 16 and 17 are diagrams showing an example of variation in change point distribution according to changes in coat amount. The amount of coating is the amount of the surface treatment solution applied in advance to the culture vessel for adhesion culture of cells. Here, iPS cells are cultured in a general 12-well plate, and the distribution of change point data in each culture when the amount of iMatrix coating is changed is shown in box plots. Cultivation was performed by changing the amount of iMatrix coating to 1/3 (0.63 μg/well), 1× (1.9 μg/well) and 3× (5.7 μg/well).
変化点データのうち、図１６はコロニー直径の分布について、図１７は面積の変化速度の分布についてそれぞれ示している。図１６から、コート量が少ないほど変化点におけるコロニー直径が大きくなる傾向があることが分かる。また図１７から、コート量は面積の変化速度にも影響を与え、コート量が多いほど変化速度が小さくなることが分かる Of the change point data, FIG. 16 shows the distribution of colony diameters, and FIG. 17 shows the distribution of area change speeds. From FIG. 16, it can be seen that the smaller the coating amount, the larger the colony diameter at the change point. Also, from FIG. 17, it can be seen that the coating amount also affects the change speed of the area, and that the larger the coating amount, the smaller the change speed.
図１８および図１９は、幹細胞の株種の違いに応じた変化点分布の変動の一例を示す図である。図１８および図１９には、株Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの４種を培養した際のそれぞれの培養における変化点データ分布を箱ひげ図で示している。 FIG. 18 and FIG. 19 are diagrams showing an example of variations in the distribution of change points depending on the type of stem cell. FIGS. 18 and 19 show the distribution of change point data in each culture when the four strains A, B, C, and D were cultured in boxplots.
変化点データのうち、図１８はコロニー直径の分布について、図１９は面積の変化速度の分布についてそれぞれ示している。 Of the change point data, FIG. 18 shows the distribution of colony diameters, and FIG. 19 shows the distribution of area change speeds.
図１８に示す通り、株Ｃは他３種の株に比べて、変化点におけるコロニー直径が小さい傾向にあり、株Ｃが他３種と比較して異なる特徴を持った細胞株である可能性が示唆される。 As shown in FIG. 18, strain C tends to have a smaller colony diameter at the point of change than the other three strains, suggesting that strain C may be a cell line with different characteristics compared to the other three strains. is suggested.
以上、図１４から図１９を用いて、本実施形態によって算出した変化点データを培養条件の異なるデータに適用し比較する例を示した。 14 to 19, an example of applying the change point data calculated according to the present embodiment to data with different culture conditions and comparing them has been described.
作業者は、細胞培養の再現性および安定性を向上させるために、本実施形態によって把握した変化点をもとに細胞処理のタイミングの判断に活用することができる。 In order to improve the reproducibility and stability of cell culture, the operator can use the points of change ascertained by this embodiment to determine the timing of cell treatment.
以上、本実施形態によれば、細胞画像データからコロニーの変化点を捉え、作業者はコロニーの成長効率が悪くなるタイミングを正確に把握することができる。 As described above, according to the present embodiment, the change point of the colony can be captured from the cell image data, and the operator can accurately grasp the timing when the growth efficiency of the colony becomes poor.
（第１の実施形態の変形例１）
ステップＳ１０２において、細胞領域を抽出する方法を説明したが、細胞領域の抽出方法は微分フィルタを用いた方法に限定しない。例えば、細胞領域の正解画像を用意し、機械学習による細胞領域抽出を実施してもよい。
(
In step S102, the method of extracting the cell area has been described, but the method of extracting the cell area is not limited to the method using the differential filter. For example, correct images of cell regions may be prepared and cell region extraction may be performed by machine learning.
（第１の実施形態の変形例２）
ステップＳ１０２において、時系列に沿った複数の画像において細胞領域を抽出し、位置情報を用いて同一のコロニーの細胞領域を特定することを説明した。ここで、画像ｎと画像ｎ＋１において、細胞領域の動きや観察装置における培養容器あるいはスキャン位置のずれ等によって位置ずれが生じる場合、画像ｎと画像ｎ＋１の位置合わせを実施してからステップＳ１０２の処理を実施してもよい。２枚の画像の位置合わせには、テンプレートマッチングや位相限定相関法といった方法を用いることができる。
(
It has been described that in step S102, cell regions are extracted from a plurality of time-series images, and the cell regions of the same colony are specified using the positional information. Here, if positional deviation occurs between the image n and the image n+1 due to the movement of the cell region, the deviation of the culture container in the observation device or the scanning position, etc., the position of the image n and the image n+1 is aligned, and then the process of step S102 is performed. may be implemented. A method such as template matching or a phase-only correlation method can be used to align the two images.
（第１の実施形態の変形例３）
ステップＳ１０３において、時系列に沿った複数の画像において細胞領域を抽出し、重心位置間の距離を用いて同一のコロニーの細胞領域を特定することを説明した。第１の実施形態の変形例３では、細胞領域同士の重なり具合を計算することで同一のコロニーの細胞領域を特定する方法を説明する。
(
It has been described that in step S103, cell regions are extracted from a plurality of time-series images, and the cell regions of the same colony are specified using the distance between the centroid positions.
具体的には、例えば、図５に示す２つの細胞領域Ｔ０１、Ｔ１１の重なり具合ｍを式３のように計算する。
重なり具合ｍは、細胞領域Ｔ０１に対して細胞領域Ｔ１１の重なりが大きいほど高い数値となる。細胞領域Ｔ１２、細胞領域Ｔ１３に対しても細胞領域Ｔ０１に対する重なり具合ｍを計算し、重なり具合ｍが最も高い数値となった細胞領域を細胞領域Ｔ０１に対応する細胞領域と判定することができる。 The degree of overlap m becomes a higher numerical value as the overlap of the cell region T11 with respect to the cell region T01 increases. The degree of overlap m with respect to cell region T01 is also calculated for cell regions T12 and T13, and the cell region with the highest degree of overlap m can be determined as the cell region corresponding to cell region T01.
（第１の実施形態の変形例４）
ステップＳ１０２において、時系列に沿った複数の画像において細胞領域を抽出し、位置情報を用いて同一のコロニーの細胞領域を特定することを説明した。ここで、画像ｎで抽出した複数の細胞領域のうちいくつかが画像ｎ＋１において結合しているケースが存在する。その場合、結合した細胞領域はその時点で抽出結果から除外してもよい。
(Modification 4 of the first embodiment)
It has been described that in step S102, cell regions are extracted from a plurality of time-series images, and the cell regions of the same colony are specified using the positional information. Here, there is a case where some of the multiple cell regions extracted in image n are combined in
（第１の実施形態の変形例５）
第１の実施形態の変形例４において、結合した細胞領域を除外する方法を説明したが、結合した領域を領域分割によって複数の細胞領域に分割してもよい。その場合、結合した領域に対して、ＬｅｖｅｌＳｅｔ法やＷａｔｅｒｓｈｅｄ法あるいはＧｒａｂｃｕｔ法といった方法を適用することで領域を分割することができる。
(Modification 5 of the first embodiment)
In the modification 4 of the first embodiment, the method of excluding joined cell regions has been described, but the joined region may be divided into a plurality of cell regions by region division. In that case, the combined area can be divided by applying a method such as the LevelSet method, the Watershed method, or the Grabcut method.
（第１の実施形態の変形例６）
ステップＳ１０４において、細胞領域の大きさと細胞領域の大きさの変化速度との関係を多項式近似し、極大点を求めることによって変化点を検出する方法を説明した。本発明の実施は、これに限らず、培養時間と細胞領域の大きさの変化速度との関係を多項式近似し、極大点を求めることによって変化点を検出してもよい。その場合、変化速度をｙ、領域の大きさをｘとして、式（２）で表される３次多項式モデルに近似し、近似曲線の極大点を検出することができる。
(Modification 6 of the first embodiment)
In step S104, the method of detecting the point of change by polynomial approximation of the relationship between the size of the cell area and the rate of change of the size of the cell area and obtaining the maximum point has been described. The practice of the present invention is not limited to this, and the change point may be detected by polynomial approximation of the relationship between the culture time and the rate of change in the size of the cell region, and obtaining the maximum point. In this case, it is possible to approximate the cubic polynomial model represented by the formula (2) with y as the change speed and x as the size of the region, and detect the maximum point of the approximation curve.
［第２の実施形態］
第１の実施形態では、時系列に沿った細胞画像データを用いて、コロニーの変化点を検出する方法を説明した。この変化点は微妙な培養条件の違いによって変動するため、細胞が作業者の期待通りに培養されたかどうかを判断する目的に使用できる。本実施形態では、ある培養条件における細胞培養に対して、検出した変化点に基づいてその細胞培養の培養条件に対する評価値を算出する方法を説明する。
[Second embodiment]
In the first embodiment, a method for detecting changing points of colonies using time-series cell image data has been described. Since this point of change fluctuates depending on subtle differences in culture conditions, it can be used for the purpose of judging whether cells have been cultured as expected by the operator. In this embodiment, a method of calculating an evaluation value for a culture condition of a cell culture based on a detected change point for the cell culture under the culture condition will be described.
図９に、第２の実施形態に係る細胞画像解析方法のフロー図を示す。
ステップＳ９０１、Ｓ９０２、Ｓ９０３およびＳ９０４は、図１のステップＳ１０１、Ｓ１０２、Ｓ１０３およびＳ１０４と同様であるため説明を省略する。
FIG. 9 shows a flowchart of a cell image analysis method according to the second embodiment.
Steps S901, S902, S903, and S904 are the same as steps S101, S102, S103, and S104 in FIG. 1, so description thereof will be omitted.
ステップＳ９０５は、変化点に基づいて、細胞培養に用いた培養条件に対する評価値を算出する評価値算出工程である。ステップＳ９０５において、ステップＳ９０４で算出したコロニーの変化点データに基づいて評価値を算出する。ここで、評価値は、用いた培養条件での細胞培養における培養状態を評価した値である。 Step S905 is an evaluation value calculation step of calculating an evaluation value for the culture conditions used for cell culture based on the change points. In step S905, an evaluation value is calculated based on the colony change point data calculated in step S904. Here, the evaluation value is a value obtained by evaluating the culture state in cell culture under the culture conditions used.
例えば、ステップＳ９０２で検出されている細胞領域のコロニーのうち、変化点が検出されているコロニーの割合を計算する。なお、変化点データのうち、細胞領域の大きさの変化速度に対して閾値を設けて、閾値以下の細胞領域の大きさの変化速度を有する細胞領域の割合を求めてもよい。これにより、細胞培養においてどの程度の割合のコロニーで成長効率が落ちてきているかを評価することができる。 For example, out of the colonies in the cell area detected in step S902, the ratio of colonies for which change points have been detected is calculated. It is also possible to set a threshold for the rate of change in the size of the cell area in the change point data, and obtain the proportion of cell areas having the rate of change in the size of the cell area equal to or less than the threshold. This makes it possible to evaluate to what extent colonies in cell culture have decreased growth efficiency.
また、評価値算出工程は、変化点データに対して、平均値、標準偏差、ＣＶ値、および中央値といった統計量から選ばれる少なくとも１種を計算することを含んでもよい。ここで変化点データは、複数のコロニーのそれぞれにおける変化点に対応する、時間、細胞領域の大きさ、および前記細胞領域の大きさの変化速度から選ばれる少なくとも１種のデータである。 In addition, the evaluation value calculation step may include calculating at least one selected from statistics such as an average value, standard deviation, CV value, and median value for the change point data. Here, the change point data is at least one kind of data selected from time, the size of the cell area, and the rate of change of the size of the cell area, corresponding to the change point in each of the plurality of colonies.
例えば、各コロニーの変化点データのうち、細胞領域の大きさに関するデータからＣＶ値（変動係数）を計算することで評価値を計算してもよい。ここで、ＣＶ値は大きさの変化速度のデータから計算してもよいし、細胞領域の大きさに関するデータおよび大きさの変化速度のデータの双方でＣＶ値を計算し、その平均を求めてもよい。これにより、培養中の細胞が均一に培養できているかどうかを評価できる。 For example, the evaluation value may be calculated by calculating the CV value (coefficient of variation) from the data regarding the size of the cell area among the change point data of each colony. Here, the CV value may be calculated from the data on the rate of change in size, or the CV values are calculated from both the data on the size of the cell region and the data on the rate of change in size, and the average is obtained. good too. This makes it possible to evaluate whether the cells in culture are uniformly cultured.
また、評価値として複数の統計量を計算してもよい。図１４に示した播種密度および培地交換量を変えて培養した６種の培養における変化点におけるコロニー直径データに対して統計量を計算した結果を図２０に示す。作業者は、図２０のようにあらかじめ培養条件に応じて算出された変化点データの統計量のテーブル情報を参照し、培養が期待通りに行われたかどうかを判断することができる。例えば、図２０の中央値の比較により、播種密度が小さいあるいは培地交換量が多い場合に、変化点のコロニー直径が大きくなっており、容器中の細胞に栄養が十分に行き届いているかを評価できていることが示唆される。作業者は、これらの結果を培養中の細胞の状態の定量的な確認や次の培養条件へのフィードバックのために使用することができる。また、この評価値は株の種類によっても異なり得るため、細胞特性試験として使用することもできる。 Moreover, you may calculate several statistics as an evaluation value. FIG. 20 shows the results of calculating statistics for the colony diameter data at the change points in the six cultures cultured at different seeding densities and medium exchange rates shown in FIG. The operator can refer to the table information of the statistics of the change point data calculated in advance according to the culture conditions, as shown in FIG. 20, and judge whether the culture has been performed as expected. For example, by comparing the median values in FIG. 20, when the seeding density is low or the amount of medium exchange is large, the colony diameter at the change point is large, and it can be evaluated whether the cells in the vessel are sufficiently nutrient-dense. It is suggested that The operator can use these results for quantitative confirmation of the state of the cells being cultured and for feedback to the next culture conditions. In addition, since this evaluation value may vary depending on the type of strain, it can also be used as a cell characteristic test.
これらの評価値を得ることで、従来のコンフルエンス（培養容器中に占める細胞領域の面積）のモニタリングや、単純にコロニーの成長挙動を比較することに比べて、培養条件あるいは株間の違いを定量的に比較することが可能となる。図２１および図２２に培養条件が異なる培養容器でのコンフルエンスおよびコロニーの成長挙動を比較した結果の例を示す。図２１および図２２は、６つの培養容器Ａ１～Ａ３およびＢ１～Ｂ３に対する計測結果を示すものであり、Ａ１とＢ１、Ａ２とＢ２、Ａ３とＢ３はそれぞれ同じ培地交換量の条件の組み合せとなっている。図２１および図２２から、従来の方法では、培地交換量の変化によるコロニーの成長挙動の変化を比較することが難しく、図２０に示すように評価値を算出することで、コロニーの成長挙動の定量的な比較が可能となることがわかる。 By obtaining these evaluation values, compared to conventional monitoring of confluence (the area of the cell area occupied in the culture vessel) or simply comparing colony growth behavior, differences in culture conditions or between strains can be quantitatively evaluated. can be compared to FIGS. 21 and 22 show examples of the results of comparison of confluence and colony growth behavior in culture vessels with different culture conditions. FIGS. 21 and 22 show the measurement results for six culture vessels A1 to A3 and B1 to B3, where A1 and B1, A2 and B2, and A3 and B3 are combinations of conditions with the same amount of medium exchange. ing. From FIGS. 21 and 22, it is difficult to compare changes in colony growth behavior due to changes in the amount of medium exchange with the conventional method, and by calculating the evaluation values as shown in FIG. It can be seen that quantitative comparison is possible.
以上、ある培養条件での細胞培養に対して、検出した変化点に基づいてその細胞培養の培養条件に対する評価値を算出する方法を説明した。なお、評価値を算出する方法をいくつか説明したが、前述した全ての方法で算出した評価値を出力してもよいし、評価値をどの方法で算出するかを作業者が選択できるようにしてもよい。 A method for calculating an evaluation value for a cell culture under a certain culture condition based on the detected change points has been described above. Several methods for calculating the evaluation value have been described, but the evaluation values calculated by all the methods described above may be output, or the operator can select which method to calculate the evaluation value. may
以上、本実施形態によれば、変化点データに基づいて培養状態を評価し、細胞が作業者の期待通りに培養されたかどうかを判断する目的に使用できる。 As described above, according to the present embodiment, the culture state can be evaluated based on the change point data, and can be used for the purpose of determining whether the cells have been cultured as expected by the operator.
［第３の実施形態］
第２の実施形態では、検出した変化点に基づいて細胞培養の培養条件に対する評価値を算出する方法を説明した。変化点は、微妙な培養条件の違いによって変動するため、作業者が互いに異なる培養条件で行われた複数の細胞培養の状態を互いに比較する目的で使用できる。本実施形態では、時系列に沿った細胞画像データが互いに異なる培養条件で行われた複数の細胞培養におけるデータを含む場合に、評価値を計算する方法を説明する。
[Third embodiment]
In the second embodiment, a method of calculating evaluation values for culture conditions of cell culture based on detected change points has been described. Since the change point fluctuates depending on subtle differences in culture conditions, it can be used for the purpose of comparing states of a plurality of cell cultures performed under mutually different culture conditions by the operator. In the present embodiment, a method of calculating an evaluation value when the cell image data in chronological order includes data on a plurality of cell cultures performed under mutually different culture conditions will be described.
図１０に、第３の実施形態に係る細胞画像解析方法のフロー図を示す。
第３の実施形態に係る細胞画像解析方法では、上記評価値算出工程が、複数の細胞培養のそれぞれに対して第１の評価値を算出し、第１の評価値に基づいて互いに異なる培養条件についての第２の評価値を計算することを含む。
FIG. 10 shows a flowchart of the cell image analysis method according to the third embodiment.
In the cell image analysis method according to the third embodiment, the evaluation value calculation step calculates a first evaluation value for each of a plurality of cell cultures, and different culture conditions based on the first evaluation value calculating a second estimate for
具体的には、ステップＳ１００１において、複数の培養条件で細胞培養における時系列に沿った細胞画像データを取得する。ここで、取得する細胞画像データを、評価対象データと参照用データとに分ける。 Specifically, in step S1001, cell image data are obtained in chronological order in cell culture under a plurality of culture conditions. Here, the acquired cell image data is divided into evaluation target data and reference data.
なお、取得する細胞画像データの期間および時間間隔の設定方法は第１の実施形態におけるステップＳ１０１と同様である。また、どの培養条件における細胞培養のデータを評価対象あるいは参照用のデータとするかは、作業者によって選択できるものとする。以降、幹細胞の維持培養プロセスにおける第ｉ＋１回目の継代培養時の細胞画像データを評価対象データ、第ｉ回目の継代培養における細胞画像データを参照用データと選択したものとする。 The method for setting the period and time interval of cell image data to be acquired is the same as in step S101 in the first embodiment. In addition, it is assumed that the operator can select under which culture conditions cell culture data is to be evaluated or used as reference data. Hereinafter, it is assumed that the cell image data at the (i+1)th subculture in the stem cell maintenance culture process is selected as evaluation target data, and the cell image data at the i-th subculture is selected as reference data.
ステップＳ１００２では、ステップＳ１００１で取得した各細胞画像データに対して変化点データを取得する。変化点データの取得方法は、第１の実施形態におけるステップＳ１０１、Ｓ１０２，Ｓ１０３、およびＳ１０４と同様である。これにより、評価対象データと参照用データとのそれぞれに対応した変化点データを取得できる。 In step S1002, change point data is acquired for each cell image data acquired in step S1001. A method of acquiring change point data is the same as steps S101, S102, S103, and S104 in the first embodiment. As a result, it is possible to acquire change point data corresponding to each of the evaluation target data and the reference data.
ステップＳ１００３では、ステップＳ１００２で取得した各細胞培養における変化点データに基づいて、細胞培養における第１の評価値を計算する。第１の評価値の計算方法は、第２の実施形態におけるステップＳ９０５と同様である。これにより、評価対象データと参照用データとのそれぞれに対応した第１の評価値を計算できる。 In step S1003, a first evaluation value in cell culture is calculated based on the change point data in each cell culture acquired in step S1002. The calculation method of the first evaluation value is the same as step S905 in the second embodiment. Thereby, the first evaluation value corresponding to each of the evaluation target data and the reference data can be calculated.
ステップＳ１００４では、ステップＳ１００３において計算した第１の評価値に基づいて、第２の評価値を計算する。第２の評価値Ｅは、ステップＳ１００３において、評価対象データに対する第１の評価値Ｅｏ、参照用データに対する第１の評価値Ｅｒが計算された場合、式４のように計算することができる。
以上、本実施形態によれば、時系列に沿った細胞画像データが互いに異なる培養条件で行われた複数の細胞培養におけるデータを含む場合に、第２の評価値を計算することができる。 As described above, according to the present embodiment, the second evaluation value can be calculated when the time-series cell image data includes data of a plurality of cell cultures performed under mutually different culture conditions.
本実施形態は、幹細胞の維持培養プロセスにおいて、継代を重ねることで培養の様子が変化していないか、あるいは、同プロセスで複数ロットの培養を実施する際にロット間で変化がないか等を作業者が確認するために有効である。 In the present embodiment, in the process of maintaining and culturing stem cells, whether there is any change in the state of culture due to repeated passages, or when culturing multiple lots in the same process, whether there is any change between lots, etc. is effective for workers to confirm
（第３の実施形態の変形例１）
第３の実施形態では、ステップＳ１００１において、第ｉ回目の継代培養におけるデータを参照用データとして選択した場合の処理の流れを説明した。
本発明はこれに限らず、２つ以上の細胞培養における細胞画像データを参照用データとして選択してもよい。その場合、例えば、ステップＳ１００４において、第２の評価値は、評価対象データに対する第１の評価値から各参照用データに対応する複数の第１の評価値の平均を引くことで計算するようにしてもよい。
(
In the third embodiment, the flow of processing when data in the i-th subculture is selected as reference data in step S1001 has been described.
The present invention is not limited to this, and cell image data in two or more cell cultures may be selected as reference data. In that case, for example, in step S1004, the second evaluation value is calculated by subtracting the average of the plurality of first evaluation values corresponding to each reference data from the first evaluation value for the evaluation target data. may
＜プログラム＞
本発明に係るプログラムは、これまで述べてきた本発明に係る細胞画像解析方法をコンピュータに実行させるためのプログラムである。
<Program>
A program according to the present invention is a program for causing a computer to execute the cell image analysis method according to the present invention described above.
図１１は、本発明に係るプログラムを実行可能な情報処理システム１１０のハードウェア構成例を示すブロック図である。
FIG. 11 is a block diagram showing an example hardware configuration of an
情報処理システム１１０は、コンピュータの機能を有する。例えば、情報処理システム１１０は、デスクトップＰＣ（Personal Computer）、ラップトップＰＣ、タブレットＰＣ、スマートフォン等と一体に構成されていてもよい。
The
情報処理システム１１０は、演算および記憶を行うコンピュータとしての機能を実現するため、ＣＰＵ（Central Processing Unit）１１０１、ＲＡＭ（Random Access Memory）１１０２、ＲＯＭ（Read Only Memory）１１０３およびＨＤＤ（Hard Disk Drive）１１０４を備える。また、情報処理システム１１０は、通信Ｉ／Ｆ（インターフェース）１１０５、表示装置１１０６、および入力装置１１０７を備える。ＣＰＵ１１０１、ＲＡＭ１１０２、ＲＯＭ１１０３、ＨＤＤ１１０４、通信Ｉ／Ｆ１１０５、表示装置１１０６、および入力装置１１０７は、バス１１１０を介して相互に接続される。なお、表示装置１１０６および入力装置１１０７は、これらの装置を駆動するための不図示の駆動装置を介してバス１１１０に接続されてもよい。
The
図１１では、情報処理システム１１０を構成する各部が一体の装置として図示されているが、これらの機能の一部は外付け装置により構成されていてもよい。例えば、表示装置１１０６および入力装置１１０７は、ＣＰＵ１１０１等を含むコンピュータの機能を構成する部分とは別の外付け装置であってもよい。
In FIG. 11, each part constituting the
ＣＰＵ１１０１は、ＲＡＭ１１０２、ＨＤＤ１１０４等に記憶されたプログラムに従って所定の動作を行うとともに、情報処理システム１１０の各部を制御する機能をも有する。ＲＡＭ１１０２は、揮発性記憶媒体から構成され、ＣＰＵ１１０１の動作に必要な一時的なメモリ領域を提供する。ＲＯＭ１１０３は、不揮発性記憶媒体から構成され、情報処理システム１１０の動作に用いられるプログラム等の必要な情報を記憶する。ＨＤＤ１１０４は、不揮発性記憶媒体から構成され、個別独立分離区画の数や位置に関する情報、蛍光強度等の記憶を行う記憶装置である。
The
通信Ｉ／Ｆ１１０５は、Ｗｉ－Ｆｉ（登録商標）、４Ｇ等の規格に基づく通信インターフェースであり、他の装置との通信を行うためのモジュールである。表示装置１１０６は、液晶ディスプレイ、ＯＬＥＤ（Organic Light Emitting Diode）ディスプレイ等であって、動画、静止画、文字等の表示に用いられる。入力装置１１０７は、ボタン、タッチパネル、キーボード、ポインティングデバイス等であって、利用者が情報処理システム１１０を操作するために用いられる。表示装置１１０６および入力装置１１０７は、タッチパネルとして一体に形成されていてもよい。
A communication I/
なお、図１１に示されているハードウェア構成は例示であり、これら以外の装置が追加されていてもよく、一部の装置が設けられていなくてもよい。また、一部の装置が同様の機能を有する別の装置に置換されていてもよい。さらに、一部の機能がネットワークを介して他の装置により提供されてもよく、本実施形態を構成する機能が複数の装置に分散されて実現されるものであってもよい。例えば、ＨＤＤ１１０４は、フラッシュメモリ等の半導体素子を用いたＳＳＤ（Solid State Drive）に置換されていてもよく、クラウドストレージに置換されていてもよい。
Note that the hardware configuration shown in FIG. 11 is an example, and devices other than these may be added, and some devices may not be provided. Also, some devices may be replaced by other devices having similar functions. Furthermore, part of the functions may be provided by another device via a network, and the functions constituting the present embodiment may be implemented by being distributed among a plurality of devices. For example, the
図１２は、情報処理システム１１０の機能ブロック図である。情報処理システム１１０は、データ取得部１２１、細胞領域抽出部１２２、データ算出部１２３、変化点検出部１２４、評価値算出部１２５、表示部１２６、および記憶部１２７を有する。
FIG. 12 is a functional block diagram of the
なお、例えば、情報処理システム１１０が、上記の第１の実施形態で述べた細胞画像解析方法を実行する場合等においては、情報処理システム１１０は評価値算出部１２５を有していなくてもよい。
For example, when the
ＣＰＵ１１０１は、ＲＯＭ１１０３等に記憶されたプログラムをＲＡＭ１１０２にロードして実行することにより、データ取得部１２１、細胞領域抽出部１２２、データ算出部１２３、変化点検出部１２４、および評価値算出部１２５の機能を実現する。また、ＣＰＵ１１０１は、表示装置１１０６を制御することにより表示部１２６の機能を実現する。また、ＣＰＵ１１０１は、ＨＤＤ１１０４を制御することにより記憶部１２７の機能を実現する。
The
情報処理システム１１０はさらに、所定のプログラムに従って上記の細胞培養観察装置や細胞培養を行うための培養器等の動作を制御する機能を有していてもよい。
The
本発明の実施形態に係る開示は、以下の構成および方法を含む。
（方法１）
細胞培養における時系列に沿った細胞画像データを取得するデータ取得工程と、
前記細胞画像データから複数のコロニーのそれぞれに対応する複数の細胞領域を抽出する細胞領域抽出工程と、
前記複数の細胞領域のそれぞれに対して、前記細胞領域の大きさに関するデータを算出するデータ算出工程と、
前記データ算出工程で算出した前記細胞領域の大きさに関するデータに基づいて、前記コロニーの状態が変化するタイミングである変化点を検出する変化点検出工程と、
を有することを特徴とする、細胞画像解析方法。
（方法２）
前記データ取得工程は、未分化状態を維持した細胞培養における時系列に沿った細胞画像データを取得する、方法１に記載の細胞画像解析方法。
（方法３）
前記細胞領域抽出工程は、前記時系列上の異なる時点で取得した前記細胞画像データの間における同一のコロニーに対応する前記細胞領域を、前記細胞領域の重心位置および前記細胞領域の重なり具合から選ばれる少なくともいずれかに基づいて判定することを含む、方法１または２に記載の細胞画像解析方法。
（方法４）
前記細胞領域抽出工程は、前記時系列上の時点Ａで取得した細胞画像データにあるコロニーが、前記時系列上の前記時点Ａより前の時点Ｂで取得した前記細胞画像データにある２つ以上のコロニーが結合して形成されたものであるか否かを判定し、前記時点Ａの前記細胞画像データにある前記コロニーは前記時点Ｂの前記細胞画像データにある２つ以上のコロニーの結合によって形成されたものであると判定した場合に、前記時点Ａの前記細胞画像データにある前記コロニーを、細胞領域を抽出する対象から除外することを含む、方法１乃至３のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
（方法５）
前記細胞領域抽出工程は、前記細胞領域を抽出する対象となるコロニーが、培養容器および撮像視野の外周から選ばれる少なくともいずれかに接触しているか否かを判定し、接触していると判定した場合に、接触していると判定したコロニーを、細胞領域を抽出する対象から除外することを含む、方法１乃至４のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
（方法６）
前記データ算出工程は、同一のコロニーに対応する前記細胞領域に対して算出された前記細胞領域の大きさに関するデータについて、前記時系列の上のある時点で取得された値が、他の少なくとも１つの時点で取得された値に基づく基準値に対して一定値以上の変化量を有する場合に、前記同一のコロニーに対応する前記細胞領域に対して算出された前記細胞領域の大きさに関するデータを除外することを含む、方法１乃至５のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
（方法７）
前記変化点は、前記細胞の培養時間または前記細胞領域の大きさと、前記細胞領域の大きさの変化速度とに基づいて検出される、方法１乃至６のいずれかに記載の細胞画像解析方法
（方法８）
前記細胞の培養時間または前記細胞領域の大きさと、前記細胞領域の大きさの変化速度との関係を多項式モデルとして近似し、前記多項式モデルにおける極大点を前記変化点とする、方法１乃至７のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
（方法９）
前記細胞領域の大きさに関するデータは、前記細胞領域の面積、前記細胞領域の周囲長、前記細胞領域の半径、前記細胞領域の直径のいずれかである、方法１乃至８のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
（方法１０）
前記変化点は、前記細胞領域の面積の変化速度が増加から減少へと変化するタイミングである、方法１乃至９のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
（方法１１）
前記変化点に基づいて、前記細胞培養に用いた培養条件に対する評価値を算出する評価値算出工程をさらに有する、方法１乃至１０のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
（方法１２）
前記評価値算出工程は、前記複数のコロニーのそれぞれにおける前記変化点に対応する、時間、前記細胞領域の大きさ、および前記細胞領域の大きさの変化速度から選ばれる少なくとも１種のデータに対して、平均値、標準偏差、ＣＶ値および中央値から選ばれる少なくとも１種の値を計算することを含む、方法１１に記載の細胞画像解析方法。
（方法１３）
前記細胞画像データは、互いに異なる培養条件で行われた複数の細胞培養におけるデータを含み、
前記評価値算出工程は、前記複数の細胞培養のそれぞれに対して第１の評価値を算出し、前記第１の評価値に基づいて前記互いに異なる培養条件についての第２の評価値を計算することを含む、方法１１または１２に記載の細胞画像解析方法。
（構成１）
方法１乃至１３のいずれかに記載の細胞画像解析方法をコンピュータに実行させる
ためのプログラム。
Disclosure according to embodiments of the present invention includes the following configurations and methods.
(Method 1)
A data acquisition step of acquiring cell image data along a time series in cell culture;
a cell area extraction step of extracting a plurality of cell areas corresponding to each of a plurality of colonies from the cell image data;
a data calculation step of calculating data regarding the size of the cell regions for each of the plurality of cell regions;
A change point detection step of detecting a change point, which is the timing at which the state of the colony changes, based on the data regarding the size of the cell area calculated in the data calculation step;
A cell image analysis method, comprising:
(Method 2)
The cell image analysis method according to
(Method 3)
The cell area extraction step selects the cell area corresponding to the same colony among the cell image data acquired at different points in the time series from the position of the center of gravity of the cell area and the degree of overlap of the cell area. Cell image analysis method according to
(Method 4)
In the cell region extraction step, two or more colonies in the cell image data acquired at time point A on the time series are present in the cell image data acquired at time point B prior to time point A on the time series. are formed by combining the colonies, and the colony in the cell image data at the time point A is formed by combining two or more colonies in the cell image data at the time point B The cell according to any one of
(Method 5)
In the cell area extraction step, it is determined whether or not the colony from which the cell area is to be extracted is in contact with at least one selected from the culture container and the periphery of the imaging field, and is determined to be in contact. 5. The cell image analysis method according to any one of
(Method 6)
In the data calculation step, for the data regarding the size of the cell area calculated for the cell area corresponding to the same colony, the value acquired at a certain point in the time series is at least one other Data on the size of the cell area calculated for the cell area corresponding to the same colony when there is a constant value or more of change with respect to the reference value based on the values obtained at two time points 6. The cell image analysis method according to any one of
(Method 7)
The cell image analysis method according to any one of
(Method 9)
9. The method according to any one of
(Method 10)
10. The cell image analysis method according to any one of
(Method 11)
11. The cell image analysis method according to any one of
(Method 12)
In the evaluation value calculation step, at least one type of data selected from time, the size of the cell region, and the rate of change in the size of the cell region corresponding to the change point in each of the plurality of colonies 12. The cell image analysis method according to method 11, comprising calculating at least one value selected from the mean value, standard deviation, CV value and median value.
(Method 13)
The cell image data includes data in a plurality of cell cultures performed under different culture conditions,
The evaluation value calculation step calculates a first evaluation value for each of the plurality of cell cultures, and calculates a second evaluation value for the different culture conditions based on the first evaluation value. The cell image analysis method according to method 11 or 12, comprising:
(Configuration 1)
A program for causing a computer to execute the cell image analysis method according to any one of
２０１ 培養容器
４０１ 細胞画像
４０２ マスク画像
Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ１３ 細胞領域
７０１ 近似曲線
７０２ 極大点
１１０ 情報処理システム
１２１ データ取得部
１２２ 細胞領域抽出部
１２３ データ算出部
１２４ 変化点検出部
１２５ 評価値算出部
201
Claims (14)
前記細胞画像データから複数のコロニーのそれぞれに対応する複数の細胞領域を抽出する細胞領域抽出工程と、
前記複数の細胞領域のそれぞれに対して、前記細胞領域の大きさに関するデータを算出するデータ算出工程と、
前記データ算出工程で算出した前記細胞領域の大きさに関するデータに基づいて、前記コロニーの状態が変化するタイミングである変化点を検出する変化点検出工程と、
を有することを特徴とする、細胞画像解析方法。 A data acquisition step of acquiring cell image data along a time series in cell culture;
a cell area extraction step of extracting a plurality of cell areas corresponding to each of a plurality of colonies from the cell image data;
a data calculation step of calculating data regarding the size of the cell regions for each of the plurality of cell regions;
A change point detection step of detecting a change point, which is the timing at which the state of the colony changes, based on the data regarding the size of the cell area calculated in the data calculation step;
A cell image analysis method, comprising:
前記評価値算出工程は、前記複数の細胞培養のそれぞれに対して第１の評価値を算出し、前記第１の評価値に基づいて前記互いに異なる培養条件についての第２の評価値を計算することを含む、請求項１１に記載の細胞画像解析方法。 The cell image data includes data in a plurality of cell cultures performed under different culture conditions,
The evaluation value calculation step calculates a first evaluation value for each of the plurality of cell cultures, and calculates a second evaluation value for the different culture conditions based on the first evaluation value. The cell image analysis method according to claim 11, comprising
ためのプログラム。 A program for causing a computer to execute the cell image analysis method according to any one of claims 1 to 13.
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