JP2023078487A - がんの処置に用いるpp65含有人工アジュバントベクター細胞 - Google Patents
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Abstract
【課題】pp65発現がんを有する患者の処置に用いるための、aAVC-pp65細胞を提供する。【解決手段】CD1dをコードするポリヌクレオチド、及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入したヒト由来細胞、並びに、ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程と、ポリヌクレオチドが導入された細胞を培養する工程を含む、がんの処置に用いる細胞を製造する方法。【選択図】なし
Description
本発明は、がんの治療又は予防に用いる、pp65含有人工アジュバントベクター細胞(artificial adjuvant vector cell:aAVC-pp65細胞)に関する。
脳神経細胞(ニューロン)を支持する神経膠細胞(グリア)から発生する腫瘍を神経膠腫(グリオーマ)という。神経膠腫には星細胞腫、乏突起神経膠腫などの種類があり、脳から発生する腫瘍のおよそ25%を占めている。悪性度に応じてグレードが4つに分かれており、最も悪性度が高いグレード4を膠芽腫(Glioblastoma multiforme:GBM)と称する。
GBMの初発時に行う標準治療は確立されている。手術により腫瘍を摘出した後に、摘出した周囲に残っている腫瘍に対して局所に放射線照射を行い、加えてテモゾロミドの内服による化学療法を行う。その後、維持療法としてテモゾロミドの内服を継続する。しかしながら、腫瘍を完全に摘出することは難しく、ほとんどの患者において放射線治療後1年以内に再発が見られる。再発後はいくつかの治療法が提案されているが、標準化された方法はなく、再発後の平均的な生存期間は1年以内と非常に短い。このような背景から、GBMに有効な新規薬剤や新規治療法の開発が強く望まれており、新たな治療方法の提供を目的として、EGFRvIII(epidermal growth factor receptor variant III)、IL-13Rα2(interleukin-13 receptor alpha chain variant2)、survivin、MAGEA1、Ephrin A2、HER2、AIM2、TRP-2、gp100等の抗原を標的としたワクチンやT細胞療法の開発が進められている(非特許文献1及び2)。
ヒトサイトメガロウイルス(human cytomegalovirus:HCMV)は、サイトメガロウイルス属に属する2本鎖DNAウイルスである。HCMVは通常、幼小児期に唾液・尿などの分泌液を介して人体に感染し、その後、潜伏・持続感染によって人体に終生寄生する。多くの健常人がHCMVの既感染者であり、そのほとんどが不顕性感染であることが知られている。しかし、免疫機能の低下によりHCMVが再活性化して増殖し、腎移植、骨髄移植などの臓器移植患者や後天性免疫不全症候群(Acquired Immunodeficiency Syndrome:AIDS)、悪性腫瘍、免疫抑制療法等の免疫不全状態にある患者にしばしば重篤な感染症をもたらす。
近年、ヒトサイトメガロウイルスが腫瘍細胞にも感染し、腫瘍細胞に腫瘍免疫や抗がん剤に対する抵抗性を獲得させ悪性度を高める可能性があることが報告された(非特許文献3)。GBMでは患者の90%以上にてHCMV由来抗原の発現が検出されている(非特許文献4~6)。また、大腸がんではHCMVのDNAが検出され(非特許文献7)、前立腺がん(非特許文献8)や乳がん(非特許文献9)からもHCMV由来のDNAやタンパクが検出されており、種々のがんとの関係が示唆されている。
pp65(65 KDa phosphoprotein、遺伝子名 UL83)は、HCMVウイルス粒子のエンベロープとヌクレオカプシドの間のテグメントを構成するタンパク質であり、HCMVウイルス粒子を形成する約70種類のタンパク質の中で最も多く含まれるタンパク質である。このpp65タンパク質は、ウイルス抗原血症の診断用の抗原として有用であるのみならず、HCMVウイルス感染症及びGBMに対する治療又は予防用のワクチンの標的抗原としても研究が行われている(非特許文献10及び11)。しかしながら、未だにHCMVウイルスに対するワクチンとして上市された薬剤はない。
藤井らは、ヒト由来細胞に外来的にCD1d及びがん抗原を発現させ、さらに当該細胞にα-ガラクトシルセラミド(α-Galactosylceramide、α-GalCer)をパルスした人工アジュバントベクター細胞(artificial adjuvant vector cell:aAVC)を作製した(特許文献1~3)。当該aAVCは、CD1d/α-GalCer複合体を介してナチュラルキラーT(NKT)細胞を活性化し、活性化されたNKT細胞はインターフェロンγ(IFN-γ)等のサイトカインを産生してナチュラルキラー(NK)細胞等を活性化する。マウスモデルにおいて、aAVC投与によるNK細胞依存的な抗腫瘍効果が示されている(特許文献1~3)。また、マウスに投与されたaAVCは生体内において活性化されたNKT細胞により速やかに殺傷され、当該aAVCの断片は樹状細胞に取り込まれる。当該aAVC断片を取り込んだ樹状細胞は、当該細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体(major histocompatibility complex:MHC)に取り込んだがん抗原の断片を抗原提示し、がん抗原特異的なT細胞を誘導する。マウスモデルにおいて、aAVC投与によるがん抗原特異的T細胞の誘導を介した抗腫瘍効果が示されている(特許文献1~3、非特許文献12及び13)。このように、aAVCはNKT細胞活性化を介したNK細胞活性化による自然免疫活性化及び抗原特異的T細胞誘導による獲得免疫誘導の二つの免疫機構を強力に誘導し得ることが示されている。しかしながら、現在までに、aAVC細胞にpp65等のHCMV抗原を発現させた細胞及び当該細胞を用いたNK/NKT細胞の活性化及びGBM抗原特異的免疫誘導作用については、未だ報告がなされていない。
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本発明の課題は、pp65発現がんの治療又は予防に有効なaAVC-pp65細胞を提供することにある。
本発明者らは、マウスの細胞にpp65を発現させたaAVC(aAVC(3T3)-pp65細胞ともいう)を作製し(実施例1-1)、当該aAVC(3T3)-pp65細胞が、マウスにおいてpp65特異的T細胞を誘導し(実施例1-2)、pp65発現B16メラノーマ細胞担癌マウス及びpp65発現GL-261グリオーマ細胞担癌マウスにおいて、pp65タンパク質特異的な抗腫瘍効果(実施例1-3及び1-4)を示すことを見出した。さらにこれらの知見に基づいて、本発明者らは、ヒトの細胞にpp65を発現させたaAVC(aAVC-pp65ともいう)を作製した(実施例2)。即ち、本発明は、aAVC-pp65細胞、当該細胞を含む医薬組成物、当該細胞の作製方法、細胞の表面にCD1dリガンドを積載している当該細胞によるpp65発現がんの治療又は予防方法を提供する。
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含んでもよい。
[1]CD1dをコードするポリヌクレオチド、及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入した、ヒト由来細胞。
[2]CD1dがヒトCD1dである、[1]に記載の細胞。
[3]ヒト由来細胞が正常細胞である、[1]又は[2]に記載の細胞。
[4]正常細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)細胞に由来する細胞である、[3]に記載の細胞。
[5]CD1d、及びpp65又はその断片を発現している、[1]~[4]のいずれかに記載の細胞。
[6]細胞の表面にCD1dリガンドを積載している、[5]に記載の細胞。
[7]CD1dリガンドがα-GalCerである、[6]に記載の細胞。
[8][6]又は[7]に記載の細胞を含む医薬組成物。
[9]がんの処置に用いるための、[8]に記載の医薬組成物。
[10]がんを処置する方法であって、[6]又は[7]に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、方法。
[11]がんを処置するための、[6]又は[7]に記載の細胞。
[12]がんの処置に用いる医薬組成物を製造するための、[6]又は[7]に記載の細胞の使用。
[13]がんの処置に用いる細胞を製造する方法であって、
ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程と、
該細胞を培養する工程を含む、方法。
[14]CD1dがヒトCD1dである、[13]に記載の方法。
[15]ヒト由来細胞が正常細胞である、[13]又は[14]に記載の方法。
[16]正常細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)細胞に由来する細胞である、[15]に記載の方法。
[17]細胞の表面にCD1dリガンドを積載する工程をさらに含む、[13]~[16]のいずれかに記載の方法。
[18]CD1dリガンドがα-GalCerである、[17]に記載の方法。
[2]CD1dがヒトCD1dである、[1]に記載の細胞。
[3]ヒト由来細胞が正常細胞である、[1]又は[2]に記載の細胞。
[4]正常細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)細胞に由来する細胞である、[3]に記載の細胞。
[5]CD1d、及びpp65又はその断片を発現している、[1]~[4]のいずれかに記載の細胞。
[6]細胞の表面にCD1dリガンドを積載している、[5]に記載の細胞。
[7]CD1dリガンドがα-GalCerである、[6]に記載の細胞。
[8][6]又は[7]に記載の細胞を含む医薬組成物。
[9]がんの処置に用いるための、[8]に記載の医薬組成物。
[10]がんを処置する方法であって、[6]又は[7]に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、方法。
[11]がんを処置するための、[6]又は[7]に記載の細胞。
[12]がんの処置に用いる医薬組成物を製造するための、[6]又は[7]に記載の細胞の使用。
[13]がんの処置に用いる細胞を製造する方法であって、
ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程と、
該細胞を培養する工程を含む、方法。
[14]CD1dがヒトCD1dである、[13]に記載の方法。
[15]ヒト由来細胞が正常細胞である、[13]又は[14]に記載の方法。
[16]正常細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)細胞に由来する細胞である、[15]に記載の方法。
[17]細胞の表面にCD1dリガンドを積載する工程をさらに含む、[13]~[16]のいずれかに記載の方法。
[18]CD1dリガンドがα-GalCerである、[17]に記載の方法。
本発明のaAVC-pp65細胞及び本発明の医薬組成物は、がんの処置に有用である。
以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
<人工アジュバントベクター細胞>
本明細書において、「人工アジュバントベクター細胞」と「aAVC」は、同義であり、相互互換的に用いられ、CD1dポリペプチド(以下、「CD1d」とも称する)及び1又は2以上の任意のがん抗原又はその断片を発現する細胞を意味する。
本明細書において、「外来性」又は「外来的」は、人工的に作製された遺伝子又はポリヌクレオチドを遺伝子操作又は遺伝子導入等の操作により目的の細胞内に導入すること、及び目的の細胞内に人為的に導入された遺伝子又はポリヌクレオチドによりそれらがコードするタンパク質を人為的に発現させることを指す用語として相互互換的に使用される。
本明細書において、「人工アジュバントベクター細胞」と「aAVC」は、同義であり、相互互換的に用いられ、CD1dポリペプチド(以下、「CD1d」とも称する)及び1又は2以上の任意のがん抗原又はその断片を発現する細胞を意味する。
本明細書において、「外来性」又は「外来的」は、人工的に作製された遺伝子又はポリヌクレオチドを遺伝子操作又は遺伝子導入等の操作により目的の細胞内に導入すること、及び目的の細胞内に人為的に導入された遺伝子又はポリヌクレオチドによりそれらがコードするタンパク質を人為的に発現させることを指す用語として相互互換的に使用される。
<本発明のaAVC-pp65細胞>
本発明は、
CD1dをコードするポリヌクレオチド、及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入した、ヒト由来細胞(本明細書において、「aAVC-pp65細胞」とも称する)を提供する。
さらに、本発明は、
CD1d及びpp65又はその断片を発現し、細胞表面にCD1dリガンドを積載している、aAVC-pp65細胞を提供する。
本発明は、
CD1dをコードするポリヌクレオチド、及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入した、ヒト由来細胞(本明細書において、「aAVC-pp65細胞」とも称する)を提供する。
さらに、本発明は、
CD1d及びpp65又はその断片を発現し、細胞表面にCD1dリガンドを積載している、aAVC-pp65細胞を提供する。
1.ヒト由来細胞
本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞又はがん組織由来の細胞である。1つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞である。
正常細胞は、増殖能を有する限り、例えば、任意のヒト組織より単離及び/又は精製された細胞、特定の細胞種由来の細胞、ヒト組織由来の株化細胞、幹細胞より分化させた細胞等のヒト由来の細胞であってよい。また、がん組織由来の細胞としては、患者のがん組織より単離及び/又は精製された細胞、又はヒトがん組織由来の株化細胞を用いることができる。ここで、「単離」とは、生体組織からの分離を意味する。また、「精製」とは、ヒト由来の細胞を、細胞が由来する組織に含まれるその他の成分の1以上からの分離を意味する。細胞の単離及び精製は、公知の方法により行うことができる。
本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞又はがん組織由来の細胞である。1つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞である。
正常細胞は、増殖能を有する限り、例えば、任意のヒト組織より単離及び/又は精製された細胞、特定の細胞種由来の細胞、ヒト組織由来の株化細胞、幹細胞より分化させた細胞等のヒト由来の細胞であってよい。また、がん組織由来の細胞としては、患者のがん組織より単離及び/又は精製された細胞、又はヒトがん組織由来の株化細胞を用いることができる。ここで、「単離」とは、生体組織からの分離を意味する。また、「精製」とは、ヒト由来の細胞を、細胞が由来する組織に含まれるその他の成分の1以上からの分離を意味する。細胞の単離及び精製は、公知の方法により行うことができる。
任意のヒト組織より単離及び/又は精製された細胞は、当該細胞が増殖能を有する限りにおいて、例えば、胃、小腸、大腸、肺、膵臓、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、前立腺、卵巣、子宮、骨髄、皮膚、筋肉、末梢血等の任意のヒト組織由来の細胞であってよい。1つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、非血球細胞である。1つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、腎臓由来の細胞である。
特定の細胞種由来の細胞は、ヒト組織における特定の細胞種(例えば、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、間質細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、ヒト胚性腎細胞、角化細胞、間葉細胞、筋芽細胞、神経細胞、グリア細胞、扁平細胞、幹細胞、乳腺細胞、メサンギウム細胞、膵β細胞、外分泌上皮細胞、内分泌細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、骨芽細胞、胚細胞、免疫細胞(例えば、樹状細胞、マクロファージ、リンパ球、B細胞等)等)由来の細胞である。1つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ヒト胚性腎細胞である。
ヒト組織由来の株化細胞は、当業者により公知の方法を用いて作製することができ、又は商業的に入手することができる。当該株化細胞としては、例えば、ヒト胎児腎細胞293(HEK293)細胞(J.Gen.Virol.;1977;36:59-74)、WI-38細胞、SC-01MFP細胞、若しくはMRC-5細胞、又はそれら細胞に由来する細胞が挙げられる。1つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、HEK293細胞に由来する細胞である。1つの実施形態において、HEK293細胞に由来する細胞は、FreeStyle 293-F細胞である。
幹細胞より分化させた細胞は、ヒト由来人工多能性幹細胞(iPS細胞)又は胚性幹細胞(ES細胞)から分化させた細胞である。iPS細胞又はES細胞の作製及び当該細胞から分化させた細胞は、当業者により公知の方法を用いて作製することができる。
がん組織由来の細胞は、当業者に公知の方法により、患者のがん組織より単離及び/又は精製により取得することができる。また、当業者がAmerican Type Culture Collection(ATCC(登録商標))等の機関より一般的に入手可能なヒトがん組織由来の株化細胞を用いることもできる。
2.pp65
pp65はHCMVウイルス粒子の構成タンパク質の一つであり、UL83遺伝子によりコードされている。UL83遺伝子は、HCMV以外にも、Chimpanzee cytomegalovirus等のサイトメガロウイルス属のウイルスに発現が認められる。
pp65はHCMVウイルス粒子の構成タンパク質の一つであり、UL83遺伝子によりコードされている。UL83遺伝子は、HCMV以外にも、Chimpanzee cytomegalovirus等のサイトメガロウイルス属のウイルスに発現が認められる。
本発明で使用されるpp65は、天然に存在するpp65であってもよく、又は、aAVCとして投与した場合にpp65特異的T細胞を誘導する限り、その改変体であってもよい。1つの実施形態において、本発明で使用されるpp65は、サイトメガロウイルス属に属するウイルス由来のpp65である。1つの実施形態において、本発明で使用されるpp65は、HCMV由来のpp65(以下、「ヒトpp65」という)である。1つの実施形態において、ヒトpp65は、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。1つの実施形態において、ヒトpp65は、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。1つの実施形態において、ヒトpp65は、配列番号2に示されるアミノ酸配列において1~20個、好ましくは1~10個、より好ましくは1~7個、さらにより好ましくは1~5個、1~3個、又は1~2個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、本発明で使用されるpp65は、aAVCとして投与した場合にpp65特異的T細胞を誘導する限り、pp65の断片であってよい。1つの実施形態において、pp65の断片は、ヒトpp65の断片である。1つの実施形態において、ヒトpp65の断片は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の長さを有するポリペプチドである。aAVCとして投与することによるpp65特異的T細胞の誘導は、例えば、後記実施例1-2に記載の方法により評価できる。本発明で使用されるpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を用いて、使用されるpp65又はその断片のアミノ酸配列から塩基配列を設計し、作製することができる。1つの実施形態において、pp65をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本明細書における「同一性」とは、EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res.;2015;43:W580-W584)を用いて、デフォルトで用意されているパラメータによって得られたIdentityの値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Gap Open Penalty = 10
Gap Extend Penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
End Gap Penalty = false
Gap Open Penalty = 10
Gap Extend Penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
End Gap Penalty = false
3.CD1d
本発明のaAVC-pp65細胞は、CD1dをコードするポリヌクレオチドを外来的に導入している。CD1dは、細胞表面に発現するMHCクラスI様糖タンパク質であり、糖脂質抗原であるCD1dリガンドをCD1d上に提示することによりCD1d拘束性のNKT細胞を活性化することが知られている(Science;1997;278;5343:1626-1629)。本発明で使用されるCD1dは、ヒト由来細胞に発現させた場合にCD1dの機能を有する限りにおいて、天然に存在するCD1d又はその改変体であってよい。CD1dの機能は、CD1dとCD1dリガンド(例えば、α-GalCer)の結合を測定することにより評価することができる。当該評価は公知の方法を用いて当業者に容易に評価され得る。また、CD1dの機能は、aAVCによるヒトNKT細胞を活性化する能力を指標に評価することもできる。このヒトNKT細胞の活性化能は、例えば、非特許文献12のFig.1に記載のin vitroの評価系において評価することができる。簡単には、α-GalCer存在下で培養したCD1d発現細胞をNKT細胞と共培養し、培養液中のIFN-γの量を測定することにより、NKT細胞の活性化を評価することができる。
本発明のaAVC-pp65細胞は、CD1dをコードするポリヌクレオチドを外来的に導入している。CD1dは、細胞表面に発現するMHCクラスI様糖タンパク質であり、糖脂質抗原であるCD1dリガンドをCD1d上に提示することによりCD1d拘束性のNKT細胞を活性化することが知られている(Science;1997;278;5343:1626-1629)。本発明で使用されるCD1dは、ヒト由来細胞に発現させた場合にCD1dの機能を有する限りにおいて、天然に存在するCD1d又はその改変体であってよい。CD1dの機能は、CD1dとCD1dリガンド(例えば、α-GalCer)の結合を測定することにより評価することができる。当該評価は公知の方法を用いて当業者に容易に評価され得る。また、CD1dの機能は、aAVCによるヒトNKT細胞を活性化する能力を指標に評価することもできる。このヒトNKT細胞の活性化能は、例えば、非特許文献12のFig.1に記載のin vitroの評価系において評価することができる。簡単には、α-GalCer存在下で培養したCD1d発現細胞をNKT細胞と共培養し、培養液中のIFN-γの量を測定することにより、NKT細胞の活性化を評価することができる。
1つの実施形態において、本発明で使用されるCD1dは哺乳動物(例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等)由来のCD1dである。1つの実施形態において、CD1dはヒトCD1dである。1つの実施形態において、ヒトCD1dは、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。1つの実施形態において、ヒトCD1dは、配列番号4に示されるアミノ酸配列において1~10個、1~7個、1~5個、1~3個、又は1~2個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、CD1dの機能を有するポリペプチドである。1つの実施形態において、ヒトCD1dは、配列番号4に示されるポリペプチドと少なくとも90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、CD1dの機能を有するポリペプチドである。
本発明で使用されるCD1dをコードするポリヌクレオチドは外来的に導入されたポリヌクレオチドであり、当該ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を用いて、使用されるCD1dのアミノ酸配列から塩基配列を設計し、作製することができる。1つの実施形態において、CD1dをコードするポリヌクレオチドは、配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
4.プロモーター
1つの実施形態では、本発明のaAVC-pp65細胞において、CD1dをコードするポリヌクレオチド及び/又はpp65若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドにプロモーターが作動可能に連結されている。プロモーターとしては、恒常的に発現を促進するプロモーター又は誘導型プロモーターのいずれも用いることができる。本明細書において、「作動可能に連結された」とは、宿主細胞におけるポリペプチドの発現をプロモーターによって制御するために当該プロモーターがポリヌクレオチドに連結されている状態を意味する。
1つの実施形態では、本発明のaAVC-pp65細胞において、CD1dをコードするポリヌクレオチド及び/又はpp65若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドにプロモーターが作動可能に連結されている。プロモーターとしては、恒常的に発現を促進するプロモーター又は誘導型プロモーターのいずれも用いることができる。本明細書において、「作動可能に連結された」とは、宿主細胞におけるポリペプチドの発現をプロモーターによって制御するために当該プロモーターがポリヌクレオチドに連結されている状態を意味する。
「恒常的に発現を促進するプロモーター」としては、例えば、CMV(cytomegalovirus)、RSV(respiratory syncytial virus)、SV40(simian virus 40)等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、EF(elongation factor)1αプロモーター等が挙げられる。
「誘導型プロモーター」とは、誘導的に発現を促進するプロモーターであり、当該プロモーターを駆動する誘導因子(本明細書において、「誘導型プロモーターの誘導因子」又は単に「誘導因子」とも称する)の存在下において、当該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導することができるプロモーターをいう。誘導型プロモーターとしては、例えば、温熱誘導型プロモーター(例えば、ヒートショックプロモーター)、薬剤誘導型プロモーターが挙げられる。1つの実施形態において、誘導型プロモーターは、薬剤誘導型プロモーターである。本明細書において、「薬剤誘導型プロモーター」とは、誘導因子である薬剤により当該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現が調節されるプロモーターを意味する。薬剤誘導型プロモーターとしては、例えば、Cumateオペレーター、λオペレーター(例えば、12×λOp)、テトラサイクリン遺伝子発現誘導系の誘導型プロモーター(以下、「テトラサイクリン系誘導型プロモーター」という)等が挙げられる。Cumateオペレーターは、CymRリプレッサー存在下において不活性であるが、誘導因子であるCumateの存在下において、CymRリプレッサーと解離して、当該オペレーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。λオペレーターは、二量体化により転写活性化能を有するアクチベーター(λRep-GyrB-AD)を二量体化する誘導因子(例えば、クメルマイシン)の存在下において、当該オペレーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。テトラサイクリン系誘導型プロモーターは、誘導因子であるテトラサイクリン又はその誘導体(例えば、ドキシサイクリン等)及びリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子(rtTA)(例えば、Tet-On 3Gタンパク質)の存在下において、当該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。テトラサイクリン系誘導型プロモーターとしては、例えば、TRE3Gプロモーターが挙げられる。1つの実施形態において、薬剤誘導型プロモーターは、テトラサイクリン系誘導型プロモーターであり、1つの実施形態において、テトラサイクリン系誘導型プロモーターは、TRE3Gプロモーターである。
5.CD1dリガンド
1つの実施形態において、本発明のaAVC-pp65細胞は、細胞表面にCD1dリガンドを積載していてもよい。細胞表面へのCD1dリガンドの積載は、<本発明のaAVC-pp65細胞の作製方法>の項に記載のように、CD1dを発現する細胞にCD1dリガンド(例えば、α-GalCer)をパルスすることによって行い得る。本明細書において、「CD1dリガンドをパルスする」とは、培養培地中にて細胞をCD1dリガンドと接触させることを指す。CD1dリガンドをパルスされたaAVCにおいては、すべての、又は少なくとも一部のCD1dにCD1dリガンドが積載されている。
1つの実施形態において、本発明のaAVC-pp65細胞は、細胞表面にCD1dリガンドを積載していてもよい。細胞表面へのCD1dリガンドの積載は、<本発明のaAVC-pp65細胞の作製方法>の項に記載のように、CD1dを発現する細胞にCD1dリガンド(例えば、α-GalCer)をパルスすることによって行い得る。本明細書において、「CD1dリガンドをパルスする」とは、培養培地中にて細胞をCD1dリガンドと接触させることを指す。CD1dリガンドをパルスされたaAVCにおいては、すべての、又は少なくとも一部のCD1dにCD1dリガンドが積載されている。
本発明で使用されるCD1dリガンドとしては、例えば、α-ガラクトシルセラミド(α-GalCer)、α-C-ガラクトシルセラミド(α-C-GalCer)、7DW8-5、イソグロボトリヘキソシルセラミド(iGb3)が挙げられる。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。α-GalCerは、化学名は(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトシル)-N-ヘキサコサノイル-2-アミノ-1,3,4-オクタデカントリオールであり、CAS RN:158021-47-7で登録され、分子式:C50H99NO9で表される物質(分子量:858.34)である。α-GalCerは、当該分野で公知の技術に従って合成してもよく、商業的に入手可能なもの(例えば、α-Galactosylceramide(フナコシ、Cat.KRN7000))を使用してもよい。
<本発明のaAVC-pp65細胞の作製方法>
本発明のaAVC-pp65細胞は、ヒト由来細胞に、CD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる。本発明のaAVC-pp65細胞の作製方法は、さらに、aAVC-pp65細胞を培養する工程、細胞をクローニングする工程、及び細胞表面にCD1dリガンドを積載させる工程を含んでいてもよい。
本発明のaAVC-pp65細胞は、ヒト由来細胞に、CD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる。本発明のaAVC-pp65細胞の作製方法は、さらに、aAVC-pp65細胞を培養する工程、細胞をクローニングする工程、及び細胞表面にCD1dリガンドを積載させる工程を含んでいてもよい。
1.ヒト由来細胞へのポリヌクレオチドの導入
本発明のaAVC-pp65細胞は、ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる(以下、導入されるポリヌクレオチドを「目的ポリヌクレオチド」とも称する)。
本発明のaAVC-pp65細胞は、ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる(以下、導入されるポリヌクレオチドを「目的ポリヌクレオチド」とも称する)。
CD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、例えば、NCBI RefSeq IDやGenBankのAccession番号からCD1d及びpp65のアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、標準的な分子生物学及び/又は化学的手法を用いて設計及び作製することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づいてホスホロアミダイト法等を用いて合成することができ、又cDNAライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して得られるDNA断片を組み合わせて作製することができる。
ヒト由来細胞への目的ポリヌクレオチドの導入は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション等の非ウイルスベクター系の方法又はウイルスベクター系のいずれかの方法を用いて行うことができる。非ウイルスベクター系の方法を用いる場合は、目的ポリヌクレオチドは、プラスミドベクター、cDNA等の形態又はmRNAの形態であってよい。
プラスミドベクター又はウイルスベクターは、ヒト由来細胞中でCD1d又はpp65若しくはその断片を外来的に発現させるための発現ベクターとして使用しうる。発現ベクターは、目的とするポリペプチドを発現できるものであれば特に制限されず、当業者により公知の方法を用いて作製することができる。発現ベクターは、プラスミドベクターとしては、例えば、pcDNAシリーズ(Thermo Fisher Scientific社)、pALTER(登録商標)-MAX(プロメガ)、pHEK293 Ultra Expression Vector(タカラバイオ社)等を使用することができる。ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスを使用することができる。例えば、ヒト由来細胞への目的ポリヌクレオチドの導入にレンチウイルスを使用する場合、当該レンチウイルスは、pLVSIN-CMV/EF1αベクター(タカラバイオ社)、pLentiベクター(Thermo Fisher Scientific社)を用いて作製できる。ヒト由来細胞においてCD1dとpp65又はその断片を外来的に発現させる場合、CD1dをコードするポリヌクレオチドとpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを、1つの発現ベクターを用いてヒト由来細胞に導入してもよく、別々の発現ベクターを用いて導入してもよい。また、発現ベクターは、目的とする遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を確認するためのマーカーとなり得る遺伝子(例えば、薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等)を含んでいてもよい。発現ベクターは、さらに、開始コドン及び終止コドン、エンハンサー配列、非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位等を含んでいてもよい。
1つの実施形態において、本発明のaAVC-pp65細胞の作製方法は、ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する工程を含む。1つの実施形態において、本発明のaAVC-pp65細胞の作製方法は、ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する工程を含む。これらの方法について、1つの実施形態において、発現ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり、1つの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターであり、1つの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
1つの実施形態において、本発明のaAVC-pp65細胞は、ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより作製された細胞である。1つの実施形態において、本発明のaAVC-pp65細胞は、ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより作製された細胞である。これらの細胞について、1つの実施形態において、発現ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり、1つの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターであり、1つの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。1つの実施形態において、作製されたaAVC-pp65細胞は、染色体外又は細胞核のゲノムDNA上に、CD1dをコードするポリヌクレオチドとpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを有する。1つの実施形態において、作製されたaAVC-pp65細胞は、その細胞核のゲノムDNA上にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを有する。
2.aAVC-pp65細胞の培養
前記の方法にて作製されたaAVC-pp65細胞は、さらに培養により増殖させることができる。aAVC-pp65細胞を維持するため、又は増殖させるための細胞の培養は、公知の方法により行われる。基礎培地としては、例えば、MEM培地(Science;1952;122:501)、DMEM培地(Virology;1959;8:396-397)、RPMI1640培地(J.Am.Med.Assoc.;1967;199:519-524)、199培地(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.;1950;73:1-8)、FreeStyle293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific社、Cat.12338022)、CD 293 Medium(Thermo Fisher Scientific社、Cat.11913019)、Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific社、Cat.A1435101)を使用することができる。培養培地は、基礎培地に、例えば、血清(例えば、ウシ胎児血清)、血清代替物(例えば、KnockOut Serum Replacement:KSR)、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質等をさらに含むことができる。1つの実施形態において、培養培地は、無血清培地又は化学的に定義された培地である。
前記の方法にて作製されたaAVC-pp65細胞は、さらに培養により増殖させることができる。aAVC-pp65細胞を維持するため、又は増殖させるための細胞の培養は、公知の方法により行われる。基礎培地としては、例えば、MEM培地(Science;1952;122:501)、DMEM培地(Virology;1959;8:396-397)、RPMI1640培地(J.Am.Med.Assoc.;1967;199:519-524)、199培地(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.;1950;73:1-8)、FreeStyle293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific社、Cat.12338022)、CD 293 Medium(Thermo Fisher Scientific社、Cat.11913019)、Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific社、Cat.A1435101)を使用することができる。培養培地は、基礎培地に、例えば、血清(例えば、ウシ胎児血清)、血清代替物(例えば、KnockOut Serum Replacement:KSR)、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質等をさらに含むことができる。1つの実施形態において、培養培地は、無血清培地又は化学的に定義された培地である。
培養条件(例えば、培養時間、温度、培地のpH、CO2濃度等の培養条件)は当業者により適宜選択され得る。培地のpHは約6~8であるのが好ましく、培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約30~40℃、好ましくは約37℃である。また、CO2濃度は約1~10%、好ましくは約5%である。培養時間は、特に限定されるものではないが、約15~336時間行なわれる。必要により通気や撹拌を行うこともできる。
aAVC-pp65細胞において、CD1dをコードするポリヌクレオチド及び/又はpp65若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドに誘導型プロモーターが作動可能に連結されている場合、aAVC-pp65細胞の培養時にaAVC-pp65細胞を当該誘導型プロモーター用の誘導因子に接触させて、CD1d及び/又はpp65又はその断片の発現を誘導させてもよい。1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞の作製方法は、aAVC-pp65細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりCD1d及び/又はpp65又はその断片の発現を誘導させる工程を含む。1つの実施形態において、当該誘導型プロモーターは薬剤誘導型プロモーターであり、当該作製方法は、aAVC-pp65細胞を薬剤誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養する工程を含む。薬剤誘導型プロモーターを使用する場合、誘導因子であるテトラサイクリン、ドキシサイクリン、Cumate、クメルマイシン等の薬剤を加えた培養培地にて細胞を培養し、薬剤誘導型プロモーターに作動可能に連結された遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を誘導させてもよい。当該工程は、一般的な遺伝子誘導システムを用いた遺伝子誘導方法に準拠して行うことができる。1つの実施形態において、当該薬剤誘導型プロモーターはテトラサイクリン系誘導型プロモーターであり、当該作製方法は、aAVC-pp65細胞をテトラサイクリン又はその誘導体及びrtTAの存在下で培養する工程を含む。1つの実施形態において、テトラサイクリン系誘導型プロモーターはTRE3Gプロモーターであり、当該作製方法は、aAVC-pp65細胞をテトラサイクリン又はその誘導体及びTet-On 3Gタンパク質の存在下で培養する工程を含む。得られたaAVC-pp65細胞におけるCD1d及びpp65又はその断片の発現量は、抗CD1d抗体又は抗pp65抗体を用いたWestern Blot法、ELISA法、フローサイトメトリー法等の当業者によって公知の方法にて測定することができる。
3.aAVC-pp65細胞のクローニング
細胞にポリヌクレオチドを導入する場合、目的ポリヌクレオチドが導入された細胞及び導入されていない細胞が混在しているため、さらに、目的ポリヌクレオチドを細胞核のゲノムDNA上に組み込む場合には、その組み込まれている場所も細胞により異なるため、不均質(heterogeneous)な細胞の集団となっている場合がある。本明細書において、前記の不均質な細胞の集団を「細胞プール」と称す。当該細胞プールから単一の遺伝子型を有する細胞を取得する方法(本明細書にて、「クローニング」という)により、CD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドが導入された1細胞(以下、「クローン化された細胞」という。)を取得し増殖させることにより、単一の遺伝子型を有する細胞集団(以下、「クローン化された細胞の集団」という。)を取得することができる。aAVC-pp65細胞のクローニングは、当業者によく知られている方法を用いて実施することができ、例えば、限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法を用いることができる。1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞のクローニング方法は限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法の1又は2以上の方法を組み合わせて用いることもできる。1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞のクローニング方法は限外希釈法である。
細胞にポリヌクレオチドを導入する場合、目的ポリヌクレオチドが導入された細胞及び導入されていない細胞が混在しているため、さらに、目的ポリヌクレオチドを細胞核のゲノムDNA上に組み込む場合には、その組み込まれている場所も細胞により異なるため、不均質(heterogeneous)な細胞の集団となっている場合がある。本明細書において、前記の不均質な細胞の集団を「細胞プール」と称す。当該細胞プールから単一の遺伝子型を有する細胞を取得する方法(本明細書にて、「クローニング」という)により、CD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドが導入された1細胞(以下、「クローン化された細胞」という。)を取得し増殖させることにより、単一の遺伝子型を有する細胞集団(以下、「クローン化された細胞の集団」という。)を取得することができる。aAVC-pp65細胞のクローニングは、当業者によく知られている方法を用いて実施することができ、例えば、限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法を用いることができる。1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞のクローニング方法は限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法の1又は2以上の方法を組み合わせて用いることもできる。1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞のクローニング方法は限外希釈法である。
前記方法にて取得された各クローン化されたaAVC-pp65細胞についてCD1d及びpp65又はその断片の発現量を測定することによって、CD1d及びpp65又はその断片について目的の発現量を示す、クローン化されたaAVC-pp65細胞の集団を選択することができる。CD1dをコードするポリヌクレオチド及び/又はpp65若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドに誘導型プロモーターが作動可能に連結されている場合、各クローン化されたaAVC-pp65細胞について、その一部を当該誘導型プロモーター用の誘導因子に接触させ、得られた細胞のCD1d及びpp65又はその断片の発現量を測定することによって、誘導因子の存在下においてCD1d及びpp65又はその断片について目的の発現量を示す、クローン化されたaAVC-pp65細胞の集団を選択してもよい。選択したクローン化された細胞の集団を凍結状態で保存したものを、リサーチセルバンク(RCB)として使用しうる。RCBの細胞を培養して増殖させ、凍結させたものをマスターセルバンク(MCB)として使用しうる。MCBの細胞を培養して増殖させ、凍結させたものをワーキングセルバンク(WCB)として使用しうる。WCBの細胞を培養したものを医薬品の原料として使用しうる。各セルバンクは、凍結保護剤を含んでもよい。各セルバンクは、複数の容器(例えば、2~10000の容器、例えば、10~1000の容器、例えば、100~500の容器)に分注され、凍結状態で保管してもよい。クローン化されたaAVC-pp65細胞の解凍、培養、及び誘導因子との接触、並びにCD1d及びpp65又はその断片の発現量の測定はそれぞれ、当業者に公知の方法で行うことができ、培養、誘導因子との接触、及び発現量の測定は、例えば、「2.aAVC-pp65細胞の培養」に記載の方法等を使用して行うことができる。1つの実施形態において、クローン化されたaAVC-pp65細胞の培養、及び誘導因子との接触、並びにCD1d及びpp65又はその断片の発現量の測定は、RCB及びWCBの解凍後に行うことができる。
4.aAVC-pp65細胞へのCD1dリガンドの積載
aAVC-pp65細胞にCD1dリガンドをパルスすることによって、CD1dリガンドを積載したaAVC-pp65細胞を作製することができる。CD1dリガンドをパルスする条件(例えば、細胞の培養培地にCD1dリガンドを添加するタイミング、培養培地中のCD1dリガンドの濃度及び培養時間等)は、使用する細胞及び培養時の諸条件を考慮して当業者にて適宜調整され得る。aAVC-pp65細胞の培養培地に添加するCD1dリガンドの濃度は、特に限定されないが、例えば、1ng/mL~10000ng/mLの範囲で適宜選択され得る。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。CD1dをコードするポリヌクレオチド及び/又はpp65若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドに誘導型プロモーターが作動可能に連結されているaAVC-pp65細胞の場合、1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞へのCD1dリガンドの積載は、当該細胞と誘導因子との接触の前に行われ得る。1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞へのCD1dリガンドの積載は、当該細胞と誘導因子との接触の後に行われ得る。1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞へのCD1dリガンドの積載は、当該細胞と誘導因子との接触と同時に行われ得る。これらの実施形態において、aAVC-pp65細胞は、好ましくは、クローン化されている。
aAVC-pp65細胞にCD1dリガンドをパルスすることによって、CD1dリガンドを積載したaAVC-pp65細胞を作製することができる。CD1dリガンドをパルスする条件(例えば、細胞の培養培地にCD1dリガンドを添加するタイミング、培養培地中のCD1dリガンドの濃度及び培養時間等)は、使用する細胞及び培養時の諸条件を考慮して当業者にて適宜調整され得る。aAVC-pp65細胞の培養培地に添加するCD1dリガンドの濃度は、特に限定されないが、例えば、1ng/mL~10000ng/mLの範囲で適宜選択され得る。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。CD1dをコードするポリヌクレオチド及び/又はpp65若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドに誘導型プロモーターが作動可能に連結されているaAVC-pp65細胞の場合、1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞へのCD1dリガンドの積載は、当該細胞と誘導因子との接触の前に行われ得る。1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞へのCD1dリガンドの積載は、当該細胞と誘導因子との接触の後に行われ得る。1つの実施形態において、aAVC-pp65細胞へのCD1dリガンドの積載は、当該細胞と誘導因子との接触と同時に行われ得る。これらの実施形態において、aAVC-pp65細胞は、好ましくは、クローン化されている。
上記で作製したCD1d及びpp65又はその断片を発現し、当該細胞の表面にCD1dリガンドを積載しているaAVC-pp65細胞において、当該細胞の増殖を人為的な方法を用いて停止させてもよい。当該細胞の増殖を停止させる方法は、特に限定されないが、例えば、放射線(例えば、X線)照射にて細胞増殖を停止させる方法、マイトマイシンC等の薬剤を添加する方法等を使用し得る。1つの実施形態において、本発明のaAVC-pp65細胞は、細胞増殖が停止している細胞である。1つの実施形態において、細胞増殖を停止させる方法は放射線照射である。
<本発明の医薬組成物等>
本発明はまた、CD1d及びpp65又はその断片を発現し、当該細胞の表面にCD1dリガンドを積載したaAVC-pp65細胞(以下、「CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞」という)を含む医薬組成物を提供する。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。1つの実施形態において、当該医薬組成物は、がんの処置に用いるための医薬組成物である。当該医薬組成物は、当該分野において通常用いられる賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。医薬組成物の製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられる。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の凍結物を含み得る。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の凍結物及び凍結保護剤を含み得る。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の懸濁液を含み得る。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の懸濁液及び凍結保護剤を含み得る。
本発明はまた、CD1d及びpp65又はその断片を発現し、当該細胞の表面にCD1dリガンドを積載したaAVC-pp65細胞(以下、「CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞」という)を含む医薬組成物を提供する。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。1つの実施形態において、当該医薬組成物は、がんの処置に用いるための医薬組成物である。当該医薬組成物は、当該分野において通常用いられる賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。医薬組成物の製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられる。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の凍結物を含み得る。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の凍結物及び凍結保護剤を含み得る。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の懸濁液を含み得る。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の懸濁液及び凍結保護剤を含み得る。
本発明はまた、がんを処置するためのCD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞を提供する。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。本発明はまた、がんの処置に用いる医薬組成物を製造するための本発明のCD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の使用を提供する。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。
本発明はまた、本発明のCD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞を対象に投与する工程を含む、がんを処置する方法を提供する。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。本明細書において、「対象」とは、哺乳動物(例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等)であり、1つの実施形態において、対象はヒトである。本明細書において、「処置」とは、治療的処置及び予防的処置を含む意味で用いられる。CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞を対象へ投与する場合、当該細胞及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の形態で対象に投与することができる。対象へのCD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の投与量及び投与回数は、がんの種類、位置、重症度、処置を受ける対象の年齢、体重及び状態などに応じて適宜調節できる。CD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の投与量は、例えば、対象への一回の投与において1×103cells/kg~1×109cells/kgを用いることができる。対象へのCD1dリガンド積載aAVC-pp65細胞の投与方法としては、例えば、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内等への注射又は点滴により投与することができる。本発明の処置方法は、他のがん治療方法と併用して用いることができる。他のがん治療方法としては、手術、放射線治療、造血幹細胞移植、又は、他の抗がん剤による治療が挙げられる。
本発明の処置の対象となるがんとしては、特に限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、ホジキンリンパ腫、ノンホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、T細胞リンパ腫等の血液がん、骨髄異形成症候群、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、胆のうがん、胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、精巣がん、卵巣がん、脳腫瘍等の固形がん、及び骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんの他、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、膠芽腫、多形性膠芽腫、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫等が挙げられる。1つの実施形態において、本発明の処置の対象となるがんは、pp65陽性のがんである。1つの実施形態において、本発明の処置の対象となるがんは、膠芽腫又は多形性膠芽腫である。
<がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法>
本発明はまた、以下の工程を含む、がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法を提供する:
ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、及び
該細胞を培養する工程。
本発明はまた、以下の工程を含む、がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法を提供する:
ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、及び
該細胞を培養する工程。
1つの実施形態において、本発明のがんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法において使用するCD1dはヒトCD1dである。
1つの実施形態において、本発明のがんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法において使用するヒト由来細胞は正常細胞である。1つの実施形態において、がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法において使用するヒト由来細胞はHEK293細胞に由来する細胞である。
1つの実施形態において、本発明のがんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法は、細胞表面にCD1dリガンドを積載する工程をさらに含む。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。
1つの実施形態において、本発明のがんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法は、誘導型プロモーターが作動可能に連結されたCD1dをコードするポリヌクレオチド及び/又はpp65若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドをヒト由来細胞に導入する工程を含む。1つの実施形態において、当該製造方法は、前記工程で得られた細胞(aAVC-pp65細胞)を当該誘導型プロモーター用の誘導因子に接触させてCD1d及び/又はpp65又はその断片の発現を誘導させる工程をさらに含む。1つの実施形態において、当該製造方法は、当該aAVC-pp65細胞を当該誘導型プロモーター用の誘導因子の存在下で培養することによりpp65又はその断片の発現を誘導させる工程を含む。1つの実施形態において、当該製造方法は、細胞表面にCD1dリガンドを積載する工程をさらに含み、1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。1つの実施形態において、細胞表面へのCD1dリガンドの積載は、aAVC-pp65細胞と誘導因子との接触の前でも後でも同時でもよい。
本発明はまた、本発明のaAVC-pp65細胞を培養する工程を含む、がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法を提供する。1つの実施形態において、当該aAVC-pp65細胞に使用されるCD1dはヒトCD1dである。1つの実施形態において、当該aAVC-pp65細胞に使用されるヒト由来細胞は正常細胞であり、1つの実施形態において、当該ヒト由来細胞はHEK293細胞に由来する細胞である。1つの実施形態において、当該製造方法は、細胞表面にCD1dリガンドを積載する工程をさらに含む。1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。
1つの実施形態において、当該製造方法で使用される本発明のaAVC-pp65細胞は、誘導型プロモーターが作動可能に連結されているCD1dをコードするポリヌクレオチド及び/又はpp65若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入したヒト由来細胞であり、1つの実施形態において、当該方法は、本発明のaAVC-pp65細胞を誘導型プロモーターの誘導因子に接触させてCD1d及び/又はpp65又はその断片の発現を誘導させる工程をさらに含む。1つの実施形態において、当該方法は、当該aAVC-pp65細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりCD1d及び/又はpp65又はその断片の発現を誘導させる工程を含む。1つの実施形態において、当該製造方法は、細胞表面にCD1dリガンドを積載する工程をさらに含み、1つの実施形態において、CD1dリガンドは、α-GalCerである。1つの実施形態において、細胞表面へのCD1dリガンドの積載は、aAVC-pp65細胞と誘導因子との接触の前でも後でも同時でもよい。本発明はまた、がんの処置に用いる医薬組成物の製造における本発明のaAVC-pp65細胞の使用を提供する。
本項に記載の製造方法に用いる細胞及び工程等に関する具体的な実施形態については、前記の<本発明のaAVC-pp65細胞>及び<本発明のaAVC-pp65細胞の作製方法>の項に記載のとおりである。
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
[実施例1:マウス型aAVC(3T3)-pp65細胞の抗腫瘍作用]
がん抗原であるpp65を搭載したaAVCの抗原特異的抗腫瘍効果をin vivo評価系にて確認した。
がん抗原であるpp65を搭載したaAVCの抗原特異的抗腫瘍効果をin vivo評価系にて確認した。
[実施例1-1:マウス型aAVC(3T3)-pp65細胞の作製]
マウスNIH/3T3細胞(ATCC、Cat.CRL-1658)にpp65遺伝子及びCD1d遺伝子のmRNAを導入し、マウス型aAVC(aAVC(3T3)-pp65とも称する)を作製した。
マウスNIH/3T3細胞(ATCC、Cat.CRL-1658)にpp65遺伝子及びCD1d遺伝子のmRNAを導入し、マウス型aAVC(aAVC(3T3)-pp65とも称する)を作製した。
pp65遺伝子(配列番号1)は、配列番号2に示されるHCMV pp65のアミノ酸配列(UniProt:P06725-1)を基に、人工遺伝子合成にて作製した。さらに、前記pp65遺伝子を、pGEM(登録商標)-4Zプラスミド(以下、pGEM-4Zプラスミド)(プロメガ社、Cat.P2161)のHindIII又はEcoRI認識配列を含む16塩基と相補的な配列を付加したプライマーを用い、PCR法にて増幅した。増幅したpp65遺伝子をpGEM-4ZプラスミドのHindIII-EcoRIサイトに、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kit(タカラバイオ社、Cat.639648)を用いて挿入した。得られたプラスミドを、pGEM-4Z-pp65プラスミドと称する。pGEM-4ZプラスミドのHindIII-BamHIサイトに、配列番号5に示す塩基配列からなるマウスCD1d遺伝子(UniProt:P11609-1のアミノ酸配列(配列番号6)を基に人工遺伝子合成にて遺伝子を合成)を挿入した。得られたプラスミドをpGEM-4Z-mCD1dプラスミドと称する。pGEM-4Z-pp65プラスミド及びpGEM-4Z-mCD1dプラスミドをそれぞれEcoRIとBamHIで切断して直鎖にしたものをテンプレートとして用い、mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific社、Cat.AMB13455)を用いてpp65 mRNA及びCD1d mRNAを作製した。NIH/3T3細胞を、α-GalCer(十全化学株式会社に合成を委託)を350ng/mL添加した10%量のウシ胎児血清を含むDulbecco’s Modified Eagle培地(Merck社、Cat.D6429)にて2日間培養した後に、回収した。回収した細胞懸濁液に、pp65 mRNAとCD1d mRNAを添加し、NEPA21エレクトロポレーター(ネッパジーン株式会社)を用いてエレクトロポレーション(ポアーリングパルス:電圧150V、パルス幅8ms、パルス間隔50ms、回数2回、減衰率10%、極性+、トランスファーパルス:電圧20V、パルス幅50ms、パルス間隔50ms、回数±5回、減衰率40%、極性+/-)を行った。エレクトロポレーション後の細胞を回収し、前記細胞にX線照射装置MBR-1520R-3(株式会社 日立パワーソリューションズ)を用いて30Gy量のX線を照射した。前記の方法により得られた細胞をaAVC(3T3)-pp65細胞と称する。
aAVC(3T3)-pp65細胞の対照被験aAVCとして使用したaAVC(3T3)-WT1細胞は、aAVC(3T3)-pp65細胞の作製方法に準じ、WT1遺伝子及びCD1d遺伝子のmRNAを導入することにより作製した。本工程において、NIH/3T3細胞は、α-GalCerを500ng/mL添加した10%量のウシ胎児血清を含むDulbecco’s Modified Eagle培地(Merck社、Cat.D6429)にて2日間培養した。WT1遺伝子は、WO2013/018778に記載のpcDNA3-ATG-WT1から調製した。
[実施例1-2:マウスにおけるaAVC(3T3)-pp65細胞のpp65特異的T細胞誘導能]
各群5例の5週齢C57BL/6J雌性マウス(日本チャールス・リバー)の尾静脈に、200μLのBICANATE Injection(株式会社大塚製薬工場)に懸濁したaAVC(3T3)-pp65細胞を、それぞれ5×103cells、5×104cells、5×105cellsずつ投与した。コントロール群には200μLのBICANATE Injectionを投与した。投与7日後にマウスから脾臓細胞を回収し、添付の方法に従って回収した細胞をmouse IFN-γ single-color enzymatic ELISPOT assay kit(Cellular Technology Limited社、mIFNGp-2M/5)のプレートに3×105cells/ウェルずつ播種した。さらに、pp65特異的T細胞を刺激するために、pp65タンパク質に特異的なオーバーラッピングペプチドのpp65ペプチド(PepTivator CMV pp65 - premium grade,human(ミルテニーバイオテク社、Cat.130-093-435))、及び、pp65タンパク質に非特異的なオーバーラッピングペプチドのWT1ペプチド(PepTivator WT1 - premium grade,human(ミルテニーバイオテク社、Cat.130-095-918))を添加し、37℃、5%CO2条件下で1日間培養した。添付の方法に従ってスポットの発色を実施し、ELISpotリーダー08クラシック(Autoimmun Diagnostika社)にてウェル底の細胞スポットの数をカウントすることにより、IFN-γ産生細胞数を計測した。aAVC(3T3)-pp65細胞投与マウスでは、pp65ペプチド刺激によりIFN-γを産生する細胞が増加した(図1-1)。抗原非特異的であるWT1ペプチド刺激によるスポット数との差が、pp65特異的T細胞数を示す。この結果より、aAVC(3T3)-pp65細胞の投与によりpp65特異的T細胞が誘導されることが示唆された。
各群5例の5週齢C57BL/6J雌性マウス(日本チャールス・リバー)の尾静脈に、200μLのBICANATE Injection(株式会社大塚製薬工場)に懸濁したaAVC(3T3)-pp65細胞を、それぞれ5×103cells、5×104cells、5×105cellsずつ投与した。コントロール群には200μLのBICANATE Injectionを投与した。投与7日後にマウスから脾臓細胞を回収し、添付の方法に従って回収した細胞をmouse IFN-γ single-color enzymatic ELISPOT assay kit(Cellular Technology Limited社、mIFNGp-2M/5)のプレートに3×105cells/ウェルずつ播種した。さらに、pp65特異的T細胞を刺激するために、pp65タンパク質に特異的なオーバーラッピングペプチドのpp65ペプチド(PepTivator CMV pp65 - premium grade,human(ミルテニーバイオテク社、Cat.130-093-435))、及び、pp65タンパク質に非特異的なオーバーラッピングペプチドのWT1ペプチド(PepTivator WT1 - premium grade,human(ミルテニーバイオテク社、Cat.130-095-918))を添加し、37℃、5%CO2条件下で1日間培養した。添付の方法に従ってスポットの発色を実施し、ELISpotリーダー08クラシック(Autoimmun Diagnostika社)にてウェル底の細胞スポットの数をカウントすることにより、IFN-γ産生細胞数を計測した。aAVC(3T3)-pp65細胞投与マウスでは、pp65ペプチド刺激によりIFN-γを産生する細胞が増加した(図1-1)。抗原非特異的であるWT1ペプチド刺激によるスポット数との差が、pp65特異的T細胞数を示す。この結果より、aAVC(3T3)-pp65細胞の投与によりpp65特異的T細胞が誘導されることが示唆された。
[実施例1-3:pp65発現B16メラノーマ細胞担癌マウスにおけるaAVC(3T3)-pp65細胞の抗原特異的抗腫瘍効果]
B16-F10メラノーマ細胞(ATCC、Cat.CRL-6475)にpp65遺伝子(配列番号1)を搭載したプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、薬剤選択することにより、pp65タンパク質を発現するB16-F10メラノーマ細胞(B16-pp65細胞とも称する)を作製した。各群12例の5週齢C57BL/6J雌性マウス(日本チャールス・リバー)の皮下に、D-PBS(-)(富士フイルム和光純薬株式会社、Cat.045-29795)に懸濁した1×105cellsのB16-pp65細胞を投与した。投与5日後、前記マウスの尾静脈に、BICANATE Injectionに懸濁したaAVC(3T3)-pp65細胞、又はaAVC(3T3)-WT1細胞を、それぞれ5×102cells、5×103cells、5×104cellsずつ投与した。コントロール群には200μLのBICANATE Injectionを投与した。がん細胞を接種した日を0日目と設定し、17日間の腫瘍体積の変化を計測した。aAVC(3T3)-pp65細胞を投与したすべての群とaAVC(3T3)-WT1細胞を5×104cells投与した群においてB16-pp65腫瘍の増大が有意に抑制されたのに対し、aAVC(3T3)-WT1細胞を5×102cells、5×103cellsを投与した群ではB16-pp65腫瘍の増大は抑制されなかった(図1-2)。aAVC(3T3)-pp65細胞及びaAVC(3T3)-WT1細胞を5×104cells投与した群では、いずれも抗腫瘍効果が見られているため、本用量における抗腫瘍効果はpp65タンパク質に非特異的な効果も含めた抗腫瘍効果を検出していると考えられる。一方で、5×102cellsと5×103cellsのaAVC(3T3)-pp65細胞投与群においては、aAVC(3T3)-WT1細胞投与群よりも強い抗腫瘍効果が得られており、両者の抗腫瘍活性の差は、pp65タンパク質に対する特異的免疫の誘導に基づくpp65特異的抗腫瘍効果と考えられる。なお、aAVC(3T3)-pp65の1×106細胞あたりのpp65の発現量は、96.8μgであった。
B16-F10メラノーマ細胞(ATCC、Cat.CRL-6475)にpp65遺伝子(配列番号1)を搭載したプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、薬剤選択することにより、pp65タンパク質を発現するB16-F10メラノーマ細胞(B16-pp65細胞とも称する)を作製した。各群12例の5週齢C57BL/6J雌性マウス(日本チャールス・リバー)の皮下に、D-PBS(-)(富士フイルム和光純薬株式会社、Cat.045-29795)に懸濁した1×105cellsのB16-pp65細胞を投与した。投与5日後、前記マウスの尾静脈に、BICANATE Injectionに懸濁したaAVC(3T3)-pp65細胞、又はaAVC(3T3)-WT1細胞を、それぞれ5×102cells、5×103cells、5×104cellsずつ投与した。コントロール群には200μLのBICANATE Injectionを投与した。がん細胞を接種した日を0日目と設定し、17日間の腫瘍体積の変化を計測した。aAVC(3T3)-pp65細胞を投与したすべての群とaAVC(3T3)-WT1細胞を5×104cells投与した群においてB16-pp65腫瘍の増大が有意に抑制されたのに対し、aAVC(3T3)-WT1細胞を5×102cells、5×103cellsを投与した群ではB16-pp65腫瘍の増大は抑制されなかった(図1-2)。aAVC(3T3)-pp65細胞及びaAVC(3T3)-WT1細胞を5×104cells投与した群では、いずれも抗腫瘍効果が見られているため、本用量における抗腫瘍効果はpp65タンパク質に非特異的な効果も含めた抗腫瘍効果を検出していると考えられる。一方で、5×102cellsと5×103cellsのaAVC(3T3)-pp65細胞投与群においては、aAVC(3T3)-WT1細胞投与群よりも強い抗腫瘍効果が得られており、両者の抗腫瘍活性の差は、pp65タンパク質に対する特異的免疫の誘導に基づくpp65特異的抗腫瘍効果と考えられる。なお、aAVC(3T3)-pp65の1×106細胞あたりのpp65の発現量は、96.8μgであった。
[実施例1-4:pp65発現GL-261グリオーマ細胞担癌マウスにおけるaAVC(3T3)-pp65細胞の抗原特異的抗腫瘍効果]
GL-261グリオーマ細胞(DSMZ、Cat.ACC802)にpp65遺伝子(配列番号1)を搭載したプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、薬剤選択することにより、pp65タンパク質を発現するGL-261グリオーマ細胞(GL-261-pp65細胞と称する)を作製した。各群12例の5週齢C57BL/6J雌性マウス(日本チャールス・リバー)の頭蓋内に、D-PBS(-)(富士フイルム和光純薬株式会社、Cat.045-29795)に懸濁した1×105cellsのGL-261-pp65細胞を投与した。投与7日後、前記マウスの尾静脈に、BICANATE Injectionに懸濁したaAVC(3T3)-pp65細胞、又はaAVC(3T3)-WT1細胞を、それぞれ5×102cells、5×103cells、5×104cellsずつ投与した。コントロール群には200μLのBICANATE Injectionを投与した。GL-261-pp65細胞投与から50日間にわたり生存を観察した。ログランク検定により生存期間を比較したところ、aAVC(3T3)-pp65細胞投与群すべてとaAVC(3T3)-WT1細胞を5×104cells投与した群はコントロール群と比較して有意に生存期間が延長されたのに対し、aAVC(3T3)-WT1細胞を5×102cells、5×103cellsを投与した群では生存期間の延長効果が見られなかった(図1-3)。実施例1-3の結果と同様に、5×102cellsと5×103cellsのaAVC(3T3)-pp65細胞の投与により示された抗腫瘍活性は、pp65特異的免疫の誘導に基づくpp65特異的抗腫瘍効果と考えられる。
GL-261グリオーマ細胞(DSMZ、Cat.ACC802)にpp65遺伝子(配列番号1)を搭載したプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、薬剤選択することにより、pp65タンパク質を発現するGL-261グリオーマ細胞(GL-261-pp65細胞と称する)を作製した。各群12例の5週齢C57BL/6J雌性マウス(日本チャールス・リバー)の頭蓋内に、D-PBS(-)(富士フイルム和光純薬株式会社、Cat.045-29795)に懸濁した1×105cellsのGL-261-pp65細胞を投与した。投与7日後、前記マウスの尾静脈に、BICANATE Injectionに懸濁したaAVC(3T3)-pp65細胞、又はaAVC(3T3)-WT1細胞を、それぞれ5×102cells、5×103cells、5×104cellsずつ投与した。コントロール群には200μLのBICANATE Injectionを投与した。GL-261-pp65細胞投与から50日間にわたり生存を観察した。ログランク検定により生存期間を比較したところ、aAVC(3T3)-pp65細胞投与群すべてとaAVC(3T3)-WT1細胞を5×104cells投与した群はコントロール群と比較して有意に生存期間が延長されたのに対し、aAVC(3T3)-WT1細胞を5×102cells、5×103cellsを投与した群では生存期間の延長効果が見られなかった(図1-3)。実施例1-3の結果と同様に、5×102cellsと5×103cellsのaAVC(3T3)-pp65細胞の投与により示された抗腫瘍活性は、pp65特異的免疫の誘導に基づくpp65特異的抗腫瘍効果と考えられる。
実施例1の結果より、マウス型aAVC(3T3)-pp65細胞は、マウスin vivo評価系において、pp65特異的T細胞を誘導することによりpp65特異的抗腫瘍効果を示すことが確認された。ヒトにおいても、ヒト型aAVC-pp65細胞は、自然免疫を惹起して抗腫瘍効果を奏すると共に、抗原特異的な獲得免疫を誘導し、獲得免疫に基づく抗腫瘍効果を奏することを期待し得るため、ヒトのpp65発現がんに対してpp65特異的抗腫瘍効果を示す治療薬の創製を目的とし、以下にヒト型aAVC-pp65細胞の作製検討を行った。
[実施例2:ヒト型aAVC-pp65細胞の作製及び調製]
pp65、CD1d、及びTet-On 3G遺伝子をFreeStyle 293-F細胞(Thermo Fisher Scientific社、Cat.R79007)に導入することによりヒト型aAVC-pp65細胞を構築した。
pp65、CD1d、及びTet-On 3G遺伝子をFreeStyle 293-F細胞(Thermo Fisher Scientific社、Cat.R79007)に導入することによりヒト型aAVC-pp65細胞を構築した。
[実施例2-1:レンチウイルス作製]
(1)レンチウイルス作製用プラスミドの構築
pLVSIN-CMV Purプラスミド(タカラバイオ社、Cat.6183)とpTRE3G(タカラバイオ社、Cat.631173)の塩基配列を基に構築したレンチウイルスプラスミドをpLVsyn-TRE3Gプラスミドと称する。pLVsyn-TRE3GプラスミドのEcoRI又はBamHI認識配列を含む16塩基に相補的な配列を付加したプライマーを用い、pp65遺伝子(配列番号1)をPCR法にて増幅した。増幅したpp65遺伝子を、EcoRI及びBamHIにて処理したpLVsyn-TRE3GプラスミドにIn-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いて挿入した。得られたプラスミドをpLVsyn-TRE3G-pp65プラスミドと称する。得られたpLVsyn-TRE3G-pp65プラスミドのWPRE配列を、当業者に周知の方法を用いて、Gene Ther.;2009;16(5):605-19に記載の変異WPRE配列(mut6)に置換した。得られたプラスミドをpLVsyn-TRE3G-pp65-mWPRE(配列番号7)と称する。
(1)レンチウイルス作製用プラスミドの構築
pLVSIN-CMV Purプラスミド(タカラバイオ社、Cat.6183)とpTRE3G(タカラバイオ社、Cat.631173)の塩基配列を基に構築したレンチウイルスプラスミドをpLVsyn-TRE3Gプラスミドと称する。pLVsyn-TRE3GプラスミドのEcoRI又はBamHI認識配列を含む16塩基に相補的な配列を付加したプライマーを用い、pp65遺伝子(配列番号1)をPCR法にて増幅した。増幅したpp65遺伝子を、EcoRI及びBamHIにて処理したpLVsyn-TRE3GプラスミドにIn-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いて挿入した。得られたプラスミドをpLVsyn-TRE3G-pp65プラスミドと称する。得られたpLVsyn-TRE3G-pp65プラスミドのWPRE配列を、当業者に周知の方法を用いて、Gene Ther.;2009;16(5):605-19に記載の変異WPRE配列(mut6)に置換した。得られたプラスミドをpLVsyn-TRE3G-pp65-mWPRE(配列番号7)と称する。
CD1d遺伝子(配列番号3)は配列番号4に示されるヒトCD1dのアミノ酸配列を基に設計し、人工遺伝子合成にて当該遺伝子の5’末側にXhoI認識配列、3’末側にNotI認識配列を付加した遺伝子を作製した。制限酵素XhoI及びNotIで切り出したCD1d遺伝子を、pLVSIN-CMV Purプラスミドの塩基配列を基に構築したpLVsyn-CMVプラスミド(配列番号8)のXhoI-NotIサイトに挿入した。得られたプラスミドをpLVsyn-CMV-CD1dプラスミドと称する。pLVsyn-TRE3G-pp65-mWPREと同様の手順でWPRE配列を変異型に変換したpLVsyn-CMV-CD1d-mWPREプラスミドを作製した。
Tet-On 3G遺伝子は、pCMV-Tet3Gプラスミド(タカラバイオ社、Cat.631335)のTet-On 3G遺伝子配列を基に、当該遺伝子の5’末側にXhoI認識配列、3’末側にNotI認識配列を付加し、人工遺伝子合成にて作製した。制限酵素XhoI及びNotIで切り出したTet-On 3G遺伝子を、pLVsyn-CMVプラスミドのXhoI-NotIサイトに挿入した。得られたプラスミドをpLVsyn-CMV-Tet3Gプラスミドと称する。pLVsyn-TRE3G-pp65-mWPREと同様の手順でWPRE配列を変異型に変換したpLVsyn-CMV-Tet3G-mWPREプラスミドを作製した。
(2)レンチウイルス作製
(1)で作製した、pLVsyn-TRE3G-pp65-mWPREプラスミド、pLVsyn-CMV-Tet3G-mWPREプラスミド、及びpLVsyn-CMV-CD1d-mWPREプラスミドを用いて、pp65遺伝子、Tet-On 3G遺伝子、及びCD1d遺伝子を搭載したレンチウイルスを作製した。得られたレンチウイルスを、それぞれ、TRE3G-pp65搭載レンチウイルス、Tet3G搭載レンチウイルス、及びCD1d搭載レンチウイルスと称する。
(1)で作製した、pLVsyn-TRE3G-pp65-mWPREプラスミド、pLVsyn-CMV-Tet3G-mWPREプラスミド、及びpLVsyn-CMV-CD1d-mWPREプラスミドを用いて、pp65遺伝子、Tet-On 3G遺伝子、及びCD1d遺伝子を搭載したレンチウイルスを作製した。得られたレンチウイルスを、それぞれ、TRE3G-pp65搭載レンチウイルス、Tet3G搭載レンチウイルス、及びCD1d搭載レンチウイルスと称する。
pLVsyn-TRE3G-pp65-mWPREプラスミド、又はpLVsyn-CMV-Tet3G-mWPREプラスミドのいずれかのプラスミドを30μgとViraPower Lentiviral Packaging Mix(Thermo Fisher Scientific社、Cat.K497500)45μLを混合し、1.5mLのOptiPRO SFM(Thermo Fisher Scientific社、Cat.12309019)を加えて混合した(A)。LV-MAX Transfection Reagent(Thermo Fischer Scientific社、Cat.A35348の構成品)540μLとOptiProSFM 4.5mLを混合して1分静置した(B)。(A)と1.5mLの(B)を混合して室温で10分静置した。125mL三角フラスコ(Thermo Fischer Scientific社、Cat.4115-0125)にてViral Production Cells(Thermo Fischer Scientific社、Cat.A35347)を培養し、培養液(1.2×108cells/mL、27mL)に(A)と(B)の混合液を全量添加して遺伝子導入を行った。前記Viral Production Cellsを、LV-MAX Production Medium(Thermo Fisher Scientific社、Cat.A3583401)にて37℃、8%CO2、120rpmの条件下で培養を行った。遺伝子導入後、前記条件にて2日間培養し、TRE3G-pp65又はTet3G遺伝子を搭載したレンチウイルスを含む培養上清を回収した。培養上清を4℃にて760×gで10分間遠心した。上清を0.45μmのフィルター(Merck社、Cat.SLHV033RS)でろ過し、PEG-it Virus Precipitaion Solution(5x)(System Biosciences社、Cat.LV810A-1)を上清液量の1/4量添加して混合し、4℃で終夜静置した。1500×g、4℃で30分間遠心し、上清を除去し、再度1500×g、4℃で5分間遠心して上清を完全に除去した。ペレットを725μLのDPBS(Thermo Fisher Scientific社、Cat.14190144)に懸濁し、TRE3G-pp65搭載レンチウイルス、及びTet3G搭載レンチウイルスを得た。
pLVsyn-CMV-CD1d-mWPREプラスミドを18μgとViraPower Lentiviral Packaging Mix(Thermo Fisher Scientific社、Cat.K497500)54μLを混合し、9mLのOptiPRO SFM(Thermo Fisher Scientific社、Cat.12309019)を加えて混合した(A)。Lipofectamine2000 CD Transfection Reagent(Thermo Fischer Scientific社、Cat.12566014)648μLとOptiProSFM 27mLを混合して5分静置した(B)。(A)と9mLの(B)を混合して室温で20分静置後、前日にFalcon(登録商標)100mm TC-treated Cell Culture Dish(Corning社、Cat.353003)に5×106cells/plateで播種したLenti-X 293T細胞(タカラバイオ社、Cat.632180)に(A)と(B)の混合液3mL/plateで添加して遺伝子導入を行った。Lenti-X 293T細胞は、10%量のウシ胎児血清(SAFC Biosciences社、Cat.12007C(γ線照射品))と0.1%量のゲンタマイシン(Thermo Fisher Scientific社、Cat.15750060)を含むDMEM培地(Thermo Fisher Scientific社、Cat.10569010)にて37℃、5%CO2条件下で培養を行った。遺伝子導入後、同条件にて2日間培養し、各遺伝子を搭載したレンチウイルスを含む培養上清を回収した。培養上清を4℃にて760×gで10分間遠心した。上清を0.45μmのフィルター(Merck社、Cat.SLHV033RS)でろ過し、PEG-it Virus Precipitaion Solution(5x)(System Biosciences社、Cat.LV810A-1)を上清液量の1/4量添加して混合し、4℃で終夜静置した。1500×g、4℃で30分間遠心し、上清を除去し、再度1500×g、4℃で5分間遠心して上清を完全に除去した。ペレットを1mLのDPBS(Thermo Fisher Scientific社、Cat.14190144)に懸濁し、CD1d搭載レンチウイルスを得た。
[実施例2-2:Lenti virus感染細胞の作製とクローニング]
FreeStyle 293-F細胞(Thermo Fisher Scientific社、Cat.510029)に実施例2-1で作製した各レンチウイルスを感染させた。TRE3G-pp65搭載レンチウイルス、CD1d搭載レンチウイルス、及びTet3G搭載レンチウイルスを感染させた細胞集団をFreeStyle 293F_Tet-on_pp65_CD1d細胞プールと称する。これらの細胞プールから細胞のクローニングを実施し、各細胞プール由来のクローンを複数取得した。
FreeStyle 293-F細胞(Thermo Fisher Scientific社、Cat.510029)に実施例2-1で作製した各レンチウイルスを感染させた。TRE3G-pp65搭載レンチウイルス、CD1d搭載レンチウイルス、及びTet3G搭載レンチウイルスを感染させた細胞集団をFreeStyle 293F_Tet-on_pp65_CD1d細胞プールと称する。これらの細胞プールから細胞のクローニングを実施し、各細胞プール由来のクローンを複数取得した。
(1)FreeStyle 293F_Tet-on_pp65_CD1d細胞プールの作製
FreeStyle 293-F細胞を2×106cells/mLの濃度に調製し、500μL/ウェルでFalcon(登録商標)セルカルチャー 12ウェル 細胞培養用マルチウェルプレート 平底 フタ付き(以下、12ウェルプレート)(Corning社、Cat.353043)に播種し、実施例2-1で得たCD1d搭載レンチウイルスを100μL添加し、さらに400μLの培地を添加した。培地は0.1%量のゲンタマイシン(Thermo Fisher Scientific社、Cat.15750-060)を含むFreeStyle 293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific社、Cat.12338018)を使用した。540×g、室温で30分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。数日培養後に12ウェルプレートからCorning(登録商標)ポリカーボネート製三角フラスコベントキャップ125mL(以下、125mL三角フラスコ)(Corning社、Cat.431143)に継代し、さらに適当な間隔で継代して細胞プールAを得た。細胞プールAを2×106cells/mLの濃度に調製し、500μL/ウェルで12ウェルプレートに播種し、実施例2-1で得たTRE3G-pp65搭載レンチウイルスとTet3G搭載レンチウイルスをそれぞれ200μL/ウェル又は25μL/ウェルずつ添加した。さらにそれぞれ100μL又は450μLの培地を添加した。培地は0.1%量のゲンタマイシンを含むFreeStyle 293 Expression Mediumを使用した。540×g、室温で30分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。数日培養後に12ウェルプレートから125mL三角フラスコに継代し、さらに適当な間隔で継代し、FreeStyle 293F_Tet-on_pp65_CD1d細胞プールを得た。
FreeStyle 293-F細胞を2×106cells/mLの濃度に調製し、500μL/ウェルでFalcon(登録商標)セルカルチャー 12ウェル 細胞培養用マルチウェルプレート 平底 フタ付き(以下、12ウェルプレート)(Corning社、Cat.353043)に播種し、実施例2-1で得たCD1d搭載レンチウイルスを100μL添加し、さらに400μLの培地を添加した。培地は0.1%量のゲンタマイシン(Thermo Fisher Scientific社、Cat.15750-060)を含むFreeStyle 293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific社、Cat.12338018)を使用した。540×g、室温で30分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。数日培養後に12ウェルプレートからCorning(登録商標)ポリカーボネート製三角フラスコベントキャップ125mL(以下、125mL三角フラスコ)(Corning社、Cat.431143)に継代し、さらに適当な間隔で継代して細胞プールAを得た。細胞プールAを2×106cells/mLの濃度に調製し、500μL/ウェルで12ウェルプレートに播種し、実施例2-1で得たTRE3G-pp65搭載レンチウイルスとTet3G搭載レンチウイルスをそれぞれ200μL/ウェル又は25μL/ウェルずつ添加した。さらにそれぞれ100μL又は450μLの培地を添加した。培地は0.1%量のゲンタマイシンを含むFreeStyle 293 Expression Mediumを使用した。540×g、室温で30分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。数日培養後に12ウェルプレートから125mL三角フラスコに継代し、さらに適当な間隔で継代し、FreeStyle 293F_Tet-on_pp65_CD1d細胞プールを得た。
(2)クローニング
(1)で作製したFreeStyle 293F_Tet-on_pp65_CD1d細胞プールからシングルセルクローニングを行い、全ての遺伝子が安定的に発現するクローンを選抜した。96ウェルプレートに1cell/ウェルとなるように細胞を播種し、細胞の増殖に合わせて継代を行い、細胞を増殖させた。増殖した細胞のpp65タンパク質及びCD1dタンパク質の発現量を、pp65タンパク質はELISA法にて、CD1dタンパク質はフローサイトメトリー法にて測定し、pp65タンパク質及びCD1dタンパク質を安定的に発現するクローンを選抜した。pp65タンパク質発現量の測定に用いた細胞は、培地に終濃度0.8~1μg/mLのドキシサイクリン(タカラバイオ社、Cat.631311)を添加し、Tet-On Systemを介してpp65タンパク質の発現を誘導した後に評価を行った。ELISA法による測定には一次抗体としてCMV pp65 (3A12)抗体(Santa Cruz Biotechnology社 Cat.sc-56973)、二次抗体としてGoat Anti-Mouse IgGFc -HRP 抗体(Jackson Immuno Research Laboratories社、Cat.115-035-071)を使用し、ELISA直接法の一般的な測定方法に準拠して測定を行った。フローサイトメトリー法による測定には、APC Mouse Anti-Human CD1d抗体(BD Biosciences社、Cat.563505)を使用し、FACSVerse(BD Biosciences社)を用いた一般的な測定方法に準拠して測定を行った。
(1)で作製したFreeStyle 293F_Tet-on_pp65_CD1d細胞プールからシングルセルクローニングを行い、全ての遺伝子が安定的に発現するクローンを選抜した。96ウェルプレートに1cell/ウェルとなるように細胞を播種し、細胞の増殖に合わせて継代を行い、細胞を増殖させた。増殖した細胞のpp65タンパク質及びCD1dタンパク質の発現量を、pp65タンパク質はELISA法にて、CD1dタンパク質はフローサイトメトリー法にて測定し、pp65タンパク質及びCD1dタンパク質を安定的に発現するクローンを選抜した。pp65タンパク質発現量の測定に用いた細胞は、培地に終濃度0.8~1μg/mLのドキシサイクリン(タカラバイオ社、Cat.631311)を添加し、Tet-On Systemを介してpp65タンパク質の発現を誘導した後に評価を行った。ELISA法による測定には一次抗体としてCMV pp65 (3A12)抗体(Santa Cruz Biotechnology社 Cat.sc-56973)、二次抗体としてGoat Anti-Mouse IgGFc -HRP 抗体(Jackson Immuno Research Laboratories社、Cat.115-035-071)を使用し、ELISA直接法の一般的な測定方法に準拠して測定を行った。フローサイトメトリー法による測定には、APC Mouse Anti-Human CD1d抗体(BD Biosciences社、Cat.563505)を使用し、FACSVerse(BD Biosciences社)を用いた一般的な測定方法に準拠して測定を行った。
本発明のaAVC-pp65細胞は、がんの処置に有用であることが期待できる。
以下の配列表の数字見出し<223>には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列表の配列番号1で示される塩基配列は、ヒトサイトメガロウイルスpp65タンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号2で示されるアミノ酸配列は、配列番号1によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号3で示される塩基配列は、ヒトCD1dタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号4で示されるアミノ酸配列は、配列番号3によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号5で示される塩基配列は、マウスCD1dタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号6で示されるアミノ酸配列は、配列番号5によりコードされるアミノ酸配列である。配列表の配列番号7及び配列番号8で示される塩基配列は、ぞれぞれ、pLVsyn-TRE3G-pp65-mWPREプラスミド及びpLVsyn-CMVプラスミドの塩基配列である。
Claims (18)
- CD1dをコードするポリヌクレオチド、及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入した、ヒト由来細胞。
- CD1dがヒトCD1dである、請求項1に記載の細胞。
- ヒト由来細胞が正常細胞である、請求項1又は2に記載の細胞。
- 正常細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)細胞に由来する細胞である、請求項3に記載の細胞。
- CD1d及びpp65又はその断片を発現している、請求項1~4のいずれかに記載の細胞。
- 細胞の表面にCD1dリガンドを積載している、請求項5に記載の細胞。
- CD1dリガンドがα-GalCerである、請求項6に記載の細胞。
- 請求項6又は7に記載の細胞を含む医薬組成物。
- がんの処置に用いるための、請求項8に記載の医薬組成物。
- がんを処置する方法であって、請求項6又は7に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、方法。
- がんを処置するための、請求項6又は7に記載の細胞。
- がんの処置に用いる医薬組成物を製造するための、請求項6又は7に記載の細胞の使用。
- がんの処置に用いる細胞を製造する方法であって、
ヒト由来細胞にCD1dをコードするポリヌクレオチド及びpp65又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程と、
該細胞を培養する工程を含む、方法。 - CD1dがヒトCD1dである、請求項13に記載の方法。
- ヒト由来細胞が正常細胞である、請求項13又は14に記載の方法。
- 正常細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)細胞に由来する細胞である、請求項15に記載の方法。
- 細胞の表面にCD1dリガンドを積載する工程をさらに含む、請求項13~16のいずれかに記載の方法。
- CD1dリガンドがα-GalCerである、請求項17に記載の方法。
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