JP2022551918A - マルチドメインタンパク質ワクチン - Google Patents

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Abstract

１つ以上のがんワクチンエピトープと足場ドメインとの組み合わせを可能にするタンパク質融合技術が、本明細書に開示される。また、タンパク質融合技術によって包含されるポリペプチドおよびポリ核酸組成物、ならびにそれらを使用する方法も本明細書に開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月９日に出願された、米国仮特許出願第６２／９１２，９０３号に対する優先権の利益を主張するものであり、当該出願の全内容は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
がん免疫療法は、がんを治療するために患者の免疫系を利用することを対象とする。これは、がん細胞が、タンパク質または他の巨大分子（例えば、炭水化物）であることが多い、腫瘍抗原として知られる、免疫系によって検出され得る分子をそれらの表面上に有することが多いという事実を利用する。能動免疫療法は、腫瘍抗原を標的とすることによって免疫系が腫瘍細胞を攻撃するように指示する。受動免疫療法は、既存の抗腫瘍応答を増強し、モノクローナル抗体、リンパ球およびサイトカインの使用を含む。能動免疫療法は、患者における新たな免疫応答を誘導することを対象とする。腫瘍ワクチンは、典型的には、腫瘍細胞を認識し、溶解する抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するように一緒に作用する腫瘍抗原および免疫刺激分子（例えば、アジュバント、サイトカインまたはＴＬＲリガンド）から構成される。治癒的および腫瘍特異的免疫療法を開発するための重要な障壁のいくつかは、高度に特異的かつ制限された腫瘍抗原を効率的に同定および選択し、高い抗腫瘍免疫原性の発生のために対象のＴ細胞活性化を最大化するような方法で抗原を必要とする対象に抗原を送達することである。
悪性細胞内の遺伝子変化（例えば、逆転、転座、欠失、ミスセンス変異、スプライス部位変異など）の結果として生じる腫瘍新抗原は、抗原の最も腫瘍特異的なクラスを表し、患者に特異的であり得るか、または共有され得る。腫瘍新抗原は、変異およびその対応するタンパク質が腫瘍にのみ存在するため、腫瘍細胞に特有である。これらはまた、中枢性トレランスを回避し、したがって、免疫原性である可能性が高い。したがって、腫瘍新抗原は、体液性免疫および細胞性免疫の両方によることを含む、免疫認識のための優れた標的を提供する。しかしながら、腫瘍新抗原は、それらを同定し、最適化された抗原を選択し、ワクチンまたは免疫原性組成物に使用するための新抗原を産生する際の技術的困難により、がんワクチンまたは免疫原性組成物に使用されることはほとんどない。したがって、さらなるがん治療薬の開発の必要性が依然として存在する。
参照による組み込み
本出願で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物であって、当該融合ポリペプチドが、（ａ）１つ以上の抗原ポリペプチド配列と、（ｂ）２つ以上の足場ポリペプチド配列と、を含む、ポリペプチド配列を含み、２つ以上の足場ポリペプチド配列のそれぞれが、ヒトポリペプチド配列、その断片またはそのバリアントを含み、（ｉ）２つ以上の足場ポリペプチド配列の分子量が１１ｋＤａ超であるか、または（ｉｉ）２つ以上の足場ポリペプチド配列のそれぞれが、少なくとも２１個のアミノ酸残基を含む、組成物である。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、融合ポリペプチドを含む組成物であって、当該融合ポリペプチドが、（ａ）１つ以上の抗原ポリペプチド配列と、（ｂ）１つ以上の足場ポリペプチド配列と、を含む、ポリペプチド配列を含み、足場ポリペプチドが、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、タイチン－Ｉ２７、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択される、組成物である。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つは、１つ以上のリンカー配列を介して１つ以上の抗原ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つに接続されている。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、リンカーの切断、１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの切断、または１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの提示を促進するように構成されている。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、組成物であって、当該融合ポリペプチドが、（ａ）１つ以上の抗原ポリペプチド配列と、（ｂ）１つ以上の足場ポリペプチド配列と、を含む、ポリペプチド配列を含み、足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つが、１つ以上のリンカー配列を介して１つ以上の抗原ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つに接続され、融合ポリペプチドが、リンカーの切断、１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの切断、または１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの提示を促進するように構成されている、組成物である。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、がん抗原である。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれは、ヒトポリペプチド配列、その断片、またはそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、組換えヒトポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、標的結合特性を有するように構成されていない。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、それぞれ独立して、タイチンＩ２７、ユビキチン、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、１０ＦＮ－ＩＩＩ、Ｉｇ－ＬフィラミンＡ、テネイシン、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択される。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、それぞれ独立して、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、タイチンＩ２７、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択される。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、（ｉ）翻訳後修飾、（ｉｉ）ペプチド内ジスルフィド結合、または両方を欠く。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、非免疫原性である。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、酵素活性を有するように構成されていない。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドのそれぞれは、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、その断片、またはそのバリアントである。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列は、同じであるか、または異なる。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の足場ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、最大でも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または２０個の足場ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、６個の足場ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列の分子量は、少なくとも１１ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、または２００ｋＤａである。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列の分子量は、最大でも１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、または５００ｋＤａである。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれの分子量は、少なくとも５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、または１００ｋＤａである。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれの分子量は、最大でも６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、または２５０ｋＤａである。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれは、少なくとも２１個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、または少なくとも２００個のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれは、最大でも３０個、最大でも３５個、最大でも４０個、最大でも４５個、最大でも５０個、最大でも５５個、最大でも６０個、最大でも６５個、最大でも７０個、最大でも７５個、最大でも８０個、最大でも８５個、最大でも９０個、最大でも１００個、最大でも１２５個、最大でも１５０個、最大でも１７５個、または最大でも２００個のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの分子量は、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、または２００ｋＤａを超える。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの分子量は、７５ｋＤａを超える。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの分子量は、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、または５００ｋＤａ以下である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチド配列のそれぞれは、１００個未満、７５個未満、５０個未満、または３５個未満のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチド配列のそれぞれは、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個を超えるアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つは、そのＮ末端を介して、融合ポリペプチドの残りの配列に連結される。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つは、そのＣ末端を介して、融合ポリペプチドの残りの配列に連結される。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも２つは、抗原配列またはリンカー配列によって中断されない。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（Ｉａ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
Ａｎ－Ｓｍ、またはＳｍ－Ａｎ
式（Ｉａ）、
式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、ｍが、２以上の整数であり、ｎが、１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１～５から選択される整数であり、ｍは、２である。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（Ｉｂ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
ＳＯ－Ａｎ－Ｓｍ 式（Ｉｂ）
式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、ｏ、ｎ、およびｍのそれぞれが、独立して、１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｏは、１または２であり、ｍは、１または２であり、ｎは、１～５から選択される整数である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｓ－Ａ－Ｓ、Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、またはＳ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓの構造を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチド配列は、２つ以上のリンカー配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（ＩＩａ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
（Ｌ－Ａ－Ｌ）ｎ－Ｓｍ、またはＳｍ－（Ｌ－Ａ－Ｌ）ｎ
式（ＩＩａ）、
式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、各Ｌが、独立して、リンカー配列を表すか、または不在であり、ｍが、２以上の整数であり、ｎが、１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１～５から選択される整数であり、ｍは、２である。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（ＩＩｂ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
Ｓｏ－－（Ｌ－Ａ－Ｌ）ｎ－Ｓｍ
式（ＩＩｂ）、
式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、各Ｌが、独立して、リンカー配列を表すか、または不在であり、ｏ、ｎ、およびｍのそれぞれが、独立して、１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｏは、１または２であり、ｍは、１または２であり、ｎは、１～５から選択される整数である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｓ、またはＳ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓの構造を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドおよび抗原ポリペプチドは、交互様式で融合ポリペプチド内に位置する。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、直鎖状フォーマットである。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または２０個の抗原ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、最大でも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、５０個、または１００個の抗原ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の抗原ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれは、リンカー配列のうちの少なくとも１つを介して抗原ポリペプチド配列のうちの１つまたは２つに接続されている。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、リンカーの切断、または１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの切断を促進するように構成されている。
いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、切断部位を含む。
いくつかの実施形態では、切断部位は、ペプチダーゼまたはプロテアーゼによって切断可能である。
いくつかの実施形態では、切断部位は、細胞ペプチダーゼまたはプロテアーゼによって切断可能である。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの提示を促進するように構成されている。
いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、リジン残基、アルギニン残基、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、グルタミン酸残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、システイン、ロイシン残基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端に直接接続された、リジン残基、アルギニン残基、またはアラニン残基を含む。
いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接接続された、セリン残基、リジン残基、アルギニン残基、またはアラニン残基を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩ抗原ポリペプチドであり、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、リジン残基、アルギニン残基、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、グルタミン酸残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基 システイン残基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩ抗原ポリペプチドであり、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端に直接接続された、リジン残基、アルギニン残基、またはアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩ抗原ポリペプチドであり、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接接続された、セリン残基、リジン残基、アルギニン残基、またはアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ポリペプチドであり、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ポリペプチドであり、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端に直接接続された、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、またはフェニルアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ポリペプチドであり、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接接続された、メチオニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、またはトリプトファン残基を含む。
いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端に直接接続された、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、またはフェニルアラニン残基を含む。
いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接接続された、メチオニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、またはトリプトファン残基を含む。
いくつかの実施形態では、リンカー配列のそれぞれは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、または５０個のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、リンカー配列のそれぞれは、最大でも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、または１００個のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブルである。
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、同じであるか、または異なる。
いくつかの実施形態では、水性溶媒中の融合ポリペプチドの溶解度は、同じ溶媒中で測定した、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの溶解度よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍高い。
いくつかの実施形態では、水性製剤中の融合ポリペプチドの溶解度は、水性製剤中の足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの溶解度よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍高い。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの血清溶解度は、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの血清溶解度よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの血清半減期は、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの血清半減期よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍長い。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの血清半減期は、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの血清溶解度よりも、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、５０００倍、または１００００倍高い。
いくつかの実施形態では、対象への投与後のリンパ節における融合ポリペプチドの蓄積は、平均放射効率によって測定した、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの蓄積よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、または１００００倍高い。
いくつかの実施形態では、対象への投与後の融合ポリペプチドに対する抗原特異的Ｔ細胞応答は、抗原特異的Ｔ細胞の頻度またはＩＦＮγの分泌の増加によって測定した、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドに対する抗原特異的Ｔ細胞応答よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、もしくは１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、または３００倍高い。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、抗原提示細胞、アジュバント、または試薬に結合するように構成された１つ以上の結合部分を含む。
いくつかの実施形態では、多価融合ポリペプチドは、樹状細胞（ＤＣ）標的化ドメイン、アジュバントまたは免疫調節剤などの官能化薬剤にカップリングされた抗足場抗体またはその断片との混合によって官能化される。
いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、またはＢ細胞である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、樹状細胞上で発現された１つ以上の受容体に結合するように構成されている。
いくつかの実施形態では、１つ以上の受容体は、Ｃ型レクチン受容体、スカベンジャー受容体、Ｆ４／８０受容体、ＤＣ特異的膜貫通タンパク質（例えば、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ）、Ｆｃ受容体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の受容体は、Ｃｌｅｃ９ａまたはＸＣＲ１を含む。
いくつかの実施形態では、結合部分のうちの少なくとも１つは、足場ポリペプチドに含まれる。
いくつかの実施形態では、結合部分のうちの少なくとも１つは、足場ポリペプチドのうちの１つのＮ末端またはＣ末端に直接接続されている。
いくつかの実施形態では、結合部分のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの１つのＮ末端またはＣ末端に直接接続されている。
いくつかの実施形態では、結合部分のうちの少なくとも１つは、リンカーポリペプチドに接続されている。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端方向において、結合部分のうちの少なくとも１つは、足場ポリペプチドのうちの最初または最後の足場ポリペプチドに末端連結されている。いくつかの実施形態では、組成物は、融合ポリペプチドに結合することができる１つ以上の結合部分を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、融合ポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、融合ポリペプチドにコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、１つ以上のがん抗原ポリペプチドは、複数の抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のがん抗原ポリペプチドは、自己免疫ペプチドである。
いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、新抗原ペプチドである。
いくつかの実施形態では、各ペプチドの新エピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）は、固有である。いくつかの実施形態では、がん新抗原ペプチドまたはその一部のそれぞれは、対象によって発現されたＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるタンパク質に結合し、対象のがん細胞のうちの少なくとも１つの発現された遺伝子によってコードされ、がん新抗原ペプチドまたはその一部のうちの少なくとも１つが、対象の正常組織内に存在しない１つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異のうちの少なくとも１つは、（Ａ）点変異であり、がん新抗原ペプチドが、対象によって発現されたＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質に、５００ｎＭ未満のＩＣ５０、および対応する野生型ペプチドより高い親和性で結合し、（Ｂ）スプライス部位変異、（Ｃ）フレームシフト変異、（Ｄ）リードスルー変異、または（Ｅ）遺伝子融合変異である。
いくつかの実施形態では、複数のうちの第１のがん新抗原ペプチドは、対象によって発現された第１のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質に結合し、複数のうちの第２のがん新抗原ペプチドが、対象によって発現された第２のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質に結合し、対象によって発現された第１および第２のＨＬＡ対立遺伝子が、異なるＨＬＡ対立遺伝子である。
いくつかの実施形態では、がん新抗原ペプチドのうちの少なくとも１つは、対象によって発現されたＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質に、２５０ｎＭ未満のＩＣ５０で結合する。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、宿主細胞において発現される。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、合成構築物である。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または２０個の異なる融合ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、最大でも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または２０個の異なる融合ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
一態様では、本明細書に開示されるのは、記載される核酸分子によってコードされた融合ポリペプチドである。
一態様では、本明細書に開示されるのは、記載される融合ポリペプチドを含む、組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、融合ポリペプチドに結合した１つ以上の結合部分を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、融合ポリペプチドにコンジュゲートされている。
一態様では、本明細書に開示されるのは、１つ以上のリンカーによって間隔を置かれた２つ以上の足場ポリペプチド、およびリンカーのうちの少なくとも１つに位置する１つ以上の制限部位をコードする核酸分子であって、（ｉ）２つ以上の足場ポリペプチド配列の分子量が１１ｋＤａ超であるか、または（ｉｉ）２つ以上の足場ポリペプチド配列のそれぞれが、少なくとも２１個のアミノ酸残基を含む、核酸分子である。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡによってコードされる。
一態様では、本明細書に開示されるのは、第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列、および第１の足場ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第１の核酸分子と、第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な配列を含む核酸配列、および第２の足場ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第２の核酸分子と、を含む、複数の核酸分子である。
別の態様では、本明細書に開示されるのは、第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列、第１の足場ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第１の核酸分子と、第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な配列を含む核酸配列、および第２の足場ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第２の核酸分子と、を含む、複数の核酸分子である。
さらに別の態様では、本明細書に開示されるのは、第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列、第１の足場ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第１の核酸分子と、第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な配列を含む核酸配列、第２の足場ポリペプチドをコードする核酸配列、および第３の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第２の核酸分子と、を含む、複数の核酸分子である。
いくつかの実施形態では、第１の足場配列および第２の足場配列は、同じである。
いくつかの実施形態では、第１の抗原ポリペプチドおよび第２の抗原ポリペプチドは、異なる。
いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の抗原ポリペプチドは、異なる。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
一態様では、本明細書に開示されるのは、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と、記載された組成物、または記載された融合ポリペプチドと、を含む、医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバントを含む。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、ポリＩＣ：ＬＣである。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ｐＨ調整剤を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、第２の治療薬剤を含む。いくつかの実施形態では、第２の治療薬剤は、免疫調節剤、サイトカインもしくはケモカイン、またはチェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を投与する前に、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物の投与と同時に投与される。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を投与した後に投与される。
一態様では、本明細書に開示されるのは、免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、方法は、遺伝子修飾細胞において、記載される核酸分子を発現させ、それによって、免疫原性融合ポリペプチドを産生することを含む、方法である。
別の態様では、本明細書に開示されるのは、免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、方法は、本明細書に記載される核酸分子を提供することと、１つ以上の抗原ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子を、制限部位のうちの少なくとも１つに挿入し、それによって、新しい核酸分子を産生することと、遺伝子修飾細胞において、新しい核酸分子を発現させ、それによって、免疫原性融合ポリペプチドを産生することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子は、等温反応を通じて、または制限酵素ベースのクローニングによって挿入される。
一態様では、本明細書に開示されるのは、免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、方法は、本明細書に記載される複数の核酸分子を提供することと、ハイブリダイゼーションにより核酸分子を接合することと、遺伝子修飾細胞において、接合した核酸分子を発現させ、それによって、免疫原性融合ポリペプチドを産生することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、細菌発現系において発現される。
いくつかの実施形態では、細菌発現系は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現系である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、方法は、（ａ）上記段落、または具体的には８９～９６段落のいずれかに記載される核酸分子を提供することと、（ｂ）１つ以上の抗原ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子を、制限部位のうちの少なくとも１つに挿入し、それによって、新しい核酸分子を産生することと、（ｃ）インビトロ翻訳によって、または遺伝子修飾細胞において、新しい核酸分子を発現させ、それによって、免疫原性融合ポリペプチドを産生することと、を含む、方法である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、方法は、（ａ）上記の段落、または具体的には８９～９６段落のいずれか１つに記載される複数の核酸分子を提供することと、（ｂ）ハイブリダイゼーションにより核酸分子を接合することと、（ｃ）インビトロ翻訳によって、または遺伝子修飾細胞において、接合した核酸分子を発現させ、それによって、免疫原性融合ポリペプチドを産生することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、細菌発現系において発現される。いくつかの実施形態では、細菌発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系である。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、インビトロ翻訳によって発現される。いくつかの実施形態では、方法は、ギャップ充填ステップおよび／またはライゲーションステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ギャップ充填ステップは、ポリメラーゼ媒介性ギャップ充填ステップを含む。
一態様では、本明細書に開示されるのは、がんの治療または予防を必要とするヒト対象においてがんを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数の新抗原ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数の融合ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内または皮下に投与される。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの用量は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのサブ用量に分割される。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの各サブ用量は、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれを超える融合ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、各融合ポリペプチドは、０．０１～１００μｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、各融合ポリペプチドは、１００μｇ～１０ｍｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、投与される融合ポリペプチドの総用量は、０．０１～１００ｍｇである。
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、肺がん、または膀胱がんである。
一態様では、本明細書に提供されるのは、複数の組換え発現構築物を含むライブラリーであって、複数のうちの各発現構築物が、（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）（ｉ）プロモーター配列の下流の開始コドン、（ｉｉ）開始コドンの下流の第１のポリヌクレオチド配列であって、第１のポリヌクレオチド配列が、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド配列からの異なる鋳型が、（Ａ）疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料に由来し、（Ｂ）対象からの疾患細胞によってコードされたタンパク質のペプチド配列をコードする、第１のポリヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列の下流の第２のポリヌクレオチド配列であって、第２のポリヌクレオチド配列が、（Ａ）フレームチェック配列およびフレームチェック配列の下流の１つ以上の親和性タグをコードする配列、または（Ｂ）親和性タグをコードする配列を含むフレームチェック配列を含む、第２のポリヌクレオチド配列、を含む、融合ポリペプチドをコードする配列と、を含む、ライブラリーである。いくつかの実施形態では、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列またはそのコピーが、親和性タグをコードする配列とフレーム外である場合、フレームチェック配列は、融合ポリペプチドの翻訳を終結するように作動する。いくつかの実施形態では、フレームチェック配列は、
Ｎ１－Ｎ２－Ｎ３－Ｎ４－Ｎ５－Ｎ６－Ｎ７－Ｎ８－Ｎ９
の式を有し、式中、各Ｎが、独立して、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、およびＧからなる群から選択される核酸であり、Ｎ１－Ｎ２－Ｎ３およびＮ４－Ｎ５－Ｎ６およびＮ７－Ｎ８－Ｎ９のそれぞれが、終止コドンではなく、Ｎ２－Ｎ３－Ｎ４およびＮ６－Ｎ７－Ｎ８のそれぞれが、終止コドンである。いくつかの実施形態では、フレームチェック配列は、Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒをコードする。いくつかの実施形態では、フレームチェック配列は、第１のポリヌクレオチド配列を、親和性タグをコードする配列に連結するリンカーをコードする。
いくつかの実施形態では、親和性タグをコードする配列は、フレームチェック配列である。いくつかの実施形態では、親和性タグは、Ｆｃ受容体に結合する断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）もしくはペプチド配列、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、プロテインＡに結合するペプチド配列、プロテインＧに結合するペプチド配列、または抗体のエピトープ、またはそれらの結合断片である。いくつかの実施形態では、親和性タグは、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、親和性タグは、ヒトである。いくつかの実施形態では、親和性タグをコードする配列は、サイズ増強ポリペプチドをコードし、かつ／または（ｉｉ）ライブラリーの各発現構築物が、サイズ増強ポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、サイズ増強ポリペプチドをコードする配列は、第１のポリヌクレオチド配列の下流にあり、かつ／またはサイズ増強ポリペプチドをコードする配列のうちの少なくとも１つが、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列の上流にある。いくつかの実施形態では、親和性タグは、サイズ増強ポリペプチドのエピトープである。いくつかの実施形態では、サイズ増強ポリペプチドをコードする配列は、複数の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個、またはそれを超えるサイズ増強ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のサイズ増強ポリペプチドのうちの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを超えるサイズ増強ポリペプチドは、同じである。いくつかの実施形態では、サイズ増強ポリペプチドをコードする配列は、サイズ増強ポリペプチドのうちの２つ以上の間の１つ以上のリンカーをコードする。いくつかの実施形態では、複数のサイズ増強ポリペプチドの分子量は、少なくとも１５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、複数のサイズ増強ポリペプチドの分子量は、２００ｋＤａ以下である。いくつかの実施形態では、複数のサイズ増強ポリペプチドの分子量は、４０ｋＤａ～８０ｋＤａまたは５０ｋＤａ～７０ｋＤａである。
いくつかの実施形態では、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列は、対象からの疾患細胞によって発現されたタンパク質のペプチド配列をコードし、対象はヒトであり、疾患はがんである。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、膀胱がんまたは肺がんである。
いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患である。
いくつかの実施形態では、試料は、生検、血液試料または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料を含み、試料は、疾患を有する細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数のうちの各発現構築物は、同じプロモーター、同じ開始コドン、同じフレームチェック配列、サイズ増強ポリペプチドをコードする同じ配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のそれぞれは、少なくとも２４ｂｐsの長さ、少なくとも４５ｂｐsの長さ、最大でも４５０ｂｐsの長さ、最大でも２５０ｂｐsの長さ、２４～３００ｂｐsの長さ、４５～４５０ｂｐsの長さ、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のそれぞれは、ｃＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のそれぞれは、ＲＮＡ分子に由来する。
いくつかの実施形態では、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のそれぞれは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に由来する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、エクソームの少なくとも５％～最大１００％を表す複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ライブラリーは、プロテオームのペプチド配列の少なくとも５％～最大１００％をコードする複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、プロテオームのタンパク質の少なくとも５％に由来するペプチド配列をコードする複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、エクソームまたはプロテオームは、疾患細胞のエクソームまたはプロテオームである。いくつかの実施形態では、ライブラリーから発現されたポリペプチドの約５％～約２５％は、親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーから発現されたポリペプチドの約２０％～約４０％は、親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも６０個のアミノ酸残基を含むライブラリーから発現されたポリペプチドの約５０％～約９０％は、親和性タグを含まない。いくつかの実施形態では、インフレーム発現構築物から発現されたポリペプチドの約８５％～約９５％は、親和性タグに取り付けられるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１００個、１０００個、１００００個、１０００００個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個または最大１×１０１０個の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、異なる鋳型ポリヌクレオチドは、少なくとも１０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、１００００個または１０００００個の異なるタンパク質のペプチド配列をコードする。
いくつかの実施形態では、異なる鋳型ポリヌクレオチドのうちの少なくとも約１０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個または１００００個は、疾患細胞内で異常に転写、スプライシングもしくは翻訳されたｍＲＮＡに由来するか、または遺伝子再構成に由来する、変異体ペプチド配列またはｍＲＮＡ翻訳産物をコードする。
いくつかの実施形態では、変異体ペプチド配列は、がん細胞特異的変異体ペプチド配列である。いくつかの実施形態では、変異体ペプチド配列は、点変異またはインデルを含む。
いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上の抗原ポリペプチド配列の上流の１つ以上の足場ポリペプチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、発現構築物は、１つ以上の足場ポリペプチド配列の下流にあり、１つ以上の抗原ポリペプチド配列の上流にある、リンカー配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列は、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のすぐ上流にある上流アダプター配列、および／または異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のすぐ下流にある下流アダプター配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、多価である。
本明細書に提供されるのは、先行請求項のいずれか一項によってコードされたポリペプチドライブラリーである。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドライブラリーのポリペプチドは、宿主細胞において発現され、インビトロ翻訳系を使用して発現され、かつ／またはファージベクターから発現される。いくつかの実施形態では、ファージベクターは、Ｍ１３ファージベクター、またはｆ１ファージベクター、またはｆｄファージベクターなどの繊維状ファージベクターである。
いくつかの実施形態では、ライブラリーのポリペプチドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の一部として発現される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ様粒子は、宿主細胞、例えば細菌細胞、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞において発現可能である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、宿主細胞内で自己集合する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌である。
いくつかの実施形態では、ライブラリーのポリペプチドは、インビトロ翻訳されたポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドライブラリーは、複数の単離されたポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ライブラリーのポリペプチドは、少なくとも親和性タグを介して単離または精製または濃縮される。
一態様では、本明細書に提供されるのは、宿主細胞において発現された複数の組換え融合ポリペプチドを含む、個別化された組換えプロテオームライブラリーであって、複数の組換え融合ポリペプチドが、疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料からの複数の少なくとも１０個の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列によってコードされた複数のポリペプチド配列を含み、複数の少なくとも１０個の異なる鋳型ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド配列のそれぞれが、ＮからＣ方向において、（ｉ）少なくとも１０個の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列の異なる鋳型ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド配列、ならびに（ｉｉ）（Ａ）フレームチェック配列およびフレームチェック配列の下流の親和性タグをコードする配列、または（Ｂ）親和性タグをコードする配列を含むフレームチェック配列、および／または少なくとも４０ｋＤａであるサイズ増強ポリペプチド配列を含む、個別化された組換えプロテオームライブラリーである。
一態様では、本明細書に提供されるのは、宿主細胞において発現された複数の組換え融合ポリペプチドを含む、個別化された組換えプロテオームライブラリーであって、複数の組換え融合ポリペプチドが、疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料からの複数の少なくとも１０００個の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列によってコードされた複数のポリペプチド配列を含む、個別化された組換えプロテオームライブラリーである。
一態様では、本明細書に提供されるのは、上記のポリペプチドライブラリーまたは個別化された組換えプロテオームライブラリーを含む、ワクチン組成物である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、上記のポリペプチドライブラリーまたは個別化された組換えプロテオームライブラリーを対象に投与することを含む、治療方法である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、上記のポリペプチドライブラリーまたは個別化された組換えプロテオームライブラリーと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、上記の医薬組成物を対象に投与することを含む、治療方法である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるポリペプチドライブラリーまたは個別化された組換えプロテオームライブラリーを含む、細胞集団である。いくつかの実施形態では、細胞集団の各細胞は、複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドによってコードされた単一の異なるポリペプチド配列を発現する。
本明細書に提供されるのは、発現ベクターを構築する方法であって、（ａ）疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料から複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドを提供することと、（ｂ）複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドにアダプター配列を取り付け、それによって、複数の異なるアダプタータグ付き鋳型ポリヌクレオチドを形成することと、（ｃ）異なるアダプタータグ付き鋳型ポリヌクレオチドを増幅させることと、（ｄ）増幅された異なるアダプタータグ付き鋳型ポリヌクレオチドをベクターに挿入し、それによって、組換え発現構築物のライブラリーを形成することと、（ｅ）組換え発現構築物のライブラリーによってコードされたポリペプチドを発現させることと、発現したポリペプチドを濃縮することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、方法は、複数の異なるポリヌクレオチドを、エクソーム捕捉オリゴヌクレオチドのライブラリーと接触させることを含み、当該捕捉オリゴヌクレオチドは標的配列を含む。
いくつかの実施形態では、エクソーム捕捉オリゴヌクレオチドは、表面上に固定化される。
いくつかの実施形態では、増幅させることは、ランダムプライマーで増幅させることを含む。
いくつかの実施形態では、増幅させることは、バイアスなしで増幅させることを含むか、または標的特異的ではない。
いくつかの実施形態では、方法は、複数の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列を、参照試料または疾患を有する対象からの非疾患細胞からの複数の参照ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドからミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドを選択的に濃縮することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、選択的に濃縮することは、二本鎖ポリヌクレオチドを、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合する薬剤に接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＮＡ塩基ミスマッチ認識薬剤である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＭｕｔＳタンパク質またはその機能的断片である。いくつかの実施形態では、ＭｕｔＳタンパク質は、とりわけ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．、Ａｚｏｔｏｂａｔｅｒ ｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．を含むが、これらに限定されない、細菌種に由来する。
いくつかの実施形態では、ミスマッチは、単一ヌクレオチドバリアント、挿入または欠失を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）ミスマッチを含む選択的に濃縮された二本鎖ポリヌクレオチドを、（ｉｉ）選択的に濃縮されていない疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料からの複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドと組み合わせることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、複数の異なる標的ポリヌクレオチドは、エクソーム全体および／またはエクソーム－イントロン境界配列に由来する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数の異なる標的ポリヌクレオチドは、１つ以上のがん型の発現データに基づいて、エクソームのサブセットに由来する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数の異なる標的ポリヌクレオチドは、全ゲノムに由来する配列を含む。
いくつかの実施形態では、複数の異なる標的ポリヌクレオチドは、エクソーム捕捉オリゴヌクレオチドのライブラリーで濃縮された全ゲノム配列のセットに由来する配列を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、複数の異なる標的ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングすることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチドのセットは、参照ゲノムエクソン捕捉プローブセットまたは対象からの非腫瘍試料からのポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、エクソーム捕捉オリゴヌクレオチドのライブラリーは、高頻度ヒト多型配列を含む。
いくつかの実施形態では、参照試料は、対象からの非腫瘍試料を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、逆転写を実施することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、シーケンシングをさらに含まない。
いくつかの実施形態では、方法は、ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質へのエピトープの結合を予測もしくは決定すること、および／またはＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質によるエピトープの提示をさらに含まない。
いくつかの実施形態では、複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドにアダプター配列を取り付けることは、鎖特異的アダプター配列を取り付けることを含む。
いくつかの実施形態では、異なる標的ポリヌクレオチド配列は、ｇＤＮＡ由来である。
いくつかの実施形態では、異なる標的ポリヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡまたはエクソーム配列に由来する。
いくつかの実施形態では、濃縮することは、発現されたポリペプチドを含有する親和性タグを濃縮することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、試料のポリ核酸を断片化することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、試料のゲノムＤＮＡを剪断することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、試料は、ＦＦＰＥ試料である。
本明細書に提供されるのは、上記の方法を実施することと、濃縮された発現ポリペプチドを対象に投与することと、を含む、治療方法である。
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明および付属の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良好な理解が得られる。
ポリペプチド構成のオプションである、オプションＡを示す。 ポリペプチド構成の別のオプションである、オプションＢを示す。 ポリペプチド構成のさらに別のオプションである、オプションＣを示す。 足場ドメイン選択および６つの例示的な足場ドメインに関する考慮事項のいくつかを示す。 六量体ポリボディとしての溶解性チャレンジ試験および発現レベル試験における例示的な足場ドメインの試験結果を示す。 Ａｌｇ８ペプチドを可溶化するために示される足場ドメインを使用した溶解性チャレンジ試験の結果を示す。 示されるペプチドを可溶化するために足場ドメインとしてＳｔｅｆｉｎ Ａを使用した溶解性チャレンジ試験の結果を示す。Ｓ：可溶性画分、Ｉ：不溶性画分。 発現レベル試験のためにクローニングされたポリボディ構築物を示す。 １～６個の足場ドメインを有するポリボディ構築物についてのリンパ節蓄積試験を示す。図７Ａは、クマシーブルーで染色したポリボディ構築物のバンドパターンの画像を示し、図７Ｂは、蓄積試験についての注入および測定スケジュールを示し、図７Ｃは、マウスにおける注入部位を示す。 同上。 同上。 合成長ペプチドと比較した、フルオロフォア標識ポリボディ構築物のリンパ節蓄積を示す。図８Ａは、マウスの鼠径部リンパ節における蛍光の蓄積を示し、図８Ｂは、マウスの腋窩リンパ節における蛍光の蓄積を示し、図８Ｃは、合成長ペプチドと比較した、六量体ポリボディの蛍光蓄積の強度を示す。図８Ｄは、リンパ節のＦＡＣＳ分析を示す。 同上。 同上。 マウスの左および右鼠径部リンパ節（ｉＬＮ）ならびに腋窩リンパ節（ａＬＮ）における合成長ペプチドと比較した、ポリボディ構築物のフルオロフォア蓄積を示す。 ＭＣ３８腫瘍モデルエピトープを使用した、ポリボディ構築物対合成長ペプチドのインビボ免疫原性を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、それぞれ、Ｒｅｐｓ１およびＡｄｐｇｋエピトープを含む、ポリボディ構築物および合成長ペプチドに対する免疫応答を示す。図１０Ｃは、ポリボディ１（ＰＢ１）、ポリボディ２（ＰＢ２）、およびポリボディ３（ＰＢ３）の構成を示す。 例示的なポリボディ構築物を示す。図１１Ａは、非機能的足場ドメインを含む、例示的なポリボディ構築物を示し、図１１Ｂは、機能的および非機能的足場ドメインを含む、例示的なポリボディ構築物を示す。 例示的なポリボディ構築物を示す。図１２Ａは、非機能的足場ドメインを含む、例示的なポリボディ構築物を示し、図１２Ｂは、官能化ペプチドタグを含む、例示的なポリボディ構築物を示す。 融合ポリペプチドの製造パイプラインを示す。 人工ミニプロテオームワクチン（ＡＭＰＶａｘ）を生成するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から抽出したＲＮＡから調製したランダムプライミングｃＤＮＡのエクソーム捕捉ライブラリーを調製するための方法を図で表したものを示す。 ＡｍｐＶａｘ濃縮エクソーム捕捉方法を図で表したものを示す。 ＭｕｔＳ濃縮を使用した、ＡｍｐＶａｘ濃縮エクソーム捕捉方法を図で表したものを示す。 ＭｕｔＳベイトのための正常なゲノムＤＮＡを使用した、ＡｍｐＶａｘ濃縮エクソーム捕捉方法を図で表したもの示す。 ＡｍｐＶａｘ濃縮エクソーム捕捉方法およびＭｕｔＳ濃縮を使用したＡｍｐＶａｘ濃縮エクソーム捕捉方法のワークフローを図で表したものを示す。 エクソーム捕捉ライブラリーの例示的なポリボディ融合構築物を図で表したものを示す。 エクソーム捕捉ライブラリーの例示的なポリボディ融合構築物を図で表したものを示す。 エクソーム捕捉ライブラリーの例示的なポリボディ融合構築物を図で表したものを示す。 エクソーム捕捉ライブラリーの例示的なポリボディ融合構築物を図で表したものを示す。 エクソーム捕捉ライブラリーの例示的なポリボディ融合構築物を図で表したものを示す。 ポリボディ融合物を発現させるためのプラスミドを構築する例示的な方法を図で表したものを示す。 図１８Ａは、１／５ ＳＮＰおよび参照エクソームＭｕｔＳ捕捉による５０倍の濃縮後の分布／均一性を図で表したものを示す。図１８Ｂは、１／５ ＳＮＰおよび正常なＤＮＡ ＭｕｔＳ捕捉による５０倍の濃縮後の分布／均一性を図で表したものを示す。図１８Ｃは、ＭｕｔＳ捕捉のためのＳＮＰ設計を有しない参照エクソーム対正常なＤＮＡの図による比較を示す。 同上。 同上。
本開示は、治療用ペプチドをコードするペプチドまたは核酸を含む治療薬開発の重要な態様に焦点を当て、治療薬のレシピエント内での安定性および標的送達のためのペプチドの修飾を包含する。いくつかの態様では、ペプチドは、増大した免疫原性のために修飾される。いくつかの態様では、ペプチドは、新抗原ペプチドである。いくつかの態様では、ペプチドは、対象において疾患を治療するための新抗原であり、疾患は、免疫疾患である。いくつかの態様では、疾患は、がんである。いくつかの態様では、修飾は、ペプチド融合物を含む。本明細書に提供されるのは、融合形態での新抗原の送達に関する方法および医薬組成物である。さらに、新抗原ペプチドは、融合形態でリンパ節に効率的に送達することができ、それによって、より多数のナイーブＴリンパ球集団を、新抗原ペプチドに対して曝露し、プライミングすることができる。
一態様では、本明細書に記載されるのは、新抗原ペプチドの効率的な送達、組織取り込み、および機能性を可能にする、ポリボディと名付けられた、高度にモジュール化されたタンパク質融合技術である。いくつかの実施形態では、ポリボディは、皮下注射後の血清中の酵素消化から新抗原ペプチドを保護する。いくつかの実施形態では、ポリボディは、新抗原ペプチドをリンパ節に標的化するのに役立つ。いくつかの実施形態では、ポリボディは、新抗原ペプチドのリンパ節保持に役立つ。いくつかの実施形態では、ポリボディは、Ｔリンパ球の効果的なプライミングおよび活性化に役立つ。
いくつかの実施形態では、モジュール化タンパク質融合技術は、単一のタンパク質構築物上の複数のがんワクチンエピトープ（例えば、新抗原、腫瘍関連抗原）の組み合わせを可能にする。いくつかの実施形態では、エピトープは、足場ドメインによって囲まれている。いくつかの実施形態では、これらの足場ドメインは、抗原ペプチドを、より可溶性に保ち、患者の循環プロテアーゼおよびペプチダーゼによって引き起こされる早期分解を防止する。いくつかの実施形態では、これらの足場ドメインは、ワクチンの免疫原性および抗腫瘍有効性をさらに増加させるために、ポリボディに所望の機能を付加するように官能化される。
本明細書に記載されるのは、個体の腫瘍に特有の変異事象から生じる新抗原の発見に基づく新たな免疫療法薬剤およびその使用である。したがって、本明細書に記載される本開示は、例えば、腫瘍関連抗原または新エピトープに対する免疫応答を刺激し、疾患の治療に使用するための免疫原性組成物またはがんワクチンを作製するために使用することができる、ペプチド、ペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびペプチド結合薬剤を提供する。
以下の説明および実施例は、本開示の実施形態を詳細に例示する。本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、したがって変更可能であることを理解されたい。当業者は、本開示の範囲内に包含される、本開示の多数の変形および修正が存在することを認識するであろう。
すべての用語は、当業者によって理解されるように理解されることが意図される。別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成の目的のためにのみ使用され、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本開示の様々な特徴は、単一の実施形態の関連において記載され得るが、特徴はまた、別々にまたは任意の適切な組み合わせで提供されてもよい。反対に、本開示は、明確にするために別個の実施形態に関して本明細書に記載され得るが、本開示はまた、単一の実施形態で実装されてもよい。
本明細書で使用される種々の専門用語は、特定の事例を記載することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。本出願では、特に断りのない限り、単数形の使用は、複数形を含む。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数形も同様に含むことが意図される。本明細書で理解されるように、「または」は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。「および／または」および「それらの任意の組み合わせ」という用語、ならびに本明細書で使用されるそれらの文法的等価物は、互換的に使用され得る。これらの用語は、任意の組み合わせが具体的に企図されていることを伝えることができる。単に例示的な目的のために、以下の「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの任意の組み合わせ」という語句は、「個別的にＡ、個別的にＢ、個別的にＣ、ＡおよびＢ、ＢおよびＣ、ＡおよびＣ、ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味することができる。「または」という用語は、文脈が具体的に離接的使用を指す場合を除いて、接続的または離接的に使用され得る。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内であることを意味することができ、これは、その値が、どのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に一部依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。代替として、「約」は、所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。代替として、特に生体系またはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別段の記載がない限り、特定の値について許容可能な誤差範囲内であることを意味する「約」という用語が、想定されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲（複数可）で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの任意の形態の含む）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの任意の形態の有する）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの任意の形態の含む）または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの任意の形態の含有する）という単語は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。
本明細書での、「いくつかの実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」または「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしもすべての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。本開示の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句が、以下に定義される。
主要組織適合性複合体または「ＭＨＣ」は、生理学的免疫応答を担う細胞相互作用の制御において役割を果たす遺伝子のクラスターである。ヒトにおいて、ＭＨＣ複合体は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体としても知られている。ＭＨＣおよびＨＬＡ複合体の詳細な説明については、Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたい。「主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のタンパク質または分子」、「ＭＨＣ分子」、「ＭＨＣタンパク質」または「ＨＬＡタンパク質」は、タンパク質抗原のタンパク質分解的切断から生じるペプチドに結合し、それらを細胞表面に輸送し、それらをそこで特異的細胞、特に細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、またはＢ細胞に提示する、潜在的なリンパ球エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープ）を表すことができるタンパク質を意味するものとして理解されるべきである。ゲノム中の主要組織適合性複合体は、細胞表面上で発現された遺伝子産物が、内因性および／または外来性抗原の結合および提示に重要であり、したがって免疫学的プロセスを調節するのに重要である、遺伝子領域を含む。主要組織適合性複合体は、異なるタンパク質をコードする２つの遺伝子群、すなわち、ＭＨＣクラスＩの分子およびＭＨＣクラスＩＩの分子に分類される。２つのＭＨＣクラスの細胞生物学および発現パターンは、これらの異なる役割に適応される。
ヒト白血球抗原または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えば、Ｓｔｉｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．（１９９４）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、およびそれらの文法的等価物は、アミノ酸残基のポリマーを指す。アミノ酸残基のポリマーは、典型的には、隣接アミノ酸残基のα－アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって、一方が他方に接続された一連のアミノ酸残基である。本明細書に開示されるポリペプチドおよびタンパク質（その機能的部分および機能的バリアントを含む）は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。このような合成アミノ酸は、当該技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－およびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンを含む。本開示は、操作された細胞における本明細書に記載されるポリペプチドの発現が、ポリペプチド構築物の１つ以上のアミノ酸の翻訳後修飾と関連付けられ得ることをさらに企図する。翻訳後修飾の非限定的な例には、リン酸化、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化（Ｎ結合型およびＯ結合型を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピエーション（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）、リポイル化、およびヨウ素化が含まれる。
免疫原性ペプチドまたは免疫原性エピトープまたはペプチドエピトープは、ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、細胞媒介性または体液性応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ（例えば、ＣＤ８＋））、ヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ（例えば、ＣＤ４＋））および／またはＢリンパ球応答を誘導するように、対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドである。したがって、本明細書に記載される免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し、その後、ペプチドに対する、ＣＴＬ（細胞傷害性）応答、またはＨＴＬ（および体液性）応答を誘導することができる。
新抗原は、タンパク質の腫瘍特異的変化から生じる腫瘍抗原のクラスである。新抗原は、例えば、対象におけるがん特異的変異から生じる腫瘍抗原を包含するが、これらに限定されず、この変異には、置換変異、フレームシフト変異、遺伝子融合、インフレーム欠失または挿入が含まれるが、これらに限定されない。新抗原はまた、内因性レトロウイルスポリペプチドおよび過剰発現された腫瘍特異的変異を含有するポリペプチドも含むことができる。
「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、典型的には、隣接アミノ酸のαーアミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって、典型的には、一方が他方に接続された、Ｌ－アミノ酸の一連の残基を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、複数の別個のエピトープを含む単一の翻訳産物を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、エピトープまたは新エピトープなどの単一の別個のペプチドを含む単一の翻訳産物と、１つ以上の追加の足場タンパク質などの１つ以上の追加の非別個のエレメントと、を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、複数のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、分岐状マルチペプチド構造であり得る。ポリペプチドまたはペプチドは、それらの中性（荷電していない）形態または塩である形態のいずれかで、グリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化などの修飾を含まないか、または修飾が本明細書に記載されるポリペプチドの生物活性を破壊しないという条件に従って、これらの修飾を含有する、様々な長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも１つの隣接配列を含む。本明細書で使用される場合、「隣接配列」という用語は、新エピトープの一部ではない、新抗原ペプチドの断片または領域を指す。「変異体ポリペプチド」、「新抗原ポリペプチド」、「新抗原性ポリペプチド」、「変異体ペプチド」、「新抗原ペプチド」および「新抗原性ペプチド」は、互換的に使用され、変異を含有するペプチドまたはポリペプチドを指す。
「残基」という用語は、アミド結合もしくはアミド結合模倣物、またはアミノ酸もしくはアミノ酸模倣物をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）によってペプチドまたはタンパク質に組み込まれる、アミノ酸残基またはアミノ酸模倣物残基を指す。
「新エピトープ」、「腫瘍特異的新エピトープ」または「腫瘍抗原」は、非疾患細胞、例えば、非がん細胞または生殖系列細胞などの参照には存在しないが、疾患細胞、例えば、がん細胞に見出される、エピトープまたは抗原決定基領域を指す。本明細書で使用される場合、「新エピトープ」という用語は、ペプチドまたは新抗原性ペプチド内の抗原決定基領域を指す。新エピトープは、少なくとも１つの「アンカー残基」および少なくとも１つの「アンカー残基隣接領域」を含み得る。新エピトープは、「分離領域」をさらに含んでもよい。「アンカー残基」という用語は、ＨＬＡ上の特定のポケットに結合し、ＨＬＡとの相互作用の特異性をもたらすアミノ酸残基を指す。一部の場合、アンカー残基は、標準的なアンカー位置にあり得る。他の場合には、アンカー残基は、非標準的なアンカー位置にあってもよい。新エピトープは、ペプチド結合溝内のポケットに突出する一次および二次アンカー残基を通じてＨＬＡ分子に結合し得る。ペプチド結合溝において、特定のアミノ酸は、提示された新エピトープのアンカー残基の対応する側鎖を収容するポケットを構成する。ＨＬＡ ＩおよびＨＬＡ ＩＩ分子の両方の異なる対立遺伝子の間にペプチド結合の優先性が存在する。ＨＬＡクラスＩ分子は、短い新エピトープに結合し、そのＮ末端およびＣ末端は、新エピトープ結合溝の末端に位置するポケットに固定される。ＨＬＡクラスＩ結合新エピトープの大部分は、約９アミノ酸のものであるが、より長い新エピトープが、それらの中心部分の***部によって収容され得、約８～１２アミノ酸の結合新エピトープをもたらす。ＨＬＡクラスＩＩタンパク質に結合する新エピトープは、サイズに拘束されず、約１６～２５アミノ酸まで変化し得る。ＨＬＡクラスＩＩ分子内の新エピトープ結合溝は両端で開口しており、比較的長い長さでペプチドの結合を可能にする。約９アミノ酸残基のコアセグメントは、新エピトープの認識に最も寄与しているが、この領域に隣接するアンカー残基もまた、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子に対するペプチドの特異性にとって重要である。一部の場合、ペプチドの特異性に寄与するコア領域に隣接するアンカー残基が、コア領域残基のＮ末端に存在する。別の場合では、コア領域に隣接するアンカー残基は、コア領域残基のＣ末端に存在する。さらに別の場合では、ＨＬＡに対するペプチドの特異性に寄与するコア領域に隣接するアンカー残基は、コア領域残基のＮ末端およびＣ末端の両方にある
「参照」を使用して、腫瘍標本から本開示の方法で得られた結果を相関させ、比較することができる。典型的には、「参照」は、患者または１つ以上の異なる個体、例えば、健康な個体、特に同じ種の個体から得られた、１つ以上の正常な標本、特に、がん疾患による影響を受けていない標本に基づいて得られ得る。「参照」は、十分に多数の正常な標本を試験することによって実験的に決定することができる。
「エピトープ」は、例えば、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ分子、またはキメラ抗原受容体によって認識される部位をともに形成する、一次、二次、および三次ペプチド構造、ならびに電荷などの分子の集合的特徴である。代替的に、エピトープは、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、またはＴ細胞の文脈において、Ｔ細胞受容体タンパク質、キメラ抗原受容体、および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）受容体による認識に必要なアミノ酸残基のセットとして定義することができる。「Ｔ細胞エピトープ」は、ペプチドを提示するＭＨＣ分子またはＭＨＣ複合体の形態でクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子によって結合され得るペプチド配列を意味し、次いで、この形態において、Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞によって認識され、結合され得ることを意味すると理解されるべきである。エピトープは、天然源からの単離によって調製することができるか、またはそれらは、当該技術分野における標準的なプロトコルに従って合成することができる。合成エピトープは、天然に存在するＬアミノ酸残基のＤ異性体、またはシクロヘキシルアラニンなどの天然に存在しないアミノ酸残基などの、人工アミノ酸残基である、「アミノ酸模倣物」を含むことができる。本開示全体を通じて、エピトープは、場合によっては、ペプチドまたはペプチドエピトープと称され得る。本明細書に記載されるエピトープまたは類似体、および追加のアミノ酸（複数可）を含むタンパク質またはペプチドは、依然として本開示の範囲内にあることを理解されたい。ある特定の実施形態では、ペプチドは、抗原の断片を含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドの長さには制限がある。長さが制限される実施形態は、本明細書に記載されるエピトープを含むタンパク質またはペプチドが、天然配列と１００％同一性を有する領域（すなわち、アミノ酸残基の連続系列）を含む場合に生じる。
ペプチドまたはタンパク質を記載するために使用される命名法は、アミノ基が、各アミノ酸残基の左側（アミノ末端またはＮ末端）に提示され、カルボキシル基が、各アミノ酸残基の右側（カルボキシ末端またはＣ末端）に提示される、従来の慣行に従う。ペプチドエピトープにおいてアミノ酸残基位置が言及される場合、それらはアミノからカルボキシル方向に番号付けされ、１位は、エピトープのアミノ末端に位置する残基、またはその一部となり得るペプチドもしくはタンパク質である。本開示の選択された特定の実施形態を表す式において、具体的に示されないが、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、別段に指定されない限り、生理学的ｐＨ値で想定される形態である。アミノ酸構造式において、各残基は、一般に、標準的な３文字または１文字の表記で表されるが、３文字の記号またはフルネームを大文字なしで使用する場合、それらは、Ｌアミノ酸残基を指し得る。グリシンは、不斉炭素原子を有せず、単に「Ｇｌｙ」または「Ｇ」と称される。本明細書に示されるペプチドのアミノ酸配列は、一般的に、標準的な単一文字記号を使用して指定される。（Ａ、アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；およびＹ、チロシン。）
変異という用語は、参照と比較した、核酸配列の変化（ヌクレオチド置換、付加または欠失）を指す。体細胞変異は、細胞***の過程で変異細胞の子孫に受け継がれ得る細胞によって獲得される遺伝子変化である。体細胞変異は、生殖細胞（すなわち、***および卵子）で生じる遺伝による遺伝子変化である、生殖細胞系列変異とは異なる。いくつかの実施形態では、変異は、非同義変異である。非同義変異という用語は、変異、例えば、翻訳産物中のアミノ酸置換などのアミノ酸変化をもたらさない、ヌクレオチド置換を指す。フレームシフトは、変異が、遺伝子のコドン周期性の正常な相（「リーディングフレーム」としても知られる）を破壊するときに生じ、非天然タンパク質配列の翻訳をもたらす。遺伝子における異なる変異は、同じ変化したリーディングフレームを達成することが可能である。
保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基に置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。例えば、フェニルアラニンのチロシンへの置換は、保存的置換である。ペプチド機能を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当該技術分野において周知である。
本明細書で使用される場合、親和性という用語は、結合対の２つのメンバー、例えば、ＨＬＡ結合ペプチドとクラスＩまたはＩＩ ＨＬＡとの間の結合の強度の尺度を指す。ＫＤは解離定数であり、モル濃度の単位を有する。親和性定数は、解離定数の逆数である。親和性定数は、この化学物質を記述するための一般用語として使用されることがある。それは、結合のエネルギーの直接的な尺度である。親和性は、例えば、市販のＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ単位を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実験的に決定され得る。親和性はまた、阻害濃度５０（ＩＣ５０）としても表すことができ、その濃度でペプチドの５０％が置換する。同様に、ｌｎ（ＩＣ５０）は、ＩＣ５０の自然対数を指す。Ｋｏｆｆは、例えば、ＨＬＡ結合ペプチドおよびクラスＩまたはＩＩ ＨＬＡの解離のためのオフレート定数を指す。本開示全体を通して、「結合データ」の結果は、「ＩＣ５０」の観点から表すことができる。ＩＣ５０は、標識された参照ペプチドの結合の５０％阻害が観察される、結合アッセイにおける試験したペプチドの濃度である。アッセイが実行される条件（すなわち、ＨＬＡタンパク質および標識された参照ペプチド濃度を制限する）を考慮すると、これらの値は、ＫＤ値に近似する。結合を決定するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公報国際公開第９４／２０１２７号および同国際公開第９４／０３２０５号、ならびにＳｉｄｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８．３．１（１９９８）、Ｓｉｄｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）、およびＳｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４）のような他の刊行物に詳細に記載されている。代替として、結合は、参照標準ペプチドによる結合と比較して発現することができる。例えば、参照標準ペプチドのＩＣ５０と比較して、そのＩＣ５０に基づくことができる。結合はまた、以下を使用するものを含む他のアッセイシステムを使用して決定することもできる：生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９２（１９８９）、Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６７（１９９１）、Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３（１９９０）、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９（１９９１）、ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５（１９９５））、洗浄剤溶解物を使用する無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２０６９（１９９１））、固定化精製ＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２８９０（１９９４）、Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６（１９９４））、ＥＬＩＳＡシステム（例えば、Ｒｅａｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２８２９（１９９２））、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｋｈｉｌｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５４２５（１９９３））、高流量可溶性相アッセイ（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３（１９９４））、およびクラスＩ ＭＨＣ安定化またはアセンブリの測定（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７６（１９９０）、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６２：５６３（１９９０）、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６２：２８５（１９９０）、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１８９６（１９９２））。「交差反応結合」は、いくつかのペプチドにおいて明らかであり、すなわち、ペプチドは、２つ以上のＨＬＡ分子への乱雑な結合を示す。
エピトープを論じるために使用される場合、「誘導された」という用語およびその文法的等価物は、「調製された」およびその文法的等価物の同義語である。誘導されたエピトープは、天然源から単離され得るか、またはそれは、当該技術分野における標準的なプロトコルに従って合成され得る。合成エピトープは、天然に存在するＬアミノ酸残基のＤ異性体、またはシクロヘキシルアラニンなどの非天然アミノ酸残基などの、人工アミノ酸残基である、「アミノ酸模倣物」を含むことができる。誘導または調製されたエピトープは、天然エピトープの類似体であり得る。
「希釈剤」には、水、および石油、動物、植物または合成由来のものを含む、油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの滅菌液が含まれる。水もまた、医薬組成物のための希釈剤である。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液もまた、例えば、注射用溶液中で希釈剤として利用され得る。
「天然」または「野生型」配列は、天然に見られる配列を指す。このような配列は、本質的に、より長い配列を含むことができる。
「受容体」は、リガンドに結合することができる生体分子または分子群を意味するものとして理解されるべきである。受容体は、細胞、細胞形成または生物において情報を伝達する役割を果たし得る。受容体は、例えば、各受容体単位が、タンパク質分子からなり得る、少なくとも１つの受容体単位を含む。受容体は、リガンドの構造を補完する構造を有し、結合パートナーとしてリガンドを複合体化し得る。情報は、特に、細胞の表面上のリガンドの複合体化後の受容体の立体構造変化によって伝達される。いくつかの実施形態では、受容体は、リガンド、特に、好適な長さのペプチドまたはペプチド断片と受容体／リガンド複合体を形成することができるＭＨＣクラスＩおよびＩＩの特定のタンパク質を意味するものとして理解されるべきである。
「リガンド」は、受容体の構造に相補的な構造を有し、この受容体と複合体を形成することができる分子を意味するものとして理解されるべきである。いくつかの実施形態では、リガンドは、ペプチドまたはペプチド断片が、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのタンパク質と複合体を形成することができるように、そのアミノ酸配列内に好適な長さおよび好適な結合モチーフを有するペプチドまたはペプチド断片を意味するとものとして理解されるべきである。
いくつかの実施形態では、「受容体／リガンド複合体」はまた、クラスＩまたはクラスＩＩのペプチドまたはペプチド断片提示ＭＨＣ分子を含む、「受容体／ペプチド複合体」または「受容体／ペプチド断片複合体」を意味するものとしても理解されるべきである。
「合成ペプチド」は、非天然源から得られるペプチド、例えば、人工のペプチドを指す。このようなペプチドは、化学合成または組換えＤＮＡ技術などの方法を使用して製造することができる。「合成ペプチド」は、「融合タンパク質」を含む。
「モチーフ」という用語は、定義された長さのアミノ酸配列、例えば、クラスＩ ＨＬＡモチーフについて、長さが約１５アミノ酸残基未満、または長さが約１３アミノ酸残基未満、例えば、約８～約１３アミノ酸残基（例えば、８、９、１０、１１、１２、または１３）、およびクラスＩＩ ＨＬＡモチーフについて、約６～約２５アミノ酸残基（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）のペプチドの残基のパターンを指し、これは、特定のＨＬＡ分子によって認識される。モチーフは、典型的には、所与のヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされた各ＨＬＡタンパク質に対して異なる。これらのモチーフは、一次および二次アンカー残基のそれらのパターンが異なる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩモチーフは、長さが９、１０、または１１アミノ酸残基のペプチドを特定する。
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」という用語およびその文法的等価物は、物体が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、天然の供給源から単離することができ、実験室でヒトによって意図的に修飾されていない、ペプチドまたは核酸は、天然に存在する。
本開示によれば、「ワクチン」という用語は、投与時に、免疫応答、例えば、がん細胞などの病原体または疾患細胞を認識し、攻撃する、細胞性または体液性免疫応答を誘導する、医薬製剤（医薬組成物）または製品に関する。ワクチンは、疾患の予防または治療のために使用され得る。「個別のがんワクチン」または「個別化されたがんワクチン」という用語は、特定のがん患者に関するものであり、がんワクチンが、個々のがん患者のニーズまたは特別な状況に適合されることを意味する。
「保護免疫応答」または「治療用免疫応答」は、病原性抗原（例えば、腫瘍抗原）に由来する抗原に対するＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を指し、これは、何らかの方法で、疾患症状、副作用または進行を予防または少なくとも部分的に停止させる。免疫応答はまた、ヘルパーＴ細胞の刺激によって促進された抗体応答を含み得る。
「抗原プロセシング」または「プロセシング」、およびその文法的等価物は、当該ポリペプチドまたは抗原の断片である、プロセス生成物へのポリペプチドまたは抗原の分解（例えば、ペプチドへのポリペプチドの分解）、ならびに特異的Ｔ細胞に対する、細胞、例えば、抗原提示細胞による提示のためのＭＨＣ分子との、これらの断片のうちの１つ以上の（例えば、結合による）会合を指す。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、タンパク質抗原のペプチド断片を、それらの細胞表面上のＭＨＣ分子と会合して提示する細胞である。いくつかのＡＰＣは、抗原特異的Ｔ細胞を活性化させ得る。プロフェッショナル抗原提示細胞は、食作用または受容体媒介性エンドサイトーシスのいずれかによって抗原を内在化し、次いでクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合した抗原の断片を、それらの膜上に表示することにおいて非常に効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原クラスＩＩ ＭＨＣ分子複合体を認識し、それと相互作用する。次いで、抗原提示細胞によってさらなる共刺激性シグナルが生成され、Ｔ細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞の決定的な特徴である。プロフェッショナル抗原提示細胞の主なタイプは、最も広い範囲の抗原提示を有し、おそらく最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および特定の活性化上皮細胞である。樹状細胞（ＤＣ）は、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩ抗原提示経路の両方を介して、末梢組織中に捕捉された抗原を、Ｔ細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞が、免疫応答の強力な誘導物質であることは周知であり、これらの細胞の活性化は、抗腫瘍免疫の誘導のための重要なステップである。樹状細胞は、便宜的に、「未成熟」および「成熟」細胞として分類され、これは、２つの十分に特徴付けられた表現型を識別するための単純な方法として使用され得る。しかしながら、この命名法は、分化の可能性のあるすべての中間段階を除外するように解釈されるべきではない。未成熟樹状細胞は、抗原取り込みおよびプロセシングについての能力が高く、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）およびマンノース受容体の高発現と相関する、抗原提示細胞として特徴付けられる。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーのより低い発現を特徴とするが、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）、ならびに共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、および４－１ＢＢ）などのＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高い発現を特徴とする。
ポリペプチドの２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、本明細書で使用される場合、「同一の」およびその文法的等価物、または「配列同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウにわたって最大一致について整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。本明細書で使用される場合、例示的な「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０の連続した位置、通常、約５０～約２００、より通常、約１００～約１５０のセグメントを指し、配列は、２つの配列が最適に整列された後に、同じ数の連続した位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）のアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣａｌｉｆによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない）によって、行うことができ、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７－２４４（１９８８）およびＨｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１－１５３（１９８９）、Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：１０８８１－１０８９０（１９８８）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，８：１５５－１６５（１９９２）、ならびにＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：３０７－３３１（１９９４）によって十分に説明されている。また、アラインメントは、多くの場合、検査および手動アラインメントによって実施される。実施形態の１つのクラスでは、本明細書におけるポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴＰ（またはＣＬＵＳＴＡＬ、もしくは任意の他の利用可能なアラインメントソフトウェア）によって測定して、参照ポリペプチド、またはその断片に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。同様に、核酸もまた、出発核酸を参照して記載することができ、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴＮ（またはＣＬＵＳＴＡＬ、もしくは任意の他の利用可能なアラインメントソフトウェア）によって測定して、参照核酸またはその断片に対して、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有することができる。１つの分子が、より大きな分子との配列同一性の一定の割合を有すると言われる場合、それは、２つの分子が最適に整列される場合、より小さな分子内の残基の当該割合が、２つの分子が最適に整列される順序に従って、より大きな分子内で一致する残基を見つけることを意味する。
核酸またはアミノ酸配列に適用される「実質的に同一」およびその文法的等価物は、核酸またはアミノ酸配列が、標準パラメータを使用して、上記のプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴを使用した参照配列と比較して、少なくとも９０％またはそれを超える配列同一性、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％を有する配列を含むことを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２）を参照されたい）。配列同一性の割合は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を乗じて、配列同一性の割合を得ることによって計算される。実施形態では、実質的な同一性は、少なくとも約５０個の残基の長さである配列の領域にわたって、少なくとも約１００個の残基の領域にわたって存在し、実施形態では、配列は、少なくとも約１５０個の残基にわたって実質的に同一である。実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
ベクターは、一般に、宿主細胞において目的の１つ以上の遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達することができ、通常、発現することができる構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性縮合薬剤に関連するＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、ならびにリポソームに封入されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。
「単離」されるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然には見出されない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、それらがもはや天然に見出される形態ではない程度に精製されたものを含む。いくつかの実施形態では、単離されるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。いくつかの実施形態では、「単離されたポリヌクレオチド」は、ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ反応において増幅されたポリヌクレオチドを含む、ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ反応を包含する。
「単離された」、「生物学的に純粋な」という用語、またはそれらの文法的等価物は、その天然の状態で見出されるように、材料に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。したがって、本明細書に記載される単離されたペプチドは、それらのその場の環境において、通常、ペプチドと会合する材料の一部またはすべてを含有しない。「単離された」エピトープは、エピトープが由来した抗原の全配列を含まないエピトープを指す。典型的には、「単離された」エピトープは、天然配列の全長にわたって１００％の同一性を有する配列をもたらすさらなるアミノ酸残基を、それに取り付けられない。天然配列は、エピトープが由来する腫瘍関連抗原などの配列であり得る。したがって、「単離された」という用語は、材料が、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然環境）から除去されることを意味する。「単離された」核酸は、その天然環境から除去された核酸である。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはペプチドは、単離されないが、天然系に共存する材料の一部またはすべてから分離された、同じポリヌクレオチドまたはペプチドが単離される。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはペプチドは、組成物の一部であり得、このようなベクターもしくは組成物が、その自然環境の一部ではないという点で、依然として「単離」され得る。単離されたＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含み、さらに、合成的に産生されたこのような分子を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」という用語、およびその文法的等価物は、核酸配列、ポリペプチド、タンパク質または他の化合物を指し、これらは、核酸配列、ポリペプチド、タンパク質もしくは他の化合物が、天然に会合する、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド、および他の分子を本質的に含まない、すなわち、約５０％超含まない、約７０％超含まない、約９０％超含まない。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質を含まない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である材料を指す。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「ポリ核酸」または「オリゴヌクレオチド」という用語、およびそれらの文法的等価物は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む。したがって、これらの用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡが含まれる。また、これには、例えば、メチル化および／またはキャッピングによる修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含まれる。この用語はまた、非天然または合成ヌクレオチド、ならびにヌクレオチド類似体を含む、分子も含むことを意味する。本明細書に開示または企図される核酸配列およびベクターは、例えば、トランスフェクション、形質転換、または形質導入によって細胞に導入され得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドおよび核酸は、インビトロで転写されたｍＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して投与されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
一般に、トランスフェクション、形質転換、または形質導入は、物理的または化学的方法を使用することによって、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを指す。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で既知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿（例えば、Ｍｕｒｒａｙ Ｅ．Ｊ．（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、タングステン粒子促進性微粒子銃（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：７７６－７７７（１９９０）を参照されたい）、およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿（Ｂｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７：２０３１－２０３４（１９８７））が含まれる。ファージまたはウイルスベクターは、好適なパッケージング細胞内の感染性粒子の増殖の後に、宿主細胞内に導入することができ、それらの多くは市販されている。
核酸および／または核酸配列は、それらが、天然または人工的に、共通の祖先の核酸または核酸配列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらのコードＤＮＡが、天然または人工的に、共通の祖先の核酸または核酸配列に由来する場合、「相同」である。相同分子は、相同体と称することができる。例えば、本明細書に記載される、任意の天然に存在するタンパク質は、任意の利用可能な変異誘発法によって修飾することができる。発現した場合、この変異誘発核酸は、元の核酸によってコードされたタンパク質に相同なポリペプチドをコードする。相同性は、一般に、２つ以上の核酸またはタンパク質（またはそれらの配列）の間の配列同一性から推測される。相同性を確立するのに有用な配列間の同一性の正確な割合は、問題の核酸およびタンパク質により変化するが、相同性を確立するために通常使用される配列同一性はわずか２５％である。配列同一性のより高いレベル、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％またはそれを超えるレベルも、相同性を確立するために使用することができる。配列同一性の割合を決定するための方法（例えば、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）が本明細書に記載されており、一般に利用可能である。
「対象」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類などを含むが、これらに限定されない、特定の治療のレシピエントであるべき、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関して本明細書で互換的に使用される。
「有効量」または「治療有効量」または「治療効果」という用語は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「治療する」のに有効な治療薬の量を指す。薬物の治療有効量は、治療効果を有するため、疾患または障害の発症を予防することができ、疾患または障害の発症を遅延させることができ、疾患または障害の進行を遅延させることができ、疾患または障害に関連する症状のうちの１つ以上を、ある程度緩和することができ、罹患率および死亡率を低減させることができ、生活の質を改善することができ、あるいはこのような効果の組み合わせが可能である。
「治療する」または「治療」または「治療すること」または「軽減する」または「軽減すること」は、（１）診断された病理学的状態または障害を治癒する、遅延させる、それらの症状を低減させる、および／またはそれらの進行を停止する、治療手段、ならびに（２）標的化された病理学的状態または障害の発症を予防または遅延させる、予防的または防止的手段の両方を指す。したがって、治療を必要とするものには、既に障害を有しているもの、障害を有する傾向があるもの、および障害が予防されるべきものが含まれる。
「薬学的に許容される」とは、一般的に無毒であり、不活性であり、かつ／または生理学的に適合する組成物もしくは組成物の成分を指す。
「薬学的賦形剤」または「賦形剤」は、アジュバント、担体、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化調整剤、湿潤剤、防腐剤などの材料を含む。「薬学的賦形剤」は、薬学的に許容される賦形剤である。
本明細書で使用される場合、「足場ドメイン（ｓｃａｆｆｏｌｄ ｄｏｍａｉｎ）」、「足場ドメイン（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」、および「足場ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用される。
一態様では、本明細書に記載されるのは、足場タンパク質に融合された複数のエピトープまたは抗原を含む、融合ポリペプチドである。エピトープは、約５～５０アミノ酸長であり得る短いペプチドである。融合ポリペプチド、または融合ポリタンパク質、または「ポリボディ」は、複数のエピトープを１つの分子に組み合わせることによって生成することができる。ポリボディは、例えば、免疫療法のために、エピトープが活性治療成分である、エピトープを含む、治療薬を生成するのに有用である。エピトープ単独は、その予想される結果を達成することなく、生体系内で急速に分解し得るが、ポリボディ形態は、単一のエピトープ形態よりも優位性を提供するように設計され得る。ポリボディにおいて、足場タンパク質は、新抗原を安定化し、エピトープの溶解性を向上させ、分子量を、例えば、５０ｋＤａ超に増加させて、リンパ節標的化および保持を可能にし、特定の組織もしくは細胞を標的化するか、またはタンパク質精製もしくは同定のためにタグを導入するように設計され得る。
製造の観点から、ポリボディは、単一ペプチドのバッチ製造を低減する。翻訳後修飾の不在は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける足場の安価な迅速な組換え産生を可能にする。足場は比較的小さいサイズであり、既知の毒性はない。いくつかの実施形態では、足場タンパク質は、ヒトタンパク質であり、それによって、抗原性の欠如を確実にする。いくつかの実施形態では、樹状細胞標的化または活性化などのために、機能的足場を組み込むことができる。ユビキチン足場は、プロテアソームの分解および抗原のプロセシングを増強することができる。いくつかの実施形態では、足場タンパク質は、例えば、細胞標的部分を含むようにさらに修飾され得る。
融合ポリペプチド
一態様では、本明細書に開示されるのは、１つ以上の抗原ポリペプチドと、１つ以上の足場ポリペプチドと、を含む、融合ポリペプチドである。また、本明細書に開示されるのは、融合ポリペプチドをコードする核酸分子、および融合ポリペプチドまたは核酸分子を含む組成物である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ポリペプチド配列を含み、当該配列は、１つ以上の抗原ポリペプチド配列および１つ以上の足場ポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、２つ以上の足場ポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれは、ヒトポリペプチド配列、その断片、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の足場ポリペプチド配列の分子量は、１１ｋＤａ超である。いくつかの実施形態では、２つ以上の足場ポリペプチド配列のそれぞれは、少なくとも２１個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、タイチン－Ｉ２７、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択される。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つは、１つ以上のリンカー配列を介して１つ以上の抗原ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つに接続されている。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、リンカーの切断、１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの切断、または１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの提示を促進するように構成されている。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、がん抗原である。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの分子量は、少なくとも２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、または２００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの分子量は、少なくとも７５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの分子量は、最大でも２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、または５００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの分子量は、約５０～８０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの分子量は、約７０～８０ｋＤａである。融合ポリペプチドは、直鎖状または分岐状のフォーマットをとるように構成され得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、直鎖状フォーマットである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、複数の分岐を有する。
１つ以上の足場ポリペプチドは、様々な方法で、融合ポリペプチドの残りの配列、またはそれらの間に連結され得る。例えば、足場ポリペプチドは、Ｎ末端もしくはＣ末端を介して、またはＮ末端とＣ末端との間の挿入を介して連結され得る。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つは、そのＮ末端を介して、融合ポリペプチドの残りの配列に連結される。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つは、そのＣ末端を介して、融合ポリペプチドの残りの配列に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドのそれぞれは、そのＮ末端、Ｃ末端、または両方の末端を介して融合ポリペプチドの残りの配列に連結される。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも２つは、抗原配列またはリンカー配列によって中断されない。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、それらのそれぞれのＮ末端とＣ末端との間の挿入によって連結されていない。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（Ｉａ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
Ａｎ－Ｓｍ、またはＳｍ－Ａｎ 式（Ｉａ）、
式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、ｍが、１以上の整数であり、ｎが、１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、１～１０から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、１～５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、１～３から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｍおよびｎのそれぞれは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、ｍは、１であり、ｎは、２である。いくつかの実施形態では、ｎは、１であり、ｍは、２である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、Ａ－Ａ－Ｓ、Ａ－Ａ－Ａ－Ｓ、Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｓ、Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｓ、Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｓ、またはＡ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｓの構造を有する、ポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、Ｓ－Ａ－Ａ、Ｓ－Ａ－Ａ－Ａ、Ｓ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ、Ｓ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ、Ｓ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ、またはＳ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａの構造を有する、ポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、Ａ－Ｓ、Ａ－Ｓ－Ｓ、Ａ－Ｓ－Ｓ－Ｓ、Ａ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ、Ａ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ、またはＡ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓの構造を有する、ポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、Ｓ－Ａ、Ｓ－Ｓ－Ａ、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ａ、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ａ、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ａ、またはＳ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ａの構造を有する、ポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（Ｉｂ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
ＳＯ－Ａｎ－Ｓｍ 式（Ｉｂ）
式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、ｏ、ｎ、およびｍのそれぞれが、独立して、１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｏ、ｎ、およびｍのそれぞれは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、ｏ、ｍ、およびｎのそれぞれは、１～５から独立して選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｏは、１または２であり、ｍは、１または２であり、ｎは、１～５から選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｏおよびｍは、１に等しく、ｎは、１～５の整数である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、Ｓ－Ａ－Ｓ、Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、またはＳ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓの構造を有する、ポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、Ｓ－Ａ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｓ、またはＳ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａ－Ｓの構造を有する、ポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（ＩＩａ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
（Ｌ－Ａ－Ｌ）ｎ－Ｓｍ、またはＳｍ－（Ｌ－Ａ－Ｌ）ｎ 式（ＩＩａ）、
式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、各Ｌが、独立して、リンカー配列を表すか、または不在であり、ｍが、１以上の整数であり、ｎが、１以上の整数である。式（ＩＩａ）のいくつかの実施形態では、ｍは、２以上の整数である。式（ＩＩａ）のいくつかの実施形態では、ｎは、１～５から選択される整数であり、ｍは、２である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、Ａ－Ｌ－Ｓ、Ａ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ａ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ａ、またはＳ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ａの構造を有する、ポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（ＩＩｂ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
Ｓｏ－（Ｌ－Ａ－Ｌ）ｎ－Ｓｍ 式（ＩＩｂ）、
式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、各Ｌが、独立して、リンカー配列を表すか、または不在であり、ｏ、ｎ、およびｍのそれぞれが、独立して、１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｏは、１または２であり、ｍは、１または２であり、ｎは、１～５から選択される整数である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｓ、またはＳ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓの構造を有する、ポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドおよび抗原ポリペプチドは、間にリンカー配列を有するか、または有しない、交互様式で融合ポリペプチド内に位置する。例えば、いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向において、Ｓ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ、Ａ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ａ、Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、またはＳ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａの構造を有する、ポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれは、リンカー配列のうちの少なくとも１つを介して抗原ポリペプチド配列のうちの１つまたは２つに接続されている。
記載される融合ポリペプチドは、足場ドメインを欠く、対応するポリペプチドと比較して、改善されたリンパ節蓄積または保持をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、対象への投与後のリンパ節における融合ポリペプチドの蓄積は、平均放射効率によって測定した、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの蓄積よりも、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い。いくつかの実施形態では、対象への投与後のリンパ節における融合ポリペプチドの蓄積は、平均放射効率によって測定した、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの蓄積よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い。例えば、リンパ節蓄積は、実施例３．１に記載される方法に従って測定することができる。
記載される融合ポリペプチドは、足場ドメインを欠く、対応するポリペプチドと比較して、水性溶媒中で改善された溶解度を有することができる。いくつかの実施形態では、水性溶媒中の融合ポリペプチドの溶解度は、同じ溶媒中で測定した、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの溶解度よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍高い。いくつかの実施形態では、水性製剤中の融合ポリペプチドの溶解度は、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの溶解度よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍高い。記載される融合ポリペプチドは、足場ドメインを欠く、対応するポリペプチドと比較して、改善された安定性、例えば、血清安定性を有することができる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの血清半減期は、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの血清半減期よりも、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍長い。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの血清半減期は、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの血清半減期よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍長い。記載される融合ポリペプチドは、足場ドメインを欠く、対応するポリペプチドと比較して、改善された溶解度を有することができる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの血清溶解度は、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの血清溶解度よりも、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い。
記載される融合ポリペプチドは、足場ドメインを欠く、対応するポリペプチドと比較して、増強された免疫応答を誘発することができる。いくつかの実施形態では、対象への投与後の融合ポリペプチドの抗原特異的Ｔ細胞応答は、脾細胞増殖の増加によって測定した、足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの抗原特異的Ｔ細胞応答よりも、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、または３００倍高い。例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答は、実施例３．２の方法に従って測定することができる。
足場ポリペプチドまたは足場ドメイン
融合ポリペプチドは、１つ以上の足場ポリペプチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、同じである。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、少なくとも２つの異なる足場ポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを超える異なる足場ポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、組換えヒトポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、ヒトタンパク質に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、ヒトタンパク質などの野生型哺乳動物タンパク質に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、標的結合特性を有するように構成されていない。他の実施形態では、足場ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、標的分子に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、翻訳後修飾を欠く。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、ペプチド内ジスルフィド結合を欠く。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、非免疫原性である。他の実施形態では、足場ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、免疫原性である。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、酵素活性を有するように構成されていない。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、シグナル配列を欠く。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の足場ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、最大でも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または２０個の足場ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、２～６個の足場ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の足場ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、６個の足場ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドにおける足場ポリペプチド配列の分子量は、少なくとも１１ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、または２００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドにおける足場ポリペプチド配列の分子量は、少なくとも７５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドにおける足場ポリペプチド配列の分子量は、最大でも１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、または５００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれの分子量は、少なくとも５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、または１００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれの分子量は、最大でも６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、または２５０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、８～１２ｋＤａ、または１０～１２ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、約１１ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれは、少なくとも２１個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、少なくとも２００個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチド配列のそれぞれは、最大でも３０個、最大でも３５個、最大でも４０個、最大でも４５個、最大でも５０個、最大でも５５個、最大でも６０個、最大でも６５個、最大でも７０個、最大でも７５個、最大でも８０個、最大でも８５個、最大でも９０個、最大でも１００個、最大でも１２５個、最大でも１５０個、最大でも１７５個、または最大でも２００個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、または少なくとも９５個のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、約９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１１０個、または１２０個のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、足場タンパク質は、哺乳動物タンパク質、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系などの細菌発現系において好適に発現され得るヒトタンパク質であり、タンパク質は、小型であり、安定しており、分泌タンパク質または細胞質タンパク質のいずれかである。いくつかの実施形態では、足場タンパク質は、ヒトタンパク質である。哺乳動物細胞は、推定１０億個のタンパク質分子を含有する。これらのタンパク質の大部分は、体内の生体分子相互作用において効率を高め、支持するのに役立つ足場タンパク質として機能することが見出され得、この相互作用は、シグナル伝達の発揮、生体分子の細胞内輸送、酵素活性、または細胞運動性を促進する構造的再形成などの、細胞挙動の態様を促進する。本開示では、本発明者らは、ヒト足場タンパク質を使用して、短いエピトープペプチドを、活性免疫応答を生成するための手段に変換する、効率的かつ簡潔な方法を提供する。いくつかの実施形態では、足場タンパク質は、エピトープペプチドに安定性を付与するように選択される。いくつかの実施形態では、足場タンパク質は、エピトープペプチドに、溶解性および増加した血清半減期を付与するように選択される。いくつかの実施形態では、足場タンパク質は、例えば、同族ＭＨＣ分子との会合のための利用可能性を増加させることによって、免疫原性を与える際の構造的利点を付与するように選択される。足場タンパク質は、それが無毒であるように選択され得る。足場タンパク質は、これらの目的のいずれかまたはすべてに適合する足場機能または能力を有する任意のタンパク質であり得る。
例えば、公知の細胞足場タンパク質は、反応のエントロピーを減少させるために他の機能的タンパク質を補助する。いくつかの実施形態では、足場タンパク質は、１つ以上のタンパク質、酵素、ペプチド、または他の生体分子をつなぎ合わせ、局所濃度を増加させるか、または機能的転帰のために一時的に固定化するのに役立つ。例えば、Ｃｕｌｌｉｎ足場タンパク質は、Ｅ２ユビキチンをつなぎ合わせ、Ｔ細胞の活性化のためのリンカー（ＬＡＴ）および７６ｋＤのＳＨ２ドメイン含有白血球タンパク質（ＳＬＰ－７６）のタンパク質は、ＴＣＲシグナル伝達を体系化するのに役立つ。
いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、シスタチンスーパーファミリーのメンバー、そのバリアント、またはその断片である。いくつかの実施形態では、シスタチンスーパーファミリーのメンバーは、１型シスタチン、２型シスタチン、または３型シスタチンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、ヒトＳｔｅｆｉｎ ＡなどのＳｔｅｆｉｎ Ａである。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドのうちのすべては、Ｓｔｅｆｉｎ Ａである。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、ヒトＳｔｅｆｉｎ Ａタンパク質配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、哺乳動物のタイチンタンパク質、そのバリアント、またはその断片の配列を含む。タイチンタンパク質の配列は、タイチンタンパク質の任意のドメイン、例えば、Ｉｇ様ドメイン、ＦｎＩＩＩ様ドメイン、および偽キナーゼドメインからの配列であり得る。いくつかの実施形態では、タイチンタンパク質の配列は、Ｉ－バンドの配列である。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、タイチンＩｇ様ドメイン配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タイチンタンパク質からの配列は、Ｉ２７ドメイン配列、Ｉ１ドメイン配列、Ｚ１ドメイン配列、Ｚ２ドメイン配列、またはＭ５ドメイン配列である。いくつかの実施形態では、タイチンタンパク質からの配列は、Ｉ２７ドメイン配列である。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、タイチンＩ２７、そのバリアント、またはその断片を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、糖タンパク質、例えばフィブロネクチン、それらのバリアント、またはそれらの断片の配列を含む。いくつかの実施形態では、糖タンパク質は、フィブロネクチンである。フィブロネクチンの配列は、そのサブユニット、例えば、フィブロネクチンＩ型、ＩＩ型、またはＩＩ型ドメインのいずれかからの配列であり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、ＦｎＩＩＩ、例えば、１ＦＮＩＩＩ、９ＦＮＩＩＩ、１０ＦＮＩＩＩ、または１１ＦＮＩＩＩの配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮＩＩＩの配列は、１０ＦＮ－ＩＩＩドメイン配列である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、チオレドキシン、１０ＦＮＩＩＩ、リポカリン、アデノ随伴ウイルスのカプシドポリペプチド、αアミラーゼ阻害剤、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、ユビキチン、Ｉｇ－ＬフィラミンＡ、テネイシン、不活性化ブドウ球菌ヌクレアーゼ、緑色蛍光タンパク質、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインなどの単離されたタンパク質折り畳み、アンキリンリピート、ビリン結合タンパク質、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択されるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の足場ポリペプチドは、それぞれ独立して、タイチンＩ２７、ユビキチン、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、１０ＦＮ－ＩＩＩ、Ｉｇ－ＬフィラミンＡ、テネイシン、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択される。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドは、それぞれ独立して、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、タイチンＩ２７、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択される。いくつかの実施形態では、足場ポリペプチドのそれぞれは、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、その断片、またはそのバリアントである。
足場タンパク質は、全長タンパク質もしくは断片、または特定のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、足場は、プロテインＡドメイン、Ｓｒｃ相同ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＷＷドメイン、ジンクフィンガードメイン、またはそれらの誘導体であり得る。
いくつかの実施形態では、足場タンパク質は、要求に合うように修飾され得る。いくつかの実施形態では、足場は、毒性を低減させるか、生物学的相互作用を低減させるか、または免疫原性を低減させるために、１個、２個、３個またはそれを超える残基で変異される。いくつかの実施形態では、足場は、結合部位または特異性決定基部分、例えば、ＣＬＥＣ９Ａ部分を標的とする樹状細胞（ＤＣ）の組み込みなどの、標的化部分を含むように、１個、２個、３個、またはそれを超える残基で変異される。
抗原ポリペプチド
本明細書に記載される融合ポリペプチドは、１つ以上の抗原ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または２０個の抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、最大でも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、５０個、または１００個の抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、５個または６個の抗原ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、複数の抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチド配列のそれぞれは、融合ポリペプチド上の他の抗原ポリペプチド配列とは異なる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの抗原ポリペプチドのすべては、同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、合成ポリペプチドである。
１つ以上の抗原ポリペプチドは、免疫応答、例えば、外因性抗原、内因性抗原、自己抗原、新抗原、またはそれらの組み合わせを誘導する任意の抗原ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原は、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原は、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチドは、第１の抗原ポリペプチドと、第２の抗原ポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原ポリペプチドは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の抗原ポリペプチドは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の抗原ポリペプチドは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第１の抗原ポリペプチドは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチドは、クラスＩ ＨＬＡ結合エピトープと、クラスＩＩ ＨＬＡ結合エピトープと、を含み得る。いくつかの実施形態では、第１の抗原ポリペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第２の抗原ポリペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、足場ポリペプチド配列および抗原ポリペプチド配列に直接接続されている。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、足場ポリペプチド配列および別のリンカー配列に直接接続されている。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、抗原ポリペプチド配列および別のリンカー配列に直接接続される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、２つの足場ポリペプチド配列に直接接続されている。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、２つの抗原ポリペプチド配列に直接接続されている。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、２つの他のリンカー配列に直接接続されている。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、以下のうちの３つ以上：足場ポリペプチド配列（複数可）、抗原ポリペプチド配列（複数可）、リンカー配列（複数可）、またはそれらの任意の組み合わせに直接接続され得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカー配列は、同じである。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカー配列のそれぞれは、特有である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるリンカー配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列のそれぞれは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、または５０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列のそれぞれは、最大でも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、または１００個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカー配列は、５～２０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、ジスルフィド結合を形成するように構成されていない。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～１００個のアミノ酸残基、２～５０個のアミノ酸残基、または２～２５個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブルである。いくつかの実施形態では、リンカーのうちの少なくとも１つは、フレキシブルである。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、小さな非極性アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒを含む。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基のストレッチ、例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含む。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤの配列を含む。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴの配列を含む。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、（Ｇｌｙ）ｚの配列を含み、ｚは、５～１０の整数である。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、（Ｇｌｙ）８の配列を含む。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカーは、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦの配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、剛性である。いくつかの実施形態では、リンカーのうちの少なくとも１つは、剛性である。いくつかの実施形態では、剛性なリンカーは、アルファヘリックスを形成することができる。いくつかの実施形態では、剛性なリンカーは、ＥＡＡＡＫの配列を含む。いくつかの実施形態では、剛性なリンカーは、Ｇｌｕ－Ｐｒｏの配列を含む。いくつかの実施形態では、剛性なリンカーは、Ｌｙｓ－Ｐｒｏの配列を含む。例示的なリンカー配列は、Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔ １５；６５（１０）：１３５７－１３６９，“Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ”に開示されているものを含み得る。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、リンカーの切断を促進するように構成されている。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの切断を促進するように構成されている。いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能である。いくつかの実施形態では、リンカーのうちの少なくとも１つは、切断可能である。切断可能なリンカーは、１つ以上の切断可能な部位を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、切断部位を含む。いくつかの実施形態では、切断部位は、細胞還元薬剤によって切断可能である。例えば、切断可能な部位は、ジスルフィド結合、例えば、リンカー上の２つのシステイン残基の間に形成されるジスルフィド結合を含み得る。いくつかの実施形態では、切断部位は、ペプチダーゼまたはプロテアーゼによって切断可能である。いくつかの実施形態では、切断部位は、プロテアーゼ、例えば、Ｋｅｘ１、Ｓｔｅ１３、およびＫｅｘ２によって切断可能である。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの提示を促進するように構成されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、抗原ポリペプチドの提示を促進することができるコンテキスト配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、リジン残基、アルギニン残基、セリン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、チロシン残基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端に直接接続された、リジン残基、アルギニン残基、またはアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接接続された、セリン残基、リジン残基、アルギニン残基、またはアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端に直接接続された、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、またはフェニルアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接接続された、メチオニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、またはトリプトファン残基を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーのうちの少なくとも１つは、機能的である。例えば、リンカーは、融合ポリペプチドの発現レベルを改善するように、融合ポリペプチドの生物活性を改善するように、または融合ポリペプチドがインビボで特定の部位を標的とすることを可能にするように構成され得る。別の例では、リンカーは、融合ポリペプチドのＰＫおよびＰＤ特性に影響を与えるように構成され得る。
標的化機能
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、インビボ標的部位などの、特定の部位を標的とするように構成されている。例えば、融合ポリペプチドは、高親和性を有するか、または標的部位に結合する、１つ以上の結合部分を有することができる。例示的な標的部位には、限定されないが、薬剤、薬物、タンパク質またはポリペプチド、ならびに抗原提示細胞などの細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、抗原提示細胞、アジュバント、または試薬に結合するように構成された１つ以上の結合部分を含む。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、またはＢ細胞である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、樹状細胞などの細胞上に発現された１つ以上の受容体に結合するように構成されている。
いくつかの実施形態では、１つ以上の受容体は、カルシウム依存性（Ｃ型）レクチン受容体、スカベンジャー受容体、Ｆ４／８０受容体、ＤＣ特異的膜貫通タンパク質（ＤＣ－ＳＴＡＭＰ）、Ｆｃ受容体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃ型レクチン受容体は、マンノース受容体、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－結合ノンインテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）受容体、Ｌ－ＳＩＧＮまたはＤＣ－ＳＩＧＮＲ受容体、肝臓およびリンパ節類洞細胞型レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）受容体、Ｃ型レクチン免疫受容体（ＣＩＲＥ）、ランゲリン受容体、ヒトマクロファージガラクトース－およびＮ－アセチルガラクトサミン特異的Ｃ型レクチン受容体、Ｄｅｃｔｉｎ－１またはβ－グルカン受容体、ＮＫレクチン群受容体－１、骨髄阻害性Ｃ型レクチン受容体、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ２）、ＣＬＥＣ１２Ｂ受容体、酸化密度リポタンパク質－１のためのレクチン様受容体、ＤＣ免疫受容体サブファミリー受容体、ＤＣ免疫受容体、Ｄｅｃｔｉｎ－２受容体、または血液ＤＣ抗原である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の受容体は、Ｃｌｅｃ９ａを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の受容体は、ケモカイン受容体を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の受容体は、ＸＣＲ１受容体を含む。
いくつかの実施形態では、結合部分のうちの少なくとも１つは、足場ポリペプチドに含まれる。
いくつかの実施形態では、結合部分のうちの少なくとも１つは、足場ポリペプチドのうちの１つのＮ末端またはＣ末端に直接接続されている。
いくつかの実施形態では、結合部分のうちの少なくとも１つは、抗原ポリペプチドのうちの１つのＮ末端またはＣ末端に直接接続されている。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端方向において、結合部分のうちの少なくとも１つは、足場ポリペプチドのうちの最初または最後の足場ポリペプチドに末端連結されている。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または２０個の異なる融合ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、最大でも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または２０個の異なる融合ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
一態様では、本明細書に開示されるのは、記載される核酸分子によってコードされた融合ポリペプチドである。
一態様では、本明細書に開示されるのは、記載される融合ポリペプチドを含む、組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、融合ポリペプチドにコンジュゲートすることができる１つ以上の結合部分を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、融合ポリペプチドにコンジュゲートされている。
一態様では、本明細書に開示されるのは、１つ以上のリンカーによって間隔を置かれた２つ以上の足場ポリペプチド、およびリンカーのうちの少なくとも１つに位置する１つ以上の制限部位をコードする核酸分子であって、（ｉ）２つ以上の足場ポリペプチド配列の分子量が１１ｋＤａ超であるか、または（ｉｉ）２つ以上の足場ポリペプチド配列のそれぞれが、少なくとも２１個のアミノ酸残基を含む、核酸分子である。
一態様では、本明細書に開示されるのは、第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列、および第１の足場ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第１の核酸分子と、第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な配列を含む核酸配列、および第２の足場ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第２の核酸分子と、を含む、複数の核酸分子である。
別の態様では、本明細書に開示されるのは、第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列、第１の足場ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第１の核酸分子と、第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な配列を含む核酸配列、および第２の足場ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第２の核酸分子と、を含む、複数の核酸分子である。
さらに別の態様では、本明細書に開示されるのは、第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列、第１の足場ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第１の核酸分子と、第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な配列を含む核酸配列、および第２の足場ポリペプチドをコードする核酸配列、および第３の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第２の核酸分子と、を含む、複数の核酸分子である。
いくつかの実施形態では、第１の足場配列および第２の足場配列は、同じである。
いくつかの実施形態では、第１の抗原ポリペプチドおよび第２の抗原ポリペプチドは、異なる。
いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の抗原ポリペプチドは、異なる。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
一態様では、本明細書に開示されるのは、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と、記載された組成物、または記載された融合ポリペプチドと、を含む、医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバントを含む。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、ポリＩＣ：ＬＣである。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ｐＨ調整剤を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、免疫調節剤、サイトカイン、ケモカイン、またはチェックポイント阻害剤などの第２の治療薬剤を含む。
一態様では、本明細書に開示されるのは、免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、方法は、遺伝子修飾細胞において、記載される核酸分子を発現させ、それによって、免疫原性融合ポリペプチドを産生することを含む、方法である。
別の態様では、本明細書に開示されるのは、免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、方法は、本明細書に記載される核酸分子を提供することと、１つ以上の抗原ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子を、制限部位のうちの少なくとも１つに挿入し、それによって、新しい核酸分子を産生することと、遺伝子修飾細胞において、新しい核酸分子を発現させ、それによって、免疫原性融合ポリペプチドを産生することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子は、等温反応を通じて、または制限酵素ベースのクローニングによって挿入される。
一態様では、本明細書に開示されるのは、免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、方法は、本明細書に記載される複数の核酸分子を提供することと、ハイブリダイゼーションにより核酸分子を接合することと、遺伝子修飾細胞において、接合した核酸分子を発現させ、それによって、免疫原性融合ポリペプチドを産生することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、細菌発現系において発現される。
いくつかの実施形態では、細菌発現系は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現系である。
一態様では、本明細書に開示されるのは、がんの治療または予防を必要とするヒト対象においてがんを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数の新抗原ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数の融合ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内または皮下に投与される。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの用量は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのサブ用量に分割される。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの各サブ用量は、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれを超える融合ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、各融合ポリペプチドは、０．０１～１００μｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、各融合ポリペプチドは、１００μｇ～１０ｍｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、投与される融合ポリペプチドの総用量は、０．０１～１００ｍｇである。
新抗原およびその使用
治癒的および腫瘍特異的免疫療法を開発するための重要な障壁のうちの１つは、自己免疫を回避するための高度に特異的および制限された腫瘍抗原の同定および選択である。悪性細胞内の遺伝子変化（例えば、逆転、転座、欠失、ミスセンス変異、スプライス部位変異など）の結果として生じる腫瘍新抗原は、抗原の最も腫瘍特異的なクラスを表す。新抗原は、それらを同定し、最適化された抗原を選択し、ワクチンまたは免疫原性組成物に使用するための新抗原を産生する際の技術的困難により、がんワクチンまたは免疫原性組成物に使用されることはほとんどない。これらの問題は、腫瘍中のＤＮＡレベルに存在するが、がんを有する対象の多くの割合からの一致する生殖系列細胞試料中に存在しない、新生物／腫瘍における変異を同定することと、１つ以上のペプチド－ＭＨＣ結合予測アルゴリズムを用いて、同定した変異を分析して、新生物／腫瘍内に発現され、患者ＨＬＡ対立遺伝子の多くの割合に結合する、複数の新抗原Ｔ細胞エピトープを生成することと、がんを有する対象の多くの割合を治療するのに好適ながんワクチンまたは免疫原性組成物に使用するために、すべての新抗原ペプチドおよび予測される結合ペプチドのセットから選択される複数の新抗原性ペプチドを合成することと、によって対処され得る。
例えば、ペプチドシーケンシング情報を治療用ワクチンに変換することは、多くの割合の個体のＨＬＡ分子に結合することができる変異ペプチドの予測を含み得る。どの特定の変異を免疫原として利用するかを効率的に選択することは、どの変異ペプチドが、多くの割合の患者のＨＬＡ対立遺伝子に効率的に結合するかを予測する能力を必要とする。最近、検証された結合および非結合ペプチドを有するニューラルネットワークベースの学習アプローチは、主要なＨＬＡ－Ａおよび－Ｂ対立遺伝子についての予測アルゴリズムの精度を向上させた。しかしながら、ＨＬＡ－ペプチド結合規則をコードするために高度なニューラルネットワークベースのアルゴリズムを使用しても、いくつかの要因は、ＨＬＡ対立遺伝子上に提示されるペプチドを予測する能力を制限する。
ペプチドシーケンシング情報を、治療用ワクチンに変換する別の例は、長いペプチドのマルチエピトープワクチンとして薬物を製剤化することを含み得る。実用的に可能な限り多くの変異エピトープを標的化することは、免疫系の膨大な能力を利用し、免疫標的遺伝子産物の下方調節による免疫回避の機会を防止し、エピトープ予測アプローチの公知の不正確さを補償する。本明細書に提供されるのは、治療用製品、またはワクチンを生成するための複数のエピトープを含む、ポリペプチドであって、ポリペプチドは、宿主細胞内のポリヌクレオチドから発現されるか、またはインビトロ翻訳によって発現される、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、合成的に製造することができる。記載されるように、複数のエピトープを含むポリペプチドは、１つ以上の足場タンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、治療用ワクチンとして使用するための、複数のエピトープ、足場タンパク質、およびリンカーを含む、合成ポリボディである。
ペプチドシーケンシング情報を、治療用ワクチンに変換するさらに別の例は、強力なワクチンアジュバントとの組み合わせを含んでもよい。有効なワクチンは、免疫応答を開始するために強力なアジュバントを必要とし得る。例えば、ＴＬＲ３のアゴニストであり、ＭＤＡ５およびＲＩＧ３のＲＮＡヘリカーゼドメインである、ポリＩＣＬＣは、ワクチンアジュバントについてのいくつかの望ましい特性を示している。これらの特性は、インビボでの免疫細胞の局所および全身活性化の誘導、刺激性ケモカインおよびサイトカインの産生、ならびにＤＣによる抗原提示の刺激を含む。さらに、ポリＩＣＬＣは、ヒトにおいて耐久性のあるＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を誘導することができる。重要なことに、転写およびシグナル伝達経路の上方制御における顕著な類似点が、ポリＩＣＬＣをワクチン接種された対象、および非常に効果的な複製能のある黄熱病ワクチンを受けたボランティアで見られた。さらに、（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅに加えて）ＮＹＥＳＯ－１ペプチドワクチンと組み合わせてポリ－ＩＣＬＣで免疫化した卵巣がん患者の９０％超が、最近の第１相試験において、ペプチドに対する抗体応答だけでなく、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を示した。同時に、ポリＩＣＬＣは、これまで２５を超える臨床試験において広範囲にわたって試験され、比較的良性の毒性プロファイルを示した。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、タンパク質の第１の新エピトープを含む第１のペプチドおよび同じタンパク質の第２の新エピトープを含む第２のペプチド、第１のペプチドおよび第２のペプチドをコードするポリヌクレオチド、第１のペプチドおよび第２のペプチドを含む１つ以上のＡＰＣ、またはＨＬＡタンパク質との複合体における第１の新エピトープに特異的な第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ならびにＨＬＡタンパク質との複合体における第２の新エピトープに特異的な第２のＴＣＲを含む、組成物であって、第１のペプチドが第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープが変異を含み、第２の新エピトープが同じ変異を含む、組成物である。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、タンパク質の領域の第１の新エピトープを含む第１のペプチドおよび同じタンパク質の領域の第２の新エピトープを含む第２のペプチドであって、第１の新エピトープおよび第２の新エピトープが、同じである領域のうちの少なくとも１つのアミノ酸を含む、第１の新エピトープおよび第２の新エピトープ、第１のペプチドおよび第２のペプチドをコードするポリヌクレオチド、第１のペプチドおよび第２のペプチドを含む１つ以上のＡＰＣ、またはＨＬＡタンパク質との複合体における第１の新エピトープに特異的な第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ならびにＨＬＡタンパク質との複合体における第２の新エピトープに特異的な第２のＴＣＲを含む、組成物であって、第１のペプチドが第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープが変異を含み、第２の新エピトープが同じ変異を含む、組成物である。
いくつかの実施形態では、第１の変異および第２の変異は、同じである。いくつかの実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、異なる分子である。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、同じタンパク質の領域の第１の新エピトープを含み、第２の新エピトープは、同じタンパク質の領域の第２の新エピトープを含む。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープおよび第２の新エピトープは、同じである領域のうちの少なくとも１つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の領域は、タンパク質のうちの少なくとも９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、または１，０００個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の領域は、タンパク質のうちの最大でも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、または１，０００個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、第１のペプチドからプロセシングされた第１の新エピトープペプチドであり、かつ／または第２の新エピトープは、第２のペプチドからプロセシングされた第２の新エピトープペプチドである。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、第１のペプチドよりも短い長さであり、かつ／または第２の新エピトープは、第２のペプチドよりも短い長さである。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープペプチドは、第１のペプチドを含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってプロセシングされ、かつ／または第２の新エピトープペプチドは、第２のペプチドを含むＡＰＣによってプロセシングされる。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、第１または第２のペプチドを含むクラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、第１または第２のペプチドを含むクラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、第１または第２のペプチドを含むクラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、第１または第２のペプチドを含むクラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＡＰＣは、第１のペプチドを含む第１のＡＰＣおよび第２のペプチドを含む第２のＡＰＣを含む。いくつかの実施形態では、変異は、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、リードスルー変異、遺伝子融合変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、単一のポリペプチドは、第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むか、または単一のポリヌクレオチドは、第１のペプチドおよび第２のペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、同じ転写開始部位から転写された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、第１の転写開始部位から転写された配列によってコードされ、第２のペプチドは、第２の転写開始部位から転写された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチドは、少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１，０００個、１，５００個、２，０００個、２，５００個、３，０００個、４，０００個、５，０００個、７，５００個、または１０，０００個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第１の対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する第１の配列と、対応する第２の野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する第２の配列と、を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、対応する第１の野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する少なくとも８個または９個の連続したアミノ酸の第１の配列と、対応する第２の野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する少なくとも１６個または１７個の連続したアミノ酸の第２の配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドよりも長い。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドよりも長い。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、少なくとも９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１，０００個、１，５００個、２，０００個、２，５００個、３，０００個、４，０００個、５，０００個、７，５００個、または１０，０００個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、少なくとも１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１，０００個、１，５００個、２，０００個、２，５００個、３，０００個、４，０００個、５，０００個、７，５００個、または１０，０００個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する少なくとも１７個の連続したアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、第１の新エピトープよりも長い。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、少なくとも８個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、８～１２個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、少なくとも８個の連続したアミノ酸の配列を含み、８個の連続したアミノ酸のうちの少なくとも２個は、野生型配列の対応する位置において異なる。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、少なくとも１６個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、１６～２５個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、少なくとも１６個の連続したアミノ酸の配列を含み、１６個の連続したアミノ酸のうちの少なくとも２個は、野生型配列の対応する位置において異なる。
いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、少なくとも１つのさらなる変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異のうちの１つ以上は、第１の新エピトープにおける変異ではない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異のうちの１つ以上は、第１の新エピトープにおける変異である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、少なくとも１つのさらなる変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異のうちの１つ以上は、第２の新エピトープにおける変異ではない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異のうちの１つ以上は、第２の新エピトープにおける変異である。いくつかの実施形態では、第１のペプチド、第２のペプチド、または両方は、少なくとも１つの隣接配列を含み、少なくとも１つの隣接配列は、新エピトープの上流または下流にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、非野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、Ｎ末端隣接配列である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、Ｃ末端隣接配列である。いくつかの実施形態では、第１のペプチドのうちの少なくとも１つの隣接配列は、第２のペプチドのうちの少なくとも１つの隣接配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１のペプチドのうちの少なくとも１つの隣接領域は、第２のペプチドのうちの少なくとも１つの隣接領域とは異なる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接残基は、変異を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上のさらなるペプチドを含み、１つ以上のさらなるペプチドは、第３の新エピトープを含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、対応する野生型配列よりも高い親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩＩタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、対象によって発現されたＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、変異は、対象の非がん細胞には存在しない。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、対象のがん細胞の遺伝子または発現遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、複数のエピトープを有するポリボディを含む組成物は、第１のＴＣＲを含む第１のＴ細胞を活性化することができる。いくつかの実施形態では、複数のエピトープを有する組成物は、第２のＴＣＲを含む第２のＴ細胞を活性化することができる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、ガンマデルタＴ細胞である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、第１のＴ細胞は、第１の新エピトープで刺激、拡張、または誘導されるＴ細胞であり、かつ／または第２のＴ細胞は、第２の新エピトープで刺激、拡張、または誘導されるＴ細胞である。
いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＴＣＲは、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡペプチド複合体に結合する。いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される第１および第２のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、αウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、またはそれらの偽型に由来する。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフェアである。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組成物、または本明細書に記載されるベクター、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、複数の細胞は、自己細胞である。いくつかの実施形態では、複数のＡＰＣ細胞は、自己細胞である。いくつかの実施形態では、複数のＴ細胞は、自己細胞である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、免疫調節薬剤またはアジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫調節薬剤は、サイトカインである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、Ｈｉｌｔｏｎｏｌである。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、がんを治療する方法であって、当該方法が、がんの治療を必要とする対象に、本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、方法である。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、がん療法に対する耐性を防止する方法であって、当該方法が、がん療法に対する耐性を防止することを必要とする対象に、本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、方法である。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、免疫応答を誘導する方法であって、当該方法が、免疫応答を誘導することを必要とする対象に、本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、免疫応答は、体液性応答である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、１つ以上のエピトープペプチド、およびポリボディをともに形成する足場タンパク質を含む、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリボディは、ホモポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリボディは、複数の第１のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリボディは、複数の第２のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリボディは、複数の第３のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、同時に、別々に、または連続して投与される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドの後に連続して投与される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドの後に連続して投与される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドがＴ細胞を活性化するのに十分な期間の後に連続して投与される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドがＴ細胞を活性化するのに十分な期間の後に連続して投与される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドがＴ細胞を再刺激した後に連続して投与される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドがＴ細胞を再刺激した後に連続して投与される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、Ｔ細胞を刺激するために投与され、第２のペプチドは、第１のペプチドがＴ細胞を再刺激した後に投与される。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、Ｔ細胞を刺激するために投与され、第１のペプチドは、第２のペプチドがＴ細胞を再刺激した後に投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、１つ以上のエピトープペプチド、およびポリボディをともに形成する足場タンパク質を含む、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリボディは、ヘテロポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリボディは、複数の第１のペプチド、ならびに複数の第２のペプチド、および／または第３のペプチド、および／または第４のペプチド、および／または第５のペプチド、および／または第６のペプチド、および／または６個を超えるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリボディは、複数の第３のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、対象は、がんを有し、がんは、黒色腫、卵巣がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象は、抗エストロゲン療法に耐性がある乳がんを有する。いくつかの実施形態では、乳がんは、変異を有するエストロゲン受容体を発現する。いくつかの実施形態では、対象は、イブルチニブ療法に耐性があるＣＬＬを有する。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、Ｃ４８１Ｓ変異などの変異を有するブルトン型チロシンキナーゼを発現する。いくつかの実施形態では、対象は、チロシンキナーゼ阻害剤に耐性がある肺がんを有する。いくつかの実施形態では、肺がんは、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ７９２Ｆ、またはＣ７９７Ｓ変異などの変異を有する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する。いくつかの実施形態では、第１のペプチドを含む複数のＡＰＣ細胞および第２のペプチドを含む複数のＡＰＣ細胞は、同時に、別々に、または連続して投与される。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも１つの追加の治療薬剤またはモダリティを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の治療薬剤またはモダリティは、手術、チェックポイント阻害剤、抗体もしくはその断片、化学療法薬剤、放射線、ワクチン、小分子、Ｔ細胞、ベクター、およびＡＰＣ、ポリヌクレオチド、腫瘍溶解性ウイルス、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の治療薬剤は、抗ＰＤ－１薬剤および抗ＰＤ－Ｌ１薬剤、抗ＣＴＬＡ－４薬剤、または抗ＣＤ４０薬剤である。いくつかの実施形態では、追加の治療薬剤は、本明細書に記載される医薬組成物を投与する前、同時に、または投与後に投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療は、ケモカインまたはサイトカインである。例示的なサイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－１２などのインターロイキン、または２つを超えるサイトカイン、３つを超えるサイトカイン、または４つを超えるサイトカインなどの組み合わせである。
ペプチド
ポリペプチドまたはペプチドは、それらの中性（荷電していない）形態または塩である形態のいずれかで、グリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化などの修飾を含まないか、または修飾が本明細書に記載されるポリペプチドの生物活性を破壊しないという条件に従って、これらの修飾を含有する、様々な長さであり得る。
いくつかの実施形態では、シーケンシング方法は、腫瘍特異的変異を特定するために使用される。任意の好適なシーケンシング方法、例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術を、本開示に従って使用することができる。第３世代シーケンシング方法は、方法のシーケンシングステップを高速化するために、将来的にＮＧＳ技術に代わる可能性がある。明確化の目的のために、本開示の文脈における「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」という用語は、Ｓａｎｇｅｒ化学として知られている「従来の」シーケンシング方法論とは対照的に、ゲノム全体を小さな断片に分解することによって、ゲノム全体に並列に沿ってランダムに核酸鋳型を読み取る、すべての新規のハイスループットシーケンシング技術を意味する。このようなＮＧＳ技術（大規模並列シーケンシング技術としても知られる）は、非常に短い期間、例えば１～２週間以内、例えば１～７日以内または２４時間未満以内に、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムのすべての転写配列）またはメチルローム（ゲノムのすべてのメチル化配列）の核酸配列情報を送達することができ、単一の細胞シーケンシングアプローチを可能にする。市販されている、または文献に言及されている複数のＮＧＳプラットフォーム、例えば、国際公開第２０１２／１５９６４３号に詳細に記載されているものが、本開示の文脈において使用され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１５０個、約２００個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約９００個、約１，０００個、約１，５００個、約２，０００個、約２，５００個、約３，０００個、約４，０００個、約５，０００個、約７，５００個、約１０，０００個のアミノ酸、またはそれを超えるアミノ酸残基、およびそれらの中で導き出せる任意の範囲を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、新抗原性ペプチド分子は、１００個以下のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、長さが、約８個～約５０個のアミノ酸残基、または長さが、約８個～約３０個、約８個～約２０個、約８個～約１８個、約８個～約１５個、または約８個～約１２個のアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、長さが、約８個～約５００個のアミノ酸残基、または長さが、約８個～約４５０個、約８個～約４００個、約８～約３５０個、約８個～約３００個、約８個～約２５０個、約８個～約２００個、約８個～約１５０個、約８個～約１００個、約８個～約５０個、または約８個～約３０個のアミノ酸残基であり得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、長さが、少なくとも８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、またはそれを超えるアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、長さが、少なくとも８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、またはそれを超えるアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、長さが、最大でも８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、またはそれ未満のアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、長さが、最大でも８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、またはそれ未満のアミノ酸残基であり得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個、または少なくとも５００個のアミノ酸の全長を有する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、最大でも８個、最大でも９個、最大でも１０個、最大でも１１個、最大でも１２個、最大でも１３個、最大でも１４個、最大でも１５個、最大でも１６個、最大でも１７個、最大でも１８個、最大でも１９個、最大でも２０個、最大でも２１個、最大でも２２個、最大でも２３個、最大でも２４個、最大でも２５個、最大でも２６個、最大でも２７個、最大でも２８個、最大でも２９個、最大でも３０個、最大でも４０個、最大でも５０個、最大でも６０個、最大でも７０個、最大でも８０個、最大でも９０個、最大でも１００個、最大でも１５０個、最大でも２００個、最大でも２５０個、最大でも３００個、最大でも３５０個、最大でも４００個、最大でも４５０個、または最大でも５００個のアミノ酸の全長を有する。
より長いペプチドは、いくつかの方法で設計することができる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ結合ペプチドが予測されるか、または既知である場合、より長いペプチドは、（１）それぞれの対応する遺伝子産物のＮ末端およびＣ末端に向かって２～５個のアミノ酸の伸長を有する個々の結合ペプチド、または（２）それぞれについての伸長配列を有する結合ペプチドのいくつかまたはすべての連結を含む。他の実施形態では、シーケンシングにより、腫瘍内に存在する長い（１０個より多い残基）新エピトープ配列が明らかになる場合（例えば、新規のペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルーまたはイントロン包含に起因する）、より長いペプチドは、単一のより長いペプチドまたはいくつかの重複するより長いペプチドのいずれかとして、新規の腫瘍特異的アミノ酸の全ストレッチからなり得る。いくつかの実施形態では、より長いペプチドの使用は、患者細胞による内因性プロセシングを可能にすると推定され、より効果的な抗原提示およびＴ細胞応答の誘導をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のペプチドを使用することができ、それらのペプチドは重複し、長い新抗原性ペプチド上に並べて表示される。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、約０．５～約１２、約２～約１０、または約４～約８のｐＩ値を有することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、またはそれを超えるｐＩ値を有することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、最大でも４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、またはそれ未満のｐＩ値を有することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、溶液中にあり得るか、凍結乾燥され得るか、または結晶形態であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、組換えＤＮＡ技術もしくは化学合成によって合成的に調製され得るか、または天然腫瘍もしくは病原性生物などの天然源から単離され得る。新エピトープは、個々に合成され得るか、またはペプチドに直接的もしくは間接的に接合され得る。本明細書に記載されるペプチドは、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびその断片を実質的に含まなくてもよいが、いくつかの実施形態では、ペプチドは、天然の断片または粒子に接合されるように合成的にコンジュゲートされてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、多種多様な方法で調製され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、細菌などの宿主細胞において発現され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、従来の技術に従って、溶液中で、または固体支持体上で合成され得る。様々な自動合成機が市販されており、公知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，１９８４を参照のこと。さらに、個々のペプチドは、化学ライゲーションを使用して接合されて、依然として本開示の範囲内にある、より大きなペプチドを生成することができる。
あるいは、発現ベクターに挿入されたペプチドをコードし、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に好適な条件下で培養されるヌクレオチド配列を含む、組換えＤＮＡ技術を利用することができる。これらの手順は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されているように、一般に、当該技術分野において公知である。したがって、本明細書に記載される１つ以上の新抗原性ペプチドを含む、組換えペプチドを使用して、適切なＴ細胞エピトープを提示することができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、天然ペプチドのアミノ酸置換をもたらす点変異を有する遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、フレームシフト変異をもたらす点変異を有する遺伝子によってコードされる。フレームシフトは、変異が、遺伝子のコドン周期性の正常な相（「リーディングフレーム」としても知られる）を破壊するときに生じ、非天然タンパク質配列の翻訳をもたらす。遺伝子における異なる変異は、同じ変化したリーディングフレームを達成することが可能である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、融合ポリペプチド、インフレーム欠失、挿入、内因性レトロウイルスポリペプチドの発現、およびポリペプチドの腫瘍特異的過剰発現をもたらす変異を有する遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と、第２の遺伝子との融合によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と、第２の遺伝子とのインフレーム融合によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と、第１の遺伝子のスプライスバリアントのエクソンとの融合によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と、第１の遺伝子の隠れエクソンとの融合によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と、第２の遺伝子との融合によってコードされ、ペプチドは、融合から生じるフレーム外配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも２つまたは２つより多いペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、少なくとも２つの異なるペプチドを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、第２の新エピトープを含む第２のペプチドと、を含有する。いくつかの実施形態では、第１および第２のペプチドは、同じタンパク質に由来する。少なくとも２つの異なるペプチドは、長さ、アミノ酸配列、または両方によって変化し得る。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有することが知られているか、または見出されている任意のタンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、タンパク質の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の新エピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、変異を含み、第２の新エピトープは、同じ変異を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、タンパク質の第１の領域の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の領域の第２の新エピトープを含む第２のペプチドと、を含み、第１の領域は、第２の領域のうちの少なくとも１つのアミノ酸を含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、第１の変異を含み、第２の新エピトープは、第２の変異を含む。いくつかの実施形態では、第１の変異および第２の変異は、同じである。いくつかの実施形態では、変異は、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、リードスルー変異、遺伝子融合変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、置換変異、例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１ＨもしくはＱ６１Ｌ変異、またはＮＲＡＳ Ｑ６１ＫもしくはＱ６１Ｒ変異を有するタンパク質に由来し得る。置換は、ペプチドの長さに沿っていずれかの位置に配置され得る。例えば、それは、ペプチドのＮ末端３分の１、ペプチドの中央３分の１、またはペプチドのＣ末端３分の１に位置することができる。別の実施形態では、置換残基は、Ｎ末端から２～５残基離れた位置にあるか、またはＣ末端から２～５残基離れた位置にある。ペプチドは、同様に、腫瘍特異的挿入変異に由来し得、ペプチドは、挿入された残基のうちの１つ以上、またはすべてを含む。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープおよび／または第２の新エピトープは、置換を有しない対応する新エピトープよりも高い親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープおよび／または第２の新エピトープは、置換を有しない対応する野生型配列よりも高い親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。
いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、少なくとも１つのさらなる変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異のうちの１つ以上は、第１の新エピトープにおける変異ではない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異のうちの１つ以上は、第１の新エピトープにおける変異である。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、少なくとも１つのさらなる変異を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異のうちの１つ以上は、第２の新エピトープにおける変異ではない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異のうちの１つ以上は、第２の新エピトープにおける変異である。
いくつかの態様では、本開示は、第１のペプチドおよび第２のペプチドを含む単一のポリペプチド、または第１のペプチドおよび第２のペプチドをコードする単一のポリヌクレオチドを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明で提供する組成物は、１つ以上のさらなるペプチドを含み、１つ以上のさらなるペプチドは、第３の新エピトープを含む。いくつかの実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、同じ転写開始部位から転写された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、第１の転写開始部位から転写された配列によってコードされ、第２のペプチドは、第２の転写開始部位から転写された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１，０００個、１，５００個、２，０００個、２，５００個、３，０００個、４，０００個、５，０００個、７，５００個、または１０，０００個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する第１の配列と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する第２の配列と、を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する少なくとも８個または９個の連続したアミノ酸の第１の配列と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する少なくとも１６個または１７個の連続したアミノ酸の第２の配列と、を含む。
いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドよりも長い。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドよりも長い。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、少なくとも９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１，０００個、１，５００個、２，０００個、２，５００個、３，０００個、４，０００個、５，０００個、７，５００個、または１０，０００個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、少なくとも１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１，０００個、１，５００個、２，０００個、２，５００個、３，０００個、４，０００個、５，０００個、７，５００個、または１０，０００個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のペプチドは、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する少なくとも１７個の連続したアミノ酸の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のペプチド、第２のペプチド、または両方は、少なくとも１つの隣接配列を含み、少なくとも１つの隣接配列は、新エピトープの上流または下流にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、非野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、Ｎ末端隣接配列である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、Ｃ末端隣接配列である。いくつかの実施形態では、第１のペプチドのうちの少なくとも１つの隣接配列は、第２のペプチドのうちの少なくとも１つの隣接配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１のペプチドのうちの少なくとも１つの隣接領域は、第２のペプチドのうちの少なくとも１つの隣接領域とは異なる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの隣接残基は、変異を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸を含む新エピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える変異アミノ酸を含む、新エピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸、および少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える非変異アミノ酸を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸、および少なくとも１つの変異アミノ酸の上流の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える非変異アミノ酸を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸、および少なくとも１つの変異アミノ酸の下流の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える非変異アミノ酸を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸と、少なくとも１つの変異アミノ酸の上流の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える非変異アミノ酸と、少なくとも１つの変異アミノ酸の下流の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える非変異アミノ酸と、を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの変異アミノ酸の上流の配列と、を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの変異アミノ酸の下流の配列と、を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの変異アミノ酸の上流の配列と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの変異アミノ酸の下流の配列と、を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える連続したアミノ酸を含む少なくとも１つの変異アミノ酸の上流の配列と、を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える連続したアミノ酸を含む少なくとも１つの変異アミノ酸の下流の配列と、を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える連続したアミノ酸を含む少なくとも１つの変異アミノ酸の上流の配列と、対応する野生型配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれを超える連続したアミノ酸を含む少なくとも１つの変異アミノ酸の下流の配列と、を含む、タンパク質に由来する新エピトープ配列を含む。
ペプチド修飾
いくつかの実施形態では、本開示は、修飾ペプチドを含む。修飾は、抗原ペプチド自体の一次アミノ酸配列を変化させない共有結合化学修飾を含むことができる。修飾は、所望の特性、例えば、インビボ半減期の延長、安定性の増加、クリアランスの低減、免疫原性またはアレルギー性の変更、特定の抗体の上昇を可能にすること、細胞標的化、抗原取り込み、抗原プロセシング、ＨＬＡ親和性、ＨＬＡ安定性または抗原提示を有するペプチドを産生することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、免疫応答の生成のためのＡＰＣによるエピトープのプロセシングおよび提示を増強する１つ以上の配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、所望の属性を提供するように修飾され得る。例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列に連結することによって増強することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、生理学的条件下で実質的に荷電されていない、アミノ酸またはアミノ酸模倣物などの、比較的小さな中性分子を含む。スペーサーは、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択され得る。任意選択的に、存在するスペーサーは、同じ残基から構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであってもよいことが理解されるであろう。新抗原性ペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接的に、またはスペーサーを介してＴヘルパーペプチドに連結され得る。新抗原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。Ｔヘルパーペプチドの例には、破傷風トキソイド残基８３０～８４３、インフルエンザ残基３０７～３１９、ならびにマラリアスポロゾイド周囲残基３８２～３９８および残基３７８～３８９が含まれる。
本開示のペプチド配列は、任意選択的に、ＤＮＡレベルでの変化を通じて、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、事前に選択された塩基においてペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって変化させてもよい。
ペプチドはまた、化合物のアミノ酸配列を伸長または減少させることによって、例えば、アミノ酸の付加または欠失によって修飾されてもよい。ペプチドまたは類似体はまた、特定の残基の順序または組成を変化させることによっても修飾されてもよい。生物学的活性に不可欠である特定のアミノ酸残基、例えば、重要な接触部位または保存された残基におけるアミノ酸残基は、一般に、生物学的活性に悪影響を及ぼさずに変化され得ないことを当業者は理解するであろう。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＨＬＡ結合上の静電荷、疎水性などの効果を決定するために、単一のアミノ酸置換を有する一連のペプチドを使用して修飾されてもよい。例えば、一連の正に荷電した（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負に荷電した（例えば、Ｇｌｕ）アミノ酸置換は、ペプチドの長さに沿って行われてもよく、様々なＨＬＡ分子およびＴ細胞受容体に対する感受性の異なるパターンが明らかになる。さらに、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、または同様の残基などの小さな、比較的中性の部分を使用した複数の置換が利用されてもよい。置換は、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであってもよい。置換または添加される残基の数および種類は、必須の接点と、求められる特定の機能的属性（例えば、疎水性対親水性）との間の必要な間隔に依存する。ＨＬＡ分子またはＴ細胞受容体に対する結合親和性の増加もまた、親ペプチドの親和性と比較した、このような置換によって達成され得る。いずれにせよ、このような置換は、例えば、結合を妨害し得る、立体的および電荷による干渉を回避するように選択されるアミノ酸残基または他の分子断片を利用するべきである。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基のものである。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを、最終ペプチドを得るために組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、末端－ＮＨ２アシル化、例えば、アルカノイル（Ｃ１～Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化、末端－カルボキシルアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンなどによって修飾され得る。いくつかの実施形態では、これらの修飾は、支持体または他の分子に連結するための部位を提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、限定されないが、グリコシル化、側鎖酸化、ビオチン化、リン酸化、表面活性物質、例えば、脂質の添加などの修飾を含有してもよいか、または、例えば、アセチル化などにより化学的に修飾されてもよい。さらに、ペプチドにおける結合は、ペプチド結合以外、例えば、共有結合、エステルまたはエーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合などであってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、例えば、当該技術分野で周知のものなどの担体、例えば、サイログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ポリＬ－リジンおよびポリＬ－グルタミン酸などのポリアミノ酸残基、インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含むことができる。
ペプチドは、通常、タンパク質の一部ではない、追加の化学部分を含有するようにさらに修飾されてもよい。これらの誘導体化部分は、溶解性、生物学的半減期、タンパク質の吸収、または結合親和性を改善することができる。この部分はまた、ペプチドなどの任意の所望の副作用を低減または排除することができる。これらの部分についての概要は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２０００）に見出され得る。例えば、所望の活性を有する新抗原性ペプチドは、所望のＨＬＡ分子に結合し、適切なＴ細胞を活性化するために、非修飾ペプチドの生物活性の実質的にすべてを増加または少なくとも保持しながら、特定の所望の属性、例えば、改善された薬理学的特性を提供するように、必要に応じて修飾され得る。例えば、ペプチドは、保存的または非保存的のいずれかの置換などの、様々な変化に供され得、そのような変化は、改善されたＨＬＡ結合などの、それらの使用における特定の利点をもたらし得る。このような保存的置換は、アミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似している別のアミノ酸残基、例えば、別のアミノ酸についての１つの疎水性残基、または別のアミノ酸についての１つの極性残基で置き換えることを包含し得る。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ－アミノ酸を使用して調べられ得る。そのような修飾は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１－２８４（１９７９）、およびＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載されているように、周知のペプチド合成手順を使用して行われ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、タンパク質などの大型のゆっくりと代謝された巨大分子、セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどの多糖類、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどの高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、不活性化ウイルス粒子、ジフテリア、破傷風、コレラ、ロイコトキシン分子由来のトキソイドなどの不活性化細菌毒素、不活性化細菌、および樹状細胞にコンジュゲートされ得る。
ペプチドに対する変化には、担体タンパク質へのコンジュゲーション、リガンドへのコンジュゲーション、抗体へのコンジュゲーション、ＰＥＧ化、ポリシアリル化ＨＥＳ化、組換えＰＥＧ模倣物、Ｆｃ融合物、アルブミン融合物、ナノ粒子付着物、ナノ粒子封入物、コレステロール融合物、鉄融合物、アシル化、アミド化、グリコシル化、側鎖酸化、リン酸化、ビオチン化、表面活性物質の付加、アミノ酸模倣物の付加、または非天然アミノ酸の付加が含まれ得るが、これらに限定されない。
コンジュゲーションのためのさらなる好適な成分および分子には、例えば、リンパ系を標的とするための分子、サイログロブリン、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）などのアルブミン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ポリ（Ｄ－リジン：Ｄ－グルタミン酸）などのポリアミノ酸、ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド、インフルエンザウイルス血球凝集素、インフルエンザウイルス核タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ならびにＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質および表面抗原、または前述の任意の組み合わせが含まれる。
別の種類の修飾は、別のタンパク質（例えば、対象のタンパク質に異種のアミノ酸配列を有するタンパク質）、または担体分子などの、ポリペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端に、１つ以上のさらなる成分または分子をコンジュゲート（例えば、連結）することである。したがって、例示的なポリペプチド配列は、別の成分または分子とのコンジュゲートとして提供することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはタンパク質へのアルブミンの融合は、例えば、ＨＳＡをコードするＤＮＡ、またはその断片が、１つ以上のポリペプチド配列をコードするＤＮＡに接合するように、遺伝子操作によって達成することができる。その後、好適な宿主は、融合ポリペプチドを発現するように、例えば、好適なプラスミドの形態で、融合ヌクレオチド配列で形質転換またはトランスフェクトすることができる。発現は、例えば、原核細胞もしくは真核細胞からインビトロで、または例えば、トランスジェニック生物からインビボで行われてもよい。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質の発現は、哺乳動物細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞株において実施される。さらに、アルブミン自体は、その循環半減期を延長するように修飾され得る。１つ以上のポリペプチドへの修飾アルブミンの融合は、上記の遺伝子操作技術によって、または化学的コンジュゲーションによって達成することができ、得られた融合分子は、非修飾アルブミンとの融合の半減期を超える半減期を有する（例えば、国際公開第２０１１／０５１４８９号を参照されたい）。コンジュゲート脂肪酸鎖（アシル化）を介したアルブミン結合を含む、直接融合の代替として、いくつかのアルブミン結合戦略が開発されている。血清アルブミンは脂肪酸の輸送タンパク質であるので、アルブミン結合活性を有するこれらの天然リガンドは、小さなタンパク質治療薬の半減期延長のために使用されている。
コンジュゲーションのためのさらなる候補成分および分子には、単離または精製に好適なものが含まれる。非限定的な例には、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対）、抗体、受容体、リガンド、レクチンなどの結合分子、または例えば、プラスチックもしくはポリスチレンビーズ、プレートもしくはビーズ、磁気ビーズ、試験片、および膜を含む、固体支持体を含む分子が含まれる。電荷差によってコンジュゲートを分離するために、カチオン交換クロマトグラフィーなどの精製方法が使用されてもよく、これにより、コンジュゲートをそれらの様々な分子量に効果的に分離する。カチオン交換クロマトグラフィーによって得られた画分の含有量は、従来の方法、例えば、質量分析法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、または分子量によって分子実体を分離するための他の公知の方法を使用して、分子量によって識別され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはタンパク質配列のアミノ末端またはカルボキシル末端は、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ）と融合して、融合コンジュゲート（または融合分子）を形成することができる。Ｆｃ融合コンジュゲートは、バイオ医薬品の全身半減期を増加させることが示されており、したがって、バイオ医薬品は、より少ない頻度での投与を必要とし得る。Ｆｃは、血管を覆う内皮細胞内の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、結合すると、Ｆｃ融合分子は分解から保護され、循環中に再放出され、分子を循環中に長く維持する。このＦｃ結合は、内因性ＩｇＧが、その長い血漿半減期を保持する機構であると考えられる。より最近のＦｃ融合技術は、従来のＦｃ融合コンジュゲートと比較して、バイオ医薬品の薬物動態および薬力学的特性を最適化するために、バイオ医薬品の単一のコピーを抗体のＦｃ領域に連結する。
本開示は、１つ以上の特性を改善するための、現在知られているか、または将来開発されるペプチドの他の修飾の使用を企図する。ペプチドの循環半減期を延長する、安定性を増加させる、クリアランスを低減する、または免疫原性もしくはアレルギー性を変化させるための１つのこのような方法。
ペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ヒト血漿および血清などの、ペプチダーゼおよび種々の生物学的媒体を使用して、安定性を試験する。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ １１：２９１（１９８６）を参照されたい。本明細書に記載されるペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを使用して簡便に決定される。プロトコルは以下の通りである：プールされたヒト血清（ＡＢ型、非熱不活性化）を、使用前に遠心分離によって破壊する。次いで、血清を、ＲＰＭＩ－１６４０または別の好適な組織培養培地で２５％まで希釈する。所定の時間間隔で、少量の反応溶液を除去し、６％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）水溶液またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応試料を１５分間（４℃）冷却し、次いで回転させて沈殿した血清タンパク質をペレット化する。次いで、安定性特異的クロマトグラフィー条件を使用して、逆相ＨＰＬＣによって、ペプチドの存在を決定する。
短い血漿半減期またはプロテアーゼ分解に対する感受性に関連する問題は、ペプチドまたはタンパク質配列を、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちのいずれかにコンジュゲートまたは連結することを含む、様々な修飾によって克服され得る（例えば、典型的には、タンパク質と非タンパク質性ポリマーの両方に共有結合した連結部分、例えば、ＰＥＧを介することを参照されたい）。このようなＰＥＧコンジュゲート生体分子は、良好な物理的および熱的安定性、酵素分解に対する感受性に対する保護、溶解度の増加、より長いインビボ循環半減期およびクリアランスの減少、免疫原性および抗原性の低下、ならびに毒性の低下を含む、臨床的に有用な特性を有することが示されている。
ポリペプチドまたはタンパク質配列へのコンジュゲーションに好適なＰＥＧは、一般に、室温で水に可溶性であり、一般式Ｒ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｏ－Ｒを有し、式中、Ｒが、水素または保護基、例えば、アルキルまたはアルカノール基であり、ｎが、１～１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、それは、一般に、１～８個の炭素を有する。ポリペプチド配列にコンジュゲートされたＰＥＧは、直鎖状であっても、分岐状であってもよい。分岐ＰＥＧ誘導体、「スターＰＥＧ」およびマルチアームＰＥＧは、本開示によって企図される。本開示はまた、ＰＥＧが、異なるｎ値を有し、したがって、種々の異なるＰＥＧが特定の比率で存在する、コンジュゲートの組成物を企図する。例えば、いくつかの組成物は、ｎ＝１、２、３、および４である、コンジュゲートの混合物を含む。いくつかの組成物では、ｎ＝１が１８～２５％である、コンジュゲートの割合、ｎ＝２が５０～６６％である、コンジュゲートの割合、ｎ＝３が１２～１６％である、コンジュゲートの割合、およびｎ＝４が最大５％である、コンジュゲートの割合である。このような組成物は、反応条件および当該技術分野で公知の精製方法によって製造することができる。例えば、カチオンイオン交換クロマトグラフィーを使用してコンジュゲートを分離してもよく、次いで、例えば、所望の数のＰＥＧが取り付けられたコンジュゲートを含有し、非修飾タンパク質配列および他の数のＰＥＧが取り付けられたコンジュゲートを含まずに精製された画分を特定する。
ＰＥＧは、末端反応性基（「スペーサー」）を介して、本開示のペプチドまたはタンパク質に結合し得る。スペーサーは、例えば、ポリペプチド配列およびＰＥＧのうちの１つ以上の遊離アミノ基またはカルボキシル基の間の結合を媒介する末端反応性基である。遊離アミノ基に結合し得るスペーサーを有するＰＥＧには、Ｎ－ヒドロキシスクシニルイミドＰＥＧが含まれ、これは、ＰＥＧのコハク酸エステルをＮ－ヒドロキシスクシニルイミドで活性化することによって調製され得る。遊離アミノ基に結合し得る別の活性化ＰＥＧは、２，４－ビス（Ｏ－メトキシポリエチレングリコール）－６－クロロ－ｓ－トリアジンであり、これは、ＰＥＧモノメチルエーテルを塩化シアニルと反応させることによって調製され得る。遊離カルボキシル基に結合する活性化ＰＥＧには、ポリオキシエチレンジアミンが含まれる。
本開示のペプチドまたはタンパク質配列のうちの１つ以上を、スペーサーを有するＰＥＧにコンジュゲートすることは、様々な従来の方法によって行われ得る。例えば、コンジュゲーション反応は、４：１～３０：１の試薬対ペプチド／タンパク質のモル比を利用して、３０分～２０時間、４℃～室温の温度で、５～１０のｐＨで、溶液中で行われ得る。反応条件は、主に所望の置換度を生成するように反応を誘導するように選択され得る。一般に、低温、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、および短い反応時間は、取り付けられたＰＥＧの数を減少させる傾向があるが、高温、中性から高ｐＨ（例えば、ｐＨ＞７）、および長い反応時間は、取り付けられたＰＥＧの数を増加させる傾向がある。反応を終了させるために、当該技術分野で公知の様々な手段が使用され得る。いくつかの実施形態では、反応混合物を酸性化し、例えば－２０℃で凍結することによって、反応は終了する。
本開示はまた、ＰＥＧ模倣物の使用を企図する。組換えＰＥＧ模倣物は、いくつかの追加の有利な特性を付与しながら、ＰＥＧの属性（例えば、増強された血清半減期）を保持するように開発されている。例として、ＰＥＧに類似した伸長コンフォメーションを形成することができる単純なポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒを含む）は、目的のペプチドまたはタンパク質薬物に既に組換え融合されて産生され得る（例えば、Ａｍｕｎｉｘ ＸＴＥＮ技術、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。これにより、製造プロセス中の追加のコンジュゲーションステップの必要性が排除される。さらに、確立された分子生物学的技術は、ポリペプチド鎖の側鎖組成の制御を可能にし、免疫原性および製造特性の最適化を可能にする。
新エピトープ
新エピトープは、免疫系によって認識される新抗原性ペプチドまたは新抗原性ポリペプチドの新抗原性決定基部分を含む。新エピトープとは、非疾患細胞、例えば、非がん細胞または生殖系列細胞などの、参照には存在しないが、疾患細胞、例えば、がん細胞に見出されるエピトープを指す。これには、対応するエピトープが、正常な非疾患細胞または生殖系列細胞に見出されるが、疾患細胞、例えば、がん細胞における１つ以上の変異により、エピトープの配列が新エピトープをもたらすように変化する状況が含まれる。「新エピトープ」という用語は、本明細書中の「腫瘍特異的新エピトープ」と互換的に使用され、典型的には、隣接するアミノ酸のαーアミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに接続される、一連の残基、典型的には、Ｌ－アミノ酸を指定する。新エピトープは、それらの中性（荷電していない）形態または塩である形態のいずれかで、グリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化などの修飾を含まないか、または修飾が本明細書に記載されるポリペプチドの生物活性を破壊しないという条件に従って、これらの修飾を含有する、様々な長さであり得る。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡクラスＩについて本明細書に記載される新エピトープは、１３個の残基またはそれ未満の長さであり、通常、約８～約１２個の残基、特に９個または１０個の残基からなる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩについて本明細書に記載される新エピトープは、２５個残基またはそれ未満の長さであり、通常、約１６個～約２５個の残基からなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、タンパク質の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の新エピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、変異を含み、第２の新エピトープは、同じ変異を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、タンパク質の第１の領域の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の領域の第２の新エピトープを含む第２のペプチドと、を含み、第１の領域は、第２の領域のうちの少なくとも１つのアミノ酸を含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、第１の変異を含み、第２の新エピトープは、第２の変異を含む。いくつかの実施形態では、第１の変異および第２の変異は、同じである。いくつかの実施形態では、変異は、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、リードスルー変異、遺伝子融合変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。
いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、第１の新エピトープよりも長い。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、少なくとも８個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、８～１２個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、少なくとも８個の連続したアミノ酸の配列を含み、８個の連続したアミノ酸のうちの少なくとも１個は、野生型配列の対応する位置において異なる。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、少なくとも８個の連続したアミノ酸の配列を含み、８個の連続したアミノ酸のうちの少なくとも２個は、野生型配列の対応する位置において異なる。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、少なくとも１６個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、１６～２５個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、少なくとも１６個の連続したアミノ酸の配列を含み、１６個の連続したアミノ酸のうちの少なくとも２個は、野生型配列の対応する位置において異なる。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、少なくとも１６個の連続したアミノ酸の配列を含み、１６個の連続したアミノ酸のうちの少なくとも２個は、野生型配列の対応する位置において異なる。
いくつかの実施形態では、新エピトープは、ＨＬＡタンパク質（例えば、ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ）に結合する。いくつかの実施形態では、新エピトープは、対応する野生型ペプチドよりも高い親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、新エピトープは、５，０００ｎＭ未満、１，０００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、またはそれ未満のＩＣ５０を有する。
いくつかの実施形態では、新エピトープは、約１ｐＭ～約１ｍＭ、約１００ｐＭ～約５００μＭ、約５００ｐＭ～約１０μＭ、約１ｎＭ～約１μＭ、または約１０ｎＭ～約１μＭのＨＬＡ結合親和性を有することができる。いくつかの実施形態では、新エピトープは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｎＭ、またはそれを超えるＨＬＡ結合親和性を有することができる。いくつかの実施形態では、新エピトープは、最大でも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｎＭのＨＬＡ結合親和性を有することができる。
いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、対応する野生型新エピトープよりも高い親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の新エピトープは、２，０００ｎＭ、１，５００ｎＭ、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩＩタンパク質に結合する。
一態様では、第１および／または第２の新エピトープは、対象によって発現されたＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質に結合する。別の態様では、変異は、対象の非がん細胞に存在しない。さらに別の態様では、第１および／または第２の新エピトープは、対象のがん細胞の遺伝子または発現遺伝子によってコードされる。
ポリヌクレオチド
あるいは、本開示のペプチドをコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）は、宿主細胞を使用するか、またはインビトロ、例えばインビトロ翻訳によってポリペプチドを産生するために使用することができる。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳が、ペプチドを産生するために使用される。治療として使用することができる、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、新抗原性ペプチドを含むポリボディも企図される。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖および／または二本鎖のいずれかであってもよい
本明細書に提供されるのは、本開示に記載される新抗原性ペプチドのそれぞれをコードする新抗原性ポリヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、または「核酸」という用語は、本開示において、「変異ポリヌクレオチド」、「変異ヌクレオチド」、「変異核酸」、「新抗原性ポリヌクレオチド」、「新抗原性ヌクレオチド」、または「新抗原性変異核酸」と互換的に使用される。種々の核酸配列は、遺伝コードの冗長性に起因して、同じペプチドをコードすることができる。これらの核酸のそれぞれは、本開示の範囲内に含まれる。ペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドをコードする核酸は、自己増幅ｍＲＮＡである（Ｂｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０１５；８９：１７９－２３３）。本明細書に記載されるペプチドをコードする任意の好適なポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。
「ＲＮＡ」という用語は、「ｍＲＮＡ」を含み、いくつかの実施形態では、「ｍＲＮＡ」に関する。「ｍＲＮＡ」という用語は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され、ペプチドまたはポリペプチドをコードする、「転写産物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’－ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、細胞内およびインビトロにおいて限定された半減期のみを有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは自己増幅ｍＲＮＡである。本開示の文脈において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成され得る。インビトロ転写の方法論は、当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
ＲＮＡの安定性および翻訳効率は、必要に応じて修飾され得る。例えば、ＲＮＡは、安定化され得、その翻訳は、安定化された効果および／またはＲＮＡの増加された翻訳効率を有する１つ以上の修飾によって増加し得る。そのような修飾は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８に記載されている。本開示に従って使用されるＲＮＡの発現を増加させるために、それは、ＧＣ含量を増加させてｍＲＮＡ安定性を増加させ、コドン最適化を実施し、それによって、細胞での翻訳を向上するように、発現ペプチドまたはタンパク質の配列を変化させることなく、コード領域、すなわち、発現ペプチドまたはタンパク質をコードする配列内で修飾され得る。
本開示で使用されるＲＮＡの文脈における「修飾」という用語は、当該ＲＮＡに天然に存在しないＲＮＡの任意の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、キャップされていない５’－トリホスフェートを有しない。このようなキャップされていない５’－トリホスフェートの除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成することができる。他の実施形態では、ＲＮＡは、その安定性を増加させる、および／または細胞傷害性を減少させるために、修飾されたリボヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、５－メチルシチジンは、例えば、シチジンについて、ＲＮＡ内で部分的または完全に置換され得る。あるいは、プソイドウリジンは、例えば、ウリジンについて、部分的または完全に置換される。
いくつかの実施形態では、「修飾」という用語は、５’キャップまたは５’キャップ類似体を有するＲＮＡを提供することに関する。「５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端上に見出されるキャップ構造を指し、概して、まれな５’～５’トリホスフェート連結を介してｍＲＮＡに接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、このグアノシンは、７位でメチル化される。「従来の５’キャップ」という用語は、７－メチルグアノシンキャップ（ｍ Ｇ）に対して天然に存在するＲＮＡ５’キャップを指す。本開示の文脈において、「５’キャップ」という用語は、ＲＮＡキャップ構造に類似する５’キャップ類似体を含み、インビボおよび／または細胞において、それに取り付けられる場合、ＲＮＡを安定化し、かつ／またはＲＮＡの翻訳を増強する能力を有するように修飾される。
ある特定の実施形態では、本開示の新抗原性ペプチドをコードするｍＲＮＡは、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本開示は、修飾ヌクレオシドを含む、ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、およびポリリボヌクレオチド分子、それらを含む遺伝子療法ベクター、それらを含む、遺伝子療法方法および遺伝子転写サイレンシング方法を提供する。いくつかの実施形態では、投与されるｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書に記載されるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル方法によって合成され得る。類似体を含むか、または類似体からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然エピトープをコードするものに対して適切で所望の核酸塩基（複数可）を置換することによって簡単に作製することができる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、転写領域において１つ以上の合成または天然に存在するイントロンを含むことができる。哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ安定化配列および複製のための配列の包含を、ポリヌクレオチド発現を増加させるために考慮することもできる。さらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、免疫賦活性配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）を含むことができる。これらの配列は、免疫原性を増強するために、ポリヌクレオチドコード配列の外側のベクターに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのペプチドまたはタンパク質の発現および／または分泌を補助するポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に、同じリーディングフレーム内で融合されたペプチドまたはタンパク質についてのコード配列を含むことができる。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、宿主細胞によって切断されてポリペプチドの成熟形態を形成するリーダー配列を有することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、コードされたペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じリーディングフレーム内で融合されたペプチドまたはタンパク質についてのコード配列を含むことができ、その後、個別化された疾患ワクチンまたは免疫原性組成物に組み込まれ得る。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するためにｐＱＥ－９ベクターによって供給されるヘキサ－ヒスチジンタグであってもよいか、またはマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ－７細胞）を使用する場合、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。追加のタグには、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質タグ）、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ、チオレドキシンタグ、ＴＣタグ、Ｔｙタグなどが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載される新抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、得られたペプチドの小胞体内への移動を促進するために、ユビキチン化シグナル配列をコードする配列、および／または細網（ＥＲ）シグナル配列などの標的化配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数の新抗原性ペプチドを産生することができる単一のコンカテマー化された新抗原性ペプチド構築物を作製するために、同じリーディングフレーム内で融合された１つ以上の現在記載されているペプチドまたはタンパク質のコード配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離または合成することによって、組換え技術を使用して構築される。任意選択により、配列は、部位特異的変異によって変異誘発されて、その機能的類似体を得ることができる。例えば、Ｚｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５６６２－５０６６（１９８４）および米国特許第４，５８８，５８５号を参照されたい。いくつかの実施形態では、目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用した化学合成によって構築される。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計することができ、目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好ましいコドンを選択することができる。標準的な方法を適用して、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次にライゲーションすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的な組み立てのために５’または３’オーバーハングを含有する。
組み立てられたら（例えば、合成、部位特異的変異、または別の方法によって）、目的の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクター内に挿入し、所望の宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に任意選択に作動可能に連結する。適切な組み立ては、好適な宿主におけるヌクレオチドシーケンシング、制限マッピング、および生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。当該技術分野で周知であるように、宿主内でトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子は、選択された発現宿主内で機能する転写および翻訳発現制御配列に作動可能に連結することができる。
したがって、本開示はまた、本明細書に記載される新抗原性ペプチドおよび新エピトープの産生および投与に有用なベクターおよび発現ベクター、ならびにそのようなベクターを含む宿主細胞も対象とする。
ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドまたはタンパク質を発現することができる発現ベクターも調製することができる。異なる細胞型についての発現ベクターは、当該技術分野で周知であり、過度の実験を行わずに選択することができる。一般的に、ＤＮＡは、発現のための適切な配向および正確なリーディングフレームにおいて、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要に応じて、ＤＮＡは、所望の宿主（例えば細菌）によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結され得るが、そのような制御は発現ベクターにおいて一般的に利用可能である。次いで、ベクターは、標準的な技術を使用してクローニングするために宿主細菌に導入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
本明細書に記載される新抗原性ペプチドの製造および投与に好適な多数のベクターおよび宿主系は、当業者に公知であり、市販されている。以下のベクトルが、例として提供される。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ－９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐ７５．６（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）；ｐＣＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＣＥＩ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ）。しかしながら、任意の他のプラスミドまたはベクターが、宿主において複製可能であり、かつ生存可能である限り、使用することができる。
本明細書に記載される新抗原性ペプチドの発現のために、コード配列は、作動可能に連結された開始コドンおよび終止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域、ならびにいくつかの実施形態では、所望の細胞宿主における発現のための発現ベクターを提供するための複製システムを提供される。例えば、細菌宿主と適合するプロモーター配列は、所望のコード配列の挿入のための便利な制限部位を含有するプラスミド中に提供される。結果として生じる発現ベクターは、好適な細菌宿主に形質転換される。
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列を含む。このようなプロモーターはまた、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ－ＩＥプロモーター）または単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ ＴＫプロモーター）などのウイルス源に由来し得る。ＳＶ４０スプライスに由来する核酸配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
組換え発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを増幅および発現し得る。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する好適な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に結合したペプチドまたは生物等価類似体をコードする、合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する、複製可能なＤＮＡ構築物である。転写単位は、概して、（１）遺伝子発現において調節役割を有する１つ以上の遺伝子エレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造またはコード配列、ならびに（３）本明細書に詳細に記載されるように、適切な転写および翻訳開始ならびに終結配列の組み立てを含む。このような調節エレメントは、転写を制御するためのオペレーター配列を含み得る。通常、複製起点によって付与される、宿主における複製能力、および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が、追加的に組み込まれ得る。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連する場合、作動可能に連結される。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）についてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターは、配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結され、リボソーム結合部位は、翻訳を可能にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されたとは、連続していることを意味し、分泌リーダーの場合では、連続しており、かつリーディングフレーム内にあることを意味する。酵母発現系での使用を意図した構造エレメントには、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。あるいは、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列なしで発現される場合、これは、Ｎ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、任意選択により、その後、発現した組換えタンパク質から切断して、最終産物を提供することができる。
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択可能なマーカー、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子、ならびに下流の構造配列の転写を指示するために高発現遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などの解糖酵素をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および終結配列、ならびにいくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質の分泌をペリプラズム空間または細胞外培地に導くことができるリーダー配列とともに適切な段階で組み立てられる。任意選択により、異種配列は、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製を与えるＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される新抗原性ペプチドはまた、細菌ベクターによって発現され得る。細菌発現ベクターの例には、最も一般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉ発現系が含まれる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、異種タンパク質の産生のために最も広範に使用される宿主のうちの１つであり、その遺伝子は任意の他の微生物の遺伝子よりもはるかに良く特徴付けられている。融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにおいて発現し、様々な宿主株において増殖することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α、ＪＭ１０１、ＲＲＩ、ＤＨ５ｃ、Ｓ１７－１λ／ｐｉｒ、Ｋ１２、Ｔｏｐ１０、およびＢＬ２１（ＤＥ３）は、異種遺伝子発現宿主に使用することができる例示的な株である。好適な細菌は、多くの実施形態では、発現レベルを増加させる１つ以上の変異または他の遺伝子修飾を含む。
これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当該技術分野で公知である。発現ベクターなどの組換え核酸の構築に好適な多種多様なクローニングおよびインビトロ増幅方法は、当業者に周知である。多くのクローニングの実施を通じて当業者を導くのに十分なこれらの技術および説明の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見出される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑｐ－レプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術を含む、インビトロ増幅方法を通じて当業者を導くのに十分なプロトコルの例は、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号に見出される。
簡単に述べると、Ｅ．ｃｏｌｉ系におけるタンパク質発現方法は、以下のステップを含む。目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を、所望のプラスミドにクローニングする。次いで、プラスミドを、プラスミドの増殖に適合する細菌宿主に組み込む（例えば、トランスフェクション、またはエレクトロポレーション、または当業者に公知の任意の他の好適な方法によって）。細菌を培養培地中で培養して増殖させ、一方で、細菌内の核酸によってコードされたタンパク質産物を増幅させる（または、コードされたタンパク質が分泌タンパク質である場合、培地中に分泌される）。次いで、増殖した細菌（内因性タンパク質について）または培養上清（分泌タンパク質について）からタンパク質を採取する。高コピー数発現プラスミドが、主にこの目的のために選択される。細菌クローニングのための任意のプラスミドの基本エレメントは、とりわけ、ＯＲＩ（複製起点）部位、５’末端におけるプロモーター、エンハンサーなどの制御エレメント、３’末端における１つ以上の発現安定剤、および抗生物質耐性などの選択マーカー遺伝子を含む。ほとんどのＥ．ｃｏｌｉ株が、プラスミドを増殖させるために使用され得る。発現プラスミドは、多くの場合、タンパク質を精製するためのタグを含む。目的のタンパク質をコードする核酸が、好適なタグを有する市販のベクターの指定されたクローニング部位内でクローニングされる場合、発現されたタンパク質は、タグを含む融合タンパク質である。例えば、プラスミドｐＤＥＳＴ－ＨｉｓＭＢＰは、ＭＢＰおよびヘキサ－ヒスチジンタグを含む。この場合、ＭＢＰタンパク質およびＨｉｓタグが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのタンパク質の単離および精製のために使用される。様々なこのようなプラスミドおよび発現系は市販されており、当業者に公知である。発現ベクターの構築には、Ｐｌａｃ、Ｐｔｒｐ、Ｐｔａｃ、λＰＬ、ＰＴ７、およびＰＢＡＤなどの多くのプロモーターが一般的に利用される。これらの中で、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、およびＰＴ７とｌａｃＵＶ５との組み合わせ系が広く使用されている。なぜなら、この発現は、誘導因子であるイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノ部位（ＩＰＴＧ）の濃度を変化させることによって容易に調節され得るからである。λＰＬおよびλＰＲと呼ばれる他のプロモーターは、一般に、温度シフトによって誘導される。クローニングされた遺伝子の高レベルの発現を得るために、発現カセットは、翻訳開始および転写／翻訳終結配列のためのリボソーム結合部位などの他の配列を含むことができる。所望のペプチドまたはポリペプチドの高レベルの発現は、二重プロモーターを含有する細菌発現ベクターを使用することによって達成され得る。細胞は、振とうフラスコまたは他の容器中で増殖させることができるが、ラージスケールに関して、発酵槽中のポリペプチド増殖の調製が好ましい。発現の最大レベルを得るために、増殖サイクルの適切な時点で栄養培地にガラクトースを添加して、所望のポリペプチドの発現の増加を誘導する。例えば、宿主細胞の増殖は、フルクトース（０．２５％最終濃度）を炭素源として含有する培地中で開始することができ、細胞内ｃＡＭＰ（アデノシン３’，５’－環状一リン酸）濃度の増加を引き起こす他の糖、グリセロール、酢酸塩）も炭素源として使用することができる。
構築物を含む細胞の選択を可能にするために、抗生物質耐性遺伝子などの１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子が、発現ベクターに好都合に含まれる。これらの遺伝子は、選択的培養培地中で増殖した形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中では生存しない。典型的な選択遺伝子は、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなどの抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする。
あるいは、選択可能なマーカーは、栄養要求性の不足を補完するタンパク質をコードしてもよいか、または複合培地から利用できない重要な栄養素を供給してもよく、その遺伝子は、桿菌についてのＤ－アラニンラセマーゼをコードする。いくつかの選択可能なマーカーは、当業者に公知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記載されている。所望のポリペプチドを発現させるために二重ｔａｃ－ｌａｃプロモーターを使用する際に使用するための好ましい選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性マーカーである（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ １９：２５９（１９８２））。カナマイシン選択の使用は、例えば、アンピシリン選択よりも有利である。なぜなら、アンピシリンが、培地中でｐ－ラクタマーゼによって速やかに分解されるため、選択圧を除去し、培養物がベクターを含有しない細胞で過剰増殖することを可能にするからである。
上記に列挙した成分のうちの１つ以上を含有する好適なベクターの構築は、上述の参考文献に記載されるような標準的なライゲーション技術を利用することができる。ベクターは、そのベクターが原核宿主においてクローニングされることを可能にするための他の配列を含んでもよい。当業者であれば、これらのベクター成分のそれぞれが、それらの機能に実質的に影響を与えることなく修飾され得ることを認識するであろう。
単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、必要なプラスミドを生成するために所望の形態で切断され、調整され、再ライゲーションされる。構築されたプラスミドにおける正確な配列を確認するために、プラスミドは、公知の方法に従って、制限エンドヌクレアーゼ消化、および／またはシーケンシングなどの標準的な技術によって分析される。
親和性タグおよび他の種類の遺伝子操作された融合パートナーは、分子生物学におけるツールとして広範に利用される。親和性タグが、発現したタンパク質を精製するのに非常に有用である。精製の基本ステップは、タンパク質溶解、タンパク質のマトリックスへの結合、洗浄および溶出を含む。一例として、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグが、クローニング中にタンパク質のＮ末端またはＣ末端に一般的に配置され、それぞれの目的のタンパク質がタグで発現され、最後に、ポリヒスチジンのイミダゾール部分の窒素が金属と相互作用するため、Ｈｉｓは、金属によって捕捉され得る。典型的には、金属は捕捉を支持するように固定される。洗浄および溶出は、好適な緩衝液によって実施される。タグは、精製後に発現されたタンパク質から切断されるように設計され得る。同様に、ＧＳＴタグ、Ｈａｌｏタグ、ＨＡタグなどの様々な他のタグが、この目的のための当業者によって周知である。タグ部分は、典型的には小さく、発現されたタンパク質構造に干渉しない。これらは、元々、組換えタンパク質の検出および精製を容易にするために開発されたが、近年、ある特定のタグがまた、収率を向上させ、溶解性を向上させ、さらには、それらの融合パートナーの適切なフォールディングを促進することができることが明らかになった。組換えタンパク質の不溶性は、構造および機能研究のための生体活性物質の産生におけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて特に大きな問題となり得るが、不溶性タンパク質凝集体の形成を回避するための溶解性向上タグの利用が、人気を得て急速に増加している。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰生産された場合、高度に可溶性である多くのタンパク質は、融合パートナーとして溶解性向上特性を有することが報告されているが、ほとんどの場合、これらの主張を支持する証拠は乏しい。公知の溶解性向上融合パートナーの中でも、ＭＢＰは天然の親和性タグでもあるという点で特有である。ＭＢＰ融合タンパク質は、アミロース親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができる。さらなる例には、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、およびその他が含まれる。
哺乳動物細胞に感染し得る発現ベクターの例には、ワクシニアまたは鶏痘などの弱毒化したウイルス宿主が含まれる。このアプローチの一例として、ワクシニアウイルスは、本明細書に記載される新抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして使用される。ワクシニアベクターおよび免疫プロトコルに有用な方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１）に記載されている。
本明細書に記載される新抗原性ポリペプチドの治療的投与または免疫化に有用な多種多様な他のベクター、例えば、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍベクター、解毒された炭疽毒素ベクター、Ｓｅｎｄａｉウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、カナリア痘ベクター、および鶏痘ベクターなどが、本明細書の説明から当業者に明白であろう。いくつかの実施形態では、ベクターは、改変ワクシニアアンカラ（ＶＡ）（例えば、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｉｄｉｃ（ＭＶＡ－ＢＮ））である。
本開示の実施において使用され得るベクターの中で、細胞の宿主ゲノムにおける組み込みは、レトロウイルス遺伝子導入方法によって可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、レンチウイルスである。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって、レトロウイルスのトロピズムを変化させることができる。レトロウイルスはまた、特定の細胞型のみがレンチウイルスによって感染するように、挿入された導入遺伝子の条件付き発現を可能にするように操作することもできる。細胞型特異的プロモーターを使用して、特定の細胞型における発現を標的にすることができる。レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである（したがって、本開示の実施においてレンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターの両方を使用することができる）。さらに、レンチウイルスベクターは、非***細胞を形質導入または感染させることができ、典型的には、高いウイルス力価を産生することができる。したがって、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用型の長い末端反復から構成される。最小のシス作用型のＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、ベクターは、次いで、所望の核酸を使用して、標的細胞に組み込んで、永続的な発現を提供する。本開示の実施において使用され得る、広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０、Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
また、本開示の実施において有用なのは、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づくレンチウイルスベクターなどの最小限の非霊長類レンチウイルスベクターである。ベクターは、標的遺伝子の発現を駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有し得る。したがって、本開示は、本開示の実施に有用なベクター（複数可）の中で、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを含む、ウイルスベクターを企図する。
本開示の実施においても有用なのは、アデノウイルスベクターである。１つの利点は、組換えアデノウイルスが、インビトロおよびインビボで様々な哺乳動物細胞および組織において組換え遺伝子を効率的に転写および発現し、転写された核酸の高発現をもたらす能力である。さらに、生産的に静止細胞に感染する能力は、組換えアデノウイルスベクターの有用性を拡大する。さらに、高い発現レベルは、核酸の産物が、免疫応答を生成するのに十分なレベルまで発現されることを確実にする（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０２９，８４８号を参照されたい）。
本開示の実施に有用なアデノウイルスベクターに関して、米国特許第６，９５５，８０８号に言及されている。使用されるアデノウイルスベクターは、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ｃ６、およびＣ７ベクターからなる群から選択され得る。アデノウイルス５（「Ａｄ５」）ゲノムの配列が公表されている。（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ，Ｊ．，Ｂｉｅｂｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ Ｊａｃｒｏｔ，Ｂ．（１９９２）Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ５ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６，２８０－２８５；この内容は参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｄ３５ベクターは、米国特許第６，９７４，６９５号、同第６，９１３，９２２号、および同第６，８６９，７９４号に記載されている。Ａｄ１１ベクターは、米国特許第６，９１３，９２２号に記載されている。Ｃ６アデノウイルスベクターは、米国特許第６，７８０，４０７号、同第６，５３７，５９４号、同第６，３０９，６４７号、同第６，２６５，１８９号、同第６，１５６，５６７号、同第６，０９０，３９３号、同第５，９４２，２３５号、および同第５，８３３，９７５号に記載されている。Ｃ７ベクターは、米国特許第６，２７７，５５８号に記載されている。Ｅ１欠損もしくは欠失、Ｅ３欠損もしくは欠失、および／またはＥ４欠損もしくは欠失であるアデノウイルスベクターも使用され得る。Ｅ１領域に変異を有する特定のアデノウイルスは、Ｅ１欠損アデノウイルス変異体が、非許容細胞において複製欠損であるか、または最低でも高度に弱毒化されるため、安全マージンが改善されている。Ｅ３領域に変異を有するアデノウイルスは、アデノウイルスがＭＨＣクラスＩ分子を下方制御する機構を破壊することによって、免疫原性を増強し得る。Ｅ４変異を有するアデノウイルスは、後期遺伝子発現の抑制のために、アデノウイルスベクターの免疫原性が低下し得る。このようなベクターは、同じベクターを利用する繰り返しの再ワクチン接種が所望される場合に特に有用であり得る。Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４；Ｅ１およびＥ３；ならびにＥ１およびＥ４において欠失または変異されるアデノウイルスベクターを、本開示に従って使用することができる。
さらに、すべてのウイルス遺伝子が欠失されている、「ガットレス」アデノウイルスベクターもまた、本開示に従って使用することができる。そのようなベクターは、それらの複製にヘルパーウイルスを必要とし、天然環境には存在しない状態である、Ｅ１ａおよびＣｒｅの両方を発現する特殊なヒト２９３細胞株を必要とする。そのような「ガットレス」ベクターは、非免疫原性であり、したがって、ベクターは、再ワクチン接種のために複数回接種され得る。「ガットレス」アデノウイルスベクターは、本開示の導入遺伝子などの異種挿入物／遺伝子の挿入に使用することができ、多数の異種挿入物／遺伝子の同時送達に使用することさえできる。
いくつかの実施形態では、送達はアデノウイルスを介して行われ、アデノウイルスは単一のブースター用量であってもよい。いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、複数の用量を介して送達される。インビボ送達に関して、ＡＡＶは、宿主ゲノムに組み込まれないため、低い毒性および挿入変異を引き起こす低い可能性により、他のウイルスベクターよりも有利である。ＡＡＶは、４．５または４．７５Ｋｂのパッケージング制限を有する。４．５または４．７５Ｋｂより大きい構築物は、ウイルス産生を著しく低下させる。核酸分子発現を駆動するために使用され得る多くのプロモーターが存在する。ＡＡＶ ＩＴＲは、プロモーターとしての役割を果たすことができ、追加のプロモーターエレメントの必要性を排除するのに有利である。
ユビキタス発現には、以下のプロモーターを使用することができる。ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖など。脳発現には、以下のプロモーターを使用することができる。すべてのニューロンについてシナプシンＩ、興奮性ニューロンについてＣａＭＫ ＩＩα、ＧＡＢＡｅｒｇｉｃニューロンについてＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴなど。ＲＮＡ合成を駆動するために使用されるプロモーターには、Ｕ６またはＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターが含まれ得る。Ｐｏｌ ＩＩプロモーターおよびイントロンカセットの使用は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現させるために使用され得る。本開示の実施において有用なＡＡＶベクターに関して、米国特許第５，６５８，７８５号、同第７，１１５，３９１号、同第７，１７２，８９３号、同第６，９５３，６９０号、同第６，９３６，４６６号、同第６，９２４，１２８号、同第６，８９３，８６５号、同第６，７９３，９２６号、同第６，５３７，５４０号、同第６，４７５，７６９号および同第６，２５８，５９５号、ならびにそれらに引用される文書に言及されている。ＡＡＶに関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。標的化される細胞に関してＡＡＶを選択することができ、例えば、脳または神経細胞を標的化するためにＡＡＶ血清型１、２、５、またはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、もしくはそれらの任意の組み合わせを選択することができ、心臓組織を標的化するためにＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。いくつかの実施形態では、送達は、ＡＡＶを介して行われる。投薬量は、いずれかの副作用に対する治療的利益のバランスをとるように調整され得る。
いくつかの実施形態では、ポックスウイルスが、本明細書に記載される組成物に使用される。これらには、オルトポックスウイルス、アビポックス、ワクシニア、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、カナリア痘、ＡＬＶＡＣ、鶏痘、ＴＲＯＶＡＣなどが含まれる（例えば、Ｖｅｒａｒｄｉｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２ Ｊｕｌ；８（７）：９６１－７０、およびＭｏｓｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１３；３１（３９）：４２２０－４２２２を参照されたい）。ポックスウイルス発現ベクターは、１９８２年に記載され、すぐにワクチン開発および多数の分野の研究に広く使用されるようになった。このベクターの利点には、単純な構築、大量の外来ＤＮＡに対応する能力、および高い発現レベルが含まれる。コードポックスウイルス亜科サブファミリーポックスウイルス（脊椎動物のポックスウイルス）、例えば、オルソポックスウイルスおよびアビポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス（例えば、Ｗｙｅｔｈ株、ＷＲ株（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－１３５４）、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、ＭＶＡ、ＭＶＡ－ＢＮ）、カナリア痘ウイルス（例えば、Ｗｈｅａｔｌｅｙ Ｃ９３株、ＡＬＶＡＣ）、鶏痘ウイルス（例えば、ＦＰ９株、Ｗｅｂｓｔｅｒ株、ＴＲＯＶＡＣ）、鳩痘（ｄｏｖｅｐｏｘ）、鳩痘（ｐｉｇｅｏｎｐｏｘ）、鶉痘（ｑｕａｉｌｐｏｘ）、およびアライグマ痘（ｒａｃｃｏｏｎ ｐｏｘ）、とりわけ、それらの合成または天然に存在しない組換え、それらの使用、およびそのような組換えを作製および使用するための方法などの、本開示の実施に使用され得るポックスウイルスに関する情報は、科学および特許文献に見出され得る。
いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスは、抗原を発現させるために、疾患ワクチンまたは免疫原性組成物に使用される。（Ｒｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｏｌｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：５１７－５２４，１９９７）。組換えワクシニアウイルスは、感染宿主細胞の細胞質内で複製することができ、したがって、目的のポリペプチドは、免疫応答を誘導することができる。さらに、ポックスウイルスは、免疫細胞、特に抗原提示細胞に直接感染することによって、主要組織適合性複合体クラスＩ経路によるプロセシングのためにコードされた抗原を標的化するそれらの能力があるが、自己アジュバントのそれらの能力もあるため、ワクチンまたは免疫原性組成物ベクターとして広く使用されてきた。
いくつかの実施形態では、ＡＬＶＡＣは、疾患ワクチンまたは免疫原性組成物中のベクターとして使用される。ＡＬＶＡＣは、外来の導入遺伝子を発現するように修飾され得るカナリア痘ウイルスであり、原核生物および真核生物抗原の両方に対するワクチン接種のための方法として使用されてきた（Ｈｏｒｉｇ Ｈ，Ｌｅｅ ＤＳ，Ｃｏｎｋｒｉｇｈｔ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ（ＡＬＶＡＣ）ｖａｃｃｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｂ７．１ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０００；４９：５０４－１４、ｖｏｎ Ｍｅｈｒｅｎ Ｍ，Ａｒｌｅｎ Ｐ，Ｔｓａｎｇ ＫＹ，ｅｔ ａｌ．Ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｄｕａｌ ｇｅｎｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｖｉｐｏｘ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｏｔｈ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）ａｎｄ Ｂ７．１ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ＣＥＡ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２０００；６：２２１９－２８、Ｍｕｓｅｙ Ｌ，Ｄｉｎｇ Ｙ，Ｅｌｉｚａｇａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＨＩＶ－１ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｂｏｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ＨＩＶ－１－ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：１０９４－１０１、Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ａｎ ｕｐｄａｔｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６；９３：１１３４９－５３、米国特許第７，２５５，８６２号）。第Ｉ相臨床試験において、腫瘍抗原ＣＥＡを発現するＡＬＶＡＣウイルスは、優れた安全性プロファイルを示し、選択された患者においてＣＥＡ特異的Ｔ細胞応答の増加をもたらしたが、客観的な臨床応答は観察されなかった（Ｍａｒｓｈａｌｌ ＪＬ，Ｈａｗｋｉｎｓ ＭＪ，Ｔｓａｎｇ ＫＹ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｆ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ａｖｉｐｏｘ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９９；１７：３３２－７）。
いくつかの実施形態では、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、抗原ワクチンまたは免疫原性組成物についてのウイルスベクターとして使用され得る。ＭＶＡは、オルソポックスウイルスファミリーのメンバーであり、ワクシニアウイルス（ＣＶＡ）のアンカラ株のニワトリ胚線維芽細胞上の約５７０の連続的な継代によって生成されている（例えば、Ｍａｙｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３，６－１４，１９７５を参照されたい）。これらの継代の結果として、得られたＭＶＡウイルスは、ＣＶＡと比較して３１キロベース少ないゲノム情報を含有し、宿主細胞が非常に制限される（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１－１０３８，１９９１）。ＭＶＡは、その極端な弱毒化、すなわち、毒性または感染能力の低下によって特徴付けられるが、依然として優れた免疫原性を有する。様々な動物モデルにおいて試験すると、免疫が抑制された個体においても、ＭＶＡは非病原性であることが証明された。さらに、ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）－ＨＥＲ２は、ＨＥＲ－２陽性乳がんの治療のために設計された候補免疫療法であり、現在臨床試験中である。（Ｍａｎｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｊａｎ ２０１２；６１（１）：１９－２９）。組換えＭＶＡを作製および使用する方法は記載されている（例えば、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３０９，０９８号および同第５，１８５，１４６号を参照のこと）。
ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下で原核生物、酵母、昆虫または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは桿菌が含まれる。高等真核細胞には、哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。細胞を含まない翻訳系も利用することができる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、当該技術分野で周知である（Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５を参照されたい）。
様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために有利に利用される。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、そのようなタンパク質が一般的に正しく折り畳まれ、適切に修飾され、完全に機能するために行うことができる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）によって記載されている、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７株、ならびに例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、２９３、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株を含む、適切なベクターを発現することができる他の細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現される遺伝子に連結した好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の５’または３’の隣接非転写配列、ならびに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位などの５’または３’の非翻訳配列、ならびに転写終結配列を含み得る。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によって概説されている。
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得るベクターで遺伝子操作される（形質導入されるか、または形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、またはポリヌクレオチドの増幅のために必要に応じて修飾された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明白であろう。
適切な宿主の代表的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどの細菌細胞、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種；酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエおよびＳｆ９などの昆虫細胞；Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）によって記載されている、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ－７株などの動物細胞、ならびに適合性ベクター、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株またはＢｏｗｅｓ黒色腫を発現することができる他の細胞株；植物細胞などが挙げられ得る。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
好適なベクターおよび制御配列を利用して、酵母、昆虫または哺乳動物細胞宿主も使用することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）によって記載されている、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ－７株、ならびに適合性ベクター、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株を発現することができる他の細胞株が含まれる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ヒト細胞（例えば、樹状細胞を含む、免疫細胞）において投与され、発現され得る。各アミノ酸についてのコドン選択を導くために、ヒトコドン使用頻度表を使用することができる。このようなポリヌクレオチドは、上記のものなどのエピトープおよび／もしくは類似体間のスペーサーアミノ酸残基を含むか、またはエピトープおよび／もしくは類似体に隣接する天然に存在する隣接配列（および／もしくはＣＴＬ（例えば、ＣＤ８＋）、Ｔｈ（例えば、ＣＤ４＋）、およびＢ細胞エピトープ）を含むことができる。
当業者に周知の標準的な調節配列を、ベクターに含めて、ヒト標的細胞における発現を確実にすることができる。いくつかのベクターエレメントが望ましい：ポリヌクレオチドの下流のクローニング部位を有するプロモーター、例えば、ミニ遺伝子挿入；効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点；およびＥ．ｃｏｌｉの選択可能なマーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。多数のプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターをこの目的のために使用することができる。他の好適なプロモーター配列については、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照されたい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ－ＩＥプロモーターである。
真核生物宿主、特に哺乳動物またはヒトのための有用な発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌宿主についての有用な発現ベクターには、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のプラスミドなどの公知の細菌プラスミド、Ｍ１３および線維状一本鎖ＤＮＡファージなどの、より広い宿主の範囲のプラスミドが含まれる。
ベクターは、いくつかの異なる方法によって動物組織に導入されてもよい。２つの最も一般的なアプローチは、標準的な皮下注射針を使用した、生理食塩水中のＤＮＡの注射、および遺伝子銃送達である。ＤＮＡワクチンプラスミドの構築およびその後のこれらの２つの方法による宿主への送達の概要は、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２８１（１）：３４－４１）に例示されている。生理食塩水中の注射は、通常、骨格筋において筋肉内（ＩＭ）で、または皮内（ＩＤ）で行われ、ＤＮＡは細胞外空間に送達される。これは、ブピバカインなどのミオトキシンで筋繊維を一時的に損傷させることによるエレクトロポレーションによって、または生理食塩水もしくはスクロースの高張溶液を使用することによって補助することができる（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ４２：３４３－４１０）。この送達方法に対する免疫応答は、針の種類、針のアラインメント、注射速度、注射量、筋肉の種類、ならびに注射される動物の年齢、性別、および生理学的状態を含む、多くの要因によって影響を受け得る（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ４２：３４３－４１０）。
他の一般的に使用される送達方法である遺伝子銃送達は、加速剤として圧縮ヘリウムを使用して、金またはタングステン微粒子に吸着されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を標的細胞内に弾道学的に加速させる（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ４２：３４３－４１０、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）５４：１２９－８８）。
代替的な送達方法には、鼻および肺粘膜などの粘膜表面上での裸のＤＮＡのエアロゾル滴下（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）５４：１２９－８８）、ならびに眼および膣粘膜へのｐＤＮＡの局所投与（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）５４：１２９－８８）が含まれ得る。粘膜表面送達はまた、腸粘膜への経口投与のための、カチオン性リポソームＤＮＡ調製物、生分解性ミクロスフェア、弱毒化したＳｈｉｇｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａベクター、ならびに組換えアデノウイルスベクターを使用しても達成される。ＤＮＡまたはＲＮＡはまた、細胞膜の軽度の機械的破壊後に細胞に送達され、細胞を一時的に透過することができる。膜のこのような軽度の機械的破壊は、細胞を小さな開口部に穏やかに通過させることによって達成することができる（Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ，ＰＬＯＳ ＯＮＥ（２０１５））。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む、脂質ベースの系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された様々な単一および多層脂質ビヒクルを包含する一般名称である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とすることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再構成を行い、脂質二重層間の水および溶解溶質を捕捉する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０（１９９１））。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物もまた、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を想定し得るか、または脂質分子の不均一な凝集体としてのみ存在し得る。リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。
脂質製剤の使用は、（インビトロ、エクスビボ、またはインビボで）宿主細胞への核酸の導入のために企図される。別の態様では、核酸は、脂質と会合し得る。脂質と会合する核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化され得、リポソームの脂質二重層内に散在され得、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに取り付けられ得、リポソーム内に捕捉され得、リポソームと複合体化され得、脂質を含有する溶液中に分散され得、脂質と混合され得、脂質と組み合わされ得、脂質中に懸濁液として含有され得、ミセルを含有し得るか、もしくはミセルと複合体化され得るか、またはそれら以外の場合、脂質と会合され得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。それらはまた、単に溶液中に散在してもよく、場合によっては、サイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成してもよい。脂質は、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る脂肪性物質である。例えば、脂質には、細胞質内に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドを含有する化合物のクラスが含まれる。
使用に好適な脂質は、商業的な供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から得ることができ、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から得ることができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約－２０℃で保管することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。いくつかの実施形態では、脂質は、目的のタンパク質をコードする核酸を細胞内に送達するために不可欠である。本明細書に記載される融合ポリペプチドをコードする核酸構築物は、脂質組成物、例えば、融合ポリペプチドの発現のための細胞内のリポソームを介して送達することができる。いくつかの実施形態では、リポソームは１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、リポソームは、少なくともカチオン性脂質、および少なくとも非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、第１の新エピトープを含む第１のペプチドおよび第２の新エピトープを含む第２のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のペプチドは、同じタンパク質に由来する。少なくとも２つの異なるペプチドは、長さ、アミノ酸配列、または両方によって変化し得る。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有することが知られているか、または見出されている任意のタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、ベクターは、タンパク質の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の新エピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、変異を含み、第２の新エピトープは、同じ変異を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、タンパク質の第１の領域の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の領域の第２の新エピトープを含む第２のペプチドと、を含み、第１の領域は、第２の領域のうちの少なくとも１つのアミノ酸を含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、第１の変異を含み、第２の新エピトープは、第２の変異を含む。いくつかの実施形態では、第１の変異および第２の変異は、同じである。いくつかの実施形態では、変異は、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、リードスルー変異、遺伝子融合変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、αウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、またはそれらの偽型に由来する。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフェアである。
Ｔ細胞およびＴ細胞受容体
Ｔ細胞は、胸腺で成熟し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を産生する免疫系細胞である、Ｔリンパ球である。Ｔ細胞は、天然であり得る、すなわち、抗原に曝露されておらず、抗原曝露および記憶を伴う、より成熟したＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡの発現の増加、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現の低下を示し、記憶Ｔ細胞（ＴＭ）（抗原経験および長寿命）、ならびにエフェクター細胞（抗原経験、細胞傷害性）である。ＴＭは、中心記憶Ｔ細胞のサブセット（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現の増加、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現の減少）、およびエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現の減少、およびＣＤ１２７の発現の増加）にさらに分けることができ、エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現が減少しており、グランザイムおよびパーフォリンに対して陽性である、抗原経験のあるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指し、他の例示的なＴ細胞には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｆｏｘｐ３＋）調節性Ｔ細胞およびＴｒｅｇｌ７細胞、ならびにＴｒｌ、Ｔｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８－、およびＱａ－１拘束性Ｔ細胞などの調節性Ｔ細胞が含まれる。
一態様では、本開示は、ナイーブＴ細胞を曝露するための新抗原を標的化するための機構を提供する。リンパ節は、ナイーブＴ細胞を保有する。抗原ペプチドをリンパ節に標的化することにより、常在ナイーブＴ細胞の抗原への曝露が促進され、したがって、新しいプライミングＴ細胞が生成される。ポリボディを新抗原濃縮ペプチドで調製すると、その後、リンパ節でプライミングされるＴ細胞は、新抗原に対してプライミングされ、腫瘍またはがんに対して免疫原性になる。
別の実施形態では、本開示は、タンパク質の第１の領域の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の領域の第２の新エピトープを含む第２のペプチドと、を含む、組成物であって、第１の領域は、第２の領域のうちの少なくとも１つのアミノ酸を含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、第１の変異を含み、第２の新エピトープは、第２の変異を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第１の新エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、第２の新エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。
いくつかの実施形態では、第１のＴＣＲは、第１の新エピトープに特異的な第１のキメラ抗原受容体であり、第２のＴＣＲは、第２の新エピトープに特異的な第２のキメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態では、第１のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、第１のＴ細胞は、ガンマデルタＴ細胞である。いくつかの実施形態では、第２のＴ細胞はヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＴＣＲは、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＴＣＲは、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩ－ペプチド複合体に結合する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＴＣＲは、２，０００、１，５００、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩＩ－ペプチド複合体に結合する。
抗原提示細胞
新抗原性ペプチドまたはタンパク質は、本明細書に記載される、このようなペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドを含有する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）として提供され得る。他の実施形態では、このような抗原提示細胞は、患者に使用するためのＴ細胞を刺激するために使用される。したがって、本開示の一実施形態は、本明細書に記載される１つ以上の新抗原性ペプチドまたはポリヌクレオチドが、パルスまたは負荷された少なくとも１つの抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含有する組成物である。いくつかの実施形態では、このようなＡＰＣは、自己（例えば、自己樹状細胞）である。あるいは、患者から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）には、エクスビボで新抗原性ペプチドまたはポリヌクレオチドが負荷され得る。関連する実施形態では、このようなＡＰＣまたはＰＢＭＣは、患者に戻して注入される。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。関連する実施形態では、樹状細胞は、新抗原性ペプチドまたは核酸でパルスされる自己樹状細胞である。新抗原性ペプチドは、適切なＴ細胞応答を生じさせる任意の好適なペプチドであり得る。腫瘍関連抗原由来のペプチドでパルスされた自己樹状細胞を使用したＴ細胞治療は、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９，３７１－３８０およびＴｊｕａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３２，２７２－２７８に開示されている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＴＬ（例えば、ＣＤ８＋）である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ（例えば、ＣＤ４＋））である。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象にも投与することができる細胞ベースの免疫原性医薬組成物を含む組成物を提供する。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベースの免疫原性医薬組成物は、当該技術分野で好適であり、理解されているように、周知の技術、担体、および賦形剤のいずれかを使用して製剤化することができる。ＡＰＣには、単球、単球由来細胞、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。場合によっては、ＡＰＣベースの免疫原性医薬組成物は、樹状細胞ベースの免疫原性医薬組成物であってもよい。
樹状細胞ベースの免疫原性医薬組成物は、当該技術分野で周知の任意の方法によって調製することができる。一部の場合では、樹状細胞ベースの免疫原性医薬組成物は、エクスビボまたはインビボ方法を通じて調製することができる。エクスビボ方法は、患者に投与する前にＤＣを活性化または負荷するために、本明細書に記載されるポリペプチドを用いてエクスビボでパルスされた自己ＤＣを使用することを含むことができる。インビボ方法は、本明細書に記載されるポリペプチドとカップリングした抗体を使用して特異的ＤＣ受容体を標的化することを含むことができる。ＤＣベースの免疫原性医薬組成物は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ－７－８、およびＣＤ４０アゴニストなどのＤＣ活性化因子をさらに含み得る。ＤＣベースの免疫原性医薬組成物は、アジュバント、および薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ヒトおよび非ヒト霊長類、他の哺乳動物、および脊椎動物を含む、様々な供給源から調製され得る。ある特定の実施形態では、ＡＰＣは、ヒトまたは非ヒト脊椎動物の血液から調製され得る。ＡＰＣはまた、濃縮された白血球の集団から単離され得る。白血球の集団は、当業者に公知の方法によって調製され得る。そのような方法は、典型的には、ヘパリン化血液の採取、アフェレーシスまたは白血球フェレーシス、バフィーコートの調製、ロゼット形成、遠心分離、密度勾配遠心分離（例えば、フィコール、コロイド状シリカ粒子、およびスクロースを使用する）、示差溶解非白血球細胞、および濾過を含む。白血球集団は、対象から血液を採取し、脱線維素化して血小板を除去し、赤血球細胞を溶解することによっても調製することができる。白血球集団は、任意選択により、単球性樹状細胞前駆体について任意に濃縮され得る。
血液細胞集団は、白血球の濃縮された集団の所望の使用に従って、様々な対象から得ることができる。対象は、健康な対象であり得る。あるいは、血液細胞は、例えば、がん患者、または免疫刺激が有益である他の患者などの、免疫刺激を必要とする対象から得ることができる。同様に、血液細胞は、例えば、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症など）を有する患者などの、免疫抑制を必要とする対象から得ることができる。白血球の集団はまた、ＨＬＡが一致した健康な個体からも得ることができる。
血液をＡＰＣの供給源として使用する場合、血液白血球は、それらの生存能を維持する従来の方法を使用して得ることができる。本開示の一態様によれば、血液は、ヘパリンまたは他の好適な抗凝固剤を含有してもよいか、または含有しなくてもよい培地中に希釈され得る。血液の培地に対する体積は、約１対１であり得る。細胞は、４℃で約１，０００ｒｐｍ（１５０ｇ）で、培地中での血液の遠心分離によって濃縮され得る。血小板および赤血球細胞は、赤血球を溶解させる当該技術分野で公知の任意の数の溶液、例えば、塩化アンモニウム中に細胞を再懸濁することによって枯渇され得る。例えば、混合物は、約１：１の体積で培地および塩化アンモニウムであり得る。細胞は、遠心分離によって濃縮され得、血小板および赤血球細胞を実質的に含まない、白血球の集団が得られるまで、所望の溶液中で洗浄され得る。組織培養において一般に使用される任意の等張溶液が、血液白血球を血小板および赤血球細胞から分離するための培地として使用され得る。そのような等張溶液の例は、リン酸緩衝食塩水、ハンクス平衡塩溶液、および完全増殖培地であり得る。ＡＰＣおよび／またはＡＰＣ前駆体細胞は、水簸によっても精製され得る。
いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、炎症条件または他の方法で活性化された条件下で、非ノミナルＡＰＣであり得る。例えば、非ノミナルＡＰＣには、インターフェロン－ガンマで刺激された上皮細胞、ＡＰＣ活性を誘導する因子または条件によって活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞および／または単球が含まれ得る。このような非ノミナルＡＰＣは、当該技術分野で公知の方法に従って調製され得る。
ＡＰＣは、ＡＰＣの型に従って、従って、所望により、培養、増殖、分化および／または成熟化され得る。ＡＰＣは、例えば、培養プレート、フラスコ、培養バッグおよび、バイオリアクターなどの任意の好適な培養容器中で培養され得る。
ある特定の実施形態では、ＡＰＣは、調製物中のＡＰＣの数を維持および／または増殖させるために、好適な培養培地または増殖培地中で培養され得る。培養培地は、単離されたＡＰＣの型に従って選択され得る。例えば、成熟樹状細胞などの成熟ＡＰＣは、それらの維持および増殖のために好適な増殖培地中で培養され得る。培養培地には、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、二価カチオンなどが補充され得る。さらに、サイトカイン、増殖因子および／またはホルモンが、増殖培地中に含められ得る。例えば、成熟樹状細胞の維持および／または増殖のために、サイトカイン、例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、および／またはインターロイキン４（ＩＬ－４）が添加され得る。他の実施形態では、未成熟ＡＰＣが、培養および／または増殖され得る。未成熟樹状細胞は、標的ｍＲＮＡを取り込み、新たな抗原をプロセシングする能力を保持し得る。いくつかの実施形態では、未成熟樹状細胞は、それらの維持および培養のために好適な培地中で培養され得る。培養培地には、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、二価カチオンなどが補充され得る。さらに、サイトカイン、増殖因子および／またはホルモンが、増殖培地中に含められ得る。
他の未成熟ＡＰＣも同様に、培養または増殖され得る。未成熟ＡＰＣの調製物は、成熟ＡＰＣを形成するために成熟化され得る。ＡＰＣの成熟化は、新抗原性ペプチドへの曝露の間またはその後に生じ得る。ある特定の実施形態では、未成熟樹状細胞の調製物が、成熟化され得る。好適な成熟化因子には、例えば、サイトカインＴＮＦ－α、細菌産物（例えば、ＢＣＧ）などが含まれる。別の態様では、単離されたＡＰＣ前駆体が、未成熟ＡＰＣの調製物を調製するために使用され得る。ＡＰＣ前駆体は、培養、分化および／または成熟化され得る。ある特定の実施形態では、単球性樹状細胞前駆体は、単球性樹状細胞前駆体の未成熟樹状細胞への分化を促進するために、アミノ酸、ビタミン、サイトカインおよび／または二価カチオンを補充した好適な培養培地の存在下で培養され得る。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ前駆体は、ＰＢＭＣから単離される。ＰＢＭＣは、ドナー、例えば、ヒトドナーから得ることができ、新鮮なまま使用され得るか、または将来的な使用のために凍結され得る。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、１つ以上のＡＰＣ調製物から調製される。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、第１および第２の新エピトープを含む第１および第２の新抗原性ペプチド、または第１および第２の新エピトープを含む第１および第２の新抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドが負荷されたＡＰＣを含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、自己ＡＰＣ、同種異系ＡＰＣ、または人工ＡＰＣである。
一実施形態では、本開示は、第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、第２の新エピトープを含む第２のペプチドとを、含む、ＡＰＣを含む、組成物であって、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、変異を含み、第２の新エピトープは、同じ変異を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、第１および第２のペプチドは、同じタンパク質に由来する。別の実施形態では、本開示は、タンパク質の第１の領域の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の領域の第２の新エピトープを含む第２のペプチドと、を含む、ＡＰＣを含む、組成物であって、第１の領域は、第２の領域のうちの少なくとも１つのアミノ酸を含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、第１の変異を含み、第２の新エピトープは、第２の変異を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、第１の変異および第２の変異は、同じである。
アジュバント
アジュバントは、本明細書で提供される組成物を受けている患者において誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するために使用され得る。組成物中の活性成分は、抗原ペプチドを含む。アジュバントの組み込みは、組成物の抗原応答をさらに増強することができる。場合によっては、アジュバントはＴｈ１型応答を誘発することができる。他の場合、アジュバントはＴh２型応答を誘発することができる。Ｔｈ１型応答は、ＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＬ－１０などのサイトカインの産生によって特徴付けられ得るＴｈ２型応答とは対照的に、ＩＦＮ－γなどのサイトカインの産生によって特徴付けられ得る。
いくつかの態様では、ＭＰＬＡおよびＭＤＰなどの、脂質ベースのアジュバントは、本明細書に開示される免疫原性医薬組成物とともに使用され得る。例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）は、特異的Ｔリンパ球へのリポソーム抗原の増加した提示を引き起こすアジュバントである。さらに、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）もまた、本明細書に記載される免疫原性医薬製剤と併せて、好適なアジュバントとして使用され得る。
好適なアジュバントは、当該技術分野で公知であり（国際公開第２０１５／０９５８１１号を参照されたい）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ－ＩＣＬＣ、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０、８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）．ベクターシステム、ＰＬＧマイクロ粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦ ｔｒａｐ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）、ミコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣物、ならびに他の独占所有権のあるアジュバント、例えば、Ｒｉｂｉ’ｓ Ｄｅｔｏｘ．ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓが含まれるが、これらに限定されない。アジュバントには、不完全なフロイントまたはＧＭ－ＣＳＦもまた含まれる。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）が、以前に記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８－２７、Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３－１１）（Ｍｏｓｃａ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７；１２：４０５０－４０６０）（Ｇａｍｖｒｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；８２：５０６－５１６）。また、サイトカインも使用され得る。いくつかのサイトカインは、リンパ系組織への樹状細胞遊走に影響を与えること（例えば、ＴＮＦ－アルファ）、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟化を加速させること（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＩＬ－１、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－４、ＩＬ－６およびＣＤ４０Ｌ）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４９，５８９号）および免疫アジュバントとして作用すること（例えば、ＩＬ－１２）に直接関連付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４－４１８）
アジュバントはまた、サイトカインなどの刺激分子も含み得る。サイトカインの非限定的な例には、以下が含まれる：ＣＣＬ２０、ａ－インターフェロン（ＩＦＮ－ａ）、β－インターフェロン（ＩＦＮ－β）、γ－インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ（リンホトキシンアルファ（ＬＴα））、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、、ＩＬ－２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－ｌａ、ＭＩＰ－１－、ＩＬ－８、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、変異形態のＩＬ－１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ－７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦκＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、およびＴＡＰ２。
さらなるアジュバントには、以下が含まれる：ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－ｌａ、ＭＩＰ－ｌｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、変異形態のＩＬ－１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ－７、ＩＬ－２２、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦκＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能的断片。
いくつかの態様では、アジュバントは、ｔｏｌｌ様受容体のモジュレーターであり得る。ｔｏｌｌ様受容体のモジュレーターの例には、ＴＬＲ－９アゴニストが含まれ、イミキモドなどのｔｏｌｌ様受容体の小分子モジュレーターに限定されない。本明細書に記載される免疫原性医薬組成物と組み合わせて使用されるアジュバントの他の例には、サポニン、ＣｐＧ ＯＤＮなどが含まれ得るが、これらに限定されない。場合によっては、アジュバントは、細菌トキソイド、ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンブロックポリマー、アルミニウム塩、リポソーム、ＣｐＧポリマー、水中油エマルション、またはそれらの組み合わせから選択される。場合によっては、アジュバントは、水中油エマルションである。水中油エマルションは、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み得、この油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生分解性（代謝可能）および生体適合性である。エマルション中の油滴は、直径が５μｍ未満であり得、さらにはサブミクロンの直径を有し得、これらの小さいサイズは、安定なエマルションを提供するために、マイクロフリュイダイザーを用いて達成される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得る。
エピトープペプチドを有するポリボディを生成するための方法
ポリボディは、クローニングによって生成され得る。一つのアプローチでは、抗原ペプチドを含む親足場アセンブリが最初に生成される。親足場は、制限酵素で消化され得、その後、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドは制限部位にクローニングされ、ペプチド足場単位（複数可）を得て、それは次いで線形化発現ベクターに挿入される。ペプチドは、隣接リンカー配列を含み得る。あるいは、リンカーを有するペプチド配列が合成され得るか、またはＰＣＲによって生成され得る。ベクターを挿入物（ベクターに挿入されるペプチドまたはポリペプチド）と容易に接合するために、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリが利用され得る。Ｇｉｂｓｏｎクローニング法は、特定の制限部位を有さずに任意の断片が接合され得、配列に関係なく、高速かつ柔軟なクローニング戦略を提供する。これは、Ｔ５エキソヌクレアーゼチューバックが、（挿入物内の）ＤＮＡ断片の５’および３’末端に一本鎖オーバーハングを生成することを伴うが、ベクターは、通常、付着末端を有する。こうして作製された挿入オーバーハングは、接触すると、ベクターの付着末端とハイブリダイズし、フィルイン（ｆｉｌｌ－ｉｎ）ライゲーションは、好適なライゲーション酵素を使用して実施される。いくつかの場合、より大きなオーバーハングが生成され得、ベクターおよび挿入物のオーバーハング領域は、オーバーハングのハイブリダイゼーションによって接合し、次いで好適なライゲーション酵素を使用してライゲーションしてインタクトなベクターを形成する。上記のスキームからの変形形態は、当業者によって考えられるものであり、本開示の範囲内であると企図される。
人工ミニプロテオームワクチン
積極的な腫瘍根絶免疫療法は、有効であり、迅速に生成され、広く採用され得る治療製品を必要とする。Ｔ細胞を活性化するために対象自身の新抗原ペプチドを使用する個別化された医薬品は、免疫腫瘍学において新しく有望な領域であるが、新抗原ワクチンの調製には、数日から数週間、またはさらに数ヶ月かかる可能性があるという点で注意が必要である。さらに、この方法は高価である。より効果的で、時間および費用効果の良い方法がここで求められる。目的は、大部分の新抗原、およびまた、対象からの他の潜在的に有用な抗原を含む、迅速で安価なワクチンを短期間で特定し、開発することである。そのような製品は、承認され、開発中の免疫療法の任意の既製の組み合わせと容易に統合されるべきであり、再発後の追加の腫瘍試料からの調製を繰り返すため、または腫瘍間の不均一性の影響を低減するために安価であるべきであり、潜在的に有用なエピトープの著しく広範な表現を組み込むべきであり、とりわけ、対象のＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞の両方を活性化するべきである。本明細書に提供されるのは、上記のような特定の満たされていないニーズを満たすワクチン製造のための組成物および方法である。
一態様では、本明細書に提供されるのは、新抗原予測のステップを回避する、対象特異的がんワクチンを生成するための効率が高い方法である。この方法は、人工ミニプロテオームワクチン（ＡｍｐＶａｘ）の生成に関する。この方法では、個別化されたがんワクチンは、腫瘍細胞からの全エクソーム捕捉ＲＮＡ断片のライブラリー、または腫瘍細胞によって発現されたタンパク質の全部または選択された一部をコードする対象からの新鮮な凍結パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織スライスを調製することによって生成され得、すべてまたはほぼすべての新抗原、ならびに腫瘍関連抗原、およびイントロンと非翻訳領域とに近接するさらなる領域を含み、これらは、核酸シーケンシングおよび抗原予測アルゴリズムの使用によって容易に決定することができない新抗原翻訳産物を含有し得る。ｃＤＮＡは、全エクソーム捕捉ＲＮＡ断片のライブラリーから調製される。ＲＮＡ断片からのｃＤＮＡ産物のそれぞれは、好適な発現ベクターにおいてクローニングされ得、細菌系などの好適な系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系）において発現され得る。次いで、発現したペプチドが単離され得、これは、ワクチンとして使用され得る。いくつかの実施形態では、疾患を有する対象の全エクソーム捕捉ＲＮＡのライブラリーから発現された単離されたペプチドは、人工ミニプロテオームであり、エクソーム捕捉ＲＮＡは、対象の疾患細胞に由来する。次いで、発現したペプチドは精製され得、さらなる修飾をせずにワクチンとして使用され得る。
いくつかの実施形態では、全エクソーム捕捉ＲＮＡ断片のライブラリー（または換言すれば、全エクソームｃＤＮＡライブラリー）から発現されたペプチドをコードするポリヌクレオチドは単離され、タンパク質（複数可）またはタンパク質断片（複数可）（例えば、本明細書の他の箇所に記載されているような足場タンパク質）の上流にサブクローニングして、ポリボディなどのペプチド融合構築物を生成し、高収率でＥ ｃｏｌｉ系などの迅速な生物発現系において容易に発現され得る、ペプチド融合ライブラリーが生成される。ペプチド融合ライブラリーから発現したタンパク質は、単離され得、精製され得、その全体を人工ミニプロテオーム（ＡｍｐＶａｘ）ワクチンとして使用され得る。
一態様では、対象のエクソーム捕捉ＲＮＡは、対象の非疾患細胞または標準的な非疾患参照細胞と比較して、疾患細胞において差次的に発現されるＲＮＡのためにさらに濃縮される。がん細胞は、１つ以上の遺伝子に体細胞変異を蓄積し、そのような変異は、対象の非がん細胞、または健康な個体由来の同等の細胞には存在しない。いくつかの実施形態では、がん細胞内の変異遺伝子から転写されたＲＮＡは、対象の非がんもしくは健康な細胞、または非がん参照細胞と比較した場合、核酸配列において異なる。変異した遺伝子からのそのようなＲＮＡは、参照と比較して、差次的に発現された遺伝子と見なされ得る。差次的に発現されたＲＮＡは、例えば、点変異などの変異遺伝子産物、または１つ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失を含む。差次的に発現されたＲＮＡは、例えば、新抗原コード配列について濃縮されたＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、疾患細胞または組織（例えば、がん細胞または腫瘍）において、参照（例えば、非疾患細胞または組織によって発現されるＲＮＡ）に対して差次的に発現されるＲＮＡは、ＡｍｐＶａｘワクチンとして使用するために選択される。
本質的に、この技術は、パンエクソーム（ｐａｎ－ｅｘｏｍｅ）新抗原捕捉および濃縮を可能にする。
上記の差次的に発現したＲＮＡは、差次的に発現した遺伝子を濃縮するための技術、例えば、がん細胞由来ＲＮＡと参照ＲＮＡとのハイブリダイゼーション、続いて、非ハイブリダイゼーション／ミスマッチ領域の単離を伴う技術によって得ることができる。例示的な方法には、ミスマッチＤＮＡ二量体のＭｕｔ Ｓ媒介性単離が含まれる。
いくつかの実施形態では、ワクチン生成プロセスには、シーケンシングは必要ない。
したがって、ライブラリーの組成物は、効率的な産生および抗原送達のために担体タンパク質に融合された腫瘍細胞内の発現タンパク質の含有量を表す。
発現タンパク質（複数可）またはタンパク質断片は、（１）良好なリンパ節保持に有益である大きなサイズであり（約５０～６０ｋＤ超）、（２）モジュール式であり、機能的ドメインの組み込み（例えば、エピトープ交差提示および樹状細胞、特に所望の樹状細胞のサブセットを標的化するためのような、ＣＬＥＣ９Ａの組み込み）を可能にし、（３）多価であり（例えば、ペプチド配列（例えば、新抗原または機能的ドメインまたは足場ドメイン）の複数のコピーを含有し、アジュバント、ＤＣ標的化または他のワクチン機能性を増強する基を保有する、抗足場エピトープにより誘導された抗体または抗体断片での単純な付加－混合ベースの機能性付与によって、分子当たりの付加された成分の複数のコピーとともに、さらなる機能性付加を可能にするように、設計され得る。例えば、ワクチン生成物は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、従来の親和性技術、イオン交換、および／またはサイズ排除クロマトグラフィーステップを使用して精製される。ワクチンは、シーケンシングまたはバイオインフォマティクスを必要とせず、複数の規定された配列オリゴヌクレオチドの合成を必要とせずに調製され得るので、迅速に調製され得る。
いくつかの実施形態では、生体試料は、疾患、例えば、がんを有する対象から得られ、生体試料は、腫瘍生検、アフェレーシスカラムからの細胞、末梢血からの細胞、パラフィン包埋組織スライス、または凍結パラフィン包埋組織試料のうちのいずれか１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、総細胞ＲＮＡは、対象の細胞から得られる。いくつかの実施形態では、全細胞ＲＮＡは、対象の疾患細胞から得られ、疾患細胞は、がん細胞、または感染細胞である。いくつかの実施形態では、総細胞ＲＮＡは、対象に由来する疾患細胞（例えば、がん細胞）と、非疾患細胞を参照して疾患細胞において差次的に発現されたＲＮＡを濃縮するために使用され得る、対象の非疾患細胞（例えば、非がん細胞）との両方から得られる。いくつかの実施形態では。
本明細書に記載される方法の１つの利点は、ワクチンが潜在的な抗原の広範な表現をカバーすることである。
本明細書に記載される方法の別の利点は、エピトープの拡散を促進することである。
本明細書に記載される方法の別の利点は、毒性または副作用に対して安全であることである。
本明細書に記載される方法の別の利点は、比較的速いことである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、総細胞ＲＮＡを含む生体試料を得てから２週間未満で調製される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１週間未満で調製される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１２日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、または３日未満で調製される。方法の例示的な簡略化されたワークフローは以下に示され、対象からの細胞の単離からワクチンを調製するのに必要なおおよその時間を示す。
（ａ）全エクソーム捕捉ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡライブラリー調製：２日
（ｂ）プラスミドにおけるクローニング：１日
（ｃ）タンパク質発現：増殖４～５日
（ｄ）精製およびワクチン組成物：１～２日。したがって、このプロセスはおよそ１０日で完了し得る。プロトコルの最適化およびさらなる改善により、手順を迅速化することができる。
エクソーム捕捉ＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーのクローニングおよび発現は、社内で生成され、最適化されたプロトコルおよび発現系を使用することによって実施され得る。例示的なプロトコルでは、簡潔に、全ＲＮＡは、対象の生体試料から抽出される。生体試料は、対象のがんまたは腫瘍からの細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象のがんまたは腫瘍からの細胞または組織（新鮮または固定、保存）を含む、第１の生体試料と、対象の非腫瘍細胞などの、非疾患細胞からの細胞または組織（新鮮または固定、保存）を含む、第２の生体試料と、を含み得る。生体試料から抽出されたＲＮＡは、約２４～約３００ヌクレオチド塩基長、または約４５～４５０ヌクレオチド塩基長、または１００～３００ヌクレオチド塩基長、または約２５０塩基長である断片に、機械的、化学的または酵素的に消化され得る。いくつかの保存された試料は、天然に分解された、または剪断されたＲＮＡを有し得る。ｃＤＮＡは、ランダムプライマーを使用して、逆転写酵素により全ＲＮＡから調製され得る。いくつかの実施形態では、トランスクリプトームのコード領域を捕捉するためのステップ、例えば、ＲＮＡまたはｃＤＮＡエクソーム捕捉ステップが利用され得る。例えば、ＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、エクソン特異的ＤＮＡまたはＲＮＡベイトにハイブリダイズさせることができ、これらは、次に、ビオチン化される。ハイブリダイゼーション後、ビオチン化ＤＮＡまたはＲＮＡベイトは、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズで捕捉され得る。エクソン特異的ベイトに結合したＲＮＡまたはｃＤＮＡ断片はプルダウンされ得、非結合ＲＮＡまたはｃＤＮＡ断片は洗い流され得る。次いで、残りの捕捉されたＲＮＡまたはｃＤＮＡ断片は、例えば、捕捉プローブから変性された後に増幅され得る。次に、生成されたｃＤＮＡ断片は、全エクソーム捕捉ｃＤＮＡライブラリーを生成するために発現ベクターにクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、変性に供され、任意選択により、鎖特異的アダプターにライゲーションされ、参照エクソームライブラリーまたはゲノムライブラリーとハイブリダイズし、少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを有するＤＮＡ二本鎖に結合し得る固定化ＭｕｔＳタンパク質を含むカラムを通過することによって、ＤＮＡ断片を含有する変異の濃縮に供される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされたエクソーム／参照ライブラリーは、溶液中のＭｕｔＳと相互作用し、続いてカラム上のＭｕｔＳを捕捉することによって、ＤＮＡ断片を含有する変異の濃縮に供され得る。発現プラスミドは、（ａ）プロモーター配列、（ｂ）ポリヌクレオチド断片（この場合、ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡ断片）を含む配列、ならびに（ｃ）理想的には、少なくとも親和性タグおよび／またはクローニングされたｃＤＮＡ配列断片からの発現ペプチドの同定を可能にするタグを含む。例示的な親和性タグは、Ｆｃ受容体に結合するペプチド配列、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、プロテインＡに結合するペプチド配列、プロテインＧに結合するペプチド配列、もしくは抗体のエピトープ、またはそれらの結合断片である。いくつかの実施形態では、発現されたペプチド配列の即時同定のためのタグが含まれ得る。この目的のための例示的なタグには、この目的にも寄与するはずの上記の親和性タグとは別に、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓ６タグ、蛍光タグ、例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰまたはＹＦＰが含まれる。親和性タグはまた、ポリヌクレオチド断片の下流で発現されるヒト足場タンパク質の領域であってもよい。
発現ベクターが、細菌細胞発現系などの好適な細胞において発現される場合、親和性タグを使用して、翻訳されたペプチドを単離し、精製することができる。
ｃＤＮＡライブラリークローニングは、標準的な方法を使用して実施され得る。さらに、ペプチド生成のためのプロセスを調整するために、いくつかの修飾が含まれ得る。ＲＴ酵素系をクローニングする前に、ｃＤＮＡを第１の鎖（または鋳型鎖）として使用して二重鎖を生成し、次いで、得られた二本鎖ＤＮＡをベクターにクローニングする。一般に、反応チューブにおける単一のＲＴ反応により、クローニングのためのｃＤＮＡを含む挿入二本鎖ＤＮＡが生成する。簡潔に述べると、挿入物は、プロモーター配列の下流の発現ベクターにライゲーションされ、ベクターは、プラス鎖の３’末端またはその付近に開始コドンを含み得る。挿入物は、開始コドンのすぐ下流、または開始コドンの１、２、３、もしくはそれを超える下流のヌクレオチドにライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、挿入物は、リンカー配列を介してベクターにライゲーションされ得る。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ断片は、５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方でリンカーに融合され得る。リンカーは、短いポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリペプチドまたはオリゴペプチドをコードし得る。リンカーは、リンカーの切断を促進するように構成されてもよく、つまり、リンカーは切断配列を含む。いくつかの実施形態では、切断配列は、タンパク質分解性切断配列であり得る。切断は、翻訳後切断事象であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーポリヌクレオチドは、核酸を消化し、クローニングを促進するための制限消化部位を含み得る。
３’末端にて、挿入物は、フレームチェック配列を含む配列にライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、挿入物の３’末端は、フレームチェック配列の下流にある１つ以上の親和性タグをコードする配列にライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、フレームチェック配列は、親和性タグをコードする配列を含む。例示的なフレームチェック配列は、Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒをコードする。
いくつかの実施形態では、フレームチェック配列は、Ｎ１－Ｎ２－Ｎ３－Ｎ４－Ｎ５－Ｎ６－Ｎ７－Ｎ８－Ｎ９の式を有し、各Ｎは、独立して、Ａ、Ｔ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択されるヌクレオチドであり、Ｎ１－Ｎ２－Ｎ３およびＮ４－Ｎ５－Ｎ６およびＮ７－Ｎ８－Ｎ９のそれぞれは、終止コドンではなく、Ｎ２－Ｎ３－Ｎ４およびＮ６－Ｎ７－Ｎ８のそれぞれは、終止コドンである。
例示的なクローニング技術には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＴＡクローニング、Ｔｏｐｏ ＰＣＲクローニング、平滑末端クローニング、ゲートウェイクローニング、およびその他。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ断片、ならびに５’および／または３’リンカー（存在する場合）は、ともに事前にライゲーションされるか、またはＰＣＲ産物として生成される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ断片を含む挿入物、または全体としてリンカーを有するｃＤＮＡ断片は、次いで、足場タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列にライゲーションされ、その結果、少なくとも１つの足場タンパク質が、少なくとも１つのｃＤＮＡ断片と同じリーディングフレームにあるようになる。いくつかの実施形態では、親足場タンパク質配列は、挿入物をライゲーションするための制限酵素によって消化され得、挿入物はまた、リンカー配列を含む隣接領域内に制限消化部位も含む。いくつかの実施形態では、リンカーに隣接し、各ＤＮＡの両側に１つ以上の足場ペプチド配列を含む、複数のこのようなｃＤＮＡ配列は、好適な発現系におけるクローニングおよび発現のための挿入物を構成し得る。
好適な発現系は、細菌発現系であり得る。一例は、ｐＴＣ７ベクター系などの、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系である。しかしながら、他の発現システムも企図され得る。例には、哺乳動物細胞ベースの発現系、酵母ベースの発現系、昆虫細胞ベースの発現系、または無細胞発現系が含まれる。
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系（ＢＡＣ）が使用される。
いくつかの実施形態では、ファージ発現系が使用される。
当業者に十分に理解されているように、クローニングおよび発現は、１つのベクターの発現を、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細胞内で発現させることを可能にする。いくつかの実施形態では、挿入物の発現は、ｃＤＮＡ断片を足場カセットに組み込む前に最初に検出される。いくつかの実施形態では、対象からのワクチンの大規模な製造の前に、ペプチドを発現する断片のための小規模な分析が行われる。いくつかの実施形態では、精製ステップは、発現ｃＤＮＡ断片のみを単離し、これは、ｃＤＮＡ挿入物からの発現の容易な証明である。全エクソーム捕捉ｃＤＮＡライブラリーのクローニングから、様々な状況が生じ得る。例えば、（ｉ）いくつかのクローニングされたｃＤＮＡ断片は、インフレームに入り、インフレームから出ることができ、ペプチドおよび親和性タグの両方が発現される；（ｉｉ）いくつかのクローニングされたｃＤＮＡ断片は、インフレームに入ることができるが、フレームから出ることができ、このような場合、ペプチドは発現されるが、親和性タグは発現されない；（ｉｉｉ）いくつかのクローニングされたｃＤＮＡ断片は、インフレームに入ることができ、インフレームから出ることができ、部分的なペプチドは発現されるが、親和性タグは発現されない；（ｉｖ）いくつかのクローニングされたｃＤＮＡ断片は、フレーム外から入ることができ、インフレームから出ることができ、ペプチドは発現されないが、親和性タグは発現される；または（ｖ）いくつかのクローニングされたｃＤＮＡ断片は、フレーム外から入ることができ、フレームから出ることができ、このような場合、ペプチドも親和性タグも発現されない。
いくつかの実施形態では、ワークフローは、少なくとも親和性タグの発現によるペプチドの最初の同定、または親和性精製タグの単離を含み、その後、精製された産物の一部は、次いで、ライブラリーから同じもののより多くのクローンを同定し、発現するなど、将来の使用のために保管されてもよく、一方、残りは、ペプチドワクチンの生成のために使用される。
発現系は、必要に応じてスケールアップのために最適化され得る。
いくつかの実施形態では、ＡｍｐＶａｘ全エクソーム（ＡｍｐＶａｘ－エクソーム）ワクチンが生成される。この方法によって生成されるワクチンは、上記のように、ワクチンにおける全エクソームＲＮＡ－生成されたｃＤＮＡ、または腫瘍の種類に基づいて腫瘍細胞において発現されると予想される全エクソームの選択された部分を含む。いくつかの実施形態では、ＡｍｐＶａｘ濃縮エクソームワクチンが生成される。この方法によって生成されるワクチンは、以下の節に記載されるように、参照エクソームと比較して、対象の疾患細胞における発現のために濃縮されたｃＤＮＡを含む。両方のプロセスを説明するための例示的なスキームでは、まず、全エクソーム捕捉ＲＮＡが断片化され、二本鎖ｃＤＮＡがライブラリーにライゲーションされ、各ｃＤＮＡ断片は鎖特異的プライマーでライゲーションされ、両方の方法で調製される。次いで、ライブラリーは、ベイトハイブリダイゼーションに供され、ＡｍｐＶａｘ－エクソーム手順の場合、エクソームはこのように捕捉されるが、ＡｍｐＶａｘ濃縮エクソームワクチン生成の場合、ヘテロ二本鎖が、ＭｕｔＳ濃縮、続いて、エクソーム捕捉ステップに供される。ＭｕｔＳ濃縮は、二本鎖内のミスマッチを選択的に濃縮し、したがって、ｃＤＮＡ配列内の変異を濃縮する。次いで、全エクソームｃＤＮＡまたはＭｕｔＳにより捕捉された濃縮ｃＤＮＡが、プラスミドにクローニングされる
点変異を含むポリヌクレオチドのエクソーム分析および濃縮のための方法：エクソームは、生物において発現されるゲノム内のすべての遺伝子として定義され得る。一般に、メッセンジャーＲＮＡのプールは、特定の時間および細胞または組織が経験した一連の状態で生物の特定の細胞または組織において発現されるすべての遺伝子を反映する。ヒトにおいて、ヒトゲノムの約１％を構成する約１８０，０００個のエクソン、またはおよそ３０００万塩基対が存在する。細胞から抽出された全ＲＮＡは、全メッセンジャーＲＮＡリポジトリを含み、これは、好適な逆転写（ＲＴ）酵素、好適なプライマー、ならびにヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、塩、およびヌクレアーゼフリー溶液中の緩衝液などの必要な試薬を使用してインビトロでｃＤＮＡに変換され得る。いくつかの実施形態では、リンカーまたはアダプターは、次いで、ｃＤＮＡ断片に取り付けられ、次いで、エクソンのみを捕捉するように設計されたポリヌクレオチドのライブラリーにハイブリダイズされる。次いで、ハイブリダイズされたＤＮＡ断片は選択的に単離され、発現ベクターにクローニングされ得る。点変異などの変異を含むＤＮＡ断片の選択的単離は、以前に記載されるように、ハイブリダイズされたＤＮＡをＭｕｔＳタンパク質との接触に供することによって達成され得、ＭｕｔＳカラムを使用して捕捉され得る。ハイブリダイズされたＤＮＡにおける１個または数個のヌクレオチドのミスマッチ（例えば、５個未満）を含む変異は、ＭｕｔＳ分離を使用して単離され得る。
「参照ゲノム」は、ゲノム比較の基礎として、またはそれに対するシーケンシングリードのアラインメントのために使用される定義されたゲノムである。参照ゲノムは、特定のゲノムのサブセットまたは全体であってもよく、例えば、エクソーム配列などのゲノム配列のサブセット、または完全なゲノム配列であってもよい。
全エクソーム分析は、対象の組織から抽出された全ＲＮＡから行われ得る。対象から得られた生体組織試料は、将来の分析のために様々な形態、例えば、新鮮な組織単離物、新鮮な組織から抽出され、保存された全ＲＮＡ、新鮮な急速凍結組織、またはホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）の形態で保存され得、後者は、組織学的分析およびＲＮＡ抽出に好適であるため、試料の最も一般的な形態である。しかしながら、当業者は、ＦＦＰＥ試料は保存および取得が容易であるが、ＦＦＰＥ試料から良好な品質のｍＲＮＡを抽出することが困難であることを認識し、理解している。ほとんどの場合、パラフィンを除去し、ＲＮＡを抽出するためにカオトロピック溶液が必要である。ＲＮＡは、当業者には明らかであるように、有機溶媒での抽出、クロロホルム抽出、フェノール－クロロホルム抽出、エタノール、イソプロパノール、もしくは任意の他の低級アルコールでの沈殿によって、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーによって、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動およびアガロースゲル電気泳動を含む、電気泳動法によって、カオトロピック溶液から回収され得る。好ましくは、フェノールクロロホルム抽出を使用してカオトロピック溶液からＲＮＡが回収される。ＲＮＡ回収後、ＲＮＡは、任意選択により、さらに精製され得る。さらなる精製により、実質的に汚染ＤＮＡまたはタンパク質を含まないＲＮＡが得られる。さらなる精製は、ＲＮＡ回収のための前述の技術のいずれかによって達成され得る。ＲＮＡは、好ましくは、低級アルコール、特にエタノールまたはイソプロパノールを使用した沈殿によって精製される。沈殿は、好ましくは、沈殿を促進するグリコーゲンなどの担体の存在下で実行される。
要するに、ＲＮＡは、以下のようにパラフィン包埋組織から単離され得る。単一の５μｍのパラフィン処理した組織の切片をエッペンドルフチューブに入れ、キシレンで２回洗浄することにより脱パラフィン化する。組織を、等級付けされたアルコール（１００％、９５％、８０％、および７０％）による連続洗浄によって再水和する。得られたペレットを、０．５％のサルコシンおよび２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を有する４Ｍのグアニジンイソチオシアネート中に懸濁する。懸濁液を均質化し、次いで、約５０～約９５℃に０～６０分間加熱する。ゼロ加熱時点を、各試料についての対照として含む。酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を０．２Ｍに添加し、溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、イソプロパノールおよび１０ｍｇのグリコーゲンで沈殿させた。遠心分離（１３０００ｒｐｍ、４℃、１５分）後、ＲＮＡペレットを１ｍＬの７５％エタノールで２回洗浄し、次いで、ＲＮａｓｅを含まない水中に再懸濁する。
全ＲＮＡを、ランダム六量体を使用してｃＤＮＡに変換した。ＲＴ条件は、凍結組織について以前に記載されている通りであった（Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
がんを有する対象は、一般的に、ゲノム全体にわたって多数の変異を示す。変異は、点変異であり得、これは最も多く存在し、がんゲノム中の多数の変化したペプチドまたはタンパク質を占め得る。他の変異は、とりわけ、伸長における１つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失、遺伝子のより長い領域に影響を与えるフレームシフト変異、鎖切断および再接合による新規ＯＲＦの生成であり得る。本明細書に記載される方法では、対象のがん細胞または組織のエクソームと、参照エクソームとの比較は、がん細胞のエクソーム内の多数の点変異を捕捉するのに最適である。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ試料は、エクソーム分析のためにがんを有する対象のがん組織試料から調製される。いくつかの実施形態では、がん試料からのｃＤＮＡは、参照ｃＤＮＡ試料と比較される。いくつかの実施形態では、参照試料は、参照エクソームプローブを表す。いくつかの実施形態では、参照ｃＤＮＡは、対象からの非がん細胞または組織から調製される。
いくつかの実施形態では、がん試料エクソームと、参照エクソームとの比較は、ハイブリダイゼーションステップを介して実施される。いくつかの実施形態では、濃縮されたポリヌクレオチド配列のセットを含むポリヌクレオチドが生成され、濃縮されたポリヌクレオチド配列のセットは、がんを有する対象の腫瘍試料から濃縮される、点変異体含有ポリヌクレオチドの全エクソームセットを含み、点変異体含有ポリヌクレオチドのそれぞれは、ハイブリダイズされる対応する点変異体含有ポリヌクレオチドに対して１００％未満の配列相補性を有する参照ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションステップの後に、発現クローニングベクターにおいて、対象のがん試料からの特異的エクソームセットのクローニングが行われ、それによって、参照エクソームと比較して、がんエクソームにおいて点変異を有するがん試料エクソームのライブラリーが作製される。本明細書では、様々な選択的ハイブリダイゼーションおよびクローニング手順が企図される。これらには、サブトラクティブハイブリダイゼーション、抑制されたサブトラクティブハイブリダイゼーション、選択的ハイブリダイゼーションが含まれ、このような方法は、当業者に公知である。
本明細書に企図されるのは、がんエクソームを発現ベクターにクローニングするための鎖特異的アダプターを使用する方法である。いくつかの実施形態では、第１の鎖特異的アダプターは、がんエクソームからのｃＤＮＡ断片にライゲーションされ、第２の鎖特異的アダプターは、参照エクソームからのｃＤＮＡ断片にライゲーションされ、第１の鎖特異的アダプターは、発現のためにベクターのプラス鎖へのライゲーションのために指定される。いくつかの実施形態では、第１の鎖特異的アダプターは、ライゲーションされたｃＤＮＡを有する第１の鎖特異的アダプターが、ベクターにライゲーションされるときに、ｃＤＮＡ鎖が、プロモーターならびに発現を開始および制御する他の調節エレメントの下流に配置されるようなものであり、一方、参照エクソームにライゲーションされた第２の鎖特異的アダプターは、発現されないベクターの鎖にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、点変異含有ポリヌクレオチドのそれぞれは、点変異含有ポリヌクレオチドの５’末端、または点変異含有ポリヌクレオチドの３’末端上のアダプターを含み、参照ポリヌクレオチドのそれぞれは、参照ポリヌクレオチドの５’末端上のアダプター、または参照ポリヌクレオチドの３’末端上のアダプターを含む。
一態様では、対象のがん細胞からの変異濃縮ＤＮＡの単離およびクローニングのための短く、効率的な方法が、本明細書において企図され、開示される。この方法は、対象の生体試料から核酸を調製することと、がん変異をコードするポリヌクレオチドを濃縮し、したがって、新エピトープをコードする配列を濃縮することと、濃縮されたポリヌクレオチドをクローニングすることと、クローニングされたポリヌクレオチドを発現させて、（例えば、細菌発現系においてクローニングされたポリヌクレオチドを発現させることによって）治療目的に使用することができるペプチドを生成することと、を含む。がん変異をコードする配列において濃縮されたクローニングされたポリヌクレオチドから翻訳されたペプチドは、がん免疫療法に有用な新エピトープを保有する。発現されたペプチドは、がんまたは腫瘍に対する対象における免疫応答を活性化するために、免疫療法ワクチンなどとして使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、以下の利点を含む。
（ｉ）この方法は、がん免疫療法ワクチンとしての高い有効性のための広範な新エピトープカバレッジを有するパンエクソーム変異の生成を含み、ワクチンは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を活性化することができる。
（ｉｉ）この方法は、一般的に使用される方法よりも単純であり、手順ステップが少ない。
（ｉｉｉ）この方法は、対象からの腫瘍細胞を含む生体試料の単離から、治療用成分の調製までの時間を短縮することを対象とする。
（ｉｖ）この方法は、新エピトープコード配列を同定するが、同時に潜在的な新エピトープコード配列を濃縮するステップを低減する（好ましくは排除する）ことを対象とする。
（ｖ）この方法は、コスト効率が良い。
いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）がん細胞エクソーム由来のＤＮＡ断片を、代表的なヒトゲノムにわたる参照ＤＮＡとハイブリダイズさせるステップと、
（ｂ）ＭｕｔＳカラムを利用したミスマッチＤＮＡ捕捉ステップにおいて、ミスマッチしたＤＮＡ断片（すなわち、変異、例えば、点変異を含むＤＮＡ断片）を単離し、がん変異の濃縮されたＤＮＡ断片を得るステップと、
（ｃ）ＭｕｔＳカラムによって捕捉されたＤＮＡ断片を溶出し、クローニングするステップと、
（ｄ）クローニングされたＤＮＡを、細菌クローニングおよび発現系において発現させ、タンパク質産物を精製するステップと、を含包含する。
いくつかの実施形態では、エクソーム由来のＤＮＡは、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、エクソーム由来のＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）は、約２００ヌクレオチド長の断片に処理される。いくつかの実施形態では、エクソーム由来のＤＮＡは、ＦＦＰＥ試料から単離されたＲＮＡから得られる。いくつかの実施形態では、この方法は、鎖特異的アダプターがライゲーションされたがんエクソームと、鎖特異的アダプターがライゲーションされた参照エクソームとのハイブリダイゼーションを含む。ハイブリダイズされたヘテロ二量体ポリヌクレオチドは、がんエクソーム内の各変異に対応する少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含有するであろう。がんに関連しない天然に存在する多型の濃縮を低減させるために、参照ゲノムまたはエクソームは注意深く選択される。いくつかの実施形態では、参照エクソームは、天然に存在する多型の濃縮を防止するために最適化される。
次に、ミスマッチ特異的タンパク質などの薬剤を使用して、少なくとも１つのミスマッチしたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに結合し、同定することができる。したがって、点変異体含有ポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、ミスマッチを含有する二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合する薬剤に結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＭｕｔＳタンパク質である。ＭｕｔＳ（ミューテーターＳ）タンパク質は、原核細胞および真核細胞におけるＤＮＡ修復系において重要な役割を果たす。ＭｕｔＳタンパク質は、ミスマッチ認識および修復（ＭＭＲ）の十分に研究されたＭｕｔＨＬＳ経路の一部であるＥ．ｃｏｌｉタンパク質であり、ＭｕｔＳファミリータンパク質のホモログは、真核生物を含む多くの種において見出される。ＭｕｔＳタンパク質は、複製の間のミスマッチしたＤＮＡの認識および修復における第１のステップに関与する。ＭｕｔＳタンパク質は、ＤＮＡミスマッチを有するハイブリダイズされたＤＮＡ産物を同定し、捕捉するための有効な手段として利用され得る。ミスマッチ結合タンパク質ＭｕｔＳは、他のタンパク質または補助因子とは独立して、様々な親和性および機能を有する、すべての可能性のある単一塩基ミスマッチ、ならびに１～５塩基の挿入または欠失ループを特異的に認識し、それらに結合することができる。本明細書に記載されるプロセスでは、ハイブリダイズされたＤＮＡ断片におけるＤＮＡミスマッチは、がんエクソーム由来のＤＮＡにおける変異を表す。ＭｕｔＳタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ中の不対および誤対塩基を認識し、インビトロでの点変異の検出のために使用され得る。ＭｕｔＳのＮ末端ドメインは、ミスマッチ認識に関与し、２つのαヘリックスに囲まれた６本鎖混合ベータシートを形成する。次いで、ＭｕｔＳ結合ヘテロ二量体が、ＭｕｔＳ結合カラム内で捕捉され、溶出されて、点変異を含むがんエクソームを得ることができる。これらのポリヌクレオチドは、ワクチンを調製するための、濃縮されたポリヌクレオチドのセットを構成する。これらのポリヌクレオチドは、上記のようにがんエクソーム鎖の選択的発現のためにクローニングされて、好適な非がん対照と比較して、対象のがん組織または細胞における差次的に発現された遺伝子を含むエクソームライブラリーを得る。
いくつかの実施形態では、濃縮は、標的特異的プローブで行われる。プローブは、特異的な核酸配列であり得、これは、濃縮されたポリヌクレオチドの分離および収集を可能にするタグにコンジュゲートされ得る。タグは、親和性タグ、例えば、ビオチン、Ｈｉｓ、ＨＡ、およびその他であり得る。分離は、プローブ結合および非結合のハイブリダイズされたＤＮＡを、アフィニティーカラムなどの固定化プローブ捕捉ベッドに通過させることによって行われ得、ハイブリダイズされたプローブは、タグに結合する成分によって捕捉される。
いくつかの実施形態では、こうして濃縮されたポリヌクレオチドは、さらに修飾され、例えば、ポリボディにライゲーションされる。
いくつかの実施形態では、対象のがんエクソーム内の変異を含む濃縮されたポリヌクレオチドは、細胞特異的標的化のためにさらに修飾される。いくつかの実施形態では、対象のがんエクソーム内の変異を含む濃縮されたポリヌクレオチドは、エフェクター機能を有する、例えば、翻訳産物の免疫応答が増加した、１つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにライゲーションされる。いくつかの実施形態では、濃縮されたポリヌクレオチドは、前述のように、特殊な機能を有するポリボディにライゲーションされ得る。代表的な方法のステップは、図１４、図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄの図表示として表現される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、濃縮されたポリヌクレオチドと共転写されたポリボディに含まれる足場タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むように設計される。いくつかの実施形態では、足場タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、機能増強のためにさらに修飾され得る。
いくつかの実施形態では、ＭｕｔＳ濃縮ポリヌクレオチド断片は、前述の節に記載されるように、特異的な標的化機構を有するポリボディにクローニングされ、ライゲーションされる。いくつかの実施形態では、ポリボディは、樹状細胞（ＤＣ）を標的とする機構を含む。標的化機構は、ＤＣに対して特異的にＣｌｅｃ９Ａタンパク質を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、このように、ＭｕｔＳ濃縮ポリヌクレオチド断片を発現することから調製され、本明細書に記載されるポリボディをさらに含むワクチンは、リンパ節蓄積に対して標的化され得る。
治療方法および医薬組成物
本明細書に記載される新抗原治療薬は、がんの治療などの、治療的処置方法を含むが、これらに限定されない、様々な用途において有用である。いくつかの実施形態では、治療的処置方法は、免疫療法を含む。ある特定の実施形態では、新抗原性ペプチドは、免疫応答を活性化、促進、増加、および／もしくは増強するため、新たな標的に対して既存の免疫応答を再指示するため、腫瘍の免疫原性を増加させるため、腫瘍成長を阻害するため、腫瘍体積を低減させるため、腫瘍細胞アポトーシスを増加させるため、ならびに／または腫瘍の腫瘍形成性を低減させるために有用である。使用方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボの方法であり得る。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料から複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドを提供することと、複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドにアダプター配列を取り付け、それによって、複数の異なるアダプタータグ付き鋳型ポリヌクレオチドを形成することと、異なるアダプタータグ付き鋳型ポリヌクレオチドを増幅させることと、増幅された異なるアダプタータグ付き鋳型ポリヌクレオチドをベクターに挿入し、それによって、組換え発現構築物のライブラリーを形成することと、組換え発現構築物のライブラリーによってコードされたポリペプチドを発現させることと、発現したポリペプチドを濃縮することと、濃縮した発現ポリペプチドを対象に投与することと、を含む、治療方法である。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される新抗原性ペプチドまたはタンパク質を使用して、対象における免疫応答を活性化するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される新抗原性ペプチドを使用して、対象における免疫応答を促進するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される新抗原性ペプチドを使用して、対象における免疫応答を増加させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、新抗原性ペプチドを使用して、免疫応答を増強するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、細胞媒介性免疫を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔ細胞活性または体液性免疫を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＣＴＬまたはＴｈ活性を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＮＫ細胞活性を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔ細胞活性を増加させること、およびＮＫ細胞活性を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔ調節（Ｔｒｅｇ）細胞の抑制活性を阻害または減少させることを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は、抗原性刺激の結果である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される新抗原性ペプチドを含むポリボディを使用して、免疫応答を活性化、促進、増加、および／または増強する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、新抗原性ペプチドを腫瘍細胞に送達する新抗原性ペプチドを含むポリボディの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍細胞などの、抗原提示細胞によって内在化された新抗原性ペプチドを含むポリボディの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、抗原提示細胞によって内在化される新抗原性ペプチドを含むポリボディを含むワクチンの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、この新抗原性ペプチドは、細胞によってプロセシングされる。
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの新抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを対象に送達する本明細書に記載される新抗原性ペプチドまたはポリヌクレオチドの濃縮されたペプチドを含むワクチンの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、新抗原性ペプチドに由来する少なくとも１つの新エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子との複合体で腫瘍細胞の表面上に提示される。いくつかの実施形態では、新エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体で腫瘍細胞の表面上に提示される。いくつかの実施形態では、方法は、新抗原性ペプチドに由来する少なくとも１つの新エピトープに対する対象の免疫応答の誘導、または増強をもたらす。
いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍細胞を、少なくとも１つの新抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを腫瘍細胞に送達する本明細書に記載される新抗原性ポリペプチドを含むポリボディと接触させることを含み、ポリボディに由来する少なくとも１つの新エピトープは、腫瘍細胞の表面上に提示される。いくつかの実施形態では、新エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子との複合体で腫瘍細胞の表面上に提示される。いくつかの実施形態では、新エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体で腫瘍細胞の表面上に提示される。
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを腫瘍細胞に送達する本明細書に記載される新抗原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、新エピトープは、腫瘍細胞の表面上に提示され、腫瘍細胞に対する免疫応答が誘導される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞に対する免疫応答は、増加される。いくつかの実施形態では、新抗原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、少なくとも１つの新抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを腫瘍細胞に送達し、新エピトープは、腫瘍細胞の表面上に提示され、腫瘍成長が阻害される。
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの新抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを腫瘍細胞に送達する本明細書に記載される新抗原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、少なくとも１つの新抗原性ペプチドに由来する新エピトープは、腫瘍細胞の表面上に提示され、腫瘍細胞に対して方向付けられるＴ細胞死滅が誘導される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞に対して方向付けられるＴ細胞死滅は、増強される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞に対して方向付けられるＴ細胞死滅は、増加される。
本開示はまた、本明細書に記載されるポリボディワクチンを使用して、腫瘍の成長を阻害するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、腫瘍の成長を阻害する方法は、細胞混合物を、インビトロでポリボディワクチンと接触させることを含む。例えば、免疫細胞（例えばＴ細胞）と混合した不死化細胞株またはがん細胞株は、ポリボディワクチンが添加された培地中で培養される。いくつかの実施形態では、新抗原を含むポリボディワクチンは、腫瘍細胞の死滅を活性化する。
ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、腫瘍を有するか、または対象は、少なくとも部分的に除去された腫瘍を有していた。
いくつかの実施形態では、腫瘍の成長を阻害する方法は、既存の免疫応答を新しい標的に向け直すことを含み、対象に、治療有効量のポリボディ治療を投与することを含み、既存の免疫応答は、対象に送達される抗原性ペプチドに対してである。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、がん幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度は、ポリボディの投与によって低減される。いくつかの実施形態では、対象における腫瘍のがん幹細胞の頻度を低減させる方法であって、対象に、治療有効量のポリボディ治療を投与することを含む、方法が提供される。
さらに、いくつかの態様では、本開示は、対象における腫瘍の腫瘍形成性を低減させる方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に記載される新抗原治療を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、がん幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍の腫瘍形成性は、腫瘍中のがん幹細胞の頻度を低減させることによって低減される。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載される新抗原治療を使用することを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍中のがん幹細胞の頻度は、本明細書に記載される新抗原治療の投与によって低減される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、***腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、神経内分泌腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頸腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群から選択される腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、卵巣腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、***腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、肺腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、膵腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、黒色腫腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。
本開示は、対象におけるがんを治療するための方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に記載される新抗原治療を投与することを含む、方法をさらに提供する。
いくつかの実施形態では、がんを治療する方法は、新たな標的に対して既存の免疫応答を向け直すことを含み、この方法は、対象に、治療有効量の新抗原治療を投与することを含み、既存の免疫応答は、新抗原性ペプチドによってがん細胞に送達される抗原性ペプチドに対するものである。
本開示は、がんを治療する方法であって、対象（例えば、治療を必要とする対象）に、治療有効量の本明細書に記載される新抗原治療を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、がん性腫瘍を有する。ある特定の実施形態では、対象は、腫瘍を少なくとも部分的に除去されている。
対象は、例えば、哺乳動物、ヒト、妊娠女性、高齢成体、成体、青年、青年前、小児、幼児、乳児、新生児（ｎｅｗｂｏｒｎ）または新生児（ｎｅｏｎａｔｅ）であり得る。対象は、患者であり得る。一部の場合、対象は、ヒトであり得る。一部の場合、対象は、小児（すなわち、思春期の年齢を下回る若いヒト）であり得る。一部の場合、対象は、乳児であり得る。一部の場合、対象は、人工栄養乳児であり得る。一部の場合、対象は、臨床研究に登録された個体であり得る。一部の場合、対象は、実験動物、例えば、哺乳動物、またはげっ歯類であり得る。一部の場合、対象は、マウスであり得る。一部の場合、対象は、肥満または体重過剰の対象であり得る。
いくつかの実施形態では、対象は、１つ以上の異なるがん治療様式で以前に治療されている。いくつかの実施形態では、対象は、放射線療法、化学療法、または免疫療法のうちの１つ以上で以前に治療されている。いくつかの実施形態では、対象は、１、２、３、４、または５ラインの以前の療法で治療されている。いくつかの実施形態では、以前の療法は、細胞傷害性療法である。
ある特定の実施形態では、がんは、結腸直腸がん、膵がん、肺がん、卵巣がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、黒色腫、子宮頸がん、神経内分泌がん、膀胱がん、神経膠芽腫、および頭頸部がんからなる群から選択されるがんである。ある特定の実施形態では、がんは、膵がんである。ある特定の実施形態では、がんは、卵巣がんである。ある特定の実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。ある特定の実施形態では、がんは、乳がんである。ある特定の実施形態では、がんは、前立腺がんである。ある特定の実施形態では、がんは、肺がんである。ある特定の実施形態では、がんは、黒色腫である。いくつかの実施形態では、がんは、固形がんである。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。
いくつかの実施形態では、がんは、血液がんである。いくつかの実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、新抗原治療は、併用療法として投与される。２つ以上の治療薬剤を用いた併用療法は、異なる作用機構によって作用する薬剤を使用するが、これは必要ではない。異なる作用機構を有する薬剤を使用する併用療法は、相加効果または相乗効果を生じ得る。併用療法は、単剤療法において使用される場合よりも低い用量の各薬剤を可能にし得、それによって、毒性副作用を低減させ、および／または薬剤（複数可）の治療指数を増加させる。併用療法は、抵抗性がん細胞が発達する可能性を減少させ得る。いくつかの実施形態では、併用療法は、免疫応答に影響を与える（例えば、応答を増強または活性化する）治療薬剤、および腫瘍／がん細胞に影響を与える（例えば、阻害または死滅させる）治療薬剤を含む。
一部の場合、免疫原性医薬組成物は、さらなる薬剤とともに投与され得る。さらなる薬剤の選択は、少なくとも一部、治療されている状態に依存し得る。さらなる薬剤には、例えば、チェックポイント阻害薬剤、例えば、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＤ４０、もしくは抗ＴＩＭ３薬剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－Ｌ１、および抗ＣＤ４０、もしくは抗ＴＩＭ３抗体）；または例えば、炎症状態を治療するために使用される薬物、例えば、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、もしくはアスピリンを含む、病原体感染（例えば、ウイルス感染）に対する治療効果を有する任意の薬剤が含まれ得る。例えば、チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１ １０６、ＯＰＤＩＶＯ）、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）、およびＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）からなる群から選択されるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストであり得る。別の例として、製剤は、１つ以上の補助剤、例えば、ビタミンＣ、Ｅ、または他の抗酸化剤をさらに含有し得る。
本開示の方法は、当該技術分野で公知の任意の種類のがんを治療するために使用することができる。本開示の方法によって治療されるがんの非限定的な例には、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン抵抗性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部の扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および他の腫瘍性悪性腫瘍が含まれる。
さらに、本明細書に提供される疾患または状態は、本開示の治療方法を使用して増殖が阻害され得る、難治性または再発性の悪性腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、本開示の治療方法によって治療されるがんは、がん腫、扁平上皮がん、腺がん、肉腫、子宮内膜がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、卵管がん、原発性腹膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、肛門性器部の扁平上皮がん、黒色腫、腎細胞がん、肺がん、非小細胞肺がん、肺の扁平上皮がん、胃がん、膀胱がん、胆嚢がん、肝臓がん、甲状腺がん、喉頭がん、唾液腺がん、食道がん、頭頸部がん、膠芽腫、神経膠腫、頭頸部の扁平上皮がん、前立腺がん、膵臓がん、中皮腫、肉腫、血液がん、白血病、リンパ腫、神経腫、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって治療されるがんには、例えば、がん腫、扁平上皮がん（例えば、子宮頸管、まぶた、結膜、膣、肺、口腔、皮膚、膀胱、舌、喉頭、および食道）、および腺がん（例えば、前立腺、小腸、子宮内膜、子宮頸管、大腸、肺、膵臓、食道、直腸、子宮、胃、乳腺、および卵巣）が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって治療されるがんには、肉腫（例えば、筋原性肉腫）、白血病、神経腫、黒色腫、およびリンパ腫がさらに含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって治療されるがんは、乳がんである。いくつかの実施形態では、本開示の治療方法によって治療されるがんは、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である。いくつかの実施形態では、本開示の治療方法によって治療されるがんは、卵巣がんである。いくつかの実施形態では、本開示の治療方法によって治療されるがんは、結腸直腸がんである。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物で治療される患者または患者集団は、固形腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、黒色腫、腎細胞がん、肺がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、胆嚢がん、喉頭がん、肝臓がん、甲状腺がん、胃がん、唾液腺がん、前立腺がん、膵臓がん、またはメルケル細胞がんである。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物で治療される患者または患者集団は、血液がんを有する。いくつかの実施形態では、患者は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（「ＤＬＢＣＬ」）、ホジキンリンパ腫（「ＨＬ」）、非ホジキンリンパ腫（「ＮＨＬ」）、濾胞性リンパ腫（「ＦＬ」）、急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）、または多発性骨髄腫（「ＭＭ」）などの血液がんを有する。いくつかの実施形態では、がんを有する治療される患者または患者集団は、卵巣がん、肺がん、および黒色腫からなる群から選択される。
本開示に従って予防および／または治療され得るがんの特定の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：腎がん、腎臓がん、多形性神経膠芽細胞腫、転移性乳がん；乳がん、***肉腫；神経線維腫；神経線維腫症；小児腫瘍；神経芽細胞腫；悪性黒色腫；表皮のがん腫；白血病、例えば、限定されないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病性白血病および骨髄異形成症候群、慢性白血病、例えば、限定されないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病；真性赤血球増加症；リンパ腫、例えば、限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、例えば、限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外形質細胞腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症；良性の単クローン性高ガンマグロブリン血症；重鎖病；骨がんおよび結合組織の肉腫、例えば、限定されないが、骨の肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、コレステリン腫誘発性骨肉腫、骨パジェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）（血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ））、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫；脳腫瘍、例えば、限定されないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍（ｎｏｎｇｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ）、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、および原発性脳リンパ腫；腺がん、小葉（小細胞）がん、腺管内がん、髄様乳がん、粘液性乳がん、管状乳がん、乳頭状乳がん、パジェット病（若年性パジェット病を含む）、および炎症性乳がんを含むが、これらに限定されない、乳がん；副腎がん、例えば、限定されないが、褐色細胞腫および副腎皮質がん；甲状腺がん、例えば、限定されないが、甲状腺乳頭がんまたは濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がんおよび未分化甲状腺がん；膵臓がん、例えば、限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは島細胞腫瘍；下垂体がん、例えば、限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎｓｉｐｉｕｓ）；眼がん、例えば、限定されないが、眼の黒色腫、例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫（ｃｉｌｌｉａｒｙ ｂｏｄｙ ｍｅｌａｎｏｍａ）、ならびに網膜芽細胞腫；腟がん、例えば、扁平上皮細胞がん、腺がん、および黒色腫；外陰部がん、例えば、扁平上皮細胞がん、黒色腫、腺がん、基底細胞がん、肉腫、およびページェット病；子宮頸がん、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞がん、および腺がん；子宮がん、例えば、限定されないが、子宮内膜がんおよび子宮肉腫；卵巣がん、例えば、限定されないが、卵巣上皮がん、境界腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質性腫瘍；子宮頸がん；食道がん、例えば、限定されないが、扁平上皮がん、腺がん、腺様嚢胞がん（ａｄｅｎｏｉｄ ｃｙｃｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘表皮がん、腺扁平上皮がん、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状がん、および燕麦細胞（小細胞）がん；胃がん、例えば、限定されないが、腺がん、菌状（ｆｕｎｇａｔｉｎｇ）（ポリープ状）、潰瘍形成性、表在拡大型、びまん性拡大型（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、およびがん肉腫；結腸がん；結腸直腸がん、ＫＲＡＳ変異した結腸直腸がん；結腸がん；直腸がん；肝臓がん、例えば、限定されないが、肝細胞がんおよび肝芽腫、胆嚢がん、例えば、腺がん；胆管細胞がん、例えば、限定されないが、乳頭、結節性、およびびまん性；肺がん、例えば、ＫＲＡＳ変異した非小細胞肺がん、非小細胞肺がん、扁平上皮細胞がん（類表皮がん）、腺がん、大細胞がんおよび小細胞肺がん；肺がん；精巣がん、例えば、限定されないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、***細胞性、非精巣上皮腫、胎児性がん、奇形腫がん、絨毛がん（卵黄嚢腫瘍）、前立腺がん、例えば、限定されないが、アンドロゲン非依存性前立腺がん、アンドロゲン依存性前立腺がん、腺がん、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫；ペナル（ｐｅｎａｌ）がん；口腔がん、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞がん；基底がん；唾液腺がん、例えば、限定されないが、腺がん、粘表皮がん、および腺様嚢胞がん；咽頭がん、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞がん、および疣状；皮膚がん、例えば、限定されないが、基底細胞がん、扁平上皮細胞がんおよび黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子由来黒色腫、末端黒子型黒色腫；腎臓がん、例えば、限定されないが、腎細胞がん、腺がん、副腎腫、線維肉腫、移行上皮細胞がん（腎盂および／または子宮）；腎がん；ウィルムス腫瘍；膀胱がん、例えば、限定されないが、移行上皮細胞がん、扁平上皮細胞がん、腺がん、がん肉腫。さらに、がんには、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮がん、嚢胞腺がん、気管支原性がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、および乳頭腺がんが含まれる。
がんには、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、およびミュー鎖病など、良性単クローン性ガンマグロブリン血症、ならびに免疫球性アミロイドーシス、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん（例えば、転移性、ホルモン不応性前立腺がん）、膵がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織のがんなどが含まれるが、これらに限定されない。本開示によって包含される方法に適用可能ながんの型の他の非限定的な例には、ヒトの肉腫およびがん腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、結腸直腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、ヘパトーマ、胆管がん、肝臓がん、絨毛がん、精上皮腫、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、骨がん、脳腫瘍、精巣がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ球性白血病および急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、および重鎖病が含まれる。いくつかの実施形態では、その表現型が本開示の方法によって決定されるがんは、上皮がん、例えば、限定されないが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、婦人科がん、腎がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または皮膚がんである。他の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、または結腸がんである。なお他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭腎細胞がん、子宮頸がん、卵巣がん（例えば、漿液性卵巣がん）、または乳がんである。漿液性、類内膜、粘液性、明細胞、ブレンナー、または未分化型が含まれるが、これらに限定されない、上皮がんは、様々な他の方法で特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、本開示は、リンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫が含まれるが、これに限定されない、そのサブタイプの治療、診断、および／または予後において使用される。リンパ増殖性障害も増殖性疾患とみなされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬剤と、少なくとも１つのさらなる治療薬剤との組み合せは、相加的または相乗的結果を生じる。いくつかの実施形態では、併用療法は、薬剤の治療指数の増加を生じる。いくつかの実施形態では、併用療法は、さらなる治療薬剤（複数可）の治療指数の増加を生じる。いくつかの実施形態では、併用療法は、薬剤の毒性および／または副作用の減少を生じる。いくつかの実施形態では、併用療法は、さらなる治療薬剤（複数可）の毒性および／または副作用の減少を生じる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される新抗原治療を投与することに加えて、方法または治療は、少なくとも１つのさらなる治療薬剤を投与することをさらに含む。さらなる治療薬剤は、薬剤の投与の前に、それと同時に、および／またはその後に、投与され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療薬剤は、１つ、２つ、３つ、またはそれを超えるさらなる治療薬剤を含む。
本明細書に記載される新抗原治療薬剤と組み合わせて投与され得る治療薬剤には、化学療法薬剤が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、この方法または治療は、化学療法薬剤と組み合わせた、または化学療法薬剤のカクテルと組み合わせた、本明細書に記載される薬剤の投与を含む。薬剤による治療は、化学療法の投与の前に、それと同時に、またはその後に、行われ得る。併用投与には、単一の医薬製剤での、もしくは別々の製剤を使用した同時投与、またはいずれかの順序であるが、一般には、すべての活性薬剤がそれらの生物活性を同時に発揮できるような期間内での連続投与が含まれ得る。このような化学療法薬剤のための調製物および投薬スケジュールは、製造業者の使用説明書に従って使用され得るか、または当業者によって経験的に決定され得る。このような化学療法のための調製物および投薬スケジュールは、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｏｏｋ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡにも記載されている。
有用なクラスの化学療法薬剤には、例えば、抗チューブリン薬剤、アウリスタチン、ＤＮＡ副溝結合因子、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化薬剤（例えば、白金錯体、例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）および三核白金錯体ならびにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プリン代謝拮抗薬、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが含まれる。ある特定の実施形態では、第２の治療薬剤は、アルキル化薬剤、代謝拮抗薬、有糸***阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、または血管新生阻害剤である。
本開示において有用な化学療法薬剤には、アルキル化薬剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｍｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メソトレキセートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メソトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ；ラゾキサン；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。化学療法薬剤には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン薬剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ）を含む抗エストロゲンなど；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体もまた含まれる。ある特定の実施形態では、さらなる治療薬剤は、シスプラチンである。ある特定の実施形態では、さらなる治療薬剤は、カルボプラチンである。
ある特定の実施形態では、化学療法薬剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（例えば、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ）の作用を妨害する化学療法薬剤である。トポイソメラーゼ阻害剤には、ドキソルビシンＨＣｌ、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンＨＣｌ、アクチノマイシンＤ、エトポシド、トポテカンＨＣｌ、テニポシド（ＶＭ－２６）、およびイリノテカン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、イリノテカンである。
ある特定の実施形態では、化学療法薬剤は、代謝拮抗薬である。代謝拮抗薬は、正常な生化学的反応に必要な代謝物と類似の構造を有するが、細胞の１つ以上の正常機能、例えば、細胞***を妨害するのに十分に異なる化学物質である。代謝拮抗薬には、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メソトレキセートナトリウム、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン、５－アザシチジン、６メルカプトプリン、アザチオプリン、６－チオグアニン、ペントスタチン、フルダラビンホスフェート、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、さらなる治療薬剤は、ゲムシタビンである。
ある特定の実施形態では、化学療法薬剤は、チューブリンに結合する薬剤が含まれるが、これに限定されない、有糸***阻害薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、タキサンである。ある特定の実施形態では、薬剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体である。ある特定の実施形態では、薬剤は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）、ＤＨＡ－パクリタキセル、またはＰＧ－パクリタキセルである。ある特定の代替的実施形態では、有糸***阻害薬剤は、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、もしくはビンデシン、またはそれらの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、有糸***阻害薬剤は、キネシンＥｇ５の阻害剤、または***期キナーゼ、例えば、Ａｕｒｏｒａ ＡもしくはＰｌｋ１の阻害剤である。ある特定の実施形態では、さらなる治療薬剤は、パクリタキセルである。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、アルブミン結合パクリタキセルである。
いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、小分子などの薬剤を含む。例えば、治療は、本開示の薬剤と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、および／またはＶＥＧＦが含まれるが、これらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する阻害剤として作用する小分子との併用投与を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の薬剤は、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、ラパタニブ（ｌａｐａｔａｎｉｂ）、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ）、ＡＥＥ７８８、ＣＩ－１０３３、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ）、およびパゾパニブ（ＧＷ７８６０３４Ｂ）からなる群から選択されるタンパク質キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む。別の実施形態では、さらなる治療薬剤は、Ｔｒｅｇ細胞の数を低減させる化学療法または他の阻害剤である。ある特定の実施形態では、治療薬剤は、シクロホスファミドまたは抗ＣＴＬＡ４抗体である。別の実施形態では、さらなる治療は、骨髄由来サプレッサー細胞の存在を低減させる。さらなる実施形態では、さらなる治療は、カルボタキソール（ｃａｒｂｏｔａｘｏｌ）である。別の実施形態では、さらなる治療薬剤は、細胞を、Ｔヘルパー１応答にシフトさせる。さらなる実施形態では、さらなる治療薬剤は、イブルチニブである。
いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、抗体などの生体分子を含む。例えば、治療は、本開示の薬剤と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、および／またはＶＥＧＦに結合する抗体が含まれるが、これらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する抗体との併用投与を含み得る。ある特定の実施形態では、さらなる治療薬剤は、がん幹細胞マーカーに対して特異的な抗体である。ある特定の実施形態では、さらなる治療薬剤は、血管新生阻害剤である抗体（例えば、抗ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体抗体）である。ある特定の実施形態では、さらなる治療薬剤は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラムシルマブ、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）、ニモツズマブ、ザルツムマブ、またはセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）である。
本明細書で提供される薬剤および組成物は、単独で、または従来の治療レジメン、例えば、手術、照射、化学療法および／もしくは骨髄移植（自家、同系、同種異系または無関係）と組み合わせて使用され得る。腫瘍抗原のセットは、例えば、大きい割合のがん患者において有用であり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つ以上の化学療法薬剤が、免疫原性ワクチンを含む組成物に加えて投与され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の化学療法薬剤は、異なるクラスの化学療法薬剤に属し得る。
化学療法薬剤の例には、アルキル化薬剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、クロラムブシル、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、イホスファミド、およびメルファラン）；ニトロソウレア（例えば、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチルウレア、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン、およびセムスチン）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）；テトラジン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ミトゾロミドおよびテモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）））；アジリジン（例えば、チオテパ、マイトマイシンおよびジアジコン）；ならびに白金薬物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン）；非古典的アルキル化薬剤、例えば、プロカルバジンおよびアルトレタミン（ヘキサメチルメラミン）；代謝拮抗薬剤、例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン（Ａｒａ－Ｃ（登録商標））、デシタビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ネララビン、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ヒドロキシウレア、メソトレキセート、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））、ペントスタチン、チオグアニン、Ｖｉｄａｚａ；抗微小管薬剤、例えば、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンおよびビンフルニン）；タキサン（例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）））；ポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；エポチロン（例えば、イクサベピロン（Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標）））；エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））；抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、エピルビシン、イダルビシン）；アクチノマイシン－Ｄ；ならびにブレオマイシン；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン（ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、ミトキサントロン、ノボビオシン、メルバロンおよびアクラルビシン；コルチコステロイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン（Ｓｏｌｕｍｅｄｒｏｌ（登録商標））、およびデキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））；Ｌ－アスパラギナーゼ；ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；免疫療法薬剤、例えば、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、サリドマイド、レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））、ＢＣＧ、インターロイキン－２、インターフェロン－アルファおよびがんワクチン、例えば、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）；ホルモン治療薬剤、例えば、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））、タモキシフェン、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ（登録商標））、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、酢酸メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ（登録商標））、エストロゲン、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、ニルタミド（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（登録商標））、リュープロリド（Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標））およびゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））；分化薬剤、例えば、レチノイド、トレチノイン（ＡＴＲＡまたはＡｔｒａｌｉｎ（登録商標））、ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（登録商標））および三酸化ヒ素（Ａｒｓｅｎｏｘ（登録商標））；ならびに標的化治療薬剤、例えば、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））およびスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、化学療法は、カクテル療法である。カクテル療法の例には、ＣＨＯＰ／Ｒ－ＣＨＯＰ（リツキサン、シクロホスファミド、ヒドロキシドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＥＰＯＣＨ（エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ヒドロキシドキソルビシン）、Ｈｙｐｅｒ－ＣＶＡＤ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、ヒドロキシドキソルビシン、デキサメタゾン）、ＦＯＬＦＯＸ（フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ロイコボリン、オキサリプラチン）、ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）、ＤＨＡＰ（高用量シタラビン［ａｒａ－Ｃ］、デキサメタゾン、シスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、シタラビン［ａｒａ－Ｃ］、シスプラチン）およびＣＭＦ（シクロホスファミド、メソトレキセート、フルオロウラシル）が含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、さらなる治療薬剤は、第２の免疫療法薬剤を含む。いくつかの実施形態では、さらなる免疫療法薬剤には、コロニー刺激因子、インターロイキン、免疫抑制機能を遮断する抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体）、免疫細胞機能を増強する抗体（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ－４０抗体、抗ＣＤ４０抗体、または抗４－１ＢＢ抗体）、ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ３ ＴＬＲ７、ＴＬＲ９）、可溶性リガンド（例えば、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬ－Ｆｃ、ＯＸ－４０Ｌ、ＯＸ－４０Ｌ－Ｆｃ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ－Ｆｃ、４－１ＢＢリガンド、または４－１ＢＢリガンド－Ｆｃ）、またはＢ７ファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、さらなる免疫療法薬剤は、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＯＸ－４０、ＣＤ－４０、または４ー１ＢＢを標的化する。
いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗４－１ＢＢ抗体、または抗ＯＸ－４０抗体である。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、抗ＴＩＧＩＴ抗体である。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピディリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＧＢ－Ａ３１７、およびＰＤＲ００１からなる群から選択される抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、ＢＭＳ９３５５５９（ＭＤＸ－１１０５）、アテキソリズマブ（ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）からなる群から選択される抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）およびトレメリムマブからなる群から選択される抗ＣＴＬＡ－４抗体である。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、ＢＭＳ－９８６０１６およびＬＡＧ５２５からなる群から選択される抗ＬＡＧ－３抗体である。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ０５６２、およびＭＯＸＲ０９１６からなる群から選択される抗ＯＸ－４０抗体である。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬剤は、ＰＦ－０５０８２５６６からなる群から選択される抗４－１ＢＢ抗体である。
いくつかの実施形態では、新抗原治療は、ＦＬＴ３リガンド、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＧＤＦ９、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＤＧＦ、トロンボポエチン、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ガンマ－ＩＦＮ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）もしくは免疫抑制性マクロファージ集団を低減させる薬剤からなる群から選択される生体分子と組み合わせて投与され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される新抗原治療による治療には、腫瘍の外科的除去、がん細胞の除去、または治療する医師が必要と考える任意の他の外科的療法が伴い得る。
ある特定の実施形態では、治療は、放射線療法と組み合わせた、本明細書に記載される新抗原治療の投与を含む。薬剤による治療は、放射線療法の投与の前に、それと同時に、またはその後に、行われ得る。このような放射線療法のための投薬スケジュールは、熟練の医師によって決定され得る。
併用投与には、単一の医薬製剤での、もしくは別々の製剤を使用した同時投与、またはいずれかの順序であるが、一般には、すべての活性薬剤が、薬剤に応じて、それらの生物活性を同時に、もしくは連続して発揮できるような期間内での連続投与が含まれ得る。
本明細書に記載される新抗原治療と、少なくとも１つのさらなる治療薬剤との組み合わせは、任意の順序で、または同時に投与され得ることは理解されるであろう。いくつかの実施形態では、薬剤は、第２の治療薬剤による治療を以前に受けた患者に投与される。ある特定の他の実施形態では、新抗原治療および第２の治療薬剤は、実質的に一緒に、または同時に投与される。例えば、対象には、第２の治療薬剤（例えば、化学療法）による治療の過程を受けつつ、薬剤が与えられ得る。ある特定の実施形態では、新抗原治療は、第２の治療薬剤による治療の１年以内に投与される。２つの（またはそれを超える）薬剤または治療は、およそ数時間以内または数分以内に（すなわち、実質的に一緒に）対象に投与され得ることは、さらに理解されるであろう。
疾患の治療のために、本明細書に記載される新抗原治療の適切な投薬量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度および過程、疾患の応答性、薬剤が治療目的で投与されるか、予防目的で投与されるか、以前の療法、患者の臨床歴などに依存し、これらはすべて、治療する医師の自由裁量である。新抗原治療は、一度に、または数日間から数ヶ月間持続する一連の治療にわたって、または治癒がもたらされるまで、もしくは疾患状態の減少（例えば、腫瘍サイズの低減）が達成されるまで、投与され得る。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定値から計算され得、個々の薬剤の相対的な有効性に依存して変動するであろう。投与する医師は、最適な投薬量、投薬方法論、および繰り返し率を決定することができる。
いくつかの実施形態では、新抗原治療は、初期のより高い「負荷」用量で、その後、１つ以上のより低い用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、投与頻度も変化し得る。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、初期用量、その後の、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、または１ヶ月毎に１回のさらなる用量（または「維持」用量）を投与することを含み得る。例えば、投薬レジメンは、初期負荷用量、その後の、例えば、初期用量の２分の１の毎週の維持用量を投与することを含み得る。または、投薬レジメンは、初期負荷用量、その後の、例えば、隔週の、初期用量の２分の１の維持用量を投与することを含み得る。または、投薬レジメンは、３週間にわたる３回の初期用量、その後の、例えば、隔週の、同じ量の維持用量を投与することを含み得る。
当業者に公知のように、任意の治療薬剤の投与は、副作用および／または毒性をもたらし得る。一部の場合、副作用および／または毒性は、治療有効用量での特定の薬剤の投与を除外するほどに重症である。一部の場合、治療を中断すべきであり、他の薬剤が試みられ得る。しかしながら、同じ治療薬クラス中の多くの薬剤は、類似の副作用および／または毒性を示し、これは、患者が、治療を停止しなければならない、または可能な場合、治療薬剤と関連する不快な副作用に悩まざるを得ないかのいずれかであることを意味する。
いくつかの実施形態では、投薬スケジュールは、特定の数の投与または「サイクル」に限定され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、３、４、５、６、７、８、またはそれを超えるサイクルにわたって投与される。例えば、薬剤は、６サイクルにわたって２週間毎に投与され、薬剤は、６サイクルにわたって３週間毎に投与され、薬剤は、４サイクルにわたって２週間毎に投与され、薬剤は、４サイクルにわたって３週間毎に投与される、などである。投薬スケジュールは、当業者によって決定され得、引き続いて改変され得る。
本開示は、対象に、本明細書に記載される新抗原治療を投与する方法であって、薬剤、化学療法薬剤などの投与と関連する副作用および／または毒性を低減させ得る、１つ以上の薬剤を投与するために間欠的な投薬戦略を使用することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象におけるがんを治療するための方法は、対象に、治療有効用量の化学療法薬剤と組み合わせて、治療有効用量の新抗原治療を投与することを含み、これらの薬剤の一方または両方は、間欠的な投薬戦略に従って投与される。いくつかの実施形態では、ヒト対象におけるがんを治療するための方法は、対象に、治療有効用量の第２の免疫療法薬剤と組み合わせて、治療有効用量の新抗原治療を投与することを含み、これらの薬剤の一方または両方は、間欠的な投薬戦略に従って投与される。いくつかの実施形態では、間欠的な投薬戦略は、対象に、初期用量の新抗原治療を投与すること、および２週間毎に約１回の引き続く用量の薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、間欠的な投薬戦略は、対象に、初期用量の新抗原治療を投与すること、および３週間毎に約１回の引き続く用量の薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、間欠的な投薬戦略は、対象に、初期用量の新抗原治療を投与すること、および４週間毎に約１回の引き続く用量の薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、間欠的な投薬戦略を使用して投与され、さらなる治療薬剤は、毎週投与される。
本開示は、本明細書に記載される新抗原治療を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に記載される新抗原治療および薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物もまた提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、免疫療法において用途を見出す。いくつかの実施形態では、組成物は、腫瘍成長を阻害することにおいて用途を見出す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象（例えば、ヒト患者）において腫瘍成長を阻害することにおいて用途を見出す。いくつかの実施形態では、組成物は、がんを治療することにおいて用途を見出す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象（例えば、ヒト患者）においてがんを治療することにおいて用途を見出す。
製剤は、本開示の新抗原治療を、薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体または賦形剤）と組み合わせることによって、貯蔵および使用のために調製される。当業者は、一般に、薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または安定剤を、製剤または医薬組成物の不活性成分とみなす。例示的な製剤は、国際公開第２０１５／０９５８１１号に列挙されている。
好適な薬学的に許容されるビヒクルには、非毒性緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；塩、例えば、塩化ナトリウム；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾール；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０アミノ酸残基未満）；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；炭水化物、例えば、単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート薬剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体、例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体；ならびに非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ．）。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、水中５％のデキストロースである。
本明細書に記載される医薬組成物は、局所または全身性のいずれかの治療のためにいくつもの方法で投与され得る。投与は、表皮もしくは経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、スプレー、液体および粉末による外用；ネブライザー、気管内、および鼻腔内によるものを含む、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくはガス注入による肺；経口；または静脈内、動脈内、腫瘍内、皮下、腹腔内、筋肉内（例えば、注射または注入）、もしくは頭蓋内（例えば、くも膜下腔内または脳室内）を含む非経口であり得る。
治療製剤は、単位投薬形態であり得る。このような製剤には、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、水もしくは非水性媒体中の溶液もしくは懸濁物、または坐剤が含まれる。
本明細書に記載される新抗原性ペプチドはまた、マイクロカプセル中に封入され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎに記載されているように、このようなマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルション中の、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製される。
ある特定の実施形態では、医薬製剤は、リポソームと複合体化した本明細書に記載される新抗原治療を含む。リポソームを産生するための方法は、当業者に公知である。例えば、一部のリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために、規定された孔径のフィルターを介して押し出され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される新抗原性ペプチドを含む徐放性調製物が産生され得る。徐放性調製物の好適な例には、薬剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸と７エチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成された注射可能なミクロスフェア）、イソ酪酸酢酸スクロース、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が含まれる。
本開示は、免疫原性ワクチンを含む治療方法を提供する。疾患（例えば、がんまたはウイルス感染）に対する治療方法が提供される。方法は、対象に、免疫原性抗原を含む組成物の有効量を投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、抗原は、ウイルス抗原を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原を含む。
調製され得るワクチンの非限定的な例には、ペプチドベースのワクチン、核酸ベースのワクチン、抗体ベースのワクチン、Ｔ細胞ベースのワクチンおよび抗原提示細胞ベースのワクチンが含まれる。
ワクチン組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性薬剤の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理的に許容される担体を使用して製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存し得る。周知の技術、担体、および賦形剤のいずれかが、当該技術分野において好適であり、理解されるように使用され得る。
一部の場合、ワクチン組成物は、ペプチドベースのワクチン、タンパク質ベースのワクチン、核酸ベースのワクチン、抗体ベースのワクチン、または細胞ベースのワクチンとして製剤化される。例えば、ワクチン組成物には、カチオン性脂質製剤中の裸のｃＤＮＡ；例えば、ポリ（ＤＬ－ラクチド－コ－グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフェア中に封入された、リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、裸のｃＤＮＡまたはペプチド（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７－２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９－３０６，１９９４、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５－６８１，１９９５を参照されたい）；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）中に含まれるペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３－８７５，１９９０、Ｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５－２４３，１９９８）；または多抗原ペプチドシステム（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９－５４１３，１９８８、Ｔａｒｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７－３２，１９９６を参照されたい）が含まれ得る。場合によっては、ワクチンは、ペプチドベースのワクチン、または核酸がポリペプチドをコードする核酸ベースのワクチンとして製剤化される。場合によっては、ワクチンは、抗体ベースのワクチンとして製剤化される。場合によっては、ワクチンは、細胞ベースのワクチンとして製剤化される。
同定された疾患特異的免疫原性新抗原ペプチドのアミノ酸配列は、薬学的に許容される組成物を開発するために使用され得る。抗原の供給源は、糖タンパク質、ペプチド、およびスーパー抗原を含む、天然または合成タンパク質；抗体／抗原複合体；リポタンパク質；ＲＮＡまたはその翻訳産物；ならびにＤＮＡまたはＤＮＡによってコードされたポリペプチドであり得るが、これらに限定されない。抗原の供給源は、形質転換されていない、形質転換された、トランスフェクトされた、または形質導入された細胞または細胞株もまた含み得る。細胞は、組換え抗原を発現させるために利用され得る、当業者に公知の様々な発現ベクターまたはレトロウイルスベクターのいずれかを使用して、形質転換、トランスフェクト、または形質導入され得る。発現はまた、組換え抗原（複数可）をコードするＤＮＡ分子を含有する発現ベクターまたはレトロウイルスベクターで形質転換、トランスフェクト、または形質導入された任意の適切な宿主細胞においても達成され得る。当業者に公知のいくつものトランスフェクション、形質転換、および形質導入プロトコルが使用され得る。組換えワクシニアベクターおよびワクシニアベクターに感染した細胞が、抗原の供給源として使用され得る。
組成物は、合成疾患特異的免疫原性新抗原ペプチドを含み得る。組成物は、２つ以上の疾患特異的免疫原性新抗原ペプチドを含み得る。組成物は、疾患特異的免疫原性ペプチドの前駆体（例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を含み得る。疾患特異的免疫原性ペプチドの前駆体は、同定された疾患特異的免疫原性新抗原ペプチドを生成し得るか、またはそれに対して生成され得る。いくつかの実施形態では、治療組成物は、免疫原性ペプチドの前駆体を含む。疾患特異的免疫原性ペプチドの前駆体は、プロドラッグであり得る。いくつかの実施形態では、疾患特異的免疫原性新抗原ペプチドを含む組成物は、アジュバントをさらに含み得る。例えば、新抗原ペプチドは、ワクチンとして利用され得る。いくつかの実施形態では、免疫原性ワクチンは、薬学的に許容される免疫原性新抗原ペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原性ワクチンは、免疫原性新抗原ペプチドに対する薬学的に許容される前駆体（例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、治療方法は、対象に、免疫原性新抗原ペプチドを特異的に認識する抗体の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療方法は、対象に、免疫原性新抗原ペプチドを特異的に認識する可溶性ＴＣＲまたはＴＣＲ類似体の有効量を投与することを含む。
本明細書に記載される方法は、同じ個体のための治療薬（例えば、ワクチンまたは治療的抗体）を開発するために免疫原性新抗原ペプチドが使用される、個別化された医薬の状況において特に有用である。したがって、対象における疾患を治療する方法は、本明細書に記載される方法に従って、対象における免疫原性新抗原ペプチドを同定することと、ペプチド（またはその前駆体）を合成することと、対象に、ペプチドまたはペプチドを特異的に認識する抗体を投与することと、を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原性新抗原の発現パターンは、患者特異的ワクチンの生成のための不可欠な基礎として機能し得る。いくつかの実施形態では、免疫原性新抗原の発現パターンは、特定の疾患を有する患者の群のためのワクチンの生成のための不可欠な基礎として機能し得る。したがって、特定の疾患、例えば、特定の型の腫瘍が、患者群において選択的に治療され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、大きい患者群中の、自己抗疾患Ｔ細胞によって認識され得る構造的に正常な抗原である。いくつかの実施形態では、疾患が構造的に正常な新抗原を発現する疾患対象の群の抗原発現パターンが決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、タンパク質の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の新エピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、変異を含み、第２の新エピトープは、同じ変異を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、タンパク質の第１の領域の第１の新エピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の領域の第２の新エピトープを含む第２のペプチドと、を含み、第１の領域は、第２の領域のうちの少なくとも１つのアミノ酸を含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１の新エピトープは、第１の変異を含み、第２の新エピトープは、第２の変異を含む。いくつかの実施形態では、第１の変異および第２の変異は、同じである。いくつかの実施形態では、変異は、点変異、スプライス部位変異、フレームシフト変異、リードスルー変異、遺伝子融合変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
免疫原性新抗原を産生するための様々な方法が存在する。タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を介したタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、天然の供給源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、インビトロ翻訳、またはタンパク質もしくはペプチドの化学的合成を含む、当業者に公知の任意の技術によって作製され得る。一般に、このような疾患特異的新抗原は、インビトロまたはインビボのいずれかで産生され得る。免疫原性新抗原は、次いで、個別化されたワクチンまたは免疫原性組成物に製剤化され得、対象に投与され得る、ペプチドまたはポリペプチドとして、インビトロで産生され得る。免疫原性新抗原のインビトロ産生は、ペプチド合成、または様々な細菌、真核生物、もしくはウイルス組換え発現系のいずれかにおけるＤＮＡもしくはＲＮＡ分子からのペプチド／ポリペプチドの発現、その後の、発現されたペプチド／ポリペプチドの精製を含み得る。あるいは、免疫原性新抗原は、免疫原性新抗原をコードする分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびウイルス発現系）を対象に導入することによってインビボで産生され得、その際に、コードされた免疫原性新抗原が発現される。いくつかの実施形態では、免疫原性新抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、新抗原ペプチドをインビトロで産生するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、免疫原性新抗原をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖および／もしくは二本鎖、ネイティブもしくは安定化された形態のポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであり得る。免疫原性新抗原ペプチドをコードする核酸は、それがペプチドをコードする限り、イントロンを含有していてもよいか、または含有していなくてもよい。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳が、ペプチドを産生するために使用される。
新抗原をコードする核酸を含む発現ベクター、ならびに発現ベクターを含有する宿主細胞もまた企図される。本開示における使用のために好適な発現ベクターは、核酸配列に操作的に連結された少なくとも１つの発現制御エレメントを含み得る。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御および調節するために、ベクターに挿入される。発現制御エレメントの例は、当該技術分野で周知であり、例えば、ｌａｃシステム、ファージラムダのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母プロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスまたはＳＶ４０に由来するプロモーターが含まれる。さらなる操作的なエレメントには、リーダー配列、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに宿主系における核酸配列の適切な転写および引き続く翻訳にとって必要な、またはそのために好ましい任意の他の配列が含まれるが、これらに限定されない。発現制御エレメントの正確な組み合わせが、選択される宿主系に依存することは、当業者によって理解されるであろう。さらに、発現ベクターは、宿主系における核酸配列を含有する発現ベクターの移入および引き続く複製にとって必要なさらなるエレメントを含有するべきであることが理解されるであろう。このようなエレメントの例には、複製起点および選択可能マーカーが含まれるが、これらに限定されない。
新抗原ペプチドは、所望の新抗原ペプチドをコードするＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子の形態で提供され得る。本開示の１つ以上の新抗原ペプチドは、単一の発現ベクターによってコードされ得る。一般に、ＤＮＡは、発現のために適切な配向および正確なリーディングフレームで、プラスミドなどの発現ベクター中に挿入され、必要に応じて、ＤＮＡは、所望の宿主（例えば、細菌）によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結され得るが、このような制御は、一般に、発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、ベクターは、標準的な技術を使用するクローニングのために、宿主細菌中に導入される。真核生物宿主、特に哺乳動物またはヒトのための有用な発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌宿主についての有用な発現ベクターには、ｐＣＲ １、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドなどの公知の細菌プラスミド、Ｍ１３および線維状一本鎖ＤＮＡファージなどの、より広い宿主の範囲のプラスミドが含まれる。
実施形態では、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用した化学的合成によって構築され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計することができ、目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好ましいコドンを選択することができる。標準的な方法を適用して、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成することができる。
ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下で原核生物、酵母、昆虫または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは桿菌が含まれる。高等真核細胞には、哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系もまた、利用され得る。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主との使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、当該技術分野において周知である。様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系が、組換えタンパク質を発現させるために利用され得る。例示的な哺乳動物宿主細胞系には、ＣＯＳ－７、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、２９３、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現される遺伝子に連結した好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の５’または３’の隣接非転写配列、ならびに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位などの５’または３’の非翻訳配列、ならびに転写終結配列を含み得る。
形質転換された宿主によって産生されたタンパク質は、任意の適切な方法に従って精製され得る。このような標準的な方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーおよびサイジングカラムクロマトグラフィーなど）、遠心分離、示差的溶解度、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によるものが含まれる。親和性タグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼなどが、適切なアフィニティーカラムを通過させることによる容易な精製を可能にするために、タンパク質に取り付けられ得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴およびＸ線結晶解析などの技術を使用して、物理的に特徴付けられ得る。さらに、免疫原またはその断片に特異的に結合することができる、特異的抗体もしくはその断片、または他の結合ドメインが使用され得る。
ワクチンは、本明細書に記載されるポリペプチド配列に結合する実体を含み得る。実体は、抗体であり得る。抗体ベースのワクチンは、当該技術分野で適切であり、理解されるように、周知の技術、担体、および賦形剤のいずれかを使用して製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、新抗原特異的治療薬、例えば、抗体治療薬を作製するために使用され得る。例えば、新抗原は、新抗原を特異的に認識する抗体を生じさせるため、および／または同定するために使用され得る。これらの抗体は、治療薬として使用され得る。抗体は、天然の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体であり得るか、または抗体断片であり得る。抗体は、本明細書に記載されるポリペプチドのうち１つ以上を認識し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるポリペプチドに対して、最大でも４０％、５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチドを認識し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるポリペプチドに対して、少なくとも４０％、５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチドを認識し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるポリペプチドの長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるポリペプチド配列を認識し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるポリペプチドの長さの最大でも３０％、４０％、５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるポリペプチド配列を認識し得る。
本開示はまた、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡワクチンの形態で、新抗原ペプチド／ポリペプチドを、それを必要とする対象に、インビボで送達するためのビヒクルとしての核酸分子の使用も企図する。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、核酸ワクチンである。いくつかの実施形態では、新抗原は、プラスミドの使用によって対象に投与され得る。プラスミドは、いくつかの異なる方法、例えば、注射、または粘膜表面、例えば、鼻および肺粘膜上での裸のＤＮＡのエアロゾル滴下注入によって、動物組織中に導入され得る。いくつかの実施形態では、例えば「遺伝子銃」による物理的送達が使用され得る。発現ベクターの正確な選択は、発現されるペプチド／ポリペプチドに依存し得、当業者の技術範囲内に十分に入る。
いくつかの実施形態では、核酸は、免疫原性ペプチドまたはペプチド前駆体をコードする。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、免疫原性ペプチドまたはペプチド前駆体をコードする配列に隣接する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、１つよりも多くの免疫原性エピトープを含む。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、ＤＮＡベースのワクチンである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、ＲＮＡベースのワクチンである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡベースのワクチンは、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡベースのワクチンは、裸のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡベースのワクチンは、修飾ｍＲＮＡ（例えば、プロタミンを使用して分解から保護されたｍＲＮＡ．修飾５’ＣＡＰ構造を含有するｍＲＮＡ、または修飾ヌクレオチドを含有するｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡベースのワクチンは、一本鎖ｍＲＮＡを含む。
ポリヌクレオチドは、実質的に純粋であり得るか、または好適なベクターもしくは送達系中に含まれ得る。好適なベクターおよび送達系には、ウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または１つより多いウイルスのエレメントを含有するハイブリッドに基づく系が含まれる。非ウイルス送達系には、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマー（例えば、カチオン性リポソーム）が含まれる。
１つ以上の新抗原ペプチドは、ウイルスベースの系を使用してコードされ得、インビボで発現され得る。ウイルスベクターは、本開示において組換えベクターとして使用され得、ウイルスゲノムの一部分は、ウイルスの感染力を破壊することなしに新たな遺伝子を導入するために欠失される。本開示のウイルスベクターは、非病原性ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、哺乳動物中の特定の細胞型に対するトロピズムを有する。別の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、プロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、樹状細胞およびマクロファージに感染することができる。本開示のさらに別の実施形態では、ウイルスベクターは、哺乳動物中の任意の細胞に感染することができる。ウイルスベクターはまた、腫瘍細胞にも感染し得る。本開示において使用されるウイルスベクターには、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、鶏痘ウイルスおよび高度に弱毒化されたワクシニアウイルス（ＡｎｋａｒａまたはＭＶＡ）、レトロウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。
ワクチンは、様々な経路を介して送達され得る。送達経路には、経口（頬側および舌下を含む）、直腸、経鼻、外用、経皮パッチ、肺、腟、坐剤、もしくは非経口（筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、真皮内、腹腔内、皮下および静脈内を含む）投与、またはエアロゾル化、吸入もしくはガス注入による投与のために好適な形態のものが含まれ得る。薬物送達系に関する一般情報は、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ．（１９９９）において見出すことができる。本明細書に記載されるワクチンは、筋肉に投与され得るか、あるいは真皮内もしくは皮下注射を介して、または例えばイオン導入によって経皮的に投与され得る。ワクチンの表皮投与が利用され得る。
一部の場合、ワクチンはまた、経鼻経路を介した投与のために製剤化され得る。担体が固体である、経鼻投与のために好適な製剤には、嗅がれる様式で、すなわち、鼻に近づけて維持した粉末の容器からの経鼻経路を介した迅速な吸入によって投与される、例えば、約１０～約５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗い粉末が含まれ得る。製剤は、経鼻スプレー、点鼻薬であり得るか、またはネブライザーによるエアロゾル投与によるものであり得る。製剤には、ワクチンの水性または油性溶液が含まれ得る。
ワクチンは、液体調製物、例えば、懸濁物、シロップまたはエリキシル剤であり得る。ワクチンはまた、非経口、皮下、真皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注射可能な投与）のための調製物、例えば、無菌懸濁物またはエマルションであり得る。
ワクチンは、単回の免疫化のための材料を含み得るか、または複数回の免疫化のための材料を含み得る（すなわち、「多用量」キット）。防腐剤の内包が、多用量配置において好ましい。多用量組成物中に防腐剤を含めることの代替法として（またはそれに加えて）、組成物は、材料の取り出しのための無菌的アダプターを有する容器中に含まれ得る。
ワクチンは、約０．５ｍＬの投薬体積で投与され得るが、半分の用量（すなわち、約０．２５ｍＬ）が小児に投与され得る。場合によっては、ワクチンは、より高い用量、例えば、約１ｍｌで投与され得る。
ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える用量過程レジメンとして投与され得る。場合によっては、ワクチンは、１、２、３または４用量過程レジメンとして投与される。場合によっては、ワクチンは、１用量過程レジメンとして投与される。場合によっては、ワクチンは、２用量過程レジメンとして投与される。
第１の用量および第２の用量の投与は、約０日、１日、２日、５日、７日、１４日、２１日、３０日、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、１．５年、２年、３年、４年、またはそれよりも長く、分離され得る。
本明細書に記載されるワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも長い年数毎に投与され得る。場合によっては、本明細書に記載されるワクチンは、２、３、４、５、６、７、またはそれよりも長い年数毎に投与される。場合によっては、明細書に記載されるワクチンは、４、５、６、７、またはそれよりも長い年数毎に投与される。場合によっては、本明細書に記載されるワクチンは、１回投与される。
投薬量の例は、限定的ではなく、本明細書に記載されるワクチンを投与するための特定の投薬レジメンを例示するためにのみ使用される。ヒトにおける使用のための有効量は、動物モデルから決定され得る。例えば、ヒトのための用量は、動物において有効であることが見出された、循環、肝臓、外用および／または胃腸濃度を達成するように製剤化され得る。動物データおよび他の型の類似のデータに基づいて、当業者は、ヒトに適切なワクチン組成物の有効量を決定できる。
有効量は、薬剤または薬剤の組み合わせに言及する場合、医療分野もしくは医薬品分野の様々な規制機関もしくは諮問機関のいずれか（例えば、ＦＤＡ、ＡＭＡ）によって、または製造業者もしくは供給業者によって推奨または承認された用量範囲、投与様式、製剤などを、一般に意味する。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるワクチンおよびキットは、２℃～８℃で保存され得る。いくつかの場合では、ワクチンは、凍結されて保存されない。いくつかの場合では、ワクチンは、例えば、－２０℃または－８０℃の温度で保存される。いくつかの場合では、ワクチンは、日光を避けて保存される。
キット
本明細書に記載される新抗原治療は、投与のための使用説明書と一緒に、キット形態で提供され得る。典型的には、キットは、容器中の単位投薬形態の所望の新抗原治療、および投与のための使用説明書を含む。さらなる治療薬、例えば、サイトカイン、リンホカイン、チェックポイント阻害剤、抗体もまた、キット中に含められ得る。また、望まれ得る他のキット構成要素には、例えば、無菌シリンジ、ブースター投薬量、および他の所望の賦形剤が含まれる。
キットおよび製造品はまた、本明細書に記載される１つ以上の方法との使用のために、本明細書で提供される。キットは、１つ以上の新エピトープを含む１つ以上の新抗原性ポリペプチドを含有し得る。キットはまた、本明細書に記載されるペプチドもしくはタンパク質のうちの１つ以上をコードする核酸、本明細書に記載されるペプチドのうちの１つ以上を認識する抗体、または本明細書に記載されるペプチドのうちの１つ以上で活性化されたＡＰＣベースの細胞も含有し得る。キットは、ワクチンの構成および送達のために必要なアジュバント、試薬、および緩衝液をさらに含有し得る。
キットはまた、１つ以上の容器、例えば、バイアル、チューブなどを受けるように区画化された担体、包装、または容器も含み得、容器（複数可）の各々は、本明細書に記載される方法において使用される、別々のエレメント、例えば、ペプチドおよびアジュバントのうちの１つを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラスまたはプラスチックから形成され得る。
本明細書で提供される製造品は、包装材料を含む。医薬品包装材料の例には、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択された製剤ならびに意図した投与および治療の様式のために好適な任意の包装材料が含まれるが、これらに限定されない。キットは、典型的には、内容物を列挙するラベルおよび／または使用のための使用説明書、ならびに使用のための使用説明書を有する添付文書を含む。使用説明書のセットもまた、典型的には含められる。
本開示は、具体的な例によってさらに詳細に記載される。以下の実施例は、例示目的のために提供され、本開示を決して限定しない意図である。当業者は、本開示に従う代替的な実施形態を得るために変化または修飾され得る様々な重要でないパラメータを容易に認識する。本明細書で列挙されるすべての特許、特許出願、および印刷された公報は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
これらの実施例は、例示的な目的のためにのみ提供され、本明細書に提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
実施例１－ポリボディ設計
１．１．足場ドメインについての選択基準
マルチドメインポリボディを設計するのに好適な足場ドメインを同定するために、一部の場合、いくつかの選択基準を考慮することができる（図４）。いくつかの実施形態では、望ましくない免疫応答のリスクを最小限に抑えることが望ましく、これらの状況において、非免疫原性であることが知られている内因性ヒトタンパク質／タンパク質ドメインまたは異種タンパク質が好ましい。いくつかの実施形態では、これらの足場は酵素活性を有さず、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉなど）または個別化されたがん免疫療法のためのインビトロ翻訳系における迅速かつコスト効率の良い産生を可能にする。いくつかの実施形態では、細菌または酵母または他の宿主細胞発現系において高い発現を有する足場ドメインが考慮される。いくつかの実施形態では、構造的および生化学的に特徴付けられた足場、ならびにワクチンとして使用されるときに毒性を有しない足場が考慮される。いくつかの実施形態では、足場ドメインは、フォールディングを補正するための翻訳後修飾を必要としない。いくつかの実施形態では、足場ドメインは、ジスルフィド結合形成を必要としない。第２世代のポリボディの生成のために、一部の場合、操作機能を可能にする足場ドメインが考慮される。一部の場合、これらのドメインを使用して、分子標的に対する結合剤（アゴニストおよび／またはアンタゴニスト）を選択することができ、抗体模倣物のように機能させることができる。
１．２．最も高い可溶化能力を有する足場ドメインの選択
いくつかの実施形態では、多種多様な異なるエピトープを可溶化し、担持することができるドメインが好ましい。可溶化することが難しいエピトープの有効性を試験するために、水溶液中の凝集および沈殿の傾向が強いＴ３マウス腫瘍モデルからのＡｌｇ８エピトープを用いてストレス試験を実施した。Ａｌｇ８エピトープを、異なる単量体足場ドメインにＣ末端融合させ、細菌発現系におけるそれらの可溶性発現について試験した。ほとんどすべての足場ドメインは良好に発現した。この条件下で、Ｓｔｅｆｉｎ Ａおよびタイチン－Ｉ２７ドメインを、可溶性Ａｌｇ８融合タンパク質として発現させ、Ｓｔｅｆｉｎ Ａは、より良好な可溶化能力を有した（図５Ａ～５Ｂ）。さらに、様々なペプチドを、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ足場ドメインにＣ末端融合させ、細菌発現系におけるそれらの可溶性発現について試験した。結果は、Ｓｔｅｆｉｎ Ａへの融合が、単独での合成または可溶化が困難な複数の異なるペプチドを可溶化することが可能であることを示した。図５Ｃ）。
１．３．様々なポリボディ構成の試験
ポリボディは、強力な抗腫瘍免疫を誘導するためのワクチン技術としての異なる特徴および利点を有することができる複数の構成で生成することができる。例えば、ポリボディは、リンカー領域を介して一緒に融合した複数の足場ドメインを有することができる。１つ、２つ、４つ、または６つの足場が一緒に連結されただけの構築物を生成した。複数の足場の融合は、これらの分子が、皮下注射後にリンパ系に流入するのに十分に大きく、したがって、高密度のプロフェッショナル抗原提示細胞に遭遇するリンパ節に優先的に蓄積することができるため、所望のワクチン機能であり得る、より大きな分子量を有する分子を生成する。ある特定の条件下で、タイチン－Ｉ２７およびＳｔｅｆｉｎ Ａドメインは、高い有効性でこのような多価構造において構成することができた。別の例では、エピトープは、ポリボディの各ドメイン間に、または２つのドメイン間のエピトープのストリングとして、Ｃ末端またはＮ末端に挿入することができる。一部の場合、５つのエピトープを６つの足場ドメインを有するポリボディに組み込むためのロバストな方法のうちの１つは、ポリボディの末端または中央に５つのエピトープのストリングを挿入するのではなく、２つのドメイン間に各単一のエピトープを挿入することである。
一部の場合、他の因子は、これらのポリボディを生成する能力およびワクチン技術としてのそれらの免疫原性に影響を与え得る。例えば、各足場とエピトープとの間のリンカー領域は、それらが柔軟性および溶解性を支持するように設計され得る。さらに、これらのリンカー領域は、例えば、抗原提示経路におけるペプチダーゼについての切断部位を含有することによって、または十分に提示されたエピトープの配列コンテキストを付加することによって、またはＨＬＡ－イムノペプチドーム研究からの分光測定データからのコンセンサス配列に基づいて、エピトープの効率的な切断および提示のために最適化され得る（例えば、Ａｂｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１７を参照されたい）。
実施例２－クローニングポリボディ
いくつかの実施形態では、ポリボディ構造の設計は、ストリングに沿ったビーズとしてリンカー領域を介して一緒にストリングになる、反復足場ドメインを含む。これらのドメインは、ポリボディ溶解性、安定性、および／または機能性に寄与し得、目的のエピトープを過度の望ましくない分解から保護することができる。以下のアプローチは、ポリボディの例示的な低スループットクローニングを示す。特有の制限酵素部位をリンカーの中心に有するフレキシブルリンカー領域によって区切られた６つの足場ドメイン遺伝子を含有する、マスター構築物を作製した。これらの制限酵素部位は、古典的な制限ベースのクローニングまたはＧｉｂｓｏｎアセンブリ分子クローニング技術を使用して、段階的に新エピトープＤＮＡ配列を挿入することを可能にする。
一部の場合、同一のＳｔｅｆｉｎ Ａドメインの反復を使用して、高スループット用途に必要な単一反応におけるポリボディ構築物をクローニングすることができる。一部の場合、リンカーおよび可変エピトープ配列と（５’および３’末端で）取り付けられた個々のＳｔｅｆｉｎ Ａドメインは、合成可能であり、高速クローニングアプローチを開発するために使用することができる。例えば、図６に示されるように、エピトープにおける配列差は、次のＤＮＡピース上の相補的５’配列に対してアニーリングするのではなく、その３’末端上の第２のエピトープをコードする別のＤＮＡピースの５’末端上の相補的領域に対してアニーリングするために使用される。
実施例３－免疫学的試験
３．１．リンパ節標的化
効果的なワクチン開発における主要な課題のうちの１つは、抗原提示細胞が、Ｔ細胞に遭遇し、プライミングすることができる、二次リンパ器官への抗原の送達である。例えば、皮下または皮内送達は、必ずしも、送達された構成要素の有効な生体内分布をもたらさない。強固なＴ細胞応答を効果的に引き起こすためのワクチンの場合、抗原は、リンパ節、例えば、腋窩リンパ節および鼠径部リンパ節に特異的に局在し得る。リンパ節の保持を達成するための１つの方法は、抗原の分子サイズを増加させることである。効果的なリンパ節取り込みを有するために、抗原は、大きな担体分子に融合されるか、または十分なサイズの内因性タンパク質に結合することができるように修飾され得る。融合タンパク質、ナノ粒子またはアルブミンヒッチハイキングを使用して、ワクチンリンパ節標的化を増強することができる。
したがって、本明細書に開示されるのは、リンパ節（ＬＮ）に保持されるように設計された十分なサイズの利点を有するポリボディ、ならびに新エピトープ、特に合成または可溶化が困難な新エピトープを可溶化および安定化するために使用されるポリボディである。ポリボディが実際にＬＮに保持されたことを確認するために、ポリボディと合成長ペプチド（ＳＬＰ）抗原を比較して、ＬＮに優先的な蓄積が存在するかを決定するように実験を設計した（図７Ａ～図７Ｃ、表１）。
Figure 2022551918000001
フルオロフォア標識化抗原ペプチドならびにタンパク質単量体、二量体、四量体および六量体を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のウシ血清（ＢＳＡ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲートからのアルブミンを使用して調製した。精製したＳｔｅｆｉｎ Ａタンパク質を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ＮＨＳエステル（スクシンイミジルエステル）反応性色素で標識し、Ｚｅｂａ脱塩カラムで洗浄し、ＨＰＬＣを実施した（２８０ｎｍおよび６４７ｎｍでのＯＤ）。
フルオロフォア標識化抗原ペプチドならびにタンパク質単量体、二量体、四量体および六量体を、Ａｌｅｘａ６４７＿ＢＳＡを陽性対照として、左右の尾基底部にマウスに皮下注射した。投薬から１２時間後、動物をＣＯ２によって安楽死させた。左右の腋窩および鼠径部リンパ節（ａＬＮ－Ｌ、ａＬＮ－Ｒ、ｉＬＮ－Ｌ、ｉＬＮ－Ｒ）を単離し、Ｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によってエクスビボで撮像した。図８Ａ～図８Ｃおよび図９に示すように、ポリボディにおけるドメインの数と、鼠径部および補助ＬＮの両方におけるＬＮ蓄積の程度との間に正の相関があった。ポリボディにおけるドメインの数が増加するにつれて、ＬＮ蓄積も増加した。六量体ポリボディは、ＬＮ蓄積が陽性対照ＢＳＡよりも顕著に高いことを示したが、これはおそらく、より大きなサイズまたはその特有の鎖状構成に起因する。ポリボディ、ＳＬＰ、およびＢＳＡの分子量を以下の表２に示す。
Figure 2022551918000002
次いで、リンパ節を処理し、細胞を再懸濁し、以下の表３に従ってＦＡＣＳで分析した。ＦＡＣＳ分析の結果を図８Ｄに示す。
Figure 2022551918000003
３．２．免疫原性
ポリボディ対合成長ペプチド（ＳＬＰ）を含む構築物においてコードされた新抗原の免疫原性を比較するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、両側のそれらの尾基底部内に、アジュバントと一緒に、１０ｕｇのＳＬＰまたは同じエピトープを担持するモル当量のポリボディを、ｓ．ｃ．注射した。プライミングおよびブーストのための２ラウンドの注射を、０日目および１４日目に実行した。２１日目にマウスを屠殺し、免疫サイトカイン検出のために脾臓を採取した。エピトープ特異的ＣＤ８＋細胞多量体染色のために、０日目、７日目、１４日目および２１日目にも血液を採取した。この研究で使用したペプチドは、ＧＩＰＶＨＬＥＬＡＳＭＴＮＭＥＬＭＳＳＩＶＨＱＱＶＦＰＴ（ａｄｐｇｋ）およびＧＲＶＬＥＬＦＲＡＡＱＬＡＮＤＶＶＬＱＩＭＥＬＣＧＡＴＲ（Ｒｅｐｓ１）を含み、それらの両方ともマウスＭＣ３８結腸がん腫瘍モデル由来であった。
図１０Ａ～図１０Ｃに示すように、Ｒｅｐｓ１を含有するポリボディで免疫化したマウスは、同じＳＬＰで免疫化したマウスと比較して、より強力な特異的Ｔ細胞応答を示した。中央にＲｅｐｓ１を含有するポリボディでのワクチン接種は、ＳＬＰと比較して抗原特異的Ｔ細胞応答の２倍の増加を誘導し、一方、末端にＲｅｐｓ１を含有するポリボディでのワクチン接種は、ＳＬＰと比較して抗原特異的Ｔ細胞応答の約３００倍の増加を誘導した。両方のエピトープを担持するポリボディからのａｄｐｇｋでも交差反応性は観察されなかった。他方では、ＳＬＰまたはａｄｐｇｋを担持するポリボディのいずれかで免疫化したマウスで観察されたａｄｐｇｋ特異的Ｔ細胞応答は類似していた。末端において単独でａｄｐｇｋをコードするポリボディは、おそらく末端クリッピングに起因して、他のポリボディ、またはさらにＳＬＰよりも低い免疫応答を誘発する傾向がある。
実施例４－官能化ポリボディ
ポリボディは、個別に、または他の機能と組み合わせて、機能性を有するように構成することができる。エピトープを含むポリボディ構築物は、追加の機能的な特殊化をせずに生成することができる（例えば、図１１Ａおよび図１２Ａ）。例示的な官能化ポリボディの構成を図１１Ｂおよび図１２Ｂに示す。この機能には、樹状細胞標的化、アジュバントとの複合体形成、およびエンドソーム脱出、交差提示、または他の薬物との同時送達を促進する試薬との複合体形成が含まれ得るが、これらに限定されない。融合ポリボディの製造パイプラインを表す一般化された概略図を図１３に示す。
樹状細胞（ＤＣ）は、細胞表面上で抗原を捕捉、プロセシング、および提示してＴ細胞をプライミングし、次いで、Ｔ細胞の増殖を制御し、それらのエフェクター機能を促進するために重要であるプロフェッショナル抗原提示細胞である。Ｃｌｅｃ９Ａは、ＤＣの選択群の表面上で発現される表面Ｃ型レクチン様分子である。ヒトにおいて、これは、抗原交差提示に不可欠である、ＢＤＣＡ３＋骨髄性樹状細胞（ｍＤＣ）によって発現される。Ｃｌｅｃ９ＡまたはＣｌｅｃ９Ａ標的化分子に対する抗体にコンジュゲートされた抗原は、免疫応答の増加を引き起こすことができ、動物モデルにおいて抗腫瘍免疫を増強することができる。Ｃｌｅｃ９Ａは、がんワクチンの効率を増加させるための抗原ＤＣ標的化を標的とすることができる。
ＤＣ標的化機能は、複数の方法でポリボディに付加することができる。例えば、足場ドメインのうちの１つ以上は、それらがＣｌｅｃ９ａのようなＤＣ受容体に結合するように操作され得る。いくつかの実施形態では、ＤＣ標的化ペプチド配列は、ポリボディ内で（Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、または正常なエピトープ位置のいくつかで）コードされ得る。いくつかの実施形態では、ＤＣ標的化ペプチドは、足場ドメイン上のリジン残基を標的化するために、例えば、架橋剤を使用して、ポリボディにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、ＤＣ標的化ペプチド配列は、ポリボディの足場ドメインに結合するペプチド配列に融合され得、次いで、この二官能性ペプチドは、製剤化の間にポリボディと混合され得る。いくつかの実施形態では、ポリボディの多価の性質は、足場部分を介する（例えば、６つの部位での）、このＤＣ標的化ペプチドの高アビディティー結合を可能にし、したがって、複数のＤＣ標的化ペプチドを示す。
実施例５－濃縮された人工ミニプロテオームワクチンを調製する方法
この実施例では、人工ミニプロテオームワクチン（ＡｍｐＶａｘ）を生成する簡略化された方法を説明する。簡単に述べると、全ＲＮＡをＦＦＰＥ試料から抽出する。メッセンジャーＲＮＡは、ＦＦＰＥ保存により、またはＲＮＡ抽出ステップの間に部分的に断片化することができる。ランダムプライマー、エクソーム全体を表すｃＤＮＡ鎖を使用して、およそ２００ｂｐの長さの各鎖を、市販のキットを使用して生成する。各ｃＤＮＡ鎖を、コード鎖の発現を選択的に可能にする鎖特異的アダプターにライゲーションする（図１４および図１５）。次いで、アダプターライゲーションした精製ｃＤＮＡを、参照エクソーム捕捉プローブにハイブリダイズさせる。
任意選択により、ミスマッチしたヘテロ二量体を、次いで、ＭｕｔＳタンパク質に結合し、ＭｕｔＳ捕捉カラムを通過させることによって分離する。（図１５、下部の拡大された正方形のセクションで詳細に示される）。ＭｕｔＳカラムは、二本鎖ＤＮＡ内にミスマッチを有する鎖（塗りつぶした太い矢印で図に示す）を捕捉するが、ホモ二本鎖は通過する。ＭｕｔＳカラムで溶出されたヘテロ二量体は、少なくとも１つの点変異を含むがんエクソームから濃縮されたポリペプチドを表す。濃縮されたｃＤＮＡを、発現のためにプラスミド中でクローニングする。
濃縮されたポリペプチドに対するさらなる修飾を、ポリボディの生成のためのペプチドをコードするポリヌクレオチドとの融合によって行う。図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＤＣ標的化部分、またはＴＬＲなどの免疫原性タンパク質、もしくはＳＴＩＮＧタンパク質とさらに融合される足場タンパク質を作製することによって達成される様々な修飾を図で表す。

Claims (223)

  1. 融合ポリペプチドを含む組成物であって、前記融合ポリペプチドが、
    （ａ）１つ以上の抗原ポリペプチド配列と、
    （ｂ）２つ以上の足場ポリペプチド配列と、を含む、ポリペプチド配列を含み、
    前記２つ以上の足場ポリペプチド配列のそれぞれが、ヒトポリペプチド配列、その断片またはそのバリアントを含み、
    （ｉ）前記２つ以上の足場ポリペプチド配列の分子量が１１ｋＤａ超であるか、または（ｉｉ）前記２つ以上の足場ポリペプチド配列のそれぞれが、少なくとも２１個のアミノ酸残基を含む、組成物。
  2. 融合ポリペプチドを含む組成物であって、前記融合ポリペプチドが、
    （ａ）１つ以上の抗原ポリペプチド配列と、
    （ｂ）１つ以上の足場ポリペプチド配列と、を含む、ポリペプチド配列を含み、
    前記足場ポリペプチド配列が、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、タイチン－Ｉ２７、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択される、組成物。
  3. 前記足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つが、１つ以上のリンカー配列を介して前記１つ以上の抗原ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つに接続されている、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記融合ポリペプチドが、前記リンカーの切断、前記１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの切断、または前記１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの提示を促進するように構成されている、請求項３に記載の組成物。
  5. 融合ポリペプチドを含む組成物であって、前記融合ポリペプチドが、
    （ａ）１つ以上の抗原ポリペプチド配列と、
    （ｂ）非免疫原性である１つ以上の足場ポリペプチド配列と、を含む、ポリペプチド配列を含み、
    前記足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つが、１つ以上のリンカー配列を介して前記１つ以上の抗原ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つに接続され、
    前記融合ポリペプチドが、前記リンカーの切断、前記１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの切断、または前記１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの提示を促進するように構成されている、組成物。
  6. 前記抗原ポリペプチドが、がん抗原である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記抗原ポリペプチドが、自己免疫疾患と関連するか、または自己免疫抗原もしくはウイルス抗原である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記足場ポリペプチド配列のそれぞれが、ヒトポリペプチド配列、その断片、またはそのバリアントを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記足場ポリペプチドが、組換えヒトポリペプチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記足場ポリペプチドが、標的結合特性を有するように構成されていない、請求項１または３～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記足場ポリペプチドが、それぞれ独立して、タイチンＩ２７、ユビキチン、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、１０ＦＮ－ＩＩＩ、Ｉｇ－ＬフィラミンＡ、テネイシン、フィブロネクチン、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択される、請求項１または３～９のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記足場ポリペプチドが、それぞれ独立して、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、タイチンＩ２７、それらの断片、およびそれらのバリアントから選択される、請求項１または３～９のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記足場ポリペプチドが、（ｉ）翻訳後修飾、（ｉｉ）ペプチド内ジスルフィド結合、または両方を欠く、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記足場ポリペプチドが、非免疫原性である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記足場ポリペプチドが、酵素活性を有するように構成されていないか、阻害剤活性を有しないか、結合活性を有しないか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記足場ポリペプチドのそれぞれが、Ｓｔｅｆｉｎ Ａ、その断片、またはそのバリアントである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記１つ以上の足場ポリペプチド配列が、同じであるか、または異なる２つ以上の足場ポリペプチド配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記融合ポリペプチドが、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の足場ポリペプチドを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記融合ポリペプチドが、最大でも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または２０個の足場ポリペプチドを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記融合ポリペプチドが、６個の足場ポリペプチドを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記足場ポリペプチド配列の分子量が、１１ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、または２００ｋＤａを超える、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記足場ポリペプチド配列の分子量が、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、または５００ｋＤａ以下である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記足場ポリペプチド配列のそれぞれの分子量が、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、または１００ｋＤａを超える、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記足場ポリペプチド配列のそれぞれの分子量が、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、または２５０ｋＤａ以下である、請求項１～０のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記足場ポリペプチド配列のそれぞれが、少なくとも２１個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、または少なくとも５０００個のアミノ酸残基を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記足場ポリペプチド配列のそれぞれが、最大でも３０個、最大でも３５個、最大でも４０個、最大でも４５個、最大でも５０個、最大でも５５個、最大でも６０個、最大でも６５個、最大でも７０個、最大でも７５個、最大でも８０個、最大でも８５個、最大でも９０個、最大でも１００個、最大でも１２５個、最大でも１５０個、最大でも１７５個、または最大でも２００個のアミノ酸残基を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記融合ポリペプチドの分子量が、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、または２００ｋＤａを超える、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記融合ポリペプチドの分子量が、７５ｋＤａを超える、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記融合ポリペプチドの分子量が、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、または５００ｋＤａ以下である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記１つ以上の抗原ポリペプチド配列のそれぞれが、１００個未満、７５個未満、５０個未満、または３５個未満のアミノ酸残基を含む、請求項１～０のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 前記１つ以上の抗原ポリペプチド配列のそれぞれが、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個を超えるアミノ酸残基を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つが、前記融合ポリペプチドのＮ末端に位置するか、または前記融合ポリペプチドのＮ末端に連結される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つが、前記融合ポリペプチドのＮ末端に位置するか、または前記融合ポリペプチドのＣ末端に連結される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記足場ポリペプチド配列のうちの少なくとも２つが、前記抗原配列またはリンカー配列によって中断されない、請求項１～３１のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（Ｉａ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
    Ａｎ－Ｓｍ、またはＳｍ－Ａｎ
    式（Ｉａ）、
    式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、
    ｍが、２以上の整数であり、
    ｎが、１以上の整数である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. ｎが、１～５から選択される整数であり、ｍが、１または２である、請求項０に記載の組成物。
  37. 前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（Ｉｂ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
    Ｓｏ－Ａｎ－Ｓｍ
    式（Ｉｂ）、
    式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、
    ｏ、ｎ、ｍのそれぞれが、独立して、１以上の整数である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. ｏが、１または２または３であり、ｍが、１または２または３であり、ｎが、１～５から選択される整数である、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記融合ポリペプチドが、Ｓ－Ａ－Ｓ、Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ａ－Ｓ－Ｓ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ｓ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ｓ－Ｓ、またはＳ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ａ－Ｓの構造を有するポリペプチド配列を含む、請求項３７に記載の組成物。
  40. 前記融合ポリペプチド配列が、２つ以上のリンカー配列を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（ＩＩａ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
    （Ｌ－Ａ－Ｌ）ｎ－Ｓｍ、またはＳｍ－（Ｌ－Ａ－Ｌ）ｎ
    式（ＩＩａ）、
    式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、各Ｌが、独立して、リンカー配列を表すか、または不在であり、
    ｍが、２以上の整数であり、
    ｎが、１以上の整数である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物。
  42. ｎが、１～５から選択される整数であり、ｍが、１または２である、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端方向において、式（ＩＩｃ）の構造を有するポリペプチド配列を含み、
    Ｓｏ－（Ｌ－Ａ－Ｌ）ｎ－Ｓｍ
    式（ＩＩｃ）、
    式中、各Ｓが、独立して、足場ポリペプチド配列を表し、各Ａが、独立して、抗原ポリペプチド配列を表し、各Ｌが、独立して、リンカー配列を表すか、または不在であり、
    ｏ、ｎ、ｍのそれぞれが、独立して、１以上の整数である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. ｏが、１または２または３であり、ｍが、１または２または３であり、ｎが、１～５から選択される整数である、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記融合ポリペプチドが、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｓ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｓ－Ｓ、Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｓ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ、Ｓ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｓ、またはＳ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｓ－Ｌ－Ａ－Ｌ－Ｓの構造を有するポリペプチド配列を含む、請求項４３に記載の組成物。
  46. 前記足場ポリペプチドおよび前記抗原ポリペプチドが、交互様式で前記融合ポリペプチド内に位置する、請求項３７または４３に記載の組成物。
  47. 前記融合ポリペプチドが、直鎖状フォーマットである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の組成物。
  48. 前記融合ポリペプチドが、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または２０個の抗原ポリペプチドを含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 前記融合ポリペプチドが、最大でも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、５０個、または１００個の抗原ポリペプチドを含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載の組成物。
  50. 前記融合ポリペプチドが、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の抗原ポリペプチドを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の組成物。
  51. 前記足場ポリペプチド配列のそれぞれが、前記リンカー配列のうちの少なくとも１つを介して前記抗原ポリペプチド配列のうちの１つまたは２つに接続されている、請求項３～５０のいずれか一項に記載の組成物。
  52. 前記融合ポリペプチドが、前記リンカーの切断、または前記１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの切断を促進するように構成されている、請求項３～５１のいずれか一項に記載の組成物。
  53. 前記リンカー配列のうちの少なくとも１つが、切断部位を含む、請求項３～５２のいずれか一項に記載の組成物。
  54. 前記切断部位が、ペプチダーゼまたはプロテアーゼによって切断可能である、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記融合ポリペプチドが、前記１つ以上の抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つの提示を促進するように構成されている、請求項３～５４のいずれか一項に記載の組成物。
  56. 前記１つ以上の抗原ポリペプチドが、ＨＬＡクラスＩ抗原ポリペプチドであり、前記リンカー配列のうちの少なくとも１つが、リジン残基、アルギニン残基、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、グルタミン酸残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３～５５のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記１つ以上の抗原ポリペプチドが、ＨＬＡクラスＩ抗原ポリペプチドであり、前記リンカー配列のうちの少なくとも１つが、前記抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端に直接接続された、リジン残基、アルギニン残基、またはアラニン残基を含む、請求項５６に記載の組成物。
  58. 前記１つ以上の抗原ポリペプチドが、ＨＬＡクラスＩ抗原ポリペプチドであり、前記リンカー配列のうちの少なくとも１つが、前記抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接接続された、セリン残基、リジン残基、アルギニン残基、またはアラニン残基を含む、請求項５６または５７に記載の組成物。
  59. 前記１つ以上の抗原ポリペプチドが、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ポリペプチドであり、前記リンカー配列のうちの少なくとも１つが、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３～５８のいずれか一項に記載の組成物。
  60. 前記１つ以上の抗原ポリペプチドが、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ポリペプチドであり、前記リンカー配列のうちの少なくとも１つが、前記抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＮ末端に直接接続された、アスパラギン酸残基、メチオニン残基、ロイシン残基、チロシン残基、またはフェニルアラニン残基を含む、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記１つ以上の抗原ポリペプチドが、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ポリペプチドであり、前記リンカー配列のうちの少なくとも１つが、前記抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つのＣ末端に直接接続された、メチオニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、またはトリプトファン残基を含む、請求項５９または６０に記載の組成物。
  62. 前記リンカー配列のそれぞれが、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、または５０個のアミノ酸残基を含む、請求項３～６１のいずれか一項に記載の組成物。
  63. 前記リンカー配列のそれぞれが、最大でも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、または１００個のアミノ酸残基を含む、請求項３～６２のいずれか一項に記載の組成物。
  64. 前記リンカーが、フレキシブルである、請求項３～６３のいずれか一項に記載の組成物。
  65. 前記リンカー配列が、同じであるか、または異なる、請求項３～６４のいずれか一項に記載の組成物。
  66. 水性溶媒中の前記融合ポリペプチドの溶解度が、同じ溶媒中で測定した、前記足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの溶解度よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍高い、請求項１～６５のいずれか一項に記載の組成物。
  67. 血清を含む溶媒中の前記融合ポリペプチドの溶解度が、同じ血清を含む溶媒中で測定した、前記足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの溶解度よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い、請求項１～６５のいずれか一項に記載の組成物。
  68. 前記融合ポリペプチドの血清半減期が、前記足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの血清半減期よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍長い、請求項１～６７および６９のいずれか一項に記載の組成物。
  69. 対象への投与後のリンパ節における前記融合ポリペプチドの蓄積が、平均放射効率によって測定した、前記足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの蓄積よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、または１００００倍高い、請求項１～６８のいずれか一項に記載の組成物。
  70. 対象への投与後の前記融合ポリペプチドの抗原特異的Ｔ細胞応答が、抗原特異的Ｔ細胞の頻度またはＩＦＮγの分泌の増加によって測定した、前記足場ポリペプチドを欠く、その対応するポリペプチドの抗原特異的Ｔ細胞応答よりも、少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、もしくは１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、または少なくとも３００倍高い、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
  71. 前記融合ポリペプチドが、抗原提示細胞、アジュバント、または試薬に結合するように構成された１つ以上の結合部分を含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載の組成物。
  72. 多価融合ポリペプチドが、ＤＣ標的化ドメイン、アジュバントまたは他の免疫調節剤のような官能化薬剤にカップリングされた抗足場抗体またはその断片との付加混合によって官能化される、請求項１～７０のいずれか一項に記載の組成物。
  73. 前記抗原提示細胞が、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、またはＢ細胞である、請求項７１に記載の組成物。
  74. 前記１つ以上の結合部分が、樹状細胞上で発現された１つ以上の受容体に結合するように構成されている、請求項７１に記載の組成物。
  75. 前記１つ以上の受容体が、Ｃ型レクチン受容体、スカベンジャー受容体、ケモカイン受容体、Ｆ４／８０受容体、ＤＣ特異的膜貫通タンパク質（ＤＣ－ＳＴＡＭＰ）、Ｆｃ受容体、内在化受容体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７４に記載の組成物。
  76. 前記１つ以上の受容体が、Ｃｌｅｃ９ａまたはＸＣＲ１を含む、請求項７４に記載の組成物。
  77. 前記結合部分のうちの少なくとも１つが、前記足場ポリペプチドに含まれる、請求項７１に記載の組成物。
  78. 前記結合部分のうちの少なくとも１つが、前記足場ポリペプチドのうちの１つのＮ末端またはＣ末端に直接接続されている、請求項７１に記載の組成物。
  79. 前記結合部分のうちの少なくとも１つが、前記抗原ポリペプチドのうちの１つのＮ末端もしくはＣ末端に、または前記リンカーペプチドに直接接続されている、請求項７１に記載の組成物。
  80. Ｎ末端からＣ末端方向において、前記結合部分のうちの少なくとも１つが、前記足場ポリペプチドのうちの最初または最後の足場ポリペプチドに末端連結されている、請求項７１に記載の組成物。
  81. 前記融合ポリペプチドにコンジュゲートすることができる１つ以上の結合部分を含む、請求項１～８０のいずれか一項に記載の組成物。
  82. 前記１つ以上の結合部分が、前記融合ポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項８１に記載の組成物。
  83. 前記１つ以上のがん抗原ポリペプチドが、複数の抗原ポリペプチドを含む、請求項１～４または６～８２のいずれか一項に記載の組成物。
  84. 前記抗原ポリペプチドが、新抗原ペプチドまたは自己免疫ペプチドである、請求項８３に記載の組成物。
  85. 各ペプチドの新エピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）が、固有である、請求項８３または８４に記載の組成物。
  86. がん新抗原ペプチドまたはその一部のそれぞれが、前記対象によって発現されたＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるタンパク質に結合し、前記対象のがん細胞のうちの少なくとも１つの発現された遺伝子によってコードされ、前記がん新抗原ペプチドまたはその一部のうちの少なくとも１つが、前記対象の正常組織内に存在しない１つ以上の変異を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の組成物。
  87. 前記１つ以上の変異のうちの少なくとも１つが、
    （Ａ）点変異であり、前記がん新抗原ペプチドが、前記対象によって発現されたＨＬＡ対立遺伝子によってコードされた前記タンパク質に、５００ｎＭ未満のＩＣ５０、および対応する野生型ペプチドより高い親和性で結合し、
    （Ｂ）スプライス部位変異、
    （Ｃ）フレームシフト変異、
    （Ｄ）リードスルー変異、または
    （Ｅ）遺伝子融合変異である、請求項８６に記載の組成物。
  88. 複数のうちの第１のがん新抗原ペプチドが、前記対象によって発現された第１のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質に結合し、前記複数のうちの第２のがん新抗原ペプチドが、前記対象によって発現された第２のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質に結合し、前記対象によって発現された前記第１および前記第２のＨＬＡ対立遺伝子が、異なるＨＬＡ対立遺伝子である、請求項８６または８７に記載の組成物。
  89. 前記がん新抗原ペプチドのうちの少なくとも１つが、前記対象によって発現された前記ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされた前記タンパク質に、１５０ｎＭ未満のＩＣ５０で結合する、請求項８３～８８のいずれか一項に記載の組成物。
  90. 少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または２０個の異なる融合ポリペプチドを含む、請求項１～８９のいずれか一項に記載の組成物。
  91. 最大でも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または２０個の異なる融合ポリペプチドを含む、請求項１～８９のいずれか一項に記載の組成物。
  92. 請求項１～９１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
  93. （ａ）１つ以上のリンカーによって間隔を置かれた２つ以上の足場ポリペプチド、および
    （ｂ）前記リンカーのうちの少なくとも１つに位置する１つ以上の制限部位
    をコードする、核酸分子であって、
    （ｉ）前記２つ以上の足場ポリペプチド配列の分子量が１１ｋＤａ超であるか、または（ｉｉ）前記２つ以上の足場ポリペプチド配列のそれぞれが、少なくとも２１個のアミノ酸残基を含む、核酸分子。
  94. 前記核酸が、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項９２または０に記載の核酸分子。
  95. 複数の核酸分子であって、
    （ａ）
    （ｉ）第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列、および
    （ｉｉ）第１の足場ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第１の核酸分子と、
    （ｂ）
    （ｉ）第１の抗原ポリペプチドをコードする前記核酸配列に相補的な配列を含む核酸配列、および
    （ｉｉ）第２の足場ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第２の核酸分子と、
    を含む、複数の核酸分子。
  96. 複数の核酸分子であって、
    （ａ）
    （ｉ）第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列、
    （ｉｉ）第１の足場ポリペプチドをコードする核酸配列、および
    （ｉｉｉ）第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第１の核酸分子と、
    （ｂ）
    （ｉ）第２の抗原ポリペプチドをコードする前記核酸配列に相補的な配列を含む核酸配列、および
    （ｉｉ）第２の足場ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第２の核酸分子と、
    を含む、複数の核酸分子。
  97. 複数の核酸分子であって、
    （ａ）
    （ｉ）第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列、
    （ｉｉ）第１の足場ポリペプチドをコードする核酸配列、および
    （ｉｉｉ）第２の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第１の核酸分子と、
    （ｂ）
    （ｉ）第２の抗原ポリペプチドをコードする前記核酸配列に相補的な配列を含む核酸配列、および
    （ｉｉ）第２の足場ポリペプチドをコードする核酸配列、および
    （ｉｉｉ）第３の抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第２の核酸構築物と、
    を含む、複数の核酸分子。
  98. 前記第１および前記第２の足場配列が、同じであるか、または異なる、請求項９５～０のいずれか一項に記載の複数の核酸分子。
  99. 前記第１の抗原ポリペプチドおよび前記第２の抗原ポリペプチドが、異なる、請求項９５または９６に記載の複数の核酸分子。
  100. 前記第１、前記第２、および前記第３の抗原ポリペプチドが、異なる、請求項０に記載の複数の核酸分子。
  101. 前記核酸分子が、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項９５～１００のいずれか一項に記載の複数の核酸分子。
  102. 医薬組成物であって、
    （ａ）薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と、
    （ｂ）請求項１～９１のいずれか一項に記載の組成物、または請求項９２～９４のいずれか一項に記載の核酸分子と、を含む、医薬組成物。
  103. アジュバントをさらに含む、請求項１０２に記載の医薬組成物。
  104. 前記アジュバントが、ポリＩＣ：ＬＣである、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  105. ｐＨ調整剤をさらに含む、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  106. 第２の治療薬剤をさらに含む、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  107. 免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、前記方法が、遺伝子修飾細胞において、またはインビトロ翻訳によって、請求項１～９１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子を発現させ、それによって前記免疫原性融合ポリペプチドを産生することを含む、方法。
  108. 免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、前記方法が、
    （ａ）請求項０または９４に記載の核酸分子を提供することと、
    （ｂ）１つ以上の抗原ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子を、制限部位のうちの少なくとも１つに挿入し、それによって、新しい核酸分子を産生することと、
    （ｃ）インビトロ翻訳によって、または遺伝子修飾細胞において、前記新しい核酸分子を発現させ、それによって、前記免疫原性融合ポリペプチドを産生することと、を含む、方法。
  109. １つ以上の抗原ポリペプチドをコードする前記１つ以上の核酸分子が、制限酵素ベースのクローニングによって挿入される、請求項１０８に記載の方法。
  110. 免疫原性融合ポリペプチドを産生する方法であって、前記方法が、
    （ａ）請求項９５～１０１のいずれか一項に記載の複数の核酸分子を提供することと、
    （ｂ）ハイブリダイゼーションにより前記核酸分子を接合することと、
    （ｃ）インビトロ翻訳によって、または遺伝子修飾細胞において、前記接合した核酸分子を発現させ、それによって、前記免疫原性融合ポリペプチドを産生することと、を含む、方法。
  111. 前記融合ポリペプチドが、細菌発現系において発現される、請求項１０７～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記細菌発現系が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現系である、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記融合ポリペプチドが、インビトロ翻訳によって発現される、請求項１０７～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  114. ギャップ充填ステップおよび／またはライゲーションステップをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記ギャップ充填ステップが、ポリメラーゼ媒介性ギャップ充填ステップを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  116. がんの治療または予防を必要とするヒト対象においてがんを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１０２～１０６のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  117. 前記医薬組成物が、複数の新抗原ペプチドを含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記医薬組成物が、複数の融合ポリペプチドを含む、請求項１１６または１１７に記載の方法。
  119. 前記医薬組成物が、静脈内または皮下に投与される、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記融合ポリペプチドの用量が、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのサブ用量に分割される、請求項１１６～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記融合ポリペプチドの各サブ用量が、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれを超える融合ポリペプチドを含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 各融合ポリペプチドが、０．０１～１００μｇの用量で投与される、請求項１１６～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 各融合ポリペプチドが、１００μｇ～１０ｍｇの用量で投与される、請求項１１６～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 投与される前記融合ポリペプチドの総用量が、０．０１～１００ｍｇである、請求項１１６～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記がんが、固形腫瘍である、請求項１１６～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記がんが、黒色腫、肺がん、または膀胱がんである、請求項１１６～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 複数の組換え発現構築物を含むライブラリーであって、前記複数のうちの各発現構築物が、
    （ａ）プロモーター配列と、
    （ｂ）
    （ｉ）前記プロモーター配列の下流の開始コドン、
    （ｉｉ）前記開始コドンの下流の第１のポリヌクレオチド配列であって、前記第１のポリヌクレオチド配列が、異なる鋳型ポリヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド配列からの前記異なる鋳型が、（Ａ）疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料に由来し、（Ｂ）前記対象からの前記疾患細胞によってコードされたタンパク質のペプチド配列をコードする、第１のポリヌクレオチド配列、ならびに
    （ｉｉｉ）前記第１のポリヌクレオチド配列の下流の第２のポリヌクレオチド配列であって、前記第２のポリヌクレオチド配列が、
    （Ａ）フレームチェック配列および前記フレームチェック配列の下流の１つ以上の親和性タグをコードする配列、または
    （Ｂ）親和性タグをコードする配列を含むフレームチェック配列を含む、第２のポリヌクレオチド配列、を含む、融合ポリペプチドをコードする配列と、
    を含む、ライブラリー。
  128. 異なる鋳型ポリヌクレオチド配列またはそのコピーが、親和性タグをコードする前記配列とフレーム外である場合、フレームチェック配列が、前記融合ポリペプチドの翻訳を終結するように作動する、請求項１に記載の組成物。
  129. 前記フレームチェック配列が、
    Ｎ１－Ｎ２－Ｎ３－Ｎ４－Ｎ５－Ｎ６－Ｎ７－Ｎ８－Ｎ９
    の式を有し、
    式中、
    各Ｎが、独立して、Ａ、Ｔ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択される核酸であり、
    Ｎ１－Ｎ２－Ｎ３およびＮ４－Ｎ５－Ｎ６およびＮ７－Ｎ８－Ｎ９のそれぞれが、終止コドンではなく、
    Ｎ２－Ｎ３－Ｎ４およびＮ６－Ｎ７－Ｎ８のそれぞれが、終止コドンである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  130. 前記フレームチェック配列が、Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒをコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  131. 前記フレームチェック配列が、前記第１のポリヌクレオチド配列を、前記親和性タグをコードする前記配列に連結するリンカーをコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  132. 親和性タグをコードする前記配列が、フレームチェック配列である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  133. 前記親和性タグが、Ｆｃ受容体に結合する断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）もしくはペプチド配列、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、プロテインＡに結合するペプチド配列、プロテインＧに結合するペプチド配列、または抗体のエピトープ、またはそれらの結合断片である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  134. 前記親和性タグが、非免疫原性である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  135. 前記親和性タグが、ヒトである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  136. （ｉ）前記親和性タグをコードする前記配列が、サイズ増強ポリペプチドをコードし、かつ／または（ｉｉ）前記ライブラリーの各発現構築物が、サイズ増強ポリペプチドをコードする配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  137. 前記サイズ増強ポリペプチドをコードする前記配列が、前記第１のポリヌクレオチド配列の下流にあり、かつ／または前記サイズ増強ポリペプチドをコードする前記配列のうちの少なくとも１つが、前記異なる鋳型ポリヌクレオチド配列の上流にある、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  138. 前記親和性タグが、サイズ増強ポリペプチドのエピトープである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  139. 前記サイズ増強ポリペプチドをコードする前記配列が、複数の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個、またはそれを超えるサイズ増強ポリペプチドをコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  140. 前記複数のサイズ増強ポリペプチドのうちの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを超えるサイズ増強ポリペプチドが、同じである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  141. 前記サイズ増強ポリペプチドをコードする前記配列が、前記サイズ増強ポリペプチドのうちの２つ以上の間の１つ以上のリンカーをコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  142. 前記複数のサイズ増強ポリペプチドの分子量が、少なくとも１５ｋＤａである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  143. 前記複数のサイズ増強ポリペプチドの前記分子量が、２００ｋＤａ以下である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  144. 前記複数のサイズ増強ポリペプチドの前記分子量が、４０ｋＤａ～８０ｋＤａまたは５０ｋＤａ～７０ｋＤａである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  145. 前記異なる鋳型ポリヌクレオチド配列が、前記対象からの前記疾患細胞によって発現されたタンパク質のペプチド配列をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  146. 前記対象が、ヒトである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  147. 前記疾患が、がんである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  148. 前記がんが、黒色腫、膀胱がんまたは肺がんである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  149. 前記疾患が、自己免疫疾患である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  150. 前記試料が、生検、血液試料または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料を含み、前記試料が、前記疾患を有する細胞を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  151. 前記複数のうちの各発現構築物が、同じプロモーター、同じ開始コドン、同じフレームチェック配列、前記サイズ増強ポリペプチドをコードする同じ配列またはそれらの任意の組み合わせを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  152. 前記異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のそれぞれが、少なくとも２４ｂｐの長さ、少なくとも４５ｂｐの長さ、最大でも４５０ｂｐの長さ、最大でも２５０ｂｐの長さ、２４～３００ｂｐの長さ、４５～４５０ｂｐの長さ、またはそれらの任意の組み合わせである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  153. 前記異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のそれぞれが、ｃＤＮＡである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  154. 前記異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のそれぞれが、ＲＮＡ分子に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  155. 前記異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のそれぞれが、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  156. 前記ライブラリーが、エクソームの少なくとも５％～最大１００％を表す複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  157. 前記ライブラリーが、前記ペプチド配列プロテオームの少なくとも５％～最大１００％をコードする複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  158. 前記ライブラリーが、プロテオームの前記タンパク質の少なくとも５％に由来するペプチド配列をコードする複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  159. 前記エクソームまたはプロテオームが、前記疾患細胞の前記エクソームまたはプロテオームである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  160. 前記ライブラリーから発現されたポリペプチドの約５％～約２５％が、前記親和性タグを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  161. 前記ライブラリーから発現されたポリペプチドの約２０％～約４０％が、前記サイズ増強ポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  162. 少なくとも６０個のアミノ酸残基を含む前記ライブラリーから発現されたポリペプチドの約５０％～約９０％が、前記親和性タグを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  163. インフレーム発現構築物から発現された前記ポリペプチドの約８５％～約９５％が、前記親和性タグに取り付けられるポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  164. 前記ライブラリーが、少なくとも１００個、１０００個、１００００個、１０００００個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個または最大１×１０１０個の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  165. 前記異なる鋳型ポリヌクレオチドが、少なくとも１０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、１００００個または１０００００個の異なるタンパク質のペプチド配列をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  166. 前記異なる鋳型ポリヌクレオチドのうちの少なくとも約１０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個または１００００個が、前記疾患細胞内で異常に転写、スプライシングもしくは翻訳されたｍＲＮＡに由来するか、または遺伝子再構成に由来する、変異体ペプチド配列またはｍＲＮＡ翻訳産物をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  167. 前記変異体ペプチド配列が、がん細胞特異的変異体ペプチド配列である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  168. 前記変異体ペプチド配列が、点変異またはインデルを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  169. 前記複数のうちの各発現構築物が、前記プロモーターの下流にあり、融合ポリペプチドをコードする前記配列の上流にある、リンカー配列をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  170. 前記第１のポリヌクレオチド配列が、前記異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のすぐ上流にある上流アダプター配列、および／または前記異なる鋳型ポリヌクレオチド配列のすぐ下流にある下流アダプター配列をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  171. 前記融合タンパク質が、多価である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  172. 先行請求項のいずれか一項に記載のライブラリーによってコードされた、ポリペプチドライブラリー。
  173. 前記ライブラリーの前記ポリペプチドが、宿主細胞において発現され、インビトロ翻訳系を使用して発現され、かつ／またはファージベクターから発現される、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  174. 前記ファージベクターが、繊維状ファージベクターである、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  175. 前記繊維状ファージベクターが、Ｍ１３、ｆ１、またはｆｄファージベクターである、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  176. 前記ライブラリーの前記ポリペプチドが、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の一部として発現される、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  177. 前記ＶＬＰが、宿主細胞、例えば細菌細胞、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞において発現可能である、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  178. 前記ＶＬＰが、前記宿主細胞内で自己集合するか、または前記宿主細胞外で自己集合する、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  179. 前記ライブラリーの前記ポリペプチドのうちの１つ以上またはそれぞれが、細胞内ポリペプチドまたは分泌ポリペプチドである、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  180. 前記宿主細胞が、細菌である、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  181. 前記ライブラリーの前記ポリペプチドが、インビトロ翻訳されたポリペプチドである、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  182. 前記ポリペプチドライブラリーが、複数の単離されたポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  183. 前記ライブラリーの前記ポリペプチドが、少なくとも前記親和性タグを介して単離または精製または濃縮される、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリー。
  184. 宿主細胞において発現された複数の組換え融合ポリペプチドを含む、個別化された組換えプロテオームライブラリーであって、前記複数の組換え融合ポリペプチドが、疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料からの複数の少なくとも１０個の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列によってコードされた複数のポリペプチド配列を含み、
    前記複数の少なくとも１０個の異なる鋳型ポリヌクレオチドによってコードされた前記ポリペプチド配列のそれぞれが、ＮからＣ方向において、
    （ｉ）前記少なくとも１０個の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列の異なる鋳型ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド配列、ならびに（ｉｉ）
    （Ａ）フレームチェック配列および前記フレームチェック配列の下流の親和性タグをコードする配列、または
    （Ｂ）親和性タグをコードする配列を含むフレームチェック配列、および／または
    （Ｃ）少なくとも４０ｋＤａであるサイズ増強ポリペプチド配列
    を含む、個別化された組換えプロテオームライブラリー。
  185. 宿主細胞において発現された複数の組換え融合ポリペプチドを含む、個別化された組換えプロテオームライブラリーであって、前記複数の組換え融合ポリペプチドが、疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料からの複数の少なくとも１０００個の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列によってコードされた複数のポリペプチド配列を含む、個別化された組換えプロテオームライブラリー。
  186. 先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリーまたは個別化された組換えプロテオームライブラリーを含む、ワクチン組成物。
  187. 先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリーまたは個別化された組換えプロテオームライブラリーを前記対象に投与することを含む、治療方法。
  188. 先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドライブラリーまたは個別化された組換えプロテオームライブラリーと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  189. 先行請求項のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、治療方法。
  190. 先行請求項のいずれか一項に記載のライブラリーを含む、細胞集団。
  191. 前記複数のうちの各細胞が、前記複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドによってコードされた単一の異なるポリペプチド配列を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
  192. 前記複数の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列をベクターまたはプラスミドに挿入することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のライブラリーを構築する、方法。
  193. 発現ベクターを構築する方法であって、
    （ａ）疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料からの複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドを提供することと、
    （ｂ）前記複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドにアダプター配列を取り付け、それによって、複数の異なるアダプタータグ付き鋳型ポリヌクレオチドを形成することと、
    （ｃ）前記異なるアダプタータグ付き鋳型ポリヌクレオチドを増幅させることと、
    （ｄ）前記増幅された異なるアダプタータグ付き鋳型ポリヌクレオチドをベクターに挿入し、それによって、組換え発現構築物のライブラリーを形成することと、
    （ｅ）組換え発現構築物の前記ライブラリーによってコードされたポリペプチドを発現させることと、
    （ｆ）前記発現したポリペプチドを濃縮することと、
    を含む、方法。
  194. 前記方法が、前記複数の異なるポリヌクレオチドを、エクソーム捕捉オリゴヌクレオチドのライブラリーと接触させることを含み、前記捕捉オリゴヌクレオチドが標的配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  195. 前記エクソーム捕捉オリゴヌクレオチドが、表面上に固定化される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  196. 増幅させることが、ランダムプライマーで増幅させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  197. 増幅させることが、バイアスなしで増幅させることを含むか、または標的特異的ではない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  198. 前記複数の異なる鋳型ポリヌクレオチド配列を、参照試料または疾患を有する前記対象からの非疾患細胞からの複数の参照ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  199. ミスマッチを含まない二本鎖ポリヌクレオチドからミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドを選択的に濃縮することをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  200. 選択的に濃縮することが、前記二本鎖ポリヌクレオチドを、ミスマッチを含む前記二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合する薬剤に接触させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  201. 前記薬剤が、ＤＮＡ塩基ミスマッチ認識薬剤である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  202. 前記薬剤が、ＭｕｔＳタンパク質またはその機能的断片である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  203. 前記ミスマッチが、単一ヌクレオチドバリアント、挿入または欠失を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  204. （ｉ）ミスマッチを含む選択的に濃縮された二本鎖ポリヌクレオチドを、（ｉｉ）選択的に濃縮されていない疾患を有する対象からの疾患細胞を含む試料からの複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドと組み合わせることをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  205. 複数の異なる標的ポリヌクレオチドが、エクソーム全体および／またはエクソーム－イントロン境界配列に由来する配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  206. 前記複数の異なる標的ポリヌクレオチドが、１つ以上のがん型の発現データに基づいて、エクソームのサブセットに由来する配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  207. 前記複数の異なる標的ポリヌクレオチドが、全ゲノムに由来する配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  208. 前記複数の異なる標的ポリヌクレオチドが、エクソーム捕捉オリゴヌクレオチドのライブラリーで濃縮された全ゲノム配列のセットに由来する配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  209. 前記複数の異なる標的ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングすることをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  210. 参照ポリヌクレオチドのセットが、参照ゲノムエクソン捕捉プローブセットまたは前記対象からの非腫瘍試料からのポリヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  211. エクソーム捕捉オリゴヌクレオチドの前記ライブラリーが、高頻度多型が除去された捕捉オリゴヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  212. 前記参照試料が、前記対象からの非腫瘍試料を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  213. 逆転写を実施することをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  214. シーケンシングをさらに含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  215. ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質へのエピトープの結合を予測もしくは決定すること、および／またはＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質によるエピトープの提示をさらに含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  216. 前記複数の異なる鋳型ポリヌクレオチドにアダプター配列を取り付けることが、鎖特異的アダプター配列を取り付けることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  217. 前記異なる標的ポリヌクレオチド配列が、ｇＤＮＡ由来である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  218. 前記異なる標的ポリヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡまたはエクソーム配列に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  219. 濃縮することが、発現されたポリペプチドを含有する親和性タグを濃縮することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  220. 前記試料のポリ核酸を断片化することをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  221. 前記試料のゲノムＤＮＡを剪断することをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  222. 前記試料が、ＦＦＰＥ試料である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  223. 先行請求項のいずれか一項に記載の方法を実施することと、前記濃縮された発現ポリペプチドを前記対象に投与することと、を含む、治療方法。
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