JP2022546372A - 組換え繁殖欠損指標バクテリオファージを使用して微生物を検出するためのデバイスおよび方法 - Google Patents

組換え繁殖欠損指標バクテリオファージを使用して微生物を検出するためのデバイスおよび方法 Download PDF

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Abstract

繁殖欠損指標バクテリオファージを使用した、微生物の迅速な検出のための組成物、方法、キットおよびシステムが、本明細書に開示されている。特定の目的の微生物の結合および感染に対する斯かる繁殖欠損指標バクテリオファージの特異性は、目的の微生物の標的化されたかつ高感度の検出を可能にする。本開示の例示的な実施形態は、ファージのゲノムの後期遺伝子領域においてインジケーター遺伝子をそれぞれ含む少なくとも２種の組換えファージを含む組成物であって、組換えファージが、繁殖欠損であり、組換えファージが、１種または複数の目的の微生物に特異的に感染することができる、組成物である。

Description

参照による援用
本出願は、２０１９年８月２６日に出願された米国特許仮出願第６２／８９１，７０１号に対する優先権を主張する。次の米国特許出願の開示は、それらの全体がこれにより参照により組み込まれる：２０１９年１月１４日に出願された米国特許出願第１６／２４７，４９０号、２０１９年１月１４日に出願された米国特許出願第１６／２４７，４８６号、２０１９年３月１１日に出願された米国特許出願第１６／２９８，６９５号、２０１８年３月９日に出願された米国特許仮出願第６２／６４０，７９３号、２０１９年１月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／７９８，９８０号、２０１３年２月２１日に出願された米国特許出願第１３／７７３，３３９号、２０１５年２月１８日に出願された米国特許出願第１４／６２５，４８１号、２０１６年９月１３日に出願された米国特許出願第１５／２６３，６１９号、２０１７年１月１８日に出願された米国特許出願第１５／４０９，２５８号、２０１８年１月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／６１６，９５６号、２０１８年２月９日に出願された米国特許仮出願第６２／６２８，６１６号、２０１８年４月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／６６１，７３９号、２０１８年３月９日に出願された米国特許仮出願第６２／６４０，７９３号、および２０１９年１月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／７９８，９８０号。
発明の分野
本開示は、組換え感染因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｇｅｎｔ）を使用した、目的の微生物の検出のための方法、装置、システムに関する。
背景
生体、食物、水および臨床試料における細菌、ウイルスおよび他の微生物の検出のスピードおよび感度の改善に強い関心が集まっている。微生物病原体は、ヒトおよび飼育動物の間の実質的な病的状態、ならびに莫大な経済的損失を引き起こし得る。ある特定の微生物、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．で汚染された食物の摂取によって引き起こされる生命を脅かすまたは致死的な疾病の大流行を考慮すると、微生物の検出は、食品医薬品局（Food and Drug Administration）（ＦＤＡ）および疾病管理センター（Centers for Disease Control）（ＣＤＣ）にとって優先順位が高い。
細菌の検出のための伝統的な微生物学的検査は、非選択的および選択的集積培養と、それに続く選択的培地での平板培養、ならびに疑われる（suspect）コロニーを確認するためのさらなる検査に頼る。斯かる手順は、数日間を要求する場合がある。種々の迅速な方法が研究され、時間要件を低下させるための実践に導入されてきた。しかし、現在のところ、時間要件を低下させる方法には弱点がある。例えば、直接的なイムノアッセイまたは遺伝子プローブが関与する技法は一般に、適当な感度を得るために一晩の富化ステップを要求し、したがって、同日に結果を出す能力を欠如する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検査もまた、増幅ステップを含み、したがって、非常に高い感度および選択性の両方が可能である；しかし、ＰＣＲ検査に経済的に供することができる試料サイズは、限定されている。ＰＣＲに供することができる希薄な細菌懸濁物は、細胞を含まず、したがって、精製および／または長い富化ステップがやはり要求される。
伝統的な生物学的富化に要求される時間は、試料の標的細菌集団の成長速度によって、試料マトリックスの効果によって、および要求される感度によって決まる。実際に、最も高い感度の方法は、一晩インキュベーションを用い、全体で約２４時間を要する。培養に要求される時間が原因で、これらの方法は、同定されるべき生物および試料の供給源に応じて、最大３日間を要する場合がある。この遅延時間は一般に不適であるが、その理由としては、斯かる遅延により、汚染された食物もしくは水または他の製品が、家畜またはヒトへと進入することが可能になることが挙げられる。加えて、抗生物質耐性細菌および生体防御（ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ）の検討事項の増加により、水、食物および臨床試料における細菌病原体の迅速な同定は、世界中で、重大な意味を持つ優先事項となっている。
したがって、細菌および他の潜在的に病原性の微生物等の微生物の、より迅速、単純かつ高感度な検出および同定の必要がある。
概要
本開示の実施形態は、細菌等が挙げられるがこれに限定されない、微生物の検出のためのデバイス、組成物、方法、装置、システムおよびキットを含む。本開示は、種々の仕方で具体化することができる。本出願の一部の例示的な実施形態について下に記述する。
本開示の例示的な実施形態は、ファージのゲノムの後期遺伝子領域においてインジケーター遺伝子を含む組換えファージであって、繁殖欠損であり、目的の微生物に特異的に感染することができる、組換えファージである。一部の実施形態では、組換えバクテリオファージは、ビリオンアセンブリに要求される後期遺伝子における変更が原因で、繁殖欠損である。組換えバクテリオファージの一部の実施形態では、インジケーター遺伝子は、組換えファージの後期遺伝子の配列に挿入され、後期遺伝子を非機能的にし、組換えファージを繁殖欠損にする。組換えバクテリオファージの一部の実施形態では、インジケーター遺伝子は、組換えファージの後期遺伝子の配列の少なくとも部分に置き換わり、組換えファージを繁殖欠損にし、後期遺伝子は、ビリオンアセンブリに要求される。組換えファージは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的なファージに由来する。一部の実施形態では、組換えファージは、Ｅ．ｃｏｌｉに特異的なファージに由来する。他の実施形態では、組換えファージは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的なファージに由来する。組換えバクテリオファージの一部の実施形態では、後期遺伝子は、ビリオンアセンブリに要求される。
本開示の例示的な実施形態は、ファージのゲノムの後期遺伝子領域においてインジケーター遺伝子をそれぞれ含む少なくとも２種の組換えファージを含む組成物であって、組換えファージが、繁殖欠損であり、組換えファージが、１種または複数の目的の微生物に特異的に感染することができる、組成物である。組成物の一部の実施形態では、少なくとも２種の組換えファージのそれぞれは、異なるインジケーター遺伝子を含む。組成物の一部の実施形態では、少なくとも２種の組換えファージのそれぞれは、異なる目的の微生物に特異的に感染することができる。組成物の一部の実施形態では、少なくとも２種の組換えファージは、複数の目的の微生物に感染することができる。組成物の一部の実施形態では、複数の目的の微生物は、少なくとも２種の異なるカテゴリーの細菌を含む。組成物の一部の実施形態では、少なくとも２種の異なるカテゴリーの細菌は、少なくとも２種の異なる属の細菌、少なくとも２種の異なる種の細菌、少なくとも２種の異なる株の細菌、または少なくとも２種の異なる血清型の細菌のうち１種または複数を含む。
本開示の例示的な実施形態は、組換えファージを調製する方法である。斯かる方法は、標的微生物に特異的に感染する親ファージを選択するステップと、親ファージ（page）の遺伝子を変更して、組換え繁殖欠損ファージを生成するステップと、繁殖欠損ファージにおいて変異された遺伝子の産物を発現することができる標的微生物の操作された株を、インジケーター遺伝子およびインジケーター遺伝子を挟み、親ファージにおける所望の配列と相同であるＨＲ配列を含む相同組換え（ＨＲ）プラスミドで形質転換するステップと、形質転換された標的微生物を、親ファージまたは繁殖欠損親ファージに感染させ、ＨＲプラスミドおよび親ファージまたは組換え繁殖欠損ファージのゲノムの間にＨＲを生じさせるステップと、繁殖欠損であり、かつインジケーター遺伝子の産物を発現することができる組換えファージの特定のクローンを単離するステップとを含むことができる。組換えファージを調製する方法の一部の実施形態では、親ファージの遺伝子を変更して、繁殖欠損ファージを生成するステップは、ＨＲプラスミドおよび親ファージのゲノムの間に生じるＨＲによって達成され、親ファージの遺伝子は、インジケーター遺伝子による親ファージの少なくとも一部の置換えによって変更される。一部の実施形態では、遺伝子の変更は、部分的なまたは全体的な親ファージの遺伝子の欠失を含む。よって、一部の実施形態では、本方法は、親ファージのゲノムを変更するステップを含み、親ファージの少なくとも１種の遺伝子が欠失される。一部の実施形態では、少なくとも２、３、４または５種の遺伝子（gen）が欠失される。
組換えファージを調製する方法の一部の実施形態は、標的微生物の操作された株を生成するステップをさらに含むことができる。一部の実施形態では、標的微生物の操作された株を生成するステップは、標的微生物を、組換え繁殖欠損ファージにおいて変更された遺伝子をコードし、これを発現することができるプラスミド（「トランスプラスミド（ｔｒａｎｓ ｐｌａｓｍｉｄ）」）で形質転換するステップを含むことができる。組換えファージを調製する方法の一部の実施形態は、形質転換するステップに先立ち、インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミドを調製するステップをさらに含むことができる。一部の実施形態では、標的微生物の操作された株を生成するステップは、標的微生物を、トランスプラスミドおよびインジケーター遺伝子を含むＨＲプラスミドで形質転換するステップを含むことができる。組換えファージを調製する方法の一部の実施形態では、親ファージの遺伝子を変更して、繁殖欠損ファージを生成するステップは、ＨＲが、ＨＲプラスミドおよび親ファージのゲノムの間に生じ得るように、トランスプラスミドおよびＨＲプラスミドの両方を含有する操作された標的微生物の野生型親ファージでの感染によって達成され、親ファージの遺伝子は、インジケーター遺伝子による親ファージの少なくとも一部の置換えによって変更され、一方、繁殖欠損組換えファージにおいて変更される遺伝子を含有するプラスミド（トランスプラスミド）は、遺伝子をトランスに提供し、繁殖欠損ファージにおける失われたまたは変更された遺伝子を補完する。組換えファージを調製する方法のさらなる実施形態では、親ファージの遺伝子を欠失させて、繁殖欠損ファージを生成するステップは、ＨＲが、ＨＲプラスミドおよび親ファージのゲノムの間に生じ得るように、トランスプラスミドおよびＨＲプラスミドの両方を含有する操作された標的微生物の野生型親ファージでの感染によって達成され、親ファージのゲノムは、インジケーター遺伝子による親ファージの少なくとも一部の置換えによって変更され、一方、繁殖欠損組換えファージにおいて変更される遺伝子を含有するプラスミド（トランスプラスミド）は、遺伝子をトランスに提供し、繁殖欠損ファージにおける失われたまたは変更された遺伝子を補完する。
組換えファージを調製する方法の一部の実施形態では、親ファージの遺伝子を変更して、繁殖欠損ファージを生成するステップは、ＨＲが、ＨＲプラスミドおよび親ファージのゲノムの間に生じ得るように、繁殖欠損ファージにおいて変更される遺伝子をコードし、これを発現することができるプラスミドを含有しないが、ＨＲプラスミドを含有する操作された標的微生物の野生型親ファージでの感染によって達成され、親ファージの遺伝子は、インジケーター遺伝子による親ファージの少なくとも一部の置換えによって変更され、一方、細菌に感染または同時感染する野生型親ファージは、前記遺伝子をトランスに提供し、繁殖欠損ファージにおける失われたまたは変更された遺伝子を補完する。
一部の実施形態では、繁殖欠損であり、かつインジケーター遺伝子の産物を発現することができる組換えファージの特定のクローンを単離するステップは、インジケーター遺伝子の発現を示すクローンを単離するための限界希釈アッセイを行うステップを含むことができる。組換えファージは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的なファージに由来する。組換えファージを調製する方法の一部の実施形態では、組換えファージは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに特異的なファージに由来する。組換えファージを調製する方法の一部の実施形態では、組換えファージは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的なファージに由来する。
本開示の例示的な実施形態は、試料における目的の微生物を検出する方法であって、試料を本開示の実施形態に係る組換えファージと共にインキュベートするステップと、インジケーター遺伝子の産物を検出するステップであって、インジケーター遺伝子の産物の陽性検出が、目的の微生物が試料中に存在することを指し示す、ステップとを含む方法である。試料における目的の微生物を検出する方法の一部の実施形態では、試料は、食物試料、環境試料、水試料または商業的試料であってよい。試料における目的の微生物を検出する方法の一部の実施形態では、本方法は、試料中のわずか１０、９、８、７、６、５、４、３、２個または単一の微生物を検出する。試料における目的の微生物を検出する方法の一部の実施形態では、目的の微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。試料における目的の微生物を検出する方法の一部の実施形態では、目的の微生物は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａである。
本開示の例示的な実施形態の中には、試料における目的の微生物を検出するためのキットであって、本開示の実施形態に係る組換えファージと、インジケーター遺伝子の産物と反応させて、インジケーター遺伝子の産物を検出するための基質とを含むキットも含まれる。本開示の例示的な実施形態の中には、目的の微生物を検出するためのシステムであって、請求項１に記載の組換えファージと、インジケーター遺伝子の産物を検出するための構成成分とを含むシステムも含まれる。
本開示は、次の非限定的な図面を参照することにより、よりよく理解することができる。
図１は、親ファージへの繁殖欠損性およびインジケーター遺伝子の導入が１ステップ組換えプロセスにおいて達成される、組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための例示的な方法を概略的に説明する。
図２は、ファージ繁殖に要求される遺伝子を発現するプラスミドで形質転換され、繁殖欠損指標ファージに感染した、「許容的」微生物を概略的に説明する。
図３は、繁殖欠損指標ファージＣＢＡ１２０．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃを産生するための、ＣＢＡ１２０ Ｅ．ｃｏｌｉ特異的ファージの同時感染トランス補完による相同組換えを概略的に説明する。
図４は、定常期Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ ＡＴＣＣ ４３８８８におけるＣＢＡ１２０．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を説明する表である。
図５は、ｇｐ２２プロヘッド（prohead）足場タンパク質を発現するプラスミドで形質転換された操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７株（「許容的」Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７株）において行われた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な組換え繁殖欠損指標ファージの増殖を概略的に説明する。
図６は、繁殖欠損指標ファージの例示的な成長曲線を示し、それによると、ファージは、許容的Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７株における成長に成功した。
図７は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖欠損指標ファージを使用した戦略を概略的に説明する。
図８は、対数期のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７において行われた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖可能な指標ファージと比較した、繁殖欠損指標ファージを使用した検出アッセイの生のシグナル結果を説明する棒グラフである。
図９は、対数期のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７において行われた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖可能な指標ファージと比較した、繁殖欠損指標ファージを使用した検出アッセイのシグナル対バックグラウンド結果を説明する棒グラフである。
図１０は、定常期のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７において行われた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖可能な指標ファージと比較した、繁殖欠損指標ファージを使用した検出アッセイの生のシグナル結果を説明する棒グラフである。
図１１は、定常期のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７において行われた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖可能な指標ファージと比較した、繁殖欠損指標ファージを使用した検出アッセイのシグナル対バックグラウンド結果を説明する棒グラフである。
図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖欠損指標ファージの特異性決定の結果を説明する折れ線グラフである。
図１３は、繁殖欠損指標ファージＴＳＰ１．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃを産生するための、ＴＳＰ１ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的ファージの同時感染トランス補完による相同組換えを概略的に説明する。
図１４は、ｇｐ２２プロヘッド足場タンパク質を発現するプラスミドで形質転換された操作されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株（「許容的」Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株）において行われた、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な組換え繁殖欠損指標ファージの増殖を概略的に説明する。
図１５は、許容的Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａと比較した、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおける繁殖欠損指標ファージを使用した検出アッセイの生のシグナル結果を説明する棒グラフである。
図１６は、定常期Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １９５８５におけるＳＰ１．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を説明する表である。
図１７は、対数期Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １９５８５におけるＳＰ１．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を説明する表である。
図１８は、繁殖欠損指標ファージＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃを産生するための、ＳＥＡ１ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的ファージの同時感染トランス補完による相同組換えを概略的に説明する。
図１９は、ｇｐ８４ベースプレートウェッジ（baseplate wedge）タンパク質を発現するプラスミドで形質転換された操作されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株（「許容的」Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株）において行われた、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な組換え繁殖欠損指標ファージの増殖を概略的に説明する。
図２０は、許容的Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａと比較した、野生型ＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージを使用した検出アッセイの生のシグナル結果を説明する線グラフである。
図２１は、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株７００１、８３２６、１３０７６および２７８６９における、ＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージを使用した検出アッセイの生のシグナル結果を説明する線グラフである。
図２２は、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株７００１、８３２６、１３０７６および２７８６９におけるＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの複製のプラークアッセイを説明する棒グラフである。
図２３は、ＡｍｐＲ ｐＵＣ５７ ＳＥＡ１．トランスｇｐ８４で形質転換された対数期Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｅｗｐｏｒｔ ＡＴＣＣ ２７８６９におけるＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を説明する表である。
図２４は、定常期Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｌｏｒｅａｅｓｕｉｓ ＡＴＣＣ ７００１におけるＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を説明する表である。
図２５は、対数期Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｌｏｒｅａｅｓｕｉｓ ＡＴＣＣ ７００１におけるＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を説明する表である。
図２６Ａは、ウェル当たりのＳＥＡ１．ＮａｎｏＬｕｃ複製ファージおよびＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ非複製ＣＦＵの概数を説明する表である。図２６Ｂは、２時間感染後の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに特異的なＳＥＡ１．ＮａｎｏＬｕｃ複製ファージと比較した繁殖欠損指標ファージと比較した、複製ファージおよびＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃを使用した検出アッセイのＲＬＵシグナル結果を説明する表である。図２６Ｃは、４時間感染後の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに特異的なＳＥＡ１．ＮａｎｏＬｕｃ複製ファージと比較した繁殖欠損指標ファージと比較した、複製ファージおよびＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃを使用した検出アッセイのＲＬＵシグナル結果を説明する表である。
図２７は、繁殖欠損指標ファージを同定するための、一連の逐次感染および希釈ステップを使用した、組換え繁殖欠損指標ファージの単離を描写する。
図２８は、本開示のある実施形態に係る、ルシフェラーゼの検出により目的の微生物を検出するための、可溶性ルシフェラーゼをコードする組換え繁殖欠損指標ファージの使用を描写する。
図２９は、本開示のある実施形態に係る組換え繁殖欠損指標ファージを使用した、目的の微生物を検出するためのフィルタープレートアッセイを描写し、それによると、目的の微生物および組換え繁殖欠損指標ファージが、フィルタープレートにおいてインキュベートされ、インキュベーション培地を除去することなく、インジケータータンパク質が直接的に検出される。
図３０は、本開示のある実施形態に係る組換え繁殖欠損指標ファージを使用して目的の微生物を検出するための「濃縮なし（No Concentration）アッセイ」を描写する。
図３１は、本開示のある実施形態に係る組換え繁殖欠損指標ファージを使用して目的の微生物を検出するためのハイブリッドイムノ－ファージ（Hybrid Immuno-Phage）（ＨＩＰ）アッセイを描写し、それによると、組換え繁殖欠損指標ファージとのインキュベーションに先立ち、目的の微生物に対する抗体を使用して、アッセイウェルの表面に微生物を捕捉する。
発明の詳細な説明
定義
本明細書に他に規定がなければ、本発明に関連して使用される科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によってそれ以外のことが要求されなければ、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびそれらの技法は、当技術分野で周知かつ一般的に使用される命名法および技法である。公知方法および技法は一般に、他に指し示されない限り、当技術分野で周知の、本明細書を通して記述されている様々な一般のおよびより特異的な参考文献に記載されている従来方法に従って行われる。酵素反応および精製技法は、当技術分野で一般的に達成される通り、または本明細書に記載されている通り、製造業者の明細書に従って行われる。本明細書に記載されている研究室手順および技法に関連して使用される命名法は、当技術分野で周知かつ一般的に使用される命名法である。
次の用語は、他に指し示されない限り、次の意味を有すると理解されるものとする：
本明細書で使用される場合、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、それ以外のことが特に言及されていない限り、１つまたは複数を指すことができる。
用語「または」の使用は、二者択一のみを指すまたは二者択一が相互排他的であると明確に指し示されない限り、「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、二者択一のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれよりも多くを意味することができる。
本出願を通して、用語「約」は、ある値が、当該値の決定に用いられるデバイス、方法についての固有の誤差変動、または試料間に存在する変動を含むことを指し示すように使用される。
用語「固体支持体」または「支持体」は、生体分子が結合され得る基材および／または表面を提供する構造体を意味する。例えば、固体支持体は、アッセイウェル（すなわち、マイクロタイタープレートまたはマルチウェルプレート等）であってよい、あるいは固体支持体は、フィルター、アレイ、またはビーズもしくは膜等の可動性支持体（例えば、フィルタープレートまたはラテラルフローストリップ）上の場所であってよい。
用語「結合剤」は、第２の（すなわち、異なる）目的の分子に特異的にかつ選択的に結合することができる分子を指す。相互作用は、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電もしくは疎水性相互作用の結果としての非共有結合性であってよい、あるいは共有結合性であってよい。用語「可溶性結合剤」は、固体支持体と会合（すなわち、共有結合または非共有結合により結合）していない結合剤を指す。
本明細書で使用される場合、用語「繁殖欠陥」または「繁殖欠損」または「複製欠陥」または「複製欠損」は、バクテリオファージが繁殖する能力の機能障害を指す。すなわち、繁殖欠陥バクテリオファージは、例えば、カプシドのアセンブリに必要とされるタンパク質が失われたことが原因で、新たなバクテリオファージ粒子を生成することができない可能性がある。バクテリオファージゲノムにおける種々の欠失、挿入または置換は、バクテリオファージを繁殖欠陥にすることができる。
本明細書で使用される場合、「分析物」は、測定されている分子、化合物または細胞を指す。目的の分析物は、ある特定の実施形態では、結合剤と相互作用することができる。本明細書に記載されている通り、用語「分析物」は、目的のタンパク質またはペプチドを指すことができる。分析物は、アゴニスト、アンタゴニストまたはモジュレーターであってよい。あるいは、分析物は、生物学的効果がない場合がある。分析物は、小分子、糖、オリゴ糖、脂質、ペプチド、ペプチドミメティック（peptidomimetic）、有機化合物その他を含むことができる。
用語「検出可能な部分」または「検出可能な生体分子」または「レポーター」または「インジケーター」または「インジケーター部分」は、定量的アッセイにおいて測定され得る、分子、または分子（酵素等）によって産生される化合物を指す。例えば、インジケーターまたはインジケーター部分は、基質から測定され得る産物への変換に使用され得る酵素を含むことができる。インジケーターまたはインジケーター部分は、生物発光放射を生成する反応を触媒する酵素（例えば、ルシフェラーゼ）であってよい。あるいは、インジケーターまたはインジケーター部分は、定量化され得る放射性同位元素であってよい。あるいは、インジケーター部分は、フルオロフォアであってよい。あるいは、他の検出可能な分子を使用することができる。用語「インジケーター遺伝子」は、タンパク質、例えば、酵素等のインジケーターをコードする遺伝子を指すように使用される。
本明細書で使用される場合、「ファージ」は、生きている細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物、酵母および他の顕微鏡レベルの生きている生物に侵入することができる複数のウイルスのうち１種または複数を含む。本開示では、用語「ファージ」および関連用語は、細菌および古細菌に侵入することができるバクテリオファージ、マイコバクテリア（結核の原因因子を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ群のマイコバクテリア、および結核の原因因子を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｓ群のマイコバクテリアを含む、細菌の科）に侵入することができるマイコバクテリオファージ、真菌に侵入することができるマイコファージ（mycophage）、マイコプラズマファージ、ならびに原生動物、酵母および他の顕微鏡レベルの生きている生物に感染することができるウイルス等、ウイルスを含む。ここで、「顕微鏡レベルの（microscopic）」は、最大寸法が、１ミリメートルまたはそれ未満であることを意味する。バクテリオファージは、自身を複製する手段として細菌、マイコバクテリアまたは古細菌を使用するように自然界で進化したウイルスである。自然界で、ファージは、自身を微生物に付着させ、そのＤＮＡ（またはＲＮＡ）をこの微生物の中に注入し、次いで、ファージを数百またはさらには数千倍に複製するように微生物を誘導することができる。これは、ファージ増幅と称される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのよく研究されているファージは、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７およびラムダを含む；ＡＴＣＣコレクションで入手できる他のＥ．ｃｏｌｉファージは、例えば、ｐｈｉＸ１７４、Ｓ１３、Ｏｘ６、ＭＳ２、ｐｈｉＶ１、ｆｄ、ＰＲ７７２およびＺＩＫ１を含む。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージは、ＴＳＰ１、ＴＳＰ１１、ＳＰＮ１Ｓ、１０、イプシロン１５、ＳＥＡ１、ＴＳＰ１およびＰ２２を含む。Ｌｉｓｔｅｒｉａファージは、Ｐ１００、ＬＭＡ８、ＬＭＡ４、ＬＰＥＳ１、ＬｉｐＺ５、Ｐ４０、ｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、Ｐ７０、Ｐ１００、ＬＰ－ＪＳ３、ＬＰ－ＥＳ１およびＡ５１１を含む。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージは、ｓｔａｐｈファージＩＳＰ、Ｐ４Ｗ、ウイルスＫ、Ｔｗｏｒｔ、ｐｈｉ１１、１８７、Ｐ６８およびｐｈｉＷＭＹを含む。
本明細書で使用される場合、「後期遺伝子領域」は、ウイルス生活環の後期に転写されるウイルスゲノムの領域を指す。後期遺伝子領域は典型的に、最も豊富に発現される遺伝子（例えば、バクテリオファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質）を含む。バクテリオファージの後期遺伝子は、クラスＩＩＩ遺伝子と同義であり、構造およびアセンブリ機能を有する遺伝子を含む。例えば、後期遺伝子（クラスＩＩＩと同義）は、ファージＴ７において、例えば、感染８分後から溶解までに、クラスＩ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）は、初期に４～８分後に、クラスＩＩは、６～１５分後に転写されるため、ＩＩおよびＩＩＩのタイミングには重複が見られる。後期プロモーターは、斯かる後期遺伝子領域に天然に配置された、活性があるプロモーターである。
本明細書で使用される場合、「富化のための培養」は、微生物の増殖に都合がよい培地中のインキュベーション等、伝統的な培養を指すものであり、試料の液体構成成分を除去して、その中に含有される微生物を濃縮することによる富化、または微生物増殖の伝統的な促進を含まない他の形態の富化等、単語「富化」の他の可能な使用と混同されるべきではない。ある期間にわたる富化のための培養は、本明細書に記載されている方法の一部の実施形態において用いることができる。
本明細書で使用される場合、「組換え」は、この操作を行わなければ見出されることがないであろう、遺伝材料を１つにまとめるために研究室において通常行われる、遺伝的（すなわち、核酸）改変を指す。この用語は、本明細書において用語「改変された」と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「ＲＬＵ」は、ルミノメーター（例えば、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６）または光を検出する同様の機器によって測定される相対的光単位を指す。例えば、ルシフェラーゼおよび適切な基質（例えば、ＮａｎｏＧｌｏによるＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標））の間の反応の検出は、多くの場合、検出されたＲＬＵで報告される。
概説
検査試料（例えば、生体、食物、水および環境）中の細菌および古細菌等の目的の微生物の検出のための驚くべき感度を示す組成物、方法およびシステムが本明細書に開示されている。目的の微生物の一部の非限定的な例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ等）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの他の志賀毒素およびエンテロトキシン産生株等）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ等）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．である。検出は、富化のための培養なしで行われるアッセイにおいて遺伝子改変されたファージを使用して以前に可能と考えられていたよりも短い時間枠で、または一部の実施形態では、微生物が潜在的に増えることができる最小のインキュベーション時間で達成することができる。同様に驚くべきことに、検査試料とのインキュベーションのための、潜在的に高い感染多重度（ＭＯＩ）または高濃度のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の使用に成功した。斯かる高いファージ濃度（ＰＦＵ／ｍＬ）は、「外からの溶菌（lysis from without）」を引き起こすと言われていたため、細菌検出アッセイにおいて有害であると以前に言われていた。しかし、高濃度のファージは、少数の標的細胞を見出し、結合し、感染することを容易にすることができる。
本発明の組成物、方法、システムおよびキットは、目的の微生物の検出における使用のための組換えファージを含むことができる。ある特定の実施形態では、本発明は、ファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を有する組換えファージを含む組成物を含むことができる。斯かる組換えファージは、「指標ファージ」と称される。ある特定の実施形態では、宿主微生物の感染後のインジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質産物の産生をもたらす。ある特定の実施形態では、インジケーター遺伝子は、バクテリオファージの後期遺伝子（すなわち、クラスＩＩＩ）領域に挿入することができる。本発明の実施形態に係る組換えバクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ７様等のポドウイルス、Ｔ４、Ｔ４様等のマイオウイルス、Ｔ５、Ｐ７０、Ｓａｋａ６等のシホウイルス、および関連ファージ、ＶｉＩ、ＶｉＩ様（またはＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩによるＶｉ１ウイルス）、Ｓａｋａ２もしくはＳａｋａ４等のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ特異的バクテリオファージ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＰＮ１Ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージ１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージイプシロン１５、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＥＡ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳｐｎ１ｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＰ２２、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬｉｐＺ５、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ４０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ７０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＡ５１１、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＰ４Ｗ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＫ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＴｗｏｒｔ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＳＡ９７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ファージＣＢＡ１２０、または別の野生型のもしくは操作されたバクテリオファージに由来することができる。
本発明の実施形態に係る指標ファージは、繁殖欠損であり、これは、検出されている目的の微生物に感染した後に効率的に繁殖することができないまたは全く繁殖することができないことを意味する。本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージは、適した遺伝子、例えば、ビリオンアセンブリに要求される後期遺伝子のうち１種または複数の変更が原因で、繁殖欠損にされる。一部の実施形態では、本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージは、インジケーター遺伝子の導入とは別々に、適した遺伝子に変異を導入することにより、繁殖欠損にされる。一部の他の実施形態では、本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージは、インジケーター遺伝子によって適した遺伝子の少なくとも一部を置き換えることにより、繁殖欠損にされる。本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージは、ファージ繁殖に必要とされる変異した遺伝子の産物を産生するように操作された宿主微生物において増殖または繁殖することができる。斯かる操作された微生物は、「許容的」と命名される。
繁殖欠損指標ファージは、以前に記載された指標ファージを上回るいくつかの利点を有する。繁殖欠損指標ファージは、繁殖のために特別な操作された微生物を要求するため、未経験のおよび／または訓練されていない提供者による、その生産および流通のための潜在力は限定される。傷んだおよび低品質の試薬の生産および流通は、診断法の分野において重大な問題である。指標ファージの生産および流通を、ある特定の資格を有し、ある特定の標準を満たす（例えば、公的認可プロセスにより）実体に限定することにより、繁殖欠損指標ファージの提供は、低品質のまたは傷んだ指標ファージが生産され診断オペレーターに流通されるリスクを低下させる。さらに、環境中に見出される宿主微生物において繁殖することができないことから、繁殖欠損指標ファージは、規定濃度および／または量の指標ファージを含有する標準化された診断試薬が、診断手順を行う前に宿主微生物によって汚染され、これにより、試薬中の指標ファージの濃度または量の検出されない増加、その帰結として、不正確な検出データが生じ得るリスクを排除する。この課題は、使用されている指標ファージの濃度または量が、検出されているシグナルの強度と相関する場合の定量的または半定量的検出において特に重要である。またさらに、診断プロセスの際に目的の微生物において繁殖できないことが原因で、本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージは、試料における目的の微生物のより正確な定量的または半定量的検出を可能にする。精度における改善は、検出プロセスを通して試料中に見出される繁殖欠損指標ファージの量を制御する能力に起因する。新たな生存可能指標ファージが、検出プロセスの際に生成されないため、最初に使用された繁殖欠損指標ファージのみが、感染後にインジケーター遺伝子産物を発現することができる。後期遺伝子に固有の高発現レベルが原因で、また、初期遺伝子の欠失が、多くの場合、ゲノム複製をもたらさず、各細胞におけるインジケーター遺伝子のコピー数を低下させるため、初期遺伝子と比較して、後期遺伝子の欠失および置換えは、インジケーター遺伝子の高発現を保証する。感染後の指標ファージの繁殖は、診断プロセスの際に産生されるインジケーターシグナルの量に著しい可変性を導入し得る。よって、本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージの使用は、定量的および半定量的検出のより容易な標準化をもたらし、検出結果の精度を改善する。
一部の態様では、本発明は、目的の微生物を検出するための方法を含む。本方法は、目的の微生物の検出のためのファージを使用することができる。よって、ある特定の実施形態では、本方法は、目的の微生物に感染する組換え繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートすることによる、試料における目的の微生物の検出を含むことができる。一部の実施形態では、組換え繁殖欠損指標ファージは、バクテリオファージである。インジケーター遺伝子は、ある特定の実施形態では、宿主微生物の感染後にインジケーター遺伝子の発現がインジケーター遺伝子産物の産生をもたらすように、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入することができる。本方法は、インジケーター遺伝子産物を検出するステップであって、インジケーター遺伝子産物の陽性検出が、目的の微生物が試料中に存在することを指し示す、ステップを含むことができる。一部の実施形態では、インジケーター遺伝子産物は、タンパク質である。一部の実施形態では、インジケーター遺伝子産物は、可溶性タンパク質である。
ある特定の実施形態では、本発明は、システムを含むことができる。本システムは、本発明の組成物の少なくとも一部を含有することができる。また、本システムは、本方法を行うための構成成分の少なくとも一部を含むことができる。ある特定の実施形態では、本システムは、キットとして処方される。よって、ある特定の実施形態では、本発明は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのシステムであって、繁殖欠損指標ファージがインジケーター遺伝子を含む、目的の微生物に特異的な繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするための構成成分と、インジケーターを検出するための構成成分とを含むシステムを含むことができる。さらに他の実施形態では、本発明は、本方法またはシステムによる使用のためのソフトウェアを含む。
本発明の一部の実施形態は、細菌の存在を指し示す検出可能なシグナルを増幅するためのバクテリオファージに基づく方法を使用することにより、微生物検出の分野における必要を解決する。ある特定の実施形態では、ほんの１個の細菌が検出される。本明細書に適用される原理は、種々の微生物の検出に適用することができる。微生物の表面におけるファージに対する多数の結合部位、およびコードされたインジケーターの高レベル発現の潜在力のため、インジケーターは、微生物それ自体よりも容易に検出可能であり得る。このようにして、本発明の実施形態は、単一の感染細胞からであっても膨大なシグナル増幅を達成することができる。
本明細書に開示および記載されている本発明の一部の実施形態は、単一の微生物が、本発明の実施形態に係る複数の組換え繁殖欠損指標ファージに結合することができるという事実を利用する。組換え繁殖欠損指標ファージによる感染後に、これは、組換え繁殖欠損指標ファージによってコードされ、微生物において発現されるインジケーターにより検出される。この原理は、微生物表面受容体の特異的認識に基づく、１個または数個の細胞からのインジケーターシグナルの増幅を可能にする。例えば、単一の細菌細胞であっても、複数の繁殖欠損指標ファージに曝露し、その後、コードされたインジケーター遺伝子産物を発現させることにより、インジケーターシグナルは、目的の微生物が高い感度で検出可能となるように増幅される。例えば、試料中に存在する単一の細菌は、本発明の実施形態を使用して検出可能であり得る。本発明の実施形態は、試料中の特異的微生物を検出および／または定量化する仕方として、特定の微生物に結合することができるファージの高い特異性を利用する。一部の実施形態では、本発明は、繁殖欠損指標ファージの高い特異性を利用する。
本発明の方法およびシステムの実施形態は、食物、水および商業的試料からの病原体の検出を含むがこれらに限定されない、種々の状況における種々の微生物（細菌および古細菌等が挙げられるがこれらに限定されない）の検出および定量化に適用することができる。本発明の方法は、高い検出感度および特異性ならびに迅速な検出を提供する。
試料
本発明の組成物、方法、キットおよびシステムの実施形態のそれぞれは、試料における目的の微生物の迅速な検出および／または定量化を可能にする。例えば、本発明の実施形態に係る方法は、優れた結果を伴いつつ短縮された期間で行うことができる。
本発明の実施形態を使用して試料において検出可能な微生物は、食物または水媒介性病原体である細菌を含むがこれに限定されない。本発明によって検出可能な細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ等）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの他の志賀毒素およびエンテロトキシン産生株等）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ等）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．を含むがこれらに限定されない。
試料は、環境試料、食物試料または水試料であってよいが、これらに限定されない。一部の実施形態は、医学的または獣医学的試料を含むことができる。試料は、液体、固体または半固体であってよい。試料は、固体表面のスワブであってよい。試料は、水試料、または空気試料から得たフィルター、またはサイクロン集塵器（cyclone collector）から得たエアロゾル試料等、環境材料を含むことができる。試料は、魚、牛肉、豚肉もしくはラム肉等の肉（meet）、家禽（poultry）、加工食品、ピーナッツバター、乳児用調製粉乳(powdered infant formula)、粉ミルク、茶、デンプン、卵、ミルク、チーズまたは他の乳製品の試料であってよい。医学的または獣医学的試料は、血液、痰、脳脊髄液、糞便試料および灌注洗浄物を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、灌注は、生体試料の収集に使用される。灌注は、開放創または植え込まれた装具の全体にわたり溶液（例えば、生理食塩水）を流すことである。よって、一部の実施形態では、生体試料は、創傷洗浄剤または装具洗浄剤である。一部の実施形態では、試料は、異なる型のスワブであってよい。
一部の実施形態では、試料は、調製、濃縮または希釈なしで、本発明の実施形態に係る検出方法において直接的に使用することができる。例えば、ミルクおよびジュースを含むがこれらに限定されない、液体試料は、直接的にアッセイすることができる。他の実施形態では、試料は、緩衝溶液または細菌培養培地を含むことができるがこれらに限定されない溶液に希釈または懸濁することができる。固体または半固体である試料は、固体を液体中で刻む、混合するまたは液浸軟化することにより、液体に懸濁することができる。一部の実施形態では、試料は、宿主細菌細胞への組換えバクテリオファージ付着を促進するｐＨ範囲内に維持されるべきである。一部の実施形態では、好まれるｐＨ範囲は、細菌細胞に付着するバクテリオファージに適した範囲であってよい。試料はまた、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋およびＫ＋を含むがこれらに限定されない、適切な濃度の二価および一価カチオンを含有するべきである。
一部の実施形態では、試料は、試料中に存在するいずれかの病原体細胞の生存度を維持する温度で維持される。バクテリオファージが細菌細胞に付着しているステップにおいて、試料は、バクテリオファージ活性を容易にする温度で維持することができる。斯かる温度は、少なくとも約２５℃かつ約４５℃以下である。一部の実施形態では、試料は、約３７℃で維持される。一部の実施形態では、試料は、組換えバクテリオファージ結合または感染において、穏やかな混合または振盪に供される。
本発明の実施形態は、様々な適切な対照試料を利用することができる。例えば、ファージを含有しない対照試料または目的の微生物なしでファージを含有する対照試料は、バックグラウンドシグナルレベルのための対照としてアッセイすることができる。
繁殖欠損指標ファージ
本明細書においてより詳細に記載されている通り、本発明の実施形態に係る組成物、方法、システムおよびキットは、病原性微生物の検出における使用のための繁殖欠損指標ファージを含むことができる。ある特定の実施形態では、本発明は、インジケーター遺伝子を含み、ファージを繁殖欠損にするための遺伝子改変（単数または複数）を有する組換え繁殖欠損指標バクテリオファージを含む。上述の遺伝子改変は、１回の遺伝子改変ステップにおいてまたは複数回の遺伝子改変ステップ（２回またはそれよりも多い遺伝子改変ステップ等）において導入することができる。一部の実施形態では、本発明は、繁殖欠損指標ファージを含む組成物を含むことができる。
組換え繁殖欠損指標ファージは、レポーターまたはインジケーター遺伝子を含むことができる。感染因子のある特定の実施形態では、インジケーター遺伝子は、融合タンパク質をコードしない。例えば、ある特定の実施形態では、細菌等の宿主微生物の感染後のインジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質産物をもたらす。ある特定の実施形態では、インジケーター遺伝子は、繁殖欠損指標ファージの後期遺伝子領域に挿入することができる。後期遺伝子は、構造タンパク質をコードするため、一般に、他のファージ遺伝子よりも高いレベルで発現される。
本発明の実施形態に係る組換え繁殖欠損指標ファージは、組換えファージを宿主生物感染後に繁殖できないようにする変更を含む。適した遺伝子および変更は、多数の検討事項に従って選択される。変更に適したファージ遺伝子は、感染後に宿主微生物において繁殖するファージ能力に影響を与えるが、宿主微生物に感染する組換え繁殖欠損ファージの能力には影響を与えない遺伝子である。一部の実施形態では、組換えファージを繁殖欠損にするために変更されるべき遺伝子は、ファージのゲノム複製に要求されないように選ばれる。このことは、組換えファージゲノムが、典型的高コピー数まで複製され、高コピー数のインジケーター遺伝子をもたらすことを確実にする。初期および最初期遺伝子は多くの場合、ファージのゲノム複製に要求される遺伝子のカテゴリーに納まる。初期および最初期遺伝子（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）は、組換えファージにおけるインジケーター遺伝子等、後期遺伝子プロモーターによって制御される遺伝子の発現に要求される場合もある。したがって、クラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子としても公知の最初期および初期遺伝子は、変更に適さない場合もある。一部の実施形態では、組換えファージを繁殖欠損にするために変更されるべき遺伝子は、成熟ファージビリオン産生に要求されるため選ばれる。例えば、変更または欠失に適した遺伝子は、ビリオンアセンブリに要求される遺伝子等、構造的に重要な遺伝子であってよい。一部の実施形態では、成熟ファージビリオン産生に要求されるが高コピー数で発現されない後期遺伝子である、組換えファージを繁殖欠損にするために変更されるべき遺伝子が選ばれる。一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、２種以上の（すなわち、１種または複数の）変更された遺伝子を含むことができる。組換えファージを繁殖欠損にするための変更または欠失に適する可能性がある遺伝子の一部の例を次に示す：バクテリオファージＴ４および関連ファージならびにＴ４ウイルス（例えば、ＳＥＡ１、Ｓａｋａ４およびＴＳＰ１２ファージ）ならびに近縁のＶｉｕ様ウイルス（Viulikevirus）（例えば、ＣＢＡ１２０、ＴＳＰ１ファージ）において、変更に適する可能性がある遺伝子の一部は、頭部完成（head completion）タンパク質をコードするｇｐ４；ポータル頂点（portal vertex）タンパク質をコードするｇｐ２０；プロヘッドコア足場タンパク質およびプロテアーゼをコードするｇｐ２１；プロヘッド足場タンパク質をコードするｇｐ２２；ベースプレートウェッジサブユニットをコードするｇｐ２５；ベースプレートハブサブユニットをコードするｇｐ２６；ベースプレートウェッジ構成成分をコードするｇｐ５３；ベースプレート・尾管（tail tube）イニシエータをコードするｇｐ５４である。ポドウイルス（podavirus）（Ｔ７、ＭＰ８７ファージ）において、変更に適する可能性がある遺伝子の一部は、ビリオンタンパク質をコードするｇｐ６．７；尾部タンパク質をコードするｇｐ７．３；頭部・尾部コネクタタンパク質をコードするｇｐ８；足場タンパク質をコードするｇｐ９；ｇｐ１３である。シホウイルス（Ｔ５、Ｐ７０関連ファージ）において、変更に適する可能性がある遺伝子の一部は、プロヘッドプロテアーゼをコードするＧｐ１５０およびポータルタンパク質をコードするｇｐ１５２である。上述のリストが非限定的であり、他の遺伝子が種々のファージにおいて変更され得ることを理解されたい。
一部の実施形態では、本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージは、適した遺伝子に変異を含む。斯かる変異は、アンバー変異、オーカー変異、塩基置換、欠失もしくは挿入、または上述の型の変異のいずれかの組合せであってよい。変異またはそれらの組合せは、変更のために選ばれた遺伝子を、コードされたタンパク質構造を変更することにより機能障害性にし、変更されている遺伝子の転写または発現を抑制し（例えば、プロモーターの変化により）、転写または発現の中途終止等を引き起こすことができる。一部の他の実施形態では、繁殖欠損指標ファージにおいて、適した遺伝子は、適した遺伝子の少なくとも一部をインジケーター遺伝子によって置き換えることにより変更される。結果として、組換えファージは、繁殖欠損になり、インジケーター遺伝子配列を取り込む。一部の実施形態では、適した遺伝子における１種または複数の変異の復帰変異または抑制および繁殖適格性への組換えファージの回復を回避するために、適した遺伝子に１種または複数の変異を導入するよりもむしろ、ファージにおける適した遺伝子の少なくとも一部を、インジケーター遺伝子によって置き換えることが好ましいことがある。
一部の実施形態では、繁殖欠損指標バクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ７様等のポドウイルス、Ｔ４、Ｔ４様等のマイオウイルス、ＶｉＩ、ＶｉＩ様（またはＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩによるＶｉ１ウイルス）、Ｓａｋａ２もしくはＳａｋａ４等のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ特異的バクテリオファージ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＰＮ１Ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージ１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージイプシロン１５、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＥＡ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳｐｎ１ｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＰ２２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＴＳＰ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＴＳＰ１１、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬｉｐＺ５、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ４０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ７０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＡ５１１、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬＭＡ４、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬＭＡ８、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬＰＥＳ１、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬＰＪＰ１、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＰ４Ｗ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＫ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＴｗｏｒｔ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＳＡ９７、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＩＳＰ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ファージＣＢＡ１２０、または別の野生型のもしくは操作されたバクテリオファージに由来することができる。一部の実施形態では、指標バクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ７様等のポドウイルス、Ｔ４、Ｔ４様等のマイオウイルス、ＶｉＩ、ＶｉＩ様（またはＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩによるＶｉ１ウイルス）、Ｓａｋａ２もしくはＳａｋａ４等のＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ特異的バクテリオファージ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＰＮ１Ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージ１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージイプシロン１５、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＥＡ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳｐｎ１ｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＰ２２、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬｉｐＺ５、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ４０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ７０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＡ５１１、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＰ４Ｗ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＫ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＴｗｏｒｔ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＳＡ９７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ファージＣＢＡ１２０、または別の野生型のもしくは操作されたバクテリオファージに由来し得るゲノムに対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％相同性を有するゲノムを有するバクテリオファージに由来する。一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、特定の微生物に高度に特異的なファージに由来する。例えば、繁殖欠損指標バクテリオファージは、ある特定の環境中に見出される細菌に特異的な環境に由来するバクテリオファージから調製することができる。
繁殖欠損指標ファージに挿入されるべきインジケーター遺伝子の選択は、種々の検討事項によって導くことができる。例えば、大部分のファージは、その天然ゲノムよりも数パーセント大型のＤＮＡをパッケージすることができる。この検討事項から、より小型のインジケーター遺伝子は、バクテリオファージ、特に、より小型のゲノムを有するそれの改変のためのより適切な選択であってよい。ＯｐＬｕｃおよびＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）タンパク質は、わずか約２０ｋＤａ（コードするためにおよそ５００～６００ｂｐ）であり、一方、ＦＬｕｃは、約６２ｋＤａ（コードするためにおよそ１，７００ｂｐ）である。比較のため、Ｔ７のゲノムは、４０ｋｂｐ前後であり、一方、Ｔ４ゲノムは、約１７０ｋｂｐである。さらに、レポーター遺伝子は、細菌によって内在性に発現されるべきではなく（すなわち、細菌ゲノムの一部ではない）、高いシグナル対バックグラウンド比を生成するべきであり、時宜を得た様式で容易に検出可能となるべきである。ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）によるＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、改変されたＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（深海エビ）ルシフェラーゼである。一部の実施形態では、ＮａｎｏＧｌｏ（同様にＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）による）、イミダゾピラジノン基質（フリマジン（ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅ））と組み合わせたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、低いバックグラウンドで頑強なシグナルを提供することができる。一部の実施形態では、２種以上のインジケーター遺伝子を繁殖欠損ファージに挿入することができる。例えば、２コピー以上（２コピー等）の同じインジケーター遺伝子を挿入することができ、これにより、繁殖欠損指標ファージを使用したアッセイのシグナル強度および／またはシグナル対ノイズ比を改善することができる。別の例では、２種の異なるインジケーター遺伝子等、異なるインジケーター遺伝子を挿入することができ、これにより、二峰性シグナル検出が可能であり得る。例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子と共に挿入することができる、またはＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ等、異なるルシフェラーゼをコードする遺伝子と共に挿入することができる。
インジケーター遺伝子は、種々の生体分子をコードすることができる、またはそれ自体が検出可能な生体分子であってよい。例えば、インジケーター遺伝子は、検出可能なポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる。別の例では、インジケーター遺伝子は、検出可能な産物または検出可能な産物を産生する酵素を発現する遺伝子であってよい。さらに１つの例では、インジケーター遺伝子は、検出可能な核酸をコードすることができる、または検出可能な核酸を含むことができる。例えば、インジケーター遺伝子は、ＲＮＡ Ｍａｎｇｏ等、検出可能なアプタマーをコードすることができる、またはインジケーター遺伝子は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）により検出可能な核酸配列を含有することができる。一部の実施形態では、インジケーター遺伝子の産物は、検出可能な酵素であってよい。インジケーター遺伝子産物は、光を生じることができる、および／または色の変化によって検出可能であり得る。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）等、様々な適切な酵素が市販されている。一部の実施形態では、これらの酵素は、インジケーター部分として機能することができる。例えば、一部の実施形態では、インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素をコードする。様々な型のルシフェラーゼを使用することができる。ルシフェラーゼは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたは操作されたルシフェラーゼのうち１種であってよい。一部の実施形態では、ホタルルシフェラーゼがインジケーター部分である。一部の実施形態では、ルシフェラーゼ遺伝子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓに由来する。一部の実施形態では、インジケーター遺伝子は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）等、遺伝子改変されたルシフェラーゼ遺伝子である。他の操作されたルシフェラーゼまたは検出可能なシグナルを生成する他の酵素も、適切なインジケーター部分であってよい。
繁殖欠損指標バクテリオファージへの遺伝子改変は、核酸の小型断片、遺伝子の相当な部分または遺伝子全体の挿入、欠失または置換を含むことができる。一部の実施形態では、挿入または置換された核酸は、非ネイティブ配列を含む。例えば、非ネイティブインジケーター遺伝子は、バクテリオファージプロモーターの制御下に置かれるように、バクテリオファージゲノムに挿入することができる。非ネイティブインジケーター遺伝子は、後期ファージ遺伝子の配列の少なくとも一部に置き換わるように挿入することができ、インジケーター遺伝子の挿入は、その結果得られる組換えファージを繁殖欠損にする。インジケーター遺伝子の全３個の読み枠に停止コドンを含むことは、漏出発現としても公知のリードスルーを低下させることにより、発現増加に役立つことができる。この戦略は、ファージから分離することができないバックグラウンドシグナルとして顕在化するであろう、低レベルで作製される融合タンパク質の可能性を排除することもできる。よって、一部の実施形態では、非ネイティブインジケーター遺伝子は、融合タンパク質の一部ではない。すなわち、一部の実施形態では、遺伝子改変は、インジケータータンパク質産物が、ファージのポリペプチドを含まないように構成され得る。一部の実施形態では、本発明は、後期（クラスＩＩＩ）遺伝子領域に非バクテリオファージインジケーター遺伝子を含む遺伝子改変された繁殖欠損指標バクテリオファージを含む。一部の実施形態では、非ネイティブインジケーター遺伝子は、後期プロモーターの制御下にある。ウイルス後期遺伝子プロモーターを使用することは、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）が、ウイルスカプシドタンパク質のように高レベルで発現されるだけでなく、同様の内在性細菌遺伝子または初期バクテリオファージ遺伝子としてシャットダウンも行わないことを確実にする。一部の実施形態では、後期プロモーターは、Ｔ４、Ｔ７もしくはＶｉＩ様プロモーター、または野生型ファージにおいて見出されるものと同様の別のファージプロモーターである。
一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージによる感染後の目的の微生物における繁殖欠損指標ファージのインジケーター遺伝子の発現は、可溶性タンパク質産物の産生をもたらす。一部の実施形態では、非ネイティブインジケーター遺伝子は、構造ファージタンパク質をコードする遺伝子と近接しておらず、したがって、融合タンパク質を生じない。カプシドタンパク質への検出部分の融合体（融合タンパク質）を用いるシステムとは異なり、本発明の一部の実施形態は、可溶性インジケーターまたはレポーター（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）を発現する。一部の実施形態では、インジケーターまたはレポーターは理想的には、ファージ構造を含まない。すなわち、インジケーターまたはレポーターは、ファージ構造に付着していない。したがって、インジケーターまたはレポーターのための遺伝子は、繁殖欠損指標ファージのゲノムにおける他の遺伝子と融合されていない。このことは、本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージが使用される検出アッセイの感度を大幅に増加させ（感度は、試料中の単一の微生物の検出に至るまで増加し得る）、アッセイを単純化し、検出可能な融合タンパク質を産生する構築物により要求される追加的な精製ステップが原因の数時間とは反対に、一部の実施形態について２時間またはそれ未満でアッセイを完了させることができる。さらに、例えば、酵素活性部位のコンフォメーションまたは基質へのアクセスを変更し得るタンパク質フォールディング制約が原因で、融合タンパク質は、可溶性タンパク質よりも活性が低くなる場合がある。濃度が、試料１ｍＬあたり１０個の細菌細胞の場合、例えば、２時間未満が、アッセイに十分となり得る。
さらに、融合タンパク質は、定義によると、バクテリオファージにおけるタンパク質のサブユニットに付着した部分の数を限定する。例えば、融合タンパク質のためのプラットフォームとして機能するように設計された市販のシステムの使用は、各Ｔ７バクテリオファージ粒子における約４１５コピーの遺伝子１０Ｂカプシドタンパク質に対応する、約４１５コピーの融合部分をもたらすであろう。この制約なしで、感染した細菌は、バクテリオファージに適合し得るものよりもさらに多くのコピーの検出部分（例えば、ルシフェラーゼ）を発現することが予想され得る。
組換え繁殖欠損指標ファージの一部の実施形態では、後期プロモーター（クラスＩＩＩプロモーター、例えば、Ｔ７、Ｔ４、ＶｉＩまたはＳａｋａ由来等）は、インジケーター遺伝子の転写に使用される。斯かるより後期のプロモーターは、ファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質のための遺伝子を転写する、同じファージのＲＮＡポリメラーゼに対して高い親和性を有する。各ファージ粒子は、数ダースまたは数百コピーのこれらの分子を含むため、このようなタンパク質は、ファージによって作製される最も豊富なタンパク質である。ウイルス後期プロモーターの使用は、ルシフェラーゼ等のインジケーター遺伝子産物の最適に高レベルの発現を確実にすることができる。繁殖欠損指標ファージが由来する本来の野生型バクテリオファージに由来する、それに特異的な、またはその下で活性がある後期ウイルスプロモーター（例えば、Ｔ４、Ｔ７、ＶｉＩまたはＳａｋａに基づくシステムによるＴ４、Ｔ７、ＶｉＩまたはＳａｋａ後期プロモーター）の使用は、検出部分の最適な発現をさらに確実にすることができる。標準細菌（非ウイルス／非バクテリオファージ）プロモーターの使用は、一部の場合では、発現に有害となり得るが、その理由として、これらのプロモーターが、多くの場合、バクテリオファージ感染の際に下方調節されることが挙げられる（バクテリオファージが、ファージタンパク質産生のための細菌資源に優先順位を付けるために）。よって、一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、好ましくは、ファージ構造構成成分のサブユニットの数に発現を限定しないゲノムにおける設置を使用して、可溶性（遊離）インジケーター部分をコードしこれを高レベルで発現するように操作される。
一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、目的の微生物の検出のためのアッセイにおける使用のために望ましい形質を最適化するように設計される。一部の実施形態では、遺伝子改変のバイオインフォマティクスおよび以前の解析を用いて、望ましい形質を最適化する。例えば、一部の実施形態では、ファージ尾部タンパク質をコードする遺伝子は、特定の種の細菌を認識し、これに結合するように最適化することができる。他の実施形態では、ファージ尾部タンパク質をコードする遺伝子は、属全体の細菌または属内の種の特定の群を認識し、これに結合するように最適化することができる。このようにして、ファージは、病原体のより広いまたはより狭い群を検出するように最適化することができる。一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、レポーター遺伝子の発現を改善するように設計することができる。その上および／またはその代わりに、一部の例では、繁殖欠損指標ファージは、検出を改善するためにファージのバーストサイズを増加させるように設計することができる。感染後に増加したコピー数のファージゲノムを産生するように、または後期遺伝子の発現レベルを増加させるように設計された繁殖欠損指標ファージの設計は、増加したバーストサイズをもたらすであろう。
一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージの安定性は、有効期間を改善するように最適化することができる。例えば、その後のファージ安定性を増加させるために、エンザイバイオティック（enzybiotic）溶解度を増加させることができる。その上および／またはその代わりに、繁殖欠損指標ファージの熱安定性を最適化することができる。熱安定性ファージは、貯蔵中の機能的活性をよりよく保存し、これにより、有効期間を増加させる。よって、一部の実施形態では、熱安定性および／またはｐＨ耐性を最適化することができる。
本発明の組成物は、１種または複数の繁殖欠損指標バクテリオファージおよび１種または複数のインジケーター遺伝子を含むことができる。一部の実施形態では、組成物は、異なる目的の微生物に特異的な異なる繁殖欠損指標ファージのカクテルを含むことができる。斯かるカクテルは、複数の目的の微生物の同時検出に使用することができる。一部の実施形態では、組成物は、同じまたは異なるインジケータータンパク質をコードしこれを発現することができる異なる繁殖欠損指標ファージのカクテルを含むことができる。一部の実施形態では、繁殖欠損バクテリオファージのカクテルは、少なくとも２種の異なる型の繁殖欠損指標バクテリオファージを含む。
繁殖欠損指標バクテリオファージを調製（作製）する方法
本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージを作製するための方法の実施形態は、遺伝子改変のための親ファージの選択から始まることができる。例えば、一部のバクテリオファージは、標的微生物に高度に特異的であり、これは、特定の株または血清型の標的微生物に対する特異性を含むことができる。これは、高度に特異的な検出のための機会を提示する。親ファージは、いずれかの環境中に見出される野生型ファージまたは操作されたファージであってよい。本発明の実施形態に係る方法は、シグナルを増幅し、これにより、試料中に存在する低レベルの微生物（一部の場合では、単一の微生物に至るまでの）を検出する手段として、特定の目的の微生物を認識しこれに結合するバクテリオファージに関連する結合の高い特異性を利用する。例えば、バクテリオファージは、特定の微生物の表面受容体を特異的に認識し、よって、このような微生物に特異的に感染する。したがって、バクテリオファージは、目的の微生物の標的化に適切である。本発明の一部の実施形態は、目的の目的の微生物に感染しその検出を容易にするための迅速なかつ高感度の標的化のために、指標バクテリオファージの結合の特異性および高レベル遺伝的発現能力を利用する。したがって、組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態は、目的の標的微生物に特異的に感染する親ファージを選択することに関連するステップを含むことができる。
組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態は、親ファージの遺伝子を変更して、組換え繁殖欠損ファージを生成するステップ（単数または複数）を含む。例えば、一部の実施形態は、親ファージを繁殖欠損にするために、適した遺伝子に１個または複数の変異を導入するステップ（単数または複数）を含むことができる。斯かる適した遺伝子および変異は、本文書の他の箇所に記載されている。
組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態は、親ファージの遺伝子を変更して、組換え繁殖欠損ファージを生成するステップを含む。繁殖のために、繁殖欠損ファージは、ファージを繁殖欠損にするために変更された遺伝子の産物を発現することができる、ファージの宿主微生物（細菌等）の操作された株を要求する。斯かる操作された株は、「許容的」と命名することができる。したがって、組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態は、宿主微生物の斯かる許容的な操作された株を生成するステップを含むことができる。組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態は、宿主微生物の許容的な操作された株を繁殖欠損指標ファージに感染させるステップを含むことができる。組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態は、インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド／ベクターを調製するステップを含むことができる。組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態は、繁殖欠損指標ファージに感染した許容的な操作された宿主微生物へと相同組換えプラスミド／ベクターを形質転換するステップを含むことができる。組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の他の実施形態は、許容的な操作された宿主微生物へと相同組換えプラスミド／ベクターを形質転換するステップと、その後、形質転換された許容的な操作された宿主微生物を繁殖欠損指標ファージに感染させるステップを含むことができる。一部の実施形態では、許容的な操作された宿主微生物の感染および許容的な操作された宿主微生物への相同組換えプラスミド／ベクターの形質転換は、同じステップにおいて達成することができる。他の実施形態では、許容的な操作された宿主微生物の感染および許容的な操作された宿主微生物への相同組換えプラスミド／ベクターの形質転換は、２ステップまたは３以上のステップにおいて達成される。許容的な操作された宿主微生物が、繁殖欠損ファージおよび相同組換えプラスミド／ベクターを受容すると、プラスミド／ベクターおよびファージゲノムの間に相同組換えが生じる。次に、インジケーター遺伝子を含む組換え組換え欠損ファージ（繁殖欠損指標ファージ）を単離することができる。
一部の実施形態では、ファージを繁殖欠損にするために変更される親ファージの遺伝子は、インジケーター遺伝子による親ファージの少なくとも一部の置換えによって変更することができる。したがって、組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態は、これを繁殖欠損にするために親ファージにおける欠失に標的化された遺伝子の配列によって挟まれたインジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド／ベクターを調製するステップを含む。次に、相同組換えプラスミド／ベクターを、親ファージに感染した許容的な操作された宿主微生物へと形質転換し、これにより、プラスミド／ベクターおよび親ファージゲノムの間に相同組換えを生じさせることができる。組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の他の実施形態は、許容的な操作された宿主微生物へと相同組換えプラスミド／ベクターを形質転換するステップと、続いて、形質転換された許容的な操作された宿主生物を繁殖欠損指標ファージに感染させ、これにより、プラスミド／ベクターおよび親ファージゲノムの間に相同組換えを生じさせるステップを含むことができる。一部の実施形態では、許容的な操作された宿主微生物の感染および許容的な操作された宿主生物への相同組換えプラスミド／ベクターの形質転換は、同じステップにおいて達成し、これにより、プラスミド／ベクターおよび親ファージゲノムの間に相同組換えを生じさせることができる。次に、インジケーター遺伝子を含む組換え組換え欠損ファージ（繁殖欠損指標ファージ）を単離することができる。
組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態では、親ファージへの繁殖欠損性およびインジケーター遺伝子の導入は、１ステップ組換えプロセスにおいて達成される。斯かるプロセスのための組換え戦略は、図１に説明される。このような実施形態の利点は、繁殖欠損指標ファージを生成するためのプロセスの単純化である。斯かる実施形態の別の利点は、レポーター遺伝子が、繁殖欠損指標ファージの検出および単離の両方のために使用されることを可能にすることである。遺伝的変更が、インジケーター遺伝子を含む繁殖可能なファージ（繁殖可能な指標ファージ）において繁殖欠損性を付与するために導入される場合、繁殖欠損性変更を有するファージおよび有しないファージの両方が成長し、指標ファージのためのスクリーニングをより困難なものとする。
図３は、本発明の実施形態の１つに係る指標ファージの生成をもたらす、宿主微生物における相同組換え（ＨＲ）プラスミドおよび親ファージ（phase）ゲノムの間に生じる相同組換えプロセスを概略的に説明する。説明される相同組換えプロセスにおいて、ファージは、ＣＢＡ１２０ Ｅ．ｃｏｌｉファージであり、レポーター遺伝子は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）レポーター遺伝子である。したがって、宿主微生物は、説明される実施形態においてＥ．ｃｏｌｉである。図３が、例示的かつ非限定的であることが意図されること、また、他のファージ、対応する宿主生物およびレポーター遺伝子を使用することができることを理解されたい。一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージの産生のために環境から単離されたファージを利用することが好まれ得る。このようにして、天然に由来する微生物に特異的な繁殖欠損指標ファージを生成することができる。
相同組換えプラスミドを設計および調製するための様々な方法が公知である。熱ショック、Ｆ線毛媒介性細菌接合、電気穿孔および他の方法を含む、プラスミドで細菌を形質転換するための様々な方法が公知である。相同組換え後に特定のクローンを単離するための様々な方法も公知である。本明細書に記載されている実施形態の一部の方法は、特定の戦略を利用する。
繁殖欠損指標バクテリオファージを調製するための方法の一部の実施形態は、目的の標的微生物に特異的に感染する親ファージを選択するステップと、選択された親ファージのゲノムの後期領域における天然配列を決定するステップと、ゲノムをアノテートし、選択された親ファージの適した後期遺伝子を同定するステップであって、適した後期遺伝子の変更が、親ファージを繁殖欠損にすることが意図される、ステップと、主要後期遺伝子に隣接し、かつコドン最適化されたレポーター遺伝子を含む、相同組換えのための配列を設計するステップと、相同組換えのために設計された配列をプラスミド／ベクターに取り込むステップと、機能的な適した後期遺伝子をコードするプラスミドを含む標的微生物へとプラスミド／ベクターを形質転換するステップと、形質転換された標的微生物について選択するステップと、形質転換された微生物を選択された親ファージに感染させ、これにより、プラスミドおよびファージゲノムの間に相同組換えを生じさせるステップと、その結果得られる組換えファージライセートの力価を決定するステップと、限界希釈アッセイを行って、組換えファージを富化および単離するステップとを含むことができる。親ファージ画分を上回る繁殖欠損組換えファージ画分の富化は、トランスプラスミドを含有する許容的標的細胞において全体的にまたは部分的に行うことができる。一部の実施形態は、適宜組換えファージが混合物の検出可能な画分を表すまで必要とされる場合、第１の限界希釈アッセイの後に、限界希釈および力価測定（titer）ステップをさらに反復するステップを含む。例えば、一部の実施形態では、限界希釈および力価測定ステップは、組換えファージの特定のクローンを単離する前に、混合物中のファージの少なくとも１／３０が組換え体になるまで反復することができる。１：３０の組換え体：親の比は、一部の実施形態では、９６個のプラーク（例えば、９６ウェルプレートにおける）当たり平均３．２形質導入単位（ＴＵ）を生じると予想される。組換え体の親ファージに対する初期比は、米国特許出願第１５／４０９，２５８号に以前に記載された通り、ＴＣＩＤ５０（組織培養感染量５０％）に基づく限界希釈アッセイを行うことにより決定することができる。ポアソン分布によって、１：３０比は、９６ウェルのいずれかにおける少なくとも１ＴＵを観察する９６％の確率を生成する。
一部の実施形態は、インジケーター遺伝子の挿入に必要な相同組換えのための配列の設計（および必要に応じて調製）を含む。一部の実施形態では、相同組換え配列は、親ファージを繁殖欠損にするために、後期遺伝子に置き換わるように設計される。一部の実施形態では、インジケーター遺伝子の配列は、非翻訳領域が先行した、コドン最適化されたレポーター遺伝子を含む。非翻訳領域は、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含むことができる。一部の実施形態では、挿入された遺伝的構築物は、インジケーター遺伝子の発現を駆動するために、それ自体の外因性の専用のプロモーターをさらに含む。外因性プロモーターが、ファージゲノムにおけるいずれかの内在性プロモーターに加えて含まれる。ファージは、ポリシストロニックｍＲＮＡ転写物を産生するため、単一のプロモーターのみが、転写物における第１の遺伝子／シストロンの上流に要求される。従来の組換え構築物は、挿入された遺伝子を駆動するために、内在性ファージプロモーターのみを使用する。レポーター遺伝子およびリボソーム結合部位の上流への追加的なプロモーターの付加は、転写のための二次開始部位として作用することにより、遺伝子発現を増加させることができる。
プラスミドを調製するための多数の公知方法および商業的製品がある。例えば、ＰＣＲ、部位特異的変異誘発、制限酵素消化、ライゲーション、クローニングおよび他の技法を組み合わせて使用して、プラスミドを調製することができる。合成プラスミドを商業的に注文することもできる（例えば、ＧｅｎｅＷｉｚ）。コスミドを用いることもできる、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを使用して、バクテリオファージゲノムを選択的に編集することができる。指標バクテリオファージを調製する方法の一部の実施形態は、出発バクテリオファージゲノムと容易に組み換えて組換えゲノムを生成することができるプラスミドを設計するステップを含む。プラスミドの設計において、一部の実施形態は、ルシフェラーゼ遺伝子等のコドン最適化されたレポーター遺伝子の付加を含む。一部の実施形態は、上流非翻訳領域へのエレメントの付加をさらに含む。例えば、上流非翻訳領域は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）レポーター遺伝子の開始コドンをコードする配列の前に付加することができる。非翻訳領域は、Ｔ４、Ｔ４様、Ｔ７、Ｔ７様、ＶｉＩまたはＶｉＩ様プロモーター等、プロモーターを含むことができる。非翻訳領域は、細菌システムによる「シャイン・ダルガーノ配列」としても公知のリボソーム進入／結合部位（ＲＢＳ）を含むこともできる。これらのエレメントのいずれか一方もしくは両方、または他の非翻訳エレメントは、ファージゲノムの残りとほぼ同じＧＣ含量を含むランダム配列でできた短い上流非翻訳領域内に埋め込むことができる。ＡＴＧ配列は開始コドンとして作用することになるため、ランダム領域は、ＡＴＧ配列を含むべきではない。
本文書の他の箇所に記述される通り、本発明の実施形態に係る組換え繁殖欠損指標ファージの単離および増殖は、繁殖欠損指標ファージを繁殖欠損にするために変更された遺伝子（単数または複数）を発現する「許容的」宿主微生物のみにおいて行うことができる。斯かる「許容的」微生物、例えば、細菌は、ファージ繁殖に要求される遺伝子を発現するプラスミドでこれを形質転換することにより操作することができる。図２は、ファージ繁殖に要求される遺伝子を発現するプラスミドで形質転換され、また、繁殖欠損指標ファージに感染した斯かる「許容的」微生物の細胞を説明する。ファージ繁殖に要求される遺伝子を含有するプラスミドは、ファージゲノムへのインジケーター遺伝子の挿入に使用される相同組換えプラスミドと適合性となるように選ばれる。例えば、ファージ繁殖に要求される遺伝子を発現するプラスミドおよび相同組換えプラスミドは、両方のプラスミドが宿主生物において同時に維持され得るように、異なる抗生物質耐性マーカーを含有するように選ぶことができる。別の例では、ファージ繁殖に要求される遺伝子を発現するプラスミドおよび相同組換えプラスミドは、互いに干渉しないように、適合性複製起点を含有するように選ばれる。適合性プラスミドの例は、ｏｒｉ複製起点を使用したｐＵＣ由来プラスミド、およびＲＣＲ（ローリングサークル複製）複製起点を使用したｐＢＡＶ１ｋ－Ｔ５－ＧＦＰプラスミドである。繁殖欠損ファージは、繁殖するために宿主微生物の操作された「許容的」株を要求するため、組換え繁殖欠損指標ファージを調製するための方法の一部の実施形態は、これを繁殖欠損にするために繁殖欠損ファージにおいて変更される遺伝子の産物を発現することができる標的微生物の操作された株を生成するステップ（単数または複数）を含む。一部の実施形態では、標的微生物の操作された株を生成するステップは、標的微生物を、組換え繁殖欠損ファージにおいて変更される遺伝子（単数または複数）をコードし、これを発現することができるプラスミドで形質転換するステップを伴う。その代わりに、要求される遺伝子は、トランスポゾン、相同組換え、部位特異的組換え／組込みまたはその他による等、様々な他の方法によって標的微生物ゲノムに組み込むことができる。
図２７は、相同組換えに起因する親ファージおよび繁殖欠損指標ファージの混合物からの繁殖欠損組換えファージの単離のプロセスの例を概略的に説明する。第１のステップ（４０２）において、相同組換えプラスミドおよび要求されるファージ遺伝子を発現するプラスミドで形質転換された許容的宿主微生物は、親ファージに感染され、親対繁殖欠損指標ファージの非常に低い比の親および繁殖欠損組換え指標ファージの混合物を有する子孫ファージをもたらす（４３４）。その結果得られるファージミックスを希釈して（４０４）、９６ウェルプレート（４０６）に入れて、プレート当たり平均５の組換え形質導入単位（ＴＵ）を得る（９．３ＰＦＵ／ウェル）。次に、後述する通り、レポーター遺伝子活性について９６ウェルプレートをアッセイして、親ファージを含有するウェル（４４０）と比較して、繁殖欠損指標ファージを含有するウェル（４３６）を同定する。要求されるファージ遺伝子を発現するプラスミドを含有する許容的宿主微生物（４３８）を各ウェルに添加する（４０８）；例えば、宿主微生物が細菌である場合、各ウェルは、約５０μＬの混濁した細菌培養物を含有することができる。このことは、繁殖欠損指標ファージが、複製し、可溶性レポーター遺伝子産物（４４２）を産生することを可能にする。インキュベーションステップ（４１０）（例えば、３７℃で５時間のインキュベーション）の後に、ウェルを、レポーター遺伝子産物（４４２）の存在についてスクリーニングすることができる。いずれかの陽性ウェルは、単一の繁殖欠損指標ファージを播種された可能性があり、このステージにおいて、混合物は、本来の比を上回る富化である、およそ１０親ファージ：１組換え体の比を含有することができる。必要であれば（例えば、組換え体：総計の比が、１：３０よりも低い場合）、この集積培養物（４１２）の子孫を追加的な限界希釈アッセイ（複数可）に供して（４１４）、比を増加させ、組換え繁殖欠損指標ファージ形質導入単位の実際の濃度を決定することができる。例えば、比が、１：３８４の組換え体：ＰＦＵ（許容的細菌において行われたプラークアッセイによって決定されたＰＦＵによる）であった場合、約５の組換えＴＵを、９６ウェルプレート（４１６）当たり１９２０個の混入総ファージ（５×３８４＝１９２０）と共に、以前の陽性ウェルからアリコートに分け（４１４）、およそ、第２の希釈アッセイプレート（４２０）のウェル当たり２０個の大部分は親ファージである播種をもたらすことができる（１９２０ＰＦＵ／９６ウェル＝２０ＰＦＵ／ウェル）。いずれかの陽性ルシフェラーゼウェルは、１９個の親ファージと共に単一の組換え繁殖欠損指標ファージを播種された可能性がある。これらのウェルは、ルシフェラーゼの存在について解析することができる（４４２）。
宿主微生物の添加およびインキュベーション後に（４１８）、可溶性レポーター遺伝子産物およびファージは、およそ２０；１で存在する（４２０）。この比は、組換え体のためのＴＵ５０滴定、細胞死滅の代わりにレポーター遺伝子産物活性についてスコア付けする組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ５０）アッセイに基づく限界希釈アッセイ、および総ＰＦＵについてのプラークアッセイによって検証することができる。最後に、プラークアッセイを行って（４２２）、レポーター遺伝子産物を発現する組換え体についてスクリーニングすることができる（４４６）。少数の個々の（例えば、ｎ＝４８）プラークは、個々に採集し、第３のマルチウェルプレート（４２６）において、ルシフェラーゼ活性についてスクリーニングすることができる（４３６）。一部の実施形態では、このアプローチは、十分なプラークがスクリーニングされることを確実にするべきであるため、組換え体の総ファージに対する公知の比に基づき、約３個の指標バクテリオファージが、スクリーニングされているプラークのミックス中にある。プレートから１個のプラークを取り出し、９６ウェルプレートの各ウェルに入れることができ（４２４）、レポーター遺伝子産物アッセイを行って（４２６）、どのウェルが、レポーター遺伝子産物活性を呈示するファージを含有したかを決定することができる（４４２）。斯かる活性を示すウェル（４２８）は、純粋な組換え繁殖欠損指標ファージ（４３４）を表す一方、斯かる活性なしのウェル（４３０）は、純粋な親ファージ（４３２）を表す。次に、個々のプラークを緩衝液（例えば、１００μＬの緩衝液）または培地に懸濁し、アリコート（例えば、約５μＬ）を、宿主微生物培養物を含有するウェルに添加し、インキュベーション（例えば、３７℃で約４５分間～１時間）後にアッセイすることができる。陽性ウェルは、繁殖欠損指標ファージの純粋培養物を含有することが予想される。ある特定の実施形態は、追加的なラウンドのプラーク精製を含むことができる。よって、図２７によって説明される通り、親ファージゲノムとの組換えのために設計されたプラスミドの相同組換えによって生成された繁殖欠損指標ファージは、非常に低いパーセンテージ（例えば、０．００５％）の指標バクテリオファージを含む混合物から単離することができる。
単離後に、大規模産生を行って、本発明の実施形態に係る検出方法における使用に適切な高力価繁殖欠損指標ファージストックを得ることができる。繁殖欠損指標ファージストックの産生および調製は、細菌培養物における繁殖欠損指標バクテリオファージの産生の際に産生されたいずれかの遊離検出部分からの繁殖欠損指標バクテリオファージの精製を含むことができる。ショ糖密度勾配遠心分離、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーおよび透析または派生技術（Ａｍｉｃｏｎブランド濃縮器 － Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｎｃ．等）等、標準ファージ精製技法を用いて、本発明に係るファージの一部の実施形態を精製することができる。精製手順の結果として、繁殖欠損指標ファージストックは、産生の際に生成されるいかなるレポーター産物遺伝子も実質的に含まなくてよい。繁殖欠損指標ファージストックに存在する残渣インジケーター遺伝子産物の除去は、繁殖欠損指標ファージが試料における目的の微生物の検出に使用される場合に観察されるバックグラウンドシグナルを実質的に低下させることができる。
微生物を検出するために繁殖欠損指標ファージを使用する方法
本明細書に言及される通り、ある特定の実施形態では、本発明は、微生物を検出するために繁殖欠損指標ファージを使用する方法を含むことができる。本発明の実施形態に係る微生物を検出するために繁殖欠損指標ファージを使用する方法は、種々の仕方で具体化することができる。
一実施形態では、本発明は、試料における目的の微生物を検出するための方法であって、目的の微生物に感染する繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするステップであって、目的の微生物の感染後のインジケーター遺伝子の発現が、インジケーター遺伝子産物の産生をもたらすように、繁殖欠損指標ファージが、インジケーター遺伝子を含む、ステップと、インジケーター遺伝子産物を検出するステップであって、陽性検出（すなわち、インジケーター遺伝子産物の存在、量またはレベルの検出）が、目的の微生物が試料中に存在することを指し示す、ステップとを含む方法を含むことができる。さらに一実施形態では、本発明は、試料における目的の微生物を検出するための方法であって、目的の微生物に感染する繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするステップであって、目的の微生物の感染後のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケーター遺伝子産物の産生をもたらすように、繁殖欠損指標ファージが、インジケーター遺伝子を含む、ステップと、可溶性インジケーター遺伝子産物を検出するステップであって、陽性検出（すなわち、可溶性インジケーター遺伝子産物の存在、量またはレベルの検出）が、目的の微生物が試料中に存在することを指し示す、ステップとを含む方法を含むことができる。さらに一実施形態では、本発明は、試料における目的の微生物を検出するための方法であって、目的の微生物に感染する繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするステップであって、目的の微生物の感染後のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケーター遺伝子産物の産生をもたらすように、繁殖欠損指標ファージが、インジケーター遺伝子を含む、ステップと、可溶性インジケーター遺伝子産物を検出するステップであって、陽性検出（すなわち、可溶性インジケーター遺伝子産物タンパク質の存在、量またはレベルの検出）が、目的の微生物が試料中に存在することを指し示す、ステップとを含む方法を含むことができる。上述の実施形態の変形形態では、目的の微生物は、目的の細菌であってよい。例えば、例示的な実施形態では、本発明は、試料における目的の細菌を検出するための方法であって、目的の細菌に感染する繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするステップであって、目的の細菌の感染後のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケーター遺伝子産物の産生をもたらすように、繁殖欠損指標ファージが、インジケーター遺伝子を含む、ステップと、インジケーター遺伝子産物を検出するステップであって、インジケーター遺伝子産物の陽性検出が、目的の細菌が試料中に存在することを指し示す、ステップとを含む方法を含むことができる。
ある特定の実施形態では、目的の微生物を検出するために繁殖欠損指標ファージを使用する方法（斯かる方法は、「アッセイ」と称することができる）を行って、異なる試料の型またはサイズおよびアッセイ形式に適応するように改変され得る一般概念を利用することができる。本発明の繁殖欠損指標バクテリオファージ（すなわち、指標バクテリオファージ）を用いる実施形態は、試料の型、試料サイズおよびアッセイ形式に応じて、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５または２６．０時間を下回る総アッセイ時間で、特異的細菌株の迅速な検出を可能にすることができる。例えば、要求される時間量は、バクテリオファージの株およびアッセイにおいて検出されるべき細菌の株、検査されるべき試料の型およびサイズ、標的の生存度に要求される条件、物理的／化学的環境の複雑さ、ならびに「内在性」非標的細菌夾雑物の濃度に応じて、若干より短くまたはより長くなることができる。
図２８は、本発明の実施形態に係る可溶性ルシフェラーゼを産生する繁殖欠損指標ファージを使用する戦略を示す。本方法において、繁殖欠損指標ファージは、可溶性ルシフェラーゼを発現するように操作することができる。ルシフェラーゼの発現は、ウイルスカプシドプロモーター（例えば、バクテリオファージＴ７またはＴ４後期プロモーター）によって駆動され、高発現を生じる。図２８において説明される実施形態では、検出されるべき微生物（５０２）を含む試料（５００）の少なくとも一部が、スピンカラムフィルターに置かれ、遠心分離されて過剰な液体を除去し、可溶性ルシフェラーゼ（５０３）を発現するように遺伝子操作された適切な多重度の繁殖欠損指標ファージ（５０４）が添加される。感染した細胞は、感染が生じるのに十分な時間インキュベートすることができる（例えば、３７℃で３０～２４０分間）。一部の実施形態では、細胞溶解が生じ得る。他の実施形態では、細胞は溶解しなくてよい。次に、ライセート中の繁殖欠損指標ファージ（５０４）および遊離ルシフェラーゼ（５０３）は、例えば、遠心分離によって収集することができ、濾液中のルシフェラーゼのレベルは、ルミノメーター（５１８）を使用して定量化することができる。その代わりに、ハイスループットな方法を用いることができ、それによると、試料が、９６ウェルフィルタープレートに添加され、上に収載されている全操作が行われた後に、最終遠心分離ステップなしで、本来の９６ウェルフィルタープレートにおいてルシフェラーゼについて直接的にアッセイすることができる。あるいは以前に記載された通り、他の単純化されたまたは内蔵型（self-contained）の形式を用いることができる。斯かる方法は、繁殖欠損指標ファージによる感染後にいずれかの構成成分の遠心分離または他の分離を要求しない場合がある。一部の実施形態では、２、３、４個またはそれよりも多い区画を有する単一のデバイスを使用して、アッセイの感染およびインキュベーションステップと、続いて適切なデバイスによる検出、例えば、ハンドヘルドルミノメーターによるルミネセンスの検出を行うことができる。
図２９は、本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージを使用して目的の微生物を検出するためのフィルタープレートアッセイを描写する。簡潔に説明すると、目的の微生物（６１８）を含む試料（６１６）を、マルチウェルフィルタープレート（６０４）のウェル（６０２）に添加し、スピン（６０６）して、試料から液体を除去することにより試料を濃縮することができる。繁殖欠損指標ファージ（６２０）がウェルに添加され、吸着に十分な、十分な時間添加しておく追加的な培地と共にインキュベートされ（６０８）、続いて、繁殖欠損指標ファージが、感染サイクル後期に通常起こる後期遺伝子産生を達成するために（ただし、繁殖欠損指標ファージによるいかなる成熟ウイルス粒子の産生も伴わない）、目的の標的微生物の感染およびファージ生活環の前進（６１０）（例えば、ほぼ４５分間～２時間）が為される。最後に、ルシフェラーゼ基質が添加され、存在するいずれかのルシフェラーゼ（６２４）と反応する。その結果得られる放射が、ルシフェラーゼ活性（６２６）を検出するルミノメーター（６１４）において測定される。
ある特定の実施形態では、アッセイは、捕捉表面でまたはその付近で目的の微生物を濃縮することなく行うことができる。図３０は、本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージを使用して目的の目的の微生物を検出するための「濃縮なしアッセイ」を説明する。繁殖欠損指標ファージ（７１４）のアリコートは、マルチウェルプレート（７０４）の個々のウェル（７０２）に分配され、次いで、目的の微生物（７１２）を含有する検査試料アリコートが添加され、ファージが可溶性インジケーター（７１６）（例えば、ルシフェラーゼ）を生成するのに十分な期間、インキュベートされる（７０６）（例えば、３７℃で４５分間）。次に、可溶性インジケーターおよび繁殖欠損指標ファージを含有するプレートウェル（７０８）を、アッセイして（７１０）、プレート（７１８）におけるインジケーター活性を測定することができる（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）。本実施形態では、検査試料は、濃縮されない（例えば、遠心分離によって）が、ある期間にわたり繁殖欠損指標ファージと共に直接的に単純にインキュベートされ、その後、ルシフェラーゼ活性についてアッセイされる。
一部の実施形態では、試料は、成長を促す条件下でのインキュベーションによって、検査に先立ち富化することができる。斯かる実施形態では、富化期間は、試料の型およびサイズに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６時間またはそれよりも長くなることができる。
一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、検出可能なインジケーター部分を含み、単一の病原性細胞（例えば、細菌）の感染は、インジケーター部分により生成された増幅されたシグナルによって検出することができる。よって、本方法は、繁殖欠損指標ファージ感染の際に産生されたインジケーター部分を検出するステップを含むことができ、インジケーターの検出は、目的の細菌等の目的の微生物が試料中に存在することを指し示す。例示的な実施形態では、本発明は、試料における目的の細菌を検出するための方法であって、目的の細菌に感染する繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするステップであって、目的の細菌の感染後のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケーター遺伝子産物の産生をもたらすように、繁殖欠損指標ファージが、ファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、ステップと、インジケーター遺伝子産物を検出するステップであって、インジケーター遺伝子産物の陽性検出（すなわち、存在、レベルまたは量の検出）が、目的の細菌が試料中に存在することを指し示す、ステップとを含む方法を含むことができる。一部の実施形態では、検出されるインジケーター部分の量は、試料中に存在する目的の細菌の量に対応する。
本明細書においてより詳細に記載されている通り、本発明の実施形態に係る方法およびシステムは、ある濃度範囲の繁殖欠損指標ファージを利用して、試料中に存在し得る目的の微生物（細菌等）を感染させることができる。一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージが、単一の細胞等、極めて少ない数で試料中に存在する標的微生物（細菌等）を迅速に見出し、結合し、感染するのに十分な濃度で試料に添加される。一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージの濃度は、１時間未満で標的細菌を見出し、結合し、感染するのに十分であってよい。他の実施形態では、これらの事象は、試料への繁殖欠損指標ファージの添加後に２時間未満または３時間未満で生じ得る。例えば、ある特定の実施形態では、インキュベートステップのための繁殖欠損指標ファージ濃度は、１×１０５ＰＦＵ／ｍＬ超、１×１０６ＰＦＵ／ｍＬ超、１×１０７ＰＦＵ／ｍＬ超または１×１０８ＰＦＵ／ｍＬ超である。
試料における目的の微生物を検出するための方法の一部の実施形態では、目的の微生物に感染する繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするステップに先立ち、繁殖欠損指標ファージは、感染因子ストックの産生の際に生成され得るいかなる残渣インジケータータンパク質も含まないように精製することができる。よって、ある特定の実施形態では、本方法は、繁殖欠損指標ファージを精製するステップを含むことができる。組換え繁殖欠損指標ファージは、様々な方法によって、例えば、試料とのインキュベーションに先立ち塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離を使用することにより精製することができる。精製は、ＤＮＡを持たないファージ（すなわち、空ファージまたは「ゴースト」）除去の付加利益を有することができる。
本発明の方法の一部の実施形態では、微生物は、試料からの微生物のいかなる単離または精製も用いずに検出することができる。例えば、ある特定の実施形態では、１個または数個の目的の微生物を含有する試料は、スピンカラム、マイクロタイターウェルまたはフィルター等のアッセイ容器に直接的に添加することができ、アッセイは、このアッセイ容器において実行される。斯かるアッセイの様々な実施形態は、本明細書に開示されている。
本方法の多くの実施形態では、マルチウェルプレートを使用して、アッセイを実行する。例えば、検査試料のアリコートは、マルチウェルプレートのウェルに直接的に分配することができ、繁殖欠損指標ファージがウェルに添加され、感染に十分な期間の後、溶解緩衝液をインジケーター部分のための基質（例えば、ルシフェラーゼインジケーターのためのルシフェラーゼ基質）と共に添加し、インジケーターシグナルの検出についてアッセイすることができる。本方法の一部の実施形態は、フィルタープレートにおいて行うことができる。本方法の一部の実施形態は、繁殖欠損指標ファージによる感染前に、試料の濃縮ありまたはなしで行うことができる。
プレート（または検出を行うことができる他のいずれかの容器）の選択は、検出ステップに影響を与えることができる。例えば、一部のプレートは、光放射の検出に影響を与え得る、有色または白色のバックグラウンドを含むことができる。一般的に言えば、白色プレートは、より高い感度を有するが、より高いバックグラウンドシグナルも生じる。他の色のプレートは、より低いバックグラウンドシグナルを生成することができるが、ややより低い感度も有する。その上、バックグラウンドシグナルの理由の１つは、あるウェルから別の隣接するウェルへの光の漏出である。白色ウェルを有するいくつかのプレートがあるが、残りのプレートは黒色である。このことは、ウェル内側の高いシグナルを可能にするが、ウェル間の光漏出を防止し、よって、バックグラウンドを減少させることができる。よって、プレートまたは他のアッセイ容器の選択は、アッセイの感度およびバックグラウンドシグナルに影響され得る。
本発明の実施形態に係る方法は、感度を増加させる様々な他のステップを含むことができる。例えば、本明細書においてより詳細に記述される通り、方法は、過剰な繁殖欠損指標ファージおよび／またはルシフェラーゼ、または繁殖欠損指標ファージ調製物を混入した他のレポータータンパク質を除去するために、繁殖欠損指標ファージを添加した後に、ただしインキュベートする前に、捕捉され感染した微生物（細菌等）を洗浄するためのステップを含むことができる。
本発明の実施形態に係る方法は、「サンプリング」または「サンプリングステップ」と称することができる、試料調製に関連する１種または複数のステップを含むことができる。一部の実施形態では、試料は、調製、濃縮または希釈なしで、本発明の実施形態に係る方法において直接的に使用することができる。例えば、液体試料は、直接的にアッセイすることができる。他の実施形態では、試料は、緩衝溶液または細菌培養培地を含むことができるがこれらに限定されない溶液に希釈または懸濁することができる。液体中で固体を刻む、混合するまたは液浸軟化することにより、固体または半固体である試料を液体に懸濁することができる。一部の実施形態では、試料は、目的の細菌等の目的の微生物への繁殖欠損指標ファージの付着を促進するｐＨ範囲内に維持されるべきである。一部の実施形態では、好まれるｐＨ範囲は、繁殖欠損指標ファージが細菌細胞に付着するのに適した範囲であり得る。試料はまた、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋およびＫ＋を含むがこれらに限定されない、適切な濃度の二価および一価カチオンを含有するべきである。
好ましくは検出アッセイを通して、試料は、試料中に潜在的に存在するいずれかの目的の微生物の生存度を維持する温度に維持される。繁殖欠損指標ファージが細菌細胞に付着するステップにおいて、繁殖欠損指標ファージの活性を容易にする温度に試料を維持することが好ましい。斯かる温度は、少なくとも約２５℃かつ約４５℃以下である。一部の実施形態では、試料は、約３７℃に維持される。一部の実施形態では、試料は、目的の微生物への繁殖欠損指標ファージの結合または付着の際に、穏やかな混合または振盪に供される。
サンプリングは、種々の仕方を使用して行うことができる。一部の実施形態では、試料（例えば、食物試料）は先ず液化され、固体支持体、例えば、固体支持体またはビーズが、液体試料に浸される。一部の実施形態では、固体支持体は先ず、サンプリング前に管内の培養培地に漬けられる。一部の実施形態では、固体支持体は、サンプリング前に乾燥している。一部の実施形態では、液体試料は先ず、ある期間、例えば、２４時間未満、１２時間未満、９時間もしくはそれ未満、８時間もしくはそれ未満、７時間もしくはそれ未満、６時間もしくはそれ未満、５時間もしくはそれ未満、４時間もしくはそれ未満、３時間もしくはそれ未満または２時間もしくはそれ未満の富化期間未満にわたり培養される（「培養富化」）。他の実施形態では、試料は、固体支持体における目的の微生物の捕捉後に富化することができる。一部の実施形態では、微生物を有する固体支持体は、成長培地においてインキュベートして、微生物の数を増やすことができる。このステップは、「インキュベーション富化」と称される。斯かる実施形態では、富化期間は、試料の型およびサイズに応じて、１、２、３、４、５、６、７もしくは最大８時間またはそれよりも長くなることができる。
一部の実施形態では、目的の微生物の検出は、微生物の集団を増加させる仕方として試料を培養する必要なく完了することができる。例えば、ある特定の実施形態では、検出に要求される総時間は、２６．０、２５．０、２４．０、２３．０、２２．０、２１．０、２０．０、１９．０、１８．０、１７．０、１６．０時間、１５．０時間、１４．０時間、１３．０時間、１２．０時間、１１．０時間、１０．０時間、９．０時間、８．０時間、７．０時間、６．０時間、５．０時間、４．０時間、３．０時間、２．５時間、２．０時間、１．５時間、１．０時間、４５分間未満または３０分間未満である。結果を得るまでの時間の最小化は、様々な適用、例えば、病原体に関する食物および環境検査において重要である。
本発明の実施形態に係る方法は、繁殖欠損指標ファージを目的の微生物に感染させることが意図されるステップを含むことができる。例えば、繁殖欠損指標ファージは、そのうちいくつかが本文書に記載されている公知方法によって、目的の微生物と接触されるまたは接触させることができる。目的の微生物との接触の際に、繁殖欠損指標ファージは、目的の微生物に感染し、インジケーター遺伝子を発現する。感染時間、すなわち、試料が繁殖欠損指標ファージと最初に接触される時点と検出ステップが開始される（例えば、酵素インジケーター部分のための基質が、繁殖欠損指標ファージと接触された試料に添加される）時点との間の期間は、繁殖欠損指標ファージの型および試料における目的の微生物の濃度に応じて変動し得る。細菌等の目的の微生物が固体支持体に捕捉されている装置の使用は、感染に要求される時間を著しく低下させることができ、例えば、感染時間は、１時間またはそれ未満であってよく、一方、細菌の捕捉に固体支持体が使用されない標準アッセイにおいて、感染は典型的に、少なくとも４時間である。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法のための感染の時間は、６．０時間、５．０時間、４．０時間、３．０時間、２．５時間、２．０時間、１．５時間、１．０時間、４５分間未満または３０分間未満である。一部の実施形態では、感染の時間は、約１時間、約２時間または約３時間である。
本発明の実施形態に係る方法は、インジケーターによって産生されたシグナルの検出に関連するさらに１ステップを含むことができる。インジケーター遺伝子の発現によって産生されたインジケーターは、公知方法を使用して検出することができる。例えば、１種または複数のシグナル産生構成成分を、インジケーターと反応させて、検出可能なシグナルを生成することができる。一部の実施形態では、インジケーターは、生物発光化合物であってよい。インジケーターが酵素である場合、検出可能なシグナルの増幅は、酵素を１種もしくは複数の基質または追加的な酵素および基質と反応させて、検出可能な反応産物を産生することにより得られる。別のシグナル産生システムにおいて、インジケーターは、蛍光化合物であってよく、この場合、検出可能なシグナルを産生するためにインジケーターの酵素の操作は要求されない。例えば、フルオレセインおよびローダミンならびにこれらの誘導体およびアナログを含む蛍光分子は、斯かるシステムにおけるインジケーターとしての使用に適する。さらに別の実施形態では、インジケーター部分は、補因子であってよく、よって検出可能なシグナルの増幅は、補因子を酵素および１種もしくは複数の基質または追加的な酵素および基質と反応させて、検出可能な反応産物を産生することにより得られる。一部の実施形態では、検出可能なシグナルは比色定量的（colorimetric）である。特定のインジケーターの選択は、本発明にとって重大な意味を持たないが、インジケーターは、それ自体が検出可能なシグナルを生成することができる、または機器により検出可能である、または酵素／基質シグナル産生システム等の１種もしくは複数の追加的なシグナル産生構成成分と併せて検出可能となるであろうことに留意されたい。一部の実施形態では、検出ステップは、作用するためにインジケーター酵素のための基質の添加を要求するであろう。基質は、種々の仕方で添加することができる。一部の実施形態では、インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）と基質との反応は、３０分間またはそれよりも多く継続することができ、様々な時点における検出が、感度の最適化に望ましいことがある。一部の実施形態では、ルミノメーター読み取り値は、最初に、および反応が完了するまで３または５または１０または１５分間間隔で取ることができる。
本発明の方法の一部の実施形態は、「検出」と称することができる、インジケーターのシグナルの検出に関連する１種または複数のステップを含む。産物インジケーター遺伝子を検出するステップは、その酵素活性を検出するステップを含むことができる。インジケーター遺伝子の産物を検出するステップは、光の放射を検出するまたは光学密度を検出するステップを含むことができる。一部の実施形態では、装置または容器の区画から試料を除去する必要がなく、感染およびその後の基質とのインキュベーションに起因するいかなる光学シグナルも検出可能となるように、基質が検査試料と混合される装置または容器の区画は透明である。この場合、シグナルは、装置または容器の区画の壁を通して検出することができる。一部の実施形態では、反応した試料を含有する装置または容器は、生じたシグナルを検出するための機器に挿入される。他の実施形態では、検出機器は、反応した試料を含有する装置の走査に使用される。
一部の実施形態では、ルミノメーターを使用して、インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）と基質との反応を検出することができる。ＲＬＵの検出は、ルミノメーターにより達成することができる、または他の機械もしくはデバイスを使用することもでき、一部の例は、ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＧＬＯＭＡＸ（登録商標）２０／２０およびＧＬＯＭＡＸ（登録商標）である。一部の実施形態では、分光光度計、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラは、色の変化および他の光放射を検出することができる。絶対的ＲＬＵは、検出に重要であるが、単一の細胞または少数の細胞が確実に検出されるためには、シグナル対バックグラウンド比も高い（例えば、＞２．０、＞２．５または＞３．０）必要がある。バックグラウンドシグナルは、上に記載されているものと同じ手順を使用して、微生物を含有しない対照試料を測定することにより得ることができる。一部の実施形態では、レポーターまたはインジケーター遺伝子からのシグナルの検出は、例えば、光ダイオードまたはＰＭＴ（光電子増倍管）技術を用いる機器の使用を含むことができる。一部の実施形態では、ハンドヘルドルミノメーターをシグナルの検出に用いることができる。適したＰＭＴハンドヘルドルミノメーターは、３Ｍ（Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）、ＢＩＯＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）およびＣＨＡＲＭ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）（Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＭＡ）から入手できる。適した光ダイオードハンドヘルドルミノメーターは、ＨＹＧＩＥＮＡ（登録商標）（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）およびＮＥＯＧＥＮ（登録商標）（Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）から入手できる。これらのハンドヘルドルミノメーターは典型的に、同じ試料について、伝統的なルミノメーター（ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）またはＧＬＯＭＡＸ（登録商標）２０／２０等）と比較して、はるかにより低い読み取り値を産生するが、複数の実験は、産生されたシグナルが、これらのハンドヘルドルミノメーターによって検出されるのに十分であったことを示した。微生物を検出するためにこれらのハンドヘルドデバイスを使用できることはまた、伝統的な非ハンドヘルド検出デバイスを使用した検出方法には欠如することが多い便宜および柔軟性を提供する。
一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、ファージが特異的に認識および感染する微生物の感染の際にのみ産生される、ルシフェラーゼ等の酵素のための遺伝子を含有するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、インジケーター部分は、ウイルス生活環の後期に発現される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている通り、インジケーターは、可溶性タンパク質（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）であり、そのコピー数を限定するファージ構造タンパク質と融合されていない。よって、繁殖欠損指標ファージを利用する一部の実施形態では、本発明は、目的の微生物を検出するための方法であって、少なくとも１個の目的の試料微生物を捕捉するステップと、少なくとも１個の目的の微生物を複数の繁殖欠損指標ファージと共にインキュベートするステップと、感染および可溶性インジケーター部分の発現のための時間を与えるステップと、インジケーター部分を検出するステップであって、インジケーター部分の検出が、目的の微生物が試料中に存在することを実証する、ステップとを含む方法を含む。
例えば、一部の実施形態では、目的の検査試料微生物は、プレートの表面に結合させることによりまたは細菌学的フィルター（例えば、０．４５μｍ孔径スピンフィルターまたはプレートフィルター）を通して試料を濾過することにより捕捉することができる。ある実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、フィルターにおいて直接的に捕捉された試料に最小体積で添加される。ある実施形態では、フィルターまたはプレート表面に捕捉された微生物をその後、１または複数回洗浄して、過剰な結合していない繁殖欠損指標ファージを除去する。ある実施形態では、培地（例えば、本明細書でＬＢとも呼ばれるルリア・ベルターニ（Luria-Bertani）ブロス、本明細書でＢＰＷとも呼ばれる緩衝ペプトン水、または本明細書でＴＳＢとも呼ばれるトリプシン大豆ブロスもしくはトリプトン大豆ブロス）を、さらなるインキュベーション時間にわたり添加して、インジケーター部分をコードする遺伝子の十分に高レベルの発現を可能にすることができる。一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージとのインキュベーションステップは、インジケーター部分から検出可能な指定のレベルのシグナル（例えば、約１００～１００００ＲＬＵ／秒または約２００～５０００ＲＬＵ／秒）または指定のレベルのシグナル対ノイズ比（例えば、１～５００、５～２００または１０～１００）を可能にするために、インジケーター部分をコードする遺伝子の十分なレベルの発現を達成するのに十分なほど長いことのみを必要とする。
一部の実施形態では、目的の微生物を含む検査試料のアリコートは、スピンカラムに添加することができ、繁殖欠損指標ファージによる感染およびいずれか過剰な繁殖欠損指標ファージを除去するための必要に応じた洗浄後に、検出される可溶性インジケーターの量は、感染した目的の微生物における繁殖欠損指標ファージの量に比例するであろう。
次に、細菌の溶解の際に周囲の液体中に放出される可溶性インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）を測定および定量化することができる。ある実施形態では、フィルターを通して溶液をスピンし、インジケーター酵素のための基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）の添加後に、新たなレセプタクル（例えば、ルミノメーター内の）内にアッセイのために濾液を収集する。その代わりに、インジケーターシグナルは、フィルターにおいて直接的に測定することができる。よって、例示的な実施形態では、インジケーター基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）は、フィルター上に残るまたはプレート表面に結合した試料の部分と共にインキュベートすることができる。したがって、一部の実施形態では、固体支持体は、９６ウェルフィルタープレート（または通常の９６ウェルプレート）であり、基質反応は、ルミノメーター内に直接的にプレートを置くことにより検出することができる。例えば、ある実施形態では、本発明は、目的の目的の微生物を検出するための方法であって、９６ウェルフィルタープレートに捕捉された目的の微生物の細胞を、感染後にルシフェラーゼを発現することができる複数の繁殖欠損指標ファージに感染させるステップと、過剰な繁殖欠損指標ファージを洗浄除去するステップと、ＬＢブロスを添加し、繁殖欠損指標ファージがルシフェラーゼを発現し、目的の微生物を溶解するための時間（例えば、３０～１２０分間、６０～１２０分間または８０～１００分間、例えば、約９０分間）を与えるステップと、ルシフェラーゼ基質を添加し、９６ウェルプレートにおいて直接的にルシフェラーゼ活性を測定することによりインジケータールシフェラーゼを検出するステップであって、ルシフェラーゼ活性の検出が、目的の細菌が試料中に存在することを指し示す、ステップとを含む方法を含むことができる。
別の実施形態では、本発明は、目的の目的の微生物を検出するための方法であって、９６ウェルプレートにおける液体の溶液または懸濁物中の細胞を、感染後にルシフェラーゼを発現することができる複数の繁殖欠損指標ファージに感染させるステップと、繁殖欠損指標ファージが、ルシフェラーゼを発現し、目的の微生物を溶解するための時間（例えば、３０～１２０分間；６０～１２０分間または８０～１００分間、例えば、約９０分間）を与えるステップと、ルシフェラーゼ基質を添加し、９６ウェルプレートにおいて直接的にルシフェラーゼ活性を測定することにより、インジケータールシフェラーゼを検出するステップであって、ルシフェラーゼ活性の検出が、目的の微生物が試料中に存在することを指し示す、ステップとを含む方法を含むことができる。斯かる実施形態では、捕捉ステップは必要ない。一部の実施形態では、液体の溶液または懸濁物は、野菜洗浄液（vegetable wash）等、消費できる検査試料であってよい。一部の実施形態では、液体の溶液または懸濁物は、濃縮ＬＢブロス、トリプシン／トリプトン大豆ブロス、ペプトン水または栄養素ブロスで強化された野菜洗浄液であってよい。一部の実施形態では、液体の溶液または懸濁物は、ＬＢブロスに希釈された細菌であってよい。
一部の実施形態では、目的の微生物の溶解は、検出ステップの前、その間またはその後に生じ得る。感染した溶解していない細胞は、一部の実施形態では、ルシフェラーゼ基質の添加後に検出可能であり得る。完全な細胞溶解なしで、ルシフェラーゼは、細胞から出ることができる、および／またはルシフェラーゼ基質は、細胞に進入することができる。よって、ライセートに放出されたルシフェラーゼのみがルミノメーターにおいて解析される（まだ無傷細菌の内側にあるルシフェラーゼは解析されない）スピンフィルターシステムを利用する実施形態のため、検出のために溶解が要求される。しかし、無傷および溶解された細胞に満ちた本来のプレートがルミノメーターにおいて直接的にアッセイされる、溶液または懸濁物中に試料を有するフィルタープレートまたは９６ウェルプレートを利用する実施形態のため、溶解は検出に必要ではない。
一部の実施形態では、インジケーター部分（例えば、ルシフェラーゼ）と基質との反応は、３０分間またはそれよりも多く継続することができ、様々な時点での検出が、感度の最適化に望ましくなることができる。例えば、固体支持体として９６ウェルフィルタープレートを、また、インジケーターとしてルシフェラーゼを使用した実施形態では、ルミノメーター読み取り値は、最初に、および反応が完了するまで１０または１５分間間隔で取ることができる。
驚くべきことに、検査試料の感染に利用される高濃度の繁殖欠損指標ファージは、非常に短い時間枠での極めて少ない数の標的微生物の検出の達成に成功した。検査試料とファージとのインキュベーションは、一部の実施形態では、単一のファージ生活環に十分な長さであることのみを必要とする。一部の実施形態では、このインキュベートステップのための繁殖欠損指標ファージ濃度は、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１．０×１０７、１．１×１０７、１．２×１０７、１．３×１０７、１．４×１０７、１．５×１０７、１．６×１０７、１．７×１０７、１．８×１０７、１．９×１０７、２．０×１０７、３．０×１０７、４．０×１０７、５．０×１０７、６．０×１０７、７．０×１０７、８．０×１０７、９．０×１０７または１．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬを超える。
本発明の方法の実施形態は、個々の微生物を検出することができる。よって、ある特定の実施形態では、本方法は、試料中に存在する微生物の≦１０個の細胞（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９個の微生物）を検出することができる。例えば、ある特定の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、目的の細菌に高度に特異的である。ある実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、他の型の細菌の存在下で目的の細菌を区別することができる。ある特定の実施形態では、繁殖欠損指標ファージを使用して、試料中の特異的な型の単一の細菌を検出することができる。ある特定の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、試料中のわずか２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個の特異的な細菌を検出する。
感染に利用される多数のファージは、標的細胞を死滅させ、これにより、有用なシグナルの生成を防止した「外からの溶菌」に以前に関連付けられた。本明細書に記載されている繁殖欠損指標ファージの調製されたストックのクリーンアップ（clean-up）は、この問題の軽減に役立つことができる（例えば、塩化セシウム等密度密度勾配超遠心分離によるクリーンアップ）。繁殖欠損指標ファージに関連するあらゆる混入ルシフェラーゼの除去に加えて、このクリーンアップは、ゴースト粒子（ＤＮＡを失った粒子）を除去することもできる。ゴースト粒子は、「外からの溶菌」により細菌細胞を溶解し、細胞の早発性の死滅を引き起こし、これにより、インジケーターシグナルの生成を防止することができる。電子顕微鏡は、粗ファージライセート（すなわち、塩化セシウムクリーンアップ前の）が、５０％超のゴーストを有し得ることを実証する。これらのゴースト粒子は、細胞膜を穿刺する多くのファージ粒子の作用により、微生物の早発性の死滅に寄与することができる。よって、ゴースト粒子は、高いＰＦＵ濃度が有害であると報告された以前の問題に寄与していた可能性がある。さらに、繁殖欠損指標ファージの精製された調製物は、アッセイが、洗浄ステップなしで行われることを可能にし、これにより、アッセイを初期濃縮ステップなしで行うことが可能になる。しかし、本発明の方法の一部の実施形態が、初期濃縮ステップを含み、一部の実施形態では、この濃縮ステップが、より短い富化インキュベーション時間を可能にすることを理解されたい。
本発明の方法の一部の実施形態は、確認アッセイをさらに含むことができる。通常より後期の時点で初期結果を確認するための種々のアッセイが、当技術分野で公知である。例えば、実施例に記載されている通りに試料を培養することができ（例えば、ＣＨＲＯＭＡＧＡＲ（登録商標）、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）アッセイ）、ＰＣＲを利用して、微生物ＤＮＡの存在を確認することができる、または他の確認アッセイを使用して、初期結果を確認することができる。
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、感染因子による検出に加えて、試料から目的の細菌等の目的の微生物を精製および／または濃縮するための結合剤（例えば、抗体）の使用を組み合わせる。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、試料における目的の微生物を検出するための方法であって、目的の細菌等の目的の微生物に特異的な捕捉抗体を使用して、前の（prior）支持体において試料から微生物を捕捉するステップと、目的の細菌に感染する繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするステップであって、目的の細菌の感染後のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケータータンパク質産物をもたらすように、繁殖欠損指標ファージが、繁殖欠損指標ファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、ステップと、インジケータータンパク質産物を検出するステップであって、インジケータータンパク質産物の陽性検出が、目的の細菌が試料中に存在することを指し示す、ステップとを含む方法を含む。
例えば、図３１は、本発明の実施形態に係る繁殖欠損指標ファージを使用して、目的の微生物を検出するためのハイブリッドイムノファージ（ＨＩＰ）アッセイを描写する。試料は先ず、微生物特異的抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートウェルに添加される（８０２）。次に、プレートを洗浄して、捕捉抗体への目的の微生物の結合を容易にする（８０４）。完全な捕捉を可能にする十分な時間の後に、微生物特異的繁殖欠損指標ファージを含有する溶液を、各試料に添加する（８０６）。ファージとのインキュベーションは、捕捉された微生物への単一のまたは複数のファージの結合および付着をもたらす（８０８）。最後に、試料をインキュベートして、ルシフェラーゼ発現を容易にし、これにより、細胞溶解および可溶性ルシフェラーゼの放出がもたらされる（８１０）。
システムおよびキット
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されている方法を行うための構成成分を含むシステム（例えば、自動化されたシステムまたはキット）を含む。一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージが、本発明に係るシステムまたはキットに含まれる。本明細書に記載されている方法は、斯かる繁殖欠損指標ファージシステムおよび／またはキットを利用することもできる。本明細書に記載されている一部の実施形態は、本方法を行うために要求される最小量の試薬および材料を考慮すると、自動化および／またはキットに特に適する。ある特定の実施形態では、キットの構成成分のそれぞれは、第１の部位から第２の部位へと送達可能な内蔵型ユニットを含むことができる。
一部の実施形態では、本発明は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのシステムまたはキットを含む。本システムまたはキットは、ある特定の実施形態では、目的の微生物に特異的な繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするための構成成分であって、繁殖欠損指標ファージがインジケーター部分を含む、構成成分と、インジケーター部分を検出するための構成成分とを含むことができる。本発明のシステムおよびキットの両方の一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、目的の細菌に特異的に感染することができ、微生物の感染の際のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケータータンパク質産物をもたらすように、インジケーター部分として繁殖欠損指標ファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む。一部のシステムは、固体支持体に目的の微生物を捕捉するための構成成分をさらに含む。本システムまたはキットは、ある特定の実施形態では、細胞結合構成成分と、シグナル検出構成成分とを含む、固体支持体を含む装置であって、シグナル検出構成成分が、繁殖欠損指標ファージによる試料中の微生物の感染から産生されたインジケーター遺伝子産物を検出することができる、装置を含むことができる。一部の実施形態では、シグナル検出構成成分は、ハンドヘルドデバイスであり得るルミノメーターである。
他の実施形態では、本発明は、試料における目的の微生物の迅速な検出のための方法、システムまたはキットであって、目的の微生物に特異的な繁殖欠損指標ファージ構成成分であって、繁殖欠損指標ファージがインジケーター部分を含む、繁殖欠損指標ファージ構成成分と、インジケーター部分を検出するための構成成分とを含む方法、システムまたはキットを含む。ある特定の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、細菌等の特定の微生物に高度に特異的である。一部の実施形態では、繁殖欠損指標ファージは、他の型の微生物の存在下で、細菌等の目的の微生物を区別することができる。ある特定の実施形態では、システムまたはキットは、試料中のわずか２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個の特異的な目的の微生物を検出する。
ある特定の実施形態では、本発明は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのシステムまたはキットであって、繁殖欠損指標ファージを含む第１の区画を有する装置を含むシステムまたはキットを含むことができる。装置は、基質を含有する第２の区画および／または培地を含有する第３の区画をさらに含むことができる。これらの区画のうち１個または複数は、スナップ式封着によって封着され、装置の他の部分から隔てられ、スナップ式封着の破損は、区画の内容物を区画から出し、試料と混合させる。その代わりに、システムまたはキットは、基質および／または培地を含有する別々の容器をさらに含むことができる。
ある特定の実施形態では、システムおよび／またはキットは、捕捉された微生物試料を洗浄するための構成成分をさらに含むことができる。その上またはその代わりに、本システムおよび／またはキットは、インジケーター部分の量を決定するための構成成分であって、検出されたインジケーター部分の量が、試料中の微生物の量に対応する、構成成分をさらに含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、本システムまたはキットは、ルミノメーターまたはルシフェラーゼ酵素活性を測定するための他のデバイスを含むことができる。
一部の実施形態では、システムおよび／またはキットは、試料中の他の構成成分から目的の微生物を単離するための構成成分を含むことができる。一部のシステムおよび／またはキットでは、同じ構成成分を複数のステップのために使用することができる。一部のシステムおよび／またはキットでは、ステップは、自動化されている、またはコンピュータ入力によりユーザーによって制御される、および／または液体取り扱いロボットが、少なくとも１ステップを行う。コンピュータ化されたシステムにおいて、本システムは、完全に自動化されていても、半自動化されていても、コンピュータを介してユーザーによって指示されてもよい（またはこれらのいくつかの組合せ）。
よって、ある特定の実施形態では、本発明は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのシステムまたはキットであって、目的の微生物に特異的な繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするための構成成分であって、繁殖欠損指標ファージがインジケーター部分を含む、構成成分と、固体支持体上で試料から目的の微生物を捕捉するための構成成分と、捕捉された目的の微生物を洗浄して、結合していない繁殖欠損指標ファージを除去するための構成成分と、インジケーター部分を検出するための構成成分とを含むシステムまたはキットを含むことができる。一部の実施形態では、同じ構成成分を、捕捉および／またはインキュベートおよび／または洗浄するステップのために使用することができる（例えば、フィルター構成成分）。一部の実施形態はその上、試料中の目的の微生物の量を決定するための構成成分であって、検出されたインジケーター部分の量が、試料中の微生物の量に対応する、構成成分を含む。斯かるシステムは、微生物の迅速な検出方法のための上に記載されているものに類似した様々な実施形態および下位実施形態（subembodiment）を含むことができる。ある実施形態では、微生物は、細菌である。コンピュータ化されたシステムにおいて、本システムは、完全に自動化されていても、半自動化されていても、コンピュータを介してユーザーによって指示されてもよい（またはこれらのいくつかの組合せ）。一部の実施形態では、本システムは、試料中の他の構成成分から目的の微生物を単離するための構成成分を含むことができる。
ある実施形態では、本開示は、目的の微生物を検出するための構成成分を含むシステムまたはキットであって、試料中の他の構成成分から少なくとも１個の微生物を単離するための構成成分と、少なくとも１個の微生物を複数の繁殖欠損指標ファージに感染させるための構成成分と、少なくとも１個の感染した微生物を溶解させて、微生物中に存在する繁殖欠損指標ファージを放出させるための構成成分と、繁殖欠損指標ファージを、またはおそらくより優れた感度で、繁殖欠損指標ファージによってコードされ発現された可溶性タンパク質を検出するための構成成分であって、繁殖欠損指標ファージまたは繁殖欠損指標ファージの可溶性タンパク質産物の検出が、微生物が試料中に存在することを指し示す、構成成分とを含むシステムまたはキットを含む。繁殖欠損指標ファージは、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）インジケーター遺伝子を運ぶＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）繁殖欠損指標ファージであってよい。
他の実施形態では、本開示は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのキットであって、目的の微生物に特異的な繁殖欠損指標ファージと共に試料をインキュベートするための構成成分であって、繁殖欠損指標ファージがインジケーター部分を含む、構成成分と、固体支持体上で試料から目的の微生物を捕捉するための構成成分と、捕捉された目的の微生物を洗浄して、結合していない繁殖欠損指標ファージを除去するための構成成分と、インジケーター部分を検出するための構成成分とを含むシステムを含むことができる。一部の実施形態では、同じ構成成分を捕捉および／またはインキュベートおよび／または洗浄するステップのために使用することができる。一部の実施形態はその上、試料中の目的の微生物の量を決定するための構成成分であって、検出されたインジケーター部分の量が、試料中の目的の微生物の量に対応する、構成成分を含む。斯かるキットは、微生物の迅速な検出方法のための上に記載されているものに類似した様々な実施形態および下位実施形態を含むことができる。ある実施形態では、微生物は、細菌である。一部の実施形態では、キットは、試料中の他の構成成分から目的の微生物を単離するための構成成分を含むことができる。
本開示のこれらのシステムおよびキットは、様々な構成成分を含む。本明細書で使用される場合、用語「構成成分」は、広く定義されており、列挙された方法の実行に適したいずれか適した装置または装置の集合を含む。構成成分は、いずれか特定の仕方で、互いに対して一体的に接続または位置付けされている必要はない。本開示は、互いに対する構成成分のいずれか適した配置を含む。例えば、構成成分は、同じ部屋にある必要はない。しかし一部の実施形態では、構成成分は、一体的ユニットにおいて互いに接続されている。一部の実施形態では、同じ構成成分が、複数の機能を果たすことができる。
コンピュータシステムおよびコンピュータ可読媒体
ある特定の実施形態では、本開示は、システムを含むことができる。本システムは、本開示の組成物の少なくとも一部を含むことができる。また、本システムは、本方法を行うための構成成分の少なくとも一部を含むことができる。ある特定の実施形態では、本システムは、キットとして処方される。よって、ある特定の実施形態では、本開示は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのシステムを含むことができる。本システムは、本開示の組成物の少なくとも一部を含むことができる。また、本システムは、本方法を行うための構成成分の少なくとも一部を含むことができる。ある特定の実施形態では、本システムは、キットとして処方される。よって、ある特定の実施形態では、本開示は、試料における目的の微生物の迅速な検出のためのシステムであって、上に記載されている装置を含むシステムを含むことができる。例えば、装置は、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝的構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、構築物が、プロモーターおよびインジケーター遺伝子を含み、固体支持体が、細胞結合構成成分を含む、第１の区画を含むことができる。一部の実施形態では、本システムは、ハンドヘルド検出デバイスも含む。
本技法に記載されているシステム、またはその構成成分のいずれかは、コンピュータシステムの形態で具体化することができる。コンピュータシステムの典型的な例は、汎用コンピュータ、プログラムされたマイクロプロセッサー、マイクロコントローラー、周辺集積回路エレメント、および本技法の方法を構成するステップを実装することができる他のデバイスまたはデバイスの配置を含む。
コンピュータシステムは、コンピュータ、入力デバイス、ディスプレイユニットおよび／またはインターネットを含むことができる。コンピュータは、マイクロプロセッサーをさらに含むことができる。マイクロプロセッサーは、通信バスに接続され得る。コンピュータは、メモリを含むこともできる。メモリは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）およびリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を含むことができる。コンピュータシステムは、記憶デバイスをさらに含むことができる。記憶デバイスは、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、光ディスクドライブ等、ハードディスクドライブまたはリムーバブル記憶ドライブであってよい。記憶デバイスは、コンピュータシステムにコンピュータプログラムまたは他の命令をローディングするための他の同様の手段であってもよい。コンピュータシステムは、通信ユニットを含むこともできる。通信ユニットは、コンピュータを、Ｉ／Ｏインターフェースを介して他のデータベースおよびインターネットに接続させる。通信ユニットは、データの他のデータベースへの転送と共に、他のデータベースからのデータの受信を可能にする。通信ユニットは、モデム、イーサネット（登録商標）カード、またはＬＡＮ、ＭＡＮ、ＷＡＮおよびインターネット等のデータベースおよびネットワークにコンピュータシステムを接続させることができるいずれか同様のデバイスを含むことができる。よって、コンピュータシステムは、Ｉ／Ｏインターフェースを介してシステムにアクセス可能な入力デバイスを介したユーザーからの入力を容易にすることができる。
コンピューティングデバイスは典型的に、当該コンピューティングデバイスの一般管理および演算のための実行可能プログラム命令を提供するオペレーティングシステムを含み、典型的に、サーバーのプロセッサーによって実行されると、コンピューティングデバイスにその意図される機能を遂行させる命令を記憶するコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ等）を含むであろう。オペレーティングシステムに適した実装およびコンピューティングデバイスの一般機能性は、公知であるまたは市販されており、特に、本明細書における開示を踏まえて、当業者によって容易に実装される。
コンピュータシステムは、入力データを処理するために、１個または複数の記憶エレメントに記憶された命令のセットを実行する。記憶エレメントは、所望に応じて、データまたは他の情報を保持することもできる。記憶エレメントは、処理機械に存在する情報源または物理メモリエレメントの形態であってよい。
環境は、上に記述されている通り、種々のデータ記憶ならびに他のメモリおよび記憶媒体を含むことができる。これらは、コンピュータのうち１個もしくは複数にとってローカルな（および／またはその中に存在する）、またはネットワークを通じてコンピュータのいずれかもしくは全てからリモートにある記憶媒体上等、種々の場所に存在することができる。特定のセットの実施形態では、情報は、当業者によく知られている記憶領域ネットワーク（「ＳＡＮ」）に存在することができる。同様に、コンピュータ、サーバーまたは他のネットワークデバイスに帰属する機能を遂行するための任意の必要なファイルは、適宜ローカルにおよび／またはリモートに記憶することができる。システムが、コンピューティングデバイスを含む場合、斯かるデバイスのそれぞれは、バス経由で電気的にカップルされ得るハードウェアエレメントを含むことができ、このエレメントは、例えば、少なくとも１個の中央処理ユニット（ＣＰＵ）、少なくとも１個の入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、コントローラー、タッチスクリーンまたはキーパッド）および少なくとも１個の出力デバイス（例えば、ディスプレイデバイス、プリンターまたはスピーカー）を含む。斯かるシステムは、ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）またはリードオンリーメモリ（「ＲＯＭ」）等、ディスクドライブ、光記憶デバイスおよびソリッドステート記憶デバイス等、１個または複数の記憶デバイス、ならびにリムーバブル媒体デバイス、メモリカード、フラッシュカード等を含むこともできる。
斯かるデバイスは、上に記載されている通り、コンピュータ可読記憶媒体リーダー、通信デバイス（例えば、モデム、ネットワークカード（無線または有線）、赤外線通信デバイス等）およびワーキングメモリを含むこともできる。コンピュータ可読記憶媒体リーダーは、リモート、ローカル、固定および／またはリムーバブル記憶デバイスを表すコンピュータ可読記憶媒体、ならびにコンピュータ可読情報を一時的におよび／またはより永続的に含有、記憶、送信および検索するための記憶媒体と接続され得る、またはこれを受信するように構成され得る。システムおよび様々なデバイスはまた、典型的に、クライアントアプリケーションまたはウェブブラウザー等のオペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラムを含む少なくとも１個のワーキングメモリデバイス内に位置する多数のソフトウェアアプリケーション、モジュール、サービスまたは他のエレメントを含むであろう。代替実施形態が、上に記載されているものの多数の変形形態を有することができることを認めるべきである。例えば、カスタマイズされたハードウェアが使用されてもよい、および／または特定のエレメントが、ハードウェア、ソフトウェア（アプレット等のポータブルソフトウェアを含む）もしくは両方において実装され得る。さらに、ネットワーク入力／出力デバイス等、他のコンピューティングデバイスへの接続が用いられてよい。
コードまたはコードの部分を含有するための非一過性記憶媒体およびコンピュータ可読媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、ＣＤ－ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）もしくは他の光記憶、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶もしくは他の磁気記憶デバイス、または所望の情報の記憶に使用され得、システムデバイスによってアクセスされ得る他のいずれかの媒体を含む、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュールまたは他のデータ等、情報の記憶および／または伝送のためのいずれかの方法または技術において実装される揮発性および非揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブル媒体等が挙げられるがこれらに限定されない、記憶媒体および通信媒体を含む、当技術分野で公知のまたは使用されるいずれか適切な媒体を含むことができる。本明細書に提供される開示および教示に基づき、当業者であれば、様々な実施形態を実装するための他の仕方および／または方法を認めるであろう。
コンピュータ可読媒体は、プロセッサーにコンピュータ可読命令を提供することができる電子、光、磁気または他の記憶デバイスを含むことができるがこれらに限定されない。他の例は、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭ、コンテントアドレッサブルメモリ（「ＣＡＭ」）、ＤＤＲ、ＮＡＮＤフラッシュもしくはＮＯＲフラッシュ等のフラッシュメモリ、ＡＳＩＣ、構成されたプロセッサー、光記憶、磁気テープもしくは他の磁気記憶、またはコンピュータプロセッサーが命令を読み取ることができる他のいずれかの媒体を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、コンピューティングデバイスは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）等、単一の型のコンピュータ可読媒体を含むことができる。他の実施形態では、コンピューティングデバイスは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ディスクドライブおよびキャッシュ等、２またはそれよりも多い型のコンピュータ可読媒体を含むことができる。コンピューティングデバイスは、外部ハードディスクドライブまたは外部ＤＶＤもしくはブルーレイドライブ等、１個または複数の外部コンピュータ可読媒体と通信することができる。
上に記述されている通り、実施形態は、コンピュータ実行可能プログラム命令を実行するようにおよび／またはメモリに記憶された情報にアクセスするように構成されたプロセッサーを含む。命令は、例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐｅｒｌ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）およびＡｃｔｉｏｎＳｃｒｉｐｔ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）を含むいずれか適したコンピュータプログラミング言語で書き込まれたコードからのコンパイラおよび／またはインタープリターによって生成されたプロセッサー特異的命令を含むことができる。ある実施形態では、コンピューティングデバイスは、単一のプロセッサーを含む。他の実施形態では、デバイスは、２個またはそれよりも多いプロセッサーを含む。斯かるプロセッサーは、マイクロプロセッサー、デジタルシグナルプロセッサー（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）および状態機械を含むことができる。斯かるプロセッサーは、ＰＬＣ、プログラマブル割り込みコントローラー（ＰＩＣ）、プログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ）、プログラマブルリードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）、電気的にプログラマブルなリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭまたはＥＥＰＲＯＭ）または他の同様のデバイス等のプログラマブル電子デバイスをさらに含むことができる。
コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェースを含む。一部の実施形態では、ネットワークインターフェースは、有線または無線通信リンク経由で通信するために構成されている。例えば、ネットワークインターフェースは、イーサネット（登録商標）、ＩＥＥＥ ８０２．１１（Ｗｉ－Ｆｉ）、８０２．１６（Ｗｉ－Ｍａｘ）、ブルートゥース（登録商標）、赤外線等経由のネットワーク上の通信を可能にすることができる。別の例として、ネットワークインターフェースは、ＣＤＭＡ、ＧＳＭ（登録商標）、ＵＭＴＳまたは他のセルラー通信ネットワーク等のネットワーク上の通信を可能にすることができる。一部の実施形態では、ネットワークインターフェースは、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、１３９４ ＦｉｒｅＷｉｒｅ、シリアルもしくはパラレル接続、または同様のインターフェース経由等、別のデバイスとのポイントツーポイント接続を可能にすることができる。適したコンピューティングデバイスの一部の実施形態は、１個または複数のネットワーク上の通信のための２個またはそれよりも多いネットワークインターフェースを含むことができる。一部の実施形態では、コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェースに加えてまたはこれに代えて、データ記憶を含むことができる。
適したコンピューティングデバイスの一部の実施形態は、マウス、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、オーディオスピーカー、１個もしくは複数のマイクロホン、または他のいずれかの入力もしくは出力デバイス等の多数の外部または内部デバイスを含むことができる、またはこれと通信することができる。例えば、コンピューティングデバイスは、様々なユーザーインターフェースデバイスおよびディスプレイと通信することができる。ディスプレイは、ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＣＲＴその他を含むがこれらに限定されない、いずれか適した技術を使用することができる。
コンピュータシステムによる実行のための命令のセットは、本技法の方法を構成するステップ等の特異的タスクを行うように処理機械に命令する様々なコマンドを含むことができる。命令のセットは、ソフトウェアプログラムの形態であってよい。さらに、ソフトウェアは、本技法に見られるように、別々のプログラムの集合、より大型のプログラムを有するプログラムモジュールまたはプログラムモジュールの部分の形態であってよい。ソフトウェアは、オブジェクト指向プログラミングの形態のモジュラープログラミングを含むこともできる。処理機械による入力データの処理は、ユーザーコマンド、以前の処理の結果、または別の処理機械によって為される要求に応答することができる。
本開示は、ある特定の実施形態を参照して開示されてきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本開示の範囲および精神から逸脱することのない、記載されている実施形態に対する多数の改変、変更および変化が可能である。したがって、本開示が、記載されている実施形態に限定されないが、その全範囲が、次の特許請求の範囲およびその均等の文言によって定義されることが意図される。
次の実施例は、結果を得るまでの短縮された時間での少数の細胞、さらに言えば単一の細菌の検出について記載するものであり、本開示を限定ではなく説明するためのものである。
（実施例１ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的なバクテリオファージからの繁殖欠損指標ファージの創出および単離）
図３に説明されている相同組換えを使用することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖欠損指標ファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な親ファージから構築した。繁殖欠損指標ファージを生成するために、親ファージのｇｐ２２プロヘッド足場タンパク質のコード配列を、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）コード配列に置き換えた。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７を、ｇｐ２２を挟むマッチする細菌ゲノム配列に挟まれたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）遺伝子を含有する相同組換えプラスミド（図３におけるＨＲプラスミド）、およびｇｐ２２の発現カセットを含有するプラスミド（図３におけるｐＢＡＶ．ｇｐ２２）の両方により、それぞれ別々の抗生物質選択下で形質転換して、形質転換された細菌が、両方のプラスミドを含有することを確実にした。これらの二重に形質転換された細菌を親ファージに感染させて、ＨＲプラスミドとの相同組換えを可能にし、ｇｐ２２のファージのコピーを欠失させ、ｇｐ２２は次いで、ｇｐ２２コードプラスミドによってトランスで提供される。相同組換え後に、一連の力価測定および富化ステップを使用して、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現する特異的組換えバクテリオファージを単離した。大規模産生を行って、検出アッセイにおける使用に適切な繁殖欠損指標ファージの高力価ストックを得た。図５において説明される通り、繁殖欠損指標ファージ（ＣＢＡ１２０Δｇｐ２２ ＮａｎｏＬｕｃと命名）は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７において増殖できないため、ｇｐ２２プロヘッド足場タンパク質を発現する高コピーｐＵＣに基づくプラスミドで形質転換された操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７株（「許容的」Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７株）において増殖を行った。図６に示す成長曲線によって説明される通り、繁殖欠損指標ファージは、許容的Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７株における成長に成功した。塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離を使用して、混入したルシフェラーゼタンパク質からファージ粒子を分離して、バックグラウンドを低下させた。
（実施例２ 検出アッセイにおけるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖欠損指標ファージの検査）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖欠損指標ファージＣＢＡ１２０Δｇｐ２２ ＮａｎｏＬｕｃを使用する戦略を図７に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７の感染後に、繁殖欠損指標ファージは、可溶性ルシフェラーゼを産生した。繁殖欠損指標ファージは、失われたｇｐ２２タンパク質が原因でファージ頭部を形成することができなかった。繁殖欠損指標ファージは、生存可能な娘ファージを産生しなかった。
ＣＢＡ１２０Δｇｐ２２ ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの活性を評価するために、その検出活性を、Ｔ４後期遺伝子プロモーターの制御下で、主要カプシドタンパク質遺伝子であるｇｐ２３の後に挿入されたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）遺伝子を有する、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に特異的な繁殖可能な指標ファージであるＣＢＡ１２０ ＮａｎｏＬｕｃと比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ ４３８８８）の対数期および定常期培養物を希釈して、１００μｌの試料が使用された場合の、図８～図１１のｘ軸に指し示すＣＦＵのおよその数を得た。各試料を、ＣＢＡ１２０ ＮａｎｏＬｕｃまたはＣＢＡ１２０Δｇｐ２２ ＮａｎｏＬｕｃのいずれかに２時間３７℃で感染させた。溶解緩衝液およびルシフェラーゼ基質を添加し、ルミノメーターにおいて試料を読み取った。５回の反復の測定を、各ファージにつき各ＣＦＵレベルで行った。各ＣＦＵについてのＲＬＵ値を平均した。各ＣＦＵレベル読み取り値における平均値を使用して、０ ＣＦＵ読み取り値の平均で割って、図８～図１１のｙ軸にプロットされたシグナル／バックグラウンド値を計算した。
細菌細胞が典型的に、高レベルの転写およびタンパク質発現が原因でより高いシグナルレベルを生成する、対数期のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７培養試料において、上述の実験を行った。結果を図８および図９に説明する。細菌細胞が典型的に、より低いレベルの転写およびタンパク質発現が原因でより低いシグナルレベルを生成する、定常期のＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７培養試料においても、上述の実験を行った。結果を図１０および図１１に説明する。図８および図９において、白色バーは、繁殖欠損指標ファージ（ＣＢＡ１２．Δｇｐ２２．ＮＬと標識）について得られた結果を指し示し、塗りつぶされたバーは、陽性対照（ＣＢＡ１２０ＮＬと標識）についての結果を指し示す。図８～図１１は、繁殖欠損指標ファージが、陽性対照に匹敵する成績を示したことを示す。
（実施例３ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖欠損指標ファージの特異性の検査）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７血清型に特異的な繁殖欠損指標ファージの特異性を検査した。前の実施例に記載されている通りに検出アッセイを行って、ある範囲の細菌を検出した。結果を図１２に説明する。ルシフェラーゼシグナルは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７または操作された許容的Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７の検出の際に産生された。ルシフェラーゼシグナルは、いくつかのＥ．ｃｏｌｉ血清型を含む非標的細菌の検出の試みの際に検出されなかった。
（実施例４ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的なＴＳＰ１バクテリオファージからの繁殖欠損指標ファージの創出および単離）
図１３に説明されている相同組換えを使用することにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な繁殖欠損指標ファージを、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な親ファージから構築した。繁殖欠損指標ファージを生成するために、親ファージのｇｐ２２プロヘッド足場タンパク質のコード配列を、野生型ＴＳＰ１においてＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）コード配列に置き換えた。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＡＴＣＣ １９５８５を、ｇｐ２２を挟むマッチする細菌ゲノム配列（すなわち、ｇｐ２１プロヘッドコアおよびプロテアーゼと、ｇｐ２３主要カプシドタンパク質）に挟まれたＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を含有する相同組換え（ＨＲ）プラスミドにより形質転換した（図１３）。形質転換された細菌を、親ファージに感染させて、ＨＲプラスミドとの相同組換えを可能にし、ｇｐ２２のファージのコピーを欠失させ、これにより、同時に、繁殖欠損変異体を創出し、インジケーター遺伝子（すなわち、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標））を挿入して、繁殖欠損指標ファージを創出した。感染した細胞は、およそ１：８の組換え：野生型ファージの比で野生型および組換えバクテリオファージのミックスを産生した。野生型ファージの同時感染は、失われたｇｐ２２遺伝子をトランスで補完することにより、組換え体複製を支持する。相同組換え後に、一連の力価測定および富化ステップを使用して、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現する特異的組換えバクテリオファージを単離した。大規模産生を行って、検出アッセイにおける使用に適切な繁殖欠損指標ファージの高力価ストックを得た。図１４において説明される通り、繁殖欠損指標ファージ（ＴＳＰ１．Δｇｐ２２ ＮａｎｏＬｕｃと命名）は、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ １９５８５において増殖できないため、ｇｐ２２プロヘッド足場タンパク質を発現する高コピーｐＵＣに基づくプラスミドで形質転換された操作されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株（「許容的」Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株）において増殖を行った。
単離されたＴＳＰ１．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃプラークを、ＴＭＳ緩衝液に懸濁し、野生型または許容的Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ １９５８５培養物のいずれかに播種し、３時間３７℃でインキュベートした。ＮａｎｏＧｌｏ（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標））アッセイを１０μｌ試料において行った。野生型および許容的Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの両方のＴＳＰ１．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃ感染は、バックグラウンドよりも高いシグナルをもたらした（１００ＲＬＵ／秒）（図１５）。
（実施例５ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な繁殖欠損ＴＳＰ１指標ファージの検出限界の検査）
定常期ＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるＴＳＰ１．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を評価するために、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １９５８５を、定常期になるまで１８～２０時間育成した。定常期培養物をＴＳＢに希釈し、細胞を、図１６に示すプレートレイアウトに従って９６ウェルプレートに移した。ＴＳＰ１．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃファージを、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ定常期培養物に添加し、２時間３７℃でインキュベートした。ファージによる感染後に、溶解緩衝液、アッセイ緩衝液および基質を添加し、プレートをルミノメーターにおいて１秒間読み取った。結果を図１６に示す。
対数期ＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるＴＳＰ１．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を評価するために、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １９５８５を、定常期になるまで１８～２０時間育成した。次に、定常期細胞培養物をＴＳＢに希釈し、初期対数期まで育成した。次に、対数期Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ培養物をＴＳＢに希釈し、細胞を、図１７に示すレイアウトに従って９６ウェルプレートに移した。ＴＳＰ１．Δｇｐ２２．ＮａｎｏＬｕｃファージを、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ対数培養物に添加し、２時間３７℃でインキュベートした。ファージによる感染後に、溶解緩衝液、アッセイ緩衝液および基質を添加し、プレートをルミノメーターにおいて１秒間読み取った。結果を図１７に示す。
（実施例６ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的なバクテリオファージからの繁殖欠損ＳＥＡ１指標ファージの創出および単離）
図１８に説明されている相同組換えを使用することにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な繁殖欠損指標ファージを、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な親ファージから構築した。繁殖欠損指標ファージを生成するために、親ファージのｇｐ８４ベースプレートウェッジサブユニットタンパク質のコード配列を、野生型ＳＥＡ１においてＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）コード配列に置き換えた。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ２７８６９を、ｇｐ８４を挟むマッチする細菌ゲノム配列（すなわち、ｇｐ８３頭部完成タンパク質と、ｇｐ８５ベースプレートハブサブユニットおよび尾部リゾチーム）に挟まれたＮａｎｏＬｕｃ遺伝子を含有する相同組換え（ＨＲ）プラスミドの両方により形質転換した（図１８）。次に、このような形質転換された細菌を、親ファージに感染させて、ＨＲプラスミドとの相同組換えを可能にし、ｇｐ８４のファージのコピーを欠失させ、これにより、同時に、繁殖欠損変異体を創出し、インジケーター遺伝子（すなわち、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標））を挿入して、繁殖欠損指標ファージを創出した。感染した細胞は、野生型および組換えバクテリオファージのミックスを産生した。野生型ファージの同時感染は、失われたｇｐ８４遺伝子をトランスで補完することにより、組換え体複製を支持する。相同組換え後に、一連の力価測定および富化ステップを使用して、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現する特異的組換えバクテリオファージを単離した。大規模産生を行って、検出アッセイにおける使用に適切な繁殖欠損指標ファージの高力価ストックを得た。図１９において説明される通り、繁殖欠損指標ファージ（ＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃと命名）は、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ２７８６９において増殖できないため、ｇｐ８４ベースプレートウェッジサブユニットタンパク質を発現する高コピーｐＵＣに基づくプラスミドで形質転換された操作されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株（「許容的」Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株）において増殖を行った。
（実施例７ 野生型および許容的Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な繁殖欠損ＳＥＡ１指標ファージの検査）
野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ２７８６９の時間経過感染を、ｐＵＣ５７．トランス．ＳＥＡ１．ｇｐ８４形質転換２７８６９許容的細胞と比較した。１．０×１０６個の細胞／ウェルの野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ２７８６９（２００μｌのＴＳＢにおける）またはｐＵＣ５７．トランス．ＳＥＡ１．ｇｐ８４形質転換２７８６９許容的細胞（２００μｌのＴＳＢ＋ｃａｒｂにおける）のいずれかを、組換えバクテリオファージ（０．１のＭＯＩ）と共に三連でインキュベートした。４時間にわたり３７℃で、ＮａｎｏＧｌｏアッセイを１０μｌ試料において行った。野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおける繁殖欠損組換えファージによって産生されたシグナルは、初期に低い状態でプラトーに達し、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるファージの持続した成長の欠如を実証する（図２０）。しかし、許容的Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるシグナルは、経時的に増加を継続し、複数ラウンドの感染および継続した成長を指し示す（図２０）。
次に、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株７００１、８３２６、１３０７６および２７８６９の時間経過感染を行った。１．０×１０６個の細胞／ウェルの各野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を、１００μｌのＴＳＢにおいて組換えバクテリオファージ（０．０１のＭＯＩ）と共にインキュベートした。０、１、２および５時間目に３７℃でＮａｎｏＧｌｏアッセイを１０μｌ試料において行った。野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおける繁殖欠損組換えファージによって産生されたシグナルは、初期に低い状態でプラトーに達した（図２１）。
５時間野生型培養物（４０μｌ培養物）のプラークアッセイを行うことにより、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株におけるＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃバクテリオファージの複製を評価した。野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株７００１、８３２６、１３０７６および２７８６９の培養物からプラークは形成されず（図２２）、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株におけるＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃの複製の欠如を確認した。
（実施例８ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な繁殖欠損ＳＥＡ１指標ファージの検出限界の検査）
ＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を評価するために、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｎｅｗｐｏｒｔ ＡＴＣＣ ２７８６９を、ＡｍｐＲ ｐｕｃ５７．ＳＥＡ１．トランスｇｐ８４で形質転換した。対数期培養物をＴＳＢに希釈し、細胞を、図２３に示すプレートレイアウトに従って９６ウェルプレートに移した。ＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃファージをＳａｌｍｏｎｅｌｌａ対数期培養物に添加し、２時間３７℃でインキュベートした。ファージによる感染後に、溶解緩衝液、アッセイ緩衝液および基質を添加し、プレートをルミノメーターにおいて１秒間読み取った。結果を図２３に示す。
定常期ＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を評価するために、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｌｏｒｅａｅｓｕｉｓ ＡＴＣＣ ２７８６９を、定常期になるまで１８～２０時間育成した。次に、定常期細胞をＴＳＢに希釈し、細胞を、図２４に示すプレートレイアウトに従って９６ウェルプレートに移した。ＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃファージをＳａｌｍｏｎｅｌｌａ定常期培養物に添加し、２時間３７℃でインキュベートした。ファージによる感染後に、溶解緩衝液、アッセイ緩衝液および基質を添加し、プレートをルミノメーターにおいて１秒間読み取った。結果を図２４に示す。
対数期ＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの検出限界を評価するために、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｌｏｒｅａｅｓｕｉｓ ＡＴＣＣ ２７８６９を、定常期になるまで１８～２０時間育成した。次に、定常期細胞をＴＳＢに希釈し、初期対数期まで育成した。次に、対数期培養物をＴＳＢに希釈し、細胞を、図２５に示すプレートレイアウトに従って９６ウェルプレートに移した。ＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃファージをＳａｌｍｏｎｅｌｌａ定常期培養物に添加し、２時間３７℃でインキュベートした。ファージによる感染後に、溶解緩衝液、アッセイ緩衝液および基質を添加し、プレートをルミノメーターにおいて１秒間読み取った。結果を図２５に示す。
（実施例９ 検出アッセイにおけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な繁殖欠損ＳＥＡ１指標ファージの検査）
ＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃ繁殖欠損指標ファージの活性を評価するために、その検出活性を、ｇｐ８４の後に挿入されたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）遺伝子を有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的な繁殖可能な指標ファージであるＳＥＡ１ ＮａｎｏＬｕｃと比較した。各試料を、ＳＥＡ１ ＮａｎｏＬｕｃまたはＳＥＡ１．Δｇｐ８４．ＮａｎｏＬｕｃのいずれかに２時間および４時間３７℃で感染させた。溶解緩衝液およびルシフェラーゼ基質を添加し、ルミノメーターにおいて試料を読み取った。図２６Ａに示す通り、５回の反復の測定を、各ファージにつき各ＣＦＵレベルで行った。各ＣＦＵについてのＲＬＵ値を図２６Ｂ（２時間感染）および図２６Ｃ（４時間感染）に示す。

Claims (28)

  1. ファージのゲノムの後期遺伝子領域においてインジケーター遺伝子を含む組換えファージであって、繁殖欠損であり、かつ目的の微生物に特異的に感染することができる、組換えファージ。
  2. バクテリオファージが、ビリオンアセンブリに要求される後期遺伝子における変更または欠失が原因で繁殖欠損である、請求項１に記載の組換えファージ。
  3. 前記インジケーター遺伝子が、前記組換えファージの後期遺伝子の配列に挿入され、前記後期遺伝子を非機能的にし、前記組換えファージを繁殖欠損にする、請求項１に記載の組換えファージ。
  4. 前記インジケーター遺伝子が、前記組換えファージの後期遺伝子の配列の少なくとも部分に置き換わり、前記組換えファージを繁殖欠損にし、前記後期遺伝子が、ビリオンアセンブリに要求される、請求項１に記載の組換えファージ。
  5. Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的なファージに由来する、請求項１に記載の組換えファージ。
  6. 前記後期遺伝子が、ビリオンアセンブリに要求される、請求項１に記載の組換えファージ。
  7. ファージのゲノムの後期遺伝子領域においてインジケーター遺伝子をそれぞれ含む少なくとも２種の組換えファージを含む組成物であって、前記組換えファージが、繁殖欠損であり、前記組換えファージが、１種または複数の目的の微生物に特異的に感染することができる、組成物。
  8. 前記少なくとも２種の組換えファージのそれぞれが、異なるインジケーター遺伝子を含む、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記少なくとも２種の組換えファージのそれぞれが、異なる目的の微生物に特異的に感染することができる、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記少なくとも２種の組換えファージが、複数の目的の微生物に感染することができる、請求項８に記載の組成物。
  11. 前記目的の微生物が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＬｉｓｔｅｒｉａおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのうち少なくとも１種を含む、請求項７に記載の組成物。
  12. 前記複数の目的の微生物が、少なくとも２種の異なるカテゴリーの細菌を含む、請求項１０に記載の組成物。
  13. 前記少なくとも２種の異なるカテゴリーの細菌が、少なくとも２種の異なる属の細菌、少なくとも２種の異なる種の細菌、少なくとも２種の異なる株の細菌または少なくとも２種の異なる血清型の細菌のうち１種または複数を含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 組換えファージを調製する方法であって、
    標的微生物に特異的に感染する親ファージを選択するステップと、
    前記親ファージの遺伝子を変更して、組換え繁殖欠損ファージを生成するステップと、
    前記繁殖欠損ファージにおいて変異された前記遺伝子の産物を発現することができる前記標的微生物の操作された株を、インジケーター遺伝子および前記インジケーター遺伝子を挟み、前記親ファージにおける所望の配列と相同であるＨＲ配列を含む相同組換え（ＨＲ）プラスミドで形質転換するステップと、
    形質転換された前記標的微生物を、前記親ファージまたは前記繁殖欠損親ファージに感染させ、前記ＨＲプラスミドおよび前記親ファージまたは前記組換え繁殖欠損ファージのゲノムの間にＨＲを生じさせるステップと、
    繁殖欠損であり、かつ前記インジケーター遺伝子の産物を発現することができる組換えファージの特定のクローンを単離するステップと
    を含む、方法。
  15. 前記親ファージの前記遺伝子を変更して、前記繁殖欠損ファージを生成するステップが、前記ＨＲプラスミドおよび前記親ファージのゲノムの間に生じる前記ＨＲによって達成され、前記親ファージの前記遺伝子が、前記インジケーター遺伝子による前記親ファージの少なくとも一部の置換えによって変更される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記標的微生物の前記操作された株を生成するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記標的微生物の前記操作された株を生成するステップが、前記標的微生物を、前記組換え繁殖欠損ファージにおいて変更された前記遺伝子をコードし、これを発現することができるプラスミドで形質転換するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記操作された株を形質転換するステップが、前記操作された株をトランスプラスミドで形質転換するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  19. 前記形質転換するステップに先立ち、前記インジケーター遺伝子を含む前記相同組換えプラスミドを調製するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  20. 繁殖欠損であり、かつ前記インジケーター遺伝子の前記産物を発現することができる組換えファージの前記特定のクローンを単離するステップが、前記インジケーター遺伝子の発現を示すクローンを単離するための限界希釈アッセイを行うステップを含む、請求項１４に記載の方法。
  21. 前記組換えファージが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的なファージに由来する、請求項１４に記載の方法。
  22. 試料における目的の微生物を検出する方法であって、
    試料を請求項１に記載の組換えファージと共にインキュベートするステップと、
    インジケーター遺伝子の産物を検出するステップであって、前記インジケーター遺伝子の前記産物の陽性検出が、前記目的の微生物が前記試料中に存在することを指し示す、ステップと
    を含む、方法。
  23. 前記試料が、食物試料、環境試料、水試料または商業的試料である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記試料におけるわずか１０、９、８、７、６、５、４、３、２個または単一の微生物を検出する、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記目的の微生物が、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記目的の微生物が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａである、請求項２２に記載の方法。
  27. 試料における目的の微生物を検出するためのキットであって、請求項１に記載の組換えファージと、インジケーター遺伝子の産物と反応させて、前記インジケーター遺伝子の前記産物を検出するための基質とを含むキット。
  28. 目的の微生物を検出するためのシステムであって、請求項１に記載の組換えファージと、インジケーター遺伝子の産物を検出するための構成成分とを含むシステム。
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