CN114246949B - Ulk1激活剂在预防和/治疗听力损伤中的应用 - Google Patents

Ulk1激活剂在预防和/治疗听力损伤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了ULK1激活剂在制备用于预防和/或治疗听力损伤的药物中的用途，所述ULK1激活剂包括BL‑918。本发明经过对小鼠模型进行噪声暴露实验测试，发现在噪声暴露前，给予ULK1激活剂如BL‑918可增强ULK1的活性，增强耳蜗中螺旋神经元中的自噬水平，减少噪声引起的听力阈值上移等，对噪声有很好的预防噪声性听力损伤的效果。作为听力保护的成分，所述ULK1激活剂还能够在听力损伤后给予有效治疗。本发明还公开了一种包含ULK1激活剂的药物组合物。本发明为听力损伤的预防、治疗提供新的思路，从而具有广泛临床应用前景。

Description

ULK1激活剂在预防和/治疗听力损伤中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及ULK1激活剂在预防和/或治疗听力损伤中 的应用，更具体地，涉及BL-918在预防和/或治疗噪声性听力损伤中的应用。
背景技术
耳聋是全球最为流行的感觉器官残疾，截至2020年，全球已有4.3亿人患有中度及以上 的听力损伤。听觉异常让患者产生言语的障碍，认知能力的降低，心理上的封闭和自卑，并 为家庭和社会带来了沉重的负担。
其中老年性聋(ARHL)，即年龄相关性听力损伤，仍然是引起听力损伤的主要因素。在听 力损伤人群中，60岁以上人群占比超过了42％。老年性聋是一种复杂的，可由多病因引起的 听觉***的退行性变，其危险因素包括耳蜗老化、环境因素、遗传易感性、家族史和合并疾 病等，特别是在嘈杂的环境中，噪声暴露是ARHL的主要原因。
随着音频设备的不安全使用及嘈杂环境的日常和职业暴露的增加，12至35岁年轻人罹 患噪声性听觉损伤的风险亦随之上升。噪声不仅会引起认知障碍、睡眠障碍和心血管健康， 长时间暴露于中高声强75-85dB的噪声还可引起听力损伤。甚至有研究表明，在噪声暴露后， 内耳听觉结构中的突触以及螺旋神经节出现丢失，从而引起隐匿性听力损伤和言语识别障碍。
噪声性听力损伤(NIHL)是指由强噪声刺激引起的暂时性或永久性听力损伤，可伴随着 耳蜗的内外毛细胞、带状突触或螺旋神经节(SGN)损伤。噪声性听力损伤相关的机制包括 离子通道的异常，钙稳态的失衡以及氧化应激的损伤等。
自噬是细胞内物质及细胞器降解的主要过程，指细胞质中的各种成分递送至溶酶体并在 溶酶体中降解的过程，最终维持细胞的基本活性和功能。自噬在耳蜗的发育，毛细胞形态和 听觉功能的维持中都起着重要作用。同时，自噬也被认为是一种限制组织对应激所产生的病 理变化所触发的一种保护机制。多项研究表明，自噬在预防耳毒性药物性听力损伤中发挥作 用，例如新霉素、庆大霉素或顺铂导致的损伤。有一项研究通过分析暴露于噪声的工人的血 浆代谢组学，发现自噬信号通路参与了NIHL的发生和发展。除此以外，相关啮齿动物的研 究还表明，噪音暴露促进了耳蜗毛细胞的自噬。目前已有一部分自噬激活剂证明可以减轻噪 音引起的内耳的氧化应激损伤。雷帕霉素作为一种特异性的mTOR的抑制剂,参与免疫抑制， 影响转录和蛋白质合成，调节细胞的生长、凋亡等，同时也是一种自噬激活剂，已被证实其 降低内耳ROS水平，从而起到减轻噪音引起的内耳耳蜗中氧化应激损伤。此外，由Pejvakin 介导的过氧化物酶体吞噬，可被认为是一种选择性的自噬，在控制过氧化物酶体水平和保护 听觉毛细胞免受噪音影响方面也起着关键作用(85)。这些研究提示了自噬在保护听觉免受噪 声损伤中的重要性，而目前尚未有直接通过增强自噬保护噪声性听力损伤的药物。
在自噬过程中，UNC-51样激酶1(ULK1)是自噬启动的重要激酶，对自噬的起始起着关键作用。ULK1与FIP200、ATG13和ATG101组成的复合物可启动自噬体形成。ULK1的 激活受mTORC1和AMPK调节。有研究报道，AMPK-mTORC1-ULK1信号通路受损可能在 听觉皮层退化中起关键作用。BL-918是ULK1的有效激活剂，已经在SH-SY5Y细胞中证明 BL-918有效通过激活ULK1增强自噬，预防由1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的小鼠帕金森模 型的表型。
发明内容
为解决现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供BL-918在预防和/或治疗听力损伤中的 应用，并公开了一种新的通过增强自噬，有效预防和/或治疗噪声性听力损伤的药物。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了ULK1激活剂在预防和/或噪声性听力损伤、保护听力、和/或治疗听力损伤 中的应用。
优选地，所述ULK1激活剂为BL-918或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。
优选地，所述ULK1激活剂用于预防听力损伤。
进一步地，所述ULK1激活剂在噪声暴露前2天进行给药。
进一步地，所述ULK1激活剂的给药方式为圆窗膜渗透给药。
进一步地，所述ULK1激活剂的给药剂量为2-200uM，体积为2ul。优选地，所述ULK1激活剂的给药剂量为200uM，体积2ul。
进一步地，所述ULK1激活剂用于增强耳蜗中的ULK1活性，用于增强耳蜗中螺旋神经 元中的自噬水平，用于减少噪声引起的听力阈值上移，用于提高噪声暴露后耳蜗毛细胞存活 率，或用于保护噪声引起的神经突触减少等。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的BL-918或其药学上可 接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物，以及药物上可接受的载体、介质。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
1、本发明提供了一种新的，对听力损伤尤其是噪声性听力损伤有预防保护作用的小分子 化合物，为噪声性听力损伤提供了新的治疗手段和途径。在噪声暴露前，单次给予BL-918可降低噪声后小鼠听力的阈值移动。
2、BL-918是一种新型ULK1激活剂，目前尚未有相关的研究报道。
3、BL-918对多个频率的噪声都具有很好的预防噪声性听力损伤的效果，尤其对噪声性 耳聋、炮震性耳聋等疾病具有良好的预防作用，能够作为预防噪声性听力损伤的药物和/或保健品。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能更清楚了解本发明的技术手段，并可依照 说明书的内容予以实施，一下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1为实施例1中无噪声对照组和无噪声打药组小鼠耳蜗组织pULK1S757蛋白相对水平。
图2为实施例2中噪声对照组和噪声打药组小鼠耳蜗中螺旋神经元自噬体和自噬溶酶体 及统计。
图3为实施例3中对照组、BL-918处理组、NK处理组、NK+BL-918处理组小鼠基底膜染色及统计。
图4为实施例4中无噪声组以及噪声对照组、噪声PBS组在噪声暴露之后3、7、14天ABR阈值。
图5为实施例5中无噪声组以及噪声对照组、噪声打药组在噪声暴露之后3、7、14天ABR阈值。
图6为实施例6中无噪声组以及噪声对照组、噪声打药组在噪声暴露之后3、7、14天ABR阈值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。以下实施例用于说明本 发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明人通过对ULK1作用的多年研究，发现ULK1的表达与听力损伤的关系，惊奇地 发现BL-918通过激活ULK1，并从细胞到组织水平上进一步证实，BL-918可以作为ULK1的激活剂，起到预防听力损伤和保护听力的作用，并对损伤的听力起到修复作用。本发明尤其提出了BL-918在预防听力损伤中的应用，为开发针对感音神经性听力损伤的药物提供了有 用的借鉴。
本发明提供了ULK1激活剂在预防和/或噪声性听力损伤、保护听力、和/或治疗听力损伤 中的应用。所述ULK1激活剂能够特异性促进ULK1基因的转录或翻译，或能够特异性促进 ULK1蛋白的表达或活性，从而增强耳蜗中螺旋神经元中的自噬水平，达到保护听力的目的。
优选地，所述ULK1激活剂为BL-918或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。所述BL-918或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物以ULK1作为药物作用靶点能够起到保护听力的作用。
所述BL-918的化学式为C23H15F8N3OS，结构如下式I所示：
Figure BDA0003410540170000041
本发明还提供了BL-918的药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物 在制备预防和/或治疗听力损伤的药物或试剂盒中的用途。
本发明应用中，进一步地，所述听力损伤为感音神经性听力损伤，选自如下中的至少一 种：耳毒性药物、噪声、遗传性、老年性、代谢性、自身免疫性疾病及肿瘤导致的听力损伤。 其中，所述噪声导致的听力损伤为噪声性听力损伤，包括噪声性耳聋和炮震性耳聋；所述 BL-918能够降低噪声暴露后听力的阈值移动，提高ULK1的活性，提高耳蜗中螺旋神经元中 的自噬水平，提高噪声暴露后耳蜗毛细胞存活率，保护噪声引起的神经突触减少等。
其中，所述噪声为频率为4～60kHz和/或强度为90～150dB的广谱噪声。
所述BL-918的给药方式为圆窗膜渗透给药；和/或，所述BL-918的给药剂量为2-200uM， 体积为2ul。
本发明应用中，所述BL-918为药物制剂的单一有效成分。在一些实施方式中，所述药物 制剂中，除包含BL-918成分外，还包括其他与听力保护相关的药物成分，为由BL-918和药 用辅料制成的药物制剂。在一具体实施方式中，所述BL-918在制备用于预防和/或治疗听力 损伤中的应用具体是指：将BL-918作为药物的主要有效成分用于制备用于预防和/或治疗听 力损伤的药物。
本发明应用中，所述BL-918对于ULK1的激活或促进效果包括但不限于：促进ULK1的基因转录或者表达，激活ULK1的活性，激活或促进ULK1的功能。例如，与对照组相比， 在不影响细胞其他功能的情况下BL-918可以增加细胞中ULK1含量的50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗听力损伤的药物组合物，所述药物组合物包含如 上所述的ULK1激活剂BL-918或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶 剂化物，以及药学上可接受的载体、介质。
进一步地，所述可接受的载体、介质例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化 剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清 白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基 酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液 时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、 D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、 非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。
本发明药物组合物中，所述BL-918或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型 物或溶剂化物可以是单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，构成联合制剂。
本发明药物组合物中，活性组分(ULK1激活剂BL-918或其药学上可接受的盐、酯、异 构体、前药、多晶型物或溶剂化物)的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域 技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述活性组分的施用量通常依赖于患者的体重、应 用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的施用量通常可以为1～1000 mg/kg/day、20～200mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20 mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100 mg/kg/day、100～150mg/kg/day、150～200mg/kg/day、200～300mg/kg/day、300～500mg/kg/day、 或500～1000mg/kg/day。
本发明所提供的活性成分或含所述活性成分的药物组合物可以适应于任何形式的给药方 式，可以是口服或胃肠外给药，例如，可以是经肺、经鼻、经直肠和/或静脉注射，更具体可 以是真皮内、皮下、肌内、关节内、腹膜内、肺部、口腔、舌下含服、经鼻、经皮、***、 口服或胃肠外给药；注射给药包括静脉注射、肌内注射和皮下注射等，经皮给药等。
如本文所用，所述药物组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶 囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领 域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以 是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉 雾剂等，再例如，适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水 的干制剂或喷雾剂等，再例如，适合于直肠给药的通常可以是栓剂，再例如，适合注射给药 的可以是注射剂、注射用无菌粉末等。
本发明进一步提供了一种治疗性或预防性治疗听力损伤的方法，它包括给予有需要的对 象(如哺乳动物)施用有效量的BL-918或药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物、 溶剂化物或药物组合物。所述方法也可以是体外的或非治疗性的。
进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜 (如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(如狗、猫)、实验室试验动物(如小鼠、家兔、大鼠、 豚鼠、仓鼠)或被捕获的野生动物(如狐狸、鹿)。所述对象优选灵长类。所述对象最优选 人。所述对象可以是听力损伤的患者或者期待预防听力损伤的个体。
所述BL-918或药物组合物可以在接受听力损伤治疗前、中、后向对象施用。
本发明中，所述ULK1激活剂BL-918的盐、酯可以以药学或生理学上可接受的盐或酯 的形式使用。述及“药学上可接受的盐”，通常指当以适当的方式用于治疗时(特别是在人 类和/或哺乳动物中应用或使用时)在生理学上可耐受的任何盐(通常来说，这意味着它是无 毒的，特别是作为抗衡离子的结果是无毒的)。这些生理上可接受的盐可以是与阳离子或碱 形成的，并且在本发明的上下文中，尤其是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解 为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常为酸(去质子化的)，如阴离子和至少一种 生理学上耐受的阳离子(优选无机阳离子)形成的盐。在一些实施方式中，所述BL-918的盐、 酯包括但不限于与如下酸形成的盐或酯：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、 乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺 酸、或羟乙磺酸。卤化物的盐同样适用。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐。
本发明中，所述“前药”指当用适当的方法服用后，该“前药”在人体内进行代谢或化 学反应而转变成所述具有活性的ULK1激活剂或药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。
本发明中，所述活性化合物BL-918还可与其他治疗剂联用。例如与选自下组的一种或多 种对于保护听力有用的成分联用：左慈丸、六味地黄丸、尼麦角林片、谷维素、长春胺缓释 胶囊、甲钴胺分散片、长春西汀注射液、脑苷肌肽注射液、曲克芦丁注射液、小牛血去蛋白 提取物注射液、银杏叶提取物片，胞磷胆碱钠胶囊等。
本发明中，当所述活性化合物与其他治疗剂联用时，所述活性化合物与其他治疗剂共同 给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予， 或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在两种或多种不同化合物的给药之间具 有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。
本发明中，所述ULK1激活剂、包含其的药物或药物组合物通过以下至少一项起到保护 听力的作用：
增强ULK1的活性；
增强耳蜗中螺旋神经元中的自噬水平；
减少噪声引起的听力阈值上移；
提高噪声暴露后耳蜗毛细胞存活率；
保护噪声引起的神经突触减少等。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较 佳实施方法与材料仅作示范之用。
本文述及“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思； 即“包括但不限于”的意思。
本文述及“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所 列出的疾病的效果。
本文述及“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性”不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会感染疾病病症。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预 防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作 的频率。
本文述及受听力损伤的“细胞”应理解为已受听力损伤的任何细胞，或可能遭受听力损 伤的任何细胞。
本发明的化合物及其方法可用于预防和/或治疗听力损伤，不仅可用于听力损伤的早期阶 段来防止损伤的扩大，还可以用于听力损伤后的修复，还可作为预防性治疗方法在接触噪声 或药物之前施用或在接触噪声或药物一段时间后施用；优选地，本发明所述的BL-918用于预 防听力损伤。
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明 的范围。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域 的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1 BL-918对小鼠耳蜗ULK1的激活能力评估
ULK1蛋白的Ser757位点处于磷酸化状态时，ULK1和AMPK之间的相互作用受抑制，从而抑制ULK1的活性。因此，检测pULK1S757蛋白水平可以反映ULK1活性，pULK1S757蛋白水平的减少能够反应ULK1的激活程度。
配置10mM BL-918储存液：将1mg BL-918粉末溶解于0.1875ml DMSO液体中。
配置200uM BL-918溶液：将2uL 10mM BL-918储存液用PBS稀释至100ul，得200uMBL-918溶液。
实验分组及实验过程：
选取健康、听力正常的雄性野生型4周龄C57BL6/J近交系小鼠3只，体重16～18克。将 小鼠左右耳分别作为无噪声对照组和无噪声打药组。具体为：
无噪声对照组：每只小鼠左耳，不作任何处理。
无噪声打药组：经小鼠右侧耳蜗圆窗膜给药，即小鼠麻醉后经耳后入路暴露圆窗膜，吸 取适量BL-918溶液的明胶海绵(给药浓度为200uM，体积2ul)置于圆窗龛，封闭听泡，缝 合。等待小鼠苏醒，确保状态良好后放回笼内饲养。给药2天后，对小鼠耳蜗组织进行取材， 研磨，使用RIPA裂解液(Thermo Fisher Scientific,89900)，裂解提取总蛋白，通过BCA法 (碧云天，P0012)对蛋白进行定量后，进行免疫印迹实验。以管家基因蛋白β-actin作为内 参，观察pULK1S757蛋白及β-actin蛋白表达水平，计算pULK1S757与β-actin的比值，并以无 噪声对照组为1计算无噪声打药组的pULK1S757的相对定量。
如图1所示，无噪声打药组耳蜗中的pULK1S757相对蛋白水平较无噪声对照组显著降低， 说明无噪声打药组耳蜗中ULK1活性更高，BL-918能够增强耳蜗内ULK1活性。
实施例2 BL-918对小鼠耳蜗自噬水平的激活能力评估
CAG-RFP-EGFP-LC3转基因小鼠具有CAG启动子/增强子序列，可驱动红色荧光蛋白(RFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和微管相关蛋白1轻链3α(Map1lc3a或LC3)基因。 LC3可作为常见自噬体的标记物，其表达高低直接反映目的区域的自噬水平。RFP和EGFP 两种荧光团对酸性环境的稳定性不同，RFP在酸性pH中稳定，而EGFP在酸性溶酶体环境 中易被淬灭。自噬小体与溶酶体结合后形成自噬溶酶体，由于pH值的降低，其EGFP荧光 会淬灭，从而可以将自噬体与自噬溶酶体区分开来。即黄色荧光(RFP和EGFP共定位)显 示自噬体，仅有红色荧光而无绿色荧光显示自噬溶酶体。CAG-RFP-EGFP-LC3小鼠常用于研 究小鼠细胞中自噬情况，能够直观的检测小鼠中不同细胞内的自噬水平。
200uM BL-918溶液配置方法同实施例1。
实验分组及实验过程：
选取健康、听力正常的雄性4周龄CAG-RFP-EGFP-LC3转基因小鼠3只，体重16～18克。将小鼠左右耳分别作为噪声对照组和噪声打药组。具体为：
噪声对照组：每只小鼠左耳，不作任何处理。
噪声打药组：经小鼠右侧耳蜗圆窗膜给药，即小鼠麻醉后经耳后入路暴露圆窗膜，吸取 适量BL-918溶液的明胶海绵(给药浓度为200uM，体积2ul)置于圆窗龛，封闭听泡，缝合。 等待小鼠苏醒，确保状态良好后放回笼内饲养。
给药2天后，将所有小鼠暴露于频率为8-16kHz，104dB SPL的窄频噪声环境中2小时， 期间小鼠可在噪声笼隔间中自由活动。于小鼠噪声暴露结束后1小时对2组小鼠耳蜗进行取 材，4％多聚甲醛在4℃下避光固定组织16小时，之后用0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)进行组织脱钙。接下来将耳蜗组织先后置于质量百分数为15％和30％的蔗糖进行组织梯度脱水各 1天，之后将耳蜗放入OCT包埋剂中，-20℃冷冻12小时。随后对小鼠耳蜗进行耳蜗冰冻切片，切片厚度10um。之后对耳蜗冰冻切片进行免疫荧光染色，RFP及EGFP信号均为自发荧光，不需要染色，应用TUJ1(801202,Biolegend)抗体显示耳蜗螺旋神经元细胞。在共聚焦显微镜下观察小鼠耳蜗中螺旋神经元中自噬体(黄色信号)和自噬溶酶体数量(仅发出RFP信号)的变化。
如图2所示，噪声打药组耳蜗中螺旋神经元中的自噬体和自噬溶酶体数量均较对照侧显 著增加，提示BL-918能够增强小鼠耳蜗螺旋神经元中的自噬水平。
实施例3 BL-918对小鼠培养基底膜神经损伤的保护作用评估
噪音损伤机制被认为是一种神经兴奋性损伤。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和红藻氨酸 (KA)是神经细胞中兴奋性氨基酸受体的有效激动剂。NMDA(Tocris)与KA(Sigma)联用(NK) 可以引起神经细胞的兴奋性毒性，从而引起培养的耳蜗基底膜的神经损伤。本实施例应用NK 在体外模拟噪音对螺旋神经元的损伤。
普通培养基：为DMEM/F12培养基(Gibco,11320033)，另外加入1x B27(Gibco,17504044) 及1x N2(Gibco,A1370701)。
含5uM BL-918的培养基，为在普通培养基中额外添加终浓度为5uM的BL-918，获得的培养基。
含NK(含0.5mM NMDA和0.5mM KA)的培养基，为在普通培养基中额外添加终浓度为0.5mM的NMDA和0.5mM的KA，获得的培养基。
含NK(含0.5mM NMDA和0.5mM KA)及5uM BL-918的培养基，为在普通培养基中 额外添加终浓度为0.5mM的NMDA、0.5mM的KA和5uM的BL-918，获得的培养基。
选取野生型出生后第2天(P2)的C57BL6/J近交系小鼠6只，对左右耳的耳蜗基底膜进行解剖，并在37℃，5％CO2条件下培养24小时，并将12个耳蜗基底膜随机均分成四组： 对照组、BL-918处理组、NK处理组、NK+BL-918处理组。
对照组：不进行任何处理；
BL-918处理组：用含5uM BL-918的培养基孵育20小时；
NK处理组：用含NK(含0.5mM NMDA和0.5mM KA)的培养基孵育2小时，随后换 成普通培养基孵育18小时；
NK+BL-918处理组：首先用同时含NK(0.5mM NMDA和0.5mM KA)及5uM BL-918 的培养基孵育2小时，随后换成含5uM BL-918的培养基继续孵育18小时。
随后对培养的基底膜进行固定及免疫染色，观察内毛细胞、神经纤维与内毛细胞的连接 情况，采用Myosin VIIa(#25-6790,Proteus BioSciences Inc)显示内毛细胞，NF-H(#AB5539, Millipore)显示连接内毛的神经纤维。计算每个内毛细胞链接的神经纤维数量，从而评估基底 膜神经损伤情况。
如图3所示，纵坐标含义为每个内毛细胞连接的神经纤维数。结果可知，BL-918处理组 与对照组的内毛细胞连接的神经纤维数相似，说明BL-918在体无毒性。相较于对照组，NK 处理组的小鼠基底膜每个内毛细胞连接的神经纤维数显著减少，说明NK处理对于小鼠基底 膜内毛细胞神经纤维连接的损伤，与以往报道相似。NK+BL-918处理组每个内毛细胞连接的 神经纤维数较NK处理组显著增多，证明BL-918能够保护NK引起的神经纤维损伤。
实施例4 PBS缓冲液对小鼠噪声性听力损伤的保护作用评估
选取健康、听力正常的雄性野生型4周龄C57BL6/J近交系小鼠8只，体重16～18克。
具体为：
无噪声组：4只小鼠不经任何处理，检测左耳听力。
另4只小鼠为噪声组，左耳和右耳分别作为噪声对照组和噪声给药组。噪声对照组：另 4只小鼠左耳，不作给药处理，2天后进行噪声暴露。该4只小鼠右耳作为噪声PBS组：经 小鼠右侧耳蜗圆窗膜给药，即小鼠麻醉后经耳后入路暴露圆窗膜，吸取适量1xPBS缓冲液的 明胶海绵(给药体积2ul)置于圆窗龛，封闭听泡，缝合。等待小鼠苏醒，确保状态良好后放 回笼内饲养，2天后进行噪声暴露。
噪声组小鼠噪声暴露方法为：在给药2天后将小鼠暴露于频率为8-16kHz，强度为104dB SPL的窄频噪声环境中2小时，期间小鼠可在噪声笼隔间中自由活动。
通过进行听性脑干反应测试测量小鼠耳蜗听力阈值。随后分别于小鼠噪声暴露结束后的 第3、7、14天通过测量噪声组小鼠左右侧耳蜗的听力阈值，即检测噪声对照组及噪声打药组 的听力阈值改变来衡量噪声损伤程度以及药物的保护效果。
如图4所示，在噪声暴露后的3、7、14天，可以观察到噪声PBS打药组没有对噪声的保护作用。
实施例5高浓度BL-918对小鼠噪声性听力损伤的保护作用评估
选取健康、听力正常的雄性野生型4周龄C57BL6/J近交系小鼠8只，体重16～18克。
具体为：
无噪声组：4只小鼠不经任何处理，检测左耳听力。
另4只小鼠为噪声组，左耳和右耳分别作为噪声对照组和噪声给药组。噪声对照组：另 4只小鼠左耳，不作给药处理，2天后进行噪声暴露。该4只小鼠右耳作为噪声打药组：经小 鼠右侧耳蜗圆窗膜给药，即小鼠麻醉后经耳后入路暴露圆窗膜，吸取适量BL-918溶液的明胶 海绵(给药浓度为200uM，体积2uL，配制方法同实施例1)置于圆窗龛，封闭听泡，缝合。 等待小鼠苏醒，确保状态良好后放回笼内饲养，2天后进行噪声暴露。
噪声组小鼠噪声暴露方法为：在给药2天后将小鼠暴露于频率为8-16kHz，强度为104dB SPL的窄频噪声环境中2小时，期间小鼠可在噪声笼隔间中自由活动。
通过进行听性脑干反应测试测量小鼠耳蜗听力阈值。随后分别于小鼠噪声暴露结束后的 第3、7、14天通过测量噪声组小鼠左右侧耳蜗的听力阈值，即检测噪声对照组及噪声打药组 的听力阈值改变来衡量噪声损伤程度以及药物的保护效果。
如图5所示，在噪声暴露后的3、7、14天，可以观察到噪声打药组小鼠内耳听力阈值上 移减少，相较于噪声对照组，减少20dB SPL左右的听力阈值移动，证实200uM BL918对小鼠内耳噪音性听力损伤具有保护作用。
实施例6低浓度BL-918对小鼠噪声性听力损伤的保护作用评估
配置2uM BL-918溶液：将2ul 10mM BL-918储存液用PBS稀释至10000ul，得200uMBL-918溶液。
选取健康、听力正常的雄性野生型4周龄C57BL6/J近交系小鼠8只，体重16～18克。
具体为：
无噪声组：4只小鼠不经任何处理，检测左耳听力。
另4只小鼠为噪声组，左耳和右耳分别作为噪声对照组和噪声给药组。噪声对照组：另 4只小鼠左耳，不作给药处理，2天后进行噪声暴露。该4只小鼠右耳作为噪声打药组：经小 鼠右侧耳蜗圆窗膜给药，即小鼠麻醉后经耳后入路暴露圆窗膜，吸取适量BL-918溶液的明胶 海绵(给药浓度为2uM，体积2ul，配制方法同实施例1)置于圆窗龛，封闭听泡，缝合。等 待小鼠苏醒，确保状态良好后放回笼内饲养，2天后进行噪声暴露。
噪声组小鼠噪声暴露方法为：在给药2天后将小鼠暴露于频率为8-16kHz，强度为104dB SPL的窄频噪声环境中2小时，期间小鼠可在噪声笼隔间中自由活动。
通过进行听性脑干反应测试测量小鼠耳蜗听力阈值。随后分别于小鼠噪声暴露结束后的 第3、7、14天通过测量噪声组小鼠左右侧耳蜗的听力阈值，即检测噪声对照组及噪声打药组 的听力阈值改变来衡量噪声损伤程度以及药物的保护效果。
如图6所示，在噪声暴露后的3、7、14天，可以观察到噪声打药组小鼠内耳听力阈值上 移减少，相较于噪声对照组，减少20dB SPL左右的听力阈值移动，证实2uM BL918对小鼠内耳噪音性听力损伤具有保护作用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明 进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式 进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技 术人员能够想到的变化和优点均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (11)

1.BL-918或其药学上可接受的盐在制备预防听力损伤的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BL-918的化学式为C23H15F8N3OS，结构如下式I所示：
Figure FDA0003945559570000011
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述听力损伤为感音神经性听力损伤。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述感音神经性听力损伤选自如下中的至少一种：由噪声、耳毒性药物、遗传性、老年性、代谢性、自身免疫性疾病及肿瘤导致的听力损伤。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述感音神经性听力损伤为噪声导致的听力损伤和/或NK导致的听力损伤。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述噪声导致的听力损伤为噪声性听力损伤，包括噪声性耳聋和炮震性耳聋；和/或，所述噪声是指频率为4～60kHz、强度为90～150dB的噪声。
7.如权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物通过以下至少一项起到保护听力的作用：
增强ULK1的活性；
增强耳蜗中螺旋神经元中的自噬水平；
减少噪声引起的听力阈值上移；
提高噪声暴露后耳蜗毛细胞存活率；
保护噪声引起的神经突触减少。
8.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述BL-918的给药方式为圆窗膜渗透给药；和/或，所述BL-918的给药剂量为2-200uM，体积为2ul。
9.一种用于预防听力损伤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1或2中所述的BL-918，以及药学上可接受的载体、介质。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物和听力保护相关药物中的至少一种联合施用。
11.如权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物通过以下至少一项起到保护听力的作用：
增强ULK1的活性；
增强耳蜗中螺旋神经元中的自噬水平；
减少噪声引起的听力阈值上移；
提高噪声暴露后耳蜗毛细胞存活率；
保护噪声引起的神经突触减少。
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