JP2023024984A - 難聴の予防および治療のための組成物および方法 - Google Patents

難聴の予防および治療のための組成物および方法 Download PDF

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ズオ，ジエン
Jian Zuo
ジェン，フェイ
Fei Zheng
哲司 山下
Tetsuji Yamashita
ケラード，ゾーイ
Kellard Zoe
テイツ，タル
Teitz Tal
ミン，ジャッキー
Jaeki Min
チェン，タオシェン
Taosheng Chen
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Abstract

【課題】難聴を予防する医薬を提供する。【解決手段】ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤を使用して難聴を予防するか、またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤および無調関連因子（ａｔｏｎａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ）をコードする核酸分子を使用して難聴を治療する、方法および組成物が記載される。【選択図】なし

Description

導入
本特許出願は、２０１７年５月３日出願の米国特許仮出願第６２／５００，６６７号に
よる優先権の利益を主張し、その内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所により認可された認証番号ＤＣ００６４７１、ＤＣ０１５０
１０、ＤＣ０１５４４４、ＤＣ０１３８７９、ＤＣ０１３２３２、およびＣＡ０２１７６
５、ならびに海軍研究事務所により認可された認証番号Ｎ０００１４－０９－Ｖ－１０１
４、Ｎ０００１４－１２－Ｖ－０１９１、Ｎ０００１４－１２－Ｖ－０７７５、およびＮ
０００１４－１６－Ｖ－２３１５の下で、政府の支援によりなされたものである。政府は
、本発明において特定の権利を有する。
耳は、聴覚および平衡を担う迷路構造で構成される複雑な器官である。聴覚および平衡
の両方の知覚は、内耳構造が機械的刺激を脳によって認識される活動電位に変換する能力
にある。聴覚を担う感覚受容器は、流体で充填された螺旋形の管である蝸牛内に位置する
。蝸牛内にはコルチ器官があり、これは、鼓膜基底板と蓋膜とを架橋する円柱感覚有毛細
胞で覆われている。音波がコルチ器官を通過すると、鼓膜基底板が振動し、これにより有
毛細胞が前後に屈曲する。この運動が有毛細胞を脱分極させ、脳に活動電位を運搬する神
経伝達物質の聴神経への放出をもたらす。
内耳蝸牛感覚上皮は、生後に有糸***が終了し、マウスでは、生後１週間の間に限定さ
れた自然再生を呈するに過ぎない。感覚有毛細胞の系列特異的な転写因子である無調（Ａ
ｔｏｎａｌ）ＢＨＬＨ転写因子１（Ａｔｏｈ１）は、蝸牛外植片培養物中およびインビボ
で、非感覚支持細胞を感覚有毛細胞に直接変換する（Ｇｕｂｂｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．（２
００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５５（７２１２）： ５３７－４１、Ｋｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ
．（２０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２（１９）： ６６９９－７１０、Ｌｉｕ，ｅ
ｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２（１９）： ６６００－１０、Ｌｉ
ｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（２）：ｅ８９３７７、Ｚｈｅｎｇ
＆Ｇａｏ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（６）：５８０－６）。さらに
、ＦＤＡは、ヒトＡｔｏｈ１をコードするｃＤＮＡを含有する組み換えアデノウイルス５
（Ａｄ５）ベクターであるＣＧＦ１６６の安全性、耐容性、および有効性を評価するため
の臨床試験（ＮＣＴ０２１３２１３０）を承認している。しかしながら、インビボでのＡ
ｔｏｈ１媒介性非感覚支持細胞から感覚有毛細胞への変換が、効率的かつ完全であるかど
うか、およびそのような変換が、前駆体細胞状態を回避するか、または正常な系列経路を
正確に追従するかどうかは、明確ではない。いくつかのマウスモデルでは、Ａｔｏｈ１変
換された感覚有毛細胞は、未熟な有毛細胞の形態を呈し、いくつかの終末分化マーカー（
例えば、プレスチンをコードするＳｌｃ２６ａ５およびオンコモジュリンをコードするＯ
ｃｍ）を発現せず、変換率が低かった（６％～２０％）（Ｋｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．（２
０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２（１９）： ６６９９－７１０、Ｌｉｕ，ｅｔ ａ
ｌ．（２０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２（１９）： ６６００－１０、Ｌｉｕ，ｅ
ｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（２）：ｅ８９３７７）。加えて、ｐ７５
によって標識される支持細胞のサブセットでは、細胞周期再進入を可能にするための細胞
周期阻害剤ｐ２７Ｋｉｐｌ（ＣＤＫＮ１ｂ）の増殖および下方制御に、上皮成長因子受容
体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達が必要とされることが示されている（Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ ａ
ｌ．（２０１２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３６３：１９１－２００）。
本発明は、難聴の治療または予防を必要とする動物に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）
シグナル伝達の阻害剤を投与することによる、難聴の治療または予防のための方法を提供
する。治療に従って、本方法は、無調関連因子（Ａｔｏｎａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｆａｃｔｏｒ）をコードする核酸分子を持つ発現ベクターおよび／または他の再生剤を投
与することをさらに含み得る。他の実施形態では、本方法は、１つ以上の耳保護剤または
再生剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻
害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、Ｐ
Ｉ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、または細胞周期
関連タンパク質キナーゼ阻害剤（例えば、Ｈｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ、
もしくはＰＤＧＦＲ）の発現または活性を阻害する。他の実施形態では、阻害剤は、阻害
性ＲＮＡ、抗体、または小有機分子である。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝
達の阻害剤と組み合わせて、無調関連因子をコードする核酸分子を持つ発現ベクターと、
任意で１つ以上の再生剤と、を含有する、薬学的組成物およびキットもまた提供される。
ＥＧＦＲシグナル伝達の薬理学的阻害が、新生仔マウスの蝸牛外植片においてＡｔｏｈ１誘導性有毛細胞（ＨＣ）変換を増加させたことを示す。代表的な画像は、Ａｔｏｈ１－ＩＲＥＳ－ＧＦＰをトランスフェクトし、ビヒクル（図１Ａおよび１Ｃ）または１００ｎＭのＡＧ１４７８（図１Ｂおよび１Ｄ）で治療した蝸牛外植片の免疫染色を示す。有毛細胞マーカーＭｙｏ６（↑）の発現およびＡｔｏｈ１をトランスフェクトした細胞（ＧＦＰ、
Figure 2023024984000001
を示す。図１Ｃおよび１Ｄはそれぞれ、図１ＡおよびＩＢの強拡大の正方形領域を表す。
スケールバー：図１Ａおよび１Ｂでは１００ｐｍ、図１Ｃおよび１Ｄでは２０ｐｍ。
示される異なる治療下での、Ａｔｏｈ１誘導性ＨＣ変換率（百分率でのＭｙｏ６＋、ＧＦＰ＋／ＧＦＰ＋細胞）の定量化を示す（各治療についてｎ＝１～５）。Ａｔｏｈ１は、全ての条件でトランスフェクトされる（観察値／期待値）。 ＥＧＦＲ阻害剤ムブリチニブ（その構造を示す）が、２．５ｎＭのＩＣ５０および５００ｎＭ超のＬＤ５０（２００超の治療指数）で、マウス蝸牛外植片においてシスプラチン誘導性有毛細胞喪失から保護することを示す。外植片の数：各用量で１～４個；１５０μＭのシスプラチン治療および中回転を有するＦＶＢ蝸牛外植片を分析した；０．８６のＲ２で曲線当て嵌め。ムブリチニブのＩＣ５０値は、全てのアッセイにおいて一定であり、これは、その特異性および効力を実証することに留意されたい。 ＥＧＦＲ阻害剤ペリチニブ（その構造を示す）が、シスプラチン誘導性有毛細胞喪失から保護することを示す。ペリチニブは、０．６μＭのＩＣ５０（シスプラチン－Ｇｌｏ３／７）および４０μＭ超のＬＤ５０（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ）で、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞内のシスプラチン誘導性カスパーゼ－３／７活性に対する保護効果を呈するＥＧＦＲの不可逆的阻害剤である。
ＥＧＦＲ阻害剤、およびその下流にあるかまたはそれに関連するタンパク質が、シスプ
ラチン、抗生物質、騒音、老化、または他の聴覚毒性侵襲によって損傷される有毛細胞を
保護し、かつ蝸牛外植片培養物中のＡｔｏｈ１の過剰発現と併せて有毛細胞形成を有意に
誘導し得ることが、現在見出されている。したがって、本発明は、ＥＧＦＲの阻害剤を使
用して難聴を予防する、かつ／または無調関連因子遺伝子療法と併用してＥＧＦＲの阻害
剤を使用して難聴を治療するための組成物および方法を提供する。理想的には、本発明の
方法は、感覚有毛細胞の喪失または損傷に関連する少なくとも１つの障害、例えば、感覚
有毛細胞の損傷に関連する耳の障害（難聴および平衡障害など）について、動物、好まし
くは哺乳動物（例えば、ヒト）を予防的または治療的に処置する。本発明の方法はまた、
感覚的知覚のレベルを維持、すなわち、例えば、老化プロセスまたは聴覚毒性剤によって
引き起こされる環境刺激の知覚の喪失を制御する上でも有用である。
ＥＧＦＲシグナル伝達。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ－１、ヒトではＨＥ
Ｒ１）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ａ（ＴＧＦα）、Ｈ
Ｂ－ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ベータセルリン、エピジェン、およびエピレギュリン
を含む、その特異的リガンドの結合によって活性化される細胞表面受容体である。ＥＧＦ
Ｒは、４つの密接に関連した受容体チロシンキナーゼ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｃ－ｎｅｕ
（ＥｒｂＢ－２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ－３）、およびＨｅｒ４（ＥｒｂＢ－４）のサブ
ファミリーであるＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーである。その成長因子リガンドに
よって活性化されると、ＥＧＦＲは、非活性単量体形態から活性ホモ二量体への移行を受
ける。リガンド結合後のホモ二量体の形成に加えて、ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２
／ｎｅｕなどのＥｒｂＢ受容体ファミリーの別のメンバーと対合して、活性化ヘテロ二量
体を作製することができる。ＥＧＦＲ二量体化は、その内在的な細胞内タンパク質－チロ
シンキナーゼ活性を刺激する。結果として、ＥＧＦＲのＣ末端ドメイン内でいくつかのチ
ロシン（Ｙ）残基の自己リン酸化が生じる。これらには、Ｙ９９２、Ｙ１０４５、Ｙ１０
６８、Ｙ１１４８、およびＹ１１７３が含まれる。この自己リン酸化は、Ｒａｓ／Ｒａｆ
／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｐｌ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、ＮＣＫ
－ＰＡＫ－ＪＮＫ、ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣ、および／またはいくつかの細胞周期関連タ
ンパク質キナーゼタンパク質／経路の下流活性化、シグナル伝達、および／または発現を
誘発する。これらのシグナル伝達事象は、ＤＮＡ合成、ならびに細胞遊走、接着、および
増殖をもたらす、いくつかのシグナル伝達カスケードを開始させる。したがって、本明細
書において、「ＥＧＦＲシグナル伝達」または「ＥＧＦＲシグナル伝達経路」は、ＥＧＦ
Ｒ自体によるシグナル伝達だけでなく、その下流にあるＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ
／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫ
、ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣ、細胞周期関連タンパク質キナーゼ経路／タンパク質も指す。
Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／
ＭＡＰＫ経路（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路としても知られる）は、当該技術分野において周知
であり、ＥＧＦＲなどのリガンド結合細胞表面チロシンキナーゼ受容体からの細胞外シグ
ナルを中継することによって、哺乳動物細胞成長を制御する上で中心的な役割を果たす。
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル制御キナー
ゼ）経路の活性化は、Ｒａｓ、例えば、ＨＲａｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００１
１２３９１４、ＮＰ＿００１３０４９８３、もしくはＮＰ＿７８９７６５）、ＫＲａｓ（
ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００４９７６もしくはＮＰ＿２０３５２４）、またはＮＲ
ａｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００２５１５）の活性化とともに開始するリン酸化
事象のカスケードを介する。Ｒａｓの活性化は、Ｒａｆ、例えば、ｃ－ＲａｆもしくはＲ
ａｆ－１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００２８７１）、Ａ－Ｒａｆ（ＧＥＮＢＡＮＫ
受託番号ＮＰ＿００１２４３１２５、ＮＰ＿００１６４５、もしくはＮＰ＿００１２４３
１２６）、またはＢ－Ｒａｆ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００４３２４）の動員およ
び活性化をもたらす。その後、活性化Ｒａｆは、ＭＥＫ１／２（すなわち、ＭＡＰＫ／Ｅ
ＲＫキナーゼ１および２、それぞれＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００２７４６およびＮ
Ｐ＿１０９５８７）をリン酸化および活性化し、これがその後、ＥＲＫ１／２（すなわち
、ＭＡＰＫ３／ＭＡＰＫ１、それぞれＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２８４８２およびＰ２７
３６１）をリン酸化および活性化する。ＲａｓからＥＲＫへのこのタンパク質の連鎖が、
細胞表面受容体からＤＮＡへとシグナルを通信する。ＥＲＫは、細胞周期進行、分化、タ
ンパク質合成、代謝、細胞生存、細胞遊走、ならびに浸潤および老化を制御する転写因子
によって媒介される遺伝子発現において、広範な変化を生成する。
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路。ヤヌスキナーゼ／シグナル伝達性転写因子（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ
）経路は、細胞増殖、分化、細胞遊走、およびアポトーシスを刺激する。機構的に、ＪＡ
Ｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達は、いくつかの主要な構成要素で構成される。哺乳動物では、
ＪＡＫファミリーには、４つのメンバー、ＪＡＫ１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００
１３０７８５２）、ＪＡＫ２（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００１３０９１２３または
ＮＰ＿００１３０９１２７）、ＪＡＫ３（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿０００２０６）
、およびＴｙｋ２（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００３３２２）が含まれる。ＪＡＫ活
性化は、リガンド媒介性受容体の多量体化時に生じ、それによりトランスリン酸化を可能
にする。その後、活性化ＪＡＫは、追加の標的、特にＳＴＡＴをリン酸化する。ＳＴＡＴ
は、活性化されるまで細胞質内に存在する潜在性転写因子である。哺乳動物ＳＴＡＴ（す
なわち、ＳＴＡＴ１、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００９３３０またはＮＰ＿６４４６
７１；ＳＴＡＴ２、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００５４１０またはＮＰ＿９３８１４
６；ＳＴＡＴ３、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００３１４１、ＮＰ＿６４４８０５、ま
たはＮＰ＿９９８８２７；ＳＴＡＴ４、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００１２３０７６
４またはＮＰ＿００３１４２；ＳＴＡＴ５Ａ、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００１２７
５６４７、ＮＰ＿００１２７５６４８、またはＮＰ＿００１２７５６４９；ＳＴＡＴ５Ｂ
、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿０３６５８０；およびＳＴＡＴ６、ＧＥＮＢＡＮＫ受託
番号ＮＰ＿００１１７１５４９、ＮＰ＿００１１７１５５０、ＮＰ＿００１１７１５５１
、またはＮＰ＿００１１７１５５２）は、ＪＡＫによってリン酸化されるＣ末端近くに保
存されたチロシン残基を持つ。このホスホチロシンが、保存されたＳＨ２ドメインとの相
互作用を通したＳＴＡＴの二量体化を可能にする。リン酸化したＳＴＡＴは核に進入し、
特異的な制御配列に結合して、標的遺伝子の転写を活性化または抑制する。したがって、
ＪＡＫ／ＳＴＡＴカスケードは、細胞外シグナルを転写応答に翻訳するための直接的な機
構を提供する。
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路は、細胞周期を制
御する上で重要な細胞内シグナル伝達経路である。ＥＧＦＲのリガンド結合活性化は、Ｐ
Ｉ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール４，５－二リン酸３－キナーゼ、例えば、クラス１
酵素（ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩ
Ｋ３Ｒ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ５、およびＰＩＫ３Ｒ６など）、ク
ラス２酵素（ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、およびＰＩＫ３Ｃ２Ｇなど）、ならびに
クラス３酵素（ＰＩＫ３Ｃ３））の活性化をもたらす。その後、ＰＩ３Ｋは、Ａｋｔ（す
なわち、ＡＫＴ１、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３１７４９；ＡＫＴ２、ＵｎｉＰｒｏｔ受
託番号Ｐ３１７５１；およびＡＫＴ３、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｙ２４３を含む、タ
ンパク質キナーゼＢまたはＰＫＢ）をリン酸化する。その後、ＰＩＫ３は、ｍＴＯＲ複合
体、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２（これらの各々が細胞成長に関与する）を活性化す
る。ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ調節関連タンパク質、ＧβＬ（ＳＥＣ１３タンパク質８を有する
哺乳動物致死）、およびドメイン含有ｍＴＯＲ相互作用タンパク質（ＤＥＰＴＯＲ）で構
成されるｍＴＯＲＣ１は、ストレス中の細胞成長および異化プロセスを促進するための成
長因子、栄養素、およびエネルギーの利用可能性を示す複数のシグナルを統一する。活性
ｍＴＯＲＣ１は、４Ｅ－ＢＰ１およびｐ７０ Ｓ６キナーゼなどの下流標的のリン酸化に
よるｍＲＮＡの翻訳、Ａｔｇ１３およびＵＬＫ１を通したオートファジーの抑制、リボソ
ーム生合成、ならびにミトコンドリア活性または脂肪生成の増加をもたらす転写の活性化
を含む、多数の下流生物学的効果を発揮する。ｍＴＯＲ、ラパマイシン非感受性ｍＴＯＲ
コンパニオン、ＧβＬ、Ｓｉｎ１、ＰＲＲ５／Ｐｒｏｔｏｒ－１、およびＤＥＰＴＯＲで
構成されるｍＴＯＲＣ２は、Ａｋｔの活性化を通して細胞生存を促進する。ｍＴＯＲＣ２
は、細胞骨格の動態、イオン輸送、ならびにＰＫＣαの活性化およびＳＧＫ１のリン酸化
による成長を制御する。
ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫ経路。Ｎｃｋ（チロシンキナーゼアダプタータンパク質１の非
触媒領域、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００１１７７７２５またはＮＰ＿００１２７８
９２８）は、そのＳＨ２ドメインを通して活性化ＥＧＦＲに結合することが知られている
。Ｎｃｋは、ＰＡＫ１の第１のＮ末端ポリプロリンドメインおよびＮｃｋのＳＨ３ドメイ
ンを通してＰＡＫ１（ｐ２１／ＣＤＣ４２／Ｒａｃ１活性化キナーゼ－１、ＧＥＮＢＡＮ
Ｋ受託番号ＮＰ＿００１１２２０９２またはＮＰ＿００２５６７）と会合する。Ｎｃｋは
ＰＡＫを活性化し、これがその後、ＭＥＫＫ１（ＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ－１、
ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００５９１２）およびＭＫＫ４／７（ＭＡＰキナーゼキナ
ーゼ－４／７、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿１２６８３６４、ＮＰ＿００３００１、Ｎ
Ｐ＿００１２８４４８４、またはＮＰ＿００１２８４４８５）を介してＪＮＫ（ｃ－Ｊｕ
ｎキナーゼ）を活性化する。活性化したＪＮＫは核に進入し、ｃ－Ｆｏｓおよびｃ－Ｊｕ
ｎなどの転写因子のリン酸化を引き起こす。
ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣ経路。ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、ＥＧＦＲ活性化を、二
次メッセンジャーの生成およびカルシウム代謝と結び付ける。ＥＧＦＲは、ＰＬＣ－γ１
（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００２６５１またはＮＰ＿８７７９６３）を動員および
リン酸化し、これがその後、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２からジアシルグリセロール（Ｄ
ＡＧ）およびイノシトール－１，４，５－三リン酸（ＩＰ３）を生成する。ＤＡＧは、従
来のアイソフォームα、β、およびγ、ならびにＰＫＣ－εおよびＰＫＣ－θを含む、タ
ンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の多くのアイソフォームを活性化する。ＰＫＣ－α、ＰＫ
Ｃ－β、ＰＫＣ－γ、およびＰＫＣ－εは、ｃ－Ｒａｆ－１をリン酸化および活性化し、
それによりＨＲａｓ／ＭＥＫ１およびＭＥＫ２／ＥＲＫ１／２キナーゼカスケードを増幅
する。ＰＫＣ－θは、核内因子ＮＦ－カッパ－Ｂ阻害剤キナーゼベータ（ＩＫＫ－ベータ
）を活性化し、核内因子ＮＦ－カッパ－Ｂ（ＮＦ－ｋＢ）の活性化をもたらす。
細胞周期関連タンパク質キナーゼ。ＥＧＦＲの下流にあるかまたはそれと相互作用する
タンパク質キナーゼは、真核生物の細胞周期の制御において中心的な役割を果たす。より
具体的には、これらのタンパク質キナーゼは、シグナル伝達、染色体凝縮、中心体成熟、
紡錘体形成、紡錘体配向、減数***成熟、および細胞質***に関与する。したがって、「
細胞周期関連タンパク質キナーゼ」は、細胞周期進行、細胞***、細胞常食、および細胞
周期機構のうちの１つ以上を制御する、ＥＧＦＲの下流にあるかまたはそれと相互作用す
るキナーゼを指す。特定の実施形態では、本発明の細胞周期関連タンパク質キナーゼは、
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、オーロラキナーゼ、（本明細書に考察されるような）Ｂ－ｒａｆ、ま
たは血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）である。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕキナーゼ。Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、染色体１７ｑ２１－２２上に位置す
るｅｒｂＢ２癌遺伝子によってコードされる、１８５ｋＤａの膜貫通タンパク質（ＧＥＮ
ＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００１００５８６２、ＮＰ＿００１２７６８６５、ＮＰ＿００１
２７６８６６、ＮＰ＿００１２７６８６７、またはＮＰ＿００４４３９）である。細胞表
面でのＨｅｒ２／ｎｅｕの正常な発現は、細胞成長および上皮細胞生存の制御にとって必
須である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの天然リガンドは特定されていない一方で、Ｈｅｒ２／ｎｅ
ｕは、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ３と強力なヘテロ二量体を形成する好ましい二量体化パート
ナーであることが知られている（Ｌｅｎｆｅｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢ
ＯＪ．１７：３３８５－９７）。
オーロラキナーゼ。オーロラキナーゼは、有糸***を通した忠実な移行に重要な、高度
に保存されたセリン／スレオニンキナーゼのファミリーである（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，ｅｔ
ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯＪ．１７：３０５２－６５、Ｃａｒｍｅｎａ＆Ｅａｒｎｓ
ｈａｗ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：８４２－５４、
Ｇｉｅｔ＆Ｐｒｉｇｅｎｔ（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１２：３５９１－６０
１）。オーロラＡの遺伝子は、異なるヒト癌において増幅されることが見出されている領
域である、染色体領域２０ｑ１３．２に位置する。オーロラＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号
ＮＰ＿００１３１０２３２、ＮＰ＿００１３１０２３３、ＮＰ＿００１３１０２３４、Ｎ
Ｐ＿００３５９１、またはＮＰ＿９４０８３５）は、中心体成熟、紡錘体形成、減数***
成熟、および中期Ｉ紡錘体配向において重要な役割を果たす（Ｃａｒｍｅｎａ＆Ｅａｒｎ
ｓｈａｗ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：８４２－５４
）。オーロラＡの機能は、分解、リン酸化、および脱リン酸化によって制御され、そのキ
ナーゼ活性は、活性化ループにおけるスレオニン２８８（Ｔｈｒ２８８）のリン酸化に依
存する。オーロラＡの選択的阻害は、Ｔｈｒ２８８でのオーロラＡの自己リン酸化の阻害
、単極紡錘体、およびＧ２－Ｍ停止をもたらす（Ｇｉｒｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００
６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１９：３６６４－７５、Ｃａｒｐｉｎｅｌｌｉ＆Ｍｏｌｌ
（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ１２：６９－８０）。
オーロラＢ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００１２４３７６３、ＮＰ＿００１２７１４
５５、ＮＰ＿００１３００８７９、ＮＰ＿００１３００８８０、またはＮＰ＿００１３０
０８８１）遺伝子は、染色体領域１７ｐ１３．１に位置し、このキナーゼは、３つの非酵
素サブユニット、つまり内部セントロメアタンパク質（ＩＮＣＥＮＰ）、サバイビン、お
よびボレアリンとともに、染色体パッセンジャー複合体（ＣＰＣ）の一部を形成する（Ｖ
ａｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７３：８３３－７）。
高度に動的なＣＰＣは、染色体凝縮、染色体－微小管結合エラーの修正を通した有糸***
紡錘体上の染色体配向、および紡錘体形成チェックポイント（ＳＡＣ）だけでなく、細胞
質***の最終段階にとっても重要である（Ｓａｍｐａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃ
ｅｌｌ１１８：１８７－２０、Ｔｅｒａｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯＪ．１
７：６６７－７６、Ｃａｒｍｅｎａ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：７８９－８０３、Ｔａｎｅｎｂａｕｍ，ｅｔ ａｌ．（２
０１１）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２１：１３５６－６）。オーロラＣ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託
番号ＮＰ＿００１０１５８７８、ＮＰ＿００１０１５８７９、またはＮＰ＿００３１５１
）発現は、精巣、甲状腺、および胎盤内で、ならびに減数***配偶子において報告されて
いる（Ｕｌｉｓｓｅ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１９：２
７５－８２、Ｂｅｒｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５３：４０
６－９、Ｋｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７
３３４－４０、Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ２１：
２３７１－８３）。さらに、ＳＴＡＴ５に関連する核ＥＧＦＲは、オーロラＡに結合し、
その遺伝子発現を増加させることが示されている（Ｈｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００８）
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６（１３）：４３３７－５１）。オーロラＣの過剰発
現は、細胞内の中心体増幅および多核化をもたらす異常な細胞***を誘導することが示唆
されている。
ＰＤＧＦＲキナーゼ。ＰＤＧＦＲは、脊椎動物の様々な組織内で細胞増殖、分化、およ
び生存の制御に関与する。活性化ＰＤＧＦＲは、それ自体および他のタンパク質をリン酸
化し、それにより遊走および増殖などの細胞応答を引き起こす細胞内シグナル伝達経路に
関与する。ＰＤＧＦＲα（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ１６２３４）およびＰＤＧＦＲ
β（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００２６００）は、胎生期１２～１４日目に急速に成
長する耳胞内で高度に発現され、その後は発現が弱くなる（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．（２０
０４）Ａｃｔａ Ｏｔｏ－Ｌａｒｙｎｇ．１２４：５５８－６２）。この分析に基づいて
、発生中の蝸牛有毛細胞の増殖にはＰＤＧＦシグナル伝達の統合性が必要とされることが
示唆された（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｃｔａ Ｏｔｏ－Ｌａｒｙｎｇ．１２
４：５５８－６２）。加えて、以前の研究は、新生仔マウスの内耳における血管および間
葉区画の栄養摂取性にとって、ならびに間接的に感覚上皮の生存にとって、ＰＤＧＦシグ
ナル伝達が必要とされることを示唆している（Ｈａｙａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００８
）Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．２４５：７３－８１）。注目すべきことに、ＰＤＧＦＲβとＥＧＦ
Ｒとの間のヘテロ二量体化および掛け合い応答は、ＰＤＧＦ刺激細胞遊走におけるＥＧＦ
Ｒトランス活性化の役割を示している（Ｓａｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１（１９）：６３８７－９４）。
ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、ＥＧＦＲタンパク
質、またはＥＧＦＲと相互作用するかもしくはその下流経路にあるタンパク質（例えば、
Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍ
ＴＯＲ（ｍＴＯＲ複合体のタンパク質を含む）、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫ
Ｃ、または細胞周期関連タンパク質キナーゼ（例えば、Ｈｅｒ－２、オーロラキナーゼ、
Ｂ－Ｒａｆ、もしくはＰＤＧＦＲ））の発現または活性を低減、遮断、または低下させる
いずれかの分子を指すことが意図される。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤はまた、ＥＧＦ
、ＴＧＦ－α、ＨＢ－ＥＧＦ、ＡＲ、ＢＴＣ、ＥＰＲ、またはエピジェンなどのＥＧＦＲ
リガンドの発現または活性を遮断する阻害剤も示す。特定の実施形態では、ＥＧＦＲシグ
ナル伝達の阻害剤は、ＥＧＦＲ、ＰＬＣ、ＳＴＡＴ３、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、Ｈ
ｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ、またはＰＤＧＦＲの発現または活性を阻害ま
たは低減する。
本発明の阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質（すなわち、タンパク質の転写も
しくは翻訳）の発現を選択的に低下もしくは遮断し、ＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質の
活性（すなわち、リガンドへの結合、チロシンキナーゼ活性、リン酸化、タンパク質間相
互作用、および／もしくは下流シグナル伝達）を低下もしくは遮断し、ＥＧＦＲシグナル
伝達タンパク質の生物学的効果（複数可）を低下もしくは遮断し、かつ／またはＥＧＦＲ
シグナル伝達タンパク質の半減期もしくは細胞内局在（膜対細胞質もしくは核の局在、内
部移行、および再利用）を修飾する。具体的には、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、以
下、転写もしくは翻訳、リガンド結合、リン酸化、多量体化、チロシンキナーゼ活性、内
部移行、および／または核への転位のうちの１つ以上を選択的に低下または遮断する活性
薬剤である。
理想的には、ＥＧＦＲシグナル伝達は、正常の生理学的レベルと比較して、ＥＧＦＲシ
グナル伝達阻害剤の阻害剤によって完全に遮断されるか、または少なくとも１０％、少な
くとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６
０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なく
とも９８％、少なくとも９８，５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２５％、少な
くとも９９．５％、もしくは少なくとも９９．７５％低減される。
本発明のＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、典型的には１ｐＭ～１００μΜの範囲内の
最大半量（５０％）阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。好ましくは、ＥＧＦＲシグナル伝達
の阻害剤は、１０μΜ未満、５μΜ未満、１μΜ未満、または１００ｎＭ未満のＩＣ５０
値を有する。さらに、いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、対象
となるＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質のうちの１つ以上に対して特異的／選択的であり
、かつ他の非ＥＧＦＲ経路タンパク質を阻害しないか、またはそれらを阻害する程度が実
質的により少ない。この点では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が、ＥＧＦＲシグナル伝
達の選択的阻害剤であることが好ましい。好ましくは、選択性は、１つ、２つ、３つ、ま
たは４つのＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質に対するものであり、かつ他の非ＥＧＦＲ経
路タンパク質を阻害しないか、またはそれらを阻害する程度が実質的により少ない。例示
として、阻害剤は二重ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２阻害剤であってもよく、これらは両方と
もＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質である。阻害剤の選択性を評価するための方法は、当
該技術分野において既知であり、ＩＣ５０の決定、阻害剤の結合親和性（すなわち、Ｋｉ
）、および／または別のタンパク質（比較タンパク質）と比較した対象となるＥＧＦＲシ
グナル伝達タンパク質の阻害剤の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を含むがこれらに限定さ
れない、任意の従来のアッセイに基づくことができる。特定の実施形態では、ＥＧＦＲシ
グナル伝達の選択的阻害剤は、比較タンパク質に対する対応するＩＣ５０値よりも少なく
とも２倍、またはより望ましくは少なくとも３倍、４倍、５倍、もしくは６倍低い、対象
となるＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質に対するＩＣ５０値を有する阻害剤である。最も
望ましくは、ＥＧＦＲシグナル伝達の選択的阻害剤は、比較タンパク質に対するＩＣ５０
値よりも少なくとも１桁または少なくとも２桁低い、ＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質に
対するＩＣ５０値を有する。
本発明の阻害剤は、阻害性ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉ
ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）；ｍＲＮＡ蓄積もしくは輸送率の改変または転写
後制御の改変の媒介などによって、スプライシングもしくは３’プロセシング（例えば、
ポリアデニル化）、または細胞内の別の遺伝子の発現のレベルに影響を与えるタンパク質
（すなわち、遺伝子発現が転写開始からプロセスタンパク質の産生までの全てのステップ
を含むと広くみなされる場合）；抗体（断片または模倣物を含む）；ペプチド；小有機分
子；あるいはそれらの組み合わせなどの核酸系阻害剤であり得る。
ｓｉＲＮＡという用語は、標的遺伝子の発現を低減するのに活性である二本鎖ＲＮＡま
たはＲＮＡおよびＤＮＡ種を指す。これらの分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」、「短干渉Ｒ
ＮＡ」、または「サイレンシングＲＮＡ」として様々に知られている。ｓｉＲＮＡ鎖は、
通常２０～２５ヌクレオチド長であるが、本明細書で使用される場合、インビボで切断に
供されて活性種を形成するより大きな前駆体分子が、この用語の範囲内にある。
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ分子」または「ｍｉＲＮＡ」は、動物のゲノ
ムによってコードされるか、または動物のゲノムによってコードされるものに対応する配
列で合成的に生成される、典型的には約２０～２５ヌクレオチド長の小ＲＮＡ分子である
。本明細書で使用される場合、ｍｉＲＮＡ分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよ
い。
阻害剤が、例えば、阻害性ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質である場合、そのよう
な阻害剤をコードする核酸分子は、無調関連因子をコードする同じ核酸分子によって担持
されても、同じ発現ベクターまたは異なる発現ベクターの一部に存在する別個の核酸分子
であってもよい。阻害性ＲＮＡ分子は、本明細書に開示される核酸配列に基づいて容易に
調製することができる。あるいは、ｓｉＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子は、Ｄｈａｒｍａ
ｃｏｎ（例えば、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴプラスｓｉＲＮＡ ＳＭＡＲＴプールを参照された
い）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、またはＺｙａｇｅｎなどの商業的供給源から得ることがで
きる。タンパク質の発現の低下は、ドットブロット、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ、ま
たはウエスタンブロット分析などの従来の技術を使用して測定することができる。
ＥＧＦＲ阻害剤。ＥＧＦＲ自体の発現を選択的に低下または遮断するＥＧＦＲ阻害剤に
は、ＥＧＦＲアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ分子が含まれるが、これらに
限定されない。ＥＧＦＲの発現を低減する例示的なアンチセンスおよびｓｉＲＮＡは、例
えば、ＵＳ２０１１／００４６０６７およびＫａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）： ５３０－８に開示されている。ＥＧＦＲの
発現を低減する例示的なｍｉＲＮＡは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込
まれる、ＵＳ８，６７３，８７２に開示されている。
ＥＧＦＲ阻害剤はまた、ＥＧＦＲに特異的に結合し、例えば、リガンド結合、活性化、
リン酸化、またはタンパク質間相互作用の遮断によってその活性をアンタゴナイズする、
抗体、抗体断片、または抗体模倣物であってもよい。セツキシマブ（ＩｇＧ１）およびパ
ニツムマブ（ＩｇＧ２）は、ＥＧＦＲのモノクローナル抗体阻害剤の例である。他のアン
タゴニストモノクローナル抗体には、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズムタブ、ＩＣ
Ｒ６２、およびｍＡｂ８０６が含まれる。ＵＳ６，５０６，８８３、ＵＳ６，２３５，８
８３、ＵＳ５，８９１，９９６、ＵＳ４，９４３，５３３、ＷＯ２００４／０５６８４７
、ＷＯ２００２／０９２７７１、ＷＯ２００２／６６０５８、およびＷＯ１９９５／２０
０４５を参照されたい。そのような抗体は、細胞外リガンド結合ドメインを遮断し、それ
によりチロシンキナーゼ活性化を遮断する。
ＥＧＦＲ多量体化および活性化を制御するＥＧＦＲのペプチド阻害剤もまた、本発明に
おいて有用である。ＥＧＦＲの例示的なペプチド阻害剤は、ＥＧＦＲ由来の以下の膜近傍
配列に基づくことができ、ＬＬＬＷＡＬＧＩＧＬＦＭＲＲＲＨＩＶＲＫＲＴＬＲＲＬＬＱ
ＥＲＥＬＶＥＰＬＴＰＳ（配列番号２）、任意で細胞への送達を促進するためのタンパク
質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）などの細胞透過性構成要素を含んでもよい。ＵＳ２０１６
／０３１１８８４を参照されたい。
またさらに、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する小分子で
あってもよい。キナーゼ活性なしでは、ＥＧＦＲはそれ自体を活性化することができず、
この活性化は下流アダプタータンパク質の結合の必要条件である。ＥＧＦＲの小分子阻害
剤の例には、エルロチニブ（ＣＡＳ１８３３２１－７４－６）、ゲフィチニブ（ＣＡＳ１
８４４７５－３５－２）、ラパチニブ（ＣＡＳ２３１２７７－９２－２、二重ＥＧＦＲお
よびＥＲＢＢ２阻害剤）、ネラチニブ（ＣＡＳ６９８３８７－０９－６）、カネルチニブ
（ＣＡＳ２６７２４３－２８－７）、バンデタニブ（ＣＡＳ４４３９１３－７３－３）、
アファチニブ（ＣＡＳ４３９０８１－１８－２）、ＡＧ１４７８（ＣＡＳ１５３４３６－
５３－４）、ＴＡＫ－２８５（ＣＡＳ８７１０２６－４４－７、二重ＨＥＲ２およびＥＧ
ＦＲ阻害剤）、ＡＲＲＹ３３４５４３（ＣＡＳ８４５２７２－２１－１、二重ＥＧＦＲリ
ン酸化阻害剤）、ダコミチニブ（ＣＡＳ１１１０８１３－３１－４、ＥＧＦＲおよびＥＲ
ＢＢ２阻害剤）、ＡＺＤ３７５９（ＣＡＳ１６２６３８７－８０－１）、ＮＴ１１３（Ｃ
ＡＳ１３９８８３３－５６－１、汎ＥＲＢＢ阻害剤）、ＯＳＩ－４２０（デスメチルエル
ロチニブ、ＣＡＳ１８３３２１－８６－０、ＥＧＦＲ阻害剤）、ＡＺＤ８９３１（ＣＡＳ
８４８９４２－６１－９、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３阻害剤）、ＡＥＥ７８８
（ＣＡＳ４９７８３９－６２－９、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＶＥＧＦＲ１／２阻害剤
）、ペリチニブ（ＥＫＢ－５６９、ＣＡＳ２５７９３３－８２－７、汎ＥｒｂＢ阻害剤）
、ＣＵＤＣ－１０１（ＣＡＳ１０１２０５４－５９－９、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨ
ＤＡＣ阻害剤）、ＸＬ６４７（ＣＡＳ６５１０３１－０１－５、二重ＨＥＲ２およびＥＧ
ＦＲ阻害剤）、ＢＭＳ－５９９６２６（ＣＡＳ７１４９７１－０９－２、二重ＥＧＦＲお
よびＨＥＲ２阻害剤）、ＰＫＣ４１２（ＣＡＳ１２０６８５－１１－２、ＥＧＦＲ、ＰＫ
Ｃ、サイクリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼおよびＳ６キナーゼ阻害剤）、ＢＩＢ
Ｘ１３８２（ＣＡＳ１９６６１２－９３－８、ＥＧＦＲ阻害剤）、ならびにＡＰ２６１１
３（ＣＡＳ１１９７９５３－５４－０、ＡＬＫおよびＥＧＦＲ阻害剤）、ならびにそれら
の誘導体および組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態で
は、ＥＧＦＲ阻害剤は、ペリチニブではない。
Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ阻害剤。Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ
／ＭＡＰＫの発現を選択的に低下または遮断するこの経路の阻害剤には、アンチセンス、
ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。例示として、
ＭＥＫ１のアンチセンス阻害は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６
，０９６，５４３に開示されている。
Ｒａｓ阻害剤の例には、Ｒ１１５７７７（ＣＡＳ１９２１８５－７２－１）、ＢＭＳ－
２１４６６２（ＣＡＳ１９５９８７－４１－８）、ＳＣＨ６６３３６（ＣＡＳ１９３２７
５－８４－２）、ＦＴＩ－２７７（ＣＡＳ１２１７４４７－０６－７）、マニュマイシン
Ａ（ＣＡＳ５２６６５－７４－４）、ＦＴＩ－２７６（ＣＡＳ１７０００６－７２－１）
、ＲａｓＣＡＡＸ（ペプチド模倣物）、Ｌ－７４４，８３２（ＣＡＳ１１７７８０６－１
１－９）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれるが、これらに限定されな
い。
本発明において有用であるＲａｆ阻害剤には、Ｂａｙ４３－９００６（ソラフェニブ、
ＣＡＳ２８４４６１－７３－０、Ｂ－ＲａｆおよびＣ－Ｒａｆの選択的阻害剤）、ベムラ
フェニブ（ＣＡＳ９１８５０４－６５－１、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤）、ダブラフェニブ（ＣＡ
Ｓ１１９５７６４－４５－７、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、ＵＳ７，９９４，１８５およびＵＳ８
，４１５，３４５もまた参照されたい）、ＬＹ３００９１２０（ＣＡＳ１４５４６８２－
７２－４、汎Ｒａｆ阻害剤）、ＧＷ５０７４（ＣＡＳ２２０９０４－８３－６、Ｃ－Ｒａ
ｆ－１阻害剤）、ＺＭ３３６３７２（ＣＡＳ２０８２６０－２９－１、Ｒａｆ－１阻害剤
）、２－ブロモアルジシン（ＣＡＳ９６５６２－９６－８、ＲＡＦ／ＭＥＫ－１／ＭＡＰ
Ｋ経路阻害剤）、Ｌ－７７９，４５０（ＣＡＳ３０３７２７－３１－３）、ＡＺ６２８（
ＣＡＳ８７８７３９－０６－１、Ｒａｆ－１阻害剤）、ＲＡＦ２６５（ＣＡＳ９２７８８
０－９０－８、Ｂ－ＲａｆおよびＶＥＧＦＲ－２阻害剤）、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８
１８、ＣＡＳ１２６９４４０－１７－６、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤）、ならびにそれらの誘導体
および組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
ＭＥＫ阻害剤には、ＳＬ－３２７（ＣＡＳ３０５３５０－８７－２、ＭＥＫ１およびＭ
ＥＫ２の阻害剤）、ＰＤ１８４，３５２（ＣＡＳ２１２６３１－７９－３）、２－ブロモ
アルジシン（ＣＡＳ９６５６２－９６－８、Ｒａｆ／ＭＥＫ－１／ＭＡＰＫ経路阻害剤）
、ＰＤ１９８３０６（ＣＡＳ２１２６３１－６１－３、ＭＥＫ１／２の非ＡＴＰ競合的阻
害剤）、ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ３９１２１０－１０－９、ＭＥＫの阻害剤およびＥ
ＲＫリン酸化の抑制剤）、ＭＥＫ阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ６２３１６３－５２－０）、ＰＤ１
８４１６１（ＣＡＳ２１２６３１－６７－９、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２の選択的阻害剤）
、Ｕ－０１２６（ＣＡＳ１０９５１１－５８－２、ＭＥＫ１／２の阻害剤）、ＰＤ９８０
５９（ＣＡＳ１６７８６９－２１－８、ＭＥＫ１の選択的阻害剤）、ＡＳ７０３０２６（
ＣＡＳ１２３６６９９－９２－５、ＭＥＫ１／２の阻害剤）、ＢＡＹ８６９７６６（ＣＡ
Ｓ９２３０３２－３７－５、ＭＥＫ－１およびＭＥＫ－２の非ＡＴＰ競合的阻害剤）、Ｐ
Ｄ３１８０８８（ＣＡＳ３９１２１０－００－７、ＭＥＫ１／２の阻害剤）、セルメチニ
ブ（ＣＡＳ６０６１４３－５２－６、ＭＥＫ－１非ＡＴＰ競合的阻害剤）、ＴＡＫ－７３
３（ＣＡＳ１０３５５５５－６３－５、ＭＥＫのアロステリック阻害剤）、トラメチニブ
（ＣＡＳ８７１７００－１７－３、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２のアロステリック阻害剤）、なら
びにそれらの誘導体および組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。追加のＭＥ
Ｋ阻害剤については、ＷＯ１９９８／０３７８８１、ＷＯ１９９９／９０１４２６、ＷＯ
２０００／０４１５０５、ＷＯ２０００／０４１９９４、ＷＯ２０００／０４２００２、
ＷＯ２０００／０４２００３、ＷＯ２０００／０４２０２２、ＷＯ２０００／０４２０２
９、ＷＯ２００１／０６８６１９、およびＷＯ２００２／０３６５７０もまた参照された
い。
ＥＲＫ阻害剤には、例えば、ＳＣＨ７７２９８４（ＣＡＳ９４２１８３－８００－４、
ＥＲＫ１／２阻害剤）、ＤＥＬ－２２３７９（ＣＡＳ１８１２２３－８０－３、ＥＲＫ二
量体化阻害剤）、ＶＸ－ｌｌｅ（ＣＡＳ８９６７２０－２０－０、ＥＲＫ２阻害剤）、プ
ルリポチン（ＳＣ１、ＣＡＳ８３９７０７－３７－８、二重ＥＲＫ１およびＲａｓＧＡＰ
阻害剤）、ウリキセルチニブ（ＢＶＤ－５２３、ＶＲＴ７５２２７１、ＣＡＳ８６９８８
６－６７－９、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２阻害剤）、ＦＲ１８０２０４（ＣＡＳ８６５３６２－
７４－９、ＡＴＰ競合的ＥＲＫ阻害剤）、ＧＤＣ－０９９４（ＣＡＳ１４５３８４８－２
６－４、ＥＲＫ１／２阻害剤）、ＫＯ－９４７（Ｋｕｒａ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ＥＲＫ１
／２阻害剤）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれる。追加のＥＲＫ阻害
剤については、ＪＰ２００５－３３０２６５もまた参照されたい。
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤。ＪＡＫまたはＳＴＡＴの発現を選択的に低下または遮断する
阻害剤には、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ分子が含まれるが、これらに
限定されない。例示として、ＳＴＡＴ－２、ＳＴＡＴ－３、ＳＴＡＴ－４、ＳＴＡＴ－５
、およびＳＴＡＴ－６のアンチセンス阻害はそれぞれ、ＵＳ２００４／０１０１８５３、
ＵＳ６，１５９，６９４、ＵＳ６，４７９，４６５、ＵＳ８，７２２，８７３、およびＷ
Ｏ１９９８／０４０４７８に開示されている。同様に、ＳＴＡＴ－１およびＳＴＡＴ－２
の発現を低減するためのｓｉＲＮＡは、ＵＳ９，１９８，９１１に開示されている。ＳＴ
ＡＴ－３ ｓｉＲＮＡは、ＵＳ２０１０／０２９８４０９に記載されており、ＳＴＡＴ－
５ ｓｉＲＮＡは、ＷＯ２００９／０３９１９９に記載されており、ＳＴＡＴ－６ ｓｉ
ＲＮＡは、ＵＳ７，５６６，７００に記載されている。Ｊａｋ１およびＪａｋ３の発現を
阻害する上で有用であるＳｉＲＮＡ分子は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ
る、ＵＳ９，１９８，９１１に開示されている。
ＳＴＡＴ阻害剤の非限定的な例には、ＷＰ－１０３４（ＣＡＳ８５７０６４－４２－７
、Ｊａｋ－Ｓｔａｔ阻害剤）、フルダラビン（ＣＡＳ２１６７９－１４－１、ＳＴＡＴ１
阻害剤）、Ｓ３Ｉ－２０１（ＣＡＳ５０１９１９－５９－１、ＳＴＡＴ３ ＤＮＡ結合活
性の阻害剤）、Ｓｔａｔｔｉｃ（ＣＡＳ１９９８３－４４－９、ＳＴＡＴ３阻害剤）、Ａ
ＰＴＳＴＡＴ３－９Ｒ（ＳＴＡＴ結合ペプチド）、ＳＴＡ－２１（ＣＡＳ２８８８２－５
３－３、ＳＴＡＴ３阻害剤）、ＳＨ－４－５４（ＣＡＳ１４５６６３２－４０－８）、ナ
パブカシン（ＣＡＳ８３２８０－６５－３、ＳＴＡＴ３阻害剤）、クリプトタンシノン（
ＣＡＳ３５８２５－５７－１、ＳＴＡＴ３阻害剤）、ニクロサミド（ＣＡＳ５０－６５－
７、ＳＴＡＴ３阻害剤）、ＮＳＣ７４８５９（ＣＡＳ５０１９１９－５９－１、ＳＴＡＴ
３阻害剤）、ＨＯ－３８６７（ＣＡＳ１１７２１３３－２８－６、ＳＴＡＴ３阻害剤）、
ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
Ｊａｋ１／Ｊａｋ２阻害剤には、ＡＧ－４９０（ＣＡＳ１３３５５０－３０－８）、Ｃ
ＹＴ３８７（ＣＡＳ１０５６６３４－６８－４）、ＳＢ１５１８（パクリチニブ、ＣＡＳ
９３７２７２－７９－２）、ＬＹ３００９１０４（ＩＮＣＢ２８０５０、バリシチニブ、
ＣＡＳ１１８７５９４－０９－７）、ＴＧ１０１３４８（ＣＡＳ９３６０９１－２６－８
）、ＢＭＳ－９１１５４３（ＣＡＳ１２７１０２２－９０－２）、ＡＺＤ１４８０（ＣＡ
Ｓ９３５６６６－８８－９）、ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ０１８４２４、ＣＡＳ９４１６
７８－４９－５）、ＣＥＰ－７０１（ＣＡＳ１１１３５８－８８－４）、ＴＧ１０１３４
８（フェドラチニブ、ＣＡＳ９３６０９１－２６－８）、ＳＤ１００８（ＣＡＳ９６０２
０１－８１－４、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３阻害剤）、ＷＰ－１０６６（ＣＡＳ８５７０６４
－３８－１、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３阻害剤）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせ
が含まれるが、これらに限定されない。ＪＡＫ３阻害剤には、Ｊａｎｅｘ１（ＷＨＩ－Ｐ
１３１、ＣＡＳ２０２４７５－６０－３）、ＰＦ－９５６９８０（ＣＡＳ１２６２８３２
－７４－５）、ＷＨＩ－Ｐ１５４（ＣＡＳ２１１５５５－０４－３）、ＶＸ－５０９（デ
セルノチニブ、ＣＡＳ９４４８４２－５４－０）、ＪＡＫ３阻害剤ＩＶ（ＺＭ－３９９２
３、ＣＡＳ１０２１８６８－９２－７）、トファシチニブ（ＣＰ－６９０５５０、ＣＡＳ
５４０７３７－２９－９）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれるが、こ
れらに限定されない。
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ阻害剤。ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、またはｍＴＯＲの発現を選択
的に低下または遮断する阻害剤には、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ分子
が含まれるが、これらに限定されない。例示として、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、およびｍＴＯＲ
のｓｉＲＮＡ阻害はそれぞれ、例えば、ＵＳ２００５／０２７２６８２、ＵＳ２００８／
０１６１５４７、およびＵＳ９，０１２，６２２に開示されている。
ＰＩ３Ｋを阻害する上で有用である小分子には、ＳＦ１１０１（ＬＹ２９４００２、Ｃ
ＡＳ１５４４４７－３６－６）、ＢＫＭ１２０（ＣＡＳ９４４３９６－０７－０）、ＢＹ
Ｌ７１９（ＣＡＳ１２１７４８６－６１－７）、ＸＬ－１４７（ＣＡＳ９５６９５８－５
３－５）、ＺＳＴＫ－４７４（ＣＡＳ４７５１１０－９６－４）、ＰＸ－８６６（ＣＡＳ
５０２６３２－６６－８）、ＰＩ－１０３（ＣＡＳ３７１９３５－７４－９）、ならびに
それらの誘導体および組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例示的なＡＫＴ阻害剤には、例えば、ＡＺＤ５３６３（ＣＡＳ１１４３５３２－３９－
１）、ＧＤＣ－００６８（ＣＡＳ１００１２６４－８９－６、ＡＴＰ競合的汎Ａｋｔ阻害
剤）、ＭＫ－２２０６（ＣＡＳ１０３２３５０－１３－２）、ペリフォシン（ＣＡＳ１５
７７１６－５２－４）、ＰＢＩ－０５２０４（オレアンドリン、ＣＡＳ４６５－１６－７
）、ＧＳＫ２１４１７９５（ＣＡＳ１０４７６３４－６５－０）、およびＳＲ１３６６８
（ＣＡＳ６３７７７４－６１－９）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれ
る。追加のＡＫＴ阻害剤は、ＵＳ２０１０／０００９３９７、ＵＳ２００７／０１８５１
５２、ＵＳ６，９６０，５８４、ＵＳ７，０９８，２０８、ＵＳ７，２２３，７３８、Ｕ
Ｓ７，３０４，０６３、ＵＳ７，３７８，４０３、ＵＳ７，３９６，８３２、ＵＳ７，３
９９，７６４、ＵＳ７，４１４，０５５、ＵＳ７，５４４，６７７、ＵＳ７，５７６，２
０９、ＵＳ７，５７９，３５５、ＵＳ７，５８９，０６８、ＵＳ７，６３８，５３０、Ｕ
Ｓ７，６５５，６４９、ＵＳ７，７０５，０１４、ＵＳ７，７５０，１５１、ＵＳ７，９
４３，７３２、ＵＳ８，００３，６４３、ＵＳ８，００３，６５１、ＵＳ８，００８，３
１７、ＵＳ８，１６８，６５２、ＵＳ８，２６３，３５７、ＵＳ８，２７３，７８２、お
よびＵＳ８，３２４，２２１に記載されている。
例示的な二重ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害剤には、例えば、ＳＦ１１２６（ＣＡＳ９３６４
８７－６７－１）、ＢＥＺ２３５（ＣＡＳ９１５０１９－６５－７）、ＢＧＴ－２２６（
ＣＡＳ１２４５５３７－６８－１）、ＰＦ－０４６９１５０２（ＣＡＳ１０１３１０１－
３６－４）、ＧＮＥ－４７７（ＣＡＳ１０３２７５４－８１－６）、ＸＬ７６５（ＣＡＳ
１３４９７９６－３６－６）、ＧＤＣ－０９４１（ＣＡＳ９５７０５４－３０－７）、Ｇ
ＤＣ－０９８０（ＣＡＳ１０３２７５４－９３－０）、ＰＦ－０５２１２３８４（ＣＡＳ
１１９７１６０－７８－３）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれる。
ｍＴＯＲの阻害は、以下の阻害剤、例えば、ＯＳＩ－０２７（ＣＡＳ９３６８９０－９
８－１）、ＩＮＫ－１２８（ＣＡＳ１２２４８４４－３８－５）、ＡＺＤ－８０５５（Ｃ
ＡＳ１００９２９８－０９－２）、ＡＺＤ－２０１４（ＣＡＳ１００９２９８－５９－２
）、パロミド５２９（ＣＡＳ９１４９１３－８８－５）、Ｐｐ－２４２（ＣＡＳ１０９２
３５１－６７－１）、ＧＳＫ２１２６４５８（ＣＡＳ１０８６０６２－６６－９）、ＰＦ
－０４６９１５０２（ＣＡＳ１０１３１０１－３６－４）、ウォルトマンニン（ＣＡＳ１
９５４５－２６－７）、Ｋｕ－００６３７９４（ＣＡＳ９３８４４０－６４－３）、ＷＡ
Ｙ－６００（ＣＡＳ１０６２１５９－３５－６）、ＷＹＥ－６８７（ＣＡＳ１０６２１６
１－９０－３）、ＷＹＥ－３５４（ＣＡＳ１０６２１６９－５６－５）、ラパマイシン（
ＣＡＳ５３１２３－８８－９）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせのうちの１つ
以上を使用して達成することができる。ラパマイシン誘導体は、例えば、ＵＳ５，２５８
，３８９、ＵＳ５，１００，８８３、ＵＳ５，１１８，６７８、ＵＳ５，１５１，４１３
、ＵＳ５，２５６，７９０、ＵＳ５，１２０，８４２、ＵＳ２０１１／０１７８０７０、
ＷＯ１９９４／０９０１０、ＷＯ１９９２／０５１７９、ＷＯ１９９３／１１１３０、Ｗ
Ｏ１９９４／０２１３６、ＷＯ１９９４／０２４８５、ＷＯ１９９４／０２１３６、ＷＯ
１９９５／１６６９１、ＷＯ１９９６／４１８０７、ＷＯ１９９６／４１８０７、ＷＯ１
９９８／０２４４１、ＷＯ２００１／１４３８７、およびＷＯ１９９５／１４０２３にさ
らに記載されている。追加のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ阻害剤については、ＵＳ２０１
６／０２４４４２４もまた参照されたい。
ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫ阻害剤。ＮＣＫ、ＰＡＫ、またはＪＮＫの発現を選択的に低下
または遮断する阻害剤には、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ分子が含まれ
るが、これらに限定されない。例示として、Ｐａｋ１のｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、ＷＯ
２０１３／１３５７４５に開示されている。同様に、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ
３のｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、ＵＳ２０１５／０３６１１８４に開示されている。
ＰＡＫキナーゼの阻害剤は当該技術分野において既知であり、それらには、２－アミノ
ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン（ＷＯ２００９／０８６２０４、Ｗ
Ｏ２０１０／０７１８４６、ＷＯ２０１１／０４４５３５、ＷＯ２０１１／１５６６４６
、ＷＯ２０１１／１５６７８６、ＷＯ２０１１／１５６６４０、ＷＯ２０１１／１５６７
８０、ＷＯ２０１１／１５６７７５、およびＷＯ２０１１／０４４２６４に開示されるも
のなど）；１Ｈ－チエノ［３，２－ｃ］ピラゾール、３－アミノ－テトラヒドロピロール
［３，４－ｃ］ピラゾール、およびＮ４－（１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ピリミジン－
２，４－ジアミン（ＷＯ２００４／００７５０４、ＷＯ２００７／０２３３８２、ＷＯ２
００７／０７２１５３、およびＷＯ２００６／０７２８３１に開示されるものなど）；Ｎ
４－（１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ピリミジン－２，４－ジアミンのＮ２－二環式イン
ドリル、インダゾリル、およびベンズイミダゾリル誘導体（ＵＳ８，６３７，５３７に開
示されるものなど）；ＰＦ－３７５８３０９（ＣＡＳ８９８０４４－１５－０）；ＩＰＡ
－３（ＣＡＳ４２５２１－８２－４）；ＦＲＡＸ５９７（ＣＡＳ１２８６７３９－１９－
２）；ＦＲＡＸ４８６（ＣＡＳ１２３２０３０－３５－１）；ＦＲＡＸ１０３６（ＣＡＳ
１４３２９０８－０５－８）；ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれるが、
これらに限定されない。
ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、および／またはＪＮＫ３阻害剤の非限定的な例には、ＪＮＫ阻害
剤Ｖ（ＣＡＳ３４５９８７－１５－７）、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩ（ＴＡＴ－ＴＩ－ＪＩＰｉ
５３＿１６３、ＣＡＳ３０５３５０－８７－２）、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩＩ（ＣＡＳ８９４
８０４－０７－０）、ＪＮＫ－ＩＮ－７（ＣＡＳ１４０８０６４－７１－０）、ＪＮＫ阻
害剤ＩＸ（ＣＡＳ３１２９１７－１４－９）、ＪＮＫ阻害剤ＸＩ（ＣＡＳ２２０７－４４
－５）、ＪＮＫ阻害剤ＸＶＩ（ＣＡＳ１４１０８８０－２２－６）、ＡＥＧ３４８２（Ｃ
ＡＳ６３７３５－７１－７）、ドラマピモド（ＣＡＳ２８５９８３－４８－４、ｐ３８α
ＭＡＰＫおよびＪＮＫ２阻害剤）、ＣＣ－４０１（ＣＡＳ３９５１０４－３０－０）、
ＳＰ６００１２５（ＣＡＳ１２９－５６－６）、ＡＳ６０１２４５（ＣＡＳ３４５９８７
－１５－７）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれるが、これらに限定さ
れない。いくつかの実施形態では、阻害剤は、レフルノミドではない。
ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣ阻害剤。ＰＬＣまたはＰＫＣの発現を選択的に低下または遮断
する阻害剤には、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ分子が含まれるが、これ
らに限定されない。例示として、ＰＬＣのｓｉＲＮＡ阻害はＵＳ９，５４６，３６７に開
示されており、そのｓｉＲＮＡ分子は参照により本明細書に組み込まれる。
ＰＬＣγの結合および／または触媒活性の調節に使用するための抗ＰＬＣγ抗体もまた
、当該技術分野において既知である。抗ＰＬＣγ抗体の例は、例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ ａ
ｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．８：１７－２５およびＢｕｃｋｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．
（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４１８０７－１４に記載されている。
ＰＬＣの小分子阻害剤の例には、Ｄ６０９（ＣＡＳ８３３７３－６０－８）、エデルホ
シン（ＥＴ－１８－ＯＣＨ３、ＣＡＳ７７２８６－６６－９、二重ＰＬＣ／ＰＫＣ阻害剤
）、マノアリド（ＣＡＳ７５０８８－８０－１）、ＮＣＤＣ（ＣＡＳ１０５５６－８８－
４）、Ｕ－７３１２２（ＣＡＳ１１２６４８－６８－７）、ならびにそれらの誘導体およ
び組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ阻害剤。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現を選択的に低下または遮断する阻害
剤には、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定
されない。例示として、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、Ｆａｌｔｕｓ，
ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ６（６）：７８６－９５、Ｃｈｏｕｄｈ
ｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０８： ７１－７７に
開示されている。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕの活性の調節に使用するための抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体もまた、当該
技術分野において既知である。抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体の例には、トラスツズマブ（ＨＥ
ＲＣＥＰＴＩＮ、ＣＡＳ１８０２８８－６９－１）およびペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ
、ＣＡＳ３８０６１０－２７－５）が含まれるが、これらに限定されない。概説について
は、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９：１５１
９６－１５２１２を参照されたい。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕの小分子阻害剤の例には、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＰ、ＣＡＳ２３１
２７７－９２－２、二重ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２阻害剤）、アファチニブ（ＧＩＯＴＲＩＦ、
ＣＡＳ４３９０８１－１８－２、不可逆的汎阻害剤）、ＡＺＤ８９３１（ＣＡＳ８４８９
４２－６１－０、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３阻害剤）、ＡＳＴ－１３０６（ＣＡＳ
８９７３８３－６２－９、不可逆的ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２阻害剤）、ＡＥＥ－７８８（
ＣＡＳ４９７８３９－６２－０、二重ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２キナーゼ阻害剤）、ＣＩ－
１０３３（カネルチニブ、ＣＡＳ２８９４９９－４５－２、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２阻害
剤）、ＴＡＫ－１６５（ムブリチニブ、ＣＡＳ３６６０１７－０９－６、Ｈｅｒ２阻害剤
、ＵＳ６，７１６，８６３およびＵＳ７，００５，５２６を参照されたい）、ＣＰ－７２
４７１４（ＣＡＳ３８３４３２－３８－０、Ｈｅｒ２阻害剤）、ＣＵＤＣ－１０１（ＣＡ
Ｓ１０１２０５４－５９－９、不可逆的ＨＤＡＣ／ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２阻害剤）、ＴＡＫ
－２８５（ＣＡＳ８７１０２６－４４－７、二重ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２阻害剤）、ＡＣ－４
８０（ＢＭＳ－５９９６２６、ＣＡＳ７１４９７１－０９－２、可逆的ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ
２／ＨＥＲ４阻害剤）、ＰＦ２９９８０４またはＰＦ２９９（ダコミチニブ、ＣＡＳ１１
１０８１３－３１－４、不可逆的ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ４阻害剤）、ならびにＥＫ
Ｂ－５６９（ペリチニブ、ＣＡＳ２５７９３３－８２－７、二重ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２阻害
剤）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、阻害剤は、Ｈｅｒ２に対して選択的であり、かつ他のキナーゼに対
する活性をほとんどまたは全く呈しない。
オーロラキナーゼ阻害剤。オーロラキナーゼの発現を選択的に低下または遮断する阻害
剤には、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定
されない。例示として、オーロラキナーゼのｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、Ｔａｏ，ｅｔ
ａｌ．（２００７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９７（１２）： １６６４－１６７２、Ｕ
ｍｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．４６（４）： １４９８
－１５０６に開示されている。
オーロラキナーゼの小分子阻害剤の例には、ＳＮＳ３１４メシル酸（ＣＡＳ１１４６６
１８－４１－８、汎オーロラ阻害剤、ＵＳ２０１６／０２８７６０２、ＵＳ２０１５／０
３２９８２８、およびＵＳ２０１１／００１４１９１を参照されたい）、ＰＨＡ－６８０
６３２（ＣＡＳ３９８４９３－７９－３、汎オーロラ阻害剤）、ＶＥ－４６５（トザセル
チブ、ＶＸ－６８０またはＭＫ０４５７、ＣＡＳ６３９０８９－５４－６）、バラセルチ
ブ（ＡＺＤ１１５２、ＣＡＳ７２２５４４－５１－６、オーロラＢキナーゼ阻害剤）、ア
リセルチブ（ＭＬＮ８２３７、ＣＡＳ１０２８４８６－０１－２、オーロラＡキナーゼ阻
害剤）、ダヌセルチブ（ＰＨＡ－７３９３５８、ＣＡＳ８２７３１８－９７－８、汎オー
ロラ阻害剤）、ＰＦ－０３８１４７３５（ＣＡＳ９４２４８７－１６－３、二重オーロラ
Ａ／Ｂ阻害剤）、ＡＭＧ９００（ＣＡＳ９４５５９５－８０－２、汎オーロラ阻害剤）、
ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。特定の
実施形態では、阻害剤は、オーロラキナーゼに対して選択的であり、かつ他のキナーゼに
対する活性をほとんどまたは全く呈しない。
ＰＤＧＦＲ阻害剤。ＰＤＧＦＲの発現を選択的に低下または遮断する阻害剤には、アン
チセンス、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。例
示として、ＰＤＧＦＲのｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００８
）Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ．２８（１０）：１４４６－１４５７、Ｋａｕｌｆｕβ，ｅｔ ａ
ｌ．（２０１３）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ４（７）：１０３７－４９、Ｙｅｈ，ｅｔ ａ
ｌ．（２０１１）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １１：１３９に開示されている。
ＰＤＧＦＲの活性の調節に使用するための抗ＰＤＧＦＲ抗体もまた、当該技術分野にお
いて既知である。抗ＰＤＧＦＲ抗体の例には、ＩＭＣ－３Ｇ３（抗ＰＤＧＦＲα抗体、Ｅ
Ｐ２１００６１８）およびＩＭＣ－２Ｃ５（ＰＤＧＦＲβ抗体、Ｓｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．
（２００９）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ １１（６）：５９４－６０４）が含まれるが、これら
に限定されない。
ＰＤＧＦＲの小分子阻害剤の例には、Ｋｉ１１５０２（ＣＡＳ３４７１５５－７６－４
）、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ／ＳＴ５７１、ＣＡＳ２２０１２７－５７－１、ＰＤＧ
ＦＲα／ＢＣＲ－ＡＢＬ／ｃ－ｋｉｔ阻害剤）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４、ＣＡＳ９
４３３１９－７０－８、Ａｂ１／ＰＤＧＦＲα／ＶＥＧＦＲ２／ＦＧＦＲ１／Ｓｒｃ阻害
剤）、テラチニブ（ＣＡＳ３３２０１２－４０－５、ＶＥＧＦＲ／ｃ－Ｋｉｔ／ＰＤＧＦ
Ｒα阻害剤）、アムバチニブ（ＭＰ－４７０、ＣＡＳ８５０８７９－０９－３、ｃ－Ｋｉ
ｔ／ＰＤＧＦＲα／Ｆｌｔ３阻害剤）、クレノラニブ（ＣＰ－８６８５９６、ＣＡＳ６７
０２２０－８８－９、ＰＤＧＦＲα／βの選択的阻害剤、ＵＳ７，０７１，３３７、ＵＳ
７，１８３，４１４、ＵＳ２０１５／０２３８４７９、およびＵＳ２０１０／００１６３
５３を参照されたい）、アキシチニブ（ＣＡＳ３１９４６０－８５－０、ＶＥＧＦＲ１／
ＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ３／ＰＤＧＦＲβ／ｃ－Ｋｉｔ阻害剤）、ＣＰ－６７３４５１
（ＣＡＳ３４３７８７－２９－１、ＰＤＧＦＲα／βの阻害剤）、ニンテダニブ（ＢＩＢ
Ｆ１１２０、ＣＡＳ６５６２４７－１７－５、ＶＥＧＦＲ／ＦＧＦＲ／ＰＤＧＦＲα／β
阻害剤）、マシチニブ（ＣＡＳ７９０２９９－７９－５、Ｋｉｔ／ＰＤＧＦＲα／β阻害
剤）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８、ＣＡＳ５５７７９５－１９－４、Ｖ
ＥＧＦＲ２／ＰＤＧＦＲβ阻害剤）、ＴＳＵ－６８（ＳＵ６６６８またはオランチニブ、
ＣＡＳ２５２９１６－２９－３）、リニファニブ（ＡＢＴ－８６９、ＣＡＳ７９６９６７
－１６－３、ＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲ阻害剤）、ＡＣ７１０（ＣＡＳ１３５１５２２－０
４－７、選択的ＰＤＧＦＲファミリー阻害剤）、ＤＭＰＱジヒドロクロリド（ＣＡＳ１３
７２０６－９７－４、ＰＤＧＦＲβ阻害剤）、ＧＳＫ１３６３０８９（ＣＡＳ８４９２１
７－６４－７、ＰＤＧＦＲ／ＭＥＴ／ＶＥＧＦＲ２／Ｒｏｎ／ＡＸＬ阻害剤）、ＰＤ１６
６２８５（ＣＡＳ２１２３９１－６３－４、ＰＤＧＦＲ／ＦＧＦＲ／Ｓｒｃ阻害剤）、な
らびにトセラニブ（ＣＡＳ３５６０６８－９４－５、ＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ阻害剤
）、ならびにそれらの誘導体および組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
無調関連因子。無調関連因子は、耳において支持細胞を感覚有毛細胞に分化転換する転
写因子のファミリーである。無調関連因子は、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス（
ｂＨＬＨ）ファミリーのタンパク質の転写因子である。このタンパク質の塩基性ドメイン
は、ＤＮＡ結合およびタンパク質の機能を担う。ショウジョウバエのｂＨＬＨタンパク質
（ａｔｏ）は、昆虫の感覚器官、特に弦音器官の発生に関連する遺伝子を活性化する。無
調相同体１（Ａｔｏｈ１）タンパク質とも称される無調関連因子は、マウス（マウス無調
相同体１（Ｍａｔｈ１））、ニワトリ（ニワトリ無調相同体１（Ｃａｔｈ１））、ツメガ
エル（ツメガエル無調相同体１（Ｘａｔｈ１））、およびヒト（ヒト無調相同体１（Ｈａ
ｔｈ１））を含む、様々な動物および昆虫に見出される。Ｍａｔｈ１は、ｂＨＬＨドメイ
ンにおいてａｔｏと高度に相同（８２％のアミノ酸類似性）で、１００％の塩基性ドメイ
ンが保存されており、マウスにおいて細胞運命を決定する上で機能する。Ｍａｔｈ１は、
有毛細胞発生にとって必須であることが示されており、耳において有毛細胞再生を刺激す
ることができる。Ｍａｔｈ１は、例えば、Ｂｅｎ－Ａｒｉｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）
Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１２０７－１２１６、Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１８３７－１８４１、Ｚｈｅｎｇ＆Ｇ
ａｏ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３（２）： ５８０－５８６、およ
びＣｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２９：２４９５－２５
０５においてさらに特性評価されている。Ｈａｔｈ１は、Ｍａｔｈ１のヒト対応物である
。特定の実施形態では、無調関連因子は、Ｍａｔｈ１もしくはＨａｔｈ１、またはＭａｔ
ｈ１およびＨａｔｈ１のアミノ酸配列と有意なアミノ酸配列類似性を共有するタンパク質
である。無調関連因子は、ＷＯ２０００／７３７６４にさらに記載されている。
Ｈａｔｈ１およびＭａｔｈ１のアミノ酸配列は、当該技術分野において既知であり、か
つそれぞれＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００５１６３（遺伝子番号：４７４）およびＮ
Ｐ＿０３１５２６（遺伝子番号：１１９２１）の下で入手可能である。Ｍａｔｈ１および
Ｈａｔｈ１のアミノ酸配列と有意なアミノ酸配列類似性を有するタンパク質は、望ましく
は、Ｈａｔｈ１（ＮＰ＿００５１６３）またはＭａｔｈ１（ＮＰ＿０３１５２６）のアミ
ノ酸配列と少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を有し、支持細胞を感覚有毛細胞
に分化転換する能力を有する。理想的には、無調関連因子は、Ｈａｔｈ１（ＮＰ＿００５
１６３）またはＭａｔｈ１（ＮＰ＿０３１５２６）のアミノ酸配列と少なくとも約６０％
のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも約６５％もしくは少なくとも約７０％の配列
同一性）、好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも約
８０％もしくは少なくとも約８５％の配列同一性）、および最も好ましくは少なくとも約
９０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも約９５％の配列同一性）を有する。無
調関連因子をコードする核酸配列を見てみると、好ましくは、核酸配列は、Ｈａｔｈ１（
ＮＰ＿００５１６３）もしくはＭａｔｈ１（ＮＰ＿０３１５２６）のアミノ酸配列（すな
わち、その遺伝子に関連する制御配列を欠損する、Ｈａｔｈ１およびＭａｔｈ１タンパク
質をコードするＨａｔｈ１もしくはＭａｔｈ１遺伝子の一部分）、またはＨａｔｈ１もし
くはＭａｔｈ１タンパク質をコードするｃＤＮＡをコードする。Ｈａｔｈ１およびＭａｔ
ｈ１をコードする核酸配列はそれぞれ、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿００５１７２およ
びＮＭ＿０３１５２６の下で公的に入手可能である。
野生型Ｈａｔｈ１またはＭａｔｈ１のタンパク質および核酸が特に有用である一方で、
本発明の文脈では、Ｈａｔｈ１またはＭａｔｈ１配列の多くの修飾および変動（例えば、
変異）が可能かつ適切である。例えば、遺伝子コードの縮重は、コードされるポリペプチ
ドを改変することなく、翻訳停止シグナルだけでなくコーディング配列全体を通したヌク
レオチドの置換も可能にする。そのような置換は、無調関連因子または無調関連因子をコ
ードする核酸配列の既知のアミノ酸配列から推定することができ、従来の合成または部位
特異的変異手順によって構築することができる。合成ＤＮＡ方法は、Ｉｔａｋｕｒａ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６－１０６３またはＣｒｅａ，ｅ
ｔ ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：５７６５
－５７６９の手順に従って実行することができる。部位特異的変異手順は、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
ＮＹに記載されている。あるいは、結果として得られる無調関連因子が活性（すなわち、
支持細胞を感覚有毛細胞に分化転換する能力）を保持する限り、核酸配列は、タンパク質
のＮ末端またはＣ末端のいずれかの拡張をもって無調関連ペプチドをコードしてもよい。
無調関連因子の機能は、タンパク質のヘリックス・ループ・ヘリックス（ＨＬＨ）部分
、特にＨＬＨドメインの塩基性領域に依存しており（Ｃｈｉｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９
６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１３２３９－１３２４４）、これは
、アミノ酸配列ＡＡＮＡＲＥＲＲＲＭＨＧＬＮＨＡＦＤＱＬＲ（配列番号１）を含む。し
たがって、無調関連因子アミノ酸配列の任意の修飾は、望ましくは、タンパク質の塩基性
ドメインの外側に位置する。無調関連因子をコードする核酸を持つ例示的な構築物および
発現ベクターは、ＷＯ２００４／０７６６２６に提供されている。
感覚的知覚。本発明は、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、ならびに任意で無調関連因子
をコードする核酸分子を持つ発現ベクター（例えば、発現ウイルスベクター）および／ま
たは耳保護剤を内耳に投与することによって、動物における感覚的知覚の調節を提供する
。「感覚的知覚を調節すること」によって、環境変化を認識しそれに順応する能力を少な
くとも部分的に達成することが意味される。感覚有毛細胞機能に関して、感覚的知覚の調
節は、内耳の機械的刺激を神経活動電位（これはその後、動物が環境変化、例えば、音、
言語、または身体／頭の位置を認識するように脳内で処理される）に変換する感覚有毛細
胞の生成または保護に関連する。感覚有毛細胞は、好ましくは、コルチ器官および／また
は前庭器で生成される。予防の文脈では、例えば、さもなければ聴覚毒性剤によって初期
にまたはさらに損傷または喪失してしまう感覚有毛細胞が、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害
剤および任意で耳保護剤の投与によって、損傷または喪失から保護される。治療の文脈で
は、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤と無調関連因子の発現のための核酸分子との組み合わ
せは、再プログラム化効率および／またはいくつかの再プログラム化細胞の終末分化を増
加させ、それにより内耳における刺激の知覚（または認識）を可能にする感覚有毛細胞の
生成を促進する。
感覚有毛細胞生成は、当業者にとって既知であるものなどの様々な手段を使用して決定
することができる。有毛細胞は、走査型電子顕微鏡を介して、および／または免疫化学に
よって検出される有毛細胞特異的タンパク質であるミオシンＶＩＩａの検出を介して検出
することができる。しかしながら、単に感覚有毛細胞の存在だけでは、必ずしも環境刺激
を認識するための機能系を意味するものではない。機能感覚有毛細胞は、機械的刺激が脳
によって認識される神経活動電位に翻訳されるように、神経経路に動作可能に連結してい
なくてはならない。したがって、有毛細胞生成の検出が標的組織に対する無調関連核酸配
列の発現の成功を決定するのに適切である一方で、対象の認識の検査が感覚的知覚の変化
のより望ましい指標である。
対象が音を検出する能力の変化は、聴覚訓練士によって一般的に実施される音調試験な
どの簡単な聴覚の試験の実施を通して容易に達成される。ほとんどの哺乳動物では、異な
る周波数に対する反応が、感覚的知覚の変化を示す。ヒトでは、言語の理解もまた、適切
である。例えば、対象は発話を理解することができなくても、耳は聞こえる可能性がある
。知覚の変化は、暗騒音からの言語の鑑別などの異なる種類の音響刺激を区別する能力に
よって、および発話の理解によって示される。発話閾値および識別試験は、そのような評
価に有用である。
平衡、運動認識、および／または運動刺激に対する応答のタイミングの変化の評価もま
た、様々な技術を使用して達成される。前庭機能はまた、運動刺激に対する応答の大きさ
（ゲイン）または応答の開始のタイミング（フェーズ）を比較することによっても測定す
ることができる。動物を、強膜サーチコイルを使用して前庭動眼反射（ＶＯＲ）ゲインお
よびフェーズについて試験して、感覚的知覚の改善を評価することができる。電気眼振検
査（ＥＮＧ）は、例えば、移動光または閃光などの刺激に応答した眼の運動、身体の再配
置、および三半規管内の流体移動などを記録する。回転椅子または移動プラットフォーム
を使用する運動中の平衡の評価もまた、この点に関して有用である。
感覚的知覚の変化を検出するために、任意の適切な感覚試験を使用する本発明の方法を
行う前にベースライン値を記録する。本発明の方法を行った後、適切な期間（例えば、本
発明の方法を行った後、１時間、６時間、１２時間、１８時間、１日、３日、５日、７日
、１４日、２１日、２８日、２ヶ月、３ヶ月、またはそれ以上）に対象を再評価し、その
結果をベースライン結果と比較して、感覚的知覚の変化を決定する。
予防または治療の方法。本発明の方法は、刺激の知覚を可能にする感覚有毛細胞の保護
および／または生成を促進する。したがって、本発明は、治療を必要とする対象に、ＥＧ
ＦＲシグナル伝達の阻害剤、ならびに任意で無調関連因子をコードする核酸分子を持つ発
現ベクター（例えば、発現ウイルスベクター）および／または１つ以上の耳保護剤／再生
剤を投与することによって、聴覚機能障害、喪失、および障害の予防、治療、制御、寛解
、またはそのリスクを低減するための方法を提供する。理想的には、本発明の方法は、難
聴および平衡障害などの感覚有毛細胞の喪失、損傷、欠損に関連する少なくとも１つの障
害について、動物を予防的または治療的に処置する。難聴は、細菌またはウイルス感染症
、遺伝、物理的損傷、音響外傷、および聴覚毒性薬（例えば、アミノグリコシド系抗生物
質またはシスプラチン）などによるコルチ器官の有毛細胞の損傷によって引き起こされ得
る。難聴は、容易に特定される一方で、平衡障害は、他の病気に容易に起因し得る多様な
合併症において顕在化する。平衡障害の症状には、見当識障害、めまい、回転性めまい、
悪心、霧視、不器用、および頻繁な転倒が含まれる。本発明の方法によって治療される平
衡障害は、好ましくは、感覚有毛細胞の損傷または欠如による機械的刺激の神経活動電位
への機能障害性翻訳を伴う、末梢前庭障害（すなわち、前庭器の妨害）に関与する。
一態様では、難聴または聴覚機能障害から保護または予防する方法が提供される。その
ような方法に従って、治療を必要とする対象には、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達の阻害
剤が投与される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、ＥＧＦＲ
、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫタンパク質、ＪＡＫ／ＳＴＡＴタンパク質
、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲタンパク質、ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫタンパク質、ＰＬＣ
－ＤＡＧ－ＰＫＣタンパク質、またはＥＧＦＲに関連するかもしくはその下流にある細胞
周期関連タンパク質キナーゼの発現または活性を阻害する。他の実施形態では、難聴の予
防は、治療を必要とする対象に、ＥＧＦＲに関連するかまたはその下流にある細胞周期関
連タンパク質キナーゼの阻害剤を投与することによって達成される。特定の実施形態では
、難聴の予防は、治療を必要とする対象に、Ｈｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ
、またはＰＤＧＦＲの発現または活性の阻害剤を投与することによって達成される。ＥＧ
ＦＲシグナル伝達の阻害剤は、単独で投与されても、１つ以上の耳保護剤と併用して投与
されてもよい。「耳保護剤」という用語は、騒音性難聴、化学性難聴、もしくは加齢性聴
覚機能障害を低減もしくは予防するか、または聴覚機能障害から別様に保護する薬剤を指
す。耳保護剤の例には、ＰＡＲＰ－１阻害剤；ピレンゼピンＬＳ－７５、オテンゼパド、
ＡＱ－ＲＡ７４１、ビラミューン、ＢＩＢＮ９９、ＤＩＢＤ、テレンゼピン（ＵＳ２０１
１／０２６３５７４を参照されたい）；メチオニン（ＵＳ７，０７１，２３０を参照され
たい）；ＩＧＦ－１、ＦＧＦ－２、アスピリン、還元グルタチオン、Ｎ－メチル－（Ｄ）
－グルカミンジチオカルバメート、ならびに鉄キレート剤（酒石酸およびマレイン酸など
）が含まれるが、これらに限定されない。追加の耳保護剤については、ＵＳ２００５／０
１０１５３４もまた参照されたい。
別の態様では、難聴または聴覚機能障害を治療する方法が提供される。そのような方法
に従って、治療を必要とする対象には、無調関連因子を発現する核酸分子を持つ発現ベク
ターと併用して、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が投与される。いくつかの実施
形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲ
Ｋ／ＭＡＰＫタンパク質、ＪＡＫ／ＳＴＡＴタンパク質、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲタ
ンパク質、ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫタンパク質、ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣタンパク質、ま
たはＥＧＦＲに関連するかもしくはその下流にある細胞周期関連タンパク質キナーゼの発
現または活性を阻害する。他の実施形態では、難聴の治療は、治療を必要とする対象に、
ＥＧＦＲ、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫタンパク質、ＪＡＫ／ＳＴＡＴタ
ンパク質、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲタンパク質、ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫタンパク質
、またはＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣタンパク質の阻害剤を投与することによって達成される
。特定の実施形態では、難聴の治療は、治療を必要とする対象に、ＥＧＦＲ、ＰＬＣ、Ｓ
ＴＡＴ３、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、またはＭＥＫの発現または活性の阻害剤を投与すること
によって達成される。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、および無調関連因子の発現のため
の核酸分子を持つ発現ベクターは、単独で投与されても、１つ以上の再生剤と併用して投
与されてもよい。「再生剤」という用語は、感覚有毛細胞の再生を刺激または促進する薬
剤を指す。再生剤の例には、ニコチンアミドリボシド（ＵＳ２０１５／０１７４１４８を
参照されたい）、ｓｉＲＮＡ標的化Ｈｅｓ１（ＵＳ９，１０１，６４７を参照されたい）
、ＰＫＡ阻害剤（ＵＳ６，２６８，３５１を参照されたい）、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、
またはＬ－ＭｙｃなどのＭｙｃファミリータンパク質（ＵＳ２０１５／００７９１１０を
参照されたい）、ならびにエリプチシン誘導体および／またはＧＳＫ－３阻害剤（ＵＳ９
，３７０，５１０を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
難聴または聴覚機能障害からの保護、およびその予防または治療は、耳鳴症、耳鳴、老
年性難聴、聴覚性ニューロパチー、音響外傷、聴神経腫瘍、ペンドレッド症候群、アッシ
ャー症候群、ワルデンベルグ症候群、非症候性感音性難聴、中耳炎、耳硬化症、メニエー
ル病、中毒性難聴、迷路炎を含むがこれらに限定されない、病態だけでなく、感染症（す
なわち、麻疹、流行性耳下腺炎、または髄膜炎）、抗生物質などの薬物、ならびにいくつ
かの癌治療（すなわち、化学療法および放射線療法）によって引き起こされる聴覚機能障
害の文脈にもあり得る。
特定の実施形態では、聴覚機能障害は、薬物性である。またさらなる態様では、薬物は
、化学療法剤である。より具体的には、薬物は、カルボプラチン、シスプラチン、トラン
スプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、トラン
スプラチン、およびトリプラチン、またはそれらの薬学的に許容される塩などの白金系化
学療法剤である。特定の実施形態では、白金系化学療法剤は、シスプラチンまたはその薬
学的に許容される塩である。またさらなる実施形態では、薬物は、ダウノルビシン、ドキ
ソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイ
トマイシンＣ、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、アストロマイシン、ベカナ
マイシン、ジベカシン、フラマイセチン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシンＢ、イセパ
マイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロドストレ
プトマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイ
シン、トブラマイシン、およびベルダマイシン、またはそれらの薬学的に許容される塩を
含むがこれらに限定されない、抗生物質である。
さらなる態様では、聴覚機能障害は、加齢性、騒音性、または平衡もしくは配向関連障
害である。平衡障害の例には、誘導性または自発性回転性めまい、平衡障害、動揺病に対
する感受性の増加、悪心、嘔吐、運動失調、迷路炎、動揺視、眼振、失神、もうろう状態
、めまい、転倒の増加、夜間歩行困難、メニエール病、ならびに視覚追跡および視覚処理
困難が含まれるが、これらに限定されない。さらに、騒音性難聴は、一時的または永久的
であり得る。
近年世界保健機関によって報告されているように、世界中で１０億人を超える１０代の
若者および若年成人に、大音量の音楽への曝露による難聴のリスクがある。職業的設定お
よび消費者操作デバイスを含む多くの他の騒音への曝露もまた騒音性難聴を引き起こし、
これは最も一般的な身体的愁訴の１つであり、かつ会話、通信、および日常生活に参加す
る能力を有意に減ずる（したがって、個人およびその家族の一般的な生活の質を低減する
）。急性的または慢性的な音響過剰曝露は、４０００万人を超える米国の労働者を永久的
な難聴のリスクに晒している（Ｋｏｐｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ
．２２６：１１４－１２５）。
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）および爆風関連損傷は、爆風への曝露が予想できないか、外傷
強度が保護デバイスの有効性を超えるか、または保護デバイスが利用可能ではない、軍事
的状況において最も頻繁に生じる。ＴＢＩにはしばしば、爆風損傷に対して高度に脆弱で
ある、聴覚感覚系に対する様々な破壊または損傷が伴う。極度の物理的爆風力は、末梢聴
覚系に対して、鼓膜（ｔｙｍｐａｎｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＴＭ、鼓膜（ｅａｒｄｒ
ｕｍ））の破裂、中耳骨の骨折、鼓膜基底板からの感覚有毛細胞の転位、および有毛細胞
を神経支配するらせん神経節の喪失を含む、様々な種類の損傷を引き起こし得る。爆風損
傷のヒト研究では、約１７～２９％の症例が重度のＴＭ破裂に関与する一方で、３３～７
８％が中度～重度の感音難聴（有毛細胞および神経節の喪失）に関与する。したがって、
ＴＢＩおよび爆風損傷は、極度ではあるが一般的な難聴の原因である。
聴覚の生物学的保護は、現在利用可能な機械的保護デバイスよりも有望である。補聴器
は、それらの高い費用およびそれらの多くの技術的問題点のために、頻繁に問題となる。
理想的には、軍人は高リスクまたは高騒音設定に入る前に保護薬を服用することができ、
それにより動作に影響を与えることなく騒音損傷から保護される。現在まで、騒音および
ＴＢＩ関連難聴から保護するためのＦＤＡ承認薬物は存在していない。
本発明の方法に従って、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、および無調関連因子の発現の
ための核酸分子を持つ任意の発現ベクターは、例えば、対象の内耳に局所投与されてもよ
い。あるいは、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、および無調関連因子の発現のための核酸
分子を持つ任意の発現ベクターは、全身投与されてもよい。さらに、ＥＧＦＲシグナル伝
達の阻害剤、および無調関連因子の発現のための核酸分子を持つ任意の発現ベクターは、
注射を介して、鼓室階、蝸牛管、蝸牛の前庭階のうちの１つ以上、聴神経幹、内耳道、ま
たは経鼓膜／鼓膜にわたって中耳洞に投与されてもよい。さらに、併用して使用される場
合、ＥＧＦＲシグナル伝達、および無調関連因子の発現のための核酸分子を持つ発現ベク
ターは、同じ経路を介して投与されても、異なる経路を介して投与されてもよい。
様々な態様では、開示される分子は、薬物をともに併用するといずれかの薬物単独より
も安全または効果的である場合に、開示される分子または他の薬物が有用性を有し得る聴
覚機能障害および障害を治療、予防、制御、寛解、またはそのリスクを低減する上で、１
つ以上の他の薬物と併用して使用することができる。そのような他の薬物（複数可）は、
それ（ら）に一般的に使用される経路および量で、本発明の化合物と同時期または連続的
に投与されてもよい。本発明の分子が１つ以上の他の薬物と同時期に使用される場合、そ
のような他の薬物および開示される化合物を含有する単位剤形の薬学的組成物が好ましい
。しかしながら、併用療法はまた、開示される分子および１つ以上の他の薬物が異なる重
複スケジュールで投与される療法も含み得る。１つ以上の他の活性成分と併用して使用さ
れる場合、開示される分子および他の活性成分が、各々が単独で使用される場合よりも低
い用量で使用され得ることもまた企図される。
本明細書の方法は、機能感覚有毛細胞の欠如またはそれらに対する損傷に関連する、急
性および持続性の進行性障害の両方の予防または治療に有用である。急性の病気の場合、
本明細書の薬物は、単回適用または短期間の複数回適用を使用して投与されてもよい。難
聴などの持続性疾患、または感覚有毛細胞の広範囲の喪失から生じる障害の場合、治療効
果を実現するために、本明細書の薬物の多数回の投与が必要である可能性がある。
適切な場合、治療後に、対象（例えば、ヒトまたは他の動物）を、聴覚または聴覚障害
に関連する他の症状の改善について試験してもよい。治療から利益を得る対象には、有毛
細胞喪失のリスクがある対象および／または有毛細胞喪失を有する患者が含まれる。例え
ば、難聴を有するかまたはそれを発症するリスクがある対象は、平均的な対象（例えば、
平均的なヒト）よりも、または難聴を経験する前の対象よりも、耳がよく聞こえない可能
性がある。例えば、聴覚は、少なくとも５％、１０％、３０％、５０％、またはそれ以上
減少し得る。聴覚を測定するための方法は、周知であり、それらには、標準純音聴力検査
、気導試験、および骨伝導試験が含まれる。これらの試験は、ヒトの耳に聞こえる音量（
強度）およびピッチ（周波数）の限界を測定する。ヒトにおける聴覚試験には、（７ヶ月
までの乳幼児用の）行動観察聴力検査、（７ヶ月～３歳までの子供用の）視覚強化定位聴
力検査、および３歳を超える子供用の遊戯聴力検査が含まれる。耳音響放射試験を使用し
て、蝸牛有毛細胞の機能を試験することができ、蝸電図検査は、蝸牛および脳への神経経
路の第１の部分の機能についての情報を提供する。様々な態様では、治療は、修正ありま
たはなしで継続しても、停止してもよい。
様々な態様では、本明細書に記載の方法を使用して、耳における有毛細胞成長を生成す
ること、ならびに／または耳（例えば、内耳、中耳、および／もしくは外耳）における有
毛細胞の数を増加させることができる。この点では、有効量の本明細書に記載の分子は、
耳における有毛細胞の数を、治療前の有毛細胞の数と比較して、約２倍、３倍、４倍、６
倍、８倍、もしくは１０倍、またはそれ以上増加させる量である。この新たな有毛細胞成
長は、対象の聴力を効果的に回復またはその少なくとも部分的な改善を確立することがで
きる。例えば、本発明の刺激剤および阻害剤の投与は、難聴を約５、１０、１５、２０、
４０、６０、８０、１００％、またはそれ以上改善することができる。
発現ベクター。当業者であれば、当該技術分野において既知であるいくつかの発現ベク
ターのうちのいずれが核酸配列の内耳への導入に好適であるかを理解するだろう。好適な
発現ベクターの例には、例えば、プラスミド、プラスミド－リポソーム複合体、ならびに
ウイルスベクター、例えば、パルボウイルス系ベクター（すなわち、アデノ関連ウイルス
（ＡＡＶ）系ベクター）、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系
ベクター、ＡＡＶ－アデノウイルスキメラベクター、およびアデノウイルス系ベクターが
含まれる。これらの発現ベクターのいずれも、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．
（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９
４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに記載の標準的な組み換えＤＮＡ技術を使
用して調製することができる。
核酸配列を内耳に送達するための発現カセットを含有するように、遺伝子操作された環
状二本鎖ＤＮＡ分子であるプラスミドを設計することができる。プラスミドは、治療核酸
の投与のために記載された最初のベクターであるが、トランスフェクション効率のレベル
は、他の技術と比較して不良である。プラスミドをリポソームと複合体化することによっ
て、遺伝子導入の効率は一般に改善される。プラスミド媒介性遺伝子導入戦略に使用され
るリポソームは、様々な組成を有する一方で、それらは、典型的には合成カチオン性脂質
である。プラスミド－リポソーム複合体の利点には、それらが治療核酸をコードする大き
なＤＮＡ片を導入する能力、およびそれらの比較的低い免疫原性が含まれる。プラスミド
はまた、ＵＳ６，１６５，７５４に記載のように、導入遺伝子の発現を延長するように修
飾することができる。プラスミドを使用する耳における導入遺伝子の発現が、記載されて
いる（例えば、Ｊｅｒｏ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
１２：５３９－５４９）。プラスミドが、本発明の方法における使用に好適である一方で
、好ましくは、発現ベクターは、ウイルスベクターである。
ＡＡＶベクターは、遺伝子療法プロトコルにおける使用に特に対象となるウイルスベク
ターである。ＡＡＶはＤＮＡウイルスであり、これはヒトに疾患を引き起こすことは知ら
れていない。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウ
イルスもしくはヘルパーウイルス）との同時感染、またはヘルパー遺伝子の発現を必要と
する。治療核酸の投与に使用されるＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製およびパッケージング
の認識シグナルを含有する末端反復（ＩＴＲ）のみが残るように、親ゲノムの約９６％が
欠失している。これにより、ウイルス遺伝子の発現による免疫性または毒性の副作用が排
除される。組み込みＡＡＶゲノムを含有する宿主細胞は、細胞成長または形態における変
化を示さない（例えば、ＵＳ４，７９７，３６８を参照されたい）。効率的ではあるが、
ヘルパーウイルスまたはヘルパー遺伝子の必要性は、このベクターの広範な使用の障壁と
なり得る。
レトロウイルスは、多様な宿主細胞に感染することができるＲＮＡウイルスである。感
染時に、レトロウイルスゲノムは、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞ＤＮＡ
とともに複製され、それにより常にウイルスＲＮＡおよびレトロウイルスゲノムに組み込
まれる任意の核酸配列を生成するようになる。病原性レトロウイルス、例えば、ヒト免疫
不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルス（ＨＴＬＶ）を用いる場
合、ウイルスゲノムを改変して毒性を排除するように注意を払わなくてはならない。レト
ロウイルスベクターをさらに操作して、ウイルスを複製不全にしてもよい。したがって、
レトロウイルスベクターは、インビボでの安定した遺伝子導入に特に有用であると考えら
れている。ＨＩＶ系ベクターなどのレンチウイルスベクターは、遺伝子送達に使用される
レトロウイルスベクターの例示的なものである。他のレトロウイルスとは異なり、ＨＩＶ
系ベクターは、それらのパッセンジャー遺伝子を非***細胞に組み込むことが知られてお
り、したがって、感覚細胞が再生しない内耳の感覚上皮において特に有用である。
ＨＳＶ系ウイルスベクターは、核酸を内耳に導入して、標的細胞を形質導入するための
発現ベクターとしての使用に好適である。成熟ＨＳＶビリオンは、エンベロープ状の正二
十面体カプシドで構成され、ウイルスゲノムは、１５２ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子で構
成される。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、１つ以上の中間初期遺伝子を除去して
複製を予防するような欠失を含有する。ヘルペスベクターの利点は、それが長期のＤＮＡ
発現をもたらし得る潜在段階に入る能力、および最大２５ｋｂの外来性ＤＮＡを収容し得
るその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。当然のことながら、この能力はまた、短期の
治療レジメンに関しては不利益でもある。本発明の方法における使用に適切なＨＳＶ系ベ
クターの説明については、例えば、ＵＳ５，８３７，５３２、ＵＳ５，８４６，７８２、
ＵＳ５，８４９，５７２、ＵＳ５，８０４，４１３、ＷＯ１９９１／０２７８８、ＷＯ１
９９６／０４３９４、ＷＯ１９９８／１５６３７、およびＷＯ１９９９／０６５８３を参
照されたい。
アデノウイルス（Ａｄ）は、様々な異なる標的細胞型に対してインビボでＤＮＡを効率的
に導入する、３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡウイルスである。本発明の方法における使用のため
に、ウイルスは、好ましくは、ウイルス複製に必要とされる選択した遺伝子を欠失させる
ことによって複製欠損にされる。消費される非複製必須Ｅ３領域はまた、より大きなＤＮ
Ａ挿入物のための追加の余地を与えるために頻繁に欠失される。ベクターは、高い力価で
生成することができ、ＤＮＡを複製細胞および非複製細胞に効率的に導入することができ
る。アデノウイルスベクターによって細胞に導入される遺伝情報は、依然として染色体外
にあるため、ランダムな挿入変異、および標的細胞の遺伝子型の永久的な改変のリスクが
排除される。しかしながら、所望される場合、ＡＡＶ－Ａｄキメラベクターを構築するこ
とによって、ＡＡＶの組み込み特性がアデノウイルスに与えられてもよい。例えば、ＡＡ
Ｖ逆方向末端反復（ＩＴＲ）、およびアデノウイルスベクターに組み込まれるＲｅｐタン
パク質をコードする核酸は、アデノウイルスベクターの哺乳動物細胞ゲノムへの組み込み
を可能にする。したがって、ＡＡＶ－Ａｄキメラベクターは、本発明の文脈における使用
のための興味深い選択肢である。
好ましくは、本発明の方法の発現ベクターは、ウイルスベクターであり、より好ましく
は、発現ベクターは、アデノウイルスベクターである。任意の起源、任意の亜型、亜型の
混合物、または任意のキメラアデノウイルス由来のアデノウイルスを、本発明のアデノウ
イルスベクターのウイルスゲノムの供給源として使用することができる。ヒトアデノウイ
ルスが、好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターのウイルスゲノムの供給源として
使用される。アデノウイルスは、任意の亜群または血清型ものであり得る。例えば、アデ
ノウイルスは、亜群Ａ（例えば、血清型１２、１８、および３１）、亜群Ｂ（例えば、血
清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、および５０）、亜群Ｃ（例えば、血
清型１、２、５、および６）、亜群Ｄ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７
、１９、２０、２２～３０、３２、３３、３６～３９、および４２～４８）、亜群Ｅ（例
えば、血清型４）、亜群Ｆ（例えば、血清型４０および４１）、未分類の血清群（例えば
、血清型４９および５１）、または任意の他のアデノウイルス血清型のものであり得る。
アデノウイルス血清型１～５１までは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。好ま
しくは、アデノウイルスベクターは、亜群Ｃ、特に血清型２、またはさらにより好ましく
は血清型５のものである。
しかしながら、非群Ｃアデノウイルス、およびさらには非ヒトアデノウイルスを使用し
て、ＤＮＡを内耳の標的細胞に送達するための複製欠損アデノウイルス遺伝子導入ベクタ
ーを調製することができる。非群Ｃアデノウイルス遺伝子導入ベクターの構築に使用され
る好ましいアデノウイルスには、Ａｄ１２（群Ａ）、Ａｄ７およびＡｄ３５（群Ｂ）、Ａ
ｄ３０およびＡｄ３６（群Ｄ）、Ａｄ４（群Ｅ）、ならびにＡｄ４１（群Ｆ）が含まれる
。非群Ｃアデノウイルスベクター、非群Ｃアデノウイルスベクターを生成する方法、およ
び非群Ｃアデノウイルスベクターを使用する方法は、例えば、ＵＳ５，８０１，０３０、
ＵＳ５，８３７，５１１、ＵＳ５，８４９，５６１、ＷＯ１９９７／１２９８６、および
ＷＯ１９９８／５３０８７に開示されている。好ましい非ヒトアデノウイルスには、サル
（例えば、ＳＡＶ２５）、ウシ、イヌ、ブタアデノウイルスが含まれるが、これらに限定
されない。
アデノウイルスベクターは、好ましくは、複製欠損である。「複製欠損」によって、（
すなわち、アデノウイルスベクターが、典型的な宿主細胞内（特に、本発明に従う治療の
経過においてアデノウイルスベクターによって感染され得るヒト患者の宿主細胞内）で複
製しないように）アデノウイルスベクターが、少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠
如するアデノウイルスゲノムを含むことが意味される。本明細書で使用される場合、遺伝
子、遺伝子機能、または遺伝子もしくはゲノム領域の欠損は、核酸配列全体またはその一
部が欠失した遺伝子の機能を障害または抹消するのに十分な、ウイルスゲノムの遺伝子材
料の欠失として定義される。遺伝子材料の欠失が好ましい一方で、遺伝子機能を破壊する
ためには、付加または置換による遺伝子材料の変異もまた適切である。複製必須遺伝子機
能は、複製（例えば、増殖）に必要とされ、かつ例えば、アデノウイルス初期領域（例え
ば、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１～Ｌ５領域）、ウイルスパ
ッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、ならびにウイルス関連ＲＮ
Ａ（例えば、ＶＡ－ＲＮＡ１および／またはＶＡ－ＲＮＡ－２）によってコードされる、
遺伝子機能である。より好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイル
スゲノムの１つ以上の領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能にアデノウイルスゲノ
ム欠損を含む。好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要とされるア
デノウイルスゲノムのＥ１領域またはＥ４領域の少なくとも１つの遺伝子機能を欠損して
いる（Ｅ１欠損アデノウイルスベクターまたはＥ４欠損アデノウイルスベクターと表わさ
れる）。Ｅ１領域の欠損に加えて、ＷＯ２０００／００６２８に考察されるように、組み
換えアデノウイルスはまた、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に変異を有してもよい。最
も好ましくは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域、および非必須Ｅ３領域の少なくと
も一部（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能（望
ましくは、全ての複製必須遺伝子機能）を欠損している（Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルス
ベクターと表わされる）。Ｅ１領域に関して、アデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａ領域の
一部または全部、およびＥ１Ｂ領域の一部または全部、例えば、Ｅ１Ａ領域およびＥ１Ｂ
領域の各々の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠損していてもよい。アデノウイル
スベクターが、アデノウイルスゲノムの１つの領域内の少なくとも１つの複製必須遺伝子
機能を欠損している（例えば、Ｅ１またはＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクター）場合
、アデノウイルスベクターは、「単独複製欠損」と称される。
本発明のアデノウイルスベクターは、「複数複製欠損」であってもよく、これは、アデ
ノウイルスゲノムの２つ以上の領域の各々においてアデノウイルスベクターが１つ以上の
複製必須遺伝子機能を欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１欠損またはＥ１
／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域（Ｅ１／Ｅ４もしくはＥ１／Ｅ３／Ｅ４
欠損アデノウイルスベクターと表わされる）、および／またはＥ２領域（Ｅ１／Ｅ２もし
くはＥ１／Ｅ２／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表わされる）、好ましくはΕ２Ａ領
域（Ｅ１／Ｅ２ＡもしくはＥ１／Ｅ２Ａ／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表わされる
）の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能をさらに欠損していてもよい。理想的には、ア
デノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域によってコードされる複製必
須遺伝子機能のみの複製必須遺伝子機能を欠如するが、これは、本発明の全ての文脈で必
要とされるわけではない。好ましい複数欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域のヌク
レオチド４５７～３３３２、Ｅ３領域のヌクレオチド２８５９３～３０４７０、Ｅ４領域
のヌクレオチド３２８２６～３５５６１、および任意でＶＡ－ＲＮＡ１をコードする領域
のヌクレオチド１０５９４～１０５９５の欠失を有するアデノウイルスゲノムを含む。し
かしながら、他の欠失が適切であり得る。ヌクレオチド３５６～３３２９または３５６～
３５１０は、複製必須Ｅ１遺伝子機能の欠損を作り出すように除去されてもよい。ヌクレ
オチド２８５９４～３０４６９は、アデノウイルスゲノムのＥ３領域から欠失していても
よい。上記に列挙される特定のヌクレオチド指定は、アデノウイルス血清型５ゲノムに対
応する一方で、非血清型５アデノウイルスゲノムの対応するヌクレオチドは、当業者であ
れば容易に決定することができる。
特に、Ｅ１領域およびＥ４領域の複製必須遺伝子機能を複数複製欠損している場合、ア
デノウイルスベクターは、好ましくは、単独複製欠損アデノウイルスベクター（好ましく
は、Ｅ１欠損アデノウイルスベクター）によって達成されるウイルス成長と類似した補完
細胞株内でのウイルス成長を提供するためのスペーサーエレメントを含む。スペーサーエ
レメントは、少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５塩基対～約１２，０００塩基対）
、好ましくは約１００塩基対～約１０，０００塩基対、より好ましくは約５００塩基対～
約８，０００塩基対、さらにより好ましくは約１，５００塩基対～約６，０００塩基対、
および最も好ましくは約２，０００～約３，０００塩基対の長さである配列などの所望の
長さである任意の配列（複数可）を含有し得る。スペーサーエレメント配列は、コーディ
ングまたは非コーディング、およびアデノウイルスゲノムに関して天然または非天然であ
り得るが、欠損領域に対する複製必須機能は回復させない。アデノウイルスベクターにお
けるスペーサーの使用は、ＵＳ５，８５１，８０６に記載されている。本発明の方法の一
実施形態では、複製欠損または条件的複製アデノウイルスベクターはＥ１／Ｅ４欠損アデ
ノウイルスベクターであり、Ｌ５線維領域は保持され、スペーサーはＬ５線維領域と右側
ＩＴＲとの間に位置する。より好ましくは、そのようなアデノウイルスベクターでは、そ
のようなベクターのウイルス生成が単独複製欠損アデノウイルスベクター（特にＥ１欠損
アデノウイルスベクター）のウイルス生成に接近するように、保持されるＬ５線維領域が
右側ＩＴＲから十分に分離させるために、単独またはより好ましくは別の配列と組み合わ
せたＥ４ポリアデニル化配列が、Ｌ５線維領域と右側ＩＴＲとの間に存在する。
アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみ、アデノウイルスゲ
ノムの後期領域のみ、ならびにアデノウイルスゲノムの初期領域および後期領域の両方の
複製必須遺伝子機能を欠損していてもよい。アデノウイルスベクターはまた、アデノウイ
ルスゲノム全体が本質的に除去されていてもよく、この場合、ウイルスＩＴＲおよび１つ
以上のプロモーター、またはウイルスＩＴＲおよびパッケージングシグナルの少なくとも
いずれかが、インタクトのままであることが好ましい（すなわち、アデノウイルス増幅産
物）。ＩＴＲおよびパッケージング配列を含むアデノウイルスゲノムの５’または３’領
域は、残りのウイルスゲノムと同じアデノウイルス血清型に起源を持つ必要はない。例え
ば、アデノウイルス血清型５ゲノムの５’領域（すなわち、アデノウイルスＥ１領域に対
するゲノム５’の領域）は、アデノウイルス血清型２ゲノムの対応する領域で置き換える
ことができる（例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に対するＡｄ５ゲノム領域５’
は、Ａｄ２ゲノムのヌクレオチド１～４５６で置き換えられる）。複数複製欠損アデノウ
イルスベクターを含む好適な複製欠損アデノウイルスベクターは、ＵＳ５，８３７，５１
１、ＵＳ５，８５１，８０６、ＵＳ５，９９４，１０６、ＵＳ２００１／００４３９２２
、ＵＳ２００２／０００４０４０、ＵＳ２００２／００３１８３１、ＵＳ２００２／０１
１０５４５、ＷＯ１９９５／３４６７１、ＷＯ１９９７／１２９８６、およびＷＯ１９９
７／２１８２６に開示されている。理想的には、複製欠損アデノウイルスベクターは、複
製可能なアデノウイルス（ＲＣＡ）混入を実質的に含まずに薬学的組成物中に存在する（
例えば、薬学的組成物は、約１％未満のＲＣＡ混入を含む）。最も理想的には、薬学的組
成物は、ＲＣＡを含まない。ＲＣＡを含まないアデノウイルスベクター組成物およびスト
ックは、ＵＳ５，９４４，１０６、ＵＳ６，４８２，６１６、ＵＳ２００２／０１１０５
４５、およびＷＯ１９９５／３４６７１に記載されている。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法の発現ベクターは、Ｅ１領域の全部
または一部、Ｅ３領域の全部または一部、Ｅ４領域の全部または一部、および任意でＥ２
領域の全部または一部を欠如する複数複製欠損アデノウイルスベクターである。外来性核
酸配列の耳への送達には、複数欠損ベクターが特に適していると考えられている。Ｅ１領
域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠損しているアデノウイルスベクターが、イ
ンビボでの遺伝子導入に最も一般的に使用される。しかしながら、現在使用されている単
独複製欠損アデノウイルスベクターは、内耳上皮の感受性細胞にとって有害であり、まさ
に治療されるべき細胞に対して損傷を引き起こす可能性がある。Ｅ４領域の少なくとも１
つの複製必須遺伝子機能を欠損しているアデノウイルスベクター、特にＥ４領域およびＥ
１領域の複製必須遺伝子機能を欠損しているアデノウイルスベクターは、Ｅ１欠損アデノ
ウイルスベクターよりも細胞に対する毒性が少ない（例えば、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（
１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２（６）：７１４－７１６およびＵＳ６，２２８，６
４６を参照されたい）。したがって、Ｅ１、Ｅ４欠損アデノウイルスベクターを用いて、
無調関連因子をコードする核酸配列を内耳細胞に送達することによって、既存の有毛細胞
および支持細胞に対する損傷を最小化することができる。
この点について、少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターが、インビボで限られた
時間だけ高レベルで導入遺伝子を発現すること、および特にＨＳＶ ＩＣＰＯ、Ａｄ ｐ
ＴＰ、ＣＭＶ－ＩＥ２、ＣＭＶ－ＩＥ８６、ＨＩＶ ｔａｔ、ＨＴＬＶ－ｔａｘ、ＨＢＶ
－Ｘ、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８、ＨＳＶ ＩＣＰＯのように機能するＵ２０５骨肉腫細胞株由
来の細胞因子、または神経成長因子によって誘導されるＰＣ１２細胞内の細胞因子などの
トランス作用因子の作用を通して、少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクターにおける
導入遺伝子の発現の持続を調節することができることが観察されている。上記に照らして
、例えば、ＵＳ６，２２５，１１３、ＵＳ６，６６０，５２１、ＵＳ６，６４９，３７３
、およびＷＯ２０００／３４４９６に記載のように、複数欠損アデノウイルスベクター（
例えば、少なくともＥ４欠損アデノウイルスベクター）または第２の発現ベクターは、無
調関連因子をコードする核酸配列の発現の持続を調節するトランス作用因子をコードする
核酸配列を含む。
複製欠損アデノウイルスベクターは、典型的には、複製欠損アデノウイルスベクターに
は存在しないが、ウイルス増殖に必要とされる遺伝子機能を提供する補完細胞株内で、高
い力価のウイルスベクターストックの生成に適切なレベルで生成される。好ましい細胞株
は、複製欠損アデノウイルスには存在しない、少なくとも１つおよび好ましくは全ての複
製必須遺伝子機能を補完する。補完細胞株は、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージ
ング領域、ウイルス関連ＲＮＡ領域、またはそれらの組み合わせによってコードされる、
少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠損（全てのアデノウイルス機能（例えば、アデ
ノウイルス増幅産物の増殖を可能にする機能）を含む）を補完することができる。最も好
ましくは、補完細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製必須
遺伝子機能（例えば、２つ以上の複製必須遺伝子機能）の欠損、特に、Ｅ１Ａ領域および
Ｅ１Ｂ領域の各々の複製必須遺伝子機能の欠損を補完する。加えて、補完細胞株は、（特
にアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質に関して）アデノウイルスゲ
ノムのＥ２領域および／またはＥ４領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠損を
補完することができる。望ましくは、Ｅ４領域内の欠損を補完する細胞は、Ｅ４－ＯＲＦ
６遺伝子配列を含み、Ｅ４－ＯＲＦ６タンパク質を生成する。そのような細胞は、望まし
くは、少なくともＯＲＦ６を含み、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の他のＯＲＦは含ま
ない。細胞株は、好ましくは、アデノウイルスベクターと重複しない様式の補完遺伝子を
含有することをさらに特徴とし、これは、ベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組み換えられる
可能性を最小化し、実際的に排除する。したがって、複製可能なアデノウイルス（ＲＣＡ
）の存在は、ベクターストックにおいて回避されない場合でも最小化され、したがって、
これは、特定の治療目的、特に遺伝子療法目的に好適である。ベクターストックにおける
ＲＣＡの欠如により、非補完細胞内でのアデノウイルスベクターの複製が回避される。そ
のような補完細胞株の構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔ
ｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによって記載のものなどの標準的な分子生物学および細胞培
養技術に関与する。
アデノウイルスベクターを生成するための補完細胞株には、２９３細胞（例えば、Ｇｒ
ａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９－７２を参照
されたい）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、ＷＯ１９９７／００３２６、ＵＳ５，９９４，
１２８、およびＵＳ６，０３３，９０８を参照されたい）、ならびに２９３－ＯＲＦ６細
胞（例えば、ＷＯ１９９５／３４６７１およびＢｒｏｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９２０６－９２１３を参照されたい）が含まれるが、これらに限
定されない。いくつかの例では、補完細胞は、全ての必要なアデノウイルス遺伝子機能を
補完しない。ヘルパーウイルスを用いて、細胞ゲノムまたはアデノウイルスゲノムによっ
てコードされない遺伝子機能をトランスで提供して、アデノウイルスベクターの複製を可
能にすることができる。アデノウイルスベクターは、例えば、ＵＳ５，９６５，３５８、
ＵＳ５，９９４，１２８、ＵＳ６，０３３，９０８、ＵＳ６，１６８，９４１、ＵＳ６，
３２９，２００、ＵＳ６，３８３，７９５、ＵＳ６，４４０，７２８、ＵＳ６，４４７，
９９５、ＵＳ６，４７５，７５７、ＵＳ２００２／００３４７３５、ＷＯ１９９８／５３
０８７、ＷＯ１９９８／５６９３７、ＷＯ１９９９／１５６８６、ＷＯ１９９９／５４４
４１、ＷＯ２０００／１２７６５、ＷＯ２００１／７７３０４、およびＷＯ２００２／２
９３８８、ならびにそれらの中に特定される他の参考文献に明記される材料および方法を
使用して、構築、増殖、および／または精製することができる。アデノウイルス血清型３
５ベクターを含む非群Ｃアデノウイルスベクターは、例えば、ＵＳ５，８３７，５１１、
ＵＳ５，８４９，５６１、ＷＯ１９９７／１２９８６、およびＷＯ１９９８／５３０８７
に明記される方法を使用して生成することができる。さらに、多数のアデノウイルスベク
ターが、市販されている。
アデノウイルスベクターのコートタンパク質を修飾して、アデノウイルスベクターが野
生型コートタンパク質に対して指向された中和抗体によって認識される能力または不能力
を低下させてもよい。そのような修飾は、複数回の投与に有用である。同様に、アデノウ
イルスベクターのコートタンパク質を操作して、潜在的な宿主細胞上のウイルス受容体に
対するアデノウイルスベクターの結合特異性または認識を改変してもよい。そのような操
作には、線維、ペントン、ヘキソン、ｐＩＩＩａ、ｐＶＩ、および／またはｐＩＸの領域
の欠失または置換、ならびにコートタンパク質の一部分への様々な天然または非天然リガ
ンドの挿入などが含まれ得る。コートタンパク質の操作は、アデノウイルスベクターによ
って感染される細胞の範囲を広げるか、またはアデノウイルスベクターの特定の細胞型へ
の標的化を可能にすることができる。アデノウイルスベクターが潜在的な宿主細胞を認識
する能力は、コートタンパク質を遺伝子操作することなく、すなわち、二重特異性分子を
通して調節することができる。例えば、ペントンベース結合ドメインまたは線維結合ドメ
インと、特定の細胞表面結合部位に選択的に結合するドメインと、を含む、二重特異性分
子にアデノウイルスを複合体化することで、アデノウイルスベクターを特定の細胞型に標
的化することが可能になる。
好ましくは、アデノウイルスカプシドは、非天然アミノ酸配列を提示するように修飾さ
れる。非天然アミノ酸配列は、（例えば、アデノウイルス線維タンパク質の曝露されたル
ープ内の）内部コートタンパク質配列中に、またはその代わりに挿入されても、アデノウ
イルスコートタンパク質の末端に融合（例えば、任意でリンカー配列またはスペーサー配
列を使用して、アデノウイルス線維タンパク質のＣ末端に融合）されてもよい。非天然ア
ミノ酸配列を、アデノウイルスコートタンパク質のいずれかに共役させて、キメラコート
タンパク質を形成してもよい。したがって、例えば、本発明の非天然アミノ酸配列は、線
維タンパク質、ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質、タンパク質ＩＸ、ＶＩ
、またはＩＩＩａなどに共役、挿入、結合することができる。そのようなタンパク質の配
列、および組み換えタンパク質中でそれらを用いるための方法は、当該技術分野において
周知である（例えば、ＵＳ５，５４３，３２８、ＵＳ５，５５９，０９９、ＵＳ５，７１
２，１３６、ＵＳ５，７３１，１９０、ＵＳ５，７５６，０８６、ＵＳ５，７７０，４４
２、ＵＳ５，８４６，７８２、ＵＳ５，９６２，３１１、ＵＳ５，９６５，５４１、ＵＳ
５，８４６，７８２、ＵＳ６，０５７，１５５、ＵＳ６，１２７，５２５、ＵＳ６，１５
３，４３５、ＵＳ６，３２９，１９０、ＵＳ６，４５５，３１４、ＵＳ６，４６５，２５
３、ＵＳ６，５７６，４５６、ＵＳ２００１／００４７０８１、ＵＳ２００３／００９９
６１９、ＷＯ１９９６／０７７３４、ＷＯ１９９６／２６２８１、ＷＯ１９９７／２００
５１、ＷＯ１９９８／０７８７７、ＷＯ１９９８／０７８６５、ＷＯ１９９８／４０５０
９、ＷＯ１９９８／５４３４６、ＷＯ２０００／１５８２３、ＷＯ２００１／５８９４０
、およびＷＯ２００１／９２５４９を参照されたい）。キメラコートタンパク質のコート
タンパク質部分は、リガンドドメインが付加される完全長アデノウイルスコートタンパク
質であっても、あるいはそれは、例えば、内部またはＣ末端および／もしくはＮ末端で切
断されていてもよい。コートタンパク質部分は、それ自体がアデノウイルスベクターに対
して天然である必要はない。
リガンドが線維タンパク質に結合している場合、それは、好ましくは、ウイルスタンパ
ク質間または線維単量体間の相互作用を妨害しない。したがって、非天然アミノ酸配列は
、好ましくは、それ自体がオリゴマー化ドメインではなく、これは、オリゴマー化ドメイ
ンがアデノウイルス線維の三量体化ドメインと有害に相互作用し得るためである。好まし
くは、リガンドは、ビリオンタンパク質に付加され、基質に対して容易に曝露されるよう
な様式で（例えば、タンパク質のＮ末端またはＣ末端（基質に面する残基に結合したもの
、基質に接触するようにペプチドスペーサー上に位置付けられたものなど）で）組み込ま
れることで、基質に対して非天然アミノ酸配列を最大限に提示するようになる。理想的に
は、非天然アミノ酸配列が、線維タンパク質のＣ末端でアデノウイルス線維タンパク質に
組み込まれ（かつスペーサーを介して結合され）るか、または線維の曝露されたループ（
例えば、ＨＩループ）内に組み込まれることで、キメラコートタンパク質が作製される。
非天然アミノ酸配列がペントンベースの一部分に結合しているか、またはそれを置き換え
る場合、好ましくは、それは、それが基質に接触することを確実にするために、超可変領
域内にある。非天然アミノ酸配列がヘキソンに結合している場合、好ましくは、それは、
超可変領域内にある（Ｍｉｋｓｚａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（
３）： １８３６－４４）。非天然アミノ酸配列をアデノウイルス粒子の表面から離れる
ように拡張するためのスペーサー配列の使用は、非天然アミノ酸配列が受容体への結合に
より容易に利用可能であり、かつ非天然アミノ酸配列とアデノウイルス線維単量体との間
のいかなる立体相互作用も低減されるという点で、有利であり得る。
非天然リガンドを含むキメラウイルスコートタンパク質は、望ましくは、キメラウイル
スコートタンパク質ではなく野生型ウイルスコートタンパク質を含むことを除いて同一で
あるベクターの細胞への移入よりも効率的な、コートタンパク質を含むウイルスベクター
、すなわち、アデノウイルスベクターの細胞への移入を指向することができる。好ましく
は、キメラウイルスコートタンパク質は、野生型コートタンパク質を含むベクターによっ
て認識されないか、または認識が不良である細胞表面上に存在する新規の内在性結合部位
に結合する。
加えて、アデノウイルスカプシドタンパク質を改変して、天然アデノウイルス受容体（
すなわち、野生型アデノウイルスによって結合される受容体）への結合を低減または除去
することができる。具体的には、コクサッキーおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）と
相互作用するアデノウイルス線維タンパク質の一部分を、欠失、置換、線維タンパク質内
の再配置などによって変異させて、アデノウイルス線維タンパク質がＣＡＲに結合しない
ようにしてもよい。同様に、インテグリンと相互作用するアデノウイルスペントンタンパ
ク質の一部分を改変して、天然インテグリン結合を除去してもよい。複製欠損または条件
的複製アデノウイルスベクターの天然結合および形質導入を低減するために、細胞移入を
媒介するアデノウイルスコートタンパク質上に位置する天然結合部位、例えば、線維およ
び／またはペントンベースが、欠損または破壊される。アデノウイルスコートタンパク質
の２つ以上が、細胞表面への結合を媒介すると考えられている（例えば、線維およびペン
トンベース）。宿主細胞（例えば、中皮細胞または肝細胞）への天然結合を改変するため
の任意の好適な技術を用いることができる。例えば、細胞への天然結合を除去するための
異なる線維長の活用は、ペントンベースまたは線維ノブへの結合配列の付加を介して達成
することができる。この付加は、直接的に、または二重特異性または多重特異性結合配列
を介して間接的に、のいずれかで行うことができる。あるいは、アデノウイルス線維タン
パク質を修飾して、線維軸内のアミノ酸の数を低減させ、それにより（例えば、ＵＳ５，
９６２，３１１に記載のものなどの）「短軸」線維を作り出してもよい。いくつかのアデ
ノウイルス血清型の線維タンパク質は、天然において他のものよりも短く、これらの線維
タンパク質を天然線維タンパク質の代わりに使用して、アデノウイルスのその天然受容体
への結合を低減することができる。例えば、血清型５アデノウイルス由来のアデノウイル
スベクターの天然線維タンパク質は、アデノウイルス血清型４０または４１由来の線維タ
ンパク質と交換することができる。
この点について、アデノウイルスベクターを修飾して、異なる血清型のアデノウイルス
由来のアデノウイルスコートタンパク質（例えば、線維、ペントン、またはヘキソンタン
パク質）を含むようにすることができる。例えば、アデノウイルス血清型５のアデノウイ
ルスを修飾して、アデノウイルス血清型３５線維を提示するようにすることができ、これ
は転じて、任意で１つ以上の非天然アミノ酸リガンドを含み得る。天然において内耳の細
胞型に感染しないアデノウイルスベクターを利用して、ベクターを特定の細胞型に標的化
することが可能である。あるいは、天然において内耳の細胞を形質導入するアデノウイル
スベクターを修飾して、アデノウイルス線維タンパク質、および／または標的細胞に対す
る天然向性を有しないアデノウイルス由来のアデノウイルスペントンベースを提示するよ
うにすることができ、このアデノウイルスベクターは、標的細胞の形質導入を可能にする
非天然アミノ酸配列を提示することができる。
別の実施形態では、変異した核酸残基を組み込むアデノウイルスベクターがその天然基
質に結合する能力がより低くなるように、天然基質結合に関連する核酸残基は、変異され
てもよい（例えば、ＷＯ２０００／１５８２３、Ｅｉｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（２００
１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２３）： １１２８４－１１２９１、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃ
ｈｅｍ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（６）： ２７５３－２７６２
を参照されたい）。例えば、アデノウイルス血清型２および５は、アデノウイルス線維タ
ンパク質のコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）への結合、なら
びにペントンタンパク質の細胞表面上に位置するインテグリンへの結合を介して、細胞を
形質導入する。したがって、本発明の方法の複製欠損または条件的複製アデノウイルスベ
クターは、ＣＡＲへの天然結合を欠如しても、かつ／またはインテグリンへの天然結合の
低減を呈してもよい。複製欠損または条件的複製アデノウイルスベクターの宿主細胞への
天然結合を低減するために、天然ＣＡＲおよび／またはインテグリン結合部位（例えば、
アデノウイルスペントンベースに位置するＲＧＤ配列）が除去または破壊される。
アデノウイルスコートタンパク質に対する修飾により、結果として得られるアデノウイ
ルスベクターが宿主免疫系を逃れる能力を増強することができる。一実施形態では、アデ
ノウイルスベクターのＣＡＲおよび／またはインテグリンへの天然結合、ならびに１つ以
上の非天然リガンドのアデノウイルスカプシドへの組み込みを除去することによって、ア
デノウイルスベクターは、瘢痕上皮細胞（例えば、内在性、機能性有毛細胞を欠く上皮の
領域）に対して選択的に標的化される。特定の受容体を介した形質導入を媒介する好適な
リガンドは、通例のライブラリ提示技術（ファージ提示法など）を使用して決定すること
ができ、それらには、例えば、ＥＧＦに結合したリガンドおよびＦＧＦファミリーのペプ
チド由来のリガンドが含まれる。非天然アミノ酸配列およびそれらの基質の他の例には、
インテグリンによって認識される短い（例えば、６アミノ酸長以下）一続きの線状アミノ
酸、およびポリアミノ酸配列（ポリリジン、ポリアルギニンなど）が含まれるが、これら
に限定されない。キメラアデノウイルスコートタンパク質を生成するための非天然アミノ
酸配列は、ＵＳ６，４５５，３１４およびＷＯ２００１／９２５４９にさらに記載されて
いる。
アデノウイルスベクターに対する好適な修飾は、ＵＳ５，５４３，３２８、ＵＳ５，５
５９，０９９、ＵＳ５，７１２，１３６、５，７３１，１９０、ＵＳ５，７５６，０８６
、ＵＳ５，７７０，４４２、ＵＳ５，８４６，７８２、ＵＳ５，８７１，７２７、ＵＳ５
，８８５，８０８、ＵＳ５，９２２，３１５、ＵＳ５，９６２，３１１、ＵＳ５，９６５
，５４１、ＵＳ６，０５７，１５５、ＵＳ６，１２７，５２５、ＵＳ６，１５３，４３５
、ＵＳ６，３２９，１９０、ＵＳ６，４５５，３１４、ＵＳ６，４６５，２５３、ＵＳ２
００１／００４７０８１、ＵＳ２００２／００９９０２４、ＵＳ２００２／０１５１０２
７、ＷＯ１９９６／０７７３４、ＷＯ１９９６／２６２８１、ＷＯ１９９７／２００５１
、ＷＯ１９９８／０７８６５、ＷＯ１９９８／０７８７７、ＷＯ１９９８／４０５０９、
ＷＯ１９９８／５４３４６、ＷＯ２０００／１５８２３、ＷＯ２００１／５８９４０、お
よびＷＯ２００１／９２５４９に記載されている。アデノウイルスベクターの構築は、当
該技術分野においてよく理解されている。アデノウイルスベクターは、例えば、ＵＳ５，
９６５，３５８、ＵＳ６，１６８，９４１、ＵＳ６，３２９，２００、ＵＳ６，３８３，
７９５、ＵＳ６，４４０，７２８、ＵＳ６，４４７，９９５、ＵＳ６，４７５，７５７、
ＷＯ１９９８／５３０８７、ＷＯ１９９８／５６９３７、ＷＯ１９９９／１５６８６、Ｗ
Ｏ１９９９／５４４４１、ＷＯ２０００／１２７６５、ＷＯ２００１／７７３０４、およ
びＷＯ２００２／２９３８８、ならびに本明細書に特定される他の参考文献に明記される
方法を使用して、構築および／または精製することができる。さらに、アデノウイルスベ
クターを含む多数の発現ベクターが、市販されている。アデノ関連ウイルスベクターは、
例えば、ＵＳ４，７９７，３６８およびＬａｕｇｈｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｇ
ｅｎｅ ２３： ６５－７３に明記されている方法を使用して、構築および／または精製
することができる。
本発明の方法における使用のための発現ベクターの選択は、例えば、宿主、ベクターの
免疫原性、所望のタンパク質生成期間、および標的細胞などの様々な因子に依存する。各
種類の発現ベクターが異なる特性を有するため、本発明の方法は、任意の特定の状況に合
わせることができる。さらに、２種類以上の発現ベクターを使用して、核酸配列を標的細
胞に送達してもよい。したがって、本発明は、感覚的知覚を変化させ、動物における難聴
を予防または治療する方法を提供し、この方法は、無調関連因子をコードする核酸配列お
よび／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸配列を含む少なくとも２つ
の異なる発現ベクターを、内耳に投与することを含む。好ましくは、アデノウイルスベク
ターが支持細胞を効率的に形質導入し、ＨＳＶベクターがニューロンを効率的に形質導入
するという点で、内耳の標的細胞、例えば、支持細胞は、アデノウイルスベクターおよび
ＨＳＶベクターと接触させられる。当業者であれば、複数の送達系の有利な特性を十分に
利用して、内耳の感覚障害を治療または研究する能力を理解するだろう。
核酸分子。本発明の発現ベクターは、その発現が有毛細胞の再生および聴覚回復を促進
するような核酸分子を持つ。理想的には、核酸分子は、無調関連因子をコードし、ＥＧＦ
Ｒシグナル伝達の阻害剤をさらにコードすることができる。当業者であれば、任意の転写
因子（例えば、Ｍａｔｈ１もしくはＨａｔｈ１）またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が
修飾または切断されてもよく、かつ活性を保持することを理解するだろう。したがって、
治療断片（すなわち、例えば、転写を活性化するのに十分な生物学的活性を有する断片）
もまた、発現ベクターへの組み込みに好適である。同様に、転写因子で構成される融合タ
ンパク質またはその断片、および例えば、ペプチド立体構造を安定化する部分もまた、発
現ベクター内に存在してもよい。
（すなわち、無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする
）核酸分子は、望ましくは、発現カセット、すなわち、核酸分子のサブクローニングおよ
び回収（例えば、１つ以上の制限部位）または核酸分子の発現（例えば、ポリアデニル化
部位もしくはスプライス部位）を促進する機能を持つ特定の塩基配列の一部として存在す
る。発現カセットは、アデノウイルスベクターであり、（例えば、無調関連因子および／
またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする）対象となる核酸分子は、Ｅ１領域内
に位置しても（例えば、Ｅ１領域全体またはその一部を置き換える）、アデノウイルスゲ
ノムのＥ４領域内に位置してもよい。Ｅ４領域内に位置付けられる場合、スペーサー配列
は必要とされない。発現カセットは、好ましくは、３’－＞５’の配向で挿入され、例え
ば、発現カセットの転写の方向が、周囲のアデノウイルスゲノムの転写の方向と反対であ
るように配向される。無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤の発現の
ために、単一の発現カセットがアデノウイルスベクターに挿入されてもよい一方で、他の
実施形態では、アデノウイルスベクターは、無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナ
ル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を持つ複数の発現カセットを含んでもよく、該カセ
ットは、アデノウイルスゲノムの欠失した領域のいずれかを置き換えることができる。発
現カセットのアデノウイルスゲノム（例えば、ゲノムのＥ１領域）への挿入は、既知の方
法によって、例えば、アデノウイルスゲノムの所与の位置での特有の制限部位の導入によ
って促進することができる。上記に明記されるように、好ましくは、アデノウイルスベク
ターのＥ３領域は欠失しており、Ｅ４領域はスペーサーエレメントによって置き換えられ
ている。
発現のために、対象となる核酸分子は、該発現に必要な制御配列、例えば、プロモータ
ーに動作可能に連結している。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指向し
、それによりＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。核酸分子は、プロモーターがその
核酸分子の転写を指向することができる場合に、プロモーターに「動作可能に連結してい
る」。プロモーターは、それが動作可能に連結している核酸分子に対して天然であっても
非天然であってもよい。本発明に関連して、（すなわち、自然から単離されているか、ま
たは組み換えＤＮＡもしくは合成技術によって生成されているかに関わらず）任意のプロ
モーターを使用して、核酸分子の転写を提供することができる。プロモーターは、好まし
くは、真核（望ましくは、哺乳動物）細胞内の転写を指向することができる。プロモータ
ーの機能は、１つ以上のエンハンサー（例えば、ＣＭＶ最初期エンハンサー）および／ま
たはサイレンサーの存在によって改変することができる。
本発明は、ウイルスプロモーターを優先的に用いる。好適なウイルスプロモーターは、
当該技術分野において既知であり、それらには、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）プロモーター（ＣＭＶ最初期プロモーターなど）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由
来のプロモーター（ＨＩＶ末端反復プロモーターなど）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーター（ＲＳＶ末端反復、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなど）、
ＨＳＶプロモーター（Ｌａｐ２プロモーターまたはヘルペスチミジンキナーゼプロモータ
ー（Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ７８：１４４－１４５）など）、ＳＶ４０またはエプスタイン・バーウイルス由来
のプロモーター、およびアデノ関連ウイルスプロモーター（ｐ５プロモーターなど）が含
まれる。好ましくは、ウイルスプロモーターは、Ａｄ２またはＡｄ５主要後期プロモータ
ーおよび三分節リーダーなどのアデノウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーター（マウ
スまたはヒト起源）、またはＲＳＶプロモーターである。
プロモーターは、ウイルスプロモーターである必要はない。例えば、プロモーターは、
細胞プロモーター、すなわち、細胞タンパク質の発現を推進するプロモーターであっても
よい。本発明における使用のための好ましい細胞プロモーターは、治療剤（複数可）を生
成するための所望の発現プロファイルに依存するだろう。一態様では、細胞プロモーター
は、好ましくは、様々な細胞型において機能する構成的プロモーターである。好適な構成
的プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子、ハウスキーピング遺伝子、または真核
生物細胞にとって一般的な構造遺伝子の発現を推進することができる。例えば、Ｙｉｎｇ
Ｙａｎｇ１（ＹＹ１）転写因子（ＮＭＰ－１、ＮＦ－Ｅ１、およびＵＣＲＢＰとも称さ
れる）は、核マトリックスの内在的構成要素である遍在性の核転写因子である（Ｇｕｏ，
ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１０５
２６－１０５３０）。ＪＥＭ－１（ＨＧＭＷおよびＢＬＺＦ－１としても知られる、Ｔｏ
ｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２（１１）：１７３３－１７４０
、Ｔｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６９（３）：３８０－３９０
）、ユビキチンプロモーター、特にＵｂＣ（Ｍａｒｉｎｏｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．（２００
２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１９）：１６６７３－１６６８１）、ならびにβ
－アクチンプロモーター（ニワトリ由来のものなど）などが、本発明の方法における使用
に適切である。
上述のプロモーターの多くは、構成的プロモーターである。構成的プロモーターである
代わりに、プロモーターは、誘導性プロモーター、すなわち、適切なシグナルに応答して
上方および／または下方制御するプロモーターであってもよい。例えば、好適な誘導性プ
ロモーター系には、ＩＬ－８プロモーター、メタロチオニン誘導性プロモーター系、細菌
ｌａｃＺＹＡ発現系、テトラサイクリン発現系、およびＴ７ポリメラーゼ系が含まれるが
、これらに限定されない。さらに、異なる発生段階で選択的に活性化されるプロモーター
（例えば、グロビン遺伝子は、胚および成人においてグロビン関連プロモーターから差次
的に転写される）が用いられてもよい。核酸分子の発現を制御するプロモーター配列は、
外来性物質による制御に対して応答性である少なくとも１つの異種制御配列を含有し得る
。制御配列は、好ましくは、薬物、ホルモン、または他の遺伝子産物などであるがこれら
に限定されない、外来性物質に対して応答性である。例えば、制御配列、例えば、プロモ
ーターは、好ましくは、グルココルチコイド受容体ホルモン複合体に対して応答性であり
、これが転じて、治療ペプチドまたはその治療断片の転写のレベルを増強する。
好ましくは、プロモーターは、組織特異的プロモーター、すなわち、所与の組織内で優
先的に活性化され、活性化された組織内で遺伝子産物の発現をもたらすプロモーターであ
る。当業者であれば、標的組織または細胞型に基づいて、本発明における使用のための組
織特異的プロモーターを選択することができる。好適なプロモーターには、ＢＲＮ．３Ｃ
、ＢＲＮ３．１、ＰＯＵ ＯＲＦ３因子プロモーター、ＢＲＫ１、ＢＲＫ３、コーディン
プロモーター、ノギンプロモーター、ｊａｇｇｅｄ１プロモーター、ｊａｇｇｅｄ２プロ
モーター、およびｎｏｔｃｈ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。有毛
細胞内で機能する無調プロモーターもしくはミオシンＶＩＩａプロモーター、または支持
細胞内で機能するｈｅｓ－１プロモーターなどの、本発明における使用に好ましい組織特
異的プロモーターは、支持細胞または感覚有毛細胞に特異的である。理想的には、瘢痕上
皮において導入遺伝子の発現を促進するプロモーターが選択される。
本発明における使用のためのプロモーターはまた、その特定の活性パターンを所望のタ
ンパク質（例えば、無調関連因子）の発現の所望のパターンおよびレベルと適合させるこ
とによっても選択することができる。あるいは、複数のプロモーターの所望の態様を組み
合わせるハイブリッドプロモーターを構築してもよい。例えば、ＣＭＶプロモーターの初
期の激しい活性を、ＲＳＶプロモーターの高い維持レベルの活性と組み合わせるＣＭＶ－
ＲＳＶハイブリッドプロモーターが、本発明の方法の多くの実施形態における使用に本質
的に好ましい。研究者による操作が可能な発現プロファイルを有するプロモーターを選択
することもまた可能である。
これに沿って、タンパク質生成を最適化するために、好ましくは、核酸分子は、核酸分
子のコーディング領域の後にポリアデニル化部位をさらに含む。合成最適化配列だけでな
く、ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、Ｅ
ＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、ならびにパピローマウイルス（ヒトパピローマウ
イルスおよびＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含む）のポリアデニル化配列も含む、
任意の好適なポリアデニル化配列を使用することができる。好ましいポリアデニル化配列
は、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス４０）ポリアデニル化配列である。また、好ましくは、
核酸分子がそれが導入される細胞内で適切に発現されるように、全ての適切な転写シグナ
ル（および適切な場合、翻訳シグナル）が正確に配置される。所望される場合、核酸分子
はまた、ｍＲＮＡ産生を促進するためのスプライス部位（すなわち、スプライス受容部位
およびスプライス供与部位）を組み込んでもよい。さらに、核酸分子が、タンパク質、ま
たはプロセシングもしくは分泌されるタンパク質であるペプチドをコードするか、または
細胞内で作用する場合、好ましくは、核酸分子は、プロセシング、分泌、および細胞内局
在化などに適切な配列をさらに含む。
特定の実施形態では、無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤の発
現を調節することが有利であり得る。核酸分子の発現を調節する特に好ましい方法は、発
現ベクターへの部位特異的組み換え部位の付加を伴う。部位特異的組み換え部位を有する
発現ベクターをリコンビナーゼと接触させることで、コーディング配列の転写が上方もし
くは下方制御されるか、または組み換え事象を通して１つのコーディング配列の転写の上
方制御および別のコーディング配列の転写の下方制御が同時に行われる。核酸配列の転写
を調節するための部位特異的組み換えの使用は、例えば、ＵＳ５，８０１，０３０、ＵＳ
６，０６３，６２７、およびＷＯ９７／０９４３９に記載されている。
無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子の内
耳への送達には、いくつかの選択肢が利用可能である。無調関連因子をコードする核酸分
子はまた、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤もコードし得る。あるいはまたは加えて、発現
ベクターは、無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする複
数の発現カセットを含んでもよい。複数のコーディング配列が、異なるプロモーター、例
えば、異なるレベルおよびパターンの活性を有する異なるプロモーターに動作可能に連結
していてもよい。あるいは、複数のコーディング配列が、同じプロモーターに動作可能に
連結されて、多シストロン性エレメントが形成されてもよい。本発明はまた、発現ベクタ
ーのカクテル（各発現ベクターは、無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の
阻害剤をコードする）を内耳に投与することも企図する。発現ベクターのカクテルは、異
なる種類の発現ベクター、例えば、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベ
クターをさらに含んでもよい。
上記に照らして、本発明は、無調関連因子（例えば、Ｍａｔｈ１もしくはＨａｔｈ１）
および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子（複数可）を持つア
デノウイルスベクターをさらに提供し、核酸分子（複数可）は、無調関連因子および／ま
たはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤の発現に必要な制御配列に動作可能に連結している。
アデノウイルスベクターは、少なくともＥ４領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能
を欠損している。核酸分子は、任意の供給源から得ること（例えば、自然からの単離、合
成的な生成、および遺伝子操作された生物からの単離など）ができる。適切なアデノウイ
ルスベクターおよび制御配列が、本明細書で考察される。
さらに、本発明は、分化した感覚上皮において有毛細胞をインビボで生成する方法をさ
らに提供する。この方法は、分化した感覚上皮細胞を、（ａ）Ｅ１領域、Ｅ４領域の１つ
以上の複製必須遺伝子機能、および任意で１つ以上のＥ３領域の遺伝子機能を欠損してお
り、（ｂ）Ｅ４領域内にスペーサーを有し、かつ（ｃ）無調関連因子および／またはＥＧ
ＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子（複数可）を持つ、アデノウイルスベク
ターと接触させることを伴う。核酸分子（複数可）は、有毛細胞が生成されるように、無
調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤を生成するために発現される。
アデノウイルスベクターを使用してインビボで有毛細胞を生成することができる（したが
って、それが聴覚障害または平衡障害の予防的または治療的な処置に有用である）一方で
、支持細胞の分化転換はインビトロで生じることができ、したがって、研究方法において
使用することができる。
投与経路。当業者であれば、薬物または発現ベクター（アデノウイルスベクターなど）
を内耳に投与する好適な方法が利用可能であることを理解するだろう。２つ以上の経路を
使用して、特定の薬物または発現ベクターが投与されてもよいが、特定の経路は、別の経
路よりも即時性かつ効果的な反応を提供することができる。したがって、記載の投与経路
は単なる例示であるに過ぎず、決して限定的なものではない。
投与経路に関わらず、本発明の方法の薬物または発現ベクターは、理想的には、内耳の
感覚上皮に到達する。したがって、最も直接的な投与経路は、内耳構造の内部へのアクセ
スを可能にする外科手技を必要とする。蝸牛切開を介した接種により、聴覚に関連する内
耳領域に発現ベクターを直接的に投与することが可能になる。蝸牛切開は、蝸牛壁を通し
て、例えば、Ｋａｗａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ ４（６）：５７５－５８５）に記載のようにアブミ骨動脈下の迷路骨包に穴
を開け、薬物または発現ベクターを含有する薬学的組成物を放出することを伴う。内リン
パ区画への投与は、聴覚を担う内耳領域へのアデノウイルスベクターの投与に特に有用で
ある。あるいは、薬物または発現ベクターは、管切開を介して三半規管に投与されてもよ
い。管切開は、前庭系および蝸牛における導入遺伝子の発現を提供する一方で、蝸牛切開
は、前庭腔ではそれほど効率的な形質導入を提供しない。蝸牛機能に対する損傷のリスク
は、管切開を使用することで、蝸牛腔への直接注射が有毛細胞に機械的損傷をもたらし得
るのと同程度まで低減される（Ｋａｗａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．、上記）。投与手順はま
た、流体（例えば、人工外リンパ）下で実行することができ、これは、アポトーシス阻害
剤または抗炎症剤などの治療または投与手順の副作用を軽減する因子を含み得る。
内耳への別の直接的な投与経路は、正円窓への注射または局所適用のいずれかによる正
円窓を通したものである。正円窓を介した投与は、薬物またはアデノウイルスベクターを
外リンパ腔に送達するのに特に好ましい。蝸牛および前庭ニューロンならびに蝸牛感覚上
皮における導入遺伝子の発現が、正円窓を介した発現ベクターの投与後に観察されている
（Ｓｔａｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｃｔａ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１
２１：１５７－１６３）。注目すべきことに、発現ベクター、特に非標的化アデノウイル
スベクターの内耳細胞への取り込みが、受容体によって媒介されない可能性があるようで
ある。換言すると、内耳細胞のアデノウイルス感染は、ＣＡＲまたはインテグリンによっ
ては媒介されないようである。外リンパ区画への投与後に、コルチ器官における細胞の形
質導入を増加させるために、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターの標的
細胞（例えば、支持細胞、血管条細胞など）への取り込みを増強する１つ以上のリガンド
を提示してもよい。この点について、アデノウイルスベクターは、天然結合（例えば、Ｃ
ＡＲ結合および／またはインテグリン結合）を低減するように修飾され、内耳の標的細胞
によるアデノウイルスベクターの取り込みを増強する非天然アミノ酸配列を持つ、１つ以
上のアデノウイルスコートタンパク質をコードし得る。
薬物または発現ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）は、内耳への投与のため
の薬学的組成物中に存在してもよい。特定の場合、支持細胞が薬物または発現ベクターに
十分に曝露されることを確実にするために、複数の適用を投与すること、ならびに／また
は複数の経路（例えば、管切開および蝸牛切開）を用いることが適切であり得る。
薬物または発現ベクターは、スポンジ、網目構造、機械的リザーバーもしくはポンプ、
または機械的移植片などの、薬物または発現ベクターの放出制御または徐放を可能にする
デバイス内またはその上に存在してもよい。例えば、薬物または発現ベクターを含有する
薬学的組成物に浸漬した生体適合性スポンジまたはゲルフォームが正円窓に隣接して置か
れ、それを通して薬物または発現ベクターが透過して、蝸牛に到達する（Ｊｅｒｏ，ｅｔ
ａｌ．、上記に記載）。ミニ浸透圧ポンプは、長期間（例えば、５～７日間）にわたる
薬物または発現ベクターの徐放を提供し、薬物または発現ベクターを含有する小体積の組
成物の投与を可能にし、これにより、内在性感覚細胞に対する機械的損傷を予防すること
ができる。薬物または発現ベクターはまた、例えば、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポ
リホスホエステル（ビス－２－ヒドロキシエチル－テレフタレート（ＢＨＥＴ）など）、
またはポリ乳酸・グリコール酸を含有する徐放性製剤（例えば、ＵＳ５，３７８，４７５
を参照されたい）の形態で投与することもできる。
あるいは、薬物または発現ベクターは、非経口、筋肉内、静脈内、経口、または腹腔内
投与されてもよい。好ましくは、耳において感覚有毛細胞を生成させるために、患者に非
経口投与される薬物または発現ベクターは、支持細胞などの感覚上皮細胞に特異的に標的
化される。望ましくは、発現ベクターは、外来性有毛細胞の生成を促進して損傷した内在
性有毛細胞を置き換えるように、瘢痕感覚上皮に標的化される。本明細書で考察されるよ
うに、発現ベクターを修飾して、潜在的な宿主細胞上の受容体に対する発現ベクターの結
合特異性または認識を改変してもよい。アデノウイルスに関して、そのような操作には、
線維領域、ペントン領域、またはヘキソン領域の欠失、および様々な天然または非天然リ
ガンドのコートタンパク質の一部分への挿入などが含まれ得る。当業者であれば、発現ベ
クターを適切な宿主細胞に効果的に送達するために、非経口投与が大用量または複数回投
与を必要とし得ることを理解するだろう。組成物にとって薬学的に許容される担体は、当
業者にとって周知である（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ，（１９８２）Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅ
ｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ２
３８－２５０、ＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ
（１９８６）Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ６２２－６３０を参照された
い）。好ましさの程度ではより低いが、発現ベクターは、微粒子銃（すなわち、遺伝子銃
）によってインビボで投与されてもよい。
当業者であれば、投薬量および投与経路は、宿主の免疫系による発現ベクターの喪失を
最小化するように選択され得ることもまた理解するだろう。例えば、インビボで標的細胞
を接触させるために、本発明の方法を実行する前に、ヌル発現ベクター（すなわち、対象
となる核酸分子（複数可）を持たない発現ベクター）を宿主に投与することが有利であり
得る。ヌル発現ベクターの事前投与は、発現ベクターに対する宿主の免疫が身体の自然排
除機構を妨害するようにし、それにより免疫系によって排除されるベクターの量を低下さ
せる役割を果たし得る。
投薬量。本発明に従って、動物、特にヒトに投与される薬物または発現ベクターの用量
は、合理的な時間枠にわたって動物における所望の応答に影響を与えるのに十分であるべ
きである。当業者であれば、投薬量が、年齢、種、損傷した感覚上皮の位置、問題となっ
ている病理（存在する場合）、および病態または病状を含む様々な因子に依存することを
認識するだろう。投薬量はまた、無調関連因子、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、および
／または細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ならびに形質導入される感覚上皮の量
にも依存する。用量のサイズはまた、投与の経路、タイミング、および頻度だけでなく、
特定の発現ベクターまたは薬物の投与に伴い得るあらゆる有害な副作用（例えば、外科的
外傷）の存在、性質、および程度、ならびに所望の生理学的効果によっても決定されるだ
ろう。当業者であれば、様々な病態または病状、特に慢性病態または病状が、複数回の投
与を伴う治療の延長を必要とし得ることを理解するだろう。
好適な用量および投薬量レジメンは、当業者にとって既知である従来の範囲検索技術に
よって決定することができる。発現ベクターがウイルスベクターである場合、最も好まし
くは、約１０５個のウイルス粒子～約１０１２個のウイルス粒子のアデノウイルスベクタ
ーが患者に送達される。換言すると、約１０５個の粒子／ｍｌ～約１０１３個の粒子／ｍ
ｌ（約１０５個の粒子／ｍｌ～約１０１３個の粒子／ｍｌの範囲内の全ての整数を含む）
、好ましくは約１０１０個の粒子／ｍｌ～約１０１２個の粒子／ｍｌの発現ベクター濃度
を含む薬学的組成物が投与されてもよく、典型的には、約０．１μｌ～約１００μｌのそ
のような薬学的組成物を内耳に直接投与することを伴うだろう。上記に照らして、１回の
投与の用量は、好ましくは少なくとも約１×１０６個の粒子（例えば、約４×１０６～４
×１０１２個の粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７個の粒子、より好ましく
は少なくとも約１×１０８個の粒子（例えば、約４×１０８～４×１０１１個の粒子）、
および最も好ましくは少なくとも約１×１０９個の粒子～少なくとも約１×１０１０個の
粒子（例えば、約４×１０９～４×１０１０個の粒子）の、無調関連因子および／または
同時転写因子および／または遺伝子サイレンシング複合体の阻害剤をコードする核酸分子
を持つアデノウイルスベクターである。あるいは、薬学的組成物の用量には、約１×１０
１４個以下の粒子、好ましくは約１×１０１３個以下の粒子、さらにより好ましくは約１
×１０１２個以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０１１個以下の粒子、および最
も好ましくは約１×１０１０個以下の粒子（例えば、約１×１０９個以下の粒子）が含ま
れる。換言すると、薬学的組成物の単回用量は、約１×１０６個の粒子単位（ｐｕ）、４
×１０６ｐｕ、１×１０７ｐｕ、４×１０７ｐｕ、１×１０８ｐｕ、４×１０８ｐｕ、１
×１０９ｐｕ、４×１０９ｐｕ、１×１０１０ｐｕ、４×１０１０ｐｕ、１×１０１１ｐ
ｕ、４×１０１１ｐｕ、１×１０１１ｐｕ、４×１０１１ｐｕ、１×１０１２ｐｕ、また
は４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクタ
ー）であり得る。発現ベクターがプラスミドである場合、好ましくは、約０．５ｎｇ～約
１０００μｇのＤＮＡが投与される。より好ましくは、約０．１μｇ～約５００μｇが投
与され、さらにより好ましくは、約１μ～約１００μｇのＤＮＡが投与される。最も好ま
しくは、約５０μｇのＤＮＡが内耳に投与される。当然のことながら、他の投与経路では
、治療効果を達成するのに、より少ないかまたはより多い用量が必要とされ得る。当業者
であれば、当該技術分野において既知である通例の技術を使用して、投薬量および投与経
路のあらゆる必要な変動を決定することができる。
内耳構造の内腔は、限られている。入れようとする組成物が多すぎると感覚上皮を損傷
してしまうため、内耳構造に直接投与される薬学的組成物の体積は、慎重に監視されるべ
きである。ヒト患者の場合、投与される体積は、好ましくは、約１０μｌ～約２ｍｌ（例
えば、約２５μｌ～約１．５ｍｌ）の組成物である。例えば、約５０μｌ～約１ｍｌ（例
えば、約１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、
７００μｌ、８００μｌ、または９００μｌ）の組成物が投与されてもよい。一実施形態
では、内耳構造（例えば、蝸牛または三半規管）の内容液全体が、薬学的組成物で置き換
えられる。別の実施形態では、機械的外傷を最小化するために、本発明の薬学的組成物は
、内耳構造に緩徐に放出される。
２回以上の（すなわち、複数回）用量の、無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナ
ル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を持つ薬物または発現ベクターを投与することが、
有利であり得る。本発明の方法は、感覚上皮において有毛細胞を生成して、動物の感覚的
知覚を変化させるための、複数回用量の薬物または発現ベクターの投与を提供する。例え
ば、少なくとも２回用量の薬物または発現ベクターが、同じ耳に投与されてもよい。好ま
しくは、複数回用量は、バックグラウンドレベルを超える遺伝子発現を保持しながら投与
される。また好ましくは、内耳の感覚上皮は、約３０日以内に２回用量以上の薬物または
発現ベクターと接触させられる。より好ましくは、約９０日以内に２回以上の適用が内耳
に投与される。しかしながら、任意の時間枠内（例えば、２日、７日、１０日、１４日、
２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、７０日、７７日、８５日、
またはそれ以上の用量間隔）に３回、４回、５回、６回、またはそれ以上の用量が投与さ
れてもよい。
薬学的組成物。本発明の薬物または発現ベクターは、望ましくは、薬学的に許容される
担体および薬物または発現ベクター（複数可）を含む薬学的組成物中で投与される。本発
明の文脈では、任意の好適な薬学的に許容される担体を使用することができ、そのような
担体は、当該技術分野において周知である。担体の選択は、一部には、組成物が投与され
る特定の部位および組成物の投与に使用される特定の方法によって決定されるだろう。理
想的には、アデノウイルスベクターの文脈では、薬学的組成物は、好ましくは、複製可能
なアデノウイルスを含まない。
好適な製剤は、水溶液および非水溶液、等張無菌溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、お
よび意図されるレシピエントの内耳の血液または流体と製剤を等張にする溶質）、ならび
に懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水溶性および非水溶性無
菌懸濁液を含む。製剤は、市販の人工内リンパまたは外リンパを含んでもよい。製剤は、
アンプルおよびバイアルなどの、単位用量または複数回用量の密閉された容器内に提示さ
れてもよく、使用直前に無菌液体担体、例えば、水の添加だけが必要なフリーズドライ（
凍結乾燥）状態で保管されてもよい。即時型溶液および懸濁液は、既に記載した種類の無
菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。好ましくは、薬学的に許容される
担体は、緩衝食塩溶液である。より好ましくは、本発明の方法における使用のための発現
ベクターは、投与前の発現ベクターを損傷から保護するように製剤化された薬学的組成物
中で投与される。例えば、薬学的組成物は、発現ベクターの調製、保管、または投与に使
用されるデバイス（ガラス器具、シリンジ、または針など）での発現ベクターの喪失を低
減するように製剤化することができる。薬学的組成物は、発現ベクターの光感受性および
／または温度感受性を低下させるように製剤化することができる。この目標を達成するた
めに、薬学的組成物は、好ましくは、例えば、上述のものなどの薬学的に許容される液体
担体と、ポリソルベート８０、Ｌ－アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、
およびそれらの組み合わせからなる群から選択される安定剤と、を含む。そのような薬学
的組成物の使用は、ベクターの有効期間を延長し、投与を容易にし、本発明の方法の効率
を増加させるだろう。この点について、薬学的組成物はまた、形質導入効率を増強するよ
うに製剤化することもできる。加えて、当業者であれば、発現ベクター、例えば、ウイル
スベクターが、他の治療剤または生物活性剤とともに組成物中に存在してもよいことを理
解するだろう。例えば、特定の適応症の治療に有用な治療因子が存在してもよい。ウイル
スベクターのインビボ投与に関連する腫脹および炎症を低減するために、イブプロフェン
またはステロイドなどの炎症を制御する因子が、組成物の一部であってもよい。ベクター
自体に対する、または内耳の障害に関連するあらゆる免疫応答を低減するために、本発明
の方法と併用して、免疫系抑制因子が投与されてもよい。血管新生因子、神経栄養因子、
および増殖剤などが、薬学的組成物中に存在してもよい。同様に、ビタミンおよびミネラ
ル、抗酸化剤、ならびに微量栄養素が同時投与されてもよい。遺伝子導入手順に関連する
感染症および他の障害のリスクを低減するために、抗生物質、すなわち、殺菌剤および殺
真菌剤が存在してもよい。
他の考慮事項。本発明の方法は、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、および／または無調
関連因子をコードする核酸分子（複数可）を持つ発現ベクター（複数可）を投与して、内
耳の感覚上皮における有毛細胞の生成によって、動物の感覚的知覚を変化させることを含
む。無調関連因子をコードする核酸分子は、複数（すなわち、２つ、３つ、またはそれ以
上）の無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードすることがで
きる。しかしながら、単に有毛細胞を生成するだけでは、動物における感覚的知覚の変化
は確実にはならない。十分な数の有毛細胞が生成されるべきであり、それらの感覚有毛細
胞は、脳にシグナルを伝達することができる神経回路網に連結されるべきである。したが
って、必須ではないが、脳へのシグナルの適切な受信および伝達を確実にするための追加
の因子を提供することが有利であり得る。
本明細書に考察されるように、複数のコーディング配列の内耳への送達には、いくつか
の選択肢が利用可能である。無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤
をコードする核酸分子（複数可）は、追加の遺伝子産物をコードしてもよい。あるいはま
たは加えて、発現ベクターは、異なる遺伝子産物をコードする複数の発現カセットを含ん
でもよい。複数のコーディング配列が、異なるプロモーター、例えば、異なるレベルおよ
びパターンの活性を有する異なるプロモーターに動作可能に連結していてもよい。あるい
は、複数のコーディング配列が、同じプロモーターに動作可能に連結されて、多シストロ
ン性エレメントが形成されてもよい。本発明はまた、発現ベクターのカクテル（各発現ベ
クターは、無調関連因子または感覚的知覚に有益な別の遺伝子産物をコードする）を内耳
に投与することも企図する。発現ベクターのカクテルは、異なる種類の発現ベクター、例
えば、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターをさらに含んでもよい
。
あるいは、またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、および／または無調関連因子をコー
ドする核酸分子（複数可）を持つ発現ベクター（複数可）に加えて、本発明の方法はまた
、発現ベクターによってコードされないＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤と併用して、無調
関連因子をコードする核酸分子を持つ発現ベクターを投与することも含む。この点では、
本明細書に開示される方法および薬学的組成物は、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する、単
離された阻害性ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、抗体、または小有機分子と組み合わ
せて、無調関連因子をコードする核酸分子を持つ発現ベクターを含むように修飾すること
ができる。さらに、本明細書に開示される方法および薬学的組成物は、（ｉｉ）ＥＧＦＲ
シグナル伝達を阻害する、単離された阻害性ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、抗体、
または小有機分子と組み合わせて、（ｉ）無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル
伝達の阻害剤をコードする核酸分子（複数可）を持つ発現ベクター（複数可）を含むよう
に修飾することができる。
本明細書に開示される方法を実行するために、本発明はまた、キットも提供する。理想
的には、キットは、無調関連因子をコードする核酸分子と、（ｉ）上皮成長因子受容体（
ＥＧＦＲ）シグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子、（ｉｉ）ＥＧＦＲシグナル伝達
の単離阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ
、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、
もしくは細胞周期関連キナーゼのうちの１つ以上を阻害する、阻害性ＲＮＡもしくは小有
機分子）、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせと、を含む。加えて、キ
ットは、凍結乾燥または液体形態の活性成分を含有する容器（例えば、バイアル、瓶、シ
リンジ、または管）、ならびに投薬、投与、および投与のタイミングなどに関する情報を
含むキット構成要素の使用のための指示書を含んでもよい。キットは、活性成分の適応症
、科学文献への参照、包装材料、および臨床試験結果などをさらに含んでもよい。情報は
、様々な研究、例えば、インビボモデルに関与する実験動物を使用する研究、およびヒト
臨床試験に基づく研究の結果に基づくものであり得る。
好ましい一実施形態では、本発明の方法はまた、少なくとも１つの神経栄養剤をコード
する核酸分子の送達も企図する。理想的には、神経栄養剤は、神経プロセスの成長、発生
、および／または成熟を誘導する神経成長刺激剤である。神経栄養因子はまた、既存また
は発生中のニューロンを保護または維持するために投与されてもよい。新たに生成された
有毛細胞が適切に機能するためには、神経回路網が神経活動電位を脳に伝達するための所
定の場所にあるべきである。したがって、新たな有毛細胞を生成しながら内耳の感覚上皮
に関連する既存のニューロンを保護すること、新たな神経プロセスの成長および成熟を誘
導すること、ならびに／または単純に既存の神経プロセスを感覚有毛細胞に対して指向す
ることが有利であり得る。神経栄養因子は、３つのサブクラス、つまり神経新生サイトカ
イン、ニューロトロフィン、および線維芽細胞成長因子に分けられる。毛様体神経栄養因
子（ＣＮＴＦ）は、神経新生サイトカインの例示的なものである。ＣＮＴＦは、毛様体神
経節ニューロンの生存を促進し、ＮＧＦ反応性である特定のニューロンを支持する。ニュ
ーロトロフィンには、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（Ｎ
ＧＦ）（これは神経突起伸長を刺激する）が含まれる。他の神経栄養因子には、例えば、
トランスフォーミング成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロト
ロフィン３、ニューロトロフィン４／５、およびインターロイキン１－βが含まれる。神
経細胞栄養因子は、ニューロン生存を増強し、かつ本発明の方法における使用にも好適で
ある。神経細胞栄養因子が、実際にはニューロンの分解を逆転させることができると仮定
されている。おそらく、そのような因子は、老化、感染症、または外傷に関連するニュー
ロンの変性を治療する上で有用である。好ましい神経細胞栄養因子は、色素上皮由来因子
（ＰＥＤＦ）である。ＰＥＤＦは、Ｃｈａｄｅｒ（１９８７）Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔ．２０：２０９－２１６、Ｐｉｇｎｏｌｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６８（１２）：８９４９－８９５７、ＵＳ５，８４０，６８６、ＷＯ１９
９３／２４５２９、ＷＯ１９９９／０４８０６、およびＷＯ２００１／５８４９４にさら
に記載されている。
増殖剤は、細胞増殖、好ましくは内耳における支持細胞の増殖を誘導する。有毛細胞前
駆体の数の増加は、無調関連因子および／または同時転写因子および／または遺伝子サイ
レンシング複合体の阻害剤の生物学的効果を最大化する。支持細胞の増殖は、線維芽細胞
成長因子（ＦＧＦ、特にＦＧＦ－２）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（
ＥＧＦ）、Ｅ２Ｆ、および細胞周期上方制御因子などの***促進成長因子によって誘導さ
れる。増殖剤をコードする核酸配列は、本発明の方法における無調関連因子および／また
はＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子（複数可）と併用して投与するこ
とができる。所望される場合、増殖剤をコードする核酸分子は、複製されるべき細胞型に
対してのみ、その生物学的効果を発揮するように操作されてもよい。支持細胞について、
核酸は、支持細胞内で優先的に活性化される制御配列を含み得る。結果として得られる増
殖剤もまた、細胞環境への分泌を予防するように操作されてもよい。あるいは、細胞増殖
を促進するか、または発現ベクターの取り込みを増強するための物質が、内耳に投与され
てもよい。
本発明の方法は、他の治療様式を伴う治療レジメンの一部であってもよい。したがって
、本発明の方法を用いて、感覚障害（すなわち、聴覚障害または平衡障害）を予防的また
は治療的に処置する場合、薬物療法または外科手術などのいくつかの他の療法いずれかで
治療されたことがある、治療されている、または治療される予定であることが適切である
。本発明の方法はまた、人工内耳などの聴覚デバイスの移植と併用して実行してもよい。
本発明の方法はまた、内耳における幹細胞による細胞集団の再生を伴う手順に特に適して
いる。この態様では、本発明の方法をエクスビボで実践して、幹細胞を形質導入し、これ
をその後内耳に移植してもよい。
発現ベクターは、好ましくは、哺乳動物などの動物が感覚有毛細胞の変性のリスクにあ
ると決定された後（予防的処置）、または感覚有毛細胞の数の低減もしくは損傷が実証さ
れた後（治療的処置）、可能な限り速やかに投与される。治療は、一部には、使用される
特定の核酸分子、発現される特定の無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の
阻害剤、発現ベクター、投与経路、ならびに（存在する場合）認識される有毛細胞喪失ま
たは損傷の原因および程度に依存するだろう。
無調関連因子および／またはＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子（複
数可）を持つ発現ベクター（複数可）は、所与の動物、特にヒトから以前に除去されてい
る細胞内にエクスビボで導入することができる。そのように形質導入された自己または相
同体宿主細胞は、動物またはヒトの内耳に再導入されて、無調関連因子および／またはＥ
ＧＦＲシグナル伝達の阻害剤を発現し、インビボで成熟有毛細胞に分化する、前駆体細胞
であり得る。当業者であれば、そのような細胞は患者から単離される必要はないが、代わ
りに、別の個体から単離し、患者に移植してもよいことを理解するだろう。
本発明の方法はまた、他の薬学的に活性な化合物の同時投与も伴い得る。「同時投与」
によって、上述の発現ベクターの投与前、それと同時（例えば、同じ製剤中もしくは別個
の製剤中の発現ベクターと併用して）、またはその後の投与が意味される。例えば、発現
ベクターの投与に関連する腫脹および炎症を低減するために、イブプロフェンまたはステ
ロイドなどの炎症を制御する因子が同時投与されてもよい。内耳障害または本発明の方法
の実施に関連する不適切な免疫応答を低減するために、免疫抑制剤が同時投与されてもよ
い。同様に、ビタミンおよびミネラル、抗酸化剤、ならびに微量栄養素が同時投与されて
もよい。外科手技に関連する感染症のリスクを低減するために、抗生物質、すなわち、殺
菌剤および殺真菌剤が同時投与されてもよい。
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示するために提供される。
実施例１：有毛細胞再生のためのＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害
転写因子であるＡｔｏｈ１は、新生児および幼若哺乳動物の蝸牛において非感覚支持細
胞（ＳＣ）を有毛細胞（ＨＣ）に変換することができる（Ｉｚｕｍｉｋａｗａ，ｅｔ ａ
ｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：２７１－６、Ｋｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．
（２０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２：６６９９－７１０、Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（
２０１２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２：６６００－１０）。Ａｔｏｈ１の異所性発現は
、遺伝子療法として臨床試験に承認されている。しかしながら、Ａｔｏｈ１誘導性ＨＣ変
換は、非効率的（１７％未満）、不完全（成熟ＨＣマーカーを欠如する）、かつ年齢依存
性（成体蝸牛では応答がない）である（Ｉｚｕｍｉｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．（２００８）
Ｈｅａｒｉｎｇ Ｒｅｓ．２４０：５２－６、Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．３２：６６００－１０）。成体マウス蝸牛におけるＳＣ、内在性外ＨＣ
（ＯＨＣ）、およびＡｔｏｈ１誘導性ＨＣ（ｃＨＣ）のトランスクリプトームを比較する
ためのＲＮＡ配列分析を使用すると、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を使用して、上
皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達がＳＣおよびｃＨＣにおいて濃縮されている
ことが観察された。エクスビボでのＥＧＦＲ経路の役割を検証するために、新生仔マウス
の蝸牛外植片を強力なＥＧＦＲ阻害剤（ＡＧ１４７８）で治療した。この分析は、ＡＧ１
４７８がそれ自体で、７日後に、内在性ＳＣおよびＨＣの増殖および分化に対して影響を
有しないことを示した。しかしながら、ＡＧ１４７８をＡｔｏｈ１と組み合わせた場合、
外植片ＳＣからのＡｔｏｈ１誘導性ＨＣ変換の有意な増加が存在した（２４．７％から８
０．６％、図１Ａ～１Ｄ）。加えて、ＷＰ１０６６（ＳＴＡＴ３阻害剤）、ＬＹ２９４０
０２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）、Ｕ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）、およびＵ７３１２２（ＰＬＣ阻
害剤）を含む、ＥＧＦＲシグナル伝達の下流のタンパク質を標的化する阻害剤を、それら
それぞれのＥＣ５０値を超える様々な用量で試験した。ＰＬＣ阻害を除いて、Ａｔｏｈ１
誘導性ＨＣの変換率において類似した増強が観察された（図２）。この分析は、ＥＧＦＲ
シグナル伝達経路がＨＣへのＳＣ変換において新規の役割を果たすことを示している。発
生において重要であることが知られている（Ｄｏｅｔｚｌｈｏｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２
００４）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７２：４３２－４７、Ｙａｍａｓｈｉｔａ＆Ｏｅｓｔｅｒ
ｌｅ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：３１５２－５）
一方で、ＥＧＦＲシグナル伝達は、ＨＣ再生とは以前に関係付けられていない。
ＨＣ再生におけるＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤の使用をさらに評価するために、新生
児および成体マウスにおけるＡＧ１４７８の毒性を評価した。この分析に基づいて、ＦＶ
Ｂにおける生後１日（Ｐ１）のＡＧ１４７８の平均致死用量（ＬＤ５０）を、腹腔内（Ｉ
Ｐ）注射を介して３０ｍｇ／ｋｇであると推定した。成体（Ｐ２１日超）ＦＶＢマウスに
ついて、経鼓膜（ＴＴ）注射の７日後、１０μｇのＡＧ１４７８は、聴性脳幹反応（ＡＢ
Ｒ）閾値の有意な変化をもたらさなかった。
実施例２：Ａｔｏｈ１を過剰発現するマウスにおけるＥＧＦＲ欠損のモデル
Ｐｒｏｘ１－ＣｒｅＥＲ（Ｐｒｏｘ１）、ＣＡＧ－ｌｏｘｐ－ｓｔｏｐ－ｌｏｘｐ－Ａ
ｔｏｈ１－ＨＡ（ＨＡ）、およびＥＧＦＲｆｌｏｘ／ｆｌｏｘを交雑して、誘導性マウス
株（Ｐｒｏｘ１；ＨＡ；ＥＧＦＲｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、またはＰＨＥＲ）を生成し、これ
らのマウス株では、タモキシフェン誘導時に新生児および幼若ＳＣ（ＨＣ（ＯＨＣ）下の
ダイテルス細胞（ＤＣ）および柱細胞（ＰＣ））において特異的にＥＧＦＲ欠失とともに
Ａｔｏｈ１過剰発現を達成することができた。誘導から３および６週間後、ＨＣマーカー
（初期および後期）の発現ならびに形態を免疫組織化学によってアッセイし、新たに生成
したＨＣの電気生理学的プロファイルをＨＡ染色で検査した。
同様に、Ｇｌａｓｔ－ＣｒｅＥＲ（Ｇｌａｓｔ）をＨＡおよびＥＧＦＲｆｌｏｘ／ｆｌ
ｏｘとともに使用して、内ＨＣ（ＩＨＣ）下の内指節細胞および内境界細胞を特異的に標
的化するマウス株（Ｇｌａｓｔ；ＨＡ；ＥＧＦＲｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、またはＧＨＥＲ）
を生成した。加えて、Ｆｇｆｒ３－ＣｒｅＥＲ；ＨＡ；ＥＧＦＲｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、ま
たはＦＨＥＲマウスを生成して、成体ダイテルス細胞および柱細胞を標的化した。Ｃｒｅ
活性をＰ２８成体年齢で誘導し、３および６週間後のＨＣ再生を調査する。ＥＧＦＲ発現
を欠損しているマウスでは、ＨＣへのＳＣ変換の増加が観察されることが予想される。
加えて、生後１ヶ月のマウスを、１２０ｄＢのＳＰＬで８～１６ｋＨｚのオクターブバ
ンドの騒音に２時間曝露して、ＯＨＣ喪失および難聴を誘導する。その後、曝露から７日
後に、タモキシフェンでＨＣ再生を誘導する。騒音損傷前、騒音損傷の７日後、およびタ
モキシフェン誘導の３週間後に、動物のＡＢＲを試験して、マウスモデルにおけるＨＣ再
生の分子経路をさらに決定する。
実施例３：Ａｔｏｈ１を過剰発現するマウスにおけるＥＧＦＲ阻害剤の治療潜在性
Ａｔｏｈ１過剰発現を有するマウスモデル（ＰＨ、ＧＨ、およびＦＨ）において選択し
たＥＧＦＲ阻害剤を試験して、それらが実施例２に上述の遺伝子モデル（すなわち、それ
ぞれＰＨＥＲ、ＧＨＥＲ、およびＦＨＥＲ）を模倣する潜在性を確認する。エルロチニブ
、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＮＴ－１１３、ＡＺＤ３７５９、およびダコミチニブを
含む６つの高度に強力かつ特異的なＥＧＦＲ阻害剤を、０．２～３３ｎＭのＥＣ５０値で
個々に試験する。これらの化合物は、ＦＤＡによって承認されているか、または他の疾患
のために臨床試験されており、種にわたって比較的特徴がはっきりした吸収、分布、代謝
、***、および毒性（ＡＤＭＥＴ）特性を有する。この分析のために、マウスモデル（Ｐ
Ｈ、ＧＨ、およびＦＨ）において、タモキシフェンでＳＣ内のＡｔｏｈ１過剰発現を誘導
する。その後、選択した化合物をＩＰまたはＴＴ注射によって送達する。血漿、蝸牛ホモ
ジネート、または外リンパにおける各化合物のＡＤＭＥＴ特性を評価し、ＮＩＨＬ後に機
能性ＨＣを再生し、聴覚を回復する上での曝露と有効性の関係を検査する。
Ａｔｏｈ１（ＥＧＦＲｉ／Ａｔｏｈ１）の過剰発現とともにＥＧＦＲ阻害剤を使用する
ことで、新生児および成体蝸牛において、Ａｔｏｈ１単独よりもずっと多くのＨＣが生成
されることが予想される。これらのＨＣの一部分が、成熟ＨＣマーカー（プレスチン、オ
ンコモジュリン、ｖＧｌｕｔ３）を発現し、正常の成熟ＨＣと類似した電気生理を呈する
ことがさらに予想される。ＥＧＦＲｉ／Ａｔｏｈ１媒介性機能性ＨＣ変換は、騒音性難聴
でさえ生じる。Ａｔｏｈ１を過剰発現する成体ＳＣにおいて、ＥＧＦＲノックアウトおよ
び／またはＥＧＦＲ阻害剤の効率が最適未満である場合、Ａｔｏｈ１／Ｐｏｕ４ｆ３を過
剰発現するマウスモデルを使用することができ、これは、成体年齢で誘導した場合、ＳＣ
から１つの蝸牛当たり約１５０個のｃＨＣ（多くのモデルのうちで最高）を生じさせる。
ＥＧＦＲ阻害は、Ｐｏｕ４ｆ３およびＡｔｏｈ１の両方の過剰発現によってＳＣからＨＣ
への変換を相乗的に促進することが予想される。
実施例４：難聴からの保護のためのＥＧＦＲ阻害剤
７５個のキナーゼ阻害剤で構成されるライブラリのスクリーニングを実行して、シスプ
ラチン誘導性有毛細胞喪失から保護する阻害剤を特定した。このスクリーニングは、マウ
ス蝸牛由来の細胞株（ＨＥＩ－ＯＣ１）におけるシスプラチン誘導性細胞死、および蝸牛
外植片におけるシスプラチン誘導性有毛細胞喪失から強力に保護する、４つの化合物、（
１）Ｈｅｒ２阻害剤ムブリチニブ（ＴＡＫ１６５）、（２）汎ＡＵＲ阻害剤ＳＮＳ３１４
、（３）ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅ阻害剤ＧＳＫ２１１８４３６Ａ（ダブラフェニブ）、およ
び（４）ＰＤＧＦＲ阻害剤クレノラニブを特定した。Ｈｅｒ２阻害剤ムブリチニブ（ＴＡ
Ｋ１６５）は、４ｎＭのＩＣ５０値および５５μΜ超のＬＤ５０で、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞
におけるシスプラチン誘導性カスパーゼ－３／７活性からの保護効果を呈し、２．５ｎＭ
のＩＣ５０および５００ｎＭ超のＬＤ５０（２００超の治療指数）で、マウス蝸牛外植片
においてシスプラチン誘導性有毛細胞喪失から保護した（図３）。同様に、汎ＥｒｂＢ阻
害剤であるペリチニブは、０．６μΜのＩＣ５０および４０μΜのＬＤ５０で、ＨＥＩ－
ＯＣ１細胞喪失におけるシスプラチン誘導性カスパーゼ－３／７活性からの保護効果を呈
することが見出された（図４）。さらに、１時間のプレインキュベーションによって、ペ
リチニブは、マウス蝸牛外植片（Ｎ＝３）において、シスプラチン誘導性有毛細胞喪失か
らの外有毛細胞の４９％の保護を呈した。
実施例５：成体マウスモデルにおけるインビボでの騒音性難聴および爆風損傷性難聴から
の保護
局所投与（中耳への経鼓膜注射）した、上位のＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤の保護効
果を、成体マウスモデルにおいてＮＩＨＬおよび爆風損傷性難聴に対して試験する。局所
送達経路を使用するのは、それが最小の侵襲性および単純な手順を提供するために、それ
が哺乳動物聴覚研究において頻繁に使用されるためである。具体的には、一般的に、この
経路を介して、薬物が小児科医およびＥＮＴ医師によって様々な年齢の患者に投与される
（Ｂａｎｅｒｊｅｅ＆Ｐａｒｎｅｓ（２００５）Ｏｔｏｌ．Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．２６：８
７８－８８１、Ｄｏｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅａｒ Ｎｏｓｅ Ｔｈｒｏａ
ｔＪ．８３：３９４－３９８、ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅａｒ Ｈｅａ
ｒ．３１：１５６－１６５、Ｍｕｌｌｅｒ＆Ｂａｒｒ－Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ（２０１５）
Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１４：３４６－３６５、Ｒａｕｃｈ（２００
４）Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．３７：１０６１－１０７４
）。マウスモデルにおいて有効性を実証する化合物は、臨床試験でシスプラチン化学療法
を受ける患者において、シスプラチン関連難聴の予防について直接試験することができる
。さらに、経鼓膜送達は、化合物が正円窓膜を横切って内リンパ液へと容易に拡散するこ
とを可能にする（Ｂｏｒｋｈｏｌｄｅｒ（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｔｏｌａｒ
ｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．１６：４７２－４７７、Ｍｉｚｕｔａｒｉ
，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｅｕｒｏｎ ７７：５８－６９、Ｓｗａｎ，ｅｔ ａｌ．
（２００８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６０：１５８３－１５９９、Ｔａ
ｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ １１５：２０００－２
００５）ため、それらの効力および毒性は、血液迷路関門（ＢＬＢ）についての懸念がほ
とんどない状態で、インビボで直接試験することができる。インビボ特性（例えば、溶解
性、透過性、薬物動態／薬力（ＰＫ／ＰＤ）、ならびに吸収、分布、代謝、***、および
毒性（ＡＤＭＥＴ））のために、経口経路および他の経路もまた考慮してもよい。
試験する化合物は、（１）強力なＩＣ５０値および最小の毒性（すなわち、高いＬＤ５
０／ＩＣ５０値、好ましくは５０超～１００μΜ）を呈すること、（２）いくつかの異な
る生物学的標的／経路を標的化すること、ならびに（３）他の経路（例えば、経口）を介
して送達される能力に基づいて選択することができる。
騒音損傷の試験には、聴覚は成熟しているが、有意な加齢性難聴になるずっと前である
Ｐ２８の年齢の、野生型ＦＶＢマウスを使用する（Ｋｅｒｍａｎｙ，ｅｔ ａｌ．（２０
０６）Ｈｅａｒ Ｒｅｓ．２２０：７６－８６、Ｍａｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２
）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１０８３８－１０８４６、Ｍａｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．
（２００７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９７：２９３０－２９３６、Ｚｈｅｎｇ，
ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｅａｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３０：９４－１０７）
。標準的な騒音曝露プロトコル（９４、１００、１０６、１１６、および１２０ｄＢの音
圧レベル（ＳＰＬ）のオクターブバンドの８～１６ｋＨｚの騒音を２時間）は、ＦＶＢバ
ックグラウンド由来の様々な遺伝子導入マウス株において以前に試験されている（Ｍａｉ
ｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１０８３８－１０８４
６、Ｍａｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９７：２
９３０－２９３６）。これらの騒音損傷のプロトコルは、ＣＢＡ／ＣａＪマウスにおいて
難聴（ＡＢＲ）をもたらした（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｓｓｏｃ．Ｒ
ｅｓ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．３：２４８－２６８）。
１３５～１５５ｄＢのＳＰＬでの反復インパルスは、成体マウス蝸牛において爆風損傷
の効果を効果的に再現することができる。動物モデルにおける爆風損傷の以前の研究は、
１４７～１６０ｄＢのＳＰＬでの５０～１６０回の反復インパルスが、ラットにおける３
～４回の１４ｐｓｉの爆風インパルス（１９４のピークｄＢのＳＰＬ）に類似した生理学
的および形態学的な損傷を、チンチラ、ヒツジ、およびブタの蝸牛に対して課すことを実
証している（Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍ
ｅｄ．４４：１７７２－１７８４、Ｈａｍｅｒｎｉｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ａ
ｃｏｕｓｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．８１：１１１８－１１２９、Ｈｅｎｓｅｌｍａｎ，ｅｔ ａ
ｌ．（１９９４）Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．７８：１－１０、Ｋｏｐｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２０
０５）Ａｃｔａ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１２５：２３５－２４３、Ｒｏｂｅｒｔｏ，
ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｏｔｏｌ．Ｒｈｉｎｏｌ．Ｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｓｕｐ
ｐｌ．１４０：２３－３４）。より興味深いことに、３～４回の１４ｐｓｉの爆風インパ
ルスは、爆風から２１日後のラットにおいて、４３％のＯＨＣ喪失および３０～４０ｄＢ
のＡＢＲ閾値上昇を引き起こし、これは、チンチラにおいて、４ｋＨｚを中心とした１０
５ｄＢのＳＰＬのオクターブバンドの騒音に対する６時間の連続曝露によって引き起こさ
れる損傷に似た損傷である（Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ
．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．４４：１７７２－１７８４、Ｅｗｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１２
）Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．２８５：２９－３９、Ｋｏｐｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｃ
ｔａ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１２５：２３５－２４３）。これらの結果に基づいて、
約１０ミリ秒の持続時間での、１３５～１５５ｄＢの範囲のＳＰＬのオクターブバンドの
８～１６ｋＨｚの騒音インパルスを使用し、これをマウスモデルにおいて１秒間隔で１０
０回反復して、外傷性爆風損傷を模倣することができる（Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．（２０
０８）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．４４：１７７２－１７８４、Ｅｗｅｒ
ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．２８５：２９－３９、Ｈｅｎｓｅｌｍ
ａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．７８：１－１０、ＭｃＦａｄｄｅｎ
，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｃｏｕｓｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．１０７：２１６２－２１
６８）。
実験設計。騒音または爆風曝露に曝露させたマウスを、一方の耳は個々の化合物で、他
方の耳はビヒクル対照（０．５％のＤＭＳＯ）で、即時に治療する。ＤＭＳＯまたは化合
物は、（蝸牛外植片におけるＩＣ５０よりもすっと高くあるべきであるが、それ自体がイ
ンビボで毒性ではない）実現可能な最高用量で、片耳当たり約５μＬで、経鼓膜注射によ
って成体マウスの中耳に局所送達する。騒音曝露またはＴＢＩ前、ならびに注射から１お
よび２週間後に、ＡＢＲおよび歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）を測定する。ＡＢＲおよ
びＤＰＯＡＥによる聴覚試験の後、マウスを心臓潅流して、蝸牛を固定および収集する。
全載調製物および切片の両方を使用して、蝸牛を分析し、免疫蛍光法を使用して、ＨＣ／
ＳＣマーカー（すなわち、ファロイジン、Ｍｙｏ７ａ、プレスチン、およびＳｏｘ２など
）ならびにシナプスマーカー（Ｃｔｂｐ２、ＧｌｕＲ２／３、およびＴｕｊ１）を検出す
る（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ８９３７７）。
手順全体は二重盲検であり、ある者がＤＭＳＯまたは化合物をコードする一方で、他者
１が同じマウスの左右の耳をランダムに注射し、ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥの記録者は、実
験全体が完了するまでどの耳に化合物が注射されたのか知らされない。
成体マウスにおけるＡＢＲ／ＤＰＯＡＥ測定。ＡＢＲ測定は、以前に詳細に記載されて
いる（Ｄａｌｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｅｕｒｏｎ ５８：３３３－３３９、
Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２７：４５００－４５
１２、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１９：３００－３
０４、Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ９：ｅ８９３７７、Ｗｕ，ｅ
ｔ ａｌ．（２００４）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１２６：３
０－３７、Ｙａｍａｓｈｉｔａ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ７：ｅ４５
４５３）。簡潔には、ＡＶＥＲＴＩＮ（０．５ｍｇ／体重ｋｇ）の腹腔内注射でマウスを
麻酔し、電気加熱パッド上に置いて、恒温被覆システム（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａ
ｔｕｓ Ｌｔｄ）を使用して体温を維持する。実験経過中に死亡するか、または内耳機能
障害の兆候を示すマウスは、分析から除外する。全ての記録は、音響調整室（Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）内で実行する。音響刺激および測定の
ために、２つのスピーカー（ｆ１およびｆ２、ＥＣ１）ならびにマイクロホン（ＥＲ－１
０Ｂ、Ｅｔｙｍｏｔｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｌｋ Ｇｒｏｖｅ Ｖｉｌｌａｇｅ，Ｉ
Ｌ）を、外耳道に挿入される先細りプラスチック先端部を有する短く柔軟なカプラー管に
接続する。カプラーが測定位置にある状態で、マイクロホンをインサイチュで較正する。
２２ｋＨｚよりも高い周波数では、測定マイクロホン（ＥＲ１０Ｂ＋）の周波数応答は、
基準マイクロホン（ＡＣＯ－７０１７、ＡＣＯ Ｐａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｍｏ
ｎｔ，ＣＡ）の周波数応答よりも低い。したがって、ＤＰＯＡＥの２ｆｌ－ｆ２応答は、
ＴＤＴ ＢｉｏＳｉｇ ＩＩＩシステム（ＴＤＴ）を使用して、５４５４～１８１８０Ｈ
ｚの周波数ｆ１範囲で記録する。１１．９２／秒の反復速度で、シグナル持続時間は、８
３．８８ミリ秒である。ｆ１およびｆ２応答は、ＰＡ５プログラム可能減衰器へのデジタ
ル／アナログ変換のために、ＲＸ６ＭｕｌｔｉＦｕｎｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（
ＴＤＴ）を通して別個に通過させる。刺激強度は、閾値を確立するために５ｄＢの段階で
９０～０ｄＢまで低減させ、２００ｋＨｚでデジタル的にサンプリングし、１００個の別
々のスペクトルから平均化する。外耳道に連結させたＥＣ１静電スピーカーにシグナルを
供給するＥＤ１スピーカードライバーを通して、シグナルを送達する。結果として得られ
る外耳道の音圧を、ｆ１およびｆ２スピーカーと同じカプラー内に収容したＥＲ１０Ｂ＋
低騒音マイクロホン（ゲイン０×）およびプローブ（Ｅｔｙｍｏｔｉｃ）で記録する。Ｅ
Ｒ１０Ｂ＋増幅器の出力をＲＸ６ＭｕｌｔｉＦｕｎｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｔ
ＤＴ）に直接転送して、２００ｋＨｚでのサンプリングのためにアナログ／デジタル変換
する。結果の波長に対してＴＤＴ ＢｉｏＳｉｇＲＰソフトウェア（ＴＤＴ）を使用して
、平均化した応答の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を生成する。２ｆ１－ｆ２の周波数ビン
を超えるかまたはそれ未満の１０個の周波数ビンの音レベルを平均化することによって、
ノイズフロアを決定する。死後の耳の評価では、機器による歪成分は観察されなかった。
成体マウスにおける騒音損傷。どの２つの側面も平行ではない特注アクリル製容器内の
ケージの中に、マウスを個々に置く。音刺激を、ＲＺ６プロセッサー（Ｔｕｃｋｅｒ－Ｄ
ａｖｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ ＦＬ）によって生成し
、フィルタリング（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈａｖｅｒｈｉｌ
ｌ，ＭＡ）し、増幅（Ｃｒｏｗｎ ＸＴｉ１０００増幅器、Ｃｒｏｗｎ、Ｅｌｋｈａｒｔ
，ＩＮ）し、スピーカーホーン（ＪＢＬ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ，ＣＡ）を介してアクリ
ル製容器に送達する。１／４インチの自由音場マイクロホン（ＡＣＯ Ｐａｃｉｆｉｃ、
Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）を通して音圧レベルを測定し、１２４ｄＢのピストンホン（Ｂｒ
ｕｅｌ ａｎｄ Ｋｊａｅｒ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に対して較正する。実験騒音に曝露する
前に、１／４インチのマイクロホンで容器の４つの四分割をサンプリングして、測定位置
にわたって音圧が０．５ｄＢ未満だけ変動することを確実にする。
成体マウスの経鼓膜注射。ＡＶＥＲＴＩＮまたはケタミンおよびキシラジンの腹腔内（
ｉ．ｐ．）注射でマウスを麻酔する。外科手技中、加熱パッド上で体温を維持する。外科
手術中はまばたきが消失するため、潤滑眼軟膏を適用して、角膜潰瘍を予防する。外科用
実体顕微鏡で、鼓膜を可視化する。３３ゲージのカニューレを使用して、ＰＢＳ中５μＬ
の化合物またはＤＭＳＯを、鼓膜を通して緩徐に注射し、その後溶液が中耳腔内にあるこ
とを外科用実体顕微鏡で確認する。その後、マウスを、ケージの中の加熱パッド上にさら
に３０分間置く。外科手術後、全てのマウスを加熱パッド上で回復させてから、動物収容
設備に戻す。

Claims (19)

  1. 難聴の治療または予防のための方法であって、難聴の治療または予防を必要とする動物
    に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達の阻害剤を投与することを含み、前記難
    聴が、耳鳴症、耳鳴、老年性難聴、聴覚性ニューロパチー、音響外傷、聴神経腫瘍、ペン
    ドレッド症候群、アッシャー症候群、ワルデンベルグ症候群、非症候性感音性難聴、中耳
    炎、耳硬化症、メニエール病、中毒性難聴、または迷路炎に関連する、方法。
  2. 治療が、無調関連因子（ａｔｏｎａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ）をコー
    ドする核酸分子を持つ発現ベクターを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法
    。
  3. １つ以上の耳保護剤または再生剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法
    。
  4. 前記ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／
    ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、
    ＰＬＣ、ＰＫＣ、または細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤の発現または活性を阻害
    する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記細胞周期関連タンパク質キナーゼが、Ｈｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ
    、またはＰＤＧＦＲである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記阻害剤が、阻害性ＲＮＡ、抗体、または小有機分子である、請求項１に記載の方法
    。
  7. 上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達の阻害剤と組み合わせて、活性無調関連
    因子タンパク質をコードする核酸分子を持つ発現ベクターを含む、薬学的組成物。
  8. 前記ＥＧＥＲシグナル伝達の阻害剤が、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／
    ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、
    ＰＬＣ、ＰＫＣ、または細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤の発現または活性を阻害
    する、請求項７に記載の薬学的組成物。
  9. 前記阻害剤が、阻害性ＲＮＡ、抗体、または小有機分子である、請求項７に記載の薬学
    的組成物。
  10. １つ以上の再生剤をさらに含む、請求項７に記載の薬学的組成物。
  11. 活性無調関連因子タンパク質をコードする核酸分子と、
    （ｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子、
    （ｉｉ）単離されたＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤、または
    （ｉｉｉ））（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせと、を含む、キット。
  12. （変更なし）：前記ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍ
    ＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＮＣＫ、Ｐ
    ＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、または細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤の発現ま
    たは活性を阻害する、請求項１１に記載のキット。
  13. 前記阻害剤が、阻害性ＲＮＡ、抗体、または小有機分子である、請求項１１に記載のキ
    ット。
  14. １つ以上の再生剤をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
  15. 難聴の治療または予防のための方法であって、難聴の治療または予防を必要とする動物
    に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達の阻害剤を投与することを含み、前記阻
    害剤が、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、Ａ
    ＫＴ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、または細胞周期関連タンパク質キナー
    ゼの発現または活性を阻害する、方法。
  16. 治療が、無調関連因子をコードする核酸分子を持つ発現ベクターを投与することをさら
    に含む、請求項１５に記載の方法。
  17. １つ以上の耳保護剤または再生剤を投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方
    法。
  18. 前記細胞周期関連タンパク質キナーゼが、Ｈｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ
    、またはＰＤＧＦＲである、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記阻害剤が、阻害性ＲＮＡ、抗体、または小有機分子である、請求項１５に記載の方
    法。
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