JP2023048810A - 慢性ストレスレベルの検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】頭皮から採取されたＳＳＬ由来のバイオマーカーを用いた慢性ストレスレベルの検出方法を提供する。【解決手段】被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質について、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における慢性ストレスレベルの検出方法。【選択図】なし

Description

本発明は、バイオマーカーを用いた慢性ストレスレベルの検出方法に関する。

ストレスは、物理的、環境的、心理的な様々な刺激や負荷を受けたときに生じる心身の機能変化とされている。現代社会においては働く世代に中心に、多くの方々がストレスを抱えながら生活している。ストレスは心理面、身体面に悪影響を及ぼし、生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ：ＱＯＬ）の低下を招くだけでなく、様々な疾患の発症や増悪に関与することが知られている。

ストレスは、急性ストレスと、持続的なストレスの負荷によって生じる慢性ストレスに大きく区分される。中でも慢性ストレスは、精神疾患などさまざまな疾患の要因となることが知られており、そのメカニズムの理解や改善技術の開発が望まれている。改善技術を開発するにあたってはストレスの評価指標が必要であるが、従来、慢性ストレスは、主に問診やアンケート（例えば、職業性ストレス簡易調査票の領域Ｂ（２９項目））に基づくスコアリングによって評価されている。このような評価法は、客観性や定量性に劣ることがあり、また試験間での評価の比較を困難にする。
また、近年、急性ストレスに対してはコルチゾールに加えクロモグラニンＡ（非特許文献１）が、慢性ストレスに対してはα－クロト（非特許文献２）及び特許文献１～４に開示されるようなストレスマーカーが提案されている。しかし、これらのストレスマーカーの多くが侵襲的な方法でしか採取できないことに加え、慢性ストレスとは必ずしも関連するとは限らない。したがって、バイオマーカーによる慢性ストレスの客観的又は定量的な評価手法は未だ確立されていない。

一方、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在、さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。生体由来の核酸は、血液等の組織、体液、分泌物などから抽出することができる。特許文献５には、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）から被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡ等の核酸を分離し、生体の解析用の試料として用いることが記載されている。

特開２０１３－１５０５５８号公報 特開２００８－０５４５９０号公報 特開２００７－１１０９１２号公報 特開２００７－３０６８８３号公報 国際公開公報第２０１８／００８３１９号

Stress. 2006,9(3):127-131. J Investig Med, 2019,67(7):1082-1086

本発明は、頭皮から採取されたＳＳＬ由来のバイオマーカーを用いた慢性ストレスレベルの検出方法を提供することに関する。

本発明者らは、健常な男女を慢性ストレスレベルが高い群と低い群に分け、それぞれの頭皮からＳＳＬを採取し、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡの発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の遺伝子の発現レベルが両群間で有意に異なり、これを指標として慢性ストレスレベルを検出できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）～４）に係るものである。
１）被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質について、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における慢性ストレスレベルの検出方法。
２）慢性ストレスに対する予防又は治療的介入の存在下、被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質について、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定することを含む、当該介入効果の評価方法。
３）ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬を含有する、１）の方法に用いられる慢性ストレスレベル検出用キット又は２）の方法に用いられる介入効果の評価用キット。
４）ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる慢性ストレスマーカー。

本発明において用いられるＳＳＬは、非侵襲的に採取可能である。したがって、本発明の方法によれば、検体採取の手間や、採取による被験者への負担をかけることなく、慢性ストレスレベルの検出が可能となる。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ-ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。

本発明において「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。

本発明において、遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌに従う。

本発明において、遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の転写産物及び翻訳産物を包含する概念である。「転写産物」とは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されて生じるＲＮＡであり、「翻訳産物」とは、ＲＮＡに基づき翻訳合成される、遺伝子にコードされたタンパク質を意味する。

本発明において、「高ストレス」とは、慢性的にストレスレベルが高い状態（慢性的ストレス状態）を表す。すなわち慢性ストレスのレベルが高いことを表す。慢性ストレスのレベルは、問診やアンケートに基づいてスコアリングすることができる。例えば、労働安全衛生法に基づくストレスチェック制度実施マニュアル改訂版（厚生労働省、２０１６）に従う職業性ストレス簡易調査票の領域Ｂ（２９項目）では、主観的スコアリングに基づくストレススコア（最高スコア３０点、最低スコア６点）として慢性ストレスのレベルを評価することができる。該職業性ストレス簡易調査票によるストレススコアは、低い値を示すほどストレスが高いことを示す。そこで、本発明において「高ストレス」に該当する慢性ストレスレベルとは、該職業性ストレス簡易調査票の領域Ｂ（２９項目）のストレススコアが１２点以下である状態をいい、「低ストレス」に該当する慢性ストレスレベルとは、該ストレススコアが２３点以上である状態をいう。また本発明において、慢性ストレスレベルが「健常」とは、該職業性ストレス簡易調査票簡易版（２３項目）のストレススコアが１３～３０点である状態をいう。

本発明において、慢性ストレスレベルの「検出」とは慢性的ストレス状態の存在又は不存在を明らかにする意味であり、検査、測定、判定又は評価支援などの用語で言い換えることもできる。本明細書における慢性ストレスレベルの「検出」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師によるストレス性疾患の診断を含むものではない。

後述する実施例に示すように、職業性ストレス簡易調査票の領域Ｂ（２９項目）に基づき判定された高ストレス群と低ストレス群の間で、頭皮ＳＳＬにおいて発現レベルが異なっている遺伝子が見出された。すなわち、頭皮ＳＳＬから抽出されたＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）について、ＤＥＳｅｑ２（Love MI et al. Genome Biol. 2014）を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）を用いて、高ストレス群と低ストレス群で尤度比検定によるｐ値の補正値（ＦＤＲ）が０．０５未満かつ、発現変動比が２倍以上もしくは０．５倍以下である遺伝子を抽出することにより、高ストレス群で発現が上昇する遺伝子１２７種（後記表１の「ＵＰ」）、発現が低下する遺伝子２５種（後記表１の「ＤＯＷＮ」）、計１５２遺伝子が同定された。
したがって、斯かる１５２種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は、慢性ストレスレベルを検出するための慢性ストレスマーカーとなり得る。この場合、高ストレス群で発現が上昇する遺伝子又はその発現産物はポジティブマーカーであり、発現が低下する遺伝子又はその発現産物はネガティブマーカーである。

また、被験者から検出された全てのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（８３２４遺伝子のＬｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値）を説明変数とし、高ストレス群と低ストレス群を目的変数とし、機械学習アルゴリズムとしてランダムフォレスト（Breiman L. Machine Learning (2001) 45;5-32）を用いて特徴量遺伝子の抽出及び予測モデルの構築を試みた。後述する実施例に示すように、ジニ係数に基づく変数重要度の上位９５遺伝子（後記表２）を特徴量遺伝子として選択し、これを用いたモデルで慢性ストレスレベルの検出が可能であることが示された。
したがって、斯かる９５種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は、慢性ストレスレベルを検出するための好適な慢性ストレスマーカーとなり得る。

また、機械学習アルゴリズムとしてＢｏｒｕｔａ法（Kursa et al. Fundamental Informaticae (2010) 101;271-286）を用いて特徴量遺伝子の抽出（最大試行回数１０００回、ｐ値０．０１未満）を行ったところ、１６遺伝子（後記表３）が特徴量遺伝子として抽出され、後述の実施例で示すように、これを用いたランダムフォレストによる予測モデルで慢性ストレスレベルの検出が可能であることが示された。
したがって、斯かる１６種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物は、慢性ストレスレベルを検出するための慢性ストレスマーカーとなり得る。

上述した発現変動解析で抽出された後記表１で示される１５２種の遺伝子群（Ａ）と、ランダムフォレストにより特徴量遺伝子として選択された後記表２で示される９５種の遺伝子群（Ｂ）及びＢｏｒｕｔａ法により特徴量遺伝子として選択された後記表３で示される１６種の遺伝子群（Ｃ）の和（Ａ∪Ｂ∪Ｃ）である２５３種の遺伝子（後記表４）はいずれも慢性ストレスマーカーとなり得る。斯かる２５３種の遺伝子は、これまでに慢性ストレスとの関係が報告されていない新規な遺伝子である。

本発明のＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群のうち、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２及びＴＭＰＲＳＳ１３の５遺伝子は、上述した発現変動解析で抽出された後記表１に記載の１５２種の遺伝子群（Ａ）と、ランダムフォレストにより特徴量遺伝子として選択された後記表２に記載の９５種の遺伝子群（Ｂ）に共通する遺伝子（Ａ∩Ｂ）であり、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５の２遺伝子は、ランダムフォレストにより特徴量遺伝子として選択された後記表２に記載の９５種の遺伝子群（Ｂ）とＢｏｒｕｔａ法により特徴量遺伝子として選択された後記表３に記載の１６種の遺伝子群（Ｃ）に共通する遺伝子（Ｂ∩Ｃ）であり、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２の３遺伝子は、発現変動解析で抽出された後記表１に記載の１５２種の遺伝子群（Ａ）とＢｏｒｕｔａ法により特徴量遺伝子として選択された後記表３に記載の１６種の遺伝子群（Ｃ）に共通する遺伝子（Ａ∩Ｃ）である。したがって、これらの遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物は、慢性ストレスレベルを検出するための慢性ストレスマーカーとして特に有用である。

本発明の慢性ストレスレベルの検出においては、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群から１種以上、２種以上、好ましくは５種以上、より好ましくは７種以上を選択して用いることができ、１０種全てを用いることもできる。
また、上記１０種の遺伝子のうちＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる８種の遺伝子群から選択される遺伝子と、後記表１で示される１５２種のうち当該８種を除いた１４４種の遺伝子群（下記表１Ａ）から選択される少なくとも１つの遺伝子を組み合わせて用いることができる。

また、上記１０種の遺伝子のうちＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５からなる７種の遺伝子群から選択される遺伝子と、後記表２で示される９５種のうち当該７種を除いた８８種の遺伝子群（下記表２Ａ）から選択される少なくとも１つの遺伝子を組み合わせて用いることができる。

また、上記１０種の遺伝子のうちＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ、ＺＮＲＦ２、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５からなる５種の遺伝子群から選択される遺伝子と、後記表３で示される１６種のうち当該５種を除いた１１種の遺伝子群（下記表３Ａ）から選択される少なくとも１つの遺伝子を組み合わせて用いることができる。

また、上記１０種の遺伝子群から選択される遺伝子と、後記表４で示される２５３種のうち当該１０種を除いた２４３種の遺伝子群（表４Ａ）から選択される少なくとも１つの遺伝子又を組み合わせて用いることができる。

なお、上記の慢性ストレスマーカーとなり得る遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称す）には、慢性ストレスレベルを検出するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子も包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらにより好ましく９８％以上の同一性があることを意味する。

本発明の慢性ストレスレベルの検出方法は、被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質について、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む。

本発明の慢性ストレスレベルの検出方法において用いられる生体試料は、被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質（ＳＳＬ）が用いられる。なお、被験者は、性別や人種など特に限定されないが、慢性ストレスレベルの検出を必要とするヒト又は慢性ストレスレベルの検出を希望するヒトが好ましい。

ここで、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む（前記特許文献５参照）。また、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。本発明において、ＳＳＬが採取される皮膚は、頭部の毛髪が生える領域の皮膚、すなわち頭皮である。

被験者の頭皮からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。

被験者から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。

本発明において、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象としては、ＲＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等が挙げられ、ＲＮＡが好ましく、より好ましくはｍＲＮＡである。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。また、発現レベルとは、当該遺伝子又は発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。

本発明の方法においては、ＲＮＡを標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象とする場合、ＲＮＡの発現レベルが解析されてもよいが、好ましくはＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。

該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。

発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。

ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定の１種のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて同時に複数の特定のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存するため一概には言えないが、上記のマルチプレックスＰＣＲキットは用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。

当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズ等によって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ等のＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。

精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦｉ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。

ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。

ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として本発明の標的遺伝子が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。

ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に本発明の標的遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。

シーケンシングによって標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。

上記の測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、当該標的遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが増幅される如く、当該検出物又は生成物が当該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９９％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又はイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。

また、本発明の標的遺伝子の翻訳産物（タンパク質）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、１－ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２－ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。

斯くして、被験者の頭皮から採取されたＳＳＬ中の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて慢性ストレスレベルが検出される。
シーケンシングにより複数の標的遺伝子の発現レベルの解析を行う場合は、上記したように、発現量のデータであるリードカウント値、該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ_２（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ_２（ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。また、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ （ＴＰＭ）などによって算出される値であってもよい。また、マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲなどにより特定の標的遺伝子のみ発現レベルの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換（相対定量）して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。

本発明における慢性ストレスレベルの検出は、本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを、各遺伝子又はその発現産物の参照値（カットオフ値）と比較することにより行われる。参照値としては、例えば、予め健常人（ストレスレベルが健常範囲である人）における当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを基準データとして取得しておき、それに基づく発現レベルの平均値や標準偏差等の統計的数値に基づき、適宜決定すれば良い。

例えば、本発明の標的遺伝子又はその発現産物がポジティブマーカーとなる場合、該マーカーの発現レベルが参照値よりも高い場合、被験者は慢性的にストレス状態にあると検出され得、そうでない場合、被験者は慢性的にストレス状態にはないと検出され得る。例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが参照値と比べて統計学的に有意に高ければ、該被験者は慢性的にストレス状態にあると検出され得、そうでない場合、被験者は慢性的なストレス状態にはないと検出され得る。また例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが参照値に対して、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上であれば、該被験者は慢性的にストレス状態にあると検出され得、そうでない場合、被験者は慢性的にストレス状態にはないと検出され得る。

一方、本発明の標的遺伝子又はその発現産物がネガティブマーカーとなる場合、該マーカーの発現レベルが参照値よりも低い場合、被験者は慢性的にストレス状態にあると検出され得、そうでない場合、被験者は慢性的にストレス状態にはないと検出され得る。例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが参照値と比べて統計学的に有意に低ければ、該被験者は慢性的にストレス状態にあると検出され得、そうでない場合、被験者は慢性的にストレス状態にはないと検出され得る。また例えば、被験者における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが参照値に対して、好ましくは９０％以下、より好ましくは７５％以下、さらに好ましくは５０％以下であれば、該被験者は慢性的にストレス状態にあると検出され得、そうでない場合、被験者は慢性的にストレス状態にはないと検出され得る。

あるいは、複数の標的遺伝子又はその発現産物を組み合わせて用いる場合には、それらの標的遺伝子又はその発現産物の一定割合、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは１００％が上述した発現レベルの基準を満たすか否かに基づいて、被験者の慢性ストレスレベルを検出することができる。

別の一実施形態においては、一被験者から本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを定期的に（例えば毎月）測定し、参照値を対照レベルとして、その発現レベルの変動を追跡することで、該被験者の慢性ストレスレベルの推移を検出することができる。この場合の参照値には、予め決定した値、例えば、同じ被験者から複数回測定した標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの統計値（例えば平均値）から該参照値を算出してもよい。あるいは、該参照値は、参照集団（慢性ストレスレベルが任意である個体からなる群）、健常群（慢性ストレスレベルが健常範囲［例えば、前述した職業性ストレス簡易調査票の領域Ｂ（２９項目）のストレススコアが１３～３０点］である個体からなる群）、低ストレス群（慢性ストレスレベルが低ストレス範囲［例えば、前述した職業性ストレス簡易調査票の領域Ｂ（２９項目）のストレススコアが２３点以上］である個体からなる群）、又は高ストレス群（慢性ストレスレベルが高ストレス範囲［例えば、前述した職業性ストレス簡易調査票の領域Ｂ（２９項目）のストレススコアが１２点以下］である個体からなる群）から測定した本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの統計値（例えば平均値など）に基づいて決定することができる。本発明の標的遺伝子又はその発現産物として複数種を用いる場合は、各々の標的遺伝子又はその発現産物について参照値を求めることが好ましい。

さらに、慢性ストレスレベルが高い個体（高ストレス群）由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、慢性ストレスレベルが低い個体（低ストレス群）由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値（発現プロファイル）を利用して、慢性的なストレス状態にあるかそうではないかを分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式を利用して、慢性的ストレスレベルを検出することができる。
すなわち、高ストレス群由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、健常又は低ストレス群由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、高ストレス群と健常又は低ストレス群を分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式に基づいて慢性ストレス状態の存在又は不存在を判別する参照値（カットオフ値）を求める。なお、判別式の作成においては、主成分分析（ＰＣＡ）により次元圧縮を行ない、主要成分を説明変数とすることができる。
そして、被験者の頭皮から採取されたＳＳＬから標的遺伝子又はその発現産物のレベルを同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果を参照値と比較することによって、被検者における慢性的ストレスレベルを評価できる。

判別式の構築に用いる変数には説明変数と目的変数がある。説明変数としては、例えば、下記の方法で選択した標的遺伝子又はその発現産物の発現レベル（特徴量）を用いることができる。目的変数としては、例えば、そのサンプルが慢性ストレス状態にある（高ストレス）かそうではない（健常又は低ストレス）か、を用いることができる。

特徴量の選択には、判別する２群間の統計学的に有意な差異、例えば、発現レベルが２群間で有意に変動する遺伝子（発現変動遺伝子）又はその発現産物の発現レベルを用いることができる。また、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用して特徴量遺伝子を抽出し、その発現レベルを用いたりすることができる。例えば、下記に示すランダムフォレストにおける変数重要度の高い遺伝子またはその発現産物の発現レベルを用いたり、Ｒ言語の“Ｂｏｒｕｔａ”パッケージなどを用いて特徴量遺伝子を抽出し、その発現レベルを用いたりすることができる。

判別式の構築におけるアルゴリズムは、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）などが挙げられる。構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。また、予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。

判別式の構築においてランダムフォレストのアルゴリズムを使用する場合、予測モデルの精度の指標として、未知データに対する推定の誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を算出することができる（Breiman L. Machine Learning (2001) 45;5-32）。

ランダムフォレストにおいては、ブートストラップ法という手法に従い、全サンプル中から重複を許して、サンプル数の約３分の２のサンプルをランダムに抽出し、決定木と呼ばれる分類器を作成する。この時抽出されなかったサンプルはＯｕｔ ｏｆ ｂｕｇ（ＯＯＢ）と呼ばれ、1本の決定木を用いて、ＯＯＢの目的変数の予測を行い、正解ラベルと比較することでその誤答率を算出することができる（決定木におけるＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）。同様の作業を５００回繰り返し行い、５００本の決定木におけるＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅの平均値をとった値を、該ランダムフォレストのモデルのＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅとすることができる。

なお、ランダムフォレストのモデルを構築する決定木の数（ｎｔｒｅｅ値）は、デフォルトでは５００本であるが、必要に応じて１本から任意の本数に変更することができる。さらに、1つの決定木においてサンプルの判別式の作成に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）は、デフォルトでは説明変数の数の平方根をとった値であるが、必要に応じて１つから全説明変数の数までの値のいずれかに変更することができる。

ｍｔｒｙ値の決定にはＲ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージを用いることができる。“ｃａｒｅｔ”パッケージのメソッドにランダムフォレストを指定し、8通りのｍｔｒｙ値を試行し、例えばＡｃｃｕｒａｃｙが最大となるｍｔｒｙ値を最適なｍｔｒｙ値として選択することができる。なお、ｍｔｒｙ値の試行回数は、必要に応じて任意の試行回数に変更することができる。

判別式の構築においてランダムフォレストのアルゴリズムを使用する場合、モデルの構築に用いた説明変数の重要度を数値（変数重要度）化することができる。変数重要度の値には、例えば、ジニ係数の減少量（Ｍｅａｎ Ｄｅｃｒｅａｓｅ Ｇｉｎｉ）を用いることができる。

カットオフ値（参照値）の決定方法は特に制限されず、公知の手法に従って決定することができる。例えば、判別式を使用して作成されたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）曲線より求めることができる。ＲＯＣ曲線では、縦軸に陽性被験者において陽性の結果がでる確率（感度）と、横軸に陰性被験者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率）がプロットされる。ＲＯＣ曲線に示される「真陽性（感度）」及び「偽陽性（１－特異度）」に関し、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値（参照値）とすることができる。

本発明の慢性ストレスレベルの検出に用いられる予測モデルを構築するための特徴量遺伝子としては、例えば、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群、当該１０種の遺伝子を全て含む後記表４で示される２５３遺伝子からなる遺伝子群、当該１０種のうちのＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２の８種を含む後記表１で示される１５２遺伝子からなる遺伝子群、当該１０種のうちのＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５の７種を含む後記表２で示される９５種の遺伝子からなる遺伝子群、当該１０種のうちのＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ、ＺＮＲＦ２、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５の５種を含む、後記表３で示される１６種の遺伝子からなる遺伝子群が挙げられる。

また、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子のうちＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる８種の遺伝子群から選択される遺伝子と、後記表１で示される１５２種のうち当該８種を除いた１４６種の遺伝子群（前記表１Ａ）から選択される少なくとも１つの遺伝子を組み合わせて特徴量遺伝子とすることができる。
また、上記１０種の遺伝子のうちＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５からなる７種の遺伝子群から選択される遺伝子と、後記表２で示される９５種のうち当該７種を除いた８８種の遺伝子群（前記表２Ａ）から選択される少なくとも１つの遺伝子を組み合わせて特徴量遺伝子とすることができる。ここで、前記表２Ａで示される遺伝子群から選択される遺伝子は、変数重要度のより上位の遺伝子から順に、あるいは変数重要度が上位から５０位以内、好ましくは３０位以内の遺伝子から選択するのが好ましい。
また、上記１０種の遺伝子のうち、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ、ＺＮＲＦ２、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５からなる５種の遺伝子群から選択される遺伝子と、後記表３で示される１６種のうち当該５種を除いた１１種の遺伝子群（前記表３Ａ）から選択される少なくとも１つの遺伝子を組み合わせて特徴量遺伝子とすることができる。
また、上記１０種の遺伝子群から選択される遺伝子と、後記表４で示される２５３種のうち当該１０種を除いた２４３種の遺伝子群（前記表４Ａ）から選択される少なくとも１つの遺伝子又を組み合わせて特徴量遺伝子とすることができる。

上述した本発明の慢性ストレスレベルの検出方法は、慢性ストレスに対する予防又は治療的介入の存在下で実施することにより当該介入の効果を評価することができる。
すなわち、本発明の介入効果の評価方法は、慢性ストレスに対する予防又は治療的介入の存在下、被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質について、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定することを含む。

ここで、慢性ストレスに対する予防又は治療的介入とは、慢性ストレスに対して予防又は治療的効果を期待して実施される介入であり、化学的介入、物理的又は機械的介入が包含される。化学的介入としては、天然物質、合成物質、組成物等の物質の投与が挙げられ、物理的又は機械的介入としては、電磁波、光等の照射、温熱付与、マッサージなどの施術が挙げられる。

介入効果の評価は、介入によって生じる被験者の標的遺伝子又はその発現産物のレベル、更にはそれに基づく慢性ストレスレベルの変化に基づいて評価することができる。
例えば、介入存在下における被験者の標的遺伝子又はその発現産物のレベル、更にはそれに基づく慢性ストレスレベルを、対照（介入非存在下）と比較することで、その効果を評価することが挙げられる。そして、被験者の慢性ストレスレベルを低下するような介入は、慢性ストレスの予防又は治療のために有効な介入と評価できる。

慢性ストレスレベル検出用キット又は介入効果の評価用キットは、本発明による慢性ストレスレベル検出方法に従って被験者の慢性ストレスレベルを検出するためのキット、及び本発明による介入効果の評価方法に従って介入効果を評価するためのキットである。
本発明のキットは、ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬を含有する。
ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬としては、例えば、ＳＳＬを採取するための脂取りフィルム、採取したＳＳＬを保存するための試薬、保存用の容器等が挙げられる。
標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬としては、例えば採取したＳＳＬからＲＮＡを抽出・精製するための試薬、標的遺伝子に由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー、シーケンシング用アダプター配列等）を含む、核酸増幅又はハイブリダイゼーションのための試薬、遺伝子発現産物（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤、ポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、試験に必要な器具の他、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを検出するための指標又はガイダンス等が包含される。

本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
＜１＞被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質について、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における慢性ストレスレベルの検出方法。
＜２＞前記１０種の遺伝子のうちのＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる８種の遺伝子群から選択される遺伝子と、前記表１Ａで示される１４４種の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜１＞の方法。
＜３＞前記１０種の遺伝子のうちのＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５からなる７種の遺伝子群から選択される遺伝子と、前記表２Ａで示される８８種の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜１＞の方法。
＜４＞前記１０種の遺伝子のうちのＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ、ＺＮＲＦ２、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５からなる５種の遺伝子群から選択される遺伝子と、前記表３Ａで示される１１種の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜１＞の方法。
＜５＞前記１０種の遺伝子群から選択される遺伝子と、前記表４Ａで示される２４３種の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜１＞の方法。
＜６＞遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量の測定である、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞発現レベルの測定値を前記各遺伝子又はその発現産物の参照値と比較し、慢性ストレス状態の存在又は不存在を評価する、＜１＞～＜６＞のいずれかの方法。
＜８＞高ストレス群由来の前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、健常又は低ストレス群由来の同遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、高ストレス群と健常又は低ストレス群を分ける判別式を作成し、被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質から得られた同遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を当該判別式に代入し、得られた結果を参照値と比較することによって、被検者における慢性ストレス状態の存在又は不存在を評価する、＜１＞～＜６＞のいずれかの方法。
＜９＞慢性ストレスに対する予防又は治療的介入の存在下、被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質について、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定することを含む、当該介入効果の評価方法。
＜１０＞ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬を含有する、＜１＞～＜８＞のいずれかの方法に用いられる慢性ストレスレベル検出用キット又は＜９＞の方法に用いられる介入効果の評価用キット。
＜１１＞ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる慢性ストレスマーカー。
＜１２＞ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の、慢性ストレスマーカーとしての使用。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ 発現変動遺伝子を用いた慢性ストレスレベル判別モデルの構築
１）被験者の選抜及びＳＳＬ採取
２０～６０歳代の健常な男女７２名に、職業性ストレス簡易調査票調査票の領域Ｂ（２９項目）（厚生労働省、２０１６）に回答させ、回答結果に基づいてストレススコアを算出した。該ストレススコアは低いほど慢性ストレスが高いことを示し、厚労省基準（労働安全衛生法に基づくストレスチェック制度実施マニュアル改訂版、厚生労働省、２０１６）で高ストレスと認定される基準である、該ストレススコアが１２点以下であった１６名を高ストレス群の被験者として選抜した。一方、該ストレススコアが２３点以上であった１５名を低ストレス群の被験者として選抜した。両群合わせて３１名の各被験者の頭部からあぶら取りフィルム（５ｃｍ×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を採取した。採取に当たっては当日の整髪料等の毛髪化粧料の使用を禁止した。皮脂は、毛髪をかき分けてからその根元の頭皮を擦るように採取し、これを頭部全体で数回繰り返して採取した。皮脂を採取したあぶら取りフィルムは、ガラスバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃で保存した。

２）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
上記１）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃で９０分間逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１を用いて遺伝子マッピングすることで各リード配列の由来する遺伝子を決定した。

３）データ解析及び特徴量遺伝子の選択
上記２）で測定した被験者由来のＲＮＡの発現レベルのデータ（リードカウント値）を、ＤＥＳｅｑ２という手法を用いて補正した。但し、全被験者の発現レベルデータのうち９０％以上の被験者で欠損値ではない発現レベルデータが得られた８３２４遺伝子のみ以下の解析に使用した。解析では、ＤＥＳｅｑ２という手法を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）を用い、群間（低ストレス群及び高ストレス群）で尤度比検定によるｐ値の補正値（ＦＤＲ）が０．０５未満かつ、発現変動比が２倍以上もしくは０．５倍以下である遺伝子を抽出した。その結果、表１に示す１５２種の遺伝子が得られた。表１のＵＰで示される１２７遺伝子は、高ストレス群で発現レベルがより高かったことから、慢性ストレスにより発現レベルが増加するマーカー（ポジティブマーカー）であった。表１のＤＯＷＮで示される２５遺伝子は、高ストレス群で発現レベルがより低かったことから、慢性ストレスにより発現レベルが低下するマーカー（ネガティブマーカー）であった。これらの遺伝子を以下の予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

４）モデル構築
３）で選択した１５２の特徴量遺伝子の発現レベルデータとして、２）で測定した被験者由来のＲＮＡの発現レベルのデータ（リードカウント値）を、サンプル間の総リードカウントの違いを補正するため、各リードカウントをＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）値に変換したものを用い、負の二項分布に従うＲＰＭ値から正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。得られた１５２の特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、慢性ストレスレベル（高ストレス又は低ストレス）を目的変数として用いて、慢性ストレスレベルを判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅを算出した。その結果、１５２遺伝子全ての発現レベルデータを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは２５.８％であり、表１に示す遺伝子を、慢性ストレスレベルを検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

実施例２ ランダムフォレスト変数重要度の高い遺伝子を用いた慢性ストレスレベル判別モデルの構築
１）使用データ
実施例１の３）で取得した９０％以上の被験者で欠損値ではない発現レベルデータが得られた８３２４種の遺伝子を以下の解析に使用した。解析では、遺伝子の発現レベルデータとして、実施例１の２）で測定した被験者由来のＲＮＡの発現レベルのデータ（リードカウント値）を、サンプル間の総リードカウントの違いを補正するため、各リードカウントをＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）値に変換したものを用い、負の二項分布に従うＲＰＭ値から正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。

２）特徴量遺伝子の選択
ランダムフォレストのアルゴリズムを用いて、予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子の選択を行った。１）で得られた８３２４遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、慢性ストレスレベル（高ストレス又は低ストレス）を目的変数として用いて、慢性ストレスレベルを判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、ジニ係数に基づく変数重要度の上位９５遺伝子を算出した（表２）。これら９５遺伝子を予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

３）モデル構築
２）で選択した９５の特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、慢性ストレスレベル（高ストレス又は低ストレス）を目的変数として用いて、慢性ストレスレベルを判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を算出した。その結果、９５遺伝子の発現レベルデータを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは２５．８％であり、表２に示す遺伝子を、慢性ストレスレベルを検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

実施例３ Ｂｏｒｕｔａ法により抽出した特徴量遺伝子を用いた慢性ストレスレベル判別モデルの構築
１）使用データ
実施例１の３）で取得した９０％以上の被験者で欠損値ではない発現レベルデータが得られた８３２４種の遺伝子を以下の解析に使用した。解析では、遺伝子の発現レベルデータとして、実施例１の２）で測定した被験者由来のＲＮＡの発現レベルのデータ（リードカウント値）を、サンプル間の総リードカウントの違いを補正するため、各リードカウントをＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）値に変換したものを用い、負の二項分布に従うＲＰＭ値から正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。

２）特徴量遺伝子の選択
１）で得られた８３２４遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、慢性ストレスレベル（高ストレス又は低ストレス）を目的変数として用いて、Ｒ言語の“Ｂｏｒｕｔａ”パッケージのアルゴリズムを実行し、慢性ストレスレベルを判別する予測モデルを構築した。最大試行回数を１０００回とし、ｐ値が０．０１未満である１６遺伝子を算出した（表３）。これら１６遺伝子を予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

３）モデル構築
２）で選択した１６の特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、慢性ストレスレベル（高ストレス又は低ストレス）を目的変数として用いて、慢性ストレスレベルを判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を算出した。その結果、１６遺伝子の発現レベルデータを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは１２．９％であり、表３に示す遺伝子を、慢性ストレスレベルを検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

実施例４ 実施例１～３で重複して用いられた特徴量遺伝子に基づく慢性ストレスレベル判別モデルの構築
１）特徴量遺伝子の選択
実施例１～３で用いられた特徴量遺伝子のうち、実施例間で重複して用いられた遺伝子は、実施例１と２で重複して用いられたＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２及びＴＭＰＲＳＳ１３の５遺伝子、実施例２と実施例３で重複して用いられたＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５の２遺伝子、実施例１と３で重複して用いられたＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２の３遺伝子の計１０遺伝子であった。これら１０遺伝子を予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

２）モデル構築
１）で選択した１０の特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、慢性ストレスレベル（高ストレス又は低ストレス）を目的変数として用いて、慢性ストレスレベルを判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を算出した。その結果、１０遺伝子の発現レベルデータを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは２２．６％であり、上記１０遺伝子を、慢性ストレスレベルを検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

実施例５ 実施例１～３で用いられた全ての特徴量遺伝子に基づく慢性ストレスレベル判別モデルの構築
１）特徴量遺伝子の選択
実施例１～３のいずれかで用いられた特徴量遺伝子の全て（表４に示された計２５３種の遺伝子）を予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

２）モデル構築
１）で選択した２５３の特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、慢性ストレスレベル（高ストレス又は低ストレス）を目的変数として用いて、慢性ストレスレベルを判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を算出した。その結果、２５３遺伝子の発現レベルデータを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは３５．５％であり、表４の２５３遺伝子を、慢性ストレスレベルを検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

Claims (11)

1. 被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質について、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における慢性ストレスレベルの検出方法。
2. 前記１０種の遺伝子のうちのＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる８種の遺伝子群から選択される遺伝子と、下記表１Ａで示される１４４種の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、請求項１記載の方法。
   

   
3. 前記１０種の遺伝子のうちのＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５からなる７種の遺伝子群から選択される遺伝子と、下記表２Ａで示される８８種の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、請求項１記載の方法。
   

   
4. 前記１０種の遺伝子のうちのＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ、ＺＮＲＦ２、ＣＲＬＦ３及びＰＤＬＩＭ５からなる５種の遺伝子群から選択される遺伝子と、下記表３Ａで示される１１種の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、請求項１記載の方法。
   

   
5. 前記１０種の遺伝子群から選択される遺伝子と、下記表４Ａで示される２４３種の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、請求項１記載の方法。
   

   
6. 遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量の測定である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
7. 発現レベルの測定値を前記各遺伝子又はその発現産物の参照値と比較し、慢性ストレス状態の存在又は不存在を評価する、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
8. 高ストレス群由来の前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、健常又は低ストレス群由来の同遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、高ストレス群と健常又は低ストレス群を分ける判別式を作成し、被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質から得られた同遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を当該判別式に代入し、得られた結果を参照値と比較することによって、被検者における慢性ストレス状態の存在又は不存在を評価する、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
9. 慢性ストレスに対する予防又は治療的介入の存在下、被験者の頭皮から採取された皮膚表上脂質について、ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定することを含む、当該介入効果の評価方法。
10. ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬を含有する、請求項１～８のいずれか１項記載の方法に用いられる慢性ストレスレベル検出用キット又は請求項９記載の方法に用いられる介入効果の評価用キット。
11. ＭＧＭＴ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＲＥＧ、ＹＥＡＴＳ２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＣＲＬＦ３、ＰＤＬＩＭ５、ＧＯＬＧＡ６Ｌ５、ＯＴＵＤ７Ｂ及びＺＮＲＦ２からなる遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる慢性ストレスマーカー。