CN114761424A - 同种异体细胞组合物和使用方法 - Google Patents

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CN114761424A CN202080076152.3A CN202080076152A CN114761424A CN 114761424 A CN114761424 A CN 114761424A CN 202080076152 A CN202080076152 A CN 202080076152A CN 114761424 A CN114761424 A CN 114761424A
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Abstract

所公开的是嵌合刺激受体(CSR)、包含CSR的细胞组合物、其制备方法以及使用其用于治疗受试者中的疾病或病症的方法。

Description

同种异体细胞组合物和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月5日提交的美国临时申请号62/896,495、以及于2020年2月14日提交的美国临时申请号62/976,536的优先权和利益。这些申请各自的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开内容涉及分子生物学，且更具体而言，涉及嵌合受体、同种异体细胞组合物、其制备方法和使用方法。
通过引用并入的序列表
于2020年8月21日创建且大小为291 KB，命名为“POTH-055_001WO_SequenceListing_ST25.txt”的文件的内容在此通过引用以其整体并入。
背景技术
本领域一直存在对于同种异体细胞组合物的长期但尚未满足的需要，所述同种异体细胞组合物克服了通过消除涉及移植物抗宿主应答和宿主抗移植物应答的基因所呈现的挑战。本公开内容提供了同种异体细胞组合物、制备这些组合物的方法和使用这些组合物的方法，所述组合物包含非天然存在的结构改善，以恢复同种异体细胞对环境刺激的应答性，以及减少或预防通过天然杀伤细胞介导的细胞毒性的排斥。
发明内容
本公开内容提供了非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)，其包含(a)包含信号肽和激活组分的胞外结构域，其中所述信号肽包含CD2信号肽，并且其中所述激活组分包含激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分；(b)跨膜结构域，其中所述跨膜结构域包含CD2跨膜结构域或其一部分；以及(c)包含细胞质结构域和信号转导结构域的胞内结构域，其中所述细胞质结构域是CD28细胞内结构域、4-1BB细胞内结构域、IL17RA细胞内结构域、IL15RA细胞内结构域、IL21R细胞内结构域、ICOS细胞内结构域、CD27细胞内结构域、OX40细胞内结构域或GITR细胞内结构域或其任何组合，并且其中所述信号转导结构域包含CD3ζ蛋白或其一部分；并且其中所述信号肽和细胞质结构域并非衍生自相同的蛋白质。
在一些方面，CD2信号肽包含与SEQ ID NO: 5至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，CD2信号肽包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
本公开内容还提供了非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)，其包含(a)包含信号肽和激活组分的胞外结构域，其中所述信号肽包含CD8α信号肽，并且其中所述激活组分包含激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分；(b)跨膜结构域，其中所述跨膜结构域包含CD2跨膜结构域或其一部分；以及(c)包含细胞质结构域和信号转导结构域的胞内结构域，其中所述细胞质结构域是CD2细胞内结构域、CD28细胞内结构域、4-1BB细胞内结构域、IL17RA细胞内结构域、IL15RA细胞内结构域、IL21R细胞内结构域、ICOS细胞内结构域、CD27细胞内结构域、OX40细胞内结构域或GITR细胞内结构域或其任何组合，并且其中所述信号转导结构域包含CD3ζ蛋白或其一部分；并且其中所述信号肽和细胞质结构域并非衍生自相同的蛋白质。
在一些方面，CD8α信号肽包含与SEQ ID NO: 7至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，CD8α信号肽包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。
本公开内容还提供了非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)，其中所述激活组分包含修饰。在一些方面，修饰包含与CD2细胞外结构域或其一部分的野生型序列相比，激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分的氨基酸序列的突变或截短。在一些方面，包含激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分的突变或截短的非天然存在的CSR并不结合CD58。在一些方面，包含突变或截短的CD2细胞外结构域或其一部分包含与SEQ ID NO: 3至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列，在一个优选的方面，包含突变或截短的CD2细胞外结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
在一些方面，CD2跨膜结构域包含与SEQ ID NO: 9至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，CD2跨膜结构域或其一部分包含SEQID NO: 9的氨基酸序列。
在一些方面，CD2细胞内结构域包含与SEQ ID NO: 13至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，CD2细胞内结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些方面，CD28细胞内结构域包含与SEQ ID NO: 15至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，CD28细胞内结构域包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。在一些方面，4-1BB细胞内结构域包含与SEQ ID NO: 17至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，4-1BB细胞内结构域包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。在一些方面，IL17RA细胞内结构域包含与SEQID NO: 19至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，IL17RA细胞内结构域包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。在一些方面，IL15RA细胞内结构域包含与SEQ ID NO: 21至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，IL15RA细胞内结构域包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列。在一些方面，IL21R细胞内结构域包含与SEQ ID NO: XX至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，IL21R细胞内结构域包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。在一些方面，ICOS细胞内结构域包含与SEQ ID NO: 25至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，ICOS细胞内结构域包含SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。在一些方面，CD27细胞内结构域包含与SEQ ID NO: 27至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，CD27细胞内结构域包含SEQ IDNO: 27的氨基酸序列。在一些方面，OX40细胞内结构域包含与SEQ ID NO: 29至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，OX40细胞内结构域包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列。在一些方面，GITR细胞内结构域包含与SEQ ID NO: 31至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，GITR细胞内结构域包含SEQ ID NO: 31的氨基酸序列。
在一些方面，包含CD3ζ蛋白或其一部分的信号转导结构域包含与SEQ ID NO: 11至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，包含CD3ζ蛋白或其一部分的信号转导结构域包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 39至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 43至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQID NO: 43的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 47至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 51至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ IDNO: 55至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 59至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 63至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 63的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 67至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 71至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列。
在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 37至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 41至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQID NO: 41的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 45至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 49至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ IDNO: 53至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 57至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 61至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 65至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 65的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 69至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列。在一些方面，非天然存在的CSR包含与SEQ ID NO: 73至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%等同的氨基酸序列。在一个优选的方面，非天然存在的CSR包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列。
本公开内容提供了编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的载体。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的转座子。
本公开内容提供了包含本文公开的任何CSR的细胞。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的细胞。本公开内容提供了包含载体的细胞，所述载体包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含转座子的细胞，所述转座子包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。
本公开内容还提供了修饰的T淋巴细胞(T细胞)，其包含：(a)编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰，其中所述修饰减少或消除了TCR的表达或活性水平；以及(b)本文公开的任何嵌合刺激受体(CSR)。本文公开的修饰的T细胞可以为同种异体细胞或自体细胞。在一些优选的方面，修饰的细胞是同种异体细胞。在一些优选的方面，修饰的细胞是同种异体T细胞或修饰的同种异体CAR T细胞。
本公开内容提供了包含本文公开的任何CSR的组合物。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的组合物。本公开内容提供了包含载体的组合物，所述载体包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含转座子的组合物，所述转座子包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含本文公开的修饰的细胞的组合物、或包含本文公开的多种修饰的细胞的组合物。
本公开内容提供了修饰的T淋巴细胞(T细胞)，其包含：(a)编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰，其中所述修饰减少或消除了TCR的表达或活性水平；以及(b)嵌合刺激受体(CSR)，其包含：(i)包含激活组分的胞外结构域，其中所述激活组分分离自或衍生自第一蛋白质；(ii)跨膜结构域；以及(iii)包含至少一个信号转导结构域的胞内结构域，其中所述至少一个信号转导结构域分离自或衍生自第二蛋白质；其中所述第一蛋白质和第二蛋白质并非等同的。
修饰的T细胞可以进一步包含诱导型促凋亡多肽。修饰的T细胞可以进一步包含编码β-2-微球蛋白(B2M)的内源序列的修饰，其中所述修饰减少或消除了主要组织相容性复合物(MHC) I类(MHC-I)的表达或活性水平。
修饰的T细胞可以进一步包含非天然存在的多肽，其包含HLA I类组织相容性抗原，α链E (HLA-E)多肽。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含B2M信号肽。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含B2M多肽。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含接头，其中所述接头置于B2M多肽和HLA-E多肽之间。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含肽和B2M多肽。包含HLA-E的非天然存在的多肽可以进一步包含置于B2M信号肽和肽之间的第一接头，以及置于B2M多肽和编码HLA-E的肽之间的第二接头。
修饰的T细胞可以进一步包含非天然存在的抗原受体、编码治疗性多肽的序列或其组合。非天然存在的抗原受体可以包含嵌合抗原受体(CAR)。
CSR可以在修饰的T细胞中瞬时表达。CSR可以在修饰的T细胞中稳定表达。包含HLA-E多肽的多肽可以在修饰的T细胞中瞬时表达。包含HLA-E多肽的多肽可以在修饰的T细胞中稳定表达。诱导型促凋亡多肽可以在修饰的T细胞中瞬时表达。诱导型促凋亡多肽可以在修饰的T细胞中稳定表达。非天然存在的抗原受体或编码治疗性蛋白质的序列可以在修饰的T细胞中瞬时表达。非天然存在的抗原受体或编码治疗性蛋白质的序列可以在修饰的T细胞中稳定表达。
修饰的T细胞可以为自体细胞。修饰的T细胞可以为同种异体细胞。修饰的T细胞可以为早期记忆T细胞、干细胞样T细胞、干性记忆T细胞(TSCM)、中枢记忆T细胞(TCM)或干细胞样T细胞。
本公开内容提供了包含本文公开的任何修饰的T细胞的组合物。本公开内容还提供了包含修饰的T淋巴细胞(T细胞)群体的组合物，其中所述群体中的多个修饰的T细胞包含本文公开的CSR。本公开内容还提供了包含T淋巴细胞(T细胞)群体的组合物，其中所述群体的多个T细胞包含本文公开的修饰的T细胞。
本公开内容提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文公开的任何组合物；或者用于疾病或病症治疗中的组合物。在一个方面，组合物是如本文公开的修饰的T细胞或修饰的T细胞群体。本公开内容还提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物和结合CSR的至少一种非天然存在的分子。
本公开内容提供了产生修饰的T细胞群体的方法，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：将包含本公开内容的CSR或其编码序列的组合物引入多个原代人T细胞内，以在多个修饰的T细胞内稳定表达CSR并保存多个修饰的T细胞的期望干样性质的条件下，产生多个修饰的T细胞。本公开内容提供了包含通过该方法产生的修饰的T细胞群体的组合物。在一些方面，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的包含CSR的群体表达干性记忆T细胞(TSCM)或TSCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中所述一种或多种细胞表面标记物包含CD45RA和CD62L。在一些方面，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的群体表达中枢记忆T细胞(TCM)或TCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中所述一种或多种细胞表面标记物包含CD45RO和CD62L。组合物可以用于疾病或病症的治疗中。本公开内容还提供了通过该方法产生的组合物用于治疗疾病或病症的用途。本公开内容进一步提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的通过该方法产生的组合物。治疗方法可以进一步包括向受试者施用激活剂组合物，以激活体内修饰的T细胞群体、诱导体内修饰的T细胞群体的细胞***或其组合。
本公开内容提供了产生修饰的T细胞群体的方法，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：将包含本公开内容的CSR或其编码序列的组合物引入多个原代人T细胞内，以在多个修饰的T细胞内瞬时表达CSR并保存多个修饰的T细胞的期望干样性质的条件下，产生多个修饰的T细胞。本公开内容提供了包含通过该方法产生的修饰的T细胞群体的组合物。在一些方面，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的包含CSR的群体表达干性记忆T细胞(TSCM)或TSCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中所述一种或多种细胞表面标记物包含CD45RA和CD62L。在一些方面，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的群体表达中枢记忆T细胞(TCM)或TCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中所述一种或多种细胞表面标记物包含CD45RO和CD62L。组合物可以用于疾病或病症的治疗中。本公开内容还提供了通过该方法产生的组合物用于治疗疾病或病症的用途。本公开内容进一步提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的通过该方法产生的组合物。在一些方面，向受试者施用的修饰的T细胞群体内的修饰的T细胞不再表达CSR。
本公开内容提供了扩增修饰的T细胞群体的方法，其包括将包含本公开内容的CSR或其编码序列的组合物引入多个原代人T细胞内，以在多个修饰的T细胞内稳定表达CSR并保存多个修饰的T细胞的期望干样性质的条件下，产生多个修饰的T细胞，并且使细胞与激活剂组合物接触，以产生多个激活的修饰的T细胞，其中与在相同条件下不稳定表达CSR的多个野生型T细胞的扩增相比，所述多个修饰的T细胞的扩增是至少2倍。在一些方面，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的包含CSR的群体表达干性记忆T细胞(TSCM)或TSCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中所述一种或多种细胞表面标记物包含CD45RA和CD62L。在一些方面，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的群体表达中枢记忆T细胞(TCM)或TCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中所述一种或多种细胞表面标记物包含CD45RO和CD62L。本公开内容提供了包含通过该方法扩增的修饰的T细胞群体的组合物。组合物可以用于疾病或病症的治疗中。本公开内容还提供了通过该方法扩增的组合物用于治疗疾病或病症的用途。本公开内容进一步提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的通过该方法扩增的组合物。治疗方法可以进一步包括向受试者施用激活剂组合物，以激活体内修饰的T细胞群体、诱导体内修饰的T细胞群体的细胞***或其组合。
本公开内容提供了扩增修饰的T细胞群体的方法，其包括将包含本公开内容的CSR或其编码序列的组合物引入多个原代人T细胞内，以在多个修饰的T细胞内瞬时表达CSR并保存多个修饰的T细胞的期望干样性质的条件下，产生多个修饰的T细胞，并且使细胞与激活剂组合物接触，以产生多个激活的修饰的T细胞，其中与在相同条件下不瞬时表达CSR的多个野生型T细胞的扩增相比，所述多个修饰的T细胞的扩增是至少2倍。本公开内容提供了包含通过该方法扩增的修饰的T细胞群体的组合物。在一些方面，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的包含CSR的群体表达干性记忆T细胞(TSCM)或TSCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中所述一种或多种细胞表面标记物包含CD45RA和CD62L。在一些方面，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的群体表达中枢记忆T细胞(TCM)或TCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中所述一种或多种细胞表面标记物包含CD45RO和CD62L。组合物可以用于疾病或病症的治疗中。本公开内容还提供了通过该方法扩增的组合物用于治疗疾病或病症的用途。本公开内容进一步提供了治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的通过该方法扩增的组合物。在一些方面，向受试者施用的修饰的T细胞群体内的修饰的T细胞不再表达CSR。
上文的任何方面可以与任何其它方面组合。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在本说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文另有明确规定；作为实例，术语“一个”、“一种”和“该/所述”应理解为单数或复数，并且术语“或”应理解为包含在内的。例如，“元素”意指一个或多个元素。在说明书自始至终，单词“包含(comprising)”或变化如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或者一组元素、整数或步骤，但不排除任何其它元素、整数或步骤，或者一组元素、整数或步骤。约可以理解为在所述值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%内。除非上下文另有确说明，否则本文提供的所有数值都由术语“约”进行修饰。
尽管下文描述了合适的方法和材料，但与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开内容的实践或测试中。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用以其整体并入。本文引用的参考文献并不承认为本发明的现有技术。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不预期是限制性的。本公开内容的其它特征和优点根据下述详细描述和权利要求将是显而易见的。
附图说明
专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
图1是显示用于同种异体或自体CAR-T的增强制造的示例性CSR CD2z-D111H突变体的示意图。CSR CD2z-D111H突变体可以在制造过程中递送给同种异体或自体CAR-T细胞，以增强细胞生长和扩增、质量、存活、表型、功能、亚群组成、基因编辑效率等。这些突变型CSR可以如在mRNA中编码的瞬时递送，或如在转座子中编码的稳定递送。
图2是显示用于同种异体或自体CAR-T的增强制造的具有CD8a信号肽的示例性CSRCD2z-D111H突变体的示意图。CSR CD2z-D111H突变体可以在制造过程中递送给同种异体或自体CAR-T细胞，以增强细胞生长和扩增、质量、存活、表型、功能、亚群组成、基因编辑效率等。这些突变型CSR可以如在mRNA中编码的瞬时递送，或如在转座子中编码的稳定递送。
图3是显示CSR的递送在生产过程中增强CAR-T细胞扩增的图。使用与Cas-CLOVER™基因编辑***组合的piggyBac® DNA修饰***，对从正常供体血液中分离的泛T细胞进行遗传修饰。在单次反应中，用编码至少CAR和选择基因的转座子、编码CSR的mRNA、编码超级piggyBac®转座酶的mRNA、编码Cas-CLOVER™的mRNA、以及靶向TCRb和b2M的多重引导RNA (gRNA)，对细胞进行电穿孔，以便敲除TCR和MHCI (双敲除；DKO)。随后用激动剂mAb抗CD2、抗CD3和抗CD28刺激细胞，并且随后在14天培养期的过程中选择用于遗传修饰。在最初的培养期结束时，所有T细胞都表达CAR，指示了遗传修饰的细胞的成功选择。在表达CSR的样品中，观察到DKO细胞的更大程度的扩增。
图4是显示用于评价通过使用不同CSR生产的CAR-T细胞的体内肿瘤控制的实验方案的示意图。如图1和图3以及表1和表2中所述的，使用不同的加强剂(booster)生产同种异体CAR-T。利用多发性骨髓瘤的鼠异种移植模型，以评价用10种不同加强剂生产的同种异体CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效。具体而言，RPMI-8226细胞系以1x107个细胞的剂量皮下(SC)注射到雌性NSG小鼠内(第-7天)，并且随后在肿瘤建立(通过卡尺测量的75-125 mm3 [靶平均值~100 mm3])的第0天时，通过以‘应激’剂量(5x106)的静脉内(IV)注射，用同种异体CAR-T细胞进行治疗。‘应激’剂量用于在检测用不同加强剂分子生产的CAR-T细胞中的功效方面可能的功能差异中的更大分辨率。
图5是显示同种异体CAR-T细胞治疗后，随着时间过去的肿瘤体积的图。根据图4中所示的方案并通过使用‘应激’剂量的CAR-T细胞来评价体内肿瘤控制，所述CAR-T细胞使用不同的CSR进行生产。对于所有动物通过卡尺测量的肿瘤体积评价展示为组平均值，且误差条作为SEM (平均值的标准误差)。
图6是显示同种异体CAR-T细胞治疗后，随着时间过去血液中的总T细胞的图。根据图4中所示的方案并通过使用‘应激’剂量的CAR-T细胞来评价体内肿瘤控制，所述CAR-T细胞使用不同的CSR进行生产。对于所有动物，血液中的总T细胞通过对于人CD45+细胞/µl(hCD45+/µL)的TruCount染色进行测量，其展示为组平均值，且误差条作为SEM。
图7是显示血液中的峰值T细胞(T细胞Cmax)的图。根据图4中所示的方案并通过使用‘应激’剂量的CAR-T细胞来评价体内肿瘤控制，所述CAR-T细胞使用不同的CSR进行生产。对于所有动物，如通过对于人CD45+ (hCD45+)细胞的TruCount染色测量的，血液中的T细胞峰值水平展示为组平均值，且误差条作为SEM。
图8是显示血液中的T细胞(hCD45+)的曲线下面积的图。根据图4中所示的方案并通过使用‘应激’剂量的CAR-T细胞来评价体内肿瘤控制，所述CAR-T细胞使用不同的CSR进行生产。对于所有动物，如根据对于人CD45+细胞的TruCount染色计算的，血液中的T细胞AUC展示为组平均值，且误差条作为SEM。
图9是显示血液中的CD8+ T细胞表型的一系列图。根据图4中所示的方案并通过使用‘应激’剂量的CAR-T细胞来评价体内肿瘤控制，所述CAR-T细胞使用不同的CSR进行生产。在CAR-T治疗后的第14天和第35天，如对于所有动物通过FACS染色测量的血液中的CD8+ T细胞表型展示为组平均值，且误差条作为SEM。细胞关于表面CD45RA、CD45RO和CD62L的表达进行染色，以限定TSCM、TCM、TEM和TEFF细胞；TSCM (CD45RA+CD45RO-CD62L+；蓝色)、TCM(CD45RA-CD45RO+CD62L+；红色)、TEM (CD45RA-CD45RO+CD62L-；绿色)、TEFF (CD45RA+CD45RO-CD62L-；紫色)。
本文引用的所有文件，包括任何交叉引用或有关的专利或申请，在此整体通过引入并入本文用于所有目的，除非明确排除或以其它方式限制。任何文件的引用并非承认它是关于本文公开或请求保护的任何发明的现有技术，且也并非承认它单独或与任何其它一个或多个参考文献的任何组合教导、暗示或公开任何此类发明。进一步地，就本文件中术语的任何含义或定义与通过引入并入的文件中相同术语的任何含义或定义冲突而言，应以本文件中赋予该术语的含义或定义为准。
具体实施方式
本公开内容提供了同种异体细胞组合物、这些组合物的制备方法和使用这些组合物的方法，所述组合物包含非天然存在的结构改善，以恢复同种异体细胞对环境刺激的应答性，以及减少或预防通过天然杀伤细胞介导的细胞毒性的排斥。
嵌合刺激受体(CSR)和重组HLA-E多肽
对于施用于任何患者“普遍”安全的过继细胞组合物需要同种异体反应性的显著减少或消除。为此，可以修饰本公开内容的细胞(例如，同种异体细胞)，以中断T细胞受体(TCR)和/或一类主要组织相容性复合物(MHC)的表达或功能。TCR介导移植物抗宿主(GvH)反应，而MHC介导宿主抗移植物(HvG)反应。在优选的方面，消除TCR的任何表达和/或功能，以预防可以引起受试者死亡的T细胞介导的GvH。因此，在一个优选的方面，本公开内容提供了纯的TCR阴性同种异体T细胞组合物(例如，组合物中的每种细胞以如此低的水平表达，以致于或无法检测或不存在)。
MHC I类(MHC-I，具体而言，HLA-A、HLA-B和HLA-C)的表达和/或功能被减少或消除，以预防HvG并因而改善细胞在受试者中的移植物植入。改善的移植物植入导致细胞的更长持久性，并且因此对于受试者更大的治疗窗口。具体而言，MHC-1的结构元件β-2-微球蛋白(B2M)的表达和/或功能被减少或消除。
上述策略引起进一步的挑战。T细胞中的T细胞受体(TCR)敲除(KO)导致CD3-ζ(CD3z或CD3ζ)的表达丧失，所述CD3-ζ是TCR复合物的部分。TCR-KO T细胞中的CD3ζ丧失急剧减少了使用标准刺激/激活试剂(包括但不限于激动剂抗CD3 mAb)，最佳地激活且扩增这些细胞的能力。当TCR复合物的任何一种组分的表达或功能中断时，该复合物的所有组分都丧失，包括TCR-α (TCRα)、TCR-β (TCRβ)、CD3-γ (CD3γ)、CD3-ε (CD3ε)、CD3-δ (CD3δ)和CD3-ζ (CD3ζ)。CD3ε和CD3ζ两者均为T细胞激活和扩增所需要的。激动剂抗CD3 mAb通常识别CD3ε和复合物内可能的另一种蛋白质，其依次又向CD3ζ发信号。CD3ζ提供了用于T细胞激活的主要刺激(连同次要共刺激信号一起)，用于最佳激活和扩增。在正常条件下，完全T细胞激活取决于与第二信号结合的TCR的接合，所述第二信号由一种或多种共刺激受体(例如，CD28、CD2、4-1BBL)介导，其增强免疫应答。然而，当TCR不存在时，当使用标准激活/刺激试剂(包括激动剂抗CD3 mAb)刺激时，T细胞扩增严重减少。事实上，当使用标准激活/刺激试剂(包括激动剂抗CD3 mAb)刺激时，T细胞扩增减少到正常扩增水平的仅20-40%。
因此，本公开内容提供了非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)，其包含：(a)包含信号肽和激活组分的胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)包含细胞质结构域和信号转导结构域的胞内结构域；并且其中所述信号肽和细胞质结构域并非衍生自相同的蛋白质。
激活组分可以包含以下中的一种或多种的一部分：T细胞受体(TCR)的组分、TCR复合物的组分、TCR共受体的组分、TCR共刺激蛋白的组分、TCR抑制蛋白的组分、细胞因子受体、和激活组分的激动剂结合的趋化因子受体。激活组分可以包含激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分。
信号转导结构域可以包含以下中的一种或多种：人信号转导结构域的组分、T细胞受体(TCR)、TCR复合物的组分、TCR共受体的组分、TCR共刺激蛋白的组分、TCR抑制蛋白的组分、细胞因子受体和趋化因子受体。信号转导结构域可以包含CD3蛋白或其一部分。CD3蛋白可以包含CD3ζ蛋白或其一部分。
激活结构域可以分离自或衍生自第一蛋白质。信号肽可以分离自或衍生自第二蛋白质。跨膜结构域可以分离自或衍生自第三蛋白质。细胞质结构域可以分离自或衍生自第四蛋白质。信号传导结构域可以分离自或衍生自第五蛋白质。第一蛋白质和第二蛋白质可以为等同的。第一蛋白质和第三蛋白质可以为等同的。第一蛋白质和第四蛋白质不能是等同的。第一蛋白质和第五蛋白质不能是等同的。第二蛋白质和第三蛋白质可以为等同的。第二蛋白质和第四蛋白质不能是等同的。第二蛋白质和第五蛋白质不能是等同的。第三蛋白质和第四蛋白质不能是等同的。第三蛋白质和第五蛋白质不能是等同的。第四蛋白质和第五蛋白质不能是等同的。
在一些方面，激活组分并不结合天然存在的分子。在一些方面，激活组分结合天然存在的分子，但CSR在激活组分与天然存在的分子结合后并不转导信号。在一些方面，激活组分结合非天然存在的分子。在一些方面，激活组分并不结合天然存在的分子，而是结合非天然存在的分子。CSR可以在激活组分与非天然存在的分子结合后选择性地转导信号。
本公开内容提供了编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的转座子或载体。
本公开内容提供了包含本文公开的任何CSR的细胞。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的细胞。本公开内容提供了包含载体的细胞，所述载体包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含转座子的细胞，所述转座子包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。
本文公开的修饰的细胞可以为同种异体细胞或自体细胞。在一些优选的方面，修饰的细胞是同种异体细胞。在一些方面，修饰的细胞是自体T细胞或修饰的自体CAR T细胞。在一些优选的方面，修饰的细胞是同种异体T细胞或修饰的同种异体CAR T细胞。
本公开内容提供了包含本文公开的任何CSR的组合物。本公开内容提供了包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列的组合物。本公开内容提供了包含载体的组合物，所述载体包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含转座子的组合物，所述转座子包含编码本文公开的任何CSR的核酸序列。本公开内容提供了包含本文公开的修饰的细胞的组合物、或包含本文公开的多种修饰的细胞的组合物。
本公开内容提供了修饰的T淋巴细胞(T细胞)，其包含：(a)编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰，其中所述修饰减少或消除了TCR的表达或活性水平；以及(b)嵌合刺激受体(CSR)，其包含：(i)包含激活组分的胞外结构域，其中所述激活组分分离自或衍生自第一蛋白质；(ii)跨膜结构域；以及(iii)包含至少一个信号转导结构域的胞内结构域，其中所述至少一个信号转导结构域分离自或衍生自第二蛋白质；其中所述第一蛋白质和第二蛋白质并非等同的。
修饰的T细胞可以进一步包含诱导型促凋亡多肽。修饰的T细胞可以进一步包含编码β-2-微球蛋白(B2M)的内源序列的修饰，其中所述修饰减少或消除了主要组织相容性复合物(MHC) I类(MHC-I)的表达或活性水平。
修饰的T细胞可以进一步包含非天然存在的多肽，其包含HLA I类组织相容性抗原，α链E (HLA-E)多肽。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含B2M信号肽。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含B2M多肽。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含接头，其中所述接头置于B2M多肽和HLA-E多肽之间。包含HLA-E多肽的非天然存在的多肽可以进一步包含肽和B2M多肽。包含HLA-E的非天然存在的多肽可以进一步包含置于B2M信号肽和肽之间的第一接头，以及置于B2M多肽和编码HLA-E的肽之间的第二接头。
修饰的T细胞可以进一步包含非天然存在的抗原受体、编码治疗性多肽的序列或其组合。非天然存在的抗原受体可以包含嵌合抗原受体(CAR)。
CSR可以在修饰的T细胞中瞬时表达。CSR可以在修饰的T细胞中稳定表达。包含HLA-E多肽的多肽可以在修饰的T细胞中瞬时表达。包含HLA-E多肽的多肽可以在修饰的T细胞中稳定表达。诱导型促凋亡多肽可以在修饰的T细胞中瞬时表达。诱导型促凋亡多肽可以在修饰的T细胞中稳定表达。非天然存在的抗原受体或编码治疗性蛋白质的序列可以在修饰的T细胞中瞬时表达。非天然存在的抗原受体或编码治疗性蛋白质的序列可以在修饰的T细胞中稳定表达。
如本文详细描述的，基因编辑组合物，包括但不限于包含dCas9-Clo051的RNA引导的融合蛋白，可以用于靶向且降低或消除内源性T细胞受体的表达。在优选的方面，基因编辑组合物靶向并缺失编码内源性T细胞受体的基因、基因的一部分或基因的调控元件(例如启动子)。用于生成引导RNA (gRNA)模板的引物(包括T7启动子、基因组靶序列和gRNA支架)的非限制性实例公开于PCT申请号PCT/US2019/049816中，所述引导RNA模板用于靶向且缺失TCR-α (TCR-α)、靶向且缺失TCR-β (TCR-β)、以及靶向且缺失β-2-微球蛋白(β2M)。
基因编辑组合物，包括但不限于包含dCas9-Clo051的RNA引导的融合蛋白，可以用于靶向且降低或消除内源性MHCI、MHCII或MHC激活物的表达。在优选的方面，基因编辑组合物靶向且缺失编码内源性MHCI、MHCII或MHC激活物的一种或多种组分的基因、基因的一部分或基因的调控元件(例如启动子)。用于靶向且缺失MHC激活物的引导RNA (gRNA)的非限制性实例公开于PCT申请号PCT/US2019/049816 (通过引用以其整体并入本文)中。
非天然存在的嵌合刺激受体，编码TCR-α (TCR-α)、TCR-β (TCR-β)和/或β-2-微球蛋白(β2M)的内源序列的遗传修饰，以及包含HLA I类组织相容性抗原α链E (HLA-E)多肽的非天然存在的多肽的详细描述，公开于PCT申请号PCT/US2019/049816 (通过引用以其整体并入本文)中。
本公开内容的嵌合刺激受体
本公开内容提供了包含激活组分的嵌合刺激受体(CSR)，所述激活组分包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分。激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：
KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD (SEQ ID NO: 1)。在一个优选的方面，激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：AAAGAGATCACAAACGCCCTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTACGACACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC (SEQ ID NO: 2)。在一个优选的方面，激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 2的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本公开内容提供了包含胞外结构域的嵌合刺激受体(CSR)，所述胞外结构域包含激活组分，所述激活组分包含非天然存在的CD2细胞外结构域、基本由其组成或由其组成。在一些方面，本公开内容的CSR的胞外结构域可以包含修饰。修饰可以包含与激活组分的野生型氨基酸序列相比，激活组分的氨基酸序列中的突变或截短。激活组分的氨基酸序列中的突变或截短可以包含激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分的突变或截短。突变或截短的CD2细胞外结构域结合抗CD2活化激动剂和抗CD2激活分子，但并不结合天然存在的CD58。在一些方面，结合抗CD2活化激动剂但并不结合CD58的CD2细胞外结构域中存在的突变是D111H突变。具有D111H突变的CD2细胞外结构包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYHTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD (SEQ ID NO: 3)。在一个优选的方面，具有D111H突变的CD2细胞外结构域包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，具有D111H突变的CD2细胞外结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：AAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTACCACACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC(SEQ ID NO: 4)。在一个优选的方面，具有D111H突变的CD2细胞外结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 4的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本公开内容的CSR的胞内结构域可以进一步包含信号肽、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，信号肽可以包含CD2信号肽或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，信号肽可以包含CD8a信号肽或其一部分、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD2信号肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99% 或100% (或两者之间的任何百分比)等同：MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVS (SEQ ID NO: 5)。在一个优选的方面，CD2信号肽包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD2信号肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCC (SEQ ID NO: 6)。在一个优选的方面，CD2信号肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 6的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD8a信号肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或 100% (或两者之间的任何百分比)等同：MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 7)。在一个优选的方面，CD8a信号肽包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD8a信号肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCT (SEQ ID NO: 8)。在一个优选的方面，CD8a信号肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 8的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本公开内容提供了包含跨膜结构域的CSR。在一些方面，跨膜结构域可以包含CD2跨膜结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，CD2跨膜结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：IYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYIT (SEQ ID NO: 9)。在一个优选的方面，CD2跨膜结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD2跨膜结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC (SEQ ID NO: 10)。在一个优选的方面，CD2跨膜结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 10的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本公开内容提供了包含胞内结构域的CSR，所述胞内结构域包含至少一个信号转导结构域。在一些方面，信号转导结构域可以包含CD3ζ细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，CD3ζ细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQID NO: 11)。在一个优选的方面，CD3ζ细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD3ζ细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：AGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 12)。在一个优选的方面，CD3ζ细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 12的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本公开内容的CSR的胞内结构域可以进一步包含细胞质结构域、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含CD2细胞内结构域(ICD)或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含CD28细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含4-1BB细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含IL17RA细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含IL15RA细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含IL21R细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含ICOS细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含CD27细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含OX40细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，细胞质结构域可以包含GITR细胞内结构域或其一部分、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD2细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：KRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN (SEQ IDNO: 13)。在一个优选的方面，CD2细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD2细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：AAGCGGAAGAAGCAGCGGAGCAGACGGAACGACGAGGAACTGGAAACACGGGCCCATAGAGTGGCCACCGAGGAAAGAGGCAGAAAGCCCCACCAGATTCCAGCCAGCACACCCCAGAATCCTGCCACCTCTCAACACCCTCCACCTCCACCTGGACACAGATCTCAGGCCCCATCTCACAGACCTCCACCACCTGGTCATCGGGTGCAGCACCAGCCTCAGAAAAGACCTCCTGCTCCTAGCGGCACACAGGTGCACCAGCAAAAAGGACCTCCACTGCCTCGGCCTAGAGTGCAGCCTAAACCTCCTCATGGCGCCGCTGAGAACAGCCTGTCTCCAAGCAGCAAC (SEQ ID NO: 14)。在一个优选的方面，CD2细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 14的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD28细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQID NO: 15)。在一个优选的方面，CD28细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD28细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：AGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCC (SEQ ID NO: 16)。在一个优选的方面，CD28细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 16的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，4-1BB细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQID NO: 17)。在一个优选的方面，4-1BB细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，4-1BB细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：AAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTG (SEQ ID NO: 18)。在一个优选的方面，4-1BB细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 18的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，IL17RA细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQID NO: 19)。在一个优选的方面，IL17RA细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，IL17RA细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：AAGAAGCGGATCAAGCCCATCGTGTGGCCCAGCCTGCCTGACCACAAGAAAACCCTGGAACACCTGTGCAAGAAGCCCCGGAAGAACCTGAATGTGTCCTTCAATCCCGAGAGCTTCCTGGACTGCCAGATCCACAGAGTGGACGACATCCAGGCCAGAGATGAGGTGGAAGGCTTTCTGCAGGACACCTTTCCACAGCAGCTGGAAGAGAGCGAGAAGCAGAGACTCGGCGGAGATGTGCAGAGCCCTAATTGCCCTAGCGAGGACGTGGTCATCACCCCTGAGAGCTTCGGCAGAGATAGCAGCCTGACATGTCTGGCCGGCAATGTGTCCGCCTGTGATGCCCCTATCCTGAGCAGCAGCAGAAGCCTGGATTGCAGAGAGAGCGGAAAGAACGGCCCTCATGTGTATCAGGACCTGCTGCTGAGCCTGGGCACCACCAATTCTACACTGCCTCCACCATTCAGCCTGCAGAGCGGCATCCTGACACTGAACCCTGTTGCTCAGGGCCAGCCAATCCTGACAAGCCTGGGCTCCAATCAAGAAGAGGCCTACGTCACCATGTCCAGCTTCTACCAGAACCAG (SEQ ID NO 20)。在一个优选的方面，IL17RA细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 20的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，IL15RA细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：KSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL (SEQ IDNO: 21)。在一个优选的方面，IL15RA细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，IL15RA细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：AAGAGCCGGCAGACACCTCCTCTGGCCAGCGTGGAAATGGAAGCCATGGAAGCTCTGCCTGTGACCTGGGGCACAAGCAGCAGAGATGAGGACCTGGAAAACTGCAGCCACCACCTG (SEQ ID NO: 22)。在一个优选的方面，IL15RA细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 22的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，IL21R细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS (SEQ ID NO: 23)。在一个优选的方面，IL21R细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，IL21R细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：AGCCTGAAAACACACCCACTCTGGCGGCTGTGGAAGAAAATCTGGGCCGTGCCATCTCCTGAGCGGTTCTTCATGCCTCTGTACAAGGGCTGCAGCGGCGACTTCAAGAAATGGGTCGGAGCCCCTTTTACCGGCAGCTCTCTGGAACTTGGACCTTGGAGCCCTGAGGTGCCCAGCACACTGGAAGTGTACAGCTGTCACCCTCCTAGAAGCCCCGCCAAGAGACTGCAGCTGACAGAGCTGCAAGAGCCTGCCGAGCTGGTGGAATCTGATGGCGTGCCCAAGCCTAGCTTCTGGCCCACAGCTCAGAATAGCGGCGGCTCTGCCTACAGCGAGGAAAGGGATAGACCTTACGGCCTGGTGTCTATCGACACCGTGACCGTGCTGGATGCCGAGGGACCTTGTACATGGCCTTGCAGCTGCGAGGACGATGGCTACCCTGCTCTGGATCTGGACGCAGGCCTTGAGCCTTCTCCAGGACTGGAAGATCCTCTGCTGGACGCCGGAACAACCGTGCTGTCTTGTGGCTGTGTGTCTGCCGGATCTCCTGGACTTGGAGGCCCTCTGGGAAGCCTGCTGGATAGACTGAAACCTCCTCTGGCCGACGGCGAAGATTGGGCTGGTGGACTTCCTTGGGGCGGAAGATCTCCAGGCGGAGTGTCTGAGTCTGAAGCCGGTTCTCCACTGGCCGGCCTGGACATGGATACCTTCGATTCTGGCTTCGTGGGCAGCGACTGTAGCAGCCCTGTGGAATGCGACTTCACAAGCCCTGGCGACGAGGGCCCACCTAGAAGCTATCTGAGACAGTGGGTCGTGATCCCTCCACCTCTGTCTAGTCCTGGACCTCAGGCCAGC (SEQ IDNO: 24)。在一个优选的方面，IL21R细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 24的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，ICOS细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (SEQ IDNO: 25)。在一个优选的方面，ICOS细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 25的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，ICOS细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：TGTTGGCTGACCAAGAAAAAGTACAGCAGCAGCGTGCACGACCCCAACGGCGAGTACATGTTCATGAGAGCCGTGAACACCGCCAAGAAGTCCAGACTGACCGACGTGACCCTG (SEQ ID NO: 26)。在一个优选的方面，ICOS细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO 26的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD27细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO: 27)。在一个优选的方面，CD27细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，CD27细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：CAGCGGCGGAAGTACAGAAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAACCTGCCGAGCCTTGTCACTACAGCTGCCCCAGAGAGGAAGAGGGCAGCACAATCCCCATCCAAGAGGACTACAGAAAGCCCGAGCCTGCCTGCTCTCCC (SEQ ID NO: 28)。在一个优选的方面，CD27细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 28的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，OX40细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQID NO: 29)。在一个优选的方面，OX40细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，OX40细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：GCCCTGTACCTGCTGCGGCGGGATCAAAGATTGCCTCCTGACGCTCACAAGCCTCCAGGCGGAGGCAGCTTTAGAACCCCTATCCAAGAGGAACAGGCTGACGCCCACAGCACCCTGGCCAAGATC (SEQ ID NO 30)。在一个优选的方面，OX40细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO 30的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，GITR细胞内结构域或其一部分包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同：QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (SEQ ID NO: 31)。在一个优选的方面，GITR细胞内结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 31的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
在一些方面，GITR细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列、基本上由核酸序列组成或由核酸序列组成，所述核酸序列与以下至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同：CAGCTGGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGAAGCCAGTGCATGTGGCCCAGAGAGACACAGCTGCTGCTGGAAGTGCCTCCTAGCACCGAGGATGCCAGAAGCTGTCAGTTCCCCGAGGAAGAGAGAGGCGAGAGATCCGCCGAGGAAAAAGGCAGACTGGGCGACCTGTGGGTCCGAGTG(SEQ ID NO: 32)。在一个优选的方面，GITR细胞内结构域或其一部分由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 32的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本公开内容的示例性的“CSR CD2z”多肽包含(CD2信号肽、CD2细胞外结构域、CD2 跨膜结构域、CD2细胞质结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT KRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHR PPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSNRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 33)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 1
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
CD2细胞质结构域：SEQ ID NO: 13
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“CSR CD2z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、CD2 细胞外结构域、CD2跨膜结构域、CD2细胞质结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列、基本上由其组成或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAGATCACAAACGCCCTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTACGACACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGAAGCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC AAGCGGAAGAAGCAGCGGAGCAGACGGAACGACGAGGAACTGGAAAC ACGGGCCCATAGAGTGGCCACCGAGGAAAGAGGCAGAAAGCCCCACCAGATTCCAGCCAGCACACCCCAGAATCCT GCCACCTCTCAACACCCTCCACCTCCACCTGGACACAGATCTCAGGCCCCATCTCACAGACCTCCACCACCTGGTC ATCGGGTGCAGCACCAGCCTCAGAAAAGACCTCCTGCTCCTAGCGGCACACAGGTGCACCAGCAAAAAGGACCTCC ACTGCCTCGGCCTAGAGTGCAGCCTAAACCTCCTCATGGCGCCGCTGAGAACAGCCTGTCTCCAAGCAGCAACAGAGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 34)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 2
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
CD2细胞质结构域：SEQ ID NO: 14
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR CD2z-D111H”或 “CD2.DH.z”或“CSR 01CD2.DH.z”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构 域、CD2跨膜结构域、CD2细胞质结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT KRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHR PPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSNRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 35)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：
SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
CD2细胞质结构域：SEQ ID NO: 13
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR CD2z-D111H”或 “CD2.DH.z”或“CSR 01CD2.DH.z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H 突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、CD2细胞质结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAGATCACAAACGCCCTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGAAGCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC AAGCGGAAGAAGCAGCGGAGCAGACGGAACGACGAGGAACTGGAAAC ACGGGCCCATAGAGTGGCCACCGAGGAAAGAGGCAGAAAGCCCCACCAGATTCCAGCCAGCACACCCCAGAATCCT GCCACCTCTCAACACCCTCCACCTCCACCTGGACACAGATCTCAGGCCCCATCTCACAGACCTCCACCACCTGGTC ATCGGGTGCAGCACCAGCCTCAGAAAAGACCTCCTGCTCCTAGCGGCACACAGGTGCACCAGCAAAAAGGACCTCC ACTGCCTCGGCCTAGAGTGCAGCCTAAACCTCCTCATGGCGCCGCTGAGAACAGCCTGTCTCCAAGCAGCAACAGAGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 36)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：
SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
CD2细胞质结构域：SEQ ID NO: 14
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 01b CD2.8.DH.z”或“CD2.8.DH.z”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、CD2细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT KRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPP PGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSNRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 37)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
CD2细胞内结构域：SEQ ID NO: 13
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 01b CD2.8.DH.z”或“CD2.8.DH.z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构 域、CD2跨膜结构域、CD2细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACC AAGCGGAAGAAGCAGCGGAGCAGACGGAACGACGAGGAACTGGAAACACGGGCCCA TAGAGTGGCCACCGAGGAAAGAGGCAGAAAGCCCCACCAGATTCCAGCCAGCACACCCCAGAATCCTGCCACCTCT CAACACCCTCCACCTCCACCTGGACACAGATCTCAGGCCCCATCTCACAGACCTCCACCACCTGGTCATCGGGTGC AGCACCAGCCTCAGAAAAGACCTCCTGCTCCTAGCGGCACACAGGTGCACCAGCAAAAAGGACCTCCACTGCCTCG GCCTAGAGTGCAGCCTAAACCTCCTCATGGCGCCGCTGAGAACAGCCTGTCTCCAAGCAGCAACAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 38)
CD8a信号肽: SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
CD2细胞内结构域：SEQ ID NO: 14
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 02 CD2.DH.28z”或 “CD2.DH.28.z”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、CD28细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 39)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
CD28细胞内结构域：SEQ ID NO: 15
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 02 CD2.DH.28z”或“CD2.DH.28.z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、CD28细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC AGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGAC CCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 40)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
CD28细胞内结构域：SEQ ID NO: 16
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 02b CD2.8.DH.28z”或“CD2.8.DH.28z”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构 域、CD28细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 41)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
CD28细胞内结构域：SEQ ID NO: 15
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 02b CD2.8.DH.28z”或“CD2.8.DH.28z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结 构域、CD2跨膜结构域、CD28细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACC AGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACG GCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 42)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
CD28细胞内结构域：SEQ ID NO: 16
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 03 CD2.DH.BBz”或“CD2.DH.BBz”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、4- 1BB细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 43)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
4-1BB细胞内结构域：SEQ ID NO: 17
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 03 CD2.DH.BBz”或“CD2.DH.BBz”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、4-1BB细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC AAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCAT GCGGCCCGTGCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAG CTGAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 44)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
4-1BB细胞内结构域：SEQ ID NO: 18
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 03 CD2.8.DH.BBz”或“CD2.8.DH.BBz”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构 域、4-1BB细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 45)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
4-1BB细胞内结构域：SEQ ID NO: 17
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 03b CD2.8.DH.BBz”或“CD2.8.DH.BBz”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结 构域、CD2跨膜结构域、4-1BB细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACC AAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGT GCAGACCACACAAGAGGAAGATGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 46)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
4-1BB细胞内结构域：SEQ ID NO: 18
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 04 CD2.DH.7z”或“CD2.DH.7z”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、IL7RA 细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQ DTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVY QDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 47)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
IL7RA细胞内结构域：SEQ ID NO: 19
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 04 CD2.DH.7z”或“CD2.DH.7z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2 跨膜结构域、IL7RA细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC AAGAAGCGGATCAAGCCCATCGTGTGGCCCAGCCTGCCTGACCACAA GAAAACCCTGGAACACCTGTGCAAGAAGCCCCGGAAGAACCTGAATGTGTCCTTCAATCCCGAGAGCTTCCTGGAC TGCCAGATCCACAGAGTGGACGACATCCAGGCCAGAGATGAGGTGGAAGGCTTTCTGCAGGACACCTTTCCACAGC AGCTGGAAGAGAGCGAGAAGCAGAGACTCGGCGGAGATGTGCAGAGCCCTAATTGCCCTAGCGAGGACGTGGTCAT CACCCCTGAGAGCTTCGGCAGAGATAGCAGCCTGACATGTCTGGCCGGCAATGTGTCCGCCTGTGATGCCCCTATC CTGAGCAGCAGCAGAAGCCTGGATTGCAGAGAGAGCGGAAAGAACGGCCCTCATGTGTATCAGGACCTGCTGCTGA GCCTGGGCACCACCAATTCTACACTGCCTCCACCATTCAGCCTGCAGAGCGGCATCCTGACACTGAACCCTGTTGC TCAGGGCCAGCCAATCCTGACAAGCCTGGGCTCCAATCAAGAAGAGGCCTACGTCACCATGTCCAGCTTCTACCAG AACCAGAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 48)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
IL7RA细胞内结构域：SEQ ID NO: 20
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 04b CD2.8.DH.7z”或“CD2.8.DH.7z”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构 域、IL7RA细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTF PQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDL LLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 49)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
IL7RA细胞内结构域：SEQ ID NO: 19
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 04b CD2.8.DH.7z”或“CD2.8.DH.7z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构 域、CD2跨膜结构域、IL7RA细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACC AAGAAGCGGATCAAGCCCATCGTGTGGCCCAGCCTGCCTGACCACAAGAAAACCCT GGAACACCTGTGCAAGAAGCCCCGGAAGAACCTGAATGTGTCCTTCAATCCCGAGAGCTTCCTGGACTGCCAGATC CACAGAGTGGACGACATCCAGGCCAGAGATGAGGTGGAAGGCTTTCTGCAGGACACCTTTCCACAGCAGCTGGAAG AGAGCGAGAAGCAGAGACTCGGCGGAGATGTGCAGAGCCCTAATTGCCCTAGCGAGGACGTGGTCATCACCCCTGA GAGCTTCGGCAGAGATAGCAGCCTGACATGTCTGGCCGGCAATGTGTCCGCCTGTGATGCCCCTATCCTGAGCAGC AGCAGAAGCCTGGATTGCAGAGAGAGCGGAAAGAACGGCCCTCATGTGTATCAGGACCTGCTGCTGAGCCTGGGCA CCACCAATTCTACACTGCCTCCACCATTCAGCCTGCAGAGCGGCATCCTGACACTGAACCCTGTTGCTCAGGGCCA GCCAATCCTGACAAGCCTGGGCTCCAATCAAGAAGAGGCCTACGTCACCATGTCCAGCTTCTACCAGAACCAGAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 50)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
IL7RA细胞内结构域：SEQ ID NO: 20
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 05 CD2.DH.15z”或“CD2.DH.15z”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、IL15RA细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT KSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHLRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 51)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
IL15RA细胞内结构域：SEQ ID NO: 21
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 05 CD2.DH.15z”或“CD2.DH.15z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、IL15RA细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC AAGAGCCGGCAGACACCTCCTCTGGCCAGCGTGGAAATGGAAGCCAT GGAAGCTCTGCCTGTGACCTGGGGCACAAGCAGCAGAGATGAGGACCTGGAAAACTGCAGCCACCACCTGAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 52)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
IL15RA细胞内结构域：SEQ ID NO: 22
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 05b CD2.8.DH.15z”或“CD2.8.DH.15z”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构 域、IL15RA细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT KSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHLRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 53)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
IL15RA细胞内结构域：SEQ ID NO: 21
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 05b CD2.8.DH.15z”或“CD2.8.DH.15z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结 构域、CD2跨膜结构域、IL15RA细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACC AAGAGCCGGCAGACACCTCCTCTGGCCAGCGTGGAAATGGAAGCCATGGAAGCTCT GCCTGTGACCTGGGGCACAAGCAGCAGAGATGAGGACCTGGAAAACTGCAGCCACCACCTGAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 54)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
IL15RA细胞内结构域：SEQ ID NO: 22
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 06 CD2.DH.21z”或“CD2.DH.21z”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、IL21R细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTL EVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTW PCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWG GRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQASRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 55)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
IL21R细胞内结构域：SEQ ID NO: 23
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 06 CD2.DH.21z”或“CD2.DH.21z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、IL21R细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC AGCCTGAAAACACACCCACTCTGGCGGCTGTGGAAGAAAATCTGGGC CGTGCCATCTCCTGAGCGGTTCTTCATGCCTCTGTACAAGGGCTGCAGCGGCGACTTCAAGAAATGGGTCGGAGCC CCTTTTACCGGCAGCTCTCTGGAACTTGGACCTTGGAGCCCTGAGGTGCCCAGCACACTGGAAGTGTACAGCTGTC ACCCTCCTAGAAGCCCCGCCAAGAGACTGCAGCTGACAGAGCTGCAAGAGCCTGCCGAGCTGGTGGAATCTGATGG CGTGCCCAAGCCTAGCTTCTGGCCCACAGCTCAGAATAGCGGCGGCTCTGCCTACAGCGAGGAAAGGGATAGACCT TACGGCCTGGTGTCTATCGACACCGTGACCGTGCTGGATGCCGAGGGACCTTGTACATGGCCTTGCAGCTGCGAGG ACGATGGCTACCCTGCTCTGGATCTGGACGCAGGCCTTGAGCCTTCTCCAGGACTGGAAGATCCTCTGCTGGACGC CGGAACAACCGTGCTGTCTTGTGGCTGTGTGTCTGCCGGATCTCCTGGACTTGGAGGCCCTCTGGGAAGCCTGCTG GATAGACTGAAACCTCCTCTGGCCGACGGCGAAGATTGGGCTGGTGGACTTCCTTGGGGCGGAAGATCTCCAGGCG GAGTGTCTGAGTCTGAAGCCGGTTCTCCACTGGCCGGCCTGGACATGGATACCTTCGATTCTGGCTTCGTGGGCAG CGACTGTAGCAGCCCTGTGGAATGCGACTTCACAAGCCCTGGCGACGAGGGCCCACCTAGAAGCTATCTGAGACAG TGGGTCGTGATCCCTCCACCTCTGTCTAGTCCTGGACCTCAGGCCAGCAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 56)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
IL21R细胞内结构域：SEQ ID NO: 24
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 06b CD2.8.DH.21z”或“CD2.8.DH.21z”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构 域、IL21R细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVY SCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCS CEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRS PGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQASRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 57)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
IL21R细胞内结构域：SEQ ID NO: 23
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 06b CD2.8.DH.21z”或“CD2.8.DH.21z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结 构域、CD2跨膜结构域、IL21R细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACC AGCCTGAAAACACACCCACTCTGGCGGCTGTGGAAGAAAATCTGGGCCGTGCCATC TCCTGAGCGGTTCTTCATGCCTCTGTACAAGGGCTGCAGCGGCGACTTCAAGAAATGGGTCGGAGCCCCTTTTACC GGCAGCTCTCTGGAACTTGGACCTTGGAGCCCTGAGGTGCCCAGCACACTGGAAGTGTACAGCTGTCACCCTCCTA GAAGCCCCGCCAAGAGACTGCAGCTGACAGAGCTGCAAGAGCCTGCCGAGCTGGTGGAATCTGATGGCGTGCCCAA GCCTAGCTTCTGGCCCACAGCTCAGAATAGCGGCGGCTCTGCCTACAGCGAGGAAAGGGATAGACCTTACGGCCTG GTGTCTATCGACACCGTGACCGTGCTGGATGCCGAGGGACCTTGTACATGGCCTTGCAGCTGCGAGGACGATGGCT ACCCTGCTCTGGATCTGGACGCAGGCCTTGAGCCTTCTCCAGGACTGGAAGATCCTCTGCTGGACGCCGGAACAAC CGTGCTGTCTTGTGGCTGTGTGTCTGCCGGATCTCCTGGACTTGGAGGCCCTCTGGGAAGCCTGCTGGATAGACTG AAACCTCCTCTGGCCGACGGCGAAGATTGGGCTGGTGGACTTCCTTGGGGCGGAAGATCTCCAGGCGGAGTGTCTG AGTCTGAAGCCGGTTCTCCACTGGCCGGCCTGGACATGGATACCTTCGATTCTGGCTTCGTGGGCAGCGACTGTAG CAGCCCTGTGGAATGCGACTTCACAAGCCCTGGCGACGAGGGCCCACCTAGAAGCTATCTGAGACAGTGGGTCGTG ATCCCTCCACCTCTGTCTAGTCCTGGACCTCAGGCCAGCAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQID NO: 58)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
IL21R细胞内结构域：SEQ ID NO: 24
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 07 CD2.DH.Iz”或“CD2.DH.Iz”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、ICOS细 胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 59)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
ICOS细胞内结构域：SEQ ID NO: 25
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 07 CD2.DH.Iz”或“CD2.DH.Iz”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2 跨膜结构域、ICOS细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC TGTTGGCTGACCAAGAAAAAGTACAGCAGCAGCGTGCACGACCCCAA CGGCGAGTACATGTTCATGAGAGCCGTGAACACCGCCAAGAAGTCCAGACTGACCGACGTGACCCTGAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 60)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
ICOS细胞内结构域：SEQ ID NO: 26
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 07b CD2.8.DH.Iz”或“CD2.8.DH.Iz”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构 域、ICOS细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 61)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
ICOS细胞内结构域: SEQ ID NO: 25
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 07b CD2.8.DH.Iz”或“CD2.8.DH.Iz”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构 域、CD2跨膜结构域、ICOS细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACC TGTTGGCTGACCAAGAAAAAGTACAGCAGCAGCGTGCACGACCCCAACGGCGAGTA CATGTTCATGAGAGCCGTGAACACCGCCAAGAAGTCCAGACTGACCGACGTGACCCTGAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 62)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
ICOS细胞内结构域：SEQ ID NO: 26
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 08 CD2.DH.27z”或“CD2.DH.27z”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、CD27细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 63)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
CD27细胞内结构域：SEQ ID NO: 27
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 08 CD2.DH.27z”或“CD2.DH.27z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、CD27细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC CAGCGGCGGAAGTACAGAAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAACC TGCCGAGCCTTGTCACTACAGCTGCCCCAGAGAGGAAGAGGGCAGCACAATCCCCATCCAAGAGGACTACAGAAAG CCCGAGCCTGCCTGCTCTCCCAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 64)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
CD27细胞内结构域：SEQ ID NO: 28
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 08b CD2.8.DH.27z”或“CD2.8.DH.27z”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构 域、CD27细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 65)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
CD27细胞内结构域：SEQ ID NO: 27
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 08b CD2.8.DH.27z”或“CD2.8.DH.27z”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结 构域、CD2跨膜结构域、CD27细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACC CAGCGGCGGAAGTACAGAAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAACCTGCCGAGCC TTGTCACTACAGCTGCCCCAGAGAGGAAGAGGGCAGCACAATCCCCATCCAAGAGGACTACAGAAAGCCCGAGCCT GCCTGCTCTCCCAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 66)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
CD27细胞内结构域：SEQ ID NO: 28
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 09 CD2.DH.Oxz”或“CD2.DH.Oxz”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、OX40细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 67)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
OX40细胞内结构域：SEQ ID NO: 29
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 09 CD2.DH.Oxz”或“CD2.DH.Oxz”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、OX40细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACC GCCCTGTACCTGCTGCGGCGGGATCAAAGATTGCCTCCTGACGCTCA CAAGCCTCCAGGCGGAGGCAGCTTTAGAACCCCTATCCAAGAGGAACAGGCTGACGCCCACAGCACCCTGGCCAAG ATCAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 68)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
OX40细胞内结构域：SEQ ID NO: 30
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 09b CD2.8.DH.Oxz”或“CD2.8.DH.Oxz”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构 域、OX40细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 69)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
OX40细胞内结构域：SEQ ID NO: 29
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 09b CD2.8.DH.Oxz”或“CD2.8.DH.Oxz”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结 构域、CD2跨膜结构域、OX40细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACC GCCCTGTACCTGCTGCGGCGGGATCAAAGATTGCCTCCTGACGCTCACAAGCCTCC AGGCGGAGGCAGCTTTAGAACCCCTATCCAAGAGGAACAGGCTGACGCCCACAGCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 70)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
OX40细胞内结构域：SEQ ID NO: 30
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 10 CD2.DH.Gz”或“CD2.DH.Gz”多肽包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构域、GITR细 胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKI AQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTL TCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGG SLLMVFVALLVFYIT QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWVRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 71)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 5
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
GITR细胞内结构域：SEQ ID NO: 31
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 10 CD2.DH.Gz”或“CD2.DH.Gz”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD2信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2 跨膜结构域、GITR细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGAGCTTCCCTTGCAAGTTCGTGGCCAGCTTCCTGCTGATCTTCAACGTGTCCTCTAAGGGCGCCGTGTCCAAAGAAATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTC CAGATGAGCGACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAG AGAAAGAGACATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAAC CGACGACCAGGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTC AAGATCCAAGAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGA ACGGCACAGACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAA GTGGACAACAAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCC GTGTCTTGCCCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGT TTGTGGCTCTGCTGGTGTTCTACATCACA CAGCTGGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGAAGCCAGTGCATGTGGCC CAGAGAGACACAGCTGCTGCTGGAAGTGCCTCCTAGCACCGAGGATGCCAGAAGCTGTCAGTTCCCCGAGGAAGAG AGAGGCGAGAGATCCGCCGAGGAAAAAGGCAGACTGGGCGACCTGTGGGTCCGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 72)
CD2信号肽：SEQ ID NO: 6
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
GITR细胞内结构域：SEQ ID NO: 32
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的示例性的“突变型CSR 10b CD2.8.DH.Gz”或“CD2.8.DH.Gz”多肽包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域、CD2跨膜结构 域、GITR细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的氨基酸序列或由其组成：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQF RKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIY H TKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCE VMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD IYLIIGICGGGSLL MVFVALLVFYIT QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWVRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 73)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 7
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 3
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 9
GITR细胞内结构域：SEQ ID NO: 31
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 11
编码本公开内容的“突变型CSR 10b CD2.8.DH.Gz”或“CD2.8.DH.Gz”多肽的示例性多核苷酸序列包含(CD8a信号肽、 在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构 域、CD2跨膜结构域、GITR细胞内结构域、CD3ζ细胞内结构域)的核酸序列或由其组成：
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTAAAGA AATCACGAATGCATTGGAAACCTGGGGAGCCCTCGGCCAGGATATTAACCTGGACATCCCCAGCTTCCAGATGAGC GACGACATCGATGACATCAAGTGGGAGAAAACCAGCGACAAGAAGAAGATCGCCCAGTTCCGGAAAGAGAAAGAGA CATTCAAAGAGAAGGACACCTACAAGCTGTTCAAGAACGGCACCCTGAAGATCAAGCACCTGAAAACCGACGACCA GGACATCTATAAGGTGTCCATCTAC CAC ACCAAGGGCAAGAACGTGCTGGAAAAGATCTTCGACCTCAAGATCCAA GAGCGGGTGTCCAAGCCTAAGATCAGCTGGACCTGCATCAACACCACACTGACCTGCGAAGTGATGAACGGCACAG ACCCCGAGCTGAACCTGTACCAGGATGGCAAACACCTGAAGCTGAGCCAGCGCGTGATCACCCACAAGTGGACAAC AAGCCTGAGCGCCAAGTTCAAGTGCACCGCCGGAAACAAAGTGTCTAAAGAGTCCAGCGTCGAGCCCGTGTCTTGC CCTGAAAAAGGACTGGAC ATCTACCTGATCATCGGCATCTGTGGCGGCGGATCCCTGCTGATGGTGTTTGTGGCTC TGCTGGTGTTCTACATCACA CAGCTGGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGAAGCCAGTGCATGTGGCCCAGAGAGAC ACAGCTGCTGCTGGAAGTGCCTCCTAGCACCGAGGATGCCAGAAGCTGTCAGTTCCCCGAGGAAGAGAGAGGCGAG AGATCCGCCGAGGAAAAAGGCAGACTGGGCGACCTGTGGGTCCGAGTGAAATTCAGCCGCAGCGCCGATGCTCCTGCCTATAAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGGCGCAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA(SEQ ID NO: 74)
CD8a信号肽：SEQ ID NO: 8
在CD2细胞外结构域内具有D111H突变的 CD2细胞外结构域：SEQ ID NO: 4
CD2跨膜结构域：SEQ ID NO: 10
GITR细胞内结构域：SEQ ID NO: 32
CD3ζ细胞内结构域：SEQ ID NO: 12
本公开内容的组合物(例如CSR)结合抗CD2活化激动剂和抗CD2活化分子，但并不结合天然存在的CD58。
包含本公开内容的CSR的组合物可以掺入如本文详细描述的细胞递送组合物(例如转座子或载体)内，并且任选地可以掺入细胞内。
本公开内容的细胞和修饰的细胞
本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为哺乳动物细胞。优选地，细胞和修饰的细胞是人细胞。本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为免疫细胞。本公开内容的免疫细胞可以包含淋巴样祖细胞、天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(T细胞)、干性记忆T细胞(TSCM细胞)、中枢记忆T细胞(TCM)、干细胞样T细胞、B淋巴细胞(B细胞)、抗原呈递细胞(APC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、髓样祖细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、红细胞、红血细胞(RBC)、巨核细胞或破骨细胞。
免疫前体细胞可以包含可以分化成一种或多种类型的免疫细胞的任何细胞。免疫前体细胞可以包含可以自我更新并发育成免疫细胞的多能干细胞。免疫前体细胞可以包含造血干细胞(HSC)或其后代。免疫前体细胞可以包含可以发育成免疫细胞的前体细胞。免疫前体细胞可以包含造血祖细胞(HPC)。
造血干细胞(HSC)是多潜能、自我更新的细胞。来自淋巴样和髓样谱系的所有分化的血细胞都起于HSC。HSC可以在成人骨髓、外周血、动员的外周血、腹膜透析流出液和脐带血中找到。
HSC可以分离自或衍生自原代或培养的干细胞。HSC可以分离自或衍生自胚胎干细胞、多潜能干细胞、多能干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。
免疫前体细胞可以包含HSC或HSC后代细胞。HSC后代细胞的非限制性实例包括多潜能干细胞、淋巴样祖细胞、天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(T细胞)、B淋巴细胞(B细胞)、髓样祖细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。
通过所公开的方法产生的HSC可以保留“原始”干细胞的特征，所述干细胞在分离自或衍生自成体干细胞并且定型至单一谱系时，共享胚胎干细胞的特性。例如，通过所公开的方法产生的“原始”HSC在***之后保留其“干性”，并且不分化。因而，作为过继细胞疗法，通过所公开的方法产生的“原始”HSC不仅补充其数目，而且在体内扩增。当作为单一剂量施用时，通过所公开的方法产生的“原始”HSC可以是治疗上有效的。
原始HSC可以为CD34+。原始HSC可以为CD34+和CD38-。原始HSC可以为CD34+、CD38-和CD90+。原始HSC可以为CD34+、CD38-、CD90+和CD45RA-。原始HSC可以为CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-和CD49f+。原始HSC可以为CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-和CD49f+。
原始HSC、HSC和/或HSC后代细胞可以根据所公开的方法进行修饰，以表达外源序列(例如，嵌合抗原受体或治疗性蛋白质)。修饰的原始HSC、修饰的HSC和/或修饰的HSC后代细胞可以向前分化，以产生修饰的免疫细胞，包括但不限于修饰的T细胞、修饰的天然杀伤细胞和/或修饰的B细胞。
修饰的免疫或免疫前体细胞可以为NK细胞。NK细胞可以为从淋巴样祖细胞分化的细胞毒性淋巴细胞。修饰的NK细胞可以衍生自修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)或修饰的HSC。在一些方面，未活化的NK细胞衍生自CD3耗竭的白细胞去除术(leukapheresis) (含有CD14/CD19/CD56+细胞)。
修饰的免疫或免疫前体细胞可以为B细胞。B细胞是在细胞表面上表达B细胞受体的一类淋巴细胞。B细胞受体与特异性抗原结合。修饰的B细胞可以衍生自修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)或修饰的HSC。
本公开内容的修饰的T细胞可以衍生自修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)或修饰的HSC。与传统的生物制品和化学治疗剂不同，所公开的修饰的T细胞能够在抗原识别后快速繁殖，从而潜在地避免了重复治疗的需要。为了实现这一点，在一些实施方案中，修饰的T细胞不仅驱动初始应答，而且还作为稳定的活记忆T细胞群体持续存在于患者中，以预防潜在的复发。可替代地，在一些方面，当不需要时，修饰的T细胞并不持续存在于患者中。
大量努力已集中于并不通过抗原非依赖性(强直)信号传导导致T细胞耗尽的抗原受体分子的开发，以及含有早期记忆T细胞，尤其是干细胞记忆(TSCM)或干细胞样T细胞的修饰T细胞产物的开发。本公开内容的干细胞样修饰的T细胞显示出最大的自我更新能力和多潜能能力，以衍生中枢记忆(TCM) T细胞或TCM样细胞、效应记忆(TEM)和效应T细胞(TE)，从而产生更好的肿瘤根除和长期修饰的T细胞移植物植入。分化的线性途径可能负责生成这些细胞：幼稚T细胞(TN) > TSCM > TCM > TEM > TE > TTE，由此TN是直接产生TSCM的亲代前体细胞，然后，其依次又直接产生TCM等。本公开内容的T细胞的组合物可以包含每个亲代T细胞子集中的一个或多个，其中TSCM细胞是最丰富的(例如，TSCM > TCM > TEM > TE > TTE)。
免疫细胞前体可以分化成或能够分化成早期记忆T细胞、干细胞如T细胞、幼稚T细胞(TN)、TSCM、TCM、TEM、TE或TTE。免疫细胞前体可以为本公开内容的原始HSC、HSC或HSC后代细胞。免疫细胞可以为早期记忆T细胞、干细胞如T细胞、幼稚T细胞(TN)、TSCM、TCM、TEM、TE或TTE。
本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达早期记忆T细胞的一种或多种细胞表面标记物。修饰的早期记忆T细胞群体包含多个修饰的干细胞样T细胞。修饰的早期记忆T细胞群体包含多个修饰的TSCM细胞。修饰的早期记忆T细胞群体包含多个修饰的TCM细胞。
本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达干细胞样T细胞的一种或多种细胞表面标记物。修饰的干细胞样T细胞群体包含多个修饰的TSCM细胞。修饰的干细胞样T细胞群体包含多个修饰的TCM细胞。
在一些方面，群体中至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达干性记忆T细胞(TSCM)或TSCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中一种或多种细胞表面标记物包含CD45RA和CD62L。细胞表面标记物可以包含CD62L、CD45RA、CD28、CCR7、CD127、CD45RO、CD95、CD95和IL-2Rβ中的一种或多种。细胞表面标记物可以包含CD45RA、CD95、IL-2Rβ、CCR7和CD62L中的一种或多种。
在一些方面，群体中至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的多个修饰的T细胞，表达中枢记忆T细胞(TCM)或TCM样细胞的一种或多种细胞表面标记物；并且其中一种或多种细胞表面标记物包含CD45RO和CD62L。细胞表面标记物可以包含CD45RO、CD95、IL-2Rβ、CCR7和CD62L中的一种或多种。
本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达幼稚T细胞(TN)的一种或多种细胞表面标记物。细胞表面标记物可以包含CD45RA、CCR7和CD62L中的一种或多种。
本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达效应T细胞(修饰的TEFF)的一种或多种细胞表面标记物。细胞表面标记物可以包含CD45RA、CD95和IL-2Rβ中的一种或多种。
本公开内容的方法可以修饰和/或产生修饰的T细胞群体，其中群体中至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或两者之间的任何百分比的多个修饰的T细胞，表达干细胞样T细胞、干性记忆T细胞(TSCM)或中枢记忆T细胞(TCM)的一种或多种细胞表面标记物。
群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约70%至约99%、约75%至约95%、或约85%至约95%的修饰的细胞群体，表达包含CD34的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+)。
群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约45%至约90%、约50%至约80%、或约65%至约75%的修饰的细胞群体，表达包含CD34的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+和CD38-)。
群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约0.2%至约40%、约0.2%至约30%、约0.2%至约2%、或0.5%至约1.5%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+、CD38-和CD90+)。
群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38和CD45RA的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约0.2%至约40%、约0.2%至约30%、约0.2%至约2%、或0.5%至约1.5%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38和CD45RA的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA)。
群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34、CD90和CD49f的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38和CD45RA的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约0.02%至约30%、约0.02%至约2%、约0.04%至约2%、或约0.04%至约1%的修饰的细胞群体，表达包含CD34、CD90和CD49f的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD38和CD45RA的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA和CD49f+)。
群体中多个修饰的细胞包含转基因或编码转基因(例如CAR)的序列，其中群体中至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，其中至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD45RA的一种或多种细胞表面标记物，或者其中至少约0.2%至约5%、约0.2%至约3%、或约0.4%至约3%的修饰的细胞群体，表达包含CD34和CD90的一种或多种细胞表面标记物，并且不表达包含CD45RA的一种或多种细胞表面标记物(例如，包含细胞表面标记物表型CD34+、CD90+和CD45RA-)。
产生和/或扩增免疫细胞或免疫前体细胞(例如，所公开的修饰的T细胞)的组合物和方法、以及用于维持或增强免疫细胞或免疫前体细胞(例如，所公开的修饰的T细胞)的细胞活力水平和/或干样表型的缓冲液，在本文其它地方公开，并且在美国专利号10,329,543和PCT公开号WO 2019/173636中更详细地公开。
本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为体细胞。本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为分化的细胞。本公开内容的细胞和修饰的细胞可以为自体细胞或同种异体细胞。对同种异体细胞进行改造，以预防在施用于受试者之后对移植物植入的不良反应。同种异体细胞可以为任何类型的细胞。同种异体细胞可以为干细胞或可以衍生自干细胞。同种异体细胞可以为分化的体细胞。
表达嵌合抗原受体的方法
本公开内容提供了在细胞的表面上表达CAR的方法。该方法包括(a)获得细胞群体；(b)在足以将CAR转移跨越细胞群体中的至少一种细胞的细胞膜的条件下，使细胞群体与包含CAR或编码CAR的序列的组合物接触，从而生成修饰的细胞群体；(c)在适合于整合编码CAR的序列的条件下，培养修饰的细胞群体；(d)从在细胞表面上表达CAR的修饰的细胞群体扩增和/或选择至少一种细胞。
在一些方面，细胞群体可以包含白细胞和/或CD4+和CD8+白细胞。细胞群体可以包含以优化比率的CD4+和CD8+白细胞。CD4+与CD8+白细胞的优化比率并不在体内天然发生。细胞群体可以包含肿瘤细胞。
在一些方面，足以将CAR或编码CAR的序列、转座子或载体转移跨越细胞群体中的至少一种细胞的细胞膜的条件，包括在特定电压下施加一种或多种电脉冲、缓冲液和一种或多种补充因子中的至少一种。在一些方面，适合于整合编码CAR的序列的条件包括缓冲液和一种或多种补充因子中的至少一种。
缓冲液可以包含PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲液或其任何组合。一种或多种补充因子可以包含(a)重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合；(b)盐、矿物质、代谢物或其任何组合；(c)细胞培养基；(d)细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、一种或多种细胞凋亡途径或其组合的抑制剂；以及(e)修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合可以包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1 α/IL-1F1、IL-1 β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异源二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32 β、IL-32 γ、IL-33、LAP (TGF-β 1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可以包含HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代物、抗生素、pH调节剂、Earle’s盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS Supplement、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露糖醇、琥珀酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5或其任何组合。细胞培养基可以包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、一种或多种细胞凋亡途径或其组合的抑制剂包含以下的抑制剂：TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNApol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A、糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)抑制剂(例如TWS119)或其任何组合。此类抑制剂的实例可以包含巴弗洛霉素、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包含pH调节剂、DNA结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、具有或不具有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。
扩增和选择步骤可以并发或序贯地发生。扩增可以在选择之前发生。扩增可以在选择之后发生，并且任选地，进一步(即第二)选择可以在扩增之后发生。并发扩增和选择可以是同时的。扩增和/或选择步骤可以进行10至14天的时期，包括端点在内。
扩增可以包含使修饰的细胞群体的至少一种细胞与抗原接触，以通过CAR刺激至少一种细胞，从而生成扩增的细胞群体。抗原可以在基底的表面上呈递。基底可以具有任何形式，包括但不限于表面、孔、珠或多个珠以及基质。基底可以进一步包含顺磁性或磁性组分。抗原可以在基底的表面上呈递，其中所述基底是磁珠，并且其中磁体可以用于从修饰且扩增的细胞群体中去除或分离磁珠。抗原可以在细胞或人工抗原呈递细胞的表面上呈递。人工抗原呈递细胞可以包括但不限于肿瘤细胞和干细胞。
在其中转座子或载体包含选择基因的一些方面，选择步骤包括使修饰的细胞群体中的至少一种细胞与选择基因对其赋予抗性的化合物接触，从而将表达选择基因的细胞鉴定为从选择中存活，并且将未能表达选择基因的细胞鉴定为未能从选择步骤中存活。
本公开内容提供了组合物，其包含本文所述的方法的修饰、扩增且选择的细胞群体。
用于在细胞的表面上表达CAR的方法的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816和PCT/US2019/049816中。
本公开内容提供了细胞或细胞群体，其中所述细胞构成组合物，所述组合物包含(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，以及(b)受体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源受体例如CAR的序列，其中在(a)的构建体和(b)的构建体整合到细胞的基因组序列内后，表达外源受体，并且其中外源受体在结合配体或抗原后转导细胞内信号，所述细胞内信号直接或间接靶向调控诱导型转基因(a)的表达的诱导型启动子，以修饰基因表达。
组合物可以通过降低基因表达来修饰基因表达。组合物可以通过瞬时修饰基因表达(例如，对于配体与外源受体结合的持续时间)来修饰基因表达。组合物可以剧烈地修饰基因表达(例如，配体与外源受体可逆地结合)。组合物可以长期修饰基因表达(例如，配体与外源受体不可逆地结合)。
外源受体可以包含相对于细胞的基因组序列的内源受体。示例性受体包括但不限于细胞内受体、细胞表面受体、跨膜受体、配体门控离子通道和G蛋白偶联受体。
外源受体可以包含非天然存在的受体。非天然存在的受体可以为合成、修饰、重组、突变型或嵌合受体。非天然存在的受体可以包含分离自或衍生自T细胞受体(TCR)的一种或多种序列。非天然存在的受体可以包含分离自或衍生自支架蛋白的一种或多种序列。在一些方面，包括其中非天然存在的受体不包含跨膜结构域的那些方面，非天然存在的受体与第二跨膜、膜结合和/或细胞内受体相互作用，所述第二跨膜、膜结合和/或细胞内受体在与非天然存在的受体接触之后，转导细胞内信号。非天然存在的受体可以包含跨膜结构域。非天然存在的受体可以与转导细胞内信号的细胞内受体相互作用。非天然存在的受体可以包含细胞内信号传导结构域。非天然存在的受体可以为嵌合配体受体(CLR)。CLR可以为嵌合抗原受体(CAR)。
编码诱导型启动子的序列包含编码NFĸB启动子的序列、编码干扰素(IFN)启动子的序列或编码白介素-2启动子的序列。在一些方面，IFN启动子是IFNγ启动子。诱导型启动子可以分离自或衍生自细胞因子或趋化因子的启动子。细胞因子或趋化因子可以包含IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、IL17A/F、IL21、IL22、IL23、转化生长因子β (TGFβ)、集落刺激因子2 (GM-CSF)、干扰素γ (IFNγ)、肿瘤坏死因子α (TNFα)、LTα、穿孔素、颗粒酶C(Gzmc)、颗粒酶B (Gzmb)、C-C基序趋化因子配体5 (CCL5)、C-C基序趋化因子配体4(Ccl4)、C-C基序趋化因子配体3 (Ccl3)、X-C基序趋化因子配体1 (Xcl1)或LIF白介素6家族细胞因子(Lif)。
诱导型启动子可以分离自或衍生自包含表面蛋白质的基因的启动子，所述表面蛋白质涉及细胞分化、活化、耗尽和功能。在一些方面，基因包含CD69、CD71、CTLA4、PD-1、TIGIT、LAG3、TIM-3、GITR、MHCII、COX-2、FASL或4-1BB。
诱导型启动子可以分离自或衍生自涉及CD代谢和分化的基因的启动子。诱导型启动子可以分离自或衍生自Nr4a1、Nr4a3、Tnfrsf9 (4-1BB)、Sema7a、Zfp36l2、Gadd45b、Dusp5、Dusp6和Neto2的启动子。
在一些方面，诱导型转基因构建体包含或驱动抑制性检查点信号下游的信号传导组分、转录因子、细胞因子或细胞因子受体、趋化因子或趋化因子受体、细胞死亡或细胞凋亡受体/配体、代谢传感分子、赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白质、以及癌基因或肿瘤抑制基因的表达。其非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636和PCT申请号PCT/US2019/049816中。
武装的细胞(Armored Cells)
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以增强其治疗潜力。可替代地或另外，修饰的细胞可以进一步进行修饰，以致使它们对免疫学和/或代谢检查点较不敏感。这种类型的修饰“武装”细胞，在修饰之后，所述细胞在此处可以被称为“武装的”细胞(例如，武装的T细胞)。可以通过例如在肿瘤免疫抑制微环境内，阻断和/或稀释天然递送至细胞的特异性检查点信号(例如检查点抑制)，来产生武装的细胞。
本公开内容的武装的细胞可以衍生自任何细胞，例如，T细胞、NK细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞(包括分离自或衍生自G-CSF动员的外周血的T细胞)、或脐带血(UCB)衍生的T细胞。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含以下中的一种或多种：嵌合配体受体(包含蛋白质支架、抗体、ScFv或抗体模拟物的CLR)/嵌合抗原受体(包含蛋白质支架、抗体、ScFv或抗体模拟物的CAR)、CARTyrin (包含Centyrin的CAR)和/或VCAR (包含骆驼科动物VHH或单结构域VH的CAR)。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含如本文公开的诱导型促凋亡多肽。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含外源序列。外源序列可以包含编码治疗性蛋白质的序列。示例性治疗性蛋白质可以为核、细胞质、细胞内、跨膜、细胞表面结合或分泌的蛋白质。由武装的细胞(例如，武装的T细胞)表达的示例性治疗性蛋白质，可以修饰武装的细胞的活性或可以修饰第二细胞的活性。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含选择基因或选择标记物。武装的细胞(例如，武装的T细胞)可以包含合成基因表达盒(在本文中也被称为诱导型转基因构建体)。
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码抑制性检查点信号的受体的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。抑制性检查点信号的受体在细胞表面上或在细胞的细胞质内表达。沉默或减少编码抑制性检查点信号的受体的基因的表达，导致在武装的细胞的表面上或在细胞质内抑制性检查点受体的蛋白质表达的丧失。因此，具有编码抑制性检查点受体的一种或多种基因的沉默或减少表达的武装的细胞对检查点信号是抗性的、不接受的或不敏感的。在这些抑制性检查点信号的存在下，武装的细胞对抑制性检查点信号的抗性或敏感性降低增强了武装的细胞的治疗潜力。抑制性检查点信号(和诱导免疫压制的蛋白质)的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。可以被沉默的抑制性检查点信号的优选实例包括但不限于PD-1和TGFβRII。
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码涉及检查点信号传导的细胞内蛋白质的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。可以通过靶向涉及检查点信号传导途径的任何细胞内信号传导蛋白，来增强修饰的细胞的活性，从而实现对一个或多个检查点途径的检查点抑制或干扰。涉及检查点信号传导的细胞内信号传导蛋白的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码阻碍疗法功效的转录因子的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。可以通过沉默或减少阻碍疗法功效的转录因子的表达(或阻遏功能)，来增强或调节修饰的细胞的活性。可以进行修饰以沉默或减少表达或阻遏其功能的转录因子的非限制性实例，包括但不限于PCT公开号WO 2019/173636中公开的示例性转录因子。
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码细胞死亡或细胞凋亡受体的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。死亡受体与其内源性配体的相互作用导致细胞凋亡的开始。细胞死亡和/或细胞凋亡受体和/或配体的表达、活性或相互作用的破坏致使修饰的细胞对死亡信号较不接受，因而，使得武装的细胞在肿瘤环境中更有效。细胞死亡和/或细胞凋亡受体和配体的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。可以进行修饰的细胞死亡受体的优选实例是Fas (CD95)。
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码代谢传感蛋白的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。通过修饰的细胞破坏免疫压制性肿瘤微环境(特征在于低水平的氧、pH、葡萄糖和其它分子)的代谢传感，导致T细胞功能的延长保留，并且因而，每个细胞杀死更多的肿瘤细胞。代谢传感基因和蛋白质的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。优选的实例，HIF1a和VHL在缺氧环境中发挥T细胞功能的作用。武装的T细胞可能具有编码HIF1a或VHL的一种或多种基因的沉默或减少表达。
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码蛋白质的一种或多种基因的表达，所述蛋白质赋予对癌症疗法包括单克隆抗体的敏感性，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。因此，在癌症疗法(例如，化学疗法、单克隆抗体疗法或另一种抗肿瘤治疗)的存在下，武装的细胞可以起作用，并且可以证实优良的功能或功效。涉及赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白质的非限制性实例公开于PCT公开号WO2019/173636中。
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以沉默或减少编码生长优势因子的一种或多种基因的表达，以产生武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)。沉默或减少癌基因的表达可以对于细胞赋予生长优势。例如，在CAR T细胞制造过程期间沉默或减少TET2基因的表达(例如，破坏表达)，导致当与缺乏这种扩增能力的非武装的CAR T细胞相比较时，具有扩增和随后根除肿瘤的显著能力的武装的CAR T细胞的生成。该策略可以与安全开关(例如，本文所述的iC9安全开关)偶联，所述安全开关允许在来自受试者的不良反应或武装的CAR T细胞不受控制的生长的情况下，武装的CAR T细胞的靶向破坏。生长优势因子的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以表达修饰/嵌合检查点受体，以产生本公开内容的武装的T细胞。
修饰/嵌合检查点受体可以包含无效受体、诱饵受体或显性失活受体。无效受体、诱饵受体或显性失活受体可以为修饰/嵌合受体/蛋白质。无效受体、诱饵受体或显性失活受体可以被截断，用于细胞内信号传导结构域的表达。可替代地或另外，无效受体、诱饵受体或显性失活受体可以在细胞内信号传导结构域内的一个或多个氨基酸位置处突变，所述氨基酸位置对于有效信号传导是决定性或必需的。无效受体、诱饵受体或显性失活受体的截断或突变，可以导致受体丧失向细胞或细胞内传递或转导检查点信号的能力。
例如，可以通过在武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)的表面上表达修饰的/嵌合的PD-1无效受体，来实现来自在肿瘤细胞的表面上表达的PD-Ll受体的免疫压制性检查点信号的稀释或阻断，所述无效受体与也在武装的细胞的表面上表达的内源性(未修饰的)PD-1受体有效地竞争，以减少或抑制免疫压制性检查点信号通过武装的细胞的内源性PD-1受体的转导。在该非限制性实例中，两种不同受体之间与肿瘤细胞上表达的PD-L1结合的竞争，减少或减弱了有效检查点信号传导的水平，从而增强了表达PD-1无效受体的武装的细胞的治疗潜力。
修饰/嵌合检查点受体可以包含无效受体、诱饵受体或显性失活受体，其为跨膜受体、膜相关或膜连接受体/蛋白质或细胞内受体/蛋白质。示例性无效、诱饵或显性失活的细胞内受体/蛋白质包括但不限于抑制性检查点信号下游的信号传导组分、转录因子、细胞因子或细胞因子受体、趋化因子或趋化因子受体、细胞死亡或细胞凋亡受体/配体、代谢传感分子、赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白质、以及癌基因或肿瘤抑制基因。细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和趋化因子受体的非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636中。
修饰/嵌合检查点受体可以包含开关受体(switch receptor)。示例性开关受体包含修饰/嵌合受体/蛋白质，其中天然或野生型细胞内信号传导结构域被不同的细胞内信号传导结构域转换或替换，所述不同的细胞内信号传导结构域或对蛋白质是非天然的和/或不是野生型结构域。例如，用刺激性信号传导结构域替换抑制性信号传导结构域将免疫压制信号转换为免疫刺激信号。可替代地，用不同的抑制性结构域替换抑制性信号传导结构域可以减少或增强抑制性信号传导的水平。经由与内源性野生型检查点受体(而不是开关受体)竞争结合免疫压制性肿瘤微环境内表达的同源检查点受体，开关受体的表达或过表达可以导致同源检查点信号的稀释和/或阻断。武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)可以包含编码开关受体的序列，导致一种或多种开关受体的表达，并且因而改变武装的细胞的活性。武装的细胞(例如，武装的CAR T细胞)可以表达开关受体，其靶向检查点受体下游的细胞内表达的蛋白质、转录因子、细胞因子受体、死亡受体、代谢传感分子、癌症疗法、癌基因和/或肿瘤抑制蛋白或基因。
示例性开关受体可以包含蛋白质或可以衍生自蛋白质，所述蛋白质包括但不限于抑制性检查点信号下游的信号传导组分、转录因子、细胞因子或细胞因子受体、趋化因子或趋化因子受体、细胞死亡或细胞凋亡受体/配体、代谢传感分子、赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白质、以及癌基因或肿瘤抑制基因。
本公开内容的修饰的细胞(例如，CAR T细胞)可以进一步进行修饰，以表达介导条件基因表达的CLR/CAR，以产生武装的T细胞。CLR/CAR与武装的T细胞的核中的条件基因表达***的组合构成合成基因表达***，其在同源配体与CLR或同源抗原与CAR结合时被条件激活。例如，该***可以通过减少或限制在配体或抗原结合的位点处、在肿瘤环境处或在肿瘤环境内的合成基因表达，来帮助‘武装’或增强修饰的T细胞的治疗潜力。
基因编辑组合物和方法
通过将转基因引入细胞内来产生修饰的细胞。引入步骤可以包含经由非转座递送***来递送核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体。
将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，可以包含局部递送、吸附、吸收、电穿孔、旋转感染(spin-fection)、共培养、转染、机械递送、声波递送、振动递送、磁转染或通过纳米颗粒介导的递送中的一种或多种。将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，可以包含脂质体转染、磷酸钙转染、fugene转染和树枝状聚合物介导的转染。通过机械转染将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，可以包含细胞挤压、细胞轰击或基因枪技术。通过纳米颗粒介导的转染将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，可以包含脂质体递送、通过胶束递送和通过聚合物囊泡(polymerosome)递送。
将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内可以包含非病毒载体。非病毒载体可以包含核酸。非病毒载体可以包含质粒DNA、线性双链DNA (dsDNA)、线性单链DNA (ssDNA)、DoggyBone™ DNA、纳米质粒、小环DNA、单链寡脱氧核苷酸(ssODN)、DDNA寡核苷酸、单链mRNA (ssRNA)和双链mRNA (dsRNA)。非病毒载体可以包含如本文所述的转座子。
将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内可以包含病毒载体。病毒载体可以为非整合的非染色体载体。非整合的非染色体载体的非限制性实例包括腺伴随病毒(AAV)、腺病毒和疱疹病毒。病毒载体可以为整合染色体载体。整合染色体载体的非限制性实例包括腺相关载体(AAV)、慢病毒和γ逆转录病毒。
将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内可以包含载体的组合。载体组合的非限制性实例包括病毒和非病毒载体、多个非病毒载体或多个病毒载体。载体组合的非限制性实例包括DNA衍生的载体和RNA衍生的载体的组合、RNA和逆转录酶的组合、转座子和转座酶的组合、非病毒载体和内切核酸酶的组合、以及病毒载体和内切核酸酶的组合。
基因组修饰可以包含将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，以稳定整合核酸序列、瞬时整合核酸序列、产生核酸序列的位点特异性整合、或产生核酸序列的偏向整合。核酸序列可以为转基因。
基因组修饰可以包含将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、在体内、在体外或原位引入细胞内，以稳定整合核酸序列。稳定的染色体整合可以为随机整合、位点特异性整合或偏向整合。位点特异性整合可以为非辅助的或辅助的。辅助位点特异性整合与定点核酸酶共递送。定点核酸酶包含具有5'和3'核苷酸序列延伸的转基因，其含有与基因组整合位点的上游和下游区域的同源性百分比。具有同源核苷酸延伸的转基因使得能够通过同源重组、微同源性介导的末端连接或非同源末端连接的基因组整合。位点特异性整合可以在安全港位点处发生。基因组安全港位点能够容纳新遗传材料的整合，其方式确保新近***的遗传元件可靠地起作用(例如，以治疗有效的表达水平表达)，并且不对宿主基因组造成对宿主生物体造成风险的有害改变。潜在基因组安全港的非限制性实例包括人白蛋白基因的内含子序列、腺伴随病毒位点1 (AAVS1)、AAV病毒在染色体19上的天然存在的整合位点、趋化因子(C-C基序))受体5 (CCR5)基因的位点和小鼠Rosa26基因座的人直向同源物的位点。
位点特异性转基因整合可以在破坏靶基因的表达的位点处发生。通过在内含子、外显子、启动子、遗传元件、增强子、抑制子、起始密码子、终止密码子和应答元件处的位点特异性整合，可以发生靶基因表达的破坏。通过位点特异性整合靶向的靶基因的非限制性实例包括TRAC、TRAB、PDI、任何免疫压制性基因和涉及同种异体排斥的基因。
位点特异性转基因整合可以在导致靶基因的表达增强的位点处发生。通过在内含子、外显子、启动子、遗传元件、增强子、抑制子、起始密码子、终止密码子和应答元件处的位点特异性整合，可以发生靶基因表达的增强。
酶可以用于在宿主基因组中产生链断裂，以促进转基因的递送或整合。酶可以产生单链断裂或双链断裂。断裂诱导酶的非限制性实例包括转座酶、整合酶、内切核酸酶、CRISPR-Cas9、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、Cas-CLOVER™和CPF1。断裂诱导酶可以以DNA编码、以mRNA编码、作为蛋白质或作为具有指导RNA (gRNA)的核蛋白复合物递送至细胞。
位点特异性转基因整合可以由载体介导的整合位点偏向进行控制。载体介导的整合位点偏向可以通过所选的慢病毒载体或所选的γ逆转录病毒载体进行控制。
位点特异性转基因整合位点可以为非稳定的染色体***。整合的转基因可以变得沉默、去除、切除或进一步修饰。基因组修饰可以为转基因的非稳定整合。非稳定整合可以为瞬时的非染色体整合、半稳定的非染色体整合、半持久的非染色体***或非稳定的染色体***。瞬时的非染色体***可以为染色体外的或细胞质的。在一个方面，转基因的瞬时的非染色体***并不整合到染色体内，并且修饰的遗传材料在细胞***期间不复制。
基因组修饰可以为转基因的半稳定或持久的非染色体整合。DNA载体编码支架/基质附着区(S-MAR)模块，其与核基质蛋白结合，用于非病毒载体的附加型保留，允许在***细胞的核中的自主复制。
基因组修饰可以为转基因的非稳定的染色体整合。整合的转基因可以变得沉默、去除、切除或进一步修饰。
通过转基因***对基因组的修饰可以经由以下发生：通过同源重组(HR)的宿主细胞指导的双链断裂修复(同源性介导的修复)、微同源性介导的末端连接(MMEJ)、非同源末端连接(NHEJ)、转座酶介导的修饰、整合酶介导的修饰、内切核酸酶介导的修饰或重组酶介导的修饰。通过转基因***对基因组的修饰可以经由CRISPR-Cas9、TALEN、ZFN、Cas-CLOVER™和cpf1而发生。
在涉及***新的或现有的核苷酸/核酸的基因编辑***中，除切割酶(例如，核酸酶、重组酶、整合酶或转座酶)之外，还必须将***工具(例如，DNA模板载体、可转座元件(转座子或逆转录转座子)递送到细胞。用于重组酶的此类***工具的实例可能包括DNA载体。其它基因编辑***需要整合酶连同***载体一起、转座酶连同转座子/逆转录转座子一起等的递送。可以用作切割酶的重组酶的实例是CRE重组酶。可以用于***工具中的整合酶的非限制性实例包括取自多种病毒(包括AAV、γ逆转录病毒和慢病毒)中的任一种的基于病毒的酶。可以用于***工具中的转座子/逆转录转座子的实例在本文中更详细地进行描述。
具有离体、在体内、在体外或原位基因组修饰的细胞可以为种系细胞或体细胞。修饰的细胞可以为人、非人、哺乳动物、大鼠、小鼠或犬细胞。修饰的细胞可以为分化的、未分化的或永生化的。修饰的未分化细胞可以为干细胞。修饰的未分化细胞可以为诱导多能干细胞。修饰的细胞可以为免疫细胞。修饰的细胞可以为T细胞、造血干细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、巨核细胞或破骨细胞。修饰的细胞可以在细胞休眠、处于激活状态、静止、处于间期、处于前期、处于中期、处于后期或处于末期时进行修饰。修饰的细胞可以为新鲜的、冷冻保存的、散装的、分选成亚群、来自全血、来自白细胞去除术或来自永生化的细胞系。用于从白细胞去除术产物或血液中分离细胞的详细描述公开于PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中。
本公开内容提供了基因编辑组合物和/或包含基因编辑组合物的细胞。基因编辑组合物可以包含编码DNA结合结构域的序列，以及编码核酸酶蛋白或其核酸酶结构域的序列。编码核酸酶蛋白的序列或编码其核酸酶结构域的序列可以包含DNA序列、RNA序列或其组合。核酸酶或其核酸酶结构域可以包含CRISPR/Cas蛋白、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和内切核酸酶中的一种或多种。
核酸酶或其核酸酶结构域可以包含核酸酶失活的Cas (dCas)蛋白和内切核酸酶。内切核酸酶可以包含Clo051核酸酶或其核酸酶结构域。基因编辑组合物可以包含融合蛋白。融合蛋白可以包含核酸酶失活的Cas9 (dCas9)蛋白和Clo051核酸酶或Clo051核酸酶结构域。基因编辑组合物可以进一步包含引导序列。引导序列包含RNA序列。
本公开内容提供了包含与效应物可操作连接的小Cas9 (Cas9)的组合物。本公开内容提供了融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子、基本上由其组成或由其组成，其中所述效应物包含小Cas9 (Cas9)。本公开内容的小Cas9构建体可以包括包含IIS型内切核酸酶的效应物。具有活性催化位点的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cas9包含SEQ ID NO: 79的氨基酸序列。
本公开内容提供了包含与效应物可操作地连接的失活的小Cas9 (dSaCas9)的组合物。本公开内容提供了融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子、基本上由其组成或由其组成，其中所述效应物包含小的失活的Cas9 (dSaCas9)。本公开内容的小的失活的Cas9(dSaCas9)构建体可以包括包含IIS型内切核酸酶的效应物。dSaCas9包含SEQ ID NO: 80的氨基酸序列，其包括D10A和N580A突变，以使催化位点失活。
本公开内容提供了包含与效应物可操作地连接的失活的Cas9 (dCas9)的组合物。本公开内容提供了融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子、基本上由其组成或由其组成，其中所述效应物包含失活的Cas9 (dCas9)。本公开内容的失活的Cas9 (dCas9)构建体可以包括包含IIS型内切核酸酶的效应物。
dCas9可以分离或衍生自化脓性链球菌(Streptoccocus pyogenes)。dCas9可以包含在氨基酸位置10和840处具有取代的dCas9，所述取代使催化位点失活。在一些方面，这些取代是D10A和H840A。dCas9可以包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82的氨基酸序列。
示例性Clo051核酸酶结构域包含SEQ ID NO: 83的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
示例性dCas9-Clo051 (Cas-CLOVER)融合蛋白可以包含SEQ ID NO: 84的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。示例性dCas9-Clo051融合蛋白可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 85的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。编码dCas9-Clo051融合蛋白的核酸可以为DNA或RNA。
示例性dCas9-Clo051 (Cas-CLOVER)融合蛋白可以包含SEQ ID NO: 86的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。示例性dCas9-Clo051融合蛋白可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 87的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。编码dCas9-Clo051融合蛋白的核酸可以为DNA或RNA。
包含基因编辑组合物的细胞可以稳定或瞬时表达基因编辑组合物。优选地，基因编辑组合物是瞬时表达的。引导RNA可以包含与基因组DNA序列内的靶序列互补的序列。基因组DNA序列内的靶序列可以为基因组DNA序列的安全港位点内的靶序列。
基因编辑组合物，包括Cas-CLOVER，以及使用这些组合物用于基因编辑的方法在美国专利公开号2017/0107541、2017/0114149、2018/0187185和美国专利号10,415,024中详细描述。
还可以使用一种或多种基于聚(组氨酸)的胶束，将基因编辑工具递送至细胞。聚(组氨酸) (例如，聚(L组氨酸))是pH敏感性聚合物，由于咪唑环在不饱和的氮上提供孤电子对。即，聚(组氨酸)通过质子化-去质子化具有两性性质。特别地，在某些pH下，含聚(组氨酸)的三嵌段共聚物可以组装成在表面上具有带正电荷的聚(组氨酸)单元的胶束，从而使得能够与带负电荷的基因编辑分子复合。使用这些纳米颗粒以pH依赖性方式结合且释放蛋白质和/或核酸，可以提供有效和选择性的机制来执行所需的遗传修饰。特别地，这种基于胶束的递送***提供了关于荷电材料的大量灵活性、以及大的有效载荷容量和纳米颗粒有效载荷的靶向释放。在一个实例中，通过使用基于聚(组氨酸)的胶束来递送核酸酶，使得能够位点特异性切割双链DNA。不希望受特定理论的束缚，认为在由各种三嵌段共聚物形成的胶束中，疏水性嵌段聚集以形成核，在端部上留下亲水性嵌段和聚(组氨酸)嵌段，以形成一个或多个包围层。
在一个方面，本公开内容提供了由亲水性嵌段、疏水性嵌段和荷电嵌段制成的三嵌段共聚物。在一些方面，亲水性嵌段可以为聚(环氧乙烷) (PEO)，并且荷电嵌段可以为聚(L组氨酸)。可以使用的示例三嵌段共聚物是PEO-b-PLA-b-PHIS，其中在每个嵌段中可变数目的重复单元因设计而变。
可以用作用于制备三嵌段共聚物的中间体的二嵌段共聚物可以具有与以下偶联的亲水性生物相容性聚(环氧乙烷) (PEO) (其在化学上与PEG同义)：各种疏水性脂肪族聚(酸酐)、聚(核酸)、聚(酯)、聚(原酸酯)、聚(肽)、聚(磷腈)和聚(糖)，包括但不限于聚(丙交酯) (PLA)、聚(乙交酯) (PLGA)、聚(乳酸共乙醇酸) (PLGA)、聚(ε-己内酯) (PCL)和聚(三亚甲基碳酸酯) (PTMC)。由100%聚乙二醇化表面构成的聚合物胶束具有改善的体外化学稳定性、加强的体内生物利用度和延长的血液循环半衰期。
聚合囊泡、聚合物囊泡和基于聚(组氨酸)的胶束，包括包含三嵌段共聚物的那些，及其制备方法，在美国专利号7,217,427；7,868,512；6,835,394；8,808,748；10,456,452；美国公开号2014/0363496；2017/0000743；和2019/0255191；以及PCT公开号WO 2019/126589中进一步详细描述。
转座子和载体组合物
本公开内容提供了用于将抗体(例如scFv)或CAR (例如，包含scFv)递送到细胞或细胞群体的组合物和方法。用于将本公开内容的组合物递送到细胞或细胞群体的组合物的非限制性实例包括转座子或载体。因此，本公开内容提供了包含抗体(例如scFv)或CAR (例如，包含scFv)的转座子、或者包含抗体(例如scFv)或CAR (例如，包含scFv)的载体。
包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含编码诱导型促凋亡多肽的序列。可替代地或另外，一个转座子或一个载体可以包含本公开内容的CAR，而第二转座子或第二载体可以包含编码本公开内容的诱导型促凋亡多肽的序列。诱导型促凋亡多肽在本文中更详细地进行描述。
包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含编码嵌合刺激受体(CSR)的序列。可替代地或另外，一个转座子或一个载体可以包含本公开内容的CAR，而第二转座子或第二载体可以包含编码本公开内容的CSR的序列。嵌合刺激受体在本文中更详细地进行描述。
包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含编码重组HLA-E多肽的序列。可替代地或另外，一个转座子或一个载体可以包含本公开内容的CAR，而第二转座子或第二载体可以包含编码重组HLA-E多肽的序列。重组HLA-E多肽在本文中更详细地进行描述。
包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含选择基因。选择基因可以编码对于细胞活力和存活所必需的基因产物。当受到选择性细胞培养条件的挑战时，选择基因可以编码对于细胞活力和存活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可以包含对细胞活力或存活有害的化合物，并且其中基因产物赋予对化合物的抗性。选择基因的非限制性实例包括neo (赋予对新霉素的抗性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对氨甲蝶呤的抗性)、TYMS (编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药抗性基因(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51旁系同源物C)、GCS (编码葡萄糖神经酰胺合酶)、NKX2.2 (编码NK2同源框2)或其任何组合。
在一个优选的方面，选择基因编码DHFR突变蛋白酶。DHFR突变蛋白酶包含SEQ IDNO: 88的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。DHFR突变蛋白酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 89的核酸序列、基本由其组成或由其组成。DHFR突变蛋白酶的氨基酸序列可以进一步包含在位置80、113或153中的一个或多个位置处的突变。DHFR突变蛋白酶的氨基酸序列可以包含以下中的一个或多个：在位置80处的苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)取代、在位置113处的亮氨酸(L)或缬氨酸(V)取代、以及在位置153处的缬氨酸(V)或天冬氨酸(D)取代。
包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含至少一种自切割肽。例如，自切割肽可以位于CAR (例如，包含scFv)和诱导型促凋亡多肽之间；或者，自切割肽可以位于CAR (例如，包含scFv)以及由选择基因编码的蛋白质之间。
包含本公开内容的CAR的转座子或包含本公开内容的CAR的载体可以进一步包含至少两种自切割肽。例如，第一自切割肽位于CAR的上游或紧上游，而第二自切割肽位于CAR的下游或紧下游；或者，第一自切割肽和第二自切割肽侧接CAR。例如，第一自切割肽位于诱导型促凋亡多肽的上游或紧上游，而第二自切割肽位于诱导型促凋亡多肽的下游或紧下游；或者，第一自切割肽和第二自切割肽侧接诱导型促凋亡多肽。例如，第一自切割肽位于由选择基因编码的蛋白质的上游或紧上游，而第二自切割肽位于由选择基因编码的蛋白质的下游或紧下游；或者，第一自切割肽和第二自切割肽侧接由选择基因编码的蛋白质。
自切割肽的非限制性实例包括T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽或GSG-P2A肽。T2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 90至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-T2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 91至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-T2A多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 92至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。E2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 93至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-E2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 94至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。F2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 95至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-F2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 96至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。P2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 97至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。GSG-P2A肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO: 98至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。
转座***
本公开内容提供了包含如本文公开的蛋白质支架的转座子，或者本公开内容提供了包含如本文公开的抗体(例如scFv)或CAR (例如，包含scFv)的转座子。在一个优选的方面，转座子是质粒DNA转座子，其包含如本文公开的编码scFv或CAR (例如，包含scFv)的核苷酸序列，侧翼为两个顺式调控绝缘子元件。本公开内容还提供了包含转座子的组合物。在一个优选的方面，包含转座子的组合物进一步包括包含编码转座酶的核苷酸序列的质粒。编码转座酶的核苷酸序列可以为DNA序列或RNA序列。优选地，编码转座酶的序列是mRNA序列。
本公开内容的转座子可以为piggyBac™ (PB)转座子。在一些方面，当转座子是PB转座子时，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶、piggyBac样(PBL)转座酶或Super piggyBac™ (SPB)转座酶。编码SPB转座酶的序列是mRNA序列。
PB转座子以及PB、PBL和SPB转座酶的非限制性实例在以下中详细描述：美国专利号6,218,182；美国专利号6,962,810；美国专利号8,399,643和PCT公开号WO 2010/099296。
PB、PBL和SPB转座酶识别在转座子的端部上的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且在染色***点(TTAT靶序列)内的序列5’-TTAT-3’处或在染色***点(TTAA靶序列)内的序列5’-TTAA-3’处在ITR之间***内容物。PB或PBL转座子的靶序列可以包含以下或由以下组成：5’-CTAA-3’、5’-TTAG-3’、5’-ATAA-3’、5’-TCAA-3’、5’AGTT-3’、5’-ATTA-3’、5’-GTTA-3’、5’-TTGA-3’、5’-TTTA-3’、5’-TTAC-3’、5’-ACTA-3’、5’-AGGG-3’、5’-CTAG-3’、5’-TGAA-3’、5’-AGGT-3’、5’-ATCA-3’、5’-CTCC-3’、5’-TAAA-3’、5’-TCTC-3’、5’TGAA-3’、5’-AAAT-3’、5’-AATC-3’、5’-ACAA-3’、5’-ACAT-3’、5’-ACTC-3’、5’-AGTG-3’、5’-ATAG-3’、5’-CAAA-3’、5’-CACA-3’、5’-CATA-3’、5’-CCAG-3’、5’-CCCA-3’、5’-CGTA-3’、5’-GTCC-3’、5’-TAAG-3’、5’-TCTA-3’、5’-TGAG-3’、5’-TGTT-3’、5’-TTCA-3’5’-TTCT-3’和5’-TTTT-3’。PB或PBL转座子***对于可以包括在ITR之间的目的基因没有有效载荷限制。
一种或多种PB、PBL和SPB转座酶的示例性氨基酸序列公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810和美国专利号8,399,643中。在一个优选的方面，PB转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 99至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。
PB或PBL转座酶可以包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 99的序列的位置30、165、282或538中的2个或更多个、3个或更多个或者每一个处的氨基酸取代。转座酶可以为SPB转座酶，其包含SEQ ID NO: 99的序列的氨基酸序列或由其组成，其中在位置30处的氨基酸取代可以为缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)，在位置165处的氨基酸取代可以为丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，在位置282处的氨基酸取代可以为缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M))，并且在位置538处的氨基酸取代可以为赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。在一个优选的方面，SPB转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 100至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。
在其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的某些方面，PB、PBL和SPB转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO: 99或SEQ ID NO: 100的序列的位置3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591中的一个或多个位置处的氨基酸取代，在PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中更详细地进行描述。
如PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中更详细地描述的，PB、PBL或SPB转座酶可以分离自或衍生自昆虫、脊椎动物、甲壳类动物或尾索动物。在优选的方面，PB、PBL或SPB转座酶分离自或衍生自昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni) (GenBank登录号AAA87375)或家蚕(Bombyx mori) (GenBank登录号BAD11135)。
高活性PB或PBL转座酶是比它衍生自其的天然存在的变体更具活性的转座酶。在一个优选的方面，高活性PB或PBL转座酶分离自或衍生自家蚕或热带爪蟾(Xenopus tropicalis)。高活性PB或PBL转座酶的实例公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810、美国专利号8,399,643和WO 2019/173636中。高活性氨基酸取代的列表公开于美国专利号10,041,077中。
在一些方面，PB或PBL转座酶是整合缺陷型的。整合缺陷型PB或PBL转座酶是这样的转座酶，其可以切除其相应的转座子，但以低于相应的野生型转座酶的频率整合切除的转座子。整合缺陷型PB或PBL转座酶的实例公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810、美国专利号8,399,643和WO 2019/173636中。整合缺陷型氨基酸取代的列表公开于美国专利号10,041,077中。
在一些方面，PB或PBL转座酶与核定位信号融合。与核定位信号融合的PB或PBL转座酶的实例公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810、美国专利号8,399,643和WO 2019/173636中。
本公开内容的转座子可以为睡美人(Sleeping Beauty)转座子。在一些方面，当转座子是睡美人转座子时，转座酶是睡美人转座酶(例如，如美国专利号9,228,180中公开的)或高活性睡美人(SB100X)转座酶。在一个优选的方面，睡美人转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 101至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一个优选的方面，高活性睡美人(SB100X)转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 102至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。
本公开内容的转座子可以为Helraiser转座子。示例性的Helraiser转座子包括Helibat1，其包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 103至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一些方面，当转座子是Helraiser转座子时，转座酶是Helitron转座酶(例如，如WO 2019/173636中公开的)。在一个优选的方面，Helitron转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 104至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。
本公开内容的转座子可以为Tol2转座子。示例性Tol2转座子，包括反向重复、亚末端序列和Tol2转座酶，包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 105至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一些方面，当转座子是Tol2转座子时，转座酶是Tol2转座酶(例如，如WO 2019/173636中公开的)。在一个优选的方面，Tol2转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 106至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。
本公开内容的转座子可以为TcBuster转座子。在一些方面，当转座子是TcBuster转座子时，转座酶是TcBuster转座酶或高活性TcBuster转座酶(例如，如WO 2019/173636中公开的)。TcBuster转座酶可以包含天然存在的氨基酸序列或非天然存在的氨基酸序列，或者由其组成。在一个优选的方面，TcBuster转座酶包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 107至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。编码TcBuster转座酶的多核苷酸可以包含天然存在的核酸序列或非天然存在的核酸序列，或者由其组成。在一个优选的方面，TcBuster转座酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO:108至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。
在一些方面，当与如PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中更详细地描述的野生型TcBuster转座酶相比时，突变型TcBuster转座酶包含一个或多个序列变异。
转座子可以为纳米转座子。纳米转座子可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)编码转座子***物的序列，其包含编码第一反向末端重复(ITR)的序列、编码第二反向末端重复(ITR)的序列和ITR内序列；(b)编码骨架的序列，其中所述编码骨架的序列包含具有1至450个核苷酸(包括端点在内)的编码复制起点的序列、以及具有1至200个核苷酸(包括端点在内)的编码可选择标记物的序列，和(c) ITR间序列。在一些方面，(c)的ITR间序列包含(b)的序列。在一些方面，(a)的ITR内序列包含(b)的序列。
编码骨架的序列可以包含1至600个核苷酸，包括端点在内。在一些方面，编码骨架的序列由以下组成：1至50个核苷酸、50至100个核苷酸、100至150个核苷酸、150至200个核苷酸、200至250个核苷酸、250至300个核苷酸、300至350个核苷酸、350至400个核苷酸、400至450个核苷酸、450至500个核苷酸、500至550个核苷酸、550至600个核苷酸，每个范围都包括端点在内。
ITR间序列可以包含1至1000个核苷酸，包括端点在内。在一些方面，ITR间序列由以下组成：1至50个核苷酸、50至100个核苷酸、100至150个核苷酸、150至200个核苷酸、200至250个核苷酸、250至300个核苷酸、300至350个核苷酸、350至400个核苷酸、400至450个核苷酸、450至500个核苷酸、500至550个核苷酸、550至600个核苷酸、600至650个核苷酸、650至700个核苷酸、700至750个核苷酸、750至800个核苷酸、800至850个核苷酸、850至900个核苷酸、900至950个核苷酸、或950至1000个核苷酸，每个范围都包括端点在内。
纳米转座子可以为短纳米转座子(SNT)，其中所述ITR间序列包含1至200个核苷酸，包括端点在内。ITR间序列可以由以下组成：1至10个核苷酸、10至20个核苷酸、20至30个核苷酸、30至40个核苷酸、40至50个核苷酸、50至60个核苷酸、60至70个核苷酸、70至80个核苷酸、80至90个核苷酸、或90至100个核苷酸，每个范围都包括端点在内。
具有1至200个核苷酸(包括端点在内)的可选择标记物可以包含编码蔗糖可选择标记物的序列。编码蔗糖可选择标记物的序列可以包含编码RNA-OUT序列的序列。编码RNA-OUT序列可以包含137个碱基对(bp)或由137个碱基对(bp)组成。具有1至200个核苷酸(包括端点在内)的可选择标记物可以包含编码荧光标记物的序列。具有1至200个核苷酸(包括端点在内)的可选择标记物可以包含编码细胞表面标记物的序列。
具有1至450个核苷酸(包括端点在内)的编码复制起点的序列可以包含编码微型复制起点的序列。在一些方面，具有1至450个核苷酸(包括端点在内)的编码复制起点的序列包含编码R6K复制起点的序列。R6K复制起点可以包含R6K γ复制起点。R6K复制起点可以包含R6K微型复制起点。R6K复制起点可以包含R6K γ微型复制起点。R6K γ微型复制起点可以包含281个碱基对(bp)或由281个碱基对(bp)组成。
在纳米转座子的一些方面，编码骨架的序列不包含重组位点、切除位点、连接位点或其组合。在一些方面，纳米转座子和编码骨架的序列两者均不包含重组位点、切除位点、连接位点或其组合的产物。在一些方面，纳米转座子和编码骨架的序列两者均并非衍生自重组位点、切除位点、连接位点或其组合。
在纳米转座子的一些方面，重组位点包含起因于重组事件的序列。在一些方面，重组位点包含其为重组事件的产物的序列。在一些方面，重组事件包含重组酶(例如，重组酶位点)的活性。
在纳米转座子的一些方面，编码骨架的序列不进一步包含编码外来DNA的序列。
在纳米转座子的一些方面，ITR间序列不包含重组位点、切除位点、连接位点或其组合。在一些方面，ITR间序列不包含重组事件、切除事件、连接事件或其组合的产物。在一些方面，ITR间序列并非衍生自重组事件、切除事件、连接事件或其组合。在一些方面，ITR间序列包含编码外来DNA的序列。在一些方面，ITR内序列包含编码绝缘子的至少一个序列、以及编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列。哺乳动物细胞可以为人细胞。在一些方面，ITR内序列包含编码绝缘子的第一序列、编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列、以及编码绝缘子的第二序列。在一些方面，ITR内序列包含编码绝缘子的第一序列、编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列、聚腺苷(聚A)序列和编码绝缘子的第二序列。在一些方面，ITR内序列包含编码绝缘子的第一序列、编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列、至少一个外源序列、聚腺苷(聚A)序列和编码绝缘子的第二序列。
纳米转座子在PCT/US2019/067758中更详细地进行描述。
载体***
本公开内容的载体可以为病毒载体或重组载体。病毒载体可以包含分离自或衍生自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒或其任何组合的序列。病毒载体可以包含分离自或衍生自腺伴随病毒(AAV)的序列。病毒载体可以包含重组AAV (rAAV)。示例性的腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包含紧靠编码本公开内容的scFv或CAR的序列顺式定位的、两个或更多个反向末端重复(ITR)序列。示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包括但不限于所有血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9)。示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包括但不限于自互补的AAV (scAAV)和AAV杂合体，其含有一种血清型的基因组和另一种血清型的衣壳(例如，AAV2/5、AAV-DJ和AAV-DJ8)。示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包括但不限于rAAV-LK03。
本公开内容的载体可以为纳米颗粒。纳米颗粒载体的非限制性实例包括核酸(例如，RNA、DNA、合成核苷酸、修饰的核苷酸或其任何组合)、氨基酸(L-氨基酸、D-氨基酸、合成氨基酸、修饰的氨基酸或其任何组合)、聚合物(例如，聚合物囊泡(polymersome))、胶束、脂质(例如，脂质体)、有机分子(例如，碳原子、片层、纤维、管)、无机分子(例如，磷酸钙或金)或其任何组合。纳米颗粒载体可以被动或主动转运跨越细胞膜。
本文公开的细胞递送组合物(例如，转座子、载体)可以包含编码治疗性蛋白质或治疗剂的核酸。治疗性蛋白质的实例包括在PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中公开的那些治疗性蛋白质。
诱导型促凋亡多肽
本文公开的诱导型促凋亡多肽优于现有的诱导型多肽，因为本公开内容的诱导型促凋亡多肽的免疫原性低得多。诱导型促凋亡多肽是重组多肽，且因此是非天然存在的。进一步地，序列经重组以产生诱导型促凋亡多肽，其不包含宿主人免疫***可以识别为“非自身的”非人序列，并且因而在受试者中诱导免疫应答，所述受试者接受诱导型促凋亡多肽、包含诱导型促凋亡多肽的细胞、或者包含诱导型促凋亡多肽或含有诱导型促凋亡多肽的细胞的组合物。
本公开内容提供了包含配体结合区、接头和促凋亡肽的诱导型促凋亡多肽，其中所述诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。在某些方面，非人序列包含限制位点。在某些方面，配体结合区可以为多聚体配体结合区。在某些方面，促凋亡肽是半胱天冬酶多肽。半胱天冬酶多肽的非限制性实例包括半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12和半胱天冬酶14。优选地，半胱天冬酶多肽是半胱天冬酶9多肽。半胱天冬酶9多肽可以为截短的半胱天冬酶9多肽。诱导型促凋亡多肽可以为非天然存在的。当半胱天冬酶是半胱天冬酶9或截短的半胱天冬酶9时，诱导型促凋亡多肽也可以被称为“iC9安全开关”。
诱导型半胱天冬酶多肽可以包含(a)配体结合区、(b)接头和(c)半胱天冬酶多肽，其中所述诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。在某些方面，诱导型半胱天冬酶多肽包含(a)配体结合区、(b)接头和(c)截短的半胱天冬酶9多肽，其中所述诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。
配体结合区可以包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可以包含在序列的位置36处的修饰。修饰可以为在位置36 (F36V)处的缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)。FKBP12多肽可以包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 109至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。FKBP12多肽可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQID NO: 110至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。
接头区可以包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 111至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同，或者接头区可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 112至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。在一些方面，编码接头的核酸序列不包含限制位点。
截短的半胱天冬酶9多肽可以包含在序列的位置87处不包含精氨酸(R)的氨基酸序列。可替代地或另外，截短的半胱天冬酶9多肽可以包含在序列的位置282处不包含丙氨酸(A)的氨基酸序列。截短的半胱天冬酶9多肽可以包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 113至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同，或者截短的半胱天冬酶9多肽可以由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQID NO: 114至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同。
在某些方面，当多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽时，诱导型促凋亡多肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:115至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或两者之间的任何百分比)等同，或者诱导型促凋亡多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含核酸序列或由核酸序列组成，所述核酸序列与SEQ ID NO: 116至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或两者之间的任何百分比)等同。
诱导型促凋亡多肽可以在本领域已知的任何启动子的转录调控下在细胞中表达，所述启动子能够启动和/或调控诱导型促凋亡多肽在该细胞中的表达。
诱导型促凋亡多肽的活化可以通过例如由诱导剂介导的化学诱导的二聚化(CID)来完成，以产生条件控制的蛋白质或多肽。由于不稳定二聚化试剂的降解或单体竞争性抑制剂的施用，促凋亡多肽不仅是诱导型，而且这些多肽的诱导也是可逆的。
在某些方面，当配体结合区包含在位置36处具有缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)(F36V)的FKBP12多肽时，诱导剂可以包含AP1903，一种合成药物(CAS索引名称：2-哌啶羧酸、1-[(2S)-1-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基]-、1,2-乙二基双[亚氨基(2-氧代-2,1-乙二基)氧基-3,1-亚苯基[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯、[2S-[1 (R*),2R*[S*[S*[1 (R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS登记号：195514-63-7；分子式：C78H98N4O20；分子量：1411.65))；AP20187 (CAS登记号：195514-80-8和分子式：C82H107N5O20)或AP20187类似物，例如AP1510。如本文使用的，诱导剂AP20187、AP1903和AP1510可以互换使用。
诱导型促凋亡肽和诱导这些肽的方法在美国专利公开号WO 2019/0225667和PCT公开号WO2018/068022中详细描述。
制剂、剂量和施用模式
本公开内容提供了用于施用本文所述的组合物的制剂、剂量和方法。
所公开的组合物和药物组合物可以进一步包含任何合适的辅助剂中的至少一种，所述辅助剂例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等等。药学上可接受的辅助剂是优选的。此类无菌溶液的非限制性实例和制备方法是本领域众所周知的，例如但不限于Gennaro，编辑，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co. (Easton，Pa.) 1990，以及“Physician's Desk Reference”，第52版，Medical Economics (Montvale，N.J.) 1998。如本领域众所周知的或如本文所述的，可以常规选择药学上可接受的载体，其适合于蛋白质支架、片段或变体组合物的施用模式、溶解性和/或稳定性。
适合于使用的药物赋形剂和添加剂的非限制性实例包括蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合存在，单独或组合构成按重量或体积计的1-99.99%。蛋白质赋形剂的非限制性实例包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等等。也可以在缓冲能力方面起作用的代表性的氨基酸/蛋白质组分，包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适合于使用的碳水化合物赋形剂的非限制性实例包括单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等等。优选地，碳水化合物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖和/或棉子糖。
组合物还可以包括缓冲液或pH调节剂；通常，缓冲液是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲液包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐；Tris、盐酸氨丁三醇或磷酸盐缓冲液。优选的缓冲液是有机酸盐，例如柠檬酸盐。
另外，所公开的组合物可以包括聚合赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗聚糖(聚合糖)、葡萄糖结合剂(dextrate) (例如环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，例如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
许多已知和开发的模式可以用于施用治疗有效量的本文公开的组合物或药物组合物。施用模式的非限制性实例包括推注、经颊、输注、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、病灶内、肌内、心肌内、鼻内、眼内、骨内(intraosseous)、骨内(intraosteal)、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、瘤内、静脉内、膀胱内、经口、肠胃外、直肠、舌下、皮下、经皮或***手段。
本公开内容的组合物可以制备用于特别是以液体溶液或悬浮液的形式的肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任何其它施用；用于特别是以半固体形式例如但不限于乳膏和栓剂的***或直肠施用；用于例如但不限于以片剂或胶囊的形式的经颊或舌下施用；或鼻内施用，例如但不限于粉末、滴鼻剂或气溶胶或某些药剂的形式；或经皮施用，例如但不限于凝胶、软膏、洗剂、悬浮液或贴剂递送***，其具有化学增强剂例如二甲基亚砜，以或修饰皮肤结构或增加经皮贴剂中的药物浓度(Junginger等人，于“Drug PermeationEnhancement；” Hsieh，D. S.，编辑，第59-90页(Marcel Dekker，Inc. New York 1994)，或具有氧化剂，其使得能够将含有蛋白质和肽的制剂施加到皮肤上(WO 98/53847)，或施加电场以产生瞬时转运途径，例如电穿孔，或增加荷电药物通过皮肤的流动性，例如离子电渗疗法，或施加超声波，例如超声导入(美国专利号4,309,989和4,767,402) (上述公开和专利整体引入本文作为参考)。
对于肠胃外施用，本文公开的任何组合物可以配制为与药学上可接受的肠胃外媒介物结合或分开提供的溶液、悬浮液、乳状液、颗粒、粉末或冻干粉末。用于肠胃外施用的制剂可以含有作为常见赋形剂的无菌水或盐水、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、植物起源的油、氢化萘等等。用于注射的水性或油性悬浮液可以根据已知方法，通过使用适当的乳化剂或增湿剂和助悬剂来制备。用于注射的药剂可以为无毒、非经口施用的稀释剂，例如在溶剂中的水溶液、无菌可注射溶液或悬浮液。作为可用的媒介物或溶剂，水、林格氏溶液、等渗盐水等是允许的；作为普通溶剂或助悬溶剂，可以使用无菌不挥发性油。为了这些目的，可以使用任何种类的不挥发性油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的甘油单酯或甘油二酯或甘油三酯。肠胃外施用是本领域已知的，并且包括但不限于常规注射手段，如美国专利号5,851,198中所述的气压无针注射装置、以及如美国专利号5,839,446中所述的激光穿孔装置。
用于经口施用的制剂依赖佐剂(例如，间苯二酚和非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)的共施用，以人为地增加肠壁的渗透性，以及酶促抑制剂(例如，胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DFF)和抑肽酶(trasylol))的共施用，以抑制酶促降解。在美国专利号6,309,663中描述了用于递送亲水性药剂包括蛋白质和蛋白质支架以及至少两种表面活性剂的组合的制剂，所述制剂预期用于经口、经颊、粘膜、鼻、肺、***、跨膜或直肠施用。用于经口施用的固体型剂型的活性组成成分化合物可以与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸、几丁质、脱乙酰壳多糖、果胶、黄蓍树胶、***树胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂型还可以含有其它类型的添加剂，例如惰性稀释剂、润滑剂(例如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯)、防腐剂(例如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚)、抗氧化剂(例如半胱氨酸)、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂、加香剂等。
片剂和丸剂可以进一步加工成肠包衣制剂。用于经口施用的液体制剂包括可允许医学用途的乳状液、糖浆剂、酏剂、悬浮液和溶液制剂。这些制剂可以含有通常用于所述领域中的惰性稀释剂，例如水。脂质体也已被描述为用于胰岛素和肝素的药物递送***(美国专利号4,239,754)。最近，混合氨基酸(类蛋白)的人工聚合物的微球已用于递送药物(美国专利号4,925,673)。此外，美国专利号5,879,681和美国专利号5,871,753中描述且用于经口递送生物活性剂的载体化合物是本领域已知的。
对于肺施用，优选地，本文所述的组合物或药物组合物以有效到达肺的下气道或鼻窦的粒径递送。组合物或药物组合物可以通过本领域已知的各种吸入或鼻装置中的任一种进行递送，所述装置用于通过吸入的治疗剂施用。能够将气溶胶化制剂沉积在患者的窦腔或肺泡中的这些装置包括计量吸入器、雾化器(例如喷射雾化器、超声雾化器)、干粉发生器、喷雾器等等。所有此类装置都可以使用适合于施用的制剂，用于将本文所述的组合物或药物组合物以气溶胶分配。这种气溶胶可以由溶液(水性和非水性)或固体颗粒组成。另外，可以通过在压力下迫使至少一种蛋白质支架的悬浮液或溶液通过喷嘴，来生产包括本文所述的组合物或药物组合物的喷雾剂。在计量吸入器(MDI)中，推进剂、本文所述的组合物或药物组合物、以及任何赋形剂或其它添加剂作为包括液化压缩气体的混合物包含在罐中。计量阀的致动将混合物作为气溶胶释放，所述气溶胶优选含有在小于约10 μm、优选约1 μm至约5 μm、并且最优选约2 μm至约3 μm的尺寸范围中的颗粒。肺施用、制剂和有关装置的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。
对于通过粘膜表面的吸收，组合物包括包含多个亚微米颗粒、粘膜粘附大分子、生物活性肽和水性连续相的乳状液，其通过实现乳状液颗粒的粘膜粘附来促进通过粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适合于施加本公开内容的乳状液的粘液表面可以包括角膜、结膜、颊、舌下、鼻、***、肺、胃、肠和直肠施用途径。用于***或直肠施用的制剂，例如栓剂，可以含有作为赋形剂的例如聚亚烷基二醇、凡士林、可可脂等等。用于鼻内施用的制剂可以为固体，并且含有作为赋形剂的例如乳糖，或者可以为滴鼻剂的水性或油性溶液。对于经颊施用，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等等(美国专利号5,849,695)。粘膜施用和制剂的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。
对于经皮施用，本文公开的组合物或药物组合物被封装在递送装置中，所述递送装置例如脂质体或聚合物纳米颗粒、微粒、微胶囊或微球体(除非另有说明，否则统称为微粒)。许多合适的装置是已知的，包括由合成聚合物和天然聚合物制成的微粒，所述合成聚合物例如聚羟基酸，例如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物，聚原酸酯、聚酐和聚磷腈，所述天然聚合物例如胶原、聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白质、海藻酸盐和其它多糖及其组合(美国专利号5,814,599)。经皮施用、制剂和合适装置的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。
可以期望在延长的时间段内，例如从单次施用开始一周到一年的时期，将所公开的化合物递送至受试者。可以利用各种缓慢释放、贮库或植入剂型。例如，剂型可以含有在体液中具有低溶解度的化合物的药学上可接受的无毒盐，例如，(a)与多元酸的酸加成盐，所述多元酸例如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、鞣酸、扑酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘单磺酸或萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等等；(b)与多价金属阳离子的盐，所述多价金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等等，或与有机阳离子的盐，所述有机阳离子由例如N,N'-二苄基乙二胺或乙二胺形成；或(c) (a)和(b)的组合，例如鞣酸锌盐。另外，所公开的化合物或优选地相对不溶性的盐，例如刚刚描述的那些盐，可以在适合于注射的凝胶中进行配制，所述凝胶例如具有例如芝麻油的单硬脂酸铝凝胶。特别优选的盐是锌盐、鞣酸锌盐、双羟萘酸盐等等。另一种类型的用于注射的缓慢释放贮库制剂，将含有分散用于封装在缓慢降解、无毒、无抗原性聚合物中的化合物或盐，所述聚合物例如如美国专利号3,773,919中描述的聚乳酸/聚乙醇酸聚合物。化合物或优选相对不溶性的盐，例如上文描述的那些盐，也可以在胆固醇基质硅橡胶丸剂中进行配制，特别是用于动物中。另外的缓慢释放、贮库或植入制剂，例如气体或液体脂质体，是文献中已知的(美国专利号5,770,222和“Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems”，J. R. Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)。
合适的剂量是本领域众所周知的。参见例如，Wells等人，编辑，PharmacotherapyHandbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，Conn. (2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，豪华版，Tarascon Publishing，Loma Linda，Calif. (2000)；Nursing 2001 Handbook of Drugs，第21版，Springhouse Corp.，Springhouse，Pa.，2001；Health Professional's Drug Guide 2001，编辑，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，N.J。优选剂量可以任选地包括约0.1-99和/或100-500 mg/kg/施用，或者其任何范围、值或分数，或者达到约0.1-5000 μg/ml血清浓度/单次施用或多重施用的血清浓度，或者其任何范围、值或分数。关于本文公开的组合物或药物组合物的优选剂量范围是约1 mg/kg，直到约3、约6或约12 mg/kg受试者的体重。
可替代地，施用的剂量可以取决于已知因素而变，所述因素例如特定药剂的药效学特性、以及其施用模式和途径；接受者的年龄、健康和重量；症状的性质和程度、并发治疗的种类、治疗频率和所需效应。通常，活性成分的剂量可以为约0.1至100毫克/千克体重。通常，0.1至50，且优选0.1至10毫克/千克/施用或以持续释放形式有效获得所需结果。
作为非限制性实例，人或动物的治疗可以使用单一、输注或重复剂量，在第1-40天中的至少一天，或者可替代地或另外，在第1-52周中的至少一周，或者可替代地或另外，在1-20年中的至少一年，或其任何组合，作为约0.1至100 mg/kg或者其任何范围、值或分数/天的本文公开的组合物或药物组合物的一次性或周期性剂量提供。
适合于内部施用的剂型一般含有约0.001毫克至约500毫克的活性成分/单位或容器。在这些药物组合物中，基于组合物的总重量，活性成分通常以按重量计约0.5-99.999%的量存在。
有效量可以包含约0.001至约500 mg/kg/单次(例如，推注)、多重或连续施用的量，以达到0.01-5000 μg/ml血清浓度/单次、多重或连续施用的血清浓度，或者其中的任何有效范围或值，如使用已知方法来完成且确定的，如本文所述或有关领域已知的。
在其中待施用于有需要的受试者的组合物是如本文公开的修饰的细胞的方面，可以施用约1x103至1x1015个细胞；约1x104至1x1012个细胞；约1x105至1x1010个细胞；约1x106至1x109个细胞；约1x106至1x108个细胞；约1x106至1x107个细胞；或约1x106至25x106个细胞的细胞。在一个方面，施用约5x106至25x106个细胞的细胞。
所公开的组合物和药物组合物的药学上可接受的赋形剂、制剂、剂量和施用方法的更详细描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。
使用本公开内容的组合物的方法
本公开内容提供了所公开的组合物或药物组合物用于治疗细胞、组织、器官、动物或受试者中的疾病或病症的用途，如本领域已知的或如本文所述的，使用所公开的组合物和药物组合物，例如用治疗有效量的组合物或药物组合物施用或接触细胞、组织、器官、动物或受试者。在一个方面，受试者是哺乳动物。优选地，受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
本公开内容提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或受试者中的至少一种恶性疾病或病症的方法。优选地，恶性疾病是癌症。恶性疾病或病症的非限制性实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性淋巴细胞性白血病、B细胞、T细胞或FAB ALL、急性髓样白血病(AML)、急性粒细胞性白血病、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增生症、副肿瘤综合征/恶性肿瘤的高钙血症、实体瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、头癌、颈癌、遗传性非息肉病性癌、何杰金氏淋巴瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、肾细胞癌、睾丸癌、腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌症有关的骨吸收、癌症有关的骨痛等等。
在优选的方面，恶性疾病或病症的治疗包括过继细胞疗法。例如，在一个方面，本公开内容提供了表达至少一种公开的抗体(例如scFv)和/或包含抗体(例如scFv)的CAR的修饰的细胞，其已进行选择和/或扩增用于施用于有需要的受试者。修饰的细胞可以配制用于在任何温度包括室温和体温下贮存。修饰的细胞可以配制用于冷冻贮存和随后的解冻。修饰的细胞可以在药学上可接受的载体中进行配制，用于从无菌包装中直接施用于受试者。修饰的细胞可以在具有细胞活力和/或CAR表达水平的指示剂的药学上可接受的载体中进行配制，以确保细胞功能和CAR表达的最低水平。修饰的细胞可以用一种或多种试剂以规定的密度在药学上可接受的载体中进行配制，以抑制进一步扩增和/或预防细胞死亡。
任何可以包括将有效量的本文公开的任何组合物或药物组合物施用于需要此类调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或受试者。此类方法可以任选地进一步包括用于治疗此类疾病或病症的共施用或组合疗法，其中本文公开的任何组合物或药物组合物的施用进一步包括之前、同时和/或之后施用至少一种化学治疗剂(例如，烷化剂、有丝***抑制剂、放射性药物)。
在一些方面，受试者在施用之后并未发展移植物抗宿主(GvH)和/或宿主抗移植物(HvG)。在一个方面，施用是全身的。全身施用可以为本领域已知并在本文中详细描述的任何手段。优选地，全身施用是通过静脉内注射或静脉内输注。在一个方面，施用是局部的。局部施用可以为本领域已知并在本文中详细描述的任何手段。优选地，局部施用是通过瘤内注射或输注、脊柱内注射或输注、脑室内注射或输注、眼内注射或输注、或者骨内注射或输注。
在一些方面，治疗有效剂量是单次剂量。在一些方面，单次剂量是同时制造的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或两者之间的任何数目的剂量之一。在一些方面，当组合物是自体细胞或同种异体细胞时，剂量是足以使细胞植入和/或持续足够的时间以治疗疾病或病症的量。
在一个实例中，本公开内容提供了治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括向受试者施用组合物，所述组合物包括抗体(例如scFv)或包含抗体(例如scFv)的CAR，所述抗体或CAR与肿瘤细胞上的抗原特异性结合。在其中组合物包含修饰的细胞或细胞群体的方面，细胞或细胞群体可以为自体的或同种异体的。
在本文描述的治疗方法的一些方面，可以修改或终止治疗。具体而言，在其中用于治疗的组合物包含诱导型促凋亡多肽的方面，可以通过使细胞与诱导剂接触，在细胞中选择性地诱导细胞凋亡。可以响应例如恢复的征兆或疾病严重性/进展降低的征兆、疾病缓解/停止的征兆、和/或不良事件的发生来修改或终止治疗。在一些方面，该方法包括施用诱导剂的抑制剂以抑制细胞疗法的修改的步骤，从而恢复细胞疗法的功能和/或功效(例如，当疾病的征兆或症状再次出现、或者严重性增加和/或不良事件得到解决时)。
抗体/scFv生产、筛选和纯化
本公开内容的至少一种抗体(例如，单克隆抗体、嵌合抗体、单结构域抗体、VHH、VH、单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)或Fab片段)，可以任选地由细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体产生，如本领域众所周知的。参见例如，Ausubel等人，编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，N.Y.(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor，N.Y. (1989)；Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，N.Y. (1989)；Colligan等人，编辑，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY (1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols inProtein Science，John Wiley & Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)。
可以改变、添加和/或缺失来自scFv的氨基酸，以减少免疫原性，或者减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、稳定性、溶解性或任何其它合适的特性，如本领域已知的。
任选地，scFv可以进行改造，伴随对于抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质的保留。为了实现这一目标，可以通过使用亲本序列和改造序列的三维模型，分析亲本序列和各种概念性改造产物的过程，来任选地制备支架蛋白质。三维模型是普遍可用的并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可获得的，其示出且展示所选候选序列的可能的三维构象结构，并且可以测量可能的免疫原性(例如，Monrovia，Calif.的Xencor，Inc.的Immunofilter程序)。这些展示的检查允许分析残基在候选序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选scFv结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从亲本序列和参考序列中选择且组合残基，使得实现所需的特性，例如对于靶抗原的亲和力。可替代地或除上述程序之外，可以使用其它合适的改造方法。
可以使用核苷酸(DNA或RNA展示)或肽展示文库，例如在体外展示中，方便地实现与相似蛋白质或片段特异性结合的scFv的筛选。该方法涉及对于具有所需功能或结构的各个成员筛选大型肽集合。展示的核苷酸或肽序列的长度可以为3至5000个或更多个核苷酸或氨基酸，频繁为5-100个氨基酸长，且经常为约8至25个氨基酸长。除用于生成肽文库的直接化学合成方法之外，还已描述了几种重组DNA方法。一种类型涉及在细菌噬菌体或细胞的表面上的肽序列展示。每种细菌噬菌体或细胞含有编码特定展示肽序列的核苷酸序列。此类方法在PCT专利公开号WO 91/17271、WO 91/18980、WO 91/19818和WO 93/08278中进行描述。
用于生成肽文库的其它***具有体外化学合成和重组方法两者的方面。参见PCT专利公开号WO 92/05258、WO 92/14843和WO 96/19256。还参见美国专利号5,658,754；和5,643,768。肽展示文库、载体和筛选试剂盒从此类供应商如Invitrogen (Carlsbad、Calif.)和Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire、UK)商购可得。参见例如，转让给Enzon的美国专利号4,704,692、4,939,666、4,946,778、5,260,203、5,455,030、5,518,889、5,534,621、5,656,730、5,763,733、5,767,260、5856456；转让给Dyax的5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,837,500；转让给Affymax的5,427,908、5,580,717；转让给CambridgeAntibody Technologies的5,885,793；转让给Genentech的5,750,373；转让给Xoma、Colligan，同上；Ausubel，同上；或Sambrook，同上的5,618,920、5,595,898、5,576,195、5,698,435、5,693,493、5,698,417。
本公开内容的scFv可以以宽范围的亲和力(KD)结合人或其它哺乳动物蛋白质。在一个优选的方面，本公开内容的至少一种scFv可以任选地以高亲和力结合靶蛋白，例如，其KD等于或小于约10−7 M，例如但不限于，0.1-9.9 (或其中的任何范围或值) X 10−8、10−9、10−10、10−11、10−12、10−13、10−14、10−15或者其中的任何范围或值，如通过表面等离振子共振或Kinexa方法确定的，如通过本领域技术人员实践的。
可以使用任何合适的方法在实验上确定scFv对于抗原的亲和力或亲合力。(参见例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions,” In FundamentalImmunology，Paul，W. E.，编辑，Raven Press: New York，N.Y. (1984)；Kuby，JanisImmunology，W.H. Freeman and Company: New York，N.Y. (1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，则所测量的特定scFv-抗原相互作用的亲和力可以不同。因此，亲和力和其它抗原结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量优选用蛋白质支架和抗原的标准化溶液，以及标准化缓冲液例如本文所述的缓冲液来进行。
可以用本公开内容的scFv执行竞争性测定法，以便确定哪些蛋白质、抗体和其它拮抗剂与本公开内容的scFv竞争结合靶蛋白和/或共享表位区域。如本领域普通技术人员容易知道的这些测定法，评估了拮抗剂或配体之间对于蛋白质上有限数目的结合位点的竞争。蛋白质和/或抗体在竞争之前或之后是固定或不溶解的，并且例如通过倾析(其中蛋白质/抗体是预先不溶解的)、或通过离心(其中蛋白质/抗体在竞争反应后是沉淀的)，将与靶蛋白结合的样品与未结合的样品分开。另外，竞争性结合可以通过以下进行确定：功能是通过scFv与靶蛋白的结合还是结合的缺乏而改变，例如，scFv分子是抑制还是加强例如标记的酶促活性。可以使用ELISA和其它功能测定性，如本领域众所周知的。
核酸分子
本公开内容的编码scFv的核酸分子可以为RNA的形式，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其它形式，或者是DNA的形式，包括但不限于通过克隆获得或合成产生的cDNA和基因组DNA，或其任何组合。DNA可以为三链、双链或单链的，或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以为编码链，也称为有义链，或者它可以为非编码链，也被称为反义链。
本公开内容的分离的核酸分子可以包括包含开放读码框(ORF)的核酸分子，任选地，具有一个或多个内含子，例如但不限于，至少一种scFv的至少一个指定部分；包含与靶蛋白结合的蛋白质支架或环区的编码序列的核酸分子；以及包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与上文所述的那些基本上不同，但由于遗传密码的简并性，仍编码如本文所述和/或如本领域已知的蛋白质支架。当然，遗传密码是本领域众所周知的。因此，对于本领域技术人员，生成编码本公开内容的特定scFv的此类简并核酸变体将是常规的。参见例如，Ausubel等人，同上，并且此类核酸变体包括在本公开内容中。
如本文指示的，包含编码scFv的核酸的本公开内容的核酸分子，可以包括但不限于编码scFv片段的氨基酸序列本身的那些核酸分子；整个蛋白质支架或其一部分的编码序列；scFv、片段或一部分的编码序列，以及另外的序列，例如至少一种信号前导区或融合肽的编码序列，伴随或不伴随上述另外的编码序列，例如至少一个内含子，连同另外的非编码序列，包括但不限于非编码5'和3'序列，例如在转录、mRNA加工包括剪接和多聚腺苷酸化信号(例如，核糖体结合和mRNA的稳定性)中起作用的转录的非翻译序列；编码另外的氨基酸例如提供另外功能性的那些氨基酸的另外的编码序列。因此，可以将编码蛋白质支架的序列与标记物序列例如编码肽的序列融合，所述肽促进包含蛋白质支架片段或一部分的融合蛋白质支架的纯化。
与如本文所述的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸
本公开内容提供了在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，多核苷酸可以用于分离、检测和/或定量包含此类多核苷酸的核酸。例如，本公开内容的多核苷酸可以用于鉴定、分离或扩增保藏文库中的部分或全长克隆。多核苷酸可以为从人或哺乳动物核酸文库中分离的基因组或cDNA序列，或者以其它方式与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA互补的基因组或cDNA序列。
优选地，cDNA文库包含至少80%的全长序列，优选地，至少85%或90%的全长序列，并且更优选地，至少95%的全长序列。cDNA文库可以进行标准化，以增加稀有序列的表示。通常但非排他地对于相对于互补序列具有减少的序列同一性的序列采用低或中等严格性杂交条件。可以任选地对于具有更高同一性的序列采用中等和高严格性条件。低严格性条件允许具有约70%序列同一性的序列的选择性杂交，并且可以用于鉴定直向同源或旁系同源序列。
任选地，多核苷酸将编码由本文所述的多核苷酸编码的蛋白质支架的至少一部分。多核苷酸包括可以用于与编码本公开内容的蛋白质支架的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见例如，Ausubel，同上；Colligan，同上，各自整体引入本文作为参考。
核酸的构建
本公开内容的分离的核酸可以使用(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术和/或(d)其组合进行制备，如本领域众所周知的。
核酸可以方便地包含除本公开内容的多核苷酸之外的核苷酸序列。例如，可以将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点***核酸内，以帮助多核苷酸的分离。另外，可以***可翻译序列，以帮助本公开内容的翻译的多核苷酸的分离。例如，六组氨酸标记物序列提供了方便的手段来纯化本公开内容的蛋白质。本公开内容的核酸，排除编码序列，任选地是用于克隆和/或表达本公开内容的多核苷酸的载体、衔接子或接头。
可以将另外的序列加入这种克隆和/或表达序列中，以优化其在克隆和/或表达中的功能，以帮助多核苷酸的分离，或改善多核苷酸引入细胞内。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域众所周知的。(参见例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
用于构建核酸的重组方法
本公开内容的分离的核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合，可以使用本领域技术人员已知的任何数目的克隆方法从生物来源中获得。在一些方面，在严格条件下，与本公开内容的多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。RNA的分离以及cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员众所周知的。(参见例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
核酸筛选和分离方法
可以使用基于本公开内容的多核苷酸序列的探针来筛选cDNA或基因组文库。探针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域技术人员将了解，可以在测定法中采用各种严格性程度的杂交；并且杂交或洗涤介质都可以为严格的。随着用于杂交的条件变得更严格，探针和靶之间必须存在更大程度的互补性用于双链体形成发生。严格性程度可以通过温度、离子强度、pH和部分变性溶剂如甲酰胺的存在中的一种或多种进行控制。例如，通过例如在0%至50%的范围内操纵甲酰胺浓度来改变反应物溶液的极性，方便地改变杂交的严格性。可检测结合所需的互补性(序列同一性)程度将依照杂交介质和/或洗涤介质的严格性而变。互补性程度最佳为100%，或70-100%，或者其中的任何范围或值。然而，应当理解，探针和引物中的微小序列变化可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格性进行补偿。
RNA或DNA的扩增方法是本领域众所周知的，并且可以基于本文呈现的教导和指导，无需过度实验，根据本公开内容而使用。
已知的DNA或RNA扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)和有关的扩增过程(参见例如，给予Mullis等人的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；给予Tabor等人的4,795,699和4,921,794；给予Innis的5,142,033；给予Wilson等人的5,122,464；给予Innis 的5,091,310；给予Gyllensten等人的5,066,584；给予Gellensten等人的4,889,818；给予Silver等人的4,994,370，给予Biswas的4,766,067；给予Ringold的4,656,134)，以及RNA介导的扩增，其使用针对靶序列的反义RNA作为用于双链DNA合成的模板(给予Malek等人的美国专利号5,130,238，具有商品名NASBA)，所述参考文献的全部内容引入本文作为参考。(参见例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上。)
例如，聚合酶链反应(PCR)技术可以用于直接从基因组DNA或cDNA文库中扩增本公开内容的多核苷酸和有关基因的序列。PCR和其它体外扩增方法也可以是有用的，例如，以克隆编码待表达的蛋白质的核酸序列，制备核酸以用作探针用于检测样品中所需mRNA的存在、用于核酸测序或用于其它目的。足以指导技术人员完成体外扩增方法的技术实例在以下中找到：Berger，同上，Sambrook，同上和Ausubel，同上，以及Mullis等人，美国专利号4,683,202 (1987)；以及Innis等人，PCR Protocols A Guide to Methods andApplications，编辑，Academic Press Inc.，San Diego，Calif. (1990)。用于基因组PCR扩增的商购可得的试剂盒是本领域已知的。参见例如，Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)。另外，例如，T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可以用于改善长PCR产物的产率。
用于构建核酸的合成方法
本公开内容的分离的核酸也可以通过经由已知方法的直接化学合成来制备(参见例如，Ausubel等人，同上)。化学合成一般产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交，或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶的聚合，转换成双链DNA。本领域技术人员将认识到，虽然DNA的化学合成可以限于约100个或更多个碱基的序列，但可以通过较短序列的连接来获得较长序列。
重组表达盒
本公开内容进一步提供了包含本公开内容的核酸的重组表达盒。本公开内容的核酸序列，例如编码本公开内容的蛋白质支架的cDNA或基因组序列，可以用于构建可以引入至少一种所需宿主细胞内的重组表达盒。重组表达盒通常包含与转录起始调控序列可操作地连接的本公开内容的多核苷酸，所述转录起始调控序列将指导多核苷酸在预期的宿主细胞中的转录。异源和非异源(即内源)启动子两者均可以用于指导本公开内容的核酸的表达。
在一些方面，充当启动子、增强子或其它元件的分离的核酸可以被引入本公开内容的多核苷酸的非异源形式的适当位置中(上游、下游或内含子中)，以便上调或下调本公开内容的多核苷酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或取代在体内或体外加以改变。
表达载体和宿主细胞
本公开内容还涉及包括本公开内容的分离的核酸分子的载体、用重组载体遗传改造的宿主细胞、以及通过重组技术生产至少一种蛋白质支架，如本领域众所周知的。参见例如，Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上，各自整体引入本文作为参考。
可以任选地将多核苷酸连接到含有可选择标记物的载体，用于在宿主中繁殖。一般地，质粒载体在沉淀物例如磷酸钙沉淀物、或具有荷电脂质的复合物中引入。如果载体是病毒，则它可以使用适当的包装细胞系在体外进行包装，然后转导到宿主细胞内。
DNA***物应该与适当的启动子可操作地连接。表达构建体将进一步含有用于转录起始、终止的位点，以及在转录区域中，用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选包括在开始处的翻译起始、以及在待翻译的mRNA的端部处适当地放置的终止密码子(例如UAA、UGA或UAG)，其中UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细胞表达。
表达载体将优选地但任选地包括至少一种可选择标记物。此类标记物包括例如但不限于用于真核细胞培养的氨苄青霉素、zeocin (Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基因)、G418/遗传霉素(neo基因)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对氨甲蝶呤的抗性)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)、杀稻瘟菌素(bsd基因)抗性基因，以及用于在大肠杆菌(E. coli)和其它细菌或原核生物中培养的氨苄青霉素、zeocin (Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基因)、G418/遗传霉素(neo基因)、卡那霉素、壮观霉素、链霉素、羧苄青霉素、博莱霉素、红霉素、多粘菌素B或四环素抗性基因(上述专利在此整体引入作为参考)。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对于技术人员将是显而易见的。将载体构建体引入宿主细胞内可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法来实现。此类方法在本领域中进行描述，例如Sambrook，同上，第1-4和16-18章；Ausubel，同上，第1、9、13、15、16章。
表达载体将优选地但任选地包括至少一种可选择的细胞表面标记物，用于分离通过本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的细胞表面标记物包含将细胞或细胞子集与另一个限定的细胞子集区分开的表面蛋白质、糖蛋白或蛋白质组。优选地，可选择的细胞表面标记物将通过本公开内容的组合物或方法修饰的那些细胞与未通过本公开内容的组合物或方法修饰的那些细胞区分开。此类细胞表面标记物包括例如但不限于“指定簇”或“分类决定簇”蛋白(经常缩写为“CD”)，例如截短或全长形式的CD19、CD271、CD34、CD22、CD20、CD33、CD52或其任何组合。细胞表面标记物进一步包括***基因标记物RQR8 (Philip B等人Blood. 2014 Aug 21；124(8):1277-87)。
表达载体将优选地但任选地包括至少一种可选择的药物抗性标记物，用于分离通过本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的药物抗性标记物可以包含野生型或突变型Neo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2或其任何组合。
本公开内容的至少一种蛋白质支架可以以修饰的形式例如融合蛋白进行表达，并且不仅可以包括分泌信号，而且还可以包括另外的异源功能区域。例如，另外的氨基酸特别是荷电氨基酸的区域，可以加入蛋白质支架的N末端，以改善在宿主细胞中、在纯化过程中或在随后的处理和贮存过程中的稳定性和持久性。另外，可以将肽部分加入本公开内容的蛋白质支架中，以促进纯化。可以在蛋白质支架或其至少一个片段的最终制备之前去除此类区域。此类方法在许多标准实验室手册中进行描述，所述实验室手册例如Sambrook，同上，第17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，同上，第16、17和18章。
本领域普通技术人员知道可用于表达编码本公开内容的蛋白质的核酸的众多表达***。可替代地，本公开内容的核酸可以通过在宿主细胞中开启(通过操纵)而在宿主细胞中表达，所述宿主细胞含有编码本公开内容的蛋白质支架的内源性DNA。此类方法是本领域众所周知的，例如，如整体引入本文作为参考的美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述的。
可用于产生蛋白质支架、其指定部分或变体的细胞培养物的示例是如本领域已知的细菌、酵母和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞***经常是单层细胞的形式，尽管也可以使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域已开发了能够表达完整的糖基化蛋白的许多合适的宿主细胞系，并且包括COS-1 (例如ATCC CRL 1650)、COS-7 (例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21 (例如ATCC CRL-10)、CHO (例如ATCC CRL 1610)和BSC-1 (例如ATCC CRL-26)细胞系，Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等等，其可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Va. (www.atcc.org)容易获得。优选的宿主细胞包括淋巴样起源的细胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登录号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登录号CRL-1851)。在一个优选的方面，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
用于这些细胞的表达载体可以包括下述表达控制序列中的一种或多种，例如但不限于复制起点；启动子(例如，晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利号5,168,062；5,385,839)、HSV tk启动子、pgk (磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1 α启动子(美国专利号5,266,491)、至少一种人启动子；增强子和/或加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点(例如，SV40大T Ag 多聚A添加位点)和转录终止子序列。参见例如，Ausubel等人，同上；Sambrook等人，同上。可用于生产本公开内容的核酸或蛋白质的其它细胞是已知的，和/或例如可得自美国典型培养物保藏中心的细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或者其它已知或商业来源。
当采用真核宿主细胞时，通常将多聚腺苷酸花或转录终止子序列引入载体内。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列。还可以包括用于转录物的准确剪接的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，J. Virol. 45:773-781 (1983))。另外，如本领域已知的，可以将控制宿主细胞中的复制的基因序列引入载体内。
scFv纯化
可以通过众所周知的方法，从重组细胞培养物中回收且纯化scFv，所述方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。高效液相层析(“HPLC”)也可以用于纯化。参见例如，Colligan，Current Protocols in Immunology，或CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)，例如，第1、4、6、8、9、10章，各自整体引入本文作为参考。
本公开内容的scFv包括纯化的产物、化学合成程序的产物和通过重组技术从原核或真核宿主产生的产物，所述宿主包括例如大肠杆菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产程序中采用的宿主，本公开内容的蛋白质支架可以为糖基化的或可以为非糖基化的。此类方法在许多标准实验室手册中进行描述，所述实验室手册例如Sambrook，同上，节段17.37-17.42；Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章，Colligan，Protein Science，同上，第12-14章，全部整体引入本文作为参考。
氨基酸密码
构成本公开内容的蛋白质支架的氨基酸经常是缩写的。氨基酸命名可以通过经由其单字母代码、其三字母代码、名称或三核苷酸密码子指定氨基酸得到指示，如本领域众所周知的(参见Alberts，B.等人，Molecular Biology of The Cell，第三版，GarlandPublishing，Inc.，New York，1994)。本公开内容的蛋白质支架可以包括来自自发或突变和/或人为操纵的一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，如本文指定的。可以通过本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如，Ausubel，同上，第8、15章；Cunningham和Wells，Science 244:1081-1085 (1989))，来鉴定本公开内容的蛋白质支架中对于功能必需的氨基酸。后一程序在分子中的每一个残基处引入单个丙氨酸突变。然后测试所得到的突变型分子的生物活性，例如但不限于至少一种中和活性。对于蛋白质支架结合关键的位点也可以通过结构分析进行鉴定，所述结构分析例如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith等人，J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)和de Vos等人，Science 255:306-312(1992))。
如本领域技术人员将了解的，本公开内容包括本公开内容的至少一种生物活性蛋白质支架。生物活性蛋白质支架具有的比活性是天然(非合成)、内源性或有关和已知的蛋白质支架的比活性的至少20%、30%或40%，且优选至少50%、60%或70%，且最优选至少80%、90%或95%-99%或更多。测定且定量酶促活性和底物特异性的方法是本领域技术人员众所周知的。
在另一个方面，本公开内容涉及如本文所述的蛋白质支架和片段，其通过有机部分的共价附着进行修饰。此类修饰可以产生具有改善的药代动力学性质(例如，增加的体内血清半衰期)的蛋白质支架片段。有机部分可以为线性或支链的亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定方面，亲水聚合物基团可以具有约800至约120,000道尔顿的分子量，并且可以为聚烷烃二醇(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且脂肪酸或脂肪酸酯基团可以包含约八至约四十个碳原子。
本公开内容的修饰的蛋白质支架和片段可以包含一个或多个有机部分，其直接或间接地与抗体共价键合。与本公开内容的蛋白质支架或片段键合的每个有机部分可以独立地是亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文使用的，术语“脂肪酸”涵盖一元羧酸和二元羧酸。如该术语在本文中使用的，“亲水聚合物基团”指在水中比在辛烷中更可溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更可溶。因此，通过聚赖氨酸的共价附着修饰的蛋白质支架由本公开内容涵盖。适合于修饰本公开内容的蛋白质支架的亲水聚合物可以为线性或支链的，并且包括例如聚烷烃二醇(例如，PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等等)、碳水化合物(例如，葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等等)、亲水性氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等等)、聚烷烃氧化物(例如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本公开内容的蛋白质支架的亲水聚合物作为分开的分子实体具有约800至约150,000道尔顿的分子量。例如，可以使用PEG5000和PEG20,000，其中下标是以道尔顿计的聚合物的平均分子量。亲水聚合物基团可以由1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。由脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物可以通过采用合适的方法进行制备。例如，包含胺基团的聚合物可以偶联到脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸酯，并且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧酸酯(例如，用N,N-羰基二咪唑激活)可以偶联到聚合物上的羟基。
适合于修饰本公开内容的蛋白质支架的脂肪酸和脂肪酸酯可以为饱和的，或者可以包含一个或多个不饱和单元。适合于修饰本公开内容的蛋白质支架的脂肪酸包括例如正十二酸(C12，月桂酸)、正十四酸(C14，肉豆蔻酸)、正十八酸(C18，硬脂酸)、正二十酸(C20，花生酸)、正二十二酸(C22，山萮酸)、正三十酸(C30)、正四十酸(C40)、顺式-Δ9-十八酸(C18，油酸)、所有顺式Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等等。合适的脂肪酸酯包括包含直链或支链低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可以包含1至约12个，优选1至约6个碳原子。
可以使用合适的方法，例如通过与一种或多种改性剂反应，来制备修饰的蛋白质支架和片段。如该术语在本文中使用的，“改性剂”指包含活化基团的合适的有机基团(例如，亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是化学部分或官能团，其可以在适当条件下与第二化学基团反应，从而在改性剂和第二化学基团之间形成共价键。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等等。可以与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等等。醛官能团可以与含胺或酰肼的分子偶联，并且叠氮基团可以与三价磷基团反应，以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺(phosphorimide)键合。将活化基团引入分子内的合适方法是本领域已知的(参见例如，Hermanson，G. T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press: San Diego，Calif.(1996))。活化基团可以直接与有机基团(例如，亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)键合，或通过接头部分键合，所述接头部分例如其中一个或多个碳原子可以替换为杂原子例如氧、氮或硫的二价C1-C12基团。合适的接头部分包括例如四甘醇、—(CH2)3—、—NH—(CH2)6—NH—、—(CH2)2—NH—和—CH2—O—CH2—CH2—O—CH2—CH2—O—CH—NH—。包含接头部分的改性剂可以例如通过以下产生：在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的存在下，使单-Boc-烷基二胺(例如，单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，以在游离胺和脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键。Boc保护基团可以通过用三氟乙酸(TFA)处理从产物中去除，以暴露可以偶联到另一种羧酸酯的伯胺，如所述的，或者可以与马来酸酐反应，并且使所得到的产物环化，以产生脂肪酸的活化的马来酰亚胺衍生物。(参见例如，Thompson等人，WO 92/16221，其全部教导引入本文作为参考。)
本公开内容的修饰的蛋白质支架可以通过使蛋白质支架或片段与改性剂反应来产生。例如，有机部分可以通过采用胺反应性改性剂，例如PEG的NHS酯，以非位点特异性方式与蛋白质支架键合。包含有机部分(其与本公开内容的蛋白质支架的特异性位点键合)的修饰的蛋白质支架和片段可以使用合适的方法进行制备，所述方法例如反向蛋白酶解(Fisch等人，Bioconjugate Chem.，3:147-153 (1992)；Werlen等人，Bioconjugate Chem.，5:411-417 (1994)；Kumaran等人，Protein Sci. 6 (10):2233-2241 (1997)；Itoh等人，Bioorg. Chem.，24(1): 59-68 (1996)；Capellas等人，Biotechnol. Bioeng.，56 (4):456-463 (1997))，以及Hermanson，G. T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press:San Diego，Calif. (1996)中描述的方法。
定义
如本公开内容自始至终使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数所指物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“方法”包括多种此类方法，并且提及“剂量”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个剂量及其等价物等等。
术语“约”或“大约”意指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，例如，测量***的局限性。例如，“约”可以意指在1个或多个标准差内。可替代地，“约”可以意指至多20%、或至多10%、或至多5%、或至多1%的给定值的范围。可替代地，特别是关于生物***或过程，该术语可以意指在值的一个数量级内，优选在5倍内，且更优选在2倍内。当本申请和权利要求中描述特定值时，除非另有说明，否则术语“约”应该假定在特定值的可接受误差范围内的含义。
本公开内容提供了分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质、或其生物活性部分，实质上或基本上不含如在其天然存在的环境中发现的，通常与多核苷酸或蛋白质伴随或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质当通过重组技术生产时基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学制品。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在多核苷酸衍生自其的生物体的基因组DNA中，天然侧接多核苷酸的序列(最佳地蛋白质编码序列) (即，位于多核苷酸的5'和3'端处的序列)。例如，在各个方面，分离的多核苷酸可以含有少于约5kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb或0.1 kb的核苷酸序列，其天然侧接多核苷酸衍生自其的细胞的基因组DNA中的多核苷酸。基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有小于约30%、20%、10%、5%或1% (按干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当重组生产本公开内容的蛋白质或其生物活性部分时，最佳地，培养基代表少于约30%、20%、10%、5%或1% (按干重计)的化学前体或非目的蛋白质化学制品。
本公开内容提供了所公开的DNA序列以及由这些DNA序列编码的蛋白质的片段和变体。在本公开内容自始至终使用的，术语“片段”指DNA序列的一部分或氨基酸序列的一部分以及因此由此编码的蛋白质。包含编码序列的DNA序列的片段可以编码蛋白质片段，其保留天然蛋白质的生物活性，并且因此保留如本文所述的对靶DNA序列的DNA识别或结合活性。可替代地，可用作杂交探针的DNA序列的片段一般不编码保留生物活性或不保留启动子活性的蛋白质。因此，DNA序列的片段的范围可以为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，且直到本公开内容的全长多核苷酸。
本公开内容的核酸或蛋白质可以通过模块化方法进行构建，所述模块化方法包括在靶载体中预组装单体单元和/或重复单元，所述靶载体随后可以组装成最终的目的载体。本公开内容的多肽可以包含本公开内容的重复单体，并且可以通过在靶载体中预组装重复单元通过模块化方法进行构建，所述靶载体随后可以组装成最终的目的载体。本公开内容提供了通过该方法产生的多肽以及编码这些多肽的核酸序列。本公开内容提供了宿主生物体和细胞，其包含编码这种模块化方法产生的多肽的核酸序列。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体地涵盖单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)和具有多表位特异性的抗体组合物。使用如本文定义的其抗体的天然或合成类似物、突变体、变体、等位基因、同源物和直向同源物(在本文中统称为“类似物”)也在其范围内。因此，根据其一个方面，术语“其抗体”在其最广泛的含义上也涵盖此类类似物。一般地，在此类类似物中，与如本文定义的其抗体相比，一个或多个氨基酸残基可能已被替换、缺失和/或添加。
如本文使用的，“抗体片段”及其所有语法变体被定义为完整抗体的一部分，其包含完整抗体的抗原结合位点或可变区，其中所述部分不含完整抗体的Fc区的恒定重链结构域 (即CH2、CH3和CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双抗体；其为具有一级结构的多肽的任何抗体片段，所述多肽由邻接氨基酸残基的一个不间断序列组成(在本文中被称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(l)单链Fv (scFv)分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、或其含有轻链可变结构域的三个CDR的片段，而不含相关的重链部分，以及(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽、或其含有重链可变区的三个CDR的片段，而不含相关的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一条或多条重链的抗体片段中，重链可以含有在完整抗体的非Fc区中发现的任何恒定结构域序列(例如，IgG同种型中的CHI)，和/或可以含有在完整抗体中发现的任何铰链区序列，和/或可以含有与重链的铰链区序列或恒定结构域序列融合或位于其中的亮氨酸拉链序列。该术语进一步包括单结构域抗体(“sdAB”)，其一般指具有单个单体可变抗体结构域的抗体片段(例如，来自骆驼科动物)。此类抗体片段类型通过本领域普通技术人员将容易理解。
“结合”指大分子之间(例如，蛋白质和核酸之间)的序列特异性、非共价相互作用。结合相互作用的并非所有组分都需要是序列特异性的(例如，与DNA骨架中的磷酸残基接触)，只要相互作用整体上是序列特异性的。
术语“包含”预期意指组合物和方法包括所叙述的要素，但不排除其它要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应该意指排除当用于预期目的时，对组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文定义的要素组成的组合物将不排除痕量杂质或惰性载体。“由……组成”应该意指排除多于痕量要素的其它成分和基本的方法步骤。由这些过渡术语各自定义的方面在本公开内容的范围内。
术语“表位”指多肽的抗原决定簇。表位可以包含空间构象中的三个氨基酸，其为表位所独有的。一般地，表位由至少4、5、6或7个此类氨基酸组成，并且更通常地，由至少8、9或10个此类氨基酸组成。确定氨基酸的空间构象的方法是本领域已知的，并且包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。
如本文使用的，“表达”指多核苷酸通过其转录成mRNA的过程，和/或转录的mRNA通过其随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中的mRNA剪接。
“基因表达”指将包含在基因中的信息转换成基因产物。基因产物可以为基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、shRNA、微小RNA、结构RNA或任何其它类型的RNA)，或通过mRNA的翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过过程如加帽、多聚腺苷酸化、甲基化和编辑进行修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻化和糖基化进行修饰的蛋白质。
基因表达的“调节”或“调控”指基因活性的变化。表达的调节可以包括但不限于基因激活和基因阻遏。
术语“可操作地连接的(operatively linked)”或其等价物(例如，“可操作地连接的(linked operatively)”)意指两个或更多个分子相对于彼此定位，使得它们能够相互作用以实现可归于一个或两个分子或其组合的功能。
公开了非共价连接的组分以及制备且使用非共价连接的组分的方法。各种组分可以采取如本文所述的各种不同形式。例如，可以使用非共价连接的(即，可操作地连接的)蛋白质，以允许暂时的相互作用，其避免了本领域中的一个或多个问题。非共价连接的组分例如蛋白质结合和解离的能力，仅或主要在其中此类结合对于所需活性需要的情况下实现功能性结合。键合可以具有足以允许所需效应的持续时间。
公开了用于将蛋白质导向生物体的基因组中的特异性基因座的方法。该方法可以包括提供DNA定位组分和提供效应分子的步骤，其中所述DNA定位组分和效应分子能够经由非共价键合可操作地连接。
术语“scFv”指单链可变片段。scFv是用接头肽相连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。接头肽的长度可以为约5至40个氨基酸，或约10至30个氨基酸，或约5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。单链可变片段缺少完整抗体分子中发现的恒定Fc区，并且因此缺少用于纯化抗体的常见结合位点(例如蛋白G)。该术语进一步包括其为细胞内抗体(其为在细胞的细胞质中稳定的抗体)，并且可以与细胞内蛋白质结合的scFv。
术语“单结构域抗体”意指具有能够选择性结合特异性抗原的单个单体可变抗体结构域的抗体片段。单结构域抗体一般是约110个氨基酸长的肽链，包含重链抗体或常见IgG的一个可变结构域(VH)，其一般具有与完整抗体相似的对抗原的亲和力，但更耐热且针对洗涤剂和高浓度尿素更稳定。实例是衍生自骆驼科动物的抗体或鱼抗体。可替代地，单结构域抗体可以由具有四条链的常见鼠或人IgG制成。
如本文使用的，术语“特异性结合(specifically bind)”和“特异性结合(specific binding)”指抗体、抗体片段或纳米抗体优先结合存在于不同抗原的均质混合物中的特定抗原的能力。在一些方面，特异性结合相互作用将区别样品中的期望抗原和不期望抗原。在一些方面，多于约10倍至100倍或更多(例如，多于约1000倍或10,000倍)。“特异性”指免疫球蛋白或免疫球蛋白片段例如纳米抗体相对于不同的抗原靶优先结合一种抗原靶的能力，并不一定暗示高亲和力。
“靶位点”或“靶序列”是定义结合分子与之结合的核酸的一部分的核酸序列，条件是存在用于结合的充分条件。
术语“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸也可以涵盖所描绘的单链的互补链。本公开内容的核酸还涵盖保留相同结构或编码相同蛋白质的基本上等同的核酸及其互补体。
本公开内容的探针可以包含可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的单链核酸。因此，本公开内容的核酸可以指在严格杂交条件下杂交的探针。
本公开内容的核酸可以为单链或双链。即使当分子的大部分是单链时，本公开内容的核酸也可以含有双链序列。即使当分子的大部分是双链时，本公开内容的核酸也可以含有单链序列。本公开内容的核酸可以包括基因组DNA、cDNA、RNA或其杂交体。本公开内容的核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合。本公开内容的核酸可以含有碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。可以合成本公开内容的核酸，以包含非天然氨基酸修饰。本公开内容的核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法来获得。
本公开内容的核酸，或其整个序列、或其任何部分，可以为非天然存在的。本公开内容的核酸可以含有并非天然存在的一个或多个突变、取代、缺失或***，致使整个核酸序列非天然存在。本公开内容的核酸可以含有一个或多个一式两份的、反向的或重复的序列，其所得的序列并非天然存在的，致使整个核酸序列非天然存在。本公开内容的核酸可以含有并非天然存在的修饰的、人工的或合成的核苷酸，致使整个核酸序列非天然存在。
考虑到遗传密码的冗余，多个核苷酸序列可以编码任何特定的蛋白质。本文考虑了所有此类核苷酸序列。
如本公开内容自始至终使用的，术语“可操作地连接的”指基因的表达，所述基因处于它与之在空间上相连接的启动子的控制下。启动子可以置于处于其控制下的基因的5'(上游)或3' (下游)。启动子和基因之间的距离可以与衍生启动子的基因中该启动子和它控制的基因之间的距离大致相同。可以适应启动子和基因之间的距离变化，而无启动子功能的丧失。
如本公开内容自始至终使用的，术语“启动子”指能够赋予、激活或增强细胞中的核酸表达的合成或天然衍生的分子。启动子可以包含一个或多个特异性转录调控序列，以进一步增强其表达和/或改变空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对处。启动子可以衍生自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以关于表达在其中发生的细胞、组织或器官，或者关于表达在其下发生的发育阶段，或者响应外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，组成性或差异性地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、EF-1 α启动子、CAG启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。
如本公开内容自始至终使用的，术语“基本上互补的”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多个核苷酸或氨基酸的区域上，第一序列与第二序列的互补体至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%等同，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。
如本公开内容自始至终使用的，术语“基本上等同的”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多个核苷酸或氨基酸的区域上，第一序列和第二序列至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%等同，或就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补。
如本公开内容自始至终使用的，当用于描述核酸时，术语“变体”指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其一部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上等同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补体或基本上等同于其的序列杂交的核酸。
如本公开内容自始至终使用的，术语“载体”指含有复制起点的核酸序列。载体可以为病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以为DNA或RNA载体。载体可以为自复制的染色体外载体，且优选为DNA质粒。载体可以包含氨基酸与DNA序列、RNA序列、或DNA和RNA序列两者的组合。
如本公开内容自始至终使用的，当用于描述肽或多肽时，术语“变体”指这样的肽或多肽，其通过氨基酸的***、缺失或保守取代而在氨基酸序列中不同，但保留至少一种生物活性。变体还可以意指具有氨基酸序列的蛋白质，其与保留至少一种生物活性的具有氨基酸序列的参考蛋白质基本上等同。
氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、荷电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域理解的，通过考虑氨基酸的亲水指数，可以部分地鉴定这些微小变化。Kyte等人，J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代，且仍保留蛋白质功能。在一个方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可以用于揭示将导致蛋白质保留生物学功能的取代。在肽的背景下氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，已报告与抗原性和免疫原性良好关联的一种有用度量。美国专利号4,554,101，完全引入本文作为参考。
具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以导致保留生物活性，例如免疫原性的肽。可以用亲水性值在彼此±2内的氨基酸来执行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受该氨基酸的特定侧链的影响。与该观察一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸且特别是这些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质所揭示的。
如本文使用的，“保守”氨基酸取代可以如下表A、B或C中阐述的进行定义。在一些方面，融合多肽和/或编码此类融合多肽的核酸包括已通过修饰编码本公开内容的多肽的多核苷酸引入的保守取代。氨基酸可以根据物理性质以及对二级蛋白质结构和三级蛋白质结构的贡献进行分类。保守取代是用一种氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸。示例性的保守取代在表A中阐述。
表A -- 保守取代I
Figure 401882DEST_PATH_IMAGE001
可替代地，如表B中阐述的，保守氨基酸可以如Lehninger，(Biochemistry，第二版；Worth Publishers，Inc. NY，N.Y. (1975)，第71-77页)中所述进行分组。
表B -- 保守取代II
Figure 459968DEST_PATH_IMAGE002
可替代地，示例性保守取代在表C中阐述。
表C -- 保守取代III
原始残基 示例性取代
Ala (A) Val Leu Ile Met
Arg (R) Lys His
Asn (N) Gln
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser Thr
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
Gly (G) Ala Val Leu Pro
His (H) Lys Arg
Ile (I) Leu Val Met Ala Phe
Leu (L) Ile Val Met Ala Phe
Lys (K) Arg His
Met (M) Leu Ile Val Ala
Phe (F) Trp Tyr Ile
Pro (P) Gly Ala Val Leu Ile
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr Phe Ile
Tyr (Y) Trp Phe Thr Ser
Val (V) Ile Leu Met Ala
应当理解，本公开内容的多肽预期包括荷有氨基酸残基的一个或多个***、缺失或取代或其任何组合，以及除氨基酸残基的***、缺失或取代外的修饰的多肽。本公开内容的多肽或核酸可以含有一个或多个保守取代。
如本公开内容自始至终使用的，术语“多于一个”上述氨基酸取代指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个所述氨基酸取代。术语“多于一个”可以指2、3、4或5个所述氨基酸取代。
本公开内容的多肽和蛋白质，或其整个序列、或其任何部分，可以为非天然存在的。本公开内容的多肽和蛋白质可以含有并非天然存在的一个或多个突变、取代、缺失或***，致使整个氨基酸序列非天然存在。本公开内容的多肽和蛋白质可以含有一个或多个一式两份的、反向的或重复的序列，其所得的序列并非天然存在的，致使整个氨基酸序列非天然存在。本公开内容的多肽和蛋白质可以含有并非天然存在的修饰的、人工的或合成的氨基酸，致使整个氨基酸序列非天然存在。
如本公开内容自始至终使用的，“序列同一性”可以通过使用独立的可执行BLAST引擎程序用于比对(blast)两个序列(bl2seq)进行确定，所述程序可以从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) (NCBI) ftp网站检索，使用缺省参数(Tatusova和Madden，FEMS Microbiol Lett.，1999，174，247-250；其整体引入本文作为参考)。当在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下使用时，术语“等同的”或“同一性”指在每个序列的指定区域上相同的残基的指定百分比。百分比可以通过以下进行计算：最佳地比对两个序列，在指定区域上比较两个序列，确定等同残基在两个序列中出现的位置数目，以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数目，并且将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同长度，或比对产生一个或多个交错端部且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括在计算的分母而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被视为等价的。可以手动地或通过使用计算机序列算法如BLAST或BLAST 2.0来执行同一性。
如本公开内容自始至终使用的，术语“内源的”指与靶基因或它引入其内的宿主细胞天然相关的核酸或蛋白质序列。
如本公开内容自始至终使用的，术语“外源的”指与靶基因或它引入其内的宿主细胞并非天然相关的核酸或蛋白质序列，包括天然存在的核酸例如DNA序列的非天然存在的多重拷贝、或位于非天然存在的基因组位置中的天然存在的核酸序列。
本公开内容提供了将包含DNA序列的多核苷酸构建体引入宿主细胞内的方法。“引入”意指以这样的方式将多核苷酸构建体呈递给细胞，使得构建体获得对宿主细胞的内部的接近。本公开内容的方法并不依赖用于将多核苷酸构建体引入宿主细胞内的特定方法，仅依赖于多核苷酸构建体获得对宿主的一种细胞的内部的接近。用于将多核苷酸构建体引入细菌、植物、真菌和动物内的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
实施例
实施例1 - 嵌合刺激受体(CSR)的构建
在TCR的存在或不存在下，用嵌合刺激受体(CSR)的表达增强刺激。在表面表达的一种或多种CSR (无论是瞬时表达还是稳定表达的)的存在下，当用展示激动剂mAb的试剂处理T细胞时，递送增强的主要和次要共刺激信号。在一个方面，这个示意图代表同种异体细胞。由于经由CSR介导的刺激信号实现了更充分的T细胞激活，因此T细胞的激活和扩增得到增强。
嵌合刺激受体(CSR)被设计为包括包含CD2细胞外结构域的抗原识别区。在CD2的细胞外结构域内设计了CSR突变体的实验对象组。该实验对象组的目标是鉴定不再结合CD58但保留其被抗CD2激活剂试剂结合的接收性的突变体。这出于两个主要原因可能是期望的：1)活化T细胞的CD58表达可能与野生型(WT) CSR相互作用，并且有可能干扰CSR的最佳性能；以及2)由于WT CSR可能充当天然配体CAR，所以表达CSR的T细胞可以介导针对表达CD58的细胞，包括活化T细胞的细胞毒活性是有可能的。因此，需要这样的突变型CSR，其不能与CD58相互作用，但保留其结合激活抗CD2试剂用于最佳细胞扩增的能力。
在CD2细胞外结构域内的D111H突变(“CD2 ECD (D111H)”)保留了与激活CD2试剂结合用于最佳细胞扩增的能力，并且不与CD58相互作用。图1和图2中显示了本公开内容的CSR的示意图。图1显示了具有CD2信号肽的CSR的示意图。图2显示了具有CD8信号肽的CSR的示意图。这些CSR可以用于同种异体或自体CAR-T细胞的增强制造。CSR CD2z-D111H突变体可以在制造过程中递送给同种异体或自体CAR-T细胞，以增强细胞生长和扩增、质量、存活、表型、功能、亚群组成、基因编辑效率等。这些突变型CSR可以如在mRNA中编码的瞬时递送，或如在转座子中编码的稳定递送。
实施例2 - 嵌合刺激受体的功能表征
为了测试CSR对CAR-T细胞扩增的作用，使用与Cas-CLOVER™基因编辑***组合的piggyBac® DNA修饰***，对从正常供体血液中分离的泛T细胞进行遗传修饰。在单次反应中，用编码至少CAR和选择基因的转座子、编码CSR的mRNA、编码超级piggyBac®转座酶的mRNA、编码Cas-CLOVER™的mRNA、以及靶向TCRb和B2M的多重引导RNA (gRNA)，对细胞进行电穿孔，以便敲除TCR和MHCI (双敲除；DKO)。随后用激动剂mAb抗CD2、抗CD3和抗CD28刺激细胞，并且随后在14天培养期的过程中选择用于遗传修饰。在最初的培养期结束时，所有T细胞都表达CAR，指示了遗传修饰的细胞的成功选择。与不表达CSR (无加强剂)的细胞相比，对于表达CSR的细胞观察到DKO细胞的更大程度的扩增(图3)。因此，CSR的表达在生产过程中增强了CAR-T细胞扩增。
测试了CSR表达对DKO CAR-T细胞的记忆表型的作用。用CSR或不用CSR (无加强剂)生产的DKO CAR-T细胞对于表面CD45RA、CD45RO和CD62L的表达进行染色，以限定Tscm、Tcm、Tem和Teff细胞；Tscm (CD45RA+CD45RO-CD62L+)、Tcm (CD45RA-CD45RO+CD62L+)、Tem(CD45RA-CD45RO+CD62L-)、Teff (CD45RA+CD45RO-CD62L-)。表1和表2中显示了具有或没有CSR的DKO CAR-T细胞的Teff、Tscm、Tcm和Tem比例。具有或没有CSR的DKO CAR-T细胞占优势地由特别高水平的有利的Tscm和Tcm细胞构成。因此，DKO CAR-T的记忆表型没有受到CSR共表达的明显影响。
表1. 具有或没有嵌合刺激受体表达的CD8+ DKO CAR-T细胞中的Teff、Tscm、Tcm和Tem比例
CSR Teff Tscm Tcm Tem
CD2.DH.z 4.9e-002 41.2 52.4 0.3
CD2.DH.28z 0.18 40.6 54.5 0.5
CD2.DH.BBZ 0.34 47.2 46.7 0.75
CD2.DH.7z 0.42 43.4 50.9 0.94
CD2.DH.15z 0.10 47.4 47.5 0.29
CD2.DH.21z 0.3 46.2 48.2 0.61
CD2.DH.lz 0.41 48 46.7 1.08
CD2.DH.27z 0.2 35.8 59.2 0.45
CD2.DH.Oxz 0.35 46.5 48.5 0.7
CD2.DH.Gz 0.48 44.8 49.9 0.76
无加强剂 0.65 39.6 54.7 1.59
表2. 具有或没有嵌合刺激受体表达的CD4+ DKO CAR-T细胞中的Teff、Tscm、Tcm和Tem比例
CSR Teff Tscm Tcm Tem
CD2.DH.z 0.43 7.68 84 6.97
CD2.DH.28z 1.03 8.8 77.9 11.8
CD2.DH.BBZ 1.81 11.4 72.2 13.9
CD2.DH.7z 1.42 9.58 72.8 15.7
CD2.DH.15z 0.67 9.33 80.2 9.09
CD2.DH.21z 1.1 13.4 71.4 13.1
CD2.DH.lz 1.77 8.77 70.1 18.8
CD2.DH.27z 0.99 8.97 78.3 11.1
CD2.DH.Oxz 1.45 9.97 72.6 15.6
CD2.DH.Gz 1.44 9.64 73.8 14.7
无加强剂 1.25 7.88 75.5 15
实施例3 - 表达嵌合刺激受体(CSR)的CAR-T细胞的体内效应
为了测试实施例2中描述的表达不同CSR的同种异体CAR-T细胞对抗肿瘤功效的作用，使用多发性骨髓瘤的小鼠异种移植模型进行体内实验。实验程序的图示在图4中进行描绘，并且10种不同的同种异体CAR-T细胞各自用10种不同的CSR进行生产。具体而言，RPMI-8226细胞系以1x107个细胞的剂量皮下注射到雌性NSG小鼠内(第-7天)，并且随后在肿瘤建立(通过卡尺测量的75-125 mm3 [靶平均值~100 mm3])的第0天时，通过以‘应激’剂量(5x106)的静脉内(IV)注射，用同种异体CAR-T细胞进行治疗。‘应激’剂量用于在检测用不同加强剂分子生产的CAR-T细胞中的功效方面可能的功能差异中的更大分辨率。用PBS的治疗用作阴性对照。表达CD2.DHz的同种异体CAR-T细胞用作阳性对照。
该实验的结果显示于图5-9中。用本公开内容的表达各种CSR的CAR-T细胞治疗动物，导致与PBS对照相比的肿瘤体积降低(图5)。在用表达CSR的同种异体CAR-T细胞治疗后的56天之后，肿瘤大小与阳性对照可比较。在用表达CSR的同种异体CAR-T细胞治疗之后，定量血液中的总T细胞(图6)。在用表达CSR的CAR-T细胞治疗之后，还定量血液中的T细胞峰值水平，并且展示为所有动物内的组平均值(图7)。相对于PBS阴性对照，所有动物都展示T细胞峰值水平的增加。相对于CD2.DH.CD2z (也被称为CD2.DH.z)对照，表达CD2.DH28z、CD2.DH.BBz、CD2.DH.15z、CD2.DH.Oxz和CD2.DH.Gz的CAR-T细胞展示血液中的T细胞峰值水平增加。在用每种同种异体CAR-T细胞治疗之后，计算T细胞的曲线下面积(T细胞AUC) (图8和表3)。相对于PBS阴性对照，所有动物都展示T细胞AUC的增加。相对于CD2.DH.CD2z (也被称为CD2.DH.z)对照，表达CD2.DH28z、CD2.DH.BBz、CD2.DH.15z、CD2.DH.Oxz和CD2.DH.Gz的CAR-T细胞展示血液中的T细胞峰值水平增加。在用表达各种CSR的每种同种异体CAR-T细胞治疗之后，对Teff、Tem、Tcm和Tscm细胞比例的作用与用阳性对照(表达CD2.DH.z CSR的CAR-T细胞)的治疗可比较。
表3. 在用同种异体CAR-T细胞治疗之后，血液中的T细胞(hCD45+)的曲线下面积
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Claims (41)

1.一种非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)，其包含：
(a)包含信号肽和激活组分的胞外结构域，其中所述信号肽包含CD2信号肽或CD8α信号肽，并且其中所述激活组分包含激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分；
(b)跨膜结构域，其中所述跨膜结构域包含CD2跨膜结构域或其一部分；和
(c)包含细胞质结构域和信号转导结构域的胞内结构域，其中所述细胞质结构域是CD2细胞内结构域、CD28细胞内结构域、4-1BB细胞内结构域、IL17RA细胞内结构域、IL15RA细胞内结构域、IL21R细胞内结构域、ICOS细胞内结构域、CD27细胞内结构域、OX40细胞内结构域或GITR细胞内结构域或其任何组合，并且其中所述信号转导结构域包含CD3ζ蛋白或其一部分；和
其中所述信号肽和细胞质结构域并非衍生自相同的蛋白质。
2.权利要求1的CSR，其中所述信号肽包含CD2信号肽。
3. 权利要求1的CSR，其中所述CD2信号肽包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
4.权利要求1的CSR，其中所述信号肽包含CD8α信号肽。
5. 权利要求1的CSR，其中所述CD8α信号肽包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。
6.权利要求1-5中任一项的CSR，其中所述激活组分包含修饰。
7.权利要求1-6中任一项的CSR，其中所述修饰包含与CD2细胞外结构域或其一部分的野生型序列相比，激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分的氨基酸序列的突变或截短。
8.权利要求7的CSR，其中包含激动剂结合的CD2细胞外结构域或其一部分的突变或截短的所述CSR并不结合CD58。
9. 权利要求7的CSR，其中包含突变或截短的所述CD2细胞外结构域或其一部分包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
10. 权利要求1-9中任一项的CSR，其中所述CD2跨膜结构域或其一部分包含SEQ IDNO: 9的氨基酸序列。
11. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述CD2细胞内结构域包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。
12. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述CD28细胞内结构域包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
13. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述4-1BB细胞内结构域包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。
14. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述IL17RA细胞内结构域包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
15. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述IL15RA细胞内结构域包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列。
16. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述IL21R细胞内结构域包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。
17. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述ICOS细胞内结构域包含SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。
18. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述CD27细胞内结构域包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列。
19. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述OX40细胞内结构域包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列。
20. 权利要求1-10中任一项的CSR，其中所述GITR细胞内结构域包含SEQ ID NO: 31的氨基酸序列。
21. 权利要求1-20中任一项的CSR，其中包含CD3ζ蛋白或其一部分的所述信号转导结构域包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
22. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 39的氨基酸序列。
23. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列。
24. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列。
25. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 51的氨基酸序列。
26. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 55的氨基酸序列。
27. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 59的氨基酸序列。
28. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 63的氨基酸序列。
29. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列。
30. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列。
31. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列。
32. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 41的氨基酸序列。
33. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列。
34. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列。
35. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列。
36. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列。
37. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 61的氨基酸序列。
38. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 65的氨基酸序列。
39. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 69的氨基酸序列。
40. 权利要求1-21中任一项的CSR，其中所述CSR包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列。
41.一种核酸序列，其编码权利要求1-40中任一项的CSR。
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