JP2022547866A - 同種異系細胞組成物と使用方法 - Google Patents

同種異系細胞組成物と使用方法 Download PDF

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Abstract

キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）、ＣＳＲを含む細胞組成物、これらの作成方法、及び被験体の疾患又は障害の治療のためにこれらの使用方法が、開示される。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８９６，４９５号、及び２０２０年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／９７６，５３６号の優先権及び利益を主張する。これらの各出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
開示の分野
本開示は、分子生物学、より具体的にはキメラ受容体、同種異系細胞組成物、これらの製造方法及び使用方法に関する。
配列表の参照による組み込み
２０２０年８月２１日に作成されサイズが２９１ＫＢである「ＰＯＴＨ－０５５＿００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前のファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の背景
移植片対宿主応答及び宿主対移植片応答に関与する遺伝子を排除することによって提示される課題を克服する同種異系細胞組成物について、当技術分野では長い間感じられてきた満たされていないニーズが存在している。本開示は、環境刺激に対する同種異系細胞の応答性を回復するために及びナチュラルキラー細胞媒介性細胞毒性による拒絶を低減又は防止するために、天然に存在しない構造改善を含む、同種異系細胞組成物、これらの組成物の製造方法、及び使用方法を提供する。
本開示は、（ａ）シグナルペプチドと活性化成分を含む外部ドメインであって、シグナルペプチドはＣＤ２シグナルペプチドを含み、及び活性化成分はアゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部を含む、前記外部ドメインと；（ｂ）ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部を含む膜貫通ドメインと；及び（ｃ）細胞質ドメインとシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインであって、細胞質ドメインは、ＣＤ２８細胞内ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメイン、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメイン、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＣＤ２７細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、若しくはＧＩＴＲ細胞内ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせであり、及びシグナル伝達ドメインはＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含む、前記内部ドメインと、を含む非天然のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供し、ここで、前記シグナルペプチドと前記細胞質ドメインは同じタンパク質に由来していない。
いくつかの態様において、ＣＤ２シグナルペプチドは、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。１つの態様において、ＣＤ２シグナルペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、（ａ）シグナルペプチドと活性化成分とを含む外部ドメインであって、シグナルペプチドはＣＤ８αシグナルペプチドを含み、活性化成分はアゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部を含む、前記外部ドメインと；（ｂ）ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部を含む膜貫通ドメインと；及び（ｃ）細胞質ドメインとシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインであって、細胞質ドメインは、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメイン、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメイン、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＣＤ２７細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、若しくはＧＩＴＲ細胞内ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせであり、シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含む、前記内部ドメインと、を含む非天然のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供し、ここで、前記シグナルペプチドと前記細胞質ドメインは同じタンパク質に由来していない。
いくつかの態様において、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、活性化成分が修飾を含む、非天然のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。いくつかの態様において、修飾は、ＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部の野生型配列と比較して、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部のアミノ酸配列の突然変異又は末端切断（truncation）を含む。いくつかの態様において、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部の突然変異又は末端切断を含む非天然のＣＳＲは、ＣＤ５８に結合しない。いくつかの態様において、突然変異又は末端切断を含むＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部は、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、突然変異又は末端切断を含むＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、ＣＤ２膜貫通ドメインは、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、ＣＤ２細胞内ドメインは、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＣＤ２細胞内ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＣＤ２８細胞内ドメインは、配列番号１５と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＣＤ２８細胞内ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、４－１ＢＢ細胞内ドメインは、配列番号１７と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、４－１ＢＢ細胞内ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメインは、配列番号１９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメインは、配列番号２１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメインは、配列番号ＸＸと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＩＣＯＳ細胞内ドメインは、配列番号２５と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＩＣＯＳ細胞内ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＣＤ２７細胞内ドメインは、配列番号２７と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＣＤ２７細胞内ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＯＸ４０細胞内ドメインは、配列番号２９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＯＸ４０細胞内ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＧＩＴＲ細胞内ドメインは、配列番号３１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＧＩＴＲ細胞内ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、ＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含むシグナル伝達ドメインは、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、ＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含むシグナル伝達ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号３９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列である。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４７と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５５と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号７１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号３７と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４５と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５７と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６５と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号７３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。好適な態様において、非天然のＣＳＲは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを提供する。
本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲを含む細胞を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含む細胞を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む細胞を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む細胞を提供する。
本開示はまた、以下を含む修飾Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を提供する：（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の修飾であって、ＴＣＲの発現又は活性レベルを低減又は排除する修飾；及び（ｂ）本明細書に開示の任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）。本明細書に開示の修飾Ｔ細胞は、同種異系細胞又は自家細胞であり得る。いくつかの好適な態様において、修飾細胞は同種異系細胞である。いくつかの好適な態様において、修飾細胞は、同種異系Ｔ細胞又は修飾された同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞である。
本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示の修飾細胞を含む組成物、又は本明細書に開示の複数の修飾細胞を含む組成物を提供する。
本開示は、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の修飾であって、ＴＣＲの発現又は活性レベルを低減又は排除する修飾と；並びに（ｂ）（ｉ）活性化成分を含む外部ドメインであって、活性化成分は第１のタンパク質から単離又は誘導される前記外部ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインであって、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは第２のタンパク質から単離又は誘導される内部ドメイン、を含むキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、を含む修飾Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を提供し、ここで、第１のタンパク質と第２のタンパク質は同一ではない。
修飾Ｔ細胞は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをさらに含むことができる。修飾Ｔ細胞は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の修飾をさらに含むことができ、ここで、修飾は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）の発現又は活性のレベルを低減又は排除する。
修飾Ｔ細胞は、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）ポリペプチドを含む非天然のポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然のポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然のポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然のポリペプチドは、リンカーをさらに含むことができ、ここで、リンカーは、Ｂ２ＭポリペプチドとＨＬＡ－Ｅポリペプチドとの間に配置される。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然のポリペプチドは、ペプチドとＢ２Ｍポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅを含む非天然のポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドとペプチドの間に配置された第１のリンカーを、及びＢ２ＭポリペプチドとＨＬＡ－Ｅをコードするペプチドの間に配置された第２のリンカーをさらに含むことができる。
修飾Ｔ細胞は、非天然の抗原受容体、治療用ポリペプチドをコードする配列、又はこれらの組み合わせをさらに含むことができる。非天然の抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができる。
ＣＳＲは、修飾Ｔ細胞で一時的に発現され得る。ＣＳＲは修飾Ｔ細胞で安定して発現され得る。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含むポリペプチドは、修飾Ｔ細胞で一時的に発現され得る。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含むポリペプチドは、修飾Ｔ細胞で安定して発現され得る。誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、修飾Ｔ細胞で一時的に発現され得る。誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、修飾Ｔ細胞で安定して発現され得る。非天然の抗原受容体又は治療用タンパク質をコードする配列は、修飾Ｔ細胞で一時的に発現され得る。非天然の抗原受容体又は治療用タンパク質をコードする配列は、修飾Ｔ細胞で安定して発現され得る。
修飾Ｔ細胞は、自己細胞であり得る。修飾Ｔ細胞は、同種異系細胞であり得る。修飾Ｔ細胞は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）、又は幹細胞様Ｔ細胞であり得る。

本開示は、本明細書に開示の任意の修飾Ｔ細胞を含む組成物を提供する。本開示はまた、修飾Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の集団を含む組成物を提供し、ここで集団の複数の修飾Ｔ細胞は、本明細書に開示のＣＳＲを含む。本開示はまた、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の集団を含む組成物を提供し、ここで集団の複数のＴ細胞は、本明細書に開示の修飾Ｔ細胞を含む。
本開示は、それを必要とする被験体に、本明細書に開示の任意の組成物、又は疾患若しくは障害の治療に使用するための組成物の治療有効量を投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法を提供する。１つの態様において、組成物は、本明細書に開示の修飾Ｔ細胞又は修飾Ｔ細胞の集団である。本開示はまた、それを必要とする被験体に、本明細書に開示の組成物、及びＣＳＲに結合する少なくとも１つの非天然の分子の治療有効量の組成物を投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法を含む。
本開示は、複数の修飾Ｔ細胞内でＣＳＲを安定して発現し、かつ複数の修飾Ｔ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞へ、本開示のＣＳＲ又はこれをコードする配列を含む組成物を導入することを含むか、から本質的になるか、又はからなる、修飾Ｔ細胞の集団の産生方法を提供する。本開示は、この方法によって産生された修飾Ｔ細胞の集団を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ＣＳＲを含む集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）又はＴSCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現し、ここで、１種以上の細胞表面マーカーはＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを含む。いくつかの態様において、集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも集団の９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）又はＴCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現し、及びここで、１種以上の細胞表面マーカーはＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌを含む。組成物は、疾患又は障害の治療に使用することができる。本開示はまた、疾患又は障害の治療のための方法によって生成される組成物の使用を提供する。本開示はさらに、その方法によって生成される治療有効量の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法を提供する。この治療方法はさらに、被験体に活性化因子組成物を投与して、修飾Ｔ細胞の集団をインビボで活性化すること、修飾Ｔ細胞の集団の細胞***をインビボで誘導すること、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
本開示は、複数の修飾Ｔ細胞内でＣＳＲを一時的に発現し、かつ複数の修飾Ｔ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞へ、本開示のＣＳＲ又はこれをコードする配列を含む組成物を導入することを含むか、から本質的になるか、又はからなる、修飾Ｔ細胞の集団の産生方法を提供する。本開示は、この方法によって産生された修飾Ｔ細胞の集団を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ＣＳＲを含む集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）又はＴSCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現し、ここで、１種以上の細胞表面マーカーはＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを含む。いくつかの態様において、集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも集団の９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）又はＴCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現し、及びここで、１種以上の細胞表面マーカーはＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌを含む。組成物は、疾患又は障害の治療に使用することができる。本開示はまた、疾患又は障害の治療のための方法によって生成される組成物の使用を提供する。本開示はさらに、その方法によって生成される治療有効量の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、被験体に投与される修飾Ｔ細胞の集団内の修飾Ｔ細胞は、もはやＣＳＲを発現しない。
本開示は、複数の修飾Ｔ細胞内でＣＳＲを安定して発現し、かつ複数の修飾Ｔ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞へ、本開示のＣＳＲ又はこれをコードする配列を含む組成物を導入し、かつ前記細胞に活性化因子組成物を接触させて複数の活性化修飾Ｔ細胞を産生することを含む、修飾Ｔ細胞の集団を拡張させる方法を提供し、ここで、複数の修飾Ｔ細胞の拡張は、同じ条件下でＣＳＲを安定して発現しない複数の野生型Ｔ細胞の拡張よりも少なくとも２倍高い。いくつかの態様において、ＣＳＲを含む集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％ 少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）又はＴSCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現し、ここで、１種以上の細胞表面マーカーはＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを含む。いくつかの態様において、集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）又はＴCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現し、ここで、１種以上の細胞表面マーカーはＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌを含む。本開示は、この方法によって拡張された修飾Ｔ細胞の集団を含む組成物を提供する。この組成物は、疾患又は障害の治療に使用することができる。本開示はまた、疾患又は障害の治療のための、前記方法によって拡張された組成物の使用を提供する。本開示はさらに、前記方法によって拡張された組成物の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法を提供する。この治療方法はさらに、被験体に活性化因子組成物を投与して、修飾Ｔ細胞の集団をインビボで活性化すること、修飾Ｔ細胞の集団の細胞***をインビボで誘導すること、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
本開示は、複数の修飾Ｔ細胞内でＣＳＲを一時的に発現し、かつ複数の修飾Ｔ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞へ、本開示のＣＳＲ又はこれをコードする配列を含む組成物を導入し、かつ前記細胞に活性化因子組成物を接触させて複数の活性化修飾Ｔ細胞を産生することを含む、修飾Ｔ細胞の集団を拡張させる方法を提供し、ここで、複数の修飾Ｔ細胞の拡張は、同じ条件下でＣＳＲを一時的に発現しない複数の野生型Ｔ細胞の拡張よりも少なくとも２倍高い。本開示は、前記方法によって拡張された修飾Ｔ細胞の集団を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ＣＳＲを含む集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％ 少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）又はＴSCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現し、ここで、１種以上の細胞表面マーカーはＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを含む。いくつかの態様において、集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）又はＴCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現し、ここで、１種以上の細胞表面マーカーはＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌを含む。この組成物は、疾患又は障害の治療に使用することができる。本開示はまた、疾患又は障害の治療のための方法によって拡張された組成物の使用を提供する。本開示はさらに、前記方法によって拡張された組成物の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、被験体に投与される修飾Ｔ細胞の集団内の修飾Ｔ細胞は、もはやＣＳＲを発現しない。
上記の態様のいずれも、他の任意の態様と組み合わせることができる。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において、文脈で特に他に明記しない限り、単数形には複数形も含まれる。例として「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、単数形又は複数形であると理解され、「又は」という用語は、包括的であると理解される。例として「要素」は、１つ以上の要素を意味する。本明細書全体を通して、「含む（comprising）」という単語、又は「含む（comprises）」若しくは「含む（comprising）」などの変形は、記載された要素、整数、若しくは工程、又は要素、整数、若しくは工程の群を含むことを意味すると理解されるが、他の要素、整数、若しくは工程、又は要素、整数、若しくは工程の群を除外しない。約とは、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解することができる。文脈から特に明確でない限り、本明細書に提供されるすべての数値は「約」という用語によって修飾される。
本明細書に記載されたものと類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料は以下に記載される。本明細書に記載されているすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されている参考文献は、クレームされた発明の先行技術であると認めるものではない。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を有する本特許又は特許出願公開のコピーは、要請と必要な料金の支払いに応じて、特許庁から提供されるであろう。
図１は、同種異系又は自家ＣＡＲ－Ｔの製造を強化するためのＣＳＲ ＣＤ２ｚ－Ｄ１１１Ｈ変異体の例を示す概略図である。ＣＳＲ ＣＤ２ｚ－Ｄ１１１Ｈ変異体は、製造中に同種異系又は自家ＣＡＲ Ｔ細胞に送達されて、細胞の増殖と拡張、品質、生存、表現型、機能、サブセット組成、遺伝子編集効率などを増強することができる。これらの変異体ＣＳＲは、ｍＲＮＡにコード化されて一時的に、又はトランスポゾンにコード化されて安定して送達することができる。
図２は、同種異系又は自家ＣＡＲ－Ｔの製造を強化するための、ＣＤ８ａシグナルペプチドを有するＣＳＲ ＣＤ２ｚ－Ｄ１１１Ｈ変異体の例を示す概略図である。ＣＳＲ ＣＤ２ｚ－Ｄ１１１Ｈ変異体は、製造に同種異系又は自家ＣＡＲ Ｔ細胞に送達されて、細胞の増殖と拡張、品質、生存、表現型、機能、サブセット組成、遺伝子編集効率などを増強することができる。これらの変異体ＣＳＲは、ｍＲＮＡにコード化されて一時的に、又はトランスポゾンにコード化されて安定して送達することができる。
図３は、ＣＳＲの送達が、産生中のＣＡＲ Ｔ細胞拡張を増強することを示すグラフである。正常なドナー血液から単離されたＰａｎＴ細胞は、Cas-CLOVER（商標）遺伝子編集システムと組み合わせたpiggyBac（登録商標）ＤＮＡ修飾システムを使用して遺伝子修飾された。細胞は、１回の反応で、少なくともＣＡＲと選択遺伝子をコードするトランスポゾン、ＣＳＲをコードするｍＲＮＡ、スーパーpiggyBac（登録商標）トランスポサーゼ酵素をコードするｍＲＮＡ、Cas-CLOVER（商標）をコードするｍＲＮＡ、及びＴＣＲとＭＨＣＩをノックアウト（ダブルノックアウト；ＤＫＯ）するためのＴＣＲｂとｂ２Ｍを標的とする多重ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いて電気穿孔された。次に、細胞をアゴニストであるモノクローナル抗体抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８で刺激し、その後１４日間の培養期間にわたって遺伝子修飾について選択した。最初の培養期間の最後に、すべてのＴ細胞がＣＡＲを発現し、遺伝子修飾細胞の選択が成功したことを示していた。ＣＳＲを発現する試料では、ＤＫＯ細胞のより顕著な拡張が観察された。
図４は、異なるＣＳＲを使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞によるインビボ腫瘍制御を評価するための実験プロトコールを示す概略図である。同種異系ＣＡＲ－Ｔは、図１と３及び表１と２に記載されているように、異なる追加免疫剤を使用して産生された。多発性骨髄腫のマウス異種移植モデルを利用して、１０個の異なる追加免疫剤を用いて産生されたアロＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果を評価した。具体的には、ＲＰＭＩ－８２２６細胞株を１×１０7細胞の用量で雌ＮＳＧマウスに皮下注射（ＳＣ）し（－７日目）、その後、腫瘍が確立された０日目（キャリパー測定により７５～１２５ｍｍ3［目標平均、約１００ｍｍ3］）に、アロＣＡＲ Ｔ細胞を「ストレス」用量（５×１０6）で静脈内（ＩＶ）注射して処理した。「ストレス」用量は、異なる追加免疫分子で産生されたＣＡＲ Ｔ細胞間の有効性における機能的差異の可能性を検出する際の、より高い分解能のために使用された。
図５は、アロＣＡＲ Ｔ細胞処理後の経時的な腫瘍体積を示すグラフである。インビボ腫瘍制御は、図４に示されるプロトコールに従って、そして異なるＣＳＲを使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞の「ストレス」用量を使用して評価された。すべての動物についてキャリパー測定による腫瘍体積評価は、エラーバーを有するグループ平均としてＳＥＭ（平均の標準誤差）として表示される。
図６は、アロＣＡＲ Ｔ細胞処理後の経時的な血中の総Ｔ細胞を示すグラフである。インビボ腫瘍制御は、図４に示されるプロトコールに従って、そして異なるＣＳＲを使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞の「ストレス」用量を使用して評価された。血液中の総Ｔ細胞は、すべての動物について、１μｌあたりのヒトＣＤ４５＋細胞（ｈＣＤ４５＋／μＬ）のTruCount染色によって測定され、エラーバーを有するグループ平均としてＳＥＭとして表示される。
図７は、血液中のピークＴ細胞（Ｔ細胞Ｃmax）を示すグラフである。インビボ腫瘍制御は、図４に示されるプロトコールに従って、そして異なるＣＳＲを使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞の「ストレス」用量を使用して評価された。すべての動物について、ヒトＣＤ４５＋（ｈＣＤ４５＋）細胞のTruCount染色によって測定された血液中のＴ細胞のピークレベルは、エラーバーを有するグループ平均としてＳＥＭとして表示される。
図８は、血液中のＴ細胞（ｈＣＤ４５＋）の曲線下の面積を示すグラフである。インビボ腫瘍制御は、図４に示されるプロトコールに従って、そして異なるＣＳＲを使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞の「ストレス」用量を使用して評価された。すべての動物について、ヒトＣＤ４５＋細胞のTruCount染色から計算された血液中のＴ細胞ＡＵＣは、エラーバーを有するグループ平均としてＳＥＭとして表示される。
図９は、血液中のＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型を示す一連のグラフである。インビボ腫瘍制御は、図４に示されるプロトコールに従って、そして異なるＣＳＲを使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞の「ストレス」用量を使用して評価された。すべての動物について、ＦＡＣＳ染色によって測定された血液中のＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型は、ＣＡＲ－Ｔ処理後１４日目及び３５日目の、エラーバーを有するグループ平均としてＳＥＭとして表示される。細胞を表面ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、及びＣＤ６２Ｌの発現について染色して、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＥＭ、及びＴＥＦＦ細胞を定義した；ＴＳＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ６２Ｌ＋；青）、ＴＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋；赤）、ＴＥＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ－；緑）、ＴＥＦＦ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ６２Ｌ－；紫）。
相互参照されるか又は関連する特許又は特許出願を含む本明細書で引用されるすべての文書は、明示的に除外又は他の方法で制限されない限り、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。文書の引用は、それが、開示されたか又はクレームされた発明に関する先行技術であることを、又は単独で若しくは他の参考文献と組み合わせて、本明細書の発明を教示し、示唆し、又は開示していることを、認めるものではない。さらに、その文書中の用語の意味又は定義が、参照により組み込まれた本明細書の同じ用語の意味又は定義と矛盾する場合、本明細書中のその用語に割り当てられた意味又は定義が優先するものとする。
発明の詳細な説明
本開示は、同種異系細胞組成物、これらの組成物の作製方法、及び使用方法を提供し、これらは、環境刺激に対する同種異系細胞の応答性を回復し、並びにナチュラルキラー細胞に媒介される細胞毒性による拒絶を低減又は防止するための、天然に存在しない構造的改善を含む。
キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）及び組換えＨＬＡ－Ｅポリペプチド
いかなる患者への投与に対しても「普遍的に」安全である養子細胞組成物は、アロ反応性の顕著な低減又は排除を必要とする。この目的のために、本開示の細胞（例えば同種異系細胞）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスの発現又は機能を妨害するように修飾され得る。ＴＣＲは移植片対宿主（ＧｖＨ）反応を媒介し、一方ＭＨＣは宿主対移植片（ＨｖＧ）反応を媒介する。好適な態様において、被験体に死を引き起こす可能性のあるＴ細胞媒介性ＧｖＨを防ぐために、ＴＣＲの発現及び／又は機能は排除される。従って好適な態様において、本開示は、純粋なＴＣＲ陰性同種異系Ｔ細胞組成物（例えば組成物の各細胞は、検出できないか存在しないような低レベルで発現する）を提供する。
ＨｖＧを防止するため、従って被験体における細胞の生着を改善するために、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ、具体的にはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）の発現及び／又は機能は低減又は排除される。改善された生着は、細胞のより長期間の持続をもたらし、従って被験体のより大きな治療ウィンドウをもたらす。具体的には、ＭＨＣ－Ｉの構造要素であるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現及び／又は機能が低減又は排除される。
上記の戦略は、さらなる課題を引き起こす。Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ノックアウト（ＫＯ）により、ＴＣＲ複合体の一部であるＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ｚ又はＣＤ３ζ）の発現が失われる。ＴＣＲ－ＫＯ Ｔ細胞におけるＣＤ３ζの喪失は、特に限定されるものではないがアゴニスト抗ＣＤ３ｍＡｂを含む標準的な刺激／活性化試薬を使用して、これらの細胞を最適に活性化及び拡張する能力を劇的に低下させる。ＴＣＲ複合体のいずれかの成分の発現又は機能が妨害されると、ＴＣＲ－アルファ（ＴＣＲα）、ＴＣＲ－ベータ（ＴＣＲβ）、ＣＤ３－ガンマ（ＣＤ３γ）、ＣＤ３－イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ３－デルタ（ＣＤ３δ）、及びＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）を含む複合体の全ての成分が失われる。ＣＤ３εとＣＤ３ζの両方がＴ細胞の活性化と拡張に必要である。アゴニストである抗ＣＤ３ｍＡｂは通常、ＣＤ３εと、おそらく複合体内の別のタンパク質を認識し、これは次にＣＤ３ζにシグナルを伝達する。ＣＤ３ζは、最適な活性化と拡張のために、Ｔ細胞活性化のための一次刺激を（二次共刺激シグナルとともに）提供する。通常の条件下では、完全なＴ細胞の活性化は、免疫応答を増強する１つ以上の共刺激受容体（例えばＣＤ２８、ＣＤ２、４－１ＢＢＬ）によって媒介される２番目のシグナルと組み合わせたＴＣＲの関与に依存する。ただし、ＴＣＲが存在しない場合、アゴニスト抗ＣＤ３ｍＡｂを含む標準的な活性化／刺激試薬を使用して刺激すると、Ｔ細胞の拡張が大幅に低下する。実際、アゴニスト抗ＣＤ３ｍＡｂを含む標準的な活性化／刺激試薬を使用して刺激した場合、Ｔ細胞の拡張は通常の拡張レベルのわずか２０～４０％に低下する。
従って本開示は、（ａ）シグナルペプチドと活性化成分とを含む外部ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；及び（ｃ）細胞質ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを含む、非天然のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供し、ここでシグナルペプチドと細胞質ドメインは同じタンパク質に由来していない。
活性化成分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激性タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害性タンパク質の成分、サイトカイン受容体、及び活性化成分のアゴニストが結合するケモカイン受容体の、１つ以上の一部を含むことができる。活性化成分は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部を含むことができる。
シグナル伝達ドメインは、ヒトシグナル伝達ドメインの成分、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害タンパク質の成分、サイトカイン受容体、及びケモカイン受容体の、１つ以上を含むことができる。シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３タンパク質又はその一部を含むことができる。ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含むことができる。
活性化ドメインは、第１のタンパク質から単離又は誘導することができる。シグナルペプチドは、第２のタンパク質から単離又は誘導することができる。膜貫通ドメインは、第３のタンパク質から単離又は誘導することができる。細胞質ドメインは、第４のタンパク質から単離又は誘導することができる。シグナル伝達ドメインは、第５のタンパク質から単離又は誘導することができる。第１のタンパク質及び第２のタンパク質は同一であり得る。第１のタンパク質及び第３のタンパク質は同一であり得る。第１のタンパク質と第４のタンパク質は同一であり得ない。第１のタンパク質と第５のタンパク質は同一であり得ない。第２のタンパク質と第３のタンパク質は同一であり得る。第２のタンパク質と第４のタンパク質は同一であり得ない。第２のタンパク質と第５のタンパク質は同一であり得ない。第３のタンパク質と第４のタンパク質は同一であり得ない。第３のタンパク質と第５のタンパク質は同一であり得ない。第４のタンパク質と第５のタンパク質は同一であり得ない。
いくつかの態様において、活性化成分は、天然の分子に結合しない。いくつかの態様において、活性化成分は、天然の分子に結合するが、ＣＳＲは、活性化成分が天然の分子に結合する時、シグナルを伝達しない。いくつかの態様において、活性化成分は、非天然の分子に結合する。いくつかの態様において、活性化成分は、天然の分子に結合しないが、非天然の分子に結合する。ＣＳＲは、活性化成分が非天然の分子に結合する時、シグナルを選択的に伝達することができる。
本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾン又はベクターを提供する。
本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲを含む細胞を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含む細胞を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む細胞を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む細胞を提供する。
本明細書に開示の修飾細胞は、同種異系細胞又は自家細胞であり得る。いくつかの好適な態様において、修飾細胞は同種異系細胞である。いくつかの態様において、修飾細胞は、自家Ｔ細胞又は修飾自家ＣＡＲ Ｔ細胞である。いくつかの好適な態様において、修飾細胞は、同種異系Ｔ細胞又は修飾された同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞である。
本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示の任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示の修飾細胞を含む組成物、又は本明細書に開示の複数の修飾細胞を含む組成物を提供する。
本開示は、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の修飾であって、ＴＣＲの発現又は活性レベルを低減又は排除する修飾と；（ｂ）（ｉ）第１のタンパク質から単離又は誘導された活性化成分を含む外部ドメイン、；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）第２のタンパク質から単離又は誘導される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含むキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）とを、含む修飾Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を提供し、ここで、第１のタンパク質と第２のタンパク質は同一ではない。
修飾Ｔ細胞は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをさらに含むことができる。修飾Ｔ細胞は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の修飾をさらに含むことができ、ここで、前記修飾は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）の発現又は活性のレベルを低減又は排除する。
修飾Ｔ細胞は、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）ポリペプチドを含む非天然のポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然のポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然のポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然のポリペプチドは、リンカーをさらに含むことができ、ここで、リンカーは、Ｂ２ＭポリペプチドとＨＬＡ－Ｅポリペプチドとの間に配置される。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然のポリペプチドは、ペプチドとＢ２Ｍポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅを含む非天然のポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドとペプチドの間に配置された第１のリンカー、及びＢ２ＭポリペプチドとＨＬＡ－Ｅをコードするペプチドの間に配置された第２のリンカーをさらに含むことができる。
修飾Ｔ細胞は、非天然の抗原受容体、治療用ポリペプチドをコードする配列、又はこれらの組み合わせをさらに含むことができる。非天然の抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができる。
ＣＳＲは、修飾Ｔ細胞で一時的に発現され得る。ＣＳＲは修飾Ｔ細胞で安定して発現され得る。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含むポリペプチドは、修飾Ｔ細胞で一時的に発現され得る。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含むポリペプチドは、修飾Ｔ細胞で安定して発現され得る。誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、修飾Ｔ細胞で一時的に発現され得る。誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、修飾Ｔ細胞で安定して発現され得る。非天然の抗原受容体又は治療用タンパク質をコードする配列は、修飾Ｔ細胞で一時的に発現され得る。非天然の抗原受容体又は治療用タンパク質をコードする配列は、修飾Ｔ細胞で安定して発現され得る。
本明細書に詳細に記載されるように、特に限定されるものではないが、ｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１を含むＲＮＡ誘導融合タンパク質を含む遺伝子編集組成物を使用して、内因性Ｔ細胞受容体の発現を標的化し、低減又は排除することができる。好適な態様において、遺伝子編集組成物は、内因性Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子、遺伝子の一部、又は遺伝子の調節要素（プロモーターなど）を標的化して削除する。ＴＣＲ－アルファ（ＴＣＲ－α）を標的化及び削除するための、ＴＣＲ－ベータ（ＴＣＲ－β）を標的化及び削除するための、及びベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）を標的化及び削除するための、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）鋳型を生成するためのプライマー（Ｔ７プロモーター、ゲノム標的配列、及びｇＲＮＡ足場を含む）の非限定的な例は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。
特に限定されるものではないが、ｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１を含むＲＮＡ誘導融合タンパク質を含む遺伝子編集組成物を使用して、内因性ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、又はＭＨＣ活性化因子の発現を標的化し、低減又は排除することができる。好適な態様において、遺伝子編集組成物は、内因性ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、又はＭＨＣ活性化因子の１つ以上の成分をコードする遺伝子、遺伝子の一部、又は遺伝子の調節要素（プロモーターなど）を標的化して削除する。ＭＨＣ活性化因子を標的化及び削除するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の非限定的な例は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）に開示されている。
非天然のキメラ刺激受容体、ＴＣＲ－アルファ（ＴＣＲ－α）、ＴＣＲ－ベータ（ＴＣＲ－β）、及び／又はベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）、及びＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）ポリペプチドをコードする内因性配列の遺伝子修飾を含む非天然のポリペプチドの詳細な説明は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）に開示されている。
本開示のキメラ刺激受容体
本開示は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなる活性化成分を含むキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000002
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000003
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部は、配列番号２の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
本開示は、非天然のＣＤ２細胞外ドメインを含むか、から本質的になるか、又はからなる活性化成分を含む外部ドメインを含むキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。いくつかの態様において、本開示のＣＳＲの外部ドメインは、修飾を含むことができる。修飾は、活性化成分の野生型アミノ酸配列と比較して、活性化成分のアミノ酸配列において突然変異又は末端切断を含むことができる。活性化成分のアミノ酸配列における突然変異又は末端切断は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部の突然変異又は末端切断を含むことができる。変異又は切断されたＣＤ２細胞外ドメインは、抗ＣＤ２活性化アゴニスト及び抗ＣＤ２活性化分子に結合するが、天然のＣＤ５８には結合しない。いくつかの態様において、抗ＣＤ２活性化アゴニストに結合するがＣＤ５８には結合しないＣＤ２細胞外ドメインに存在する突然変異は、Ｄ１１１Ｈ突然変異である。Ｄ１１１Ｈ突然変異を有するＣＤ２細胞外ドメインは、
Figure 2022547866000004
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、Ｄ１１１Ｈ突然変異を有するＣＤ２の細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、Ｄ１１１Ｈ変異を有するＣＤ２細胞外ドメインは、
Figure 2022547866000005
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、Ｄ１１１Ｈ変異を有するＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号４の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
本開示のＣＳＲの内部ドメインはさらに、シグナルペプチドを含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、ＣＤ２シグナルペプチド又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、ＣＤ８ａシグナルペプチド又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、ＣＤ２シグナルペプチドは、MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVS （配列番号５）と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＣＤ２シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＣＤ２シグナルペプチドは、
Figure 2022547866000006
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＣＤ２シグナルペプチドは、配列番号６の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、ＣＤ８ａシグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP （配列番号７）と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＣＤ８ａシグナルペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＣＤ８ａシグナルペプチドは、
Figure 2022547866000007
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＣＤ８ａシグナルペプチドは、配列番号８の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
本開示は、膜貫通ドメインを含むＣＳＲを提供する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部は、IYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYIT（配列番号９）と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000008
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部は、配列番号１０の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
本開示は、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含むＣＳＲを提供する。いくつかの態様において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000009
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000010
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号１２の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
本開示のＣＳＲの内部ドメインはさらに、細胞質ドメインを含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＣＤ２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＣＤ２８細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、４－１ＢＢ細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＣＤ２７細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＯＸ４０細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、細胞質ドメインは、ＧＩＴＲ細胞内ドメイン又はその一部を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、ＣＤ２細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000011
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＣＤ２細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＣＤ２細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000012
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＣＤ２細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号１４の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、ＣＤ２８細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000013
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＣＤ２８細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＣＤ２８細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000014
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＣＤ２８細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号１６の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、４－１ＢＢ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000015
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、４－１ＢＢ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、４－１ＢＢ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000016
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、４－１ＢＢ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号１８の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000017
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000018
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２０の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000019
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000020
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２２の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000021
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000022
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２４の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000023
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000024
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２６の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、ＣＤ２７細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000025
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＣＤ２７細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＣＤ２７細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000026
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＣＤ２７細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２８の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、ＯＸ４０細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000027
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＯＸ４０細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＯＸ４０細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000028
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＯＸ４０細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号３０の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、ＧＩＴＲ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000029
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。好適な態様において、ＧＩＴＲ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、ＧＩＴＲ細胞内ドメイン又はその一部は、
Figure 2022547866000030
 と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好適な態様において、ＧＩＴＲ細胞内ドメイン又はその一部は、配列番号３２の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
Figure 2022547866000031
Figure 2022547866000032
Figure 2022547866000033
Figure 2022547866000034
Figure 2022547866000035
Figure 2022547866000036
Figure 2022547866000037
Figure 2022547866000038
Figure 2022547866000039
Figure 2022547866000040
Figure 2022547866000041
Figure 2022547866000042
Figure 2022547866000043
Figure 2022547866000044
Figure 2022547866000045
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Figure 2022547866000047
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Figure 2022547866000049
Figure 2022547866000050
Figure 2022547866000051
Figure 2022547866000052
Figure 2022547866000053
Figure 2022547866000054
Figure 2022547866000055
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Figure 2022547866000072
本開示の組成物（例えばＣＳＲ）は、抗ＣＤ２活性化アゴニスト及び抗ＣＤ２活性化分子に結合するが、天然のＣＤ５８には結合しない。
本開示のＣＳＲを含む組成物は、本明細書に詳細に記載されるように細胞送達組成物（例えばトランスポゾン又はベクター）に組み込むことができ、任意選択的に、細胞に組み込むことができる。
本開示の細胞及び修飾細胞
本開示の細胞及び修飾細胞は、哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、細胞及び修飾細胞はヒト細胞である。本開示の細胞及び修飾細胞は、免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、リンパ系前駆細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM細胞）、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）、幹細胞様Ｔ細胞、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、血小板、赤血球、赤血球（ＲＢＣ）、巨核球、又は破骨細胞を含むことができる。
免疫前駆細胞は、１つ以上のタイプの免疫細胞に分化することができる任意の細胞を含むことができる。免疫前駆細胞は、自己複製して免疫細胞に成長することができる多能性幹細胞を含むことができる。免疫前駆細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はその子孫を含むことができる。免疫前駆細胞は、免疫細胞に成長することができる前駆細胞を含むことができる。免疫前駆細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含むことができる。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性の自己複製細胞である。リンパ系及び骨髄系からのすべての分化した血液細胞は、ＨＳＣから生じる。ＨＳＣは、成人の骨髄、末梢血、動員された末梢血、腹膜透析廃液、及び臍帯血に見られる。
ＨＳＣは、初代又は培養幹細胞から単離又は誘導することができる。ＨＳＣは、胚性幹細胞、多能性（multipotent）幹細胞、多能性（pluripotent）幹細胞、成体幹細胞、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から単離又は誘導することができる。
免疫前駆細胞は、ＨＳＣ又はＨＳＣ子孫細胞を含むことができる。ＨＳＣ子孫細胞の非限定的な例には、多能性幹細胞、リンパ球前駆細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球細胞（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球細胞（Ｂ細胞）、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、及びマクロファージが含まれる。
開示された方法によって生成されたＨＳＣは、「原始」幹細胞の特徴を保持することができ、この「原始」幹細胞は、成体幹細胞から単離又は誘導され、単一の系統に関与している間、胚性幹細胞の特徴を共有する。例えば開示された方法によって生成された「原始」ＨＳＣは、分割後もそれらの「幹細胞性」を保持し、分化しない。その結果、養子細胞療法として、開示された方法によって生成された「原始」ＨＳＣは、それらの数を補充するだけでなく、インビボで拡張する。開示された方法によって生成された「原始」ＨＳＣは、単回投与として投与された場合に治療的に有効であり得る。
原始ＨＳＣはＣＤ３４＋であり得る。原始ＨＳＣはＣＤ３４＋及びＣＤ３８－であり得る。原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、及びＣＤ９０＋であり得る。原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、及びＣＤ４５ＲＡ－であり得る。原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－、及びＣＤ４９ｆ＋であり得る。原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－、及びＣＤ４９ｆ＋であり得る。
原始ＨＳＣ、ＨＳＣ、及び／又はＨＳＣ子孫細胞は、開示された方法に従って修飾して、外因性配列（例えばキメラ抗原受容体又は治療用タンパク質）を発現させることができる。特に限定されるものではないが、修飾された原始ＨＳＣ、修飾されたＨＳＣ、及び／又は修飾されたＨＳＣ子孫細胞は前方分化させて、特に限定されるものではないが、修飾Ｔ細胞、修飾ナチュラルキラー細胞、及び／又は修飾Ｂ細胞を含む修飾免疫細胞を産生することができる。
修飾された免疫細胞又は免疫前駆細胞は、ＮＫ細胞であり得る。ＮＫ細胞は、リンパ球前駆細胞から分化する細胞傷害性リンパ球であり得る。修飾ＮＫ細胞は、修飾造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は修飾ＨＳＣに由来し得る。いくつかの態様において、非活性化ＮＫ細胞は、ＣＤ３枯渇白血球アフェレーシス（ＣＤ１４／ＣＤ１９／ＣＤ５６＋細胞を含む）に由来する。
修飾された免疫細胞又は免疫前駆細胞は、Ｂ細胞であり得る。Ｂ細胞は、細胞表面にＢ細胞受容体を発現するリンパ球の一種である。Ｂ細胞受容体は特定の抗原に結合する。修飾Ｂ細胞は、修飾造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は修飾ＨＳＣに由来し得る。
本開示の修飾Ｔ細胞は、修飾造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は修飾ＨＳＣに由来し得る。従来の生物学的製剤及び化学療法薬とは異なり、開示された修飾Ｔ細胞は、抗原認識時に迅速に複製する能力を有し、従って、反復治療の必要性を潜在的に排除する。これを達成するために、いくつかの実施態様において、修飾Ｔ細胞は初期応答を促進するだけでなく、生存能力のある記憶Ｔ細胞の安定した集団として患者に存続して、潜在的な再発を防ぐ。あるいは、いくつかの態様において、それが望まれない場合、修飾Ｔ細胞は患者中で持続しない。
抗原非依存性（トニック）シグナル伝達を介するＴ細胞枯渇を引き起こさない抗原受容体分子の開発、並びに初期記憶Ｔ細胞、特に幹細胞記憶（ＴSCM）又は幹細胞様Ｔ細胞を含む修飾Ｔ細胞産物の開発に、集中的な努力がされてきた。本開示の幹細胞様修飾Ｔ細胞は、自己複製と多能性能力について最大の能力を示して、中央記憶（ＴCM）Ｔ細胞又はＴCM様細胞、エフェクター記憶（ＴEM）及びエフェクターＴ細胞（ＴE）を誘導し、それによりより良好な腫瘍根絶と長期の修飾Ｔ細胞生着を達成する。分化の線形経路は、これらの細胞（ナイーブＴ細胞（ＴN）＞ＴSCM＞＞ＴEM＞ＴE＞ＴTE）の生成に関与している可能性があり、ここで、ＴNは、ＴSCMを直接生み出す親前駆細胞であり、これは、次に、ＴCMを直接生成する。本開示のＴ細胞の組成物は、各親Ｔ細胞サブセットの１つ以上を含むことができ、ＴSCM細胞が最も豊富である（例えばＴSCM＞ＴCM＞ＴEM＞ＴE＞ＴTE）。
免疫細胞前駆細胞は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＴN）、ＴSCM、ＴＣＭ、ＴEM、ＴE、又はＴTEに分化され得るか又は分化し得る。免疫細胞前駆体は、本開示の原始ＨＳＣ、ＨＳＣ、又はＨＳＣ子孫細胞であり得る。免疫細胞は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＴN）、ＴSCM、ＴCM、ＴEM、ＴE、又はＴTEであり得る。
本開示の方法は、修飾Ｔ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団内の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意のパーセントが、初期記憶Ｔ細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。修飾された初期記憶Ｔ細胞の集団は、複数の修飾された幹細胞様Ｔ細胞を含む。修飾された初期記憶Ｔ細胞の集団は、複数の修飾されたＴSCM細胞を含む。修飾された初期記憶Ｔ細胞の集団は、複数の修飾されたＴCM細胞を含む。
本開示の方法は、修飾Ｔ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団内の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意のパーセントが、幹細胞様Ｔ細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。修飾された幹細胞様Ｔ細胞の集団は、複数の修飾されたＴSCM細胞を含む。修飾された幹細胞様Ｔ細胞の集団は、複数の修飾されたＴCM細胞を含む。
いくつかの態様において、集団内の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％、あるいはこれらの間の任意のパーセントが、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）又はＴSCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現する；及びここで、１種以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを含む。細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５、及びＩＬ－２Ｒβの１つ以上を含むことができる。細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌの１つ以上を含むことができる。
いくつかの態様において、集団内の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％、あるいはこれらの間の任意のパーセントが、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）又はＴCM様細胞の１種以上の細胞表面マーカーを発現する；及びここで、１種以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌを含む。細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌの１つ以上を含むことができる。
本開示の方法は、修飾Ｔ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団内の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意のパーセントが、ナイーブＴ細胞（ＴN）の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌの１つ以上を含むことができる。
本開示の方法は、修飾Ｔ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団内の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意のパーセントが、エフェクターＴ細胞（ＴEFF）の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、及びＩＬ－２Ｒβの１つ以上を含むことができる。
本開示の方法は、修飾Ｔ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団内の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意のパーセントが、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、又は中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。
集団の複数の修飾細胞は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列（例えばＣＡＲ）を含み、ここで、集団の複数の細胞の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列を含み、ここで、修飾細胞の集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、ＣＤ３４を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、又はここで、修飾細胞の集団の少なくとも約７０％～約９９％、約７５％～約９５％、又は約８５％～約９５％は、ＣＤ３４を含む１種以上の細胞表面マーカー（例えば細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋を含む）を発現する。
集団の複数の修飾細胞は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列（例えばＣＡＲ）を含み、ここで、集団の複数の細胞の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列を含み、ここで、修飾細胞の集団の少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、ＣＤ３４を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ３８を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現せず、又はここで、修飾細胞の集団の少なくとも約４５％～約９０％、約５０％～約８０％、又は約６５％～約７５％は、ＣＤ３４を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ３８を含む１種以上の細胞表面マーカー（例えば細胞表面マーカーの表現型ＣＤ３４＋及びＣＤ３８－）を発現しない。
集団の複数の修飾細胞は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列（例えばＣＡＲ）を含み、ここで、集団の複数の細胞の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列を含み、ここで、修飾細胞の集団の少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ３８を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現せず、又はここで、修飾細胞の集団の少なくとも約０．２％～約４０％、約０．２％～約３０％、約０．２％～約２％、又は０．５％～約１．５％は、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ３８を含む１種以上の細胞表面マーカー（例えば細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、及びＣＤ９０＋）を発現しない。
集団の複数の修飾細胞は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列（例えばＣＡＲ）を含み、ここで、集団の複数の細胞の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列を含み、ここで、修飾細胞の集団の少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ３８及びＣＤ４５ＲＡを含む１種以上の細胞表面マーカーを発現せず、又はここで、修飾細胞の集団の少なくとも約０．２％～約４０％、約０．２％～約３０％、約０．２％～約２％、又は０．５％～約１．５％は、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ３８及びＣＤ４５ＲＡを含む１種以上の細胞表面マーカー（例えば細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－）を発現しない。
集団の複数の修飾細胞は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列（例えばＣＡＲ）を含み、ここで、集団の複数の細胞の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列を含み、ここで、修飾細胞の集団の少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、ＣＤ３４、ＣＤ９０、及びＣＤ４９ｆを含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ３８及びＣＤ４５ＲＡを含む１種以上の細胞表面マーカーを発現せず、又はここで、修飾細胞の集団の少なくとも約０．０２％～約３０％、０．０２％～約２％、約０．０４％～約２％、又は約０．０４％～約１％は、ＣＤ３４、ＣＤ９０、及びＣＤ４９ｆを含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ３８及びＣＤ４５ＲＡを含む１種以上の細胞表面マーカー（例えば細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－、及びＣＤ４９ｆ＋）を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現しない。
集団の複数の修飾細胞は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列（例えばＣＡＲ）を含み、ここで、集団の複数の細胞の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、トランス遺伝子又はトランス遺伝子をコードする配列を含み、ここで、修飾細胞の集団の少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％は、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ４５ＲＡを含む１種以上の細胞表面マーカーを発現せず、又はここで、修飾細胞の集団の少なくとも約０．２％～約５％、約０．２％～約３％、又は約０．４％～約３％は、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１種以上の細胞表面マーカーを発現し、かつＣＤ４５ＲＡを含む１種以上の細胞表面マーカー（例えば細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、及びＣＤ４５ＲＡ－）を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現しない。
免疫細胞又は免疫前駆細胞（例えば開示された修飾Ｔ細胞）を産生及び／又は拡張する組成物及び方法、並びに免疫細胞又は免疫前駆細胞（例えば開示された修飾Ｔ細胞）の細胞生存率及び／又は幹様表現型のレベルを維持又は増強するための緩衝液は、本明細書の他の場所に開示されており、及び米国特許第１０，３２９，５４３号及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６により詳細に開示されている。
本開示の細胞及び修飾細胞は、体細胞であり得る。本開示の細胞及び修飾細胞は、分化した細胞であり得る。本開示の細胞及び修飾細胞は、自家細胞又は同種異系細胞であり得る。同種異系細胞は、被験体への投与後の生着に対する有害反応を防ぐように工学作成される。同種異系細胞は、任意のタイプの細胞であり得る。同種異系細胞は幹細胞でもよく、又は幹細胞に由来してもよい。同種異系細胞は、分化した体細胞でもよい。
キメラ抗原受容体を発現させる方法
本開示は、細胞の表面上でＣＡＲを発現させる方法を提供する。この方法は、（ａ）細胞集団を取得すること；（ｂ）細胞集団内の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切ってＣＡＲを移送するのに十分な条件下で、細胞集団をＣＡＲ又はＣＡＲをコードする配列を含む組成物に接触させ、こうして修飾された細胞集団を生成すること；（ｃ）修飾された細胞集団を、ＣＡＲをコードする配列の組み込みに適した条件下で培養すること；（ｄ）細胞表面にＣＡＲを発現する修飾された細胞集団から、少なくとも１つの細胞を拡張及び／又は選択すること、を含む。
いくつかの態様において、細胞集団は、白血球及び／又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋白血球を含むことができる。細胞集団は、最適化された比率でＣＤ４＋及びＣＤ８＋白血球を含むことができる。ＣＤ４＋白血球とＣＤ８＋白血球の最適比率は、インビボでは自然には発生しない。細胞集団は腫瘍細胞を含むことができる。
いくつかの態様において、ＣＡＲ、又はＣＡＲ、トランスポゾン、若しくはベクターをコードする配列を、細胞集団中の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切って移送するのに十分な条件は、特定の電圧の１つ以上の電気パルス、緩衝液、及び１種以上の補足因子の少なくとも１つの適用を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲをコードする配列の組み込みに適した条件は、少なくとも１つの緩衝液及び１種以上の補足因子を含む。
緩衝液は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、OptiMEM、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。１種以上の補足因子は、（ａ）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はこれらの任意の組み合わせ；（ｂ）塩、無機物、代謝物、又はこれらの任意の組み合わせ；（ｃ）細胞培地；（ｄ）細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つ以上のアポトーシス経路、又はこれらの組み合わせの阻害剤；及び（ｅ）１つ以上の核酸を修飾又は安定化する試薬、を含むことができる。組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はこれらの任意の組み合わせは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ ｂｅｔａ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロダイマー、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。塩、無機物、代謝物、又はこれらの任意の組み合わせは、ヘペス、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、ｐＨ調整剤、アールズ塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ2、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮＡＨ2ＰＯ4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ3）2、トリス／ＨＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１８１、ポロキサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、Ｃｒｏｗｎ－５、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞培地は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、OptiMEM、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、CellGro DC培地、CTS OpTimizer Ｔ細胞拡張ＳＦＭ、TexMACS培地、PRIME-XV Ｔ細胞拡張培地、ImmunoCult-XFＴ細胞拡張培地、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つ以上のアポトーシス経路、又はこれらの組み合わせの阻害剤は、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）の阻害剤（例えばＴＷＳ１１９）、又はこれらの任意の組み合わせを含む。このような阻害剤の例には、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫ、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つ以上の核酸を修飾又は安定化する試薬は、ｐＨ修飾剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を含むか又は含まない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
拡張と選択の工程は、同時に又は逐次的に実行することができる。拡張は、選択の前に行われる可能性がある。拡張は選択後に行われる可能性があり、任意選択的に、拡張後にさらなる（つまり２回目の）選択が行われる可能性がある。共同的な拡張と選択は同時に行うことができる。拡張及び／又は選択工程は、１０～１４日間（両端の値を含む）続行することができる。
拡張は、修飾細胞集団の少なくとも１つの細胞を抗原と接触させて、ＣＡＲを介してその少なくとも１つの細胞を刺激し、こうして、拡張された細胞集団を生成することを含むことができる。抗原は、基質の表面に提示することができる。基質は任意の形成で良く、特に限定されるものではないが、表面、ウェル、ビーズ、又はこれらの複数、及びマトリックスを含む。基質は、常磁性又は磁性成分をさらに含むことができる。抗原は基質の表面に提示することができ、ここで、基質は磁性ビーズであり、磁石を使用して、修飾及び拡張された細胞集団から磁性ビーズを除去又は分離することができる。抗原は、細胞の表面又は人工的抗原提示細胞に提示することができる。人工的抗原提示細胞には、特に限定されるものではないが、腫瘍細胞及び幹細胞が含まれ得る。
トランスポゾン又はベクターが選択遺伝子を含むいくつかの態様において、選択工程は、修飾細胞集団の少なくとも１つの細胞に、選択遺伝子が耐性を付与する化合物を接触させ、こうして、選択遺伝子を発現する細胞を選択を生き残るものとして特定し、選択遺伝子を発現できない細胞を選択工程を生き残ることができないものとして特定する。
本開示は、本明細書に記載された方法の修飾され、拡張され、そして選択された細胞集団を含む組成物を提供する。
細胞の表面にＣＡＲを発現させるための方法のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０４９８１６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。
本開示は、細胞又は細胞の集団を提供し、ここで、細胞は、（ａ）誘導性プロモーターをコードする配列及びトランス遺伝子をコードする配列を含む、誘導性トランス遺伝子構築物と、（ｂ）構成的プロモーターをコードする配列とＣＡＲなどの外因性受容体をコードする配列とを含む受容体構築物、とを含む組成物を含み、ここで、（ａ）の構築物と（ｂ）の構築物が細胞のゲノム配列に組み込まれると、外因性受容体が発現され、ここで、外因性受容体は、リガンド又は抗原に結合すると、誘導性プロモーターを直接的又は間接的に標的とする細胞内シグナルを伝達し、誘導性トランス遺伝子（ａ）の発現を調節して遺伝子発現を修飾する。
組成物は、遺伝子発現を減少させることによって遺伝子発現を修飾することができる。組成物は、遺伝子発現を一時的に（例えばリガンドが外因性受容体に結合している間）修飾することによって、遺伝子発現を修飾することができる。組成物は、遺伝子発現を急激に（例えばリガンドは外因性受容体に可逆的に結合する）修飾することができる。組成物は、遺伝子発現を慢性的に（例えばリガンドは外因性受容体に不可逆的に結合する）修飾することができる。
外因性受容体は、細胞のゲノム配列に関して内因性受容体を含むことができる。例示的な受容体には、特に限定されるものではないが、細胞内受容体、細胞表面受容体、膜貫通受容体、リガンド依存性イオンチャネル、及びＧタンパク質共役受容体が含まれる。
外因性受容体は、非天然の受容体を含むことができる。非天然の受容体は、合成、修飾、組換え、変異、又はキメラ受容体であり得る。非天然の受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離又は誘導される１つ以上の配列を含むことができる。非天然の受容体は、足場タンパク質から単離又は誘導される１つ以上の配列を含むことができる。非天然の受容体が膜貫通ドメインを含まないものを含むいくつかの態様において、非天然の受容体は、第２の膜貫通、膜結合、及び／又は細胞内受容体と相互作用し、これは、非天然の受容体との接触後に細胞内シグナルを伝達する。非天然の受容体は、膜貫通ドメインを含むことができる。非天然の受容体は、細胞内シグナルを伝達する細胞内受容体と相互作用することができる。非天然の受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。非天然の受容体は、キメラリガンド受容体（ＣＬＲ）であり得る。ＣＬＲはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
誘導性プロモーターをコードする配列は、ＮＦκＢプロモーターをコードする配列、インターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターをコードする配列、又はインターロイキン－２プロモーターをコードする配列を含む。いくつかの態様において、ＩＦＮプロモーターはＩＦＮγプロモーターである。誘導性プロモーターは、サイトカイン又はケモカインのプロモーターから単離又は誘導することができる。サイトカイン又はケモカインは、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、コロニー刺激因子２（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、ＬＴα、パーフォリン、グランザイムＣ（Ｇｚｍｃ）、グランザイムＢ（Ｇｚｍｂ）、ＣＣモチーフケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド４（Ｃｃｌ４）、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド３（Ｃｃｌ３）、Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（Ｘｃｌ１）、又はＬＩＦインターロイキン６ファミリーサイトカイン（Ｌｉｆ）を含むことができる。
誘導性プロモーターは、細胞の分化、活性化、枯渇、及び機能に関与する表面タンパク質を含む遺伝子のプロモーターから、単離又は誘導することができる。いくつかの態様において、遺伝子は、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＧＩＴＲ、ＭＨＣＩＩ、ＣＯＸ－２、ＦＡＳＬ、又は４－１ＢＢを含む。
誘導性プロモーターは、ＣＤの代謝及び分化に関与する遺伝子のプロモーターから、単離又は誘導することができる。誘導性プロモーターは、Ｎｒ４ａ１、Ｎｒ４ａ３、Ｔｎｆｒｓｆ９（４－１ＢＢ）、Ｓｅｍａ７ａ、Ｚｆｐ３６ｌ２、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｄｕｓｐ５、Ｄｕｓｐ６、及びＮｅｔｏ２のプロモーターから、単離又は誘導することができる。
いくつかの態様において、誘導性トランス遺伝子構築物は、抑制性チェックポイントシグナル、転写因子、サイトカイン又はサイトカイン受容体、ケモカイン又はケモカイン受容体、細胞死又はアポトーシス受容体／リガンド、代謝感知分子、癌治療に対する感受性を付与するタンパク質、及び癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の下流の、シグナル伝達成分の発現を含むか又は駆動する。その非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。
装甲細胞（armored cells）
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）は、さらに修飾してそれらの治療可能性を高めることができる。あるいは又はさらに、修飾細胞はさらに修飾して、これらを、免疫学的及び／又は代謝的チェックポイントに対して感受性を低下させることができる。この種の修飾は、細胞を「装甲」し、この修飾後の細胞は、本明細書では「装甲」細胞（例えば装甲Ｔ細胞）と呼ばれる。装甲細胞は、例えば腫瘍免疫抑制微小環境内で、自然に細胞に送達される特定のチェックポイントシグナルを遮断及び／又は希釈（例えばチェックポイント阻害）することによって生成され得る。
本開示の装甲細胞は、任意の細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、造血前駆細胞、末梢血（ＰＢ）由来Ｔ細胞（Ｇ－ＣＳＦ動員末梢血から単離又は誘導されたＴ細胞を含む）、又は臍帯血（ＵＣＢ）由来Ｔ細胞に由来し得る。装甲細胞（例えば装甲Ｔ細胞）は、キメラリガンド受容体（タンパク質足場、抗体、ＳｃＦｖ、又は抗体模倣物を含むＣＬＲ）／キメラ抗原受容体（タンパク質足場、抗体、ＳｃＦｖ、又は抗体ミメティックを含むＣＡＲ）、ＣＡＲＴｙｒｉｎ（センチリンを含むＣＡＲ）、及び／又はＶＣＡＲ（ラクダＶＨＨ又は単一ドメインＶＨを含むＣＡＲ）の１つ以上を含むことができる。装甲細胞（例えば装甲Ｔ細胞）は、本明細書に開示されるように、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。装甲細胞（例えば装甲Ｔ細胞）は、外因性配列を含むことができる。外因性配列は、治療用タンパク質をコードする配列を含むことができる。例示的な治療用タンパク質は、核、細胞質、細胞内、膜貫通、細胞表面結合、又は分泌タンパク質であり得る。装甲細胞（例えば装甲Ｔ細胞）によって発現される例示的な治療用タンパク質は、装甲細胞の活性を修飾し得るか、又は第２の細胞の活性を修飾し得る。装甲細胞（例えば装甲Ｔ細胞）は、選択遺伝子又は選択マーカーを含むことができる。装甲細胞（例えば装甲Ｔ細胞）は、合成遺伝子発現カセット（誘導性トランス遺伝子構築物とも呼ばれる）を含むことができる。
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、抑制性チェックポイントシグナルの受容体をコードする１種以上の遺伝子の発現をサイレンス化又は低減して、装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）を生成することができる。抑制性チェックポイントシグナルの受容体は、細胞表面又は細胞の細胞質内に発現される。抑制性チェックポイントシグナルの受容体をコードする遺伝子の発現をサイレンス化又は低減すると、装甲細胞の表面又は細胞質内での抑制性チェックポイント受容体のタンパク質発現が失われる。従って、抑制性チェックポイント受容体をコードする１種以上の遺伝子の発現をサイレンス化又は低減した装甲細胞は、チェックポイントシグナルに対して耐性、非受容性、又は非感受性である。抑制性チェックポイントシグナルに対する装甲細胞の耐性又は低下した感受性は、これらの抑制性チェックポイントシグナルの存在下での装甲細胞の治療可能性を高める。抑制性チェックポイントシグナル（及び免疫抑制を誘導するタンパク質）の非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。サイレンス化され得る抑制性チェックポイントシグナルの好適な例には、特に限定されるものではないが、ＰＤ－１及びＴＧＦβＲＩＩが含まれる。
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内タンパク質をコードする１種以上の遺伝子の発現をサイレンス化又は低減して、装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）を産生することができる。修飾細胞の活性は、チェックポイントシグナル伝達経路に関与する任意の細胞内シグナル伝達タンパク質を標的とすることによって増強することができ、こうして、１つ以上のチェックポイント経路へのチェックポイント阻害又は干渉が達成される。チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内シグナル伝達タンパク質の非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、治療の有効性を妨げる転写因子をコードする１種以上の遺伝子の発現をサイレンス化又は低減して、装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）を産生することができる。修飾細胞の活性は、治療の有効性を妨げる転写因子の発現をサイレンス化又は低減する（又は機能を抑制する）ことによって増強又は調節することができる。発現をサイレンス化又は低減するか又はその機能を抑制するように修飾され得る転写因子の非限定的な例には、特に限定されるものではないが、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている例示的な転写因子が含まれる。
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、細胞死又は細胞アポトーシス受容体をコードする１種以上の遺伝子の発現をサイレンス化又は低減して、装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）を産生することができる。死滅受容体とその内因性リガンドの相互作用は、アポトーシスの開始をもたらす。細胞死及び／又は細胞アポトーシス受容体及び／又はリガンドの発現、活性、又は相互作用の破壊は、死滅シグナルに対する修飾細胞の感受性を低下させ、その結果、装甲細胞を腫瘍環境においてより有効にする。細胞死及び／又は細胞アポトーシス受容体及びリガンドの非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。修飾され得る細胞死受容体の好適な例は、Ｆａｓ（ＣＤ９５）である。
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、代謝感知タンパク質をコードする１種以上の遺伝子の発現をサイレンス化又は低減して、装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）を産生することができる。修飾細胞による免疫抑制性腫瘍微小環境（酸素、ｐＨ、グルコース、及び他の分子の低レベルによって特徴付けられる）の代謝感知の破壊は、Ｔ細胞機能の保持の延長をもたらし、その結果、細胞あたりより多くの腫瘍細胞が殺される。代謝感知遺伝子及びタンパク質の非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。好適な例であるＨＩＦ１ａとＶＨＬは、低酸素環境でＴ細胞機能に関与する。装甲Ｔ細胞は、ＨＩＦ１ａ又はＶＨＬをコードする１種以上の遺伝子の発現を抑制又は低減している可能性がある。
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、モノクローナル抗体を含む癌治療に対する感受性を付与するタンパク質をコードする１種以上の遺伝子の発現をサイレンス化又は低減して、装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）を産生することができる。こうして、装甲細胞は機能することができ、癌治療（例えば化学療法、モノクローナル抗体療法、又は別の抗腫瘍治療）の存在下で、優れた機能又は有効性を示す可能性がある。癌治療に対する感受性の付与に関与するタンパク質の非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、増殖優位性因子をコードする１種以上の遺伝子の発現をサイレンス化又は低減して、装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）を産生することができる。癌遺伝子の発現のサイレンス化又は低減は、細胞に増殖優位性を付与することができる。例えばＣＡＲ Ｔ細胞製造プロセス中のＴＥＴ２遺伝子の発現のサイレンス化又は低減（例えば発現の破壊）は、拡張能力を欠く非装甲ＣＡＲ Ｔ細胞と比較した場合、腫瘍の拡張とその後の根絶の顕著な能力を備えた装甲ＣＡＲ Ｔ細胞の生成をもたらす。この戦略は、安全スイッチ（例えば本明細書に記載されているｉＣ９安全スイッチ）と組み合わせることができ、これにより、被験体からの有害反応時、又は装甲ＣＡＲ Ｔの制御不可能な増殖時に、装甲ＣＡＲ Ｔ細胞の標的化破壊が可能になる。増殖優位性因子の非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、修飾／キメラチェックポイント受容体を発現させて、本開示の装甲Ｔ細胞を産生することができる。
修飾／キメラチェックポイント受容体は、ヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体を含むことができる。ヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体は、修飾／キメラ受容体／タンパク質であり得る。ヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインの発現のために末端切断することができる。あるいは又はさらに、ヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメイン内で、効果的なシグナル伝達に確定的な又は必要な１つ以上のアミノ酸位置で変異させることができる。ヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体の末端切断又は突然変異は、細胞に又は細胞内でチェックポイントシグナルを送るか又は伝達する受容体の能力の喪失をもたらす可能性がある。
例えば、腫瘍細胞の表面に発現されるＰＤ－Ｌ１受容体からの免疫抑制チェックポイントシグナルの希釈又は遮断は、修飾／キメラＰＤ－１ヌル受容体を装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）の表面に発現させることによって達成することができ、これは、装甲細胞の表面にも発現される内因性（非修飾）ＰＤ－１受容体と効果的に競合して、装甲細胞の内因性ＰＤ－１受容体を介する免疫抑制チェックポイントシグナルの伝達を低減又は阻害する。この非限定的な例では、腫瘍細胞に発現されるＰＤ－Ｌ１に結合するための２つの異なる受容体間の競合により、効果的なチェックポイントシグナル伝達のレベルが低下又は縮小し、こうしてＰＤ－１ヌル受容体を発現する装甲細胞の治療可能性が増強される。
修飾／キメラチェックポイント受容体は、膜貫通受容体、膜結合若しくは膜連結受容体／タンパク質、又は細胞内受容体／タンパク質であるヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体を含むことができる。例示的なヌル、デコイ、又はドミナントネガティブ細胞内受容体／タンパク質には、特に限定されるものではないが、抑制性チェックポイントシグナルの下流のシグナル伝達成分、転写因子、サイトカイン又はサイトカイン受容体、ケモカイン又はケモカイン受容体、細胞死又はアポトーシス受容体／リガンド、代謝感知分子、癌治療に対する感受性を付与するタンパク質、及び癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子が含まれる。サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、及びケモカイン受容体の非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。
修飾／キメラチェックポイント受容体は、スイッチ受容体を含むことができる。例示的なスイッチ受容体は、修飾／キメラ受容体／タンパク質を含み、ここで、天然又は野生型の細胞内シグナル伝達ドメインは、タンパク質に対して固有でないか及び／又は野生型ドメインではない異なる細胞内シグナル伝達ドメインに切り替えられるか又は置換される。例えば、抑制性シグナル伝達ドメインを刺激性シグナル伝達ドメインで置換すると、免疫抑制性シグナルが免疫刺激性シグナルに切り替わる。あるいは、抑制性シグナル伝達ドメインを別の抑制性ドメインで置換すると、抑制性シグナル伝達のレベルを低下又は増強することができる。スイッチ受容体の発現又は過剰発現は、免疫抑制腫瘍微小環境内で発現される同族チェックポイント受容体に結合するための内因性野生型チェックポイント受容体（スイッチ受容体ではない）との競合を介して、同族チェックポイントシグナルの希釈及び／又は遮断をもたらす可能性がある。装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）は、スイッチ受容体をコードする配列を含むことができ、１つ以上のスイッチ受容体の発現をもたらし、その結果、装甲細胞の活性を変化させる。装甲細胞（例えば装甲ＣＡＲ Ｔ細胞）は、チェックポイント受容体の下流の細胞内発現タンパク質、転写因子、サイトカイン受容体、死滅受容体、代謝感知分子、癌治療、癌遺伝子、及び／又は腫瘍抑制タンパク質又は遺伝子を標的とするスイッチ受容体を発現することができる。
例示的なスイッチ受容体は、特に限定されるものではないが、抑制性チェックポイントシグナルの下流のシグナル伝達成分、転写因子、サイトカイン又はサイトカイン受容体、ケモカイン又はケモカイン受容体、細胞死又はアポトーシス受容体／リガンド、代謝感知分子、癌治療に対する感受性を付与するタンパク質、及び癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子を含むタンパク質を含むことができるか、又はに由来し得る。
本開示の修飾細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、条件付き遺伝子発現を媒介するＣＬＲ／ＣＡＲを発現させて、装甲Ｔ細胞を生成することができる。装甲Ｔ細胞の核におけるＣＬＲ／ＣＡＲと条件遺伝子発現系の組み合わせは、同族リガンドとＣＬＲの結合又は同族抗原とＣＡＲの結合により条件付きで活性化される合成遺伝子発現系を構成する。この系は、例えばリガンド又は抗原結合の部位で又は腫瘍環境内で合成遺伝子発現を低減又は制限することにより、修飾Ｔ細胞の治療可能性を「装甲」又は増強するのに役立つ可能性がある。
遺伝子編集組成物及び方法
修飾細胞は、トランス遺伝子を細胞に導入することによって生成される。導入工程は、非転位送達システムを介する核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物の送達を含むことができる。
核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物の細胞へのエクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでの導入は、局所送達、吸着、吸収、電気穿孔法、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、マグネトフェクション、又はナノ粒子媒介送達の１つ以上を含むことができる。核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物の細胞へのエクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでの導入は、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、フジーン（fugene）トランスフェクション、及びデンドリマー媒介トランスフェクションを含むことができる。核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物の細胞へのエクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでの機械的トランスフェクションによる導入は、細胞圧搾、細胞衝撃、又は遺伝子銃技術を含むことができる。核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物の細胞へのエクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのナノ粒子媒介トランスフェクションによる導入は、リポソーム送達、ミセルによる送達、及びポリメロソームによる送達を含むことができる。
核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物の細胞へのエクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでの導入は、非ウイルスベクターを含むことができる。非ウイルスベクターは、核酸を含むことができる。非ウイルスベクターは、プラスミドＤＮＡ、線状２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、線状１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、DoggyBone（商標）ＤＮＡ、ナノプラスミド、ミニ環状ＤＮＡ、１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、ＤＤＮＡオリゴヌクレオチド、１本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、及び２本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むことができる。非ウイルスベクターは、本明細書に記載されているようにトランスポゾンを含むことができる。
核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物の細胞へのエクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでの導入は、ウイルスベクターを含むことができる。ウイルスベクターは、非組み込み性の非染色体ベクターであり得る。非組み込み非染色体ベクターの非限定的な例は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、及びヘルペスウイルスが含むことができる。ウイルスベクターは、組み込み性染色体ベクターであり得る。組み込み性染色体ベクターの非限定的な例は、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルス、及びガンマレトロウイルスが含むことができる。
核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物の細胞へのエクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでの導入は、ベクターの組み合わせを含むことができる。ベクターの組み合わせの非限定的な例は、ウイルスベクターと非ウイルスベクター、複数の非ウイルスベクター、又は複数のウイルスベクターを含むことができる。ベクターの組み合わせの非限定的な例は、ＤＮＡ由来ベクターとＲＮＡ由来ベクターの組み合わせ、ＲＮＡ及び逆転写酵素の組み合わせ、トランスポゾン及びトランスポサーゼの組み合わせ、非ウイルスベクターとエンドヌクレアーゼの組み合わせ、及びウイルスベクターとエンドヌクレアーゼの組み合わせを含むことができる。
ゲノム修飾は、核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物を細胞にエクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで導入して、核酸配列を安定して組み込み、核酸配列を一時的に組み込み、核酸配列の部位特異的組み込みを生成し、又は核酸配列の偏向した組み込みを生成することができる。核酸配列はトランス遺伝子であり得る。
ゲノム修飾は、核酸配列、トランス遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物を細胞にエクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで導入して、核酸配列を安定して組み込むことができる。安定した染色体組み込みは、ランダム組み込み、部位特異的組み込み、又は偏向した組み込みであり得る。部位特異的組み込みは、支援されていない場合と支援されている場合がある。支援された部位特異的組み込みは、部位特異的ヌクレアーゼと同時送達される。部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム組み込み部位の上流及び下流領域に対する相同性パーセントを含む５'及び３'ヌクレオチド配列伸長を有するトランス遺伝子を含む。相同ヌクレオチド伸長を有するトランス遺伝子は、相同組換え、マイクロホモロジー媒介末端結合、又は非相同的末端結合によるゲノム組み込みを可能にする。部位特異的組み込みは、セーフハーバーサイト（safe harbor site）で発生する可能性がある。ゲノムのセーフハーバーサイトは、新しく挿入された遺伝子要素が確実に機能し（例えば、治療上有効な発現レベルで発現される）、宿主生物にリスクをもたらす宿主ゲノムへの有害な変化を引き起こさないように、新しい遺伝物質の組み込みに対応することができる。潜在的なゲノムセーフハーバーの非限定的な例は、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン配列、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、第１９染色体上のＡＡＶウイルスの天然の組み込み部位、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子の部位、及びマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログの部位を含む。
部位特異的なトランス遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現を妨害する部位で起こり得る。標的遺伝子発現の破壊は、イントロン、エクソン、プロモーター、遺伝子要素、エンハンサー、サプレッサー、開始コドン、停止コドン、及び応答要素での部位特異的組み込みによって起こり得る。部位特異的組み込みの標的となる標的遺伝子の非限定的な例は、ＴＲＡＣ、ＴＲＡＢ、ＰＤＩ、任意の免疫抑制遺伝子、及び同種拒絶に関与する遺伝子を含む。
部位特異的なトランス遺伝子組み込みは、標的遺伝子の増強発現をもたらす部位で起こり得る。標的遺伝子発現の増強は、イントロン、エクソン、プロモーター、遺伝子要素、エンハンサー、サプレッサー、開始コドン、停止コドン、及び応答要素での部位特異的組み込みによって起こり得る。
酵素を使用して、宿主ゲノムに鎖切断を作成し、トランス遺伝子の送達又は組み込みを容易にすることができる。酵素は１本鎖切断又は２本鎖切断を作成することができる。切断誘導酵素の非限定的な例には、トランスポサーゼ、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Cas-CLOVER（商標）、及びＣＰＦ１が含まれる。切断誘導酵素は、ＤＮＡにコードされて、ｍＲＮＡにコードされて、タンパク質として、又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との核タンパク質複合体として、細胞に送達することができる。
部位特異的なトランス遺伝子組み込みは、ベクターを介する組み込み部位のバイアスによって制御することができる。ベクターを介する組み込み部位のバイアスは、選択されたレンチウイルスベクター又は選択されたガンマレトロウイルスベクターによって制御できる。
部位特異的トランス遺伝子組み込み部位は、不安定な染色体挿入であり得る。組み込まれたトランス遺伝子は、サイレンス化、除去、切除、又はさらに修飾され得る。ゲノム修飾は、トランス遺伝子の不安定な組み込みであり得る。不安定な組み込みは、一時的な非染色体組み込み、半安定的非染色体組み込み、半持続的非染色体挿入、又は不安定な染色体挿入であり得る。一時的な非染色体挿入は、エピ染色体性又は細胞質性であり得る。１つの態様において、トランス遺伝子の一時的な非染色体性挿入は染色体に組み込まれず、修飾された遺伝物質は細胞***中に複製されない。
ゲノム修飾は、トランス遺伝子の半安定的又は持続的な非染色体組み込みであり得る。ＤＮＡベクターは、非ウイルスベクターのエピソーム保持のために核マトリックスタンパク質に結合して***細胞の核での自律複製を可能にする、足場／マトリックス結合領域（Ｓ－ＭＡＲ）モジュールをコードする。
ゲノム修飾は、トランス遺伝子の不安定な染色体組み込みであり得る。組み込まれたトランス遺伝子は、サイレンス化、除去、切除、又はさらに修飾される可能性がある。
トランス遺伝子挿入によるゲノムの修飾は、相同組換え（ＨＲ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、トランスポサーゼ酵素媒介修飾、インテグラーゼ酵素媒介修飾、エンドヌクレアーゼ酵素媒介修飾、又は組換え酵素媒介修飾による、宿主細胞指向２本鎖切断修復（相同性指向修復）を介して起こり得る。トランス遺伝子の挿入によるゲノムの修飾は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Cas-CLOVER（商標）、及びｃｐｆ１を介して起こり得る。
新規又は既存のヌクレオチド／核酸の挿入を伴う遺伝子編集システムにおいて、切断酵素（例えば、ヌクレアーゼ、レコンビナーゼ、インテグラーゼ、又はトランスポサーゼ）に加えて、挿入ツール（例えば、ＤＮＡ鋳型ベクター、転移因子（トランスポゾン又はレトロトランスポゾン））を細胞に送達する必要がある。リコンビナーゼのそのような挿入ツール例には、ＤＮＡベクターが含まれる。他の遺伝子編集システムは、挿入ベクターと一緒にインテグラーゼ、トランスポゾン／レトロトランスポゾンと一緒にトランスポゾンなどの送達を必要とする。切断酵素として使用できるリコンビナーゼの例は、ＣＲＥリコンビナーゼである。挿入ツールで使用できるインテグラーゼの非限定的な例には、ＡＡＶ、ガンマレトロウイルス、レンチウイルスなどの多くのウイルスのいずれかから採取したウイルスベースの酵素が含まれる。挿入ツールで使用できるトランスポゾン／レトロトランスポゾンの例は本明細書でさらに詳しく説明される。
エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュのゲノム修飾を有する細胞は、生殖系列細胞又は体細胞であり得る。修飾細胞は、ヒト、非ヒト、哺乳動物、ラット、マウス、又はイヌの細胞であり得る。修飾細胞は、分化、未分化、又は不死化することができる。修飾された未分化細胞は幹細胞であり得る。修飾された未分化細胞は、人工多能性幹細胞であり得る。修飾細胞は免疫細胞であり得る。修飾細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、巨核球、又は破骨細胞であり得る。修飾細胞は、細胞が静止状態、活性化状態、休止期、間期、前期、中期、後期、又は終期にある間に修飾することができる。修飾細胞は、全血から、白血球アフェレーシスから、又は不死化細胞株からの、新鮮なもの、凍結保存されたもの、バルクでもよく、亜集団に分類されてもよい。白血球アフェレーシス産物又は血液から細胞を単離するための詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。
本開示は、遺伝子編集組成物及び／又は遺伝子編集組成物を含む細胞を提供する。遺伝子編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列と、ヌクレアーゼタンパク質又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列とを含むことができる。ヌクレアーゼタンパク質をコードする配列又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はこれらの組み合わせを含むことができる。ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びエンドヌクレアーゼの１つ以上を含むことができる。
ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質及びエンドヌクレアーゼを含むことができる。エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｏ０５１ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインを含むことができる。遺伝子編集組成物は、融合タンパク質を含むことができる。融合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質及びＣｌｏ０５１ヌクレアーゼ又はＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインを含むことができる。遺伝子編集組成物は、ガイド配列をさらに含むことができる。ガイド配列はＲＮＡ配列を含む。
本開示は、エフェクターに機能できる形で結合された小さなＣａｓ９（Ｃａｓ９）を含む組成物を提供する。本開示は、ＤＮＡ局在化成分及びエフェクター分子を含むか、から本質的になるか、又はからなる融合タンパク質を提供し、ここで、エフェクターは、小さなＣａｓ９（Ｃａｓ９）を含む。本開示の小さなＣａｓ９構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含むことができる。活性触媒部位を有する黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
本開示は、エフェクターに機能できる形で結合された不活性化された小さなＣａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む組成物を提供する。本開示は、ＤＮＡ局在化成分及びエフェクター分子を含むか、から本質的になるか、又はからなる融合タンパク質を提供し、ここで、エフェクターは、小さな不活性化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む。本開示の小さな不活性化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含むことができる。ｄＳａＣａｓ９は、配列番号８０のアミノ酸配列を含み、これは、触媒部位を不活性化するためのＤ１０Ａ及びＮ５８０Ａ突然変異を含む。
本開示は、エフェクターに機能できる形で結合された不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む組成物を提供する。本開示は、ＤＮＡ局在化成分及びエフェクター分子を含むか、から本質的になるか、又はからなる融合タンパク質を提供し、ここで、エフェクターは、不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。本開示の不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含むことができる。
ｄＣａｓ９は、化膿連鎖球菌（Streptoccocus pyogenes）から単離又は誘導することができる。ｄＣａｓ９はアミノ酸位置１０及び８４０に置換を有するｄＣａｓ９を含むことができ、これは触媒部位を不活性化する。いくつかの態様において、これらの置換は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａである。ｄＣａｓ９は、配列番号８１又は配列番号８２のアミノ酸配列を含むことができる。
例示的なＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１（Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ）融合タンパク質は、配列番号８４のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質は、配列番号８５の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされ得る。ｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１（Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ）融合タンパク質は、配列番号８６のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質は、配列番号８７の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされ得る。ｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
遺伝子編集組成物を含む細胞は、遺伝子編集組成物を安定的に又は一時的に発現することができる。好ましくは、遺伝子編集組成物は一時的に発現される。ガイドＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ配列内の標的配列に相補的な配列を含むことができる。ゲノムＤＮＡ配列内の標的配列は、ゲノムＤＮＡ配列のセーフハーバー部位内の標的配列であり得る。
Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲを含む遺伝子編集組成物、及びこれらの組成物を遺伝子編集に使用する方法は、米国特許公開番号２０１７／０１０７５４１、２０１７／０１１４１４９、２０１８／０１８７１８５、及び米国特許第１０，４１５，０２４号に詳細に記載されている。
遺伝子編集ツールはまた、１つ以上のポリ（ヒスチジン）ベースのミセルを使用して細胞に送達することもできる。ポリ（ヒスチジン）（例えばポリ（Ｌ－ヒスチジン））は、不飽和窒素上に孤立電子対を提供するイミダゾール環のためにｐＨ感受性のポリマーである。すなわち、ポリ（ヒスチジン）はプロトン化－脱プロトン化による両性特性を有する。特に、特定のｐＨでは、ポリ（ヒスチジン）含有トリブロックコポリマーは集合して、表面に陽性荷電したポリ（ヒスチジン）単位を有するミセルになり、こうして、陰性荷電した遺伝子編集分子との複合体形成を可能にする。これらのナノ粒子を使用して、タンパク質及び／又は核酸をｐＨ依存的に結合及び放出することにより、目的の遺伝子修飾を実行するための効率的かつ選択的なメカニズムが提供され得る。特に、このミセルベースの送達システムは、帯電した材料に関して実質的な柔軟性、並びに大きなペイロード容量、及びナノ粒子ペイロードの標的化放出を提供する。１つの例において、２本鎖ＤＮＡの部位特異的切断は、ポリ（ヒスチジン）ベースのミセルを使用するヌクレアーゼの送達によって可能になる。特定の理論に拘束されることを望まないが、様々なトリブロックコポリマーによって形成されるミセルにおいて、疎水性ブロックが凝集してコアを形成し、末端に親水性ブロック及びポリ（ヒスチジン）ブロックを残して、１つ以上の周囲層を形成すると考えられる。
１つの態様において、本開示は、親水性ブロック、疎水性ブロック、及び荷電ブロックからなるトリブロックコポリマーを提供する。いくつかの態様において、親水性ブロックは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）でもよく、そして荷電ブロックは、ポリ（Ｌ－ヒスチジン）でもよい。使用できるトリブロックコポリマーの例は、ＰＥＯ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＨＩＳであり、各ブロックの繰り返し単位の数は設計によって異なる。
トリブロックコポリマーを作成するための中間体として使用できるジブロックコポリマーは、さまざまな疎水性脂肪族ポリ（無水物）、ポリ（核酸）、ポリ（エステル）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ペプチド）、ポリ（ホスファゼン）、及びポリ（糖類）［特に限定されるものではないが、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）］に結合した親水性生体適合性ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）（これは、化学的にＰＥＧと同義である）を有することができる。１００％ＰＥＧ化された表面で構成される高分子ミセルは、インビトロの化学的安定性が向上し、インビボのバイオアベイラビリティが向上し、血液循環半減期が延長している。
トリブロックコポリマーを含むものを含むポリマー小胞、ポリマーソーム、及びポリ（ヒスチジン）ベースのミセル、及びこれらを製造する方法は、米国特許番号７，２１７，４２７号；７，８６８，５１２号；６，８３５，３９４号；８，８０８，７４８号；１０，４５６，４５２号；米国特許出願公開第２０１４／０３６３４９６号；２０１７／００００７４３号；及び２０１９／０２５５１９１号；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１２６５８９により詳細に記載されている。
トランスポゾンとベクター組成物
本開示は、抗体（例えばｓｃＦｖ）又はＣＡＲ（例えばｓｃＦｖを含む）を細胞又は細胞の集団に送達するための組成物及び方法を提供する。本開示の組成物を細胞又は細胞集団に送達するための組成物の非限定的な例には、トランスポゾン又はベクターが含まれる。従って本開示は、抗体（例えばｓｃＦｖ）又はＣＡＲ（例えばｓｃＦｖを含む）を含むトランスポゾン、又は抗体（例えばｓｃＦｖ）又はＣＡＲ（例えばｓｃＦｖを含む）を含むベクターを提供する。
本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。あるいは又はさらに、１つのトランスポゾン又は１つのベクターは本開示のＣＡＲを含むことができ、第２のトランスポゾン又は第２のベクターは本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列を含むことができる。誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、本明細書中により詳細に記載されている。
本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）をコードする配列をさらに含むことができる。あるいは又はさらに、１つのトランスポゾン又は１つのベクターは本開示のＣＡＲを含むことができ、第２のトランスポゾン又は第２のベクターは本開示のＣＳＲをコードする配列を含むことができる。キメラ刺激受容体は、本明細書中により詳細に記載されている。
本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、組換えＨＬＡ－Ｅポリペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。あるいは又はさらに、１つのトランスポゾン又は１つのベクターは本開示のＣＡＲを含むことができ、第２のトランスポゾン又は第２のベクターは組換えＨＬＡ－Ｅポリペプチドをコードする配列を含むことができる。組換えＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、本明細書中により詳細に記載されている。
本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、選択遺伝子をさらに含むことができる。選択遺伝子は、細胞の生存能力と生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的な細胞培養条件によって刺激されたときに、細胞の生存能力と生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択的な細胞培養条件は、細胞の生存能力又は生存に有害な化合物を含むことがあり、ここで、遺伝子産物はそのような化合物に対する耐性を付与する。選択遺伝子の非限定的な例には、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンセターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
好適な態様において、選択遺伝子はＤＨＦＲムテイン酵素をコードする。ＤＨＦＲムテイン酵素は、配列番号８８のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。ＤＨＦＲムテイン酵素は、配列番号８８の核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。ＤＨＦＲムテイン酵素のアミノ酸配列は、８０、１１３、又は１５３位に１つ以上の変異をさらに含むことができる。ＤＨＦＲムテイン酵素のアミノ酸配列は、８０位のフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）の置換、１１３位のロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）の置換、及び１５３位のバリン（Ｖ）又はアスパラギン酸（Ｄ）の置換の１つ以上を含むことができる。
本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドをさらに含むことができる。例えば自己切断ペプチドは、ＣＡＲ（例えばｓｃＦｖを含む）と誘導性アポトーシス促進ポリペプチドとの間に位置することができる。又は、自己切断ペプチドは、ＣＡＲ（例えばｓｃＦｖを含む）と選択遺伝子によってコードされるタンパク質との間に位置することができる。
本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、少なくとも２つの自己切断ペプチドをさらに含むことができる。例えば第１の自己切断ペプチドは、ＣＡＲの上流又はすぐ上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、ＣＡＲの下流又はすぐ下流に位置する。又は、第１の自己切断ペプチドと２番目の自己切断ペプチドはＣＡＲに隣接している。例えば第１の自己切断ペプチドは、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの上流又はすぐ上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの下流又はすぐ下流に位置する。又は、第１の自己切断ペプチド及び第２の自己切断ペプチドは、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドに隣接している。例えば第１の自己切断ペプチドは、選択遺伝子によってコードされるタンパク質の上流又はすぐ上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、選択遺伝子によってコードされるタンパク質の下流又はすぐ下流に位置する。又は、第１の自己切断ペプチド及び第２の自己切断ペプチドは、選択遺伝子によってコードされるタンパク質に隣接している。
自己切断ペプチドの非限定的な例には、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、又はＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドが含まれる。Ｔ２Ａペプチドは、配列番号９０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、配列番号９１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。ＧＳＧ－Ｔ２Ａポリペプチドは、配列番号９２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。Ｅ２Ａペプチドは、配列番号９３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドは、配列番号９４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。Ｆ２Ａペプチドは、配列番号９５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドは、配列番号９６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。Ｐ２Ａペプチドは、配列番号９７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。ＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドは、配列番号９８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
転位システム
本開示は、本明細書に開示のようなタンパク質足場を含むトランスポゾンを提供するか、又は本開示は、本明細書に開示のような抗体（例えばｓｃＦｖ）若しくはＣＡＲ（例えばｓｃＦｖを含む）を含むトランスポゾンを提供する。好適な態様において、トランスポゾンは、２つのシス調節インスレーター要素が隣接している、本明細書に開示のようなｓｃＦｖ又はＣＡＲ（例えばｓｃＦｖを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。本開示はまた、トランスポゾンを含む組成物を提供する。好適な態様において、トランスポゾンを含む組成物は、トランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドをさらに含む。トランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であり得る。好ましくは、トランスポサーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。
本開示のトランスポゾンは、PiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポゾンであり得る。いくつかの態様において、トランスポゾンがＰＢトランスポゾンである場合、、トランスポサーゼは、PiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ、PiggyBac様（ＰＢＬ）トランスポサーゼ、又はSuper PiggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼである。ＳＰＢトランスポサーゼをコードする配列はｍＲＮＡ配列である。
ＰＢトランスポゾン及びＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼの非限定的な例は、米国特許第６，２１８，１８２号；米国特許第６，９６２，８１０号；米国特許第８，３９９，６４３号、及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０９９２９６に詳細に記載されている。
ＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼは、トランスポゾンの末端にあるトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、染色体部位内の配列５'－ＴＴＡＴ－３'（ＴＴＡＴ標的配列）、又は染色体部位内の配列５'－ＴＴＡＡ－３'（ＴＴＡＡ標的配列）のＩＴＲ間に内容物を挿入する。ＰＢ又はＰＢＬトランスポゾンの標的配列は、５'－ＣＴＡＡ－３'、５'－ＴＴＡＧ－３'、５'－ＡＴＡＡ－３'、５'－ＴＣＡＡ－３'、５'ＡＧＴＴ－３'、５'－ＡＴＴＡ－３'、５'－ＧＴＴＡ－３'、５'－ＴＴＧＡ－３'、５'－ＴＴＴＡ－３'、５'－ＴＴＡＣ－３'、５'－ＡＣＴＡ－３'、５'－ＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＴＡＧ－３'、５'－ＴＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＧＴ－３'、５'－ＡＴＣＡ－３'、５'－ＣＴＣＣ－３'、５'－ＴＡＡＡ－３'、５'－ＴＣＴＣ－３'、５'ＴＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＴ－３'、５'－ＡＡＴＣ－３'、５'－ＡＣＡＡ－３'、５'－ＡＣＡＴ－３'、５'－ＡＣＴＣ－３'、５'－ＡＧＴＧ－３'、５'－ＡＴＡＧ－３'、５'－ＣＡＡＡ－３'、５'－ＣＡＣＡ－３'、５'－ＣＡＴＡ－３'、５'－ＣＣＡＧ－３'、５'－ＣＣＣＡ－３'、５'－ＣＧＴＡ－３'、５'－ＧＴＣＣ－３'、５'－ＴＡＡＧ－３'、５'－ＴＣＴＡ－３'、５'－ＴＧＡＧ－３'、５'－ＴＧＴＴ－３'、５'－ＴＴＣＡ－３'、５'－ＴＴＣＴ－３'、及び５'－ＴＴＴＴ－３'を含むか又はからなる。ＰＢ又はＰＢＬトランスポゾンシステムには、ＩＴＲ間に含めることができる目的の遺伝子のペイロード制限はない。
１つ以上のＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼの例示的なアミノ酸配列は、米国特許第６，２１８，１８５号；米国特許第６，９６２，８１０号、及び米国特許８，３９９，６４３号に開示されている。好適な態様において、ＰＢトランスポサーゼは、配列番号９９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか又はからなる。
ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、配列番号９９の配列の３０、１６５、２８２、又は５３８位の２つ以上、３つ以上、又はそれぞれに、アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はからなり得る。トランスポサーゼは、配列番号９９の配列のアミノ酸配列を含むか又はからなるＳＰＢトランスポサーゼであり得、ここで、３０位のアミノ酸置換はバリン（Ｖ）によるイソロイシン（Ｉ）の置換、１６５位のアミノ酸置換はセリン（Ｓ）によるグリシン（Ｇ）の置換、２８２位のアミノ酸置換はバリン（Ｖ）によるメチオニン（Ｍ）の置換、５３８位のアミノ酸置換はリジン（Ｋ）によるアスパラギン（Ｎ）の置換であり得る。好適な態様において、ＳＰＢトランスポサーゼは、配列番号１００と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか又はからなる。
トランスポサーゼが３０、１６５、２８２、及び／又は５３８位に上記突然変異を含む特定の態様において、ＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼは、配列番号９９又は配列番号１００の３、４６、８２、１０３、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２５８、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８６、５０３、５５２、５７０、及び５９１位の１つ以上にアミノ酸置換をさらに含むことができ、そしてこれらは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６にさらに詳細に記載されている。
ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に詳細に記載されているように、昆虫、脊椎動物、甲殻類、又は尾索動物から単離又は誘導することができる。好適な態様において、ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼは、昆虫キンウワバ（Trichoplusia ni）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ８７３７５）又はカイコ（Bombyx mori）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＤ１１１３５）から単離又は誘導される。
過活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、それが由来する天然の変異体よりも活性の高いトランスポサーゼである。好適な態様において、過活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、カイコ又はネッタイツメガエル（Xenopus tropicalis）から単離又は誘導される。過活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼの例は、米国特許第６，２１８，１８５号；米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。過活性アミノ酸置換のリストは、米国特許第１０，０４１，０７７号に開示されている。
いくつかの態様において、ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは組み込み欠損である。組み込み欠損ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、対応するトランスポゾンを切除できるトランスポサーゼであるが、切除されたトランスポゾンを対応する野生型トランスポサーゼよりも低い頻度で組み込む。組み込み欠損ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼの例は、米国特許第６，２１８，１８５号；米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。組み込み欠損アミノ酸置換のリストは、米国特許第１０，０４１，０７７号に開示されている。
いくつかの態様において、ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは核局在化シグナルに融合されている。核局在化シグナルに融合されたＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼの例は、米国特許第６，２１８，１８５号；米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。
本開示のトランスポゾンは、「眠れる森の美女（Sleeping Beauty）」トランスポゾンであり得る。いくつかの態様において、トランスポゾンが「眠れる森の美女」トランスポゾンである場合、トランスポサーゼは、「眠れる森の美女」トランスポサーゼ（例えば米国特許第９，２２８，１８０号に開示されている）又は過活性「眠れる森の美女」（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼである。好適な態様において、「眠れる森の美女」トランスポサーゼは、配列番号１０１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか又はからなる。好適な態様において、過活性「眠れる森の美女」（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼは、配列番号１０２と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか又はからなる。
本開示のトランスポゾンは、ヘルレイザー（Hellaiser）トランスポゾンであり得る。例示的なヘルレイザートランスポゾンは、ヘリバット１（Helibat1）を含み、これは、配列番号１０３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の流山セントラルパークを含むか又はからなる。いくつかの態様において、トランスポゾンがヘルレイザートランスポゾンである場合、トランスポサーゼはヘリトロン（Helitron）トランスポサーゼである（例えばＷＯ２０２０／１７３６３６に開示されている）。好適な態様において、ヘリトロントランスポサーゼは、配列番号１０４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか又はからなる。
本開示のトランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポゾンであり得る。逆方向反復配列、サブターミナル配列、及びＴｏｌ２トランスポサーゼを含む例示的なＴｏｌ２トランスポゾンは、配列番号１０５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか又はからなる。いくつかの態様において、トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである場合、トランスポサーゼはＴｏｌ２トランスポサーゼである（例えばＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている）。好適な態様において、Ｔｏｌ２トランスポサーゼは、配列番号１０６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又は任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか又はからなる。
本開示のトランスポゾンは、TcBusterトランスポゾンであり得る。いくつかの態様において、トランスポゾンがTcBusterトランスポゾンである場合、トランスポサーゼは、TcBusterトランスポサーゼ又は過活性TcBusterトランスポサーゼである（例えばＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている）。TcBusterトランスポサーゼは、天然のアミノ酸配列又は天然に存在しないアミノ酸配列を含むか又はからなり得る。好適な態様において、TcBusterトランスポサーゼは、配列番号１０７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列をを含むか又はからなる。TcBusterトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドは、天然の核酸配列又は天然に存在しない核酸配列を含むか又はからなり得る。好適な態様において、TcBusterトランスポサーゼは、配列番号１０８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様において、変異体TcBusterトランスポサーゼは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に詳細に記載されているように、野生型TcBusterトランスポサーゼと比較した場合、１つ以上の配列の変化を含む。
トランスポゾンはナノトランスポゾンであり得る。ナノトランスポゾンは、（ａ）第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列、第２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列、及びイントラ－ＩＴＲ配列を含む、トランスポゾン挿入体をコードする配列と、（ｂ）骨格をコードする配列であって、この配列は、１～４５０ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を有する複製開始点をコードする配列と、１～２００ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を有する選択マーカーをコードする配列とを含む上記骨格をコードする配列と、及び（ｃ）ＩＴＲ間配列と、を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、（ｃ）のＩＴＲ間配列は（ｂ）の配列を含む。いくつかの態様において、（ａ）のＩＴＲ間配列は（ｂ）の配列を含む。
骨格をコードする配列は、１～６００ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を含むことができる。いくつかの態様において、骨格をコードする配列は、１～５０ヌクレオチド、５０～１００ヌクレオチド、１００～１５０ヌクレオチド、１５０～２００ヌクレオチド、２００～２５０ヌクレオチド、２５０～３００ヌクレオチド、３００～３５０ヌクレオチド、３５０～４００ヌクレオチド、４００～４５０ヌクレオチド、４５０～５００ヌクレオチド、５００～５５０ヌクレオチド、５５０～６００ヌクレオチド（それぞれ、エンドポイントを含む）からなる。
ＩＴＲ間配列は、１～１０００ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を含むことができる。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、１～５０ヌクレオチド、５０～１００ヌクレオチド、１００～１５０ヌクレオチド、１５０～２００ヌクレオチド、２００～２５０ヌクレオチド、２５０～３００ヌクレオチド、３００～３５０ヌクレオチド、３５０～４００ヌクレオチド、４００～４５０ヌクレオチド、４５０～５００ヌクレオチド、５００～５５０ヌクレオチド、５５０～６００ヌクレオチド、６００～６５０ヌクレオチド、６５０～７００ヌクレオチド、７００～７５０ヌクレオチド、７５０～８００ヌクレオチド、８００～８５０ヌクレオチド、８５０～９００ヌクレオチド、９００～９５０ヌクレオチド、又は９５０～１０００ヌクレオチド（各範囲はエンドポイントを含む）からなる。
ナノトランスポゾンは、短いナノトランスポゾン（ＳＮＴ）でもよく、ここで、ＩＴＲ間配列は、１～２００ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を含む。ＩＴＲ間配列は、１～１０ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、３０～４０ヌクレオチド、４０～５０ヌクレオチド、５０～６０ヌクレオチド、６０～７０ヌクレオチド、７０～８０ヌクレオチド、８０～９０ヌクレオチド、又は９０～１００ヌクレオチド（各範囲はエンドポイントを含む）からなることができる。
１～２００ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を有する選択マーカーは、ショ糖選択マーカーをコードする配列を含むことができる。ショ糖選択マーカーをコードする配列は、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列をコードする配列を含むことができる。ＲＮＡ－ＯＵＴ配列をコードする配列は、１３７塩基対（ｂｐ）を含むか又はからなることができる。１～２００ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を有する選択マーカーは、蛍光マーカーをコードする配列を含むことができる。１～２００ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を有する選択マーカーは、細胞表面マーカーをコードする配列を含むことができる。
１～４５０ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を有する複製開始点をコードする配列は、ミニ複製開始点をコードする配列を含むことができる。いくつかの態様において、１～４５０ヌクレオチド（エンドポイントを含む）を有する複製開始点をコードする配列は、Ｒ６Ｋ複製開始点をコードする配列を含む。Ｒ６Ｋ複製開始点は、Ｒ６Ｋガンマ複製開始点を含むことができる。Ｒ６Ｋ複製開始点は、Ｒ６Ｋミニ複製開始点を含むことができる。Ｒ６Ｋ複製開始点は、Ｒ６Ｋガンマミニ複製開始点を含むことができる。Ｒ６Ｋガンマミニ複製開始点は、２８１塩基対（ｂｐ）を含むか又はからなることができる。
ナノトランスポゾンのいくつかの態様において、骨格をコードする配列は、組換え部位、切除部位、連結部位、又はこれらの組み合わせを含まない。いくつかの態様において、ナノトランスポゾンも骨格をコードする配列も、組換え部位、切除部位、連結部位、又はこれらの組み合わせの産物を含まない。いくつかの態様において、ナノトランスポゾンも骨格をコードする配列も、組換え部位、切除部位、連結部位、又はこれらの組み合わせに由来しない。
ナノトランスポゾンのいくつかの態様において、組換え部位は、組換え事象から生じる配列を含む。いくつかの態様において、組換え部位は、組換え事象の産物である配列を含む。いくつかの態様において、組換え事象は、リコンビナーゼの活性（例えばリコンビナーゼ部位）を含む。
ナノトランスポゾンのいくつかの態様において、骨格をコードする配列は、外来ＤＮＡをコードする配列をさらに含まない。
ナノトランスポゾンのいくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、組換え部位、切除部位、連結部位、又はこれらの組み合わせを含まない。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、組換え事象、切除事象、連結事象、又はこれらの組み合わせの産物を含まない。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、組換え事象、切除事象、連結事象、又はこれらの組み合わせに由来しない。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、外来ＤＮＡをコードする配列を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、インスレーターをコードする少なくとも１つの配列、及び哺乳動物細胞において外因性配列を発現することができるプロモーターをコードする配列を含む。哺乳動物細胞はヒト細胞であり得る。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、インスレーターをコードする第１の配列、哺乳動物細胞において外因性配列を発現することができるプロモーターをコードする配列、及びインスレーターをコードする第２の配列を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、インスレーターをコードする第１の配列、哺乳動物細胞において外因性配列を発現することができるプロモーターをコードする配列、ポリアデノシン（ｐｏｌｙＡ）配列、及びインスレーターをコードする第２の配列を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、インスレーターをコードする第１の配列、哺乳動物細胞において外因性配列を発現することができるプロモーターをコードする配列、少なくとも１つの外因性配列、ポリアデノシン（ｐｏｌｙＡ）配列、及びインスレーターをコードする第２の配列を含む。
ナノトランスポゾンは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６７７５８にさらに詳細に記載されている。
ベクターシステム
本開示のベクターは、ウイルスベクター又は組換えベクターであり得る。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はこれらの任意の組み合わせから単離又は誘導された配列を含むことができる。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離又は誘導された配列を含むことができる。ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含むことができる。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスは、本開示のｓｃＦｖ又はＣＡＲをコードする配列の隣にシスで位置する２つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、特に限定されるものではないが、すべての血清型（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、特に限定されるものではないが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、及びある血清型のゲノムと別の血清型のキャプシドを含むＡＡＶハイブリッド（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、特に限定されるものではないが、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３が含まれる。
本開示のベクターは、ナノ粒子であり得る。ナノ粒子ベクターの非限定的な例には、核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせ）、アミノ酸（Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、合成アミノ酸、修飾アミノ酸、又はこれらの任意の組み合わせ）、ポリマー（例えばポリマーソーム）、ミセル、脂質（例えばリポソーム）、有機分子（例えば炭素原子、シート、繊維、チューブ）、無機分子（例えばリン酸カルシウム又は金）、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。ナノ粒子ベクターは、細胞膜を横切って受動的又は能動的に移送することができる。
本明細書に開示の細胞送達組成物（例えばトランスポゾン、ベクター）は、治療用タンパク質又は治療薬をコードする核酸を含むことができる。治療用タンパク質の例には、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されているものが含まれる。
誘導性アポトーシス促進ポリペプチド
本明細書に開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは免疫原性がはるかに低いため、既存の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドよりも優れている。誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは組換えポリペプチドであり、従って天然には存在しない。さらに、再結合されて、宿主のヒト免疫系が「非自己」として認識できる非ヒト配列を含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを産生し、その結果、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む細胞、又は誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む組成物、又は誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む細胞を投与される被験体において免疫応答を誘導する。
本開示は、リガンド結合領域、リンカー、及びアポトーシス促進ペプチドを含む誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを提供し、ここで、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。特定の態様において、非ヒト配列は、制限部位を含む。特定の態様において、リガンド結合領域は、多量体リガンド結合領域であり得る。特定の態様において、アポトーシス促進ペプチドは、カスパーゼポリペプチドである。カスパーゼポリペプチドの非限定的な例には、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、及びカスパーゼ１４が含まれる。好ましくは、カスパーゼポリペプチドはカスパーゼ９ポリペプチドである。カスパーゼ９ポリペプチドは、末端切断型カスパーゼ９ポリペプチドであり得る。誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、天然に存在しいことがある。カスパーゼがカスパーゼ９又は末端切断型カスパーゼ９である場合、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは「ｉＣ９安全スイッチ」と呼ばれることもある。
誘導性カスパーゼポリペプチドは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）カスパーゼポリペプチドを含むことができ、ここで、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。特定の態様において、誘導性カスパーゼポリペプチドは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）末端切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含み、ここで、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。
リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むことができる。ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、配列の３６位に修飾を含むことができる。修飾は、位置３６（Ｆ３６Ｖ）のバリン（Ｖ）によるフェニルアラニン（Ｆ）の置換であり得る。ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、配列番号１０９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、配列番号１１０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか又はからなる。ポリヌクレオチドによってコードされ得る。
リンカー領域は、配列番号１１１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができるか、又はリンカー領域は、配列番号１１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）の核酸配列を含むか又はからなるポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの態様において、リンカーをコードする核酸配列は、制限部位を含まない。
末端切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列の８７位にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列を含むことができる。あるいは又はさらに、末端切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列の２８２位にアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列を含むことができる。末端切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列番号１１３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができるか、又は配列番号１１４４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか又はからなるポリヌクレオチドによってコードされ得る。
ポリペプチドが末端切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む特定の態様において、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、配列番号１１５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなり、又は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、配列番号１１６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はこれらの間の任意のパーセント）同一の核酸配列を含むか又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、その細胞における誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの発現を開始及び／又は調節することができる当技術分野で知られている任意のプロモーターの転写調節下で、細胞内で発現させることができる。
誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの活性化は、例えば条件付きで制御されたタンパク質又はポリペプチドを生成するための誘導剤によって媒介される化学的に誘導された二量体化（ＣＩＤ）によって達成することができる。アポトーシス促進ポリペプチドは、誘導性であるだけでなく、不安定な二量体化剤の分解又は単量体競合阻害剤の投与により、これらのポリペプチドの誘導もまた可逆的である。
特定の態様において、リガンド結合領域が、３６位のバリン（Ｖ）によるフェニルアラニン（Ｆ）の置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む場合、誘導剤は、合成薬物であるＡＰ１９０３（ＣＡＳ指標名：２－ピペリジンカルボン酸、１－［（２Ｓ）－１－オキソ－２－（３，４，５－トリメトキシフェニル）ブチル］－、１，２－エタンジイルビス［イミノ（２－オキソ－２，１－エタンジイル）オキシ－３、１－フェニレン［（１Ｒ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ－［１（Ｒ*）、２Ｒ*［Ｓ*［Ｓ*［１（Ｒ*），２Ｒ*］］］］］－（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４－６３－７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０；分子量：１４１１．６５））；ＡＰ２０１８７（ＣＡＳ登録番号：１９５５１４－８０－８、及び分子式：Ｃ８２Ｈ１０７Ｎ５Ｏ２０）、又はＡＰ２０１８７類似体、例えばＡＰ１５１０を含む。本明細書中で使用される誘導剤ＡＰ２０１８７、ＡＰ１９０３、及びＡＰ１５１０は互換的に使用できる。
誘導性アポトーシス促進ペプチド及びこれらのペプチドを誘導する方法は、米国特許公開番号ＷＯ２０１９／０２２５６６７及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／０６８０２２に詳細に記載されている。
製剤、投与量、及び投与方法
本開示は、本明細書に記載の組成物の製剤、投与量、及び投与方法を提供する。
開示される組成物及び医薬組成物は、特に限定されるものではないが、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩類、親油性溶媒、保存剤、補助物質などの任意の適切な補助物質の少なくとも１つをさらに含むことができる。医薬的に許容し得る補助物質が好ましい。そのような無菌溶液の非限定的な例及びその調製方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、特に限定されるものではないが、Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990 及び “Physician's Desk Reference”, 52nd ed., Medical Economics (Montvale, N.J.) 1998がある。医薬的に許容し得る担体は、当技術分野でよく知られている、又は本明細書に記載されているような投与方法、タンパク質足場、断片、又は変種組成物の溶解度及び／又は安定性に適したものを、日常的に選択することができる。
使用に適した医薬賦形剤及び添加剤の非限定的な例には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば単糖、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖類；誘導体化された糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖など；及び多糖類又は糖ポリマー）が含まれ、これらは、単独又は組み合わせて存在することができ、単独で又は組み合わせて１～９９．９９重量％又は容積％を含む。タンパク質賦形剤の非限定的な例には、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが含まれる。緩衝能力においても機能することができる代表的なアミノ酸／タンパク質成分には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが含まれる。１つの好ましいアミノ酸はグリシンである。
使用に適した炭水化物賦形剤の非限定的な例には、単糖、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど；二糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；及びアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどのが含まれる。好ましくは、炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、及び／又はラフィノースである。
組成物はまた、緩衝液又はｐＨ調整剤を含むことができる。通常、緩衝液は有機酸又は有機塩基から調製される塩である。代表的な緩衝液には、有機酸塩、例えばクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩；トリス、塩酸トロメタミン、又はリン酸緩衝液が含まれる。好ましい緩衝液は、クエン酸塩などの有機酸塩である。
さらに、開示される組成物は、高分子賦形剤／添加剤、例えばポリビニルピロリドン、フィコール（高分子糖）、デキストレート（例えば２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、香味剤、抗菌剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ツイーン２０」や「ツイーン８０」などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含むことができる。
多くの既知の開発されたモードを使用して、本明細書に開示の組成物又は開示された医薬組成物の治療有効量を投与することができる。投与様式の非限定的な例には、ボーラス、頬内、注入、関節内、気管支内、腹腔内、被膜内、軟骨内、腔内、腹腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、病変内、筋肉内、心筋内、鼻内、眼内、骨内（intraosseous）、骨内（intraosteal）、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑液内、胸腔内、子宮内、腫瘍内、静脈内、膀胱内、経口、非経口、直腸内、舌下、皮下、経皮、又は膣手段が含まれる。
本開示の組成物は、非経口（皮下、筋肉内、又は静脈内）投与又は任意の他の投与で使用するために、特に液体溶液若しくは懸濁液の形態で；膣又は直腸投与で使用するために、特に、限定されるものではないが、クリーム剤や坐剤などの半固形形態で；口腔内又は舌下投与で使用するために、限定されるものではないが、錠剤又はカプセルの形態で；又は鼻内に、例えば限定されるものではないが、粉末、点鼻薬、又はエアロゾル、又は特定の薬剤の形態で；又は経皮的に、例えば限定されるものではないが、ゲル、ローション、懸濁剤で、又は皮膚構造を修飾するか又は経皮パッチ中の薬物濃度を増加させるためのジメチルスルホキシドなどの化学的増強剤(Junginger, et al. In “Drug Permeation Enhancement;” Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90, (Marcel Dekker, Inc. New York 1994))と共に、又はタンパク質やペプチドを含む製剤の皮膚への塗布を可能にする酸化剤（ＷＯ９８／５３８４７）と共に、又は一時的な輸送経路を作成するための電界の適用、例えば電気穿孔法と共に、又は皮膚を通過する荷電薬物の移動性を高めるためにイオントフォレーシスと共に、又はソノフォレシスなどの超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号、及び４，７６７，４０２号）と共に、パッチ送達システムで使用するために、調製することができる（上記刊行物及び特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まる）。
非経口投与の場合、本明細書に開示の任意の組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、粒子、粉末、又は凍結乾燥粉末として、医薬的に許容し得る非経口ビヒクルと組み合わせて、又は別個に提供されて、配合され得る。非経口投与用の製剤は、一般的な賦形剤として、無菌水又は食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、硬化ナフタレンなどを含むことができる。注射用の水性又は油性懸濁液は、既知の方法に従って、適切な乳化剤又は加湿剤及び懸濁剤を使用することによって調製することができる。注射用薬剤は、非毒性の経口投与できない希釈剤、例えば水溶液、無菌の注射溶液、又は溶媒中の懸濁液などであり得る。使用可能なビヒクル又は溶媒として、水、リンゲル液、等張食塩水などが許容される。通常の溶剤又は懸濁剤として、無菌の不揮発性油を使用することができる。これらの目的のために、あらゆる種類の不揮発性油及び脂肪酸、例えば天然又は合成又は半合成の脂肪油又は脂肪酸、天然又は合成又は半合成のモノグリセリド又はジグリセリド又はトリグリセリドを使用することができる。非経口投与は当技術分野で知られており、特に限定されるものではないが、従来の注射手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記載されているようなガス圧式無針注射装置、及び米国特許第５，８３９，４４６号に記載されているレーザー穿孔装置が含まれる。
経口投与用の製剤は、腸壁の透過性を人工的に増加させるための補助物質（例えば、レゾルシノール、及び非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテル）の同時投与、並びに、酵素的分解を阻害するための酵素的阻害剤（例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＦ）及びトラシロール）の同時投与に依存する。タンパク質及びタンパク質足場を含む親水性薬剤、並びに経口、頬、粘膜、鼻、肺、膣膜貫通、又は直腸投与を目的とした少なくとも２つの界面活性剤の組み合わせを送達するための製剤は、米国特許第６，３０９，６６３号に記載されている。経口投与用の固体剤形の有効成分化合物は、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリマー、及びグリセリドを含む少なくとも１つの添加剤と混合することができる。これらの剤形はまた、他のタイプの添加剤、例えば不活性希釈剤、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、パラベン、保存剤、例えばソルビン酸、アスコルビン酸、α－トコフェロール、抗酸化剤、例えばシステイン、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、香味剤、芳香剤などを含むことができる。
錠剤や丸薬は、さらに加工して腸溶コーティング製剤にすることができる。経口投与用の液体製剤には、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、及び医療用途に許容される溶液製剤が含まれる。これらの調製物は、前記分野で通常使用される不活性な希釈剤、例えば水を含むことができる。リポソームはまた、インスリン及びヘパリンの薬物送達システムとして記載されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。より最近では、混合アミノ酸の人工ポリマーのミクロスフェア（プロテイノイド）が、医薬品を送達するために使用されている（米国特許第４，９２５，６７３号）。さらに、米国特許第５，８７９，６８１号及び米国特許第５，８７１，７５３号に記載されており、生物学的に活性な薬剤を経口的に送達するために使用される担体化合物が、当技術分野で知られている。
肺投与の場合、好ましくは、本明細書に記載されている組成物又は医薬組成物は、肺又は副鼻腔の下気道に到達するのに有効な粒子サイズで送達される。組成物又は医薬組成物は、吸入による治療薬の投与のための当技術分野で知られている様々な吸入又は鼻用装置のいずれかによって送達することができる。患者の副鼻腔又は肺胞にエアロゾル化製剤を沈着させることができるこれらの装置には、定量吸入器、ネブライザー（例えばジェットネブライザー、超音波ネブライザー）、乾燥粉末発生器、噴霧器などが含まれる。そのような装置はすべて、エアロゾル中の本明細書に記載された組成物又は医薬組成物の分配のための投与に適した製剤を使用することができる。そのようなエアロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）又は固体粒子のいずれかで構成することができる。さらに、本明細書に記載された組成物又は医薬組成物を含むスプレーは、圧力下でノズルを通して、少なくとも１つのタンパク質足場の懸濁液又は溶液を強制通過させることによって生成することができる。定量吸入器（ＭＤＩ）では、噴射剤、本明細書に記載の組成物又は医薬組成物、並びに任意の賦形剤又は他の添加剤が、キャニスター中に液化圧縮ガスを含む混合物として含まれる。計量弁の作動は、混合物を、好ましくは約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍのサイズ範囲の粒子を含むエアロゾルとして放出する。肺投与、製剤、及び関連する装置のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０４９８１６に開示されている。
粘膜表面を介する吸収のために、組成物は、複数のサブミクロン粒子、粘膜付着性高分子、生物活性ペプチドを含むエマルジョン、及びエマルジョン粒子の粘膜付着を達成することによって粘膜表面を介する吸収を促進する水性連続相を含む（米国特許第５，５１４，６７０号）。本開示のエマルジョン剤の適用に適した粘膜表面には、角膜、結膜、口腔内、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸、及び直腸投与経路が含まれ得る。膣又は直腸投与用の製剤、例えば坐剤は、賦形剤として、例えばポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオ脂などを含むことができる。鼻内投与用の製剤は固体であり、賦形剤として例えばラクトースを含むことができ、又は点鼻薬の水溶液又は油性溶液であり得る。口腔内投与の場合、賦形剤には、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどが含まれる（米国特許第５，８４９，６９５号）。粘膜投与及び製剤のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０４９８１６に開示されている。
経皮投与の場合、本明細書に開示の組成物又は医薬組成物は、送達デバイス、例えばリポソーム又はポリマーナノ粒子、微粒子、マイクロカプセル、又はミクロスフェア（特に明記しない限り、まとめて微粒子と呼ばれる）にカプセル化される。多くの適切なデバイスが知られており、これらには、合成ポリマー、例えばポリヒドロキシ酸、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びこれらのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、及びポリホスファゼン、並びに天然ポリマー、例えばコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン、及び他のタンパク質、アルギン酸塩、及び他の多糖類、並びにこれらの組み合わせからなる微粒子が含まれる（米国特許第５，８１４，５９９号）。経皮投与、製剤、及び適切なデバイスのより詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０４９８１６に開示されている。
開示された化合物を、被験体に、長期間にわたって、例えば単回投与から１週間～１年の期間にわたって送達することが望ましい場合がある。様々な徐放、デポー、又はインプラント剤形を利用することができる。例えば剤形は、体液への溶解度が低い化合物の医薬的に許容し得る非毒性の塩、例えば（ａ）多塩基酸、例えばリン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモイン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ又はジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などとの酸付加塩、（ｂ）多価金属カチオン、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどとの塩、又は例えばＮ，Ｎ'－ジベンジルエチレンジアミン若しくはエチレンジアミンから形成される有機カチオンとの塩、又は（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、例えばタンニン酸亜鉛塩を含むことができる。さらに、開示された化合物、又は好ましくは上述されたものなどの比較的不溶性の塩を、ゲル中で、例えば注射に適したゴマ油を含むモノステアリン酸アルミニウムゲルに配合することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩などである。注射用の別のタイプの徐放性デポー製剤は、例えば米国特許３，７７３，９１９号で記載されているように、ポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーなどの、ゆっくり分解する非毒性、非抗原性ポリマーにカプセル化するために分散された化合物又は塩を含むであろう。化合物、又は好ましくは上記のものなどの比較的不溶性の塩も、特に動物で使用するために、コレステロールマトリックスシラスティックペレットに配合することができる。追加の徐放、デポー、又はインプラント製剤、例えばガス又は液体リポソームは、文献で知られている（米国特許第５，７７０，２２２号、及び “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978）。
適切な用量は当技術分野でよく知られている。例えば、Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J.を参照されたい。好ましい用量は、任意選択的に、約０．１～９９及び／又は１００～５００ｍｇ／ｋｇ／投与、又はその任意の範囲、値、若しくは画分を含むことができるか、又は単回又は複数回投与あたり約０．１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、又はその任意の範囲、値、若しくは割合を含むことができる。本明細書に開示の組成物又は医薬組成物の好ましい用量範囲は、被験体の体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ／ｋｇ～最大約３、約６、又は約１２ｍｇ／ｋｇである。
あるいは、投与される用量は、既知の要因、例えば特定の薬剤の薬力学的特性、及びその投与様式と投与経路；受容者の年齢、健康状態、及び体重；症状の性質と程度、同時治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果に応じて変化し得る。通常、有効成分の用量は、体重１キログラムあたり約０．１～１００ｍｇである。通常、１回の投与につき又は徐放性の形態で体重１キログラムあたり０．１～５０、好ましくは０．１～１０ｍｇが、所望の結果を得るのに有効である。
非限定的な例として、ヒト又は動物の治療は、１日当たり約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ又はその任意の範囲、値、若しくは分画の本明細書で開示される組成物又は医薬組成物の１回又は定期的な投与量として、１～４０日の少なくとも１日、又は代替的若しくは追加的に１～５２週の少なくとも１週、あるいは代替的若しくは追加的に１～２０年の少なくとも１年、又はこれらの任意の組み合わせで、単回の注入又は反復投与で提供され得る。
内部投与に適した剤形は、一般に、ユニット又は容器あたり約０．００１ｍｇ～約５００mgの有効成分を含む。これらの医薬組成物において、有効成分は通常、組成物の総重量に基づいて約０．５～９９．９９９重量％の量で存在する。
本明細書に記載の又は関連技術で公知のような、公知の方法を使用して行われ測定された場合に、単回、複数回、若しくは連続投与で０．０１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を達成するために、有効量は、単回（例えばボーラス）、複数回、若しくは連続投与当たり、約０．００１～約５００ｍｇ／ｋｇの量を含むことができる。
それを必要とする被験体に投与される組成物が、本明細書に開示されているような修飾細胞である態様において、約１×１０3～１×１０15細胞、約１×１０4～１×１０12細胞、約１×１０5～１×１０10細胞、約１×１０6～１×１０9細胞、約１×１０6～１×１０8細胞、約１×１０6～１×１０7細胞、又は約１×１０6～２５×１０6細胞が投与され得る、１つの態様において、約５×１０6～２５×１０6細胞が投与される。
開示された組成物及び医薬組成物の医薬的に許容し得る賦形剤、製剤、投薬量、及び投与方法のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０４９８１６に開示されている。
本開示の組成物の使用方法
本開示は、開示された組成物及び医薬組成物を使用して、例えば細胞、組織、器官、動物、又は被験体に、治療有効量の組成物又は医薬組成物を投与し又は接触させて、当技術分野で知られているか又は本明細書に記載されているように、細胞、組織、器官、動物、又は被験体における疾患又は障害の治療のための、開示された組成物又は医薬組成物の使用を提供する。１つの態様において、被験体は哺乳動物である。好ましくは、被験体はヒトである。「被験体」と「患者」という用語は同義で使用される。
本開示は、細胞、組織、器官、動物、又は被験体における少なくとも１つの悪性疾患又は障害を調節又は治療するための方法を提供する。好ましくは、悪性疾患は癌である。悪性疾患又は障害の非限定的な例には、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞、Ｔ細胞、若しくはＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球症、傍腫瘍性症候群／悪性高カルシウム血症、固形腫瘍、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭部癌、頸部癌、遺伝性非ポリポーシス癌、ホジキンリンパ腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、精巣癌、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連の骨吸収、癌関連の骨痛などが含まれる。
好適な態様において、悪性疾患又は障害の治療は養子細胞療法を含む。例えば１つの態様において、本開示は、それを必要とする被験体への投与のために選択及び／又は拡張された、少なくとも１つの開示された抗体（例えばｓｃＦｖ）及び／又は抗体（例えばｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現する修飾細胞を提供する。修飾細胞は、室温及び体温を含む任意の温度での保存用に調製することができる。修飾細胞は、凍結保存及びその後の解凍用に調製することができる。修飾細胞は、無菌包装から直接被験体に投与するために、医薬的に許容し得る担体中に調製することができる。修飾細胞は、細胞の生存能力び／又はＣＡＲ発現レベルの指標を有する医薬的に許容し得る担体中に調製されて、細胞機能とＣＡＲ発現の最小レベルを確保することができる。修飾細胞は、医薬的に許容し得る担体中に所定の密度で、１つ以上の試薬を用いて調製されて、さらなる拡張を阻害し、及び／又は細胞死を防止することができる。
任意の方法が、本明細書に開示の任意の組成物又は医薬組成物の有効量を、そのような調節、処理、又は治療を必要とする細胞、組織、器官、動物、又は被験体に投与することを含むことができる。そのような方法は、任意選択的に、そのような疾患又は障害を治療するための同時投与又は併用療法をさらに含むことができ、ここで、本明細書に開示の任意の組成物又は医薬組成物の投与は、少なくとも１種の化学療法剤（例えばアルキル化剤、有糸***阻害剤、放射性医薬品）の前、同時、及び／又は後に行われることを含む。
いくつかの態様において、被験体は、投与後に移植片対宿主病（ＧｖＨ）及び／又は宿主対移植片病（ＨｖＧ）を発症しない。１つの態様において、投与は全身的である。全身投与は当技術分野で知られている任意の手段であり得、本明細書に詳細に説明されている。好ましくは、全身投与は静脈内注射又は静脈内注入によるものである。１つの態様において、投与は局所的である。局所投与は当技術分野で知られている任意の手段であり得、本明細書に詳細に説明されている。好ましくは、局所投与は腫瘍内注射又は注入、脊髄内注射又は注入、脳室内注射又は注入、眼内注射又は注入、あるいは骨内注射又は注入によるものである。
いくつかの態様において、治療上有効な用量は単一用量である。いくつかの態様において、単回投与は、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又はその間の任意の数の用量が同時に製造される用量の１つである。組成物が自家細胞又は同種異系細胞であるいくつかの態様において、用量は、細胞が生着するのに十分な量であり、及び／又は疾患又は障害を治療するのに十分な時間持続する用量である。
１つの例において、本開示は、被験体に抗体（例えばｓｃＦｖ）を含む組成物又は抗体（例えばｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを投与することを含む、それを必要とする被験体における癌を治療する方法を提供し、ここで、抗体又はＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する。組成物が修飾細胞又は細胞集団を含む態様において、細胞又は細胞集団は、自己由来又は同種異系であり得る。
本明細書に記載されている治療方法のいくつかの態様において、治療を修正又は終了することができる。具体的には、治療に使用される組成物が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む態様において、アポトーシスは細胞を誘導剤と接触させることによって細胞内で選択的に誘導することができる。治療は、例えば回復の兆候又は疾患の重症度／進行の低下の兆候、疾患の寛解／停止の兆候、及び／又は有害事象の発生に応じて修正又は終了することができる。いくつかの態様において、この方法は、細胞治療の修正を阻害するために誘導剤の阻害剤を投与する工程を含み、こうして、細胞治療の機能及び／又は有効性が回復される（例えば、疾患の徴候又は症状が再発した場合、又は重症度の上昇及び／又は有害事象が解決された場合）。
抗体／ｓｃＦｖの産生、スクリーニング、及び精製
本開示の少なくとも１つの抗体（例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ＶＨ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗原結合断片（Ｆａｂ）又はＦａｂ断片）は、当技術分野でよく知られているように、任意選択的に、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、又は不死化細胞のクローン集団によって産生され得る。例えば、Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)を参照されたい。
ｓｃＦｖからのアミノ酸は、当技術分野で知られているように、改変、追加、及び／又は削除して、免疫原性を低下させるか、又は結合、親和性、オンレート、オフレート、結合力、特異性、半減期、安定性、溶解性、又はその他の適切な特徴を低減、増強、又は修飾することができる。
任意選択的に、ｓｃＦｖは、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持するように工学作成することができる。この目標を達成するために、足場タンパク質は、任意選択的に、親配列及び工学作成された配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的な工学作成された生成物の分析プロセスによって調製することができる。三次元モデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補配列の可能性のある三次元コンフォメーション構造を例示及び表示し、可能な免疫原性を測定できるコンピュータープログラムが利用可能である（例えばXencor, Inc. of MonroviaのImmunofilterプログラム）。これらの表示の検査により、候補配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補ｓｃＦｖがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにして、親配列及び参照配列から残基を選択及び組み合わせることができ、その結果、標的抗原に対する親和性などの所望の特性が達成される。あるいは又は上記の手順に加えて、他の適切な工学作成法を使用することができる。
類似のタンパク質又は断片への特異的結合についてのｓｃＦｖのスクリーニングは、ヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ表示）又はペプチド表示ライブラリー、例えばインビトロ表示を使用して便利に達成することができる。この方法は、所望の機能又は構造を有する個々のメンバーについて、ペプチドの大規模なコレクションをスクリーニングすることを含む。表示されるヌクレオチド又はペプチド配列は、３～５０００以上の長さのヌクレオチド又はアミノ酸であり得、頻繁に５～１００アミノ酸の長さであり、そしてしばしば約８～２５アミノ酸の長さであり得る。ペプチドライブラリーを生成するための直接の化学合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ法が記載されている。１つのタイプは、バクテリオファージ又は細胞の表面にペプチド配列を表示することである。各バクテリオファージ又は細胞は、特定の表示されたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような方法は、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９１／１８９８０、ＷＯ９１／１９８１８、及びＷＯ９３／０８２７８に記載されている。
ペプチドのライブラリーを作成するための他のシステムは、インビトロ化学合成及び組換え法の両方の態様を有する。ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９２／０５２５８、ＷＯ９２／１４８４３、及びＷＯ９６／１９２５６を参照されたい。また、米国特許第５，６５８，７５４号、及び５，６４３，７６８号も参照されたい。ペプチド表示ライブラリー、ベクター、及びスクリーニングキットは、Invitrogen (Carlsbad, Calif.), 及び Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)などの供給業者から市販されている。例えば、Enzonに譲渡された米国特許第４，７０４，６９２号、４，９３９，６６６号、４，９４６，７７８号、５，２６０，２０３号、５，４５５，０３０号、５，５１８，８８９号、５，５３４，６２１号、５，６５６，７３０号、５，７６３，７３３号、５，７６７，２６０号、５，８５６，４５６号；Dyaxに譲渡された米国特許第５，２２３，４０９号、５，４０３，４８４号、５，５７１，６９８号、５，８３７，５００号；Affymaxに譲渡された米国特許第５，４２７，９０８号、５，５８０，７１７号；Cambridge Antibody Technologiesに譲渡された米国特許第５，８８５，７９３号；Genentechに譲渡された米国特許第５，７５０，３７３号；Xomaに譲渡された米国特許第５，６１８，９２０号、５，５９５，８９８号、５，５７６，１９５号、５，６９８，４３５号、５，６９３，４９３号、５，６９８，４１７号、Colligan、前出；Ausubel、前出；Sambrook、前出を参照されたい。
本開示のｓｃＦｖは、広範囲の親和性（ＫＤ）でヒト又は他の哺乳動物タンパク質に結合することができる。好適な態様において、本開示の少なくとも１つのｓｃＦｖは、任意選択的に標的タンパク質に、高親和性で、例えば当業者によって実践されているように、表面プラズモン共鳴又はKinexa法によって測定して、約１０-7Ｍ以下のＫＤ、例えば、限定されるものではないが、０．１～９．９（又はその中の任意の範囲又は値）×１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、１０-12、１０-13、１０-14、１０-15、又はその中の任意の範囲又は値で結合することができる。
抗原に対するｓｃＦｖの親和性又は結合力は、任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる（例えばBerzofsky, et al., “Antibody-Antigen Interactions,” In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)；及び本明細書に記載されている方法）。特定のｓｃＦｖ－抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件下（例えば塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変化する可能性がある。従って、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えばＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆ）の測定は、好ましくは、タンパク質足場及び抗原の標準化された溶液、並びに本明細書に記載の緩衝液などの標準化された緩衝液を用いて行われる。
本開示のｓｃＦｖを用いて競合アッセイを実施して、どのタンパク質、抗体、及び他のアンタゴニストが、標的タンパク質への結合について本開示のｓｃＦｖと競合するか、及び／又はエピトープ領域を共有するかを決定することができる。当業者に容易に知られているこれらのアッセイは、タンパク質上の限られた数の結合部位についてのアンタゴニスト又はリガンド間の競合を評価する。タンパク質及び／又は抗体は、競合の前後に固定化又は不溶化され、標的タンパク質に結合した試料は、非結合試料から、例えばデカンテーション（ここで、タンパク質／抗体は事前に不溶化された）又は遠心分離（ここで、タンパク質／抗体は競合反応後に沈殿された）によって単離される。また、競合的結合は、ｓｃＦｖの標的タンパク質への結合又は結合の欠如によって機能が変化するかどうか、例えばｓｃＦｖ分子が、例えば標識物の酵素活性を阻害又は増強するかどうかによって、決定され得る。ＥＬＩＳＡ及び他の機能的アッセイは、当技術分野でよく知られているように使用することができる。
核酸分子
ｓｃＦｖをコードする本開示の核酸分子は、ＲＮＡの形態、例えばｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又は任意の他の形態、また、限定されるものではないが、クローニングによって合成法で得られたｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡは、３本鎖、２本鎖、１本鎖、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１つの鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られているコード鎖であるか、又はアンチセンス鎖としても知られている非コード鎖であり得る。
本開示の単離された核酸分子は、任意選択的に１つ以上のイントロン、例えば、特に限定されるものではないが、少なくとも１つのｓｃＦｖの少なくとも１つの特定の部分を有する、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子；標的タンパク質に結合するタンパク質足場又はループ領域のコード配列を含む核酸分子；及び、上記のものとは実質的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝暗号の縮重のために、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で知られているタンパク質足場を依然としてコードする核酸分子を含むことができる。もちろん、遺伝暗号は当技術分野でよく知られている。従って、当技術分野の当業者にとって、本開示の特定のｓｃＦｖをコードするそのような縮重核酸変異体を生成することは日常的であろう。例えば上記のAusubel, et al.が参照され、そのような核酸変異体は、本開示に含まれる。
本明細書に示されるように、ｓｃＦｖをコードする核酸を含む本開示の核酸分子は、特に限定されるものではないが、それ自体で、ｓｃＦｖ断片のアミノ酸配列をコードするもの；タンパク質足場全体又はその一部のコード配列；ｓｃＦｖ、断片又は部分のコード配列、並びに追加の配列、例えば、前述の追加のコード配列を含むか又は含まない、少なくとも１つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列、例えば、特に限定されるものではないが、非コード５'及び３'配列を含む、追加の非コード配列と一緒の少なくとも１つのイントロン、例えば転写、スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含むｍＲＮＡプロセシング（例えば、リボソーム結合及びｍＲＮＡの安定性）において役割を果たす転写された非翻訳配列；追加の官能基を提供する追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列、を含む。従って、タンパク質足場をコードする配列は、マーカー配列、例えばタンパク質足場断片又は部分を含む融合タンパク質足場の精製を容易にするペプチドをコードする配列に融合することができる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本開示は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示のポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸を提供する。すなわち、ポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／又は定量するために使用することができる。例えば本開示のポリヌクレオチドを使用して、寄託されたライブラリー中の部分的長さ又は完全長のクローンを同定、単離、又は増幅することができる。ポリヌクレオチドは、ヒト又は哺乳動物の核酸ライブラリーから単離されたゲノム又はｃＤＮＡ配列であるか、又は前記ライブラリーからのｃＤＮＡに相補的であり得る。
好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％の完全長配列、好ましくは少なくとも８５％又は９０％の完全長配列、より好ましくは少なくとも９５％の完全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリーは、まれな配列の表示を向上させるように標準化することができる。低厳密性又は中厳密性のハイブリダイゼーション条件は、典型的には、しかし排他的にではなく、相補的配列と比較して減少した配列同一性を有する配列と共に使用される。中厳密性及び高厳密性の条件は、任意選択的に、より高い同一性の配列に使用することができる。低厳密性条件は、約７０％の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オーソログ又はパラログ配列を同定するために使用することができる。
任意選択的に、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質足場の少なくとも一部をコードする。ポリヌクレオチドは、本開示のタンパク質足場をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションに使用することができる核酸配列を包含する。例えばAusubel, 前述；Colligan, 前述を参照されたい。これらは、それぞれ参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
核酸の構築
本開示の単離された核酸は、当技術分野で周知されているように、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、及び／又は（ｄ）これらの組み合わせを使用して作製することができる。
核酸は、本開示のポリヌクレオチドに加えて、ヌクレオチド配列を都合よく含むことができる。例えば１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離を助けることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本開示の翻訳されたポリヌクレオチドの単離を助けることができる。例えばヘキサヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。コード配列を除く本開示の核酸は、任意選択的に、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプター、又はリンカーである。
追加の配列をそのようなクローニング及び／又は発現配列に追加して、クローニング及び／又は発現におけるそれらの機能を最適化するか、ポリヌクレオチドの単離を助けるか、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ausubel、前述；又はSambrook、前述を参照）。
核酸を構築するための組換え法
本開示の単離された核酸組成物、例えばＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせは、生物学的供給源から、当業者に知られている任意の数のクローニング方法を使用して得ることができる。いくつかの態様において、厳密性条件下で本開示のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列が同定される。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーの構築は、当業者によく知られている（例えば、Ausubel、前述；又はSambrook、前述を参照）。
核酸のスクリーニング及び単離方法
本開示のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。プローブを使用して、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて、同じか又は異なる生物の相同遺伝子を単離することができる。当業者は、ハイブリダイゼーションの様々な程度の厳密性をアッセイに使用でき；そして、ハイブリダイゼーション又は洗浄媒体のいずれかが厳密性であり得ることを理解しているであろう。ハイブリダイゼーションの条件がより厳密になるにつれて、２本鎖形成が起こるためには、プローブと標的との間に、より高度な相補性がなければならない。厳密性の程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドなどの部分的変性溶媒の存在によって制御することができる。例えばハイブリダイゼーションの厳密性は、例えば０％～５０％の範囲内でホルムアミドの濃度を操作して反応物溶液の極性を変えることにより都合よく変化させられる。検出可能な結合に必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒体及び／又は洗浄媒体の厳密性に応じて変化する。相補性の程度は、最適には１００％、又は７０～１００％、又はその間の任意の範囲若しくは値であろう。しかしながら、プローブ及びプライマーのわずかな配列変化により、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄媒体の厳密性を低下させて補償できることを理解されたい。
ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は当技術分野で周知であり、本明細書に提示された教示及び指針に基づいて、過度の実験なしに本開示に従って使用することができる。
ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の既知の方法には、特に限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセス（例えばMullisらの米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第４，９６５，１８８号；Taborらの第４，７９５，６９９号、及び第４，９２１，７９４号；Innisの第５，１４２，０３３号；Wilsonらの第５，１２２，４６４号；Innisの第５，０９１，３１０号；Gyllenstenらの第５，０６６，５８４号；Gelfandらの第４，８８９，８１８号；Silverらの第４，９９４，３７０号；Biswasの第４，７６６，０６７号；Ringoldの第４，６５６，１３４号）、及び標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型として使用するＲＮＡ媒介増幅（Maledらの米国特許第５，１３０，２３８号、商品名NASBA）が含まれ、これらの参考文献の全内容は参照により本明細書に取り込まれる（例えば、Ausubel、前述；又はSambrook、前述を参照）。
例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、本開示のポリヌクレオチド及び関連遺伝子の配列を、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから直接増幅することができる。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅法もまた、例えば発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローン化するために、試料中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用する核酸を作製するために、核酸配列決定のために、又は他の目的のために、有用であり得る。インビトロ増幅法を技術者を指導するのに十分な技術の例は、Berger, 前述, Sambrook, 前述, 及び Ausubel, 前述, 並びに Mullis, et al., 米国特許第４，６８３，２０２号 (1987); 及び Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)に見いだされる。ゲノムＰＣＲ増幅のための市販のキットは当技術分野で知られている。例えば、Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech)を参照されたい。さらに、例えばＴ４遺伝子３２タンパク質（Boehringer Mannheim）を使用して、長いＰＣＲ産物の収量を改善することができる。
核酸を構築するための合成方法
本開示の単離された核酸はまた、既知の方法による直接化学合成によって調製することができる（例えば上記のAusubel, et al.、前述を参照されたい）。化学合成は一般に１本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、これは相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、又は１本鎖を鋳型として使用するＤＮＡポリメラーゼを用いる重合によっ、て２本鎖ＤＮＡに変換することができる。当業者は、ＤＮＡの化学合成が約１００塩基以上の配列に限定され得るが、長い配列がより短い配列の連結によってより得られ得ることを認識するであろう。
組換え発現カセット
本開示はさらに、本開示の核酸を含む組換え発現カセットを提供する。本開示の核酸配列、例えば本開示のタンパク質足場をコードするｃＤＮＡ又はゲノム配列を使用して組換え発現カセットを構築し、これを少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入することができる。組換え発現カセットは典型的には、目的の宿主細胞におけるポリヌクレオチドの転写を指令する転写開始調節配列に機能できる形で結合された本開示のポリヌクレオチドを含むであろう。異種及び非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方を使用して、本開示の核酸の発現を指令することができる。
いくつかの態様において、プロモーター、エンハンサー、又は他の要素として機能する単離された核酸を、本開示のポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入して、本開示のポリヌクレオチドの発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることができる。例えば内因性プロモーターは、インビボ又はインビトロで突然変異、欠失、及び／又は置換によって改変することができる。
発現ベクターと宿主細胞
本開示はまた、当技術分野で周知のように、本開示の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び組換え技術による少なくとも１つのタンパク質足場の産生に関する。例えばSambrook, et al.、前述；Ausubel, et al.、前述（それぞれ参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）を参照されたい。
ポリヌクレオチドは、任意選択的に、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合することができる。一般にプラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿などの沈殿物で又は荷電脂質との複合体で、沈殿物中に導入される。ベクターがウイルスの場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングし、次に宿主細胞に導入することができる。
ＤＮＡ挿入体は適切なプロモーターに機能できる形で結合している必要がある。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、及び転写された領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含むであろう。構築物によって発現される成熟転写物のコーディング部分は好ましくは、先頭の翻訳開始コドンと、翻訳されるｍＲＮＡの最後に適切に配置された終止コドン（例えばＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）を含み、哺乳動物又は真核細胞の発現用にはＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。
発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択的に、少なくとも１つの選択マーカーを含む。そのようなマーカーには、例えば、特に限定されるものではないが、アンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ヒグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサート耐性を付与する）、ミコフェノール酸、又はグルタミンシンセターゼ（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；５，７７０，３５９号；５，８２７，７３９号）、ブラスチシジン（ｂｓｄ遺伝子）、真核生物細胞培養の耐性遺伝子、並びにアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ヒグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、又は大腸菌及び他の細菌又は原核細胞で培養するためのテトラサイクリン耐性遺伝子を含む（上記特許は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。上記の宿主細胞のための適切な培地及び条件は、当技術分野で知られている。適切なベクターは、当業者には直ちに明らかであろう。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染、又は他の既知の方法によって達成することができる。そのような方法は、例えばSambrook, 前述, Chapters 1-4 and 16-18; Ausubel, 前述, Chapters 1, 9, 13, 15, 16に記載されている。
発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択的に、本開示の組成物及び方法によって修飾された細胞の単離のための、少なくとも１つの選択可能な細胞表面マーカーを含む。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、細胞又は細胞のサブセットを別の定義された細胞のサブセットから区別する表面タンパク質、糖タンパク質、又はタンパク質のグループを含む。好ましくは、選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物又は方法によって修飾された細胞を、本開示の組成物又は方法によって修飾されていない細胞から区別する。そのような細胞表面マーカーには、例えば、特に限定されるものではないが、「指定のクラスター」又は「分類決定因子」タンパク質（しばしば「ＣＤ」と略される）、例えばＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２末端切断型又は完全長型、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。細胞表面マーカーには、自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８（Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87）がさらに含まれる。
発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択的に、本開示の組成物及び方法によって修飾された細胞の単離のための、少なくとも１つの選択可能な薬剤耐性マーカーを含むであろう。本開示の選択可能な薬剤耐性マーカーは、野生型又は変異体Ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
本開示の少なくとも１つのタンパク質足場は、融合タンパク質などの修飾された形態で発現することができ、そして分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能領域も含むことができる。例えば追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域をタンパク質足場のＮ末端に付加して、精製中に又はその後の取り扱い中及び保存中に、宿主細胞における安定性及び持続性を改善することができる。また、ペプチド部分を本開示のタンパク質足場に付加して、精製を促進することができる。そのような領域は、タンパク質足場又はその少なくとも１つの断片の最終調製の前に除去することができる。そのような方法は、標準的な実験室マニュアル、例えばSambrook, 前述, Chapters 17.29-17.42 and 18.1-18.74; Ausubel, 前述, Chapters 16, 17 and 18に記載されている。
当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系に精通している。あるいは、本開示の核酸は、本開示のタンパク質足場をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞において、（操作によって）オンにすることによって宿主細胞において発現され得る。そのような方法は、当技術分野でよく知られており、例えば米国特許号５，５８０，７３４号、５，６４１，６７０号、５，７３３，７４６号、及び５，７３３，７６１号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
タンパク質足場、その特定の部分又は変異体の産生に有用な細胞培養物の例は、当技術分野で知られている細菌、酵母、及び哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系はしばしば細胞の単層の形態であるが、哺乳動物の細胞懸濁液やバイオリアクターも使用することができる。未変性のグリコシル化タンパク質を発現することができる多くの適切な宿主細胞株が当技術分野で開発されており、ＣＯＳ－１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ－７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）、及びＢＳＣ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが含まれ、これらは、例えば、American Type Culture Collection, Manassas, Va. (www.atcc.org)から容易に入手できる。好ましい宿主細胞には、骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞が含まれる。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ－１５８０）及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ－１８５１）である。好適な態様において、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞である。
これらの細胞の発現ベクターは、以下の発現制御配列、例えば、特に限定されるものではないが、複製開始点；プロモーター（例えば後期又は初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒトプロモーター）；エンハンサー及び／又はプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えばＳＶ４０ラージＴ ＡｇポリＡ付加部位）、及び転写ターミネーター配列のうちの１つ以上を含むことができる。例えばAusubel, et al.、前述、Sambrook, et al.、前述を参照されたい。本開示の核酸又はタンパク質の産生に有用な他の細胞は公知であり、例えばAmerican Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) から、又は他の既知若しくは商用供給源から入手可能である。
真核生物の宿主細胞が使用される場合、ポリアデニル化又は転写ターミネーター配列は、通常ベクターに組み込まれる。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)）。さらに、当技術分野で知られているように、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列をベクターに組み込むことができる。
ｓｃＦｖ精製
ｓｃＦｖは、組換え細胞培養物から、特に限定されるものではないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む、よく知られた方法によって回収及び精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用することができる。例えば、Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 例えば、Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10を参照されたい（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
本開示のｓｃＦｖは、例えば大腸菌、酵母、高等植物、昆虫、及び哺乳動物細胞を含む原核生物又は真核生物の宿主からの、精製された生成物、化学合成手順の生成物、及び組換え技術によって生成された生成物を含む。組換え産生方法で使用される宿主に応じて、本開示のタンパク質足場は、グリコシル化され得るか又は非グリコシル化され得る。このような方法は多くの標準的な実験マニュアル、例えばSambrook、前, Sections 17.37-17.42; Ausubel, 前述, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20, Colligan, Protein Science, 前述, Chapters 12-14に記載されており、これらははすべて参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
アミノ酸コード
本開示のタンパク質足場を構成するアミノ酸は、しばしば略記される。アミノ酸の指定は、当技術分野で周知されているように、その一文字コード、その３文字コード、名前、又は３ヌクレオチドコドンによって、アミノ酸を指定することにより行われる（Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994参照）。本開示のタンパク質足場は、本明細書で特定されるように、自然の又は突然変異及び／又はヒトの操作による１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を含むことができる。機能に必須である本開示のタンパク質足場中のアミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発などの当技術分野で知られている方法によって特定することができる（例えばAusubel、前出、Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)参照）。後者の手順では、分子内のすべての残基に１つのアラニン変異が導入される。次に、得られた変異分子は、生物活性、特に限定されるものではないが、少なくとも１つの中和活性について試験される。タンパク質足場の結合に重要な部位は、構造解析、例えば結晶化、核磁気共鳴、又は光親和性標識（Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) 及び de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)）によっても特定し得る。
当業者が理解するように、本開示は、本開示の少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質足場を含む。生物学的に活性なタンパク質足場は、未変性（非合成）、内因性、又は関連する既知のタンパク質足場の比活性の、少なくとも２０％、３０％、又は４０％、及び好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％、９０％、又は９５％～９９％以上の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性の測定値をアッセイし及び定量する方法は、当業者によく知られている。
別の態様において、本開示は、有機部分の共有結合によって修飾される本明細書に記載のタンパク質足場及び断片に関する。そのような修飾は、改善された薬物動態特性（例えばインビボ血清半減期の延長）を有するタンパク質足場断片を生成することができる。有機部分は、線状又は分枝状の親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。特定の態様において、親水性ポリマー基は、約８００～約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、又はポリビニルピロリドンでもよく、そして脂肪酸又は脂肪酸エステル基は、約８～約４０個の炭素原子を含むことができる。
本開示の修飾タンパク質足場及び断片は、抗体に直接又は間接的に共有結合している１つ以上の有機部分を含むことができる。本開示のタンパク質足場又は断片に結合している各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用される「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。本明細書で使用される「親水性ポリマー基」という用語は、オクタンよりも水に溶けやすい有機ポリマーを指す。例えば、ポリリジンはオクタンよりも水に溶けやすい。従って、ポリリジンの共有結合によって修飾されたタンパク質足場は、本開示に含まれる。本開示のタンパク質足場を修飾するのに適した親水性ポリマーは、線状又は分枝状であり得、例えばポリアルカングリコール（例えばＰＥＧ、モノメトキシ－ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えばデキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えばポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、及びポリビニルピロリドンであり得る。好ましくは、本開示のタンパク質足場を修飾する親水性ポリマーは、別個の分子実体として約８００～約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えばＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００を使用することができ、ここで、下付き文字はダルトン単位のポリマーの平均分子量である。親水性ポリマー基は、１～約６個のアルキル、脂肪酸、又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、適切な方法を使用することによって調製することができる。例えばアミン基を含むポリマーは、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボンキシレートに結合することができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えばＮ，Ｎ－カルボニルジイミダゾールで活性化）は、ポリマー上のヒドロキシル基に結合することができる。
本開示のタンパク質足場を修飾するのに適した脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和されていてもよく、又は１つ以上の不飽和単位を含むこともできる。本開示のタンパク質足場を修飾するのに適した脂肪酸には、例えばｎ－ドデカン酸（Ｃ１２、ラウリン酸）、ｎ－テトラデカン酸（Ｃ１４、ミリスチン酸）、ｎ－オクタデカン酸（Ｃ１８、ステアリン酸）、ｎ－エイコサン酸（Ｃ２０、アラキジン酸）、ｎ－ドコサン酸（Ｃ２２、ベヘン酸）、ｎ－トリアコンタン酸（Ｃ３０）、ｎ－テトラコンタン酸（Ｃ４０）、ｃｉｓ－Δ９－オクタデカン酸（Ｃ１８、オレイン酸）、すべてｃｉｓ－Δ５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸（Ｃ２０、アラキドン酸）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが含まれる。適切な脂肪酸エステルには、直鎖又は分岐低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルが含まれる。低級アルキル基は、１～約１２、好ましくは１～約６個の炭素原子を含むことができる。
修飾されたタンパク質足場及び断片は、適切な方法、例えば１つ以上の修飾剤との反応を使用して、調製することができる。本明細書で使用される「修飾剤」という用語は、活性化基を含む適切な有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で第２の化学基と反応し、それにより修飾剤と第２の化学基との間に共有結合を形成することができる化学部分又は官能基である。例えばアミン反応性活性化基には、求電子性基、例えばトシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などが含まれる。チオールと反応することができる活性化基には、例えばマレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５－チオール－２－ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ－チオール）などが含まれる。アルデヒド官能基はアミン－又はヒドラジド－含有分子に結合することができ、アジド基は三価のリン基と反応して、ホスホルアミデート又はホスホルイミド結合を形成することができる。活性化基を分子に導入するための適切な方法は、当技術分野で知られている（例えばHermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)参照）。活性化基は、有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接結合することができるか、又はリンカー部分、例えば二価のＣ１～Ｃ１２基（１つ以上の炭素原子を酸素、窒素、硫黄などのヘテロ原子により置換することができる）を介して、結合することができる。適切なリンカー部分には、例えばテトラエチレングリコール、－（ＣＨ２）３－、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、及び－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ－ＮＨ－が含まれる。リンカー部分を含む修飾剤は、例えばモノ－Ｂｏｃ－アルキルジアミン（例えばモノ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、モノ－Ｂｏｃ－ジアミノヘキサン）を脂肪酸と、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で反応させて、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートの間にアミド結合を形成することによって生成することができる。Ｂｏｃ保護基は、生成物からトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理して除去して、説明したように別のカルボキシレートに結合できる一級アミンを露出させることができるか、又は無水マレイン酸と反応させて得られた生成物を環化して、脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる（例えばThompson, et al.、ＷＯ９２／１６２２１を参照されたい、これらの全教示は参照により本明細書に組み込まれる）。
本開示の修飾されたタンパク質足場は、タンパク質足場又は断片を修飾剤と反応させることによって生成することができる。例えば有機部分は、アミン反応性修飾剤、例えばＰＥＧのＮＨＳエステルを使用して、非部位特異的方法でタンパク質足場に結合することができる。本開示のタンパク質足場の特定の部位に結合している有機部分を含む修飾タンパク質足場及び断片は、逆タンパク質分解などの適切な方法を使用して調製することができる（Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)）、及びHermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)に記載されている方法）。
定義
本開示を通して使用される単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば「方法」への言及は、複数のそのような方法を含み、「用量」への言及は、当業者に知られている１つ以上の用量及びその同等物への言及などを含む。
「約（about）」又は「約（approximately）」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲を意味し、これは一部は、値がどのように測定又は決定されるかに、例えば測定システムの限界に依存する。例えば「約」は、１又はそれ以上の標準偏差内を意味し得る。あるいは「約」は、所定の値の最大２０％、又は最大１０％、又は最大５％、又は最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が特許出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、他に明記されない限り、特定の値の許容誤差範囲内を意味する「約」という用語を推測しなければならない。
本開示は、単離されたか又は実質的に精製されたポリヌクレオチド又はタンパク質組成物を提供する。「単離された」又は「精製された」ポリヌクレオチド又はタンパク質、又はその生物学的に活性な部分は、その天然の環境に見られるようなポリヌクレオチド又はタンパク質に通常付随又は相互作用する成分を、実質的又は本質的に含まない。従って、単離又は精製されたポリヌクレオチド又はタンパク質は、組換え技術によって生成される場合、他の細胞材料又は培養培地を実質的に含まず、又は化学的に合成される場合、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドの５'及び３'末端に位置する配列）に自然に隣接する配列（最適にはタンパク質をコードする配列）を含まない。例えば様々な態様において、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、ポリヌクレオチドに自然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量で）未満の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。本開示のタンパク質又はその生物学的に活性な部分が組換え法で産生される場合、最適な培養培地は、約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量による）未満の化学前駆体又は目的ではないタンパク質を示す。
本開示は、開示されたＤＮＡ配列及びこれらのＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の断片及び変異体を提供する。本開示を通して使用される「断片」という用語は、ＤＮＡ配列の一部又はアミノ酸配列の一部、従ってこれにコードされるタンパク質の一部を指す。コード配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然タンパク質の生物活性を保持し、従って、本明細書に記載されるような標的ＤＮＡ配列へのＤＮＡ認識又は結合活性を保持するタンパク質断片をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なＤＮＡ配列の断片は、一般に生物活性を保持するタンパク質をコードせず、またプロモーター活性も保持しない。従って、ＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、本開示の完全長ポリヌクレオチドまでの範囲であり得る。
本開示の核酸又はタンパク質は、標的ベクター中でモノマー単位及び／又は繰り返し単位を事前に組み立て、次にこれらを最終目的のベクターに組み立てることができることを含むモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示のポリペプチドは、本開示の反復モノマーを含むことができ、標的ベクター中で反復単位を事前に組み立て、次にこれらを最終目的のベクターに組み立てることができることを含むモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示は、この方法によって産生されるポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュラーアプローチによって生成されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物及び細胞を提供する。
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）及びポリエピトープ特異性を有する抗体組成物を具体的にカバーする。本明細書で定義される抗体の天然又は合成の類似体、変異体、変種、対立遺伝子、ホモログ及びオルソログ（まとめて「類似体」と呼ばれる）を使用することも本明細書の範囲内である。従って本明細書の１つの態様において、「本明細書の抗体」という用語はその最も広い意味で、そのような類似体も包含する。一般に、そのような類似体では、本明細書で定義される抗体と比較して、１つ以上のアミノ酸残基が置換、削除、及び／又は付加されている可能性がある。
「抗体断片」、及び本明細書で使用されるそのすべての文法的変化形は、未変性の抗体の抗原結合部位又は可変領域を含む未変性の抗体の一部として定義され、ここで、一部は、未変性の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を含まない。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'－ＳＨ、Ｆ（ａｂ'）2、及びＦｖ断片；ダイアボディ；隣接するアミノ酸残基の１つの途切れのない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（「単鎖抗体断片」又は「単鎖ポリペプチド」と呼ばれる）が含まれ、特に限定されるものではないが、（１）１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）１つの軽鎖可変ドメインのみを含む単鎖ポリペプチド、又は、関連する重鎖部分を含まない軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含むその断片、及び（３）１つの重鎖可変ドメインのみを含む単鎖ポリペプチド、又は、関連する軽鎖部分を含まない重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含むその断片；及び、抗体断片から形成された多重特異性又は多価構造体が含まれる。１つ以上の重鎖を含む抗体断片において、重鎖は、未変性の抗体の非Ｆｃ領域に見られる任意の定常ドメイン配列（例えばＩｇＧアイソタイプのＣＨＩ）を含むことができ、及び／又は未変性の抗体に見られるヒンジ領域配列を含むことができ、及び／又はヒンジ領域配列又は重鎖の定常ドメイン配列に融合又はその中に位置するロイシンジッパー配列を含むことができる。この用語はさらに、一般に単一の単量体可変抗体ドメイン（例えばラクダ由来）を有する抗体断片を指す単一ドメイン抗体（「ｓｄＡＢ」）を含む。このような断片抗体タイプは、当業者によって容易に理解されるであろう。
「結合」とは、巨大分子間の（例えばタンパク質と核酸との間の）配列特異的な非共有相互作用を指す。相互作用全体が配列特異的である限り、結合相互作用のすべての成分が配列特異的である必要はない（例えばＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。
「含む」という用語は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味することを意図している。組成物及び方法を定義するために使用される「から本質的になる」とは、意図された目的に使用される場合、組み合わせにとって何らかの本質的重要性のある他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、微量の汚染物質や不活性担体を排除しない。「からなる」は、他の成分の微量要素や実質的な方法の工程以外のものを排除することを意味する。これらの移行用語のそれぞれによって定義される態様は、本開示の範囲内である。
「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに固有の空間的コンフォメーションにおいて３つのアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも４、５、６、又は７個のそのようなアミノ酸からなり、より一般的には、少なくとも８、９、又は１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は当技術分野で知られており、例えばＸ線結晶学及び二次元核磁気共鳴が含まれる。
本明細書で使用される「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが次にペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングが含まれる場合がある。
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡ、又は任意の他のタイプのＲＮＡ）、又はｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡや、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、グリコシル化などによって修飾されたタンパク質も含まれる。
遺伝子発現の「調節（modulation）」又は「調節（regulatiion）」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、特に限定されるものではないが、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が含まれ得る。
「機能できる形で結合された（operatively linked）」又はその同等物（例えば「機能できる形で結合された（linked operatively）」）という用語は、２つ以上の分子が相互作用して、一方又は両方の分子又はこれらの組合わせに起因する機能に影響を与えることができるように、互いに対して配置されることを意味する。
非共有的に結合された成分及び非共有的に結合された成分を作製及び使用する方法が開示される。さまざまな成分は、本明細書に記載されているようにさまざまな異なる形態をとることができる。例えば非共有的に結合された（すなわち、機能できる形で結合された）タンパク質を使用して、当技術分野における１つ以上の問題を回避する一時的な相互作用を可能にすることができる。タンパク質などの非共有的に結合された成分が会合及び解離する能力は、そのような会合が所望の活性に必要とされる状況下でのみ又は主にそのような状況下で、機能的会合を可能にする。連結は、所望の効果を可能にするのに十分な持続時間であり得る。
生物のゲノム中の特定の遺伝子座にタンパク質を向けるための方法が開示される。この方法は、ＤＮＡ局在化成分を提供し、エフェクター分子を提供する工程を含むことができ、ここで、ＤＮＡ局在化成分及びエフェクター分子は、非共有的連結を介して機能できる形で結合することができる。
「ｓｃＦｖ」という用語は、単鎖可変断片を指す。ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、リンカーペプチドで連結されている。リンカーペプチドは、約５～４０アミノ酸、又は約１０～３０アミノ酸、又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０アミノ酸の長さであり得る。単鎖可変断片は、完全な抗体分子に見られる一定のＦｃ領域が欠如しているため、抗体の精製に使用される共通の結合部位（例えばプロテインＧ）が欠如している。この用語はさらに、細胞の細胞質内で安定であり、細胞内タンパク質に結合し得る抗体であるイントラボディであるｓｃＦｖを含む。
「単一ドメイン抗体」という用語は、特定の抗原に選択的に結合することができる単一の単量体可変抗体ドメインを有する抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体は、一般に約１１０アミノ酸長さのペプチド鎖であり、重鎖抗体又は一般的なＩｇＧの１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含み、これは、一般に抗体全体として、抗原に対して同様の親和性を有するが、より耐熱性があり、洗剤や高濃度の尿素に対して安定している。例としては、ラクダや魚の抗体に由来するものがある。あるいは、単一ドメイン抗体は、４本の鎖を有する一般的なマウス又はヒトＩｇＧから作成することができる。
本明細書中で使用される「特異的に結合する」及び「特異的結合」という用語は、異なる抗原の均一な混合物中に存在する特定の抗原に対して優先的に結合する、抗体、抗体断片、又はナノボディの能力を指す。いくつかの態様において、特異的結合相互作用は、試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを区別する。いくつかの態様において、約１０倍～１００倍以上（例えば約１０００倍又は１０，０００倍以上）。「特異性」は、免疫グロブリン又はナノボディなどの免疫グロブリン断片が、ある抗原性標的に対して、異なる抗原性標的よりも優先的に結合する能力を指し、必ずしも高い親和性を意味するわけではない。
「標的部位」又は「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。
「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを指す。１本鎖の記述はまた、相補鎖の配列も定義する。従って、核酸はまた、記述された１本鎖の相補鎖を包含し得る。本開示の核酸はまた、同じ構造を保持するか又は同じタンパク質をコードする、実質的に同一の核酸及びその相補体を包含する。
本開示のプローブは、厳密性ハイブリダイゼーション条件下で、標的配列にハイブリダイズすることができる１本鎖核酸を含むことができる。従って、本開示の核酸は、厳密性ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを指し得る。
本開示の核酸は、１本鎖又は２本鎖であり得る。本開示の核酸は、分子の大部分が１本鎖である場合でさえ、２本鎖配列を含むことができる。本開示の核酸は、分子の大部分が２本鎖である場合でさえ、１本鎖配列を含むことができる。本開示の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらのハイブリッドを含むことができる。本開示の核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができる。本開示の核酸は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。本開示の核酸は、非天然アミノ酸修飾を含むように合成することができる。本開示の核酸は、化学合成法又は組換え法によって得ることができる。
本開示の核酸は、それらの配列全体又はその任意の一部のいずれかが、天然に存在しない可能性がある。本開示の核酸は、天然に存在しない１つ以上の突然変異、置換、欠失、又は挿入を含むことがあり、核酸配列全体を天然に存在しないものにする。本開示の核酸は、１つ以上の複製、反転、又は反復配列を含むことができ、その結果として生じる配列は天然には存在せず、核酸配列全体を天然に存在しないものにする。本開示の核酸は、天然に存在しない修飾ヌクレオチド、人工ヌクレオチド、又は合成ヌクレオチドを含むことができ、核酸配列全体を天然に存在しないものにする。
遺伝暗号の重複性を考えると、複数のヌクレオチド配列が特定のタンパク質をコードする可能性がある。そのようなすべてのヌクレオチド配列は、本明細書で企図されている。
本開示を通して使用される「機能できる形で結合された」という用語は、それが空間的に結合されているプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５'（上流）又は３'（下流）に配置することができる。プロモーターと遺伝子間の距離は、プロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。プロモーターと遺伝子間の距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく対応することができる。
本開示を通して使用される「プロモーター」という用語は、細胞内の核酸の発現を付与、活性化、又は増強することができる合成又は天然由来の分子を指す。プロモーターは、発現をさらに増強するため、及び／又はその空間的発現及び／又は時間的発現を変更するために、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、遠位のエンハンサー又はリプレッサー要素を含むことができ、これらは転写の開始部位から数千塩基対まで位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来することができる。プロモーターは、発現が起きる細胞、組織、又は器官に関して、又は発現が起こる成長段階に関して、又は生理学的ストレス、病原体、金属イオン、若しくは誘導剤などの外部刺激に音して、遺伝子成分の発現を構成的又は示差的に調節することができる。プロモーターの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。
本開示を通して使用される「実質的に相補的」という用語は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、又は２つの配列が厳密性ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。
本開示を通して使用される「実質的に同一」という用語は、第１の配列と及び第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、又は核酸に関して、第１の配列が第２の配列の補体に実質的に相補的であるかどうかを指す。
本開示を通して使用される場合、核酸を説明するために使用される場合の「変種」という用語は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部又は断片；（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列又はその一部の相補体；（ｉｉｉ）参照される核酸又はその相補体と実質的に同一である核酸；又は（ｉｖ）厳密性条件下で、参照される核酸、その相補体、又はこれらと実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を指す。
本開示を通して使用される「ベクター」という用語は、複製開始点を含む核酸配列を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、又は酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターでもよく、好ましくはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、アミノ酸とＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はＤＮＡとＲＮＡ配列の両方との組み合わせを含むことができる。
本開示を通して使用される場合、ペプチド又はポリペプチドを説明するために使用される「変種」という用語は、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持するペプチド又はポリペプチドを指す。変種はまた、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。
アミノ酸の保存的置換、すなわちアミノ酸を同様の特性（例えば親水性、荷電領域の程度と分布）を有する異なるアミノ酸で置き換えることは、典型的には小さな変化を伴うものとして当技術分野で認識されている。これらの小さな変化は、一部は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することによって特定することができる。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性と電荷の考慮に基づいている。同様のハイドロパシー指数のアミノ酸は置換しても、タンパク質の機能を維持している。１つの態様において、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をたらす置換を明らかにするためにも使用できる。ペプチドとの関連でアミノ酸の親水性を考慮すると、そのペプチドの最大の局所平均親水性の計算が可能になり、これは、抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている有用な指標である。米国特許第４，５５４，１０１号（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、免疫原性などの生物活性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で実施することができる。アミノ酸の疎水性指数と親水性値はどちらも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能で互換性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び他の特性により明らかなように、アミノ酸、特にこれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存する。
本明細書中で使用される「保存的」アミノ酸置換は、以下の表Ａ、Ｂ、又はＣに示されているように定義することができる。いくつかの態様において、融合ポリペプチド及び／又はそのような融合ポリペプチドをコードする核酸は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾によって導入された保存的置換を含む。アミノ酸は、物理的特性と二次及び三次タンパク質構造への寄与に従って分類することができる。保存的置換とは、同様の特性を有する別のアミノ酸をあるアミノ酸で置換することである。例示的な保存的置換が表Ａに示される。
Figure 2022547866000073
あるいは、保存的アミノ酸は、表Ｂに記載されているように、Lehninger, (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY, N.Y. (1975), pp. 71-77) に記載されているようにグループ化することができる。
Figure 2022547866000074
あるいは、例示的な保存的置換が表Ｃに示される。
Figure 2022547866000075
本開示のポリペプチドは、アミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの任意の組み合わせ、並びにアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換以外の修飾を有するポリペプチドを含むことを意図していることを理解されたい。本開示のポリペプチド又は核酸は、１つ以上の保存的置換を含むことができる。
本開示を通して使用される前述のアミノ酸置換の「２つ以上」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０以上の記載されているアミノ酸置換を指す。「２つ以上」という用語は、２、３、４、又は５つの列挙されたアミノ酸置換を指す場合がある。
本開示のポリペプチド及びタンパク質は、それらの配列全体又はその任意の部分のいずれかが天然に存在しない可能性がある。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在しない１つ以上の突然変異、置換、欠失、又は挿入を含むことができ、これはアミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、１つ以上の複製配列、反転配列、又は反復配列を含むことができ、その結果として生じる配列は天然には存在せず、これはアミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在しない修飾アミノ酸、人工アミノ酸、又は合成アミノ酸を含むことができ、これはアミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする。
本開示を通して使用される「配列同一性」は、National Center for Biotechnology Information (NCBI) ftp サイトから、デフォルトパラメーターを使用して検索できる２つの配列（ｂｌ２ｓｅｑ）をブラスト（blast）するための、スタンドアローンの実行可能なＢＬＡＳＴエンジンプログラムを使用することによって決定され得る（Tatusova and Madden, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174, 247-250；これは、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈で使用される「同一の」又は「同一性」という用語は、各配列の特定の領域にわたって同一である残基の特定のパーセントを指す。パーセントは、２つの配列を最適に整列させ、特定の領域にわたって２つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が存在する位置の数を決定して、一致する位置の数を得て、一致する位置の数を特定の領域内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセントを得ることによって、算出することができる。２つの配列の長さが異なる場合、又はアラインメントによって１つ以上のずれた端部が生成され、特定の比較領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は計算の分母に含まれるが分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等であると見なすことができる。同一性は、用手法で実行することも、ＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ２．０などのコンピューター配列アルゴリズムを使用して実行することもできる。
本開示を通して使用される「内因性」という用語は、それが導入される標的遺伝子又は宿主細胞に自然に関係している核酸又はタンパク質配列を指す。
本開示を通して使用される「外因性」という用語は、それが導入される標的遺伝子又は宿主細胞に自然には関係していない核酸又はタンパク質配列を指し、天然の核酸、例えばＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピー、又は天然に存在しないゲノム位置に存在する天然の核酸配列を含む。
本開示は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入する方法を提供する。「導入する」とは、構築物が宿主細胞の内部にアクセスできるように、ポリヌクレオチド構築物を細胞に提示することを意図している。本開示の方法は、ポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入するための特定の方法には依存せず、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部へのアクセスを獲得することのみに依存する。ポリヌクレオチド構築物を細菌、植物、真菌、及び動物に導入するための方法は当技術分野で知られており、特に限定されるものではないが、安定な形質転換法、一時的な形質転換法、及びウイルス媒介法が含まれる。
実施例
実施例１－キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）の構築
刺激は、ＴＣＲの存在下又は非存在下でのキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）の発現により増強される。一時的に又は安定して発現される表面発現ＣＳＲ／ｓの存在下で、Ｔ細胞がアゴニストｍＡｂを表示する試薬で処理されると、増強された一次及び二次共刺激シグナルが送達される。１つの態様において、この概略図は、同種異系細胞を表す。より完全なＴ細胞の活性化はＣＳＲを介した刺激シグナルにより達成されるため、Ｔ細胞の活性化と拡張が促進される。
キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、ＣＤ２細胞外ドメインを含む抗原認識領域を含むように設計された。ＣＳＲ変異体のパネルは、ＣＤ２の細胞外ドメイン内で設計された。このパネルの目的は、ＣＤ５８に結合しなくなったが、抗ＣＤ２活性化因子試薬による結合に対する受容性を保持している変異体を特定することであった。これは２つの主な理由で望ましい場合がある：１）活性化Ｔ細胞によるＣＤ５８発現が野生型（ＷＴ）ＣＳＲと相互作用し、ＣＳＲの最適な性能を妨げる可能性がある、及び２）ＷＴ ＣＳＲが天然のリガンドＣＡＲとして機能する可能性があるため、ＣＳＲを発現するＴ細胞は、活性化Ｔ細胞を含むＣＤ５８発現細胞に対する細胞障害活性を媒介する可能性がある。従って、ＣＤ５８と相互作用することができないが、最適な細胞拡張のために活性化抗ＣＤ２試薬に結合する能力を保持する変異体ＣＳＲが望まれる。
ＣＤ２細胞外ドメイン内のＤ１１１Ｈ変異（「ＣＤ２ＥＣＤ（Ｄ１１１Ｈ）」）は、最適な細胞拡張のために活性化ＣＤ２試薬に結合する能力を保持し、ＣＤ５８とは相互作用しない。本開示のＣＳＲの概略図を図１及び図２に示す。図１は、ＣＤ２シグナルペプチドを有するＣＳＲの概略図を示す。図２は、ＣＤ８シグナルペプチドを有するＣＳＲの概略図を示す。これらのＣＳＲは、同種異系又は自家ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造を強化するために使用できる。ＣＳＲ ＣＤ２ｚ－Ｄ１１１Ｈ変異体は、製造中に同種異系又は自家ＣＡＲ－Ｔ細胞に送達されて、細胞の増殖と拡張、品質、生存、表現型、機能、サブセット組成、遺伝子編集効率などを高めることができる。これらの変異体ＣＳＲは、一時的にｍＲＮＡにコード化されて、又は安定してトランスポゾンにコード化されて送達され得る。
実施例２－キメラ刺激受容体の機能的特性決定
ＣＡＲ－Ｔ細胞拡張に対するＣＳＲの効果を試験するために、正常なドナー血液から単離されたＰａｎＴ細胞を、Cas-CLOVER（商標）遺伝子編集システムと組み合わせたPiggyBac（登録商標）ＤＮＡ修飾システムを使用して遺伝子修飾した。細胞を、少なくともＣＡＲと選択遺伝子をコードするトランスポゾン、ＣＳＲをコードするｍＲＮＡ、スーパーPiggyBac（登録商標）トランスポサーゼ酵素をコードするｍＲＮＡ、Cas-CLOVER（商標）をコードするｍＲＮＡ、及びＴＣＲｂとｂ２Ｍを標的とするマルチガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いて、単一反応で電気穿孔して、ＴＣＲとＭＨＣＩをノックアウトした（ダブルノックアウト；ＤＫＯ）。続いて、細胞をアゴニストｍＡｂである抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８で刺激し、その後、１４日間の培養期間にわたって遺伝子修飾について選択した。最初の培養期間の終わりに、すべてのＴ細胞がＣＡＲを発現し、遺伝子修飾細胞の選択が成功したことを示した。ＣＳＲを発現しなかった（ブースターなし）細胞と比較して、ＣＳＲを発現している細胞では、ＤＫＯ細胞のより大きなｌｌｃが観察された（図３）。従って、ＣＳＲの発現は、産生中のＣＡＲ－Ｔ細胞の拡張を増強する。
ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の記憶表現型に対するＣＳＲ発現の効果を試験した。ＣＳＲあり又はＣＳＲなし（ブースターなし）で生成されたＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、表面ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、及びＣＤ６２Ｌの発現について染色して、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、及びＴｅｆｆ細胞；Ｔｓｃｍ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ６２Ｌ＋）、Ｔｃｍ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）、Ｔｅｍ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ－）、Ｔｅｆｆ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ６２Ｌ－）を定義した。ＣＳＲ有り又は無しのＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞についてのＴｅｆｆ、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、及びＴｅｍの比率を表１と２に示す。ＣＳＲの有無にかかわらずＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、主に非常に高レベルの好ましいＴｓｃｍ及びＴｃｍ細胞で構成されている。従って、ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔの記憶表現型は、ＣＳＲの共発現による大きな影響を受けていない。
Figure 2022547866000076
Figure 2022547866000077
実施例３－キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ効果
実施例２に記載の異なるＣＳＲを発現する同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗腫瘍効果に及ぼす影響を試験するために、多発性骨髄腫のマウス異種移植モデルを使用してインビボ実験を行った。実験手順の概略を図４に示し、１０個の異なるＣＳＲを用いて１０個の異なる同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞が産生した。具体的には、ＲＰＭＩ－８２２６細胞株を１×１０7細胞の用量で雌ＮＳＧマウスに皮下注射し（－７日目）、その後、腫瘍が確立された０日目（キャリパー測定による７５～１２５ｍｍ3［目標平均約１００ｍｍ3］）に、アロＣＡＲ－Ｔ細胞を「ストレス」用量（５×１０6）で静脈内（ＩＶ）注射して処理した。「ストレス」用量は、異なるＣＳＲを用いて産生されたＣＡＲ－Ｔ細胞間の有効性の可能な機能的差異を検出する際の、より高い分解能を得るために使用された。ＰＢＳによる処理を陰性対照として使用した。ＣＤ２．ＤＨｚを発現する同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞を陽性対照として使用した。
この実験の結果を図５～９に示す。本開示の様々なＣＳＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞による動物の処理は、ＰＢＳ対照と比較して腫瘍体積の減少をもたらした（図５）。ＣＳＲを発現する同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞による処理の５６日後の腫瘍サイズは、陽性対照の腫瘍サイズと同等であった。血液中の総Ｔ細胞を、ＣＳＲを発現する同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理後に定量した（図６）。ＣＳＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞による処理後に、血液中のＴ細胞のピークレベルも定量し、すべての動物のグループ平均として表示した（図７）。すべての動物は、ＰＢＳ陰性対照と比較してピークレベルのＴ細胞の増加を示した。ＣＤ２．ＤＨ２８ｚ、ＣＤ２．ＤＨ．ＢＢｚ、ＣＤ２．ＤＨ．１５ｚ、ＣＤ２．ＤＨ．Ｏｘｚ、及びＣＤ２．ＤＨ．Ｇｚを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２．ＤＨ．ＣＤ２ｚ（ＣＤ２．ＤＨ．ｚとしても知られている）対照と比較して、血中Ｔ細胞のピークレベルの増加を示した。曲線下のＴ細胞面積（Ｔ細胞ＡＵＣ）は、各同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞による処理後に計算された（図８及び表３）。すべての動物は、ＰＢＳ陰性対照と比較してＴ細胞ＡＵＣの増加を示した。ＣＤ２．ＤＨ２８ｚ、ＣＤ２．ＤＨ．ＢＢｚ、ＣＤ２．ＤＨ．１５ｚ、ＣＤ２．ＤＨ．Ｏｘｚ、及びＣＤ２．ＤＨ．Ｇｚを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２．ＤＨ．ＣＤ２ｚ（ＣＤ２．ＤＨ．ｚとしても知られている）対照と比較して血中Ｔ細胞のピークレベルの増加を示した。さまざまなＣＳＲを発現する各同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理した後のＴｅｆｆ、Ｔｅｍ、Ｔｃｍ、及びＴｓｃｍ細胞の比率に対する影響は、陽性対照（ＣＤ２．ＤＨ．ｚ ＣＳＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞）による処理と同等であった。
Figure 2022547866000078

Claims (41)

  1. （ａ）シグナルペプチドと活性化成分を含む外部ドメインであって、シグナルペプチドはＣＤ２シグナルペプチド又はＣＤ８αシグナルペプチドを含み、及び活性化成分はアゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部を含む、前記外部ドメインと；
    （ｂ）ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部を含む膜貫通ドメインと；及び
    （ｃ）細胞質ドメインとシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインであって、細胞質ドメインは、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメイン、ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメイン、ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＣＤ２７細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、若しくはＧＩＴＲ細胞内ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせであり、及びシグナル伝達ドメインはＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含む、前記内部ドメインと、
    を含む非天然のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、
    前記シグナルペプチドと前記細胞質ドメインが同じタンパク質に由来していない、前記受容体。
  2. 前記シグナルペプチドがＣＤ２シグナルペプチドを含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
  3. 前記ＣＤ２シグナルペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
  4. 前記シグナルペプチドがＣＤ８αシグナルペプチドを含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
  5. 前記ＣＤ８αシグナルペプチドが配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
  6. 前記活性化成分が修飾を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  7. 前記修飾が、ＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部の野生型配列と比較して、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部のアミノ酸配列の突然変異又は末端切断を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  8. アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部の突然変異又は末端切断を含むＣＳＲがＣＤ５８に結合しない、請求項７に記載のＣＳＲ。
  9. 前記突然変異又は末端切断を含むＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＣＳＲ。
  10. 前記ＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  11. 前記ＣＤ２細胞内ドメインが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  12. 前記ＣＤ２８細胞内ドメインが配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  13. 前記４－１ＢＢ細胞内ドメインが配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  14. 前記ＩＬ１７ＲＡ細胞内ドメインが配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  15. 前記ＩＬ１５ＲＡ細胞内ドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  16. 前記ＩＬ２１Ｒ細胞内ドメインが配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  17. 前記ＩＣＯＳ細胞内ドメインが配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  18. 前記ＣＤ２７細胞内ドメインが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  19. 前記ＯＸ４０細胞内ドメインが配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  20. 前記ＧＩＴＲ細胞内ドメインが配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  21. ＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含む前記シグナル伝達ドメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  22. 前記ＣＳＲが配列番号３９のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  23. 前記ＣＳＲが、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  24. 前記ＣＳＲが、配列番号４７のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  25. 前記ＣＳＲが配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  26. 前記ＣＳＲが配列番号５５のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  27. 前記ＣＳＲが配列番号５９のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  28. 前記ＣＳＲが配列番号６３のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  29. 前記ＣＳＲが配列番号６７のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  30. 前記ＣＳＲが配列番号７１のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  31. 前記ＣＳＲが配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  32. 前記ＣＳＲが配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  33. 前記ＣＳＲが配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  34. 前記ＣＳＲが配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  35. 前記ＣＳＲが配列番号５３のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  36. 前記ＣＳＲが配列番号５７のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  37. 前記ＣＳＲが配列番号６１のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  38. 前記ＣＳＲが配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  39. 前記ＣＳＲが配列番号６９のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  40. 前記ＣＳＲが配列番号７３のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＣＳＲ。
  41. 請求項１～４０のいずれか１項に記載のＣＳＲをコードする核酸配列。
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