JP2022543722A - 機能的ニューロン死に関連する神経系疾患の予防および／または治療におけるＰｔｂｐ１阻害剤の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患の予防および/または治療におけるPtbp1阻害剤の使用に関する。具体的に、本発明は、Ptbp1遺伝子またはRNAまたはそれらによってコードされるタンパク質阻害剤の使用であって、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を予防および/または治療する組成物または製剤の製造のための使用を提供する。本発明は、脳における星状膠細胞のPtbp1遺伝子またはRNAあるいはそれによってコードされるタンパク質の発現または活性を抑制することにより、有効に星状膠細胞のドーパミンニューロンへの分化転換を誘導することができ、同時に、本発明は、網膜におけるミュラーグリア細胞のPtbp1遺伝子またはRNAあるいはそれによってコードされるタンパク質の発現または活性を抑制することにより、有効にミュラーグリア細胞視神経節細胞への分化転換を誘導することができることで、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を予防および/または治療する。

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は、生物医薬の分野に関する。より具体的に、本発明は、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患の予防および/または治療におけるPtbp1阻害剤の使用に関する。

［背景技術］
パーキンソン病（PD）は重度な神経変性疾患で、その特徴は中脳黒質のドパミンニューロンの喪失である。従来の研究では、いくつかの転写因子の過剰発現により、体外および動物モデルにおいて星状膠細胞からドーパミンニューロンへの直接のリプログラミングが実現された。しかし、今まで、Ptbp1を介する体内におけるニューロンのリプログラミングは、まだ報告されていない。

現在、パーキンソン病に対する主な治療手段は、レボドパ製剤をはじめとする薬物である。同時に、手術治療もある程度症状を改善する。ただし、これらの手段は、いずれも一部の病状の緩和のみで、病状の発展を阻止する効果までは達していない。

そのため、本分野では、有効的に神経変性疾患を治療できる標的の開発が切望されている。
［発明の概要］
本発明の目的は、有効的に神経変性疾患を治療できる標的を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、パーキンソンを治療する新規な標的であるPtbp1を提供することにあり、Ptbp1の発現を抑制することによって線条体内における星状膠細胞を直接ドーパミンニューロンに転換させ、そしてパーキンソン病の表現型を回復させることができる。

本発明のもう一つの目的は、視力損傷疾患を治療する新規な標的であるPtbp1を提供することにあり、Ptbp1の発現を抑制することによって網膜内におけるミュラーグリア細胞を直接視神経節細胞に転換させ、そして永久的視力損傷の表現型を緩和することができる。

本発明の第一の側面では、Ptbp1遺伝子またはRNAまたはそれらによってコードされるタンパク質の阻害剤の使用であって、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療する組成物または製剤の製造のための使用を提供する。

もう一つの好適な例において、前記組成物または製剤は、さらに、以下の群から選ばれる一つまたは複数の用途に使用される：
（a1）星状膠細胞からドーパミンニューロンへの分化転換の誘導；
（b1）哺乳動物のパーキンソン病の運動障害の治療；
（c1）グリア細胞から機能的ニューロンへの転換または分化の誘導；
（d1）視神経節細胞（RGC）変性に関連する神経系疾患の治療；
（e1）網膜疾患の予防または治療；
（f1）神経変性疾患の予防および/または治療；
（g1）ミュラーグリア細胞から視神経節細胞への分化転換；
（h1）哺乳動物の視神経節死による視力損傷の治療。

もう一つの好適な例において、前記神経系疾患は、緑内障、年齢に関連するRGC喪失、視神経損傷、網膜虚血、Leber遺伝性視神経症、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、うつ病、麻薬依存、運動障害（たとえば舞踏病、高コレステロール血症や動作障害）、運動ニューロン損傷疾患（たとえば筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷）、躁うつ病、自閉症スペクトラム障害（ASD）、機能障害、パーキンソン病、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記膠細胞は、星状膠細胞、MG細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、シュワン細胞、NG2細胞、衛星細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記機能的ニューロンは、RGCニューロン、ドーパミンニューロン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記機能的ニューロンは、線条体由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記機能的ニューロンは、成熟した網膜由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記網膜疾患は、神経変性による網膜疾患である。

もう一つの好適な例において、前記組成物または製剤は、MG細胞からRGC細胞への分化転換を誘導することによって神経変性による網膜疾患を治療する。
もう一つの好適な例において、前記のMG細胞は、Mullerグリア細胞（ミュラーグリア細胞）である。

もう一つの好適な例において、前記のMG細胞は、網膜由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記のRGC細胞は、網膜神経節細胞である。
もう一つの好適な例において、前記のRGC細胞は、機能的RGCである。

もう一つの好適な例において、前記のRGC細胞は、視覚経路に取り込まれ、視覚機能を改善する。
もう一つの好ましい例において、前記のRGC細胞は、中央視覚野への機能的投射を実現させ、視覚機能を改善する。

もう一つの好適な例において、前記の視覚機能を改善するとは、神経変性による網膜疾患を罹患した哺乳動物の視覚機能を改善するということである。
もう一つの好適な例において、前記MG細胞は、RGCへの分化転換と同時に、アマクリン細胞にも分化する。

もう一つの好適な例において、RGCは、（1）Brn3a、Rbpms、Foxp2、Brn3cおよび/またはパルブアルブミンを発現し、（2）F-RGC、3型RGCまたはPV-RGCで、（3）前記被験者における既存の網膜経路に組み込まれ（たとえば、中央の情報をdLGNに投射させ、そして視覚の情報をV1に中継して部分的に視覚を回復させることができる）、ならびに/あるいは（4）視覚の情報を受け取ることができ、これらの情報の特徴は、光刺激、シナプス結合（たとえば、大脳における既存の機能的dLGNニューロンと）、シナプス前神経伝達物質の生物的発生および/または後続作用において活動電位を生じさせる能力シナプス反応にある。

もう一つの好適な例において、前記成熟した網膜におけるミュラーグリア細胞をリプログラミングし、RGCに転換させる。
もう一つの好適な例において、ドーパミンニューロンは、（1）チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパミントランスポーター（DAT）、小胞モノアミントランスポーター2（VMAT2）、ヘテロ化ホメオボックス1（En1）、FoxA2および/またはLIMホメオボックス転写因子1アルファ（Lmxla）を発現し、（2）シナプス前神経伝達物質の生物的発生を示し、（3）前記被験者の大脳における既存のニューロン回路に組み込まれ、ならびに/あるいは（4）活動電位、シナプス結合、シナプス前神経伝達物質の生物的発生および/またはシナプス後反応を生じさせる能力を特徴とする。

もう一つの好適な例において、前記線条体における複数の神経膠細胞をリプログラミングし、そのうちの少なくとも10％または少なくとも30％の膠細胞をドーパミンニューロンに転換させた。

もう一つの好適な例において、前記哺乳動物は、神経変性疾患を罹患した哺乳動物を含む。
もう一つの好適な例において、前記哺乳動物は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含む。

もう一つの好適な例において、前記ヒト以外の哺乳動物は、齧歯動物（たとえば、マウス、ラットやウサギ）、霊長類動物（たとえば、サル）を含む。
もう一つの好適な例において、前記星状膠細胞は、線条体、黒質、脊髄、背側中脳または大脳皮質由来のもので、好ましくは、前記の星状膠細胞は、線条体由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記星状膠細胞は、線条体の星状膠細胞を含む。
もう一つの好適な例において、前記星状膠細胞は、脳組織の星状膠細胞である。
もう一つの好適な例において、前記阻害剤は、抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、遺伝子エディター、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記遺伝子エディターは、DNA遺伝子エディターおよびRNA遺伝子エディターを含む。

もう一つの好適な例において、前記遺伝子エディターは、任意のgRNAおよび遺伝子編集タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記遺伝子エディターは、神経膠細胞特異的プロモーター（たとえば、GFAPプロモーター）によって駆動して発現される。

もう一つの好適な例において、前記遺伝子エディターは、2つまたはそれ以上のgRNAおよび遺伝子編集タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記gRNAは、遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のRNAと結合するようにガイドする。

もう一つの好適な例において、前記gRNAは、遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のmRNAと結合するようにガイドする。
もう一つの好適な例において、前記遺伝子編集タンパク質は、Cas13d、 CasRx、 Cas13e、CRISPR/Cas9、 Cpf1、 Cas9、 Cas13a、 Cas13b、Cas13c、 Cas13f、RNA標的遺伝子編集タンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記の遺伝子編集タンパク質はCasRxで、かつgRNAのヌクレオチド配列は配列番号1、2、3、4、5および6からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記遺伝子編集タンパク質の由来は、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、アシドアミノコッカス属(Acidaminococcus sp)、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）、ルミノコッカス・フラベファシエンス(Ruminococcus Flavefaciens)、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記Ptbp1は、哺乳動物、好ましくはヒト、マウス、ラット、またはウサギ、より好ましくはヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記Ptbp1遺伝子は、野生型Ptbp1遺伝子および突然変異型Ptbp1遺伝子を含む。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型は、突然変異後、コードされるタンパク質の機能が変わらない突然変異の様態（すなわち、機能が野生型のコードされるタンパク質と同様かほぼ同様である）を含む。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型Ptbp1遺伝子によってコードされるポリペプチドは野生型Ptbp1遺伝子によってコードされるポリペプチドと同様かほぼ同様である。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型Ptbp1遺伝子は、野生型Ptbp1遺伝子と比べ、相同性が≧80％（好ましくは≧90％、より好ましくは≧95％、さらに好ましくは≧98％または99％）のポリヌクレオチドを含む。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型Ptbp1遺伝子は、野生型Ptbp1遺伝子の5’末端および/または3’末端が短縮されたか、ヌクレオチドが1～60個（好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個）付加されたポリヌクレオチドを含む。

もう一つの好適な例において、前記のPtbp1遺伝子は、cDNA配列、ゲノム配列、またはこれらの組み合わせを含む。
もう一つの好適な例において、前記Ptbp1タンパク質は、Ptbp1の活性断片またはその誘導体を含む。

もう一つの好適な例において、前記活性断片またはその誘導体は、Ptbp1との相同性が少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは98％、99％である。
もう一つの好適な例において、前記活性断片またはその誘導体は、少なくとも80％、85％、90％、95％、100％のPtbp1活性を有する。

もう一つの好適な例において、前記組Ptbp1タンパク質のアミノ酸配列は、以下の群から選ばれる：
（i）配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ii）配列番号11で示されるアミノ酸配列が1個または複数個（たとえば1～10個）のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を経てなる、前記タンパク質の機能を有する、（i）から誘導されるポリペプチド；あるいは
（iii）アミノ酸配列の配列番号11で示されるアミノ酸配列との相同性が≧90％（好ましくは≧95％、より好ましくは≧98％または99％）で、前記タンパク質の機能を有するポリペプチド。

もう一つの好適な例において、前記Ptbp1遺伝子ののヌクレオチド配列は、以下の群から選ばれる：
（a）配列番号11で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）配列が配列番号12で示されるポリヌクレオチド；
（c）ヌクレオチド配列の配列番号12で示される配列との相同性が≧95％（好ましくは≧98％、より好ましくは≧99％）のポリヌクレオチド；
（d）配列番号12で示されるポリヌクレオチドの5’末端および/または3’末端が短縮されたかヌクレオチドが1～60個（好ましくは1～30、より好ましくは1～10個）付加されたポリヌクレオチド；
（e）（a）～（d）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。

もう一つの好適な例において、前記ptbp1タンパク質は、配列番号11で示されるものである。
もう一つの好適な例において、前記ptbp1タンパク質をコードする核酸は、配列番号12で示されるものである。

もう一つの好適な例において、前記ptbp1遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤（たとえば、遺伝子編集タンパク質）が標的とする領域は、ptbp1遺伝子配列の4758～4787番目、および/または5381～5410番目である。

もう一つの好適な例において、前記ptbp1遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤は、ptbp1の活性および/または発現量を抑制する。
もう一つの好適な例において、前記ptbp1遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤の濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。

もう一つの好適な例において、前記ptbp1遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤のptbp1の活性および/または発現量に対する抑制率は90％超、好ましくは90％～95％である。

もう一つの好適な例において、前記阻害剤は、脳組織の星状膠細胞を標的とする。
もう一つの好適な例において、前記阻害剤は、網膜のMG細胞を標的とする。
もう一つの好適な例において、前記神経変性疾患は、パーキンソン病を含む。

本発明の第二の側面では、以下のものを含む組成物を提供する。
（a）CasRx、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、RNA標的遺伝子編集タンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクター；ならびに
（b）前記遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のDNAまたはRNAと結合するようにガイドするgRNAまたは発現ベクター。

もう一つの好適な例において、前記gRNAは、遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のmRNAと結合するようにガイドする。
もう一つの好適な例において、前記gRNAのヌクレオチド配列は、配列番号1、2、3、4、5および6からなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記組成物は、薬物組成物を含む。
もう一つの好適な例において、前記組成物は、さらに、以下のもの含む：
（c）ほかの神経変性疾患を予防および/または治療する薬物。

もう一つの好適な例において、前記組成物は、さらに、以下のもの含む：
（d）ほかの機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療するための薬物。
もう一つの好適な例において、前記組成物は、さらに、以下のもの含む：
（e）ほかの網膜疾患を予防および/または治療する薬物。

もう一つの好適な例において、前記遺伝子編集タンパク質の発現ベクターは、膠細胞を標的とするベクターを含む。
もう一つの好適な例において、前記遺伝子編集タンパク質の発現ベクターは、脳組織の星状膠細胞を標的とするベクターを含む。

もう一つの好適な例において、前記遺伝子編集タンパク質の発現ベクターは、網膜のMG細胞を標的とするベクターを含む。
もう一つの好適な例において、前記ベクターは、ウイルスベクターを含む。

もう一つの好適な例において、前記のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、SV40、ポックスウイルス、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ベクターはレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、好ましくは、前記ベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）である。

もう一つの好適な例において、前記ベクターは、AAV2またはAAV9を含む。
もう一つの好適な例において、前記遺伝子編集タンパク質をコードする遺伝子は、gRNAと同一の発現ベクター（たとえば、AAVベクター）に位置する。

もう一つの好適な例において、前記遺伝子編集タンパク質の発現ベクターは、gRNAの発現ベクターと同一の発現ベクター（たとえば、AAVベクター）である。
もう一つの好適な例において、前記発現ベクターは、さらに、前記遺伝子編集タンパク質の発現を駆動するための、神経膠細胞特異的プロモーター（たとえば、GFAPプロモーター）を含む。

もう一つの好適な例において、前記組成物の剤形は、凍結乾燥製剤、液体製剤、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記組成物の剤形は、液体製剤である。

もう一つの好適な例において、前記組成物の剤形は、注射剤形である。
もう一つの好適な例において、ほかの神経変性疾患を予防および/または治療する薬物は、ドーパミン前駆体薬物、非麦角系ドーパミン受容体作動薬、モノアミン酸化酵素B阻害薬、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記組成物は、細胞製剤である。
もう一つの好適な例において、前記遺伝子編集タンパク質の発現ベクターは、gRNAの発現ベクターと同一のベクターか異なるベクターである。

もう一つの好適な例において、前記成分（a）と成分（b）の重量比は、100：1～0.01：1、好ましくは10：1～0.1：1、より好ましくは2：1～0.5：1である。
もう一つの好適な例において、前記組成物では、前記成分（a）の含有量は0.001％～99％、好ましくは0.1％～99％、より好ましくは1％～70％である。

もう一つの好適な例において、前記組成物では、前記成分（b）の含有量は0.001％～99％、好ましくは0.1％～90％、より好ましくは1％～70％である。
もう一つの好適な例において、前記組成物では、前記成分（c）の含有量は1％～99％、好ましく、10％～90％、より好ましくは30％～70％である。

もう一つの好適な例において、前記組成物では、前記成分（a）と成分（b）と任意の成分（c）の前記組成物の全重量のうちの0.01～99.99wt％、好ましくは0.1～90wt％、より好ましくは1～80wt％を占める。

本発明の第三の側面では、以下のものを含む薬物キットを提供する：
（a1）第一容器、ならびに前記第一容器の中に位置する、Cas13d、CasRx、Cas13e、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13f、RNA標的遺伝子編集タンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクター、あるいは前記遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクターを含有する薬物；
（b1）第二容器、ならびに前記第二容器の中に位置する、遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のDNAまたはRNAと結合するようにガイドする、gRNAまたは発現ベクター、あるいは前記gRNAまたは発現ベクターを含有する薬物。

もう一つの好適な例において、前記gRNAは、遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のmRNAと結合するようにガイドする。
もう一つの好適な例において、前記gRNAのヌクレオチド配列は、配列番号1、2、3、4、5および6からなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記gRNAが標的とする領域は、Ptbp1遺伝子配列の4758～4787番目、および/または5381～5410番目である。
もう一つの好適な例において、前記薬物キットは、さらに、以下のものを含む：
（c1）第三容器と、前記第三容器の中に位置する、ほかの神経変性疾患を予防および/または治療する薬物、ならびに/あるいはほかの網膜疾患を予防および/または治療する薬物、ならびに/あるいはほかの機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療する薬物と。

もう一つの好適な例において、前記の第一容器は、第二容器、第三容器と同様か異なる容器である。
もう一つの好適な例において、前記の第一容器の薬物は、遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクターを含む単一製剤である。

もう一つの好適な例において、前記の第二容器の薬物は、gRNAまたはその発現ベクターを含む単一製剤である。
もう一つの好適な例において、前記の第三容器の薬物は、ほかの機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療するための薬物を含む単一製剤である。

もう一つの好適な例において、前記薬物の剤形は、凍結乾燥製剤、液体製剤、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記薬物の剤形は、経口投与剤形または注射剤形である。

もう一つの好適な例において、前記のキットは、さらに、説明書を含む。
本発明の第四の側面では、本発明の第二の側面に記載の組成物またはまたは本発明の第三の側面に記載の薬物キットの使用であって、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療する薬物の製造のための使用を提供する。

もう一つの好適な例において、前記組成物では、遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクターの作用濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。

もう一つの好適な例において、前記組成物では、前記gRNAはまたはその発現ベクターの作用濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。

もう一つの好適な例において、前記薬物組成物では、前記ほかの機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療する薬物の作用濃度（ウイルス力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。

もう一つの好適な例において、前記組成物では、前記ほかの機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療する薬物の作用濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。

もう一つの好適な例において、前記組成物または薬物キットは、（a）遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクターと、（b）gRNAまたはその発現ベクターと、（c）任意のほかの機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療するための薬物と、（d）薬学的に許容される担体とを含む。

もう一つの好適な例において、前記組成物または薬物キットでは、（a）遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクターと、（b）gRNAまたはその発現ベクターと、（c）任意のほかの機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療するための薬物との前記組成物または薬物キットの全重量のうちの0.01～99.99wt％、好ましくは0.1～90wt％、より好ましくは1～80wt％を占める。

本発明の第五の側面では、膠細胞の機能的ニューロンへの分化を促進する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
Ptbp1遺伝子またはRNAあるいはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤あるいは本発明の第二の側面に記載の組成物の存在下において、膠細胞を培養することにより、膠細胞の機能的ニューロンへの分化を促進する。

もう一つの好適な例において、前記膠細胞は、星状膠細胞、MG細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、シュワン細胞、NG2細胞、衛星細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記機能的ニューロンは、RGCニューロン、ドーパミンニューロン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記膠細胞は、体外における細胞である。

もう一つの好適な例において、前記Ptbp1遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤の作用濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。

もう一つの好適な例において、前記請求項2に記載の組成物の作用濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。
本発明の第六の側面では、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を予防および/または治療する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
必要な対象に、Ptbp1遺伝子またはRNAあるいはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤、あるいは本発明の第二の側面に記載の組成物、あるいは本発明の第三の側面に記載の薬物キットを施用する。

もう一つの好適な例において、前記対象は、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を罹患したヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含む。
もう一つの好適な例において、前記ヒト以外の哺乳動物は、齧歯動物および霊長類動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、サルを含む。

本発明の第七の側面では、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を予防および/または治療する候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（a）テスト群で、細胞の培養系に被験化合物を添加し、かつ前記テスト群の細胞におけるPtbp1の発現量（E1）および/または活性（A1）を観察し、対照群で、同様の細胞の培養系に被験化合物を添加せず、かつ対照群の前記細胞におけるPtbp1の発現量（E0）および/または活性（A0）を観察し、
ここで、テスト群におけるPtbp1の発現量（E1）および/または活性（A1）が顕著に対照群よりも低い場合、当該被験化合物がPtbp1の発現および/または活性に抑制作用を有する、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を予防および/または治療する候補化合物であることが示される。

もう一つの好適な例において、前記のPtbp1の発現量は、qPCRによるものである。
もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、以下の工程を含む：
（b）工程（a）で得られた候補化合物に対し、さらにその膠細胞の機能的ニューロンへの分化に対する促進作用をテストし、ならびに/あるいは、さらにそれにPtbp1遺伝子に対して下方調節する作用があるかテストする。

もう一つの好適な例において、前記の方法は、工程（a）で確認された候補化合物を哺乳動物モデルに施用し、その哺乳動物への影響を測定する工程（c）を含む。
もう一つの好適な例において、前記哺乳動物は、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を罹患した哺乳動物である。

もう一つの好適な例において、前記「顕著に低い」とは、E1/E0≦1/2、好ましくは≦1/3、より好ましくは≦1/4である。
もう一つの好適な例において、前記「顕著に低い」とは、A1/A0≦1/2、好ましくは≦1/3、より好ましくは≦1/4である。

もう一つの好適な例において、前記細胞は、膠細胞を含む。
もう一つの好適な例において、前記細胞は、体外で培養された細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の方法は非診断的で非治療的なものである。

本発明の第八の側面では、星状膠細胞のドーパミンニューロンへの分化を促進する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
Ptbp1遺伝子またはRNAあるいはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤あるいは本発明の第二の側面に記載の組成物の存在下において、星状膠細胞を培養することにより、星状膠細胞のドーパミンニューロンへの分化を促進する。

もう一つの好適な例において、前記星状膠細胞は、線条体の星状膠細胞を含む。
もう一つの好適な例において、前記星状膠細胞は、脳組織の星状膠細胞である。
もう一つの好適な例において、前記星状膠細胞は、体外における細胞である。

もう一つの好適な例において、前記Ptbp1遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤の作用濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。

もう一つの好適な例において、前記組成物の作用濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、非診断的で非治療的な方法である。

本発明の第九の側面では、ミュラーグリア細胞の視神経節細胞への分化を促進する方法であって、Ptbp1遺伝子またはRNAあるいはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤あるいは本発明の第二の側面に記載の組成物の存在下において、網膜ミュラーグリア細胞の視神経節細胞への分化を促進する工程を含む方法を提供する。

もう一つの好適な例において、前記Ptbp1遺伝子またはRNAあるいはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤の作用濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。

もう一つの好適な例において、前記組成物の作用濃度（ウイルスの力価）は＞1×10¹³、好ましくは1×10¹³～1×10¹⁴である。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、非診断的で非治療的な方法である。

本発明の第十の側面では、以下のものを含むAAVベクターを提供する：
（a） CasRx、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、RNA標的遺伝子編集タンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子編集タンパク質のコード配列；ならびに
（b）前記遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のDNAまたはRNAと結合するようにガイドするgRNA。

もう一つの好適な例において、前記AAVベクターは、さらに、前記遺伝子編集タンパク質の発現を駆動するための、神経膠細胞特異的プロモーター（たとえば、GFAPプロモーター）を含む。

もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。

図1は、CasRxが体外において特異的にPtbp1のmRNA1をノックダウンできることを示す。（A）CasRxを介するPtbp1のmRNAのノックダウンの概略図である。（B）Ptbp1遺伝子における6つのgRNAの標的部位を示す概略図である。（CとD）異なる組み合わせのgRNAのノックダウンの効率である。gRNA 5と6は、N2a細胞（C）と星状膠細胞（D）のいずれにおいても最も高いノックダウンの効率を示す。上方の数字は、各群の繰り返された回数を表す。全ての値は、平均値±SEMで表示される。（EとF）CasRx-Ptbp1が特異的にPtbp1をノックダウンできることを示す。N2a細胞（E）は、n=4で独立に繰り返され、星状膠細胞（F）は、n=2で独立に繰り返された。 図2は、AAVの特異性および発現、GFPの発現の経時的なオフおよび転換したRGCのサブタイプを表すが、図1に関連するものである。（A）CasRx対照（x軸）に対する、CasRx-Ptbp1（y軸）のRNA-seqライブラリーにおいて検出されたすべての遺伝子のlog₂（FPKM+1）値の発現レベルである。N2a細胞は、n=4で独立に繰り返され、星状膠細胞は、n=2で独立に繰り返された。典型的なニューロン由来遺伝子は黒点で示された。（B）AAV-GFAP-GFP-Creの特異性である。AAV-GFAP-GFP-Creは、Ai9マウスのMGにおいてGFPの発現を駆動してtdTomatoの発現をアンロックする。Sox9は、MG特異的なマーカーである。スケールバーは、50μmである。（C）AAVの発現の確認である。tdTomatoを発現するGFP+細胞の百分率および表達Sox9を発現するtdTomato+細胞の百分率である。全ての値は、平均値±SEMで示す。（D）qPCR分析によって感染した網膜においてAAV-GFAP-CasRxおよびAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1が発現されたことが実証された。上方の数字は、各群の繰り返された回数を表す。全ての値は、平均値±SEMで表示される。（E）MGによって誘導されたRGCにおいて最終的に経時的にGFPの発現がオフになった。スケールバーは、20μmである。各群では、実験が独立に6回繰り返されたが、結果が近かった。（F～H）Foxp2、Brn3cおよびPVの染色である。なお、Foxp2、Brn3cおよびPVは、それぞれRGCサブタイプF-RGC、3型RGCおよびPV-RGCのマーカーである。黄色の矢印はtdTomato+細胞と異なるマーカーの共局在を、白色の矢印はtdTomato+細胞と異なるマーカーの共局在を示す。スケールバーは、20μmである。各群では、実験が3回繰り返されたが、結果が近かった。 図3は、完全に成熟した網膜においてPtbp1の組み合わせによってMGがRGCへ転換したことを示す。（A）MGからRGCへの転換の概略図である。ベクターI（AAV-GFAP-GFP-Cre）はMG特異的プロモーターGFAPによって駆動されるCreレコンビナーゼおよびGFPを、ベクターII（AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1）はCasRxおよびgRNAをコードする。RGCを誘導するために、網膜（5週齢のAi9マウス）にAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1または対照ベクターAAV-GFAP-CasRxおよびAAV-GFAP-GFP-Creを注射した。注射から約1か月で転換の発生をチェックした。ONLは外顆粒層、 OPLは外網状層、INLは内顆粒層、IPLは内網状層、 GCLは視神経節細胞層である。（B）代表的な画像によってGCLにおけるtdTomatoとBrn3aの共局在が示された（点線）。白色の矢印はBrn3aと共局在していないMGの末端を、黄色の矢印はtdTomatoとBrn3aのAAV-GFAP-GFP-CreおよびAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1が注射された網膜における共局在を示す。Brn3aはRGC特異的なマーカーである。スケールバーは、20μmである。（C）AAV注射から1か月の時点の、GCLにおけるtdTomato⁺またはtdTomato⁺Brn3a⁺細胞の数である。AAV-GFAP-GFP-Cre＋AAV-GFAP-CasRxは、n=6の網膜で、AAV-GFAP-GFP-Cre＋AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1は、n=7の網膜である。データは平均値±SEMで示され、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001で、対応のないt検定である。（D）代表的な画像によってtdTomatoとGCLにおけるRGCのもう一つの特異的なマーカーRbpmsの共局在が示された。黄色の矢印はtdTomatoとRbpmsの共局在を示す。スケールバーは、20μmである。（E）AAV注射から1か月の時点の、GCLにおけるtdTomato+またはtdTomato+Rbpms+細胞の数である。AAV-GFAP-GFP-Cre＋AAV-GFAP-CasRxは、n=6の網膜で、AAV-GFAP-GFP-Cre＋AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1は、n=8の網膜である。データは平均値±SEMで示され、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001で、対応のないt検定である。 図4は、Ptbp1をノックダウンしてC57BLマウスの完全な網膜においてMGをRGCに転換させたことを示すが、図3に関連するものである。 （A）MGからRGCへの誘導の概略図である。ベクター1（GFAP-mCherry）はMG特異的プロモーターGFAPによって駆動されるmCherryを、ベクター2（AAV-EFS-CasRx-Ptbp1）はスペクトルのプロモーターの下においてgRNAおよびCasRxを発現する。RGCを誘導するために、網膜にAAV-GFAP-mCherryを注射し、同時にAAV-EFS-CasRx-Ptbp1または対照ウイルスAAV-GFAP-mCherryを注射した。注射から2～3週で転換の発生をチェックした。（B）代表的な画像によってmCherryおよびMGマーカーであるSox9の共局在が示され、AAV-GFAP-mCherryがMGにおいて特異的に発現することがわかる。スケールバーは、50μmである。（C、D）代表的な画像によってGCLにおけるmCherry+Brn3a+およびmCherry+Rbpms+細胞が示された。各群はn=3の網膜である。スケールバーは、50μmである。（E）RGCに類似するmCherry+細胞はLED光に対して電気生理学的反応が生じる。 図5は、Ptbp1をノックダウンしてMGをアマクリン細胞に転換させたことを示すが、図3に関連するものである。（A）AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1を注射されたAi9マウスの完全な網膜においてtdTomato+Pax6+細胞が観察された。緑色の矢印はtdTomato+細胞とPax6の非共局在を、黄色の矢印はPax6とtdTomatoの共局在を示す。なお、Pax6はアマクリン細胞のマーカーである。スケールバーは、20μmである。（B）tdTomato+Prox1+細胞が観察されなかった。矢印はtdTomato細胞とProx1（双極細胞のマーカー）の非共局在を示す。スケールバーは、20μmである。（Ｃ）光受容細胞層（ONL）においてtdTomato+細胞が観察されなかった。白色の矢印はGCLにおけるtdTomato陽性RGC様細胞を、黄色の矢印はINLにおけるtdTomato+プロタミン様細胞を、緑色の矢印はMGのtdTomato+投射を示す。スケールバーは、20μmである。各群では、実験が独立に少なくとも3回繰り返されたが、結果が近かった。 図6は、NMDAによる網膜損傷のマウスモデルにおけるMGからRGCへの転換の誘導を示す。（A）実験の設計である。硝子体内にNMDA（200 mM、1.5 mL）を注射することによって4～8週齢のAi9マウスにおいて網膜損傷を引き起こした。NMDA注射から2～3週で、網膜下にAAVを注射した。AAV注射から1か月で、免疫染色および行動試験を行った。（B）NMDA注射によって基本的にGCLにおける大半のRGCが死亡した。スケールバーは、50μmである。（C）tdTomatoとBrn3aの共局在である。黄色の矢印はBrn3aとtdTomatoのGCLにおける共局在を示す。n=6の網膜で、スケールバーは、20μmである。（D）GCLにおけるBrn3a+またはtdTomato+またはtdTomato+Brn3a+細胞の数である。無損傷の網膜は、n=6の網膜で、GFAP-CasRx＋GFAP-GFP-Creは、n=6の網膜で、GFAP-CasRx-Ptbp1＋GFAP-GFP-Creは、n=7の網膜である。データは平均値±SEMで示され、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001で、対応のないt検定である。（E）tdTomatoとRbpmsの共局在である。黄色の矢印はGFAP-CasRx-Ptbp1＋GFAP-GFP-Creを注入されたGCLにおけるRbpmsとtdTomatoの共局在を示す。スケールバーは、20μmである。（F）GCLにおけるRbpms+またはtdTomato+またはtdTomato+Rbpms+細胞の数である。無損傷の網膜は、n=6の網膜で、GFAP-CasRx＋GFAP-GFP-Creは、n=7の網膜で、GFAP-CasRx-Ptbp1＋GFAP-GFP-Creは、n=7の網膜である。データは平均値±SEMで示され、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001で、対応のないt検定である。（G）画像によって二光子顕微鏡で記録された代表的なRGC様tdTomato+細胞を示す。スケールバーは、20μmである。（H）誘導された視神経節細胞の光に対する反応である。計8個の細胞が記録されたが、そのうち、6個がLED光に対する反応を示した。これらの細胞のうち、5個がON細胞で、1個がOFF細胞である。 図7は、MGからRGCへの転換の進行を示すが、図6に関連するものである。（A）代表的な画像によって完全な網膜における5つの異なる時点（NMDA未注射）でのMGからRGCへの転換が示された。矢印は誘導されたRGＣを示す。スケールバーは、20μmである。実験が独立に3回以上繰り返されたが、結果が近かった。なお、「2か月」における代表的な画像は図2Bと2Dにも示された。（B）GCLにおけるtdTomato+Brn3a+およびtdTomato+Rbpms+細胞の絶対数である。なお、図1Cと3Eにも「1か月」における値が示された。全ての値は、平均値±SEMで表示される。（C）代表的な画像によってAAV注射から1.5週の時点における誘導細胞の中間段階が示された（白色の矢印）。各群では、n≧3匹のマウスである。なお、中間ユニットはONLにおける投射が失われることが多い。スケールバーは、10μmである。実験が独立に3回以上繰り返されたが、結果が近かった。（D）代表的な画像によって4つの異なる時点でのNMDA損傷の網膜におけるMGからRGCへの過程が示された。矢印は誘導されたRGＣを示す。スケールバーは、20μmである。なお、「3か月」における代表的な画像は図3Cと3Eにも示された。実験が独立に2回以上繰り返されたが、結果が近かった。 図8は、転換後のRGCが大脳に投射でき、かつ部分的に視覚機能を回復させたことを示す。（Ａ）視覚経路の概略図である。RGCは、視神経送信軸索により、視神経の信号を網膜外の背側膝状核および上丘に送達する。（B）網膜の平面像である。黄色の矢印はMGから誘導されるtdTomato陽性RGCの軸索を示す。スケールバーは、100μmである。各群では、実験が3回繰り返されたが、結果が近かった。（C）代表的な画像によって視神経における誘導されたRGCのtdTomato+の軸索が示された。スケールバーは、200μmである。各群では、独立に5回繰り返されたが、結果が近かった。（DとE）代表的な画像によって対側の背側膝状核（D）および上丘（E）（大脳におけるRGCが投射する標的の領域）において強い信号が観察されたことが示された。各群では、独立に4回繰り返されたが、結果が近かった。なお、同側の背側膝状核およびSCは弱いtdTomato+信号を示す。スケールバーは、500μm（左）、50μm（右）である。（F）VEP記録の概略図である。（G）VEPの一次視覚皮質における放出状況である。同一の群からのマウスの反応を示し、各線はそれぞれ一つの網膜を表す。縦棒グラフの上方は各群の網膜の数を表す。（H）野生型（WT、n=8の網膜）、NMDAおよびAAV-GFAP-mCherry（n=12の網膜）、NMDA、AAV-GFAP-mCherryおよびAAV-GFAP-CasRx（n=11の網膜）、ならびにNMDA、AAV-GFAP-mCherryおよびAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1（n=8の網膜）である。各点はそれぞれ1匹のマウスを表す。データは平均値±SEMで示され、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001で、対応のないt検定である。（I）明暗嗜好性試験の設計である。なお、両眼はいずれもNMDAによる治療を受け、そしてNMDA注射から2週間で同様のAAVを注射した。（J）暗室にいる時間の百分率である。WTは、n=8匹のマウスで、NMDAおよびGFAP-mCherryは、n=14匹のマウスで、NMDA、AAV-GFAP-mCherryおよびAAV-GFAP-CasRxは、n=12匹のマウスで、NMDA、AAV-GFAP-mCherryおよびAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1は、n=12匹のマウスである。すべての値は平均値±SEMで表示される。対応のないt検定で、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001である。 図9は、誘導されたRGCの視神経および脳部への投射の過程を示す。（A）代表的な画像によって5つの異なる時点（1週、1.5週、2週、3週および1か月）が示された。AAV注射から1.5週ではじめてtdTomato+軸索が見られた（黄色の矢印）。スケールバーは、50μmである。実験が独立に3回繰り返されたが、結果が近かった。（B）背側膝状核におけるtdTomato+軸索（黄色の矢印）の密度が段々増加してきた。なお、AAV注射から1.5週の時点で、対側の背側膝状核においてはじめてtdTomato+軸索が観察された。スケールバーは、500μm（上部）、50μm（下部）である。実験が独立に3回繰り返されたが、結果が近かった。（C）tdTomato+軸索（黄色の矢印）のSCへの投射の過程である。なお、AAV注射から2週の時点で、対側のSCにおいてはじめてtdTomato+軸索が観察された。スケールバーは、500μm（上部）、50μm（下部）である。実験が独立に3回繰り返されたが、結果が近かった。（D）誘導されたRGCの段階的な投射の過程を示す概略図である。 図10は、損傷した網膜における誘導されたRGCの投射の過程を示すが、図9に関連する。（A）代表的な画像によって3つの異なる時点（1週、2週、3週）が示されたが、NMDAによって誘導された視神経においてtdTomato+軸索が段々増加してきた。スケールバーは、50μmである。実験が独立に2回繰り返されたが、結果が近かった。（B）背側膝状核におけるtdTomato+軸索（黄色の矢印）の密度が段々増加してきた。スケールバーは、500μm（上部）、50μm（下部）である。実験が独立に2回繰り返されたが、結果が近かった。（C）上丘におけるtdTomato+軸索（黄色の矢印）の投射の過程である。スケールバーは、500μm（上部）、50μm（下部）である。実験が独立に2回繰り返されたが、結果が近かった。 図11は、CasRxを介する膠細胞からニューロンへの転換を示す。（A、B）注射プランの概略図である。注射から約1か月で転換の効率を評価した。STは、線条体である。（C）mCherryとGFAPの共局在である。GFAPを発現するmCherry+細胞の百分率で、n=3匹のマウスである。スケールバーは、20μmである。（D）AAV注射から1週でのFlag（CasRxと融合する）とGFAP共局在である。スケールバーは、20μmである。（E）AAV注射から1週で、線条体におけるPtbp1発現（Ptbp1抗体によって検出された）が下方調節された。抗Flagタグの抗体でCasRx（Flagと融合する）の発現を検出した。各群では、n＝4匹のマウスである。スケールバーは、10μmである。（F）ImageJによって定量的にPtbp1の蛍光強度を測定した。a.u.は任意単位を表す。（G）線条体の代表的な画像である。NeuNは成熟ニューロンの特異的なマーカーである。白色の矢印はNeuN発現とmCherryの非共局在を、黄色の矢印はNeuNとmCherryの共局在を示す。スケールバーは、50μmである。（H）mCherry+細胞におけるmCherry+NeuN+細胞の百分率である（各群では、n=6匹のマウスで、t=-4.7、p＜0.001である）。（I）画像によってmCherry+NeuN+グルタミナーゼ陽性細胞（ピンク色の矢印）とmCherry+NeuN+グルタミナーゼ陰性細胞（黄色の矢印）が隣接することが示された。スケールバーは、10μmである。（J）mCherry+NeuN+細胞におけるmCherry+グルタミナーゼ+NeuN+細胞の百分率である。n＝5匹のマウスである。（K）代表的な画像によってmCherry+NeuN+細胞とSomatostatinの共局在が少ないことが示された。黄色の矢印はmCherry+NeuN+Somatostatin-細胞を、ピンク色の矢印はmCherry+NeuN+Somatostatin+細胞を示す。対照AAVはmCherry+SST+細胞が存在しないことを示し、SST+細胞がAAV-GFAP-mCherryに感染しないことがわかる。実験が独立に5回繰り返されたが、結果が近かった。スケールバーは、20μmである。（L）代表的な画像によってmCherry+NeuN+細胞とPalvabuminの共局在がないことが示された。実験が独立に4回繰り返されたが、結果が近かった。スケールバーは、20μmである。（M）完全な線条体においてmCherry+TH+細胞が観察された（白色の矢印）。スケールバーは、20μmである。（N）mCherry+細胞におけるmCherry+TH+細胞の百分率で、各群では、n=5匹のマウスである。（O）通常、mCherry+TH+細胞においてNeuNの発現が低い（上部、白色の矢印）か、検出できないレベルである（下部、黄色の矢印）。スケールバーは、5μmである。実験が独立に5回繰り返されたが、結果が近かった。すべての値は平均値±SEMで表示される。対応のないt検定で、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001である。 図12は、パーキンソンモデルのマウスにおいて星状膠細胞がドーパミンニューロンに転換された。（AとB）実験の概要である。6-OHDAを片側から黒質に注射した。3週後、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1＋AAV-GFAP-mCherry、AAV-GFAP-CasRx＋AAV-GFAP-mCherryまたは生理食塩水をラットの同側（6-OHDA注入側に対する）の線条体に注入した。（B）AAV注射から約1か月または3か月で免疫染色を行った。（C）AAV注射から1か月または3か月で、転換したmCherry+TH+（黄色の矢印）およびmCherry+DAT+（黄色の矢印）細胞の共焦点画像である。オレンジ色の矢印は転換したmCherry+TH+DAT+細胞の神経シナプスを示す。なお、THおよびDATはドーパミンニューロンの特異的なマーカーである。スケールバーは、50μmまたは10μmである。（D）mCherry+細胞におけるmCherry+TH+細胞の百分率である。AAV-GFAP-CasRx、1か月：n=5匹のマウスで、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1、1か月：n=5匹のマウスで、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1、3か月：n=3匹のマウスである。（E）TH+細胞におけるmCherry+TH+細胞の百分率で、各群では、n=5匹のマウスである。スケールバーは、50μmである。（F）mCherry+細胞におけるmCherry+DAT+細胞の百分率である。AAV-GFAP-CasRx、1か月：n=5匹のマウスで、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1、1か月：n=5匹のマウスで、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1、3か月：n=3匹のマウスである。（G）mCherry+TH+細胞におけるmCherry+DAT+TH+細胞の百分率である。AAV-GFAP-CasRx、1か月：n=5匹のマウスで、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1、1か月：n=5匹のマウスで、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1、3か月：n=3匹のマウスである。（H）代表的な画像によってALDH1A1およびGIRK2の発現がmCherry+TH+（黄色の矢印）と共局在するが、Calbindinの発現（オレンジ色の矢印）がmCherry+DAT+と共局在しないことが示された。ALDH1A1およびGIRK2はSNc A9領域のドーパミンニューロンの特異的なマーカーで、calbindinはVTAドーパミンニューロンの特異的なマーカーである。各群では、n＝3匹のマウスである。スケールバーは、50μmである。（I）mCherry+細胞におけるmCherry+ALDH1A1+、mCherry+GIRK2+およびmCherry+calbindin+細胞の百分率である。各群では、n＝3匹のマウスである。（J）mCherry+TH+細胞におけるmCherry+TH+ALDH1A1+およびmCherry+TH+GIRK2+の百分率、ならびにmCherry+DAT+細胞におけるmCherry+DAT+calbindin+細胞の百分率である。各群では、n＝3匹のマウスである。（K）線条体の切片によって全細胞記録を行った（n=22の細胞）。当該図によってニューロン様mCherry+細胞の反復活動電位を発生させる能力（22個の細胞のうちの20個）および整流する能力（10個の細胞のうちの4個、緑色）。（L）画像によってニューロンを誘導する自発的シナプス電流が示された。（M）過分極した電位依存性電流である。（N）代表的な画像によってmCherry+TH+細胞がVMAT2（黄色の矢印）を発現したことおよびmCherry+TH+細胞におけるmCherry+VMAT2+TH+細胞の百分率で、n=3のマウスである。スケールバーは、20μmである。（O）画像によってAAV注射から1か月でmCherry+細胞がFFN206（青色）（蛍光ドーパミン誘導体）を取り込めることが示された。各群では、n≧10の切片である。スケールバーは、30μm（上部）、20μm（下部）である。（P）FFN206はmCherry+細胞（黄色の矢印）において放出された。画像によって高KClで誘導されたFFN206の放出が示された。スケールバーは、10μmである。（Q）AAV-GFAP-mCherry＋AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1を注射された切片におけるKClで誘導されたFFN206の放出の統計分析で、n=25のmCherry+blue+細胞である。5枚の切片（n=3匹のマウス）から25個の細胞を分析した。すべての値は平均値±SEMで表示される。対応のないt検定で、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001である。 図13は、6-OHDAで誘導されたパーキンソン病のマウスモデルにおいて、Ptbp1をノックダウンして星状膠細胞をドーパミンニューロンに転換させたことを示す。（A）実験の概略図である。（B）染色によって同側の黒質（6-OHDA注入側に対する）においてTH+ニューロン（緑色）が死亡したことが示された。スケールバーは、100μmである。実験が独立に12回繰り返されたが、結果が近かった。（C）DAT染色によって同側の線条体におけるドーパミンニューロン線維（緑色）がなくなったことが示された。スケールバーは、500μmである。実験が独立に＞10回繰り返されたが、結果が近かった。（D、E）代表的な共焦点画像により、AAVを注射された後の異なる時点におけるmCherry+TH+およびmCherry+DAT+細胞、ならびにmCherry+TH+およびmCherry+DAT+細胞の定量が示された。各群では、n≧3匹のマウスである。スケールバーは、50μmである。なお、「GFAP-CasRx、1か月」、「GFAP-CasRx-Ptbp1、1か月」および「GFAP-CasRx-Ptbp1、3か月」のデータは図6C、6Dおよび6にも示された。スケールバーは、50μmである。（F）パーキンソン病モデルのマウスにおけるTH+細胞の絶対数である。（G）mCherry+TH+細胞の共焦点画像およびTH+細胞におけるmCherry+TH+細胞の百分率で、各群では、n=5匹のマウスである。スケールバーは、50μmである。（H）mCherry+細胞におけるmCherry+TH+細胞の百分率である。なお、データは図6DとS6Nにも示された。（I）PDモデルのマウスにおけるDAT+細胞の絶対数である。（J、K）mCherry+DDC+細胞の共焦点画像およびmCherry+細胞におけるmCherry+DDC+細胞の百分率で、各群では、n=5匹のマウスである。DDCはドーパミンニューロンのマーカーである。スケールバーは、50μmである。（L、M）代表的な画像によってFOXA2とmCherry（黄色の矢印）の共局在、および細胞におけるmCherry+FOXA2+細胞の百分率が示された。各群では、n＝5匹のマウスである。FOXA2はドーパミンニューロンのマーカーである。スケールバーは、30μmである。（N）代表的な画像によってmCherry+TH+細胞が代表的な線条体の中間ニューロンのマーカーであるPV、SSTおよびCRと共局在しないことが示された。黄色の矢印はmCherry+TH+細胞を、青色の矢印はPV+、SST+またはCR+細胞を示す。なお、SSTはmCherryと共局在するが、THと共局在せず、これは図S1Hにおける結果と一致し、Ptbp1のノックアウトはわずかながらSST+ニューロンを誘導できることがわかる。実験が独立に3回繰り返されたが、結果が近かった。スケールバーは、20μmである。（O）AAV注射の前および1か月後の純転換数の比較である。点の上方の数字は、各群のマウスの数を表す。対応のあるt検定である。「1か月」のデータは図7にも示された。（P）アポモルフィン注射による実質回転数（回/分）である。各マウスは1か月と3か月の時点で行為を評価し、各群では、n=3匹のマウスである。二元ANOVAおよびbonferroniの検定である。「1か月」のデータは図7にも示された。（Q）アンフェタミン注射による実質回転数（回/分）で、各群では、n=3匹のマウスである。二元ANOVAおよびbonferroniの検定である。「1か月」のデータは図7にも示された。すべての値は平均値±SEMで表示される。対応のないt検定で、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001である。 図14は、誘導されたニューロンがパーキンソン病モデルのマウスの運動機能障害を軽減させたことが示された。（A）実験の設計である。（B）アポモルフィン注射による実質回転数（対側-同側）である。（C）アンフェタミン注射による実質回転数（同側-対側）である。（D）アンフェタミンを全身注射した後の同側の回転の総回転数に対する百分率（同側/総回転）である。（E）自発的な同側のタッチの総タッチ数に対する百分率である。（F）ロータロッド装置による測定である。結果はマウスの落下までの加速のロータロッドに停留した時間（秒）で表示される。バーの上方の数字は、各群のマウスの数を表す。全ての値は、平均値±SEMで表示される。一元配置分散分析、そしてTukey検定である。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001である。 図15は、体外におけるPtbp1ノックダウンツールのオフターゲットの検出方法を示す。検出群のプラスミドをそれぞれN2a細胞（1）に形質移入し、48時間後、細胞を収集し、フローサイトメーターによって形質移入陽性細胞（3）を選別し、RNAを抽出した後、トランスクリプトームのシーケンシング（3、RNA-seq）分析を行った。Ptbp1をノックダウンする異なるツールのオフターゲット効果を検出するために、実験では、Cas13e-sg（Ptbp1-target）実験群、およびCas13e-sg（none-target）対照群が設けられた。同時に、ほかの遺伝子編集ツールと比較するために、Cas13d-sg（Ptbp1-target）およびCas13d-sg（none-target）対照群ならびにshRNA（Ptbp1-target）およびshRNA(none-target)対照群が設けられた。結果から、Cas13e-sg（Ptbp1-target）の編集ツールの組み合わせが低いオフターゲット効果を有することがわかる。 図16は、体内におけるPtbp1ノックダウン後の分化転換の効率の検出方法を示す。本実験では、6-OHDAによって誘導されたパーキンソンマウスモデルを使用し、マウスMFB（Medial Forebrain Bundle、内側前脳束）に6-OHDAを注射してドーパミンニューロンを損傷させ、パーキンソン病の表現型をシミュレーションした。モデルの誘導から21日後、マウスの線条体（Striatum）にそれぞれ実験群および対照群のAAVウイルスを注射し、そして共に特異的に膠細胞を標識するAAVウイルス（GFAPプロモーターによって駆動されてmCherryを発現する）を注射した。ウイルスの注射から28日または90日で、行動測定分析および組織染色分析によって体内における分化転換の効率を検証した。本実験に関わる編集ツールはいずれもAAVベクターを使用し、実験では、Cas13e-sg（Ptbp1-target）実験群、ならびにCas13e-sg（none-target）、Cas13d-sg（Ptbp1-target）およびCas13d-sg（none-target）対照群が設けられた。以上の4群の遺伝子編集ツールは、いずれも膠細胞に特異的なGFAPプロモーターによって駆動されてCas13e/dタンパク質が発現され、U6プロモーターによって駆動されて相応するsgが発現される。同時に、shRNA（Ptbp1-target）、shRNA(none-target)対照群を増やし、U6プロモーターによって駆動されて発現される。結果から、Cas13e-sg（Ptbp1-target）の編集ツールの組み合わせがより効率的に膠細胞の体内における分化転換を実現させたことがわかる。

［具体的な実施形態］
本発明者は、幅広く深く研究したところ、初めて、意外に、膠細胞のptbp1遺伝子またはRNAあるいはそれによってコードされるタンパク質の発現または活性を抑制すると、有効に膠細胞から機能的ニューロンへの分化を誘導することができることで、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を治療することが可能になるこをを見出した。これに基づき、本発明者が本発明を完成した。

本発明において、網膜神経節細胞（RGC）の変性は永久的失明につながる要因である。一方、ミュラーグリア細胞（MG）の機能的RGCへの分化転換は視力の回復に役立つ。発明者は、成熟なマウス網膜においてRNAを標的とするCRISPR系CasRxによってPtbp1をノックダウンすることで、MGを直接機能的RGCに転換させることができることを見出した。また、NMDA（N-メチル-D-アスパラギン酸）によって誘導される網膜損傷のマウスモデルにおいて、MGから転換したRGCは、中央視覚野への機能的投射を実現させ、そして視覚機能が改善される。そのため、CasRxを介するPtbp1のノックアウトは、将来性のある神経変性による網膜疾患を治療する療法になる。

本願では、最近特徴づけされたRNA標的CRISPR系CasRxによってPtbp1を抑制することになっている。CasRxを介する再生は、DNA編集ヌクレアーゼによってshRNAによって誘導される実質的なオフターゲット効果の出現および永久的に遺伝子を改変するリスクを避け、多くの疾患を治療できる立派なツールを提供する。

本明細書で用いられるように、ミュラーグリア細胞（MG）は網膜組織における主な神経膠細胞で、網膜神経節細胞（RGC）は網膜の最内層に位置する神経細胞で、そのシナプスが主に双極細胞と連結し、その軸索は視神経頭まで伸び、視神経を形成する。

網膜疾患は眼部の疾患である。よく見られる網膜疾患は、以下の5種類がある。（１）血管および血管系の病変。たとえば、網膜血管閉塞、動脈硬化性、高血圧性、血液病性および糖尿病性の眼底病変など。（２）網膜炎症。脈絡膜炎および視神経炎と影響し合い、密接に関連する。（３）網膜剥離。網膜の神経層と色素上皮層の分離のことである。（４）網膜変性および栄養不良。遺伝的要素がある。（５）網膜腫瘍。中でも、網膜芽細胞腫が多く見られる。

本発明において、好適な網膜疾患は神経変性による網膜疾患で、症状が主に視力衰退または失明になっている。
本発明において、前記遺伝子エディターは、DNA遺伝子エディターおよびRNA遺伝子エディターを含む。一つの好適な実施形態において、本発明の遺伝子エディターは、遺伝子編集タンパク質および任意のgRNAを含む。

用語「リプログラミング」または「分化転換」とは、中間の分化過程がなく、異なる種類の細胞（たとえば、線維芽細胞）から特定の系統の細胞（たとえば、ニューロン）になることである。

機能的ニューロン死に関連する神経系疾患
本発明において、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患は、主に、パーキンソン病および視神経節死による視力障碍を含む。

一つの好適な実施形態において、機能的ニューロンの変性に関連する神経系疾患は、緑内障、年齢に関連するRGC喪失、視神経損傷、網膜虚血、Leber遺伝性視神経症、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、うつ病、麻薬依存、運動障害（たとえば舞踏病、高コレステロール血症や動作障害）、運動ニューロン損傷疾患（たとえば筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷）、躁うつ病、自閉症スペクトラム障害（ASD）、機能障害、パーキンソン病を含むが、これらに限定されない。

星状膠細胞
星状膠細胞は、哺乳動物の脳内で数が最も多い種類の細胞である。生化学的サポート（たとえば血液脳関門の形成）、ニューロンへの栄養供給、細胞外のイオンバランスの維持、および脳と脊髄の損傷後の修復および瘢痕の形成への関与を含む多くの機能を執行する。星状膠細胞はグリアフィラメントの含有量および突起の形状によって以下の2種類に分かれる。線維型星状膠細胞（fibrous astrocyte）は、脳および脊髄の白質における分布が多く、突起が細長く、分岐が少なく、細胞質にグリアフィラメントが多く含まれる。原形質型星状膠細胞（protoplasmic astrocyte）は、灰白質における分布が多く、細胞の突起が大まかで短く、分岐が多い。

本発明に使用可能な星状膠細胞は特に限定されず、哺乳動物の中枢神経系由来の各種類の星状膠細胞、たとえば線条体、脊髄、背側中脳または大脳皮質由来のもの、好ましくは、線条体由来のものを含む。

機能的ニューロン
本発明において、機能的ニューロンとは、化学または電気の信号によって情報を発信または受信できるニューロンのことである。一部の実施形態において、機能的ニューロンは正常な神経系に存在する成熟ニューロンの一つまたは複数の機能的特性を示し、興奮性（たとえば、活動電位を表す能力、たとえば快速の上昇およびその後の降下）（細胞膜をはさむ電圧または膜電位）、ほかのニューロンとのシナプス結合の形成、シナプス前神経伝達物質の放出およびシナプス後反応（たとえば、興奮性シナプス後電流または抑制性シナプス後電流）を含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態において、機能的ニューロンの特徴は機能的ニューロンの一つまたは複数のマーカーを発現することにあり、前記マーカーは、シナプシン、シナプトフィジン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ67（GAD67）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ67（GAD65）、パルバルブミン、ドーパミン・cAMP調節性リン酸化タンパク質32（DARPP32）、小胞グルタミン酸トランスポーター1（vGLUT1）、小胞グルタミン酸トランスポーター2（vGLUT2）、アセチルコリン、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパミン、小胞GABAトランスポーター（VGAT）およびγ-アミノ酪酸（GABA）を含むが、これらに限定されない。

ドーパミンニューロン
ドーパミン作動性ニューロン（dopaminergic neuron）は、ドーパミン(dopamine、DA)を含有して神経伝達物質として放出するニューロンである。ドーパミンは、カテコールアミン系神経伝達物質に属し、中枢神経系において重要な生物学的作用を発揮し、大脳内におけるドーパミン作動性ニューロンは主に中脳の黒質緻密部(substantria nigra pars compacta、SNc)、腹側被蓋野(ventral tegmental area、VTA)、視床下部および脳室周囲に集中している。多くの実験では、ドーパミン作動性ニューロンは人体の多くの疾患と密接に関連し、最も典型的なのはパーキンソン病であることが実証されている。

神経変性疾患
神経変性疾患は、脳部および脊髄のニューロンの喪失による疾患である。ニューロンは、神経系の最も重要な構成要素で、その死亡は最終的に神経系の機能障害につながる。患者は、神経変性疾患を罹患すると、行動または認知障害が生じ、病状の進展によって多くの合併症が発生し、患者の生活に大きな支障をもたらす。臨床において、神経変性疾患は、主に、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などを含む。現在、神経変性疾患には、疾患の進展の緩和または遅延しかできず、完治までにならない。パーキンソン病（PD）は重度な神経変性疾患で、その特徴は中脳黒質のドパミンニューロンの喪失である。

遺伝子エディター
本発明のにおいて、前記遺伝子エディターは、DNA遺伝子エディターおよびRNA遺伝子エディターを含む。一つの好適な実施形態において、本発明の遺伝子エディターは、遺伝子編集タンパク質および任意のgRNAを含む。

遺伝子編集タンパク質
本発明において、遺伝子編集タンパク質のヌクレオチドは、遺伝子工学技術、たとえばゲノムシークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって得られ、そのアミノ酸配列はヌクレオチド配列から推測することができる。前記野生型の遺伝子編集タンパク質の由来は、ルミノコッカス・フラベファシエンス(Ruminococcus Flavefaciens)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、アシドアミノコッカス属(Acidaminococcus sp)、ラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）を含むが、これらに限定されない。

本発明の一つの好適な例において、前記遺伝子編集タンパク質は、Cas13d、 CasRx、 Cas13e、CRISPR/Cas9、 Cpf1、 Cas9、 Cas13a、 Cas13b、Cas13c、 Cas13f、RNA標的遺伝子編集タンパク質を含むが、これらに限定されない。

ptbp1タンパク質およびポリヌクレオチド
本発明において、用語「本発明のタンパク質」、「ptbp1蛋白」、「ptbp1ポリペプチド」、「PTB」は、いずれもptbp1のアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを指し、入れ替えて使用することができる。これらは、開始のメチオニンを含有するか、含有しないptbp1タンパク質を含む。また、当該用語は、さらに、全長のptbp1およびその断片を含む。本発明で言及されるptbp1タンパク質は、その完全なアミノ酸配列、その分泌タンパク質、その突然変異体およびその機能的に活性の断片を含む。

ptbp1タンパク質はポリピリミジントラクト結合タンパク質1で、RNA結合タンパク質で、RNAスプライシングを調節する。同時に、RNAのほかの機能にも重要な作用を果たす。

本発明において、用語「ptbp1遺伝子」、「ptbp1ポリヌクレオチド」、「PTB遺伝子」は、いずれもptbp1のヌクレオチド配列を有する核酸配列を指し、入れ替えて使用することができる。

ヒトptbp1遺伝子のゲノムは全長14936 bpである(NCBI GenBank登録番号：5725)。
マウスptbp1遺伝子のゲノムは全長10004bpである(NCBI GenBank登録番号：19205)。

ヒトとマウスのptbp1は、DNAレベルの類似性が88％、タンパク質配列の類似性が84％である。なお、コードが同様のアミノ酸の場合、コドンにおけるヌクレオチドの置換は可能である。また、ヌクレオチドの置換によって保存的アミノ酸置換が生じる場合、ヌクレオチドの変更は可能である。

ptbp1のアミノ酸断片が得られると、それに基づいてそれをコードする核酸配列を構築し、そしてヌクレオチド配列から特異的なプローブを設計することができる。ヌクレオチド全長配列またはその断片は、通常、PCR増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られる。PCR増幅法について、本発明で公開されたptbp1のヌクレオチド配列、特に読み枠によってプライマーを設計し、市販のcDNAライブラリーまたは当業者に既知の通常の方法によって調製されるcDNAライブラリーを鋳型とし、増幅して関連配列を得る。配列が長い場合、通常、2回または2回以上のPCR増幅を行った後、各回の増幅で得られた断片を正確な順でつなげる必要がある。

関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。

また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。

現在、本発明のタンパク質（またはその断片、誘導体）をコードするDNA配列は全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（たとえばベクター）や細胞に導入してもよい。

通常の組み換えDNA技術によって、本発明のポリヌクレオチド配列で組み換えのptbp1ポリペプチを発現または生産することができる。一般的に、以下の工程を含む：
（1）本発明のヒトptbp1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（または変異体）を使用し、あるいはこのポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する；
（2）適切な培地において宿主細胞を培養する；
（3）培地または細胞からタンパク質を分離し、精製する。

本発明において、ptbp1のポリヌクレオチド配列は組み換え発現ベクターに挿入してもよい。つまり、宿主体内で安定して複製することができれば、どんなプラスミドおよびベクターでも使用できる。発現ベクターの重要な特徴の一つは、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御エレメントを含むことである。

ptbp1のコードDNA配列および適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの構築に当業者によく知られている方法を使用することができる。これらの方法は、体外組み換えDNA技術、DNA合成技術、体内組み換え技術などを含む。前記のDNA配列は、有効に発現ベクターにおける適切なプロモーターに連結し、mRNA合成を指導することができる。発現ベクターは、さらに、翻訳開始用リボゾーム結合部位および転写ターミネーターを含む。

また、発現ベクターは、好ましくは1つまたは2つ以上の選択性マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞を選択するための形質、たとえば真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性および緑色蛍光タンパク質（GFP）、あるいは大腸菌用のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を提供する。

上記の適切なDNA配列及び適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主細胞を形質転換し、タンパク質を発現するようにすることができる。
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属の細菌細胞、酵母のような真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などがある。

DNA組み換えによる宿主細胞の形質転換は当業者に熟知の通常の技術で行ってもよい。宿主が原核細胞、たとえば大腸菌である場合、DNAを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、CaCl₂法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、MgCl₂を使用する。必要により、形質転換はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのDNAトランスフェクションの方法が用いられる。

得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は通常の培地を選んでもよい。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適当の細胞密度に成長したら、適切な方法（たとえば温度転換もしくは化学誘導）で選んだプロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。

上記の方法における組み換えポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現し、あるいは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）およびほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、ならびにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。

アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus、AAV）は、ほかのウイルスベクターよりも小さく、非病原性で、***中および未***の細胞に形質移入が可能といった特性のため、AAVベクターに基づいた遺伝性疾患に対する遺伝子治療方法は幅広く注目されている。

アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、AAV)は、アデノ関連ウイルスとも呼ばれ、パルボウイルス科ディペンドウイルス属に属し、現在発見された構造が最も簡単な一本鎖DNA欠陥型ウイルスで、複製にヘルパーウイルス（通常、アデノウイルス）の関与が必要である。2つの末端逆位反復配列（ITR）におけるcapおよびrep遺伝子をコードする。ITRはウイルスの複製およびパッケージングに決定的な作用がある。cap遺伝子はウイルスのカプシドタンパク質をコードし、rep遺伝子はウイルスの複製およびインテグレーションに関与する。AAVは多くの細胞に感染することができる。

組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（rAAV）は、非病原性の野生型アデノ随伴ウイルス由来で、安全性が良く、宿主細胞の範囲が広く（***中および未***の細胞）、免疫原性が低く、体内において外来遺伝子を発現する時間が長いといった特徴のため、最も将来性のある遺伝子導入ベクターの一つとされ、世界中の遺伝子治療およびワクチンの研究において幅広く応用されている。十数年の研究を経て、組み換えアデノ随伴ウイルスの生物学的特性は深く知られ、特に様々な細胞、組織および体内の実験における応用効果において多くの資料が蓄積されている。医学の研究において、rAAVは多くの疾患の遺伝子治療の研究（体内、体外の実験を含む）に使用され、同時に、特徴のある遺伝子導入ベクターとして、遺伝子機能の研究、疾患モデルの構築、遺伝子ノックアウトマウスの作製などにも幅広く使用されている。

本発明の一つの好適な実施例において、ベクターは組み換えAAVベクターである。AAVは、比較的に小さいDNAウイルスで、安定して部位特異的に感染された細胞のゲノムに組み込むことができる。幅広い細胞に感染可能で、細胞の生長、形態または分化に何らの影響もなく、そして人体病理学に関わらないようである。AAVのゲノムは既にクローニング、シーケンシングおよび特徴づけをされている。AAVは各末端に約145塩基の末端逆位反復配列（ITR）の領域が含まれ、ウイルスの複製起点とされている。当該ゲノムのほかの部分は2つのカプシド形成機能を有する重要な領域に分かれ、それぞれ、ウイルスの複製およびウイルスの遺伝子発現に関与するrep遺伝子を含むゲノムの左側の部分、ならびにウイルスのカプシドタンパク質をコードするcap遺伝子を含むゲノムの右側の部分である。

AAVベクターは本分野の標準方法によって製造することができる。いずれの血清型のアデノ随伴ウイルスも適する。ベクターを精製するための方法は、たとえば米国特許No.6566118、6989264および6995006を参照するが、これらの公開内容を全体として引用で本明細書に取り入れる。ハイブリッドベクターの製造は、たとえばPCT出願No.PCT/US2005/027091に記載されているが、当該出願の開内容を全体として引用で本明細書に取り入れる。体外と体内の遺伝子導入のためのAAV由来のベクターの使用は既に記載されている（たとえば、国際特許出願公開No.WO91/18088およびWO93/09239、米国特許No.4,797,368、6,596,535および5,139,941、ならびに欧州特許No.0488528を参照するが、これらのいずれも引用で本明細書に取り入れる）。これらの特許では、そのrepおよび/またはcap遺伝子が欠失して注目の遺伝子で置き換えられた様々なAAV由来の構築体、ならびに体外（培養された細胞に入る）または体内（直接生体に入る）において注目の遺伝子を導入するためのこれらの構築体の使用が開示されている。複製欠陥の組み換えAAVは以下のプラスミドでヒトヘルパーウイルス（たとえばアデノウイルス）に感染された細胞系に共形質移入して製造することができる：含まれる注目の核酸配列が2つのAAV末端逆位反復配列（ITR）領域にはさまれたプラスミド、ならびにAAVカプシド形成遺伝子（repおよびcap遺伝子）を持つプラスミド。そして、標準技術によって生成したAAＶ組み換え体を精製する。

一部の実施形態において、組み換えベクターはカプシド形成してウイルス粒子（たとえば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15およびAAV16のAAVウイルス粒子を含むが、これらに限定されない）に入っている。そのため、本開示は本明細書に記載のいずれのベクターを含有する組み換えウイルス粒子（組み換えポリヌクレオチドを含むことで組み換えたもの）も含む。このような粒子を生成する方法は本分野で既知のもので、米国特許No.6,596,535に記載されている。

ptbp1阻害剤および薬物組成物
本発明のタンパク質を利用し、様々な通常のスクリーニング方法により、ptbp1遺伝子またはタンパク質と相互作用する物質、特に阻害剤などをスクリーニングすることができる。

本発明に使用可能なptbp1阻害剤（または拮抗剤）は、ptbp1遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の発現および/または活性を抑制できる物質のいずれも含む。

たとえば、前記ptbp1の阻害剤は、ptbp1の抗体、ptbp1核酸のアンチセンスRNA、siRNA、shRNA、miRNA、遺伝子エディター、またはptbp1活性阻害剤を含む。一つの好適なptbp1の阻害剤は、ptbp1の発現を抑制できる遺伝子エディターである。

好ましくは、本発明のptbp1の阻害剤は、ptbp1遺伝子配列の4758～4787番目、および/または5381～5410番目を標的とする阻害剤を含む。本発明のptbp1阻害剤が作用する対象は、星状膠細胞またはMG細胞を含む。

一つの好適な実施形態において、ptbp1を抑制する方法および工程は、ptbp1の抗体でそのタンパク質を中和させ、ウイルス（たとえばアデノ随伴ウイルス）が持つshRNAまたはsiRNAまたは遺伝子エディターでptbp1遺伝子のサイレンシングを行うことを含む。

ptbp1に対する抑制率は、通常、少なくとも50％以上に達する抑制で、好ましくは60％、70％、80％、90％、95％の抑制で、通常の技術、たとえばフローサイトメトリー、蛍光定量PCRまたはウエスタンブロットなどの方法によってptbp1の抑制率を制御・検出することができる。

本発明のptbp1タンパク質の阻害剤（抗体、アンチセンス核酸、遺伝子エディターおよびほかの阻害剤を含む）は、治療で施用（投与）すると、ptbp1タンパク質の発現および/または活性を抑制することにより、膠細胞の機能的ニューロンへの分化を誘導することで、機能的ニューロンの変性に関連する神経系疾患を治療することができる。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、pH値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、pH値は通常5～8程度、好ましくは6～8程度である。配合された薬物組成物通常の経路で給与することができ、局所、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、皮内、局部給与、自己細胞の抽出・培養後の再静注などを含むが、これらに限定されない。

また、本発明は、安全有効量の本発明の阻害剤（たとえば、抗体、遺伝子エディター、アンチセンス配列（たとえばsiRNA）、または阻害剤）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む薬物組成物を提供する。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。錠剤やカプセルのような薬物組成物は、通常の方法で調製することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液、錠剤やカプセルの場合、無菌条件で製造するほうがよい。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約1μg-10 mg／kg体重である。

本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明では、初めて、星状膠細胞におけるPtbp1遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の発現または活性を低下させると、星状膠細胞のドーパミンニューロンへの分化を誘導することで、神経変性疾患（たとえばパーキンソン病）を予防および/または治療することができることが見出された。

（2）本発明では、初めて、遺伝子エディター（遺伝子編集タンパク質およびgRNAを含む）で星状膠細胞におけるptbp1の発現を抑制すると、星状膠細胞をドーパミンニューロンに分化転換させることで、パーキンソン病の治療に潜在のアプローチを提供することができることが見出された。

（3）本発明では、初めて、ドーパミンニューロンの誘導によってパーキンソンマウスモデルの運動機能障害が緩和されることが見出された。
（4）本発明では、初めて、RNAを標的とするCRISPR系CasRxによって従来のCRISPR-Cas9編集による永久的なDNA改変のリスクが避けられることが見出された。そのため、CasRxを介するRNA編集は様々な疾患に有効な手段を提供する。

（5）本発明では、網膜におけるPtbp1の発現を抑制することにより、MGを直接機能的RGCに転換させる。
（6）再生のRGC細胞は、視覚経路に取り込まれ、RGC損傷マウスモデルの視覚機能を改善することができる。

（7）本発明では、RNAを標的とするCRISPR系CasRxでPtbp1をノックダウンするため、shRNAによって誘導される実質的なオフターゲット効果の出現および永久的に遺伝子を改変するリスクを避け、多くの疾患を治療できる立派なツールを提供する。

以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。

特別に説明しない限り、本発明の実施例で使用された材料または試薬はいずれも市販品である。
共通の方法
動物倫理：動物の使用および飼養は中国科学院神経科学研究所生物医学研究倫理委員会の指導原則に沿っている。

ガイドRNA配列
ガイド1: 5’-tttgtaccgactgctatgtctgggacgat-3’(配列番号1)、
ガイド2：5’-ggctggctgtctccagagggcaggtcaggt-3’(配列番号2)、
ガイド3：5’-gtatagtagttaaccatagtgttggcagcc-3’(配列番号3)、
ガイド4：5’-gctgtcggtcttgagctctttgtggttgga-3’(配列番号4)、
ガイド5：5’-tgtagatgggctgtccacgaagcactggcg-3’(配列番号5)、
ガイド6：5’-gcttggagaagtcgatgcgcagcgtgcagc-3’(配列番号6)。

星状膠細胞の一過性形質移入およびqPCR：星状膠細胞の分離および培養は前記の通りである¹。要約すると、星状膠細胞を6ウェルプレートに接種した。標準プロトコールに従ってLipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）を使用し、3μgのgRNA-CasRx-GFPを発現するベクターで一過性形質移入を行った。対照プラスミドは非標的ガイドを発現する。一過性形質移入から1～2日後、蛍光活性化細胞選別（FACS）によってGFP陽性細胞を収集して分解させてqPCR分析を行った：まず、Trizol （Ambion）でRNAを抽出し、さらに逆転写キット（qPCRのためのHiScript Q RT SuperMix、Vazyme、Biotech）でRNAをcDNAに逆転写した。AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme、Biotech）で増幅を追跡した。Ptbp1のqPCRプライマーは、フォワードの5'-AGAGGAGGCTGCCAACACTA-3'(配列番号13)、リバースの5'-GTCCAGGGTCACTGGGTAGA-3'(配列番号14)である。

定位的注射：当該研究においてAAV8（図1）およびAAV-PhP.eb（図2と3）が使用された。定位的注射（C57BL / 6,1-3个月大）の方法は前記の通りである²。図1および図2、3におけるAAV-CasRx-Ptbp1の力価はそれぞれ約5×10e12（2μl/回注射）および1.6×10e13（2～3μl/回注射）である。AAVを線条体（AP + 0.8mm、ML±1.6mmおよびDV-2.8mm）に注入した。

免疫蛍光染色：免疫蛍光染色は注射から5～6週（図1）または3～4週（図2と3）で実施された。マウスは灌流後、脳を採取して4％パラホルムアルデヒド（PFA）で一晩固定し、そして30％ショ糖において少なくとも12時間保存した。包埋後、凍結切片を作ったが、切片の厚さは35μmである。免疫蛍光染色の前、0.1Mリン酸塩緩衝液（PB）で脳切片を徹底的に洗浄した。一次抗体：ウサギポリクローナルNeuN抗体（脳、1：500、＃ABN78、Millipore）、ウサギポリクローナルTbr1抗体（＃NG1854874、Millipore）、マウスTH抗体（1：300、MAB318、Millipore）およびウサギDAT抗体（1：100、MAB369、Millipore）。二次抗体：当該研究においてロバ抗マウス（＃715-545-150、Jackson ImmunoResearch）、ロバ抗ウサギ（＃711-545-152、Jackson ImmunoResearch）が使用された。抗体でインキュベートした後、切片を洗浄して封入剤（Life Technology）で被覆した。

電気生理学的記録：AAV注射から5～6週で電気生理学的記録を行ったが、方法は前記の通りである³。要約すると、マウスを麻酔して心臓灌流を行った後、脳を二酸化炭素で充満したNMDG人工脳脊髄液（aCSF）[NMDG aCSF（mM）：NMDG 92、塩化カリウム 2.5、リン酸二水素ナトリウム 1.25、炭酸水素ナトリウム 30、HEPES 20、ブドウ糖25、チオウレア2、アスコルビン酸ナトリウム5）、室温において、ピルビン酸ナトリウム3、塩化カルシウム 0.5、硫酸マグネシウム10]に入れた。灌流後、脳を採取して氷で冷却されたNMDG aCSF溶液に30秒置いた。脳をカットして250～350μmの厚さで切片にし、速度は0.04～0.05 mm/sであった。脳切片を二酸化炭素で充満したNMDG aCSFの皿に移し、そして32～34℃で≦12分間維持した。室温において、切片を二酸化炭素で充満したHEPES aCSFの新しい皿に移した[HEPESには、aCSF（mM）：塩化ナトリウム 92、塩化カリウム 2.5、リン酸二水素ナトリウム 1.25、炭酸水素ナトリウム 30、HEPES 20、ブドウ糖25、チオウレア2、アスコルビン酸ナトリウム5、ピルビン酸ナトリウム3、塩化カルシウム 2、硫酸マグネシウム2が含まれる]。1時間語、切片を記録皿に移し、当該皿に記録緩衝液が入れてあった[記録aCSF（mM）：塩化ナトリウム 119、塩化カリウム2.5、リン酸二水素ナトリウム 1.25、炭酸水素ナトリウム 24、ブドウ糖12.5、塩化カルシウム 2、硫酸マグネシウム 2]。顕微鏡（Olympus BX51WI）においてニューロン様mCherry陽性細胞を記録し、そしてClampex 10でエータを得た。

6-OHDA PDマウスモデル
当該研究の過程は以前の研究に基づいたものである⁴。成年C57BL/6マウス（7～10週）に腹腔注射した。麻醉の半時間前に25mg/kgの塩酸デシプラミン（D3900、Sigma-Aldrich）を注射した。麻醉後、以下の座標でマウスの右側内側前脳束に3μgの6-OHDA（H116、Sigma-Aldrich）または生理食塩水を注射した：前後方（A / P）= -1.2 mm、内外側（M / L）= -1.1 mm、背腹（D / V）= -5 mm。手術から1時間ですべてのマウスに1mlの4％ブドウ糖-食塩水溶液を皮下注射した。マウスはその後の3週内で浸漬された食物の顆粒を摂取させた。

アポモルフィンによって誘導される回転試験
マウスは試験の10分前に0.5mg/kgのアポモルフィン（A4393、Sigma-Aldrich）を腹腔注射した。その後、それぞれ不透明の円柱体（直径30 cm）の中に置き、カメラで上方から20分間記録した。回転の定義は全身の向き変えで、ここで、1本の後ろ足を中心にし、かつ頭部の向きの切り替えがない。注射側と対側の回転数を計算した。データを20分間内の対側の逆転数に数値化した。

シリンダー試験
各マウスを慎重にガラスビーカー（1000 ml）に置き、その前のカメラで10分間記録した。それぞれ注射側と対側の壁にタッチする回数を計算し、そしてデータを同側の壁タッチ数と総壁タッチ数の比率に数値化した。

ロータロッド試験
すべてのマウスを2日訓練させて3日目にテストを行った。1日目は、ロータロッドの上で4回転/分の一定の速度でマウスを4回、毎回300秒で訓練させた。2日目と3日目は、4～40回転/分の加速訓練でマウスを4回テストした。マウスの落下までのロッドに停留した時間を停留期間として記録し、そして最も長い上位3つの停留期間の平均値で分析した。

統計分析：s.e.m.からエラーバーを設け、対応のない両側t検定または一元配置分散分析によって統計的有意性を計算した（p＜0.05）。すべての実験は無作為に設定され、統計学的方法によってサンプル数を予め確定しなかったが、こちらのサンプル数は前の文献における報告を参照した⁵。データの分布が正常であると仮定されたが、正式に検定されていない。データの収集および分析は盲検の条件において行われなかった。

N2a細胞の一過性形質移入、qPCRおよびRNA-seq
N2a細胞を6ウェルプレートに接種した。標準プロトコールエベロリムスLipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)を使用失しし、7μgのgRNA-CasRx-GFPを発現するベクターで細胞の形質移入を行った。対照プラスミドはgRNAを発現しない。形質移入の2日後、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって各サンプルに対して約50000個のGFP陽性細胞を収集し、分解させてqPCR分析に用いた。同時に、網膜を分離してAAVの発現を測定した。Trizol （Ambion）でRNAを抽出し、失し逆転写キット(qPCRのためのHiScript Q RT SuperMix、Vazyme、Biotech）でRNAをcDNAに転換した。AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme、Biotech)で増幅過程を追跡した。

Ptbp1のqPCRプライマーは、上流プライマーの5’-AGAGGAGGCTGCCAACACTA-3’(配列番号7)、
下流プライマーの5’-GTCCAGGGTCACTGGGTAGA-3’(配列番号8)である。

CasRxのqPCRプライマー、上流プライマーの5’-CCCTGGTGTCCGGCTCTAA-3’(配列番号9)、
下流プライマーの5’-GGACTCGCCGAAGTACCTCT-3’(配列番号10)である。

RNA-seqは、15 cm培養シャーレにおいてN2a細胞を培養し、そして70μgのプラスミドで一過性形質移入を行った。FACSによって～500000のGFP陽性(前20％GFP)のN2a細胞を収集し、RNAを抽出し、cDNAに転換させた後、全トランスクリプトームのRNA-seqに使用した。

硝子体内および網膜下への注射
前記のように、それぞれ硝子体内および網膜下にNMDAおよびAAV(AAV-PHP.eB)を注射して導入した。網膜下への注射は、Olympus顕微鏡(Olympus、日本東京)においてハミルトンシリンジ(32G針)で目に高力価(＞1×10¹³)のAAVを注射した。完全な網膜におけるリプログラミングを確認するため、網膜下へ注射(Ai9およびC57BL/6マウス、5週齢)で計1μlのGFAP-GFP-Cre(0.2μl)とGFAP-CasRx-Ptbp1(0.8μl)、またはGFAP-Cre-GFP(0.2μl)とGFAP-CasRx(0.8μl)を網膜に送達した。損傷した網膜におけるリプログラミングを確認するために、PBSにNMDAを濃度が200mMになるように溶解させた後、硝子体内へ注射で1.5μlのNMDA溶液を4～8週齢のAi9マウスまたは5～6週齢のC57BL/6マウスの目に注入した(VEPおよび明暗嗜好性試験に使用した)。NMDA注射から2～3週後、GFAP-GFP-CreをGFAP-CasRx-Ptbp1またはGFAP-CasRxとともに網膜下注射で網膜に同時送達した。損傷した網膜の機能的レスキューを評価するために（VEPおよび明暗箱シャトル実験）、5～6週齢のマウス(C57BL/6)にNMDAを注射した網膜の損傷を誘導し、そして注射の2～3週後にGFAP-mCherry(0.2 μl)とGFAP-CasRx-Ptbp1 (0.8 μl)またはGFAP-CasRx (0.8 μl)の混合物を送達した。

免疫蛍光染色
AAV注射から1か月後、目、視神経および脳を採取し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で2時間（目と視神経）または24時間（脳部）固定し、そして30％ショ糖において2時間（目と視神経）または24時間保存した。包埋と凍結の後、目および大脳を30μmの厚さで切片にした。免疫蛍光染色に使用された一次抗体は、マウス抗Brn3a(1：100、MAB1585、Millipore)、ウサギ抗RBPMS(1：500,15187-1-AP、Proteintech)、ウサギ抗Sox9(1：500、AB5535、Millipore)、ウサギ抗Pax6(1：500,901301、Biolegent)、ウサギ抗Prox1(1：500、AB5475、Millipore)で、そして二次抗体は、Cy ^TM 5 AffiniPure Donkey マウス抗 IgG(H + L)(1：500,715-175-150、Jackson ImmunoResearch)、Cy ^TM 5 AffiniPure Donkey ウサギ抗IgG(H + L)(1：500,711-175-152、Jackson ImmunoResearch)である。抗体を敷いた後、切片を洗浄して封止した。Olympus FV3000顕微鏡で画像を得た。

電気生理学
マウスは、安楽死の前、一晩、暗環境に慣れさせた。室温の赤外顕微鏡において、126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、2 mM CaCl₂、2mM NaHCO₃および10mMブドウ糖を含有する酸素含有(95％ O₂ / 5％ CO₂)人工脳脊髄液(ACSF)の中で網膜の解剖を行った。正立顕微鏡の台の上において、網膜のRGCを細胞記録槽に向くように置いた。二光子(λ = 1030 nm)顕微鏡で神経節細胞層におけるtdTomato陽性細胞を識別し、そして赤外線において細胞の付着の記録を行った。記録用ピペット(4～7 MΩ)にASCFおよび0.25 mMのAlexa488水和を添加した。Multiclamp 700AアンプおよびpClamp10ソフトのセット(Molecular Devices)で記録した。1 kHzで信号をローパスフィルターに通させ、10 kHzでデジタル化した。白色LED光で全視野の光刺激を伝送した。記録完了後、電流パルスを注入し、形態が可視化できるように細胞を充填した。

視覚誘発電位
マウスの腹内にフェンタニル(0.05mg/kg)、ミダゾラム(5mg/kg)およびメデトミジン(0.5mg/kg)の混合物を注射した。マウスの頭部を脳定位固定装置に固定し、そして電気毛布で体温を37℃に維持した。一次視覚野(V1)(AP -3.6 ～ - 3.9 mm、ML 2.2 mm)の両側の上方から開頭し(直径約1 mm)、そして硬膜を除去した。視覚刺激は17インチ液晶ディスプレイ(Dell P170S、最大明度69 cd/m²)によって放出され、当該ディスプレイは記録端の目から8センチ離れ、同時に視覚刺激の影響を受けないように記録端と同側の眼部の横を遮った。100回の2秒の繰り返しのフラッシュ刺激(全視野、100％コントラスト)を行い、間隔は2秒である。マルチポイントシリコンプローブ(A1×16-5mm-50-177、NeuroNexus Technologies) でV1(AP -3.6～- 3.9 mm、ML 2.2 mm)において記録し、毎回の記録の電極先端が到達する皮質の深さが約900μmであった。小開頭手術において参照線とアース線はいずれも記録ポイントから少なくとも3 mmの位置に置かれた。Cerebus 32チャネルシステム(Blackrock microsystems)によって神経反応を増幅させてフィルターに通させた。広帯域フロントエンドフィルター(0.3 ～ 500 Hz)によって2 kHzまたは10 kHzにおいて局所フィールド電位(LFP)の信号をサンプリングした。皮質層⁴³の位置を確定するために、LFPの全画面フラッシュ刺激に対する反応は電流源密度(CSD)分析に使用された。CSD分布の断面図を作成するために、以下の方程式でLFPの二階空間微分項を算出した。

層4（顆粒層）は初期電流受信器における記録された位置とされた。最大平均振幅を示す層4チャネルで各マウスの視覚誘発反応を分析した。

明暗嗜好性試験
明暗箱シャトル試験に使用された設備は、ドア付きの箱を含み、それが小さい（三分の一）暗箱部分と大きい（三分の二）照明部分に分かれる。マウスは2つの区画の間で自由に10分間移動することができる。マウスは各区画にいる時間はカメラで記録され、そしてEthovision XTで分析した。臭覚のヒントがないように、毎回の試験後、70％エタノールで区画をクリーニングした。

統計分析
すべての値は平均値±s.e.m.で表示される。対応のないt検定は統計的有意性の確認に使用された(p＜0.05)。すべての実験は無作為なもので、統計学的方法によってサンプルの規模を予想しなかったが、こちらのサンプル規模は前の出版物における報告に近い。データの分布が正常であると仮定されたが、正式にアッセイされていない。

実施例1 CasRxによる体外における特異的なPtbp1のノックダウン
CasRxを介するPtbp1のノックダウンの効率を確認するために、まず、6つのPtbp1を標的とするgRNAを設計し、そして培養されたN2a細胞および星状膠細胞におけるそれらの抑制効率を比較した（図1Aと1B）。2つのPtbp1のエクソンIVとVII領域を標的とするgRNA（5と6の組み合わせ）を共形質移入させると、それぞれN2a細胞および星状膠細胞において87％±0.4％および76％±4％の低下を実現させることができた（図1Cと1D）。さらに、RNA全トランスクリプトームシーケンシングのデータから、このようなノックダウンは非常に特異的なものであることが示された（図1E、1Fおよび2A）。

実施例2 成熟網膜におけるミュラーグリア細胞から視神経節細胞化合物への転換
従来の研究では、shRNAでPtbp1をノックダウンすると、培養されたマウス線維芽細胞およびN2a細胞を機能的ニューロンに転換させることができることが発見されたが、それから、成熟網膜において、Ptbp1のノックダウンにより、体内でミュラーグリア細胞を視神経節細胞に転換させることができるか、研究した。特異的かつ永久的に網膜ミュラーグリア細胞を標識するために、AAV-GFAP-GFP-CreをAi9マウス（Rosa-CAG-LSL-tdTomato-WPRE）の目に注入して特異的にtdTomatoのミュラーグリア細胞における発現を誘導した（図2Bと2C）。また、特異的にミュラーグリア細胞におけるPtbp1をノックダウンするように、ミュラーグリア細胞の特異的なプロモーターGFAPによって駆動されるAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1（gRNA 5+6）を構築し、同時にPtbp1を標的としない対照ウイルスAAV-GFAP-CasRxを構築した（図3Aと2D）。まず、約5週齢のAi9マウスの網膜下にAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1およびAAV-GFAP-Cre-GFPを共に注射し、1か月後、多くのtdTomato陽性の細胞と視神経節細胞に特異的な抗体Brn3aまたはRbpmsの網膜視神経節細胞層（GCL）における共標識が見られたが、対照AAVベクターを注射された網膜においてこのような細胞が見られなかった（図3B～3E）。これらの結果から、成熟網膜においてPtbp1のノックダウンによってミュラーグリア細胞から視神経節細胞化合物への転換が可能であることがわかる。なお、転換された視神経節細胞はミュラーグリア細胞ではなくなるため、GFAPによって駆動されるGFPの発現も誘導された視神経節細胞において低下した（図2E）。同時に、ほかの方法でもこのような存在が証明された（図4）。視神経節細胞以外、アマクリン細胞も見られた（図5）。

実施例3 網膜損傷マウスモデルにおけるMGからRGCへの転換
MGによって誘導されるRGCで網膜損傷マウスモデルにおいて失われたRGCを補うことができるか、検討するため、4～8週齢のAi9マウスの硝子体内にNMDA（200 mM）を注射し、ほとんどのRGCの死亡および内網状層（IPL）の厚さの減少をさせた。NMDA注射から2～3週後、目にAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1＋AAV-GFAP-GFP-Creまたは対照AAVウイルスを注射した（図6Aと6B）。AAV注射から1か月で、視神経節細胞層のBrn3aまたはRbpms陽性細胞の数がAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1を注射された網膜において明らかに増加したことが見られた。興味深いのは、これらの細胞はほとんどtdTomato陽性のものであることである。一方、対照AAVを注射された視神経節細胞層では、増加が見られなかった（図6C～6F）。MGによって誘導されるRGCは網膜経路に組み込まれて視覚情報を受信する能力を有するか、確認するために、二光子顕微鏡においてMGによって誘導されたRGCに対して細胞外記録を行うことにより、光刺激による反応をモニタリングした（図6G）。検査された8個の細胞のうち、6個の細胞が光刺激による活動電位を示したことが見られた（図6H）。これらの細胞のうち、5つはON細胞、1つOFF細胞であった（図6）。これらの結果から、機能的RGCは損傷網膜においてミュラー細胞におけるPtbp1の発現を低下させることによってMGから転換できることがわかる。

実施例4 誘導される視神経節細胞による視覚機能の部分的な回復
視覚系において、視覚情報はRGCによって大脳の背側外側膝状核および上丘に投射される（図8A）。永久的に損傷した網膜において、治療によって網膜および視神経に大量のtdTomato陽性の軸索が観察されたが、対照群では、このような軸索が見られなかった（図8Bと8C）。注目すべきのは、背側膝状核および上丘にも大量のtdTomato陽性の軸索が見られ、かつ大脳の対側の分布が同側よりも多かったことで（図8Dと8E）、これはRGCの正常なマウスにおける正確な投射と一致する。損傷した視覚機能は誘導されるRGCによって改善されるか、研究するためである。AAVウイルスの注射から1か月後、麻酔されたマウスの一次視覚野（V1）において視覚誘発電位（VEP）が記録された（図8F）。AAV-GFPA-CasRx-Ptbp1とAAV-GFAP-mCherryで処理された網膜損傷のマウスにおいて、非常に顕著な誘発電位が見られ、そして幅は未損傷のマウスで見られたものに近かった。対照群では、非常に弱い反応しか観察されなかった（図8Ｇと8Ｈ）。これらの結果は、視神経細胞の誘導はたぶん大脳における現存の機能的な背側膝状核のニューロンを介してシナプス結合を作ることにより、部分的に視覚情報の一次視覚野への伝達を回復させたということを支持する。行動学の角度から、CasRxを介するMGからRGCへの転換が網膜損傷によって失われた視力行動を回復させるか、検討した（図8I）。まず、マウスの両眼にNMDAを注射し、さらにAAVウイルスを注射した。明暗嗜好性試験において、治療されなかったマウスは暗室にいる顕著な傾向がなかったが、これは網膜損傷による視力喪失に一致する。これに対し、治療されたマウスは暗室にいる持続時間が顕著に増え、健康な対照マウスのレベルに近かったが（図8J）、誘導された視神経細胞によって視力損傷マウスの視覚行動が改善されたことが示唆された。

実施例5 視神経節細胞の大脳への投射プロセス
どの時点からミュラーグリア細胞から誘導される視神経節細胞が見られるようになるか、探索するために、5つの異なる時点（1週、1.5週、2週、3週、および1か月）を設けた。AAV注射から1.5週の時点で、初めて、網膜にtdTomato+Rbpms+およびtdTomato+Brn3a+細胞が見られ、かつこれらの細胞の数が経時的に増えていった（図7Aと7B）。その結果から、AAV注射から1.5週で、誘導されたRGCがINLから視神経細胞層に移動する中間段階が存在することが示された（図7C）。これらの発見は、NMDAによって誘導された永久的損傷の網膜においても実証された（図7D）。どの時点から正確な脳領域に投射されるようになるかについて、まず、視神経におけるtdTomato陽性軸索が経時的に増加していたことが見出された（図9A）。大脳において、1週の時点で脳内に何らの投射も見られなかったが、AAV注射から1.5週の時点から対側の背側膝状核にtdTomato陽性の軸索が見られるようになったが、このような投射は同側に現れないものである（図9B）。AAV注射から2週の時点で、対側の視床下部に誘導された視神経節細胞の投射が見られるようになり（図5C）、AAV注射から3週の時点で、対側と同側の背側膝状核と上丘のいずれにも誘導された視神経節細胞の投射が見られ、そしてこのような投射の密度が1か月の時点でさらに増加した（図9B～9D）。NMDAを注射された損傷網膜においても近い結果が観察された（図10A～10C）。

実施例6 星状膠細胞からニューロンへの転換
さらにCasRxによって誘導される膠細胞-ニューロン転換のほかのシステムにおける潜在的な用途を発掘するために、さらに線条体において星状膠細胞におけるPtbp1発現のノックダウンによって星状膠細胞が部分的にドーパミンニューロンに転換できるか、研究したが、それはパーキンソン病（PD）と密接に関連する細胞の種類である。まず、野生型マウスの線条体にAAV-GFAP-mCherryを注射して星状膠細胞を標識し、同時にAAV-GFAP-CasRx-Ptbp1（gRNA：5+6）を注射して星状膠細胞におけるPtbp1の発現を下方調節した（図11Aと11B）。対照として、Ptbp1のgRNAを含まないAAV-GFAP-CasRxを使用した。mCherryおよびCasRxはいずれも星状膠細胞において大量に発現され、そして線条体において高い共感染効率を示し、中では、99％±1％のmCherry+細胞がCasRxを発現した（82％±2％のGFAP⁺細胞がmCherryを発現したが、95％±1％のmCherry+細胞がGFAPを発現した）ことが見出された（図11Cと11D）。AAVを線条体に注射してから1週後、星状膠細胞におけるPtbp1の発現が下方調節されたことがわかった（図11Eと11F）。AAVウイルスの注射から1か月後、高比率のmCherry+細胞が成熟ニューロンのマーカーであるNeuNを発現することが見られたが（48％±10％、SEM、n=6小鼠）、AAV-GFAP-mCherryおよびAAV-GFAP-CasRxを注射された対照群では、このような発現が見られなかった（0.97％±0.45％、SEM、n=6）（図11Gと11H）。さらにこれらの転換したニューロンの特異的な種類を探求するために、特異的なニューロンの抗体で免疫染色を行った。約50％の誘導されたニューロンがグルタミナーゼを発現することが見られたが（図11Iと11J）、それは興奮型グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーで、同時にごく一部の誘導されたニューロンが中間ニューロンサブタイプのマーカーであるSSTを発現し、そしてもう一つのニューロンサブタイプのマーカーであるPVを発現する細胞がなかったことが見出された（図11Kと11L）。同時に、ドーパミンニューロンのマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（TH）とNeuNの共染色によって転換したニューロンのうち、ドーパミンニューロンがあるか、確認したところ、一部（7.5％±3％、SEM）のmCherry+細胞がTHを発現することが見出された（図11M～11O）。また、転換後のニューロンにおいて、mCherryの発現は感染から1か月後も持続したことが見られたが（図11G）、このような現象は前の報告と一致する。

実施例7 ドーパミンニューロンの誘導
CasRxを介する線条体におけるニューロンの転換の潜在的な臨床応用を探索するために、6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）を片側から黒質に注射することによってパーキンソンマウスモデルを誘導した。このような注射は黒質のけるドーパミンニューロンの死亡および同側の線条体におけるドーパミン作動性投射の退化を引き起こす（図13A～13C）。6-OHDA注射から3週の時点で、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1を（またはAAV-GFAP-CasRxを対照として）AAV-GFAP-mCherryとともに同側の線条体に注射した。同時に、異なる時点で線条体の細胞の転換を分析した（図12Aと12B）。ウイルス注射から1か月後、6-OHDAによって損傷を誘導されたマウスでは、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1よびAAV-GFAP-mCherryを注射された線条体に高比率のドーパミンニューロンのマーカーであるＴＨを発現するmCherry細胞が現れ、そしてAAV注射から3か月の時点で、その百分率が増加した（19％±0.4％、SEM、n=5匹のマウス、1か月の時点; 32％±7％、SEM、n=3匹のマウス、3か月の時点）ことが見出された（図12C、12D、13Dおよび13E）。一方、対照群では、このような細胞が観察されたことが少なかった（図12C、12Dおよび13D～13F）。また、ウイルス注射領域の約80％のTH ⁺細胞はmCherry+のものであることから（図12Eと13G）、これらのドーパミン細胞は主に星状膠細胞から転換したものであることが示された。野生型（無6-OHDA損傷）マウスにおけるmCherry+TH+細胞の百分率が6-OHDA損傷のマウスよりも低かったことから（図13H）、損傷後の修復機序はTH+ニューロンの誘導を促進する可能性があることうが示された。また、誘導されたドーパミンニューロンが成熟ドーパミンニューロンのマーカーであるドーパミントランスポーターSlc6a3（DAT）を発現することが見出されたがが、そのタンパク質は一過性のTHを発現する線条体のニューロンに存在しない。高比率のmCherry陽性細胞がDATを発現することが見出されたが（10％±3％、SEM、n=5、1か月；AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1を注射された線条体において、mCherry+DAT+細胞のうちの31％±7％、3か月の時点、n=3匹のマウス）、対照群のウイルスを注射された線条体においては、このような細胞の存在がほとんど見られなかった（図12C、12F、13Dおよび13I）。THとDATの共免疫染色では、さらに、多くのmCherry+TH+細胞がDATを発現することが示されたが（図12C、12Gおよび13D）、誘導されたドーパミンニューロンの多くが成熟したドーパミン作動性ニューロンのマーカーを発現したことがわかる。また、mCherry+細胞は、さらに、ほかの2つの中脳ドーパミンニューロンののマーカー、すなわち、ドパ脱炭酸酵素（DDC）およびフォークヘッドボックスA2（FOXA2）を発現したが（図13J～13M）、転換したニューロンがドーパミン作動性ニューロンであることがさらに証明された。前の研究では、6-OHDAによる損傷後、一過性にマウスの線条体における一部の中間ニューロンのTH発現が誘導されることが示された。ここで、それについて評価したが、AAV注射から3か月の時点で、中間ニューロンのマーカーであるPV+、SST+およびcalretinin+（CR +）を共形質移入させた。これらの中間ニューロンのいずれもmCherry+TH+細胞と共局在しないことが見出されたが、転換したTH+ニューロンは一過性に誘導されたTH+ニューロンではないことが示された（図13N）。誘導ドーパミンニューロンのサブタイプを探索するために、それぞれ2つの黒質A9領域の特異的なドーパミンニューロンのマーカーであるALDH1A1およびGIRK2をTHと、そして腹側被蓋野（VTA）ドーパミンニューロンの特異的なマーカーであるカルビンジン（Calbindin）をDATと共形質移入させた。結果から、ほとんどの誘導されたニューロンがALDH1A1およびGIRK2を発現するが、カルビンジンを発現しないことがわかったが（図12H～12J）、誘導されたドーパミンニューロンが黒質のドーパミンニューロンに近いことが示唆された。次に、脳切片において電気生理学の全細胞記録を行った。大半のニューロン様mCherry陽性細胞（22個の細胞のうちの20個）が電流クリップのモードにおいて脱分極化電流による活動電位に反応できたことが見出された（図12K）。また、電圧クランプのモードにおける自発的なシナプス後電流（Vc=-70 mV）が観察されたが、転換後のニューロンは機能的シナプスの入力を受信できることが示された（図12Lと12M）。また、検査された10個のニューロンのうちの4個で、過分極活性化電流（Ih）によって誘導される遅延電圧整流が観察されたが（図12K）、これも中脳ドーパミンニューロンの特徴の一つである。次に、誘導されたドーパミンニューロンがドーパミンを放出できるか、確認するために、免疫染色を行ったところ、誘導されたドーパミン細胞の大半が小胞モノアミントランスポーター2（VMAT2）を発現することが見出されたが（図12N）、これはドーパミンのパッケージング、蓄積および放出を調節するタンパク質である。同時に、ウイルスを注射された線条体の領域における多くの細胞が蛍光ドーパミン誘導体（FFN206）を取り込むことが見出されたが、これはVMAT2の基質で、発現されるVMAT2が機能するか、確認することができる。高濃度の塩化カリウムの処理において、蛍光の部分の減少が見られたが、転換した細胞がドーパミンを放出する機能を有することが示された（図12O～12Q）。以上の結果から、CasRxを介するPtbp1のノックダウンは有効にPDモデルのマウスの線条体においてドーパミン作動性ニューロンを誘導できることがわかる。

実施例8 パーキンソン病モデルのマウスの運動機能の改善
さらに、線条体における誘導されるドーパミンニューロンが6-OHDAによって誘導されるパーキンソン病マウスモデルの運動の症状を緩和できるか、確認した（図14A）。同時に、運動機能について、薬物誘導と無薬物誘導の評価を行った。薬物誘導の活動について、まず、アポモルフィンによって誘導される対側の回転行為を研究したが、当該行為は片側のドーパミンニューロンの喪失による行動の変化を測定するために幅広く使用されている。対照のマウス（AAV-GFAP-CasRxおよびAAV-GFAP-mCherryまたは生理食塩水を注射した）と比べ、Ptbp1ノックダウンマウス（AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1およびAAV-GFAP-mCherryを注射した）のアポモルフィンによって誘導される実質回転数（対側から同側を引いた回転数で計算する）は顕著に降下し、そのレベルは未損傷の健康なマウスに相当することがわかった（図14B、13Oおよび13P）。もう一つの全身的アンフェタミン投与による同側回転行為試験において、線条体におけるDATのドーパミンの取り込みを抑制することによって細胞間のドーパミン濃度を増加させた。対照群のマウスと比べ、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1を注射されたマウスの実質回転数（同側から対側を引いた回転数で計算する）および同側回転比（同側/総回転数で計算する）は顕著に低下した（図14C、14Dおよび13Q）。これらの結果から、線条体における誘導されたニューロンは薬物によるPDモデルマウスの運動機能障害を軽減するに十分なドーパミンを放出できることが示された。また、それぞれ2つの無薬物の運動機能、すなわち、前肢使用の非対称性および運動協調性の改善の有無を検出した。対照のマウスと比べ、AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1を注射されたマウスの円柱体同側タッチ百分率が顕著に低下し、そしてロータロッド上の持続時間がより長いことがわかった（図14Eと14F）。つまり、これらの結果から、線条体における星状膠細胞のPtbp1ノックダウンを介するドーパミンニューロンの転換によってパーキンソン病モデルのマウスの運動機能障害が軽減されることがわかる。

実施例9 体外におけるPtbp1ノックダウンツールのオフターゲットの検出
後続のCas13RxおよびCas13eの体内における臨床治療への使用の可能性を探究するために、本発明では、体外システムでこれらのRNA編集ツールについてPtbp1をノックダウンする過程においてオフターゲットの検出を行ってみた。まず、CasRx-sgRNA（当該sgRNAの組み合わせはCell, DOI:10.1016/j.cell.2020.03.024からのものである）、Cas13e-sgRNA（当該sgRNAの組み合わせは新しくスクリーニングして得られたもので、それぞれsgRNA1：TGTGGTTGGAGAACTGGATGTAGATGGGCT （配列番号15）、sgRNA2：GAGCCCATCTGGATCAGTGCCATCTTGCGG（配列番号16）、sgRNA3：AGTCGATGCGCAGCGTGCAGCAGGCGTTGT（配列番号17）である）を含有するプラスミド、そして対照群としてCas13e-NT、CasRx-NT、U6-shPTB（shPTBはNature, DOI:10.1038/s41586-020-2388-4からのものである）およびU6-shNTを含有するプラスミドを構築した（図15）。そして、リポソームで形質移入する方法によってそれぞれN2a細胞に導入し、これらのベクタープラスミドにいずれもmcherryレポーター遺伝子があるため、形質移入から48時間で、フローサイトメトリーによってmcherry陽性細胞を選別し、各群はそれぞれ約50000個の細胞を収集し、そしてRNA全トランスクリプトームシーケンシングを行った。RNA全トランスクリプトームシーケンシングの結果を分析したところ、Cas13e-sgRNAのオフターゲット率がCasRx-sgRNAよりも低く、かつCas13e-sgRNAおよびCasRx-sgRNAのオフターゲット率がいずれもU6-shPTB群よりも遥かに低いことがわかった。結果から、CRISPRを介するRNA編集ツール、特にCas13eはオフターゲット効果において従来のshRNAツールよりも優れたものであることがわかる。

実施例10 体内におけるPtbp1ノックダウン後の分化転換の効率の検出
さらにCas13eの膠細胞からニューロンへの誘導の分化過程における潜在的な用途を探究するために、Cas13eが線条体内において星状膠細胞におけるPtbp1をノックダウンした後、ドーパミンニューロンに転換させることができるか、検証し、そしてCasRxおよびshRNAといった2つのツールと比較した。そのため、GFAPプロモーターによって発現を駆動されるCas13e-sgRNA（当該sgRNAの組み合わせは新しくスクリーニングして得られたもので、それぞれsgRNA1：TGTGGTTGGAGAACTGGATGTAGATGGGCT（配列番号15）、sgRNA2：GAGCCCATCTGGATCAGTGCCATCTTGCG（配列番号16）、sgRNA3：AGTCGATGCGCAGCGTGCAGCAGGCGTTGT（配列番号17）である）、CasRx-sgRNA（当該sgRNAの組み合わせはCell, DOI:10.1016/j.cell.2020.03.024からのものである）を含有するプラスミド、そして対照群としてCas13e-NT、CasRx-NT、U6-shPTB （shPTBはNature, DOI:10.1038/s41586-020-2388-4からのものである）およびU6-shNTを含有するプラスミドを構築した（図16）。そして、これらのプラスミドについてアデノ随伴ウイルスAAVのパッケージングおよび精製を行った。ウイルス注射実験の3週前に、6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）を片側から黒質に注射することによってパーキンソンマウスモデルを誘導し、さらにこれらのパーキンソンマウスの線条体にそれぞれこれらのAAVウイルスを注射し、そして同時に星状膠細胞を標識するためにAAV-GFAP-mCherryウイルスを注射した（図16）。ウイルス注射から28日と90日後、それぞれDAT/TH染色、電気生理学およびマウス行動学の検出を行い、多方面から体内における分化転換の効率を検証した。Cas13e-sgRNAの組み合わせを使用すると、有効にマウスの体内においてPtbp1のノックダウンを行うこともでき、そして星状膠細胞からドーパミンニューロンへの分化につながり、さらにパーキンソン病モデルのマウスの運動機能が改善され、臨床治療への応用の面でも潜在的な将来性があることがわかった。

検討
今回の仕事において、我々の研究では、神経膠細胞はCasRxを介するPtbp1の下方調節によって有効にニューロンに転換することがわかった。NMDAによって誘導される網膜損傷モデルにおいて、Ptbp1ノックダウンにより、損傷した網膜におけるMGのRGCへの転換が誘導され、部分的に視覚反応および視力依存的行為が回復する。6-OHDAによって誘導されるパーキンソン病マウスモデルにおいて、それにより、線条体における星状膠細胞がドーパミンニューロンに誘導され、そして黒質ドーパミンニューロンの喪失に関連する運動機能障害が軽減される。これらの結果から、一つのRNA結合タンパク質Ptbp1の発現を下方調節するだけで、異なる神経系において膠細胞を失われた特異的な種類のニューロンに転換することができ、今後の治療への応用に新たな方法を提供することがわかる。ヘアピン型RNA（shRNA）技術は、所望の転写体を切断あｍたは抑制することができるが、ひどいオフターゲット作用がある。Cas13を介するノックダウンはRNAiよりも効率が高いのみならず、大幅にオフターゲット効果を減少させることができ、治療への応用により可能性がある。また、CasRxはCas13タンパク質ファミリーで最も小さいため、CRISPRアレイ（複数のガイドRNAをコードする）とともに一つのAAVにパッケージングすることができる。遺伝子編集分野において、標的とRNAするCRISPR系CasRxによってDNAを標的とするCRISPR-Cas9編集システムによる永久的なDNA改変のリスクが避けることができることで、臨床への応用においてより安全性がある。

参考文献：
1. Mccarthy, K.D. & Devellis, J. Preparation Of Separate Astroglial And Oligodendroglial Cell-Cultures From Rat Cerebral Tissue. Journal Of Cell Biology 85, 890-902 (1980).
2. Zhou, H. et al. Cerebellar modules operate at different frequencies. Elife 3, e02536 (2014).
3. Xu, H.T. et al. Distinct lineage-dependent structural and functional organization of the hippocampus. Cell 157, 1552-1564 (2014).
4. Su, J. et al. Reduction of HIP2 expression causes motor function impairment and increased vulnerability to dopaminergic degeneration in Parkinson's disease models. Cell Death Dis 9, 1020 (2018).
5. Chavez, A. et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nat Methods 13, 563-567 (2016).
6． Qian, Hao et al. Reversing a model of Parkinson's disease with in situ converted nigral neurons. Nature 582, 550-556 (2020).
7． Zhou, Haibo et al. Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice. Cell 181,590-603.e16 (2020).
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims (11)

1. Ptbp1遺伝子またはRNAまたはそれらによってコードされるタンパク質の阻害剤の使用であって、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を予防および/または治療する組成物または製剤の製造のためであることを特徴とする使用。
2. 前記組成物または製剤は、さらに、以下の群から選ばれるの一つまたは複数のために使用されることを特徴とする請求項1に記載の使用：
   （a1）星状膠細胞からドーパミンニューロンへの分化転換の誘導；
   （b1）哺乳動物のパーキンソン病の運動障害の治療；
   （c1）グリア細胞から機能的ニューロンへの転換または分化の誘導；
   （d1）視神経節細胞（RGC）変性に関連する神経系疾患の治療；
   （e1）網膜疾患の予防または治療；
   （f1）神経変性疾患の予防および/または治療；
   （g1）ミュラーグリア細胞から視神経節細胞への分化転換；
   （h1）哺乳動物の視神経節死による視力損傷の治療。
3. 前記星状膠細胞は、線条体、黒質、脊髄、背側中脳または大脳皮質由来のもので、好ましくは、前記の星状膠細胞は、線条体由来のものであることを特徴とする請求項2に記載の使用。
4. 前記機能的ニューロンは、RGCニューロン、ドーパミンニューロン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の使用。
5. 前記阻害剤は、抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、遺伝子エディター、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の使用。
6. 以下のものを含むことを特徴とする組成物：
   （a）CasRx、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、RNA標的遺伝子編集タンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクター；ならびに
   （b）遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のDNAまたはRNAと結合するようにガイドするgRNAまたは発現ベクター。
7. 以下のものを含むことを特徴とする薬物キット：
   （a1）第一容器、ならびに前記第一容器の中に位置する、CasRx、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、RNA標的遺伝子編集タンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクター、あるいは前記遺伝子編集タンパク質またはその発現ベクターを含有する薬物；
   （b1）第二容器、ならびに前記第二容器の中に位置する、遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のDNAまたはRNAと結合する是ようにガイドする、gRNAまたは発現ベクター、あるいは前記gRNAまたは発現ベクターを含有する薬物。
8. 請求項6に記載の組成物または請求項7に記載の薬物キットの使用であって、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を予防および/または治療する薬物の製造のためであることを特徴とする使用。
9. 膠細胞の機能的ニューロンへの分化を促進する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
   Ptbp1遺伝子またはRNAあるいはそれによってコードされるタンパク質の阻害剤あるいは請求項6に記載の組成物の存在下において、膠細胞を培養することにより、膠細胞の機能的ニューロンへの分化を促進する。
10. 機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を予防および/または治療する候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
    （a）テスト群で、細胞の培養系に被験化合物を添加し、かつ前記テスト群の細胞におけるPtbp1の発現量（E1）および/または活性（A1）を観察し、対照群で、同様の細胞の培養系にPtbp1を標的としない被験化合物を添加し、かつ対照群の前記細胞におけるPtbp1の発現量（E0）および/または活性（A0）を観察し、
    ここで、テスト群におけるPtbp1の発現量（E1）および/または活性（A1）が顕著に対照群よりも低い場合、当該被験化合物がPtbp1の発現および/または活性に抑制作用を有する、機能的ニューロン死に関連する神経系疾患を予防および/または治療する候補化合物であることが示される。
11. 以下のものを含むことを特徴とするAAVベクター。
    （a）CasRx、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、RNA標的遺伝子編集タンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子編集タンパク質のコード配列；ならびに
    （b）前記遺伝子編集タンパク質が特異的にPtbp1遺伝子のDNAまたはRNAと結合するようにガイドするgRNA。

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