JP2023078487A

JP2023078487A - がんの処置に用いるｐｐ６５含有人工アジュバントベクター細胞

Info

Publication number: JP2023078487A
Application number: JP2020069501A
Authority: JP
Inventors: 恵介大隅; keisuke Osumi; 仁中村; Hitoshi Nakamura
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2023-06-07
Also published as: WO2021206104A1

Abstract

【課題】ｐｐ６５発現がんを有する患者の処置に用いるための、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を提供する。【解決手段】ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド、及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入したヒト由来細胞、並びに、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程と、ポリヌクレオチドが導入された細胞を培養する工程を含む、がんの処置に用いる細胞を製造する方法。【選択図】なし

Description

本発明は、がんの治療又は予防に用いる、ｐｐ６５含有人工アジュバントベクター細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌａｄｊｕｖａｎｔｖｅｃｔｏｒｃｅｌｌ：ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞）に関する。

脳神経細胞（ニューロン）を支持する神経膠細胞（グリア）から発生する腫瘍を神経膠腫（グリオーマ）という。神経膠腫には星細胞腫、乏突起神経膠腫などの種類があり、脳から発生する腫瘍のおよそ２５％を占めている。悪性度に応じてグレードが４つに分かれており、最も悪性度が高いグレード４を膠芽腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ：ＧＢＭ）と称する。

ＧＢＭの初発時に行う標準治療は確立されている。手術により腫瘍を摘出した後に、摘出した周囲に残っている腫瘍に対して局所に放射線照射を行い、加えてテモゾロミドの内服による化学療法を行う。その後、維持療法としてテモゾロミドの内服を継続する。しかしながら、腫瘍を完全に摘出することは難しく、ほとんどの患者において放射線治療後１年以内に再発が見られる。再発後はいくつかの治療法が提案されているが、標準化された方法はなく、再発後の平均的な生存期間は１年以内と非常に短い。このような背景から、ＧＢＭに有効な新規薬剤や新規治療法の開発が強く望まれており、新たな治療方法の提供を目的として、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｖａｒｉａｎｔＩＩＩ）、ＩＬ－１３Ｒα２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３ｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａｃｈａｉｎｖａｒｉａｎｔ２）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＭＡＧＥＡ１、ＥｐｈｒｉｎＡ２、ＨＥＲ２、ＡＩＭ２、ＴＲＰ－２、ｇｐ１００等の抗原を標的としたワクチンやＴ細胞療法の開発が進められている（非特許文献１及び２）。

ヒトサイトメガロウイルス（ｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＨＣＭＶ）は、サイトメガロウイルス属に属する２本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＣＭＶは通常、幼小児期に唾液・尿などの分泌液を介して人体に感染し、その後、潜伏・持続感染によって人体に終生寄生する。多くの健常人がＨＣＭＶの既感染者であり、そのほとんどが不顕性感染であることが知られている。しかし、免疫機能の低下によりＨＣＭＶが再活性化して増殖し、腎移植、骨髄移植などの臓器移植患者や後天性免疫不全症候群（ＡｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤＳ）、悪性腫瘍、免疫抑制療法等の免疫不全状態にある患者にしばしば重篤な感染症をもたらす。

近年、ヒトサイトメガロウイルスが腫瘍細胞にも感染し、腫瘍細胞に腫瘍免疫や抗がん剤に対する抵抗性を獲得させ悪性度を高める可能性があることが報告された（非特許文献３）。ＧＢＭでは患者の９０％以上にてＨＣＭＶ由来抗原の発現が検出されている（非特許文献４～６）。また、大腸がんではＨＣＭＶのＤＮＡが検出され（非特許文献７）、前立腺がん（非特許文献８）や乳がん（非特許文献９）からもＨＣＭＶ由来のＤＮＡやタンパクが検出されており、種々のがんとの関係が示唆されている。

ｐｐ６５（６５ＫＤａｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ、遺伝子名ＵＬ８３）は、ＨＣＭＶウイルス粒子のエンベロープとヌクレオカプシドの間のテグメントを構成するタンパク質であり、ＨＣＭＶウイルス粒子を形成する約７０種類のタンパク質の中で最も多く含まれるタンパク質である。このｐｐ６５タンパク質は、ウイルス抗原血症の診断用の抗原として有用であるのみならず、ＨＣＭＶウイルス感染症及びＧＢＭに対する治療又は予防用のワクチンの標的抗原としても研究が行われている（非特許文献１０及び１１）。しかしながら、未だにＨＣＭＶウイルスに対するワクチンとして上市された薬剤はない。

藤井らは、ヒト由来細胞に外来的にＣＤ１ｄ及びがん抗原を発現させ、さらに当該細胞にα－ガラクトシルセラミド（α－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ、α－ＧａｌＣｅｒ）をパルスした人工アジュバントベクター細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌａｄｊｕｖａｎｔｖｅｃｔｏｒｃｅｌｌ：ａＡＶＣ）を作製した（特許文献１～３）。当該ａＡＶＣは、ＣＤ１ｄ／α－ＧａｌＣｅｒ複合体を介してナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を活性化し、活性化されたＮＫＴ細胞はインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）等のサイトカインを産生してナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等を活性化する。マウスモデルにおいて、ａＡＶＣ投与によるＮＫ細胞依存的な抗腫瘍効果が示されている（特許文献１～３）。また、マウスに投与されたａＡＶＣは生体内において活性化されたＮＫＴ細胞により速やかに殺傷され、当該ａＡＶＣの断片は樹状細胞に取り込まれる。当該ａＡＶＣ断片を取り込んだ樹状細胞は、当該細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）に取り込んだがん抗原の断片を抗原提示し、がん抗原特異的なＴ細胞を誘導する。マウスモデルにおいて、ａＡＶＣ投与によるがん抗原特異的Ｔ細胞の誘導を介した抗腫瘍効果が示されている（特許文献１～３、非特許文献１２及び１３）。このように、ａＡＶＣはＮＫＴ細胞活性化を介したＮＫ細胞活性化による自然免疫活性化及び抗原特異的Ｔ細胞誘導による獲得免疫誘導の二つの免疫機構を強力に誘導し得ることが示されている。しかしながら、現在までに、ａＡＶＣ細胞にｐｐ６５等のＨＣＭＶ抗原を発現させた細胞及び当該細胞を用いたＮＫ／ＮＫＴ細胞の活性化及びＧＢＭ抗原特異的免疫誘導作用については、未だ報告がなされていない。

国際公開番号２００７／０９７３７０国際公開番号２０１０／０６１９３０国際公開番号２０１３／０１８７７８

ＬｉｍＭｅｔａｌ．，「ネイチャーレビューズ．クリニカルオンコロジー（Ｎａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、（イングランド）、２０１８；１５（７）：４２２－４４２ＭｃＧｒａｎａｈａｎＴｅｔａｌ．，「カレントトリートメントオプションズインオンコロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｐｔｉｏｎｓｉｎｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２０１９；２０（３）：２４ＭｉｃｈａｅｌｉｓＭ．ｅｔａｌ．，「ネオプラシア（Ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」、（米国）、２００９；１１（１）：１－９ＣｏｂｂｓＣ．Ｓ．ｅｔａｌ．，「キャンサーリサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２００２；６２（１２）：３３４７－３３５０ＭｉｔｃｈｅｌｌＤ．Ａ．ｅｔａｌ．，「ニューロ－オンコロジー（Ｎｅｕｒｏ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、（イングランド）、２００８；１０（１）：１０－１８ＳｃｈｅｕｒｅｒＭ．Ｅ．ｅｔａｌ．，「アクタニューロパソロジカ（ＡｃｔａＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ）」、（ドイツ）、２００８；１１６（１）：７９－８６ＣｈｅｎＨ．Ｐ．ｅｔａｌ．，「ジャーナルオブクリニカルビロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、（オランダ）、２０１２；５４（３）：２４０－２４４ＳａｍａｎｔａＭ．ｅｔａｌ．，「ザジャーナルオブウロロジー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｕｒｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００３；１７０（３）：９９８－１００２ＨａｒｋｉｎｓＬ．Ｅ．ｅｔａｌ．，「ヘルペスビリダエ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）」、（イングランド）、２０１０；１（１）：８ＢａｔｉｃｈＫＡｅｔａｌ．，「クリニカルキャンサーリサーチ（ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１７；２３（８）：１８９８－１９０９ＳｃｈｕｅｓｓｌｅｒＡｅｔａｌ．，「キャンサーリサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１４；７４（１３）：３４６６－３４７６ＳｈｉｍｉｚｕＫ．ｅｔａｌ．，「キャンサーリサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１３；７３（１）：６２－７３ＳｈｉｍｉｚｕＫ．ｅｔａｌ．，「キャンサーリサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１６；７６（１３）：３７５６－３７６６

本発明の課題は、ｐｐ６５発現がんの治療又は予防に有効なａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を提供することにある。

本発明者らは、マウスの細胞にｐｐ６５を発現させたａＡＶＣ（ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞ともいう）を作製し（実施例１－１）、当該ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞が、マウスにおいてｐｐ６５特異的Ｔ細胞を誘導し（実施例１－２）、ｐｐ６５発現Ｂ１６メラノーマ細胞担癌マウス及びｐｐ６５発現ＧＬ－２６１グリオーマ細胞担癌マウスにおいて、ｐｐ６５タンパク質特異的な抗腫瘍効果（実施例１－３及び１－４）を示すことを見出した。さらにこれらの知見に基づいて、本発明者らは、ヒトの細胞にｐｐ６５を発現させたａＡＶＣ（ａＡＶＣ－ｐｐ６５ともいう）を作製した（実施例２）。即ち、本発明は、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞、当該細胞を含む医薬組成物、当該細胞の作製方法、細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している当該細胞によるｐｐ６５発現がんの治療又は予防方法を提供する。

すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含んでもよい。

［１］ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド、及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入した、ヒト由来細胞。
［２］ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、［１］に記載の細胞。
［３］ヒト由来細胞が正常細胞である、［１］又は［２］に記載の細胞。
［４］正常細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞に由来する細胞である、［３］に記載の細胞。
［５］ＣＤ１ｄ、及びｐｐ６５又はその断片を発現している、［１］～［４］のいずれかに記載の細胞。
［６］細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している、［５］に記載の細胞。
［７］ＣＤ１ｄリガンドがα－ＧａｌＣｅｒである、［６］に記載の細胞。
［８］［６］又は［７］に記載の細胞を含む医薬組成物。
［９］がんの処置に用いるための、［８］に記載の医薬組成物。
［１０］がんを処置する方法であって、［６］又は［７］に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、方法。
［１１］がんを処置するための、［６］又は［７］に記載の細胞。
［１２］がんの処置に用いる医薬組成物を製造するための、［６］又は［７］に記載の細胞の使用。
［１３］がんの処置に用いる細胞を製造する方法であって、
ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程と、
該細胞を培養する工程を含む、方法。
［１４］ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、［１３］に記載の方法。
［１５］ヒト由来細胞が正常細胞である、［１３］又は［１４］に記載の方法。
［１６］正常細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞に由来する細胞である、［１５］に記載の方法。
［１７］細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載する工程をさらに含む、［１３］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］ＣＤ１ｄリガンドがα－ＧａｌＣｅｒである、［１７］に記載の方法。

本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞及び本発明の医薬組成物は、がんの処置に有用である。

図１－１はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞投与マウスの脾臓細胞中のＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞数を示す。横軸のＢＩＣＡＮＡＴＥはコントロール群を示す。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞投与群における－（マイナス）は脾臓細胞中に含まれるＴ細胞を刺激するためのペプチドを添加していないことを示し、ＷＴ１及びｐｐ６５はそれぞれ、Ｔ細胞の刺激剤としてＷＴ１ペプチド及びｐｐ６５ペプチドを用いたことを示す。縦軸はＥＬＩＳＰＯＴリーダーにてカウントした際の３×１０^５脾臓細胞あたりのスポット数を示し、水平線は個体ごとのスポット数の平均値を、エラーバーは±平均の標準誤差を示す。図１－２はｐｐ６５発現Ｂ１６担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の抗腫瘍効果を示す。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞はｐｐ６５非発現の対照被験ａＡＶＣとして用いた。縦軸は腫瘍体積を、横軸はがん細胞投与後日数を示す。実線は各群の腫瘍体積の平均値の推移を、エラーバーは平均値の標準誤差を示す。有意確率Ｐ値（＊＊：Ｐ＜０．０１）は、ダネットの多重比較検定によりＢＩＣＡＮＡＴＥ投与群とａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞及びａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞投与群の１２日目の腫瘍体積を比較することにより算出した。図１－３はｐｐ６５発現ＧＬ－２６１担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の抗腫瘍効果を示す。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞はｐｐ６５非発現の対照被験ａＡＶＣとして用いた。縦軸は生存率を、横軸はがん細胞投与後日数を示す。有意確率Ｐ値は、ログランク検定を用いて、ＢＩＣＡＮＡＴＥ投与群の生存期間とａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞及びａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞投与群の生存期間を比較することにより求めた。図中の＊＊は、Ｐ値が０．０１／６（ボンフェローニの方法にて補正した有意水準）より小さい群を示す。

以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。

＜人工アジュバントベクター細胞＞
本明細書において、「人工アジュバントベクター細胞」と「ａＡＶＣ」は、同義であり、相互互換的に用いられ、ＣＤ１ｄポリペプチド（以下、「ＣＤ１ｄ」とも称する）及び１又は２以上の任意のがん抗原又はその断片を発現する細胞を意味する。
本明細書において、「外来性」又は「外来的」は、人工的に作製された遺伝子又はポリヌクレオチドを遺伝子操作又は遺伝子導入等の操作により目的の細胞内に導入すること、及び目的の細胞内に人為的に導入された遺伝子又はポリヌクレオチドによりそれらがコードするタンパク質を人為的に発現させることを指す用語として相互互換的に使用される。

＜本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞＞
本発明は、
ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド、及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入した、ヒト由来細胞（本明細書において、「ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞」とも称する）を提供する。
さらに、本発明は、
ＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片を発現し、細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を提供する。

１．ヒト由来細胞
本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞又はがん組織由来の細胞である。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞である。
正常細胞は、増殖能を有する限り、例えば、任意のヒト組織より単離及び／又は精製された細胞、特定の細胞種由来の細胞、ヒト組織由来の株化細胞、幹細胞より分化させた細胞等のヒト由来の細胞であってよい。また、がん組織由来の細胞としては、患者のがん組織より単離及び／又は精製された細胞、又はヒトがん組織由来の株化細胞を用いることができる。ここで、「単離」とは、生体組織からの分離を意味する。また、「精製」とは、ヒト由来の細胞を、細胞が由来する組織に含まれるその他の成分の１以上からの分離を意味する。細胞の単離及び精製は、公知の方法により行うことができる。

任意のヒト組織より単離及び／又は精製された細胞は、当該細胞が増殖能を有する限りにおいて、例えば、胃、小腸、大腸、肺、膵臓、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、前立腺、卵巣、子宮、骨髄、皮膚、筋肉、末梢血等の任意のヒト組織由来の細胞であってよい。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、非血球細胞である。1つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、腎臓由来の細胞である。

特定の細胞種由来の細胞は、ヒト組織における特定の細胞種（例えば、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、間質細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、ヒト胚性腎細胞、角化細胞、間葉細胞、筋芽細胞、神経細胞、グリア細胞、扁平細胞、幹細胞、乳腺細胞、メサンギウム細胞、膵β細胞、外分泌上皮細胞、内分泌細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、骨芽細胞、胚細胞、免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、リンパ球、Ｂ細胞等）等）由来の細胞である。1つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ヒト胚性腎細胞である。

ヒト組織由来の株化細胞は、当業者により公知の方法を用いて作製することができ、又は商業的に入手することができる。当該株化細胞としては、例えば、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．；１９７７；３６：５９－７４）、ＷＩ－３８細胞、ＳＣ－０１ＭＦＰ細胞、若しくはＭＲＣ－５細胞、又はそれら細胞に由来する細胞が挙げられる。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞である。１つの実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞である。

幹細胞より分化させた細胞は、ヒト由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から分化させた細胞である。ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞の作製及び当該細胞から分化させた細胞は、当業者により公知の方法を用いて作製することができる。

がん組織由来の細胞は、当業者に公知の方法により、患者のがん組織より単離及び／又は精製により取得することができる。また、当業者がＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））等の機関より一般的に入手可能なヒトがん組織由来の株化細胞を用いることもできる。

２．ｐｐ６５
ｐｐ６５はＨＣＭＶウイルス粒子の構成タンパク質の一つであり、ＵＬ８３遺伝子によりコードされている。ＵＬ８３遺伝子は、ＨＣＭＶ以外にも、Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ等のサイトメガロウイルス属のウイルスに発現が認められる。

本発明で使用されるｐｐ６５は、天然に存在するｐｐ６５であってもよく、又は、ａＡＶＣとして投与した場合にｐｐ６５特異的Ｔ細胞を誘導する限り、その改変体であってもよい。１つの実施形態において、本発明で使用されるｐｐ６５は、サイトメガロウイルス属に属するウイルス由来のｐｐ６５である。１つの実施形態において、本発明で使用されるｐｐ６５は、ＨＣＭＶ由来のｐｐ６５（以下、「ヒトｐｐ６５」という）である。１つの実施形態において、ヒトｐｐ６５は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。１つの実施形態において、ヒトｐｐ６５は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。１つの実施形態において、ヒトｐｐ６５は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～７個、さらにより好ましくは１～５個、１～３個、又は１～２個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、本発明で使用されるｐｐ６５は、ａＡＶＣとして投与した場合にｐｐ６５特異的Ｔ細胞を誘導する限り、ｐｐ６５の断片であってよい。１つの実施形態において、ｐｐ６５の断片は、ヒトｐｐ６５の断片である。１つの実施形態において、ヒトｐｐ６５の断片は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の長さを有するポリペプチドである。ａＡＶＣとして投与することによるｐｐ６５特異的Ｔ細胞の誘導は、例えば、後記実施例１－２に記載の方法により評価できる。本発明で使用されるｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を用いて、使用されるｐｐ６５又はその断片のアミノ酸配列から塩基配列を設計し、作製することができる。１つの実施形態において、ｐｐ６５をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。

本明細書における「同一性」とは、ＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．；２０１５；４３：Ｗ５８０－Ｗ５８４）を用いて、デフォルトで用意されているパラメータによって得られたＩｄｅｎｔｉｔｙの値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
ＧａｐＯｐｅｎＰｅｎａｌｔｙ＝１０
ＧａｐＥｘｔｅｎｄＰｅｎａｌｔｙ＝０．５
Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２
ＥｎｄＧａｐＰｅｎａｌｔｙ＝ｆａｌｓｅ

３．ＣＤ１ｄ
本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドを外来的に導入している。ＣＤ１ｄは、細胞表面に発現するＭＨＣクラスＩ様糖タンパク質であり、糖脂質抗原であるＣＤ１ｄリガンドをＣＤ１ｄ上に提示することによりＣＤ１ｄ拘束性のＮＫＴ細胞を活性化することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９９７；２７８；５３４３：１６２６－１６２９）。本発明で使用されるＣＤ１ｄは、ヒト由来細胞に発現させた場合にＣＤ１ｄの機能を有する限りにおいて、天然に存在するＣＤ１ｄ又はその改変体であってよい。ＣＤ１ｄの機能は、ＣＤ１ｄとＣＤ１ｄリガンド（例えば、α－ＧａｌＣｅｒ）の結合を測定することにより評価することができる。当該評価は公知の方法を用いて当業者に容易に評価され得る。また、ＣＤ１ｄの機能は、ａＡＶＣによるヒトＮＫＴ細胞を活性化する能力を指標に評価することもできる。このヒトＮＫＴ細胞の活性化能は、例えば、非特許文献１２のＦｉｇ．１に記載のｉｎｖｉｔｒｏの評価系において評価することができる。簡単には、α－ＧａｌＣｅｒ存在下で培養したＣＤ１ｄ発現細胞をＮＫＴ細胞と共培養し、培養液中のＩＦＮ－γの量を測定することにより、ＮＫＴ細胞の活性化を評価することができる。

１つの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ１ｄは哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等）由来のＣＤ１ｄである。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄはヒトＣＤ１ｄである。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、又は１～２個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＣＤ１ｄの機能を有するポリペプチドである。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号４に示されるポリペプチドと少なくとも９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、ＣＤ１ｄの機能を有するポリペプチドである。

本発明で使用されるＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドは外来的に導入されたポリヌクレオチドであり、当該ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を用いて、使用されるＣＤ１ｄのアミノ酸配列から塩基配列を設計し、作製することができる。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。

４．プロモーター
１つの実施形態では、本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞において、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び／又はｐｐ６５若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドにプロモーターが作動可能に連結されている。プロモーターとしては、恒常的に発現を促進するプロモーター又は誘導型プロモーターのいずれも用いることができる。本明細書において、「作動可能に連結された」とは、宿主細胞におけるポリペプチドの発現をプロモーターによって制御するために当該プロモーターがポリヌクレオチドに連結されている状態を意味する。

「恒常的に発現を促進するプロモーター」としては、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎｖｉｒｕｓ４０）等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。

「誘導型プロモーター」とは、誘導的に発現を促進するプロモーターであり、当該プロモーターを駆動する誘導因子（本明細書において、「誘導型プロモーターの誘導因子」又は単に「誘導因子」とも称する）の存在下において、当該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導することができるプロモーターをいう。誘導型プロモーターとしては、例えば、温熱誘導型プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、薬剤誘導型プロモーターが挙げられる。１つの実施形態において、誘導型プロモーターは、薬剤誘導型プロモーターである。本明細書において、「薬剤誘導型プロモーター」とは、誘導因子である薬剤により当該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現が調節されるプロモーターを意味する。薬剤誘導型プロモーターとしては、例えば、Ｃｕｍａｔｅオペレーター、λオペレーター（例えば、１２×λＯｐ）、テトラサイクリン遺伝子発現誘導系の誘導型プロモーター（以下、「テトラサイクリン系誘導型プロモーター」という）等が挙げられる。Ｃｕｍａｔｅオペレーターは、ＣｙｍＲリプレッサー存在下において不活性であるが、誘導因子であるＣｕｍａｔｅの存在下において、ＣｙｍＲリプレッサーと解離して、当該オペレーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。λオペレーターは、二量体化により転写活性化能を有するアクチベーター（λＲｅｐ－ＧｙｒＢ－ＡＤ）を二量体化する誘導因子（例えば、クメルマイシン）の存在下において、当該オペレーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。テトラサイクリン系誘導型プロモーターは、誘導因子であるテトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン等）及びリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）（例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇタンパク質）の存在下において、当該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。テトラサイクリン系誘導型プロモーターとしては、例えば、ＴＲＥ３Ｇプロモーターが挙げられる。１つの実施形態において、薬剤誘導型プロモーターは、テトラサイクリン系誘導型プロモーターであり、１つの実施形態において、テトラサイクリン系誘導型プロモーターは、ＴＲＥ３Ｇプロモーターである。

５．ＣＤ１ｄリガンド
１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載していてもよい。細胞表面へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、＜本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の作製方法＞の項に記載のように、ＣＤ１ｄを発現する細胞にＣＤ１ｄリガンド（例えば、α－ＧａｌＣｅｒ）をパルスすることによって行い得る。本明細書において、「ＣＤ１ｄリガンドをパルスする」とは、培養培地中にて細胞をＣＤ１ｄリガンドと接触させることを指す。ＣＤ１ｄリガンドをパルスされたａＡＶＣにおいては、すべての、又は少なくとも一部のＣＤ１ｄにＣＤ１ｄリガンドが積載されている。

本発明で使用されるＣＤ１ｄリガンドとしては、例えば、α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）、α－Ｃ－ガラクトシルセラミド（α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ）、７ＤＷ８－５、イソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉＧｂ３）が挙げられる。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。α－ＧａｌＣｅｒは、化学名は（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－１－Ｏ－（α－Ｄ－ガラクトシル）－Ｎ－ヘキサコサノイル－２－アミノ－１，３，４－オクタデカントリオールであり、ＣＡＳＲＮ：１５８０２１－４７－７で登録され、分子式：Ｃ_５０Ｈ_９９ＮＯ_９で表される物質（分子量：８５８．３４）である。α－ＧａｌＣｅｒは、当該分野で公知の技術に従って合成してもよく、商業的に入手可能なもの（例えば、α－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（フナコシ、Ｃａｔ．ＫＲＮ７０００））を使用してもよい。

＜本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の作製方法＞
本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、ヒト由来細胞に、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる。本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の作製方法は、さらに、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を培養する工程、細胞をクローニングする工程、及び細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載させる工程を含んでいてもよい。

１．ヒト由来細胞へのポリヌクレオチドの導入
本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる（以下、導入されるポリヌクレオチドを「目的ポリヌクレオチド」とも称する）。

ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑＩＤやＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号からＣＤ１ｄ及びｐｐ６５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、標準的な分子生物学及び／又は化学的手法を用いて設計及び作製することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づいてホスホロアミダイト法等を用いて合成することができ、又ｃＤＮＡライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得られるＤＮＡ断片を組み合わせて作製することができる。

ヒト由来細胞への目的ポリヌクレオチドの導入は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション等の非ウイルスベクター系の方法又はウイルスベクター系のいずれかの方法を用いて行うことができる。非ウイルスベクター系の方法を用いる場合は、目的ポリヌクレオチドは、プラスミドベクター、ｃＤＮＡ等の形態又はｍＲＮＡの形態であってよい。

プラスミドベクター又はウイルスベクターは、ヒト由来細胞中でＣＤ１ｄ又はｐｐ６５若しくはその断片を外来的に発現させるための発現ベクターとして使用しうる。発現ベクターは、目的とするポリペプチドを発現できるものであれば特に制限されず、当業者により公知の方法を用いて作製することができる。発現ベクターは、プラスミドベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）－ＭＡＸ（プロメガ）、ｐＨＥＫ２９３ＵｌｔｒａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）等を使用することができる。ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスを使用することができる。例えば、ヒト由来細胞への目的ポリヌクレオチドの導入にレンチウイルスを使用する場合、当該レンチウイルスは、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ／ＥＦ１αベクター（タカラバイオ社）、ｐＬｅｎｔｉベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて作製できる。ヒト由来細胞においてＣＤ１ｄとｐｐ６５又はその断片を外来的に発現させる場合、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドとｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを、１つの発現ベクターを用いてヒト由来細胞に導入してもよく、別々の発現ベクターを用いて導入してもよい。また、発現ベクターは、目的とする遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を確認するためのマーカーとなり得る遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を含んでいてもよい。発現ベクターは、さらに、開始コドン及び終止コドン、エンハンサー配列、非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位等を含んでいてもよい。

１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の作製方法は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する工程を含む。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の作製方法は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する工程を含む。これらの方法について、１つの実施形態において、発現ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり、１つの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターであり、１つの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより作製された細胞である。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより作製された細胞である。これらの細胞について、１つの実施形態において、発現ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり、１つの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターであり、１つの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。１つの実施形態において、作製されたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、染色体外又は細胞核のゲノムＤＮＡ上に、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドとｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを有する。１つの実施形態において、作製されたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、その細胞核のゲノムＤＮＡ上にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを有する。

２．ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の培養
前記の方法にて作製されたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、さらに培養により増殖させることができる。ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を維持するため、又は増殖させるための細胞の培養は、公知の方法により行われる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９５２；１２２：５０１）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１９５９；８：３９６－３９７）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．；１９６７；１９９：５１９－５２４）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．；１９５０；７３：１－８）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３３８０２２）、ＣＤ２９３Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１１９１３０１９）、Ｅｘｐｉ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ａ１４３５１０１）を使用することができる。培養培地は、基礎培地に、例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清）、血清代替物（例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＫＳＲ）、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質等をさらに含むことができる。１つの実施形態において、培養培地は、無血清培地又は化学的に定義された培地である。

培養条件（例えば、培養時間、温度、培地のｐＨ、ＣＯ_２濃度等の培養条件）は当業者により適宜選択され得る。培地のｐＨは約６～８であるのが好ましく、培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ_２濃度は約１～１０％、好ましくは約５％である。培養時間は、特に限定されるものではないが、約１５～３３６時間行なわれる。必要により通気や撹拌を行うこともできる。

ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞において、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び／又はｐｐ６５若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドに誘導型プロモーターが作動可能に連結されている場合、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の培養時にａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を当該誘導型プロモーター用の誘導因子に接触させて、ＣＤ１ｄ及び／又はｐｐ６５又はその断片の発現を誘導させてもよい。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の作製方法は、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＣＤ１ｄ及び／又はｐｐ６５又はその断片の発現を誘導させる工程を含む。１つの実施形態において、当該誘導型プロモーターは薬剤誘導型プロモーターであり、当該作製方法は、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を薬剤誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養する工程を含む。薬剤誘導型プロモーターを使用する場合、誘導因子であるテトラサイクリン、ドキシサイクリン、Ｃｕｍａｔｅ、クメルマイシン等の薬剤を加えた培養培地にて細胞を培養し、薬剤誘導型プロモーターに作動可能に連結された遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を誘導させてもよい。当該工程は、一般的な遺伝子誘導システムを用いた遺伝子誘導方法に準拠して行うことができる。１つの実施形態において、当該薬剤誘導型プロモーターはテトラサイクリン系誘導型プロモーターであり、当該作製方法は、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞をテトラサイクリン又はその誘導体及びｒｔＴＡの存在下で培養する工程を含む。１つの実施形態において、テトラサイクリン系誘導型プロモーターはＴＲＥ３Ｇプロモーターであり、当該作製方法は、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞をテトラサイクリン又はその誘導体及びＴｅｔ－Ｏｎ３Ｇタンパク質の存在下で培養する工程を含む。得られたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞におけるＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片の発現量は、抗ＣＤ１ｄ抗体又は抗ｐｐ６５抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法等の当業者によって公知の方法にて測定することができる。

３．ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞のクローニング
細胞にポリヌクレオチドを導入する場合、目的ポリヌクレオチドが導入された細胞及び導入されていない細胞が混在しているため、さらに、目的ポリヌクレオチドを細胞核のゲノムＤＮＡ上に組み込む場合には、その組み込まれている場所も細胞により異なるため、不均質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）な細胞の集団となっている場合がある。本明細書において、前記の不均質な細胞の集団を「細胞プール」と称す。当該細胞プールから単一の遺伝子型を有する細胞を取得する方法（本明細書にて、「クローニング」という）により、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドが導入された１細胞（以下、「クローン化された細胞」という。）を取得し増殖させることにより、単一の遺伝子型を有する細胞集団（以下、「クローン化された細胞の集団」という。）を取得することができる。ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞のクローニングは、当業者によく知られている方法を用いて実施することができ、例えば、限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法を用いることができる。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞のクローニング方法は限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法の１又は２以上の方法を組み合わせて用いることもできる。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞のクローニング方法は限外希釈法である。

前記方法にて取得された各クローン化されたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞についてＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片の発現量を測定することによって、ＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片について目的の発現量を示す、クローン化されたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の集団を選択することができる。ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び／又はｐｐ６５若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドに誘導型プロモーターが作動可能に連結されている場合、各クローン化されたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞について、その一部を当該誘導型プロモーター用の誘導因子に接触させ、得られた細胞のＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片の発現量を測定することによって、誘導因子の存在下においてＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片について目的の発現量を示す、クローン化されたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の集団を選択してもよい。選択したクローン化された細胞の集団を凍結状態で保存したものを、リサーチセルバンク（ＲＣＢ）として使用しうる。ＲＣＢの細胞を培養して増殖させ、凍結させたものをマスターセルバンク（ＭＣＢ）として使用しうる。ＭＣＢの細胞を培養して増殖させ、凍結させたものをワーキングセルバンク（ＷＣＢ）として使用しうる。ＷＣＢの細胞を培養したものを医薬品の原料として使用しうる。各セルバンクは、凍結保護剤を含んでもよい。各セルバンクは、複数の容器（例えば、２～１００００の容器、例えば、１０～１０００の容器、例えば、１００～５００の容器）に分注され、凍結状態で保管してもよい。クローン化されたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の解凍、培養、及び誘導因子との接触、並びにＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片の発現量の測定はそれぞれ、当業者に公知の方法で行うことができ、培養、誘導因子との接触、及び発現量の測定は、例えば、「２．ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の培養」に記載の方法等を使用して行うことができる。１つの実施形態において、クローン化されたａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の培養、及び誘導因子との接触、並びにＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片の発現量の測定は、ＲＣＢ及びＷＣＢの解凍後に行うことができる。

４．ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞へのＣＤ１ｄリガンドの積載
ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞にＣＤ１ｄリガンドをパルスすることによって、ＣＤ１ｄリガンドを積載したａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を作製することができる。ＣＤ１ｄリガンドをパルスする条件（例えば、細胞の培養培地にＣＤ１ｄリガンドを添加するタイミング、培養培地中のＣＤ１ｄリガンドの濃度及び培養時間等）は、使用する細胞及び培養時の諸条件を考慮して当業者にて適宜調整され得る。ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の培養培地に添加するＣＤ１ｄリガンドの濃度は、特に限定されないが、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１００００ｎｇ／ｍＬの範囲で適宜選択され得る。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び／又はｐｐ６５若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドに誘導型プロモーターが作動可能に連結されているａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の場合、１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、当該細胞と誘導因子との接触の前に行われ得る。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、当該細胞と誘導因子との接触の後に行われ得る。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、当該細胞と誘導因子との接触と同時に行われ得る。これらの実施形態において、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、好ましくは、クローン化されている。

上記で作製したＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片を発現し、当該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載しているａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞において、当該細胞の増殖を人為的な方法を用いて停止させてもよい。当該細胞の増殖を停止させる方法は、特に限定されないが、例えば、放射線（例えば、Ｘ線）照射にて細胞増殖を停止させる方法、マイトマイシンＣ等の薬剤を添加する方法等を使用し得る。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、細胞増殖が停止している細胞である。１つの実施形態において、細胞増殖を停止させる方法は放射線照射である。

＜本発明の医薬組成物等＞
本発明はまた、ＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片を発現し、当該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載したａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞（以下、「ＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞」という）を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。１つの実施形態において、当該医薬組成物は、がんの処置に用いるための医薬組成物である。当該医薬組成物は、当該分野において通常用いられる賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。医薬組成物の製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の凍結物を含み得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の凍結物及び凍結保護剤を含み得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の懸濁液を含み得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の懸濁液及び凍結保護剤を含み得る。

本発明はまた、がんを処置するためのＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。本発明はまた、がんの処置に用いる医薬組成物を製造するための本発明のＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の使用を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。

本発明はまた、本発明のＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を対象に投与する工程を含む、がんを処置する方法を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。本明細書において、「対象」とは、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等）であり、１つの実施形態において、対象はヒトである。本明細書において、「処置」とは、治療的処置及び予防的処置を含む意味で用いられる。ＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を対象へ投与する場合、当該細胞及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の形態で対象に投与することができる。対象へのＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の投与量及び投与回数は、がんの種類、位置、重症度、処置を受ける対象の年齢、体重及び状態などに応じて適宜調節できる。ＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の投与量は、例えば、対象への一回の投与において１×１０³ｃｅｌｌｓ／ｋｇ～１×１０⁹ｃｅｌｌｓ／ｋｇを用いることができる。対象へのＣＤ１ｄリガンド積載ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の投与方法としては、例えば、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内等への注射又は点滴により投与することができる。本発明の処置方法は、他のがん治療方法と併用して用いることができる。他のがん治療方法としては、手術、放射線治療、造血幹細胞移植、又は、他の抗がん剤による治療が挙げられる。

本発明の処置の対象となるがんとしては、特に限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、ノンホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫等の血液がん、骨髄異形成症候群、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、胆のうがん、胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、精巣がん、卵巣がん、脳腫瘍等の固形がん、及び骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんの他、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、膠芽腫、多形性膠芽腫、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫等が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の処置の対象となるがんは、ｐｐ６５陽性のがんである。１つの実施形態において、本発明の処置の対象となるがんは、膠芽腫又は多形性膠芽腫である。

＜がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法＞
本発明はまた、以下の工程を含む、がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法を提供する：
ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、及び
該細胞を培養する工程。

１つの実施形態において、本発明のがんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法において使用するＣＤ１ｄはヒトＣＤ１ｄである。

１つの実施形態において、本発明のがんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法において使用するヒト由来細胞は正常細胞である。１つの実施形態において、がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法において使用するヒト由来細胞はＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞である。

１つの実施形態において、本発明のがんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法は、細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載する工程をさらに含む。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。

１つの実施形態において、本発明のがんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法は、誘導型プロモーターが作動可能に連結されたＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び／又はｐｐ６５若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドをヒト由来細胞に導入する工程を含む。１つの実施形態において、当該製造方法は、前記工程で得られた細胞（ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞）を当該誘導型プロモーター用の誘導因子に接触させてＣＤ１ｄ及び／又はｐｐ６５又はその断片の発現を誘導させる工程をさらに含む。１つの実施形態において、当該製造方法は、当該ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を当該誘導型プロモーター用の誘導因子の存在下で培養することによりｐｐ６５又はその断片の発現を誘導させる工程を含む。１つの実施形態において、当該製造方法は、細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載する工程をさらに含み、１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。１つの実施形態において、細胞表面へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞と誘導因子との接触の前でも後でも同時でもよい。

本発明はまた、本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を培養する工程を含む、がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法を提供する。１つの実施形態において、当該ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞に使用されるＣＤ１ｄはヒトＣＤ１ｄである。１つの実施形態において、当該ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞に使用されるヒト由来細胞は正常細胞であり、１つの実施形態において、当該ヒト由来細胞はＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞である。１つの実施形態において、当該製造方法は、細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載する工程をさらに含む。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。

１つの実施形態において、当該製造方法で使用される本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、誘導型プロモーターが作動可能に連結されているＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び／又はｐｐ６５若しくはその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入したヒト由来細胞であり、１つの実施形態において、当該方法は、本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を誘導型プロモーターの誘導因子に接触させてＣＤ１ｄ及び／又はｐｐ６５又はその断片の発現を誘導させる工程をさらに含む。１つの実施形態において、当該方法は、当該ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＣＤ１ｄ及び／又はｐｐ６５又はその断片の発現を誘導させる工程を含む。１つの実施形態において、当該製造方法は、細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載する工程をさらに含み、１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。１つの実施形態において、細胞表面へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞と誘導因子との接触の前でも後でも同時でもよい。本発明はまた、がんの処置に用いる医薬組成物の製造における本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の使用を提供する。

本項に記載の製造方法に用いる細胞及び工程等に関する具体的な実施形態については、前記の＜本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞＞及び＜本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の作製方法＞の項に記載のとおりである。

本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。

［実施例１：マウス型ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の抗腫瘍作用］
がん抗原であるｐｐ６５を搭載したａＡＶＣの抗原特異的抗腫瘍効果をｉｎｖｉｖｏ評価系にて確認した。

［実施例１－１：マウス型ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の作製］
マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ－１６５８）にｐｐ６５遺伝子及びＣＤ１ｄ遺伝子のｍＲＮＡを導入し、マウス型ａＡＶＣ（ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５とも称する）を作製した。

ｐｐ６５遺伝子（配列番号１）は、配列番号２に示されるＨＣＭＶｐｐ６５のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０６７２５－１）を基に、人工遺伝子合成にて作製した。さらに、前記ｐｐ６５遺伝子を、ｐＧＥＭ（登録商標）－４Ｚプラスミド（以下、ｐＧＥＭ－４Ｚプラスミド）（プロメガ社、Ｃａｔ．Ｐ２１６１）のＨｉｎｄＩＩＩ又はＥｃｏＲＩ認識配列を含む１６塩基と相補的な配列を付加したプライマーを用い、ＰＣＲ法にて増幅した。増幅したｐｐ６５遺伝子をｐＧＥＭ－４ＺプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩサイトに、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３９６４８）を用いて挿入した。得られたプラスミドを、ｐＧＥＭ－４Ｚ－ｐｐ６５プラスミドと称する。ｐＧＥＭ－４ＺプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ－ＢａｍＨＩサイトに、配列番号５に示す塩基配列からなるマウスＣＤ１ｄ遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１１６０９－１のアミノ酸配列（配列番号６）を基に人工遺伝子合成にて遺伝子を合成）を挿入した。得られたプラスミドをｐＧＥＭ－４Ｚ－ｍＣＤ１ｄプラスミドと称する。ｐＧＥＭ－４Ｚ－ｐｐ６５プラスミド及びｐＧＥＭ－４Ｚ－ｍＣＤ１ｄプラスミドをそれぞれＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断して直鎖にしたものをテンプレートとして用い、ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥＴ７ＵＬＴＲＡＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．ＡＭＢ１３４５５）を用いてｐｐ６５ｍＲＮＡ及びＣＤ１ｄｍＲＮＡを作製した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、α－ＧａｌＣｅｒ（十全化学株式会社に合成を委託）を３５０ｎｇ／ｍＬ添加した１０％量のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ培地（Ｍｅｒｃｋ社、Ｃａｔ．Ｄ６４２９）にて２日間培養した後に、回収した。回収した細胞懸濁液に、ｐｐ６５ｍＲＮＡとＣＤ１ｄｍＲＮＡを添加し、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーター（ネッパジーン株式会社）を用いてエレクトロポレーション（ポアーリングパルス：電圧１５０Ｖ、パルス幅８ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓ、回数２回、減衰率１０％、極性＋、トランスファーパルス：電圧２０Ｖ、パルス幅５０ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓ、回数±５回、減衰率４０％、極性＋／－）を行った。エレクトロポレーション後の細胞を回収し、前記細胞にＸ線照射装置ＭＢＲ－１５２０Ｒ－３（株式会社日立パワーソリューションズ）を用いて３０Ｇｙ量のＸ線を照射した。前記の方法により得られた細胞をａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞と称する。

ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の対照被験ａＡＶＣとして使用したａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞は、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の作製方法に準じ、ＷＴ１遺伝子及びＣＤ１ｄ遺伝子のｍＲＮＡを導入することにより作製した。本工程において、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、α－ＧａｌＣｅｒを５００ｎｇ／ｍＬ添加した１０％量のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ培地（Ｍｅｒｃｋ社、Ｃａｔ．Ｄ６４２９）にて２日間培養した。ＷＴ１遺伝子は、ＷＯ２０１３／０１８７７８に記載のｐｃＤＮＡ３－ＡＴＧ－ＷＴ１から調製した。

［実施例１－２：マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞のｐｐ６５特異的Ｔ細胞誘導能］
各群５例の５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の尾静脈に、２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥＩｎｊｅｃｔｉｏｎ（株式会社大塚製薬工場）に懸濁したａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞を、それぞれ５×１０^３ｃｅｌｌｓ、５×１０^４ｃｅｌｌｓ、５×１０^５ｃｅｌｌｓずつ投与した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥＩｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。投与７日後にマウスから脾臓細胞を回収し、添付の方法に従って回収した細胞をｍｏｕｓｅＩＦＮ－γ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｌｏｒｅｎｚｙｍａｔｉｃＥＬＩＳＰＯＴａｓｓａｙｋｉｔ（ＣｅｌｌｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｉｍｉｔｅｄ社、ｍＩＦＮＧｐ－２Ｍ／５）のプレートに３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ播種した。さらに、ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を刺激するために、ｐｐ６５タンパク質に特異的なオーバーラッピングペプチドのｐｐ６５ペプチド（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒＣＭＶｐｐ６５－ｐｒｅｍｉｕｍｇｒａｄｅ，ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社、Ｃａｔ．１３０－０９３－４３５））、及び、ｐｐ６５タンパク質に非特異的なオーバーラッピングペプチドのＷＴ１ペプチド（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒＷＴ１－ｐｒｅｍｉｕｍｇｒａｄｅ，ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社、Ｃａｔ．１３０－０９５－９１８））を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で１日間培養した。添付の方法に従ってスポットの発色を実施し、ＥＬＩＳｐｏｔリーダー０８クラシック（ＡｕｔｏｉｍｍｕｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｋａ社）にてウェル底の細胞スポットの数をカウントすることにより、ＩＦＮ－γ産生細胞数を計測した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞投与マウスでは、ｐｐ６５ペプチド刺激によりＩＦＮ－γを産生する細胞が増加した（図１－１）。抗原非特異的であるＷＴ１ペプチド刺激によるスポット数との差が、ｐｐ６５特異的Ｔ細胞数を示す。この結果より、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の投与によりｐｐ６５特異的Ｔ細胞が誘導されることが示唆された。

［実施例１－３：ｐｐ６５発現Ｂ１６メラノーマ細胞担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の抗原特異的抗腫瘍効果］
Ｂ１６－Ｆ１０メラノーマ細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ－６４７５）にｐｐ６５遺伝子（配列番号１）を搭載したプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、薬剤選択することにより、ｐｐ６５タンパク質を発現するＢ１６－Ｆ１０メラノーマ細胞（Ｂ１６－ｐｐ６５細胞とも称する）を作製した。各群１２例の５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の皮下に、Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬株式会社、Ｃａｔ．０４５－２９７９５）に懸濁した１×１０^５ｃｅｌｌｓのＢ１６－ｐｐ６５細胞を投与した。投与５日後、前記マウスの尾静脈に、ＢＩＣＡＮＡＴＥＩｎｊｅｃｔｉｏｎに懸濁したａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞、又はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞を、それぞれ５×１０^２ｃｅｌｌｓ、５×１０^３ｃｅｌｌｓ、５×１０^４ｃｅｌｌｓずつ投与した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥＩｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。がん細胞を接種した日を０日目と設定し、１７日間の腫瘍体積の変化を計測した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞を投与したすべての群とａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ投与した群においてＢ１６－ｐｐ６５腫瘍の増大が有意に抑制されたのに対し、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞を５×１０^２ｃｅｌｌｓ、５×１０^３ｃｅｌｌｓを投与した群ではＢ１６－ｐｐ６５腫瘍の増大は抑制されなかった（図１－２）。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞及びａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ投与した群では、いずれも抗腫瘍効果が見られているため、本用量における抗腫瘍効果はｐｐ６５タンパク質に非特異的な効果も含めた抗腫瘍効果を検出していると考えられる。一方で、５×１０^２ｃｅｌｌｓと５×１０^３ｃｅｌｌｓのａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞投与群においては、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞投与群よりも強い抗腫瘍効果が得られており、両者の抗腫瘍活性の差は、ｐｐ６５タンパク質に対する特異的免疫の誘導に基づくｐｐ６５特異的抗腫瘍効果と考えられる。なお、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５の１×１０^６細胞あたりのｐｐ６５の発現量は、９６．８μｇであった。

［実施例１－４：ｐｐ６５発現ＧＬ－２６１グリオーマ細胞担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の抗原特異的抗腫瘍効果］
ＧＬ－２６１グリオーマ細胞（ＤＳＭＺ、Ｃａｔ．ＡＣＣ８０２）にｐｐ６５遺伝子（配列番号１）を搭載したプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、薬剤選択することにより、ｐｐ６５タンパク質を発現するＧＬ－２６１グリオーマ細胞（ＧＬ－２６１－ｐｐ６５細胞と称する）を作製した。各群１２例の５週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の頭蓋内に、Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬株式会社、Ｃａｔ．０４５－２９７９５）に懸濁した１×１０^５ｃｅｌｌｓのＧＬ－２６１－ｐｐ６５細胞を投与した。投与７日後、前記マウスの尾静脈に、ＢＩＣＡＮＡＴＥＩｎｊｅｃｔｉｏｎに懸濁したａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞、又はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞を、それぞれ５×１０^２ｃｅｌｌｓ、５×１０^３ｃｅｌｌｓ、５×１０^４ｃｅｌｌｓずつ投与した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥＩｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。ＧＬ－２６１－ｐｐ６５細胞投与から５０日間にわたり生存を観察した。ログランク検定により生存期間を比較したところ、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞投与群すべてとａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ投与した群はコントロール群と比較して有意に生存期間が延長されたのに対し、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＷＴ１細胞を５×１０^２ｃｅｌｌｓ、５×１０^３ｃｅｌｌｓを投与した群では生存期間の延長効果が見られなかった（図１－３）。実施例１－３の結果と同様に、５×１０^２ｃｅｌｌｓと５×１０^３ｃｅｌｌｓのａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞の投与により示された抗腫瘍活性は、ｐｐ６５特異的免疫の誘導に基づくｐｐ６５特異的抗腫瘍効果と考えられる。

実施例１の結果より、マウス型ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ｐｐ６５細胞は、マウスｉｎｖｉｖｏ評価系において、ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を誘導することによりｐｐ６５特異的抗腫瘍効果を示すことが確認された。ヒトにおいても、ヒト型ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、自然免疫を惹起して抗腫瘍効果を奏すると共に、抗原特異的な獲得免疫を誘導し、獲得免疫に基づく抗腫瘍効果を奏することを期待し得るため、ヒトのｐｐ６５発現がんに対してｐｐ６５特異的抗腫瘍効果を示す治療薬の創製を目的とし、以下にヒト型ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の作製検討を行った。

［実施例２：ヒト型ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞の作製及び調製］
ｐｐ６５、ＣＤ１ｄ、及びＴｅｔ－Ｏｎ３Ｇ遺伝子をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ｒ７９００７）に導入することによりヒト型ａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞を構築した。

［実施例２－１：レンチウイルス作製］
（１）レンチウイルス作製用プラスミドの構築
ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶＰｕｒプラスミド（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６１８３）とｐＴＲＥ３Ｇ（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３１１７３）の塩基配列を基に構築したレンチウイルスプラスミドをｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇプラスミドと称する。ｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３ＧプラスミドのＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨＩ認識配列を含む１６塩基に相補的な配列を付加したプライマーを用い、ｐｐ６５遺伝子（配列番号１）をＰＣＲ法にて増幅した。増幅したｐｐ６５遺伝子を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて処理したｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３ＧプラスミドにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて挿入した。得られたプラスミドをｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５プラスミドと称する。得られたｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５プラスミドのＷＰＲＥ配列を、当業者に周知の方法を用いて、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．；２００９；１６（５）：６０５－１９に記載の変異ＷＰＲＥ配列（ｍｕｔ６）に置換した。得られたプラスミドをｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５－ｍＷＰＲＥ（配列番号７）と称する。

ＣＤ１ｄ遺伝子（配列番号３）は配列番号４に示されるヒトＣＤ１ｄのアミノ酸配列を基に設計し、人工遺伝子合成にて当該遺伝子の５’末側にＸｈｏＩ認識配列、３’末側にＮｏｔＩ認識配列を付加した遺伝子を作製した。制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切り出したＣＤ１ｄ遺伝子を、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶＰｕｒプラスミドの塩基配列を基に構築したｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶプラスミド（配列番号８）のＸｈｏＩ－ＮｏｔＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＣＤ１ｄプラスミドと称する。ｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５－ｍＷＰＲＥと同様の手順でＷＰＲＥ配列を変異型に変換したｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＣＤ１ｄ－ｍＷＰＲＥプラスミドを作製した。

Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ遺伝子は、ｐＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇプラスミド（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３１３３５）のＴｅｔ－Ｏｎ３Ｇ遺伝子配列を基に、当該遺伝子の５’末側にＸｈｏＩ認識配列、３’末側にＮｏｔＩ認識配列を付加し、人工遺伝子合成にて作製した。制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切り出したＴｅｔ－Ｏｎ３Ｇ遺伝子を、ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶプラスミドのＸｈｏＩ－ＮｏｔＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇプラスミドと称する。ｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５－ｍＷＰＲＥと同様の手順でＷＰＲＥ配列を変異型に変換したｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇ－ｍＷＰＲＥプラスミドを作製した。

（２）レンチウイルス作製
（１）で作製した、ｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５－ｍＷＰＲＥプラスミド、ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇ－ｍＷＰＲＥプラスミド、及びｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＣＤ１ｄ－ｍＷＰＲＥプラスミドを用いて、ｐｐ６５遺伝子、Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ遺伝子、及びＣＤ１ｄ遺伝子を搭載したレンチウイルスを作製した。得られたレンチウイルスを、それぞれ、ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５搭載レンチウイルス、Ｔｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルス、及びＣＤ１ｄ搭載レンチウイルスと称する。

ｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５－ｍＷＰＲＥプラスミド、又はｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇ－ｍＷＰＲＥプラスミドのいずれかのプラスミドを３０μｇとＶｉｒａＰｏｗｅｒＬｅｎｔｉｖｉｒａｌＰａｃｋａｇｉｎｇＭｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ｋ４９７５００）４５μＬを混合し、１．５ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３０９０１９）を加えて混合した（Ａ）。ＬＶ－ＭＡＸＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ａ３５３４８の構成品）５４０μＬとＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ４．５ｍＬを混合して１分静置した（Ｂ）。（Ａ）と１．５ｍＬの（Ｂ）を混合して室温で１０分静置した。１２５ｍＬ三角フラスコ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．４１１５－０１２５）にてＶｉｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＣｅｌｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ａ３５３４７）を培養し、培養液（１．２×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２７ｍＬ）に（Ａ）と（Ｂ）の混合液を全量添加して遺伝子導入を行った。前記ＶｉｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＣｅｌｌｓを、ＬＶ－ＭＡＸＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ａ３５８３４０１）にて３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍの条件下で培養を行った。遺伝子導入後、前記条件にて２日間培養し、ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５又はＴｅｔ３Ｇ遺伝子を搭載したレンチウイルスを含む培養上清を回収した。培養上清を４℃にて７６０×ｇで１０分間遠心した。上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｅｒｃｋ社、Ｃａｔ．ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）でろ過し、ＰＥＧ－ｉｔＶｉｒｕｓＰｒｅｃｉｐｉｔａｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（５ｘ）（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．ＬＶ８１０Ａ－１）を上清液量の１／４量添加して混合し、４℃で終夜静置した。１５００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を除去し、再度１５００×ｇ、４℃で５分間遠心して上清を完全に除去した。ペレットを７２５μＬのＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１４１９０１４４）に懸濁し、ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５搭載レンチウイルス、及びＴｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルスを得た。

ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＣＤ１ｄ－ｍＷＰＲＥプラスミドを１８μｇとＶｉｒａＰｏｗｅｒＬｅｎｔｉｖｉｒａｌＰａｃｋａｇｉｎｇＭｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ｋ４９７５００）５４μＬを混合し、９ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３０９０１９）を加えて混合した（Ａ）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＣＤＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２５６６０１４）６４８μＬとＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ２７ｍＬを混合して５分静置した（Ｂ）。（Ａ）と９ｍＬの（Ｂ）を混合して室温で２０分静置後、前日にＦａｌｃｏｎ（登録商標）１００ｍｍＴＣ－ｔｒｅａｔｅｄＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＤｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ．３５３００３）に５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｐｌａｔｅで播種したＬｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３２１８０）に（Ａ）と（Ｂ）の混合液３ｍＬ／ｐｌａｔｅで添加して遺伝子導入を行った。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞は、１０％量のウシ胎児血清(ＳＡＦＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．１２００７Ｃ（γ線照射品）)と０．１％量のゲンタマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１５７５００６０）を含むＤＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１０５６９０１０）にて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養を行った。遺伝子導入後、同条件にて２日間培養し、各遺伝子を搭載したレンチウイルスを含む培養上清を回収した。培養上清を４℃にて７６０×ｇで１０分間遠心した。上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｅｒｃｋ社、Ｃａｔ．ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）でろ過し、ＰＥＧ－ｉｔＶｉｒｕｓＰｒｅｃｉｐｉｔａｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（５ｘ）（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．ＬＶ８１０Ａ－１）を上清液量の１／４量添加して混合し、４℃で終夜静置した。１５００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を除去し、再度１５００×ｇ、４℃で５分間遠心して上清を完全に除去した。ペレットを１ｍＬのＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１４１９０１４４）に懸濁し、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルスを得た。

［実施例２－２：Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ感染細胞の作製とクローニング］
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．５１００２９）に実施例２－１で作製した各レンチウイルスを感染させた。ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５搭載レンチウイルス、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルス、及びＴｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルスを感染させた細胞集団をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ｐｐ６５＿ＣＤ１ｄ細胞プールと称する。これらの細胞プールから細胞のクローニングを実施し、各細胞プール由来のクローンを複数取得した。

（１）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ｐｐ６５＿ＣＤ１ｄ細胞プールの作製
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞を２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製し、５００μＬ／ウェルでＦａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャー１２ウェル細胞培養用マルチウェルプレート平底フタ付き（以下、１２ウェルプレート）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ．３５３０４３）に播種し、実施例２－１で得たＣＤ１ｄ搭載レンチウイルスを１００μＬ添加し、さらに４００μＬの培地を添加した。培地は０．１％量のゲンタマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１５７５０－０６０）を含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３３８０１８）を使用した。５４０×ｇ、室温で３０分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。数日培養後に１２ウェルプレートからＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ポリカーボネート製三角フラスコベントキャップ１２５ｍＬ（以下、１２５ｍＬ三角フラスコ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ．４３１１４３）に継代し、さらに適当な間隔で継代して細胞プールＡを得た。細胞プールＡを２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製し、５００μＬ／ウェルで１２ウェルプレートに播種し、実施例２－１で得たＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５搭載レンチウイルスとＴｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルスをそれぞれ２００μＬ／ウェル又は２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらにそれぞれ１００μＬ又は４５０μＬの培地を添加した。培地は０．１％量のゲンタマイシンを含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍを使用した。５４０×ｇ、室温で３０分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。数日培養後に１２ウェルプレートから１２５ｍＬ三角フラスコに継代し、さらに適当な間隔で継代し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ｐｐ６５＿ＣＤ１ｄ細胞プールを得た。

（２）クローニング
（１）で作製したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ｐｐ６５＿ＣＤ１ｄ細胞プールからシングルセルクローニングを行い、全ての遺伝子が安定的に発現するクローンを選抜した。９６ウェルプレートに１ｃｅｌｌ／ウェルとなるように細胞を播種し、細胞の増殖に合わせて継代を行い、細胞を増殖させた。増殖した細胞のｐｐ６５タンパク質及びＣＤ１ｄタンパク質の発現量を、ｐｐ６５タンパク質はＥＬＩＳＡ法にて、ＣＤ１ｄタンパク質はフローサイトメトリー法にて測定し、ｐｐ６５タンパク質及びＣＤ１ｄタンパク質を安定的に発現するクローンを選抜した。ｐｐ６５タンパク質発現量の測定に用いた細胞は、培地に終濃度０．８～１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３１３１１）を添加し、Ｔｅｔ－ＯｎＳｙｓｔｅｍを介してｐｐ６５タンパク質の発現を誘導した後に評価を行った。ＥＬＩＳＡ法による測定には一次抗体としてＣＭＶｐｐ６５（３Ａ１２）抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社Ｃａｔ．ｓｃ－５６９７３）、二次抗体としてＧｏａｔＡｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧＦｃ－ＨＲＰ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｃａｔ．１１５-０３５-０７１）を使用し、ＥＬＩＳＡ直接法の一般的な測定方法に準拠して測定を行った。フローサイトメトリー法による測定には、ＡＰＣＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＨｕｍａｎＣＤ１ｄ抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．５６３５０５）を使用し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた一般的な測定方法に準拠して測定を行った。

本発明のａＡＶＣ－ｐｐ６５細胞は、がんの処置に有用であることが期待できる。

以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。配列表の配列番号１で示される塩基配列は、ヒトサイトメガロウイルスｐｐ６５タンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号３で示される塩基配列は、ヒトＣＤ１ｄタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号５で示される塩基配列は、マウスＣＤ１ｄタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列は、配列番号５によりコードされるアミノ酸配列である。配列表の配列番号７及び配列番号８で示される塩基配列は、ぞれぞれ、ｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ｐｐ６５－ｍＷＰＲＥプラスミド及びｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶプラスミドの塩基配列である。

Claims

ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド、及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを外来的に導入した、ヒト由来細胞。
ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、請求項１に記載の細胞。
ヒト由来細胞が正常細胞である、請求項１又は２に記載の細胞。
正常細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞に由来する細胞である、請求項３に記載の細胞。
ＣＤ１ｄ及びｐｐ６５又はその断片を発現している、請求項１～４のいずれかに記載の細胞。
細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している、請求項５に記載の細胞。
ＣＤ１ｄリガンドがα－ＧａｌＣｅｒである、請求項６に記載の細胞。
請求項６又は７に記載の細胞を含む医薬組成物。
がんの処置に用いるための、請求項８に記載の医薬組成物。
がんを処置する方法であって、請求項６又は７に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、方法。
がんを処置するための、請求項６又は７に記載の細胞。
がんの処置に用いる医薬組成物を製造するための、請求項６又は７に記載の細胞の使用。
がんの処置に用いる細胞を製造する方法であって、
ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びｐｐ６５又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程と、
該細胞を培養する工程を含む、方法。
ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、請求項１３に記載の方法。
ヒト由来細胞が正常細胞である、請求項１３又は１４に記載の方法。
正常細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞に由来する細胞である、請求項１５に記載の方法。
細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載する工程をさらに含む、請求項１３～１６のいずれかに記載の方法。
ＣＤ１ｄリガンドがα－ＧａｌＣｅｒである、請求項１７に記載の方法。