JP2021101713A

JP2021101713A - 筋強直性ジストロフィーの処置

Info

Publication number: JP2021101713A
Application number: JP2021042924A
Authority: JP
Inventors: ファーリング，ドゥニ; Furling Denis; セルジュアン，ニコラ; Sergeant Nicolas; カイエ−ブーダン，マリー−ローレ; Caillet-Boudin Marie-Laure; アランデル，リュドヴィック; Arandel Ludovic
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Association Institut de Myologie; Sorbonne Universite
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Association Institut de Myologie; Sorbonne Universite
Priority date: 2014-04-14
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2021-07-15
Also published as: JP2023099082A; JP6953131B2; WO2015158740A1; CA2944606C; US20170035841A1; EP3145529A1; WO2015158365A1; EP3145529B1; JP2017511145A; US10799556B2; CA2944606A1

Abstract

【課題】筋強直性ジストロフィーの処置のための組成物及び方法を提供する。【解決手段】医薬品としての使用のための、ＹＧＣＹ結合特性を有し、かつ野生型ＭＢＮＬタンパク質と比較して減少したスプライシング活性を有する、改変されたＭＢＮＬポリペプチド、該改変されたＭＢＮＬポリペプチドをコードする核酸分子、制御配列に作動可能に連結された該核酸分子を含む遺伝子構築物、該遺伝子構築物を含むウイルスベクター、及び筋強直性ジストロフィー疾患の処置に使用するための該ウイルスベクターの使用を提供する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、筋強直性ジストロフィーの処置のための組成物及び方法に関する。

発明の背景
成人における最も一般的な神経筋疾患の１つである筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置する不安定なＣＴＧ増大によって引き起こされる遺伝性の常染色体優性遺伝疾患である（Brook et al. 1992）。ＣＴＧの数は、罹患患者においては５０個から数千個の反復配列までばらつきがあるが、一方、罹患していない個体は３８個未満の反復配列を有し、全体的にＣＴＧ反復配列のサイズと、疾患の重度と、発症年齢（逆相関）との間には相関性がある（Hunter et al. 1992; Tsilfidis et al. 1992）。ＤＭ１の臨床特徴は様々であるが、一般的には、筋強直症、進行性筋力低下、及び萎縮症、並びに心伝導障害が含まれるが、しかしまた、筋肉以外の症状、例えば認知障害、白内障、性腺機能低下症及び内分泌腺不全症も含まれる（Harper 2001）。

病原性のＣＴＧ配列が転写され、ＤＭ１型の病気発生における有毒なＲＮＡの機能獲得型機序に関与している、ＤＭＰＫ転写物の３’ＵＴＲに位置する増加したＣＵＧ反復配列（ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ）を含有しているＲＮＡを生じる（Klein et al. 2011）。明確に異なる凝集物又は病巣として核内に保持されているＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡは、ＭＢＮＬ及びＣＥＬＦファミリーのＲＮＡスプライシング因子メンバーの機能を変化させ、その結果、ＤＭ１罹患組織において特定の群の転写物の選択的スプライシングの誤調節が起こる（Taneja et al. 1995; Ranum and Cooper 2006）。スプライシング事象の異常調節により主に、成人のＤＭ１の組織において致命的なスプライシングパターンの再発現が起こり、ＣＬＣ−１、ＩＮＳＲ及びＢＩＮ１のプレｍＲＮＡに影響を及ぼすミススプライシング事象はそれぞれ、筋強直症、インスリン抵抗性、及び筋力低下に関連している（Savkur et al. 2001; Charlet et al. 2002; Mankodi et al. 2002; Fugier et al. 2011）。５０人のＤＭ１患者の集団に対して実施された近年の研究は、罹患した骨格筋において４２個のスプライシングの異常を確認し、これらのスプライシング変化は、他の筋疾患と比較してＤＭ１に特異的であり、主に、ＭＢＮＬ１の機能欠失に起因することを示した（Nakamori et al. 2013）。

ＭＢＮＬ１は、ＭＢＮＬ１、−２及び−３をはじめとする、muscleblind-likeＲＮＡ結合タンパク質ファミリーの一員であり（Pascual et al. 2006）、成人骨格筋に発現されている主要なＭＢＮＬタンパク質である（Kanadia et al. 2003; Holt et al. 2009）。ＭＢＮＬ１は、他のＭＢＮＬタンパク質パラログのように、高い親和性で増大したＣＵＧ反復配列に結合し、ＤＭ１の筋肉細胞におけるＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡの核内フォーカスと同じ場所に局在する（Miller et al. 2000; Fardaei et al. 2001）。突然変異体ＲＮＡにおける多数のＣＵＧ反復配列に起因するこれらのリボ核タンパク質複合体へのＭＢＮＬ１の捕捉により、その機能は欠失し、その結果、ＭＢＮＬ１それ自体を含むいくつかの標的プレｍＲＮＡの選択的スプライシングの誤調節が起こる。この仮説と一致して、Ｍｂｎｌ１ノックアウトマウスは、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡを発現しているＤＭ１患者又はＤＭ１マウスモデルの筋肉試料に観察される大半の調節解除されたスプライシング事象を再現する（Mankodi et al. 2000; Kanadia et al. 2003; Lin et al. 2006; Du et al. 2010）。さらに、ＤＭ１マウスの骨格筋における機能的かつ完全長のＭＢＮＬ１（アイソフォーム４０又は４１）の過剰発現は、スプライシングの異常を修正し、ＤＭ１疾患の特徴である筋強直症を消失させるのに十分である（Kanadia et al. 2006; Chamberlain and Ranum 2012）。さらに、国際公開公報第２０１０／０４４８９４号では、ＭＢＮＬタンパク質又はその機能的変異体、すなわち、ＭＢＮＬタンパク質の生物学的活性を保持した変異体を、標的化部分とコンジュゲートさせたキメラポリペプチドの剤形で投与することが提案されている。この文献は、ＤＭ１の処置のための非機能的なＭＢＮＬポリペプチドの使用を開示していない。さらに、脳内で顕著に発現されているＭＢＮＬ２の破壊は、ヒトＤＭ１の脳においても同じように誤調節されているマウスの特定のスプライシング事象を調節解除し、このことは、ヒト疾患の病的変化におけるＭＢＮＬ２の機能欠失の顕著な役割を支持している（Charizanis et al. 2012）。要するに、これらの結果は、ＤＭ１において増大したＣＵＧ反復配列によって誘発されるＲＮＡ毒性に関与している重要な機序としてのＭＢＮＬの機能欠失を支持する。

ＤＭ１マウスモデルにおけるスプライシングの誤調節及び筋強直症を元に戻すための、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡと干渉して病巣からＭＢＮＬ１を放出させる改変されたオリゴヌクレオチドアンチセンスアプローチはすでに提案されている。しかしながら、スプライシングの誤調節を元に戻し、筋強直性ジストロフィーにおける筋強直症などの臨床症状を打ち消すための代替的かつ効果的な手段は依然として必要とされている。

発明の要約
本発明の目的は、筋強直性ジストロフィーの処置のための新規なツール及び方法を提供することである。本発明は、特にウイルスベクターの使用を通して異所的に発現されている改変されたＭＢＮＬポリペプチドが、インビトロ及びインビボの両方においてＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡの毒性を打ち消すのに効果的であるという本明細書に提供されたエビデンスに基づく。

本発明の１つの態様は、改変されたＭＢＮＬポリペプチドに関する。以下に提供されているように、本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、完全長のＭＢＮＬタンパク質のスプライシング活性と比較した場合に、減少したスプライシング活性、特に、少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は少なくとも９０％、又はさらには少なくとも９５％減少したスプライシング活性を有するが、そのＹＧＣＹ結合特性を維持している。特に、本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、病的なＣＵＧ反復配列に結合することができる。さらに、本明細書において使用される改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２などの捕捉された内因性ＭＢＮＬをＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ凝集物から放出することによって、これらの内因性ＭＢＮＬタンパク質の機能を回復させることによって、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡの毒性を打ち消すことができる。

本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、筋強直性ジストロフィーの処置に使用される。別の態様は、有効量の本発明に記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチドをそれを必要とする被験者に投与する工程を含む、筋強直性ジストロフィーの処置法に関する。本発明のさらなる態様は、筋強力性ジストロフィーの処置に使用する医薬品の製造のための、本明細書に記載のような改変されたＭＢＮＬポリペプチドの使用である。

本明細書において開示された別の態様は、それを必要とする細胞又は生物内のＣＵＧ反復配列に由来する、内因性ＭＢＮＬ１又はＭＢＮＬ２などの内因性ＭＢＮＬタンパク質を置換し、これにより、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ発現によって誘発された調節解除されたスプライシング事象を元に戻すための、本発明に記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチドの使用である。特定の実施態様では、改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、ウイルスベクターを使用して細胞又は生物に提供される。

ヒトＭＢＮＬ１遺伝子のゲノムＤＮＡ構成。エキソンの順番及び名称、並びに、各エキソンのヌクレオチド長が示されている。透き通った灰色のボックスはＵＴＲを示す。色の付いたボックスはカセットエキソンを示す。白抜きのボックスは構成性エキソンを示す。ＭＢＮＬ１選択的カセットの選択的スプライシングにより、ＭＢＮＬ１_４３又はＭＢＮＬ１_４０をはじめとする１０個を超えるアイソフォームが生じる。アミノ酸長（ａａ）が示され、濃い灰色のボックスはＣ_３Ｈ_１ジンクフィンガーモチーフを示す。２つはＭＢＮＬ１エキソン２に位置し、他の２つはＭＢＮＬ１エキソン４に位置する。改変されたＭＢＮＬ１ポリペプチド（本明細書ではΔＣＴ３と称される）は、４番目のＣ_３Ｈ_１ジンクフィンガーモチーフの後のＣ末端ドメインを欠失している、切断短縮されたＭＢＮＬ１構築物である。 ΔＣＴ３は、インビトロで核内ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ凝集物と同じ場所に局在する。ＧＦＰ、ＧＦＰ−ΔＣＴ３、又はＧＦＰ−ＭＢＮＬ１_４０構築物を、Ｈｅｌａ細胞に９６０個のＣＴＧ反復配列と共に同時トランスフェクトした。ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣を、Ｃｙ３−ＣＡＧ７プローブを使用してＦＩＳＨによって可視化した。様々なＭＢＮＬ１アイソフォーム並びにΔＣＴ３構築物の発現は、ＤＭ１で調節解除されたタウのエキソン２／３のミニ遺伝子のスプライシングを回復させる。タウのエキソン２／３のミニ遺伝子は、ｐｓｖＩＲＢスプライシングレポーターミニ遺伝子において２つの選択的カセット２及び３の挿入断片を含む（Tran et al. 2011）。ＭＢＮＬ１_３５又は_３８又は_４１又は_４３アイソフォーム（パネルＡ）又はＧＦＰ−ΔＣＴ３（パネルＢ）を、以前に記載されているように（Tran et al. 2011）、Ｈｅｌａ細胞においてタウのエキソン２／３のミニ遺伝子、及び、９６０個の断続性のＣＴＧ反復配列を含有しているプラスミドと共に同時発現させた。タウＥ２の包含率を計算し、タウのエキソン２及びエキソン３の周辺のプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ後に確立した。 ΔＣＴ３の核内局在は、スプライシング事象を調節するために必要とされる。Ａ）核外移行シグナル（ＮＥＳ）を含有している又は含有していないＧＦＰ−ΔＣＴ３構築物を、Ｈｅｌａ細胞内で９６０個のＣＴＧ反復配列と共に同時発現させたか又は同時発現させなかった。Ｂ）ｃＴＮＴエキソン５又はＩＲエキソン１１の包含を、Ｈｅｌａ細胞におけるＭＢＮＬ又はＧＦＰ構築物と、ｃＴＮＴエキソン５又はＩＲエキソン１１のミニ遺伝子との同時トランスフェクション後にＲＴ−ＰＣＲによって評価した。Ｃ）タウのエキソン２の包含を、タウのエキソン２／３のミニ遺伝子、９６０個のＣＴＧ反復配列、及びＭＢＮＬ又はＧＦＰ構築物と共に同時トランスフェクトされたＨｅｌａ細胞において分析した。 ΔＣＴ３は、インビトロでＣＵＧ反復配列に由来するＭＢＮＬ１を置換することができる。組換えＭＢＮＬ１_４０（又はΔＣＴ３）タンパク質を、漸増濃度の組換えΔＣＴ３（ＭＢＮＬ１_４０）タンパク質の非存在下又は存在下で９５個のＣＵＧ反復配列を含有しているインビトロで転写された^３２ＰＲＮＡに架橋した。 ΔＣＴ３は、ヒトＤＭ１筋肉細胞において核内ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡと同じ場所に局在する。一次ＤＭ１筋肉細胞に、ＧＦＰ−ΔＣＴ３をコードしているｃＤＮＡを含有しているレンチウイルスベクターを形質導入した。ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣を、Ｃｙ３−ＣＡＧ_７プローブを使用してＦＩＳＨによって可視化した。 ΔＣＴ３は、分化したヒトＤＭ１筋肉細胞におけるミススプライシング事象を標準化する。一次ヒトＤＭ１筋肉細胞及び非ＤＭ１筋肉細胞に、ＧＦＰ−ΔＣＴ３又はＧＦＰのみを発現しているレンチウイルスベクターを形質導入したか又は形質導入しなかった。ＢＩＮ１エキソン１１、ＬＤＢ３エキソン７、及びＤＭＤエキソン７８転写物のスプライシングプロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。 ΔＣＴ３は、分化したヒトＤＭ１筋肉細胞におけるミススプライシング事象を標準化する。一次ヒトＤＭ１筋肉細胞及び非ＤＭ１筋肉細胞に、ＧＦＰ−ΔＣＴ３又はＧＦＰのみを発現しているレンチウイルスベクターを形質導入したか又は形質導入しなかった。ＢＩＮ１エキソン１１、ＬＤＢ３エキソン７、及びＤＭＤエキソン７８転写物のスプライシングプロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。分化した筋肉細胞（対照、ＤＭ１、又はＣを発現しているＤＭ１）を、Ｃ末端エキソン９に対して指向されるＭＢＮＬ１ｓｉＲＮＡ（ＭＢＮＬ１に存在するが、ΔＣＴ３配列には存在しない）を用いてトランスフェクトしたか又はトランスフェクトしなかった。ＤＭＤエキソン７８転写物のスプライシングプロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＧＦＰ−ΔＣＴ３をコードしているｃＤＮＡを含有している血清型９のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）の筋肉内注射は、ＤＭ１マウスにおいてスプライシングの誤調節を標準化する。ＨＳＡ−ＬＲマウスの腓腹筋にＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３（１×１０^１１vg；ｎ＝６）を注射し、６週間後に分析した。反対側の筋肉に食塩水を注射した。Ｓｅｒｃａｌエキソン２２、Ｍｂｎｌ１エキソン７、及びＣｌｃｎ１エキソン７ａのスプライシングプロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＧＦＰ−ΔＣＴ３をコードしているｃＤＮＡを含有している血清型９のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）の筋肉内注射は、ＤＭ１マウスにおいてスプライシングの誤調節を標準化する。ＨＳＡ−ＬＲマウスの腓腹筋にＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３（１×１０^１１vg；ｎ＝６）を注射し、６週間後に分析した。反対側の筋肉に食塩水を注射した。Ｓｅｒｃａｌエキソン２２、Ｍｂｎｌ１エキソン７、及びＣｌｃｎ１エキソン７ａのスプライシングプロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＧＦＰ−ΔＣＴ３は、インビボで核内ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣と同じ場所に局在する。ＦＩＳＨ−ＩＦを実施して、ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３を注射されたＨＳＡ−ＬＲマウスの筋肉切片上でＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣及びＧＦＰ−ΔＣＴ３を検出した。ＧＦＰ−ΔＣＴ３は、インビボで核内のＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣に由来するＭｂｎｌ１を置換する。ＦＩＳＨ−ＩＦを実施して、ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３又は食塩水を注射されたＨＳＡ−ＬＲマウスの筋肉切片上でＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣、内因性Ｍｂｎｌ１及びＧＦＰ−ΔＣＴ３を検出した。各成分のピーク強度を、核内に観察された病巣を横切る任意のレーンに沿って測定した。ＧＦＰ−ΔＣＴ３は、インビボで核内のＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣に由来するＭｂｎｌ１を置換する。ＦＩＳＨ−ＩＦを実施して、ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３又は食塩水を注射されたＨＳＡ−ＬＲマウスの筋肉切片上でＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣、内因性Ｍｂｎｌ１及びＧＦＰ−ΔＣＴ３を検出した。各成分のピーク強度を、核内に観察された病巣を横切る任意のレーンに沿って測定した。ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３の筋肉内注射は、ＤＭ１マウスの筋強直症を消失させる。ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３（１×１０^１１vg；ｎ＝６）又は食塩水（反対側の筋肉）を注射されたＨＳＡ−ＬＲ腓腹筋の力の弛緩を注射から６週間後に測定した。ＦＶＢ野生型マウスの腓腹筋でも力の弛緩を測定した。ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３を発現しているＦＶＢ野生型マウスにおける筋肉変性の兆候は全くない。ＦＶＢ野生型マウスの前脛骨筋に、ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３（１×１０^１１vg；ｎ＝６）を注射し、３、４又は６週間後にＩＦによって分析した。反対側の筋肉に、空のＡＡＶ９ＭＣＳを注射した。胚性ＭｙＨＣ抗体及びラミニン抗体を使用して再生線維及び筋線維をそれぞれ検出した。核をＤＡＰＩで染色した。ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３のみの発現は、野生型マウスにおいて選択的スプライシングを調節解除しなかった。ＦＶＢ野生型マウスの前脛骨筋に、ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３（１×１０^１１vg；ｎ＝６）を注射し、Ｃｌｃｎ１エキソン７ａ又はＳｅｒｃａｌエキソン１1のスプライシングプロファイルを、形質導入から３、４又は６週間後に分析した。反対側の筋肉に空のＡＡＶＭＣＳを注射した。ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３の筋肉内注射は、ＤＭ１マウスにおけるスプライシング誤調節を標準化する。ＨＳＡ−ＬＲマウスの前脛骨筋にＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３（１×１０^１１vg；ｎ＝６）を注射し、６週間後に分析した。反対側の筋肉にＡＡＶ９ＭＣＳを注射した。Ｃｌｃｎ１エキソン７ａ、Ｓｅｒｃａｌエキソン１１、ＬＤＢ３エキソン１１のスプライシングプロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＡＡＶ９−Ｖ５−ΔＣＴ構築物の筋肉内注射。ＮＬＳ−Ｖ５−ΔＣＴ及びＶ５−ΔＣＴ３構築物は、エキソン３を欠失しているＶ５−ΔＣＴ（−３）とは対照的に、ＤＭ１マウスのスプライシング誤調節を標準化する。ＨＳＡ−ＬＲマウスの前脛骨筋にＡＡＶ９−Ｖ５−ΔＣＴ構築物（５×１０^１０vg；ｎ＝３）を注射し、６週間後に分析した。反対側の筋肉にＰＢＳを注射した。Ｃｌｃｎ１エキソン７ａ及びＳｅｃａｌエキソン１１のスプライシングプロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって決定した。 ΔＣＴ３は、ＭＢＮＬ２スプライシング依存性事象を回復させる。ＭＢＮＬ構築物（ＭＢＮＬ１、パネルＡ；ＭＢＮＬ２、パネルＢ；ΔＣＴ３、パネルＣ）を、（Carpentier et al., 2014）に記載のように、Ｔ９８Ｇ細胞内でヒトタウのエキソン２のミニ遺伝子及び９６０個のＣＴＧ反復配列と同時に発現させた。タウＥ２の包含をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。グラフは、タウのエキソン２の包含率を示す（少なくとも３回の独立した実験についての平均値±標準誤差）。有意差がアステリスクによって示されている：^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１。１８Ｓ転写物を内部対照として使用して、ＲＮＡの量を確認した。ＤＴ９６０トランスフェクションの効率を、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲによって確認した。パネルＤは、突然変異ＭＢＮＬ構築物において突然変異していた突然変異ＭＢＮＬ１部位（太文字の灰色）を示す。

発明の詳細な説明
本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、ＭＢＮＬＹＧＣＹＲＮＡモチーフに結合することができ、「Ｙ」はピリミジン（ウリジン又はシトシン）を示す。特に、本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、病原性のＤＭ１において増大したＣＵＧ反復配列の構築ブロックである、ＵＧＣＵモチーフに結合することができる。特定の実施態様では、本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、ＭＢＮＬ１ｍＲＮＡのエキソン３に対応するアミノ酸（アクセッション番号ＮＭ＿０２１０３８）を含むか又は含まない。さらなる実施態様では、本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、ＭＢＮＬ１ｍＲＮＡのエキソン５〜１０に相当する配列番号１

のアミノ酸を欠失している。

本明細書において使用される「ＭＢＮＬ」という用語は、muscleblind-likeＲＮＡ結合タンパク質ファミリーの全てのパラログメンバーを示し、特にＭＢＮＬ１、−２、及び−３を含む。特定の実施態様では、本発明に記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、ヒトＭＢＮＬ１タンパク質配列に由来する。１つの実施態様では、改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、エキソン３によりコードされる配列を有するが、ＭＢＮＬ１遺伝子のエキソン５〜１０によってコードされるアミノ酸配列は欠失している、ＭＢＮＬ１タンパク質である。具体的な実施態様では、改変されたＭＢＮＬ１由来ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：

を有するΔＣＴ３と称される。

１つの実施態様では、改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、エキソン３によりコードされる配列と、ＭＢＮＬ１遺伝子のエキソン５〜１０によってコードされる配列の両方を欠失している、ＭＢＮＬ１タンパク質である。具体的な実施態様では、非機能的なＭＢＮＬ１由来ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：

を有するΔＣＴと称される。

別の実施態様では、改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、ＭＢＮＬ２タンパク質のエキソン２〜５のアミノ酸配列によってコードされるＭＢＮＬ２タンパク質である。具体的な実施態様では、改変されたＭＢＮＬ２由来ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：

を有するＭＢＮＬ２−ΔＣＴ３と称される。

本明細書において使用される本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドの「変異体」は、ＹＧＣＹモチーフに対して、特にＣＵＧ反復配列に対して、それが由来する野生型ＭＢＮＬタンパク質（特にＭＢＮＬ１、２、又は３）、又は、上記に示されているような配列番号２、配列番号３又は配列番号４の改変されたＭＢＮＬタンパク質と同一又は類似の結合特性を有するタンパク質であり、該変異体は、野生型ＭＢＮＬタンパク質と比較して減少したスプライシング活性を有する。換言すれば、本発明に使用される改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、野生型の親ＭＢＮＬタンパク質と比較して低いスプライシング活性を有しているか又はさらには全くスプライシング活性を有していない、非機能的なＭＢＮＬポリペプチドである。筋強直性ジストロフィーの処置のための、そのスプライシング活性に関してこのような非機能的であるＭＢＮＬポリペプチドの使用は、先行技術においては報告されたことは全くなかった。なぜなら、全ての以前の治療的試みは、機能的ＭＢＮＬタンパク質、すなわち、ＹＧＣＹモチーフへのその結合能及びそのスプライシング活性をはじめとする野生型タンパク質の全ての特徴を有するタンパク質を使用して行なわれたからである。実際に、以前の試みは、病的反復配列上に捕捉されている遊離しかつ機能的に利用可能な内因性ＭＢＮＬタンパク質の減少を補うであろう、処置された細胞によるＭＢＮＬタンパク質の過剰発現を提供することを目指していた。本開示に適用された戦略には、関連性がない。機能的ＭＢＮＬタンパク質の過剰発現を提供する代わりに、本発明者らは、改変されたＭＢＮＬタンパク質、すなわち、減少したスプライシング活性を有するか又はさらには全くスプライシング活性を有さない非機能的な変異ＭＢＮＬタンパク質を、それを必要とする細胞に導入して、その上の内因性ＭＢＮＬタンパク質（群）と競合する、置換する、及び交換して、その捕捉のネガティブな結果を回避することを提案する。本開示の実験の部分に提供されているように、本戦略を用いて得られた結果は極めて満足の行くものであった。

特定の実施態様では、本発明に記載の変異体は、野生型ＭＢＮＬタンパク質（例えばＭＢＮＬ１、２又は３）のエキソン１〜４に相当するアミノ酸配列、又は配列番号２、３若しくは４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、より特定すると少なくとも９５％又はさらには少なくとも９９％同一である配列を有し得る。

本発明の特定の実施態様では、本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、ＭＢＮＬポリペプチドと標的化部分とからなるキメラペプチドではない。

本発明は、ほぼ全くスプライシング活性を有していないか、又はさもなくば野生型ＭＢＮＬタンパク質と比較して減少した活性を有する、改変されたＭＢＮＬポリペプチドを実施する。「ほぼ全く活性がない」又は「減少した活性」によって、本明細書では、野生型ＭＢＮＬタンパク質のスプライシング活性と比較して少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はさらには少なくとも９５％減少したスプライシング活性を説明することを意図する。このような活性は、ミニ遺伝子の使用などの当業者によって周知の方法に従って決定され、これにより、ｃＴＮＴのエキソン５、ＩＲのエキソン１１、及びタウのエキソン２の選択的スプライシングを分析し得る（Tran et al., 2011）。

特定の実施態様では、本発明の改変されたＭＢＮＬタンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）又は核外移行シグナル（ＮＥＳ）などの局在化配列を含み得る。代表的なＮＬＳは、配列番号５：PKKKRKVに示される配列を有する。代表的なＮＥＳは、配列番号６：LPPLERLTLDに示される配列を有する。本開示は、このような局在化配列、特にＮＬＳ又はＮＥＳ、例えば上記に具体的に記載されたようなものと組み合わせられた、上記のような任意の改変されたＭＢＮＬポリペプチドを含む。

本発明はさらに、本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチド又はその変異体を含む、医薬組成物に関する。

本発明の別の態様は、本発明に記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸配列である。本発明はさらに、本明細書において定義されているようなヌクレオチド配列と、宿主細胞内で本発明に記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチドの発現（例えば転写及び翻訳）を可能とする調節配列（例えば適切なプロモーター（群）、エンハンサー（群）、終結因子（群）など）とからなる又は含む、遺伝子構築物に関する。本発明の遺伝子構築物はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物はまた、目的の宿主細胞又は宿主生物の形質転換に適した形態、目的の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに適した形態、あるいは、目的とする宿主生物における独立した複製、維持及び／又は遺伝に適した形態であり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスをコードするベクター、又はトランスポゾンなどの形態であり得る。特に、該ベクターは、発現ベクター、すなわち、インビトロ及び／又はインビボ（例えば適切な宿主細胞、宿主生物、及び／又は発現系において）における発現を提供し得るベクターであり得る。好ましいが非制限的な態様では、本発明の遺伝子構築物は、ｉｉ）１つ以上の調節配列、例えばプロモーター及び場合により適切な終結因子に；並びに場合によりまたｉｉｉ）遺伝子構築物の１つ以上のさらなる配列、例えば３’−又は５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／リポーター遺伝子、及び／又は、改変されたＭＢＮＬポリペプチドの形質転換若しくは組込み若しくは細胞下局在若しくは発現（の効率）を促進若しくは増加させ得る配列、例えば核局在化シグナル（ＮＬＳ）若しくは核外移行シグナル（ＮＥＳ）に作動可能に連結された、ｉ）本発明の少なくとも１つの核酸配列を含む。

特定の実施態様では、遺伝子構築物は、組換えウイルスベクターのゲノムに対応する。本発明を実施するのに使用される適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。特に、本発明は、本発明に記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチドをコードしている核酸配列を含むレンチウイルスに関する。別の特定の実施態様では、本発明は、本発明に記載の改変されたＭＢＮＬタンパク質をコードしている核酸配列を含む、ＡＡＶベクター、特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１ベクター、特にＡＡＶ９ベクターに関する。ＡＶＶベクターは、シュードタイプ化ベクターでもよく、すなわち、そのゲノム及びそのキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来していてもよい。例えば、ゲノムは、ＡＡＶ２ゲノムに由来していてもよく、そのキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１血清型であってもよい。

別の態様は、医薬品としての使用のための、本発明に記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチドに関する。

本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、特に、ＭＢＮＬタンパク質の捕捉に関連した、又は、ＭＢＮＬ１などのＭＢＮＬメンバー若しくは他のパラログメンバー（ＭＢＮＬ２及びＭＢＮＬ３を含む）の調節解除された機能に関連した、疾病若しくは疾患の処置において有用な治療剤である。好ましい実施態様では、本発明の改変されたポリペプチドは、ＤＭ１及びＤＭ２などの筋強直性ジストロフィー、又は、ＭＢＮＬ機能の低下（例えば捕捉、凝集、突然変異など）が本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドの異所性送達によって救出され得るあらゆる疾病の処置のために使用される。

さらなる態様では、本発明は、筋強直性ジストロフィーの処置法に使用するための、上記のような改変されたＭＢＮＬポリペプチドに関する。

本明細書において使用される「処置」又は「療法」という用語は、治癒的及び／又は予防的処置を含む。より特定すると、治癒的処置は、症状の軽減、寛解、及び／又は除去、縮小、及び／又は安定化（例えば、より進行したステージへと進行できない）、並びに、特定の疾患の症状の進行の遅延のいずれかをいう。予防的処置は、発症の停止、発症の遅延、発生の減少、発生のリスクの減少、発症率の低下、重篤度の低下、並びに、所与の疾患に関する症状の発症までの時間の延長及び生存期間の延長をいう。

したがって、筋強直性ジストロフィーの処置を必要とする被験者における筋強直性ジストロフィーの処置法が記載され、該方法は、該患者に、本発明に記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチド、又は該ＭＢＮＬポリペプチドをコードしている核酸配列を投与する工程を含む。

本発明の脈絡において、「被験者」又は「患者」は、その年齢又は性別に関係なく筋強直性ジストロフィーを患っている哺乳動物、特にヒトを意味する。この用語は具体的には、家畜及び一般的な実験用哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラット、及びマウスを含む。好ましくは、処置すべき患者は、ヒト、例えば小児又は青年である。

本発明に記載の使用及び方法のために、改変されたＭＢＮＬポリペプチド、核酸、遺伝子構築物、又はウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター又はＡＡＶベクター）は、当技術分野において公知の方法によって製剤化され得る。さらに、任意の投与経路が考えられ得る。例えば、改変されたＭＢＮＬポリペプチド、核酸、遺伝子構築物、及びウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター又はＡＡＶベクター）を、経口、肺内、腹腔内（ｉｐ）、静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）、皮下（ｓｃ）、皮内、頬側、鼻腔内、舌下、眼内、直腸内、及び膣内を含むがこれらに限定されない、任意の慣用的な投与経路によって投与し得る。さらに、神経系への直接投与は、ポンプ装置を用いて若しくは用いずに、頭蓋内若しくは椎骨内用の針若しくはカテーテルを介しての送達による、脳内、脳室内、側脳室内、くも膜下腔内、大槽内、脊髄内、又は脊髄周辺の投与経路を含み得るがこれらに限定されない。本明細書に記載の治療効果をもたらす任意の用量又は投与頻度が、本発明への使用に適していることは当業者には容易に理解されるだろう。特定の実施態様では、被験者に、筋肉内経路によって本発明に記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチドをコードしているウイルスベクターを投与する。この実施態様の具体的な変法では、ベクターは上記に定義されているようなＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９ベクターである。さらに具体的な態様では、被験者は１回のベクターの注射を受ける。

さらに、標準的な薬学的方法を使用して、作用の持続時間を調節することができる。これらは当技術分野において周知であり、かつ放出制御製剤を含み、かつ適切な巨大分子、例えばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又は硫酸プロタミンを含むことができる。

さらに、医薬組成物は、本発明の改変されたＭＢＮＬポリペプチドを含有しているナノ粒子を含み得る。

以下の実施例は本発明の範囲を制限することなく本発明を説明する。

実施例
材料及び方法
プラスミド及びウイルス産生
９６０個の断続性ＣＴＧを含むＤＭＰＫの３’ＵＴＲを含有しているプラスミドは、これもまたＣＭＶプロモーターの制御下にあるミニ遺伝子ベクターであった（アメリカ合衆国テキサス州ヒューストン市のベイラー医科大学のT. Cooperからの親切なる贈り物）。本研究に使用されるＭＢＮＬ１の完全長の変異体構築物及び切断短縮されたΔＣＴ３の配列は以前に記載されていた（Tran et al. 2011）。ＮＥＳは、ＨＩＶのＲＥＶタンパク質に由来し（Fischer et al. 1995）、ΔＣＴ構築物に融合させた。ＭＢＮＬ１、ΔＣＴ３、及びΔＣＴ３−ＮＥＳのスプライシング活性を、以前に記載された３つのミニ遺伝子を使用して評価した：ヒトｃＴＮＴ（ｈｃＴＮＴ）のエキソン５を含有しているＲＴＢ３００ミニ遺伝子；ヒトインシュリン受容体のエキソン１１を含有しているＩＮＳＲミニ遺伝子、並びにエキソン２及び３を含有しているｐＳＶＩＲＢ／タウミニ遺伝子。全てのプラスミドＤＮＡはGATC Biotech（フランス）で二本鎖がシークエンスされ、Nucleobond（登録商標）ＡＸエンドトキシンフリーのキット（Macherey Nagel、ドイツ）を使用して精製された。ＧＦＰ−ΔＣＴ３をコードしている、又は両方のコザック共通配列を含有しているＧＦＰタンパク質をコードしているｃＤＮＡを、ＳＩＮ−ｃＰＰＴ−ＰＧＫ−ＷＨＶ又はｐＳＭＤ２導入用ベクターにクローニングした。レンチウイルスベクター及びＡＡＶ９ベクターは以前に記載のように得られ（Caillierez et al. 2013; Francois et al. ; Fugier et al. 2011）、−８０℃で凍結して保存した。組換えＧＳＴ−ＭＢＮＬ１及びΔＣＴ３タンパク質を産生し、ＵＶ架橋実験を前記のように実施した（Laurent et al. 2012, Tran et al. 2011）。ヒトタウミニ遺伝子及び突然変異ＭＢＮＬ構築物は（Carpentier et al., 2014）に記載されている。簡潔に言えば、ヒトタウＥ２ミニ遺伝子は、ｐＥＧＦＰＮ１真核生物発現ベクター（Clontech）に挿入されたヒトＭＡＰＴ遺伝子のエキソン１、エキソン２、及びエキソン４の配列からなる。エキソン２の前に及び後に、それぞれヒトＭＡＰＴ遺伝子のイントロン配列２及び３の８７８及び２１００ヌクレオチドがある（Carpentier et al., 2014に詳述されている）。図１５ＤのＳｅｑ２５０Ｅ２２５０ＭＢＮＬ１突然変異部位は、ＭＢＮＬ結合部位が突然変異しているエキソン２の周辺のイントロン配列の２５０ヌクレオチドを示す（太文字の灰色の配列）。この突然変異体ミニ遺伝子は、ＭＢＮＬスプライシング調節活性に対してもはや応答性ではない。これらのミニ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Gene Synthesis company）によって作製し、プラスミド調製物の配列を、ＧＡＴＣ（Biotech, Constance, Germany）によって二本鎖配列によって確認した。

細胞培養、トランスフェクション、及び感染
ＨｅＬａ細胞を、３７℃の加湿ＣＯ_２（５％）インキュベーター中、単層培養で、６ウェルプレート中の、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の補充されたダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）（Invitrogen）中で増殖させた。約７０％コンフルエントになるまで増殖させた細胞を、３つ組で、ミニ遺伝子プラスミドＤＮＡ１μg、ＣＵＧ反復配列１μg、及びＭＢＮＬプラスミドＤＮＡ３μgを用いて、ＦｕＧＥＮＥＨＤトランスフェクション試薬（Roche Diagnostics）を使用して製造業者の説明書に従って一過性に同時トランスフェクトした。

ヒト筋肉細胞を、倫理規定に関するフランスの法律に従って、記載（Furling et al, 2001）のように骨格筋生検材料から単離した。野生型（ＷＴ）及びＤＭ１筋芽細胞を、２０％ＦＢＳ及び５μg/mLのゲンタマイシン（Invitrogen）の補充されたＨＡＭのＦ１０培地中で５％ＣＯ_２及び３７℃で増殖させた。１００ngのＰ２４/μlを使用して、２×１０^５個のヒト筋肉細胞を形質導入した。ベクターの形質導入を、４μg/mlのポリブレン（Sigma）の存在下で一晩行なった。分化をトリガーするために、増殖用培地をサブコンフルエントの培養液から除去し、１０μg/mLのインシュリン（Sigma）の補充されたＤＭＥＭと交換した。

インビボでの遺伝子導入及び実験
ＨＳＡ−ＬＲマウスはC. Thorntonから入手し、対照ＦＶＢマウスはJanvierから入手した。全てのマウス手順を、ピティエ・サルペトリエール動物施設の機能開発センターでの動物資源に対する倫理委員会によって承認された実験プロトコールに従って、生物学的封じ込めの下で行なわれた。成体マウスの腓腹筋又は前脛骨筋に、それぞれ、ＡＡＶ９ベクターを含有しているか又は含有していない、生理溶液３０〜１００μlを注射した。各マウスについて、１つの筋肉にＡＡＶＧＦＰ−ΔＣＴ３を注射し、反対側の筋肉に、任意の導入遺伝子（ＭＣＳ）又はＧＦＰ又はビヒクルのみ（ＰＢＳ）を含有している対照ＡＡＶを注射した。注射から６週間後、筋肉の等尺性収縮を、以前に記載されているように（Mouisel et al. 2006）測定した。次いで、マウスを屠殺し、筋肉を回収し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。

蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及び免疫蛍光法
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、Ｃｙ３で標識された２−Ｏ−メチルＲＮＡ（ＣＡＧ）_７プローブを使用して記載の通りに行なった。組み合わせたＦＩＳＨ免疫蛍光（ＩＦ）実験を記載の通りに（Francois et al.）ポリクローナルＭＢＮＬ１抗体（Everest Biotech.）又はＧＦＰ（Invitrogen）抗体、次いでそれぞれＣｙ５−又はＡｌｅｘａ４８８−コンジュゲート抗二次体を使用して行なった。Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡及びソフトウェア（Leica microsytems）を使用して写真を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して処理した。筋肉切片に対する免疫蛍光を、胚性ＭｙＨＣ抗体（Novocastra）及びラミニン抗体（Novocastra）を使用して記載の通りに行なった。

タンパク質抽出及びウェスタンブロット分析
ウェスタンブロットを、以前に記載されているように（Tran et al. 2011）、抗ＧＦＰ抗体（Santa Cruz）又は抗ＧＡＰＤＨ抗体（Tebu-Bio）を使用して標準的な方法を用いて行なった。

ＲＮＡ抽出及び半定量分析
全ＲＮＡを、全ＲＮＡ抽出キット（Nucleospin（登録商標）ＲＮＡＩＩキット、Macherey Nagel）又はトリゾール試薬（Invitrogen）を使用して製造業者のプロトコールに従って単離した。ＲＮＡ濃度を、Nanodrop（Labtech）を使用することによって２６０nmでの吸光度を測定することによって測定した。ＲＴ−ＰＣＲを、全ＲＮＡ１μgを使用して、ランダムヘキサマー及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Invitrogen）を使用して標準的なプロトコールに従って行なった。ＲＴ対照にはＤＮＡの増幅は全く観察されなかった。ＰＣＲを以前に記載されているように行なった。５％又は８％ポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動によって反応産物を分離し、バンドをＳＹＢＲＧｏｌｄ（Invitrogen）で染色した。ＳＹＢＲＧｏｌｄ発光強度を、フルオロイメージャースキャナー（Claravision）を使用して測定した。ＰＣＲ実験を少なくとも３回繰り返した。

統計分析
統計分析を、Prism６ソフトウェア（GraphPad Software Inc.）の助けを借りて、両側のＰ値と対応のないｔ検定を使用して行なった。

結果
様々なＭＢＮＬ１アイソフォームの結合親和性及びスプライシング活性に焦点を当てた以前の研究において、本発明者らは、Ｃ末端ドメインを欠失している切断短縮されたＭＢＮＬ１構築物（ΔＣＴ３、図１）が、ＹＧＣＹ結合特性と、完全長のＭＢＮＬ１アイソフォームと比較して僅かにより低い親和性を維持しているが、エキソン５〜１０によってコードされる配列がないことに因りそのスプライシング活性は劇的に減少していることを示した（Tran et al. 2011）。非機能的なポリペプチドであるΔＣＴ３ポリペプチドが依然として病原性ＣＵＧ反復配列に結合することができるかどうかを評価するために、Ｈｅｌａ細胞に、増大したＣＵＧ反復配列と、ＭＢＮＬ１構築物又はＧＦＰでタグ化されたΔＣＴ３構築物とを同時にトランスフェクトした。図２に観察されているように、ＧＦＰ−ΔＣＴ３は、完全長のＭＢＮＬ１に観察されているように、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡの核内フォーカスと同じ場所に局在する。本発明者らは次に、ＧＦＰ−ΔＣＴ３又はＭＢＮＬ１構築物を、増大したＣＵＧ反復配列と共に同時発現させることによってＤＭ１において調節解除されたスプライシング事象に対するその効果を調べ、Ｈｅｌａ細胞内でスプライシングレポーターミニ遺伝子を使用してタウのエキソン２／３のスプライシングを分析する（図３）。ＣＵＧ反復配列の存在下においては、タウのエキソン２の包含は、ＤＭ１患者において観察されているように有意に減少し、類似したスプライシング活性を有する様々なＭＢＮＬ１アイソフォームの過剰発現（Tran et al. 2011）は、タウのエキソン２の包含を部分的に回復させる（図３Ａ）。しかしながら、ＭＢＮＬ１と比較してそのスプライシング活性が８０％を超えて減少したＧＦＰ−ΔＣＴ３構築物の過剰発現もまた、ＭＢＮＬ１と同程度だけ、タウのエキソン２／３のミニ遺伝子のスプライシング変化を修正する（図３Ｂ）。この結果は、ＧＦＰ−ΔＣＴ３がＣＵＧ反復配列と相互作用して、タウのエキソン２のスプライシングの調節に関与している機能的ＭＢＮＬ１を放出させることができることを示唆する。なぜなら、ＧＦＰ−ΔＣＴ３の残留スプライシング活性では、ＣＵＧ反復配列の存在下でタウの正常なスプライシングを回復するのに十分ではないようであるからである。この仮説を確認するために、本発明者らは、ＨＩＶのＲＥＶタンパク質に由来する強力な核外移行シグナル（ＮＥＳ）と融合させたＧＦＰ−ΔＣＴ３構築物を作製した（Fischer et al. 1995）。予想された通り、ＧＦＰ−ΔＣＴ３−ＮＥＳは、核細胞質への局在化を示したＧＦＰ−ΔＣＴ３と比較した場合に完全な細胞質内への局在化を示す（図４）。効果的な核外移行及び排他的な細胞質への局在化に因り、ＧＦＰ−ΔＣＴ３−ＮＥＳは、ｈｃＴＮＴエキソン５及びＩＲエキソン１１のミニ遺伝子を使用して示されているように、残留スプライシング活性をもはや有さない（図４Ｂ）。対照的に、ＧＦＰ−ΔＣＴ３−ＮＥＳとＣＵＧ反復配列及びタウのエキソン２／３のスプライシングリポーターミニ遺伝子との同時発現は依然として、完全長のＭＢＮＬ１及びＧＦＰ−ΔＣＴ３を用いて以前に観察されているように、タウの正常なスプライシングを回復させることができる（図４Ｃ）。図４Ａに示されているように、ＧＦＰ−ΔＣＴ３−ＮＥＳは、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣と同じ場所に局在するが、遊離し残留している結合していないＧＦＰ−ΔＣＴ３−ＮＥＳは核外に効果的に排出され、それ故、選択的スプライシングの調節にはもはや利用できない。まとめると、本発明者らの結果は、ΔＣＴ３が、ＣＵＧ結合部位を飽和させ、十分量の機能的ＭＢＮＬ１をＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣から放出させることによって、病原性ＣＵＧ反復配列の存在下で調節解除されたスプライシング事象を元に戻すことを示す。

ΔＣＴ３はＣＵＧ反復配列に結合することができ、ＭＢＮＬ１との結合に競合することができることを確認するために、組換えＭＢＮＬ１タンパク質を、漸増濃度の組換えΔＣＴ３タンパク質の非存在下又は存在下で９５個のＣＵＧ反復配列を含有しているインビトロで転写された^３２ＰＲＮＡに架橋した（又はその逆）（図５）。両方の条件において、漸増濃度の組換えΔＣＴ３又はＭＢＮＬ１はそれぞれ、組換えＭＢＮＬ１又はΔＣＴ３の量を減少させることができ、このことはΔＣＴ３が、ＣＵＧ反復配列に由来するＭＢＮＬ１と競合することができ、かつＣＵＧ反復配列に由来するＭＢＮＬ１を効果的に置換することができることを示す。

ΔＣＴ３がＤＭ１細胞内のＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡと相互作用することができ、選択的スプライシングの誤調節としてのＤＭ１の分子特徴を調節することができるかどうかを評価するために、ＤＭ１患者及び非ＤＭ１患者のヒト一次筋肉細胞培養液に、ＧＦＰ−ΔＣＴ３又はＧＦＰのいずれかを発現しているレンチウイルスベクターを形質導入したか又は形質導入しなかった。図６に示されているように、ＧＦＰ−ΔＣＴ３は、ＤＭ１筋肉細胞内の核内ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣と同じ場所に局在する。本発明者らは次に、分化したＤＭ１筋肉細胞において異常にスプライシングされている、ＤＭＤ、ＢＩＮ１、及びＬＤＢ３転写物のスプライシング誤調節に対する効果を調べた（図７Ａ）（Francois et al. 2011）。ＧＦＰ−ΔＣＴ３の発現は、ＤＭ１細胞内のこれらの転写物のスプライシングプロファイルを有意に標準化し、一方、対照のＤＭ１ではない細胞においてはそのスプライシングに影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ＧＦＰ−ΔＣＴ３の発現が、ＤＭ１筋肉細胞内の有害なＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡによって誘発された分子変化を元に戻すことができることを確認する。さらに、それはまた、改変されたＧＦＰ−ΔＣＴ３単独では、内因性標的のスプライシングを改変させないことを示す。改変されたＧＦＰ−ΔＣＴ３の作用機序をさらに解読するために、本発明者らは、ＧＦＰ−ΔＣＴ３で処置された筋肉細胞においてｓｉＲＮＡを使用してＭＢＮＬ１をサイレンス状態とした。図７Ｂに示されているように、ＧＦＰ−ΔＣＴ３は、ＤＭ１筋肉細胞においてＤＭＤのスプライシングプロファイルを完全に回復させるために、ＭＢＮＬ１活性を必要とした。対照の筋肉細胞におけるＭＢＮＬ１の欠失は、ＤＭＤのスプライシングプロファイルを変化させることを注記する。この結果は、ＤＭ１細胞では、ＧＦＰ−ΔＣＴ３は、スプライシングに対して直接的な活性を示さないことを示す。したがって、ΔＣＴ３は、ＤＭ１細胞内でのスプライシングの変化を修正するために、増大したＣＵＧ−ＲＮＡから機能的ＭＢＮＬ１を放出することを必要とする。

増大したＣＵＧ反復配列によって誘発されたＲＮＡ毒性をインビボで中和するΔＣＴ３の能力を次に、ヒト骨格アクチン遺伝子の３’ＵＴＲにおいて２２０個のＣＴＧを発現しているＤＭ１マウスモデル（ＨＳＡ−ＬＲ）において試験した（Mankodi et al. 2000）。これらのマウスは、その骨格筋線維の核内にＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡを蓄積させ、ミススプライシング事象並びに筋強直症を示す。ＨＳＡ−ＬＲマウスの腓腹筋（ＧＡＳ）にＡＡＶ９−ＧＦＰ−ΔＣＴ３ベクターを筋肉内注射し、一方、反対側のＧＡＳに食塩水溶液を注射した。６週間後、これらの筋肉の収縮特性をインサイツで測定し、その後、マウスを屠殺し、筋肉を組織学的分析及び生化学的分析のために採取した。ＤＭ１患者に観察されたのと同じようなＨＳＡ−ＬＲマウスにおけるスプライシング変化の中で、本発明者らは、Ｓｅｒｃａ１、Ｍｂｎｌ１、及びＣｌｃ−１のスプライシング誤調節を調べた。図８に示されているように、ＡＡＶ９−ＧＦＰ−ΔＣＴ３の注射は、ＨＳＡ−ＬＲの反対側の筋肉と比較した場合にこれらの転写物のスプライシングパターンを修正し、ＦＶＢ野生型マウスと比較した場合にほぼ完全に正常なスプライシングプロファイルを回復させる。顕著には、ＡＡＶ９−ＧＦＰ−ΔＣＴ３は、ＦＶＢ野生型マウスにおけるこれらの転写物の内因性スプライシングに対して全く影響を及ぼさず、したがってこのことは、ΔＣＴ３構築物は、野生型ＭＢＮＬ１タンパク質と等価なインビボ及び（図１３）又はインビトロ濃度でスプライシング調節活性をほぼ全く有さないことを確認した（Tran et al., 2011）。まとめると、本発明者らの結果は、ΔＣＴ３が、増大したＣＵＧ反復配列への異常な結合に関して内因性ＭＢＮＬと競合し、これにより、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ凝集物から捕捉された機能的なＭＢＮＬが放出されることを示唆する。ΔＣＴ３は十分に機能的なＭｂｎｌ１をＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣から放出させて、ＨＳＡ−ＬＲマウスにおける正常な選択的スプライシングプロファイルを回復させることを示す本発明者らのデータを支持するために、本発明者らは、筋肉切片に対するその核内局在をモニタリングした（図９）。予想された通り、ΔＣＴ３は、ＡＡＶ９−ＧＦＰ−ΔＣＴ３の注射されたＨＳＡ−ＬＲマウスの筋核内においてＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣と同じ場所に局在する。これとは対照的に、対照ＨＳＡ−ＬＲマウスにおいて重なるＭｂｎｌ１：ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣の共局在（ピーク強度によって示されるような）は、ＡＡＶ９ＧＦＰ−ΔＣＴ３の注射されたマウスにおいて大きく減少し（図１０）、このことは、ΔＣＴ３が、ＭＢＮＬ１を置換して病巣内へと入り、十分な内因性のＭＢＮＬ１を置換して、ＤＭ１マウスにおける機能的なＭＢＮＬ依存性スプライシング活性を回復させることを確認する。

生理学的レベルでは、このＤＭ１マウスモデルにおいて観察された筋強直症は、筋肉特異的クロライドチャネルＣｌｃ−１エキソン７ａの異常なスプライシングから生じることが確立されている（Wheeler et al. 2007）。持続的な放電及び遅延した力の弛緩をもたらす、筋肉興奮性亢進によって特徴付けられる筋強直症。Ｃｌｃ−１エキソン７ａのミススプライシングは、ΔＣＴ３の発現によってほぼ完全に標準化されたので、筋肉の力の弛緩に対するその効果を、収縮が誘導された後に決定した（図１１）。野生型ＦＶＢマウスと比較してＨＳＡ−ＬＲ筋肉において有意な力の弛緩の増加が測定され、これらのＤＭ１マウスにおいて筋電図検査によって以前に確立された筋強直症が確認された。ＡＡＶ９−ＧＦＰ−ΔＣＴ３を注射されたＨＳＡ−ＬＲマウスのＧＡＳ筋肉において、異常な力の弛緩による筋強直症の顕現は、反対側の筋肉と比較した場合に消失し、一方、筋肉強度及び筋肉の組織学的検査において有意な変化は検出されなかった（データは示されていない）。さらに、野生型マウスの前脛骨筋（ＴＡ）にまた、ＡＡＶ９−ＧＦＰ−ΔＣＴ３又は空のＡＡＶ９−ＭＣＳを注射し、３、４及び６週間後に屠殺した（図１２）。これらの筋肉は、中心核、胚性ミオシン重鎖の再発現、並びに異常なサイズの筋線維がほぼ存在しない（１％未満）ことによって示されているように、毒性又は筋肉再生／変性の兆候を全く示さなかった。さらに、ＤＭ１において異常にスプライシングされている遺伝子のスプライシングプロファイルは、ΔＣＴ３の発現又はＡＡＶ９の形質導入のいずれかによって野生型マウスにおいては攪乱されない（図１３）。最後に、ＨＳＡ−ＬＲマウスのＴＡ筋肉へのＡＡＶ９−ＧＦＰ−ΔＣＴ３の注射もまた、空のＡＡＶ９−ＭＣＳを注射された反対側の筋肉と比較した場合に、いくつかのＤＭ１遺伝子のスプライシング誤調節を修正する（図１４−１）。さらに、ΔＣＴ３構築物への核局在化シグナル（ＮＬＳ）の添加は、ＨＳＡ−ＬＲマウスのΔＣＴ３効力を改変させない（図１４−２）。これとは対照的に、ΔＣＴ３構築物からのエキソン３の除去は、そのスプライシング修正活性を妨げる。

ＭＢＮＬ２はまた、増大したＣＵＧ反復配列に結合することができ、その結果、その捕捉をもたらすことができるので、本発明者らは、ＭＢＮＬ２の欠損症に関連したスプライシングの変化がΔＣＴ３によって修正され得るかどうかを調べた。図１５Ａに示されているように、増大したＣＵＧ反復配列を有するヒトタウＥ２ミニ遺伝子と、ＭＢＮＬ構築物又はＧＦＰでタグ化されたΔＣＴ３構築物をＴ９８Ｇ細胞に同時トランスフェクトすることによって、ＭＢＮＬ１の過剰発現は、タウのエキソン２の異常なスプライシングを修正することはできない。これとは対照的に、ＭＢＮＬ２の過剰発現は、増大したＣＵＧ反復配列の存在によって誘発されたこの調節解除されたスプライシング事象を元に戻し（図１５Ｂ）、このことは、増大したＣＵＧ反復配列の存在によって誘発されたヒトタウＥ２ミニ遺伝子のミススプライシングが、ＭＢＮＬ１の欠損症ではなくむしろＭＢＮＬ２の欠損症に起因することを示す。ΔＣＴ３はまた、タウのエキソン２の異常なスプライシングを救出することができる（図１５Ｃ）。ＭＢＮＬ２又はΔＣＴ３の過剰発現のいずれかで観察された救出効果は、タウのエキソン２の周辺の突然変異したＭＢＮＬ部位（図１５Ｄ）を含むＭＢＮＬ突然変異ミニ遺伝子（図１５Ｂ及びＣ）を使用している間に消失し、このことは、救出が、ＭＢＮＬから独立していないか、又は間接的な作用に起因することを実証する。それ故、ΔＣＴ３は、増大したＣＵＧ反復配列からいくつかのＭＢＮＬパラログを放出させることによって、ＭＢＮＬ１及びＭＢＮＬ２の両方の調節解除されたスプライシング事象を救出することができる。

考察
本研究において、本発明者らは、ほぼスプライシング活性を欠いている非機能的なＭＢＮＬ（ΔＣＴ３）が、インビトロ及びインビボの両方においてＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ毒性を打ち消すのに効果的であるというエビデンスを提供した。したがって、ΔＣＴ３タンパク質を発現しているＡＡＶベクターの筋肉内投与は、ＤＭ１マウスにおける選択的スプライシングの誤調節及び筋強直症の両方を修正する。ＭＢＮＬ１のＲＮＡ結合ドメインのみを発現しているΔＣＴ３は、病原性ＣＵＧ反復配列と相互作用し、捕捉されたＭＢＮＬ１を核内のＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣から放出させる。この機序は、ＤＭ１筋肉細胞内の内因性の機能的なＭＢＮＬ１を回復させ、インビボにおいてＤＭ１の関連した表現型を修正する。この知見は、ＤＭ１の代替的又は補完的な治療的アプローチとしての、改変された非機能的なＭＢＮＬΔ遺伝子療法アプローチの開発を支持する。

高い親和性で増大したＣＵＧ反復配列にＭＢＮＬが結合できる能力に基づいて、本発明者らは、病原性反復配列とポリ−ＣＵＧ結合タンパク質の有害な相互作用を遮断するための餌として、ＭＢＮＬ１ＲＮＡ結合ドメインを使用することを提案する。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＭＢＮＬ１ＲＮＡ結合ドメインのみを含有し、かつＭＢＮＬ１スプライシング調節活性、ＭＢＮＬ核細胞質シャトル輸送、及び最も可能性が高いのはＭＢＮＬのオリゴマー形成に関与するエキソン５〜１０によってコードされるＣ末端ドメインを欠失している、改変された非機能的なＭＢＮＬ（ΔＣＴ３）を作製した（Tran et al. 2011）。本発明者らの結果は、ΔＣＴ３が、インビトロ及びインビボの両方において、筋肉細胞内のＣＵＧ反復配列に結合し、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡと同じ場所に局在するその能力を維持することを確認する。インビトロでの架橋アッセイによって示されているように、ΔＣＴ３は、増大したＣＵＧ配列に由来するＭＢＮＬ１を置換し、このことは、病原性ＤＭ１反復配列へのΔＣＴ３のインビボでの結合は、ＭＢＮＬ１並びに他の同定されていないポリ−ＣＵＧ結合タンパク質の有害な相互作用を遮断するか、又は、核内ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣から捕捉されたＭＢＮＬ１を置換するかのいずれかを行なうことができることを示唆する。結果として、機能的なＭＢＮＬ１の放出は、ＤＭ１で誤調節された事象を元に戻すだろう。

ＤＭ１筋肉細胞又はＤＭ１マウスの骨格筋のいずれかにおけるΔＣＴ３による選択的スプライシング誤調節の標準化は、病原性ＣＵＧ反復配列を標的化して、内因性ＭＢＮＬ１への接近を遮断するΔＣＴ３の能力を支持する。しかしながら、インビトロでのアッセイは、ΔＣＴ３のＹＧＣＹへの結合特性が、ＭＢＮＬ１と同じか又は僅かにより低いことを示したので、本発明者らは、ΔＣＴ３が、ＭＢＮＬ１により調節される事象を直接調節することができるかどうかを考えた。これはそうでないように思われる。なぜなら、ＭＢＮＬ１エキソン５〜１０の欠失に起因するΔＣＴ３のスプライシング活性は、インビトロでのミニ遺伝子アッセイを使用してＭＢＮＬ１と比較した場合に劇的に減少し、その強力な核外移行シグナルに因りスプライシング活性を全く有さないΔＣＴ３−ＮＥＳ構築物を用いても同じ結果が得られた。しかしとりわけ、ΔＣＴ３を発現している野生型マウス又は対照ヒト細胞においてスプライシングの変化は全く検出されなかった。むしろ、本発明者らの結果は、機能的なＭＢＮＬ１内因性活性を回復するΔＣＴ３を発現している筋肉細胞における、核内ＣＵＧ−ｅｘｐ−ＲＮＡ病巣からの内因性ＭＢＮＬ１の放出に賛成して議論する。ＭＢＮＬ１は、対照ＨＳＡ−ＬＲマウスにおいてはＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣内に捕捉され、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣と同じ場所に局在するが、その局在は、ＨＳＡ−ＬＲを注射されたマウスにおいてΔＣＴ３と比べて核内フォーカスにはあまり結合していない。ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡによるΔＣＴ３の捕捉は、これらの異常な構造に由来する内因性ＭＢＮＬ１を置換し、その結果、ＤＭ１マウスにおけるＭＢＮＬ１の誤調節された事象が修正される。

本発明者らのＡＡＶ−ΔＣＴ３戦略は、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡを標的化して、有害なポリ−ＣＵＧ結合タンパク質を阻害し、インビボでその毒性作用を修正する、最初の遺伝子療法アプローチである。現在までにＭＢＮＬタンパク質は、核内フォーカス内に捕捉されて見つかったＤＭ１ヒト組織試料中のほぼ唯一のタンパク質であり、近年、ＤＭ１患者の罹患筋肉に存在するスプライシングの異常は主に、ＭＢＮＬ１の機能的欠失に関連していた（Nakamori et al. 2013）。ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡへのその異常な結合及びＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡによる捕捉に因る機能的なＭＢＮＬスプライシング因子の枯渇は、転写物の特定のサブセットの選択的スプライシングの誤調節をもたらし、最終的には、ＤＭ１組織の病的変化をもたらす。したがって、ＭＢＮＬ１により調節される事象はＤＭ１骨格筋の異常に関連し、一方、ＭＢＮＬ２により調節される事象はＤＭ１脳において誤調節された。さらに、ＡＡＶベクターを使用しての機能的ＭＢＮＬ１（アイソフォーム−４０及び−４１）の過剰発現は、二重トランスジェニックＨＳＡ−ＬＲ：ＭＢＮＬ１−ＯＥマウスによって確認されるように、ＤＭ１マウスにおけるミススプライシング及び筋強直症を元に戻すのに十分である（Kanadia et al. 2006; Chamberlain and Ranum 2012）。機能的ＭＢＮＬ１の過剰発現のこの戦略は、機能的ＭＢＮＬ１のレベルを人工的に増加させることによって、ＤＭ１マウス細胞におけるＭＢＮＬ１の減少を補う。したがって、ＭＢＮＬ１アイソフォーム−４０及び−４１は、筋肉内において成功裡に過剰発現されたが、様々な発現プロファイル及び組織特異的パターンを有する１０個以下の様々なＭＢＮＬ１アイソフォームが記載されていた。様々なアイソフォームの機能は、ＭＢＮＬ１アイソフォーム−４３がＳｒｃファミリーキナーゼと相互作用することができることを示す近年の報告によって示されているように、まだ完全には確立されていない（Wang et al. 2012; Botta et al. 2013）。さらに、選択的スプライシング事象を調節するＭＢＮＬ１はまた、ｍＲＮＡの崩壊及びｍｉＲＮＡの生合成のような他のＲＮＡプロセスにも関与している（Rau et al. 2011; Masuda et al. 2012）。ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡを標的化するΔＣＴ３は、ＭＢＮＬ１のどのアイソフォームが過剰発現されるべきであるかという問題を回避するだろう。なぜなら、捕捉された内因性ＭＢＮＬ１タンパク質は、組織特異的に放出されるからである。さらに、ＤＭ１組織におけるＭＢＮＬ１のアイソフォームの比を変化させるＭＢＮＬ１それ自体のミススプライシングは、ΔＣＴ３を発現しているＤＭ１マウスの筋肉組織において修正される。その上、ＭＢＮＬ１の過剰発現が、ＭＢＮＬ２などの他のＭＢＮＬパラログの減少を回復又は補填することができるかどうかは不明である。本発明者らは、ΔＣＴ３が、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡから他のＭＢＮＬタンパク質も放出し、骨格筋以外の他の組織におけるＭＢＮＬのミススプライシングされた事象も修正すると推定することができる。本発明者らのインビトロでの結果は、ΔＣＴ３が、ＤＭ１の状況でＭＢＮＬ２の減少を補填することが十中八九できることを示す（図１５）。事実、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡの存在下におけるヒトタウＥ２ミニ遺伝子の異常なスプライシングは、ＭＢＮＬ２又はΔＣＴ３のいずれかによって回復され得るが、ＭＢＮＬ１の過剰発現によっては回復することができず、このことは、ΔＣＴ３が、ＤＭ１においてＭＢＮＬ２により誤調節された事象も打ち消すことができることを示唆する。それ故、まとめると本発明者らの結果は、ΔＣＴ３が、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２、又はその両方によって調節される、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡにより調節解除された標的の効果を均衡することができることを示す。ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ凝集物へのその捕捉に因る、遊離しかつ機能的に利用可能な内因性ＭＢＮＬ１の減少を補足する機能的なＭＢＮＬ１の過剰発現戦略とは対照的に、非機能的なΔＣＴ３は、増大したＣＵＧ反復配列に結合して、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ凝集物から内因性ＭＢＮＬ１を放出させ、その細胞内局在及び機能を回復させるだろう。

ＤＭ１について現在開発下にある治療アプローチの中で、突然変異ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡを標的化する様々な改変されたオリゴヌクレオチド又は小分子化合物が、インビボにおいて有望で有益な効果を示した（Mulders et al. 2009; Warf et al. 2009; Wheeler et al. 2009; Garcia-Lopez et al. 2011; Sobczak et al. 2012; Wheeler et al. 2012; Leger et al. 2013）。ＤＭ１マウスの筋肉表現型を元に戻すこれらの中の大半の戦略は、共通した特徴を共有する：ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡ病巣から捕捉されたＭＢＮＬパラログを放出することにより、その細胞内再分布／再局在化が起こり、機能的なＭＢＮＬパラログを回復させ、その結果、最終的にはＤＭ１に関連した表現型が修正される。この機序は、ＣＵＧｅｘｐ−ＲＮＡの分解又は増大したＣＵＧ反復配列の立体障害のいずれかを引き起こす戦略のために記載された。ここで、本発明者らは、ＤＭ１のための新規なＡＡＶ−ΔＣＴ３遺伝子療法を提案する。ＡＡＶ−ΔＣＴ３の一回の注射は、ＤＭ１マウスにおけるＲＮＡ毒性を中和するのに効果的であった。反復処置を必要とする合成オリゴヌクレオチド又は小分子化合物とは対照的に、ＡＡＶベクターは、筋肉内に数年間持続することが示され（Rivera et al. 2005）、これにより、毒性のあるＣＵＧｅｘｐＲＮＡの持続的発現を打ち消し、長期に持続する効果をトリガーすることのできる、非機能的ΔＣＴ３の持続的発現を可能とした。したがって、本発明者らは、ＤＭ１のための価値ある代替的又は補足的な治療アプローチとしてのこの新規な遺伝子療法アプローチを提案する。

参考文献

Claims

医薬品としての使用のための、ＹＧＣＹ結合特性を有し、かつ野生型ＭＢＮＬタンパク質と比較して減少したスプライシング活性を有する、改変されたＭＢＮＬポリペプチド。
前記ポリペプチドがＣＵＧ反復配列に結合する、請求項１記載の使用のための改変されたＭＢＮＬポリペプチド。
ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２、又はＭＢＮＬ３に由来する、請求項１又は２記載の使用のための改変されたＭＢＮＬポリペプチド。
ＭＢＮＬ１に由来する、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用のための改変されたＭＢＮＬポリペプチド。
野生型ＭＢＮＬタンパク質のＣ末端ドメインを欠失している、請求項１〜４のいずれか一項記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチド。
ＭＢＮＬ１タンパク質に由来し、かつ、ＭＢＮＬ１ｍＲＮＡのコードしているエキソン５〜１０に相当するアミノ酸を欠失している、請求項１〜５のいずれか一項記載の使用のための改変されたＭＢＮＬポリペプチドであって、該改変されたＭＢＮＬポリペプチドは特に配列番号２及び３に示された参照配列を有しているか、又は、その非機能的なＹＧＣＹ結合変異体である、ＭＢＮＬポリペプチド。
野生型ＭＢＮＬタンパク質と比較して少なくとも７５％減少したスプライシング活性を有する、請求項１〜６のいずれか一項記載の改変されたＭＢＮＬポリペプチド。
請求項１〜７のいずれか一項に定義されている改変されたＭＢＮＬポリペプチドをコードする核酸分子。
制御配列に作動可能に連結された請求項８記載の核酸分子を含む、遺伝子構築物、特に、ウイルスベクターゲノム。
レンチウイルス又はＡＡＶ由来ゲノムである、請求項９記載の遺伝子構築物。
請求項９又は１０記載の遺伝子構築物を含むウイルスベクター。
血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のＡＡＶキャプシドを有するＡＡＶベクターである、請求項１１記載のウイルスベクター。
血清型９のＡＡＶキャプシドを有するＡＡＶベクターである、請求項１２記載のウイルスベクター。
筋強直性ジストロフィー疾患の処置に使用するための、特に筋強直性ジストロフィー１型若しくは筋強直性ジストロフィー２型、又はＭＢＮＬの異常な捕捉によって引き起こされる疾患の処置のための、請求項１〜７のいずれか一項に定義されたような改変されたＭＢＮＬポリペプチド、請求項８記載の核酸分子、請求項９〜１０のいずれか一項記載の遺伝子構築物、又は請求項１１若しくは１２記載のウイルスベクター。
筋肉内に、又は、直接ＣＮＳに、又は、任意の慣用的な経路によって投与される、ＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９ベクターである、請求項１４記載の使用のためのウイルスベクター。
前記ＡＡＶベクターが、１回の注射として投与される、請求項１５記載の使用のためのウイルスベクター。